ES2828627T3

ES2828627T3 - Anticuerpo multivalente estable

Info

Publication number: ES2828627T3
Application number: ES09734826T
Authority: ES
Inventors: Nobuaki Takahashi
Original assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2021-05-27
Anticipated expiration: 2029-04-27
Also published as: US20170335016A1; EP2281845A1; EP2281845A4; WO2009131239A1; EP2281845B1; US9758594B2; US20110076722A1; JPWO2009131239A1; JP5522405B2

Abstract

Un anticuerpo multivalente que comprende múltiples regiones variables de cadena pesada de anticuerpo (en lo sucesivo en el presente documento, denominadas VH) unidas entre sí mediante un enlazador, en donde el enlazador consiste en: (i) un dominio CH1; o (ii) un fragmento de dominio CH1 que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 1 a 14 de un dominio CH1 con cisteína (Cys) en la posición 14, en donde el dominio CH1 o el fragmento de dominio CH1 es de la subclase lgG4.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo multivalente estable

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo multivalente en el que múltiples regiones variables de cadena pesada del anticuerpo (en lo sucesivo en el presente documento, simplemente denominadas VH) se unen entre sí a través de un dominio de inmunoglobulina o un fragmento del mismo; al ADN que codifica una secuencia de aminoácidos del anticuerpo multivalente; a un vector que comprende el ADN; a un transformante que expresa el anticuerpo multivalente; y a un método para producir el anticuerpo multivalente utilizando el transformante.

Antecedentes de la técnica

Las inmunoglobulinas son glicoproteínas que existen en el suero y en los tejidos y fluidos corporales de todos los mamíferos y tienen la función de reconocer antígenos extraños (Bibliografía no de patente 1). El anticuerpo está implicado en la defensa biológica mediante la activación del sistema del complemento y la activación de sus funciones efectoras, tal como los efectos de la fagocitosis celular, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, liberación de mediadores, presentación de antígenos, a través de receptores (FcR) que existen en la superficie celular. Hay cinco clases diferentes de inmunoglobulinas humanas, en concreto, IgG IgA, IgM, IgD e IgE. La IgG se puede clasificar en las 4 subclases de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. También, la IgA se puede clasificar en 2 subclases de IgAl e IgA2. La estructura básica de la inmunoglobulina está compuesta por dos cadenas L (ligeras) y dos cadenas H (pesadas). La clase y subclase de inmunoglobulina están determinadas por cadenas H. Se sabe que diferentes clases y subclases de inmunoglobulinas tienen funciones diferentes. Por ejemplo, el nivel de capacidad de unión al complemento disminuye en el siguiente orden: IgM>IgG3>IgG1>IgG2. También, el nivel de afinidad por FcyRI (receptor de Fc I) disminuye en el siguiente orden: IgG3>IgG1>IgG4>IgG2. Además, IgG1, IgG2 e IgG4 pueden unirse a la proteína A. La especificidad del anticuerpo a un antígeno está determinada por la combinación de cadenas pesadas y cadenas ligeras. En el caso de IgG, una molécula está compuesta por dos pares de una cadena pesada y una cadena ligera y tiene dos sitios de reconocimiento de anticuerpos por una molécula de anticuerpo.

En los últimos años, se han realizado muchos ensayos clínicos de anticuerpos monoclonales. Además, existen muchos anticuerpos monoclonales que están disponibles comercialmente (Bibliografía no de patente 2). En 1986 la FDA aprobó un anticuerpo anti-CD3 de ratón, muromonab-CD3. En 1994, se aprobó un anticuerpo quimérico abciximab en el que una región constante de ratón del anticuerpo se sustituyó por una región constante humana para reducir la antigenicidad. Se desarrollaron tecnologías de humanización para reducir adicionalmente la antigenicidad. En 1997, se aprobó un anticuerpo humanizado anti-CD20, daclizumab, en el que se humanizó una región variable. En 2002, se aprobó el anticuerpo anti-TNFa completamente humano, adalimumab.

Con el fin de modificar la actividad del anticuerpo, se ha intentado la producción de mutantes de diversos anticuerpos. Por ejemplo, se produjo un anticuerpo multivalente que reconoce diferentes antígenos por un hibridoma híbrido. Sin embargo, cuando se utiliza este método, debido a que se expresan dos tipos diferentes de cadena pesada y cadena ligera en una célula, se obtienen aproximadamente diez combinaciones de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo. Por consiguiente, como resultado, se reduce la productividad de un anticuerpo multivalente que tiene la combinación deseada de una cadena pesada y una cadena ligera y, además, es difícil aislar y purificar el anticuerpo multivalente dirigido (Bibliografía no de patente 3).

Para superar este problema, se ha informado de un intento de producir un anticuerpo que tenga una combinación correcta de polipéptidos reduciendo las variaciones de las combinaciones de subunidades mediante la unión de múltiples sitios de reconocimiento de antígenos en una cadena polipeptídica. Por ejemplo, se conoce un anticuerpo que comprende scFv en el que los sitios de reconocimiento de antígenos de una cadena pesada y una cadena ligera están unidos entre sí mediante un polipéptido (Bibliografía no de patente 4). Por otra parte, se ha informado de un anticuerpo en el que dos sitios de reconocimiento de antígenos están unidos entre sí utilizando un dominio CH1 de una región constante de cadena H, un fragmento parcial del mismo, o la región constante de cadena L de un anticuerpo IgG1, o un enlazador flexible (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) (bibliografía no de patente 5, Bibliografía de patente 1, Bibliografía de patente 2) o similares.

Sin embargo, tal anticuerpo multivalente convencional tiene desventajas porque la proteína del anticuerpo se agrega fácilmente y la estabilidad y productividad del mismo son bajas.

Lista de citas

Bibliografía no de patente

Bibliografía no de patente 1: Charles A. Janeway et al. Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.

Bibliografía no de patente 2: Emmanuelle Laffy et al., Human Antibodies 14, 33-55, 2005

Bibliografía no de patente 3: Suresh et al., Methods Enzymol. 121,210-228, 1986

Bibliografía no de patente 4: Gruber et al., J. Immunol. 152, 5369, 1994

Bibliografía no de patente 5: Wu et al., Nat. Biothech. 25, 1290-1297, 2007

Bibliografía no de patente 6: Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Quinta edición Bibliografía no de patente 7: Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97:722

Bibliografía no de patente 8: Yelton, D.E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7(1978) Bibliografía no de patente 9: Kohler, G et al. European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)

Bibliografía no de patente 10: Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270 (1978)

Bibliografía no de patente 11: Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550(1979)

Bibliografía no de patente 12: Horibata, K. y Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)

Bibliografía no de patente 13: P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY Bibliografía no de patente 14: P. Shepherd y C.Dean. Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS,

Bibliografía no de patente 15: J.W.Goding. Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993, ACADEMIC PRESS

Bibliografía de patente

Bibliografía de patente 1: documento US2007/0071675

Bibliografía de patente 2: documento WO2001/77342

Sumario de la invención

Problema técnico

Durante mucho tiempo se ha necesitado un anticuerpo multivalente que tenga múltiples sitios de reconocimiento de antígenos y que sea altamente estable y productivo.

Solución del problema

Como resultado de las deliberaciones para resolver el problema mencionado anteriormente, los presentes inventores han descubierto que, entre los anticuerpos multivalentes que comprenden múltiples sitios de reconocimiento de antígenos en un polipéptido de cadena pesada, un anticuerpo multivalente que comprende sitios de reconocimiento de antígenos que no están próximos entre sí es muy estable y de excelente productividad.

Los presentes inventores han descubierto que dicho anticuerpo multivalente es altamente estable y productivo y, por tanto, es útil para diversos fármacos y reactivos para estudios, y han realizado la presente invención basándose en este conocimiento.

Es decir, la presente invención se resume para comprender las siguientes características.

(1) Un anticuerpo multivalente que comprende múltiples regiones variables de cadena pesada de anticuerpo (en lo sucesivo en el presente documento, denominadas VH) unidas entre sí mediante un enlazador, en donde el enlazador consiste en:

(i) un dominio CH1; o

(ii) un fragmento de dominio CH1 que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 1 a 14 de un dominio CH1 con cisteína (Cys) en la posición 14,

en donde el dominio CH1 o el fragmento de dominio CH1 es de la subclase IgG4.

(2) El anticuerpo multivalente descrito en (1), en donde el fragmento del dominio CH1 es la secuencia de aminoácidos en las posiciones 1 a 14 del extremo N de una secuencia de aminoácidos de CH1.

(3) El anticuerpo multivalente descrito en (1) o (2), que comprende las mismas cadenas ligeras.

(4) Un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que codifica el anticuerpo multivalente descrito en uno cualquiera de (1) a (3).

(5) Un vector de recombinación que comprende el ADN descrito en (4).

(6) Una célula transformante en la que se introduce el vector de recombinación descrito en (5).

(7) Un método para producir el anticuerpo multivalente descrito en uno cualquiera de (1) a (3), que comprende cultivar la célula transformante descrita en (6) en medio para producir y acumular el anticuerpo multivalente descrito en uno cualquiera de (1) a (3) en el cultivo y recuperar el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo del cultivo.

Efectos ventajosos de la invención

El anticuerpo multivalente de la presente invención es altamente estable y de excelente productividad. Además, el anticuerpo multivalente de la presente invención puede usarse como un agente terapéutico o un agente de diagnóstico para diversos tipos de enfermedades. Por otra parte, el anticuerpo multivalente de la presente invención puede usarse como reactivo estable para investigación.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1] La Fig. 1 es un diagrama que ilustra una estructura de un anticuerpo multivalente de la presente invención. Los marcos de línea gruesa representan estructuras enlazadoras.

Descripción de las realizaciones

Los términos usados en la presente invención incluyen las siguientes definiciones.

El término "anticuerpo" de la invención representa anticuerpos derivados de genes (generalmente denominados genes de anticuerpos) que codifican la totalidad o una parte de una región variable de cadena pesada, una región constante de cadena pesada, una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera, que juntas constituyen una inmunoglobulina. El anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo de cualquier clase y subclase de inmunoglobulina.

El "anticuerpo humano" significa un anticuerpo que comprende una secuencia que codifica un gen de anticuerpo derivado de seres humanos y que puede obtenerse de una tecnología, tal como Presentación en Fagos, Presentación en Levaduras, o similares utilizando un hibridoma de linfocitos B humanos, un ratón SCID humanizado, un ratón que expresa un gen de anticuerpos humanos o una biblioteca de genes de anticuerpos humanos. El "anticuerpo humanizado" representa un anticuerpo en el que partes de la secuencia de anticuerpos obtenidas de animales distintos de seres humanos se injertan con una secuencia de anticuerpos humanos (Emmanuelle Laffy et al., Human Antibodies 14, 33-55, 2005).

La "cadena pesada" representa un polipéptido que tiene un peso molecular más alto de dos tipos de polipéptidos (cadena H y cadena L) que constituyen una molécula de inmunoglobulina. La cadena pesada determina una clase y una subclase de un anticuerpo. Cada uno de IgG1, IgG2, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD e IgE, tiene una región constante diferente de la cadena pesada en la secuencia de aminoácidos.

La "cadena ligera" representa un polipéptido que tiene un peso molecular más bajo de dos tipos de polipéptidos (cadena H y cadena L) que constituyen una molécula de inmunoglobulina. En el caso de anticuerpos humanos, existen dos tipos de cadenas ligeras, denominadas k y A.

La "región variable" (también denominada región V) representa una región muy diversa en una secuencia de aminoácidos que generalmente existe en un lado N-terminal de la inmunoglobulina. La otra parte de la inmunoglobulina tiene una estructura con una diversidad escasa y, por lo tanto, se denomina "región constante" (también denominada región C). Las regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera forman un complejo y el complejo determina la propiedad de un anticuerpo contra un antígeno. En cuanto a una cadena pesada de un anticuerpo humano, la secuencia de aminoácidos en la posición 1 a 117 del índice EU de Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest 1991 Fifth edition) corresponde a la región variable, y la región constante comienza desde el aminoácido en la posición 118. En cuanto a una cadena ligera de un anticuerpo humano, la secuencia de aminoácidos en la posición 1 a 107 del índice EU de Kabat et al. corresponde a la región variable, y la región constante comienza desde el aminoácido en la posición 108. En la siguiente descripción, una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera se denomina simplemente VH o VL, respectivamente.

El "sitio de reconocimiento de antígenos" es un sitio que reconoce un antígeno y forma una estructura tridimensional complementaria a un determinante antigénico (epítopo). El sitio de reconocimiento de antígenos puede inducir una fuerte interacción molecular con un determinante antigénico. Ejemplos del sitio de reconocimiento de antígenos incluyen una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) que comprenden al menos tres regiones determinantes de la complementariedad (denominadas simplemente CDR). En un anticuerpo humano, cada una de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera tiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y sitios de reconocimiento de antígenos. Estas CDR se denominan CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente en el orden de posición desde el lado N-terminal.

El "anticuerpo multivalente" representa un anticuerpo que comprende al menos dos o más sitios de reconocimiento de antígenos en una cadena pesada y/o una cadena ligera. Cada uno de los sitios de reconocimiento de antígenos puede reconocer el mismo determinante antigénico o puede reconocer diferentes determinantes antigénicos.

El anticuerpo multivalente de la presente invención es un anticuerpo multivalente en el que múltiples regiones variables de cadena pesada del anticuerpo están unidas entre sí mediante un dominio de inmunoglobulina o un fragmento del mismo.

El anticuerpo multivalente de la presente invención se caracteriza específicamente porque (a) múltiples (tales como 2 a 5) sitios de reconocimiento de antígenos diferentes están comprendidos en un polipéptido de cadena pesada, y los sitios de reconocimiento de antígenos están separados y no están cerca unos de otros, (b) los sitios de reconocimiento de antígenos están unidos en tándem mediante un enlazador polipeptídico, (c) el sitio de reconocimiento de antígenos en una cadena ligera forma un complejo con el sitio de reconocimiento de antígenos correspondiente en una cadena pesada, (d) el anticuerpo multivalente tiene una estructura de anticuerpo que comprende dos polipéptidos de cadena pesada y al menos cuatro polipéptidos de cadena ligera como se muestra en la Fig. 1, un enlace disulfuro que une los dos polipéptidos de cadena pesada en esta región bisagra, y un enlace disulfuro que une el polipéptido de cadena ligera con el polipéptido de cadena pesada, (e) la región constante de la cadena pesada comprende la totalidad o una parte de la región constante de una cadena pesada de anticuerpo natural (tal como un fragmento CH1, CH1, CH2, CH3, CH1-bisagra, CH1-bisagra-CH2, CH1-bisagra-CH2-CH3, o similares) y similares.

De manera más específica, la Fig. 1 ilustra tanto una estructura enlazadora como un ejemplo de la estructura de un anticuerpo multivalente.

Un anticuerpo que reconoce un solo antígeno se define como un anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo monoclonal es un anticuerpo secretado por una célula productora de anticuerpos de un solo clon, reconoce solo un epítopo (también denominado determinante antigénico) y tiene una secuencia de aminoácidos uniforme (estructura primaria) que constituye el anticuerpo monoclonal.

Ejemplos del epítopo incluyen una sola secuencia de aminoácidos, una estructura tridimensional que comprende la secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos unida a la cadena de azúcar, una estructura tridimensional que comprende una secuencia de aminoácidos unida a una cadena de azúcar y similares, reconocidos y unidos por un anticuerpo monoclonal.

Existe una región de aminoácidos altamente flexible denominada "región bisagra" entre CH1 y CH2.

En un anticuerpo humano, CH1 significa una región que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 118 a 215 del índice EU. De manera similar, la región de bisagra representa una región que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 216 a 230 del índice EU, CH2 representa una región que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 231 a 340 del índice EU, y CH3 representa una región que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 341 a 446 del índice EU.

"CL" representa una región constante de una cadena ligera. En el caso de una cadena k de un anticuerpo humano, CL representa una región que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 108 a 214 del índice EU por Kabat et al. En una cadena A, CL representa una región que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 108 a 215.

El "enlazador" representa una estructura química que enlaza dos sitios de reconocimiento de antígenos. El enlazador es un polipéptido.

El enlazador usado para el anticuerpo multivalente de la presente invención incluye un enlazador que tiene la secuencia de aminoácidos completa o parcial del dominio de inmunoglobulina.

En la presente invención, el enlazador es un polipéptido que comprende 14 o más aminoácidos, preferentemente 50 o más aminoácidos.

El dominio de inmunoglobulina y el fragmento del mismo utilizado como enlazador para el anticuerpo multivalente de la presente invención consiste en: (i) un dominio CH1; o (ii) un fragmento de dominio CH1 que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 1 a 14 de un dominio CH1 con cisteína (Cys) en la posición 14, en donde el dominio CH1 o el fragmento de dominio CH1 es de la subclase IgG4.

