ES2899956T3

ES2899956T3 - Diseño de anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc

Info

Publication number: ES2899956T3
Application number: ES12845801T
Authority: ES
Inventors: Von Kreudenstein Thomas Spreter; Surjit Bhimarao Dixit; Eric Escobar-Cabrera; David Kai Yuen Poon; Paula Irene Lario
Original assignee: Zymeworks Inc Canada
Current assignee: Zymeworks BC Inc
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2012-11-02
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2032-11-02
Also published as: AU2012332021A8; RU2018142832A; US9732155B2; AU2017245451B9; RU2675319C2; US20200087414A1; US20130195849A1; EP2773671A1; BR112014010580A2; CN104080811A; CN109897103A; CA2854233A1; AU2012332021B2; WO2013063702A1; MX358862B; US20180030150A1; BR112014010580B1; AU2012332021A1; PT2773671T; CN109897103B

Abstract

Una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 heterodimérico modificado, comprendiendo el dominio CH3 heterodimérico modificado: un primer polipéptido de dominio CH3 modificado y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado; en donde el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones L351, F405 e Y407, y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones T366, K392 y T394 en comparación con el dominio CH3 de la secuencia de cadena pesada de IgG1 expuesta en la Tabla B, en donde la sustitución de aminoácidos en la posición L351 es L351Y, la sustitución de aminoácidos en la posición F405 es F405A, la sustitución de aminoácidos en la posición Y407 es Y407V, la sustitución de aminoácidos en la posición T366 es T366I o T366L, la sustitución de aminoácidos en la posición K392 es K392L o K392M y la sustitución de aminoácidos en la posición T394 es T394W; en donde además al menos uno del primer y el segundo polipéptidos de dominio CH3 modificados comprende una sustitución T350V; en donde además el dominio CH3 heterodimérico tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos 74 °C y una pureza de al menos 95 %; en donde además la construcción de Fc heteromultimérica está basada en una inmunoglobulina de tipo G 1 humana (IgG1); y en donde además la numeración de restos de aminoácidos es de acuerdo con el índice de EU como se expone en Kabat.

Description

DESCRIPCIÓN

Diseño de anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc

Campo de la invención

La presente divulgación proporciona en general heterodímeros polipeptídicos, composiciones de los mismos, y métodos para preparar y usar dichos heterodímeros polipeptídicos. Más específicamente, esta invención se refiere a anticuerpos termoestables multiespecíficos, incluyendo biespecíficos, que comprende un dominio Fc heterodimérico.

Antecedentes de la invención

Los productos terapéuticos biespecíficos son moléculas basadas en anticuerpos que pueden unirse simultáneamente a dos dianas separadas y distintas o epítopos diferentes del mismo antígeno. Los anticuerpos biespecíficos están comprendidos por las entidades basadas en dominio de inmunoglobulina e intentan imitar estructural y funcionalmente componentes de la molécula de anticuerpo. Un uso de los anticuerpos biespecíficos ha sido redirigir las células efectoras inmunitarias citotóxicas para destrucción potenciada de células tumorales, tal como por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). En este contexto, un brazo del anticuerpo biespecífico se une con un antígeno en la célula tumoral, y el otro se une con un determinante expresado en células efectoras. Por reticulación de células tumorales y efectoras, el anticuerpo biespecífico no solamente pone las células efectoras en proximidad a las células tumorales sino que también desencadena simultáneamente su activación, lo que conduce a destrucción eficaz de células tumorales. También se han usado anticuerpos biespecíficos para enriquecer agentes quimio o radioterapéuticos en tejidos tumorales para minimizar los efectos perjudiciales para el tejido normal. En esta situación, un brazo del anticuerpo biespecífico se une con un antígeno expresado en la célula marcada para destrucción, y el otro brazo suministra un fármaco quimioterapéutico, radioisótopo, o toxina. Además de biespecíficos, se necesita que los productos terapéuticos proteicos consigan sus eficacias dirigiéndose a múltiples modalidades simultáneamente. Dichos efectos biológicos nuevos y complejos pueden obtenerse con productos terapéuticos proteicos diseñando unión multidiana y aspectos multifuncionales en la proteína.

Se requiere un armazón robusto que proporcione una estructura para fusionar otras ojivas funcionales o dominios de unión a proteína diana para diseñar estos productos terapéuticos multifuncionales y de unión multidiana. Idealmente, el armazón no debería proporcionar solamente la estructura sino también poner a disposición varios otros elementos terapéuticamente relevantes y valiosos para el producto terapéutico diseñado. Un obstáculo importante en el desarrollo general de productos terapéuticos basados en anticuerpo biespecíficos y multifuncionales ha sido la dificultad de producir materiales de suficiente calidad y cantidad para estudios tanto preclínicos como clínicos. Sigue existiendo la necesidad en la técnica de construcciones polipeptídicas que comprendan dominios variables individuales como los dominios de unión a proteína que se unen con una región Fc variante, comprendiendo dicho Fc variante dominios CH3 que se han modificado para seleccionar heterodímeros con una estabilidad y pureza aumentadas.

Sumario de la invención

Se proporciona de acuerdo con un aspecto de la invención una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 heterodimérico modificado, comprendiendo dicho dominio CH3 modificado:

un primer polipéptido de dominio CH3 modificado y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado;

en donde el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones L351, F405 e Y407, y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones T366, K392 y T394 en comparación con el dominio CH3 de la secuencia de cadena pesada de IgG1 expuesta en la Tabla B,

en donde la sustitución de aminoácidos en la posición L351 es L351Y, la sustitución de aminoácidos en la posición F405 es F405A, la sustitución de aminoácidos en la posición Y407 es Y407V, la sustitución de aminoácidos en la posición T366 es T366I o T366L, la sustitución de aminoácidos en la posición K392 es K392L o K392M y la sustitución de aminoácidos en la posición T394 es T394W; en donde además al menos uno del primer y el segundo polipéptidos de dominio CH3 modificados comprende una sustitución T350V;

en donde además el dominio CH3 heterodimérico tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos 74 °C y una pureza de al menos 95 %;

en donde además la construcción de Fc heteromultimérica está basada en una inmunoglobulina de tipo G 1 humana (IgG1); y

en donde además la numeración de restos de aminoácidos es de acuerdo con el índice de EU como se expone en Kabat.

En una realización está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394w . En algunas realizaciones está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos T366L, K392L y T394W. En una realización adicional está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394w . En algunas realizaciones está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos T366I, K392L y T394W. En ciertas realizaciones está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende una modificación de aminoácidos en la posición S400. En una realización adicional está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, que comprende la modificación S400Z, en donde Z se selecciona de un aminoácido con carga positiva y un aminoácido con carga negativa. En algunas realizaciones, el aminoácido con carga positiva es lisina o arginina y el aminoácido con carga negativa es ácido aspártico o ácido glutámico. En ciertas realizaciones está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 una modificación de aminoácidos seleccionada de S400E y S400R. En algunas realizaciones se proporciona la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende una modificación de aminoácidos en la posición N390. En algunas realizaciones, la modificación de N390 es N390Z, en donde Z se selecciona se selecciona de un aminoácido con carga positiva y un aminoácido con carga negativa. En una realización, N390Z es N390R. En ciertas realizaciones de la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, dicho primer polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende la modificación de aminoácidos S400E y dicho segundo polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende la modificación de aminoácidos N390R. En algunas realizaciones de la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, cada uno del primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado, comprendiendo uno de dichos polipéptidos de dominio CH3 modificado la modificación de aminoácidos Q347R y comprendiendo el otro polipéptido de dominio CH3 modificado la modificación de aminoácidos K360E.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 heterodimérico modificado, comprendiendo dicho dominio CH3 modificado: un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido de dominio CH3 de tipo silvestre, y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido de dominio CH3 de tipo silvestre; en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 comprende una modificación de aminoácidos de K392J en donde J se selecciona de L, I; en donde dicho primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado preferentemente forman un dominio CH3 heterodimérico con una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 74 °C y una pureza de al menos 95 %; y en donde al menos una modificación de aminoácidos no es de un aminoácido que está en el interfaz entre dicho primer y dicho segundo polipéptidos de dominio CH3. Se describe en el presente documento una construcción de Fc heteromultimérica, que comprende al menos una modificación de T350X, en donde X es un aminoácido natural o no natural seleccionado de valina, isoleucina, leucina, metionina y derivados o variantes de los mismos. En algunas realizaciones hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, que comprende al menos una modificación T350V. En una realización hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 75 °C o superior. En una realización está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una Tm de aproximadamente 77 °C o superior. En ciertas realizaciones, el dominio CH3 modificado tiene una Tm de aproximadamente 80 °C o superior. Se describe en el presente documento una construcción de Fc heteromultimérica aislada en donde al menos un polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende una modificación de aminoácidos de al menos uno de K409 y T411. También se describe en el presente documento una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende al menos uno de K409F, T411E y T411D. En algunas realizaciones está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento en donde al menos un polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende una modificación de aminoácidos de D399. En algunas realizaciones, la modificación de aminoácido de D399 es al menos una de D399R y D399K.

Se describe en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 heterodimérico modificado, comprendiendo dicho dominio CH3 modificado: un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido de dominio CH3 de tipo silvestre, y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido de dominio CH3 de tipo silvestre; en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 comprende una modificación de aminoácidos de K392J en donde J se selecciona de L, I o un aminoácido con un volumen de cadena lateral no sustancialmente mayor que el volumen de cadena lateral de K; en donde dicho primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificados preferentemente forman un dominio CH3 heterodimérico con una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 74 °C y una pureza de al menos 95 %; y en donde al menos una modificación de aminoácidos no es de un aminoácido que está en el interfaz entre dicho primer y dicho segundo polipéptidos de dominio CH3. En ciertas realizaciones hay una construcción de Fc heteromultimérica descrita en el presente documento, que comprende al menos una modificación de T350X, en donde X es un aminoácido natural o no natural seleccionado de valina, isoleucina, leucina, metionina y derivados o variantes de los mismos. En algunas realizaciones hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, que comprende al menos una modificación T350V. En una realización hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 75 °C o superior. En una realización está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una Tm de aproximadamente 77 °C o superior. En ciertas realizaciones, el dominio CH3 modificado tiene una Tm de aproximadamente 80 °C o superior. En ciertas realizaciones está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el primer polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de K409F, T411E y T411D, y el segundo polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de Y407A, Y407I, Y407V, D399R y D399K. En algunas realizaciones está una cualquiera de las construcciones de Fc heteromultiméricas aisladas descritas en el presente documento, que comprende además un primer dominio CH3 modificado que comprende una de las modificaciones de aminoácidos T366V, T366I, T366A, T366M y T366L; y un segundo dominio CH3 modificado que comprende la modificación de aminoácidos L351Y. En algunas realizaciones está una cualquiera de las construcciones de Fc heteromultiméricas aisladas descritas en el presente documento, que comprende un primer dominio CH3 modificado que comprende una de las modificaciones de aminoácidos K392L o K392E; y un segundo dominio CH3 modificado que comprende una de las modificaciones de aminoácidos S400R o S400V.

Se describe en el presente documento una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado, comprendiendo cada polipéptido de dominio CH3 modificado al menos cuatro mutaciones de aminoácidos, en donde al menos uno de dicho primer y dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende una mutación seleccionada de N390Z y S400Z, en donde Z se selecciona de un aminoácido con carga positiva y un aminoácido con carga negativa, y en donde dichos primero y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado preferentemente forman un dominio CH3 heterodimérico con una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 70 °C y un pureza de al menos 90%. Como se describe en el presente documento, la construcción de Fc heteromultimérica aislada, puede comprender un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones F405 y Y407 y dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende modificación de aminoácidos en la posición T394. En un aspecto se proporciona la construcción de Fc heteromultimérica aislada, comprendiendo el primer polipéptido de dominio CH3 modificado una modificación de aminoácidos en la posición L351. En ciertos aspectos, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado una modificación de al menos una de las posiciones T366 y K392. En algunos aspectos del heteromultímero aislado descrito en el presente documento, el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 75 °C y se forma con una pureza de al menos aproximadamente 95 %. En ciertas realizaciones, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo al menos un polipéptido de dominio CH3 modificado las modificaciones de aminoácidos de al menos una de N390R, S400E y S400R. En algunas realizaciones hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos de la posición 347 y comprendiendo el otro polipéptido de dominio CH3 modificado modificación de aminoácidos en la posición 360. En ciertas realizaciones está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado modificación de aminoácidos de T350V. En realizaciones específicas hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de L351Y, F405A y Y407V; y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de T366L, T366I, K392L, K392M y T394W. Se describe en el presente documento un heteromultímero aislado, comprendiendo el primer polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos en las posiciones D399 y Y407, y comprendiendo un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos en las posiciones K409 y T411. En algunas realizaciones hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificación de aminoácido en la posición L351, y comprendiendo el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos en la posición T366 y K392. En realizaciones específicas hay heteromultímeros aislados descritos en el presente documento, comprendiendo al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 la modificación de aminoácidos de T350V. En ciertas realizaciones hay heteromultímeros aislados descritos en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 75 °C o superior y se forma con una pureza de al menos aproximadamente 95 %. Se describen en el presente documento construcciones de Fc heteromultiméricas aisladas, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácido seleccionadas de L351Y, D399R, D399K, S400D, S400E, S400R, S400K, Y407A y Y407V; y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácido seleccionadas de T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392I, K392D, K392E, K409F, K409W, T411D y T411E.

Se describe en el presente documento una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado, comprendiendo cada polipéptido de dominio CH3 modificado al menos tres mutaciones de aminoácidos, en donde uno de dicho primer y dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende una mutación seleccionada de T411E y T411D, y en donde dicho primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado forman preferentemente un dominio CH3 heterodimérico con una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 70 °C y un pureza de al menos 90 %. En una realización se proporciona la construcción de Fc heteromultimérica aislada, en donde dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones F405 y Y407 y dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende modificación de aminoácidos en la posición T394. En un aspecto se proporciona la construcción de Fc heteromultimérica aislada, comprendiendo el primer polipéptido de dominio CH3 modificado una modificación de aminoácidos en la posición L351. En ciertos aspectos, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado una modificación de al menos una de las posiciones T366 y K392. En algunos aspectos, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (T m) de al menos aproximadamente 75 °C y se forma con una pureza de al menos aproximadamente 95 %. En ciertos aspectos, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, al menos un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende modificaciones de aminoácidos de al menos una de N390R, S400E y S400R. En algunos aspectos está un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos de la posición 347 y comprendiendo el otro polipéptido de dominio CH3 modificado modificación de aminoácidos en la posición 360. En ciertos aspectos está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado modificación de aminoácidos de T350V. En aspectos específicos hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de L351Y, F405A y Y407V; y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de T366L, T366I, K392L, K392M y T394W. En ciertos aspectos se describe en el presente documento un heteromultímero aislado, comprendiendo el primer polipéptido de dominio CH3 modificado las modificaciones de aminoácidos en las posiciones D399 y Y407, y comprendiendo un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos en las posiciones K409 y T411. En algunos aspectos hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo el primer polipéptido de dominio CH3 modificación de aminoácidos en la posición L351, y comprendiendo el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos en las posiciones t 366 y K392. En aspectos específicos hay heteromultímeros aislados descritos en el presente documento, comprendiendo al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificación de aminoácidos de T350V. En ciertos aspectos hay heteromultímeros aislados descritos en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 75 °C o superior y se forma con una pureza de al menos aproximadamente 95 %. Se proporcionan en ciertos aspectos construcciones de Fc heteromultiméricas aisladas descritas en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos seleccionadas de L351Y, D399R, d 399K, S400D, S400E, S400R, S400K, Y407A y Y407V; y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácido seleccionadas de T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392I, K392D, K392E, K409F, K409W, T411D y T411E.

Se proporciona en el presente documento una construcción de Fc heteromultimérica aislada de la invención, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada de la invención, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, K392L y T394W.

Se proporciona en un cierto aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada de la invención, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W.

Se proporciona en algunos aspectos una construcción de Fc heteromultimérica aislada de la invención, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392L y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada de la invención, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, F405A y Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, K392L y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada de la invención, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400R, F405A, Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, K392M y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada de la invención, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400E, F405A, Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, N390R, K392M y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada de la invención, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, F405A, Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366l , K392L y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T366V, K392L, K409F y T411E; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, D399R y Y407A.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T366V, K392L, K409F y T411E; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, D399R, S400R y Y407A.

Se proporciona de acuerdo con un aspecto descrito en el presente documento un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros, en donde la región Fc heterodimérica comprende además un dominio CH2 variante que comprende al menos una modificación de aminoácidos asimétrica para promover la unión selectiva de un receptor Fcgamma. En un aspecto el dominio CH2 variante se une selectivamente al receptor Fcgamma IIIa en comparación con el dominio CH2 de tipo silvestre. En un aspecto, el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o superior. En ciertas realizaciones, el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (T m) de al menos aproximadamente 75 °C. En algunas realizaciones, el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 80 °C.

Se proporciona en otro aspecto un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos, en donde dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o superior, y en donde dicho dominio CH3 modificado da como resultado la formación de región Fc heterodimérica con mayor estabilidad en comparación con un dominio CH3 que no comprenda mutaciones de aminoácidos. En una realización, la región Fc heterodimérica no comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 en relación con una región Fc de tipo silvestre. En una realización alternativa, la región Fc heterodimérica comprende al menos un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 modificado en relación con una región Fc de tipo silvestre, a condición de que la temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o superior sea en ausencia del enlace disulfuro adicional. En otra realización, la región Fc heterodimérica comprende al menos un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 modificado en relación con una región Fc de tipo silvestre, y en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 77,5 °C o superior.

Se proporciona en una realización un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o superior y la región Fc heterodimérica se forma con una pureza de aproximadamente 95 % o superior o la región Fc heterodimérica se forma con una pureza de aproximadamente 98 % o superior.

También se proporciona en ciertas realizaciones un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende una o más mutaciones de aminoácidos que dan como resultado la formación de región Fc heterodimérica con mayor estabilidad en comparación con un dominio CH3 que no comprende dichas una o más mutaciones de aminoácidos, en donde dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o superior. En otro aspecto descrito en el presente documento, la región Fc heterodimérica se forma en solución con una pureza de aproximadamente 98 % o superior, y Tm de aproximadamente 73 °C o en donde la región Fc heterodimérica se forma con una pureza de aproximadamente 90 % o superior, y Tm de aproximadamente 75 °C.

Se proporciona en ciertas realizaciones un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer y un segundo polipéptidos de dominio CH3, en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos T350V. Se proporciona en ciertas realizaciones un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende la modificación de aminoácidos T350V y un segundo polipéptido de dominio CH3 que comprende también la modificación de aminoácidos T350V. Se describe en ciertos aspectos un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407A y un segundo polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos T366A y K409F. En un aspecto, el primer polipéptido de dominio CH3 o el segundo polipéptido de dominio CH3 comprenden una modificación de aminoácidos adicional en la posición T411, D399, S400, F405, N390 o K392. La modificación de aminoácidos en la posición T411 se selecciona de T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. La modificación de aminoácidos en la posición D399 se selecciona de D399R, D399W, D399Y o D399K. La modificación de aminoácidos en la posición S400 se selecciona de S400E, S400D, S400R o S400K. La modificación de aminoácidos en la posición F405 se selecciona de F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W. La modificación de aminoácidos en la posición N390 se selecciona de N390R, N390K o N390D. La modificación de aminoácidos en la posición K392 se selecciona de K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E.

Se describe en ciertos aspectos un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V y L351Y y un segundo polipéptido de dominio CH3 que también comprende modificaciones de aminoácidos T350V y L351Y.

Se describe en ciertos aspectos un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende la modificación de aminoácidos Y407A y un segundo polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos T366A y K409F. En un aspecto el primer polipéptido de dominio CH3 o el segundo polipéptido de dominio CH3 comprenden las modificaciones de aminoácidos adicionales K392E, T411E, D399R y S400R. En otro aspecto, el primer polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos D399R, S400R y Y407A y el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos T366A, K409F, K392E y T411E. En un aspecto adicional, el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o superior y el heterodímero tiene una pureza de aproximadamente 95 % o superior.

Se describe en ciertos aspectos un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende una modificación de aminoácidos en la posición L351 y modificación de aminoácidos Y407A y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende una modificación de aminoácidos en la posición T366 y modificación de aminoácidos K409F. En un aspecto, la modificación de aminoácidos en la posición L351 se selecciona de L351Y, L351I, L351D, L351R o L351F. En otro aspecto, la modificación de aminoácidos en la posición Y407 se selecciona de Y407A, Y407V o Y407S. En otro aspecto más, la modificación de aminoácidos en la posición T366 se selecciona de T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. En un aspecto el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (T m) de aproximadamente 75 °C o superior y el heterodímeros tiene una pureza de aproximadamente 90% o superior.

Se describe en ciertos aspectos un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende una modificación de aminoácidos en la posición F405 y las modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos T394W. En un aspecto, el primer polipéptido de dominio CH3 o el segundo polipéptido de dominio CH3 comprenden una modificación de aminoácidos en las posiciones K392, T411, T366, L368 o S400. La modificación de aminoácidos en la posición F405 es F405A, F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W. La modificación de aminoácidos en la posición K392 es K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. La modificación de aminoácidos en la posición T411 es T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. La modificación de aminoácidos en la posición S400 es S400E, S400D, S400R o S400K. La modificación de aminoácidos en la posición T366 es T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. La modificación de aminoácidos en la posición L368 es L368D, L368R, L368T, L368M, L368V, L368F, L368S y L368A.

En otra realización se proporciona un heteromultímero aislado de la invención que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende una modificación de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos T394W. En un aspecto, el segundo polipéptido de dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos T366L o T366I.

Se describe en ciertos aspectos un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende al menos una de las modificaciones de aminoácidos Y349C, F405A y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W.

Se describe en ciertos aspectos un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos K392M y T394W, y una de T366L y T366i.

Se describe en ciertos aspectos un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos T366L y T394W.

Se describe en ciertos aspectos un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un primer polipéptido de dominio CH3 que comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y un segundo polipéptido de dominio CH3 comprende las modificaciones de aminoácidos T366I y T394W.

En ciertas realizaciones del heteromultímero se proporciona un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico.

En otra realización se proporciona una composición que comprende un heteromultímero de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización se proporciona una célula hospedadora que comprende ácido nucleico que codifica el heteromultímero de la invención.

En ciertas realizaciones se proporciona un heteromultímero, en donde el heteromultímero comprende al menos un anticuerpo terapéutico. En un aspecto el anticuerpo terapéutico se selecciona del grupo que consiste en abagovomab, adalimumab, alemtuzumab, aurograb, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, briakinumab, canakinumab, catumaxomab, certolizumab pegol, cetuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, galiximab, ozogamicina de gemtuzumab, golimumab, tiuxetano de ibritumomab, infliximab, ipilimumab, lumiliximab, mepolizumab, motavizumab, muromonab, mycograb, natalizumab, nimotuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, tocilizumab/atlizumab, tositumomab, trastuzumab, ProxiniumTM, RencarexTM, ustekinumab, y zalutumumab.

En otra realización del heteromultímero de la invención se proporciona un método para tratar cáncer en un paciente que tiene un cáncer caracterizado por un antígeno de cáncer, comprendiendo dicho método administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un heteromultímero.

En otra realización del heteromultímero de la invención se proporciona un método para tratar trastornos inmunitarios en un paciente que tenga un trastorno inmunitario caracterizado por un antígeno inmunitario, comprendiendo dicho método administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un heteromultímero.

En ciertos aspectos, la región Fc modificada utilizada en las construcciones de heteromultímeros descritas en el presente documento comprende inmunoglobulinas de tipo G, por ejemplo inmunoglobulinas que se definen como inmunoglobulinas de clase 2 (IgG2) o inmunoglobulinas de clase 3 (IgG3). En algunos aspectos, la región Fc modificada utilizada en las construcciones de heteromultímero descritas en el presente documento comprende inmunoglobulina M o IgM. En algunos aspectos, la región Fc modificada utilizada en las construcciones de heteromultímero descritas en el presente documento comprende Inmunoglobulina A, o IgA. En algunos aspectos, la región Fc modificada utilizada en las construcciones de heteromultímero descritas en el presente documento comprende inmunoglobulina D o IgD. En algunos aspectos, la región Fc modificada utilizada en las construcciones de heteromultímero descritas en el presente documento comprende inmunoglobulina E o IgE. En ciertos aspectos, la región Fc utilizada en las construcciones de heteromultímero descritas en el presente documento comprende todos los casos de isotipos de inmunoglobulinas G, por ejemplo inmunoglobulinas que se definen como inmunoglobulinas de clase 1 (IgG1), clase 2 (IgG2), clase 3 (IgG3) o clase 4 (IgG4).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una estructura tridimensional gráfica de un anticuerpo de tipo silvestre que muestra las regiones CH3 (superior), CH2 (media) y receptora. El rectángulo de línea discontinúa en el lado izquierdo se expande al lado derecho mostrando dos regiones, Región 1 y Región 2, del área diana de CH3;

La Figura 2 es una representación tridimensional gráfica que muestra el

de tipo silvestre en la posición 368;

La Figura 3 es una representación tridimensional gráfica de la Región 1 que muestra la posición mutada 368;

La Figura 4 es una representación tridimensional gráfica de mutaciones adicionales en la Región 2;

La Figura 5 es una tabla de cálculos por ordenador para puntuación de choque, diferencia de área de interfaz, diferencia de empaquetamiento, diferencia de energía electrostática y "puntuación de afinidad" general para las tres primeras variantes AZ1, AZ2 y AZ3;

La Figura 6 muestra una imagen tridimensional gráfica que muestra las variantes AZ2 y AZ3, que se basan en la variante AZ1;

La Figura 7 muestra representaciones tridimensionales gráficas de las variantes AZ2 y AZ3;

La Figura 8 muestra una tabla como en la Figura 5 pero para heterodímeros de AZ1, AZ2 y AZ3, y homodímeros potenciales. No se muestra la puntuación de afinidad para homodímeros, ya que no es relevante;

La Figura 9 es una representación gráfica de una representación tridimensional de AZ4 de tipo silvestre (izquierda) y mutada (derecha);

La Figura 10 es una tabla como en la Figura 5 que muestra cálculos por ordenador para heterodímero y homodímeros potenciales de AZ4;

La Figura 11 es una representación gráfica de las variantes de CH3 AZ5 (izquierda) y AZ6 (derecha);

La Figura 12 es una tabla como se ha descrito para la Figura 5 que muestra datos por ordenador para AZ4, AZ5 y AZ6;

La Figura 13 es una representación tridimensional gráfica de un anticuerpo en la izquierda, con un dibujo de las posibilidades de características de unión en la región receptora usando un enfoque heterodimérico;

La Figura 14 es una representación esquemática de la molécula de IgG;

La Figura 15 muestra múltiples alineamientos de secuencia de receptores Fcy. ID de Secuencia de Genebank/Uniprot: FcyRIIA (sp P12318), FcyRIIB (sp P31994), FcyRIIC (gi 126116592), FcyRMIA (sp P08637), FcyRMIB (sp O75015); La Figura 16 es un esquema de la estructura cristalina del Complejo Fc-FcyRIIIb [PDB ID: 1T83, Radaev y Sun]. Se observa un complejo 1:1 del Fc y receptor Fcy con un contacto asimétrico entre las dos cadenas de Fc y el FcyR; La Figura 17 muestra un esquema de moléculas multifuncionales basadas en el armazón de Fc asimétrico formado por variantes heterodiméricas descritas en el presente documento: Armazón de Fc Asimétrico y Brazo de IgG Monomérico - Fc Asimétrico;

La Figura 18 muestra un esquema de moléculas multifuncionales basadas en el armazón de Fc asimétrico formado por variantes heterodiméricas descritas en el presente documento: Brazos IgG Monoespecíficos -Fc Asimétrico y Brazos IgG Biespecíficos - Fc Asimétrico (Cadena Ligera Común);

La Figura 19 muestra una ilustración de moléculas multifuncionales basadas en el armazón de Fc asimétrico formado por variantes heterodiméricas descritas en el presente documento: Brazos IgG Biespecíficos - Fc Asimétrico y una molécula funcional tal como toxina;

La Figura 20 ilustra moléculas multifuncionales basadas en el armazón de Fc asimétrico formado por variantes heterodiméricas descritas en el presente documento: Brazo de scFv sencillo - Fc Asimétrico y Brazos de scFv biespecíficos - Fc Asimétrico;

La Figura 21 ilustra moléculas multifuncionales alternativas basadas en el armazón de Fc asimétrico formado por las variantes heterodiméricas descritas en el presente documento: Brazos de scFv T riespecíficos - Fc Asimétrico y Brazos de scFv tetraespecíficos -Fc Asimétrico;

La Figura 22 presenta un diseño asimétrico de mutaciones en una cara del Fc para mejor selectividad de FcyR, que introduce un lado productivo para las interacciones de FcyR y un lado no productivo con interacciones parecidas a las de tipo silvestre. Pueden introducirse mutaciones en la cara no productiva del Fc para bloquear interacciones con FcR y polarización del Fc para interaccionar solo en la cara productiva.

