[go: up one dir, main page]

TWI875760B - 與cd40及gpc3結合之雙專一性抗體 - Google Patents

與cd40及gpc3結合之雙專一性抗體 Download PDF

Info

Publication number
TWI875760B
TWI875760B TW109116230A TW109116230A TWI875760B TW I875760 B TWI875760 B TW I875760B TW 109116230 A TW109116230 A TW 109116230A TW 109116230 A TW109116230 A TW 109116230A TW I875760 B TWI875760 B TW I875760B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
bispecific antibody
gpc3
amino acid
human
Prior art date
Application number
TW109116230A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202108625A (zh
Inventor
住友嘉樹
甲斐正之
Original Assignee
日商協和麒麟股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商協和麒麟股份有限公司 filed Critical 日商協和麒麟股份有限公司
Publication of TW202108625A publication Critical patent/TW202108625A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI875760B publication Critical patent/TWI875760B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本發明之目的在於提供一種包含與CD40結合之抗原結合域及與GPC3結合之抗原結合域的雙專一性抗體。本發明係關於一種包含與CD40結合之抗原結合域及與GPC3結合之抗原結合域的雙專一性抗體、該雙專一性抗體片段、編碼該雙專一性抗體或雙專一性抗體片段之DNA、包含該DNA之載體等。