Ejemplos del anticuerpo multivalente de la presente invención incluyen un anticuerpo multivalente que comprende dos o más regiones variables de cadena pesada unidas mediante el dominio de inmunoglobulina mencionado anteriormente o el fragmento del mismo. Cuando tres o más regiones variables de cadena pesada están unidas entre sí, pueden usarse diferentes dominios de inmunoglobulina o los fragmentos de los mismos, o también pueden usarse los mismos dominios de inmunoglobulina y los fragmentos de los mismos. Además, cuando dos o más regiones variables de cadena pesada están unidas entre sí, es posible cambiar la longitud o el tipo del dominio de inmunoglobulina o el fragmento del mismo de modo que cada VH pueda unirse a un antígeno específico.

En la presente invención, las regiones variables de cadena ligera incluidas en el anticuerpo multivalente pueden ser las mismas regiones variables de cadena ligera o diferentes regiones variables de cadena ligera. La región variable de cadena pesada del anticuerpo multivalente que puede unirse a dos o más antígenos y las mismas regiones variables de cadena ligera pueden seleccionarse apropiadamente utilizando un método como Presentación en Fagos de manera que cada región variable de anticuerpo pueda unirse a un antígeno específico.

El antígeno al que se une el anticuerpo multivalente de la presente invención no está particularmente limitado. Ejemplos del antígeno incluyen un antígeno que está asociado con una enfermedad relacionada con un crecimiento celular anormal, tal como un cáncer, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad alérgica y similares, y un antígeno implicado en la regeneración de órganos y tejidos; y el anticuerpo multivalente de la presente invención puede unirse a esos dos o más antígenos o epítopos diferentes. Es decir, el anticuerpo multivalente de la presente invención puede unirse a dos antígenos diferentes o dos epítopos diferentes existentes en un antígeno. Además, debido a que el anticuerpo multivalente de la presente invención puede activar o inactivar el antígeno después de unirse al mismo, es posible seleccionar el antígeno adecuado para una enfermedad diana. En lo sucesivo en el presente documento, se ejemplificarán los antígenos que pueden ser una diana del anticuerpo multivalente de la presente invención. Sin embargo, los antígenos no se limitan a los mismos.

El antígeno en el que se induce la apoptosis mediante la unión del anticuerpo incluye un grupo de diferenciación (en lo sucesivo en el presente documento, "CD") 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80 (B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86 (B7.2), antígeno leucocitario humano (HLA) -Clase II, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y similares.

El antígeno que participa en la formación del estado patológico del tumor o el antígeno para el anticuerpo que regula la función inmunitaria incluye CD40, ligando de CD40, molécula de la familia B7 (CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, B7-H4), ligando de la molécula de la familia B7 (CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, BTLA), OX-40, ligando de OX-40, CD137, molécula de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (DR4, d R5, TNFR1, TNFR2), molécula de la familia de receptores de ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), familia de ^{receptores de la molécula de la familia TRAIL (TRAIL-R1, TRAIL-R}2^{, TRAIL-R3, TRAIL-R4), receptor activador del}ligando del factor nuclear kappa B (RANK), ligando de RANK, CD25, receptor de ácido fólico 4, citocina [IL-1a, II, -1p, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, factor de crecimiento transformante (TGF) p, TNFa, efe.], receptores de estas citocinas, quimiocina (SLC, ELC, 1-309, TARC, MDC, CTACK, efe.), receptores de estas quimiocinas, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), Angiopoyetina, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), EGF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), eritropoyetina (Ep O), TGFp, IL-8, Efilina, SDF-1 y receptores de ellos.

El antígeno implicado en la angiogénesis en la parte patológica y la regeneración de órganos o tejidos incluye el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetina, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), EGF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), eritropoyetina (EPO), TGFp, IL-8, Efilina, SDF-1, receptores de los mismos y similares.

En la presente invención, la activación efectora del anticuerpo multivalente se puede controlar como sigue.

La actividad efectora de un anticuerpo monoclonal obtenido mediante el método de la presente invención puede controlarse mediante diversos métodos. Por ejemplo, los métodos conocidos son un método para controlar una cantidad de fucosa (en lo sucesivo en el presente documento, también denominada "fucosa del núcleo") que se une a N-acetilglucosamina (GlcNAc) a través de un enlace a-1,6 en un extremo reductor de una cadena de azúcar ligada a N de tipo complejo que está unida a asparagina (Asn) en la posición 297 de una región Fc de un anticuerpo (documentos W o 2oo5/035586, WO2002/31140 y WO00/61739), un método para controlar una actividad efectora de un anticuerpo monoclonal modificando el o los grupos de aminoácidos de una región Fc (región constante que comprende los dominios CH2 y CH3) del anticuerpo y similares. La actividad efectora del anticuerpo multivalente de la presente invención puede controlarse utilizando cualquiera de los métodos.

La "actividad efectora" significa una actividad dependiente de anticuerpo que se induce a través de una región Fc de un anticuerpo. Como la actividad efectora, se conoce una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC, por sus siglas en inglés), una citotoxicidad dependiente del complemento (actividad CDC, por sus siglas en inglés), una fagocitosis dependiente de anticuerpos (actividad ADP, por sus siglas en inglés) por células fagocíticas tales como macrófagos o células dendríticas, y similares.

Además, controlando un contenido de fucosa del núcleo de una cadena de azúcar ligada a N de tipo complejo de Fc de un anticuerpo, se puede aumentar o disminuir la actividad efectora del anticuerpo multivalente. Como un método para reducir el contenido de fucosa que está unida a una cadena de azúcar ligada a N de tipo complejo unida a Fc del anticuerpo, se puede obtener un anticuerpo al que no se une la fucosa mediante la expresión de un anticuerpo utilizando una célula CHO que es deficiente en un gen que codifica la a1,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo al que no se une la fucosa tiene una alta actividad ADCC. Por otro lado, como un método para aumentar el contenido de fucosa que está unida a una cadena de azúcar ligada a N de tipo complejo unida a Fc del anticuerpo multivalente, se puede obtener un anticuerpo multivalente al que se une la fucosa mediante la expresión de un anticuerpo utilizando una célula hospedadora en la que se introduce un gen que codifica la a1,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo al que se une la fucosa tiene una actividad ADCC menor que un anticuerpo al que no se une la fucosa.

Además, modificando los restos de aminoácidos en una región Fc de un anticuerpo multivalente, la actividad ADCC o la actividad CDC se puede aumentar o disminuir. Por ejemplo, la actividad CDC a un anticuerpo multivalente se puede incrementar utilizando la secuencia de aminoácidos de la región Fc descrita en el documento US2007/0148165. Además, la actividad ADCC o la actividad CDC puede aumentarse o disminuirse modificando el aminoácido como se describe en las Patentes de EE.UU. números 6.737.056, 7.297.775 o 7.317.091.

Por otra parte, es posible obtener un anticuerpo multivalente, en el que la activación efectora del anticuerpo multivalente se controla aplicando los métodos mencionados anteriormente en combinación a un anticuerpo multivalente.

En una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo multivalente de la presente invención, resulta más fácil cambiar la secuencia de la región variable de cadena pesada y el enlazador de diversas formas introduciendo un sitio de enzimas de restricción entre la región variable de cadena pesada y el enlazador.

La estabilidad del anticuerpo multivalente de la presente invención puede evaluarse midiendo una cantidad de agregado (oligómero) formado en la muestra que está en el proceso de purificación o conservado en condiciones con stantes. Es decir, cuando la cantidad de agregado se reduce en las mismas condiciones, se determina que se mejora la estabilidad del anticuerpo. La cantidad de agregado se puede medir separando el anticuerpo agregado del anticuerpo que no se ha agregado, utilizando un método de cromatografía apropiado que incluye cromatografía de filtración en gel. El método para medir la cantidad de agregado se ejemplificará en el Ejemplo 18.

La productividad del anticuerpo multivalente de la presente invención puede evaluarse midiendo una cantidad del anticuerpo en el medio de cultivo producido a partir de una célula productora de anticuerpos. De manera más específica, la productividad se puede evaluar midiendo la cantidad de anticuerpo que se encuentra en el sobrenadante del cultivo que se ha obtenido eliminando las células productoras del medio de cultivo utilizando un método apropiado, tal como un método de HPLC y un método de ELISA. El método de medir la productividad se ejemplificará en el Ejemplo 17.

Con respecto al anticuerpo de la presente invención, es posible determinar el animal de origen a usar para la región variable y la región constante de la cadena pesada y la cadena ligera dependiendo de los animales diana a usar y los fines del uso. Por ejemplo, cuando un animal diana es un ser humano, es posible seleccionar el origen humano o el origen de ratón para una región variable, origen humano para la región constante y origen humano para un enlazador.

En la presente memoria descriptiva, "animales" generalmente representa mamíferos, incluidos ser humano, mono, chimpancé, ratón, rata, ganado bovino, cerdo, cabra, oveja, camello, pájaro y similares.

Por otra parte, el anticuerpo de la presente invención puede modificarse químicamente. Ejemplos de la modificación incluyen pegilación, acetilación, amidación, fosforilación, glucosilación, y la modificación generalmente se puede realizar a través de un grupo funcional tal como un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo o similares. Como alternativa, el anticuerpo de la presente invención puede conjugarse con un material médico o de diagnóstico. El material médico o de diagnóstico no está particularmente limitado. Los ejemplos incluyen un péptido, un polipéptido, un ácido nucleico, una molécula pequeña, un elemento inorgánico, una molécula inorgánica, una molécula orgánica y similares. El material médico es un material que puede mostrar una eficacia terapéutica para un sitio diana en un cuerpo. Los ejemplos incluyen un agente contra el cáncer, un agente antivirus y similares. Los ejemplos del material de diagnóstico incluyen un radioisótopo. Pueden usarse para la conjugación un enlace covalente, enlace no covalente, sistema biotina/avidina (o estreptavidina) y similares. Como alternativa, el anticuerpo de la presente invención puede fijarse a una fase sólida (por ejemplo, resina, plástico, papel, metal) tal como una placa, una cuenta, una tira reactiva y una matriz.

En lo sucesivo en el presente documento, se hará una descripción detallada de un método para producir el anticuerpo multivalente. Sin embargo, el método para producir el anticuerpo no se limita al mismo.

(1) Método para Producir el Anticuerpo Monoclonal

En la presente invención, las siguientes etapas de preparación se incluyen en el proceso para producir el anticuerpo.

En concreto, (1) purificar el antígeno para usarlo como inmunógeno y/o producir una célula que exprese excesivamente el antígeno en la superficie celular, (2) inmunizar a un animal con el antígeno, seguido de la recogida de sangre para analizar el título de anticuerpos, determinar el momento para la enucleación de, por ejemplo, el bazo y preparar una célula productora de anticuerpos, (3) preparar una célula de mieloma (en lo sucesivo en el presente documento, denominada "mieloma"), (4) producir un hibridoma mediante la fusión celular entre la célula productora de anticuerpos y el mieloma, (5) seleccionar grupos de hibridomas que produzcan anticuerpos diana, (6) separación en clones unicelulares (clonación) y similares.

En lo sucesivo en el presente documento, el método para producir el anticuerpo monoclonal se describe en detalle en línea con las etapas mencionadas anteriormente. Sin embargo, el método para producir el anticuerpo no se limita al mismo, y también es posible usar una célula productora de anticuerpos distinta de las células esplénicas y un mieloma. Además, también es posible utilizar un anticuerpo derivado de suero animal.

(1-1) Purificación de Antígeno

Puede usarse una proteína antigénica tal cual, o puede usarse una proteína antigénica en forma de proteína de fusión fusionándola con otro polipéptido apropiado. Los ejemplos de la proteína de fusión incluyen una proteína de fusión de una región extracelular de la proteína antigénica con una región Fc de IgG humana o una glutatiónS-transferasa (GST). La proteína de fusión anterior se puede obtener preparando un vector de expresión para células animales que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de una región extracelular de antígeno con una región constante de IgG humana o una GST, introduciendo el vector de expresión en las células animales y purificando el sobrenadante del cultivo del transformante obtenido. Además, el propio antígeno purificado que se expresa en una membrana celular de una línea celular humana también se usa como antígeno.

(1-2) Etapa de preparación de la Célula Productora de Anticuerpos

El antígeno obtenido en (1-1) se mezcla con adyuvante de Freund completo o incompleto o un agente aditivo tal como sulfato de aluminio y potasio y se inmuniza con un animal experimental como inmunógeno. Como animal experimental, por ejemplo, se puede utilizar un ratón. Se usa más preferentemente un ratón transgénico que tiene la capacidad de producir un anticuerpo de origen humano, y dicho ratón se describe en la bibliografía por Tomizuka. et al. (Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97:722).

El método de administración del inmunógeno en el momento de la inmunización del ratón puede ser uno cualquiera seleccionado de inyección hipodérmica, inyección intraperitoneal, inyección intravenosa, inyección intradérmica, inyección intramuscular, inyección en las almohadillas de los pies y similares. Entre ellos, inyección intraperitoneal, preferentemente se usa inyección en la almohadilla plantar o inyección intravenosa.

La inmunización se puede realizar una vez o repetidamente en un intervalo apropiado (preferentemente en un intervalo de tres días a una semana). A partir de entonces, se mide el título de anticuerpos contra el antígeno en el suero del animal inmunizado. Si un animal cuyo título de antígenos se ha aumentado suficientemente se utiliza como fuente de suministro de la célula productora de anticuerpos, es posible potenciar la eficacia de las siguientes operaciones. En general, se usa preferentemente una célula productora de anticuerpos derivada de un animal después de tres a cinco días desde la última inmunización para la siguiente fusión celular.

Como método para medir el título de anticuerpos utilizado en este caso, se pueden utilizar varias técnicas conocidas tales como un método de radioinmunoensayo (en lo sucesivo en el presente documento, denominado "método RIA"), un método de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (en lo sucesivo en el presente documento denominado "método ELISA"), un método de anticuerpos de fluorescencia y un método de hemaglutinación pasiva.

Cuando se utiliza el método ELISA, el título de anticuerpos en la presente invención se puede medir mediante las siguientes etapas. En primer lugar, el antígeno purificado o parcialmente purificado se coloca en una superficie de fase sólida, tal como una placa de 96 pocillos, para que ELISA lo absorba, la superficie de la fase sólida a la que no se absorbe el antígeno está cubierta de proteína que no tiene relación con el antígeno, tal como albúmina de suero bovino (en lo sucesivo en el presente documento, denominada "BSA"), la superficie se lava y después se deja entrar en contacto con una muestra (por ejemplo, un suero de ratón) como anticuerpo primario que se ha diluido en serie, y después el anticuerpo de la muestra se une al antígeno. Adicionalmente, el título de anticuerpos se calcula añadiendo un anticuerpo marcado con enzimas contra un anticuerpo humano como anticuerpo secundario para unirse al anticuerpo humano. Después de lavar el objeto resultante, se añade un sustrato de la enzima para medir la variación de la absorbancia debida al cromógeno provocada por la degradación del sustrato.

(1-3) Preparación de células de mieloma

Como mieloma, se puede usar una célula que procede de un ratón, una rata, una cobaya, un hámster, un conejo, un ser humano o similares y no tiene la capacidad de producir autoanticuerpos. En general, como células de mieloma, se puede utilizar una línea celular obtenida de ratón. Los ejemplos incluyen la línea celular de mieloma de ratón resistente a 8-azaguanina (derivada de ratón BALB/c) P3X63Ag8U.1 (P3-U1) [Yelton D.E. et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3/NS1/1-Ag4-1(NS-1) [Kohler G et al., European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)], Sp2/0-Ag14 (SP-2) [Shulman M. et al., Nature, 276, 269-270 (1978)], P3X63Ag8.653 (653) [Kearney J.F. et al., J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)], P3X63Ag8 (X63) [Horibata K. y Harris A.W. et al., Nature, 256, 495-497 (1975)] y similares. Estas líneas celulares se subcultivan en un medio apropiado, tal como un medio con 8-azaguanina [un medio en el que se añade 8-azaguanina al medio RPMI-1640 que contiene glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina y suero fetal de ternera (en lo sucesivo en el presente documento, denominado FCS)], Medio de Dulbecco modificado de Iscove (en lo sucesivo en el presente documento, denominado IMDM) y Medio Eagle modificado de Dulbecco (en lo sucesivo en el presente documento, denominado DMEM), y se subcultivan en el medio normal (por ejemplo, DMEM que incluye FCS al 10 %) 3 o 4 días antes de la fusión celular para garantizar el número de células de 2x 107 o más en el día de la fusión.

(1-4) Fusión celular

La célula productora de anticuerpos es una célula plasmática o un linfocito que es un precursor de la misma y puede obtenerse de cualquier parte del individuo. En general, la célula productora de anticuerpos se puede obtener del bazo, ganglio linfático, médula ósea, amígdalas, sangre periférica o una combinación de los mismos. La célula esplénica es la más utilizada.