La Figura 23 muestra la secuencia de aminoácidos para IgG1 humana de tipo silvestre.

La Figura 24 muestra el proceso por iteraciones del diseño heterodimérico de Fc, que combina estrategias de diseño positivas y negativas como se describe en detalle posteriormente.

Las Figuras 25A a 25C muestran el ensayo in vitro usado para determinar la pureza del heterodímero. El ensayo se basa en un armazón de anticuerpo monoespecífico de longitud completa con dos cadenas pesadas de Fc de peso molecular diferente; la cadena Pesada A tiene un Marcador His C terminal (His) y la cadena pesada B un Marcador mRFP escindible, C terminal (RFP). Las dos cadenas pesadas A (His) y B (RFP) se expresan en relaciones relativas diferentes junto con una cantidad fija de cadena ligera, dando lugar a tres posibles especies de dímeros con diferente peso molecular: a) Homodímero de Cadena A (His)/ Cadena A (His) (~150 kDa); b) Heterodímero de Cadena A (His)/Cadena B (RFP) (~175 kDa); c) Homodímero de Cadena B (RFP)/Cadena B (RFP) (~200 kDa). Después de la expresión, como se describe en el Ejemplo 2, se determinó la relación de heterodímero frente a los dos homodímeros por SDS-PAGE no reductor, lo que permite la separación de las 3 especies diméricas por peso molecular. Se tiñeron geles de SDS-PAGE con Azul Brillante de Coomassie. Figura 25A: las variantes ensayadas fueron Cadena A TS (His) solamente; cadena B TS (RFP) solamente; cadena A (His) más cadena B (RFP) TS; cadena A (His) más cadena B (RFP) de Control 1, que tiene una pureza heterodimérica indicada de >95 %. La composición de las bandas de dímeros se verificó por Transferencia Western con anticuerpos dirigidos contra el IgG-Fc (anti Fc), el Marcador de mRFP (anti mRFP) y el Marcador de His (anti His), como se ha ilustrado anteriormente. El SDS-PAGE muestra una única banda para el homodímero His/His, una banda doble para el heterodímero His/RFP y múltiples bandas para el homodímero de RFP. Las bandas múltiples son un artefacto del Marcador de mRFP y se ha confirmado que no influyen en las propiedades físicas del heterodímero de Fc. Figura 25B: el ensayo de SDS-PAGE se validó con las variantes de heterodímero de Fc publicadas Controles 1 a 4 como controles. Véase, Tabla A. Las variantes se expresaron con diferentes relaciones relativas de la cadena A (His) frente a la cadena B (RFP): específicamente, la Relación 1:3 es equivalente a una relación de LC, HC_His, HC_mRFP de 25 %, 10 %, 65 %; Relación 1:1 de 25 %, 20 %, 55 % y Relación 3:1 de 25 %, 40 %, 35 % respectivamente (se ha determinado que la expresión aparente 1:1 de cadena A (His) y cadena B (RFP) es cercana al 20 %/55 % (His/RFP) para Fc TS). La Figura 25C muestra un ensayo de SDS-PAGE no reductor para determinar la pureza heterodimérica de variantes del Armazón 1. Las variantes de Fc se expresaron con relaciones relativas diferentes de la cadena A (His) frente a la cadena B (RFP) y se analizaron por SDS-PAGE no reductor como se describe en la Figura 2. Específicamente, la Relación 1:3 es equivalente a una relación de LC, HC_His, HC_mRFP del 25 %, 10 %, 65 %; Relación 1:1 de 25 %, 20 %,55 % y Relación 3:1 de 25 %, 40 %, 35 % respectivamente (se ha determinado que la expresión aparente 1:1 de cadena A (His) y cadena B (RFP) es cercana al 20 %/55 % (His/RFP) para Fc TS).

Las Figuras 26A a 26B muestran variantes heterodiméricas de Fc expresadas con una relación específica de cadena A (His) frente a cadena B (RFP) (Véase, Tabla 2), purificadas por cromatografía de afinidad de proteína A y analizadas por SDS-PAGE no reductor como se describe en las Figuras 25A a 25C. La Figura 26A ilustra la clasificación de heterodímeros basándose en la pureza como se observa por inspección visual de los resultados de SDS-PAGE. Para comparación se cargó la cantidad equivalente de producto purificado de Proteína A en el gel. Esta definición de pureza basada en SDS-PAGE no reductor se ha confirmado por Cl/EM en variantes seleccionadas (véase la Figura 28). La Figura 26B proporciona resultados de SDS-PAGE ilustrativos de variantes heterodiméricas purificadas de Proteína A seleccionada (AZ94, AZ86, AZ70, AZ33 y AZ34).

Las Figuras 27A a 27B ilustran análisis de DSC para determinar la temperatura de fusión del dominio CH3-CH3 heterodimérico formado por las variantes heterodiméricas descritas en el presente documento. Se usaron dos métodos independientes para determinar las temperaturas de fusión. La Figura 27A proporciona termogramas ajustados a 4 transiciones independientes no de 2 estados y optimizados para producir valores para las transiciones de CH2 y Fab cercanos a los valores indicados en la bibliografía para Herceptina de ~72 °C (CH2) y ~82 °C (Fab). La Figura 27B muestra que los termogramas corregidos para línea basal y normalizados para las variantes heterodiméricas se restaron del TS para producir un pico de diferencia positiva y negativa para solamente la transición de CH3.

La Figura 28 ilustra el análisis de CL/EM de la variante de ejemplo AZ70 como se describe en el ejemplo 2. Se indican las masas esperadas (media calculada) para el heterodímero y los homodímeros glucosilados. La región coherente con la masa heterodimérica contiene picos importantes correspondientes a la pérdida de una glicina (-57 Da) y la adición de 1 o 2 hexosas (+162 Da y 324 Da, respectivamente). La pureza de1Heterodímero se clasifica como >90 % si no hay picos significativos correspondientes a ninguno de los homodímeros.

Las Figuras 29A a 29D muestran la interfaz de CH3 de Fig29A TS Fc; Fig29B AZ6; Fig29C AZ33; Fig29D AZ19. El análisis por ordenador exhaustivo, como se describe en la sección de descripción detallada, y la comparación de las variantes con el TS indicaron que una de las razones para la estabilidad inferior a TS del heterodímero AZ33 inicial es la pérdida de la interacción/empaquetamiento del núcleo de Y407 y T366. El AZ33 inicial muestra empaquetamiento no óptimo en este núcleo hidrófobo como se ilustra en la Figura 29B, lo que sugiere que la optimización de esta región, particularmente en la posición T366 mejoraría la estabilidad de AZ33. Esto se ilustra en la Figura 29C y Figura 29D con T366I y T366L. Los datos experimentales se correlacionan con este análisis estructural y muestran que T366L proporciona la mayor mejora de Tm. Véase, Ejemplo 5.

La Figura 30 ilustra la utilidad e importancia del análisis de dinámica conformacional, ejemplificado en la variante AZ8 del armazón 1 inicial. La estructura después de mutagénesis por ordenador (conformación de cadena principal cercana a TS) se superpone con una estructura representativa de un análisis de simulación de Dinámica Molecular de 50 ns. La Figura destaca la gran diferencia conformacional en la región del bucle D399-S400 de la variante AZ8 frente a TS, que a su vez expone el núcleo hidrófobo al disolvente y provoca estabilidad reducida del heterodímero AZ8.

Las Figuras 31A a 31C ilustran cómo la información del análisis por ordenador exhaustivo y la simulación de MD se usaron en la estrategia de diseño positivo descrita. Como se ilustra en la Figura 30, una de las razones para la estabilidad inferior a TS de AZ8 es la interacción debilitada del bucle 399-400 a 409, que se debe principalmente a la pérdida de las interacciones de empaquetamiento de F405 (véase comparación de Figura 31A (TS) frente a Figura 31B (AZ8)). Una de las estrategias de diseño positivo fue la optimización del empaquetamiento hidrófobo de área, para estabilizar la conformación del bucle 399 a 400. Esto se consiguió por la mutación K392M que se ilustra en la Figura 31C. La Figura 31C representa el heterodímero AZ33, que tiene una Tm de 74 °C frente a 68 °C de la variante de diseño negativo inicial AZ8.

Las Figuras 32A a 32B ilustran la dinámica de la molécula de Fc observada usando análisis de componentes principales de una trayectoria de dinámica molecular. La Figura 32A muestra un seguimiento de cadena principal de la estructura de Fc como referencia. La Figura 32B y C representan una superposición de dinámicas observadas a lo largo de los dos modos de movimiento principales superiores en la estructura de Fc. Los dominios CH2 de la cadena A y B muestran movimiento de apertura/cierre significativo entre sí mientras que los dominios CH3 son relativamente rígidos. Las mutaciones en la interfaz de CH3 influyen en la flexibilidad y dinámica relativa de este movimiento de apertura/cierre en los dominios CH2.

Las Figuras 33A a 33C ilustran el empaquetamiento de núcleo hidrófobo de dos variantes de Armazón 2 frente a TS.

Fig 33A TS Fc; Fig 33B AZ63; y Fig 33C AZ70. El análisis por ordenador exhaustivo de la variante de Armazón 2 inicial sugirió que la pérdida de las interacciones de TS del núcleo de Y407-T366 es una de las razones para la estabilidad inferior a TS para las variantes de Armazón 2 iniciales. La pérdida de Y407-T366 se compensa parcialmente por las mutaciones K409F, pero como se ilustra en la Figura 33B, particularmente la mutación T366A deja una cavidad en el núcleo hidrófobo, que desestabiliza la variante frente a TS. La dirección a este núcleo hidrófobo de mutaciones adicionales T366V_L351Y, como se muestra por la variante de Fc AZ70 en la Figura 33C, resultó ser exitosa; AZ70 tiene una Tm determinada de forma experimental de 75,5 °C. Véase, Tabla 4 y Ejemplo 6.

Las Figuras 34A a 34C ilustran las interacciones del bucle 399-400 de dos variantes de Armazón 2 frente al TS: Fig 34A TS Fc; Fig 34B AZ63; y Fig 34C AZ94. El análisis por ordenador exhaustivo de la variante de Armazón 2 inicial sugirió que la pérdida del enlace salino de TS K409-D399 (Figura 34A) debido a la mutación K409F y la D399 de este modo no satisfecha (Figura 34B) provoca una conformación más "abierta" del bucle 399-400. Esto conduce además a una mayor exposición a disolvente del núcleo hidrófobo y una mayor desestabilización de la variante frente a TS. Una de las estrategias empleadas para estabilizar el bucle 399-400 y compensar la pérdida de la interacción K409-D399 fue el diseño de enlaces salinos adicionales D399R-T411E y S400R-K392E como se ilustra en la Figura 34C para la variante AZ94. Los datos experimentales mostraron una pureza de >95 % y Tm de 74 °C. Véase, Tabla 4 y Ejemplo 6. Además, aunque AZ94 tiene una pureza y estabilidad considerablemente superiores en comparación con la variante de Armazón 2 inicial (pureza <90 %, Tm 71 °C), las mutaciones de núcleo hidrófobo de AZ94 se prefieren menos que las "mejores" puntuaciones de núcleo hidrófobo identificadas en la variante AZ70 (Figura 33). Dado que las mutaciones en el núcleo hidrófobo en AZ70 (T366V_L351Y) están distantes de las mutaciones de enlace salino de AZ94 en el bucle 399-400, se espera que la combinación de mutaciones de aminoácidos de AZ70 y las mutaciones de AZ94 adicionales, tengan una temperatura de fusión superior a AZ70 o AZ94. Esta combinación puede ensayarse como se describe en los Ejemplos 1 a 4.

La Figura 35 ilustra la constante de asociación (Ka (M_1)) de Fc IgG1 homodimérico, las variantes heterodiméricas hetl (Control 1): A:Y349C_T366S_L368A_Y407V/B:S354C_T366W y het2 (Control 4): A:K409D_K392D/B:D399K_D356K que se unen con los seis receptores Fcgamma. Las variantes de Fc heterodiméricas tienden a mostrar unión ligeramente alterada con los receptores Fcgamma en comparación con el Fc IgG1 de tipo silvestre. Véase, Ejemplo 7.

La Figura 36A muestra la fuerza de unión relativa de un Fc IgG1 de tipo silvestre y sus diversas formas mutantes homodiméricas y asimétricas con los receptores IIbF, IIBY y IIaR, basándose en la fuerza de unión de tipo silvestre como referencia (Homo Fc S267D) se refieren a la fuerza de unión de un Fc homodimérico con la mutación S267D en ambas cadenas. (Het Fc asym S267D) se refiere a la fuerza de unión de un Fc heterodimérico con la mutación S267D introducida en una de las cadenas en Fc. Se presenta la media de la fuerza de unión obtenida introduciendo la mutación en una de las dos cadenas Fc. La introducción de esta mutación en una cadena redujo la fuerza de unión a aproximadamente la mitad de la fuerza observada para la misma mutación de una manera homodimérica. La (Het Fc asym S267D asym E269K) se refiere a la fuerza de unión de un Fc heterodimérico con las mutaciones tanto S267D como E269K introducidas de una manera asimétrica en una de las dos cadenas de Fc. La mutación E269K bloquea la interacción del FcgR con una de las caras del Fc y es capaz de reducir la fuerza de unión en aproximadamente la mitad de lo que se observó para la variante S267D asimétrica (Het Fc+S267D) por sí sola. El Fc Het comprende aquí mutaciones de CH3 como se indica para la variante het2 (Control 4) en la Figura 35.

La Figura 36B muestra la constante de asociación (Ka (M’1)) de diversos Fc y sus variantes con varios alotipos FcgRIIa, FcgRIIb y FcgRIIIa. La Ka de Fc IgG1 de tipo silvestre por diversos receptores Fcg está representada como columnas con sombreado horizontal. Las barras con sombreados verticales (base homodimérica 2) representa la Ka de Fc homodimérico con las mutaciones S239D/D265S/I332E/S298A. Las columnas con el sombreado inclinado representan la Ka de Fc heterodimérico con mutaciones asimétricas A:S239D/D265S/I332E/E269K y B:S239D/D265S/S298A en el dominio CH2. La introducción de mutaciones asimétricas puede conseguir selectividad aumentada entre los receptores Illa y Ila/IIb. El Fc heterodimérico comprende aquí mutaciones de CH3 como se indica para la variante het2 (Control 4) en la Figura 35.

La Figura 36C muestra la constante de asociación (Ka (M-1)) para IgG1 de tipo silvestre y otras tres variantes que implican mutaciones homodiméricas o asimétricas en el dominio CH2 de la región Fc. La Ka de Fc de tipo silvestre se representa en la columna sombreada en rejilla. La Ka de la variante de Fc con la mutación base S239D/K326E/A330L/I332E/S298A introducida de una manera homodimérica (base homodimérica 1) en ambas cadenas de Fc se muestra con la columna en patrón inclinado. La introducción de mutaciones relacionadas de una manera asimétrica en las cadenas A y B de un Fc heterodimérico (base hetero 1) se muestra con las líneas horizontales. La columna con líneas sombreadas verticales representa la variante asimétrica que incluye la mutación E269K (base hetero 1+PD). El Fc heterodimérico comprende aquí mutaciones de CH3 como se indica para la variante het2 (Control 4) en la Figura 35.

La Figura 37 - Tabla 6 es una lista de dominios CH3 variantes basados en la tercera fase de diseño como se describe en el Ejemplo 5 para el Armazón 1.

La Figura 38 - Tabla 7 es una lista de dominios CH3 modificados basados en la tercera fase de diseño como se describe en el Ejemplo 6 para el Armazón 2.

La Figura 39A a 39B ilustra determinación de pureza de variantes sin ningún marcador C terminal usando CL/EM. La Figura 39A muestra los espectros de CL/EM de una variante representativa (AZ162: L351Y_F405A_Y407V / T366L_K392L_T394W). La variante se expresó por coexpresión transitoria como se describe en los Ejemplos usando 3 diferentes relaciones de Cadena Pesada A y Cadena Pesada B de 1:1,5 (AZ133-1), 1:1 (AZ133-2) y 1,5:1 (AZ133-3). Las muestras se purificaron y se desglucosilaron con Endo S durante 1 hora a 37 °C. Antes del análisis de MS las muestras se inyectaron en una columna Poros R2 y se eluyeron en un gradiente con ACN de 20 a 90 %, FA 0,2 % en 3 minutos. El pico de la columna LC se analizó con un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap XL (Tensión de Cono: 50 V, lente de Tubo: 215 V; Resolución FT: 7.500) y se integró con el software Promass para generar perfiles de peso molecular. La Figura 39B muestra los espectros de CL/EM de la muestra de Control 2 que representa la variante de Botón en Ojal. La variante se expresó por coexpresión transitoria como se describe en los Ejemplos usando 3 diferentes relaciones de Cadena Pesada A y Cadena Pesada B de 1:1,5 (Control 2-1), 1:1 (Control 2-2) y 1,5:1 (Control 2-3). Las muestras se purificaron y desglucosilaron con Endo S durante 1 hora a 37 °C. Antes del análisis de MS las muestras se inyectaron en una columna Poros R2 y se eluyeron en un gradiente con ACN 20 a 90 %, FA 0,2 % en 3 minutos. El pico de la columna LC se analizó con un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap XL (Tensión de Cono: 50 V, lente de Tubo 215 V; Resolución FT: 7.500) y se integró con el software Promass para generar perfiles de peso molecular.

Figuras 40A a 40B. Se demostró unión biespecífica usando un heterodímero de Fc scFv anti HER2 y anti HER3 fusionado con el extremo N terminal de la Cadena A y la Cadena B del heterodímero de Fc. Las variantes resultantes variante HER2/HER3 biespecífica y las dos variantes HER2, HER3 monoespecíficas monovalentes se ilustran en la Figura 40-A (Cadena A en gris oscuro; Cadena B en gris claro). La Figura 40-B demuestra un ensayo de unión biespecífica.

La Figura 41 ilustra un modelo computacional que compara Fc IgG1 de tipo silvestre y AZ3003. El modelo computacional para AZ3002 es el mismo que para AZ3003 en la posición T350. La tabla resume las variantes heterodiméricas seleccionadas y el efecto estabilizador de la mutación T350V en la temperatura de fusión de CH3. La Figura muestra que las variantes Heterodiméricas se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 11. Se realizó DSC como se detalla en el Ejemplo 3 y se realizó cuantificación CL/EM como se detalla en el Ejemplo 11.

La Figura 42 ilustra una comparación de la estructura cristalina y el modelo predicho del heterodímero candidato. Los restos de la interfaz mutada (indicados en la tabla) se resaltan en la presentación ilustrada.

La Figura 43 representa el análisis del patrón de glucosilación del heterodímero candidato purificado.

La Figura 44 ilustra los resultados de la evaluación de degradación forzada del heterodímero candidato purificado.

La Figura 45 representa un esquema del proceso de purificación de anticuerpos convencional en la industria.

La Figura 46 representa un compendio de la evaluación de purificación corriente abajo de la variante heterodimérica AZ3003 que muestra rendimientos por etapas y recuperación (véase Ejemplo 15 para detalles). El heterodímero se produjo en 10 l de CHO transitorias como se describe en detalle en el Ejemplo 11.

Descripción detallada

Se proporcionan en el presente documento dominios CH3 modificados que comprenden modificaciones de aminoácidos específicas para promover la formación de heteromultímeros. En una realización, los dominios CH3 modificados comprenden modificaciones de aminoácidos específicas para promover la formación de heterodímeros (Véase, por ejemplo, Tablas 1.1 a 1.3). Descrito en ciertos aspectos, los dominios CH3 modificados comprenden modificaciones de aminoácidos específicas para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada (Véase, por ejemplo, Tabla 4, Tabla 6 y Tabla 7). La estabilidad se mide como la temperatura de fusión (Tm) del dominio CH3 y una estabilidad aumentada se refiere a una Tm de aproximadamente 74 °C o superior. Los dominios CH3 forman parte de la región Fc de un anticuerpo heteromultimérico, multiespecífico. Se proporcionan en el presente documento en una realización heteromultímeros que comprenden una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros en donde los dominios CH3 modificados se seleccionan de las variantes enumeradas en la Tabla 1.

Las modificaciones de aminoácidos utilizadas para generar un dominio CH3 modificado incluyen, pero no se limitan a, inserciones, deleciones, sustituciones y reordenaciones de aminoácidos. Las modificaciones del dominio CH3 y los dominios CH3 modificados se denominan en el presente documento de forma colectiva "modificaciones de CH3", "dominios CH3 modificados", "dominios CH3 modificados" o "variantes de CH3". En ciertas realizaciones, los dominios CH3 modificados se incorporan en una molécula elegida. En consecuencia, en una realización se proporcionan moléculas, por ejemplo polipéptidos, tales como inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos) y otras proteínas de unión, que comprenden una región Fc (como se usa en el presente documento "región Fc" y expresiones similares abarcan cualquier dominio de región constante de cadena pesada que comprenda al menos un dominio CH3) que incorpora un dominio CH3 modificado. Las moléculas que comprenden regiones Fc que comprenden un dominio CH3 modificado (por ejemplo, un dominio CH3 que comprende una o más inserciones, deleciones, sustituciones o reordenamientos de aminoácidos) se denominan en el presente documento "variantes de Fc", "heterodímeros" o "heteromultímeros". Las presentes variantes de Fc comprenden un dominio CH3 que se ha modificado de forma asimétrica para generar variantes o regiones Fc heterodiméricas. La región Fc comprende dos polipéptidos de dominio constante de cadena pesada - Cadena A y Cadena B, que pueden usarse de forma intercambiable siempre que cada región Fc comprenda un polipéptido de Cadena A y uno de Cadena B. Las modificaciones de aminoácidos se introducen en el CH3 de una manera asimétrica dando como resultado un heterodímero cuando dos dominios CH3 modificados forman una variante de Fc (Véase, por ejemplo, Tabla 1). Como se usa en el presente documento, las modificaciones de aminoácidos asimétricas son cualquier modificación en donde un aminoácido en una posición específica en un polipéptido (por ejemplo, "Cadena A") es diferente del aminoácido en el segundo polipéptido (por ejemplo, "Cadena B") en la misma posición del heterodímero o variante de Fc. Esto puede ser un resultado de la modificación de solamente uno de los dos aminoácidos o modificación de ambos aminoácidos a dos aminoácidos diferentes de Cadena A y Cadena B de la variante de Fc. Se entiende que los dominios CH3 modificados comprenden una o más modificaciones de aminoácidos asimétricas.

Un aminoácido que está en la interfaz entre el primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 es cualquier aminoácido en el primer o el segundo polipéptido de dominio CH3 que interacciona con un aminoácido en el otro polipéptido de dominio CH3 dando como resultado la formación del dominio CH3 dimérico. Un aminoácido que no está en la interfaz entre el primer y dicho segundo polipéptidos de dominio CH3 es cualquier aminoácido en el primer o el segundo polipéptidos de dominio CH3 que no interacciona con un aminoácido en el otro polipéptido de dominio CH3. En realizaciones descritas en el presente documento, un aminoácido modificado que no está en la interfaz entre el primer y dicho segundo polipéptidos de dominio CH3 es cualquier aminoácido en el primer o el segundo polipéptido de dominio CH3 que después de modificarse como se describe en el presente documento, no interacciona con un aminoácido en el otro polipéptido de dominio CH3. Por ejemplo, en ciertas realizaciones descritas en el presente documento, se proporcionan modificaciones de la posición de aminoácido T350. Como se demuestra por la estructura cristalina proporcionada en el Ejemplo 12 y mostrada en la Figura 42, T350 no está implicado en las interacciones entre los dos polipéptidos de dominio CH3. Se ha mostrado que cualquier modificación de T350 tiene una influencia insignificante en la formación de los dímeros de CH3, como se describe en Carter et al. Biochemistry 1998, 37, 9266. En las construcciones de Fc heteromultiméricas descritas en el presente documento, se vio que las modificaciones en las posiciones T350 tenían un efecto estabilizador inesperado en los dominios CH3 variantes a pesar de no estar implicadas directamente en la formación del dímero de CH3 en sí mismo. Por ejemplo, variantes que comprenden al menos una modificación T350X, en donde X es un aminoácido natural o no natural seleccionado de valina, isoleucina, leucina, metionina y derivados o variantes de los mismos forman dominios CH3 variantes muy estables. En algunas realizaciones descritas en el presente documento se aíslan construcciones de Fc heteromultiméricas descritas en el presente documento, que comprenden al menos una modificación T350V. En ciertas realizaciones, el primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 variantes comprenden la modificación T350V que confiere estabilización inesperada al dominio CH3 variante en comparación con el dominio CH3 correspondiente que no comprende la modificación.

En la presente descripción, se entiende que cualquier intervalo de concentraciones, intervalo de porcentajes, intervalo de relaciones o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo indicado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tal como un décimo y un centésimo de un número entero), a no ser que se indique de otro modo. Como se usa en el presente documento "aproximadamente" significa 10 % del intervalo, valor, secuencia o estructura indicado, a no ser que se indique de otro modo. Debería entenderse que el término "un" como se usa en el presente documento se refiere a "uno o más" de los componentes enumerados a no ser que se indique o se dicte de otro modo por su contexto. Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, "o") significa una, ambas o cualquier combinación de las mismas de las alternativas. Como se usa en el presente documento, los términos "incluir" y "comprender" se usan de forma sinónima. Además, debería entenderse que los polipéptidos monocatenarios individuales o heterodímeros derivados de diversas combinaciones de las estructuras y sustituyentes (por ejemplo, dominios CH3 modificados) descritos en el presente documento se divulgan por esta solicitud en el mismo grado que si cada polipéptido monocatenario o heterodímero se expusiera individualmente. Por lo tanto, la selección de componentes particulares para formar polipéptidos monocatenarios o heterodímeros individuales está dentro del alcance de la presente divulgación.

El "primer polipéptido" es cualquier polipéptido que vaya a asociarse con un segundo polipéptido, también denominado en el presente documento "cadena A". El primer y segundo polipéptido se encuentran en una "interfaz". El "segundo polipéptido" es cualquier polipéptido que vaya a asociarse con el primer polipéptido mediante una "interfaz", también denominada en el presente documento "Cadena B". La "interfaz" comprende los restos de aminoácidos "de contacto" en el primer polipéptido que interaccionan con uno o más restos de aminoácidos de "contacto" en la interfaz del segundo polipéptido. Como se usa en el presente documento, la interfaz comprende el dominio CH3 de una región Fc que preferentemente deriva de un anticuerpo IgG y más preferentemente un anticuerpo IgG1humano.

Como se usa en el presente documento, heteromultímero "aislado" significa un heteromultímero que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente de cultivo celular natural. Son componentes contaminantes de su ambiente natural materiales que interferirían con usos de diagnóstico o terapéuticos para el heteromultímero, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos.

Un aminoácido con un volumen de cadena lateral "no sustancialmente mayor" que un primer aminoácido es cualquier aminoácido que tenga un volumen de cadena lateral no más de 20 A3 mayor que el primer aminoácido basándose en valores de volumen de cadena lateral de A. A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24: 107-123, 1972. En ciertas realizaciones, el volumen no es más de 10 A3 mayor que el primer aminoácido. En algunas realizaciones, el volumen no es más de 5 A3 mayor que el primer aminoácido. Por ejemplo en ciertas realizaciones descritas en el presente documento, hay mutaciones de lisina (K) tales como K392J en donde J se selecciona de L, I.