Description

與CD40及GPC3結合之雙專一性抗體
本發明係關於一種包含與CD40結合之抗原結合部位及與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(Glypican 3，GPC3)結合之抗原結合部位之雙專一性抗體、該雙專一性抗體片段、編碼該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之DNA、包含該DNA之載體、生產該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之融合瘤及轉形株、該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之製造方法、包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療及診斷劑、使用該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療及診斷方法、以及包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之檢測或測定試劑。
CD40係鑑定為於人類B細胞表面表現之抗原之I型膜型糖蛋白質，且已知亦於B淋巴細胞或樹狀細胞、單核球上皮細胞、纖維母細胞等多種細胞類型、或腫瘤性人類B細胞等某種腫瘤細胞表現。於CD40缺失小鼠中，確認到胸腺依賴之免疫球蛋白之類型轉變或胚芽中心之形成受到損害，證實了CD40於細胞性及液性免疫反應之重要作用。
CD40之訊息會參與免疫球蛋白之類型轉變或CTL之誘導，因此亦期待作為腫瘤免疫之活化或癌症疫苗之佐劑應用於醫藥品(非專利文獻1)。
磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(GPC3、SGB、DGSX、MXR7、SDYS、SGBS、OCI-5、SGBS1、GTR2-2)係包含580個胺基酸之GPI錨 定型膜蛋白質。GPC3於產生期在全身之組織中可見表現，但成體於正常組織中表現受限(非專利文獻2)，作為於肝細胞癌中高表現之癌抗原為人所知。又，報告有GPC3於惡性黑色素瘤、卵巢透明細胞癌、卵黃囊瘤、絨毛膜癌、神經胚細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯腫瘤、睾丸生殖細胞腫瘤、脂肪肉瘤中亦表現，而期待作為癌症分子靶向醫藥品之靶分子或診斷標記物、癌疫苗靶(非專利文獻3)。
作為既有之以CD40為靶之抗體，可列舉：Chi-Lob 7/4、HCD-122、APX005M、SEA-CD40及CP870,893(21.4.1)等(非專利文獻3)。其中，CP870,893具有強力之CD40訊息誘導能力，並對於實體腫瘤實施了以全身性之免疫活化作為藥效機制之臨床試驗。然而，並未顯示出有效性，且報告有細胞激素綜合症、血栓標記物之上升、肝臟參數之上升等源自全身性免疫活化之毒性之表現(非專利文獻5)。
作為識別CD40之雙專一性蛋白質，已知有識別CD28與CD40之多價抗體(專利文獻1)。已知有具有經異型二聚化之重鏈之IgG型抗人類GPC3/抗小鼠CD40雙專一性抗體(專利文獻2)。又，已知有與結合素4(nectin-4)、PSMA、EGFR、HER2及MSLN等癌抗原以及CD40結合、使CD40活化之雙專一性蛋白質(專利文獻3、4)。專利文獻1、3及4之雙專一性抗體具有源自抗CD40促效性抗體之CD40結合部位。
進而，已知有藉由對CD40及癌細胞表面抗原具有特異性之雙功能抗體(Diabody)等雙專一性分子而於癌細胞附近使CD40表現細胞活化的方法(專利文獻5)。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開第2009/131239號
專利文獻2：國際公開第2015/156268號
專利文獻3：國際公開第2017/205738號
專利文獻4：國際公開第2018/140831號
專利文獻5：國際公開第99/61057號
非專利文獻
非專利文獻1：Diehl L et al., Nat Med. 1999 Jul; 5 (7):774-9.
非專利文獻2：Nakatsura Tetsuya et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 306 (2003) 16-25
非專利文獻3：Mitchell Ho and Heungnam Kim, Eur J of Cancer. 2011 Nov; 47 (3):333-338
非專利文獻4：Beatty GL et al., Expert Rev Anticancer Ther. 2017 Feb; 17 (2):175-186.
非專利文獻5：Vonderheide RH et al., Oncoimmunology. 2013 Jan 1; 2(1):e23033.
本發明係提供一種與CD40及GPC3特異性結合之雙專一性抗體。本發明之目的在於提供一種包含與CD40結合之抗原結合域及與GPC3結合之抗原結合域之雙專一性抗體、該雙專一性抗體片段、編碼該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之DNA、包含該DNA之載體、生產該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之融合瘤及轉形株、該雙專一性抗 體或該雙專一性抗體片段之製造方法、包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療及診斷劑、使用該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療及診斷方法、以及包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之檢測或測定試劑。
作為解決上述課題之方法，本發明提供一種雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段等，該雙專一性抗體包含與CD40結合之抗原結合域及與GPC3結合之抗原結合域。
即，本發明係關於以下。
1.一種雙專一性抗體，其含有包含第一抗原結合域之IgG部分及第二抗原結合域，且該IgG部分之重鏈之C末端直接或經由連接子與該第二抗原結合域結合，該雙專一性抗體係選自由以下(i)及(ii)所組成之群中之一者；(i)第一抗原結合域為與人類CD40結合之抗原結合域，第二抗原結合域為與人類磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(GPC3)結合之抗原結合域之雙專一性抗體(ii)第一抗原結合域為與人類GPC3結合之抗原結合域，第二抗原結合域為與人類CD40結合之抗原結合域之雙專一性抗體。
2.如上述1記載之雙專一性抗體，其以二價分別與人類CD40及人類GPC3結合。
3.如上述1或2記載之雙專一性抗體，其中IgG部分之重鏈之C末端與第二抗原結合域直接結合。
4.如上述1至3中任一項記載之雙專一性抗體，其中第二抗原結合域 為Fab。
5.如上述1至4中任一項記載之雙專一性抗體，其具有CD40促效劑活性。
6.如上述1至5中任一項記載之雙專一性抗體，其於不存在GPC3表現細胞下不顯示CD40促效劑活性，僅於GPC3表現細胞之存在下顯示CD40促效劑活性。
7.如上述1至6中任一項記載之雙專一性抗體，其中與人類CD40結合之抗原結合域包含源自非促效性抗CD40抗體之重鏈可變區(VH)之互補決定區(CDR)1~3及輕鏈可變區(VL)之CDR1~3。
8.如上述1至7中任一項記載之雙專一性抗體，其中與人類CD40結合之抗原結合域包含如下VH及VL，該VH分別包含序列編號16~18所表示之胺基酸序列之CDR1~3，該VL含有分別包含序列編號11~13所表示之胺基酸序列之CDR1~3。
9.如上述1至8中任一項記載之雙專一性抗體，其中與人類CD40結合之抗原結合域包含如下VH及VL，該VH包含序列編號15所表示之胺基酸序列，該VL包含序列編號10所表示之胺基酸序列。
10.如上述1至9中任一項記載之雙專一性抗體，其中與人類GPC3結合之抗原結合域包含如下VL及VH，該VL含有分別包含序列編號11~13所表示之胺基酸序列之CDR1~3，該VH係選自由以下(1a)~(1g)所組成之群中之任一者；
(1a)含有分別包含序列編號42~44所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1b)含有分別包含序列編號47~49所表示之胺基酸序列之CDR1~3 之VH
(1c)含有分別包含序列編號52~54所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1d)含有分別包含序列編號57~59所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1e)含有分別包含序列編號62~64所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1f)含有分別包含序列編號67~69所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1g)含有分別包含序列編號72~74所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH。
11.如上述1至10中任一項記載之雙專一性抗體，其中與人類GPC3結合之抗原結合域包含如下VL及VH，該VL包含序列編號10所表示之胺基酸序列，該VH係選自由以下(2a)~(2g)所組成之群中之任一者；
(2a)包含序列編號41所表示之胺基酸序列之VH
(2b)包含序列編號46所表示之胺基酸序列之VH
(2c)包含序列編號51所表示之胺基酸序列之VH
(2d)包含序列編號56所表示之胺基酸序列之VH
(2e)包含序列編號61所表示之胺基酸序列之VH
(2f)包含序列編號66所表示之胺基酸序列之VH
(2g)包含序列編號71所表示之胺基酸序列之VH。
12.如上述1至11中任一項記載之雙專一性抗體，其中上述IgG部分之重鏈恆定區包含序列編號77所表示之胺基酸序列。
13.如上述1至12中任一項記載之雙專一性抗體，其包含2條重鏈及4條輕鏈，該重鏈包含選自序列編號96、98、100、102、104、106及108中之任一者所表示之胺基酸序列，該輕鏈含有包含序列編號10所表示之胺基酸序列之VL。
14.一種雙專一性抗體片段，其係如上述1至13中任一項記載之雙專一性抗體之雙專一性抗體片段。
15.一種DNA，其編碼如上述1至13中任一項記載之雙專一性抗體或如上述14記載之雙專一性抗體片段。
16.一種重組體載體，其含有如上述15記載之DNA。
17.一種轉形株，其係將如上述16記載之重組體載體導入至宿主細胞而獲得。
18.一種如上述1至13中任一項記載之雙專一性抗體或如上述14記載之雙專一性抗體片段之製造方法，其特徵在於：將如上述17記載之轉形株於培養基中進行培養，於培養物中使如上述1至13中任一項記載之雙專一性抗體或如上述14記載之雙專一性抗體片段產生並蓄積，而自該培養物採集該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。
19.一種與人類CD40及人類GPC3之至少一者相關之疾病之治療劑及/或診斷劑，其含有如上述1至13中任一項記載之雙專一性抗體或如上述14記載之雙專一性抗體片段作為有效成分。
20.如上述19記載之劑，其中與人類CD40及人類GPC3之至少一者相關之疾病為癌症。
21.一種與人類CD40及人類GPC3之至少任一者相關之疾病之治療方法及/或診斷方法，其使用如上述1至13中任一項記載之雙專一性抗體或如 上述14記載之雙專一性抗體片段。
22.如上述21記載之方法，其中與人類CD40及人類GPC3之至少一者相關之疾病為癌症。
23.一種如上述1至13中任一項記載之雙專一性抗體或如上述14記載之雙專一性抗體片段，其用以治療及/或診斷與人類CD40及人類GPC3之至少一者相關之疾病。
24.如上述23記載之雙專一性抗體或雙專一性抗體片段，其中與人類CD40及人類GPC3之至少一者相關之疾病為癌症。
25.一種如上述1至13中任一項記載之雙專一性抗體或如上述14記載之雙專一性抗體片段之用途，其係用於製造與人類CD40及人類GPC3之至少一者相關之疾病之治療劑及/或診斷劑。
26.如上述25記載之用途，其中與人類CD40及人類GPC3之至少一者相關之疾病為癌症。
27.一種用以檢測或測定GPC3及CD40之至少一者之試劑，其包含如上述1至13中任一項記載之雙專一性抗體或如上述14記載之雙專一性抗體片段。
28.一種雙專一性抗體之衍生物，其係使放射性同位素、低分子藥劑、高分子藥劑、蛋白質或抗體醫藥以化學或基因工程方式與如上述1至13中任一項記載之雙專一性抗體或如上述14記載之雙專一性抗體片段結合而成。
藉由本發明，可提供一種包含與CD40結合之抗原結合域及與GPC3結合之抗原結合域之雙專一性抗體、該雙專一性抗體片段、編 碼該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之DNA、包含該DNA之載體、產生該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之融合瘤及轉形株、該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之製造方法、包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療劑及診斷劑、使用該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之治療方法及診斷方法、以及包含該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之檢測或測定試劑。
圖1係表示本發明之雙專一性抗體之結構之一例。
圖2(A)、(B)及(C)係藉由ELISA法對各種GPC3-CD40雙專一性抗體與hGPC3-His之結合進行評價所得之結果。縱軸表示吸光度，橫軸表示各所添加之CD40-GPC3雙專一性抗體。抗體係以10、1、0.1、0.01、0.001或0.0001μg/mL添加。比較對象係使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體。
圖3(A)、(B)、(C)及(D)係藉由FCM對各種CD40-GPC3雙專一性抗體對於Expi293F細胞之結合活性進行評價所得之結果。縱軸表示平均螢光強度(MFI)，橫軸表示各所添加之雙專一性抗體。抗體係以10、1或0.1μg/mL添加。比較對象係使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體。圖3(E)、(F)、(G)及(H)係藉由FCM對各種CD40-GPC3雙專一性抗體與暫時性表現人類GPC3之Expi293F細胞之結合進行評價所得之結果。縱軸表示平均螢光強度(MFI)，橫軸表示各所添加之雙專一性抗體。抗體係以10、1或0.1μg/mL添加。比較對象係使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體。
圖4(A)及(C)係藉由FCM對各抗體或雙專一性抗體對於Ramos細胞之 結合活性進行評價所得之結果。縱軸表示平均螢光強度(MFI)，橫軸表示各所添加之抗體或雙專一性抗體。抗體係以10、1、0.1或0.01μg/mL添加。圖4(B)及(D)係藉由FCM對各抗體或雙專一性抗體對於HepG2細胞之結合活性進行評價所得之結果。縱軸表示平均螢光強度(MFI)，橫軸表示各所添加之抗體或雙專一性抗體。抗體係以10、1、0.1或0.01μg/mL添加。比較對象係使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體。
圖5(A)、(B)、(C)、(D)及(E)係表示R1090S55A及各種CD40-GPC3雙專一性抗體對於Ramos細胞之CD40訊息誘導活性。縱軸表示基於平均螢光強度(MFI)之CD95表現量，橫軸表示所添加之雙專一性抗體。抗體係以10、1、0.1、0.01或0.001μg/mL添加。比較對象係使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用抗CD40促效劑抗體即CP-870,893作為陽性對照抗體。
圖6(A)、(B)、(C)及(D)係表示各種CD40-GPC3雙專一性抗體對於與HepG2細胞共培養之Ramos細胞之CD40訊息誘導活性。圖6(A)、(B)及(C)表示分別將雙專一性抗體以10、1、0.1、0.01或0.001μg/mL添加時抗CD95抗體對於Ramos細胞之結合活性。縱軸表示基於平均螢光強度(MFI)之CD95表現量。橫軸表示所添加之雙專一性抗體。比較對象係使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用抗CD40促效劑抗體即CP-870,893作為陽性對照抗體。
圖7(A)、(B)係表示各種CD40-GPC3雙專一性抗體對於與HepG2細胞共培養之人類樹狀細胞之CD40訊息誘導活性。圖7(A)係表示藉由FCM對樹狀細胞之CD80表現進行評價所得之結果，圖7(B)係表示藉由FCM對樹狀細胞之CD86表現進行評價所得之結果。縱軸表示相對於添加抗DNP 抗體時之相對螢光強度(RFI)。各雙專一性抗體係以10、1、或0.1μg/mL。比較對象係使用抗CD40促效劑抗體即CP-870,893作為陽性對照抗體。
圖8(A)係表示藉由FCM對HuH-7細胞、MC-38/hGPC3細胞、HepG2細胞之GPC3表現量進行評價所得之結果。縱軸表示將作為抗GPC3抗體之GpS1019以1μg/mL添加之情形時，相對於使用抗DNP抗體之情形之相對螢光強度(RFI)。圖8(B)係表示將肝細胞癌患者檢體及HuH-7細胞、MC-38/hGPC3細胞於相同條件下進行免疫組織染色所得之結果。縱軸表示藉由圖像分析對免疫組織染色進行定量化所得之各染色強度之細胞之比例。
圖9(A)及(B)分別表示各種CD40-GPC3雙專一性抗體對於與HuH-7細胞或MC-38/hGPC3共培養之Ramos細胞之CD40訊息誘導活性。表示分別將雙專一性抗體以10、1、0.1、0.01或0.001μg/mL添加時抗CD95抗體對於Ramos細胞之結合活性。縱軸表示CD95之平均螢光強度(MFI)。比較對象係使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用抗CD40促效劑抗體即CP-870,893作為陽性對照抗體。
圖10(A)、(B)及(C)係表示各種抗GPC3抗體之競爭FCM之結果。於作為競爭抗體之各抗GPC3抗體之非標記體之存在下，使用作為檢測抗體之各抗GPC3抗體之螢光標記體來實施FCM。將相對於競爭抗體非存在下之MFI，競爭抗體存在下之MFI成為0.5以下之情形作為有競爭並記載為+，將超過0.5之情形作為無競爭並記載為-。
圖11(A)及圖11(B)係表示藉由FCM對抗GPC3抗體HN3及Ct-R1090-HN3對於HepG2細胞及Ramos細胞之結合性進行評價所得之結果。圖11(A)係表示對於HepG2細胞之結合性，圖11(B)係表示對於Ramos細胞之 結合性。縱軸表示MFI。
圖12(A)及圖12(B)係表示藉由FCM對抗GPC3抗體GC33及YP7、以及CD40-GPC3雙專一性抗體Ct-R1090-GpS1019-FL、Cross-R1090-GC33、及Cross-R1090-YP7對於HepG2細胞及Ramos細胞之結合性進行評價所得之結果。圖12(A)係表示對於HepG2細胞之結合性，圖12(B)係表示對於Ramos細胞之結合性。縱軸表示MFI。
圖13(A)係表示在與HuH-7共培養條件下各種CD40-GPC3雙專一性抗體對於Ramos之CD40訊息誘導活性，圖13(B)係表示在HuH-7(GPC3陽性細胞)非存在下各種CD40-GPC3雙專一性抗體對於Ramos之CD40訊息誘導活性。表示分別將雙專一性抗體以10、1、0.1、0.01或0.001μg/mL添加時抗CD95抗體對於Ramos細胞之結合活性。縱軸表示CD95之平均螢光強度(MFI)。比較對象係使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用抗CD40促效劑抗體即CP-870,893作為陽性對照抗體。
圖14(A)係表示在與MC-38/hGPC3共培養條件下各種CD40-GPC3雙專一性抗體之CD40訊息誘導活性，圖14(B)係表示在MC-38/hGPC3(GPC3陽性細胞)非存在下各種CD40-GPC3雙專一性抗體之CD40訊息誘導活性。表示分別將雙專一性抗體以10、1、0.1、0.01或0.001μg/mL添加時抗CD95抗體對於Ramos細胞之結合活性。縱軸表示CD95之平均螢光強度(MFI)。比較對象係使用抗DNP抗體作為陰性對照抗體，使用抗CD40促效劑抗體即CP-870,893作為陽性對照抗體。
圖15係表示使用人類CD40基因轉殖小鼠之MC-38/hGPC3荷瘤模型腫瘤中各種CD40-GPC3雙專一性抗體投予後之CD40訊息相關基因的表現變化。藉由即時PCR測定各基因之表現，將使用△△Ct法所計算出之相對 於賦形劑投予群之相對基因表現量於縱軸進行繪圖。
圖16(A)、(B)及(C)係表示於MC-38/hGPC3荷瘤人類CD40基因轉殖小鼠中投予各種抗體或雙專一性抗體後之末梢血液之血小板數、AST及ALT之值。
本發明係關於一種包含與CD40結合之抗原結合域及與GPC3結合之抗原結合域之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段(以下，記載為本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段)。
本發明中之CD40係以與TNF receptor superfamily member 5(TNFRSF5)、Bp50、CDW40、MGC9013及p50相同之含義來使用。作為CD40，例如可列舉：包含NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中基因庫登錄號(GenBank Accession No.)NP_001241或序列編號6所示之胺基酸序列之人類CD40、及包含基因庫登錄號XP_005569274或序列編號8所示之胺基酸序列之猴CD40等。又，例如可列舉：包含於序列編號6、基因庫登錄號NP_001241、或基因庫登錄號XP_005569274所示之胺基酸序列中缺失、置換或附加1個以上之胺基酸而成之胺基酸序列且具有CD40之功能的多肽。
本發明之CD40亦包括如下多肽：包含與序列編號6、基因庫登錄號NP_001241或基因庫登錄號XP_005569274所示之胺基酸序列具有通常70%以上、較佳為80%以上、進而較佳為90%以上之同源性之胺基酸序列的多肽；最佳為包含具有95%、96%、97%、98%及99%以上之同源性之胺基酸序列且具有CD40之功能的多肽。
關於具有於序列編號6、基因庫登錄號NP_001241或基因庫登錄號XP_005569274所示之胺基酸序列中缺失、置換或附加1個以上之胺基酸殘基而成之胺基酸序列的多肽，可藉由使用定點突變導入法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proceeding of the National Academy of Sciences in USA,82,488(1985)]等，對例如編碼序列編號6、基因庫登錄號NP_001241或基因庫登錄號XP_005569274所示之胺基酸序列之DNA導入定點突變而獲得。缺失、置換或附加之胺基酸之數量並無特別限定，較佳為1個~數十個、例如1~20個、更佳為1個~數個、例如1~5個胺基酸。
作為編碼CD40之基因，例如可列舉：序列編號5或基因庫登錄號NM_001250所示之人類CD40之鹼基序列、及序列編號7或基因庫登錄號XM_011766922所示之猴CD40之鹼基序列等。又，本發明之編碼CD40之基因例如亦包括：包含編碼如下多肽之DNA之基因，該多肽包含於序列編號5或基因庫登錄號NM_001250所示之鹼基序列中缺失、置換或附加1個以上之鹼基而成之鹼基序列，且具有CD40之功能；包含編碼如下多肽之DNA之基因，該多肽包含與序列編號5或基因庫登錄號NM_001250所示之鹼基序列具有60%以上之同源性之鹼基序列、更佳為具有80%以上之同源性之鹼基序列、進而較佳為具有95%以上之同源性之鹼基序列，且具有CD40之功能；以及包含編碼如下多肽之DNA之基因，該多肽包含與 包含序列編號5或基因庫登錄號NM_001250所示之鹼基序列之DNA在嚴格條件下進行雜交之DNA，且具有CD40之功能；等。
作為在嚴格條件下進行雜交之DNA係指藉由如下方法所獲得之能夠進行雜交之DNA：例如將具有序列編號5或基因庫登錄號NM_001250所示之鹼基序列之DNA用於探針之菌落雜交法、噬菌斑雜交法、南方墨點雜交法、或DNA微陣列法等。具體而言，可列舉：使用固定有源自經雜交之菌落或噬菌斑之DNA、或者具有該序列之PCR產物或寡DNA的過濾器或載玻片，於0.7~1.0mol/L之氯化鈉存在下，於65℃下進行雜交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、DNA Cloning 1：Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University(1995)]後，使用0.1~2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度之SSC溶液之組成包含150mmol/L氯化鈉、15mmol/L檸檬酸鈉)，於65℃條件下將過濾器或載玻片洗淨，藉此能夠進行鑑定之DNA。作為能夠進行雜交可能之DNA，例如可列舉：與序列編號5或基因庫登錄號NM_001250所示之鹼基序列具有較佳為60%以上之同源性之DNA、更佳為具有80%以上之同源性之DNA、進而較佳為具有95%以上之同源性之DNA。
關於編碼真核生物之蛋白質之基因之鹼基序列，經常可見基因之多態性。本發明之編碼CD40之基因中亦包括本發明中所使用之基因中由於此種多態性而於鹼基序列中產生小規模突變而成之基因。
關於本發明中之同源性之數值，除特別標明之情形以外，可為使用業者公知之同源性檢索程式所算出之數值，關於鹼基序列，可列 舉：BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中使用預設之參數所算出之數值等，關於胺基酸序列，可列舉：於BLAST2[Nucleic Acids Research,25,3389(1997)、Genome Research,7,649(1997)、http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中使用預設之參數所算出之數值等。
作為預設之參數，G(起始空位罰分(Cost to open gap))於鹼基序列之情形時為5，於胺基酸序列之情形時為11，-E(空位延伸罰分(Cost to extend gap))於鹼基序列之情形時為2，於胺基酸序列之情形時為1，-q(核苷酸錯配罰分(Penalty for nucleotide mismatch))為-3，-r(核苷酸匹配獎分(reward for nucleotide match))為1，-e(期望值(expect value))為10，-W(序列長度(wordsize))於鹼基序列之情形時為11個殘基，於胺基酸序列之情形時為3個殘基，-y[以位數表示之非空位延伸下降值(Dropoff(X)for blast extensions in bits)]於blastn之情形時為20，於blastn以外之程式中為7，-X(以位數表示之空位比對下降值(X dropoff value for gapped alignment in bits))為15，且-Z(以位數表示之最終空位比對下降值(final X dropoff value for gapped alignment in bits))於blastn之情形時為50，於blastn以外之程式中為25(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
包含CD40之胺基酸序列之部分序列之多肽可藉由業者公知之方法進行製作，例如可藉由如下方式進行製造：使編碼序列編號6、基因庫登錄號NP_001241或基因庫登錄號XP_005569274所示之胺基酸序列之DNA之一部分缺失，導入包含其之表現載體而獲得轉形體，將該轉形體進行培養。又，基於藉由上述方法所製作之多肽或DNA，並藉由與 上述相同之方法，例如可獲得具有於序列編號6、基因庫登錄號NP_001241或基因庫登錄號XP_005569274所示之胺基酸序列之部分序列中缺失、置換或附加1個以上之胺基酸而成之胺基酸序列的多肽。進而，包含CD40之胺基酸序列之部分序列之多肽、或具有於CD40之胺基酸序列之部分序列中缺失、置換或附加1個以上之胺基酸而成之胺基酸序列之多肽亦可藉由茀基甲氧基羰基(Fmoc)法、第三丁氧基羰基(tBoc)法等化學合成法進行製造。
作為本發明中之CD40之細胞外區，例如可列舉：使用公知之跨膜區預測程式SOSUI(http：//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM ver.2(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)或ExPASy Proteomics Server(http：//Ca.expasy.org/)等對基因庫登錄號NP_001241所示之人類CD40之胺基酸序列進行預測所得之區域等。具體而言，可列舉：序列編號6或基因庫登錄號NP_001241之第21號~第194號所示之胺基酸序列。
作為CD40之功能，可列舉：於結合有CD40配位體或促效劑時誘導CD40訊息而引起各種作用。例如若癌細胞被CD40訊息誘導，則引起該癌細胞之細胞死亡或增生阻礙等。若對B淋巴細胞誘導CD40訊息，則例如引起該B淋巴細胞之活化、CD95之表現促進、類型轉變重組及體細胞超突變(Somatic hypermutation)等，而誘導抗原高親和性抗體產生等。若對樹狀細胞誘導CD40訊息，則例如引起該樹狀細胞之作為輔助刺激分子之CD80、CD83及/或CD86之表現上升、HLA-ABC之表現上升、成熟化或IL-12產生。若對巨噬細胞誘導CD40訊息，則例如引起M2巨噬細胞之表面標記物之減少、及M1巨噬細胞之表面標記物之表現之誘 發或促炎性(pro-inflammatory)細胞激素產生。
本發明中之GPC3係以與SGB、DGSX、MXR7、SDYS、Simpson-Golabi-Hehmel Syndrome，Type1(SGBS)、OCI-5、SGBS1、及GTR2-2相同之含義使用。
作為GPC3，例如可列舉：包含基因庫登錄號NP_004475所示之胺基酸序列之人類GPC3、包含基因庫登錄號XP_005594665所示之胺基酸序列之猴GPC3；或包含基因庫登錄號NP_057906所示之胺基酸序列之小鼠GPC3等。又，例如可列舉：包含於基因庫登錄號NP_004475、基因庫登錄號XP_005594665或NP_057906所示之胺基酸序列中缺失、置換或附加1個以上之胺基酸而成之胺基酸序列且具有GPC3之功能的多肽。
本發明之GPC3亦包括如下多肽：包含與基因庫登錄號NP_004475、基因庫登錄號XP_005594665或基因庫登錄號NP_057906所示之胺基酸序列具有較佳為70%以上、更佳為80%以上、進而較佳為90%以上之同源性之胺基酸序列的多肽；最佳為包含具有95%、96%、97%、98%及99%以上之同源性之胺基酸序列且具有GPC3之功能之多肽。
關於具有於基因庫登錄號NP_004475、基因庫登錄號XP_005594665或基因庫登錄號NP_057906所示之胺基酸序列中缺失、置換或附加1個以上之胺基酸殘基而成之胺基酸序列的多肽，可藉由使用上述定點突變導入法等，對例如編碼序列編號基因庫登錄號NP_004475、基因庫登錄號XP_005594665或基因庫登錄號NP_057906所示之胺基酸序列之DNA導入定點突變而獲得。缺失、置換或附加之胺基酸之數量並無特別限定，較佳為1個~數十個、例如1~20個、更佳為1個~數個、例如1 ~5個胺基酸。
作為本發明中之編碼GPC3之基因，例如可列舉：包含基因庫登錄號NM_004484所示之鹼基序列之人類GPC3之基因；包含基因庫登錄號XM_005594608所示之鹼基序列之猴GPC3之基因；或包含基因庫登錄號NM_016697所示之鹼基序列之小鼠GPC3之基因。
又，本發明之編碼GPC3之基因例如亦包括：包含編碼如下多肽之DNA之基因，該多肽包含於基因庫登錄號NM_004484、基因庫登錄號XM_005594608或基因庫登錄號NM_016697所示之鹼基序列中缺失、置換或附加1個以上之鹼基而成之鹼基序列且具有GPC3之功能；包含編碼如下多肽之DNA之基因，該多肽包含與基因庫登錄號NM_004484、Genbank accession No.XM_005594608或基因庫登錄號NM_016697所示之鹼基序列具有60%以上之同源性之鹼基序列、較佳為具有80%以上之同源性之鹼基序列、進而較佳為具有95%以上之同源性之鹼基序列且具有GPC3之功能；及包含編碼如下多肽之DNA之基因，該多肽包含與包含序列編號基因庫登錄號NM_004484、基因庫登錄號XM_005594608或基因庫登錄號NM_016697所示之鹼基序列之DNA在嚴格條件下進行雜交之DNA且具有GPC3之功能；等。
作為本發明中之GPC3之細胞外區，例如可列舉：使用公知之跨膜區預測程式SOSUI(http：//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM ver.2(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)或ExPASy Proteomics Server(http：//Ca.expasy.org/)等對基因庫登錄號NP_004475所示之人類GPC3之胺基酸序列進行預測所得之區域等。具體而言，可列舉：序列編號31或基因庫登錄號NP_004475之第 25號~第563號所示之胺基酸序列。
作為GPC3之功能，例如可列舉：藉由與Wnt形成複合體而促進Wnt與Frizzled之結合，使Wnt路徑活化，藉此於肝細胞癌細胞株中促進細胞增生或細胞遷移等。
所謂抗體，係源自編碼構成免疫球蛋白之重鏈之可變區及重鏈之恆定區、以及輕鏈之可變區及輕鏈之恆定區的全部或一部分之基因(稱為「抗體基因」)的蛋白質。本發明之抗體亦包括具有任一免疫球蛋白類別及亞型之抗體或抗體片段。
重鏈(H鏈)係指構成免疫球蛋白分子之2種多肽中分子量較大之多肽。重鏈係決定抗體之類別與亞型。IgA、IgD、IgE、IgG及IgM之特徵在於：分別具有α鏈、δ鏈、ε鏈、γ鏈及μ鏈作為重鏈，且重鏈之恆定區為不同之胺基酸序列。輕鏈(L鏈)係指構成免疫球蛋白分子之2種多肽中分子量較小之多肽。於人類抗體之情形時，輕鏈存在κ鏈與λ鏈2種。
可變區(V區)通常係指免疫球蛋白之N末端側之胺基酸序列內所存在之富有多樣性的區域。可變區以外之部分由於採用多樣性較少之結構，故稱為恆定區(C區)。重鏈與輕鏈之各可變區締合而形成抗原結合部位，並決定抗體對抗原之結合特性。
於人類抗體之重鏈中，可變區相當於Kabat等人之EU索引(Kabat et al.,Sequences of proteins of immunological interest,1991 Fifth edition)中之第1號直至第117號之胺基酸序列，恆定區相當於第118號以後之胺基酸序列。於人類抗體之輕鏈中，Kabat等人所編號(Kabat編號)之第1號直至第107號之胺基酸序列相當於可變區，第108號以後之胺基酸序列相當於恆定區。以下，將重鏈可變區或輕鏈可變區簡記為VH或VL。
抗原結合部位係抗體中識別抗原並進行結合之部位，且係指與抗原決定基(表位)形成互補立體結構之部位。抗原結合部位在與抗原決定基之間產生較強之分子間相互作用。抗原結合部位係由包含至少3個互補決定區(CDR)之VH及VL所構成。於人類抗體之情形時，VH及VL分別具有3個CDR。將該等CDR自N末端側起依序分別稱為CDR1、CDR2及CDR3。
恆定區中，重鏈恆定區或輕鏈恆定區分別記載為CH或CL。CH係根據作為重鏈之亞型之α鏈、δ鏈、ε鏈、γ鏈及μ鏈來分類。CH係由自N末端側依序排列之CH1區、鉸鏈區、CH2區、CH3區所構成，將CH2區與CH3區一併稱為Fc區。另一方面，CL係分為稱為Cλ鏈及Cκ鏈之2個亞型。
本發明中，所謂抗CD40抗體，係特異性地識別CD40之細胞外區且進行結合之單株抗體。又，本發明中，所謂抗GPC3抗體，係特異性地識別GPC3之細胞外區且進行結合之單株抗體。又，本發明中所謂抗體，亦包括多株抗體及寡株抗體。
本發明中，抗體或該抗體片段與CD40或GPC3結合例如可藉由如下方法進行確認，即使用公知之免疫學檢測法、較佳為螢光細胞染色法等對表現CD40或GPC3之細胞與抗體之結合性進行確認。又，亦可組合使用公知之免疫學檢測法[Monoclonal Antibodies-Principles and Practice,Third Edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單純系抗體實驗指南、Kodansha Scientific(1987)]等。
單株抗體係保持單一性(monoclonality)之抗體產生細胞所 分泌之抗體，且識別單一之表位(亦稱為抗原決定基)。單株抗體分子彼此具有一致之胺基酸序列(1次結構)且採用單一之結構。多株抗體係指不同純系之抗體產生細胞所分泌之抗體分子之集群。寡株抗體係指將複數個不同之單株抗體混合而成之抗體分子之集群。
表位係抗體所識別、結合之抗原之結構部位。作為表位，例如可列舉：單株抗體所識別、結合之單一胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、糖鏈所結合之胺基酸序列及包含糖鏈所結合之胺基酸序列之立體結構等。
作為本發明中之單株抗體，可列舉：由融合瘤產生之抗體、及由經包含抗體基因之表現載體轉形而成之轉形體產生之基因重組抗體。
融合瘤例如可藉由如下方式進行製備：製備抗原，自經該抗原免疫之動物取得具有抗原特異性之抗體產生細胞，進而使該抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合。培養該融合瘤、或者將該融合瘤投予至動物中並使該融合瘤腹水癌化，對該培養液或腹水進行分離、純化，藉此可取得所需之單株抗體。作為用抗原進行免疫之動物，只要能夠製作融合瘤，則則可使用任何動物，可適宜地使用小鼠、大鼠、倉鼠及兔等。又，亦可自此種被免疫動物取得具有抗體產生能力之細胞，於在活體外對該細胞實施免疫後，使之與骨髓瘤細胞融合而製作融合瘤。
作為本發明中之基因重組抗體，例如可列舉：重組小鼠抗體、重組大鼠抗體、重組倉鼠抗體、重組兔抗體、人型嵌合抗體(亦稱為嵌合抗體)、人類化抗體(亦稱為CDR移植抗體)及人類抗體等藉由基因重組技術所製造之抗體。基因重組抗體中，可視作為對象之動物種類或目的 來決定應用源自何種動物種類之重鏈及輕鏈之可變區以及恆定區。例如於作為對象之動物種類為人類之情形時，可將可變區設為源自人類或小鼠等非人類動物，將恆定區及連接子設為源自人類。
所謂嵌合抗體，係指包含人類以外之動物(非人類動物)之抗體之VH及VL、與人類抗體之CH及CL的抗體。作為非人類動物，只要為小鼠、大鼠、倉鼠及兔等能夠製作融合瘤之動物，則可使用任何動物。嵌合抗體可藉由如下方式製造：自產生單株抗體之源自非人類動物之融合瘤取得編碼VH及VL之cDNA，分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之DNA的動物細胞用表現載體中而構建嵌合抗體表現用載體，將該表現用載體導入至動物細胞使之表現。
所謂人類化抗體，係指將非人類動物抗體之VH及VL之CDR移植至人類抗體之VH及VL所對應之CDR所得的抗體。VH及VL之CDR以外之區域係稱為架構區(以下，記載為FR)。人類化抗體可藉由如下方式製造：構建編碼包含非人類動物抗體之VH之CDR之胺基酸序列、與任意之人類抗體之VH之FR之胺基酸序列的VH之胺基酸序列之cDNA、及編碼包含非人類動物抗體之VL之CDR之胺基酸序列、與任意之人類抗體之VL之FR之胺基酸序列的VL之胺基酸序列之cDNA，分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現用載體中而構建人類化抗體表現載體，導入至動物細胞使之表現。
人類抗體本來係指天然地存在於人類體內之抗體，但亦包括藉由最近之基因工程、細胞工程、發育工程之技術進步所製作之自人類抗體噬菌體庫及人類抗體產生基因轉殖動物獲得之抗體等。
關於天然地存在於人類體內之抗體，例如可藉由如下方式 取得：使EB病毒等感染人類末梢血淋巴細胞以使之永生化，進行選殖，藉此培養產生該抗體之淋巴細胞，自該培養上清液純化該抗體。
人類抗體噬菌體庫係藉由將自人類B細胞製備之抗體基因插入至噬菌體基因，而於噬菌體表面表現Fab、scFv等抗體片段之庫。可自該庫以對於固定有抗原之基質之結合活性作為指標，回收於表面表現具有所需抗原結合活性之抗體片段之噬菌體。該抗體片段可進而藉由基因工程方法，轉化為包含兩條完整之H鏈及兩條完整之L鏈之人類抗體分子。
人類抗體產生基因轉殖動物係指細胞內組入有人類抗體基因之動物。具體而言，例如向小鼠ES細胞導入人類抗體基因，將該ES細胞向小鼠之早期胚胎移植後使個體發育，藉此可製作人類抗體產生基因轉殖小鼠。源自人類抗體產生基因轉殖動物之人類抗體可藉由如下方式製備：使用通常於非人類動物中進行之融合瘤製作法來取得融合瘤，加以培養，藉此使抗體於培養上清液中產生並蓄積。
作為基因重組抗體之CH，只要屬於人免疫球蛋白，則可為任意者，較佳為人免疫球蛋白G(hIgG)Class者。進而屬於hIgG Class之hIgG1、hIgG2、hIgG3及hIgG4等亞型均可使用。又，作為基因重組抗體之CL，只要屬於人免疫球蛋白，則可為任一者，可使用κ Class或λ Class者。
本發明中，所謂雙專一性抗體，係指具有特異性不同之2種抗原結合域之多肽或蛋白質。雙專一性抗體之各抗原結合域可與單一抗原之不同表位結合，亦可與不同之抗原結合。
本發明之雙專一性抗體含有包含第一抗原結合域之IgG部分及第二抗原結合域，且該IgG部分之重鏈之C末端直接或經由連接子與 該第二抗原結合域結合。
本發明中所謂抗原結合域，係具有特異性地識別抗原並進行結合之功能之部分結構。作為本發明之抗原結合域，例如可列舉：利用抗體或該抗體片段、包含抗體之CDR之重組蛋白質、包含CDR之抗體可變區、配位體或受體等具有對於抗原之結合能力之蛋白質進行重組所得的蛋白質或多肽。其中，於本發明中，抗原結合域較佳為抗體之Fab。
本發明中，所謂第一抗原結合域，係指雙專一性抗體中所包含之第1個抗原結合域，所謂第二抗原結合域，係指雙專一性抗體中所包含之結合於與第一抗原結合域不同之表位之抗原結合域。
本發明中，與CD40或GPC3結合之抗原結合域只要為特異性地識別CD40或GPC3並進行結合者，則可為任何者。例如可為如下任一種形態：抗體、配位體、受體、及天然存在之相互作用分子等能夠藉由基因重組技術來製作之多肽、蛋白質分子及其片段、以及該蛋白質分子與低分子或天然物之偶聯物等。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段可與在同一細胞上表現之CD40及GPC3結合，亦可與在不同細胞上表現之CD40及GPC3結合，但較佳為與在不同細胞上表現之CD40及GPC3結合。
作為表現CD40之細胞，例如可列舉：B細胞、樹狀細胞(DC)、巨噬細胞及單核球等抗原呈現細胞、以及Ramos細胞等癌細胞等。
作為表現GPC3之細胞，例如可列舉：肝細胞癌、惡性黑色素瘤、卵巢透明細胞癌、卵黃囊瘤、絨毛膜癌、神經胚細胞瘤、肝母細胞瘤、威爾姆斯腫瘤、睾丸生殖細胞腫瘤、脂肪肉瘤等中所包含之癌細胞。
作為本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段，例如可列舉：具有CD40促效劑活性之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。作為本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段，較佳為於GPC3分子或表現GPC3之細胞(GPC3表現細胞)之非存在下不顯示CD40促效劑活性，僅於GPC3分子或表現GPC3之細胞之存在下顯示CD40促效劑活性之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。此種雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段於如下方面上較佳：由於僅在表現GPC3之細胞所存在之癌等病變部使CD40活化，故不會產生全身性之伴隨CD40之活化之副作用。
於本發明之雙專一性抗體中，對於CD40之抗原結合域只要為源自非促效性抗CD40抗體且特異性地識別CD40並進行結合者，則可為任何者。所謂非促效性抗CD40抗體，係指特異性地識別CD40並進行結合，但不具有促效劑活性之抗體。例如可列舉：包含雖具有CD40結合能力但不會對促效劑活性/拮抗劑活性造成影響之抗CD40抗體之CDR之多肽、包含非促效性抗CD40抗體之CDR之多肽、非促效性抗CD40抗體之抗體片段、包含非促效性抗CD40抗體之可變區之多肽等。作為對於CD40之抗原結合域，較佳為包含非促效性抗CD40抗體之可變區之多肽，進而較佳為非促效性抗CD40抗體之Fab。亦有時將抗CD40抗體之Fab稱為抗CD40 Fab。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段所具有之CD40促效劑活性係指誘導抗原呈現細胞活化之活性、誘導腫瘤細胞之細胞死亡之活性等，該等活性係藉由使雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段與細胞上之CD40結合而引起經由該CD40之訊息從而產生。
本發明中，抗體或雙專一性抗體與表現CD40之細胞結合時，若與陰 性對照相比，使CD95、CD80、CD83、CD86、及/或HLA-ABC等之表現量增加，則判定該抗體或該雙專一性抗體具有促效劑活性。另一方面，抗體或雙專一性抗體與表現CD40之細胞結合時，若與陰性對照，未使CD95、CD80、CD83、CD86、及/或HLA-ABC等之表現量增加，則判定該抗體或該雙專一性抗體不具有促效劑活性。
CD40促效劑活性例如可藉由如下方式進行確認：對人類伯奇氏淋巴瘤細胞株Ramos細胞(JCRB、No.JCRB9119)等表現CD40之細胞上之CD95表現量增加進行評價。與表現CD40之細胞(CD40表現細胞)結合時，使CD95表現量亢進之抗體、雙專一性抗體具有促效劑活性。又，CD40促效劑活性例如可藉由如下方式進行確認：使用未成熟樹狀細胞，對作為輔助刺激分子之CD80、CD83及CD86以及HLA-ABC之表現量進行評價。若藉由結合抗CD40抗體或CD40雙專一性抗體，而表現CD40之樹狀細胞之CD80、CD83及CD86以及HLA-ABC之表現量上升，則可知該抗體或該雙專一性抗體具有促效劑活性。
即，作為本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段，具體而言，可列舉：於表現GPC3之細胞之存在下與GPC3及CD40結合時，誘導表現CD40之抗原呈現細胞之活化及/或腫瘤細胞之細胞死亡之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段等。
本發明中，CD40拮抗劑活性係指抑制由CD40配位體或CD40促效劑引起之CD40之活化的活性等。例如係指抑制由CD40配位體或CD40促效劑與CD40結合引起之訊息誘導之活性等。
抗體之CD40拮抗劑活性例如可藉由如下方式進行確認由CD40配位體引起之向Ramos細胞等表現CD40之細胞之CD95表現誘導因 添加抗體而得到抑制。
將一分子之雙專一性抗體所具有之與某一抗原之結合區的數稱為結合價數。例如於本發明中，於一分子之雙專一性抗體具有與CD40結合之抗原結合域及與GPC3結合之抗原結合域各兩個之情形時，該雙專一性抗體以二價分別與CD40及GPC3結合。
本發明中，每一分子之雙專一性抗體可以某結合價數與CD40或GPC3結合，但較佳為至少以二價分別與CD40及GPC3結合。
作為本發明之雙專一性抗體，可列舉：第二抗原結合域直接或經由連接子與包含第一抗原結合域之IgG部分之重鏈之C末端結合之結構的雙專一性抗體，但並不限於此。第一、第二抗原結合域可適當調換，可製作具有所需活性之雙專一性抗體。例如於本發明之雙專一性抗體中，與CD40結合之抗原結合域(亦稱為對於CD40之抗原結合域)及與GPC3結合之抗原結合域(亦稱為對於GPC3之抗原結合域)之位置可適當選擇。作為本發明之雙專一性抗體，較佳為第一抗原結合域為對於CD40之抗原結合域，第二抗原結合域為對於GPC3之抗原結合域。
本發明中所謂IgG部分，係本發明之雙專一性抗體中所包含之IgG、或改變Fc部分之IgG，具有包含一條輕鏈及一條重鏈之異源二聚物締合2個而成之異源四聚物結構且包含第一抗原結合域。
上述IgG部分之重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之任一亞型。又，亦可缺失、附加、置換、及/或插入該等胺基酸序列之一部分。又，可將包含IgG之重鏈之CH1、鉸鏈、CH2及CH3之胺基酸序列之全部或一部分片段適當組合加以使用。又，亦可使該等胺基酸序列部分地缺失、或改換順序加以使用。又，IgG部分之恆定區所使用之IgG之 亞型並無特別限定，較佳為分別將IgG4、IgG4之重鏈恆定區之第228號之Ser殘基置換為Pro，將第235號之Leu殘基置換為Asn之IgG4變異體(以下，記載為IgG4PE)；或者分別將IgG4之重鏈恆定區之第228號之Ser殘基置換為Pro，將第235號之Leu殘基置換為Asn，且將第409號之Arg殘基置換為Lys之IgG4變異體(以下，記載為IgG4PE R409K)。
例如，重鏈之恆定區(自N末端側依序為CH1-鉸鏈-CH2-CH3)較佳為含有包含序列編號77所表示之胺基酸序列之IgG4PE R409K的IgG部分。
本發明之雙專一性抗體中所包含之IgG部分中所包含之2個可變區較佳為識別相同抗原。又，較佳為具有相同結構及胺基酸序列。
本發明中第一抗原結合域包含IgG部分之抗原結合域，與CD40或GPC3特異性地結合。
本發明中第二抗原結合域係構成本發明之雙專一性抗體之一部分，直接或經由連接子與上述IgG部分之重鏈之C末端結合。第二抗原結合域包含對於CD40或GPC3之抗原結合部位。第二抗原結合域只要為與CD40或GPC3特異性地結合之多肽即可，但較佳為包含抗體之可變區者，尤佳為Fab。又，亦可同樣地使用對於細胞表面抗原之配位體分子或受體分子。
本發明之雙專一性抗體可藉由既有之製作技術([Nature Protocols,9,2450-2463(2014)]、國際公開第1998/050431號、國際公開第2001/7734號、國際公開第2002/002773號及國際公開第2009/131239號)等進行製作。
本發明中，雙專一性抗體中所包含之抗CD40抗體之VH(意 指源自抗CD40抗體之VH)與抗GPC3抗體之VH(意指源自抗GPC3抗體之VH)的位置可適當選擇。例如，關於圖1所示之結構之雙專一性抗體，抗CD40抗體之VH較抗GPC3抗體之VH，更位於N末端側，亦可位於C末端側，但較佳為位於N末端側。