Después de la última inmunización, una parte en la que existen las células productoras de anticuerpos, por ejemplo, el bazo, se escinde del animal experimental (por ejemplo, un ratón) en el que se ha alcanzado un título de anticuerpos predeterminado, y se preparan células esplénicas como células productoras de anticuerpos. El método más utilizado para fusionar estas células esplénicas con el mieloma obtenido en la etapa (3) es un método que utiliza polietilenglicol, ya que provoca una citotoxicidad celular relativamente baja y las operaciones de fusión son fáciles. Por ejemplo, este método incluye las siguientes etapas.

Las células esplénicas y el mieloma se lavan suficientemente con medio de cultivo sin suero (por ejemplo, DMEM) o solución salina tamponada con fosfato (en lo sucesivo en el presente documento denominado, "tampón fosfato") y se mezclan para dar una relación de las células esplénicas: las células de mieloma = 5:1 a 10:1, seguido por centrifugación. Después de eliminar el sobrenadante, el grupo celular depositado está suficientemente suelto. Después, el medio de cultivo sin suero que contiene 1 ml de polietilenglicol al 50 % (p/v) (peso molecular: 1000 a 4000) se deja caer sobre el mismo mientras se agita el objeto resultante. A partir de entonces, se añaden lentamente 10 ml de medio de cultivo sin suero y después se centrifuga la mezcla resultante. El sobrenadante se retira nuevamente, las células depositadas se suspenden en una cantidad apropiada de medio de cultivo normal (en lo sucesivo en el presente documento, denominado "medio de cultivo HAT") que contiene una solución de hipoxantina aminopterina timidina (en lo sucesivo en el presente documento, denominada "HAT") e interleucina-2 humana (en lo sucesivo en el presente documento, denominada "IL-2") y se distribuyen en los pocillos correspondientes de una placa de cultivo (en lo sucesivo en el presente documento, denominada "placa") para cultivar a 37 °C en dióxido de carbono al 5 % durante aproximadamente dos semanas. El medio de cultivo HAT se complementa adecuadamente durante el cultivo.

(1-5) Grupo de Hibridoma de Selección

Cuando las células de mieloma mencionadas anteriormente son una línea resistente a la 8-azaguanina, en concreto, las células de mieloma son una línea celular deficiente en hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT), las células de mieloma no fusionadas y las células de fusión entre las células de mieloma no pueden existir en el medio de cultivo que contiene HAT. Por consiguiente, es posible seleccionar el hibridoma continuando el cultivo dentro del medio de cultivo que contiene HAT.

El medio de cultivo en el que se cultiva el hibridoma en forma de colonia se cambia del medio de cultivo HAT a un medio de cultivo del que se elimina la aminopterina (en lo sucesivo en el presente documento, denominado "medio de cultivo HT"). A partir de entonces, se recoge una parte del sobrenadante del cultivo y se mide el título de anticuerpos mediante el método ELISA.

Como se describe anteriormente, aunque se ejemplifica el método de usar la línea celular resistente a la 8-azaguanina, se pueden usar otras líneas celulares dependiendo del método de selección del hibridoma.

(2) Método para Producir el Anticuerpo Multivalente

En la presente invención, el anticuerpo multivalente se puede preparar, por ejemplo, clonando genes de múltiples anticuerpos monoclonales contra diferentes epítopos que se expresan a partir del hibridoma obtenido como se describe anteriormente, determinando los sitios de reconocimiento de antígenos y diseñando un gen del anticuerpo multivalente que contiene los sitios de reconocimiento de antígenos obtenidos. De manera más específica, la secuencia de nucleótidos del anticuerpo multivalente que comprende los sitios de reconocimiento de antígenos obtenidos y el enlazador se combinan de manera apropiada, se sintetiza e incorpora en un plásmido de expresión.

En la realización de la presente invención, un enlazador más preferente es un enlazador que consiste en CH1 de una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano. En la Fig. 1 se muestra un enlazador que comprende CH1 tal como un enlazador constituido por CH1-bisagra-CH2-CH3, pero no pertenece a la presente invención. En algunas realizaciones que no pertenecen a la invención, el primer enlazador tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 77, y el último enlazador tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 99.

Además, ejemplos del plásmido de expresión incluyen pTracer-CMV/Bsd, pTracer-EF/Bsd, pTracer-SV40 (Invitrogen de Life Technologies Corporation) y similares.

El plásmido de expresión se introduce en una célula productora apropiada (por ejemplo, células animales tales como células CHO) y el transformante obtenido se cultiva como células productoras de anticuerpos multivalentes. El anticuerpo multivalente se puede purificar del medio de cultivo. En lo sucesivo en el presente documento, se hará una descripción detallada de un método para producir el anticuerpo multivalente. Sin embargo, el método de producción del anticuerpo multivalente no se limita a la siguiente descripción. Los ejemplos de un método para producir el anticuerpo multivalente incluyen un método en el que el plásmido de expresión se expresa en un animal para expresar el anticuerpo multivalente en el suero o la leche del animal, un método en el que el anticuerpo multivalente se produce sintetizando químicamente un péptido o similares.

(2-1) Clonación de Hibridoma

El hibridoma, que se ha demostrado que prepara un anticuerpo específico midiendo el título del anticuerpo de la misma manera que se describe en (1-2), se mueve a otra placa para realizar la clonación. Los ejemplos del método de clonación incluyen un método de dilución limitante en el que un hibridoma se diluye y se cultiva de manera que un hibridoma se encuentre en un pocillo de la placa, un método de agar blando en el que se cultiva un hibridoma en un medio de cultivo de agar blando para recoger la colonia, un método para recoger cada una de las células por separado utilizando un micromanipulador para cultivar las células, un "clon clasificador" en el que una célula se separa utilizando un clasificador de células, y similares. Sin embargo, el método de dilución limitante es un método simple y de uso frecuente.

La clonación utilizando, por ejemplo, el método de dilución limitante, se realiza de manera repetida de 2 a 4 veces en el pocillo en el que se ha observado el título de anticuerpos, y la célula en la que se observa continuamente el título de anticuerpos se selecciona como un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales.

(2-2) Célula Productora de Anticuerpos

Se clona un gen que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo a partir de las células productoras de anticuerpos, tal como el hibridoma, que produce el anticuerpo para cada antígeno. Cuando se prepara un anticuerpo multivalente utilizando una única cadena ligera, se selecciona una cadena pesada de anticuerpo optimizada para la única cadena ligera realizando una exploración tal como el método de presentación en fagos de modo que la región variable del anticuerpo comprendida en el anticuerpo multivalente reaccione con un antígeno específico. Una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada seleccionada se une con la secuencia del enlazador del dominio de inmunoglobulina o el fragmento del mismo utilizado en el anticuerpo multivalente de la presente invención y, por lo tanto, se prepara la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada del anticuerpo multivalente. La secuencia de nucleótidos así preparada que codifica la cadena pesada del anticuerpo multivalente y una secuencia de nucleótidos que codifica la única cadena ligera se insertan en un vector de expresión de proteínas apropiado para preparar un vector de expresión del anticuerpo multivalente. Por otro lado, cuando se utilizan múltiples cadenas ligeras que son diferentes para cada antígeno, la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo múltiple está unida mediante la secuencia del enlazador para el dominio de inmunoglobulina o el fragmento del mismo usado para el anticuerpo multivalente de la presente invención para preparar la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada del anticuerpo multivalente. Las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo multivalente pueden insertarse en un único vector de expresión como un vector de expresión del anticuerpo multivalente de tipo tándem, o pueden insertarse en diferentes vectores de expresión como un tipo separado de vector de expresión del anticuerpo multivalente. Después, el vector de expresión del anticuerpo multivalente preparado se introduce en un hospedador (por ejemplo, células de mamífero, Escherichia coli, células de levadura, células de insecto, células vegetales, o similares) y, por lo tanto, se puede preparar un anticuerpo recombinante preparado utilizando una tecnología recombinante (P. J. Deives., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY; P. Shepherd y C. Dean. Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W.Goding, Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Ejemplos del vector incluyen fago, plásmido, un virus, un cromosoma artificial y similares, que puede reproducirse de forma autónoma en el hospedador. Los ejemplos del ADN plasmídico incluyen plásmidos derivados de Escherichia coli, Bacillus subtilis, u origen de levadura y similares. Los ejemplos del ADN del fago incluyen el fago A, fago T7, fago M13 y similares. Los ejemplos del vector de virus incluyen adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, lentivirus y similares. Los ejemplos del cromosoma artificial incluyen un cromosoma artificial de mamífero (MAC, por su siglas en inglés) que incluye un cromosoma artificial humano (HAC, por su siglas en inglés), un cromosoma artificial de levadura (YAC, por sus siglas en inglés), un cromosoma artificial bacteriano (tal como BAC, PAC, por sus siglas en inglés) y similares.

El hospedador que se utilizará para la transformación no está particularmente limitado siempre que pueda expresar un gen diana. Los ejemplos del hospedador incluyen bacterias (Escherichia coli, Bacillus subtilis o similares), levaduras, células animales (tal como células COS, células CHO), células de insectos y similares.

Se conoce el método de introducir un gen en el hospedador. Se puede usar un método arbitrario (tal como un método que utiliza iones de calcio, un método de electroporación, un método de esferoplasto, un método de acetato de litio, un método de fosfato de calcio, un método de lipofección).

El transformante que contiene el gen que codifica el anticuerpo multivalente de la presente invención es una célula.

El anticuerpo multivalente se puede producir sintetizando un gen que codifica un anticuerpo multivalente en el que se combinan de forma apropiada múltiples sitios de reconocimiento de antígenos y un enlazador e incorporan el gen en un plásmido de expresión apropiado. El sitio de reconocimiento de antígenos se puede obtener especificando y separando el sitio de reconocimiento de antígenos apropiado utilizando una técnica tal como un método de presentación en fagos, una presentación en levaduras o similares, así como el método mencionado anteriormente utilizando el hibridoma (Emmanuelle Laffy et al., Human Antibodies 14, 33-55, 2005).

(2-3) Expresión y Purificación de Anticuerpo Multivalente

De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo multivalente puede obtenerse cultivando el transformante y recogiéndolo del cultivo del mismo. El "cultivo" significa todo (a) el sobrenadante del cultivo, (b) células de cultivo, cuerpos bacterianos de cultivo, o fragmentos de los mismos, y (c) las secreciones del transformante. Cuando se cultiva el transformante, se selecciona un medio de cultivo adecuado para el hospedador que se va a utilizar y se aplica un método de cultivo estacionario, un método de cultivo utilizando un frasco rotatorio o similares.

Cuando la proteína dirigida se produce en un cuerpo bacteriano o en una célula después del cultivo, el anticuerpo se recoge alterando el cuerpo bacteriano o la célula. Cuando el anticuerpo dirigido se produce fuera del cuerpo bacteriano o de la célula, la solución de cultivo se usa tal cual o después de eliminar los cuerpos bacterianos o las células mediante centrifugación o similares. A partir de entonces, el anticuerpo dirigido puede aislarse y purificarse del cultivo utilizando un solo método bioquímico general o una combinación apropiada de métodos bioquímicos generales por medio de diversos tipos de cromatografía usados para el aislamiento y purificación de proteínas.

(3) Método para Determinar el Sitio de Reconocimiento de Antígenos

La identificación del epítopo de reconocimiento del anticuerpo monoclonal se puede realizar como sigue. En primer lugar, se producen diversas estructuras parciales de una molécula a reconocer por el anticuerpo monoclonal. Al producir las estructuras parciales, se puede usar un método tal como un método para producir diversos péptidos parciales de la molécula utilizando un método conocido de síntesis de oligopéptidos, un método para producir el péptido parcial dirigido dentro y fuera del hospedador, tal como Escherichia coli mediante la incorporación de la secuencia de nucleótidos que codifica los péptidos parciales dirigidos en un plásmido de expresión adecuado utilizando una tecnología de recombinación. Sin embargo, ambos métodos se combinan generalmente para su uso con el fin anterior. Por ejemplo, después de preparar una serie de polipéptidos que se acortan secuencialmente para tener una longitud adecuada desde el extremo C o el extremo N de la proteína antigénica, utilizando la tecnología de recombinación conocida por los expertos en la materia, se examina la reactividad del anticuerpo monoclonal contra la serie de polipéptidos para determinar de forma aproximada el sitio de reconocimiento.

A partir de entonces, se sintetizan adicionalmente diversos oligopéptidos, mutante de los mismos o similar en la parte correspondiente utilizando una técnica de síntesis de oligopéptidos conocida por los expertos en la materia. Después, el epítopo puede confinarse examinando la propiedad de unión del anticuerpo monoclonal que se encuentra en un agente preventivo o el agente terapéutico de la presente invención como ingrediente eficaz contra esos péptidos o examinando una actividad inhibidora competitiva del péptido sobre la unión del anticuerpo monoclonal y el antígeno. Como método simple para obtener diversos oligopéptidos, se puede utilizar un kit disponible comercialmente (tal como el kit SPOTs (fabricado por Genosys Biotechnologies, Inc.), o una serie de kit de síntesis de péptidos en multipines utilizando un método de síntesis en multipines (fabricado por Chiron Corporation), o similares).

(4) Método de Prueba de Unión al Antígeno

En la presente invención, la prueba para determinar la unión del anticuerpo al antígeno se puede realizar utilizando análisis por medio de una citometría de flujo con células que expresan antígenos y un método de detección utilizando una resonancia de plasmón superficial utilizando un antígeno soluble, así como con el método ELISA utilizando el antígeno soluble descrito en el Ejemplo 19.

Ejemplos

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle con Ejemplos del anticuerpo multivalente. Sin embargo, No hace falta decir que la presente invención no se limita a estos Ejemplos.

Además, los anticuerpos de animales tales como ser humano y ratón y las secuencias de los genes de los mismos pueden usarse en los registrados en un banco de genes tal como GenBank.

Ejemplo 1

Preparación del Primer Sitio de Reconocimiento de Antígenos

Para obtener un primer sitio de reconocimiento de antígenos, se utilizó el anticuerpo anti-CD40 divulgado en el documento WO02/088186. De manera específica, se utilizó una cadena ligera y una cadena pesada del anticuerpo (en lo sucesivo en el presente documento, denominado simplemente 341-1-19) producido por el hibridoma KM341-1-19 (Número de registro BP-7759). El hibridoma KM341-1-19 se ha depositado en el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositario del Organismo Internacional de Patentes (AIST Tsukuba Central 6, 1 1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566 Japón).

Cada una de la secuencia de ADN de longitud completa (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la cadena pesada de 341-1-19, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región variable de cadena ligera 341-1-19 se muestra en el Listado de Secuencias.

El sitio de inicio de la traducción de la secuencia de nucleótidos de cadena pesada es el codón ATG que comienza con adenina (A) en la posición 50 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 1, y el codón de terminación es TGA que comienza con timina (T) en la posición 1472. El límite entre la región variable y la región constante del anticuerpo se coloca entre la adenina (A) en la posición 493 desde el extremo 5' y la guanina (G) en la posición 494. En la secuencia de aminoácidos de cadena pesada, la región variable de la cadena H es desde el extremo N de la SEQ ID NO: 2 hasta el resto de serina (S) en la posición 148, y la región constante es desde la alanina (A) en la posición 149. Se estimó que la secuencia señal de la cadena H era desde el extremo N de la SEQ ID NO: 2 hasta la serina (S) en la posición 20 mediante el programa informático de estimación de secuencias génicas (Signal P ver. 2). Se considera que el extremo N de la proteína madura es glutamina (Q) en la posición 21 de la SEQ ID NO: 2.

El sitio de inicio de la traducción de la secuencia de nucleótidos de cadena ligera es el codón ATG que comienza con A en la posición 29 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 3, y la región variable es desde el extremo 5' hasta la adenina (A) en la posición 400. En la secuencia de aminoácidos, la región variable es desde el extremo N de la SEQ ID NO: 4 hasta la lisina (K) en la posición 124. Se hizo evidente a partir del análisis en el extremo N de la proteína de la cadena L purificada que la secuencia señal de la cadena L es del extremo N hasta la glicina (G) en la posición 20 en la SEQ ID NO:4 y que el extremo N de la proteína madura era ácido glutámico (E) en la posición 21 en la SEQ ID NO: 4.

Ejemplo 2

Inmunización para obtener un Segundo Sitio de Reconocimiento de Antígenos

Para obtener un segundo sitio de reconocimiento de antígenos, se obtuvo un anticuerpo anti-CD28 humano.

La inmunización para obtener el anticuerpo anti-CD28 se realizó de acuerdo con el método del documento WO02/088186 que es el método para obtener el anticuerpo anti-CD40 mencionado anteriormente. Se mezclaron quimera CD28/Fc humana recombinante (fabricada por R&D system) y EMULSION MPL+TDM (RiBi, fabricada por Sigma-Aldrich, Inc) en una relación de 1:1 para inmunizar un ratón en su cavidad abdominal derecha a 40 pg/ratón. La inmunización se realizó tres veces cada 14 días. Además, el ratón se inmunizó con el mismo antígeno tres días antes de recoger el bazo.