Los heterodímeros de Fc variantes se purifican generalmente hasta homogeneidad sustancial. Las frases "sustancialmente homogéneo", "forma sustancialmente homogénea" y "homogeneidad sustancial" se usan para indicar que el producto está sustancialmente desprovisto de productos secundarios originados de combinaciones polipeptídicas indeseadas (por ejemplo homodímeros). Expresado en términos de pureza, la homogeneidad sustancial significa que la cantidad de productos secundarios no excede el 10 %, y preferentemente es inferior al 5 %, más preferentemente inferior al 1 %, más preferentemente inferior al 0,5 %, en donde los porcentajes están en peso.

Se da a expresiones entendidas por los expertos en la materia de la tecnología de anticuerpos el significado adquirido en la técnica, a no ser que se definan expresamente de forma diferente en el presente documento. Se sabe que los anticuerpos tienen regiones variables, una región bisagra y dominios constantes. Se revisan la estructura y función de inmunoglobulina, por ejemplo, en Harlow etal., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).

El diseño de diversos heterodímeros de Fc variantes a partir de homodímeros de tipo silvestre se ilustra por el concepto de diseño positivo y negativo en el contexto de ingeniería proteica equilibrando estabilidad frente a especificidad, en donde se introducen mutaciones con el objetivo de conducir la formación de heterodímeros sobre la formación de homodímeros cuando los polipéptidos se expresen en condiciones de cultivo celular. Las estrategias de diseño negativas maximizan interacciones desfavorables para la formación de homodímeros, introduciendo cadenas laterales voluminosas en una cadena y cadenas laterales pequeñas en la opuesta, por ejemplo la estrategia de botón en ojal desarrollada por Genentech (Ridgway JB, Presta LG, Cárter P. 'Knobs-into-holes' engineering of antibody c H3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. Jul 1996; 9(7): 617 a 21; Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Cárter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J Mol Biol. 270(1): 26 a 35 (1997))), o por ingeniería electrostática que conduce a la repulsión de la formación de homodímeros, por ejemplo la estrategia de dirección electrostática desarrollada por Amgen (Gunaskekaran K, et al. Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG. JBC 285 (25): 19637 a 19646 (2010)). En estos dos ejemplos, se introdujeron mutaciones puntuales asimétricas de diseño negativo en el dominio CH3 de tipo silvestre para conducir la formación de heterodímeros. Hasta la fecha, solamente se han usado estrategias de diseño negativo para desarrollar heterodímeros de Fc. Los resultados publicados muestran que los heterodímeros diseñados usando solamente un enfoque de diseño negativo conducen a alta especificidad con >95 % de los heterodímeros, pero desestabiliza el complejo considerablemente (mencionado anteriormente). Estos heterodímeros de diseño negativo poseen una temperatura de fusión del dominio CH3 modificado, de 69 °C o inferior, sin enlaces disulfuro adicionales en comparación con el tipo silvestre. Véase, Tabla A a continuación.

T l A: An i r h r ím r F li .

A diferencia del diseño negativo, un concepto general usado para modificar por ingeniería genética proteínas es el diseño positivo. En este caso se introducen modificaciones de aminoácidos en polipéptidos para maximizar las interacciones favorables dentro de o entre proteínas. Esta estrategia asume que cuando se introducen múltiples mutaciones que estabilizan específicamente el heterodímero deseado ignorando el efecto en los homodímeros, el efecto neto será mejor especificidad para las interacciones heterodiméricas deseadas sobre los homodímeros y por lo tanto una mayor especificidad heterodimérica. Se entiende en el contexto de la ingeniería proteica que las estrategias de diseño positivo optimizan la estabilidad de las interacciones proteicas deseadas, pero en pocas ocasiones alcanzan >90 % de especificidad (Havranek JJ y Harbury PB. Automated design of specificity in molecular recognition. Nat Struct Biol. 10(1): 45 a 52 (2003); Bolon DN, Grant RA, Baker TA, Sauer RT. Specificity versus stability in computational protein design. Proc Natl Acad Sci USA. 6; 102(36): 12724-9 (2005); Huang Ps, Love JJ, Mayo SL. A de novo designed protein protein interface Protein Sci. 16(12): 2770-4 (2007)). Antes de la presente divulgación no se han usado estrategias de diseño positivo para diseñar heterodímeros de Fc ya que se ha prestado más atención a la especificidad en comparación con la estabilidad para la preparación y el desarrollo de anticuerpos terapéuticos. Además, puede ser difícil predecir mutaciones de diseño positivo beneficiosas. Se han intentado otras metodologías para mejorar la estabilidad, tales como enlaces disulfuro adicionales, para mejorar la estabilidad en heterodímeros de Fc con éxito limitado en mejoras para la molécula (véase Tabla A). Esto puede deberse a que todos los enlaces disulfuro del dominio CH3 de Fc modificados por ingeniería genética están expuestos al disolvente, lo que da como resultado un tiempo de vida más corto del enlace disulfuro y por lo tanto un impacto significativo en la estabilidad a largo plazo del heterodímero, especialmente cuando el dominio CH3 modificado por ingeniería genética tiene una Tm inferior a 70 °C sin el enlace disulfuro adicional (como en el Control 4 que tiene una Tm de 69 °C sin el disulfuro (véase Control 2). Se contempla que también pueden usarse otras metodologías para mejorar la estabilidad, tales como enlaces disulfuro, con las presentes variantes de Fc, siempre que la estabilidad intrínseca (medida como temperatura de fusión) del dominio CH3 sea 70 °C o superior sin el enlace disulfuro, en particular cuando la estabilidad intrínseca (medida como temperatura de fusión) del dominio CH3 sea 72 °C o superior sin el enlace disulfuro.

Por lo tanto, los inventores divulgan en el presente documento un nuevo método para diseñar heterodímeros de Fc que da como resultado formación de heterodímeros tanto estable como altamente específica. Este método de diseño combina estrategias de diseño tanto positivas como negativas junto con técnicas de ingeniería proteica dirigida por modelos computacionales. Este potente método ha permitido a los inventores diseñar nuevas combinaciones de mutaciones en el dominio CH3 de IgG1 en donde usando solamente condiciones de cultivo celular convencionales se formaron heterodímeros con más del 90 % de pureza en comparación con homodímeros y los heterodímeros resultantes tenían una temperatura de fusión de 70 °C o superior. En aspectos ilustrativos, los heterodímeros variantes de Fc tienen una temperatura de fusión de 73 °C o superior y una pureza superior al 98 %. En otros aspectos ilustrativos, los heterodímeros variantes de Fc tienen una temperatura de fusión de 75 °C o superior y una pureza superior al 90 %. En ciertas realizaciones de las variantes de Fc heterodiméricas descritas en el presente documento, los heterodímeros variantes de Fc tienen una temperatura de fusión de 77 °C o superior y una pureza superior al 98 %. En algunas realizaciones de las variantes de Fc heterodiméricas descritas en el presente documento, los heterodímeros variantes de Fc tienen una temperatura de fusión de 78 °C o superior y una pureza superior al 98 %. En ciertas realizaciones de las variantes de Fc heterodiméricas descritas en el presente documento, los heterodímeros variantes de Fc tienen una temperatura de fusión de 79 °C o superior y una pureza superior al 98 %. En ciertas realizaciones de las variantes de Fc heterodiméricas descritas en el presente documento, los heterodímeros variantes de Fc tienen una temperatura de fusión de 80 °C o superior y una pureza superior al 98 %. En ciertas realizaciones de las variantes de Fc heterodiméricas descritas en el presente documento, los heterodímeros variantes de Fc tienen una temperatura de fusión de 81 °C o superior y una pureza superior al 98 %.

En ciertas realizaciones, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de 74 °C o superior. Como se usa en el presente documento "estabilidad aumentada" o "heterodímero estable", se refiere a un dominio CH3 modificado, en formación heterodimérica, con una temperatura de fusión de aproximadamente 70 °C o superior. En ciertas realizaciones, "estabilidad aumentada" o "heterodímero estable" se refiere a un dominio CH3 modificado, en formación heterodimérica, con una temperatura de fusión de aproximadamente 74 °C o superior. En ciertas realizaciones, "estabilidad aumentada" o "heterodímero estable" se refiere a un dominio CH3 modificado, en formación heterodimérica, con una temperatura de fusión de aproximadamente 75 °C o superior. En ciertas realizaciones, "estabilidad aumentada" o "heterodímero estable" se refiere a un dominio CH3 modificado, en formación heterodimérica, con una temperatura de fusión de aproximadamente 76 °C o superior. En ciertas realizaciones, "estabilidad aumentada" o "heterodímero estable" se refiere a un dominio CH3 modificado, en formación heterodimérica, con una temperatura de fusión de aproximadamente 78 °C o superior. En ciertas realizaciones, "estabilidad aumentada" o "heterodímero estable" se refiere a un dominio CH3 modificado, en formación heterodimérica, con una temperatura de fusión de aproximadamente 79 °C o superior. En ciertas realizaciones, "estabilidad aumentada" o "heterodímero estable" se refiere a un dominio CH3 modificado, en formación heterodimérica, con una temperatura de fusión de aproximadamente 80 °C o superior. En ciertas realizaciones, "estabilidad aumentada" o "heterodímero estable" se refiere a un dominio CH3 modificado, en formación heterodimérica, con una temperatura de fusión de aproximadamente 81 °C o superior. Además, se entiende que la expresión "promover la formación de heterodímeros" se refiere en el presente documento a las mutaciones de aminoácidos en el dominio CH3 que dan como resultado más del 90 % de formación de heterodímeros en comparación con la formación de homodímeros.

En una realización adicional, esta estabilidad aumentada es en ausencia de un enlace disulfuro adicional. Específicamente, la estabilidad aumentada es en ausencia de un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3. En una realización, el dominio CH3 modificado no comprende un enlace disulfuro adicional en comparación con el dominio CH3 de tipo silvestre. En una realización alternativa, el CH3 modificado comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con el dominio CH3 de tipo silvestre, siempre que el CH3 modificado tenga una temperatura de fusión de 70 °C o superior en ausencia del enlace disulfuro. En una realización, el dominio CH3 modificado comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con el dominio CH3 de tipos silvestre, y el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 77,5 °C o superior. En una realización, el dominio CH3 modificado comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con el dominio CH3 de tipo silvestre, y el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 78 °C o superior. En otra realización, el dominio CH3 modificado comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con el dominio CH3 de tipo silvestre, y el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a aproximadamente 78 °C, superior a aproximadamente 78,5 °C, superior a aproximadamente 79 °C, superior a aproximadamente 79,5 °C, superior a aproximadamente 80 °C, superior a aproximadamente 80,5 °C, superior a aproximadamente 81 °C, superior a aproximadamente 81,5 °C, superior a aproximadamente 82 °C, superior a aproximadamente 82,5 °C o superior a aproximadamente 83 °C.

En una realización, el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión superior a aproximadamente 74 °C, superior a aproximadamente 74,5 °C, superior a aproximadamente 75 °C, superior a aproximadamente 75,5 °C, superior a aproximadamente 76 °C, superior a aproximadamente 76,5 °C, superior a aproximadamente 77 °C, superior a aproximadamente 77,5 °C, superior a aproximadamente 78 °C, superior a aproximadamente 78,5 °C, superior a aproximadamente 79 °C, superior a aproximadamente 79,5 °C, superior a aproximadamente 80 °C, superior a aproximadamente 80,5 °C, superior a aproximadamente 81 °C, superior a aproximadamente 81,5 °C, superior a aproximadamente 82 °C, superior a aproximadamente 82,5 °C o superior a aproximadamente 83 °C. En otra realización, el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 74 °C, aproximadamente 74,5 °C, aproximadamente 75 °C, aproximadamente 75,5 °C, aproximadamente 76 °C, aproximadamente 76,5 °C, aproximadamente 77 °C, aproximadamente 77,5 °C, aproximadamente 78 °C, aproximadamente 78,5 °C, aproximadamente 79 °C, aproximadamente 79,5 °C, aproximadamente 80 °C, aproximadamente 80,5 °C o aproximadamente 81 °C. En otra realización más, el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 74 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 74,5 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 75 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 75,5 °C a aproximadamente 81 °C, de 76 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 76,5 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 77 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 77,5 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 78 °C a aproximadamente 81 °C, de aproximadamente 78,5 °C a aproximadamente 82 °C, o de aproximadamente 79 °C a aproximadamente 81 °C. En otra realización más, el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 74 °C a aproximadamente 76 °C.

Además de la estabilidad mejorada, la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros. Se entiende que estas mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros son en comparación con la formación de homodímeros. Esta formación de heterodímeros en comparación con la formación de homodímeros se denomina de forma conjunta en el presente documento "pureza", "especificidad", "pureza heterodimérica" o "especificidad heterodimérica". Se entiende que la pureza heterodimérica se refiere al porcentaje de heterodímero deseado formado en comparación con especies homodiméricas formadas en solución en condiciones de cultivo celular convencionales antes de la purificación selectiva de la especie heterodimérica. Por ejemplo, una pureza heterodimérica del 90 % indica que el 90 % de las especies diméricas en solución son el heterodímero deseado. En una realización, los heterodímeros variantes de Fc tienen una pureza superior a aproximadamente el 95 %, superior a aproximadamente el 96 %, superior a aproximadamente el 97 %, superior a aproximadamente el 98 % o superior a aproximadamente el 99 %. En otra realización, los heterodímeros variantes de Fc tienen una pureza de aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %.

En una realización específica, el heteromultímero aislado comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a aproximadamente 74 °C, superior a aproximadamente 75 °C, superior a aproximadamente 76 °C, superior a aproximadamente 77 °C, superior a aproximadamente 78 °C, superior a aproximadamente 79 °C, superior a aproximadamente 80 °C o superior a aproximadamente 81 °C. En un aspecto adicional, el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión de 74 °C o superior y el heterodímero variante de Fc resultante tiene una pureza superior a aproximadamente el 95 %, superior a aproximadamente el 96 %, superior a aproximadamente el 97 %, superior a aproximadamente el 98 % o superior a aproximadamente el 99 %.

Para diseñar estas variantes de Fc con estabilidad y pureza mejoradas los inventores emplearon un proceso por iteraciones de diseño computacional y exploración experimental para seleccionar las combinaciones más exitosas de estrategias de diseño positivo y negativo (véase Figura 24).

Específicamente, en la fase de diseño inicial se realizaron diferentes heterodímeros variantes de Fc de diseño negativo y se ensayaron con respecto a expresión y estabilidad como se describe en los Ejemplos 1 a 3. La fase de diseño inicial incluyó los heterodímeros variantes de Fc AZ1-AZ16 (véase, Tabla 1). A partir de este conjunto inicial de heterodímeros variantes de Fc de diseño negativo, que se esperaba que tuvieran baja estabilidad (por ejemplo, una Tm de menos de 71 °C), los heterodímeros variantes de Fc con más de 90 % de pureza y una temperatura de fusión de aproximadamente 68 °C o superior se seleccionaron para desarrollo adicional. Esto incluyó heterodímeros variantes de Fc AZ6, AZ8 y AZ15. En la segunda fase de diseño, los heterodímeros variantes de Fc seleccionados se modificaron además para conducir tanto la estabilidad como la pureza usando estrategias de diseño positivo siguiendo un análisis computacional y estructural detallado. Los heterodímeros variantes de Fc seleccionados (AZ6, AZ8 y AZ15) se analizaron cada uno con métodos computacionales y análisis de función estructural exhaustivo para identificar las razones estructurales por las que estas variantes de Fc tenían una menor estabilidad que el homodímero de Fc de tipo silvestre, que es 81 °C para IgG1. Véase Tabla 4 para la lista de heterodímeros variantes de Fc y los valores de Tm.

Las herramientas computacionales y análisis de función estructural incluyeron, pero no se limitaron a análisis de dinámica molecular (MD), reempaquetamiento de cadena principal/cadena lateral, Potencial de Base de Conocimiento (KBP), análisis de cavidad y empaquetamiento (hidrófobo) (LJ, CCSD, SASA, dSASA (carbono/todos los átomos)), cálculos de GB electrostáticos y análisis de acoplamiento (véase, Figura 24 para un resumen de la estrategia computacional).

Un aspecto del enfoque de ingeniería proteica se basó en combinar la información estructural de la proteína IgG Fc derivada de cristalografía de rayos X con modelos computacionales y simulación de las formas de tipo silvestre y variantes del dominio CH3. Esto permitió a los inventores obtener nueva información estructural y fisicoquímica acerca del papel potencial de los aminoácidos individuales y su acción cooperativa. Estas informaciones estructurales y fisicoquímicas, obtenidas de múltiples dominios c H3 modificados, junto con los datos empíricos resultantes pertenecientes a su estabilidad y pureza ayudaron a los inventores a desarrollar un entendimiento de la relación entre la pureza y estabilidad del heterodímero de Fc en comparación con los homodímeros de Fc y los modelos estructurales simulados. Para ejecutar las simulaciones de los inventores, comenzaron construyendo modelos completos y realistas y refinando la calidad de la estructura de Fc de tipo silvestre de un anticuerpo IgG1. Las estructuras proteicas derivadas de cristalografía de rayos X carecen de detalle con respecto a ciertas características de la proteína en medio acuoso en condiciones fisiológicas y los procedimientos de refinamiento de los inventores abordaron estas limitaciones. Estos incluyen construir regiones ausentes de la estructura proteica, con frecuencia partes flexibles de la proteína tales como bucles y algunas cadenas laterales de restos, evaluar y definir los estados de protonación de los restos neutros y cargados y colocación de moléculas de agua potenciales funcionalmente relevantes asociadas con la proteína.

Los algoritmos de dinámica molecular (MD) son una herramienta que usaron los inventores, simulando la estructura proteica, para evaluar la naturaleza dinámica intrínseca del homodímero de Fc y el dominio CH3 modificado está en un ambiente acuoso. Las simulaciones de dinámica molecular siguen la trayectoria dinámica de una molécula resultante de movimientos que surgen de interacciones y fuerzas que actúan entre todas las entidades atómicas en la proteína y su ambiente local, en este caso los átomos que constituyen el Fc y sus moléculas de agua circundantes. Después de simulaciones dinámicas moleculares, se analizaron diversos aspectos de las trayectorias para obtener información acerca de las características estructurales y dinámicas del homodímero de Fc y el heterodímero de Fc variante, que los inventores usaron para identificar mutaciones de aminoácidos específicas para mejorar tanto la pureza como la estabilidad de la molécula.

Por lo tanto, las trayectorias de MD generadas se estudiaron usando métodos tales como el análisis de componentes principales para revelar los modos de movimiento de baja frecuencia intrínsecos en la estructura de Fc. Esto proporciona información acerca de los subestados conformacionales potenciales de la proteína (véase Figura 32). Aunque las interacciones proteína-proteína críticas entre la cadena A y B en la región Fc suceden en la interfaz de los dominios CH3, las simulaciones de los inventores indicaron que esta interfaz actúa como una bisagra en un movimiento que implica la "apertura" y "cierre" de los extremos N terminales de los dominios CH2 entre sí. El dominio CH2 interacciona con FcgR en este extremo como se ve en la Figura 16. Por lo tanto, sin desear quedar ligado a la teoría, parece que la introducción de mutaciones de aminoácidos en la interfaz de CH3 influye en la magnitud y naturaleza del movimiento de apertura/cierre en el extremo N terminal del Fc y por lo tanto cómo interacciona el Fc con los FcgR. Véase, ejemplo 4 y Tabla 5.

Las trayectorias de MD generadas también se estudiaron para determinar la mutabilidad de posiciones de restos de aminoácidos específicas en la estructura de Fc basándose en la realización de perfiles de su flexibilidad y análisis de su ambiente. Este algoritmo permitió a los inventores identificar restos que podrían afectar a la estructura y función proteica, proporcionando información única acerca de las características de los restos y mutabilidad para fases de diseño posteriores de los dominios CH3 modificados. Este análisis también permitió a los inventores comparar múltiples simulaciones, y evaluar la mutabilidad basándose en valores discrepantes después de la realización del perfil.

Las trayectorias de MD generadas también se estudiaron para determinar los movimientos de restos correlacionados en la proteína y la formación de redes de restos como resultado del acoplamiento entre ellos. Encontrar correlaciones dinámicas y redes de restos dentro de la estructura Fc es una etapa crítica en el entendimiento de la proteína como una entidad dinámica y para desarrollar información acerca de los efectos de mutaciones en sitios distales. Véase, por ejemplo, Ejemplo 6.

Por lo tanto, los inventores estudiaron en detalle el impacto de las mutaciones en el ambiente local del sitio de mutación. La formación de un núcleo bien empaquetado en la interfaz de CH3 entre la cadena A y B es crítica para el emparejamiento espontáneo de las dos cadenas en una estructura de Fc estable. El buen empaquetamiento es el resultado de fuerte complementariedad estructural entre compañeros moleculares que interaccionan acoplada con interacciones favorables entre los grupos de contacto. Las interacciones favorables resultan de contactos hidrófobos internados bastante separados de la exposición al disolvente y/o de la formación de contactos electrostáticos complementarios entre grupos polares hidrófilos. Estos contactos hidrófobos e hidrófilos tienen contribuciones entrópicas y entálpicas a la energía libre de la formación de dímeros en la interfaz de CH3. Los inventores emplean una diversidad de algoritmos para modelar con precisión el empaquetamiento en la interfaz de CH3 entre la cadena A y cadena B y posteriormente evaluar las propiedades termodinámicas de la interfaz puntuando varias propiedades fisicoquímicas relevantes.

Los inventores emplearon varios métodos de empaquetamiento proteico incluyendo cadenas principales flexibles para optimizar y preparar estructuras modelo para el gran número de variantes que los inventores exploran computacionalmente. Después del empaquetamiento los inventores evaluaron varias condiciones incluyendo densidad de contacto, puntuación de choque, enlaces de hidrógeno, hidrofobicidad y electrostática. El uso de los modelos de solvatación permitió a los inventores abordar con más precisión el efecto del ambiente disolvente y contrastar las diferencias de energía libre después de mutación de posiciones específicas en la proteína para alternar tipos de restos. La densidad de contacto y puntuación de choque proporcionan una medida de la complementariedad, un aspecto crítico del empaquetamiento de proteínas eficaz. Estos procedimientos de exploración se basan en la aplicación de potenciales basados en conocimiento o esquemas de análisis de acoplamiento que se basan en la energía de interacción de restos por pares y cálculos de entropía.

Este análisis por ordenador exhaustivo proporcionó un entendimiento detallado de las diferencias de cada variante de Fc en comparación con el tipo silvestre con respecto a puntos calientes de interfaz, sitios de asimetría, cavidades y regiones mal empaquetadas, dinámicas estructurales de sitios individuales y sitios de desplegamiento local. Estos resultados combinados del análisis computacional descrito identificaron restos específicos, motivos secuenciales/estructurales y cavidades que no estaban optimizadas y en combinación responsables de la menor estabilidad (por ejemplo, Tm de 68 °C) y/o menor especificidad de pureza <90 %. En la segunda fase de diseño los inventores usaron diseño positivo dirigido para abordar específicamente estas hipótesis por mutaciones puntuales adicionales y ensayaron estas mediante ingeniería por ordenador usando la metodología y el análisis anteriormente descritos (véase, Figura 24). Los heterodímeros variantes de Fc diseñados para mejorar la estabilidad y pureza para cada diseño dirigido en la fase dos (heterodímeros variantes de Fc AZ17 a AZ101) se validaron experimentalmente con respecto a expresión y estabilidad como se describe en los Ejemplos 1 a 4.

En una realización ilustrativa, el dominio CH3 comprende un primer y segundo polipéptido (también denominado en el presente documento Cadena A y Cadena B) en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y en donde el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W. En otra realización, un primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, S400E, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, N390R, K392M y T394W.

El proceso por iteraciones de análisis de la función estructural computacional, ingeniería dirigida y validación experimental se usó para diseñar las variantes de Fc restantes enumeradas en la Tabla 1 en fases de diseño posteriores y dando como resultado heterodímeros variantes de Fc con una pureza superior al 90 % y una estabilidad aumentada con una temperatura de fusión del dominio CH3 superior a 70 °C.

A partir de la primera y segunda fases de diseño se identificaron dos armazones del núcleo, el Armazón 1 y el Armazón 2, en donde se introdujeron modificaciones de aminoácidos adicionales en estos armazones para ajustar la pureza y estabilidad de los heterodímeros variantes de Fc. Véase Ejemplo 5 para una descripción detallada del desarrollo del Armazón 1 incluyendo AZ8, AZ17 a 62 y las variantes enumeradas en la Tabla 6. Véase, el Ejemplo 6 para una descripción detallada del desarrollo del Armazón 2 incluyendo AZ15 y AZ63 a 101 y las variantes enumeradas en la Tabla 7.

Las mutaciones principales del Armazón 1 comprenden L351Y_F405A_Y407V / T394W. El Armazón 1a comprende las mutaciones de aminoácidos T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V y el Armazón 1b comprende las mutaciones de aminoácidos T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V. Véase, Ejemplo 5.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido (también denominado en el presente documento Cadena A y Cadena B) en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende la modificación de aminoácidos T394W. En un aspecto el dominio CH3 modificado comprende además mutaciones puntuales en las posiciones F405 y/o K392. Estas mutaciones en la posición K392 incluyen, pero no se limitan a, K392v , K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. Estas mutaciones en la posición F405 incluyen, pero no se limitan a, F405I, F405M, F405S, F405S, F405V o F405W. En otro aspecto, el dominio CH3 modificado comprende además mutaciones puntuales en las posiciones T411 y/o S400. Estas mutaciones en la posición T411 incluyen, pero no se limitan a, T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. Estas mutaciones en la posición S400 incluyen, pero no se limitan a, S400E, S400D, S400R o S400K. En otra realización más, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende la modificación de aminoácidos T394W, en donde el primer y/o segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos adicionales en las posiciones T366 y/o L368. Estas mutaciones en la posición T366 incluyen, pero no se limitan a, T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. En una realización ilustrativa, la mutación de aminoácidos en la posición T366 es T366I. En otra realización ilustrativa, la mutación de aminoácidos en la posición T366 es T366L. Las mutaciones en la posición L368 incluyen, pero no se limitan a, L368D, L368R, L368T, L368M, L368V, L368F, L368S y L368A.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido (denominado también en el presente documento Cadena A y Cadena B) en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366L y T394W. En otra realización, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366I y T394W.

En ciertas otras realizaciones, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido (también denominado en el presente documento Cadena A y Cadena B) en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W. En otra realización, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W.

En otra realización más, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido (también denominado en el presente documento Cadena A y Cadena B) en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W. En otra realización, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido (también denominado en el presente documento Cadena A y Cadena B) en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366L y T394W.

En otra realización, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366I y T394W.

En una realización ilustrativa, se proporcionan en el presente documento heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o superior. En otra realización, se proporcionan en el presente documento heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (T m) de aproximadamente 74 °C o superior y el heterodímero tiene una pureza de aproximadamente 98 % o superior.

En ciertas realizaciones, el heteromultímero aislado que comprende una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) mayor de 70 °C y los dominios CH3 modificados se seleccionan de la Tabla 6.

Las mutaciones principales del Armazón 2 comprenden L351Y_Y407A / T366A_K409F. El Armazón 2a comprende las mutaciones de aminoácidos L351Y_Y407A / T366V_K409F y el Armazón 2b comprende las mutaciones de aminoácidos Y407A / T366A_K409F. Véase, Ejemplo 6.

En ciertos aspectos descritos en el presente documento, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido (también denominado en el presente documento Cadena A y Cadena B) en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407A y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366A y K409F. En un aspecto el dominio CH3 modificado comprende además mutaciones puntuales en las posiciones T366, L351 y Y407. Estas mutaciones en la posición T366 incluyen, pero no se limitan a, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. En una realización específica, la mutación en la posición T366 es T366V. Las mutaciones en la posición L351 incluyen, pero no se limitan a, L351I, L351D, L351R o L351F. Las mutaciones en la posición Y407 incluyen, pero no se limitan a, Y407V o Y407S. Véase, variantes de CH3 AZ63 a AZ70 en la Tabla 1 y Tabla 4 y en el Ejemplo 6.