本發明中，雙專一性抗體中所包含之VL可為相同之VL，亦可為不同之VL。具有相同之VL且可與兩個不同之抗原或相同抗原上之不同之兩個表位結合的雙專一性抗體之VH只要為以各可變區可分別特異性地與抗原或表位結合之方式進行最佳化或改變而成之VH即可，例如可使用基於胺基酸改變之篩選、或噬菌體呈現等方法來選擇適當之VH。
本發明之雙專一性抗體中所包含之VL只要為抗CD40抗體或抗GPC3抗體之VL，則可為任何者，較佳為含有分別包含序列編號11、12及13所示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VL及包含序列編號10所示之胺基酸序列之VL。
本發明之雙專一性抗體中所包含之VH只要為抗CD40抗體或抗GPC3抗體之VH，則可為任何者，作為抗CD40抗體之VH，較佳為含有分別包含序列編號16、17及18所示之胺基酸序列之CDR1、2及3之VH及包含序列編號15所示之胺基酸序列之VH。作為本發明之雙專一性抗體中所包含之抗GPC3抗體之VH，較佳為含有分別包含序列編號42~44所示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、含有包含序列編號52~54所示之胺基酸序列之CDR1~3之VH、包含序列編號41所示之胺基酸序列之VH、或包含序列編號51所示之胺基酸序列之VH。
本發明中，所謂連接子，係指使複數個抗原結合域結合之化學結構，較佳為多肽。作為本發明之雙專一性抗體所使用之連接子，例 如可列舉：包含免疫球蛋白區之全部或一部分胺基酸序列之連接子、GGGGS等公知之GS連接子及包含其重複序列之連接子、以及其他公知之肽連接子等。
本發明中，所謂免疫球蛋白區，係以包含具有與免疫球蛋白類似之胺基酸序列且存在至少2個半胱胺酸殘基之約100個胺基酸殘基之肽作為最小單元。本發明中，免疫球蛋白區亦含有包含上述最小單元之免疫球蛋白區複數個之多肽。作為免疫球蛋白區，例如可列舉：免疫球蛋白重鏈之VH、CH1、CH2及CH3、以及免疫球蛋白輕鏈之VL及CL等。
免疫球蛋白之動物種類並無特別限定，較佳為人類。又，免疫球蛋白重鏈之恆定區之亞型可為IgD、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2及IgE之任一者，較佳為可列舉源自IgG及源自IgM。又，免疫球蛋白輕鏈之恆定區之亞型可為κ及λ之任一者。
又，免疫球蛋白區亦存在於免疫球蛋白以外之蛋白質，例如可列舉：主要組織相容性抗原(MHC)、CD1、B7及T細胞受體(TCR)等屬於免疫球蛋白超家族之蛋白質所包含之免疫球蛋白區。作為本發明之雙專一性抗體所使用之免疫球蛋白區，可使用任一者之免疫球蛋白區。
於人類抗體之情形時，CH1係具有EU索引中所示之第118號至第215號之胺基酸序列之區域。同樣地，CH2係指具有Kabat等人之EU索引中所示之第231號至第340號之胺基酸序列之區域，CH3係指具有Kabat等人之EU索引中所示之第341號至第446號之胺基酸序列之區域。在CH1與CH2之間存在稱為鉸鏈(hinge)區(以下亦有時記載為鉸鏈)之富有柔軟性之胺基酸區域。鉸鏈區係指具有Kabat等人之EU索引中所示之第216號至第230號之胺基酸序列的區域。
CL於人類抗體之κ鏈之情形時，係指具有Kabat編號中所示之第108號至第214號之胺基酸序列之區域，於λ鏈之情形時，係指具有第108號至第215號之胺基酸序列之區域。
本發明之雙專一性抗體可於IgG部分之兩條重鏈之C末端具有第二抗原結合域各1個，亦可僅於一條重鏈之C末端具有1個第二抗原結合域，但較佳為於兩條重鏈之C末端具有第二抗原結合域各1個。於在兩條重鏈之C末端具有各1個第二抗原結合域之情形時，該等可相同亦可不同，但較佳為相同。
於本發明之第二抗原結合域為Fab之情形時，與IgG部分之重鏈C末端結合的可為Fab之VH-CH1，亦可為VL-CL，但較佳為VH-CH1。又，於第二抗原結合域為Fab，且於本發明之雙專一性抗體中包含2個第二抗原結合域之情形時，與IgG部分之重鏈C末端結合的可一個第二抗原結合域為Fab之VH-CH1且另一個第二抗原結合域為VL-CL，亦可2個第二抗原結合域為Fab之VH-CH1或2個第二抗原結合域為Fab之VL-CL，但較佳為2個第二抗原結合域為Fab之VH-CH1。
於第二抗原結合域包含Fab之情形時，該Fab所包含之輕鏈與IgG部分之輕鏈可相同亦可不同，較佳為相同。又，輕鏈可為λ鏈及κ鏈之任一者，但較佳為κ鏈。
於本發明之雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段中亦包括：於構成本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之胺基酸序列中缺失、附加、置換或插入1個以上之胺基酸殘基且具有與上述雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段相同之活性的雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段。
供缺失、置換、插入及/或附加之胺基酸之數為1個以上，其數量並無特別限定，係藉由Molecular Cloning,The Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985)等所記載之定點突變導入法等周知之技術，可缺失、置換、插入或附加之程度之數。例如通常為1~數十個、較佳為1~20個、更佳為1~10個、進而較佳為1~5個。
上述所謂於本發明之雙專一性抗體之胺基酸序列中缺失、附加、置換或插入1個以上之胺基酸殘基係表示如下情況。意指於同一序列中之任意且1個或複數個胺基酸序列中缺失、置換、插入或附加有1個或複數個胺基酸殘基。又，亦存在缺失、置換、插入或附加同時產生之情形，且亦存在供置換、插入或附加之胺基酸殘基為天然型與非天然型中之任一者之情形。
作為天然型胺基酸殘基，例如可列舉：L-丙胺酸、L-天冬醯胺、L-天冬胺酸、L-麩醯胺、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-精胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯基丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸及L-半胱胺酸等。
於以下表示能夠相互置換之胺基酸殘基之較佳例。同一群中所含有之胺基酸殘基能夠相互置換。
A群：白胺酸、異白胺酸、甘白胺酸、纈胺酸、正纈胺 酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、O-甲基絲胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸
B群：天冬胺酸、麩胺酸、異天冬胺酸、異麩胺酸、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸
C群：天冬醯胺、麩醯胺
D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4-二胺基丁酸、2,3-二胺基丙酸
E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸
F群：絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺酸
G群：苯基丙胺酸、酪胺酸
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段亦含有包含經轉譯後修飾之任何胺基酸殘基的抗體。
作為本發明之雙專一性抗體，具體而言，可列舉：選自由下述(1)~(3)所組成之群中之任一個雙專一性抗體等。
(1)如下雙專一性抗體，其係作為Fab之第二抗原結合域與包含第一抗原結合域之IgG部分之重鏈C末端直接結合者，且第一抗原結合域與第二抗原結合域中，第一抗原結合域為與CD40結合之抗原結合域，第二抗原結合域為與GPC3結合之抗原結合域；(2)如下雙專一性抗體，其與CD40結合之抗原結合域包含源自抗CD40抗體之VH之CDR1~3及VL之CDR1~3，且與GPC3結合之抗原結合域包含源自抗GPC3抗體之VH之CDR1~3及VL之CDR1~3；及(3)如下雙專一性抗體，其與CD40結合之抗原結合域包含源自抗CD40抗體之VH及VL，且與GPC3結合之抗原結合域包含源自抗GPC3抗體之VH及VL。
關於上述(2)中所記載之雙專一性抗體，源自抗CD40抗體之VL之CDR1~3與源自抗GPC3抗體之VL之CDR1~3各自可相互相同亦可不同，但較佳為相同。
又，關於上述(3)中所記載之雙專一性抗體，源自抗CD40抗體之VL與源自抗GPC3抗體之VL相互可相同亦可不同，較佳為相同。
上述(2)及(3)中所記載之雙專一性抗體中所包含之抗CD40抗體可具有CD40促效劑活性，亦可不具有CD40促效劑活性，但較佳為不具有CD40促效劑活性之抗CD40抗體(非促效性抗CD40抗體)。作為本發明之雙專一性抗體，例如可列舉：與CD40結合之抗原結合域包含源自非促效性抗CD40抗體之VH之CDR1~3及VL之CDR1~3之雙專一性抗體、包含源自非促效性抗CD40抗體之VH及VL之雙專一性抗體等。
又，上述(2)及(3)中之抗CD40抗體可具有CD40拮抗劑活性，亦可不具有CD40拮抗劑活性，但較佳為不具有CD40拮抗劑活性之抗CD40抗體(非拮抗劑性抗CD40抗體)。
作為本發明之雙專一性抗體中之與CD40結合之抗原結合域之一例，可列舉：包括如下VH及VL之抗原結合域，該VH含有分別包含序列編號16~18所示之胺基酸序列之CDR1~3，該VL含有分別包含序列編號11~13所示之胺基酸序列之CDR1~3。
本發明之雙專一性抗體中之與CD40結合之抗原結合域亦含有包含如下VH及VL之CDR1~3之胺基酸序列之抗原結合域，該VH及VL之CDR1~3之胺基酸序列係與序列編號16~18分別所示之VH之CDR1~3之胺基酸序列及序列編號11~13分別所示之VL之CDR1~3之胺基酸序列分別至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少 60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同。
本發明之雙專一性抗體中之與CD40結合之抗原結合域亦包括下述(i)或(ii)所記載之抗原結合域。
(i)與如下抗CD40抗體競爭性地與CD40結合之抗原結合域，該抗CD40抗體包括如下VL及VH，該VL含有分別包含序列編號11~13所示之胺基酸序列之CDR1~3，該VH含有分別包含序列編號16~18所示之胺基酸序列之CDR1~3。
(ii)與如下抗CD40抗體結合於相同表位之抗原結合域，該抗CD40抗體包括如下VL及VH，該VL含有分別包含序列編號11~13所示之胺基酸序列之CDR1~3，該VH含有分別包含序列編號16~18所示之胺基酸序列之CDR1~3。
作為本發明之雙專一性抗體中之與CD40結合之抗原結合域之另一例，可列舉：含有包含序列編號10所示之胺基酸序列之VL及包含序列編號15所示之胺基酸序列之VH的抗原結合域。
作為本發明之雙專一性抗體中之與GPC3結合之抗原結合域之一例，可列舉如下抗原結合域，其含有：含有分別包含序列編號11~13所示之胺基酸序列之CDR1~3之VL以及選自以下(1a)~(1g)中之任一個VH。
(1a)含有分別包含序列編號42~44所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1b)含有分別包含序列編號47~49所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1c)含有分別包含序列編號52~54所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1d)含有分別包含序列編號57~59所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1e)含有分別包含序列編號62~64所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1f)含有分別包含序列編號67~69所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(1g)含有分別包含序列編號72~74所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
本發明之雙專一性抗體中之與GPC3結合之抗原結合域亦包括包含如下VH及VL之CDR1~3之胺基酸序列之抗原結合域，該VH及VL之CDR1~3之胺基酸序列與上述(1a)~(1g)之任一者所示之VH之CDR1~3之胺基酸序列及序列編號11~13分別所示之VL之CDR1~3之胺基酸序列分別至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%相同。
本發明之雙專一性抗體中之與GPC3結合之抗原結合域亦包括下述(i)或(ii)所記載之抗原結合域。
(i)與如下抗GPC3抗體競爭性地與GPC3結合之抗原結合域，該抗GPC3抗體包括如下VL及VH，該VL含有分別包含序列編號11~13所示之胺基酸序列之CDR1~3，該VH係上述(1a)~(1g)之任一者所示。
(ii)與如下抗GPC3抗體結合於相同表位之抗原結合域，該抗GPC3抗 體包括如下VL及VH，該VL含有分別包含序列編號11~13所示之胺基酸序列之CDR1~3，該VH係上述(1a)~(1g)之任一者所示。
作為本發明之雙專一性抗體中之與GPC3結合之抗原結合域，可列舉：與人類GPC3之全長胺基酸序列(序列編號129)中第192號至第358號之胺基酸序列所包含之表位結合之抗原結合域。
作為本發明之雙專一性抗體中之與GPC3結合之抗原結合域之其他例，可列舉：含有包含序列編號10所示之胺基酸序列之VL及包含序列編號41、46、51、56、61、66或71所示之胺基酸序列之VH的抗原結合域。
作為本發明之一態樣，可列舉如下雙專一性抗體，其含有包含第一抗原結合域之IgG部分與第二抗原結合域，且該第二抗原結合域為Fab，該Fab之VH-CH1直接或經由連接子與該IgG部分之重鏈C末端結合。
又，作為本發明之一態樣，亦可列舉如下雙專一性抗體，其含有包含第一抗原結合域之IgG部分與第二抗原結合域，且該第二抗原結合域為Fab，該Fab之VL-CL直接或經由連接子與該IgG部分之重鏈C末端結合。
作為本發明之一態樣，可列舉如下雙專一性抗體，其含有包含針對CD40之第一抗原結合域之IgG部分、及針對GPC3之第二抗原結合域。
作為本發明之一態樣，亦可列舉如下雙專一性抗體，其含有包含針對GPC3之第一抗原結合域之IgG部分、及針對CD40之第二抗原結合域。
作為本發明之雙專一性抗體之更具體例，可列舉以下之(A)或(B)。
(A)包含以下(i)及(ii)，且(ii)中所記載之Fab直接或經由連接子與(i)中記載之IgG部分之重鏈C末端結合之雙專一性抗體。
(i)包含如下抗原結合域之IgG部分，該抗原結合域含有含有分別包含序列編號11~13所示之胺基酸序列之CDR1~3之VL以及含有分別包含序列編號16~18所示之胺基酸序列之CDR1~3之VH，且與CD40結合
(ii)包含如下抗原結合域之Fab，該抗原結合域含有含有分別包含序列編號11~13所示之胺基酸序列之CDR1~3之VL以及選自以下(2a)~(2g)中之任一個VH，且與GPC3結合
(2a)含有分別包含序列編號42~44所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(2b)含有分別包含序列編號47~49所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(2c)含有分別包含序列編號52~54所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(2d)含有分別包含序列編號57~59所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(2e)含有分別包含序列編號62~64所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(2f)含有分別包含序列編號67~69所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH
(2g)含有分別包含序列編號72~74所表示之胺基酸序列之CDR1~3 之VH
(B)包含以下(i)及(ii)，且(ii)中所記載之Fab直接或經由連接子與(i)中記載之IgG部分之重鏈C末端結合之雙專一性抗體。
(i)包含如下抗原結合域之IgG部分，該抗原結合域含有包含序列編號10所示之胺基酸序列之VL以及包含序列編號15所示之胺基酸序列之VH，且與CD40結合
(ii)包含如下抗原結合域之Fab，該抗原結合域含有包含序列編號10所示之胺基酸序列之VL以及包含序列編號41、46、51、56、61、66或71所示之胺基酸序列之VH，且與GPC3結合
作為上述(A)或(B)之雙專一性抗體，直接或經由連接子與IgG部分之重鏈C末端結合的可為Fab之VL-CL，亦可為VH-CH1，但較佳為VH-CH1。又，作為上述(A)或(B)之雙專一性抗體，Fab可直接與IgG部分之重鏈C末端結合，亦可經由連接子與IgG部分之重鏈C末端結合，但較佳為直接結合。
作為本發明之一態樣，可列舉如下雙專一性抗體，其係含有包含第一抗原結合域之IgG部分及第二抗原結合域，且上述第二抗原結合域直接或經由連接子與上述IgG部分之重鏈C末端結合者，上述IgG部分之重鏈恆定區為人類IgG4或其改變體。作為本發明之進而較佳之一態樣，可列舉上述重鏈恆定區為IgG4PE或IgG4PE R409K之雙專一性抗體。作為上述IgG4PE R409K之重鏈恆定區之胺基酸序列之具體例，可列舉序列編號77所示之胺基酸序列。
作為本發明之雙專一性抗體，具體而言，例如可列舉Ct-R1090-GpS1019-FL、Ct-R1090-GpA6005-FL、Ct-R1090-GpA6014- FL、Ct-R1090-GpA6062-FL、Ct-R1090-GpS3003、Ct-R1090-GPngs18及Ct-R1090-GPngs62等。又，作為本發明之雙專一性抗體，具體而言，例如亦可同樣地列舉Ct-GpS1019-R1090、Ct-GpA6005-R1090、Ct-GpA6014-R1090、Ct-GpA6062-R1090、Ct-GpS3003-R1090、Ct-GPngs18-R1090及Ct-GPngs62-R1090等。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段亦包括具有效應物活性之抗體或該雙專一性抗體片段。
所謂效應物活性，係指經由抗體之Fc區所引起之抗體依賴性之細胞毒殺活性，例如可列舉：抗體依賴性細胞毒殺活性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity activity；ADCC活性)、補體依賴性細胞毒殺活性(Complement-Dependent Cytotoxicity activity；CDC活性)、利用巨噬細胞或樹狀細胞等吞噬細胞之抗體依賴性巨噬活性(Antibody-dependent cellular phagocytosis activity；ADCP活性)及助噬作用效果等。
本發明中，ADCC活性及CDC活性可使用公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行測定。
所謂ADCC活性，係指與靶細胞上之抗原結合之抗體經由抗體之Fc區與免疫細胞之Fc受體結合，藉此使免疫細胞(自然殺手細胞等)活化而殺傷靶細胞之活性。
Fc受體(FcR)係與抗體之Fc區結合之受體，藉由抗體之結合而誘發各種效應物活性。各FcR係與抗體之亞型對應，IgG、IgE、IgA、IgM分別與FcγR、FcεR、FcαR、FcμR特異性地結合。進而於FcγR中存在FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)之亞型，各亞型存 在FcγRIA、FcγRIB、FcγRIC、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA及FcγRIIIB之同功異型物。該等不同之FcγR存在於不同之細胞上[Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)]。於人類中，FcγRIIIB係於嗜中性球中特異性地表現，、FcγRIIIA係於單核球、自然殺手細胞(NK細胞)、巨噬細胞及一部分之T細胞中表現。經由抗體向FcγRIIIA之結合而誘發NK細胞依賴性之ADCC活性。
所謂CDC活性，係指與靶細胞上之抗原結合之抗體使血液中之包含補體相關蛋白質群之一系列級聯(補體活化途徑)活化而殺傷靶細胞的活性。又，藉由利用補體之活化而產生之蛋白質片段，而誘發免疫細胞之趨化及活化。CDC活性之級聯係藉由首先使C1q與Fc區結合，繼而與2個絲胺酸蛋白酶即C1r及C1s結合，而形成C1複合體從而開始。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段對於抗原表現細胞之CDC活性、或ADCC活性可藉由公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行評價。
作為控制本發明之雙專一性抗體之效應物活性之方法，已知有：控制α-1,6結合至N-結合複合型糖鏈之還原末端所存在之N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)之海藻糖(亦稱為核心海藻糖)之量的方法，該N-結合複合型糖鏈與抗體之Fc區(包含CH2及CH3區之恆定區)之第297號之天冬醯胺(Asn)結合(國際公開第2005/035586號、國際公開第2002/31140號及國際公開第00/61739號)；或者藉由改變抗體之Fc區之胺基酸殘基來進行控制之方法(國際公開第00/42072號)等。
藉由控制附加於雙專一性抗體之核心海藻糖之量，可增加或降低抗體之ADCC活性。例如，作為使結合至與抗體之Fc結合之N-結合 複合型糖鏈之海藻糖的含量降低之方法，藉由使用缺失有α1,6-海藻糖轉移酶基因之宿主細胞來使雙專一性抗體表現，可取得具有較高之ADCC活性之雙專一性抗體。另一方面，作為使結合至與雙專一性抗體之Fc結合之N-結合複合型糖鏈之海藻糖的含量增加之方法，藉由使用導入有α1,6-海藻糖轉移酶基因之宿主細胞來使抗體表現，可取得具有較低之ADCC活性之雙專一性抗體。
又，藉由改型雙專一性抗體之Fc區之胺基酸殘基，可增加或降低ADCC活性或CDC活性。例如藉由使用美國專利申請公開第2007/0148165號說明書中記載之Fc區之胺基酸序列，可增加雙專一性抗體之CDC活性。又，藉由進行美國專利第6,737,056號說明書、美國專利第7,297,775號說明書或美國專利第7,317,091號說明書等中所記載之胺基酸改變，可增加ADCC活性或CDC活性，亦可降低ADCC活性或CDC活性。
進而，藉由將上述方法組合，亦可取得效應物活性得到控制之雙專一性抗體。
本發明之雙專一性抗體之穩定性可藉由測定純化過程中或在一定條件下保存之樣品中所形成之凝集體(寡聚物)量來進行評價。即，將於相同條件下凝集體量降低之情形評價為抗體之穩定性得到提高。凝集體量可藉由使用包含凝膠過濾層析法之適當層析法將所凝集之抗體與未凝集之抗體進行分離而進行測定。
本發明之雙專一性抗體之生產性可藉由對培養液中自抗體產生細胞產生之抗體量進行測定來評價。更具體而言，可藉由利用HPLC法或ELISA法等適當之方法對自培養液中去除產生細胞後所得之培養上清 液中所含之抗體量進行測定來評價。
本發明中，所謂抗體片段，係包含抗原結合部位且具有對於該抗原之結合活性之蛋白質。本發明中作為抗體片段，例如可列舉：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、雙功能抗體、dsFv、VHH或包含CDR之肽等。
Fab係利用蛋白分解酵素木瓜酶對IgG抗體進行處理所獲得之片段中(在H鏈之第224號之胺基酸殘基被切斷)、H鏈之N末端側約一半與L鏈整體以雙硫鍵(S-S鍵)結合之分子量約5萬的具有抗原結合活性之抗體片段。將包含VH及CH1之Fab之H鏈記載為VH-CH1，將包含VL及CL之Fab之L鏈記載為VL-CL。
F(ab')2係利用蛋白分解酵素胃蛋白酶對IgG進行處理所獲得之片段中(在H鏈之第234號之胺基酸殘基被切斷)，較經由鉸鏈區之S-S鍵而結合有Fab者稍大，分子量約10萬之具有抗原結合活性的抗體片段。
Fab'係上述F(ab')2之鉸鏈區之S-S鍵被切斷之分子量約5萬之具有抗原結合活性的抗體片段。
scFv係使用12個殘基以上之適當之肽連接子(P)將一條VH與一條VL連結而成之VH-P-VL或VL-P-VH多肽，且係具有抗原結合活性之抗體片段。
雙功能抗體係抗原結合特異性相同或不同之scFv形成了二聚物之抗體片段，且係具有對於相同抗原之二價抗原結合活性、或對於不同抗原分別具有特異性抗原結合活性之抗體片段。
dsFv係指使將VH及VL中之各1個胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基而成之多肽經由該半胱胺酸殘基間之S-S鍵進行結合而成者。
VHH亦稱為奈米抗體，係指VHH抗體中之重鏈可變區，且可於不存在其他多肽之情況下與抗原結合。
VHH抗體係存在於羊駝等駝科動物及鯊魚等軟骨魚中之抗體，無輕鏈及CH1，僅包含重鏈。
包含CDR之肽包含VH或VL之CDR之至少1個區域。包含複數個CDR之肽可藉由使CDR彼此直接或經由適當之肽連接子結合而製作。包含CDR之肽可藉由如下方式表現並製造：構建編碼本發明之雙專一性抗體之VH及VL之CDR之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體，將該表現載體向原核生物或真核生物導入。又，包含CDR之肽亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法來製造。
本發明之雙專一性抗體片段本質上為包含雙專一性抗體之結構之一部分，且包含雙專一性抗體之抗原結合部位特異性不同之2種抗原結合域並對於該2種抗原均具有結合活性之蛋白質。
本發明之雙專一性抗體亦可使用包含胺基酸殘基改變之Fc區，該胺基酸殘基改變係以抗體之效應物活性之增強或缺損、抗體之穩定化、及血中半衰期之控制為目的。
作為本發明之雙專一性抗體或雙專一性抗體片段，包含使放射性同位素、低分子之藥劑、高分子之藥劑、蛋白質或抗體醫藥等以化學或基因工程方式與本發明之雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段結合而成的雙專一性抗體之衍生物。
本發明中之雙專一性抗體之衍生物可藉由如下方式進行製造：利用化學手法[抗體工程入門，地人書館(1994)]使放射性同位素、低分子之藥劑、高分子之藥劑、免疫活化劑、蛋白質或抗體醫藥等與本發明 之雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段之H鏈或L鏈之N末端側或C末端側、該雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段中之適當取代基或側鏈、進而該雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段中之糖鏈等結合。
又，本發明中之雙專一性抗體之衍生物可藉由如下基因工程方法進行製造：使編碼本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之DNA、與編碼所需蛋白質或抗體醫藥之DNA連結並插入至表現載體，將該表現載體導入至適當之宿主細胞使之表現。
作為放射性同位素，例如可列舉：111In、131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性同位素可藉由氯胺T法等直接結合至抗體。又，亦可使抗體與使放射性同位素螯合之物質結合。作為螯合劑，例如可列舉：1-異硫氰酸酯基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作為低分子之藥劑，例如可列舉：烷基化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗生素、植物鹼、拓樸異構酶抑制劑、激素治療劑、激素拮抗劑、芳香酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉑錯合物衍生物、M期抑制劑或激酶抑制劑等抗癌劑[臨床腫瘤學，癌與化學療法社(1996)]；氫化可體松或潑尼松等類固醇劑；阿司匹林或吲哚美辛等非類固醇劑；硫代蘋果酸金或青黴胺等免疫調節劑；環磷醯胺或硫唑嘌呤等免疫抑制劑；或者如馬來酸氯苯那敏或氯苯苄咯(Tavegil)之抗組織胺劑等抗炎症劑[炎症與抗炎症療法，醫齒藥出版股份有限公司(1982)]等。
作為抗癌劑，例如可列舉：阿密磷定(阿米福汀(Ethyol))、順鉑、達卡巴(DTIC)、放線菌素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、鏈佐星、環磷醯胺、異環磷醯胺、卡莫司汀(BCNU)、環己亞硝脲(CCNU)、多柔比星 (阿德力黴素)、表柔比星、吉西他濱(鹽酸吉西他濱)、道諾紅菌素、甲基苄肼)、絲裂黴素、阿糖胞苷、依託泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長春花鹼、長春新鹼、博萊黴素、道諾黴素、培洛黴素、雌莫司汀、紫杉醇(泰克索)、歐洲紫杉醇(多西他賽)、阿地白介素、門冬醯胺酶、白消安、卡鉑、奧沙利鉑、奈達帕汀、克拉屈濱、喜樹鹼、10-羥基-7-乙基-喜樹鹼(SN38)、氟尿苷、氟達拉濱、羥基脲、依達比星、巰乙磺酸鈉、伊立替康(CPT-11)、拓樸替康、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、羥基脲、光輝黴素、密妥坦、培門冬酶、噴司他丁、哌泊溴烷、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊甙、睾內脂、硫鳥嘌呤、噻替派、尿嘧啶氮芥、長春瑞濱、氯芥苯丁酸、氫化可體松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、長春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他濱、拓優得、阿紮胞苷、UFT、奧沙利鉑、吉非替尼(易瑞沙)、伊馬替尼(STI571)、埃羅替尼、類FMS酪胺酸激酶(FMS-like tyrosine kinase 3)(Flt3)抑制劑、血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor)(VEGFR)抑制劑、纖維母細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor)(FGFR)抑制劑、埃羅替尼(Tarceva)等表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor)(EGFR)抑制劑、根赤殼菌素、17-烯丙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素、雷帕黴素、安吖啶、全反維他命A酸、沙利竇邁、來那度胺、阿那曲唑、法倔唑、來曲唑、依西美坦、布西拉明、咪唑立賓、環孢靈、氫化可體松、蓓薩羅丁(貝沙羅汀)、地塞米松、助孕素類、雌激素類、阿那曲唑(阿納托唑)、亮丙瑞林、阿司匹林、吲哚美辛、塞來昔布、硫唑嘌呤、青黴胺、硫代蘋果酸金、馬來酸氯苯那敏、馬來酸氯苯吡胺、氯雷他定、維生素A酸、蓓薩羅丁、砷、硼替 佐米、別嘌呤醇、卡奇黴素、替伊莫單抗、貝沙羅汀、Ozogamine、克拉紅黴素、甲醯四氫葉酸、酮康唑、氨魯米特、蘇拉明、美登素類化合物或其衍生物等。
作為使低分子之藥劑與本發明之雙專一性抗體鍵結之方法，例如可列舉：經由戊二醛使藥劑與該抗體之胺基間鍵結之方法、或者經由水溶性碳二醯亞胺使藥劑之胺基與該抗體之羧基鍵結之方法等。
作為高分子之藥劑，例如可列舉：聚乙二醇(PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、吡喃共聚物、或羥丙基甲基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子化合物與本發明之雙專一性抗體或雙專一性抗體片段結合，而期待(1)對於化學、物理或生物上之各種因子之穩定性之提高、(2)血中半衰期之顯著延長、或者(3)免疫原性之消失或抗體產生之抑制等效果[Bioconjugates醫藥品，廣川書店(1993)]。
例如，作為使PEG與本發明之雙專一性抗體結合之方法，可列舉：與PEG化修飾試劑進行反應之方法等[Bioconjugates醫藥品，廣川書店(1993)]。作為PEG化修飾試劑，可列舉：對於離胺酸之ε-胺基之修飾劑(日本專利特開昭61-178926號公報)、對於天冬胺酸及麩胺酸之羧基之修飾劑(日本專利特開昭56-23587號公報)、或者對於精胺酸之胍基之修飾劑(日本專利特開平2-117920號公報)等。
作為免疫活化劑，可為作為免疫佐劑為人所知之天然物，作為具體例，使免疫亢進之藥劑可列舉：β(1→3)葡聚糖(例如，香菇多糖或裂褶菌多糖)、或α半乳糖苷基神經醯胺(KRN7000)等。
作為蛋白質，例如可列舉：使NK細胞、巨噬細胞或嗜中 性球等免疫活性(適格)細胞活化之細胞激素或生長因子或者毒素蛋白質等。
作為細胞激素或生長因子，例如可列舉：干擾素(以下，記為IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、介白素(以下，記為IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、顆粒球菌落刺激因子(G-CSF)、顆粒球/巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)或巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)等。
作為毒素蛋白質，例如可列舉：離胺酸、白喉毒素或ONTAK等，亦包括為了調節毒性而向蛋白質導入突變而成之蛋白質毒素。
與蛋白質或抗體醫藥之融合抗體可藉由如下方式表現並製造：使編碼本發明之雙專一性抗體或雙專一性抗體片段之cDNA與編碼蛋白質之cDNA連結而構建編碼融合抗體之DNA，將該DNA插入至原核生物或真核生物用表現載體，將該表現載體向原核生物或真核生物導入。
於將上述抗體之衍生物用作檢測方法、測定方法、檢測用試劑、測定用試劑或診斷藥的情形時，作為與本發明之雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段結合之藥劑，可列舉：通常之免疫學檢測或測定方法中所使用之標記物。作為標記物，例如可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化酶或螢光素酶等酶；吖啶鎓酯或咯吩等發光物質；或者螢光異硫氰酸鹽(FITC)或異硫氰酸四甲基羅丹明(RITC)、Alexa(註冊商標)Fluor 488、R-紅藻素(R-PE)等螢光物質等。
本發明中包含具有CDC活性或ADCC活性等細胞毒殺活性之雙專一性抗體及其雙專一性抗體片段。本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段對於抗原表現細胞之CDC活性或ADCC活性可藉由公知之測 定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行評價。
又，本發明係關於一種包含特異性地識別CD40及GPC3並進行結合之雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段之組合物、或者含有該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段作為有效成分之與CD40及/或GPC3相關之疾病、較佳為CD40及GPC3之表現細胞所參與之疾病之治療藥。
作為與CD40及/或GPC3相關之疾病，例如只要為與CD40及/或GPC3有關之疾病，則可為任何者，例如可列舉惡性腫瘤及癌症等。
本發明中，作為惡性腫瘤及癌症，例如可列舉：大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、神經膠質瘤、惡性黑色素瘤(黑色素瘤)、甲狀腺癌、腎細胞癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、膽管癌、食道癌、肝臟癌、頭頸癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、前列腺癌、絨毛膜癌、咽頭癌、喉頭癌、間皮瘤、胸膜瘤、雄胚瘤、子宮內膜增生、子宮內膜症、胚組織瘤、纖維肉瘤、卡波西肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、星狀細胞瘤、神經纖維瘤、少突膠質細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、神經膠母細胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤及威爾姆斯瘤等。
含有本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段、或者該等之衍生物之治療藥可為僅包含作為有效成分之該抗體或該雙專一性抗體片段、或該等之衍生物者，較佳為通常與藥理學上所容許之1種以上之載體一起混合，而以藉由製劑學之技術領域中所公知之任意方法所製造之醫藥製劑的形式提供。
投予路徑較佳為使用治療時最具效果者，例如可列舉：經 口投予、或者口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌內或靜脈內等非經口投予。其中，較佳為靜脈內投予。
作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。
投予量或投予次數係根據設為目標之治療效果、投予方法、治療期間、年齡、及體重等而不同，通常成人每天為10μg/kg~10mg/kg。
進而，本發明係關於一種含有本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之CD40及/或GPC3之檢測或測定試劑、或者與CD40及/或GPC3相關之疾病、較佳為CD40及GPC3之表現細胞所參與之疾病之診斷藥。又，本發明係關於一種使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之CD40及/或GPC3之檢測或測定方法、與CD40及/或GPC3相關之疾病、較佳為CD40及GPC3之表現細胞所參與之疾病之治療方法、或者與CD40及/或GPC3相關之疾病、較佳為CD40及GPC3之表現細胞所參與之疾病之診斷方法。
作為本發明中檢測或測定CD40及/或GPC3之量之方法，可列舉任意之公知方法。例如可列舉：免疫學檢測或測定方法等。
所謂免疫學檢測或測定方法，係使用施加了標記之抗原或抗體，對抗體量或抗原量進行檢測或測定之方法。作為免疫學檢測或測定方法，例如可列舉：放射免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(luminescent immunoassay)、西方點墨法或物理化學手法等。
藉由使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段檢 測或測定表現CD40及/或GPC3之細胞，可診斷與CD40及/或GPC3相關之疾病、較佳為CD40及GPC3之表現細胞所參與之疾病。
於檢測表現CD40或GPC3之細胞時，可使用公知之免疫學檢測法，例如可列舉：免疫沈澱法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法或螢光抗體染色法等。又，例如亦可列舉：FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等螢光抗體染色法等。
本發明中作為成為檢測或測定CD40及/或GPC3之對象的生物樣本，例如為組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿、糞便、組織液或培養液等，只要有可能包含表現CD40或GPC3之細胞，則無特別限定。
含有本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段、或者該等之衍生物之診斷藥亦可視目標之診斷法而含有用以進行抗原抗體反應之試劑、該反應之檢測用試劑。作為用以進行抗原抗體反應之試劑，例如可列舉緩衝劑、鹽等。
作為檢測用試劑，例如可列舉：與上述雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段、或者該等之衍生物結合之經標記之二次抗體、或者與標記對應之受質等通常之免疫學檢測或測定法所使用之試劑。
以下，關於本發明之雙專一性抗體之製作方法、該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之活性評價方法、以及使用該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之疾病之治療方法及診斷方法，具體地進行記載。
1.單株抗體之製作方法
本發明中之單株抗體之製造方法包括下述作業步驟。即，(1)純化用作免疫原之抗原及製作抗原於細胞表面過度表現之細胞之至少一步驟； (2)用抗原免疫動物後，採集血液對其抗體效價進行檢驗以決定摘除脾臟等之時期，從而製備抗體產生細胞之步驟；(3)製備骨髓瘤細胞(myeloma)之製備；(4)使抗體產生細胞與骨髓瘤進行細胞融合；(5)篩選產生目標抗體之融合瘤群；(6)自融合瘤群分離(選殖)單純系(monoclonal)細胞；(7)視情形培養用以大量製造單株抗體之融合瘤、或飼養移植有融合瘤之動物；(8)對如此製造之單株抗體之生理活性及其抗原結合特異性進行研究、或者檢驗作為標記試劑之特性等。
以下，按照上述步驟，對用以製作本發明中之與CD40及GPC3結合之雙專一性抗體的與CD40結合之單株抗體及與GPC3結合之單株抗體的製作方法進行詳述。該抗體之製作方法並不限於此，例如亦可使用脾臟細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤。
(1)抗原之純化
表現CD40或GPC3之細胞可藉由將包含編碼CD40或GPC3全長或其部分長度之cDNA的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等中而獲得。又，可自大量地表現CD40或GPC3之各種人類腫瘤培養細胞或人類組織等純化CD40或GPC3並用作抗原。又，亦可將該腫瘤培養細胞或該組織等直接用作抗原。進而，亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法製備具有CD40或GPC3之部分序列之合成肽用於抗原。
本發明中所使用之CD40或GPC3可使用Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)等所記載之方法等，例如藉由以下之方法使編 碼該CD40或該GPC3之DNA於宿主細胞中表現而進行製造。
藉由將包含編碼CD40或GPC3之部分之全長cDNA插入至適當之表現載體之啟動子之下游，從而製作重組載體。亦可使用基於全長cDNA所製備之包含編碼多肽之部分之適當長度之DNA片段代替上述全長cDNA。繼而，將所獲得之該重組載體導入至適於該表現載體之宿主細胞，藉此可獲得生產CD40或GPC3之轉形體。
作為表現載體，只要可實現於使用之宿主細胞中自主複製或向染色體中組入，且於可轉錄編碼CD40或GPC3之DNA之位置含有適當啟動子，則可使用任一種。
作為宿主細胞，例如為大腸桿菌等屬於艾氏菌屬等之微生物、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等，只要可表現目標之基因，則可使用任一種。
於使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞之情形時，重組載體較佳為於原核生物中能夠自主複製，並且含有啟動子、核糖體結合序列、包含編碼CD40或GPC3之部分之DNA、及轉錄終止序列的載體。又，對於該重組載體，轉錄終止序列並非必需，但較佳為於結構基因之正下方配置轉錄終止序列。進而，該重組載體亦可含有控制啟動子之基因。
作為該重組載體，較佳為使用將作為核糖體結合序列之夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno sequence)與起始密碼子之間調節為適當距離(例如6~18個鹼基)的質體。
又，作為編碼該CD40或GPC3之DNA之鹼基序列，可以成為最適合宿主內之表現之密碼子之方式置換鹼基，藉此，可提高目標之CD40或GPC3之生產率。
作為表現載體，只要為能夠於所使用之宿主細胞中發揮功能者，則可使用任一種，例如可列舉：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上為Roche-Diagnostics公司製造)、pKK233-2(Pharmacia公司製造)、pSE280(Invitrogen公司製造)、pGEMEX-1(Promega公司製造)、pQE-8(Qiagen公司製造)、pKYP10(日本專利特開昭58-110600號公報)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造)、pTrs30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)製備]、pTrs32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2(FERM BP-400)製造，日本專利特開昭60-221091號公報]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)製備，日本專利特開昭60-221091號公報]、pTerm2(美國專利第4,686,191號說明書，美國專利第4,939,094號說明書，美國專利第5,160,735號說明書)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司製造)、pET系統(Novagen公司製造)或pME18SFL3(東洋紡織公司製造)等。
作為啟動子，只要為於所使用之宿主細胞中發揮功能者，則可為任何者。例如可列舉：trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子或T7啟動子等源自大腸桿菌或噬菌體等之啟動子。又，例如亦可列舉：使2個Ptrp串聯而成之串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子或let I啟動子等經人工設計改變之啟動子等。
作為宿主細胞，例如可列舉：大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿 菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、或大腸桿菌DH5α等。
作為向宿主細胞導入重組載體之方法，只要為向所使用之宿主細胞導入DNA之方法，則可使用任一種方法，例如可列舉：使用鈣離子之方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)、Gene,17,107(1982)、Molecular & General Genetics,168,111(1979)]。
於使用動物細胞作為宿主之情形時，作為表現載體，只要為於動物細胞中發揮功能者，則可使用任一種，例如可列舉：pcDNAI(Invitrogen公司製造)、pcDM8(舟越公司製造)、pAGE107[日本專利特開平3-22979號公報；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本專利特開平2-227075號公報)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司製造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)、pREP4(Invitrogen公司製造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3或pKANTEX93(國際公開第97/10354號)等。
作為啟動子，只要為於動物細胞中能夠發揮功能者，則可使用任一種，例如可列舉：巨細胞病毒(CMV)之即刻早期(IE)基因之啟動子、SV40之初期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子或來源於小鼠白血病病毒(Molony Murine Leukemia Virus)之啟動子或促進子。又，亦可將人類CMV之IE基因之促進子與啟動子一併使用。
作為宿主細胞，例如可列舉：人類伯奇氏淋巴瘤細胞 Namalwa、源自非洲綠猴腎臟之細胞COS、源自中國倉鼠卵巢之細胞CHO、或人類白血病細胞HBT5637(日本專利特開昭63-000299號公報)等。
作為向宿主細胞導入重組載體之方法，只要為向動物細胞導入DNA之方法，則可使用任一種方法，例如可列舉：電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)、或脂轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
將源自保有組入有以上述方式獲得之編碼CD40或GPC3之DNA之重組載體的微生物、或動物細胞等的轉形體於培養基中進行培養，使該CD40或GPC3於培養物中生成蓄積，自該培養物中進行採集，藉此可製造CD40或GPC3。將該轉形體於培養基中進行培養之方法可依據宿主之培養所使用之通常方法進行。
於利用源自真核生物之細胞來表現之情形時，可獲得附加有糖或糖鏈之CD40或GPC3。
於培養經使用誘導性之啟動子之重組載體轉形之微生物時，亦可視需要將誘導劑(inducer)添加至培養基中。例如，於培養經使用lac啟動子之重組載體轉形之微生物之情形時，亦可將異丙基-β-D-硫代半乳糖苷等添加至培養基中，於培養經使用trp啟動子之重組載體轉形之微生物之情形時，亦可將吲哚丙烯酸等添加至培養基中。
作為培養將動物細胞作為宿主所獲得之轉形體之培養基，例如可列舉：通常所使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、Eagle之MEM培養基[Science,122,501(1952)]、杜爾貝科改良MEM培養基[Virology,8, 396(1959)]、199培養基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]、Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)培養基、或於該等培養基中添加有胎牛血清(FBS)等之培養基等。培養係通常於pH值6~8、30~40℃、5%CO2存在下等條件下進行1~7天。又，於培養中亦可視需要，將康黴素或青黴素等抗生素添加至培養基中。