Ejemplo 3

Preparación de la biblioteca de scFV de anticuerpo anti-CD28 que comprende la misma cadena ligera que la del anticuerpo anti-CD40

Para realizar la exploración de un anticuerpo anti-CD28 que comprende la misma cadena ligera que la del anticuerpo anti-CD40341-1-19 del Ejemplo 1, se produjo una biblioteca de un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFV) en el que un fragmento génico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD28 se une a un fragmento génico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CD28, utilizando el bazo del ratón que se inmunizó con CD28 producido en el Ejemplo 2.

El bazo se extirpó quirúrgicamente del ratón inmunizado, se le añadieron 3 ml de reactivo TRIzol (fabricado por Invitrogen por Life Technologies Corporation), y después los tejidos se picaron con Polytron. El ARN total se extrajo de la solución después de picar de acuerdo con el folleto explicativo adjunto. Después, el ADNc se sintetizó mediante el sistema de síntesis Super Script III First-Stand (fabricado por Invitrogen por Life Technologies Corporation) utilizando el ARNm que se purificó del ARN total con el kit de purificación de ARNm oligotex-dT30 (fabricado por Takara Bio Inc) como plantilla. Además, en la síntesis de ADNc, como cebadores se utilizaron hexámeros aleatorios incluidos en el kit.

Después, la PCR se realizó utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd.) repitiendo 35 ciclos de una reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 58 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 1 minuto como un ciclo para amplificar un fragmento génico de la región variable de cadena pesada de 341-1-19 en el que la secuencia Sfil se añadió al extremo 5' y una secuencia rica en glicina se añadió al extremo 3' mientras se usaba la cadena pesada (SEQ ID NO: 1) de 341-1-19 como plantilla y 5'-GCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG-3' (SEQ ID NO: 5) y 5'-CCGAGGCGCGCCCACCGCTGCCACCGCCTCCTGAGGAGACGGTGACCGT-3' (SEQ ID NO: 6) como cebadores, y para amplificar un fragmento génico de la región variable de cadena ligera de 341-1-19 en el que se añadió una secuencia rica en glicina al extremo 5' y se añadió una secuencia Notl se añadió al extremo 3' mientras se usaba la cadena ligera de 341-1-19 (SEQ ID NO: 3) como plantilla y el 5'-CGGTGGGCGCGCCTCGGGCGGAGGTGGTTCAGAAATTGTGTTGACACAG-3' (SEQ ID NO: 7) y 5'-CATTCTCGAGTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTC-3' (SEQ ID NO: 8) como cebadores, respectivamente. Las secuencias ricas en glicina utilizadas en la presente invención se muestran como las SEQ ID NO: 9 y 10. EL sitio de restricción ^scI se insertó en esta secuencia rica en glicina. Los fragmentos de genes VH y VL así obtenidos se unieron entre sí mediante PCR de extensión solapada utilizando la secuencia rica en glicina que se añadió mediante PCR, para obtener el fragmento génico de 341-1-19 scFv. Este fragmento génico se digirió con Sfil y Notl y se insertó en un vector pCANTAB5E (fabricado por GE Healthcare Bio-sciences Ltd) que se había digerido de antemano con Sfil y Notl. El plásmido obtenido se denominó pCANTAB5E/341-1-19. Debido a que el fin de la presente invención es obtener un anticuerpo para un antígeno de CD28 humano que comprende la misma secuencia de aminoácidos que la de la cadena ligera de 341-1-19, este plásmido se digirió con Sfil y ^scI (para eliminar la región del gen que codifica VH de 341-1-19), y después, el gen del vector que se había desfosforilado con fosfatasa alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) para usarlo como vector productor de bibliotecas.

El fragmento génico de la región variable de cadena pesada para producir una biblioteca de fagos de anticuerpos se preparó utilizando ADNc derivado del bazo de ratones inmunizados como plantilla. Como una primera etapa, la PCR se realizó repitiendo 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 58 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando ADNc como plantilla y utilizando un cebador (uno de las SEQ ID NO: 11 a 35) específico para la región señal de la cadena pesada humana y un cebador (SEQ ID NO: 36) específico para la región constante de IgG, y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Como segunda etapa, la PCR se realizó repitiendo 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 58 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando estos productos de PCR como plantillas, utilizando un cebador (una de las SEQ ID NO: 37 a 56) específico para la región variable de cadena pesada humana y un cebador (una de las SEQ ID NO: 57 a 61) específico para la región de unión, y utilizando ADN polimerasa (KOD- Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Además, el cebador específico para la región variable se seleccionó de acuerdo con el cebador específico para la región variable y se usó en la PCR en la primera etapa, y se mezclaron 5 tipos de cebadores específicos para la región de unión (la combinación de los cebadores específicos para la región variable y los productos de la PCR en la primera etapa se muestran en la Tabla 1) y se usaron para el cebador. Además, el sitio de restricción de Sfil se insertó en el extremo 5' de cada secuencia de nucleótidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 37 a 56, y el sitio de restricción de ^scI y la secuencia del enlazador se insertaron en el extremo 5' de cada secuencia de nucleótidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 57 a 61.

(continuación)

Los fragmentos génicos de VH amplificados por PCR se mezclaron, se digirieron con Sfil y ^scyo, y después se insertaron en el vector productor de bibliotecas realizando la reacción a 16 °C durante la noche utilizando un kit de ligadura de ADN (fabricado por Takara Bio Inc). Esta solución de unión se introdujo en células competentes para electroporación TG1 (fabricadas por SRATAGENE) mediante electroporación. La Escherichia coli transformada se sometió a cultivo con agitación a 3o °C durante una hora en medio de cultivo 2*YTAG (que se preparó disolviendo 17 g de Bactro-triptona, 10 g de extracto de levadura Bact y 5 g de NaCl con agua destilada para alcanzar 1 l, y después se esterilizó en autoclave seguido de la adición de 100 pg/ml de ampicilina y glucosa al 2 % al mismo), después se sembró en una placa de medio de cultivo SOBAG (que se preparó disolviendo 20 g de Bactro-triptona, 5 g de extracto de levadura Bact, 15 g de Bacto-agar, 0,5 g de NaCl en 900 ml de agua destilada, después se esterilizó en autoclave seguido de enfriamiento de 50 a 60 °C para añadir 10 ml de MgCh 1 M estéril, 55,6 ml de glucosa 2 M esterilizada y ampicilina) preparadas utilizando una placa convencional (150*15 mm, fabricada por Becton, Dickinson and Company) y después se incubó a 30 °C durante la noche. Se recogieron las colonias que crecieron en el medio de cultivo (se recogieron las colonias de 3 ml de medio de cultivo 2*YTAG por placa) como la biblioteca de anticuerpos scFv. En este ejemplo, se recogieron aproximadamente 5*105 colonias para producir la biblioteca.

La biblioteca de anticuerpos scFv (100 pl) se sometió a cultivo con agitación en medio de cultivo 2*YTAG (50 ml) a 30 °C hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó de 0,3 a 0,5. Esta solución de cultivo se infectó con el fago auxiliar M13KO a una MOI de 10 a 20 (sometida a cultivo con agitación a 30 °C durante 1 hora), después se cambió el medio de cultivo a 2*YTAK (que se preparó disolviendo 17 g de Bacto -triptona, 10 g de extracto de levadura Bact y 5 g de NaCl con agua destilada a 1 l y después se esterilizó en autoclave seguido de la adición de 100 pg/ml de ampicilina y 50 pg/ml de kanamicina), y después el resultante se sometió a cultivo con agitación a 30 °C durante la noche. El sobrenadante del cultivo se utilizó como biblioteca de fagos de anticuerpos. La biblioteca de fagos de anticuerpos se precipitó con PEG (preparado añadiendo agua destilada a 200 g de polietilenglicol 8000 y 146,1 g de NaCl para disolverlos en 1 l, seguido de esterilización en autoclave) y la solución se sustituyó por 3 ml de PBS (-).

Ejemplo 4

Preparación del Antígeno CD28 Humano

El CD28 humano (SEQ ID NO: 62) se amplificó realizando 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 1 minuto como un ciclo utilizando ADNc de Human Spleen Marathon Ready (Clontech Laboratories Inc) como plantilla y 5'-ATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTC-3'(SEQ ID NO: 63) y 5'-TCAGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGCG-3' (SEQ ID NO: 64) como cebadores, y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El vector de expresión de la proteína de fusión Fc (CD28-FC) del dominio extracelular de CD28 humano (SEQ ID NO: 65) con IgG se preparó utilizando el fragmento génico anterior como plantilla. Se obtuvo el fragmento génico de la región extracelular de CD28 humano y se realizó PCR para añadir la secuencia Kpnl al extremo 5' y una secuencia Xbal al extremo 3', respectivamente. En la práctica, la PCR se realizó repitiendo 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando el ADNc de CD28 humano como plantilla, 5'-GGGGGTACCATGCTCAGGCTGCTCTTGGCTC-3' (SEQ ID NO: 66) y 5'-GGGTCTAGACCAAAAGGGCTTAGAAGGTCCG-3' (SEQ iD NO: 67) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El fragmento génico amplificado por esta PCR se digirió con Kpnl y Xbaly se insertó en pTracer-CMV/Zeo (Invitrogen de Life Technologies Corporation) en el que se insertó previamente la región Fc de IgG humana. El plásmido así obtenido se denominó pTracer/hECD28-Fc.

El plásmido del vector de expresión preparado se obtuvo utilizando Nucleobomd PC2000EF (fabricado por Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG) y se introdujo en células 293 no adherentes utilizando el sistema de expresión FreeStyle™ 293 (Invitrogen de Life Technologies Corporation) y, por lo tanto, el sobrenadante de cultivo que contenía cada anticuerpo se obtuvo por expresión transitoria. El sobrenadante del cultivo se recogió después de 7 días desde la introducción del vector y se filtró con un filtro de membrana (fabricado por Millipore Corporation) que tenía un diámetro de poro de 0,22 pm. Este sobrenadante de cultivo se cargó en una columna de afinidad de purificación de anticuerpos, HiTrap rProtein A FF (volumen de columna 1 ml) (fabricada por GE Healthcare Bio-sciences Ltd), lavado con PBS (-), se eluyó con tampón de citrato de sodio 20 mM y tampón de NaCl 50 mM (pH 2,7), y la solución eluida se recogió en un tubo con tampón de fosfato de sodio 200 mM (pH 7,0). A partir de entonces, la solución obtenida se cargó con la columna en la que se unió Q-Sepharose (Hitrap Q HP, fabricada por GE Healthcare Bio-sciences Ltd) con SP-Sepharose (HiTrap SP FF, fabricada por GE Healthcare Biosciences Ltd) para absorberse en las columnas y se lavó con tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 5,0) para eluir con tampón 1 xPBS. El eluato se filtró y esterilizó con un filtro de membrana que tenía un diámetro de poro de 0,22 pm (Millex-GV, fabricado por Millipore Corporation), y de ese modo se obtuvo la proteína de fusión Fc recombinante. La concentración de la proteína de fusión CD28-Fc humana purificada se calculó utilizando la absorbancia a 280 nm.

Ejemplo 5

Concentración de fago que presenta el anticuerpo scFv que reconoce CD28 humano

La proteína de fusión CD28 humano-Fc se preparó para dar una concentración de 10 pg/ml con tampón de recubrimiento (tampón de carbonato 50 mM, pH 9), después se añadió al tubo Maxisorp Inmuno (tipo tubo en estrella, fabricado por Nalge Nunc International) y se incubó a 4 °C durante la noche para inmovilizarla. Después, al tubo, se añadieron 500 ml de reactivo de bloqueo (Tampón de Bloqueo SuperBlock (marca registrada), fabricado por Pierce Protein Research) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, para bloquearla. El tubo resultante se lavó tres veces con tampón de lavado (Tween20-TBS al 0,1 %). La biblioteca de fagos de anticuerpos se incubó con 2 ml de block Ace (fabricado por Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd) a temperatura ambiente durante 2 horas. La biblioteca de fagos de anticuerpos obtenida se añadió al tubo lavado y después se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. El tubo resultante se lavó 10 veces con tampón de lavado y después se eluyó con una solución de Glicina-HCl 0,1 M (pH 2,2). Después, a la solución eluida, se añadió una solución de base Tris 2 M para la neutralización. El fago así eluido se infectó de nuevo con TG1 y el TG1 infectado se sembró en la placa de medio de cultivo 2xYTAG seguido de incubación a 30 °C durante la noche. Las colonias que crecieron en el medio de cultivo se recuperaron nuevamente para realizar una selección un total de tres veces de acuerdo con el método anterior.

Ejemplo 6

Selección del Fago de Presentación de Anticuerpo que Reconoce CD28 Humano y Producción de Anticuerpo anti-CD28 (341VL34 y 341VL36)

Cada colonia obtenida de la biblioteca de anticuerpos a la que se había aplicado la selección se sembró en 200 pl de medio de cultivo 2*YTAG y se sometió a un cultivo con agitación a 30 °C durante 4 a 5 horas. Después, se añadieron 200 pl de 1 x1010 ufp/ml de fago auxiliar M13KO a la solución de cultivo para la infección (el cultivo con agitación a 30 °C durante 1 hora). Después de cambiar el medio de cultivo a 2xYTAK, el cultivo con agitación se realizó a 30 °C durante la noche. La propiedad de unión al antígeno se examinó mediante las siguientes etapas (ELISA) utilizando este sobrenadante de cultivo como una solución de fagos.

La proteína de fusión CD28 humano-Fc se diluyó con tampón de recubrimiento (tampón de carbonato 50 mM, pH 9) para dar una concentración de 2 pg/ml. La solución obtenida se puso en la placa Maxisorp (fabricada por Nalge Nunc International) a 50 pl/pocillo y se incubó a 4 °C durante la noche para inmovilizarla. Después, al pocillo, se añadieron 200 pl/pocillo de reactivo de bloqueo (Tampón de Bloqueo SuperBlock (marca registrada), fabricado por Pierce Protein Research), el objeto resultante se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos para completar el bloqueo. Al pocillo, se añadieron 50 pl/pocillo de cada solución de fagos y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocilio se lavó tres veces con tampón de Lavado (Tween20-TBS al 0,1 %). Después de diluir el conjugado HRP/Anti etiqueta E (fabricado por GE Healthcare Bio-sciences Ltd) con diluyente de ensayo (Tween20-TBS al 0,1 % que contiene 10% Block Ace fabricado por Dainippon Sumitomo Pharma Co.Ltd), Se añadieron 50 pl/pocillo del conjugado HRP/Anti etiqueta E diluido a cada pocillo seguido de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar cada pocillo tres veces con tampón de lavado, se añadieron 50 pl de solución de sustrato cromogénico TMB (fabricado por Dako) a cada pocillo y se incubaron en una habitación oscura a temperatura ambiente. Después de desarrollar el color, se añadió vitriol 0,5 M (50 pl/pocillo) para detener la reacción. La absorbancia a la longitud de onda de 450 nm se midió con un lector de microplacas (SPECTRAMAX190, fabricado por Molecular Devices Inc).

Dos anticuerpos scFv que se encontró que se unían al antígeno en el ELISA se denominaron 341VL34 scFv y 341VL36 scFv, respectivamente. Para cambiar el anticuerpo scFV obtenido por el anticuerpo de tipo normal, se clonó el gen del anticuerpo para preparar el vector de expresión.

El fragmento génico de cadena pesada se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 58 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando pCANTAB/341VL34 o pCANTAB/341VL36 como plantilla y 5'-AAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3' (SEQ ID NO: 68) y 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGG-3' (SEQ ID NO: 69) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Se realizó PCR para añadir la secuencia SalI, la secuencia de Kozac, y la secuencia que codifica la señal al extremo 5' y añadir la secuencia Nhel al extremo 3' utilizando cada fragmento génico obtenido como plantilla. Se realizó la PCR, 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 58 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando los correspondientes fragmentos génicos de cadena pesada como plantilla y 5'-GGGGTCGACACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTT TAAAAGGTGTCCAGTGT-3' (SEQ ID NO:70) y 5'-GGGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACC-3' (SEQ ID NO: 71) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Debido a que cada una de las cadenas ligeras de 341VL34 scFv y 341VL36 scFv tiene la misma secuencia de aminoácidos que la de 341-1-19, la región variable de cadena pesada del vector de expresión de 341-1-19 (que es el mismo que el N5KG2Ser divulgado en la Solicitud de Patente Japonesa N.° 2003-431408) se cortó con SalI y Nhel, y se insertaron cada uno de los fragmentos génicos de cadena pesada preparados mediante la digestión de 341VL34scFv y 341VL36scFv con SalI y NheI. El anticuerpo que comprende una cadena ligera de 341-1-19 (SEQ ID NO: 2) y una cadena pesada derivada de 341VL34scFv se denominó 341VL34, y el anticuerpo que comprende una cadena ligera de 341-1-19 (SEQ ID NO: 2) y una cadena pesada derivada de 341VL36scFv se denominó 341VL36.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 341VL34 (SEQ ID NO: 72), secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 341VL34 (SEQ ID NO: 73), secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 341VL36 (SEQ ID NO: 74) y secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 341VL36 (SEQ ID NO: 75) se muestra en el Listado de Secuencias.