En un aspecto, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido (también denominado en el presente documento Cadena A y Cadena B) en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407A y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366V y K409F.

En un aspecto ilustrativo descrito en el presente documento son heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 75,5 °C o superior. En otra realización, se proporcionan en el presente documento heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (T m) de aproximadamente 75 °C o superior y el heterodímero tiene una pureza de aproximadamente 90 % o superior.

En ciertos otros aspectos, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptidos (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) en donde el primer polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y y Y407A y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366A y K409F, en donde el dominio CH3 modificado comprende una o más modificaciones de aminoácidos en las posiciones T411, D399, S400, F405, N390 y/o K392. Estas mutaciones en la posición D399 incluyen, pero no se limitan a, D399R, D399W, D399Y o D399K. Las mutaciones en la posición T411 incluyen, pero no se limitan a, T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. Las mutaciones en la posición S400 incluyen, pero no se limitan a, S400E, S400D, S400R o S400K. Las mutaciones en la posición F405 incluyen, pero no se limitan a, F405I, F405M, F405S, F405S, F405V o F405W. Las mutaciones en la posición N390 incluyen, pero no se limitan a, N390R, N390K o N390D. Las mutaciones en la posición K392 incluyen, pero no se limitan a, K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. Véase, variantes de c H3 AZ71 a 101 en la Tabla 1 y la Tabla 4 y el Ejemplo 6.

En un aspecto, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido (también denominado en el presente documento Cadena A y Cadena B) en donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos Y407A y el segundo polipéptido comprende las modificaciones de aminoácidos T366A y K409F. En un aspecto, este dominio CH3 modificado comprende además las modificaciones de aminoácidos K392E, T411E, D399R y S400R. En un aspecto adicional, el dominio CH3 modificado comprende un primer y segundo polipéptido en donde el primer polipéptido comprende la modificación de aminoácidos D399R, S400R y Y407A y el segundo polipéptido comprende la modificación de aminoácidos T366A, K409F, K392E y T411E.

En un aspecto ilustrativo, se proporcionan en el presente documento heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o superior. En otra realización, se proporcionan en el presente documento heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (T m) de aproximadamente 74 °C o superior y el heterodímero tiene una pureza de aproximadamente 95 % o superior.

En ciertos aspectos se describen en el presente documento heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 70 °C y los dominios CH3 modificados se seleccionan de la Tabla 7.

Además, este nuevo método para diseñar heterodímeros variantes de Fc con estabilidad y pureza mejoradas puede aplicarse a otras clases e isotipos de regiones Fc. En ciertas realizaciones, la región Fc es una región Fc IgG humana. En realizaciones adicionales, la región Fc IgG humana es una región Fc IgG1 humana.

Tabla 1.1: modificaciones de aminoácidos de dominio CH3 para la generación de heterodímeros variantes de Fc.

continuación

continuación

continuación

.

Fc. La temperatura de fusión de DSC del dominio CH3 se estimó como se muestra en las Figuras 29A a 29B y se describe en los Ejemplos.

Tabla 1.3: modificaciones de aminoácidos del dominio CH3 para la generación de heterodímeros variantes de Fc. La Kd en la tabla anterior se determinó como se ha descrito en los Ejemplos y la Figura 35.

continuación

La región Fc como se define en el presente documento comprende un dominio CH3 o fragmento del mismo, y puede comprender además uno o más dominios de región constante de adición, o fragmentos de los mismos, incluyendo bisagra, CH1 o CH2. Se entenderá que la numeración de los restos de aminoácidos de Fc es la del índice de EU como en Kabat et al., 1991, Publicación de NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va. El "índice de EU como se expone en Kabat" se refiere a la numeración del índice de EU del anticuerpo de Kabat de IgG1 humano. Por conveniencia, la Tabla B proporciona los aminoácidos numerados de acuerdo con el índice de EU como se expone en Kabat del dominio CH2 y CH3 de IgG1 humano.

Tabla B

continuación

Se proporciona de acuerdo con un aspecto de la invención una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 heterodimérico modificado, comprendiendo dicho dominio CH3 modificado: un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido de dominio CH3 de tipo silvestre, y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido de dominio CH3 de tipo silvestre; en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 comprende una modificación de aminoácidos de K392J en donde J se selecciona de L, I; en donde dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado preferentemente forman un dominio CH3 heterodimérico con una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 74 °C y una pureza de al menos 95 %; y en donde al menos una modificación de aminoácidos no es de un aminoácido que está en la interfaz entre dicho primer y dicho segundo polipéptidos de dominio CH3. En ciertas realizaciones hay una construcción de Fc heteromultimérica descrita en el presente documento, que comprende al menos una modificación T350X, en donde X es un aminoácido natural o no natural seleccionado de valina, isoleucina, leucina, metionina y derivados o variantes de los mismos. En algunas realizaciones hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, que comprende al menos una modificación T350V. En una realización hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (T m) de al menos aproximadamente 75 °C o superior. En una realización está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una Tm de aproximadamente 77 °C o superior. En ciertas realizaciones, el dominio CH3 modificado tiene una Tm de aproximadamente 80 °C o superior. Se proporciona en ciertos aspectos una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde al menos un polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende una modificación de aminoácidos de al menos una de L351, F405 y Y407. En algunos aspectos hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada, en donde al menos un polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende además una modificación de aminoácidos de T366. En ciertos aspectos hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el primer polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos en las posiciones L351, F405 y Y407, y el segundo polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones T366, K392 y T394. En una realización está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 las modificaciones L351Y, F405A y Y407V, y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W. En algunas realizaciones está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos T366L, K392L y T394W. En una realización adicional está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W. En algunas realizaciones está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 las modificaciones de aminoácidos T366I, K392L y T394W. En ciertas realizaciones está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende una modificación de aminoácidos en la posición S400. En una realización está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, que comprende la modificación S400Z, en donde Z se selecciona de un aminoácido con carga positiva y un aminoácido con carga negativa. En algunas realizaciones, el aminoácido con carga positiva es lisina o arginina y el aminoácido con carga negativa es ácido aspártico o ácido glutámico. En ciertas realizaciones está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 una modificación de aminoácidos seleccionada de S400E y S400R. En algunas realizaciones se proporciona la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende una modificación de aminoácidos en la posición N390. En algunas realizaciones, la modificación de N390 es N390Z, en donde Z se selecciona de un aminoácido con carga positiva y un aminoácido con carga negativa. En una realización, N390Z es N390R. En ciertas realizaciones de la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, dicho primer polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende la modificación de aminoácidos S400E y dicho segundo polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende la modificación de aminoácidos N390R. En algunas realizaciones de la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, cada uno del primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado, comprendiendo uno de dichos polipéptidos de dominio CH3 modificado la modificación de aminoácidos Q347R y comprendiendo el otro polipéptido de dominio CH3 modificado la modificación de aminoácidos K360E.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 heterodimérico modificado, comprendiendo dicho dominio CH3 modificado: un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido de dominio CH3 de tipo silvestre, y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido de dominio CH3 de tipo silvestre; en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 comprende una modificación de aminoácidos de K392J en donde J se selecciona de L, I; en donde dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado preferentemente forman un dominio CH3 heterodimérico con una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 74 °C y una pureza de al menos 95 %; y en donde al menos una modificación de aminoácido no es de un aminoácido que está en el interfaz entre dicho primer y dicho segundo polipéptidos de dominio CH3. En ciertos aspectos hay una construcción de Fc heteromultimérica descrita en el presente documento, que comprende al menos una modificación T350X, en donde X es un aminoácido natural o no natural seleccionado de valina, isoleucina, leucina, metionina, y derivados o variantes de los mismos. En algunas realizaciones hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, que comprende al menos una modificación T350V. En una realización hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 75 °C o superior. En una realización está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una Tm de aproximadamente 77 °C o superior. En ciertas realizaciones, el dominio CH3 modificado tiene una Tm de aproximadamente 80 °C o superior. En un aspecto está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde al menos un polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende una modificación de aminoácidos de al menos uno de K409 y T411. En ciertos aspectos está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento que comprende al menos uno de K409F, T411E y T411D. En algunos aspectos está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento en donde al menos un polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende una modificación de aminoácidos de D399. En algunos aspectos, la modificación de aminoácido de D399 es al menos una de D399R y D399K.

Se proporciona en un aspecto descrito en el presente documento una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 heterodimérico modificado, comprendiendo dicho dominio CH3 modificado: un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido de dominio CH3 de tipo silvestre, y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos tres modificaciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido de dominio CH3 de tipo silvestre; en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 comprende una modificación de aminoácidos de K392J en donde J se selecciona de L, I; en donde dicho primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado preferentemente forman un dominio CH3 heterodimérico con una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 74 °C y una pureza de al menos 95 %; y en donde al menos una modificación de aminoácidos no es de un aminoácido que está en la interfaz entre dicho primer y dicho segundo polipéptidos de dominio CH3. En ciertos aspectos hay una construcción de Fc heteromultimérica descrita en el presente documento, que comprende al menos una modificación T350X, en donde X es un aminoácido natural o no natural seleccionado de valina, isoleucina, leucina, metionina y derivados o variantes de los mismos. En algunas realizaciones hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, que comprende al menos una modificación T350V. En una realización hay una construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (T m) de al menos aproximadamente 75 °C o superior. En una realización está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una Tm de aproximadamente 77 °C o superior. En ciertas realizaciones, el dominio CH3 modificado tiene una Tm de aproximadamente 80 °C o superior. En ciertos aspectos está la construcción de Fc heteromultimérica aislada descrita en el presente documento, en donde el primer polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de K409F, T411E y T411D, y el segundo polipéptido de dominio CH3 es un polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende al menos una modificación de aminoácido seleccionada de Y407A, Y407I, Y407V, D399R y D399K. En algunos aspectos está una cualquiera de las construcciones de Fc heteromultiméricas aisladas descritas en el presente documento, que comprende además un primer dominio CH3 modificado que comprende una de las modificaciones de aminoácidos T366V, T366I, T366A, T366M y T366L; y un segundo dominio CH3 modificado que comprende la modificación de aminoácidos L351Y. En algunos aspectos está una cualquiera de las construcciones de Fc heteromultiméricas aisladas descritas en el presente documento, que comprende un primer dominio CH3 modificado que comprende una de las modificaciones de aminoácidos K392L o K392E; y un segundo dominio CH3 modificado que comprende una de las modificaciones de aminoácidos S400R o S400V.

Se describe en el presente documento una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado, comprendiendo cada polipéptido de dominio CH3 modificado al menos cuatro mutaciones de aminoácidos, en donde al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado comprende una mutación seleccionada de N390Z y S400Z, en donde Z se selecciona de un aminoácido con carga positiva y un aminoácido con carga negativa, y en donde dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificados preferentemente forman un dominio CH3 heterodimérico con una temperatura de fusión (T m) de al menos aproximadamente 70 °C y un pureza de al menos 90 %. En un aspecto se proporciona la construcción de Fc heteromultimérica aislada, en donde dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones F405 y Y407 y dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende modificación de aminoácidos en la posición T394. En un aspecto se proporciona la construcción de Fc heteromultimérica aislada, comprendiendo el primer polipéptido de dominio Ch 3 modificado una modificación de aminoácidos en la posición L351. En ciertos aspectos, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado una modificación de al menos una de las posiciones T366 y K392. En algunas realizaciones, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (T m) de al menos aproximadamente 75 °C y se forma con una pureza de al menos aproximadamente 95 %. En ciertos aspectos, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo al menos un polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos de al menos una de N390R, S400E y S400R. En algunos aspectos hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos de la posición 347 y comprendiendo el otro polipéptido de dominio CH3 modificado modificación de aminoácido en la posición 360. En ciertas realizaciones está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado modificación de aminoácidos de T350V. En realizaciones específicas hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de L351Y, F405A y Y407V; y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de T366L, T366I, K392L, K392M y T394W. En ciertos aspectos se describe en el presente documento un heteromultímero aislado, comprendiendo el primer polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos en las posiciones D399 y Y407, y comprendiendo un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificación de aminoácidos en las posiciones K409 y T411. En algunas realizaciones hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo el primer polipéptido de dominio CH3 modificación de aminoácidos en la posición L351, y comprendiendo el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos en la posición T366 y K392. En realizaciones específicas hay heteromultímeros aislados descritos en el presente documento, comprendiendo al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificación de aminoácidos de T350V. En ciertas realizaciones hay heteromultímeros aislados descritos en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 75 °C o superior y se forma con una pureza de al menos aproximadamente 95 %. Se proporcionan en ciertos aspectos construcciones de Fc heteromultiméricas aisladas descritas en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos seleccionadas de L351Y, D399R, D399K, S400D, S400E, S400R, S400K, Y407A y Y407V; y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácido seleccionadas de T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392I, K392D, K392E, K409F, K409W, T411D y T411E.

Se describe en el presente documento una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado, comprendiendo cada polipéptido de dominio CH3 modificado al menos tres mutaciones de aminoácidos, en donde uno de dichos primer y dicho segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado comprende una mutación seleccionada de T411E y T411D, y en donde dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado preferentemente forman un dominio CH3 heterodimérico con una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 70 °C y una pureza de al menos 90 %. En una realización se proporciona la construcción de Fc heteromultimérica aislada, en donde dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones F405 y Y407 y dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende modificación de aminoácidos en la posición T394. En una realización se proporciona la construcción de Fc heteromultimérica aislada, comprendiendo el primer polipéptido de dominio CH3 modificado una modificación de aminoácidos en la posición L351. En ciertas realizaciones, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado una modificación de al menos una de las posiciones T366 y K392. En algunas realizaciones, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (T m) de al menos aproximadamente 75 °C y se forma con una pureza de al menos aproximadamente 95 %. En ciertas realizaciones, está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo al menos un polipéptido de dominio CH3 modificado las modificaciones de aminoácidos de al menos una de N390R, S400E y S400R. En algunos aspectos hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos de la posición 347 y comprendiendo el otro polipéptido de dominio CH3 modificado modificación de aminoácidos en la posición 360. En ciertas realizaciones está el heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado modificación de aminoácidos de T350V. En realizaciones específicas hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de L351Y, F405A y Y407V; y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado al menos una modificación de aminoácidos seleccionada de T366L, T366I, K392L, K392M y T394W. En algunos aspectos se describe en el presente documento un heteromultímero aislado, comprendiendo el primer polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos en las posiciones D399 y Y407, y comprendiendo un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificación de aminoácidos en las posiciones K409 y T411. En algunas realizaciones hay un heteromultímero aislado descrito en el presente documento, comprendiendo el primer polipéptido de dominio CH3 modificación de aminoácidos en la posición L351, y comprendiendo el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos en las posiciones T366 y K392. En realizaciones específicas hay heteromultímeros aislados descritos en el presente documento, comprendiendo al menos uno de dichos primer y segundo polipéptidos de dominio CH3 la modificación de aminoácidos de T350V. En ciertas realizaciones hay heteromultímeros aislados descritos en el presente documento, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 75 °C o superior y se forma con una pureza de al menos aproximadamente 95 %. Se proporcionan en ciertas realizaciones construcciones de Fc heteromultiméricas aisladas descritas en el presente documento, comprendiendo dicho primer polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos seleccionadas de L351Y, D399R, D399K, S400D, S400E, S400R, S400K, Y407A y Y407V; y comprendiendo dicho segundo polipéptido de dominio CH3 modificado modificaciones de aminoácidos seleccionadas de T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392I, K392D, K392E, K409F, K409W, T411D y T411E.

Se proporciona en el presente documento una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V; y comprendiendo un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado las modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T366I, K392L y T394W.

Se proporciona en cierto aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W.

Se proporciona en algunos aspectos una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392L y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, F405A y Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, K392L y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400R, F405A, Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, K392M y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400E, F405A, Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, N390R, K392M y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, F405A, Y407V; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, K392L y T394W.

Se proporciona en un aspecto una construcción de Fc heteromultimérica aislada, que comprende un dominio CH3 modificado que comprende un primer polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos T366V, K392LE K409F y T411E; y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado que comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, D399R, S400R y Y407A.

En ciertas realizaciones, la variante de Fc comprende un dominio CH2. En algunas realizaciones, el dominio CH2 es un dominio CH2 variante. En algunas realizaciones, los dominios CH2 variantes comprenden sustituciones de aminoácidos asimétricas en la primera y/o segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2 de modo que una cadena de dicho heteromultímero se une selectivamente con un receptor de Fc.

En ciertas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente a un receptor de Fc. En algunas realizaciones, el receptor de Fc es un miembro de la familia de receptores Fcy. En algunas realizaciones, el receptor se selecciona de FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa y FcyRIIIb. En una realización, el dominio CH2 comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas que promueven la unión selectiva con receptores Fcgamma.

En algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente con FcyRINa. En algunas realizaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S267D, K392D y K409D. En algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente con FcyRIIa. En algunas realizaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, K326E, A330L y I332E. En algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente con FcyRIIb. En algunas realizaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, D265S, E269K y I332E. En algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcyRIIIa y FcyRIIa. En algunas realizaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, D265S y S298A. En algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente con FcyRIIIa y FcyRIIb. En algunas realizaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, S298A, K326E, A330L y I332E. En algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcyRIIa y FcyRIIb. En algunas realizaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, D265S, S298A e I332E.

En ciertas realizaciones se proporciona un método para diseñar productos terapéuticos multifuncionales que comprenden el heteromultímero descrito en el presente documento. En algunas realizaciones se proporciona un método para diseñar productos terapéuticos bifuncionales que comprenden un heterodímero de Fc variante. En algunas realizaciones se proporciona un método para el diseño de mutaciones asimétricas en el dominio CH2 de un heterodímero de Fc variante derivado con mutaciones en el dominio CH3. En algunas realizaciones se proporciona un método para diseñar selectividad para los diferentes receptores Fc gamma basándose en las mutaciones en el Fc asimétrico. En ciertas realizaciones se proporciona un método para diseñar mutaciones que polarizan la unión de los receptores Fc gamma a una cara de la molécula de Fc. En ciertas realizaciones se proporciona un método para diseñar conductores de polaridad que polarizan los receptores Fcy para interaccionar con solamente una cara del armazón de Fc asimétrico del heteromultímero descrito en el presente documento.

En algunas realizaciones se proporciona un polipéptido que comprende mutaciones en el dominio CH2 del Fc asimétrico que conduce a perfiles de selectividad de receptor Fc gamma preferentes. En algunas realizaciones mutaciones en el dominio CH3 conducen a formación preferente de Fc heterodimérico. En ciertas realizaciones hay un método para diseñar entidades terapéuticas biespecíficas basado en el Fc asimétrico descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones hay un método para diseñar entidades terapéuticas multiespecíficas basadas en el Fc asimétrico descrito en el presente documento.

Los anticuerpos monoclonales tales como IgG son moléculas simétricas compuestas por dos cadenas polipeptídicas pesadas y dos ligeras equivalentes (Figura 14), que comprenden cada una múltiples dominios estructurales de inmunoglobulina (Ig). La clase IgG de mAb existe en una de cuatro isoformas, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La cadena pesada está compuesta por cuatro (VH, CH1, CH2 y CH3) y la cadena ligera por dos (VL y CL) dominios Ig, respectivamente. Los dominios VH y CH1 de cada una de las cadenas pesadas se combina con los dominios VL y CL de cadena ligera para formar los dos brazos de Fab ("fragmento de unión a antígeno") del mAb. Los dominios CH3 y CH2 de las dos cadenas pesadas interaccionan mediante contactos proteína-proteína entre los dominios CH3 y glucosilación en los dominios CH2 para formar la región Fc homodimérica ("fragmento cristalizable"). La región de enlace entre los dominios CH1 y CH2 del anticuerpo constituye la región bisagra de la molécula de anticuerpo. Aparte de conectar las regiones Fab y Fc del mAb, la bisagra también mantiene enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas y las mantiene juntas. El número de aminoácidos y enlaces disulfuro en la región bisagra es notablemente diferente entre los cuatro isotipos de IgG. El patrón de glucosilación en moléculas IgG puede ser significativamente diverso, se han observado aproximadamente 30 restos de carbohidratos diferentes en moléculas IgG [Arnold J. N.; Wormald M. R.; Sim R. B.; Rudd P. M. y Dwek R. A. (2007) Annual Reviews of Immunology 25, 21 a 50].

La naturaleza simétrica de la estructura de anticuerpos monoclonales da como resultado que ambos brazos de Fab tengan su capacidad de unión a antígeno madurada por afinidad para reconocer el mismo epítopo. En el otro extremo, la parte Fc de la molécula de anticuerpo está implicada en interacciones con diversas moléculas receptoras en las células inmunitarias o "efectoras", y algunas de estas interacciones son responsables de mediar en las funciones efectoras tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) y activación del complemento. Generalmente, la función efectora implica respuestas inmunitarias que conducen a neutralización y eliminación de patógenos o toxinas, activación del complemento y respuesta fagocítica del sistema inmunitario humoral. Las moléculas de receptores Fcy (FcyR) en las células efectoras entran en contacto con el Fc del anticuerpo IgG activado implicado en el complejo inmunitario anticuerpo-antígeno integral para mediar en y regular la respuesta efectora. La optimización de la interacción de agentes terapéuticos proteicos basados en anticuerpos monoclonales con estos receptores Fcy puede conducir a mejoras en la eficacia de estos candidatos farmacológicos.

En seres humanos hay tres clases conocidas de FcyR con tipos polimórficos adicionales dentro de cada clase. Se sabe que el Fc en la molécula IgG1 se une con FcyRI (CD64) con constantes de disociación en el intervalo nanomolar mientras que se produce unión de FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) en el intervalo micromolar [Bruhns P.; lannascoli B.; England P.; Mancardi D. A.; Fernandez N.; Jorieux S. y Daeron M. (2009) Blood 113: 3716-25]. Los receptores FcyRI de alta afinidad pueden unirse a IgG en formas monoméricas mientras que los receptores de baja afinidad FcyRII y FcyRIII pueden unirse solamente a complejos inmunitarios antígeno-anticuerpo o agregados de IgG como resultado de efectos de la avidez. Las diferentes formas de IgG tienen diversas afinidades para los diferentes FcyR; en particular, la IgG1 e IgG3 muestran actividad más fuerte. Los receptores Fcy son los dominios extracelulares de proteínas transmembrana y poseen dominios citoplasmáticos que están implicados en la regulación de rutas de señalización dentro de la célula. Cuando se agrupan en la superficie de células inmunitarias en asociación con los complejos inmunitarios mediados por anticuerpos, dependiendo de la naturaleza de las subunidades de señalización unidas con los FcyR en el extremo citoplasmático de estos receptores de superficie celular, estas moléculas regulan la respuesta efectora [Nimmerjahn F. y Ravetch J. V. (2008) Nature Immu Rev 8(1): 34 a 47].

Al nivel cromosómico humano, tres genes codifican el FcyRI (FcyRIA, FcyRIB, FcyRIC) y FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC) y dos genes codifican el FcyRIII (FcyRIIIA, FcyRIIIB). Entre los receptores Fcy humanos de unión a IgG, se ha mostrado que los tipos FcyRIA, FcyRIC y FcyRIIIA se asocian a membrana con una proteína adaptadora de señal de cadena y común que contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptor citoplasmático (ITAM) que conduce a la activación de la función efectora. El FcyRIIA y FcyRIIC también comprende un ITAM citoplasmático, pero sin la proteína adaptadora de señal de cadena y común. Al mismo tiempo, FcyRIIB está unido a un motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptor (ITIM). La activación de FcyRIIB que da como resultado fosforilación de ITIM da como resultado la inhibición de la cascada de señalización de activación. El FcyRIIIB, aunque carece de las colas citoplasmáticas inmunomoduladores basadas en tirosina, tiene un anclaje GPI (glicosil-fosfatidil-inositol) y se ha mostrado que contribuye a la activación de algunos granulocitos en presencia de FcyRIIA.

Tabla C: características del rece tor Fc

Aunque se conoce el papel funcional de los motivos ITAM e ITIM y las moléculas receptoras asociadas, no se entiende completamente la naturaleza y mecanismos de la modulación de señalización en combinación, especialmente cuando se combina con la actividad de un hospedador de otros receptores de superficie de células inmunitarias y moléculas adaptadoras (por ejemplo BCR, CD22, CD45, etc.) implicadas en la transducción de señales. En este contexto, el diseño de moléculas tipo Fc que pueden interaccionar con estos receptores Fcy con perfiles de selectividad exquisita es un armazón valioso en cualquier intento de desconvolucionar y modular el efecto de dichas moléculas receptoras con actividades reguladoras sutiles.

En el contexto del diseño de moléculas de anticuerpo que puedan diferenciar los FcyR, el intento se complica por el hecho de que las secciones de unión a Fc extracelulares de los tipos de receptor FcyRII y FcyRIII muestran alta similitud de secuencia (Figura 15), lo que puede atribuirse al menos en parte a duplicación segmentaria ancestral. Los dos tipos principales de receptores FcyRII, A y B, tienen 69 % de identidad de secuencia mientras que el FcyRIIA y FcyRIIIA muestran aproximadamente 44 % de identidad de secuencia. El FcyRIIB y FcyRIIC difieren solamente en 2 restos en la región extracelular, aunque son significativamente diferentes en la región intracelular, siendo notable la presencia de motivos ITIM e ITAM respectivamente. Como resultado puede anticiparse que las moléculas de anticuerpo terapéuticas requeridas para unirse a un receptor también se unirían potencialmente con otras clases de receptores, posiblemente dando como resultado efectos terapéuticos no pretendidos.

Complica más la situación que cada una de las clases de receptor presenta múltiples polimorfismos de un único nucleótido (SNP) y variaciones del número de copias (CNV). La diversidad de receptores resultante influye de forma diferente en su afinidad por IgG y su mecanismo de acción. Estas variaciones genéticas podrían afectar a la afinidad de subclases de IgG particulares por los receptores Fcy, alterar los eventos efectores corriente abajo o afectar a mecanismos que alteran los niveles de expresión del receptor dando como resultado fenotipos funcionalmente relevantes, variantes de receptores no funcionales o funcionalmente desconocidos (Bournazos S.; Woof J. M.; Hart S. P. y Dransfield I. (2009) Clinical and Experimental Immunology 157(2): 244 a 54). Potencialmente conducen a efectos complejos, alterando el equilibrio entre señalización de receptores activadores e inhibidores, dando como resultado la creación de fenotipos susceptibles a enfermedad.

Algunas de estas variaciones alélicas se enumeran en la Tabla C. Notablemente, la variante R131 en FcyRIIa es altamente sensible a IgG1 mientras que las variantes H131 alternativas muestran interacciones más eficaces con IgG2 e IgG3. En el caso de FcyRIIIa, los homocigotos donantes para V en la posición 158 muestran actividad de linfocitos NK aumentada en comparación con individuos homocigotos F/F158 debido a mayor afinidad del primer alotipo por IgG1, IgG3 e IgG4 humano. Las variantes alélicas NA1 y NA2 de FcyRIIIb es el resultado de una sustitución de cuatro aminoácidos que a su vez conduce a diferencias en la glucosilación del receptor. El alelo NA1 presenta unión potenciada y fagocitosis del complejo inmunitario por neutrófilos. El FcyRIIB tiene dos variantes alélicas conocidas, 232I y 232T. Se sabe que la variante 232T está fuertemente alterada en su actividad reguladora negativa. Se han indicado las frecuencias de polimorfismos de FcyR y sus asociaciones con sensibilidad diferencial a infecciones o predisposición a condiciones de enfermedad tales como lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide (RA), vasculitis, púrpura trombocitopénica mediada por sistema inmunitario (ITP), miastenia grave, esclerosis múltiple (MS) e inmunoneuropatía (síndrome de Guillian-Barre (GBS)).