作為編碼CD40或GPC3之基因之表現方法，除直接表現以外，亦可使用分泌生產或融合蛋白質表現等方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。作為CD40或GPC3之生產方法，例如可列舉：於宿主細胞內生產CD40或GPC3之方法；使CD40或GPC3分泌至宿主細胞外之方法；或於宿主細胞外膜上生產CD40或GPC3之方法，且可藉由改變所使用之宿主細胞或所生產之CD40或GPC3之結構而選擇適當之方法。
例如製作於編碼細胞外區之胺基酸序列之DNA上連結編碼抗體之Fc區之DNA、編碼麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之DNA、或編碼FLAG標籤之DNA或者編碼組胺酸標籤之DNA等而成的DNA，使之表現並進行純化，藉此可製作抗原融合蛋白質。具體而言，例如可列舉：使CD40或GPC3之細胞外區與人類IgG之Fc區結合而成之Fc融合蛋白質、CD40或GPC3之細胞外區與麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之融合蛋白質。
於在宿主細胞內或宿主細胞外膜上生產CD40或GPC3之情形時，可藉由使用Paulson等人之方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、LOW等人之方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本專利特開平05-336963號公報或國際公開第94/23021號等所記載之方法，使CD40或GPC3積極地分 泌至宿主細胞外。又，亦可利用使用二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增系統(日本專利特開平2-227075號公報)而使CD40或GPC3之生產量上升。
所產生之CD40或GPC3例如可以下述方式進行單離、純化。
於CD40或GPC3以溶解狀態在細胞內表現之情形時，於培養結束後藉由離心分離而回收細胞，於水系緩衝液中懸浮後，使用超音波破碎機、法式壓碎機、Manton-Gaulin均質機或Dyno磨機等將細胞破碎，而獲得無細胞萃取液。可藉由將該無細胞萃取液進行離心分離而獲得上清液，將通常之蛋白質之單離純化法、即溶劑萃取法、利用硫酸銨等之鹽析法、除鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、使用二乙胺基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法、使用S-瓊脂糖凝膠(S-Sepharose)FF(Pharmacia公司製造)等樹脂之陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖凝膠(Butyl Sepharose)、苯基瓊脂糖凝膠(Phenyl Sepharose)等樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦(Chromatofocusing)法、或等電點電泳等電泳法等方法單獨或組合使用，而自所獲得之上清液獲得純化蛋白質。
於CD40或GPC3在細胞內形成不溶體而表現之情形時，與上述同樣地回收細胞後將之破碎，進行離心分離，藉此以沈澱組分回收該CD40或GPC3之不溶體。利用蛋白質改性劑將所回收之該CD40或GPC3之不溶體進行可溶化。可藉由對該可溶化液進行稀釋或透析而使該CD40或GPC3恢復到正常之立體結構後，利用與上述相同之單離純化法而獲得多肽之純化蛋白質。
於CD40或GPC3或者其糖修飾體等衍生物被分泌至細胞外 之情形時，可於培養上清液中回收該CD40或GPC3、或者其糖修飾體等衍生物。可藉由與上述同樣地使用離心分離等方法對該培養上清液進行處理而取得可溶性組分，藉由使用與上述相同之單離純化法而自可溶性組分獲得純化蛋白質。
又，本發明中所使用之CD40或GPC3亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法進行製造。具體而言，例如可利用Advanced ChemTech公司製造、PerkinElmer公司製造、Pharmacia公司製造、Protein Technology Instrument公司製造、Synthecell-Vega公司製造、Perceptive公司製造或島津製作所公司製造等之肽合成機進行化學合成。
(2)抗體產生細胞之製備步驟
用(1)中所獲得之抗原來免疫3~20週齡之小鼠、大鼠或倉鼠等動物，採取該動物之脾臟、淋巴結或末梢血中之抗體產生細胞。又，作為動物，例如可列舉富塚等人之文獻[Tomizuka.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,97,722,(2000)]中所記載之產生源自人類之抗體的基因轉殖小鼠作為被免疫動物，且為了提高免疫原性，可列舉CD40或GPC3之調節劑剔除小鼠等作為被免疫動物。
免疫係藉由將抗原與弗氏完全佐劑、或氫氧化鋁凝膠與百日咳菌疫苗等適當之佐劑一併投予來進行。小鼠免疫時之免疫原投予法可為皮下注射、腹腔內注射、靜脈內注射、皮內注射、肌內注射或足底注射等之任一種，較佳為腹腔內注射、足底注射或靜脈內注射。於抗原為部分肽之情形時，與牛血清白蛋白(BSA)或匙孔螺血氰蛋白(Keyhole Limpet hemocyanin，KLH)等載體蛋白製作偶聯物，將其用作免疫原。
抗原之投予係於第1次之投予後，每隔1~2週進行5~10次。於各投予後第3~7天自眼底靜脈叢進行採血，使用酵素免疫測定法[Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等，對其血清之抗體效價進行測定。若將對於用於免疫之抗原，上述血清顯示出充分之抗體效價之動物作為融合用抗體產生細胞之供給源，則可提高以後之操作之效果。
於抗原之最終投予後第3~7天，自經免疫之動物摘除脾臟等包含抗體產生細胞之組織，採集抗體產生細胞。抗體產生細胞係漿細胞及作為其前驅細胞之淋巴細胞，其可自個體之任意部位獲得，一般而言，可自脾臟、淋巴結、骨髓、扁桃體、末梢血、或適當組合有該等者等中獲得，最常使用脾臟細胞。於使用脾臟細胞之情形時，將脾臟切碎、解開後，進行離心分離，進而去除紅血球而取得融合用抗體產生細胞。
(3)骨髓瘤之製備步驟
作為骨髓瘤，可使用源自小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人類等哺乳動物之無自我抗體產生能力之細胞，一般而言，使用自小鼠獲得之培養細胞株、例如使用8-氮鳥嘌呤耐性小鼠(源自BALB/c)骨髓瘤細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、或P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。該細胞株係於適當之培養基、例如8-氮鳥嘌呤培養基[添加有麩醯胺、2-巰基乙醇、慶大黴素、FCS及8-氮鳥嘌呤之RPMI- 1640培養基]、Iscove改良達爾伯克培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium；以下稱為「IMDM」)、或達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；以下稱為「DMEM」)等培養基中繼代培養。於細胞融合之3~4天前將上述細胞株於正常培養基(例如，包含10% FCS之DMEM培養基)中進行繼代培養，確保融合當天2×107個以上之細胞數。
(4)細胞融合
利用最低基礎培養基(Minimum Essential Medium，MEM)或磷酸緩衝生理鹽水(PBS；磷酸二鈉1.83g、磷酸一鉀0.21g、食鹽7.65g、蒸餾水1升、pH值7.2)將(2)中所獲得之融合用抗體產生細胞與(3)中所獲得之骨髓瘤細胞充分洗淨，並以成為融合用抗體產生細胞：骨髓瘤細胞=5：1~10：1之方式加以混合，進行離心分離後，將上清液去除。將沈澱之細胞群充分地解開後，一面加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培養基及二甲基亞碸之混液一面於37℃下進行攪拌。進而每1~2分鐘添加MEM培養基1~2mL數次後，添加MEM培養基以使總量成為50mL。離心分離後，將上清液去除。將沈澱之細胞群緩慢地解開後，於HAT培養基[添加有次黃嘌呤、胸苷、及胺基喋呤之正常培養基]中緩慢地使細胞懸浮。將該懸浮液於5%CO2培養箱中以37℃培養7~14天。
又，亦可藉由以下之方法進行細胞融合。將脾臟細胞與骨髓瘤細胞利用無血清培養基(例如DMEM)、或磷酸緩衝生理鹽水(以下稱為「磷酸緩衝液」)充分地洗淨，並以脾臟細胞與骨髓瘤細胞之細胞數之比成為5：1~10：1左右的方式加以混合，進行離心分離。將上清液去 除，將沈澱之細胞群充分地解開後，一面滴加1mL之包含50%(w/v)聚乙二醇(分子量1000~4000)之無血清培養基一面進行攪拌。其後，緩慢地加入10L之無血清培養基後，進行離心分離。再次捨棄上清液，使沈澱之細胞於包含適量之次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷(HAT)液及人類介白素-2(IL-2)之正常培養基(以下，稱為HAT培養基)中懸浮，分注至培養用培養板(以下，稱為培養板)之各孔中，於5%二氧化碳存在下，於37℃下培養2週左右。途中適當補充HAT培養基。
(5)融合瘤群之選擇
於用於融合之骨髓瘤細胞為8-氮鳥嘌呤耐性株之情形時、即為次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶(HGPRT)缺損株之情形時，未融合之骨髓瘤細胞及骨髓瘤細胞彼此之融合細胞於HAT培養基中無法生存。另一方面，抗體產生細胞彼此之融合細胞及抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合瘤可於HAT培養基中生存，但抗體產生細胞彼此之融合細胞不久會達到壽命。因此，藉由於HAT培養基中繼續培養，而僅抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合瘤存活，結果可取得融合瘤。
針對生長成群落狀之融合瘤，將培養基更換為自HAT培養基中去除胺基喋呤後之培養基(以下，稱為HT培養基)。其後，可採集培養上清液之一部分，並使用下述之抗體效價測定法來選擇產生抗體之融合瘤。作為抗體效價之測定方法，例如可列舉：放射性同位素免疫測定法(RIA法)、固相酵素免疫測定法(ELISA法)、螢光抗體法及被動血球凝集反應法等各種之公知技術，就檢測感度、迅速性、正確性及操作之自動化之可能性等觀點而言，較佳為RIA法或ELISA法。
將藉由測定抗體效價而判明了產生所需之抗體之融合瘤移至另一培養板來進行選殖。作為該選殖法，例如可列舉：以於培養板之1個孔中包含1個細胞之方式進行稀釋並進行培養之限制稀釋法；於軟瓊脂培養基中進行培養並回收群落之軟瓊脂法；藉由顯微操作儀單離1個細胞之方法；藉由細胞分選儀單離1個細胞之方法等。
關於確認到抗體效價之孔，例如選擇將利用限制稀釋法之選殖反覆進行2~4次而穩定地確認到抗體效價者作為產生對於人類CD40或GPC3之單株抗體之融合瘤株。
(6)單株抗體之製備
對於經姥鮫烷處理[將2,6,10,14-四甲基十五烷(Pristane)0.5mL進行腹腔內投予，飼養2週]之8~10週齡之小鼠或裸小鼠，將(5)中所獲得之單株抗體產生融合瘤注射至腹腔內。於10~21天融合瘤發生腹水癌化。自該小鼠採集腹水，進行離心分離，將固形物成分去除後，利用40~50%硫酸銨進行鹽析，利用辛酸沈澱法、DEAE-瓊脂糖凝膠管柱、蛋白A-管柱或凝膠過濾管柱進行純化，收集IgG或IgM組分，作為純化單株抗體。又，藉由於同系統之小鼠(例如，BALB/c)或Nu/Nu小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或兔等之腹腔內使該融合瘤增生，可獲得包含大量與CD40或GPC3結合之單株抗體之腹水。
將(5)中所獲得之單株抗體產生融合瘤於添加有10%FBS之RPMI1640培養基等中進行培養後，藉由離心分離去除上清液，於GIT培養基、或添加有5%Daigo GF21之Hybridoma-SFM培養基等中懸浮，藉由燒瓶培養、旋轉培養或袋裝培養等來培養3~7天。將所獲得之細胞懸浮液 進行離心分離，自所獲得之上清液藉由蛋白A管柱或蛋白G管柱進行純化，收集IgG組分，亦可獲得純化單株抗體。作為純化之簡便方法，亦可利用市售之單株抗體純化套組(例如，MAbTrap GII套組；Amersham Pharmacia Biotech公司製造)等。
抗體之亞型之確定係使用亞型分型套組(subtype typing kit)，藉由酵素免疫測定法進行。蛋白量之測定係可藉由勞立法(Lowry method)及自280nm下之吸光度[1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/mL]算出之方法來進行。
(7)單株抗體對於CD40或GPC3之結合分析
單株抗體對於CD40或GPC3之結合活性可藉由歐氏(雙向)擴散法(Ouchterlony)法、ELISA法、RIA法、流式細胞分析法(FCM)或表面電漿子共振法(SPR)等結合分析系統來進行測定。
歐氏(雙向)擴散法雖簡便，但於抗體濃度較低之情形時需要濃縮操作。另一方面，於使用ELISA法或RIA法之情形時，使培養上清液直接與抗原吸附固相進行反應，進而使用各種免疫球蛋白同型、與亞型對應之抗體作為二次抗體，藉此能夠一面鑑定抗體之同型、亞型，一面測定抗體之結合活性。
作為程序之具體例，使經純化或部分純化之重組CD40或GPC3吸附於ELISA用96孔培養板等之固相表面，進而藉由與抗原無關係之蛋白質、例如牛血清白蛋白(BSA)對未吸附抗原之固相表面進行阻斷。利用包含磷酸緩衝生理鹽水(PBS)及0.05% Tween20之PBS(Tween-PBS)等將ELISA培養板洗淨後，使經階段稀釋之第1抗體(例如小鼠血清、培養 上清液等)進行反應，使抗體與固定在培養板之抗原結合。繼而，分注經作為第2抗體之生物素、酵素(辣根過氧化酶；HRP、鹼性磷酸酶；ALP等)、化學發光物質或放射線化合物等標記之抗免疫球蛋白抗體，使結合至培養板之第1抗體與第2抗體反應。利用Tween-PBS充分洗淨後，進行與第2抗體之標記物質相應之反應，選擇與靶抗原特異性地反應之單株抗體。
FCM中，可測定抗體對於抗原表現細胞之結合活性[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]。抗體與在細胞膜上表現之膜蛋白質抗原結合意指該抗體識別天然存在之抗原之立體結構並進行結合。
作為SPR法，可列舉利用表面電漿子共振(Biacore)之動力學解析。例如使用Biacore T100，測定抗原與受驗物之間之結合之動力學，並利用機器附帶之解析軟體對其結果進行解析。作為程序之具體例，藉由胺偶合法將抗小鼠IgG抗體固定至感測器晶片CM5後，使融合瘤培養上清液或純化單株抗體等受驗物質流過以結合適當量，進而使濃度既知之複數種濃度之抗原流過，測定結合及解離。繼而，對於所獲得之資料，使用機器附帶之軟體，進行基於1：1結合模型之動力學解析，取得各種參數。或者，藉由例如胺偶合法將CD40或GPC3固定至感測器晶片上後，使濃度既知之複數種濃度之純化單株抗體流過，對結合及解離進行測定。對於所獲得之資料，使用機器附帶之軟體，進行基於二價結合(bivalent binding)模型之動力學解析，取得各種參數。
又，於本發明中，與對於CD40或GPC3之抗體競爭性地與CD40或GPC3結合之抗體可藉由使受驗抗體共存於上述結合分析系統中並 進行反應而選擇。即，對添加有受驗抗體時與抗原之結合會受到抑制之抗體進行篩選，藉此可獲得與上述中所取得之抗體競爭性地與CD40或GPC3結合之抗體。
(8)對於CD40或GPC3之單株抗體之表位之鑑定
本發明中，抗體所識別並結合之表位之鑑定可以如下方式進行。
例如，製作抗原之部分缺損體、改變了種間不同之胺基酸殘基之變異體、或改變了特定區域之變異體，若抗體對於該缺損體或變異體之反應性降低，則明確缺損部位或胺基酸改變部位為該抗體之表位。此種抗原之部分缺損體及變異體可使用適當之宿主細胞、例如大腸桿菌、酵母、植物細胞或哺乳動物細胞等，以分泌蛋白質之形式取得，亦可於宿主細胞之細胞膜上表現而以抗原表現細胞之形式製備。於膜型抗原之情形時，為了在保持抗原之立體結構之狀態下進行表現，較佳為於宿主細胞之膜上進行表現。又，亦可製作模仿抗原之一次結構或立體結構之合成肽，而確認抗體之反應性。關於合成肽，可列舉使用公知之肽合成技術而製作分子之各種部分肽之方法等。
例如，對於人類及小鼠之CD40或GPC3之細胞外區，製作適當組合構成各區域之區而成之嵌合蛋白質，確定抗體對於該蛋白質之反應性，藉此可鑑定抗體之表位。其後，進一步細緻地，使用業者所周知之寡肽合成技術，合成各種其對應部分之寡肽、或該肽之變異體等，確定抗體對於該肽之反應性，藉此可特定表位。作為用以獲得多種寡肽之簡便方法，亦可利用市售之套組[例如，SPOTs套組(GENOSYS BIOTECHNOLOGIES公司製造)、使用多中心合成法之一系列多中心-肽 合成套組(Chiron公司製造)等]。
與和與CD40或GPC3結合之抗體所結合之表位相同之表位結合的抗體可藉由鑑定上述結合分析系統中所獲得之抗體之表位，製作該表位之部分合成肽、擬態為該表位之立體結構之合成肽、或該表位之重組體等並進行免疫而取得。
例如若表位為膜蛋白質，則可藉由使全細胞外區或一部分細胞外域與適當之標籤、例如FLAG標籤、組胺酸標籤、GST蛋白質或抗體Fc區域等連結而製作重組融合蛋白質，用該重組蛋白質進行免疫而更有效率地製作該表位特異性抗體。
2.基因重組抗體之製作
作為基因重組抗體之製作例，雖於P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean.Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS及J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies：principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS等有概論，但於以下表示嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體之製作方法。又，關於基因重組小鼠、大鼠、倉鼠及兔子抗體，亦可藉由相同之方法進行製作。
(1)自融合瘤取得編碼單株抗體之V區之cDNA
編碼單株抗體之VH及VL之cDNA之取得例如可以如下方式進行。
首先，自產生單株抗體之融合瘤提取mRNA而合成cDNA。繼而，將所合成之cDNA選殖至噬菌體或質體等載體而製作cDNA 庫。使用編碼抗體之C區部分或V區部分之DNA作為探針，自該庫分別單離具有編碼VH或VL之cDNA之重組噬菌體或重組質體。確定所單離之重組噬菌體或重組質體內之VH或VL之完整鹼基序列，根據該鹼基序列推測VH或VL之完整胺基酸序列。
作為製作融合瘤時所使用之非人類動物，使用小鼠、大鼠、倉鼠或兔等，但只要能夠製作融合瘤，則可使用任何動物。
於自融合瘤製備總RNA時，使用硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]、或RNA簡易套組(Qiagen公司製造)等套組等。
於自總RNA製備mRNA時，使用寡(dT)固定化纖維素管柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]、或Oligo-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TAKARA BIO公司製造)等套組等。又，亦可使用Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen公司製造)、或QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia公司製造)等套組，而製備mRNA。
於cDNA之合成及cDNA庫之製作時，使用公知之方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons(1987-1997)]或SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Invitrogen公司製造)或ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene公司製造)等套組等。
於製作cDNA庫時，作為供組入以自融合瘤提取之mRNA為模板所合成之cDNA的載體，只要為供組入該cDNA之載體，則可使用 任何者。
例如使用ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司製造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning：A Practical Approach,I,49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司製造)、λExCell、pT7T3-18U(Pharmacia公司製造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
關於供導入由噬菌體或質體載體構建之cDNA庫之大腸桿菌，只要為可導入、表現及維持該cDNA庫者，則可使用任何者。例如使用XL1-Blue MRF'[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]、或JM105[Gene,38,275(1985)]等。
自cDNA庫選擇編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA純系時，使用利用同位素或經螢光標記之探針之菌落雜交法、或者噬菌斑雜交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]等。
又，製備引子，以自mRNA合成之cDNA或cDNA庫為模板而進行聚合酶鏈反應法[以下，記載為PCR法，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons(1987-1997)]，藉此亦可製備編碼VH或VL之cDNA。
利用適當之限制酶等切斷所選擇之cDNA後，選殖至 pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體，藉由通常所使用之鹼基序列分析方法等而確定該cDNA之鹼基序列。例如進行雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等反應後，使用A.L.F.DNA核酸定序(Pharmacia公司製造)等鹼基序列自動分析裝置等來進行解析。
根據所確定之完整鹼基序列分別推測VH及VL之完整胺基酸序列，與既知之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較，藉此確認所取得之cDNA是否編碼包括分泌訊息序列在內之抗體之VH及VL各自之完整胺基酸序列。
關於包含分泌訊息序列之抗體之VH及VL各自之完整胺基酸序列，與既知之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較，藉此可推測分泌訊息序列之長度及N末端胺基酸序列，進而可鑑定該等所屬之亞群。
又，關於VH及VL之各CDR之胺基酸序列，可藉由與既知之抗體之VH及VL之胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較而推測。
又，對於所獲得之VH及VL之完整胺基酸序列，例如使用SWISS-PROT或PIR-Protein等任意之資料庫，進行基於BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等之同源性檢索，藉此可確認該VH及VL之完整胺基酸序列是否為新穎者。
(2)基因重組抗體表現用載體之構建
基因重組抗體表現用載體可藉由將編碼人類抗體之CH及CL之至少一者之DNA選殖至動物細胞用表現載體而構建。
作為人類抗體之C區，可使用任意之人類抗體之CH及CL，例如可使用人類抗體之γ1亞型之CH及κ型之CL等。作為編碼人類抗體之CH及CL之DNA，使用cDNA，但亦可使用包含外顯子與內含子之染色體DNA。
關於動物細胞用表現載體，只要為可組入編碼人類抗體之C區之基因並表現者，則可使用任何者，例如可使用pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]、或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]、INPEP4(Biogen-IDEC公司製造)、N5KG1val(美國專利第6,001,358號說明書)、N5KG4PE R409K(國際公開第2006/033386號所記載)、N5KG2載體(國際公開第2003/033538號所記載)、轉位子載體(國際公開第2010/143698號)等。
作為動物細胞用表現載體之啟動子與促進子，可使用SV40之初期啟動子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、來源於小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]、CMV啟動子(美國專利第5,168,062號說明書)或免疫球蛋白H鏈之啟動子[Cell,41,479(1985)]及促進子[Cell,33,717(1983)]等。
為了表現基因重組抗體，就載體之構建容易性、向動物細胞之導入容易性、細胞內之抗體H鏈及L鏈之表現量之均衡性等觀點而 言，使用搭載有抗體H鏈及L鏈之兩基因之載體(串聯型載體)[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]，但亦可將分別搭載有抗體H鏈與L鏈之各基因之複數個載體(分離型載體)組合使用。
作為串聯型之基因重組抗體表現用載體，使用pKANTEX93(國際公開第97/10354號)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]、N5KG1val(美國專利第6,001,358號說明書)、N5KG4PE R409K(國際公開第2006/033386號所記載)、N5KG2載體(國際公開第2003/033538號所記載)、Tol2轉位子載體(國際公開第2010/143698號)等。
(3)嵌合抗體表現用載體之構建
將編碼(1)中所獲得之非人類抗體之VH或VL之cDNA分別選殖至(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體內的編碼人類抗體之CH或CL之各基因的上游，藉此可構建嵌合抗體表現用載體。
首先，為了將編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA之3'末端側、與人類抗體之CH或CL之5'末端側連結，而製作以編碼連結部分之鹼基序列適當之胺基酸，且成為適當之限制酶識別序列之方式所設計的VH及VL之cDNA。繼而，將所製作之VH及VL之cDNA以其等以適當形式表現的方式分別選殖至(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體內的編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游，而構建嵌合抗體表現用載體。
又，亦可使用於兩端具有適當限制酶之識別序列之合成DNA，藉由PCR法分別擴增編碼非人類抗體之VH或VL的cDNA，並選殖至(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體，藉此構建嵌合抗體表現用載 體。
(4)編碼人類化抗體之V區之cDNA之製作
編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA可以如下方式進行製作。首先，分別選擇供移植(1)中所獲得之非人類抗體之VH或VL之CDR之胺基酸序列的人類抗體之VH或VL之架構區(以下，記載為FR)之胺基酸序列。
關於所選擇之FR之胺基酸序列，只要為源自人類抗體者，則可使用任一者。例如使用登陸於蛋白質資料庫(Protein Data Bank)等資料庫中之人類抗體之FR之胺基酸序列、或者人類抗體之FR之各亞群之共通胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]等。為了抑制抗體之結合活性之降低，而選擇與原本之非人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列具有儘可能高之同源性(60%以上)的人類FR之胺基酸序列。
繼而，將原本之非人類抗體之CDR之胺基酸序列分別移植至所選擇的人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列，而分別設計人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列。考慮抗體基因之鹼基序列中可見之密碼子之使用頻度[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]，將所設計之胺基酸序列轉化為DNA序列，藉此分別設計人類化抗體之VH或VL之cDNA序列。
基於所設計之cDNA序列，合成包含100~150個鹼基左右長度之數條合成DNA，使用其等進行PCR反應。於該情形時，就PCR反應中之反應效率及能夠合成之DNA長度之觀點而言，較佳為對於H鏈及L鏈各設計4~6條合成DNA。又，亦可合成可變區全長之合成DNA來使 用。
進而，將適當之限制酶之識別序列導入至位於兩端之合成DNA之5'末端，藉此可容易地將編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA選殖至(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體。PCR反應後，將擴增產物分別選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體，藉由與(1)中所記載之方法相同之方法來確定鹼基序列，取得具有所需之編碼人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列之DNA序列的質體。
(5)人類化抗體之V區之胺基酸序列之改變
人類化抗體若僅將非人類抗體之VH及VL之CDR移植至人類抗體之VH及VL之FR，則其抗原結合活性較原本之非人類抗體降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。因此，對人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列中直接參與與抗原之結合之胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及維持抗體之立體結構且間接地參與與抗原之結合之胺基酸殘基進行鑑定，將該等胺基酸殘基置換為原本之非人類抗體之胺基酸殘基，藉此可使已降低之人類化抗體之抗原結合活性上升。
為了鑑定與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基，使用X射線結晶解析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或電腦建模[Protein Engineering,7,1501(1994)]等，藉此可進行抗體之立體結構之構建及解析。又，關於各抗體，製作數種改變體，反覆研究各自與抗原結合活性之相關性，並進行試誤，藉此可取得具有所需之抗原結合活性之改變人類化抗體。
人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基可藉由使用改變用 合成DNA來進行(4)中所記載之PCR反應而進行改變。關於PCR反應後之擴增產物，藉由(1)中所記載之方法來確定鹼基序列以確認實施過目標改變。
(6)人類化抗體表現用載體之構建
將所構建之編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA分別選殖至(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游，而可構建人類化抗體表現用載體。
例如，將適當之限制酶之識別序列導入至構建(4)及(5)中所獲得之人類化抗體之VH或VL時所使用之合成DNA中位於兩端之合成DNA的5'末端，藉此以其等以適當之形式進行表現之形式分別選殖至(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體內之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游。
(7)人類抗體表現用載體之構建
於使用產生人類抗體之動物作為被免疫動物，構建產生單株抗體之融合瘤的情形時，於(1)中可獲得人類抗體之VH及VL之胺基酸序列及cDNA序列。因此，將編碼(1)中所獲得之人類抗體之VH或VL之基因分別選殖至(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因的上游，藉此可構建人類抗體表現用載體。
(8)基因重組抗體之短暫性表現
可使用(3)、(6)及(7)中所獲得之基因重組抗體表現用載體、或改變 其等而成之表現載體，使基因重組抗體短暫性表現，而有效率地評價所獲得之多種基因重組抗體之抗原結合活性。
關於供導入表現載體之宿主細胞，只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任何細胞，例如使用COS-7細胞[American Type Culture Collection(ATCC)編號：CRL1651]。向COS-7細胞導入表現載體時，使用DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press(1991)]、或脂轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
導入表現載體後，使用酵素免疫抗體法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third Edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單純系抗體實驗指南、Kodansha Scientific(1987)]等，對培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性進行測定。
(9)基因重組抗體之穩定表現株之取得與基因重組抗體之製備
將(3)、(6)及(7)中所獲得之基因重組抗體表現用載體導入至適當之宿主細胞，藉此可獲得穩定地表現基因重組抗體之轉形株。
關於表現載體向宿主細胞之導入，例如可列舉：電穿孔法[日本專利特開平2-257891號公報、Cytotechnology,3,133(1990)]、鈣離子方法、電穿孔法、球形質體法、乙酸鋰法、磷酸鈣法、脂轉染法等。又，作為下述向動物導入基因之方法，例如可列舉：顯微注射法、使用電穿孔法或脂轉染法向ES細胞導入基因之方法、及核移植法等。
作為供導入基因重組抗體表現用載體之宿主細胞，只要為 可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任何細胞。例如使用小鼠SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、中國倉鼠CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5細胞(ATCC CCL-1781)、CHO-S細胞(Life Technologies、Cat No.11619)、缺失有二氫葉酸還原酶基因(dhfr)之CHO細胞(CHO/DG44細胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、獲得了凝集素耐性之Lec13細胞[Somatic Cell and Molecular genetics,12,55(1986)]、缺失有α1,6-海藻糖轉移酶基因之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC編號：CRL1662)等。
又，亦可使用：與細胞內糖核苷酸GDP-海藻糖之合成相關之酶等蛋白質、與海藻糖之1位α結合至N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯胺基葡萄糖之6位的糖鏈修飾相關的酶等蛋白質、或者與細胞內糖核苷酸GDP-海藻糖向高爾基體的輸送相關之蛋白質等之活性降低或缺失之宿主細胞、例如缺失有α1,6-海藻糖基轉移酶基因之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)等。
藉由於導入表現載體後，將穩定地表現基因重組抗體之轉形株於包含G418硫酸鹽(以下，記載為G418)等藥劑之動物細胞培養用培養基中進行培養而選擇(日本專利特開平2-257891號公報)。
關於動物細胞培養用培養基，使用RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基(JRH公司製造)、EX-CELL302培養基(JRH公司製造)、EX-CELL325培養基(JRH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)或融 合瘤-SFM培養基(Invitrogen公司製造)、或者於該等培養基中添加有FBS等各種添加物之培養基等。將所獲得之轉形株於培養基中進行培養，藉此使基因重組抗體於培養上清液中表現並蓄積。培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等進行測定。又，可利用DHFR擴增系統(日本專利特開平2-257891號公報)等，使轉形株所產生之基因重組抗體之表現量提昇。
基因重組抗體係使用蛋白A-管柱，自轉形株之培養上清液進行純化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。又，亦可將凝膠過濾、離子交換層析法及超過濾等蛋白質之純化中所使用之方法組合來進行純化。
經純化之基因重組抗體之H鏈、L鏈或抗體分子整體之分子量可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature,227,680(1970)]、或西方墨點法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等進行測定。
3.雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之製作
本發明之雙專一性抗體可藉由如下方式製作：分別設計包含第一抗原結合域之IgG部分與第二抗原結合域，進而設計連結有其等之雙專一性抗體。
3-1.包含第一抗原結合域之IgG部分之設計
IgG部分可藉由如下方式獲得：使用上述1.中所記載之方法取得單株抗體，使用上述2.中所記載之方法來確定各抗體之CDR及可變區之cDNA序列，設計包含抗體之CDR或可變區作為第一抗原結合域之IgG部分。
3-2.第二抗原結合域之設計
於第二抗原結合域包含抗體之CDR或可變區之情形時，可藉由如下方式進行製作：利用上述1.及2.中所記載之方法來確定抗體之CDR或可變區之DNA序列，設計包含其等之第二抗原結合域。作為此種第二抗原結合域，亦可使用如scFv等般使VH與VL直接或經由適當之連接子結合而成之單鏈者、如Fab及dsFv等般以於雙鏈中表現並於表現後進行雙硫鍵結之方式設計者、或者VHH等。第二抗原結合域之抗原結合活性係利用上述方法進行評價，可選擇保持有抗原結合活性者。
4.雙專一性抗體之製作 4-1.第二抗原結合域為Fab之雙專一性抗體之製作
(1)具有第二抗原結合域為Fab並且該Fab之VH-CH1直接或經由連接子與IgG部分之重鏈C末端結合之結構，且第一結合區與第二結合區之輕鏈共通的雙專一性抗體具體而言，可以如下方式進行製作。
合成編碼連結有IgG部分之重鏈與該Fab之VH-CH1之多肽之DNA，切出CH後組入至2.(2)中所記載之包含CH之基因重組抗體表現用載體。又，合成編碼VL之DNA，組入至2.(2)中所記載之包含CL之基因重組抗體表現用載體。針對各載體，依據2.(8)中所記載之方法進行表現，藉此可製作該雙專一性抗體。
(2)具有第二抗原結合域為Fab並且該Fab之VL-CL直接或經由連接子與IgG部分之重鏈C末端結合之結構的雙專一性抗體具體而言，可以如下方式進行製作。
合成編碼連結有Fab之VL-CL與IgG部分之重鏈連結之多肽之DNA及編碼Fab之VH-CH1之DNA，將CH切出後組入至2.(2)中所記載之包含CH之基因重組抗體表現用載體。又，合成編碼IgG部分之VL之DNA，組入至2.(2)中所記載之包含CL之基因重組抗體表現用載體。針對各載體，依據2.(8)中所記載之方法使該雙專一性抗體表現，藉此可製作該雙專一性抗體。
4-2.第二抗原結合域為Fab以外之雙專一性抗體
(1)第二抗原結合域為VHH之雙專一性抗體具體而言，可以如下方式進行製作。
合成編碼連結有VHH與IgG部分之VH-CH1多肽之DNA，將CH切出後組入至2.(2)中所記載之包含CH之基因重組抗體表現用載體。又，合成編碼IgG部分之VL之DNA，組入至2.(2)中所記載之包含CL之基因重組抗體表現用載體。針對各載體，依據2.(8)中所記載之方法使該雙專一性抗體表現，藉此可製作該雙專一性抗體。
(2)第二抗原結合域為包含scFv、dsFv或CDR之上述(1)(2)以外之多肽之雙專一性抗體具體而言，可以如下方式進行製作。
於第二抗原結合域為單鏈之情形時，合成連結有編碼第二抗原結合域之DNA與編碼IgG部分之重鏈之DNA的DNA。於第二抗原結合域為包含2條單鏈多肽之締合體之情形時，一面將構成第二抗原結合域之一單鏈 多肽與編碼IgG部分之重鏈之DNA連結來進行合成，一面亦合成編碼構成第二抗原結合域之另一單鏈多肽之DNA。將該等DNA之CH切出後組入至2.(2)中所記載之包含CH之基因重組抗體表現用載體。又，亦合成編碼IgG部分之VL之DNA，組入至2.(2)中所記載之包含CL之基因重組抗體表現用載體。針對各載體，依據2.(8)中所記載之方法使該雙專一性抗體表現，藉此可製作該雙專一性抗體。
(3)第二抗原結合域為上述以外之雙專一性抗體之製作
於第二抗原結合域為上述以外之多肽之情形時，本發明之雙專一性抗體具體而言，可以如下方式進行製作。
於第二抗原結合域為單鏈之情形時，合成連結有編碼第二抗原結合域之DNA與編碼IgG部分之重鏈之DNA的DNA。於第二抗原結合域為包含2條以上之單鏈多肽之締合體之情形時，一面將構成第二抗原結合域中之1條單鏈多肽與編碼IgG部分之重鏈之DNA連結來進行合成，一面亦合成編碼構成第二抗原結合域之其他所締合之多肽之DNA。將該等DNA之CH切出後組入至2.(2)中所記載之包含CH之基因重組抗體表現用載體。又，亦合成編碼IgG部分之VL之DNA，組入至2.(2)中所記載之包含CL之基因重組抗體表現用載體。針對各載體，依據2.(8)中所記載之方法使該雙專一性抗體表現，藉此可製作該雙專一性抗體。
又，於製作上述雙專一性抗體中經由連接子結合有第二抗原結合域之雙專一性抗體之情形時，藉由合成於IgG部分之C末端連結有連接子之DNA並使多肽表現，可製作雙專一性抗體。
抗原結合部位除上述1.中所記載之使用融合瘤之方法以外，亦可藉由噬菌體呈現(Phage Display)法、酵母呈現(Yeast display)法 等技術進行單離並取得[Emmanuelle Laffy et al.,Human Antibodies 14,33-55,(2005)]。
又，於製作包含複數個VH與單一VL之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之情形時，以雙專一性抗體中所包含之各抗原結合部位分別特異性地與抗原進行反應的方式，使用噬菌體呈現法等進行篩選，選擇最適合單一VL之各VH。
具體而言，首先，使用上述1.中所記載之方法，用第1抗原免疫動物，自該動物之脾臟製作融合瘤，選殖編碼第1抗原結合部位之DNA序列。繼而，用第2抗原免疫動物，自該動物之脾臟製備cDNA庫，自該庫，藉由PCR取得編碼VH之胺基酸序列之DNA。
繼而，製作表現連結第2抗原之免疫中所獲得之VH與第1抗原結合部位之VL而成之scFv的噬菌體庫，使用該噬菌體庫進行篩選，藉此選擇呈現與第2抗原特異性地結合之scFv之噬菌體。根據所選擇之噬菌體，對編碼第2抗原結合部位之VH之胺基酸序列之DNA序列進行選殖。
進而，於第二抗原結合域為Fab之情形時，設計編碼將第1抗原結合部位之VH與第2抗原結合部位之VH經由上述連接子連結而成之多肽之胺基酸序列的DNA序列，將編碼單一VL之胺基酸序列之DNA序列與該DNA序列插入至例如上述2.(2)中所記載之基因重組抗體表現用載體，藉此可構建本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之表現載體。
4.本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之活性評價
經純化之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之活性評價可以如下方式進行。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段對於表現CD40及/或GPC3之細胞株之結合活性可使用上述1.(7)記載之結合分析系統來進行測定。
對於表現CD40及/或GPC3之細胞之CDC活性、或ADCC活性可藉由公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行測定。
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之細胞死亡誘導活性可藉由以下之方法進行測定。例如將細胞接種至96孔培養板中，添加抗體並培養一定期間後，使WST-8試劑(Dojindo公司製造)進行反應，藉由讀板儀測定450nm之吸光度，藉此測定細胞之存活率。
5.使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之疾病之治療方法
本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段可用於治療與CD40及/或GPC3相關之疾病、較佳為CD40及GPC3之表現細胞所參與之疾病。作為與CD40及/或GPC3相關之疾病，例如可列舉惡性腫瘤及癌症等。
作為惡性腫瘤及癌症，例如可列舉：大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、神經膠質瘤、惡性黑色素瘤(黑色素瘤)、甲狀腺癌、腎細胞癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、膽管癌、食道癌、肝臟癌、頭頸部鱗狀細胞癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、前列腺癌、絨毛膜癌、咽頭癌、喉頭癌、胸膜瘤、雄胚瘤、子宮內膜增生、子宮內膜症、胚組織瘤、纖維肉瘤、卡波西肉 瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、星狀細胞瘤、神經纖維瘤、少突膠質細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤、神經膠母細胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤及威爾姆斯瘤等。
含有本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段、或者該等之衍生物之治療藥可為僅包含作為有效成分之該抗體或該雙專一性抗體片段、或者該等之衍生物者，通常與藥理學上所容許之1種以上之載體一起混合，而以藉由製劑學之技術領域中所公知之任意方法所製造之醫藥製劑的形式提供。
作為投予路徑，例如可列舉：經口投予、或者口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌內或靜脈內等非經口投予。作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。各種製劑可使用通常使用之賦形劑、增量劑、結合劑、浸潤劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、分散劑、緩衝劑、保存劑、增溶劑、防腐劑、著色料、香味劑、及穩定劑等，藉由常規方法進行製造。
作為賦形劑，例如可列舉：乳糖、果糖、葡萄糖、玉米澱粉、山梨糖醇、結晶纖維素、殺菌水、乙醇、甘油、生理鹽水及緩衝液等。作為崩解劑，例如可列舉：澱粉、海藻酸鈉、明膠、碳酸鈣、檸檬酸鈣、糊精、碳酸鎂及合成矽酸鎂等。
作為結合劑，例如可列舉：甲基纖維素或其鹽、乙基纖維素、阿拉伯膠、明膠、羥丙基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮等。作為潤滑劑，例如可列舉：滑石、硬脂酸鎂、聚乙二醇及氫化植物油等。
作為穩定劑，例如可列舉：精胺酸、組胺酸、離胺酸、甲硫胺酸等胺基酸、人類血清白蛋白、明膠、葡聚糖40、甲基纖維素、亞硫酸鈉、偏亞硫酸鈉等。
作為其他添加劑，例如可列舉：糖漿、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、檸檬酸、氯化鈉、亞硝酸鈉及磷酸鈉等。
作為適合經口投予之製劑，例如可列舉：乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等。
如乳劑或糖漿劑之液體製備物係使用水、蔗糖、山梨糖醇或果糖等糖類；聚乙二醇或丙二醇等二醇類；芝麻油、橄欖油或大豆油等油類；對羥基苯甲酸酯類等防腐劑；或者草莓香料或胡椒薄荷等香料類等作為添加劑來進行製造。
膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等係使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等賦形劑；澱粉或海藻酸鈉等崩解劑；硬脂酸鎂或滑石等潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素或明膠等結合劑；脂肪酸酯等界面活性劑或者甘油等塑化劑等作為添加劑來進行製造。
作為適合非經口投予之製劑，例如可列舉注射劑、栓劑或噴霧劑等。注射劑係使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液、或者上述兩者之混合物之載體等來進行製造。