El sitio de inicio de la traducción del ácido nucleico de cadena pesada del anticuerpo 341VL34 es el codón ATG que comienza con adenina (A) en la posición 1 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 72, y el codón de terminación es TGA que comienza con timina (T) en la posición 1417. El límite entre la región variable y la región constante del anticuerpo se coloca entre la adenina (A) en la posición 438 y la guanina (G) en la posición 439 desde el extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de cadena pesada es desde el extremo N de la SEQ ID NO: 73 hasta el resto de serina (S) en la posición 146, y la región constante es desde la alanina (A) en la posición 147. Se considera que la secuencia señal de cadena pesada es desde el extremo N de la SEQ ID NO: 73 hasta la cisteína (C) en la posición 19 y que el extremo N de la proteína madura es ácido glutámico (E) en la posición 20.

El sitio de inicio de la traducción del ácido nucleico de cadena pesada del anticuerpo 341VL36 es el codón ATG que comienza con adenina (A) en la posición 1 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 74, y el codón de terminación es TGA que comienza desde la timina (T) en la posición 1417. El límite entre la región variable y la región constante del anticuerpo se coloca entre la adenina (A) en la posición 438 y la guanina (G) en la posición 439 desde el extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de cadena pesada es desde el extremo N de la SEQ ID NO: 75 hasta el resto de serina (S) en la posición 146, y la región constante es desde la alanina (A) en la posición 147. Se considera que la secuencia señal de cadena pesada es desde el extremo N de la SEQ ID NO: 75 hasta la cisteína (C) en la posición 19 y que el extremo N de la proteína madura es ácido glutámico (E) en la posición 20.

Ejemplo 7

Estructura del Anticuerpo Multivalente Producido

Las características estructurales del anticuerpo multivalente producido en la presente invención se muestran en la Fig. 1. Las regiones variables derivadas de dos anticuerpos se unen mediante un enlazador. utilizando un anticuerpo (341 1-19) como anticuerpo anti-CD40 y dos anticuerpos (341VL34 y 341VL36) como anticuerpo anti-CD28, se produjo un anticuerpo en el que se cambiaron las combinaciones de estructura y posición de los enlazadores para examinarlo. Como el enlazador del anticuerpo multivalente en los Ejemplos, se insertó el enlazador representado por la SEQ ID NO: 77 que comprende la región CH1 de la subclase IgG2 derivado de 341-1-19 o el enlazador representado por la SEQ ID No : 99 que comprende las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3.

La Tabla 2 muestra las estructuras de los anticuerpos multivalentes producidos.

T l 21

Ejemplo 8

Preparación del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente (341VL34-CH1-341) que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 341VL34) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 341-1-19) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por la SEQ ID NO: 77

Para producir el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD28 341VL34 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD40341-1-19 mediante el enlazador (SEQ ID NO: 77). Debido a que se usó la misma cadena ligera que la de 341-1-19 para un anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprendía un tipo de secuencia de cadena ligera. Este anticuerpo multivalente se denominó 341VL34-CH1-341.

La secuencia (SEQ ID NO: 76 y 77) que comprende la secuencia CH1 (posiciones 118 a 215 del índice EU de Kabat) y la secuencia BamHI (GGATCC) en su extremo 3' se insertó como un enlazador entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada de 341VL34, extremo 5' de cadena pesada de 341-1-19).

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de 341VL34-CH1-341 se preparó mediante las siguientes etapas.

El fragmento génico del enlazador con la secuencia Nhel añadida al extremo 5' se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GGGGCTAGCACCAAGGGCCCATC-3' (SEQ ID NO:78) y 5'-GGATCCAACTGTCTTGTCCACCTTGG-3' (SEQ ID NO:79) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El fragmento génico de cadena pesada de 341-1-19 con el gen del enlazador (21 bases del lado 3'-terminal) añadido al extremo 5' y con la secuencia Nhel añadida al extremo 3' se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos se realizó como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GTGGACAAGACAGTTGGATCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTC-3' (SEQ ID NO:80) y 5'-CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAC-3' (SEQ ID NO:81) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Los dos fragmentos génicos así obtenidos se unieron con PCR de extensión solapada, y por lo tanto se preparó el fragmento génico de enlazador-cadena pesada de 341-1-19. Este fragmento génico se digirió con Nhel y después se insertó en el vector de expresión de 341VL4 que se había desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de la digestión con Nhel.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 341VL34-CH1-341 (SEQ ID NO: 82) y secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 341VL34-CH1-341 (SEQ ID NO: 83) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 9

Preparación del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente (341-CH1-341VL34) que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 341-1-194) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 341VL34) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por la SEQ ID NO: 77

Para producir el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento de antígenos para CD40 y el sitio de reconocimiento de antígenos para CD28 en una fila en orden desde el lado N-terminal de cadena pesada, la región variable de cadena pesada de 341-1-19 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada de 341VL34 mediante el enlazador (SEQ ID NO: 77). Se usó la misma cadena ligera que la de 341-1-19 para un anticuerpo anti-CD28. La secuencia (SEQ ID NO: 76 y 77) que comprende la secuencia CH1 (posiciones 118 a 215 del índice EU de Kabat) y la secuencia BamHI (GGATCC) añadida a su extremo 3' se insertó como un enlazador entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada de 341VL34, extremo 5' de cadena pesada de 341-1-19). Este anticuerpo se denominó 341-CH1-341VL34.

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de 341-CH1-341VL se preparó mediante las siguientes etapas.

El fragmento génico del enlazador con la secuencia Nhel añadida al extremo 5' se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GGGGCTAGCACCAAGGGCCCATC-3' (SEQ ID NO:78) y 5'-GGATCCAACTGTCTTGTCCACCTTGG-3' (s EQ ID NO:79) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El fragmento génico de cadena pesada de 341-1-19 con el gen del enlazador (21 bases del extremo 3') añadido al extremo 5' y con la secuencia Nhel añadida al extremo 3' se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 341VL-34 como plantilla y 5'-GTGGACAAGACAGTTGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3' (SEQ ID NO:84) y 5'-CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAC-3' (SEQ ID NO:81) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Los dos fragmentos génicos así obtenidos se unieron con PCR de extensión solapada, y por lo tanto se preparó el fragmento génico de enlazador-cadena pesada de 341VL34. Este fragmento génico se digirió con Nhel y después se insertó en el vector de expresión de 341-1-19 que se había desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de la digestión con Nhel.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 341-CH1-341VL34 (SEQ ID NO: 85) y secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 341-CH1-341VL34 (SEQ ID NO: 86) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 10

Preparación del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente (DVD341VL34-341) que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 341VL34) en el lado N-terminal, Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 341-1-19) en el lado C-terminal y Enlazador Corto representado por la SEQ ID NO: 88 que une Dos Sitios de Reconocimiento de Antígenos

Para comparar las estabilidades de los anticuerpos multivalentes, el anticuerpo multivalente en el que se unieron múltiples sitios de reconocimiento de antígenos a través del enlazador que comprende una secuencia de aminoácidos corta (6 aminoácidos) se preparó de acuerdo con el informe de Wu. et al. (Bibliografía no de patente 5). El anticuerpo multivalente que utiliza el enlazador corto preparado de acuerdo con el informe de Wu et al. se conoce como DVDIgG. De manera específica, el DVDIgG se preparó utilizando el anticuerpo anti-CD40 341-1-19 y el anticuerpo anti-CD28 341VL34. El DVDIgG que comprende el sitio de reconocimiento de antígenos para CD28 y el sitio de reconocimiento de antígenos para CD40 en orden desde el lado N-terminal se denominó DVD341VL34-341. La región variable de 341VL34 se unió en tándem al lado N-terminal de la región variable de cadena pesada de 341-1-19.

Respecto a la cadena ligera, la región variable de cadena ligera de 341VL34 se unió en tándem al lado N-terminal de la región variable de cadena ligera de 341-1-19. Una secuencia parcial (SEQ ID NO: 89 y 90: posiciones 108 a 113 del índice EU de Kabat) de la región constante de cadena ligera k se insertó entre las regiones variables como enlazador.

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de DVD341VL34-341 se preparó mediante las siguientes etapas.

El fragmento génico de cadena pesada de 341-1-19 con la secuencia del gen del enlazador (5'-terminal del enlazador es la secuenciaNhel ) añadida al extremo 5' y con la secuencia Nhelañadida al extremo 3' se amplificó realizando 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCACAGGTCCAACTGCAGCAGTC -3' (SEQ ID NO:91) y 5'-CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAC-3' (SEQ ID NO:81) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Este fragmento génico se digirió con Nhel y después se insertó en el vector de expresión de 341VL34 que se había desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de la digestión con Nhel. Adicionalmente, la cadena ligera preparada mediante el siguiente método se insertó en este vector.

La secuencia del gen que codifica la cadena ligera de DVD341VL34-341 se preparó mediante las siguientes etapas.

El fragmento génico de cadena ligera de 341-1-19 con la secuencia del gen del enlazador (5'-terminal del enlazador es la secuenciaBs/WI) añadida al extremo 5' y con la secuencia BsiWI añadida al extremo 3' se amplificó realizando 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la cadena ligera de 341-1-19 como plantilla y 5'-GGGCGTACGGTGGCTGCACCAGAAATTGTGTTGACACAGTC-3' (SEQ ID NO:92) y 5'-GGGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCC-3' (SEQ ID NO:93) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Este fragmento génico se digirió con BsiWI y después se insertó en el vector de expresión que comprende el DVD341VL34-341-1-19 mencionado anteriormente que se había desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de la digestión con BsiWI.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de DVD341VL34-341 (SEQ ID NO: 94), secuencia de aminoácidos de cadena pesada de DVD341VL34-341 (SEQ ID NO: 95), secuencia del ácido nucleico de cadena ligera de DVD341VL34-341 (SEQ ID NO: 96) y secuencia de aminoácidos de cadena ligera de DVD341VL34-341 (SEQ ID NO: 97) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 11

Preparación del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente (341VL34-CH1-H-CH2-CH3-341-CH1) que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 341VL34) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 341-1-19) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por la SEQ ID NO: 99

Se preparó el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento de CD28 y el sitio de reconocimiento de CD40 en orden desde el lado N-terminal de cadena pesada y que comprende el enlazador largo representado por la SEQ ID NO: 98 o 99 (CH1, bisagra, CH2, CH3: posiciones 118 a 447 del índice UE de Kabat). De manera específica, la región variable de 341VL34 se unió a la región variable de 341-1-19 mediante el enlazador representado por la SEQ ID NO: 98 o 99. Al extremo 3', se añadió TGA como codón de terminación. Se usó la misma cadena ligera que la de 341-1-19 para el anticuerpo anti-CD28. Este anticuerpo se denominó 341VL34-CH1-H-CH2-CH3-341-CH1.

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de 341VL34-CH1-H-CH2-CH3-341-CH1 se preparó mediante las siguientes etapas.

El fragmento génico del enlazador (5'-terminal del enlazador es la secuencia NheI) con la secuencia BamHI añadida al extremo 3' se amplificó realizando 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCA-3' (SEQ ID NO:100) y 5'-GGGGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3' (SEQ ID NO:101) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El fragmento génico así obtenido se digirió con Nhel y BamHI y después se insertó en el vector de expresión de 341VL34 mediante la digestión con NheI y BamHI para eliminar la región del gen que codifica la región constante de cadena pesada. Se realizó la PCR, 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GATATCAAAGGATCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTC-3' (SEQ ID NO:102) y 5'-GGGGGATCCTCa Aa CTGTCTTGTCCACCTTGG-3' (SEQ ID NO:103) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). La región variable de cadena pesada de 341-1-19 obtenida en la que la secuencia BamHI se añadió en el extremo 5' y la secuencia BamHI, el codón de terminación y la región CH1 (desde la adenina en la posición 118 hasta la valina en la posición 215) (desde el extremo 3') se añadieron en el extremo 3'; y la región CH1 se digirió con BamHI y se insertó en el extremo 3' de este vector de expresión.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 341VL34-CH1-H-CH2-CH3-341-CH1 (SEQ ID NO: 104) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 341VL34-CH1-H-CH2-CH3-341-CH1 (SEQ ID NO: 105) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 12

Preparación del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente (341VL36-CH1-341) que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 341VL36) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 341-1-19) en el lado C-terminal y que comprende el Enlazador representado por la SEQ ID NO: 77

Para producir el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento de CD28 y el sitio de reconocimiento de CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada de 341VL36 se unió a la región variable de cadena pesada de 341-1-19 en tándem mediante el enlazador representado por la SEQ ID NO: 77. Debido a que se utiliza la misma cadena ligera que la de 341-1-19 para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende una secuencia de cadena ligera. Este anticuerpo multivalente se denominó 341 VL36-CH1-341.

La secuencia (SEQ ID NO: 76 o 77) que comprende la secuencia CH1 (posiciones 118 a 215 del índice EU de Kabat) y la secuencia BamHI (GGATCC) añadida a su extremo 3' se insertó como un enlazador entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada de 341VL34, extremo 5' de cadena pesada de 341-1-19).

El fragmento génico del enlazador con la secuencia NheI añadida al extremo 5' se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GGGGCTAGCACCAAGGGCCCATC-3' (SEQ ID NO:78) y 5'-GGATCCAACTGTCTTGTCCACCTTGG-3' (SEQ ID NO:79) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). La reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos se realizó durante 30 ciclos para amplificar el fragmento génico de cadena pesada de 341-1-19 con la secuencia del enlazador (21 bases del lado 3'-terminal) añadida al extremo 5' y con la secuencia NheI añadida al extremo 3' mientras se usa la secuencia de cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GTGGACAAGACAGTTGGATCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTC-3' (SEQ ID NO:80) y 5'-CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAC-3' (SEQ ID NO:81) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Los dos fragmentos génicos así obtenidos se unieron con PCR de extensión solapada, y por lo tanto se produjo el fragmento génico de enlazador-cadena pesada de 341-1-19. Este fragmento génico se digirió con NheI y después se insertó en el vector de expresión de 341VL36 que se había desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de la digestión con NheI.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 341VL36-CH1-341 (SEQ ID NO: 106) y secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 341VL36-CH1-341 (SEQ ID NO: 107) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 13

Producción del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente (341-CH1-341VL36) que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 341-1-19) en el lado N-terminal y el sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 341VL36) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por la SEQ ID NO: 77

Para producir el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento de CD40 y el sitio de reconocimiento de c D28 en una fila en orden desde el lado N-terminal de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada de 341-1-19 se unió a la región variable de cadena pesada de 341VL36 en tándem mediante el enlazador representado por la SEQ ID NO: 77. Se utiliza la misma cadena ligera que la de 341-1-19 para el anticuerpo anti-CD28. La secuencia (SEQ ID NO: 76 y 77) con la secuencia CH1 (posiciones 118 a 215 del índice EU de Kabat) y la secuencia BamHI (GGATCC) añadida a su extremo 3' se insertó entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada de 341VL36, extremo 5' de cadena pesada de 341-1-19) como enlazador. Este anticuerpo se denominó 341-CH1-341VL36.

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de 341-CH1-341VL36 se produjo mediante las siguientes etapas.

El fragmento génico del enlazador con la secuencia NheI añadida al extremo 5' se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GGGGCTAGCACCAAGGGCCCATC-3' (SEQ ID NO:78) y 5'-GGATCCAACTGTCTTGTCCACCTTGG-3' (SEQ ID NO:79) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El fragmento génico de cadena pesada de 341-1-19 con el gen del enlazador (21 bases del lado 3'-terminal) añadido al extremo 5' y con la secuencia NheI añadida al extremo 3' se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando el 341VL36 como plantilla y 5'-GTGGACAAGACAGTTGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3' (SEQ ID NO:84) y 5'-CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAC-3' (SEQ ID NO:81) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Los dos fragmentos génicos así obtenidos se unieron con PCR de extensión solapada, y por lo tanto se preparó el fragmento génico de enlazador-cadena pesada de 341VL36. Este fragmento génico se digirió con NheI y después se insertó en el vector de expresión de 341-1-19 que se había desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de la digestión con NheI.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 341-CH1-341VL36 (SEQ ID NO: 108) y secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 341-CH1-341VL36 (SEQ ID NO: 109) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 14

Producción del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente (DVD341VL36-341) que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 341VL36) en el lado N-terminal, Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 341-1-19) en el lado C-terminal y Enlazador Corto representado por la SEQ ID NO: 88 que une Dos Sitios de Reconocimiento de Antígenos

Para comparar las estabilidades de los anticuerpos multivalentes, el DVD-IgG se produjo utilizando los anticuerpos 341-1-19 y 341VL36 de acuerdo con el informe de Wu et al. (Bibliografía no de patente 5). El DVDIgG que comprende el sitio de reconocimiento de antígenos para CD28 y el sitio de reconocimiento de antígenos para CD40 en orden desde el lado N-terminal se denominó DVD341VL36-341. La región variable de 341VL34 se unió en tándem al lado N-terminal de la región variable de cadena pesada de 341-1-19. El enlazador que comprende 6 aminoácidos y está representado por la SEQ ID NO: 87 u 88, se insertó entre las regiones variables.