Se ha demostrado la variación del número de copias en el locus de genes de FcyR, en particular para FcyRIIIB, FcyRIIc y FcyRIIIA, y se ha observado una correlación adicional de estas diferencias con la expresión en superficie celular de estos receptores. Por el contrario FcyRIIa y FcyRIIb no muestran variación del número de copias del gen. De hecho se ha asociado el bajo número de copias de FcyRIIIb con la glomerulonefritis en la enfermedad autoinmunitaria lupus eritematoso sistémico (SLE) [Aitman TJ et al. (2006) Nature 16; 439(7078): 851 a 5]. Esto es particularmente interesante dado el hecho de que un módulo de GPI no señalizador ancla el receptor FcyRIIIb. Se puede plantear la hipótesis de que la presencia de estos receptores FcyRIIIb podrían actuar potencialmente como inhibidores competitivos de las interacciones de Fc con otros FcyR señalizadores. El efecto de la variación del número de copias en FcyRIIc también es especialmente interesante. Un SNP de C/T en la posición 202 en FcyRIIc convierte un resto de glutamina en un codón de parada lo que evita la generación de una proteína funcional. La fase abierta de lectura funcional de FcyRIIc se expresa en el 9 % de los individuos sanos (población blanca) y hay una sobrerrepresentación significativa (19 %) del alelo en la población de ITP lo que implica una predisposición de estos fenotipos a ITP [Breunis WB et al. (2008) Blood 111(3): 1029 a 38]. Se ha demostrado que en individuos que expresan FcyRIIc funcional en linfocitos NK, la ADCC conseguida está mediada por estos receptores en un mayor grado que el FcyRIIIa. Dichas complejidades asociadas con estos polimorfismos y variaciones genéticas destacan la necesidad de estrategias de tratamiento personalizadas que requieren productos terapéuticos altamente adaptados.

Las diversas células efectoras difieren en la presentación de estos receptores Fcy así como en su distribución humoral y tisular, contribuyendo de este modo a variaciones en su mecanismo de activación y acción [Tabla D]. El ajuste de la selectividad de anticuerpos terapéuticos hacia el reconocimiento de tipos de FcyR específicos y la modulación del impacto de ciertas clases de células efectoras, conduce a la optimización del mecanismo efector para condiciones de enfermedad particulares. Se pretende que esto active o inhiba selectivamente modalidades efectoras específicas, dependiendo de la condición de enfermedad que se trate.

Tabla D: distribución celular de Fc R.

continuación

Además, también se expresa FcyR por células dendríticas foliculares, células endoteliales, células microgliales, osteoclastos y células mesangiales. En la actualidad, no se conoce la importancia funcional de la expresión de FcyR en estas otras células.

El FcyRI de alta afinidad está compuesto por tres dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) de tipo C mientras que los FcyRII y FcyRIII de baja afinidad están constituidos por dos dominios de IgSF de tipo C cada uno. La estructura de las proteínas receptoras FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa y FcyRIIIb se ha resuelto por cristalografía. Los dos dominios de IgSF en estas estructuras se sitúan a 50 a 55 grados entre sí y están conectados por una bisagra.

La estructura públicamente disponible de un co-complejo Fc-FcyR es la del sistema Fc-FcyRIIIb y la geometría de FcyR en el complejo se mantiene muy cerca de la observada en el estado apo de la proteína [Sondermann P.; Huber R.; Oosthuizen V. y Jacob U. (2000) Nature 406, 267 a 273.; Radaev S.; Motyaka S.; Fridman W.; Sautes-Fridman C. y Sun P.D. (2001) J Biol Chem 276, 16469 a 16477; Sondermann P. et al. Biochem Soc Trans. Ago 2002; 30(4): 481 a 6; Sondermann P, Oosthuizen V. Immunol Lett. 3 Jun 2002; 82(1-2):51 a 6; Radaev S, Sun P. Mol Immunol. Mayo 2002; 38(14): 1073 a 83.][Figura 16]. La fuerte similitud de secuencia y estructural entre los receptores forma la base de modelos comparativos del Fc unido a los otros receptores. Por otro lado, la similitud de secuencia y estructural entre estas moléculas receptoras también hace difícil el diseño de Fc con la selectividad exquisita entre los receptores y sus diversos isotipos.

Antes de la evaluación estructural del complejo Fc-FcyR basándose en la cristalografía, se cuestionó si el eje doble de simetría en la molécula Fc significa que hay dos sitios de unión potenciales y una estequiometría 2:1 eficaz para la asociación Fc-FcyR. Los estudios estructurales basados en resonancia magnética nuclear (NMR) de interacciones Fc - FcyR indican que la unión de un Fc con un FcyR en una cara de la molécula induce un cambio conformacional que impide la unión de una segunda molécula FcyR con el Fc de la misma molécula de anticuerpo [Kato K. et al (2000) J Mol Biol. 295(2): 213 a 24]. La geometría del co-complejo cristalino disponible del Fc-FcyRIIIb confirma la asociación del FcyR con Fc en orientación asimétrica con una estequiometría 1:1. Como se muestra en la Figura 16, el FcyR se une a una hendidura en un extremo de la molécula de Fc en forma de herradura, y está en contacto con los dominios CH2 de ambas cadenas.

La mutagénesis de exploración de alanina [Shields RL et al. (2001) JBC 276(9): 6591 a 604] proporciona información sobre los restos del Fc en interfaz con los diversos tipos de receptores y por lo tanto implicados en la interacción y reconocimiento de Fc-FcyR. T radicionalmente, la optimización de los anticuerpos terapéuticos se ha centrado en torno a mutaciones que muestran unión aumentada con los receptores activadores FcyRIII [Patente de Estados Unidos N.° 6.737.056] o afinidad reducida con FcyRIIb [documento US2009/0010920A1]. En todas estas variantes alternativas, se introducen mutaciones simultáneamente en ambas cadenas.

Los anticuerpos monoclonales con frecuencia muestran su actividad terapéutica induciendo localización espacial de las células inmunitarias dianas y efectoras. Un anticuerpo natural media en esto interaccionando con la diana usando sus dominios Fab y la célula efectora usando el dominio Fc. Son capaces de yuxtaponer el complejo inmunitario frente a la célula efectora de tal modo que pueda inducirse la respuesta mediada por células. Los efectos de avidez requeridos para señalización de FcyR, que se origina en la formación de complejos inmunitarios que implican la dirección a una única diana por múltiples moléculas de anticuerpo, es otro ejemplo de la importancia de la organización espaciotemporal en la acción inmunitaria.

También hay un aspecto espaciotemporal en la señalización celular que se induce como parte de la actividad efectora de moléculas de mAb. La señalización celular tal como la basada en activación de moléculas FcyR implica la localización de las moléculas receptoras relevantes dentro de una región de dominio de membrana denominadas balsas lipídicas. Las balsas lipídicas están enriquecidas con glucoesfingolípidos y colesterol y varias clases de transductores de señal corriente arriba incluyendo las quinasas de la familia Src. Tras la estimulación celular se reclutan diversas moléculas de señalización, proteínas adaptadoras y las quinasas de señalización así como fosfatasas. El ensamblaje molecular en balsas lipídicas es importante para la transducción de señales.

Una estrategia de diseño no natural, que combina diferentes especificidades antigénicas y avidez aumentada para proporcionar mejores propiedades de unión es la base del diseño terapéutico biespecífico. Se diseñan anticuerpos biespecíficos u otras formas de productos terapéuticos proteicos biespecíficos o multifuncionales para mediar en interacciones entre la diana y una diversidad de células efectoras [Müller & Kontermann (2010) BioDrugs 24(2): 89 a 98]. Se modifican por ingeniería genética moléculas terapéuticas multiespecíficas para redirigir los linfocitos T auxiliares u otras células efectoras inmunitarias contra células diana específicas.

En otra realización, la invención se refiere a un método para identificar polipéptidos variantes de Fc por ordenador basándose en afinidades de unión calculadas por FcyRIIa, FcyRIIb y/o FcyRIIIa. En otra realización, el método comprende además calcular por ordenador la electrostática, solvatación, empaquetamiento, densidad de empaquetamiento, unión de hidrógeno y efectos entrópicos de dichos polipéptidos variantes de Fc. En otra realización más, el método de esta invención incluye además construir los polipéptidos variantes de Fc y expresar dichos polipéptidos en el contexto de un anticuerpo terapéutico y expresar además dicho anticuerpo en células de mamífero. En otra realización más, el método de esta invención comprende construir los polipéptidos variantes de Fc identificados por ordenador por mutagénesis dirigida, mutagénesis basada en PCR, mutagénesis de casete o síntesis ^{de novo.}

Los factores que se tienen en cuenta en el diseño del armazón de Fc sintético incluyen cálculos por ordenador con respecto a repulsión estérica, cambio de área de interfaz internada, densidad de contacto relativa, solvatación relativa y efecto electrostático. Todas estas matrices se usaron para llegar a una puntuación de afinidad.

En un aspecto, esta solicitud describe un diseño molecular para conseguir perfiles de selectividad de FcyR exquisitos mediante el diseño de un armazón asimétrico construido en un Fc heterodimérico. Este armazón permite mutaciones asimétricas en el dominio CH2 para conseguir una diversidad de perfiles de selectividad nuevos. Además, el armazón tiene características inherentes para la modificación por ingeniería genética de moléculas terapéuticas multifuncionales (bi, tri, tetra o pentafuncionales).

En ciertas realizaciones, el armazón asimétrico se optimiza con respecto a propiedades de unión dependientes de pH con el receptor de Fc neonatal (FcRn) para permitir un mejor reciclaje de la molécula y potenciar su semivida y propiedades farmacocinéticas relacionadas.

El armazón asimétrico puede optimizarse para unión con los alotipos del receptor FcyRI funcionalmente relevantes. FcyRI es un marcador prominente en macrófagos que están implicados en trastornos inflamatorios crónicos tales como Artritis Reumatoide, Dermatitis Atópica, Psoriasis y varias enfermedades pulmonares.

El armazón asimétrico puede optimizarse con respecto a unión con proteína A. La unión con proteína A se emplea con frecuencia para la separación y purificación de moléculas de anticuerpo. Pueden introducirse mutaciones en el armazón asimétri

Por lo tanto, se contempla específicamente que las variantes de Fc de la invención pueden contener entre otras una o más sustituciones, mutaciones y/o modificaciones de restos de aminoácidos adicionales que dan como resultado un anticuerpo con características preferidas incluyendo pero no limitado a: semivida en suero aumentada, afinidad de unión aumentada, inmunogenicidad reducida, producción aumentada, actividad ADCC o CDC potenciada o reducida, glucosilación y/o enlaces disulfuro alterados y especificidad de unión modificada.

Se contempla que las variantes de Fc de la invención pueden tener otras características alteradas incluyendo semividas ^{in v ivo} aumentadas (por ejemplo, semividas en suero) en un mamífero, en particular un ser humano, estabilidad aumentada ^{in v ivo} (por ejemplo, semividas en suero) y/o ^{in v itro} (por ejemplo, periodo de validez) y/o temperatura de fusión (Tm) aumentada, en relación con una molécula comparable. En una realización, una variante de Fc de la invención tiene una semivida ^{in v ivo} superior a 15 días, superior a 20 días, superior a 25 días, superior a 30 días, superior a 35 días, superior a 40 días, superior a 45 días, superior a 2 meses, superior a 3 meses, superior a 4 meses o superior a 5 meses. En otra realización, una variante de Fc de la invención tiene una semivida ^{in v itro} (por ejemplo, formulación líquida o en polvo) superior a 15 días, superior a 30 días, superior a 2 meses, superior a 3 meses, superior a 6 meses, superior a 12 meses, superior a 24 meses, superior a 36 meses o superior a 60 meses.

También se apreciará por un experto en la materia que las variantes de Fc de la invención pueden tener inmunogenicidad alterada cuando se administran a un sujeto. En consecuencia, se contempla que el dominio CH3 modificado, que minimiza la inmunogenicidad de la variante de Fc, generalmente es más deseable para aplicaciones terapéuticas.

Las variantes de Fc de esta invención pueden combinarse con otras modificaciones de Fc, incluyendo pero no limitado a modificaciones que alteran la función efectora. La invención abarca combinar una variante de Fc de la invención con otra modificación de Fc para proporcionar propiedades aditivas, sinérgicas o nuevas en anticuerpos o proteínas de fusión de Fc.

Dichas modificaciones pueden estar en los dominios bisagra, CH1 o CH2 (o CH3 siempre que no altere de forma negativa las propiedades de estabilidad y pureza de los presentes dominios CH3 modificados) o una combinación de los mismos. Se contempla que las variantes de Fc de la invención potencian la propiedad de la modificación con la que se combinan. Por ejemplo, si se combina una variante de Fc de la invención con un mutante que se sabe que se une a FcyRIIIA con una mayor afinidad que una molécula comparable que comprende una región Fc de tipo silvestre; la combinación con un mutante de la invención da como resultado un mayor factor de potenciación en la afinidad de FcyRIIIA.

En una realización, las variantes de Fc de esta invención pueden combinarse con otras variantes de Fc conocidas tales como las divulgadas en Duncan et al., 1988, Nature 332: 563 a 564; Lund et al., 1991, J Immunol 147: 2657 a 2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29: 53 a 59; Alegre et al., 1994, Transplantation 57: 1537 a 1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci USA 92: 11980 a 11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett. 44: 111 a 117; Lund et al., 1995, Faseb J 9: 115 a 119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54: 101 a 104; Lund et al., 1996, Immunol 157: 4963 a 4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29: 2613 a 2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164: 4178 a 4184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164: 1925 a 1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200: 16 a 26; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166: 2571 a 2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276: 6591 a 6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82: 57 a 65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30: 487 a 490; Patentes de Estados Unidos N.° 5.624.821; 5.885.573; 6.194.551; Solicitudes de Patente de Estados Unidos N.° 60/601.634 y 60/608.852; Publicaciones de PCT N.° WO 00/42072 y WO 99/58572.

Un experto en la materia entenderá que las variantes de Fc de la invención pueden tener propiedades de unión a ligandos de Fc (por ejemplo FcyR, C1q) alteradas (los ejemplos de propiedades de unión incluyen, pero no se limitan a, especificidad de unión, constante de disociación en equilibrio (Kd), velocidades de disociación y asociación Koff y Kon respectivamente), afinidad de unión y/o avidez) y que ciertas alteraciones son más o menos deseables. Se conoce bien en la técnica que la constante de disociación en equilibrio (Kd) se define como koff/kon. Se entiende generalmente que una molécula de unión (por ejemplo, un anticuerpo) con una Kd baja es preferible a una molécula de unión (por ejemplo, un anticuerpo) con una Kd alta. Sin embargo, en algunos casos el valor de la kon o la koff puede ser más relevante que el valor de la Kd. Un experto en la materia puede determinar qué parámetro cinético es más importante para una aplicación de anticuerpo dada. Por ejemplo un CH3 y/o CH2 modificado que potencie la unión de Fc con uno o más reguladores positivos (por ejemplo, FcyRIIIA) dejando sin cambios o incluso reduciendo la unión de Fc con el regulador negativo FcyRIIB sería más ventajoso para potenciar la actividad ADCC. Como alternativa, un CH3 y/o CH2 modificado que redujera la unión con uno o más reguladores positivos y/o potenciara la unión con FcyRIIB sería ventajoso para reducir la actividad ADCC. En consecuencia, la relación de afinidades de unión (por ejemplo, constantes de disociación en equilibrio (Kd)) puede indicar si la actividad ADCC de una variante de Fc está potenciada o reducida. Por ejemplo, una reducción en la relación de las constantes de disociación en equilibro de FcyRIIIA/FcyRIIB (Kd), se correlacionará con actividad ADCC mejorada, mientras que un aumento en la relación se correlacionará con una reducción en la actividad ADCC.

Como parte de la caracterización de las variantes de Fc. estas se ensayaron con respecto a su afinidad de unión por FcyRIIIA (CD16a) y FcyRIIB (CD32b), presentada como una relación en comparación con IgG1 de tipo silvestre. (Véase, Ejemplo 4 y Tabla 5) en este caso fue posible evaluar el impacto de las mutaciones del dominio CH3 en la unión con estos receptores de Fc activadores e inhibidores. En una realización, se proporcionan en el presente documento heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 70 °C, en donde el heterodímero que se une con CD16a es aproximadamente el mismo en comparación con el homodímero de tipo silvestre. En ciertas realizaciones el heterodímero que se une con CD16a aumenta en comparación con el homodímero de tipo silvestre. En una realización alternativa, el heterodímero que se une con CD16a está reducido en comparación con el homodímero de tipo silvestre.

En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 74 °C, en donde el heterodímero que se une con CD32b es aproximadamente el mismo en comparación con el homodímero de tipo silvestre. En ciertas realizaciones la unión del heterodímero con CD32b aumenta en comparación con el homodímero de tipo silvestre. En una realización alternativa, la unión del heterodímero con CD32b se reduce en comparación con el homodímero de tipo silvestre.

Un experto en la materia entenderá que en lugar de presentar la Kd de la unión de CD16a y CD32b como una relación de variante de Fc y homodímero de tipo silvestre, la Kd podría presentarse como una relación de unión de variante de Fc con CD16a y unión de variante de Fc con CD32b (datos no mostrados). Esta relación proporcionaría un indicio de la mutación del dominio CH3 modificado en ADCC, bien sin cambios, aumentado o reducido en comparación con el tipo silvestre, descrito posteriormente en más detalle.

Las afinidades y propiedades de unión de las variantes de Fc de la invención para un FcyR se determinan inicialmente usando ensayos in vitro (ensayos de base bioquímica o inmunológica) conocidos en la técnica para determinar las interacciones Fc-FcyR, es decir, unión específica de una región Fc con un FcyR incluyendo pero no limitado a ensayo de ELISA, ensayo de resonancia de plasmón superficie, ensayos de inmunoprecipitación (véase sección titulada "Ensayos de Caracterización y Funcionales" posteriormente) y otros métodos tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de inhibición competitiva, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), electroforesis en gel y cromatografía (por ejemplo, filtración de gel). Estos y otros métodos pueden utilizar un marcador en uno o más de los componentes que se examinan y/o emplear una diversidad de métodos de detección incluyendo pero no limitado a marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes o isotópicos. Puede encontrarse una descripción detallada de las afinidades y cinética de unión en Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4a Ed., Lippincott-Raven, Filadelfia (1999), que se centra en las interacciones anticuerpo-inmunógeno.

Se contempla que las propiedades de unión de las moléculas de la invención también se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de células efectoras mediadoras de FcyR (véase sección titulada "Ensayos de Caracterización y Funcionales" posteriormente). En ciertas realizaciones, las moléculas de la invención tienen propiedades de unión similares en modelos in vivo (tales como los descritos y divulgados en el presente documento) a los ensayos basados in vitro. Sin embargo, esta invención no excluye moléculas de la invención que no muestran el fenotipo deseado en ensayos basados in vitro pero sí muestran el fenotipo deseado in vivo.

La invención abarca variantes de Fc que se unen con FcyRIIA (CD16a) con afinidad aumentada, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc de la invención se unen con FcyRIIIA con afinidad aumentada y se unen con FcyRIIB (CD32b) con una afinidad aumentada que no cambia o está reducida, en relación con una molécula comparable. En otra realización más, las variantes de Fc de la invención tienen una relación de constantes de disociación en equilibrio de FcyRIIIA/FcyRIIB (Kd) que está reducida en relación con una molécula comparable.

También se abarcan por esta invención variantes de Fc que se unen con FcyRIIIA (CD16a) con afinidad reducida, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc se unen con FcyRIIIA con afinidad reducida, en relación con una molécula comparable y se unen con FcyRIIB con una afinidad de unión que no cambia o está aumentada, en relación con una molécula comparable.

En una realización, las variantes de Fc se unen con afinidad aumentada con FcyRIIIA. En una realización específica, dichas variantes de Fc tienen afinidad por FcyRIIIA que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces o al menos 200 veces superior a la de una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fc tienen una afinidad por FcyRIIIA que está aumentada en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 % o al menos 200 %, en relación con una molécula comparable.

En otra realización, la variante de Fc tiene una constante de disociación en equilibrio (Kd) para un ligando de Fc (por ejemplo, FcyR, C1q) que está reducida entre aproximadamente 2 veces y 10 veces, entre aproximadamente 5 veces y 50 veces, entre aproximadamente 25 veces y 250 veces, entre aproximadamente 100 veces y 500 veces, o entre aproximadamente 250 veces y 1000 veces en relación con una molécula comparable.

En otra realización, dichas variantes de Fc tienen una constante de disociación en equilibrio (Kd) para FcyRIIIA que está reducida en al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces, al menos 200 veces, al menos 400 veces o al menos 600 veces, en relación con una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fc tienen una constante de disociación en equilibrio (Kd) para FcyRIIIA que está reducida en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 % o al menos 200 %, en relación con una molécula comparable.

En una realización, la variante de Fc se une con FcyRIIB con una afinidad que no cambia o está reducida. En una realización específica, dichas variantes de Fc tienen afinidad por FcyRIIB que no cambia o está reducida en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fc tienen una afinidad por FcyRIIB que no cambia o está reducida en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 % o al menos 200 %, en relación con una molécula comparable.

En otra realización, las variantes de Fc tienen una constante de disociación en equilibrio (Kd) para FcyRIIB que no cambia o está aumentada en al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos S0 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces o al menos 200 veces en relación con una molécula comparable. En otra realización específica, las variantes de Fc tienen una constante de disociación en equilibrio (K^d) para FcyRIIB que no cambia o está aumentada en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 % o al menos 200 %, en relación con una molécula comparable.

En otra realización más, las variantes de Fc se unen con FcyRIIIA con afinidad aumentada, en relación con una molécula comparable y se unen con FcyRIIB con una afinidad que no cambia o está reducida, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc tienen una afinidad por FcyRIIIA que está aumentada en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otra realización específica, las variantes de Fc tienen una afinidad por FcyRIIB que no cambia o está reducida en al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fc tienen una afinidad por FcyRIIIA que está aumentada en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 % o al menos 200 %, en relación con una molécula comparable y las variantes de Fc tienen una afinidad por FCyRIIB que no cambia o está aumentada en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 % o al menos 200 %, en relación con una molécula comparable.

En otra realización más, las variantes de Fc tienen una relación de constantes de disociación en equilibrio (K^d) de Fc^yRIIIA/Fc^yRIIB que está reducida en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc tienen una relación de constantes de disociación en equilibrio (K^d) de FcYRIIIA/FcyRIIB que está reducida en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otra realización específica, las variantes de Fc tienen una relación de constantes de disociación en equilibrio (K^d) de FcYRIIIA/FcyRIIB que está reducida en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 % o al menos 200 %, en relación con una molécula comparable.

En otra realización, las variantes de Fc se unen con FcyRIIIA con una afinidad reducida, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, dichas variantes de Fc tienen afinidad por FcyRIIIA que está reducida en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fc tienen una afinidad por FcyRIIIA que está reducida en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 % o al menos 200 %, en relación con una molécula comparable.

En otra realización más, las variantes de Fc se unen con FcyRIIIA con afinidad reducida y se unen con FcyRIIB con una afinidad que no cambia o está aumentada, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc tienen afinidad por FcyRIIIA que está reducida en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces en relación con una molécula comparable. En otra realización específica, las variantes de Fc tienen afinidad por FcyRIIB que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces superior a la de una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fc tienen una afinidad por FcyRIIIA que está reducida en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 % o al menos 200 %, en relación con una molécula comparable y las variantes de Fc tienen una afinidad por FcyRIIB que está aumentada en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 % o al menos 200 %, en relación con una molécula comparable.

En otra realización más, las variantes de Fc tienen una constante de disociación en equilibrio (K^d) para FcyRIIIA que está aumentada en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces al menos 10 al menos 20 veces o al menos 50 veces en comparación con la de una molécula comparable. En una realización específica, dichas variantes de Fc tienen constante de disociación en equilibrio (K^d) para FcyRIIB que está reducida en al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable.

Variaciones de CH2 para selectividad de FcyR

La interacción proteína-proteína Fc-FcyR en este complejo indica que las dos cadenas en la molécula de Fc interaccionan con dos sitios distintos en la molécula de FcyR. Aunque hay simetría en las dos cadenas pesadas en las moléculas de Fc naturales, el ambiente de FcyR local en torno a restos en una cadena es diferente de los restos de FcyR que rodean la misma posición de resto en la cadena de Fc opuesta. Las dos posiciones relacionadas por simetría interaccionan con diferente selección de restos de FcyR.

Dada la asimetría en la asociación de Fc con FcyR, mutaciones simultáneas en la cadena A y B de la molécula de Fc no afectan a las interacciones con FcyR de una manera simétrica. Cuando se introducen mutaciones para optimizar las interacciones en una cadena del Fc con su ambiente de FcyR local, en una estructura de Fc homodimérica, la mutación correspondiente en la segunda cadena puede ser favorable, desfavorable o no contribuir al perfil de selectividad y unión de FcyR requerido.

Usando una estructura y enfoque guiado por computación, se introducen por ingeniería genética mutaciones asimétricas en las dos cadenas del Fc para superar estas limitaciones de las estrategias de ingeniería de Fc tradicionales, que introducen las mismas mutaciones en ambas cadenas de Fc. Se puede conseguir mejor selectividad de unión entre los receptores si las dos cadenas de Fc se optimizan independientemente para unión potenciada con su cara correspondiente de la molécula receptora.

Por ejemplo, pueden diseñarse mutaciones en una posición particular en una cadena del Fc para potenciar la selectividad por un resto particular, un intento de diseño positivo, mientras que la misma posición de resto puede mutarse para interaccionar de forma desfavorable con su ambiente local en un tipo de receptor Fcy alternativo, un esfuerzo de diseño negativo, consiguiendo de este modo mejor selectividad entre los dos receptores. En ciertas realizaciones se proporciona un método para diseñar modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2 que se une selectivamente con un receptor Fcy en comparación con un receptor Fcy diferente (por ejemplo, se une selectivamente con FcgRIIIa en vez de con FcgRIIb). En ciertas otras realizaciones, se proporciona un método para el diseño de modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2 de un heterodímero de Fc variante que comprende modificaciones de aminoácidos en el dominio CH3 para promover la formación de heterodímeros. En otra realización, se proporciona un método para diseñar selectividad con respecto a los receptores Fcy diferentes basándose en un heterodímero de Fc variante que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2. En otra realización más, se proporciona un método para diseñar modificaciones de aminoácidos asimétricas que polarizan la unión de los receptores Fcy con una cara de la molécula de Fc. En ciertas otras realizaciones, se proporciona un método para diseñar conductores de polaridad que polarizan los receptores Fcy para interaccionar con solamente una cara del heterodímero de Fc variante que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2.

El diseño asimétrico de mutaciones en el dominio CH2 puede adaptarse para reconocer el FcyR en una cara de la molécula de Fc. Esta constituye la cara productiva del armazón de Fc asimétrico mientras que la cara opuesta presenta propensión a interacción similar al tipo silvestre sin el perfil de selectividad diseñado y puede considerarse una cara no productiva. Puede emplearse una estrategia de diseño negativo para introducir mutaciones en la cara no productiva para bloquear las interacciones de FcyR con este lado del armazón de Fc asimétrico, forzando de este modo las tendencias de interacción deseadas en los receptores Fcy.

Tabla E: Perfiles de selectividad potencialmente interesantes de Fc para diferentes receptores Fcy Unión al receptor

FcyRIIIa F/V FcyRIIa H/R Fc

t /- x x

(t /-) indica una variante que muestra una unión aumentada o similar a tipo silvestre con el tipo de receptor particular o uno de sus alotipos. (x) indica ausencia de unión observable con el receptor o un alotipo de subconjunto.

La presente invención también se refiere a polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de unión fusionado con una región Fc, en donde la región Fc comprende un dominio CH3 modificado, que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 70 °C. Se contempla específicamente que pueden generarse moléculas que comprenden un heterodímero que comprende un dominio CH3 modificado por métodos bien conocidos por un experto en la materia. Brevemente, dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, combinar una región variable o dominio de unión con la especificidad deseada (por ejemplo, una región variable aislada de una biblioteca de presentación de fagos o de expresión o derivada de un anticuerpo humano o no humano o un dominio de unión de un receptor) con un heterodímero de Fc variante. Como alternativa, un experto en la materia puede generar un heterodímero de Fc variante modificando el dominio CH3 en la región Fc de una molécula que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo).