栓劑係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體來進行製造。噴霧劑係使用不會刺激接受者之口腔及呼吸道黏膜，且使本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段以微細粒子之形式分散而使吸收變得容易的載體等來進行製造。作為載體，例如可列舉乳糖或甘油等。又，亦可以霧劑或乾粉之形式進行製造。進而，於上述非經口劑中，亦可添加於適合經 口投予之製劑中作為添加劑所例示之成分。
關於以本發明之雙專一性抗體之有效量與適當之稀釋劑及藥理學上可使用之載子的組合所投予之有效量，每次體重每1kg為0.0001mg~100mg，且以2天至8週之間隔來投予。
6.使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段之疾病之診斷方法
使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段，對表現CD40及/或GPC3之細胞進行檢測或測定，藉此可診斷與CD40及/或GPC3相關之疾病、較佳為CD40及GPC3之表現細胞所參與之疾病。
與CD40及/或GPC3相關之疾病即惡性腫瘤或癌症之診斷例如可以下述方式對CD40及/或GPC3進行檢測或測定來進行。
首先，對於自複數個健康者之生物體採集到之生物樣本，使用本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段、或者該等之衍生物，並使用下述免疫學方法，進行CD40及/或GPC3之檢測或測定，調查健康者之生物樣本中之CD40及/或GPC3之存在量。
繼而，於受驗者之生物樣本中，同樣地調查CD40及/或GPC3之存在量，將其存在量與健康者之存在量進行比較。於受驗者之CD40及/或GPC3之存在量較健康者增加之情形時，該受驗者被診斷為癌症。關於其他與CD40及/或GPC3相關之疾病之診斷，亦可藉由相同之方法進行診斷。
所謂免疫學方法，係使用施加有標記之抗原或抗體等，對抗體量或抗原量進行檢測或測定之方法。例如可列舉：放射性物質標記免疫抗體法、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、發光免疫測定法、西方墨 點法或物理化學方法等。
作為放射性物質標記免疫抗體法，例如可列舉如下方法：使抗原或表現抗原之細胞等與本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段進行反應，進而使施加過放射線標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段進行反應後，利用閃爍計數器等進行測定。
作為酵素免疫測定法，例如可列舉如下方法：使抗原或表現抗原之細胞等與本發明之雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段進行反應，進而使施加過標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段進行反應後，利用吸光光度計對顯色色素進行測定。例如可列舉夾層ELISA法等。
作為酵素免疫測定法中所使用之標記體，可使用公知之酶標記[酵素免疫測定法，醫學書院(1987)]。例如使用鹼性磷酸酶標記、過氧化酶標記、螢光素酶標記、或生物素標記等。
夾層ELISA法係如下方法：使抗體與固相結合後，捕獲作為檢測或測定對象之抗原，使所捕獲之抗原與第2抗體進行反應。該ELISA法中，準備與欲檢測或測定之抗原結合之抗體或抗體片段且抗原結合部位不同之2種抗體，之後，預先使第1抗體或抗體片段吸附於培養板(例如96孔培養板)，繼而預先利用FITC等螢光物質、過氧化酶等酵素、或者生物素等來標記第2抗體或抗體片段。與上述吸附有抗體之培養板中，使自體內分離出之細胞或其破碎液、組織或其破碎液、細胞培養上清液、血清、胸水、腹水、或眼液等反應後，使經標記之抗體或抗體片段反應，進行與標記物質對應之檢測反應。根據階段性地稀釋濃度已知之抗原所製作之校準曲線，而算出受驗樣品中之抗原濃度。
作為用於夾層ELISA法之抗體，可使用多株抗體或單株抗 體中之任一種，亦可使用Fab、Fab'、或F(ab)2等抗體片段。作為夾層ELISA法中所使用之2種抗體之組合，可為與不同表位結合之單株抗體或該抗體片段之組合，亦可為多株抗體與單株抗體或其抗體片段之組合。
作為螢光免疫測定法，例如利用文獻[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單純系抗體實驗指南、Kodansha Scientific(1987)]等中所記載之方法進行測定。作為螢光免疫測定法中所使用之標記體，可使用公知之螢光標記[螢光抗體法、Soft science公司(1983)]。例如使用FITC或RITC等。
作為發光免疫測定法，例如利用文獻[生物發光與化學發光臨床檢查42、廣川書店(1998)]等所記載之方法進行測定。作為發光免疫測定法中所使用之標記體，可列舉公知之發光體標記，例如使用吖啶鎓酯或咯吩等。
作為西方墨點法，係如下方式進行測定：利用SDS(十二烷基硫酸鈉)-PAGE(聚丙烯醯胺凝膠)[Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]區分抗原或表現抗原之細胞等後，將該凝膠印漬至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝化纖維素膜，使該膜和與抗原結合之抗體或抗體片段進行反應，進而使施加有FITC等螢光物質、過氧化酶等酵素標記、或生物素標記等之抗IgG抗體或其抗體片段反應後，將該標記進行可視化。將一例示於以下。
首先，使表現具有所需胺基酸序列之多肽之細胞或組織溶解，於還原條件下，藉由SDS-PAGE法，使以每區帶之蛋白量計0.1~30μg進行泳動。繼而，將泳動之蛋白質轉移至PVDF膜，於室溫下與包含1 ~10%BSA之PBS(以下，記載為BSA-PBS)反應30分鐘而進行阻斷操作。此處，使本發明之雙專一性抗體進行反應，利用包含0.05~0.1%之Tween-20之PBS(Tween-PBS)洗淨，於室溫下，使經過氧化酶標記之山羊抗小鼠IgG反應2小時。利用Tween-PBS洗淨，使用ECL西方墨點法檢測試劑(Amersham公司製造)等，檢測該抗體所結合之帶，藉此檢測抗原。作為西方墨點法中之檢測所使用之抗體，可使用可與未保持天然型立體結構之多肽結合之抗體。
作為物理化學方法，例如藉由使作為抗原之CD40及/或GPC3與本發明之雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段結合而形成凝集體，對該凝集體進行檢測。作為除此以外之物理化學方法，亦可使用毛細管法、單向免疫擴散法(single immunodiffusion)、免疫比濁法或乳膠免疫比濁法[臨床檢查法摘要，金原出版(1998)]等。
關於乳膠免疫比濁法，係使用使抗體或抗原致敏之粒徑0.1~1μm左右之聚苯乙烯乳膠等載體，若藉由相對應之抗原或抗體而引起抗原抗體反應，則反應液中之散射光增加，而透過光減少。將該變化作為吸光度或積分球濁度進行檢測，藉此測定受驗樣品中之抗原濃度等。
另一方面，於檢測或測定表現CD40及/或GPC3之細胞時，可使用公知之免疫學檢測法，較佳為使用免疫沈澱法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法或螢光抗體染色法等。
作為免疫沈澱法，係使表現CD40及/或GPC3之細胞等與本發明之雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段反應後，添加對於蛋白G-瓊脂糖凝膠等免疫球蛋白具有特異性結合能力之載體，使抗原抗體複合體沈降。
或者，亦可藉由如以下之方法來進行。首先，將本發明之雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段固相化至ELISA用96孔培養板後，藉由BSA-PBS進行阻斷。繼而，捨棄BSA-PBS，利用PBS充分洗淨後，使表現CD40及/或GPC3之至少一者之細胞或組織之溶解液進行反應。利用SDS-PAGE用樣品緩衝液，自充分洗淨後之培養板提取免疫沈澱物，藉由上述西方墨點法進行檢測。
免疫細胞染色法或免疫組織染色法係如下方法：針對表現抗原之細胞或組織等，視情形為了使抗體之通過性變得良好而利用界面活性劑或甲醇等進行處理後，與本發明之雙專一性抗體進行反應，進而與施加有FITC等螢光標記、過氧化酶等酵素標記或生物素標記等之抗免疫球蛋白抗體或其結合片段進行反應，之後將該標記進行可視化，並利用顯微鏡進行觀察。又，可藉由使螢光標記之抗體與細胞進行反應並利用流式細胞儀進行解析之螢光抗體染色法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單純系抗體實驗指南、Kodansha Scientific(1987)]來進行檢測。尤其是本發明之雙專一性抗體或其雙專一性抗體片段可藉由螢光抗體染色法而檢測出於細胞膜上表現之CD40及/或GPC3。
又，螢光抗體染色法中，於使用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等之情形時，可不將所形成之抗體-抗原複合體、與不參與形成抗體-抗原複合體之游離之抗體或抗原分離而測定抗原量或抗體量。
[實施例]
以下，藉由實施例對本發明具體地進行說明，但本發明並 不限定於下述實施例。
[實施例1]可溶性人類及猴CD40抗原之取得 1.人類CD40及猴CD40之可溶性抗原之製備
藉由以下所記載之方法分別製作於C末端附加有FLAG-Fc之人類及猴CD40之細胞外域蛋白質。將編碼人類CD40細胞外域之鹼基序列示於序列編號1，將自該鹼基序列推測之胺基酸序列示於序列編號2，將編碼猴CD40細胞外域之鹼基序列示於序列編號3，將自該鹼基序列推測之胺基酸序列示於序列編號4。
(1)人類及猴CD40-FLAG-Fc載體之製作
基於人類CD40基因之鹼基序列(基因庫登錄號：NM_001250、序列編號5；將該基因所編碼之胺基酸序列示於序列編號6)，製作包含序列編號1所示之鹼基序列之人類CD40之細胞外域之基因片段。
利用限制酶KpnI及XbaI來消化包含FLAG-tag及人類IgG之Fc區之INPEP4載體(Biogen-IDEC公司製造)，加上包含序列編號1所示之鹼基序列之第1~60號鹼基序列的人類CD40訊息序列編碼區，將所得之該細胞外域之基因片段插入至適當部位，製作人類CD40-FLAG-Fc表現載體。
藉由相同之方法，基於自猴末梢血液單核球(PBMC)選殖之猴CD40基因之鹼基序列(序列編號7；將該基因所編碼之胺基酸序列示於序列編號8)，而製作包含猴CD40之細胞外域之基因片段之猴CD40-FLAG-Fc表現載體，該猴CD40之細胞外域之基因片段包含序列編號3所 示之鹼基序列。
(2)人類及猴CD40-FLAG-Fc蛋白質之製作
使用FreeStyle(商標)293表現系統(Thermo Fisher公司製造)，將1-(1)中所製作之人類CD40-FLAG-Fc表現載體導入至HEK293細胞並進行培養，利用短暫性表現系統使蛋白質表現。於載體導入5天後回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)進行過濾。
使用蛋白A(Protein A)樹脂(MabSelect、GE healthcare公司製造)對該培養上清液進行親和純化。利用達爾伯克磷酸緩衝生理鹽水[D-PBS(-)無Ca及Mg，液體；以下記載為D-PBS(-)；Nacalai Tesque公司製造]將吸附於蛋白A樹脂之抗體洗淨，藉由20mM檸檬酸鈉、50mM之NaCl緩衝液(pH值3.4)溶出，回收至包含1M磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之試管中。
繼而，藉由使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)之超過濾，置換為D-PBS(-)後，利用孔徑0.22μm之膜濾器Millex-Gv(Millipore公司製造)進行過濾殺菌，製作人類CD40-FLAG-Fc蛋白質。利用相同之方法，使用1.(1)中所製作之猴CD40-FLAG-Fc表現載體製作猴CD40-FLAG-Fc蛋白質。所取得之蛋白質之濃度係測定波長280nm之吸光度，使用自各蛋白質之胺基酸序列推測之吸光係數而算出。
(3)人類及猴CD40-GST載體之製作
利用限制酶BglII及KpnI來消化包含GST區之N5載體(Biogen-IDEC公司製造)，將包含1.(1)記載之序列編號1所表示之鹼基序列之人類CD40 之細胞外域的基因片段插入至適當之部位，而製作人類CD40-GST表現載體。藉由相同之方法製作含有包含序列編號3所示之鹼基序列之細胞外域之基因片段的猴CD40-GST表現載體。
(4)人類及猴CD40-GST蛋白質之製作
將1.(3)中所製作之人類CD40-GST載體藉由與1.(2)相同之方法導入至HEK293細胞，培養該細胞後，將培養上清液利用膜濾器進行過濾。使該培養上清液與麩胱甘肽Sepharose 4B(GE healthcare Bioscience公司製造)進行反應，利用D-PBS(-)洗淨，使用含10mM麩胱甘肽之50mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(pH值8.0)作為溶出緩衝液來進行親和純化。
對於所溶出之融合蛋白溶液，藉由與1.(2)相同之方法，利用超過濾及膜濾器進行過濾殺菌，而獲得人類CD40-GST蛋白質。又，使用猴CD40-GST載體，藉由相同之方法獲得猴CD40-GST蛋白質。所取得之蛋白質之濃度係測定波長280nm之吸光度，使用自各蛋白質之胺基酸序列推測之吸光係數而算出。
[實施例2]抗CD40抗體之取得 1.CD40免疫人類抗體M13噬菌體庫之製作
向人類抗體產生小鼠[Ishida & Lonberg,IBC's 11th Antibody Engineering,Abstract 2000；Ishida,I.et al.,Cloning & Stem Cells 4,85-96(2002)及石田功(2002)實驗醫學20,6,846-851]之腹腔內投予作為免疫原之實施例1中所製作的人類CD40-FLAG-Fc計4次。僅於初次免疫時添加作為佐劑之明礬凝膠(2mg/隻)及百日咳菌疫苗(1×109個/隻)。
於初次免疫後之2週後進行第2次免疫，於第2次免疫之1週後進行第3次免疫，於第3次免疫後之10天後進行最終免疫，在最終免疫後之4天後進行解剖，外科摘除脾臟。將所摘除之脾臟置於細胞濾網(Falcon公司製造)上，一面利用矽棒輕輕地壓碎一面將細胞移至試管中，進行離心分離，使細胞沈澱後，使之與紅血球去除試劑(Sigma-Aldrich公司製造)在冰中反應3分鐘，進而進行離心分離。
使用RNeasy微型套組(QIAGEN公司製造)，自所獲得之脾臟細胞提取RNA，利用SMARTer RACE cDNA擴增套組(Clontech公司製造)擴增cDNA，進而利用PCR擴增VH基因片段。將該VH基因片段、與包含為人類之抗體胚系序列且編碼L6之胺基酸序列(VL)的序列編號9所示之鹼基序列之VL基因一起插入至噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia公司製造)，將大腸桿菌TG1(Lucigen公司製造)轉形而獲得質體。
再者，L6序列編碼包含序列編號10所示之胺基酸序列之人類抗體之輕鏈可變區(VL)，且該VL之CDR1、2及3(分別表示為LCDR1、2及3)之胺基酸序列分別以序列編號11、12及13表示。
使VCSM13抗干擾輔助噬菌體(Agilent Technologies公司製造)感染所獲得之質體，藉此獲得具有包含L6序列之VL基因，且VH基因得到庫化之CD40免疫人類抗體M13噬菌體庫。
2.抗CD40單株抗體之取得
使用該CD40免疫人類抗體M13噬菌體庫，藉由下述噬菌體呈現法，取得具有包含L6之胺基酸序列之VL之抗CD40單株抗體。將實施例1中所 取得之人類CD40-GST固相化，使人類抗體M13噬菌體庫於室溫下與使用SuperBlock阻斷緩衝液(Thermo Fisher公司製造)阻斷了未結合人類CD40-GST之部位的MAXISORP STARTUBE(NUNC公司製造)反應1~2小時，利用D-PBS(-)及含有0.1% Tween20之PBS(以下記載為PBS-T；和光純藥工業公司製造)分別洗淨3次後，利用0.1M之甘胺酸-鹽酸鹽緩衝液(Gly-HCl)(pH值2.2)使噬菌體溶出。
使所溶出之噬菌體感染TG1勝任細胞，擴增噬菌體，再次與固相化至MAXISORP STARTUBE之人類CD40-GST進行反應，利用D-PBS(-)及PBS-T分別洗淨5次後，利用0.1M之甘胺酸-鹽酸鹽緩衝液(Gly-HCl)(pH值2.2)使噬菌體溶出。
將該操作反覆2次或3次，將呈現與人類CD40特異性地結合之scFv之噬菌體進行濃縮。使經濃縮之噬菌體感染TG1，接種至SOBAG培養板(2.0%胰蛋白腖、0.5%酵母萃取液、0.05% NaCl、2.0%葡萄糖、10mM MgCl2、100μg/mL安比西林、1.5%瓊脂)而形成群落。
對群落進行植菌並培養後，使VCSM13抗干擾輔助噬菌體感染其，再次進行培養，藉此獲得單純系之噬菌體。使用所獲得之單純系之噬菌體，利用ELISA選擇與人類及猴CD40-GST均結合之純系。
於ELISA中，將實施例1之人類或猴CD40-GST固相化至各孔，使用利用SuperBlock阻斷緩衝液(Thermo Fisher公司製造)阻斷了未結合人類或猴CD40-GST之部位的MAXISORP(NUNC公司製造)。於各孔中添加各噬菌體純系，於室溫下反應30分鐘後，將各孔利用PBS-T洗淨3次。
繼而，利用含有10%Block Ace(大日本製藥股份有限公司 製造)之PBS-T將經辣根過氧化酶標記之抗M13抗體(GE healthcare Bioscience公司製造)稀釋至5000倍，於各孔中各添加50μL，於室溫下保溫30分鐘。利用PBS-T將微量培養板洗淨4次後，於各孔中添加TMB顯色基質液(DAKO公司製造)各50μL，於室溫下保溫10分鐘。於各孔中添加2N之HCl溶液(50μL/well)以停止顯色反應，利用讀板儀(Emax；Molecular Devices公司)對波長450nm(參照波長570nm)下之吸光度進行測定。
針對與人類及猴CD40均結合之純系，進行序列分析，取得具有包含L6序列之VL之抗CD40抗體R1090S55A。於表1中表示編碼所取得之CD40抗體之VH之完整鹼基序列及自該鹼基序列推測之胺基酸序列、以及VH之CDR1~3(以下亦有時記載為HCDR1~3)之胺基酸序列。
Figure 109116230-A0305-12-0097-1
分別製作組入有所取得之抗CD40抗體R1090S55A之基因之可溶性IgG的表現載體。首先，將編碼R1090S55A之VL之L6基因次選殖至N5KG4PE R409K(國際公開第2006/033386號所記載)之BglII-BsiWI位點。
其後，將R1090S55A之VH基因次選殖至N5KG4PE R409K載體之SalI-NheI位點，獲得具有人類IgG4PE R409K之恆定區之抗CD40單株抗體R1090S55A之表現載體即N5KG4PE R409K_R1090S55A。
又，為了將國際公開第2003/040170號所記載之抗CD40單株抗體21.4.1(以下，亦記載為CP-870,893)作為抗CD40抗體之陽性對照抗體來進行製作，而製作表現載體。分別將21.4.1之VH之鹼基序列示於序列編號19，將自該序列推測之VH之胺基酸序列示於序列編號20。又，分別將21.4.1之VL之鹼基序列示於序列編號21，將自該序列推測之VL之胺基酸序列示於序列編號22。
合成編碼21.4.1之VH及VL之基因，分別次選殖至N5KG2載體(國際公開第2003/033538號所記載)之SalI-NheI及BglII-BsiWI位點，獲得具有人類IgG2之恆定區之抗CD40單株抗體21.4.1之表現載體N5KG2_21.4.1。
[實施例3]可溶性人類及小鼠GPC3抗原之製備
藉由以下所記載之方法，製作於人類或小鼠之GPC3蛋白質之C末端附加人類、小鼠或兔IgG之Fc區或GST而成之可溶型GPC3蛋白質。
(1)人類及小鼠GPC3-小鼠Fc載體之製作
自人類GPC3基因之鹼基序列(基因庫登錄號：NM_004484)取得人類GPC3之完整胺基酸序列，轉化為最適合於哺乳類細胞中表現之密碼子，獲得編碼人類GPC3全長之鹼基序列。以編碼GPC3全長之鹼基序列作為模板，藉由聚合酶鏈反應(PCR)獲得可溶型人類GPC3之DNA片段。又，以編碼小鼠IgG之載體作為模板進行PCR，獲得小鼠Fc(以下，亦記載為mFc)之DNA片段。使用Infusion-HD選殖套組(Clontech公司製造)，將於包含訊息序列之可溶型人類GPC3之C末端連結mFc而成之鹼基序列(序列 編號23)插入至pCI載體(Promega公司製造)，獲得人類GPC3-mFc之表現載體。將自人類GPC3-mFc之鹼基序列推測之胺基酸序列中不包含訊息序列之胺基酸序列示於序列編號24。
利用相同之方法，使用小鼠GPC3基因之鹼基序列(基因庫登錄號：NM_016697)，製作插入有包含訊息序列之小鼠GPC3-mFc之鹼基序列(序列編號25)之小鼠GPC3-mFc載體。將自小鼠GPC3-mFc之鹼基序列推測之胺基酸序列中不包含訊息序列之胺基酸序列示於序列編號26。
(2)人類及小鼠GPC3-小鼠Fc蛋白質之製作
使用Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)，將(1)中所製作之人類GPC3-mFc表現載體導入至Expi293F細胞並進行培養，使蛋白質暫時性地表現。於載體導入4天後回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)進行過濾。
使用蛋白A樹脂(MabSelect、GE healthcare Bioscience公司製造)對該培養上清液進行親和純化。利用D-PBS(-)將蛋白A所吸附之抗體洗淨，藉由20mM之檸檬酸鈉、50mM之NaCl緩衝液(pH值3.4)使蛋白A所吸附之抗體溶出，回收至包含1M磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之試管中。
繼而，藉由使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)之超過濾，將溶出液置換成D-PBS(-)後，利用孔徑0.22μm之膜濾器Millex-Gv(Millipore公司製造)進行過濾殺菌，製作人類GPC3-mFc蛋白質。
利用相同之方法，使用1.(1)中所製作之小鼠GPC3-mFc表現載體而製作小鼠GPC3-mFc蛋白質。所取得之蛋白質之濃度係測定波長 280nm之吸光度，使用自各蛋白質之胺基酸序列推測之吸光係數而算出。
(3)人類及小鼠GPC3-兔Fc載體之製作
利用與(1)相同之方法獲得可溶型人類GPC3之DNA片段。又，以編碼兔IgG之載體作為模板進行PCR，獲得兔Fc(以下，亦記載為rFc)之DNA片段。使用Infusion-HD選殖套組(Clontech公司製造)，將於包含訊息序列之可溶型人類GPC3之C末端連結rFc而成之鹼基序列(序列編號27)插入至pCI載體(Promega公司製造)，獲得人類GPC3-rFc之表現載體。將自人類GPC3-rFc之鹼基序列推測之胺基酸序列中不包含訊息序列之胺基酸序列示於序列編號28。
利用相同之方法製作插入有包含訊息序列之小鼠GPC3-rFc之鹼基序列(序列編號29)之小鼠GPC3-rFc載體。將自小鼠GPC3-rFc之鹼基序列推測之胺基酸序列中不包含訊息序列之胺基酸序列示於序列編號30。
(4)人類及小鼠GPC3-兔Fc蛋白質之製作
使用Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)，將(3)中所製作之人類GPC3-rFc表現載體導入至Expi293F細胞並進行培養，利用短暫性表現系統使蛋白質表現。於載體導入4天後回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)進行過濾。
使用蛋白A樹脂(MabSelect、GE healthcare Bioscience公司製造)對該培養上清液進行親和純化。利用D-PBS(-)將蛋白A所吸附之 抗體洗淨，藉由20mM之檸檬酸鈉、50mM之NaCl緩衝液(pH值3.4)使蛋白A所吸附之抗體溶出，回收至包含1M磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之試管中。
繼而，藉由使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)之超過濾，將溶出液置換成D-PBS(-)後，利用孔徑0.22μm之膜濾器Millex-Gv(Millipore公司製造)進行過濾殺菌，製作人類GPC3-rFc蛋白質。
利用相同之方法，使用(3)中所製作之小鼠GPC3-rFc表現載體而製作小鼠GPC3-rFc蛋白質。所取得之蛋白質之濃度係測定波長280nm之吸光度，使用自各蛋白質之胺基酸序列推測之吸光係數而算出。
(5)人類GPC3-GST載體之製作
自人類GPC3基因之鹼基序列(基因庫登錄號：NM_001164618)去除GPI錨定附加序列及訊息序列，而獲得序列編號31所示之可溶型人類GPC3胺基酸序列。於序列編號31所記載之可溶型人類GPC3胺基酸序列之C末端附加GST胺基酸序列，而製作序列編號33所記載之人類GPC3-GST胺基酸序列。基於人類GPC3-GST之胺基酸序列而轉化成最適合於哺乳類細胞中表現之密碼子，獲得序列編號32所記載之人類GPC3-GST之鹼基序列。合成人類GPC3-GST之鹼基序列全長，插入至包含訊息序列之pCI載體(Promega公司製造)之適當部位，而製作人類GPC3-GST表現載體。
(6)人類GPC3-GST蛋白質之製作
使用Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)，將(5)中所製 作之人類GPC3-GST表現載體導入至Expi293F細胞並進行培養，利用短暫性表現系統使蛋白質表現。於載體導入4天後回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)進行過濾。
使用麩胱甘肽樹脂(麩胱甘肽-瓊脂糖4B、GE healthcare Bioscience公司製造)對該培養上清液進行親和純化。利用D-PBS(-)將麩胱甘肽所吸附之抗體洗淨，藉由50mM之三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽、10mM之還原型麩胱甘肽(pH值8.0)使麩胱甘肽所吸附之抗體溶出。
繼而，藉由使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)之超過濾，將溶出液置換成D-PBS(-)後，利用孔徑0.22μm之膜濾器Millex-Gv(Millipore公司製造)進行過濾殺菌，製作人類GPC3-GST蛋白質。所取得之蛋白質之濃度係測定波長280nm之吸光度，使用自各蛋白質之胺基酸序列推測之吸光係數而算出。
(7)人類及小鼠GPC3之硫酸乙醯肝素附加部位變異體之製作
基於序列編號31所記載之可溶型人類GPC3胺基酸序列，將作為硫酸乙醯肝素之附加位點所知之第495號之絲胺酸及第509號之絲胺酸置換為丙胺酸，藉此獲得未附加硫酸乙醯肝素之可溶型人類GPC3(人類GPC3-AA)之胺基酸序列。基於人類GPC3-AA之胺基酸序列，轉化成最適合於哺乳類細胞中表現之密碼子，獲得人類GPC3-AA之鹼基序列。
合成人類GPC3-AA之完整鹼基序列，插入至包含訊息序列及Flag標籤及人類Fc(以下記載為hFc)之pCI載體(Promega公司製造)之適當限制酶位點，藉此製作人類GPC3-AA-Flag-hFc(將包含訊息序列之鹼基序列記載於序列編號34)之表現載體。將自鹼基序列推測之人類GPC3- AA-Flag-hFc之胺基酸序列中不包含訊息序列之胺基酸序列示於序列編號35。
同樣地，自小鼠GPC3基因之鹼基序列(基因庫登錄號：NM_0016697)去除GPI錨定附加序列及訊息序列，獲得序列編號36所示之可溶型小鼠GPC3胺基酸序列。基於序列編號36所記載之可溶型小鼠GPC3胺基酸序列，將作為硫酸乙醯肝素之附加位點所知之第494號之絲胺酸及第508號之絲胺酸置換為丙胺酸，藉此獲得未附加硫酸乙醯肝素之可溶型小鼠GPC3(小鼠GPC3-AA)之胺基酸序列。
基於小鼠GPC3-AA之胺基酸序列，轉化成最適合於哺乳類細胞中表現之密碼子，獲得小鼠GPC3-AA之鹼基序列。合成小鼠GPC3-AA之完整鹼基序列，插入至包含訊息序列及Flag標籤及hFc之pCI載體(Promega公司製造)之適當限制酶位點，藉此製作具有小鼠GPC3-AA-Flag-hFc(將包含訊息序列之鹼基序列記載於序列編號37)之表現載體。將自小鼠GPC3-AA-Flag-hFc之鹼基序列推測之胺基酸序列中不包含訊息序列之胺基酸序列示於序列編號38。
(8)生物素化人類GPC3-hFc及生物素化小鼠GPC3-hFc之製作
使用EZ-Link Sulfo-HNS-LC-Biotin,No-Weight Format(Thermo Fisher Scientific公司製造)對人類GPC3-Fc及小鼠GPC3-Fc(Acro Biosystems公司製造)進行生物素化，獲得生物素化人類GPC3-Fc及生物素化小鼠GPC3-Fc。
(9)人類GPC3全長之表現載體製作
合成編碼(1)中所獲得之人類GPC3全長之鹼基序列，將所獲得之鹼基序列片段(序列編號39)連結於pEF6載體(Thermo Fisher Scientific公司製造)之適當限制酶位點，藉此獲得人類GPC3表現載體pEF6-MycHisC-hGPC3(1-580)。
[實施例4]抗GPC3抗體之取得 人類未活化抗體M13噬菌體庫之製作
自源自人類PBMC之cDNA，利用PCR擴增VH基因片段。將該VH基因片段及包含為人類抗體胚系序列且包含序列編號9所示之鹼基序列之L6之鹼基序列的VL基因片段插入至將噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia公司製造)之標籤序列變更為FLAG-His標籤及胰蛋白酶識別序列之載體，將大腸桿菌TG1(Lucigen公司製造)轉形而獲得質體。
再者，L6為包含序列編號10所示之胺基酸序列之人類抗體之輕鏈可變區(VL)，且該VL之CDR1、2及3(分別表示為LCDR1、2及3)之胺基酸序列分別以序列編號11、12、及13表示。
使VCSM13抗干擾輔助噬菌體(Agilent Technologies公司製造)感染所獲得之質體，藉此獲得具有包含編碼L6之胺基酸序列之鹼基序列之VL基因，且VH基因得到庫化之人類未活化抗體M13噬菌體庫。
GPC3免疫人類抗體M13噬菌體庫之製作
向人類抗體產生小鼠[Ishida & Lonberg,IBC's 11th Antibody Engineering,Abstract 2000；Ishida,I.et al.,Cloning & Stem Cells 4,85-96(2002)及石田功(2002)實驗醫學20,6,846-851]投予20μg/隻或50 μg/隻之作為免疫原之實施例3中所製作之人類GPC3-GST、人類GPC3-mFc、小鼠GPC3-mFc、人類GPC3-rFc、小鼠GPC3-rFc、人類GPC3-Fc(Acro Biosystems公司製造)、或小鼠GPC3-Fc(Acro Biosystems公司製造)計4次。僅於初次免疫時添加作為佐劑之明礬凝膠(0.25mg/隻或2mg/隻)及不活化百日咳菌懸浮液(Nacalai Tesque公司製造)(1×109個/隻)。
於初次免疫後之2週後進行第2次免疫，於第2次免疫之1週後進行第3次免疫，於第3次免疫後之2週後進行最終免疫，在最終免疫後之4天後進行解剖，外科摘除淋巴結或脾臟。將所摘除之淋巴結或脾臟均質化後，通過細胞濾網(Falcon公司製造)而將細胞移至試管中，進行離心分離而使細胞沈澱。所獲得之脾臟細胞與紅血球去除試劑(Sigma-Aldrich公司製造)混合，於37℃之熱水浴中反應1分鐘後，利用DMEM培養基(Sigma-Aldrich公司製造)進行稀釋後，進而進行離心分離。
使用RNeasy微型Plus套組(QIAGEN公司製造)，自所獲得之淋巴結細胞或脾臟細胞提取RNA，利用SMARTer RACE cDNA擴增套組(Clontech公司製造)擴增cDNA，進而利用PCR擴增VH基因片段。將該VH基因片段及包含為人類抗體胚系序列且包含序列編號9所示之鹼基序列之L6序列的VL基因片段插入至將噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia公司製造)之標籤序列變更為FLAG-His標籤及胰蛋白酶識別序列之載體，將大腸桿菌TG1(Lucigen公司製造)轉形而獲得質體。
使VCSM13抗干擾輔助噬菌體(Agilent Technologies公司製造)感染所獲得之質體，藉此獲得具有包含L6序列之VL基因且VH基因得到庫化之GPC3免疫人類抗體M13噬菌體庫。
3.抗GPC3單株抗體之取得
使用人類未活化抗體M13噬菌體庫、GPC3免疫人類抗體M13噬菌體庫，藉由下述噬菌體呈現法，取得具有包含L6之胺基酸序列之VL之抗GPC3單株抗體。繼而，將抗生蛋白鏈菌素(Thermo Fisher公司製造)固相化至MAXISORP STARTUBE(NUNC公司製造)，使用SuperBlock阻斷緩衝液(Thermo Fisher公司製造)進行阻斷後，結合實施例3中所製作之生物素化人類GPC3-Fc、或生物素化小鼠GPC3-Fc。
將實施例3中所製作之人類GPC3-AA-FLAG-hFc、或小鼠GPC3-AA-FLAG-hFc固相化至MAXISORP STARTUBE(NUNC公司製造)，使用SuperBlock阻斷緩衝液進行阻斷。使該等MAXISORP STARTUBE、與人類未活化抗體M13噬菌體庫、或GPC3免疫人類抗體M13噬菌體庫於室溫下反應1~2小時，利用D-PBS(-)及含有0.1% Tween20之PBS(以下記載為PBS-T；和光純藥工業公司製造)洗淨後，利用0.25%胰蛋白酶(Nacalai Tesque公司製造)使噬菌體溶出。使所溶出之噬菌體感染TG1勝任細胞以擴增噬菌體。
其後，再次與固相化至MAXISORP STARTUBE之生物素化人類GPC3-Fc、生物素化小鼠GPC3-Fc、人類GPC3-AA-FLAG-hFc、或小鼠GPC3-AA-FLAG-hFc進行反應，實施洗淨及溶出。反覆該操作，將呈現與人類GPC3及小鼠GPC3特異性結合之抗體分子之噬菌體進行濃縮。
使所濃縮之噬菌體感染TG1，接種至SOBAG培養板(2.0%胰蛋白腖、0.5%酵母萃取液、0.05% NaCl、2.0%葡萄糖、10mM MgCl2、100μg/mL安比西林、1.5%瓊脂)而形成群落。
對群落進行植菌並培養數小時後，添加1mM之IPTG(Nacalai Tesque公司製造)，再次進行培養，藉此獲得單純系之大腸桿菌培養上清液。使用所獲得之單純系之大腸桿菌培養上清液，利用ELISA選擇與人類GPC3及小鼠GPC3結合之純系。
將抗生蛋白鏈菌素(Thermo Fisher公司製造)固相化至ELISA，使用SuperBlock阻斷緩衝液(Thermo Fisher公司製造)進行阻斷後，使用結合有實施例3中所製作之生物素化人類GPC3-Fc、或生物素化小鼠GPC3-Fc之MAXISORP(NUNC公司製造)。於各孔中添加各培養上清液及抗FLAG抗體(Sigma-Aldrich公司製造)，於室溫下反應60分鐘後，將各孔利用PBS-T洗淨3次。
繼而，利用含有10%Block Ace(大日本製藥股份有限公司製造)之PBS-T將經辣根過氧化酶標記之抗小鼠抗體(Abcam公司製造)稀釋至1000倍，於各孔各添加50μL，於室溫下保溫30分鐘。將微量培養板利用PBS-T洗淨3次後，於各孔中各添加50μL之TMB顯色基質液(DAKO公司製造)，於室溫下保溫10分鐘。於各孔中添加2N之HCl溶液(50μL/well)以停止顯色反應，利用讀板儀(EnSpire：PerkinElmer公司製造)對波長450nm(參照波長570nm)下之吸光度進行測定。
針對與人類GPC3及小鼠GPC3結合之純系進行序列分析，取得具有包含L6之胺基酸序列之VL之抗GPC3抗體。
又，使用自藉由使上述濃縮之噬菌體感染TG1所取得之大腸桿菌製備之DNA，利用Ion PGM(商標)系統(Thermo Fisher Scientific公司製造)進行序列分析，選擇濃縮之抗體序列。對於編碼所選擇之抗體之鹼基序列及L6之鹼基序列，進行人工合成，利用依據J Virol Methods. (2009)158(1-2)：171-179所記載之方法之程序來製作抗體表現盒。使用該抗體表現盒，藉由Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)對Expi293F細胞進行基因導入，使用所取得之抗體短暫性表現細胞培養上清液，依據以下之程序，藉由酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)來評價對於人類GPC3及小鼠GPC3之結合性。
將人類GPC3-His(AcroBiosystems公司製造)以2μg/mL之濃度於D-PBS(-)中進行稀釋，以100μL/well分注至Ni-NTA HisSorb Plates(QIAGEN公司製造)，於室溫下靜置1小時。利用200μL/well之D-PBS(-)將孔洗淨3次後，將以於1%(w/v)BSA-PBS(-)pH值7.0(Nacalai Tesque公司製造；以下記載為BSA-PBS)中成為0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL之方式進行過稀釋之GPC3抗體分別以100μL/well添加至孔中。
於室溫下靜置1小時後，利用200μL/well之PBS-T洗淨3次，將作為2次抗體之Peroxidase AffiniPure山羊抗人IgG,Fcγ Fragment specific(Jackson ImmunoReseach公司製造)於1%(w/v)BSA-PBS(-)pH值7.0(Nacalai Tesque公司製造；以下記載為BSA-PBS)中稀釋1000倍，將所得之溶液以100μL/well進行添加並靜置1小時。利用200μL/well之PBS-T將孔洗淨3次後，利用200μL/well之D-PBS(-)洗淨2次，將基質試劑盒(R&D systems公司製造)之A液與B液進行等量混合，將混合所得者以50μL/well進行添加並靜置5分鐘。將停止溶液(R&D systems公司製造)以50μL/well進行添加以停止反應，使用EPOCH2微型讀板儀(Biotek公司製造)來測定450nm及570nm之吸光度，計算自450nm之吸光度減去570nm之吸光度所得之值。
於表2中表示編碼所取得之各GPC3抗體之VH之完整鹼基序列及自該鹼基序列推測之胺基酸序列、以及VH之CDR1~3(以下亦有時記載為HCDR1~3)之胺基酸序列。
Figure 109116230-A0305-12-0109-2
4.抗GPC3抗體之表現載體之製作
分別製作組入有表2所示之抗GPC3抗體之基因的IgG之表現載體。人工合成編碼實施例2中所取得之抗CD40抗體R1090S55A、與表2中所記載之抗GPC3抗體純系所共通之VL(L6)之胺基酸序列(序列編號10)的鹼基序列(序列編號9)，並連結至包含訊息序列之pCI載體(Promega公司製造)之適當限制酶位點，獲得具有L6之VL之輕鏈表現載體。將編碼包含L6作為VL之輕鏈之鹼基序列記載於序列編號75，將自該序列推測之輕鏈之胺基酸序列記載於序列編號76。
繼而，利用PCR擴增表2中所記載之抗GPC3抗體之VH之鹼基序列，將包含編碼包含序列編號77所記載之人類IgG4PE R409K之重鏈恆定區(以下亦記載為CH)之多肽之鹼基序列的pCI載體(Promega公司製造)插入至適當之限制酶位點，藉此獲得抗GPC3抗體之重鏈表現載體。於 表3中記載包含所取得之各抗GPC3抗體之VH之單株抗體之鹼基序列及自該鹼基序列推測之胺基酸序列的序列編號。
Figure 109116230-A0305-12-0110-3
5.抗GPC3抗體之製備
利用以下之方法使4.中所製作之抗GPC3抗體之表現載體表現並純化。
藉由Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)將抗GPC3抗體之重鏈表現載體及輕鏈表現載體共基因導入至Expi293F細胞，於16小時後添加轉染增強劑(Transfection Enhancer)，利用短暫性表現系統使抗體表現。
於載體導入4天後回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)進行過濾後，使用蛋白A樹脂(MabSelect、GE healthcare Bioscience公司製造)對抗體進行親和純化。作為洗淨液，使用D-PBS(-)。藉由20mM之檸檬酸鈉、50mM之NaCl緩衝液(pH值3.0)使蛋白A所吸附之抗體溶出，回收至包含200mM之磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之試管中。
繼而，藉由使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)之超 過濾，置換為D-PBS(-)後，利用孔徑0.22μm之膜濾器Millex-Gv(Millipore公司製造)進行過濾殺菌，製作雙專一性抗體。對抗體溶液之波長280nm之吸光度進行測定，使用自各抗體之胺基酸序列推測之吸光係數，算出純化抗體之濃度。
關於抗CD40單株抗體R1090S55A及CP-870,893，亦利用相同之方法進行製備。
[實施例5]與CD40及GPC3結合之雙專一性抗體之表現載體之構建
利用以下之方法製作具有圖1所記載之結構之與人類及猴CD40之至少一者以及人類、猴及小鼠GPC3之至少任一者結合之雙專一性抗體。雙專一性抗體之形狀係採用國際公開第2009/131239號所記載之形狀。
該雙專一性抗體具有包含第一抗原結合域之IgG部分之重鏈C末端分別與第二抗原結合域直接結合的結構，該第二抗原結合域為Fab。圖1之VH1及VH2係抗CD40抗體之VH或抗GPC3抗體之VH之任一者，且一者為抗CD40抗體之VH另一者為抗GPC3抗體之VH。
又，亦將圖1之VH1為抗CD40抗體之VH且VH2為抗GPC3抗體之VH之雙專一性抗體稱為CD40-GPC3雙專一性抗體。同樣地，亦將圖1之VH1為抗GPC3抗體之VH且VH2為抗CD40抗體之VH之雙專一性抗體稱為GPC3-CD40雙專一性抗體。
本雙專一性抗體具有包含IgG4PE R409K之CH之多肽(將鹼基序列以序列編號92表示，將自該鹼基序列推測之胺基酸序列以序列編號77表示)作為IgG部分之重鏈恆定區。又，作為該Fab之CH1，具有IgG4之CH1(將鹼基序列以序列編號93表示，將自該鹼基序列推測之胺基酸序 列以序列編號94表示)。又，以下之步驟中所製作之雙專一性抗體具有含有包含L6之胺基酸序列之VL之輕鏈。
將該雙專一性抗體之名稱、該抗體製作中所使用之抗CD40抗體之純系(VH1)及抗GPC3抗體之純系(VH2)示於表4。
Figure 109116230-A0305-12-0112-4
1.雙專一性抗體之表現載體之製作
利用以下所記載之方法，製作將表4中所記載之雙專一性抗體之IgG部分之重鏈與Fab之VH-VL結合而成之胺基酸序列(亦稱為雙專一性抗體之重鏈)的表現載體。
於包含編碼序列編號15所記載之抗CD40抗體R1090S55A之VH之胺基酸序列的鹼基序列(序列編號14)、編碼序列編號77所記載之包含IgG4PE R409K之CH之多肽之胺基酸序列的鹼基序列(序列編號92)、及編碼序列編號94所記載之IgG4之CH1之鹼基序列(序列編號93)的pCI載體(Promega公司製造)之適當限制酶位點插入編碼經PCR擴增之表2所記載之抗GPC3抗體之VH之鹼基序列片段，而獲得重鏈表現載體。於表5中表示編碼包含所取得之各抗GPC3抗體之VH之CD40-GPC3雙專一性抗體之重鏈的鹼基序列、及自該鹼基序列推測之胺基酸序列。
Figure 109116230-A0305-12-0113-5
2.雙專一性抗體之製備
利用以下之方法使1中所製作之雙專一性抗體之表現載體分別表現並純化。
藉由Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)，將CD40-GPC3雙專一性抗體之重鏈表現載體及實施例4之4中所製作之包含編碼L6之胺基酸序列之鹼基序列之輕鏈表現載體共基因導入至Expi293F細胞，於16小時後添加轉染增強劑(Transfection Enhancer)，利用短暫性表現系統使抗體表現。
於載體導入4天後回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE製造)進行過濾後，使用蛋白A樹脂(MabSelect、GE healthcare Bioscience公司製造)對抗體進行親和純化。作為洗淨液，使用D-PBS(-)。藉由20mM之檸檬酸鈉、50mM之NaCl緩衝液(pH值3.0)使蛋白A所吸附之抗體溶出，回收至包含200mM之磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之試管中。
繼而，藉由使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)之超過濾，置換為D-PBS(-)後，利用孔徑0.22μm之膜濾器Millex- Gv(Millipore公司製造)進行過濾殺菌，而製作CD40-GPC3雙專一性抗體。對抗體溶液之波長280nm之吸光度進行測定，使用自各抗體之胺基酸序列推測之吸光係數，算出純化抗體之濃度。
[實施例6]利用ELISA評價CD40-GPC3雙專一性抗體對於人類GPC3之結合性
依據以下之程序，藉由酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)對實施例5中所取得之CD40-GPC3雙專一性抗體對於人類GPC3之結合性進行評價。
將人類GPC3-His(AcroBiosystems公司製造)以2μg/mL之濃度於D-PBS(-)中進行稀釋，以100μL/well分注至Ni-NTA HisSorb Plates(QIAGEN公司製造)，於室溫下靜置1小時。利用200μL/well之D-PBS(-)將孔洗淨3次後，將以於1%(w/v)BSA-PBS(-)pH值7.0(Nacalai Tesque公司製造；以下記載為BSA-PBS)中成為0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL之方式進行過稀釋之CD40-GPC3雙專一性抗體分別以100μL/well添加至孔中。
於室溫下靜置1小時後，利用200μL/well之PBS-T洗淨3次，將作為2次抗體之Peroxidase AffiniPure山羊抗人IgG,Fcγ Fragment specific(Jackson ImmunoReseach公司製造)於1%(w/v)BSA-PBS(-)pH7.0(Nacalai Tesque公司製造；以下記載為BSA-PBS)中稀釋1000倍，將所得之溶液以100μL/well進行添加並靜置1小時。
利用200μL/well之PBS-T將孔洗淨3次後，利用200μL/well之D-PBS(-)洗淨2次，將基質試劑盒(R & D systems公司製造)之A液與B液等量混合，將混合所得者以50μL/well進行添加並靜置5分鐘。將 停止溶液(R&D systems公司製造)以50μL/well進行添加以停止反應，使用EPOCH2微型讀板儀(Biotek公司製造)測定450nm及570nm之吸光度，計算自450nm之吸光度減去570nm之吸光度所得之值。再者，陰性對照係使用包含編碼[Clin Cancer Res 2005,11(8),3126-3135]記載之抗2,4-二硝基酚(DNP)抗體之鹼基序列之載體，使用依據實施例4之5.所記載之方法所製作之IgG4抗體(恆定區為IgG4PE R409K；以下記為抗DNP抗體)。
圖2(A)、(B)及(C)中表示對CD40-GPC3雙專一性抗體與人類GPC3之結合性測定所得之結果。如圖2(A)、(B)及(C)所示，確認到所有CD40-GPC3雙專一性抗體均與固相化之人類GPC3-His結合。
[實施例7]CD40-GPC3雙專一性抗體與細胞上之GPC3之結合性評價
為了評價實施例5中所獲得之CD40-GPC3雙專一性抗體與細胞膜上GPC3之結合性，如下述般使用Expi293F細胞之人類GPC3短暫性表現細胞，藉由FCM來進行評價。
使用Expi293(商標)表現系統(Thermo Fisher公司製造)，將實施例3中所製作之人類GPC3表現載體導入至Expi293F細胞並進行培養，利用短暫性表現系統使人類GPC3於細胞膜上表現。作為未表現人類GPC3之陰性對照細胞，使用於基因導入時不添加人類GPC3表現載體之Expi293F細胞。
將載體導入48小時後之Expi293F細胞以1×106cells/mL且50μL/well接種至U底96孔培養板(Falcon公司製造)。離心分離(1500rpm、4℃、3分鐘)後，去除上清液，利用200μL/well之包含3%胎牛血清 之D-PBS(-)(以下記載為SB)將沈澱物洗淨1次。離心分離(1500rpm、4℃、3分鐘)後，去除上清液，將經稀釋之CD40-GPC3雙專一性抗體分別以最終濃度成為0.1、1或10μg/mL之方式以100μL/well向沈澱物進行添加，於冰溫下靜置30分鐘。作為陰性對照，使用抗DNP抗體。
進行離心分離(1500rpm、4℃、3分鐘)，將上清液去除，利用SB洗淨2次後，將經100倍稀釋之包含APC-conjugated AffiniPure F(ab')2山羊抗人IgG,Fcγ(Jackson ImmunoReseach公司製造)之SB以100μL/well進行添加，於冰溫下靜置30分鐘。
進而進行離心分離(1500rpm、4℃、3分鐘)，將上清液去除，利用SB洗淨2次後，於100μL/well之SB中懸浮，利用流式細胞儀FACSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定Expi293F細胞上之APC之螢光強度。
於圖3(A)、(B)、(C)及(D)中表示CD40-GPC3雙專一性抗體對於未表現人類GPC3之Expi293F細胞之評價結果。所有雙專一性抗體均未顯示對於未表現人類GPC3之Expi293F細胞之結合性。
圖3(E)、(F)、(G)及(H)中表示CD40-GPC3雙專一性抗體對於表現人類GPC3之Expi293F細胞之評價結果。所有CD40-GPC3雙專一性抗體均顯示出對於表現人類GPC3之Expi293F細胞之結合性。
根據該等結果顯示，實施例5中所取得之CD40-GPC3雙專一性抗體選擇性地與細胞膜上之人類GPC3結合。
[實施例8]利用FCM之細胞株之CD40及GPC3表現評價
依據以下之程序，藉由FCM對Ramos細胞(JCRB9119)、HepG2細胞 (ATCC HB-8065)之CD40及GPC3之表現進行評價。評價中使用實施例2中所獲得之抗CD40抗體R1090S55A、實施例4中所製備之抗GPC3抗體、及實施例5中所製備之CD40-GPC3雙專一性抗體。