En cuanto a la cadena ligera, la región variable de cadena ligera de 341VL36 se unió en tándem al lado N-terminal de la región variable de cadena ligera del 341-1-19. La secuencia parcial (SEQ ID NO: 89 o 90: posiciones 108 a 113 del índice EU de Kabat) de la región constante de la cadena ligera k se insertó como un enlazador entre las regiones variables.

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de DVD341VL36-341 se preparó mediante las siguientes etapas.

El fragmento génico de cadena pesada del 341-1-19 con la secuencia del gen del enlazador añadida al extremo 5' y con la secuencia Nhel añadida al lado 3'-terminal se amplificó realizando 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCACAGGTCCAACTGCAGCAGTC-3' (SEQ ID NO:91) y 5'-CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAC-3' (SEQ ID NO:84) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Este fragmento génico se digirió con Nhel y después se insertó en el vector de expresión de 341VL36 que se había desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de la digestión con Nhel. Adicionalmente, la cadena ligera que se había preparado mediante el siguiente método se insertó en este vector.

La secuencia del gen que codifica la cadena ligera de DVD341VL36-341 se preparó mediante las siguientes etapas.

El fragmento génico de cadena ligera de 341-1-19 con la secuencia del enlazador añadida al extremo 5' y con la secuencia BsiWI añadida al extremo 3' se amplificó realizando la reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos se realizó durante 35 ciclos para amplificar como un ciclo utilizando la secuencia de cadena ligera de 341-1-19 como plantilla y 5'-GGGCGTACGGTGGCTGCACCAGAAATTGTGTTGACACAGTC-3' (SEQ ID NO: 92) y 5'-GGGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCC-3' (SEQ ID NO: 93) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Este fragmento génico se digirió con BsiWI y después se insertó en el vector de expresión que comprende la cadena pesada de DVD341VL36-341 mencionada anteriormente que se había desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de digerir con BsiWI.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de DVD341VL36-341 (SEQ ID NO: 110), secuencia de aminoácidos de cadena pesada de DVD341VL36-341 (SEQ ID NO: 111), secuencia del ácido nucleico de la cadena ligera de DVD341VL36-341 (SEQ ID NO: 112) y secuencia del ácido nucleico de cadena ligera de DVD341VL36-341 (SEQ ID NO: 113) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 15

Producción del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente (341VL36-CH1-H-CH2-CH3-341-CH1) que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 341VL34) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 341-1-19) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por la SEQ ID NO: 99

Se preparó el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento de CD28 y el sitio de reconocimiento de CD40 en orden desde el lado N-terminal de la cadena pesada y que comprende el enlazador largo representado por la SEQ ID NO: 99. La región variable de cadena pesada de 341-1-19 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada de 341VL36 a través del enlazador representado por la SEQ ID NO: 98 o 99. Al extremo 3', se añadió TGA como codón de terminación. Se usó la misma cadena ligera que la de 341-1-19 para el anticuerpo anti-CD28. Este anticuerpo se denominó 341VL36-CH1-H-CH2-CH3-341-CH1.

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de 341VL36-CH1-H-CH2-CH3-341-CH1 se preparó mediante las siguientes etapas.

El fragmento génico del enlazador con la secuencia BamHI añadida al extremo 3' se amplificó realizando 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCA-3' (SEQ ID NO:100) y 5'-GGGGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3' (SEQ ID NO:101) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El fragmento génico así obtenido se digirió con NheI y BamHI y después se insertó en el vector de expresión de 341VL36 digerido con Nhel y BamHI. Se realizó la PCR, 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 341-1-19 como plantilla y 5'-GATATCAAAGGATCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTC-3' (SEQ ID NO:102) y 5'-GGGGGATCCTCAAACTGTCTTGTCCACCTTGG-3' (SEQ ID NO:103) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricado por Toyobo Co. Ltd) para preparar la región variable de cadena pesada de 341-1-19 con la secuencia de genes añadida a la secuencia BamHI en el extremo 5' y añadida a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia BamHI, el codón de terminación y la región CH1 (Thr en la posición 118 a valina en la posición 215) (desde el extremo 3') en el extremo 3' y la región CH1. El fragmento génico obtenido se digirió con BamHI y se insertó en el vector de expresión. Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 341VL36-CH1-H-CH2-CH3-341-CH1 (s Eq ID NO: 114) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 341VL36-CH1-H-CH2-CH3-341-CH1 (SEQ ID NO: 115) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 16

Expresión y Purificación de Anticuerpo Multivalente

El gen del vector de expresión producido se preparó utilizando el kit QIAGEN Plasmid Maxi (fabricado por Qiagen) y se introdujo en células 293 no adherentes utilizando el Sistema de Expresión de 293 FreeStyle™ (Invitrogen de Life Technologies Corporation). El sobrenadante del cultivo que contenía los anticuerpos correspondientes se obtuvo mediante expresión transitoria. El sobrenadante del cultivo se recogió 7 días después de la introducción del vector y se filtró con un filtro de membrana (fabricado por Millipore Corporation) que tenía un diámetro de poro de 0,22 pm. La purificación por afinidad se realizó en el sobrenadante del cultivo utilizando resina con Proteína A (MabSelect, fabricada por GE Healthcare Bio-sciences Ltd). Se usó tampón fosfato como tampón de lavado y tampón de citrato de sodio 20 mM y se usó NaCl 50 mM (pH 2,7) como tampón de elución. La fracción de elución se ajustó a aproximadamente pH 6,0 añadiendo tampón de fosfato de sodio 200 mM (pH 7,0). La solución de anticuerpos ajustada se sustituyó por el tampón fosfato utilizando una membrana de diálisis (10000 cortes, fabricada por Spectrum Laboratories Inc), se filtró y se esterilizó con un filtro de membrana que tenía un diámetro de poro de 0,22 pm (Millex-GV; fabricado por Millipore Corporation) para obtener un anticuerpo purificado. Con respecto a la densidad del anticuerpo purificado, se midió la absorbancia a 280 nm y se asumió que la densidad de 1 mg/ml de anticuerpo era 1,40 de Densidad Óptima para el cálculo.

Ejemplo 17

Medición de la Productividad de Anticuerpos

Se midió el contenido de anticuerpos en cada sobrenadante de cultivo para conocer la productividad del anticuerpo. Para medir el contenido de anticuerpos, el análisis se realizó utilizando un aparato de cromatografía de líquidos de alta resolución (fabricado por Hitachi Ltd) y POROS 50A (fabricado por Applied Biosystems, cat. 4319037) y utilizando fosfato 20 mM y NaCl 300 mM pH 7,0 como disolvente. El contenido de anticuerpos se calculó comparando las áreas de los picos obtenidas inyectando cada sobrenadante de cultivo con las áreas de los picos obtenidas mediante la inyección de 1, 2, 5 y 10 pg, respectivamente, de anticuerpo humano purificado (IgG1).

En la Tabla 3 se muestra el resultado. A partir de la Tabla 3 se encontró que la productividad de un anticuerpo multivalente unido mediante un enlazador más corto es menor.

T l 1

(continuación)

Ejemplo 18

Evaluación de la Estabilidad de los Anticuerpos

Para medir una tasa de contenido agregado de la solución de anticuerpos, el análisis se realizó utilizando un aparato de cromatografía de líquidos de alta resolución (fabricado por Shimadzu Corporation) y una columna TSK-G3000 SW (fabricada por Tosoh Corporation) y utilizando fosfato de sodio 20 mM y NaCl 500 mM pH 7,0 como disolvente. La tasa de contenido agregado se calculó inyectando 40 |jg de cada anticuerpo para comparar la posición del pico con la de un marcador de peso molecular para HPLC de filtración en gel (fabricado por Oriental Yeast Co.Ltd, N.° de Cat.

40403701) y especificando los picos de un monómero de proteína de anticuerpo y el agregado distinto de la proteína de anticuerpo para calcular la concentración del agregado.

En la Tabla 4 se muestra el resultado. En la Tabla 4 se encontró que con el enlazador más corto, se generó más agregado en el proceso de purificación y se degradó la estabilidad del anticuerpo multivalente en la solución acuosa.

T l 41

Ejemplo 19

Evaluación de la Propiedad de Unión al Antígeno del Anticuerpo

La propiedad de unión del anticuerpo preparado que comprende dos sitios de reconocimiento (CD40 y CD28) para cada antígeno se examinó mediante las siguientes etapas.

La proteína de fusión CD40 humano-Fc y la proteína de fusión CD28 humano-Fc se ajustaron para dar una concentración de 1 jg/m l utilizando tampón de recubrimiento (tampón carbonato 50 mM, pH 9). A un pocillo, se añadieron 50 jl/pocillo de la proteína de fusión CD40 humano-Fc obtenida o la proteína de fusión CD28 humano-Fc obtenida a la placa Maxisorp (fabricada por Nalge Nunc International) respectivamente, y se incubaron a 4 °C durante la noche para inmovilizarlas. Después, se añadieron 200 jl/pocillo de reactivo de bloqueo (Tampón de Bloqueo SuperBlock (marca registrada), fabricado por Pierce Protein Research) al pocillo, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos para el bloqueo. Después, se añadieron al pocillo 50 jl/pocillo del sobrenadante de cultivo que comprendía cada anticuerpo obtenido en los Ejemplos anteriores, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con tampón de lavado (Tween20-TBS al 0,1 %), se diluyó F(ab)²anti-K humana de cabra conjugado con anticuerpo aislado por afinidad HRP (fabricado por EY Laboratories Inc) se diluyó con diluyente de ensayo (Tween20-TBS al 0,1 % que contenía Block Ace fabricado por Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd. al 10 %). Después, se añadieron 50 j l de la solución obtenida a cada pocillo seguido de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con tampón de lavado, se añadieron 50 j l de solución de sustrato colorante TMB (fabricado por Dako) a cada pocillo, seguido de incubación en una habitación oscura a temperatura ambiente. Después de desarrollar el color, se añadió vitriol 0,5 M (50 pl/pocillo) para detener la reacción. La absorbancia a la longitud de onda de 450 nm se midió con un lector de microplacas (SPECTRAMAX190, fabricado por Molecular Devices Inc).

Ejemplo 20

Preparación del Primer Sitio de Reconocimiento de Antígenos

De la misma manera que en el Ejemplo 1, se estableció un anticuerpo 281 anti-CD40 como un nuevo anticuerpo anti-CD40.

Ejemplo 21

Preparación de la biblioteca de scFV del Anticuerpo anti-CD28 que comprende la Misma Cadena Ligera que la Cadena Ligera del Anticuerpo anti-CD40

Para realizar la exploración de un anticuerpo anti-CD28 que comprende la misma cadena ligera que la del anticuerpo anti-CD40281 del Ejemplo 20, se preparó una biblioteca de fragmentos de anticuerpos monocatenarios (scFV) en la que el fragmento génico de la región variable de cadena pesada se enlazó con el fragmento génico de la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CD28, utilizando el bazo del ratón inmunizado con CD28 preparado en el Ejemplo 2.

El fragmento génico de la región variable de cadena pesada del 281 con la secuencia Sfil añadida al extremo 5' y con una secuencia rica en glicina añadida al extremo 3' se amplificó realizando los 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 58 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 1 minuto como un ciclo utilizando la cadena pesada (SEQ ID NO: 116) del 281 como plantilla y 5'-GCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG-3' (SEQ ID NO:120) y 5'-CCGAGGCGCGCCCACCGCTGCCACCGCCTCCTGAGGAGACGGTGACCAG-3' (SEQ ID NO: 121) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El fragmento génico de la región variable de cadena ligera del 281 con una secuencia rica en glicina añadida al extremo 5' y con la secuencia Notl añadida al extremo 3' se amplificó utilizando la cadena ligera (SEQ ID NO: 118) del 281 como plantilla y 5'-CGGTGGGCGCGCCTCGGGCGGAGGTGGTTCAGAAATTGTGTTGACGCAG-3 (SEQ ID NO: 122) y 5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGTCGTGTCCC-3' (SEQ ID NO: 123) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). La VH así obtenida se unió con fragmentos génicos de VL con PCR de extensión solapada de la misma manera que en el Ejemplo 3, y por tanto se preparó el fragmento génico de scFv de 281. Este fragmento génico se digirió con Sfil y NotI y se insertó en el vector pCANTAB 5E (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd) que se había digerido previamente con Sfil y NotI. El plásmido obtenido se denominó pCANTAB5E/281. Debido a que el fin de este ejemplo es obtener un anticuerpo para CD28 humano como un antígeno que comprende la misma secuencia de aminoácidos que la de cadena ligera de 281, este plásmido se digirió con Sfil y ^scI (se eliminó la región génica que codifica VH de 341-1-19). El vector obtenido se desfosforiló con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) para utilizarlo como vector productor de bibliotecas.

El fragmento génico de la región variable de cadena pesada para producir la biblioteca de fagos de anticuerpos se obtuvo utilizando ADNc sintetizado en el Ejemplo 3 como plantilla. Se realizó la PCR, 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 58 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando este ADNc como plantilla, un cebador (SEQ ID NO: 124 a 131) específico de la región variable de la cadena pesada humana, y un cebador (SEQ ID NO: 132 a 135) específicos de la región de unión y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Además, se utilizaron juntos 5 tipos de cebadores específicos de la región de unión. Por otra parte, el sitio de restricción de Sfil se insertó en el extremo 5' de las SEQ ID NO: 124 a 131, respectivamente, y el sitio de restricción de ^scI y la secuencia del enlazador se insertaron en el extremo 5' de las SEQ ID NO: 132 a 135, respectivamente.

Estos fragmentos génicos de VH amplificados por PCR se insertaron en el vector preparado utilizando pCANTAB5E/281 de la misma manera que en el Ejemplo 3 para preparar una biblioteca de anticuerpos scFv. En este ejemplo, se recogieron aproximadamente 5*105 colonias para preparar la biblioteca. La biblioteca de fagos de anticuerpos se preparó a partir de esta biblioteca de anticuerpos scFv.

Ejemplo 22

Concentración de Fagos que Muestran el Anticuerpo svFv que reconoce CD28 humano

La concentración de la biblioteca de fagos de anticuerpos preparada en el Ejemplo 21 se preparó de la misma manera que en el Ejemplo 5.

Ejemplo 23

Selección del fago de Presentación de Anticuerpo que Reconoce el CD28 Humano y Preparación del Anticuerpo anti-CD28 (281VL4)

La selección del fago de presentación de anticuerpos se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 6.

El anticuerpo scFv que se encontró que se unía al antígeno mediante ELISA se denominó 281VL4 scFv. Para sustituir el anticuerpo scFv obtenido por un anticuerpo de tipo normal, se realizó la clonación del gen del anticuerpo y después se preparó el vector de expresión.

Un fragmento génico de cadena pesada se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 58 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando pCANTAB/281 VL4 como plantilla y 5'-CTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCGAGGTCCAGCTGGTG-3' (SEQ ID NO:136) y 5'-TGAGGAGACGGTGACCA-3' (SEQ ID NO:137) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Después, para añadir la secuencia SalI, la secuencia de Kozac, y la secuencia que codifica la señal al extremo 5' del mismo y añadir la secuencia NheI al extremo 3' del mismo, la PCR se realizó utilizando este fragmento génico como plantilla. Se realizó la PCR, 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 58 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando los correspondientes fragmentos génicos de cadena pesada como plantilla y 5'-GGGGTCGACACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGG-3' (SEQ ID NO: 138) y 5'-GGGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCA-3' (SEQ ID NO:139) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Debido a que la cadena ligera del 281VL4 scFv tiene la misma secuencia de aminoácidos que la del 281, el vector de expresión de 281 (utilizando N5KG4PE divulgado en el documento WO2002/088186) se digirió con SalI y NheI para cortar la región variable de cadena pesada. Se insertó el fragmento génico de cadena pesada del 281VL4 scFv que se obtuvo por digestión con SalI y NheI. El anticuerpo que comprende la cadena ligera del 281 (SEQ ID NO: 118 y 119) y la cadena pesada del 281VL4 scFv se denominó 281VL4.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4 (SEQ ID NO: 140) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4 (SEQ ID NO: 141) se muestra en el Listado de Secuencias.