En una realización, las variantes de Fc son anticuerpos o proteínas de fusión de Fc. En una realización específica, la invención proporciona anticuerpos que comprenden una región Fc que comprende un dominio CH3 modificado, que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 74 °C. Dichos anticuerpos incluyen moléculas de IgG que comprenden de forma natural una región Fc que contiene un dominio CH3 que puede modificarse para generar una variante de Fc, o derivados de anticuerpos que se han modificado por ingeniería genética para contener una región Fc que comprende un dominio CH3 modificado. Las variantes de Fc de la invención incluyen cualquier molécula de anticuerpo que se una, preferentemente, de forma específica (es decir, compite con la unión no específica como se determina por inmunoensayos bien conocidos en la técnica para ensayar unión antígenoanticuerpo específica) con un antígeno que comprenda una región Fc que incorpore un dominio CH3 modificado. Dichos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, biespecíficos, multiespecíficos, humanos, humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab') ² , Fv con enlaces disulfuro y fragmentos que contienen un dominio VL o VH o incluso una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente con un antígeno, en ciertos casos, modificada por ingeniería genética para contener o fusionada con un heterodímero de Fc variante.

"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en donde el anticuerpo secretado unido a receptores de Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente con una célula diana de curación de antígenos y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Anticuerpos IgG de alta afinidad específicos dirigidos a la superficie de células diana "arman" a las células citotóxicas y se requieren de forma absoluta para dicha destrucción. La lisis de la célula diana es extracelular, requiere contacto entre células directo, y no implica el complemento.

Puede ensayarse la capacidad de cualquier anticuerpo particular para mediar en la lisis de la célula diana por ADCC. Para evaluar la actividad ADCC se añade un anticuerpo de interés a células diana en combinación con células efectoras inmunitarias, que pueden activarse por los complejos de anticuerpo y antígeno dando como resultado la citolisis de la célula diana. La citolisis generalmente se detecta por la liberación de marcador (por ejemplo, sustratos radiactivos, marcadores fluorescentes o proteínas intracelulares naturales) de las células lisadas. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos Naturales (NK). Se describen ejemplos específicos de ensayos de ADCC in vitro en Wisecarver et al^., 1985, 79: 277; Bruggemann et al^., 1987, J Exp Med 166: 1351; Wilkinson et al^., 2001, J Immunol Methods 258: 183; Patel et al^., 1995 J Immunol Methods 184: 29 y en el presente documento (véase sección titulada "Ensayos de Caracterización y Funcionales" posteriormente). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC del anticuerpo de interés puede evaluarse in vivo^, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al^., 1998, PNAS USA 95: 652.

Se contempla que las variantes de Fc de la invención se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de células efectoras mediadoras de FcyR. En realizaciones específicas, las moléculas de la invención tienen propiedades de unión similares y funciones de células efectoras en modelos in vivo (tales como los descritos y divulgados en el presente documento) como los de ensayos basados in vitro. Sin embargo, esta invención no excluye moléculas de la invención que no muestran el fenotipo deseado en ensayos basados in vitro pero sí muestran el fenotipo deseado in vivo.

La presente invención proporciona además variantes de Fc con función CDC potenciada. En una realización, las variantes de Fc tienen actividad CDC aumentada. En una realización, las variantes de Fc tienen actividad CDC que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces superior a la de una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fc se unen con C1q con una afinidad que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, superior a la de una molécula comparable. En otra realización más, las variantes de Fc tienen actividad CDC que está aumentada en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200%, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc de la invención se unen con C1q con afinidad aumentada; tienen actividad CDC potenciada y se unen específicamente con al menos un antígeno.

La presente invención también proporciona variantes de Fc con función CDC reducida. En una realización, las variantes de Fc tienen actividad CDC reducida. En una realización, las variantes de Fc tienen actividad CDC que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces inferior a la de una molécula comparable. En otra realización, la variante de Fc se une con C1q con una afinidad que está reducida en al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fc tienen actividad CDC que está reducida en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150% o al menos 200%, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc se unen con C1q con afinidad reducida, tienen actividad c Dc reducida y se unen específicamente con al menos un antígeno.

En algunas realizaciones, las variantes de Fc comprenden una o más glucoformas modificadas por ingeniería genética, es decir, una composición de carbohidratos que está unida covalentemente con una molécula que comprende una región Fc. Las glucoformas obtenidas por ingeniería genética pueden ser útiles para una diversidad de fines, incluyendo pero no se limitan a potenciar o reducir la función efectora. Las glucoformas obtenidas por ingeniería genética pueden generarse por cualquier método conocido por un experto en la materia, por ejemplo usando cepas de expresión modificadas por ingeniería genética o variantes, mediante coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo P(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTI11), expresando una molécula que comprende una región Fc en diversos organismos o líneas celulares de diversos organismos, o modificando un carbohidrato o carbohidratos después de haberse expresado la molécula que comprende región Fc. Se conocen en la técnica métodos para generar glucoformas obtenidas por ingeniería genética, e incluyen pero no se limitan a los descritos en Umana ^{e t al.,} 1999, Nat. Biotechnol 17: 176 a 180; Davies ^{e t al.,} 20017 Biotechnol Bioeng 74: 288 a 294; Shields ^{e t al.,} 2002, J Biol Chem 277: 26733 a 26740; Shinkawa ^{e t al.,} 2003, J Biol Chem 278: 3466 a 3473, Patente de Estados Unidos N.° 6.602.684; N.° de Serie de Estados Unidos 10/277.370; N.° de Serie de Estados Unidos 10/113.929; Documentos PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N. J.); tecnología de ingeniería de glucosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zúrich, Suiza). Véase, por ejemplo, documentos WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki ^{e t al.,} 2004, JMB, 336: 1239 a 49.

Se contempla que las variantes de Fc incluyen anticuerpos que comprenden una región variable y una región Fc heterodimérica, en donde la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 modificado que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con estabilidad aumentada, en donde el dominio CH3 modificado tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 74 °C. Las variantes de Fc que son anticuerpos pueden producirse ^{de n o vo} combinando un dominio variable, o fragmento del mismo, que une específicamente al menos un antígeno con una región Fc heterodimérica que comprende un dominio CH3 modificado. Como alternativa, pueden producirse variantes de Fc heterodiméricas modificando el dominio CH3 de un anticuerpo que contiene región Fc que se une con el antígeno.

Los anticuerpos de la invención pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante, intracuerpos, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos sintéticos, FvFc monocatenarios (scFvFc), Fv monocatenarios (scFv) y anticuerpos antiidiotípicos (anti Id). En particular, los anticuerpos usados en los métodos de esta invención incluyen moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG ¹ , IgG ² , IgG3, IgG4, IgA ¹ e IgA ² ) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos (por ejemplo, ser humano, murino, burro, oveja, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo). En una realización específica, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, en particular anticuerpos monoclonales biespecíficos. Como se usa en el presente documento, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de ratones que expresan anticuerpos de genes humanos.

Los anticuerpos como todos los polipéptidos tienen un Punto Isoeléctrico (pI), que generalmente se define como el pH al que un polipéptido no porta carga neta. Se conoce en la técnica que la solubilidad proteica es típicamente más baja cuando el pH de la solución es igual al punto isoeléctrico (pI) de la proteína. Es posible optimizar la solubilidad alterando el número y localización de restos ionizables en el anticuerpo para ajustar el pI. Por ejemplo, el pI de un polipéptido puede manipularse haciendo las sustituciones de aminoácidos apropiadas (por ejemplo, sustituyendo con un aminoácido cargado tal como una lisina un resto no cargado tal como alanina). Sin desear quedar ligado a ninguna teoría particular, las sustituciones de aminoácidos de un anticuerpo que dan como resultado cambios del pI de dicho anticuerpo pueden mejorar la solubilidad y/o la estabilidad del anticuerpo. Un experto en la materia entendería qué sustituciones de aminoácidos serían las más apropiadas para que un anticuerpo particular alcance un pI deseado. El pI de una proteína puede determinarse por una diversidad de métodos incluyendo pero no limitado a isoelectroenfoque y diversos algoritmos informáticos (véase, por ejemplo Bjellqvist ^{e t al.,} 1993, Electrophoresis 14: 1023). En una realización, el pI de las variantes de Fc de la invención está entre pH 6,2 y pH 8,0. En otra realización, el pI de los anticuerpos de la invención está entre pH 6,8 y pH 7,4. En una realización, las sustituciones que dan como resultado alteraciones en el pI de la variante de Fc de la invención no reducirán de forma significativa su afinidad de unión por un antígeno. Se contempla que el dominio CH3 modificado con una estabilidad aumentada también puede dar como resultado un cambio en el pI. En una realización, se seleccionan específicamente heterodímeros de Fc variantes para efectuar tanto la estabilidad y pureza aumentadas como cualquier cambio deseado en el pI.

Los anticuerpos de la invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o tener multiespecificidad superior. Los anticuerpos multiespecíficos pueden unirse específicamente con diferentes epítopos de la molécula diana deseada o pueden unirse específicamente tanto con la molécula diana como con un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véase, por ejemplo, Publicaciones Internacionales N.° WO 94/04690; WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; y WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147: 60 a 69; Patentes de Estados Unidos N.°; 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920 y 5.601.819 y Kostelny et al., 1992, J. Immunol.148: 1547).

Pueden diseñarse diversas realizaciones de moléculas de dirección multifuncionales basándose en este armazón asimétrico como se muestra en la Figura 20.

Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Aunque dichas moléculas normalmente solamente se unirán a dos antígenos (es decir anticuerpos biespecíficos, BsAb), están abarcados por esta invención anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos. Los ejemplos de BsAb incluyen pero no se limitan a los que tienen un brazo dirigido contra un antígeno de células tumorales y el otro brazo dirigido contra una molécula citotóxica, o ambos brazos se dirigen contra dos antígenos de células tumorales diferentes, o ambos brazos se dirigen contra dos ligandos solubles diferentes, o un brazo se dirige contra un ligando soluble y el otro brazo se dirige contra un receptor de superficie celular, o ambos brazos se dirigen contra dos receptores de superficie celular diferentes. Se conocen en la técnica métodos para realizar anticuerpos biespecíficos.

De acuerdo con un enfoque diferente, se fusionan dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión puede ser con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se contempla que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera está presente en al menos una de las fusiones. Se insertan ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones cuando relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Véase Ejemplo 1 y Tabla 2. Es posible, sin embargo, insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no son particularmente importantes.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados", Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede estar acoplado con avidina, el otro con biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (Patente de Estados Unidos N.° 4.676.980) y para el tratamiento de infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Pueden prepararse anticuerpos heteroconjugados usando cualquier método de reticulación conveniente. Se conocen bien en la técnica agentes de reticulación adecuados, y se divulgan en la Patente de Estados Unidos N.° 4.676.980, junto con varias técnicas de reticulación.

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias que incorporan dominios CH3 modificados y heterodímeros Fc resultantes de la invención. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Véase, por ejemplo, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos de la presente invención también abarcan los que tienen semividas (por ejemplo, semividas en suero) en un mamífero (por ejemplo, un ser humano), superiores a 15 días, superiores a 20 días, superiores a 25 días, superiores a 30 días, superiores a 35 días, superiores a 40 días, superiores a 45 días, superiores a 2 meses, superiores a 3 meses, superiores a 4 meses o superiores a 5 meses. Las semividas aumentadas de los anticuerpos de esta invención en un mamífero (por ejemplo, un ser humano), dan como resultado un mayor título en suero de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en el mamífero, y por lo tanto reducen la frecuencia de la administración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo y/o reducen la concentración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo para administrar. Pueden generarse anticuerpos que tienen semividas in vitro aumentadas por técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos con semividas in vivo aumentadas modificando (por ejemplo, sustituyendo, suprimiendo o añadiendo) restos de aminoácidos que se ha identificado que están implicados en la interacción entre el dominio de Fc y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, Publicaciones Internacionales N.° WO 97/34631; WO 04/029207; Patente de Estados Unidos N.° 6.737.056 y Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0190311).

En una realización específica, el heterodímero de Fc variante que comprende el dominio CH3 modificado es un anticuerpo multiespecífico (indicado en el presente documento como un anticuerpo de la invención), el anticuerpo de la invención se une específicamente con un antígeno de interés. En particular, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo biespecífico. En una realización, un anticuerpo de la invención específicamente se une con un antígeno polipeptídico. En otra realización, un anticuerpo de la invención se une específicamente con un antígeno no polipeptídico. En otra realización más, la administración de un anticuerpo de la invención con un mamífero que padece una enfermedad o trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en ese mamífero.

Prácticamente cualquier molécula puede ser diana de y/o incorporarse en una construcción heterodimérica de Fc variante proporcionada en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos, proteínas de fusión de Fc) incluyendo, pero no limitado a, la siguiente lista de proteínas, así como subunidades, dominios, motivos y epítopos que pertenecen a la siguiente lista de proteínas: renina; una hormona del crecimiento, incluyendo hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor de liberación de hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante de tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona folículo estimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor VII, factor VIIIC, factor IX, factor tisular (TF) y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como Proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como uroquinasa o activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA) u orina humana; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulado en activación normalmente expresado y secretado en linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófagos humana (MIP-1-alfa); una albúmina de suero tal como albúmina de suero humana; sustancia inhibidora Mulleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores del crecimiento tales como, por ejemplo, EGFR, VEGFR; interferones tales como interferón alfa (a -IFN), interferón beta (P-IFN) e interferón gamma (y-IFN); proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como AFGF y PFGF; factor de crecimiento epidérmico (e Gf ); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 o TGF-5; factor de crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des (1-3)-IGF- I (IGF-I del cerebro), proteínas de unión a factor de crecimiento de tipo insulina; proteínas CD tales como Cd 2, CD3, Cd 4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD40, CD40L, CD52, CD63, CD64, CD80 y CD147; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética del hueso (BMP); un interferón tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), tales como M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-13; TNFa , superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración de la desintegración; antígeno vírico tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura del SIDA, por ejemplo, gp120; proteínas de transporte; receptores buscadores; adresinas; proteínas reguladoras; moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Mac 1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, ICAM-3 y VCAM, integrina a4/p7 e integrina (Xv/p3 incluyendo una o subunidades de esta, subunidades de integrina alfa tales como CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, alfa7, alfa8, alfa9, alfaD, CD11a, CD11b, CD51, CD11c, CD41, alfaIIb, alfaIELb; subunidades de integrina beta tales como CD29, CD18, CD61, CD104, beta5, beta6, beta7 y beta8; combinaciones de subunidades de integrina incluyendo pero no limitado a, a Vp3, aVp5 y a4p7; un miembro de una ruta de apoptosis; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor de mp1; CTLA-4; proteína C; un receptor de Eph tal como EphA2, EphA4, EphB2, etc.; un Antígeno de Leucocitos Humanos (HLA) tal como HLA-DR; proteínas del complemento tales como receptor del complemento CR1, C1Rq y otros factores del complemento tales como C3, y C5; un receptor de glucoproteínas tal como GpIba , GPIIb/IIIa y CD200; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos anteriormente enumerados.

También se proporcionan anticuerpos de la invención que se unen específicamente con antígenos de cáncer incluyendo, pero no limitado a, recetor ALK (receptor de pleiotrofina), pleiotrofina, antígeno pancarcinoma KS 1/4; antígeno de carcinoma ovárico (CA125); fosfato ácido prostático; antígeno específico de próstata (PSA), antígeno asociado a melanoma p97; antígeno de melanoma gp75; antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA); antígeno de membrana específico de próstata; antígeno carcinoembrionario (CEA); antígeno de mucina epitelial polimórfica; antígeno de glóbulos de grasa de la lecha humano; antígenos asociados a tumor colorrectal tales como: CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 y LEA; antígeno de linfoma de Burkitt 38.13; CD19; antígeno de linfoma B humano CD20; CD33; antígenos específicos de melanoma tales como gangliósido GD2, gangliósido GD3, gangliósido GM2 y gangliósido GM3; antígeno de superficie celular de tipo trasplante específico de tumor (TSTA); antígenos tumorales inducidos por virus incluyendo antígeno T, virus tumorales de ADN y antígenos de envoltura de virus tumorales de ARN; antígeno oncofetal fetoproteína alfa tal como CEA de colon, glucoproteína de trofoblastos oncofetales 5T4 y antígeno oncofetal de tumor de vejiga; antígeno de diferenciación tal como antígenos de carcinoma de pulmón humano L6 y L20; antígenos de fibrosarcoma; antígeno de linfocitos T de leucemia humana Gp37; neoglucoproteína; esfingolípidos; antígenos de cáncer de mama tales como EGFR (receptor del factor de crecimiento Epidérmico); antígeno NY-BR-16; NY-BR-16 y HER2 (p185HER2); mucina epitelial polimórfica (PEM); antígeno de linfocito humano maligno APO-1; antígeno de diferenciación tal como antígeno I encontrado en eritrocitos fetales; antígeno I de endodermo primario hallado en eritrocitos adultos; embriones preimplantación; I(Ma) hallado en adenocarcinomas gástricos; M18, M39 hallado en epitelio de mama; SSEA-1 hallado en células mieloides; VEP8; VEP9; Myl; Va4-D5; D156-22 hallada en cáncer colorrectal; TRA-1-85 (grupo sanguíneo H); SCP-1 hallado en cáncer de testículo y ovárico; C14 hallado en adenocarcinoma colónico; F3 hallado en adenocarcinoma de pulmón; AH6 hallado en cáncer gástrico; hapteno Y; Ley hallado en células de carcinoma embrionario; TL5 (grupo sanguíneo A); receptor de EGF hallado en células A431; serie Ei (grupo sanguíneo B) hallada en el cáncer pancreático; FC10.2 hallado en células de carcinoma embrionario; antígeno de adenocarcinoma gástrico; CO-514 (grupo sanguíneo Lea) hallado en Adenocarcinoma; NS-10 hallado en adenocarcinomas; CO-43 (grupo sanguíneo Leb); G49 hallado en receptor de EGF de células A431; MH2 (grupo sanguíneo ALeb/Ley) hallado en adenocarcinoma colónico; 19.9 hallado en cáncer de colon; mucinas de cáncer gástrico; T⁵A⁷hallado en células mieloides; R²⁴hallado en melanoma; 4.2, Gd3, D1.1, OFA-1, Gm², OFA-2, Gd², y M1:22:25:8 hallado en células de carcinoma embrionario y SSEA-3 y SSEA-4 hallados en embriones de estadio de 4 a 8 células; antígeno de Linfoma de Linfocitos T Cutáneo; antígeno MART-1; antígeno Sialy Tn (STn); antígeno de cáncer de Colon NY-CO-45; antígeno de cáncer de pulmón NY-LU-12 valiant A; antígeno de Adenocarcinoma ART1; antígeno de cáncer de testículo-cerebro asociado Paraneoplásico (antígeno onconeural MA2; antígeno neuronal paraneoplásico); antígeno ventral Neurooncológico 2 (NOVA2); gen de antígeno de carcinoma Hepatocelular 520; ANTÍGENO ASOCIADO A TUMOR CO-029; antígenos asociados a Tumor MAGE-C1 (antígeno de cáncer/testículo CT7), MAGE-B1 (antígeno MAGE-XP), MAGE-B2 (DAM6), MAGE-2, MAGE-4-a, MAGE-4-b y MAGE-X2; Antígeno de Cáncer-Testículo (NY-EOS-1) y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos anteriormente enumerados.

En ciertas realizaciones, el heteromultímero descrito en el presente documento, comprende al menos un anticuerpo terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo terapéutico se une con un antígeno diana del cáncer. En una realización, el anticuerpo terapéutico puede ser uno que se selecciona del grupo que consiste en abagovomab, adalimumab, alemtuzumab, aurograb, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, briakinumab, canakinumab, catumaxomab, certolizumab pegol, cetuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, galiximab, ozogamicina de gemtuzumab, golimumab, tiuxetano de ibritumomab, infliximab, ipilimumab, lumiliximab, mepolizumab, motavizumab, muromonab, mycograb, natalizumab, nimotuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, tocilizumab/atlizumab, tositumomab, trastuzumab, ProxiniumTM, RencarexTM, ustekinumab, y zalutumumab y cualquier otro anticuerpo.

Los anticuerpos de la invención incluyen derivados que están modificados (es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula con el anticuerpo tal como unión covalente). Por ejemplo, pero no limitado a, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica, enlace con un ligando celular u otra proteína, etc. Puede llevarse a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitado a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Pueden generarse anticuerpos o fragmentos de los mismos con semividas in vivo aumentadas uniendo moléculas poliméricas tales como polietilenglicol de alto peso molecular (PEG) con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. Puede unirse PEG con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con o sin un enlazador multifuncional bien mediante conjugación específica de sitio del PEG con el extremo N o C terminal de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o mediante grupos amino épsilon presentes en restos de lisina. Se usará derivatización de polímeros lineales o ramificados que da como resultado pérdida mínima de la actividad biológica. El grado de conjugación se controlará estrechamente por SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la conjugación apropiada de moléculas de PEG con los anticuerpos. Puede separarse PEG que no ha reaccionado de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante, por ejemplo, exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico.

Además, pueden conjugarse anticuerpos con albúmina para hacer al anticuerpo o fragmento de anticuerpo más estable in vivo o tener una semivida más larga in vivo. Las técnicas se conocen bien en este campo, véase por ejemplo Publicaciones Internacionales N.° WO 93/15199, WO 93/15200, y WO 01/77137; y Patente Europea EP N.° 413.622. Esta invención abarca el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos, conjugados o fusionados con uno o más restos, incluyendo pero no limitado a, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas.

La presente invención abarca el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos fusionados de forma recombinante o conjugados de forma química (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento del mismo, por ejemplo, con un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. La fusión no tiene que ser necesariamente directa, sino que puede realizare mediante secuencias enlazadoras. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos celulares particulares, bien in vitro o bien in vivo fusionando o conjugando los anticuerpos con anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particulares. También pueden usarse anticuerpos fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, publicación Internacional N.° Wo 93/21232; Patente Europea N.° EP 439.095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39: 91 a 99; Patente de Estados Unidos N.° 5.474.981; Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428 a 1432; y Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446 a 2452.

La presente invención incluye además composiciones que comprenden proteínas, péptidos o polipéptidos heterólogos fusionados o conjugados con fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, los polipéptidos heterólogos pueden fusionarse o conjugarse con un fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)², un dominio VH, un dominio VL, una CDR VH, una CDR VL o fragmento de los mismos. Se conocen bien en la técnica métodos para fusionar o conjugar polipéptidos con partes de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.° 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851 y 5.112.946; Patentes Europeas N.° EP 307.434 y EP 367.166; publicaciones Internacionales N.° WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535 a 10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154: 5590 a 5600; y Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11337 a 11341.

Pueden generarse proteínas de fusión adicionales, por ejemplo de anticuerpos que se unen específicamente con un antígeno (por ejemplo, el mencionado anteriormente), mediante las técnicas de combinación de genes, combinación de motivos, combinación de exones y/o combinación de codones (denominados colectivamente "combinación de ADN"). La combinación de ADN puede emplearse para alterar las actividades de anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos con afinidades superiores y velocidades de disociación inferiores). Véase, en general, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252 y 5.837.458, y Patten et al., 1997, Curr. Opinión Biotechnol. 8: 724 a 33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76 a 82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287: 265 a 76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308 a 313. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, pueden alterarse sometiéndolos a mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores, inserción de nucleótidos aleatoria u otros métodos antes de la recombinación. Una o más partes de un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, partes que se unen específicamente con un antígeno pueden recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.

La presente invención abarca además usos de heterodímeros de Fc variantes o fragmentos de los mismos conjugados con un agente terapéutico.

Puede conjugarse un anticuerpo o fragmento del mismo con un resto terapéutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para células. Los ejemplos incluyen ribonucleasa, monometilauristatina E y F, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, puromicina, epirubicina y ciclofosfamida y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbacina), agente alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamino de platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Puede encontrarse una lista más exhaustiva de restos terapéuticos en las publicaciones de PCT WO 03/075957.

Además, puede conjugarse un anticuerpo o fragmento del mismo con un agente terapéutico o resto farmacológico que modifique una respuesta biológica dada. Los agentes terapéuticos o restos farmacológicos no deben interpretarse como limitados a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, Onconasa (u otra RNasa citotóxica), exotoxina de Pseudomonas, toxina del cólera o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón a , interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-a , TNF-P, AIM I (véase, Publicación Internacional N.° WO 97/33899), AIM II (véase, Publicación Internacional N.° WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6: 1567), y VEGI (véase, Publicación Internacional N.° WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina 1 ("IL-1"), interleucina 2 ("IL-2"), interleucina 6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos ("GM-CSF") y factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF")), o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona del crecimiento ("GH")).

Además, puede conjugarse un anticuerpo con restos terapéuticos tales como materiales radiactivos o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (véase anteriormente para ejemplos de materiales radiactivos). En ciertas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N',N",N"-tetraacético (DOTA) que puede unirse con el anticuerpo mediante una molécula enlazadora. Dichas moléculas enlazadoras se conocen habitualmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4: 2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10: 553; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26: 943.

Se conocen en la técnica métodos para fusionar o conjugar anticuerpos con restos polipeptídicos. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.° 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851 y 5.112.946; documentos EP 307.434; EP 367.166; Publicaciones de PCT WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10535; Zheng et al., 1995, J Immunol 154: 5590; y Vil et al., 1992, PNAS USA 89: 11337. La fusión de un anticuerpo con un resto no tiene que ser necesariamente directa, sino que puede producirse mediante secuencias enlazadoras. Dichas moléculas enlazadoras se conocen habitualmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4: 2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10: 553; Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26: 943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171.

La expresión recombinante de una variante, derivado, análogo de Fc o fragmento de los mismos (por ejemplo, un anticuerpo o proteína de fusión de la invención) requiere construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique la variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión). Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión), el vector para la producción de la variante de Fc (por ejemplo anticuerpo o proteína de fusión) puede producirse por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en este campo. Por lo tanto, se describen en el presente documento métodos para preparar una proteína expresando un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión). Pueden usarse métodos que se conocen bien por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contengan secuencias codificantes de variantes de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) y señales de control de la transcripción y la traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La invención proporciona por lo tanto vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de Fc de la invención, unida operativamente con un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, Publicación Internacional N.° WO 86/05807; Publicación Internacional N.° WO 89/01036; y Patente de Estados Unidos N.° 5.122.464 y el dominio variable del anticuerpo, o un polipéptido para generar una variante de Fc puede clonarse en dicho vector para expresión de la cadena de anticuerpo de longitud completa (por ejemplo cadena pesada o ligera) o variante de Fc completa que comprende una fusión de un polipéptido no derivado del anticuerpo y una región Fc que incorpora al menos el dominio CH3 modificado.

El vector de expresión se transfiere a una célula hospedadora por técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan después por técnicas convencionales para producir una variante de Fc de la invención. Por lo tanto, la invención incluye células hospedadoras que contienen un polinucleótido que codifica una variante de Fc de la invención, unido operativamente con un promotor heterólogo. En realizaciones específicas para la expresión de variantes de Fc que comprenden anticuerpos bicatenarios, pueden coexpresarse vectores que codifican las cadenas tanto pesada como ligera en la célula hospedadora para expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla posteriormente.

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de vector de expresión-hospedador para expresar las variantes de Fc de la invención (por ejemplo, anticuerpo o moléculas de proteína de fusión) (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 5.807.715). Dichos sistemas de expresión-hospedador representan vehículos por los que pueden producirse las secuencias codificantes de interés y purificarse posteriormente, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar una variante de Fc de la invención in situ. Estas incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen secuencias codificantes de variantes de Fc; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de variantes de Fc; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de variantes de Fc; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de variantes de Fc; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NS0, y 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5 K de virus vaccinia). En ciertas realizaciones, se usan células bacterianas tales como Escherichia coli, o células eucariotas para la expresión de una variante de Fc, que es un anticuerpo recombinante o moléculas de proteína de fusión. Por ejemplo, las células de mamífero tales como células de ovario de hámster Chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor de gen temprano intermedio principal de citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; y Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2). En una realización específica, la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican una variante de Fc de la invención (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) está regulada por un promotor constitutivo, promotor inducible o promotor específico de tejido.