使Ramos細胞以1x106cells/mL之濃度於SB中懸浮，以100μL/well分注至96孔圓底培養板(Falcon公司製造)。離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液，向沈澱物添加100μL/well之將實施例2中所獲得之抗CD40抗體R1090S55A、實施例4中所獲得之抗GPC3抗體、及實施例5中所獲得之CD40-GPC3雙專一性抗體分別以0.01、0.1、1、10μg/mL之濃度包含之SB，進行懸浮後，於冰溫下靜置30分鐘。
進而，進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)，將上清液去除，利用200μL/well之SB將沈澱物洗淨3次後，將稀釋至100倍之APC-conjugated AffiniPure F(ab')2山羊抗人IgG,Fcγ(Jackson ImmunoReseach公司製造)以100μL/well進行添加，於冰溫下保溫30分鐘。利用SB洗淨2次後，於100μL/well之SB中懸浮，利用流式細胞儀FACSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定各細胞之螢光強度。
同樣地實施HepG2細胞之評價。
圖4(A)及(C)中表示各種抗體或雙專一性抗體與Ramos細胞之結合性之評價結果，圖4(B)及(D)中表示各種抗體或雙專一性抗體與HepG2細胞之結合性之評價結果。
如圖4(A)及(C)所示，實施例4中所製作之抗GPC3抗體對於Ramos細胞未顯示結合活性，作為抗CD40抗體之CP-870,893及R1090S55A對於Ramos細胞顯示出結合活性。又，實施例5中所製作之CD40-GPC3雙專一性抗體亦對於Ramos細胞顯示出結合活性。根據該等 結果提示，Ramos細胞係於細胞表面表現CD40而不表現GPC3。又，顯示本發明之雙專一性抗體與CD40結合。
如圖4(B)及(D)所示，抗GPC3抗體對於HepG2細胞顯示出明顯強於抗CD40抗體之結合活性。CD40-GPC3雙專一性抗體亦對於HepG2細胞顯示出與抗GPC3抗體同樣強之結合活性。因此，本發明之CD40-GPC3雙專一性抗體顯示具有對於GPC3之結合能力。
根據以上之結果顯示，本發明之雙專一性抗體具有對於GPC3及CD40兩者之結合活性。
[實施例9]藉由使用FCM之CD95表現量分析來評價CD40-GPC3雙專一性抗體之CD40訊息誘導活性
以Ramos細胞上之CD95之表現量增加作為指標，以下述方式利用FCM對實施例5中所獲得之CD40-GPC3雙專一性抗體之CD40訊息誘導能力進行評價。
1.於不存在GPC3表現細胞下之CD40促效劑活性評價
將1.25×106cells/mL之Ramos細胞以40μL/well接種至U底96孔培養板(Falcon公司製造)，將經包含10%FBS之RPMI1640培養基(Sigma-Aldrich公司製造)稀釋之受驗抗體以最終濃度成為0.001、0.01、0.1、1或10μg/mL之方式以60μL/well進行添加，於37℃、5.0%二氧化碳下培養16小時。
離心分離(1500rpm、4℃、3分鐘)後，去除上清液，利用200μL/well之SB將沈澱物洗淨1次。離心分離(1500rpm、4℃、3分鐘) 後，去除上清液，向沈澱物添加經100倍稀釋之PE小鼠抗人CD95(Becton Dickinson公司製造)抗體並使之懸浮後，於冰溫下靜置30分鐘。
進而進行離心分離(1500rpm、4℃、3分鐘)，去除上清液，利用包含SB之D-PBS(-)洗淨2次後，於包含100μL/well之SB之D-PBS(-)中懸浮，利用流式細胞儀FACSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定Ramos細胞上之CD95之螢光強度。陰性對照係使用抗DNP抗體。
圖5(A)中表示抗DNP抗體、CP-870,893及R1090S55A之評價結果。作為CD40促效劑抗體之CP-870,893係較強地誘導Ramos細胞上之CD95之表現。另一方面，基本上未發現R1090S55A誘導Ramos細胞上之CD95之活性，可知無CD40促效劑活性。圖5(B)、(C)、(D)及(E)中表示抗DNP抗體、CP-870,893及各種CD40-GPC3雙專一性抗體之評價結果。
本發明之CD40-GPC3雙專一性抗體(Ct-R1090-GpS1019-FL、Ct-R1090-GpA6014-FL、Ct-R1090-GpA6005-FL、Ct-R1090-GpA6062-FL及Ct-R1090-GpS3003、Ct-R1090-GPngs18、及Ct-R1090-GPngs62)均基本上未見誘導CD95表現之活性。
根據該等評價結果顯示，本發明之雙專一性抗體於僅存在CD40陽性細胞之條件下不會對CD40陽性細胞誘導CD40訊息。
2.在與GPC3表現細胞之共培養條件下之CD40促效劑活性評價
將1.25×106cells/mL之Ramos細胞以40μL/well接種至U底96孔培養板(Falcon公司製造)，添加20μL/mL之經包含10%FBS之RPMI1640培養 基(Sigma-Aldrich公司製造)稀釋之0.005、0.05、0.5、5或50μg/mL(最終濃度0.001、0.01、0.1、1或10μg/mL)之受驗抗體，進而將HepG2細胞1.25×106cells/mL以40μL/well進行添加，於37℃、5.0%二氧化碳下培養16小時。
離心分離(1500rpm、4℃、3分鐘)後，去除上清液，利用包含200μL/well之SB之D-PBS(-)將沈澱物洗淨1次。離心分離(1500rpm、4℃、3分鐘)後，去除上清液，向沈澱物添加經100倍稀釋之PE小鼠抗人CD95(Becton Dickinson公司製造)抗體，進行懸浮後，於冰溫下靜置30分鐘。
進而進行離心分離(1500rpm、4℃、3分鐘)，去除上清液，利用SB洗淨2次後，於100μL/well之SB中進行懸浮，利用流式細胞儀FACSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定Ramos細胞上之CD95之螢光強度。陰性對照係使用抗DNP抗體。
圖6(A)、(B)、(C)及(D)中表示抗DNP抗體、CP-870,893及各種CD40-GPC3雙專一性抗體之評價結果。
如圖6所示，顯示在與GPC3陽性之HepG2共培養之情形時，抗DNP抗體不誘導Ramos細胞之CD95表現，但實施例5中所製作之CD40-GPC3雙專一性抗體(Ct-R1090-GpS1019-FL、Ct-R1090-GpA6014-FL、Ct-R1090-GpA6005-FL、Ct-R1090-GpA6062-FL、Ct-R1090-GpS3003、Ct-R1090-GPngs18、及Ct-R1090-GPngs62)均以與作為CD40促效劑抗體之CP-870,893相同之程度濃度依賴性地誘導Ramos細胞之CD95之表現。
如圖5(B)、(C)、(D)及(E)所示，本發明之CD40-GPC3雙 專一性抗體於單獨地與Ramos細胞上之CD40結合時不會誘導CD40訊息。另一方面，如圖6(A)、(B)、(C)及(D)所示，僅於共存GPC3陽性細胞時對Ramos細胞誘導CD40訊息。
確認到該等CD40-GPC3雙專一性抗體對於CD40之抗原結合域所使用之抗CD40抗體(亦稱為親本抗體)即R1090S55A如圖5(A)所示，不會對Ramos細胞誘導CD40訊息(非促效劑活性)。因此，可知本發明之CD40-GPC3雙專一性抗體藉由進行雙專一性抗體化而顯示原本親本抗體所不具有之CD40訊息誘導活性(促效劑活性)。
藉此提示，藉由投予本發明之CD40-GPC3雙專一性抗體，而於不存在GPC3陽性細胞之部位不會誘導CD40訊息，於腫瘤等存在GPC3陽性細胞之病變部位特異性地對免疫細胞或腫瘤細胞等CD40陽性細胞誘導訊息。
[實施例10]GPC3-CD40雙專一性抗體之製作及促效劑活性之評價
依據實施例5所記載之方法，製作具有表6所示之重鏈及包含L6所編碼之VL之輕鏈之雙專一性抗體。將該雙專一性抗體之名稱、該抗體製作所使用之抗GPC3抗體純系(VH1)及抗CD40抗體純系(VH2)示於表6。
Figure 109116230-A0305-12-0121-6
1.GPC3-CD40雙專一性抗體之表現載體之製作
依據實施例5之1.所記載之方法來製作表6所記載之雙專一性抗體之重鏈表現載體。於表7中表示編碼包含所取得之各抗GPC3抗體之VH之雙專一性抗體之重鏈之鹼基序列及自該鹼基序列推測之胺基酸序列。
Figure 109116230-A0305-12-0122-7
2.雙專一性抗體之製備
依據實施例5之2.所記載之方法，使用實施例10之1.中所製作之重鏈表現載體而製備GPC3-CD40雙專一性抗體。
3.雙專一性抗體之CD40訊息誘導活性之評價
與實施例9同樣地，評價所製作之GPC3-CD40雙專一性抗體之訊息誘導活性。其結果為，該等雙專一性抗體未顯示促效劑活性。
CD40結合區使用其他純系R1066，GPC3結合區使用GpS1019，以相同方式製作CD40-GPC3雙專一性抗體及GPC3-CD40雙專一性抗體，並評價促效劑活性，結果為，所有雙專一性抗體均顯示出促效劑活性。
根據以上之結果可知，於本發明之雙專一性抗體中，將第 一抗原結合域與第二抗原結合域調換而是否發揮促效劑活性係根據抗體之純系不同有所差異。
[實施例11]對於人類誘導樹狀細胞之CD40促效劑活性評價
以樹狀細胞上之活化標記物作為指標，藉由FCM來評價實施例5中所獲得之CD40-GPC3雙專一性抗體於GPC3陽性細胞共存下對於樹狀細胞之CD40訊息誘導活性。陰性對照係使用抗DNP抗體，陽性對照係使用CP-870,893。
具體而言，將CD14陽性之單核球向未成熟樹狀細胞進行分化誘導。若於未成熟樹狀細胞中CD40訊息活化，則作為補助刺激分子之CD80及CD86之表現上升，因此於所製備之人類誘導樹狀細胞中添加抗CD40抗體或各種CD40雙專一性抗體，利用FCM對輔助刺激分子之表現量進行分析，藉此評價各種抗體或雙專一性抗體之CD40促效劑活性。
1.細胞之製備
將Untouched Frozen NPB-CD14+單核球(AllCells公司製造)解凍後，於包含100ng/mL之重組人GM-CSF(R & D公司製造)及100ng/mL之重組人IL4(R & D公司製造)之X-VIVO15無血清造血細胞培養基(LONZA公司製造)中以成為1×106cells/mL之細胞密度之方式進行懸浮，並以3mL/well添加至6well Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface(CORNING公司製造)。
於培養2天及4天後更換為新鮮培養基。於培養開始後之7天後回收細胞，於1500rpm、室溫下離心分離5分鐘。於包含100ng/ml之 IL-4及100ng/mL之GM-CSF之X-VIVO15無血清造血細胞培養基中將沈澱細胞以成為2×105cells/mL之方式進行製備，於24well Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface(CORNING公司製造)之各孔中各添加250μL/well。進而，將HepG2細胞以成為4×105/mL之方式進行製備，並於各孔中各添加125μL/well。將以最終濃度成為1、10μg/mL之方式所製備之評價抗體以125μL/well進行添加並進行混合，於37℃、5%CO2存在下培養2天。
2.利用FCM之樹狀細胞上之活化標記物之表現測定
將培養了2天之細胞進行離心分離(2000rpm、4℃、5分鐘)。去除上清液，於各孔中各添加1%(w/v)BSA-PBS(-),pH值7.0 without KCl(Nacalai公司製造)(亦記載為FACS緩衝液)150μL。添加BD Fc Block Reagent for Human(BD Pharmingen公司製造)，進行懸浮，於冰上靜置5分鐘。
其後，於96孔U底培養板(FALCON公司製造)之各孔中各添加50μL之細胞懸浮液。將於FACS緩衝液中懸浮之標記抗體Brilliant Violet 421抗人CD80抗體(Biolegend公司製造)、PE小鼠抗人CD86(BD Pharmingen公司製造)、或PE-Cy7抗人CD45(Biolegend公司製造)分別以50μL/well進行添加，於4℃下保溫30分鐘。
進行離心分離(1200rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液。將所沈澱之細胞利用200μL之FACS緩衝液洗淨2次。其後，利用100μL之FACS緩衝液將細胞進行再懸浮，利用FACS Canto II(BD Biosciences公司製造)測定螢光強度。於分析時使用資料分析軟體FlowJo9.6.4，將 CD45陽性細胞作為樹狀細胞，對於CD45陽性細胞中之CD80及CD86，藉由所結合之抗體之平均螢光強度(MFI)來評價表現量。
圖7(A)及(B)中表示利用FCM對添加有抗DNP抗體、CP-870,893及各種CD40-GPC3雙專一性抗體時樹狀細胞上之CD80及CD86之表現量進行分析所得之結果。
如圖7(A)及(B)所示，顯示與GPC3陽性之HepG2共培養之情形時，實施例5中所製作之CD40-GPC3雙專一性抗體(Ct-R1090-GpS1019-FL及Ct-R1090-GpA6014-FL)與抗DNP抗體相比，與作為CD40促效劑抗體之CP-870,893同樣地誘導樹狀細胞之CD80及CD86之表現上升。
根據以上情況顯示，本發明之CD40-GPC3雙專一性抗體於GPC3陽性細胞之存在下對於樹狀細胞具有CD40促效劑活性。
[實施例12]人類GPC3陽性細胞株與肝細胞癌臨床檢體之GPC3表現量之比較 1.MC-38/hGPC3之製作
藉由以下之方法，製作使未表現GPC3之小鼠細胞株MC-38(Kerafast社)表現人類GPC3之MC-38/hGPC3。
人工基因合成序列編號39所示之人類GPC3基因，使用KpnI/BamHI選殖至pEF6/myc-HisC載體之多選殖位點，藉此取得人類GPC3表現載體pEF6-hGPC3。
使用Nucleofector(Lonza公司製造)將所取得之表現載體pEF6-hGPC3導入至MC-38細胞並進行培養，自翌日利用5μg/ml殺稻瘟 菌素-S(InvivoGen公司製造)進行選擇。藉由細胞分選儀進行單細胞選殖，獲得表現人類GPC3之MC-38細胞(MC-38/hGPC3)。
2.藉由FCM分析各種GPC3陽性細胞株之GPC3表現量
藉由FCM，對實施例9中作為GPC3陽性細胞用於促效劑活性評價之HepG2細胞(ATCC HB-8065)、HuH-7細胞(JCRB0403)及實施例11中所製作之MC-38/hGPC3之GPC3表現量進行比較。
使用HepG2細胞、HuH-7細胞及MC-38/hGPC3細胞，利用與實施例7相同之方法，藉由FCM來測定GPC3表現量。使用實施例4中所獲得之抗GPC3抗體GpS1019及抗DNP抗體，分別以1μg/mL之濃度進行染色。將用經GpS1019染色時之MFI除以經抗DNP抗體染色時之MFI所得之值作為相對螢光強度(RFI)來算出。
圖8(A)中表示HuH-7細胞、HepG2細胞及MC-38/hGPC3細胞之評價結果。
如圖8(A)所示，顯示HuH-7細胞、HepG2細胞及MC-38/hGPC3細胞均表現GPC3，但HepG2細胞與HuH-7細胞及MC-38/hGPC3細胞相比，RFI明顯較高，GPC3之表現量較多。
3.人類GPC3陽性細胞株與肝細胞癌臨床檢體之GPC3表現量之比價
為了將人類臨床肝細胞癌中之GPC3之表現量、與HuH-7細胞及MC-38/hGPC3細胞之GPC3表現量進行比較，藉由免疫組織染色(IHC)對人類肝臟癌組織陣列、HuH-7細胞及MC-38/hGPC3細胞之GPC3表現進行分析。
利用以下所示之方法製作既有之抗GPC3抗體GC33之mIgG1型(GC33-mIgG1)。作為GC33之可變區胺基酸序列，使用國際公開第2006/006693號所記載之序列。分別將GC33之VH之胺基酸序列示於序列編號124，將GC33之VL之胺基酸序列示於序列編號125。重鏈恆定區之胺基酸序列係使用小鼠IgG1，輕鏈係使用小鼠κ鏈序列，依據實施例4所記載之方法來製作GC33-mIgG1。
使用GC33-mIgG1及陰性對照抗體，實施對於經福馬林固定及石蠟包埋之人類肝臟癌組織陣列(肝細胞癌、61例)、HuH-7細胞及MC-38/hGPC3細胞之免疫組織染色(IHC)。
對於經脫蠟處理之標本，於110℃之Decloaking Chamber中進行10分鐘利用標靶恢復液(Target retrieval solution)pH9(安捷倫公司製造)之抗原賦活化後，於室溫下冷卻30分鐘，利用自來水洗淨5分鐘。繼而，利用Peroxidase阻斷試劑(安捷倫公司製造)進行內源性過氧化酶之失活10分鐘。
進而，利用Protein Block(安捷倫公司製造)進行阻斷。繼而，使原液與稀釋至10倍之抗GPC3抗體及陰性對照抗體於室溫下反應1小時後，利用PBS進行洗淨。添加Envision System-HRP標記聚合物抗小鼠(安捷倫公司製造)，於室溫下進行30分鐘反應。添加DAB(安捷倫公司製造)，為了發色而進行1分鐘反應。使蘇木精(安捷倫公司製造)反應5分鐘，利用流水洗淨，進行核染色。
使用乙醇及二甲苯對染色之樣本進行脫水、透徹處理，最後利用DPX(Merck)封入。
圖8(B)表示人類肝臟癌組織陣列、HuH-7細胞及MC- 38/hGPC3細胞之IHC結果。對各細胞之細胞膜上之染色強度進行定量，以染色強度自低至高之順序分類0、1+、2+、3+，每種檢體均繪製各染色強度之細胞之頻度。
如圖8(B)所示，確認到於人類肝細胞癌組織中表現GPC3。又，HuH-7細胞及MC-38/hGPC3細胞中之各染色強度之細胞之比率係與人類肝細胞癌組織中GPC3之染色強度相對較高之病例中的各染色強度之比例同等程度。根據以上情況顯示，HuH-7及MC-38/hGPC3中之GPC3表現量反映出人類肝細胞癌組織中之GPC3表現量。
[實施例13]使用HuH-7細胞或MC-38/hGPC3細胞作為GPC3陽性細胞之CD40促效劑活性評價
藉由如下方式實施評價：使用實施例12中判明GPC3表現量為與臨床肝細胞癌檢體相同程度之HuH-7細胞及MC-38/hGPC3細胞作為GPC3陽性細胞，以Ramos細胞上之CD95之表現量增加作為指標，藉由與實施例9相同之方法，利用FCM來評價實施例5中所獲得之CD40-GPC3雙專一性抗體之CD40訊息誘導能力。
圖9(A)及(B)中表示抗DNP抗體、CP-870,893及各種CD40-GPC3雙專一性抗體之評價結果。
如圖9(A)所示，顯示與HuH-7細胞共培養之情形時，實施例5中所製作之CD40-GPC3雙專一性抗體(Ct-R1090-GpS1019-FL、Ct-R1090-GpA6014-FL、Ct-R1090-GpA6005-FL、Ct-R1090-GpA6062-FL、Ct-R1090-GpS3003、Ct-R1090-GPngs18、及Ct-R1090-GPngs62)均以與作為CD40促效劑抗體之CP-870,893相同之程度濃度依賴性地誘導Ramos 細胞之CD95之表現。如圖9(B)所示，於將MC-38/hGPC3細胞與Ramos細胞共培養之情形時亦可獲得相同之結果。
根據以上之結果顯示，本發明之CD40-GPC3雙專一性抗體以與臨床肝細胞癌相同程度之GPC3表現量顯示與作為CD40促效劑抗體之CP-870,893相同程度之促效劑活性。
[實施例14]抗GPC3抗體之結合活性測定
評價實施例4中所獲得之抗GPC3抗體以及既有之抗GPC3抗體GC33、YP7及HN3對於人類GPC3之結合活性。具體而言，使用人類CD40-His，利用表面電漿子共振法(SPR法)實施結合性試驗。作為測定機器，使用BiacoreT100(GE healthcare Bioscience公司製造)。
1.作為既有之抗GPC3抗體之GC33、YP7及HN3之製作
既有之抗GPC3抗體GC33、YP7及HN3之可變區胺基酸序列分別使用國際公開第2006/006693號、國際公開第2013/181543號、及國際公開第2012/145469號所記載之胺基酸序列。分別將YP7之VH之胺基酸序列示於序列編號126，將YP7之VL之胺基酸序列示於序列編號127，將HN3之VH之胺基酸序列示於序列編號128。
重鏈恆定區之胺基酸序列係使用序列編號77所示之IgG4PE R409K，輕鏈係使用κ鏈之序列，利用實施例4中所記載之方法獲得各種抗GPC3抗體。
2.藉由SPR法測定結合活性
使用人類抗體捕捉套組(GE healthcare Bioscience公司製造)，依據附件，將抗人IgG抗體固定化至CM5感測器晶片(GE healthcare Bioscience公司製造)。將製備成2μg/mL之受驗抗體以10μL/min之流速添加至流槽中10秒鐘。
繼而，將自125nM或25nM進行5倍稀釋至5個階段所得之人類CD40-His蛋白質溶液(利用HBS-EP+進行稀釋)分別以30μL/min之流速進行添加以作為分析物，對各抗體與分析物之結合反應測定2分鐘，對解離反應測定10分鐘。測定係利用單循環動力學法來進行。
對於所獲得之感測器圖譜(sensorgram)，使用Bia Evaluation Software(GE healthcare Bioscience公司製造)進行分析，算出各抗體之動力學常數。將各抗GPC3抗體對於人類GPC3之解離常數[kd/ka=KD]示於表8。
Figure 109116230-A0305-12-0130-8
如表8所示，實施例14中所製作之抗GPC3抗體GC33、YP7及HN3具有對於人類GPC3之結合活性，關於對於人類GPC3之KD值，GC33及YP7係1nM左右，HN3係10nM左右。
利用相同之方法，對GC33、HN3及實施例4中所獲得之抗GPC3抗體進行分析，將所得之結果示於表9。
[表9]
Figure 109116230-A0305-12-0131-9
如表9所示，顯示GpS1019、GpA6005、GpA6014、GpA6062、GpS3003、GPngs18及GPngs62對於人類GPC3之KD值為6.35~0.39×10-9M，具有與既有之抗GPC3抗體同等以上之較強結合活性。
[實施例15]抗GPC3抗體之表位分析
藉由FCM對各種抗GPC3抗體有無競爭進行分析，對表位進行分類。又，製作GPC3之部分片段表現細胞，測定各種抗GPC3抗體之結合活性，藉此分析表位。
1.基於有無競爭之分類 (1)標記抗體之製作
使用Alexa Fluor 647抗體標記套組(Thermo Fisher Scientific製造)，對實施例4中所獲得之抗GPC3抗體GpS1019、GpA6005、GpA6014、GpA6062、GPngs18、GPngs62及實施例14中所獲得之抗GPC3抗體GC33、HN3及YP7進行標記。
(2)利用FCM之競爭分析
使HepG2細胞以1×106cells/mL之濃度於SB中懸浮，以100μL/well分注至96孔圓底培養板(Falcon公司製造)。離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液，向沈澱物添加25μL/well之將實施例4中所獲得之抗GPC3抗體GpS1019、GpA6005、GpA6014、GpA6062、GPngs18、 GPngs62、實施例14中所獲得之抗GPC3抗體GC33、HN3、或YP7之非標記物(以下亦記載為競爭抗體)分別以100μg/mL之濃度包含之SB，進行懸浮後，於冰溫下靜置30分鐘。
繼而，將作為檢測抗體之實施例15之1.(1)中所製作之各種標記抗體分別以20μg/mL添加25μL/well，進行懸浮後，於冰溫下靜置30分鐘。
進而進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)，去除上清液，將沈澱物利用200μL/well之SB洗淨3次後，於100μL/well之SB中懸浮，利用流式細胞儀FACSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定各細胞之螢光強度。對於各競爭抗體及檢測抗體之組合，計算添加有競爭抗體之情形時之MFI除以未添加競爭抗體之情形時之MFI所得之值，將值成為0.5以下之情形定義為競爭。
圖10(A)、(B)及(C)中表示與競爭抗體及檢測抗體之組合有無競爭。圖10(A)係表示將HN3、GC33、或YP7之非標記抗體作為競爭抗體進行添加，使用抗DNP抗體、GC33或YP7之標記抗體作為檢測抗體之情形時對於各競爭抗體有無競爭。
又，圖10(B)係表示使用GpS1019、HN3、GC33之非標記物作為競爭抗體，使用GpS1019、HN3、GC33之標記抗體作為檢測抗體之情形時有無競爭。
又，圖10(C)係表示添加GpS1019、GpA6005、GpA6014、GpA6062、GPngs18、GPngs62之非標記抗體作為競爭抗體，使用GpS1019、GpA6005、GpA6014、GpA6062、GPngs18、GPngs62之標記抗體作為檢測抗體之情形時與各競爭抗體有無競爭。
如圖10(A)所示，未確認到HN3、GC33、及YP7與自身以外之抗體之競爭。由此可知，HN3、GC33、及YP7分別與不同之表位結合。
如圖10(B)所示，未確認到GpS1019、HN3、GC33與自身以外之抗體之競爭。由此可知，GpS1019、HN3、及GC33分別與不同之表位結合。
如圖10(C)所示，GpS1019、GpA6005、GpA6014、GpA6062、GPngs18及GPngs62於所有組合中均於添加競爭抗體時結合降低，相互競爭。由此可知，GpS1019、GpA6005、GpA6014、GpA6062、GPngs18及GPngs62識別相互附近之表位，或者識別一部分或全部重複之表位。
根據以上之結果可知，GpS1019、GpA6005、GpA6014、GpA6062、GPngs18、GPngs62與和作為既有抗GPC3抗體之GC33或HN3不同之表位結合。
2.使用GPC3之部分片段表現細胞之結合部位之鑑定
藉由以下所示之方法，使人類GPC3之部分片段於ExpiCHO-S細胞(ThermoFishher Scientfic公司製造)表現，驗證抗GPC3抗體之結合性，藉此進行實施例4中所取得之抗GPC3抗體之表位分析。
將序列編號39所示之人類GPC3完整鹼基序列進行密碼子轉化，而取得人類GPC3完整胺基酸序列，製作人類GPC3完整胺基酸序列中自第25號至第358號之胺基酸序列所示之多肽序列。
製作分別於人類GPC3完整胺基酸序列中自第25號至第358 號之胺基酸序列所示之多肽序列之N末端側連結His序列、於C末端側連結作為GPI附加序列之人類GPC3完整胺基酸序列中自第563號至第580號之胺基酸序列所示之多肽而成之序列(記載為hGPC3(25-358))。將胺基酸序列進行密碼子轉化而作為鹼基序列，藉由人上基因合成而合成片段後，插入至pCI載體之適當部位，而取得hGPC3(25-358)之表現載體。同樣地，取得hGPC3(192-580)、hGPC3(359-580)及hGPC3(25-580)之表現載體。
使用Expifectamine CHO-S轉染套組(Thermo Fisher Scientific公司)，使所取得之人類GPC3部分片段之表現載體分別向ExpiCHO-S細胞進行轉染，使人類GPC3之部分片段進行短暫性表現。
以與實施例7所示之方法相同之方式，將暫時表現所獲得之人類GPC3之部分片段之ExpiCHO-S細胞(以下，亦記載為GPC3部分片段表現細胞)供於FCM，測定各細胞之螢光強度。將其結果示於表10。於抗GPC3抗體GpS1019所結合之GPC3部分片段表現細胞與作為陰性對照之抗DNP抗體相比為10倍以上之情形時，定義為反應性。表10中，將抗GPC3抗體GpS1019具有反應性之部分片段記載為+，將不具有反應性之部分片段記載為-。
Figure 109116230-A0305-12-0134-10
如表10所示，抗GPC3抗體GpS1019與表現hGPC3(25-580)、hGPC3(25-358)、及hGPC3(192-580)之細胞結合，未與表現hGPC3(359-580)之細胞結合。因此，推測於人類GPC3之第192號至第358號之胺基酸之間包含抗GPC3抗體GpS1019之表位。
抗GPC3抗體YP7係對作為GPC3分子之C末端區域之第511號至第560號之肽進行免疫所得之抗體(國際公開第2013/181543號)，因此認為會識別GPC3分子之C末端附近。因此，認為所取得之抗GPC3抗體GpS1019、GpA6005、GpA6014、GpA6062、GPngs18、或GPngs62所識別之表位亦與YP7之表位不同。
[實施例16]使用既有之抗GPC3抗體之CD40-GPC3雙專一性抗體之製作
利用以下之方法製作使用抗GPC3抗體GC33及YP7之可變區作為GPC3結合區之CD40-GPC3雙專一性抗體的表現載體。
設計如下胺基酸序列，其連結有於序列編號15所記載之抗CD40抗體R1090S55A之VH之胺基酸序列、序列編號77所記載之包含IgG4PE R409K之CH之多肽之胺基酸序列、序列編號128所記載之包含甘胺酸及絲胺酸之連接子序列、及序列編號76所記載之輕鏈胺基酸序列中將L6之VL置換為序列編號124所記載之GC33之VL或序列編號126所記載之YP7之VL而成之胺基酸序列。
對如此獲得之胺基酸序列進行密碼子轉化後，藉由基因合成而插入至pCI載體(Promega公司製造)之適當限制酶位點，藉此獲得抗CD40抗體VH及抗GPC3抗體VL表現載體。繼而，製作於序列編號123所記載之GC33之VH之胺基酸序列或序列編號125所記載之YP7之VH之胺基酸序列連結序列編號94所記載之IgG4之CH1之胺基酸序列而成的胺基酸序列，以相同方式獲得抗GPC3抗體VH表現載體。
將抗CD40抗體VH及抗GPC3抗體VL表現載體、抗GPC3抗體VH表現載體及實施例4-4中所製作之抗CD40抗體VL表現載體之3種 表現載體利用實施例4所記載之方法導入至Expi293F細胞，自所獲得之培養上清液純化抗體，利用尺寸排外層析法對單體成分進行分取，藉此製作各種CD40-GPC3雙專一性抗體(Ct-R1090-HN3、Cross-R1090-GC33、及Cross-R1090-YP7)。
利用以下所記載之方法製作使用HN3之可變區作為GPC3結合區之CD40-GPC3雙專一性抗體之表現載體。
製作連結有序列編號15所記載之抗CD40抗體R1090S55A之VH之胺基酸序列、序列編號77所記載之包含IgG4PE R409K之CH之多肽之胺基酸序列及序列編號127所記載之HN3之VH之胺基酸序列的胺基酸序列，進行密碼子轉化後，藉由基因合成插入至pCI載體(Promega公司製造)之適當限制酶位點，藉此獲得Ct-R1090-HN3之重鏈表現載體。
將Ct-R1090-HN3之重鏈表現載體及實施例4-4中所製作之抗CD40抗體VL表現載體利用實施例4所記載之方法導入至Expi293F細胞，自所獲得之培養上清液純化抗體，利用尺寸排外層析法對單體組分進行分取，藉此製作Ct-R1090-HN3。
[實施例17]實施例16中所製作之雙專一性抗體與GPC3及CD40之反應性評價
以與實施例7相同之方式，藉由FCM對實施例16中所製作之各種雙專一性抗體對於HepG2細胞及Ramos細胞之反應性進行評價。將結果示於圖11(A)及(B)以及圖12(A)及(B)。
圖11(A)係表示各種雙專一性抗體對於HepG2細胞之反應性，圖11(B)係表示各種雙專一性抗體對於Ramos細胞之反應性。同樣 地，圖12(A)係表示各種雙專一性抗體對於HepG2細胞之反應性，圖12(B)係表示各種雙專一性抗體對於Ramos細胞之反應性。橫軸表示抗體或雙專一性抗體，縱軸表示MFI。
根據該結果可知，無論何種雙專一性抗體均同樣地與CD40結合。又，可知無論何種雙專一性抗體均反應性較原本之抗GPC3抗體降低，但保持GPC3結合性。
[實施例18]使用HuH-7細胞或MC-38/hGPC3細胞作為GPC3陽性細胞之CD40促效劑活性評價
利用與實施例9相同之方法評價實施例16中所製作之各種雙專一性抗體之CD40促效劑活性。將Ct-R1090-HN3、Ct-R1090-GpS1019-FL及Ct-R1090-GpA6014-FL之CD40促效劑活性進行比較，將比較所得之結果示於圖13。圖13(A)係表示使用HuH-7細胞作為GPC3陽性細胞之結果，圖13(B)係表示於HuH-7細胞非存在下之結果。
將Cross-R1090-GC33、Cross-R1090-YP7、Ct-R1090-GpS1019-FL及Ct-R1090-GpA6014-FL之CD40促效劑活性進行比較，將比較所得之結果示於圖14(A)及(B)。圖14(A)係表示使用MC-38/hGPC3細胞作為GPC3陽性細胞之結果，圖14(B)係表示於MC-38/hGPC3細胞非存在下之結果。
根據該結果顯示，本發明之CD40-GPC3雙專一性抗體與使用既有之抗GPC3抗體HN3、GC33或YP7之CD40-GPC3雙專一性抗體相比，以低濃度顯示較高之促效劑活性。
本發明之CD40-GPC3雙專一性抗體與使用既有之抗GPC3 抗體之雙專一性抗體相比，均顯示出較強之CD40促效劑活性。本發明之雙專一性抗體所使用之抗GPC3抗體之表位係包含於人類GPC3之第192號至第358號之胺基酸序列中，其係與既有之抗GPC3抗體之表位不同之新穎表位。因此，推測包含源自與人類GPC3之胺基酸序列之第192號至第358號所包含之表位結合之抗GPC3抗體的GPC3結合區之CD40-GPC3雙專一性抗體發揮較強之促效劑活性。
[實施例19]利用荷瘤小鼠模型之促效劑活性評價
CD40-GPC3雙專一性抗體Ct-R1090S55A-GpS1019-FL、Ct-R1090S55A-GpA6014-FL及抗CD40抗體CP-870,893均未與小鼠CD40結合，因此於使用小鼠模型之研究中，使用向C57BL/6J Jcl小鼠導入包含人類CD40之BAC載體而表現人類CD40之人類CD40 BAC Tg小鼠(以下稱為hCD40Tg小鼠)。
hCD40Tg小鼠係將BAC純系(CTD-2532I19)(Invitrogen公司)純化後導入至受精卵而製作。所製作之hCD40Tg小鼠與C57BL/6J Jcl小鼠交配，利用PCR法確認具有人類CD40基因後供於試驗。
將實施例12中所製作之MC-38/hGPC3以5×105細胞於第10天至第7天之間移植至hCD40Tg小鼠之皮下。於第0天分為各群3-4隻，將各CD40-GPC3雙專一性抗體或作為陰性對照之抗體稀釋緩衝液(0.05mg/mL PS80，10mM之L-麩胺酸鈉、262mM之D-山梨糖醇、pH值5.5)自尾靜脈進行投予。抗體投予量係Ct-R1090S55A-GpS1019-FL設為2mg/kg，Ct-R1090S55A-GpA6014-FL設為10mg/kg。於投予3天後回收腫瘤，使用氧化鋯珠(Qiagen公司)使腫瘤破碎，使用RNeasy Plus微型套組 (Qiagen公司)提取RNA。
使用Superscript VILO(Thermo Fisher Scientific公司)，對所獲得之RNA進行反轉錄而獲得cDNA。以所獲得之cDNA作為模板，藉由Mm99999915_g1、Mm01288989_m1、Mm00711660_m1、Mm00444543_m1及Mm00441891_m1所示之Taqman分析(Thermo Fisher Scientific公司)分別對小鼠GAPDH、小鼠IL-12b、小鼠CD80、小鼠CD86及小鼠CD40進行即時PCR。即時PCR係使用7900HT(Thermo Fisher Scientific公司)來實施，藉由△△Ct法定量相對於GAPDH及抗體稀釋緩衝液(媒劑)投予群之各基因之相對拷貝數。
圖15中表示各基因之利用即時PCR所得之相對表現量。每次試驗以N=3~4實施，將2~3次之試驗資料合併所得之結果進行圖示。
如圖15所示，與媒劑投予群相比，於CD40-GPC3雙專一性抗體Ct-R1090-GpS1019-FL及Ct-R1090-GpA6014-FL之投予群中，IL-12b、CD80、CD86及CD40之表現上升。
已知IL-12b、CD80、CD86及CD40係表現量會因CD40訊息進入至抗原呈現細胞而上升之基因。由此認為，CD40-GPC3雙專一性抗體Ct-R1090-GpS1019-FL及Ct-R1090-GpA6014-FL於小鼠腫瘤中使抗原呈現細胞之CD40訊息活化。因此，認為本發明之雙專一性抗體不僅可於活體外發揮CD40促效劑活性，亦可於生物體內之腫瘤局部發揮CD40促效劑活性。
[實施例20]利用荷瘤小鼠模型之毒性試驗
於使用以與實施例19相同方式所製作之hCD40Tg小鼠之MC- 38/hGPC3荷瘤模型中，驗證實施例5中所製作之CD40-GPC3雙專一性抗體對於正常組織之影響。
將CD40-GPC3雙專一性抗體Ct-R1090S55A-GpS1019-FL、抗CD40抗體CP-870,893及作為陰性對照之抗體稀釋緩衝液自尾靜脈分別向hCD40Tg小鼠各群4隻進行投予，測定投予24小時後之血小板數、血漿中天冬胺酸胺基轉移酶(AST)及丙胺酸胺基轉移酶(ALT)濃度。Ct-R1090-GpS1019-FL係投予2mg/kg或10mg/kg。CP-870,893因毒性而難以投予10mg/kg，因此投予0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg。將結果示於圖16(A)~(C)。
如圖16(A)~(C)所示，於投予了抗CD40抗體CP-870,893之群中，確認到於投予後AST及ALT上升以及血小板減少。另一方面，關於投予了CD40-GPC3雙專一性抗體Ct R1090S55A-GpS1019-FL之群，無論投予量如何，AST、ALT及血小板數均與投予了作為陰性對照之抗體稀釋緩衝液(媒劑)之群相同程度。
根據以上情況顯示，本發明之CD40-GPC3雙專一性抗體僅於GPC3陽性細胞存在下發揮CD40促效劑活性，藉此與先前抗CD40促效劑抗體相比，全身性之毒性得到明顯減少。由此可期待本發明之雙專一性抗體一面抑制副作用一面僅於GPC3陽性之腫瘤局部發揮CD40促效劑活性，於腫瘤局部提高免疫。
已使用特定態樣對本發明詳細地進行了說明，但業者明確，能夠不脫離本發明之意圖與範圍而進行各種變更及變化。再者，本申請案係基於2019年5月15日提出申請之日本專利申請(特願2019-092297號)，且藉由引用將其全部內容援用於本文中。
[序列表非關鍵文字]
序列編號1：人類CD40細胞外域之鹼基序列
序列編號2：人類CD40細胞外域之胺基酸序列
序列編號3：猴CD40細胞外域之鹼基序列
序列編號4：猴CD40細胞外域之胺基酸序列
序列編號5：人類CD40之完整鹼基序列
序列編號6：人類CD40之完整胺基酸序列
序列編號7：猴CD40之完整鹼基序列
序列編號8：猴CD40之完整胺基酸序列
序列編號9：L6 VL之鹼基序列
序列編號10：L6 VL之胺基酸序列
序列編號11：L6 LCDR1之胺基酸序列
序列編號12：L6 LCDR2之胺基酸序列
序列編號13：L6 LCDR3之胺基酸序列
序列編號14：R1090S55A VH之鹼基序列
序列編號15：R1090S55A VH之胺基酸序列
序列編號16：R1090S55A HCDR1之胺基酸序列
序列編號17：R1090S55A HCDR2之胺基酸序列
序列編號18：R1090S55A HCDR3之胺基酸序列
序列編號19：21.4.1 VH之鹼基序列
序列編號20：21.4.1 VH之胺基酸序列
序列編號21：21.4.1 VL之鹼基序列
序列編號22：21.4.1 VL胺基酸序列
序列編號23：人類GPC3-mFc之鹼基序列
序列編號24：人類GPC3-mFc之胺基酸序列
序列編號25：小鼠GPC3-mFc之鹼基序列
序列編號26：小鼠GPC3-mFc之胺基酸序列
序列編號27：人類GPC3-rFc之鹼基序列
序列編號28：人類GPC3-rFc之胺基酸序列
序列編號29：小鼠GPC3-rFc之鹼基序列
序列編號30：小鼠GPC3-rFc之胺基酸序列
序列編號31：可溶型人類GPC3之胺基酸序列
序列編號32：人類GPC3-GST之鹼基序列
序列編號33：人類GPC3-GST之胺基酸序列
序列編號34：人類GPC3-AA-hFc之鹼基序列
序列編號35：人類GPC3-AA-hFc之胺基酸序列
序列編號36：可溶型小鼠GPC3之胺基酸序列
序列編號37：小鼠GPC3-AA-hFc之鹼基序列
序列編號38：小鼠GPC3-AA-hFc之胺基酸序列
序列編號39：人類GPC3完整鹼基序列
序列編號40：GpS1019VH之鹼基序列
序列編號41：GpS1019VH之胺基酸序列
序列編號42：GpS1019 HCDR1之胺基酸序列
序列編號43：GpS1019 HCDR2之胺基酸序列
序列編號44：GpS1019 HCDR3之胺基酸序列
序列編號45：GpA6005 VH之鹼基序列
序列編號46：GpA6005 VH之胺基酸序列
序列編號47：GpA6005 HCDR1之胺基酸序列
序列編號48：GpA6005 HCDR2之胺基酸序列
序列編號49：GpA6005 HCDR3之胺基酸序列
序列編號50：GpA6014 VH之鹼基序列
序列編號51：GpA6014 VH之胺基酸序列
序列編號52：GpA6014 HCDR1胺基酸序列
序列編號53：GpA6014 HCDR2胺基酸序列
序列編號54：GpA6014 HCDR3胺基酸序列
序列編號55：GpA6062 VH之鹼基序列
序列編號56：GpA6062 VH之胺基酸序列
序列編號57：GpA6062 HCDR1胺基酸序列
序列編號58：GpA6062 HCDR2胺基酸序列
序列編號59：GpA6062 HCDR3胺基酸序列
序列編號60：GpS3003 VH之鹼基序列
序列編號61：GpS3003 VH之胺基酸序列
序列編號62：GpS3003 HCDR1胺基酸序列
序列編號63：GpS3003 HCDR2胺基酸序列
序列編號64：GpS3003 HCDR3胺基酸序列
序列編號65：GPngs18 VH之鹼基序列
序列編號66：GPngs18 VH之胺基酸序列
序列編號67：GPngs18 HCDR1胺基酸序列
序列編號68：GPngs18 HCDR2胺基酸序列
序列編號69：GPngs18 HCDR3胺基酸序列
序列編號70：GPngs62 VH之鹼基序列
序列編號71：GPngs62 VH之胺基酸序列
序列編號72：GPngs62 HCDR1之胺基酸序列
序列編號73：GPngs62 HCDR2之胺基酸序列
序列編號74：GPngs62 HCDR3之胺基酸序列
序列編號75：包含L6作為VL之輕鏈之鹼基序列
序列編號76：包含L6作為VL之輕鏈之胺基酸序列
序列編號77：IgG4PE R409K重鏈恆定區之胺基酸序列
序列編號78：GpS1019重鏈之鹼基序列
序列編號79：GpS1019重鏈之胺基酸序列
序列編號80：GpA6005重鏈之鹼基序列
序列編號81：GpA6005重鏈之胺基酸序列
序列編號82：GpA6014重鏈之鹼基序列
序列編號83：GpA6014重鏈之胺基酸序列
序列編號84：GpA6062重鏈之鹼基序列
序列編號85：GpA6062重鏈之胺基酸序列
序列編號86：GpS3003重鏈之鹼基序列
序列編號87：GpS3003重鏈之胺基酸序列
序列編號88：GPngs18重鏈之鹼基序列
序列編號89：GPngs18重鏈之胺基酸序列
序列編號90：GPngs62重鏈之鹼基序列
序列編號91：GPngs62重鏈之胺基酸序列
序列編號92：IgG4PE R409K重鏈恆定區之鹼基序列
序列編號93：IgG4之CH1之鹼基序列
序列編號94：IgG4之CH1之胺基酸序列
序列編號95：Ct-R1090-GpS1019-FL重鏈之鹼基序列
序列編號96：Ct-R1090-GpS1019-FL重鏈之胺基酸序列
序列編號97：Ct-R1090-GpA6005-FL重鏈之鹼基序列
序列編號98：Ct-R1090-GpA6005-FL重鏈之胺基酸序列
序列編號99：Ct-R1090-GpA6014-FL重鏈之鹼基序列
序列編號100：Ct-R1090-GpA6014-FL重鏈之胺基酸序列
序列編號101：Ct-R1090-GpA6062-FL重鏈之鹼基序列
序列編號102：Ct-R1090-GpA6062-FL重鏈之胺基酸序列
序列編號103：Ct-R1090-GpS3003重鏈之鹼基序列
序列編號104：Ct-R1090-GpS3003重鏈之胺基酸序列
序列編號105：Ct-R1090-GPngs18重鏈之鹼基序列
序列編號106：Ct-R1090-GPngs18重鏈之胺基酸序列
序列編號107：Ct-R1090-GPngs62重鏈之鹼基序列
序列編號108：Ct-R1090-GPngs62重鏈之胺基酸序列
序列編號109：Ct-GpS1019-R1090重鏈之鹼基序列
序列編號110：Ct-GpS1019-R1090重鏈之胺基酸序列
序列編號111：Ct-GpA6005-R1090重鏈之鹼基序列
序列編號112：Ct-GpA6005-R1090重鏈之胺基酸序列
序列編號113：Ct-GpA6014-R1090重鏈之鹼基序列
序列編號114：Ct-GpA6014-R1090重鏈之胺基酸序列
序列編號115：Ct-GpA6062-R1090重鏈之鹼基序列
序列編號116：Ct-GpA6062-R1090重鏈之胺基酸序列
序列編號117：Ct-GpS3003-R1090重鏈之鹼基序列
序列編號118：Ct-GpS3003-R1090重鏈之胺基酸序列
序列編號119：Ct-GPngs18-R1090重鏈之鹼基序列
序列編號120：Ct-GPngs18-R1090重鏈之胺基酸序列
序列編號121：Ct-GPngs62-R1090重鏈之鹼基序列
序列編號122：Ct-GPngs62-R1090重鏈之胺基酸序列
序列編號123：GC33 VH之胺基酸序列
序列編號124：GG33 VL之胺基酸序列
序列編號125：YP7 VH之胺基酸序列
序列編號126：YP7 VL之胺基酸序列
序列編號127：HN3 VH之胺基酸序列
序列編號128：GS連接子之胺基酸序列
序列編號129：人類GPC3完整胺基酸序列
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090
Figure 12_A0101_SEQ_0091
Figure 12_A0101_SEQ_0092
Figure 12_A0101_SEQ_0093
Figure 12_A0101_SEQ_0094
Figure 12_A0101_SEQ_0095
Figure 12_A0101_SEQ_0096
Figure 12_A0101_SEQ_0097
Figure 12_A0101_SEQ_0098
Figure 12_A0101_SEQ_0099
Figure 12_A0101_SEQ_0100
Figure 12_A0101_SEQ_0101
Figure 12_A0101_SEQ_0102
Figure 12_A0101_SEQ_0103
Figure 12_A0101_SEQ_0104
Figure 12_A0101_SEQ_0105
Figure 12_A0101_SEQ_0106
Figure 12_A0101_SEQ_0107
Figure 12_A0101_SEQ_0108
Figure 12_A0101_SEQ_0109
Figure 12_A0101_SEQ_0110
Figure 12_A0101_SEQ_0111
Figure 12_A0101_SEQ_0112
Figure 12_A0101_SEQ_0113
Figure 12_A0101_SEQ_0114
Figure 12_A0101_SEQ_0115
Figure 12_A0101_SEQ_0116
Figure 12_A0101_SEQ_0117
Figure 12_A0101_SEQ_0118
Figure 12_A0101_SEQ_0119
Figure 12_A0101_SEQ_0120
Figure 12_A0101_SEQ_0121
Figure 12_A0101_SEQ_0122
Figure 12_A0101_SEQ_0123
Figure 12_A0101_SEQ_0124
Figure 12_A0101_SEQ_0125
Figure 12_A0101_SEQ_0126
Figure 12_A0101_SEQ_0127
Figure 12_A0101_SEQ_0128
Figure 12_A0101_SEQ_0129
Figure 12_A0101_SEQ_0130
Figure 12_A0101_SEQ_0131
Figure 12_A0101_SEQ_0132
Figure 12_A0101_SEQ_0133
Figure 12_A0101_SEQ_0134
Figure 12_A0101_SEQ_0135
Figure 12_A0101_SEQ_0136
Figure 12_A0101_SEQ_0137
Figure 12_A0101_SEQ_0138
Figure 12_A0101_SEQ_0139
Figure 12_A0101_SEQ_0140
Figure 12_A0101_SEQ_0141
Figure 12_A0101_SEQ_0142
Figure 12_A0101_SEQ_0143
Figure 12_A0101_SEQ_0144
Figure 12_A0101_SEQ_0145
Figure 12_A0101_SEQ_0146
Figure 12_A0101_SEQ_0147
Figure 12_A0101_SEQ_0148
Figure 12_A0101_SEQ_0149
Figure 12_A0101_SEQ_0150
Figure 12_A0101_SEQ_0151
Figure 12_A0101_SEQ_0152
Figure 12_A0101_SEQ_0153
Figure 12_A0101_SEQ_0154
Figure 12_A0101_SEQ_0155
Figure 12_A0101_SEQ_0156
Figure 12_A0101_SEQ_0157
Figure 12_A0101_SEQ_0158
Figure 12_A0101_SEQ_0159
Figure 12_A0101_SEQ_0160
Figure 12_A0101_SEQ_0161
Figure 12_A0101_SEQ_0162
Figure 12_A0101_SEQ_0163
Figure 12_A0101_SEQ_0164
Figure 12_A0101_SEQ_0165
Figure 12_A0101_SEQ_0166
Figure 12_A0101_SEQ_0167
Figure 12_A0101_SEQ_0168
Figure 12_A0101_SEQ_0169
Figure 12_A0101_SEQ_0170
Figure 12_A0101_SEQ_0171
Figure 12_A0101_SEQ_0172
Figure 12_A0101_SEQ_0173
Figure 12_A0101_SEQ_0174
Figure 12_A0101_SEQ_0175
Figure 12_A0101_SEQ_0176
Figure 12_A0101_SEQ_0177
Figure 12_A0101_SEQ_0178
Figure 12_A0101_SEQ_0179
Figure 12_A0101_SEQ_0180
Figure 12_A0101_SEQ_0181
Figure 12_A0101_SEQ_0182
Figure 12_A0101_SEQ_0183
Figure 12_A0101_SEQ_0184
Figure 12_A0101_SEQ_0185
Figure 12_A0101_SEQ_0186
Figure 12_A0101_SEQ_0187
Figure 12_A0101_SEQ_0188
Figure 12_A0101_SEQ_0189