El sitio de inicio de la traducción del ácido nucleico de cadena pesada del anticuerpo 281VL4 es el codón ATG que comienza en adenina (A) en la posición 1 y el codón de terminación es TGA que comienza en la timina (T) en la posición 1417 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 140. El límite entre la región variable y la región constante del anticuerpo se coloca entre la adenina (A) en la posición 435 y la guanina (G) en la posición 436 desde el extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de cadena pesada es desde el extremo N del resto de serina (S) en la posición 145 de la SEQ ID NO: 141 y la región constante es después de la alanina (A) en la posición 146. Se considera que la secuencia señal de cadena pesada es desde el extremo N a la serina (S) en la posición 19 de la SEQ ID NO: 141 y que el extremo N de la proteína madura es ácido glutámico (E) en la posición 20.

Ejemplo 24

Preparación de Vectores de Expresión de Anticuerpo Multivalente (281VL4-CH1-281, 281VL4-CH1(118-131)-281, 281VL4-CH1(118-130)-281) que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281v L4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador en la Tabla 6

Para preparar un anticuerpo multivalente que comprenda el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en orden desde el lado N-terminal de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281VL4 anti-CD28 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281 anti-CD40 desde el lado N-terminal mediante un enlazador mostrado en la Tabla 6. Debido a que se utiliza la misma cadena ligera que la de 281 para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende un tipo de secuencia de cad ena ligera. Estos anticuerpos se denominaron 281VL4-CH1-281, 281VL4-CH1(118-131)-281 y 281VL4-CH1(118-130)-281, respectivamente.

T l 1

El 281VL4-CH1-281 comprende la secuencia que comprende la secuencia CH1 (posiciones 118 a 215 del índice EU de Kabat) de IgG4 y la secuencia BamHI (GGATCC) añadida a su extremo 3' se insertó como un enlazador entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada de 281VL4, extremo 5' de cadena pesada de 281).

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de 281VL4-CH1-281 se preparó mediante las siguientes etapas.

El fragmento génico del enlazador con la secuencia Nhel añadida al extremo 5' se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 281 como plantilla y 5'-GGGGCTAGCACCAAGGGGCCA-3' (SEQ ID NO:144) y 5'-GGATCCAACTCTCTTGTCCACCTT-3' (SEQ ID NO:145) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Un fragmento génico de cadena pesada de 281 con el gen del enlazador (15 bases del lado 3'-terminal ) añadido al extremo 5' y con la secuencia Nhel añadida al extremo 3' se amplificó realizando 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 30 segundos utilizando la secuencia de cadena pesada de 281 como plantilla y 5'-AAGAGAGTTGGATCCCAGGTGCAGCTGCAG-3' (SEQ ID NO:146) y 5'-GGGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCA-3' (SEQ ID NO:147) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Los dos fragmentos génicos así obtenidos se unieron con RCR de extensión solapada y de ese modo se preparó el enlazadorfragmento génico de cadena pesada de 281. Este fragmento génico se digirió con NheI y después se insertó en el vector de expresión de 281VL4 que había sido desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de la digestión con NheI. Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-CH1-281 (SEQ ID NO: 148) y secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-CH1-281 (SEQ ID NO: 149) se muestra en el Listado de Secuencias.

Para preparar un anticuerpo multivalente que comprenda el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD28 281VL4 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 281 mediante el enlazador (SEQ ID NO: 151). Debido a que se utiliza la misma cadena ligera que la de 281 para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende un tipo de secuencia de cadena ligera. Este anticuerpo multivalente se denominó 281VL4-CH1(118-131)-281.

En 281VL4-CH1(118-131)-281, la secuencia CH1 de IgG4 (posiciones 118 a 131 del índice EU de Kabat) se insertó como un enlazador entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada de 281VL4, extremo 5' de cadena pes ada de 281).

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de 281VL4-CH1(118-131)-281 se preparó mediante las siguientes etapas.

Se realizaron treinta ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 281 como plantilla y 5'-GTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC-3' (SEQ ID NO: 150) y 5'-GGGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCA-3 (SEQ ID NO: 147) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Un fragmento génico de cadena pesada de 281 con el gen del enlazador (el extremo 5' de la secuencia del enlazador es la secuencia NheI) añadido al extremo 5' y con la secuencia NheI añadida al extremo 3' se amplificó realizando 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando este producto de PCR como plantilla y 5'-GGGGCTAGCACCAAGGGGCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCC-3' (SEQ ID NO: 151) y 5'-GGGGCTAGCTGAGGAGACGTGACCA-3' ( SEQ ID NO: 147) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El fragmento génico así obtenido se digirió con NheI y después se insertó en el vector de expresión de 281VL4 que se había desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de la digestión con NheI. Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-CH1(118-131)-281 (SEQ ID NO: 152) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-CH1(118-131)-281 (SEQ ID NO: 153) se muestra en el Listado de Secuencias.

En 281VL4-CH1(118-130)-281, la secuencia CH1 (posiciones 118 a 130 del índice EU de Kabat) de IgG4 se insertó como un enlazador entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada de 281VL4, extremo 5' de cadena pesada de 281).

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de 281VL4-CH1(118-130)-281 se preparó mediante las siguientes etapas.

Se realizaron treinta ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 281 como plantilla y 5'-GTCTTCCCCCTGGCGCCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC-3' (SEQ ID NO: 154) y 5'-GGGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCA-3 (SEQ ID NO: 147) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El fragmento génico de cadena pesada de 281 con el gen del enlazador (el extremo 5' de la secuencia del enlazador es la secuencia NheI) añadido al extremo 5' y con la secuencia NheI añadida al extremo 3' se amplificó realizando 35 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a 68 °C durante 30 segundos como un ciclo utilizando el producto de PCR así obtenido como plantilla y 5'-GGGGCTAGCACCAAGGGGCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCC-3' (SEQ ID NO: 151) y 5'-GGGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCA-3' (SEQ ID NO: 147) como cebadores y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). El fragmento génico así obtenido se digirió con NheI y después se insertó en el vector de expresión de 281VL4 que se había desfosforilado con Fosfatasa Alcalina (BAP, fabricada por Takara Bio Inc) después de la digestión con NheI. Cada una de las secuencias de ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-CH1(118-130)-281 (SEQ ID NO: 155) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-CH1(118-130)-281 (SEQ ID No : 156) ) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 25

Expresión y Purificación de Anticuerpo Multivalente

El gen del vector de expresión producido se preparó utilizando el kit QIAGEN Plasmid Maxi (fabricado por Qiagen) y después se introdujo en células 293 no adherentes utilizando el Sistema de Expresión de 293 FreeStyle™ (Invitrogen de Life Technologies Corporation), y por lo tanto el sobrenadante de cultivo que contenía cada anticuerpo se obtuvo por expresión transitoria. El anticuerpo purificado se obtuvo del sobrenadante de cultivo de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 16. Con respecto a la densidad de un anticuerpo purificado, se midió la absorbancia a 280 nm y se asumió que la densidad de 1 mg/ml de anticuerpo era 1,40 de densidad óptima para el cálculo.

Ejemplo 26

Medición de la Productividad de Anticuerpos

Se midió el contenido de anticuerpos de cada sobrenadante de cultivo para conocer la productividad del anticuerpo. La medición del contenido de anticuerpos se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 17. En la Tabla 7 se muestra el resultado.

T l 71

Ejemplo 27

Evaluación de la Estabilidad de los Anticuerpos

La tasa de contenido agregado de la solución de anticuerpos se midió de la misma manera que en el Ejemplo 18. En la Tabla 8 se muestra el resultado.

Ejemplo 28

Evaluación de la Propiedad de Unión al Antígeno del Anticuerpo

La unión del anticuerpo producido que comprende dos sitios de reconocimiento (CD40 y CD28) para cada antígeno se midió de la misma manera que en el Ejemplo 19. Como resultado, se encontró que la totalidad de 281VL4-CH1-281, 281VL4-CH1(118-131)-281 y 281VL4-CH1(118-130)-281 se unían a la proteína de fusión CD40 humano-Fc y a la proteína de fusión CD28 humano-Fc.

Ejemplo 29

Preparación del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador en la Tabla 9

Para producir el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281VL4 anti-CD28 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281 anti-CD40 desde el lado N-terminal mediante el enlazador mostrado en la Tabla 9. Debido a que se utiliza la misma cadena ligera que la de 281 para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende un tipo de secuencia de cadena ligera. Este anticuerpo multivalente se denominó 281VL4-CH1(118-131/C131S)-281.

[Tabla 9]

En 281VL4-CH1(118-131/C131S)-281, la secuencia CH1 de IgG1 (posiciones 118 a 131 del índice EU de Kabat) se insertó como un enlazador entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada de 281VL4, extremo 5' de cadena pesada de 281).

Las secuencias génicas que codifican las cadenas pesadas de estos anticuerpos se prepararon basándose en el procedimiento del método genético usado en el Ejemplo 24. Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-CH1(118-131/C131S)-281 (s Eq ID NO: 157) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-CH1(118-131/C131S)281 (SEQ ID NO: 158) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 30

Preparación del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador en la Tabla 10

Para producir el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281VL4 anti-CD28 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281 anti-CD40 desde el lado N-terminal mediante un enlazador mostrado en la Tabla 10. Debido a que se utiliza la misma cadena ligera que la del 281 para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende un tipo de secuencia de cadena ligera. Estos anticuerpos multivalentes se denominaron 281VL4-CH1(118-119+C)-281, 281VL4-CH1(118-120+C)-281, 281VL4-CH1(118-121+C)-281, 281VL4-CH1(118-122+C)-281, 281VL4-CH1(118-123+C)-281, 281VL4-CH1(118-124+C)-281, 281VL4-CH1(118-125+C)-281, 281VL4-CH1(118-126+C)-281, 281VL4-CH1(118-127+C)-281,281VL4-CH1(118-128+C)-281 y 281VL4-CH1(118-129+C)-281, respectivamente.

T l 1

(continuación)

En 281VL4-CH1(118-119+C)-281, 281VL4-CH1(118-120+C)-281, 281VL4-CH1(118-121+C)-281, 281VL4-CH1(118-122+C)-281, 281VL4-CH1(118-123+C)-281, 281VL4-CH1(118-124+C)-281, 281VL4-CH1(118-125+C)-281, 281VL4-CH1(118-126+C)-281, 281VL4-CH1(118-127+C)-281, 281VL4-CH1(118-128+C)-281 y 281VL4-CH1(118-129+C)-281, la secuencia que comprende la secuencia CH1 (en las posiciones 118 y 119 a 129 del índice EU de Kabat) de IgG4 y TGC (la secuencia del ácido nucleico que codifica cisteína cuando se convierte en aminoácido) en su extremo 3' se insertó como un enlazador entre el cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada de 281VL4, extremo 5' de la cadena pesada de 281).

Las secuencias génicas que codifican las cadenas pesadas de estos anticuerpos se prepararon basándose en el procedimiento del método genético usado en el Ejemplo 24. Cada una de las secuencias de los ácidos nucleicos de cadena pesada y las secuencias de aminoácidos de cadena pesada (SEQ ID NO: 159 a 180) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 31

Preparación del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador en la Tabla 11

Para preparar un anticuerpo multivalente que comprenda el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281VL4 anti-CD28 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281 anti-CD40 desde el lado N-terminal mediante un enlazador mostrado en la Tabla 11. Debido a que se utiliza la misma cadena ligera que la del 281 para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende un tipo de secuencia de cadena ligera. Estos anticuerpos multivalentes se denominaron 281VL4-CH1 (118-131/A118S)-281, 281VL4-CH1(118-131/S119A)-281, 281VL4-CH1(118-131/T120A)-281,281VL4-CH1(118-131/K121 A)-281, 281VL4-CH1(118-131/G122A)-281, 281VL4-CH1(118-131/P123A)-281, 281VL4-CH1(118-131/S124A)-281, 281VL4-CH1(118-131/V125A)-281,281VL4-CH1(118-131/F126A)-281,281VL4-CH1(118-131/P127A)-281,281VL4-CH1(118-131/L128A)-281,281VL4-CH1(118-131/A129S)-281 y 281VL4-CH1(118-131/P130A)-281, respectivamente.

(continuación)

En 281VL4-CH1(118-131/A118S)-281, 281VL4-CH1(118-131/S119A)-281, 281VL4-CH1(118-131/T120A)-281, 281VL4-CH1(118-131/K121A)-281, 281VL4-CH1(118-131/G122A)-281, 281VL4-CH1(118-131/P123A)-281, 281VL4-CH1(118-131/S124A)-281, 281VL4-CH1(118-131/V125A)-281, 281VL4-C1H1(118-131/F126A)-281, 281VL4-CH1(118-131/P127A)-281, 281VL4-CH1(118-131/L128A)-281, 281VL4-CH1(118-131/A129S)-281 y 281VL4-CH1(118-131/P130A)-281, se insertó una secuencia en la que se mutó el CH1 (posiciones 118 a 131 del índice EU de Kabat) de IgG4 como enlazador entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada 281VL4, extremo 5' de la cadena pesada de 281). La mutación en cada enlazador es un aminoácido. En concreto, el aminoácido en la secuencia CH1 de IgG4 se sustituyó con alanina. Además, cuando la alanina existe originalmente en la posición a mutar, la alanina se sustituye con cisteína.

Las secuencias génicas que codifican las cadenas pesadas de estos anticuerpos se produjeron basándose en el procedimiento del método genético usado en el Ejemplo 24. Cada una de las secuencias de los ácidos nucleicos de cadena pesada y las secuencias de aminoácidos de cadena pesada (SEQ ID NO: 181 a 206) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 32

Preparación del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador en la Tabla 12

Para producir el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281VL4 anti-CD28 se unió en tándem desde el lado N-terminal a la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281 anti-CD40 mediante el enlazador mostrado en la Tabla 12. Debido a que se utiliza la misma cadena ligera que la del 281 para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende un tipo de secuencia de cadena ligera. Estos anticuerpos multivalentes se denominaron 281VL4-CH1 (IGHa )-281, 281VL4-CH1(IGHD(14))-281, 281VL4-CH1(IGHD(15))-281, 281VL4-CH1(IGHE)-281, 281VL4-CH1(IGHGP)-281 y 281VL4-^CH1^{( iGHM)-}281^{, respectivamente.}

En 281VL4-CH1(IGHA)-281, 281VL4-CH1 (IGHD(14))-281, 281VL4-CH1(IGHE)-281, 281VL4-CH1(IGHGP)-281 y 281VL4-CH1(IGHM)-281, la secuencia CH1 (posiciones 118 a 131 del índice EU de Kabat) de cada subclase se insertó como un enlazador entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada 281VL4, extremo 5' de la cadena pesada de 281). Debido a que la subclase IGHD en la que el aminoácido en la posición 131 no era cisteína, el aminoácido en la posición 131 se sustituyó reemplazando glicina con cisteína, y para IGHGP, el aminoácido en la posición 131 se sustituyó reemplazando serina con cisteína. Además, en 281VL4-CH1(IGHD(15))-281, la secuencia CH1 (posiciones 118 a 132) de IGHD se insertó como un enlazador entre las cadenas pesadas.

Las secuencias génicas que codifican las cadenas pesadas de estos anticuerpos se produjeron basándose en el procedimiento del método genético usado en el Ejemplo 24. Cada una de las secuencias de los ácidos nucleicos de cadena pesada y las secuencias de aminoácidos de cadena pesada (SEQ ID NO: 207 a 218) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 33

Preparación del Vector de Expresión del Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador en la Tabla 13

Para producir el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281VL4 anti-CD28 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281 anti-CD40 desde el lado N-terminal mediante un enlazador mostrado en la Tabla 13. Debido a que se utiliza la misma cadena ligera que la de 281 para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende un tipo de secuencia de cadena ligera. Estos anticuerpos multivalentes se denominaron 281VL4-CH1 (118-131/A118G)-281, 281VL4-CH1(118-131/S119T)-281, 281VL4-CH1(118-131/P123F)-281, 281VL4-CH1(118-131/V125L)-281, 281VL4-CH1(118-131/V125I)-281, 281VL4-CH1(118-131/F126L)-281, 281VL4-CH1(118-131/F126Y)-281, 281VL4-CH1(118-131/P127G)-281, 281VL4-CH1(118-131/L128V)-281, 281VL4-CH1(118-131/L128I)-281, 281VI,4-CH1(118-131/A129I)-281, y 281VL4-CH1(118-131/P130F)-281, respectivamente.

En 281VL4-CH1(118-131/A118G)-281, 281VL4-CH1(118-131/S119T)-281, 281VL4-CH1(118-131/P123F)-281, 281VL4-CH1(118-131/V125L)-281, 281VL4-CH1(118-131/V125I)-281, 281VL4-CH1(118-131/F126L)-281, 281VL4-CH1(118-131/F126Y)-281,281VL4-CH1(118-131/P127G)-281,281VL4-CH1(118-131/L128V)-281,281VL4-CH1(118-131/L128I)-281, 281VL4-CH1(118-131/A129I)-281, y 281VL4-CH1(118-131/P130F)-281, se insertó una secuencia en la que se mutó el CH1 (posiciones 118 a 131 del índice EU de Kabat) de IgG4 como enlazador entre las cadenas pesadas (extremo 3' de cadena pesada 281VL4, extremo 5' de la cadena pesada de 281). La mutación en cada enlazador es un aminoácido. El aminoácido en la secuencia CH1 de IgG4 se sustituyó con otros aminoácidos al azar.