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse provechosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) que se exprese. Por ejemplo, cuando va a producirse una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una variante de Fc, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12: 1791), en donde la secuencia codificante de la variante de Fc puede ligarse individualmente con el vector en fase con la región codificante de lac Z de modo que se produzca una proteína de fusión de lac Z; vectores pIN (Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke y Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); y similares. También pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos ajenos como proteínas de fusión con glutatión 5-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión con perlas de agarosa de glutatión de matriz seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de factor Xa proteasa o trombina de modo que el producto génico diana clonado pueda liberarse del resto de GST.

En un sistema de insecto se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes ajenos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. Las secuencias codificantes de variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) pueden clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina).

En células hospedadoras de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En casos donde se use un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia codificante de variante de Fc (anticuerpo o proteína de fusión) de interés puede ligarse con un complejo de control de traducción/transcripción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse después en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) en hospedadores infectados (por ejemplo, véase Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359). También pueden requerirse señales de inicio específicas para traducción eficaz de secuencias codificantes de anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de inicio debe estar en fase con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de la traducción exógenas y codones de inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (véase, por ejemplo, Bittner et al^., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).

La expresión de una variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) puede controlarse por cualquier elemento promotor o potenciador conocido en la técnica. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión del gen que codifica una variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) incluyen, pero no se limitan a, la región promotor temprana de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor contenido en la repetición terminal 3' larga del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al^., 1980, Cell 22: 787-797), el promotor de timidina quinasa del herpes (Wagner et al^., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al^., 1982, Nature 296: 39-42), el promotor de tetraciclina (Tet) (Gossen et al^., 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551); vectores de expresión procariotas tales como el promotor de p lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3 727-3731), o el promotor de tac (DeBoer et al^., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25; véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94); vectores de expresión de plantas que comprenden la región promotora de nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al^., Nature 303: 209-213) o el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al^., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871) y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al^., 1984, Nature 310: 115-120); elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), promotor de alcalina fosfatasa y las siguientes regiones de control de la transcripción animales, que muestran especificidad tisular y se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I que está activo en células de acinos pancreáticos (Swift et al^., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al^., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); región de control del gen de insulina que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), región de control del gen de inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al^., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al^., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al^., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), región de control del virus del tumor mamario de ratón que está activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al^., 1986, Cell 45: 485-495), región de control del gen de albúmina que está activa en el hígado (Pinkert et al^., 1987, Genes y Devel. 1: 268-276), región de control del gen de la alfa fetoproteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al^., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al^., 1987, Science 235: 53-58); región de control del gen de alfa 1 -antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al^., 1987, Genes y Devel. 1: 161-171), región de control del gen de beta globina que está activa en células mieloides (Mogram et al^., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al^., 1986, Cell 46: 89-94); región de control del gen de proteína básica de mielina que está activa en oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al^., 1987, Cell 48: 703-712); región de control del gen de cadena ligera 2 de miosina que está activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314: 283-286); enolasa específica neuronal (NSE) que está activa en células neuronales (Morelli et al^., 1999, Gen. Virol. 80: 571-83); región de control del gen de factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) que está activa en células neuronales (Tabuchi et al^., 1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253: 818 823); promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) que está activo en astrocitos (Gomes et al^., 1999, Braz J Med Biol Res 32(5): 619-631; Morelli et al^., 1999, Gen. Virol. 80: 571-83) y región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica que está activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).

Pueden identificarse vectores de expresión que contienen insertos de un gen que codifica una variante de Fc de la invención (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) por tres enfoques generales: (a) hibridación de ácidos nucleicos, (b) presencia o ausencia de funciones de genes "marcadores", y (c) expresión de secuencias insertadas. En el primer enfoque, la presencia de un gen que codifica un péptido, polipéptido, proteína o una proteína de fusión en un vector de expresión pueden detectarse por hibridación de ácidos nucleicos usando sondas que comprenden secuencias que son homólogas de un gen insertado que codifica el péptido, polipéptido, proteína o la proteína de fusión, respectivamente. En el segundo enfoque, el sistema de hospedador/vector recombinante puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones génicas "marcadoras" (por ejemplo, actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) provocadas por la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o proteína de fusión en el vector. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) se inserta dentro de la secuencia génica marcadora del vector, pueden identificarse recombinantes que contienen el gen que codifica el anticuerpo o inserto de proteína de fusión por la ausencia de la función génica marcadora. En el tercer enfoque, pueden identificarse vectores de expresión recombinantes ensayando el producto génico (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) expresado por el recombinante. Dichos ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de la proteína de fusión en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, unión con anticuerpo anti molécula bioactiva.

Además, puede seleccionarse una cepa de célula hospedadora que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de la manera específica deseada. La expresión de ciertos promotores puede elevarse en presencia de ciertos inductores, por lo tanto, puede controlarse la expresión de la proteína de fusión modificada por ingeniería genética. Además, diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación traduccional y postraduccional (por ejemplo, glucosilación, fosforilación de proteínas). Pueden seleccionarse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y procesamiento deseados de la proteína ajena expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano producirá un producto no glucosilado y la expresión en levadura producirá un producto glucosilado. Pueden usarse células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario (por ejemplo, glucosilación y fosforilación) del producto génico. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, NS0, y en particular líneas celulares neuronales tales como, por ejemplo, neuroblastomas humanos SK-N-AS, SK-N-FI, SK-N-DZ (Sugimoto et al., 1984, J. Natl. Cancer Inst. 73: 51-57), neuroblastoma humano SK-N-SH (Biochim. Biophys. Acta, 1982, 704: 450-460), meduloblastoma cerebelar humano de Daoy (He et al., 1992, Cancer Res. 52: 1144-1148), células de glioblastoma DBTRG-05MG (Kruse et al., 1992, In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 609-614), neuroblastoma humano IMR-32 (Cancer Res., 1970, 30: 2110-2118), astrocitoma humano 1321N1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 4816), astrocitoma humano MOG-G-CCM (Br. J. Cáncer, 1984, 49: 269), glioblastoma-astrocitoma humano U87MG (Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968, 74: 465-486), glioblastoma humano A172 (Olopade et al., 1992, Cancer Res. 52: 2523-2529), células de glioma de rata C6 (Benda et al., 1968, Science 161: 370-371), neuroblastoma de ratón Neuro-2a (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1970, 65: 129-136), neuroblastoma de ratón NB41A3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1962, 48: 1184-1190), plexo coroideo de oveja SCP (Bolin et al., 1994, J. Virol. Methods 48: 211-221), astrocito normal de gato PG-4, G355-5 (Haapala et al., 1985, J. Virol. 53: 827-833), cerebro de hurón Mpf (Trowbridge et al., 1982, In Vitro 18: 952-960), y líneas celulares normales tales como, por ejemplo, corteza cerebral normal de rata CTX TNA2 (Radany et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6467-6471) tal como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst. Además, diferentes sistemas de expresión de hospedador/vector pueden efectuar reacciones de procesamiento en diferentes grados.

Para producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere con frecuencia expresión estable. Por ejemplo, pueden obtenerse por ingeniería genética líneas celulares que expresan de forma estable una variante de Fc de la invención (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión). En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos, las células hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, secuencias promotoras, potenciadoras, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN ajeno, puede permitirse que las células obtenidas por ingeniería genética crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse a líneas celulares. Este método puede usarse provechosamente para obtener por ingeniería genética líneas celulares que expresan una variante de Fc que se une específicamente con un antígeno. Dichas líneas celulares obtenidas por ingeniería genética pueden ser particularmente útiles en la exploración y evaluación de compuestos que afectan a la actividad de una variante de Fc (por ejemplo, un polipéptido o una proteína de fusión) que se une específicamente con un antígeno.

Pueden usarse varios sistemas de selección, incluyendo pero no limitados a los genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) que pueden emplearse en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, puede usarse la resistencia a antimetabolitos como la base de selección para genes dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler ^{e t al.,} 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare ^{e t al.,} 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin ^{e t al.,} 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); e higro, que confiere resistencia a higromcina (Santerre ^{e t al.,} 1984, Gene 30: 147).

Una vez que se ha producido una variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o una proteína de fusión) de la invención por expresión recombinante, puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para purificación de una proteína, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de la Proteína A y en columna por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. La variante de Fc generalmente se recupera del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse del lisado de células hospedadoras cuando se produce directamente sin una señal secretora. Si la variante de Fc está unida a membrana, se puede liberar de la membrana usando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, T riton X 100).

Cuando la variante de Fc se produce en una célula recombinante distinta de una de origen humano, está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar la variante de Fc de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas con respecto a la variante de Fc. Como una primera etapa, el medio de cultivo o lisado normalmente se centrifuga para retirar residuos celulares en partículas.

Los heterodímeros de Fc que tienen dominios constantes de anticuerpo pueden purificarse convenientemente por cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. Otras técnicas para purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina Sepharose, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del polipéptido para recuperar. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo del dominio Fc de inmunoglobulina que se use. Puede usarse proteína A para purificar regiones Fc de inmunoglobulina que se basan en las cadenas pesadas y1, ^y2 o y4 humanas (Lindmark ^{e t al.,} J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Se recomienda la proteína G para todos los isotipos de ratón y para ^y3 humano (Guss ^{e t al.,} EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz con la que se une el ligando de afinidad es con más frecuencia agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio poroso controlado o poli(estirendivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden conseguirse con agarosa. Las condiciones para unión de una inmunoadhesina con la columna de afinidad de proteína A o G se determinan completamente por las características del dominio Fc; es decir, su especie e isotipo. Generalmente, cuando se elige el ligando apropiado, se produce unión eficaz directamente a partir de fluido de cultivo no acondicionado. Los heterodímeros de Fc variantes unidos pueden eluirse eficazmente bien a pH ácido (en o por encima de 3,0) o en un tampón de pH neutro que contiene una sal suavemente caotrópica. Esta etapa de cromatografía de afinidad puede dar como resultado una preparación heterodimérica de Fc variante que es >95 % pura.

Los niveles de expresión de una variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) pueden aumentarse por amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in ADN cloning, Vol. 3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Por ejemplo, cuando un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo o proteína de fusión es amplificable, el aumento del nivel de inhibidor presente en cultivo de células hospedadoras aumenta el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada se asocia con el gen de anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo o proteína de fusión (Crouse ^{e t al.,} 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).

La célula hospedadora puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la invención. Por ejemplo, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos, que permiten la misma expresión de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, puede usarse un único vector que codifica, y es capaz de expresar, una proteína de fusión o polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. Las secuencias codificantes para la proteína de fusión o cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico. Ensayos de caracterización y funcionales

Pueden caracterizarse variantes de Fc (por ejemplo, anticuerpos o proteínas de fusión) de esta invención de diversas maneras. En una realización, se evalúa la pureza de los heterodímeros de Fc variantes usando técnicas bien conocidas en este campo incluyendo, pero no limitado a, geles de SDS-PAGE, transferencias Western, densitometría o espectrometría de masas. La estabilidad de las proteínas puede caracterizarse usando una serie de técnicas, pero no limitadas a, cromatografía de exclusión por tamaño, espectroscopía de UV Visible y CD, espectroscopía de masas, dispersión de luz diferencial, ensayo de estabilidad de sobremesa, congelación y descongelación acopladas con otras técnicas de caracterización, calorimetría diferencial de barrido, fluorimetría de exploración diferencial, cromatografía de interacción hidrófoba, isoelectroenfoque, ensayos de unión con receptor o niveles de expresión de proteína relativos. En una realización ilustrativa, se evalúa la estabilidad de los heterodímeros de Fc variantes por la temperatura de fusión del dominio CH3 modificado, en comparación con el dominio CH3 de tipo silvestre, usando técnicas bien conocidas en este campo tales como la calorimetría diferencial de barrido o la fluorimetría de exploración diferencial.

También pueden ensayarse variantes de Fc de esta invención con respecto a la capacidad para unirse específicamente con un ligando (por ejemplo, FcyRIIIA, FcyRIIB, C1q). Dicho ensayo puede realizarse en solución (por ejemplo, Houghten, Bio/Techniques, 13: 412-421, 1992), en perlas (Lam, Nature, 354: 82-84, 1991), en microplacas (Fodor, Nature, 364: 555-556, 1993), en bacterias (Patente de Estados Unidos N.° 5.223.409) en plásmidos (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1865-1869, 1992) o en fagos (Scott y Smith, Science, 249: 386-390, 1990; Devlin, Science, 249: 404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382, 1990; y Felici, J. Mol. Biol., 222: 301-310, 1991). Después pueden ensayarse moléculas que se ha identificado que se unen específicamente con un ligando (por ejemplo, FcyRIIIA, FcyRIIB, C1q o con un antígeno) con respecto a su afinidad por el ligando.

Pueden ensayarse variantes de Fc de la invención con respecto a unión específica con una molécula tal como un antígeno (por ejemplo antígeno de cáncer y reactividad cruzada con otros antígenos) o un ligando (por ejemplo, FcyR) por cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden usarse para analizar unión específica y reactividad cruzada incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como transferencias Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "de tipo sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar solamente algunos. Dichos ensayos son rutinarios y se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).

La afinidad de unión de las variantes de Fc de la presente invención con una molécula tal como un antígeno o un ligando (por ejemplo, FcyR) y la velocidad de disociación de la interacción pueden determinarse por ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de ligando marcado, tal como FcyR (por ejemplo, 3H o 125I con una molécula de interés (por ejemplo, variantes de Fc de esta invención) en presencia de cantidades crecientes de ligando no marcado, tal como FcyR, y la detección de la molécula unida con el ligando marcado. La afinidad de la molécula de esta invención por el ligando y las velocidades de disociación de unión pueden determinarse a partir de los datos de saturación por análisis de scatchard.

También pueden determinarse los parámetros cinéticos de una variante de Fc usando cualquier ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) conocido en la técnica (por ejemplo, análisis cinético de BIAcore). Para una revisión de tecnología basada en SPR véase Mullet et al., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., 1998, Current Opinión in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinión in Biotechnology 11: 54-61. Además, cualquiera de los instrumentos de SPR y métodos basados en SPR para medir interacciones entre proteínas descritos en las Patentes de Estados Unidos N.° 6.373.577; 6.289.286; 5.322.798; 5.341.215; 6.268.125 se contemplan en los métodos de la invención.

Puede usarse separación de células activadas por fluorescencia (FACS), usando cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la materia, para caracterizar la unión de variantes de Fc con una molécula expresada en la superficie celular (por ejemplo, FcyRIIIA, FcyRIIB). Los clasificadores de flujo son capaces de examinar rápidamente un gran número de células individuales que contienen insertos de biblioteca (por ejemplo, 10-100 millones de células por hora) (Shapiro et al., Practical Flow, Cytometry, 1995). Se conocen bien en la técnica citómetros de flujo para clasificar y examinar células biológicas. Se describen citómetros de flujo conocidos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 4.347.935; 5.464.581; 5.483.469; 5.602.039; 5.643.796; y 6.211.477. Otros citómetros de flujo conocidos son el sistema FACS Vantage™ fabricado por Becton Dickinson y Compañía, y el sistema COPAS™ fabricado por Union Biometrica.

Las variantes de Fc de la invención pueden caracterizarse por su capacidad para mediar en la función de células efectoras mediada por FcyR. Los ejemplos de funciones de células efectoras que pueden ensayarse incluyen, pero no se limitan a, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC), fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis, unión con C1q, y citotoxicidad mediada por células dependiente del complemento (CDC). Puede usarse cualquier ensayo basado en células o sin células conocido por los expertos en la materia para determinar la actividad de función de células efectoras (Para ensayos de células efectoras, véase Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggiolini et al., 1998 Experientia, 44(10): 841-8; Lehmann et al., 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown E J. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al., 1990 J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al., 2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al., 1998, Immunity 8: 403-411).

En particular, las variantes de Fc de la invención pueden ensayarse con respecto a actividad ADCC mediada por FcyR en células efectoras (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales) usando cualquiera de los métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Véase, por ejemplo, Perussia ^{e t al.,} 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92). Un ensayo ilustrativo para determinar la actividad ADCC de las moléculas de la invención se basa en un ensayo de liberación de 51Cr que comprende: marcar células diana con [51Cr]Na2CrO4 (esta molécula permeable a membrana celular se usa habitualmente para marcaje dado que se une con proteínas citoplasmáticas y aunque se libera espontáneamente de las células con cinética lenta, se libera de forma masiva después de necrosis de células diana); opsonizar las células diana con las variantes de Fc de la invención; combinar las células diana radiomarcadas opsonizadas con células efectoras en una placa de microtitulación a una relación apropiada de células diana y células efectoras; incubar la mezcla de células durante 16 a 18 horas a 37 °C; recoger sobrenadantes y analizar la radiactividad. La citotoxicidad de las moléculas de la invención puede determinarse después, por ejemplo, usando la siguiente fórmula: % de lisis = (cpm experimental-cpm de fuga diana)/(cpm de lisis de detergente-cpm de fuga diana)x100 %. Como alternativa, el % de lisis = (ADCC-AICC)/(liberación máxima-liberación espontánea). La lisis específica puede calcularse usando la fórmula: lisis específica = % de lisis con las moléculas de la invención-% de lisis en ausencia de las moléculas de la invención. Puede generarse una gráfica variando la relación de células diana:efectoras o concentración de anticuerpos.

Se conocen bien en este campo métodos para caracterizar la capacidad de las variantes de Fc para unirse a C1q y mediar en la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Por ejemplo, para determinar la unión de C1q, puede realizarse un ELISA de unión a C1q. Un ensayo ilustrativo puede comprender lo siguiente: pueden recubrirse placas de ensayo durante una noche a 4 C con variante del polipéptido o polipéptido de partida (control) en tampón de recubrimiento. Las placas pueden después lavarse y bloquearse. Después del lavado, puede añadirse una alícuota de C1q humano a cada pocillo e incubarse durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de un lavado adicional, pueden añadirse 100 |il de un anticuerpo conjugado con peroxidasa anti C1q del complemento de oveja a cada pocillo e incubarse durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa puede lavarse de nuevo con tampón de lavado y pueden añadirse 100 |il de tampón de sustrato que contiene OPD (clorhidrato de O-fenilendiamina (Sigma)) a cada pocillo. Puede permitirse que la reacción de oxidación, observada por la aparición de un color amarillo, continúe durante 30 minutos y se detiene mediante la adición de 100 |il de H2 SO44,5 N. La absorbancia puede después leerse a (492 405) nm.

Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro ^{e t al.,} 1996, J. Immunol. Methods 202: 163). Brevemente, pueden diluirse diversas concentraciones de variante de Fc y complemento humano con tampón. Las células que expresan el antígeno con el que se une la variante de Fc pueden diluirse hasta una densidad de aproximadamente 1*106 células/ml. Pueden añadirse mezclas de la variante de Fc, complemento humano diluido y células que expresan el antígeno a una placa de 96 pocillos de cultivo tisular de fondo plano y permitir que se incube durante 2 horas a 37 C y CO25 % para facilitar la lisis celular mediada por complemento. Después pueden añadirse 50 |il de azul de alamar (Accumed International) a cada pocillo e incubarse durante una noche a 37 C. La absorbancia se mide usando un fluorímetro de 96 pocillos con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados pueden expresarse en unidades de fluorescencia relativas (RFU). Las concentraciones de la muestra pueden calcularse a partir de una curva patrón y se indica el porcentaje de actividad, en relación con una molécula comparable (es decir, una molécula que comprende una región Fc con un dominio CH3 no modificado o de tipo silvestre) para la variante de Fc de interés.

Pueden realizarse ensayos de complemento con suero de cobaya, conejo o humano. La lisis del complemento de células diana puede detectarse controlando la liberación de enzimas intracelulares tales como lactato deshidrogenasa (LDH), como se describe en Korzeniewski ^{e t al.,} 1983, Immunol. Methods 64(3): 313-20; y Decker ^{e t al.,} 1988, J. Immunol Methods 115(1): 61-9; o la liberación de un marcador intracelular tal como europio, cromo 51 o indio 111 con el que las células diana están marcadas.

Métodos

La presente invención abarca administrar una o más variantes de Fc de la invención (por ejemplo, anticuerpos) a un animal, en particular un mamífero, específicamente un ser humano, para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección. Las variantes de Fc de la invención son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno cuando se desee una eficacia alterada de la función de las células efectoras (por ejemplo, ADCC, CDC). Las variantes de Fc y composiciones de las mismas son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de enfermedad neoplásica primaria o metastásica (es decir, cáncer) y enfermedades infecciosas. Pueden proporcionarse moléculas de la invención en composiciones farmacéuticamente aceptables como se conocen en la técnica o como se describen en el presente documento. Como se detalla posteriormente, las moléculas de la invención pueden usarse en métodos para tratar o prevenir cáncer (particularmente en inmunoterapia pasiva), enfermedad autoinmunitaria, trastornos inflamatorios o enfermedades infecciosas.

Las variantes de Fc de la invención también pueden utilizarse provechosamente en combinación con otros agentes terapéuticos conocidos en la técnica para el tratamiento o prevención de un cáncer, enfermedad autoinmunitaria, trastornos inflamatorios o enfermedades infecciosas. En una realización específica, las variantes de Fc de la invención pueden usarse en combinación con anticuerpos monoclonales o quiméricos, linfocinas, o factores de crecimiento hematopoyético (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), que, por ejemplo, actúan para aumentar el número o actividad de células efectoras que interaccionan con las moléculas y aumentar la respuesta inmunitaria. Las variantes de Fc de la invención también pueden utilizarse provechosamente en combinación con uno o más fármacos usados para tratar una enfermedad, trastorno o infección tal como, por ejemplo, agentes antineoplásicos, agentes antiinflamatorios o agentes anti víricos.

En consecuencia, esta invención proporciona métodos para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con el cáncer y afecciones relacionadas administrando una o más variantes de Fc de la invención. Aunque sin pretender quedar ligado a ningún mecanismo de acción, una variante de Fc de la invención que se une con FcyRIIIA y/o FcyRIIA con una mayor afinidad que una molécula comparable, y se une además con FcyRIIB con una menor afinidad que una molécula comparable y/o dicha variante de Fc tiene una función efectora potenciada, por ejemplo, ADCC, CDC, fagocitosis, opsonización, etc. dará como resultado la dirección selectiva y destrucción eficaz de células cancerosas.

La invención abarca además administrar una o más variantes de Fc de la invención en combinación con otras terapias conocidas por los expertos en la materia para el tratamiento o prevención de cáncer, incluyendo pero no limitado a, quimioterapias convencionales y experimentales actuales, terapias hormonales, terapias biológicas, inmunoterapias, radioterapias o cirugía. En algunas realizaciones, las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antineoplásicos, anticuerpos terapéuticos u otros agentes conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o prevención de cáncer. Los ejemplos de regímenes de dosificación y terapias que pueden usarse en combinación con las variantes de Fc de la invención se conocen bien en la técnica y se han descrito en detalle en otra parte (véase por ejemplo, publicaciones de PCT WO 02/070007 y WO 03/075957).

Los cánceres y trastornos relacionados que pueden tratarse o prevenirse por métodos y composiciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: leucemias, linfomas, mielomas múltiples, sarcomas de hueso y tejido conectivo, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer adrenal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cánceres de hipófisis, cánceres oculares, cánceres vaginales, cáncer vulvar, cánceres del cuello uterino, cánceres uterinos, cánceres ováricos, cánceres esofágicos, cánceres de estómago, cánceres de colon, cánceres rectales, cánceres de hígado, cánceres de la vesícula biliar, colangiocarcinomas, cánceres de pulmón, cánceres testiculares, cánceres de próstata, cánceres peneanos, cánceres orales, cánceres de las glándulas salivares, cánceres de faringe, cánceres cutáneos, cánceres de riñón, cánceres de vejiga (para una revisión de dichos trastornos, véase Fishman ^{et al.,} 1985, Medicine, 2a Ed., J. B. Lippincott Co., Filadelfia y Murphy ^{e t al.,} 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cáncer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., Estados Unidos de América).

La invención contempla además modificar por ingeniería genética cualquiera de los anticuerpos conocidos en la técnica para el tratamiento y/o prevención de cáncer y trastornos relacionados, de modo que los anticuerpos comprendan una región Fc que incorpore un dominio CH3 modificado de la invención.

En una realización específica, una molécula de la invención (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un heterodímero de Fc variante) inhibe o reduce el crecimiento de tumor primario o metástasis de células cancerosas en al menos 99 %, al menos 95 %, al menos 90 %, al menos 85 %, al menos 80 %, al menos 75 %, al menos 70 %, al menos 60 %, al menos 50 %, al menos 45 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 35 %, al menos 30 %, al menos 25 %, al menos 20 % o al menos 10 % en relación con el crecimiento de tumor primario o metástasis en ausencia de dicha molécula de la invención.

Esta invención abarca el uso de una o más variantes de Fc de la invención para prevenir, tratar o controlar uno o más síntomas asociados con un trastorno inflamatorio en un sujeto. Aunque sin pretender quedar ligado a ningún mecanismo de acción, las variantes de Fc con afinidad potenciada por FcyRIIB conducirán a una amortiguación de los receptores activadores y por lo tanto una amortiguación de la respuesta inmunitaria y tienen eficacia terapéutica para tratar y/o prevenir un trastorno autoinmunitario. Además, los anticuerpos que se unen con más de una diana, tales como anticuerpos biespecíficos que comprenden un heterodímero de Fc variante, asociado a un trastorno inflamatorio pueden proporcionar efectos sinérgicos sobre la terapia monovalente.

La invención abarca además administrar las variantes de Fc de la invención en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antiinflamatorios. La invención también proporciona métodos para prevenir, tratar o controlar uno o más síntomas asociados con una enfermedad autoinmunitaria que comprenden además administrar a dicho sujeto una variante de Fc de la invención en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes inmunomoduladores. Los ejemplos de trastornos autoinmunitarios que pueden tratarse administrando las variantes de Fc de la invención incluyen, pero no se limitan a, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Addison autoinmunitaria, enfermedades autoinmunitarias de la glándula adrenal, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, ooforitis y orquitis autoinmunitaria, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, enfermedad celiaca-dermatitis, síndrome de disfunción inmunitaria de fatiga crónica (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad de aglutinina fría, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), neuropatía de IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Menier, enfermedad del tejido conectivo mixto, esclerosis múltiple, diabetes mellitus de tipo 1 o mediada por inmunidad, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis Reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome de la persona rígida, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis de takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis tales como vasculitis de dermatitis herpetiforme, vitíligo y granulomatosis de Wegener. Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía indiferenciada, artropatía indiferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones víricas o bacterianas crónicas. Algunos trastornos autoinmunitarios están asociados con una afección inflamatoria, por lo tanto, hay un solapamiento entre lo que se considera un trastorno autoinmunitario y un trastorno inflamatorio. Por lo tanto, algunos trastornos autoinmunitarios también pueden caracterizarse como trastornos inflamatorios. Los ejemplos de trastornos inflamatorios que pueden prevenirse, tratarse o controlare de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía indiferenciada, artropatía indiferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones víricas o bacterianas crónicas.

Las variantes de Fc de la invención también pueden usarse para reducir la inflamación experimentada por animales, particularmente mamíferos, con trastornos inflamatorios. En una realización específica, un Fc de la invención reduce la inflamación en un animal en al menos 99 %, al menos 95 %, al menos 90 %, al menos 85 %, al menos 80 %, al menos 75 %, al menos 70 %, al menos 60 %, al menos 50 %, al menos 45 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 35 %, al menos 30 %, al menos 25 %, al menos 20 % o al menos 10 % en relación con la inflamación en un animal, al que no se administra dicha molécula.

La invención contempla además la modificación por ingeniería genética de cualquiera de los anticuerpos conocidos en la técnica para el tratamiento y/o prevención de enfermedad autoinmunitaria o enfermedad inflamatoria, de modo que los anticuerpos comprendan un heterodímero de Fc variante de la invención.

La invención también abarca métodos para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más variantes de Fc de la invención. Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse por las variantes de Fc de la invención están provocadas por agentes infecciosos incluyendo pero no se limitan a virus, bacterias, hongos, protozoos y virus.