Claims (18)

  1. 一種雙專一性抗體，其含有包含第一抗原結合域之IgG部分及第二抗原結合域，且該IgG部分之重鏈之C末端直接或經由連接子與該第二抗原結合域結合，該雙專一性抗體係以下(i)之雙專一性抗體；(i)第一抗原結合域為與人類CD40結合之抗原結合域，第二抗原結合域為與人類磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(GPC3)結合之抗原結合域之雙專一性抗體，其中與人類CD40結合之抗原結合域包含如下VH及VL，該VH含有分別包含序列編號16~18所表示之胺基酸序列之CDR1~3，該VL含有分別包含序列編號11~13所表示之胺基酸序列之CDR1~3，與人類GPC3結合之抗原結合域包含如下VL及VH，該VL含有分別包含序列編號11~13所表示之胺基酸序列之CDR1~3，該VH係選自由以下(1a)~(1g)所組成之群中之任一者；(1a)含有分別包含序列編號42~44所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH(1b)含有分別包含序列編號47~49所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH(1c)含有分別包含序列編號52~54所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH(1d)含有分別包含序列編號57~59所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH(1e)含有分別包含序列編號62~64所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH (1f)含有分別包含序列編號67~69所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH(1g)含有分別包含序列編號72~74所表示之胺基酸序列之CDR1~3之VH。
  2. 如請求項1之雙專一性抗體，其以二價分別與人類CD40及人類GPC3結合。
  3. 如請求項1或2之雙專一性抗體，其中IgG部分之重鏈之C末端與第二抗原結合域直接結合。
  4. 如請求項1或2之雙專一性抗體，其中第二抗原結合域為Fab。
  5. 如請求項1或2之雙專一性抗體，其具有CD40促效劑活性。
  6. 如請求項1或2之雙專一性抗體，其中與人類CD40結合之抗原結合域包含如下VH及VL，該VH包含序列編號15所表示之胺基酸序列，該VL包含序列編號10所表示之胺基酸序列。
  7. 如請求項1或2之雙專一性抗體，其中與人類GPC3結合之抗原結合域包含如下VL及VH，該VL包含序列編號10所表示之胺基酸序列，該VH係選自由以下(2a)~(2g)所組成之群中之任一者；(2a)包含序列編號41所表示之胺基酸序列之VH (2b)包含序列編號46所表示之胺基酸序列之VH(2c)包含序列編號51所表示之胺基酸序列之VH(2d)包含序列編號56所表示之胺基酸序列之VH(2e)包含序列編號61所表示之胺基酸序列之VH(2f)包含序列編號66所表示之胺基酸序列之VH(2g)包含序列編號71所表示之胺基酸序列之VH。
  8. 如請求項1或2之雙專一性抗體，其中上述IgG部分之重鏈恆定區包含序列編號77所表示之胺基酸序列。
  9. 如請求項1或2之雙專一性抗體，其包含2條重鏈及4條輕鏈，該重鏈包含選自序列編號96、98、100、102、104、106及108中之任一者所表示之胺基酸序列，該輕鏈含有包含序列編號10所表示之胺基酸序列之VL。
  10. 一種雙專一性抗體片段，其係如請求項1至9中任一項之雙專一性抗體之雙專一性抗體片段。
  11. 一種DNA，其編碼如請求項1至9中任一項之雙專一性抗體或如請求項10之雙專一性抗體片段。
  12. 一種重組體載體，其含有如請求項11之DNA。
  13. 一種轉形株，其係將如請求項12之重組體載體導入至宿主細胞而獲得。
  14. 一種如請求項1至9中任一項之雙專一性抗體或如請求項10之雙專一性抗體片段之製造方法，其特徵在於：將如請求項13之轉形株於培養基中進行培養，於培養物中生產蓄積如請求項1至9中任一項之雙專一性抗體或如請求項10之雙專一性抗體片段，自該培養物採集該雙專一性抗體或該雙專一性抗體片段。
  15. 一種與人類CD40及人類GPC3之至少一者相關之癌症之治療劑及/或診斷劑，其含有如請求項1至9中任一項之雙專一性抗體或如請求項10之雙專一性抗體片段作為有效成分。
  16. 一種如請求項1至9中任一項之雙專一性抗體或如請求項10之雙專一性抗體片段之用途，其係用於製造與人類CD40及人類GPC3之至少一者相關之癌症之治療劑及/或診斷劑。
  17. 一種用以檢測或測定GPC3及CD40之至少一者之試劑，其包含如請求項1至9中任一項之雙專一性抗體或如請求項10之雙專一性抗體片段。
  18. 一種雙專一性抗體之衍生物，其係使放射性同位素、低分子藥劑、高分子藥劑、蛋白質或抗體醫藥以化學或基因工程方式與如請求項1至9中任一項之雙專一性抗體或如請求項10之雙專一性抗體片段結合而成。
TW109116230A 2019-05-15 2020-05-15 與cd40及gpc3結合之雙專一性抗體 TWI875760B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-092297 2019-05-15
JP2019092297 2019-05-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202108625A TW202108625A (zh) 2021-03-01
TWI875760B true TWI875760B (zh) 2025-03-11