Las secuencias génicas que codifican las cadenas pesadas de estos anticuerpos se prepararon basándose en el procedimiento del método genético usado en el Ejemplo 24. Cada una de las secuencias de los ácidos nucleicos de cadena pesada y las secuencias de aminoácidos de cadena pesada (SEQ ID NO: 219 a 242) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 34

Expresión y Purificación de Anticuerpo Multivalente

Cada gen del vector de expresión preparado en los Ejemplos 29 a 33 se obtuvo utilizando el kit QIAGEN Plasmid Maxi (fabricado por Qiagen) y después se introdujo en células 293 no adherentes utilizando el Sistema de Expresión de 293 FreeStyle™ (Invitrogen de Life Technologies Corporation) para obtener el sobrenadante de cultivo que contenía cada anti cuerpo mediante expresión transitoria. El anticuerpo purificado se obtuvo del sobrenadante de cultivo de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 16. Con respecto a la densidad del anticuerpo purificado, se midió la absorbancia a 280 nm y se asumió que la densidad del 1 mg/ml de anticuerpo era 1,40 de Densidad Óptima para el cálculo.

Ejemplo 35

Evaluación de la Estabilidad de los Anticuerpos

La tasa de contenido agregado de la solución de anticuerpos se midió de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 18. En la Tabla 14 se muestra el resultado.

T l 141

(continuación)

Ejemplo 36

Estructura del Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y la Secuencia en la Región CH1 de Cada Subclase de Ig Humana como Enlazador

Para preparar un anticuerpo multivalente que comprenda el sitio de reconocimiento para CD28, el sitio de reconocimiento para CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de cadena pesada, la región variable de cadena pesada de anticuerpo 281VL4 anti-CD28 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281 anti-CD40 desde el lado N-terminal mediante un enlazador mostrado en la Tabla 1. Como enlazador del anticuerpo multivalente en cada Ejemplo, se insertaron la secuencia en la región CH1 de cada subclase de Ig humana y GS (GGATCC) de la secuencia BamHI añadida a su extremo 3'. Estos anticuerpos multivalentes se denominaron 281VL4-A1(118-143)GS-281, 281VL4-A2(118-143)GS-281, 281VL4-E(118-143)GS-281, 281VL4-G1(118-143)GS-281, 281VL4-G2(118-143)GS-281, 281VL4-G3(118-143)GS-281, 281VL4-HGP(118-143)GS-281, 281VL4-D(118-143)GS-281 y 281VL4-M(118-143)GS-281, respectivamente. La figura 15 muestra las estructuras de los anticuerpos multivalentes producidos.

Ejemplo 37

Preparación del Vector de Expresión de Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por la SEQ ID NO: 244, 246, 250, 252, 254, 256 o 258

Para producir un anticuerpo multivalente que comprenda el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en orden desde el lado N-terminal de la cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD28 281VL4 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD40281 desde el lado N-terminal a través de un enlazador (SEQ ID NO: 244, 246, 250, 252, 254, 256 o 258). Debido a que se utiliza la misma cadena ligera tanto para el anticuerpo anti-281 como para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende un tipo de secuencia de cadena ligera.

Las secuencias génicas que codifican las cadenas pesadas de estos anticuerpos se prepararon basándose en el procedimiento del método genético usado en el Ejemplo 24.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-A1(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO: 261), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-A1(118 - 143)GS-281 (SEQ iD NO: 262), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281v L4-A2(118 - 143)GS-281 (Se Q ID NO: 263), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-A2(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO: 264), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-E(118 - 143)Gs -281 (SEQ ID n O: 265), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-E(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO: 266), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G1(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO: 267), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G1(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO: 268), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 143)GS-281 (Se Q ID NO: 269), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 143)GS-281 (Se Q ID NO: 270), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G3(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO: 271), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G3(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO: 272), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-HGP(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO: 273) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-HGP(118 - 143)Gs -281 (s Eq ID NO: 274) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 38

Preparación del Vector de Expresión de Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por la SEQ ID NO: 248 o 260

Para producir el anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281VL4 anti-CD28 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281 anti-CD40 desde el lado N-terminal mediante un enlazador (SEQ ID NO:248 o 260). Debido a que se utiliza la misma cadena ligera tanto para el anticuerpo anti-281 como para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende un tipo de secuencia de cadena ligera.

La secuencia del gen que codifica la cadena pesada de 281VL4-enlazador (SEQ ID NO: 248 y 260)-281 se preparó mediante las siguientes etapas.

^{Se realizó la PCR de 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a}68 ^°Cdurante 30 minutos como un ciclo utilizando la cadena pesada de 281 como plantilla y Nhel CD40 Hc L 5'-CTAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGGGGTGG-3 ' (SEQ ID NO:275) como el cebador L e IgD-CH1-CD40 U 5'-GCCCTGTGGTCCTGGCAggatccCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCC-3 ' (SEQ ID NO:276) y IgM-CH1-CD40 U 5'-ACGAGCAGCGTGGCCGTTGGCggatccCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG-3' (SEQ ID NO:277) como el cebador U, y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Adicionalmente, ^{se realizó la PCR de 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a}68 ^°Cdurante 30 minutos como un ciclo utilizando el producto de PCR obtenido como plantilla y Nhel CD40 Hc L 5'-CTAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGGGGTGG-3 ' (SEQ ID NO:275) como el cebador L e IgD-CH1-2U 5'-CATATCAGGGTGCAGACACCCAAAGGATAACAGCCCTGTGGTCCTGGCA-3' (SEQ ID NO:278) e IgM-CH1-2 U 5'-CTCGTCTCCTGTGAGAATTCCCCGTCGGATACGAGCAGCGTGGCCGTTG -3' (SEQ ID NO:279) como el cebador U, y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co. Ltd). Por otra parte, se realizó ^{la PCR de 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a}68 ^{°C durante 30}minutos como un ciclo utilizando el producto de PCR obtenido como plantilla y Nhel CD40 Hc L 5'-CTAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGGGGTGG-3 ' (SEQ ID NO:275) como el cebador L e IgD-CH1U 5'-GCACCCACCAAGGCTCCGGATGTGTTCCCCATCATATCAGGGTGCAGAC -3' (SEQ ID NO:280) e IgMCH1U 5'-GGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATT -3' (SEQ ID NO:281) como el cebador U, y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co.Ltd), y por lo tanto se preparó el enlazador-cadena pesada de 281-fragmento génico de Nhel que tiene la secuencia Nhel en el extremo 3'. Por otro ^{lado, se realizó PCR de 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos, y a}68 ^°C durante 30 segundos como un ciclo utilizando la secuencia de cadena pesada de 281VL4 como plantilla y 5'-GGGGTCGACACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGG-3' (SEQ ID NO: 138) como cebador U y CD28-IgD L 5'-CATCCGGAGCCTTGGTGGGTGCTGAGGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG-3' (SEQ ID NO: 282) y CD28-IgM L 5'-GGGTTGGGGCGGA TGCACTCCCTGAGGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG-3' (SEQ ID NO:283) como el cebador L y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co.Ltd) para preparar Sa/I-281VL4-enlazador, se preparó el fragmento génico que comprendía la secuencia Sa/I en el extremo 5'. El Sa/I-281VL4-fragmento génico del enlazador y el enlazador-cadena pesada de 281-fragmento génico de NheI se unieron con PCR de extensión solapada y se realizó PCR de 30 ciclos de reacción a 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 ^{segundos, y a}68 ^{°C durante 30 segundos como un ciclo utilizando 5'-}GGGGTCGACACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGG-3' (SEQ ID NO: 138) y NheI CD40 Hc L 5'-CTAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGGGGTGG-3' (SEQ ID NO: 275) y utilizando ADN polimerasa (KOD-Plus, fabricada por Toyobo Co.Ltd) para preparar Sa/I-281VL4-enlazador-281-fragmento génico de NheI que comprendía la secuencia de Sa/I en el extremo 5' y la secuencia NheI en el extremo 3'. Este fragmento génico se digirió con Sa/I y NheI y se insertó en el vector de expresión de 281VL4 digerido con Sa/I y NheI. Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-D(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO: 284), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-D(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO: 285 ), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-M(118 - 143)GS-281 (Se Q ID NO: 286) y la secuencia de aminoácidos ^{de cadena pesada de 281VL4-M(118 - 143)GS-281 (SEQ ID NO:}287^{) se muestra en el Listado de secuencias.}

Ejemplo 39

Expresión y Purificación del Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por una cualquiera de las SEQ ID NO: 244 a 260

El gen del vector de expresión preparado se obtuvo utilizando el kit QIAGEN Plasmid Maxi (fabricado por Qiagen) y se introdujo en células 293 no adherentes utilizando el Sistema de Expresión de 293 FreeStyle™ (Invitrogen de Life Technologies Corporation) para obtener el sobrenadante de cultivo que contenía cada anticuerpo por expresión transitoria. El anticuerpo purificado se obtuvo a partir de este sobrenadante de cultivo de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 16. Con respecto a la densidad del anticuerpo purificado, se midió la absorbancia a 280 nm y se asumió que la densidad del 1 mg/ml de anticuerpo era 1,40 de densidad óptima para el cálculo.

Ejemplo 40

Medición de la Productividad del Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por una cualquiera de las SEQ ID NO: 244 a 260

Se midió la cantidad que contenía el anticuerpo en los sobrenadantes de cultivo correspondientes para conocer la productividad del anticuerpo. El contenido de anticuerpos se midió de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 17. En la Tabla 16 se muestra el resultado.

T l 11

Ejemplo 41

Evaluación de la Estabilidad del Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por una cualquiera de las SEQ ID NO: 244 a 260

La tasa de contenido agregado de la solución de anticuerpos se midió mediante las etapas del Ejemplo 18. En la Tabla 17 se muestra el resultado.

Ejemplo 42

Estructura del Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y la Secuencia (SEQ ID NO: 254, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309 o 311) en la Región CH1 de IgG2 como enlazador

Para preparar un anticuerpo multivalente que comprenda el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en una fila en orden desde el lado N-terminal de la cadena pesada, el aminoácido de la ^{secuencia CH1 de la IgG2 humana (posiciones 118 a 143 del índice EU de Kabat) que se muestra en la Tabla}6 ^seeliminó uno a uno del lado C-terminal (posiciones 118 a 131 del índice EU de Kabat). A cada secuencia obtenida, se añadió la secuencia BamHI, GS (GGATCC), en el extremo 3' para ser un enlazador. Los enlazadores obtenidos se representaron por las SEQ ID NO: 254, 289, 291,293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309 y 311, respectivamente. La región variable de cadena pesada del anticuerpo 281VL4 anti-CD28 se unió en tándem a la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281 anti-CD40 desde el lado N-terminal mediante cada enlazador.

Estos anticuerpos multivalentes se denominaron 281VL4-G2(118 - 143)GS-281, 281VL4-G2(118 - 142)GS-281, 281VL4-G2(118 - 141)GS-281, 281VL4-G2(118 - 140)GS-281, 281VL4-G2(118 - 139)GS-281, 281VL4-G2(118 -138)GS-281,281VL4-G2(118 - 137)GS-281,281VL4-G2(118 - 136)GS-281, 281VL4-G2(118 - 135)GS-281, 281VL4-G2(118 - 134)GS-281,281VL4-G2(118 - 133)GS-281,281VL4-G2(118 - 132)GS-281 y 281VL4-G2(118 -131)GS-281, respectivamente. Además, 281VL4-G2(118-143)GS-281 se mostró en el Ejemplo 36. Por otra parte, como un anticuerpo multivalente utilizando las posiciones 118 - 131 del índice UE de Kabat como enlazador, se usó 281VL4-CH1(118-131)-281 mostrado en el Ejemplo 24.

La Tabla 18 muestra las estructuras de los anticuerpos multivalentes producidos.

-o 'o c _o o

Ejemplo 43

Preparación del Vector de Expresión de Anticuerpo Multivalente que comprende el Sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD28 (origen 281VL4) en el lado N-terminal, el sitio de Reconocimiento de Antígenos para CD40 (origen 281) en el lado C-terminal y el Enlazador representado por la SEQ ID NO: 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307 o 309

Para producir un anticuerpo multivalente que comprende el sitio de reconocimiento para CD28 y el sitio de reconocimiento para CD40 en orden desde el lado N-terminal de cadena pesada, la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281VL4 anti-CD28 se unió en tándem desde el lado N-terminal a la región variable de cadena pesada del anticuerpo 281 anti-CD40 mediante un enlazador (SEQ ID NO: 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307 o 309). Debido a que se utiliza la misma cadena ligera tanto para el anticuerpo anti-281 como para el anticuerpo anti-CD28, el vector de expresión comprende un tipo de secuencia de cadena ligera. La secuencia de genes que codifica las cadenas pesadas de estos anticuerpos se produjo basándose en el procedimiento del método genético usado en el Ejemplo 24.

Cada una de la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 142)GS-281 (SEQ ID NO: 312), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 142)GS-281 (SEQ iD NO: 313), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281v L4-G2(118 - 141)GS-281 (Se Q ID NO: 314), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 141)GS-281 (SEQ ID NO: 315), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 140)GS-281 (SEQ ID NO: 316), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 140)Gs -281 (SEQ ID n O: 317), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 139)GS-281 (SEQ ID NO: 318), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G2(118 -139)GS-281 (Se Q ID NO: 319), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 138)GS-281 (SEQ ID NO: 320), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281v L4-G2(118 - 138)GS-281 (SEQ ID NO: 321), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 137)GS-281 (SEQ ID NO: 322), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 137)GS-281 (Se Q ID NO: 323), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 136)GS-281 (SEQ ID NO: 324), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 136)GS-281 (SEQ ID NO: 325), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 135)GS-281 (SEQ ID NO: 326), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 135)Gs -281 (SEQ ID n O: 327), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 134)GS-281 (SEQ ID NO: 328), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G2(118 -134)GS-281 (Se Q ID NO: 329), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 133)GS-281 (SEQ ID NO: 330), la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281v L4-G2(118 - 133)GS-281 (SEQ ID NO: 331), la secuencia del ácido nucleico de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 132)GS-281 (Se Q ID No : 332) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 281VL4-G2(118 - 132)Gs -281 (SEQ ID NO: 333) se muestra en el Listado de Secuencias.

Ejemplo 44

Expresión y Purificación de Anticuerpo Multivalente

El gen del vector de expresión producido se obtuvo utilizando el kit QIAGEN Plasmid Maxi (fabricado por Qiagen) y se introdujo en células 293 no adherentes utilizando el Sistema de Expresión de 293 FreeStyle™ (Invitrogen de Life Technologies Corporation) para obtener el sobrenadante de cultivo que contenía cada anticuerpo por expresión transitoria. El anticuerpo purificado se obtuvo del sobrenadante del cultivo de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 16. Con respecto a la densidad del anticuerpo purificado, se midió la absorbancia a 280 nm y se asumió que la densidad del 1 mg/ml de anticuerpo era 1,40 de densidad óptima para el cálculo.

Ejemplo 45

Medición de la Productividad de Anticuerpos

Se midió la cantidad que contenía el anticuerpo en el sobrenadante de cultivo correspondiente para conocer la productividad del anticuerpo. La medición del contenido de anticuerpos se realizó de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 17. En la Tabla 19 se muestra el resultado.

(conitnuación)

Ejemplo 46

Evaluación de la Estabilidad del Anticuerpo

El contenido agregado de la solución de anticuerpos se midió de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 18. En la Tabla 20 se muestra el resultado.

Aplicabilidad industrial

El anticuerpo de la presente invención muestra alta estabilidad y una característica de que el anticuerpo puede producirse con alta productividad y tiene utilidad como anticuerpo para un fármaco o en diagnóstico.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo multivalente que comprende múltiples regiones variables de cadena pesada de anticuerpo (en lo sucesivo en el presente documento, denominadas VH) unidas entre sí mediante un enlazador, en donde el enlazador consiste en:

(i) un dominio CH1; o

en donde el dominio CH1 o el fragmento de dominio CH1 es de la subclase lgG4.

2. El anticuerpo multivalente de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento de dominio CH1 es la secuencia de aminoácidos en las posiciones 1 a 14 desde el extremo N de una secuencia de aminoácidos de CH1.

3. El anticuerpo multivalente de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende las mismas cadenas ligeras.

4. Un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos del anticuerpo multivalente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector de recombinación que comprende el ADN de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Una célula transformante en la que se introduce el vector de recombinación de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un método para producir el anticuerpo multivalente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar la célula transformante descrita en la reivindicación 6 en un medio para producir y acumular el anticuerpo multivalente descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el cultivo y recuperar el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo del cultivo.