Family

ID=73290054

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109116230A TWI875760B (zh) 2019-05-15 2020-05-15 與cd40及gpc3結合之雙專一性抗體

Country Status (5)

Country Link
US (1) US12466891B2 (zh)
EP (1) EP3971293A4 (zh)
JP (1) JP7502281B2 (zh)
TW (1) TWI875760B (zh)
WO (1) WO2020230901A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2024545363A (ja) 2021-11-16 2024-12-05 ソティオ・バイオテック・インコーポレイテッド 粘液型／円形細胞型脂肪肉腫患者の治療

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015156268A1 (ja) * 2014-04-07 2015-10-15 中外製薬株式会社 免疫活性化抗原結合分子
WO2018185045A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap
US20180326058A1 (en) * 2015-11-18 2018-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using t cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5623587A (en) 1979-08-03 1981-03-05 Mitsuwa Seiki Co Ltd Vane type compressor
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
WO1985003934A1 (fr) 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteine modifiee chimiquement et son procede de preparation
JPS60221091A (ja) 1983-12-21 1985-11-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プロモ−タ−
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
JP2564268B2 (ja) 1985-08-28 1996-12-18 協和醗酵工業株式会社 融合抗原ポリペプチド
ZA872705B (en) 1986-04-22 1987-10-05 Immunex Corporation Human g-csf protein expression
JP2958019B2 (ja) 1988-05-06 1999-10-06 住友製薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
JP2928287B2 (ja) 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
JP3131322B2 (ja) 1991-12-17 2001-01-31 協和醗酵工業株式会社 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
DE69434749T2 (de) 1993-03-29 2007-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Alpha-1,3-Fucosyltransferase
CN1241944C (zh) 1995-09-11 2006-02-15 协和发酵工业株式会社 抗人白介素－5受体α链的抗体
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
AU751659B2 (en) 1997-05-02 2002-08-22 Genentech Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
WO1999061057A2 (en) 1998-05-23 1999-12-02 Tanox, Inc. Molecules targeting cd40 and tumor cells
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU3672800A (en) 1999-04-09 2000-11-14 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
DE19934785C2 (de) 1999-07-27 2001-05-23 Dorma Gmbh & Co Kg Türterminal mit Montageplatte
JP4955185B2 (ja) 2000-06-29 2012-06-20 アボット・ラボラトリーズ 二重特異性抗体ならびに作製方法および使用方法
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
KR20050036852A (ko) 2001-10-15 2005-04-20 기린 비루 가부시키가이샤 항-ｈｌａ-ｄｒ 항체
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
EP2216046B1 (en) 2004-07-09 2014-03-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody
JP4958555B2 (ja) 2004-09-22 2012-06-20 協和発酵キリン株式会社 安定化されたヒトＩｇＧ４抗体
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
JP5522405B2 (ja) 2008-04-25 2014-06-18 協和発酵キリン株式会社 安定な多価抗体
CN102803484A (zh) 2009-06-11 2012-11-28 大学共同利用机关法人情报·系统研究机构 生产蛋白质的方法
ES2666550T3 (es) 2011-04-19 2018-05-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anticuerpos monoclonales humanos específicos para glipicano 3 y uso de los mismos
US9409994B2 (en) 2012-06-01 2016-08-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof
CA3025345A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
WO2018140831A2 (en) 2017-01-27 2018-08-02 Silverback Therapeutics, Inc. Tumor targeting conjugates and methods of use thereof
EP3708589A4 (en) * 2017-11-08 2021-08-11 Kyowa Kirin Co., Ltd. BISPECIFIC ANTIBODIES THAT BIND TO CD40 AND EpCAM
JP6606157B2 (ja) 2017-11-15 2019-11-13 ファナック株式会社 ロータおよび回転電機

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015156268A1 (ja) * 2014-04-07 2015-10-15 中外製薬株式会社 免疫活性化抗原結合分子
US20180326058A1 (en) * 2015-11-18 2018-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using t cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
WO2018185045A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap

Also Published As

Publication number Publication date
EP3971293A1 (en) 2022-03-23
WO2020230901A1 (ja) 2020-11-19
TW202108625A (zh) 2021-03-01
EP3971293A4 (en) 2023-02-08
JP7502281B2 (ja) 2024-06-18
US12466891B2 (en) 2025-11-11
US20220220216A1 (en) 2022-07-14
JPWO2020230901A1 (zh) 2020-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240059788A1 (en) BISPECIFIC ANTIBODY WHICH BINDS TO CD40 AND EpCAM
US20220259328A1 (en) Bispecific antibody binding to cd40 and fap
US20250250352A1 (en) BISPECIFIC ANTIBODY BINDING TO TfR
US20180016346A1 (en) Bispecific antibody binding to trailr2 and psma
TWI875760B (zh) 與cd40及gpc3結合之雙專一性抗體
WO2021261597A1 (ja) ＧＰＣ３とＴｆＲに結合するバイスペシフィック抗体
HK40062464A (zh) 与tfr结合的双特异性抗体
HK40038050A (zh) 与cd40和epcam结合的双特异性抗体