Las enfermedades víricas que pueden tratarse o prevenirse usando las variantes de Fc de la invención junto con los métodos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, las provocadas por virus de hepatitis de tipo A, hepatitis de tipo B, hepatitis de tipo C, gripe, varicela, adenovirus, herpes simple de tipo I (HSV-I), herpes simple de tipo II (HSV-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus del papiloma, papova virus, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus coxsackie, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la polio, viruela, virus de Epstein Barr, virus de la inmunodeficiencia humana de tipo I (HIV-I), virus de la inmunodeficiencia humana de tipo II (HIV-II), y agentes de enfermedades víricas tales como meningitis vírica, encefalitis, dengue o viruela.

Las enfermedades bacterianas que puede tratarse o prevenirse usando las variantes de Fc de la invención junto con los métodos de esta invención, que están provocadas por bacterias incluyen, pero no se limitan a, micobacterias rickettsia, micoplasma, neisseria, S. pneumonía, Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme), Bacillus antracis (carbunco), tétanos, estreptococos, estafilococos, micobacterias, tétanos, pertisus, cólera, peste, difteria, clamidia, S. aureus y legionela. Las enfermedades protozoarias que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los métodos de esta invención, que están provocadas por protozoos incluyen, pero no se limitan a, leishmania, coccidia, tripanosoma o malaria. Las enfermedades parasitarias que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los métodos de la presente invención, que están provocadas por parásitos incluyen, pero no se limitan a, clamidia y rickettsia.

En algunas realizaciones, las variantes de Fc de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o adicionales agentes terapéuticos conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad infecciosa. La invención contempla el uso de las moléculas de la invención en combinación con otras moléculas conocidas por los expertos en la materia para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad infecciosa incluyendo, pero no se limitan a, antibióticos, agentes antifúngicos y agentes anti víricos.

La invención proporciona métodos y composiciones farmacéuticas que comprenden variantes de Fc de la invención (por ejemplo, anticuerpos, polipéptidos). La invención también proporciona métodos de tratamiento, profilaxis y alivio de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección administrando a un sujeto una cantidad eficaz de al menos una variante de Fc de la invención, o una composición farmacéutica que comprende al menos una variante de Fc de la invención. En un aspecto, la variante de Fc está sustancialmente purificada (es decir, sustancialmente sin sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios indeseados, esto incluye homodímeros y otros materiales celulares). En una realización específica, el sujeto es un animal, tal como un mamífero incluyendo no primates (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y primates (por ejemplo, monos tales como un mono cinomolgus y un ser humano). En una realización específica, el sujeto es un ser humano. En otra realización específica más, el anticuerpo de la invención es de la misma especie que el sujeto.

La vía de administración de la composición depende de la afección para tratar. Por ejemplo, puede preferirse inyección intravenosa para el tratamiento de un trastorno sistémico tal como un cáncer linfático o un tumor que se ha metastatizado. La dosificación de las composiciones para administrar puede determinarse por el experto en la materia sin experimentación indebida junto con estudios de respuesta a dosis convencionales. Las circunstancias relevantes para considerar al realizar esas determinaciones incluyen la afección o afecciones para tratar, la elección de composición para administrar, la edad, peso y respuesta del paciente individual, y la gravedad de los síntomas del paciente. Dependiendo de la afección, la composición puede administrarse por vía oral, por vía parenteral, por vía intranasal, por vía vaginal, por vía rectal, por vía lingual, por vía sublingual, por vía bucal, por vía intrabucal y/o por vía transdérmica al paciente.

En consecuencia, las composiciones diseñadas para administración oral, lingual, sublingual, bucal e intrabucal pueden realizarse sin experimentación indebida por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible. La composición puede incluirse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el fin de administración terapéutica oral, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, gomas de mascar y similares.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares también pueden contener aglutinantes, recipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes y/o agentes saporíferos. Algunos ejemplos de aglutinantes incluyen celulosa microcristalina, goma de tragacanto y gelatina. Los ejemplos de excipientes incluyen almidón y lactosa. Algunos ejemplos de agentes disgregantes incluyen ácido algínico, almidón de maíz y similares. Los ejemplos de lubricantes incluyen estearato de magnesio y estearato de potasio. Un ejemplo de un emoliente es dióxido de silicio coloidal. Algunos ejemplos de agentes edulcorantes incluyen sacarosa, sacarina y similares. Los ejemplos de agentes saporíferos incluyen menta, metil salicilato, saporífero de naranja y similares. Los materiales usados al preparar estas diversas composiciones deberían ser farmacéuticamente puros y no tóxicos en las cantidades usadas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención puede administrarse por vía parenteral, tal como, por ejemplo, por inyección intravenosa, intramuscular, intratecal y/o subcutánea. La administración parenteral puede conseguirse incorporando las composiciones de la presente invención en una solución o suspensión. Dichas soluciones o suspensiones también pueden incluir diluyentes estériles, tales como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol y/u otros disolventes sintéticos. Las formulaciones parenterales también pueden incluir agentes antibacterianos tales como, por ejemplo, alcohol bencílico y/o metilparabenos, antioxidantes, tales como, por ejemplo, ácido ascórbico y/o bisulfito sódico, y agentes quelantes, tales como EDTA. También pueden añadirse tampones, tales como acetatos, citratos y fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro sódico y dextrosa. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables y/o frascos de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico. La administración rectal incluye administrar la composición al recto y/o intestino grueso. Esto puede conseguirse usando supositorios y/o enemas. Pueden realizarse formulaciones de supositorios por métodos conocidos en la técnica. La administración transdérmica incluye absorción percutánea de la composición a través de la piel. Las formulaciones transdérmicas incluyen parches, ungüentos, cremas, geles, pomadas y similares. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por vía nasal a un paciente. Como se usa en el presente documento, administrar por vía nasal o la administración nasal incluye administrar las composiciones a las membranas mucosas del orificio nasal y/o cavidad nasal del paciente.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse de acuerdo con los métodos de la invención para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección. Se contempla que las composiciones farmacéuticas de la invención son estériles y están en forma adecuada para su administración a un sujeto.

En una realización las composiciones de la invención son formulaciones sin pirógenos que están sustancialmente sin endotoxinas y/o sustancias pirogénicas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que están confinadas dentro de un microorganismo y se liberan cuando los microorganismos se degradan o mueren. Las sustancias pirogénicas también incluyen sustancias termoestables, inductoras de fiebre (glucoproteínas) de la membrana externa de bacterias y otros microorganismos. Ambas de estas sustancias pueden provocar fiebre, hipotensión y choque si se administran a seres humanos. Debido a los efectos perjudiciales potenciales, es ventajoso retirar incluso cantidades pequeñas de endotoxinas de soluciones farmacológicas administradas por vía intravenosa. La Administración de Fármacos y Alimentos ("FDA") ha establecido un límite superior de 5 unidades de endotoxina (EU) por dosis por kilogramo de peso corporal en un único periodo de una hora para aplicaciones farmacológicas intravenosas (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1): 223 (2000)). Cuando se administran proteínas terapéuticas en cantidades de varios cientos o miles de miligramos por kilogramo de peso corporal, como puede suceder con anticuerpos monoclonales, es ventajoso retirar incluso cantidades traza de endotoxina. En una realización específica, los niveles de endotoxina y pirógeno en la composición son inferiores a 10 EU/mg, inferiores a 5 EU/mg, inferiores a 1 EU/mg, inferiores a 0,1 EU/mg, inferiores a 0,01 EU/mg o inferiores a 0,001 EU/mg.

La invención proporciona métodos para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección, comprendiendo dicho método: (a) administrar a un sujeto que lo necesite una dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una o más variantes de Fc y (b) administrar una o más dosis posteriores de dichas variantes de Fc, para mantener una concentración en plasma de la variante de Fc a un nivel deseable (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 |ig/ml), que se une continuamente con un antígeno. En una realización específica, la concentración en plasma de la variante de Fc se mantiene a 10 |ig/ml, 15 |ig/ml, 20 |ig/ml, 25 |ig/ml, 30 |ig/ml, 35 |ig/ml, 40 |ig/ml, 45 |ig/ml o 50 |ig/ml. En una realización específica, dicha cantidad eficaz de variante de Fc para administrar está entre al menos 1 mg/kg y 8 mg/kg por dosis. En otra realización específica, dicha cantidad eficaz de variante de Fc para administrar está entre al menos 4 mg/kg y 5 mg/kg por dosis. En otra realización específica más, dicha cantidad eficaz de variante de Fc para administrar está entre 50 mg y 250 mg por dosis. En otra realización específica más, dicha cantidad eficaz de variante de Fc para administrar está entre 100 mg y 200 mg por dosis.

La presente invención también abarca protocolos para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección en donde se usa una variante de Fc en combinación con una terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico) distinta de una variante de Fc y/o proteína de fusión variante. La invención se basa, en parte, en el reconocimiento de que las variantes de Fc de la invención potencian y tienen efecto sinérgico con, potencian la eficacia de, mejoran la tolerancia de y/o reducen los efectos secundarios provocados por otras terapias de cáncer, incluyendo quimioterapias actuales convencionales y experimentales. Las terapias de combinación de la invención tienen potencia aditiva, un efecto terapéutico aditivo o un efecto sinérgico. Las terapias de combinación de la invención permiten utilizar dosificaciones inferiores de la terapia (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) junto con variantes de Fc para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección y/o administración menos frecuente de dichos agentes profilácticos o terapéuticos a un sujeto con una enfermedad, trastorno o infección para mejorar la calidad de vida de dicho sujeto y/o para conseguir un efecto profiláctico o terapéutico. Además, las terapias de combinación de la invención reducen o evitan los efectos secundarios no deseados o adversos asociados con la administración de terapias actuales de un único agente y/o terapias de combinación existentes, lo que a su vez mejora la conformidad del paciente con el protocolo del tratamiento. Se conocen bien en la técnica numerosas moléculas que pueden utilizarse en combinación con las variantes de Fc de la invención. Véase, por ejemplo, publicaciones de PCT WO 02/070007; WO 03/075957 y Publicación de Patente de Estados Unidos 2005/064514.

La presente invención proporciona kits que comprenden una o más variantes de Fc con afinidad de unión alterada por FcyR y/o C1q y actividad ADCC y/o CDC alterada que se unen específicamente con un antígeno conjugado o fusionado con un agente detectable, agente terapéutico o fármaco, en uno o más recipientes, para su uso en el control, diagnóstico, prevención, tratamiento o alivio de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección.

EJEMPLOS

Los ejemplos posteriores se proporcionan para ilustrar la práctica de esta invención. No se pretende que limiten o definan el alcance completo de esta invención.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoespecíficos bivalentes con dominios Fc heterodiméricos.

Los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se construyeron mediante síntesis génica usando codones optimizados para expresión en seres humanos/mamíferos. Las secuencias de Fab se generaron a partir de un Ab de unión a Her2/neu conocido (Carter P. ^{e t al.} (1992) Humanization of an anti P185 Her2 antibody for human cancer therapy. ^{P ro c N a tl A c a d} Se; 89, 4285) y el Fc fue un isotipo IgG1 (SEQ ID NO: 1). Los productos génicos finales se subclonaron en el vector de expresión de mamíferos pTT5 (NRC-BRI, Canadá) (Durocher, Y., Perret, S. y Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human HEK293-EBNA1 cells. ^{N u c le ic ac ids re s e a rc h} 30, E9 (2002)). Las mutaciones en el dominio CH3 se introdujeron mediante mutagénesis dirigida de los vectores molde pTT5. Véase Tabla 1 y Tabla 6 y Tabla 7 para una lista de las mutaciones del dominio CH3 modificado realizadas.

Para estimar la formación de heterodímeros y determinar la relación de homodímeros frente a heterodímeros se diseñaron las dos cadenas pesadas de heterodímeros con extensiones C terminales de diferente tamaño (específicamente, cadena A con Marcador His C terminal y cadena B con mRFP C terminal más StrepTaglI). Esta diferencia en el peso molecular permite la diferenciación de homodímeros frente a heterodímeros en SDS-PAGE no reductor como se ilustra en la FIGURA 25A.

Las células HEK293 se transfectaron en fase de crecimiento exponencial (de 1,5 a 2 millones de células/ml) con polietilenimina de 25 kDa 1 mg/ml acuosa (PEI, Polysciences) a una relación PEI:ADN de 2,5:1.(Raymond C. ^{e t al.} A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods.

55(1): 44-51 (2011)). Para determinar el intervalo de concentración óptimo para formar heterodímeros, el ADN se transfectó en tres relaciones separadas de las dos cadenas pesadas. Por ejemplo, esto se realizó en un volumen de cultivo de 2 ml y ADN de transfección, comprendido por GFP 5 %, ADN de esperma de salmón 45 %, cadena ligera 25 % y cadenas pesadas totales 25 %, en donde se tomaron muestras del plásmido de cadena pesada A (con Marcador His C terminal) y el plásmido de cadena pesada B (con StrepTagII C terminal más RFP) a 65 %/55 %/35 % o 10 %/20 %/40 % a 3 relaciones relativas diferentes (cadena_A(His)/cadena_B(mRFP)) de 10 %/65 %; 20 %/55 %; 40 %/35 % (se determinó que la relación de expresión 1:1 aparente de un heterodímero TS_His/TS_mRFP estaba cerca de la relación de ADN 20 %/55 %). A las 4 a 48 horas después de la transfección en medio sin suero F17 (Gibco), se añadió peptona TN1 a una concentración final de 0,5 %. El anticuerpo expresado se analizó por SDS-PAGE para determinar la mejor relación de cadena pesada y ligera para la formación de heterodímeros óptima (Véase Figura 25B y C).

Una relación de ADN seleccionada, por ejemplo se usó 50 % de plásmido de cadena ligera, 25 % de plásmido de cadena pesada A, 25 % de cadena pesada B de AZ33 y AZ34, con 5 % de GFP y 45 % de ADN de esperma de salmón para transfectar 150 ml de cultivo celular como se ha descrito anteriormente. Las células transfectadas se recogieron después de 5 a 6 días con el medio de cultivo recogido después de centrifugación a 4000 rpm y se clarificaron usando un filtro de 0,45 |im. Véase Tabla 2 posterior, para una lista del porcentaje de plásmidos de cadena ligera y pesada A y B usados en los ensayos de transfección a mayor escala para cada uno de los anticuerpos con mutaciones de CH3 generados para análisis adicional, incluyendo determinación de pureza y temperatura de fusión.

Tabla 2:

Ejemplo 2: Purificación de anticuerpos monoespecíficos bivalentes con dominios Fc heterodiméricos.

El medio de cultivo clarificado se cargó en una columna de proteína A MabSelect SuRe (GE Healthcare) y se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón PBS a pH 7,2. El anticuerpo se eluyó con 10 volúmenes de columna de tampón de citrato a pH 3,6 con las fracciones agrupadas que contenían el anticuerpo neutralizadas con TRIS a pH 11. La proteína se desaló finalmente usando una columna Econo-Pac 10DG (Bio-Rad). El marcador de mRFP C terminal en la cadena pesada B se retiró incubando el anticuerpo con enteroquinasa (NEB) a una relación de 1:10.000 durante una noche en PBS a 25 oC. El anticuerpo se purificó de la mezcla por filtración en gel. Para filtración en gel, se concentraron 3,5 mg de la mezcla de anticuerpos con 1,5 ml y se cargaron en una columna de 200 pg Sephadex 200 HiLoad 16/600 (GE Healthcare) mediante un FPLC AKTA Express a un caudal de 1 ml/minuto. Se usó tampón de PBS a pH 7,4 a un caudal de 1 ml/minuto. Las fracciones correspondientes al anticuerpo purificado se recogieron, se concentraron a ~1 mg/ml y se almacenaron a -80 °C.

Se ensayó la formación de heterodímeros, en comparación con homodímeros, usando SDS-PAGE no reductor y espectrometría de masas. El anticuerpo purificado por Proteína A se procesó en un gel no reductor de SDS-PAGE de gradiente de 4 a 12 % para determinar el porcentaje de heterodímeros formados antes del tratamiento con enteroquinasa (EK) (Véase, Figura 26). Para espectrometría de masas, se realizaron todos los experimentos de CL/EM Trap (ESI-TOF) en un sistema Agilent 1100 HPLC en interfaz con un espectrómetro de masas Q-TOF2 Waters. Se inyectaron cinco |ig de anticuerpo purificado por filtración en gel en una MicroTrampa Proteica (1,0 por 8,0 mm), se lavó con acetonitrilo 1 % durante 8 minutos, un gradiente de 1 a 20 % de acetonitrilo/0,1 % de ácido fórmico durante 2 minutos, después se eluyó con un gradiente de 20 a 60 % de acetonitrilo/0,1 % de ácido fórmico durante 20 minutos. El eluato (30 a 50 |il/minuto) se dirigió al espectrómetro con un espectro adquirido cada segundo (m/z de 800 a 4.000). (Véase, Figura 28). Se seleccionaron variantes que tenían más del 90 % de heterodímeros para análisis posterior, con la excepción de AZ12 y AZ14 que tenían cada uno más de 85 % de formación de heterodímeros.

Ejemplo 3: Determinación de estabilidad de anticuerpos monoespecíficos bivalentes con dominios Fc heterodiméricos usando calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Todos los experimentos de DSC se llevaron a cabo usando un instrumento GE VP-Capillary. Se intercambió el tampón de las proteínas a PBS (pH 7,4) y se diluyó de 0,4 a 0,5 mg/ml con 0,137 ml cargados en la célula de la muestra y se midió con una velocidad de exploración de 1 °C/minuto de 20 a 100 °C. Los datos se analizaron usando el software Origin (GE Healthcare) con el fondo del tampón de PBS restado (Véase, Figura 27). Véase Tabla 3 para una lista de variantes ensayadas y una temperatura de fusión determinada. Véase la Tabla 4 para una lista de las variantes con una temperatura de fusión de 70 °C y superior y la Tm específica para cada variante.

Tabla 3: Mediciones de temperatura de fusión de dominios CH3 modificados en un anticuerpo IgG1 que tiene 90 % o más de formación de heterodímeros en com aración con formación de homodímeros

Tabla 4: Mediciones de temperatura de fusión de dominios CH3 modificados seleccionados en un anticuerpo IgG1 ,

Ejemplo 4: Evaluación de la unión de FcgammaR usando resonancia de plasmón superficial

Todos los experimentos de unión se llevaron a cabo usando un instrumento BioRad ProteOn XPR36 a 25 °C con HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM y Tween 20 0,05 % a pH 7,4. Se capturó HER-2/neu recombinante (p185, ErbB-2 (eBiosciences, Inc.)) en la microplaca sensora GLM activada inyectando 4,0 |ig/ml en NaOAc 10 mM (pH 4,5) a 25 |il/minuto hasta que se inmovilizaron aproximadamente 3000 unidades de resonancia (RU) con los grupos activos restantes inactivados. Se capturaron indirectamente 40 |ig/ml de anticuerpos anti HER-2/neu purificados que comprendían los dominios CH3 modificados en la microplaca sensora uniendo la proteína Her-2/neu cuando se inyectó a 25 ^l/minuto durante 240 segundos (dando como resultado aproximadamente 500 RU) después de una inyección de tampón para establecer una línea basal estable. Se inyectaron concentraciones (6000, 2000, 667, 222 y 74,0 nM) de FcgammaR (CD16a (alotipo f) y CD32b) a 60 ^l/minuto durante 120 segundos con una fase de disociación de 180 segundos para obtener un conjunto de sensogramas de unión. Los valores de K ^d resultantes se determinaron a partir de isotermas de unión usando el modelo de Ajuste de Equilibrio con valores presentados como la media de tres ciclos independientes. Se realizaron comparaciones con el dominio Fc IgG1 de tipo silvestre y la unión se expresa como una relación de la kD TS con la kD variante (Véase, Tabla 5).

Tabla 5: Relación de kD de IgG1 de tipo silvestre y anticuerpo de dominio CH3 modificado que se unen de f rm in n i n D1 D 2

continuación

Ejemplo 5: Diseño racional de variantes de Fc usando modificación por ingeniería genética de Fc_CH3 -Armazón 1 (1a y 1b) y el desarrollo de AZ17-62 y AZ133-AZ2438

Para obtener variantes de AZ con alta estabilidad y pureza, se emplearon las estrategias estructurales y conmutacionales descritas anteriormente (véase, Figura 24). Por ejemplo, el análisis de función estructural en profundidad de AZ8 proporcionó un entendimiento detallado para cada una de las mutaciones introducidas de AZ8, L351Y_V397S_F405A_Y407V / K392V_T394W en comparación con IgG1 humano de tipo silvestre e indicó que las mutaciones heterodiméricas del núcleo importantes eran L351Y_F405A_Y407V / T394W, mientras que V397S, K392V no eran relevantes para la formación de heterodímeros. Las mutaciones del núcleo (L351Y_F405A_Y407V / T394W) se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón 1". El análisis reveló además que los puntos calientes de interfaz importantes que se pierden con respecto a la formación de homodímeros de tipo silvestre (TS) son las interacciones de TS-F405-K409, Y407-T366 y el empaquetamiento de Y407-Y407 y F405 (Véase, Figura 29). Esto se reflejó en el análisis de empaquetamiento, cavidad y MD, que mostró una gran diferencia conformacional en la región de bucle D399-S400-D401 (Véase, Figura 30) y las láminas p asociadas en K370. Esto dio como resultado la pérdida de las interacciones intercatenarias K409-D399 (Véase, Figura 30) y el debilitamiento del enlace de hidrógeno K370 fuerte con E357 (K370 ya no está en contacto directo con S364 y E357, pero está expuesto completamente al disolvente). En el dominio CH3 de IgG1 TS estas regiones se unen a la interfaz en el borde y protegen las interacciones del núcleo de la competición por disolvente masiva y aumenta la aparición dinámica de interacciones de van der Waals hidrófobas favorables. La consecuencia fue un área de superficie internada inferior de AZ8 en comparación con TS y una mayor accesibilidad al disolvente del núcleo hidrófobo. Esto indicó que los factores más importantes para la inferior estabilidad de AZ8 en comparación con la estabilidad de TS fueron a) la pérdida de la interacción TS-F405-K409 y empaquetamiento de F405 y b) la pérdida de la interacción de empaquetamiento fuerte de Y407-Y407 y Y407-T366. Véase, Figura 29.

En consecuencia, los inventores identificaron los restos/motivos de secuencia claves responsables de la estabilidad baja de AZ8 en comparación con TS. Para mejorar la estabilidad y especificidad de heterodímeros de AZ8 los intentos de ingeniería genética de diseño positivo posteriores se centraron específicamente por lo tanto en la estabilización de la conformación en bucle de las posiciones 399-401 en una conformación de tipo TS más "cerrada" (Véase, Figura 30) y la compensación del empaquetamiento general ligeramente reducido (más suelto) del núcleo hidrófilo en las posiciones t 366 y L368 (Véase, Figura 29).

Para conseguir esta estabilización de la conformación en bucle de las posiciones 399-401 se usó el enfoque computacional descrito para evaluar las diferentes ideas de diseño dirigido de los inventores. Específicamente, se analizaron tres opciones independientes diferentes para la variante de Fc AZ8 para optimizar las regiones clave identificadas para mejorar la estabilidad. En primer lugar, se evaluó el bolsillo de unión cercano a la posición K409 y F405A con respecto a un mejor empaquetamiento hidrófobo tanto para proteger el núcleo hidrófobo como para estabilizar la conformación en bucle de 399-400 (Véase, Figura 30). Esto incluyó, pero no se limitan a mutaciones puntuales adicionales en las posiciones F405 y K392. En segundo lugar, se evaluaron las opciones para mejorar las interacciones electrostáticas de las posiciones 399-409, para estabilizar la conformación en bucle de 399-400 y proteger el núcleo hidrófobo. Esto incluyó, pero no se limitó a, mutaciones puntuales adicionales en las posiciones T411 y S400. En tercer lugar, se evaluó el bolsillo de unión en las posiciones de empaquetamiento del núcleo T366, T394W y L368 para mejorar el empaquetamiento hidrófobo del núcleo (Véase, Figura 29). Esto incluyó, pero no se limitó a, mutaciones puntuales adicionales en las posiciones T366 y L368. Las diferentes ideas de diseño independientes se ensayaron por ordenador y se validaron ciertas variantes buenas usando las herramientas computacionales (AZ17 a AZ62) experimentales con respecto a expresión y estabilidad como se describe en los Ejemplos 1-4. Véase la Tabla 4 para una lista de ciertas construcciones heterodiméricas basadas en Fc que comprenden esta estrategia de diseño, con una temperatura de fusión de 70 °C o superior.

La variante de Fc AZ33 es un ejemplo del desarrollo de una variante de Fc en donde el Armazón 1 se modificó dando como resultado mutaciones de Armazón 1a para mejorar la estabilidad y pureza. Esta variante de Fc se diseñó basándose en AZ8 con el objetivo de mejorar el empaquetamiento hidrófobo en las posiciones 392-394-409 y 366 tanto para proteger el núcleo hidrófobo como para estabilizar la conformación en bucle de 399-400. Este heterodímero AZ33 variante de Fc tiene dos mutaciones puntuales adicionales diferentes de las mutaciones del núcleo de AZ8, K392M y T366I. Las mutaciones T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón 1a". La mutación K392M se diseñó para mejorar el empaquetamiento en la cavidad cerca de la posición K409 y F405A para proteger el núcleo hidrófobo y estabilizar la conformación en bucle de 399-400 (Véase, Figura 31). T366I se diseñó para mejorar el empaquetamiento hidrófobo del núcleo y para eliminar la formación de homodímeros de la cadena T394W (Véase, Figura 29). Los datos experimentales para AZ33 mostraron estabilidad significativamente mejorada frente a otras variantes de Fc de diseño negativo tales como AZ8 (Tm 68 °C) en donde AZ33 tiene una Tm de 74 °C y un contenido heterodimérico de >98 %. (Véase, Figura 25C)

Desarrollo de variantes de Fc usando mutaciones de Armazón 1 en el diseño de fase tres de heterodímeros variantes de Fc

Aunque AZ33 proporciona una mejora de la estabilidad y especificidad (o pureza) significativa sobre la variante de partida inicial AZ8, el análisis de los inventores indica que pueden realizarse mejoras adicionales a la estabilidad del heterodímero variante de Fc con modificaciones de aminoácidos adicionales usando los datos experimentales de AZ33 y los métodos de diseño anteriormente descritos. Las diferentes ideas de diseño se han ensayado de forma independiente con respecto a expresión y estabilidad, pero las ideas de diseño independientes son transferibles y el heterodímero más exitoso contendrá una combinación de los diferentes diseños. Específicamente, para optimización de AZ8 se han evaluado mutaciones de empaquetamiento en la cavidad cerca de K409-F405A-K392 de forma independiente de mutaciones que optimizan el empaquetamiento del núcleo en los restos L366T-L368. Estas dos regiones 366-368 y 409-405-392 están distantes entre sí y se consideran independientes. La variante de Fc AZ33 por ejemplo se ha optimizado con respecto a empaquetamiento en 409-405-392, pero no en 366-368, debido a que estas mutaciones de optimización se evaluaron por separado. La comparación de las mutaciones 366-368 sugiere que T366L tiene una estabilidad mejorada sobre T366 y también T366I, la mutación puntual usada en el desarrollo de la variante de Fc AZ33. En consecuencia, los datos experimentales presentados inmediatamente sugieren optimización adicional de AZ33 introduciendo T366L en lugar de T366I, por ejemplo. Por lo tanto, las mutaciones de aminoácidos en el dominio CH3 T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón 1b".

De una manera similar, se han analizado los datos experimentales completos para identificar mutaciones puntuales que puedan usarse para mejorar adicionalmente el heterodímero variante de Fc actual AZ33. Estas mutaciones identificadas se analizaron por el enfoque computacional anteriormente descrito y se clasificaron para producir la lista de heterodímeros variantes de Fc adicionales basados en AZ33 como se muestra en la Tabla 6.

Ejemplo 6: Diseño racional de variantes de Fc usando modificación por ingeniería genética de Fc_CH3 -Armazón 2 (a y b) y el desarrollo de AZ63-101 y AZ2199-AZ2524

Para mejorar la variante de Fc de fase de diseño negativo inicial AZ15 con respecto a estabilidad y pureza, se emplearon las estrategias estructurales y computacionales descritas anteriormente (Véase, Figura 24). Por ejemplo, el análisis de función estructural en profundidad de la variante de Fc AZ15 proporcionó un entendimiento detallado para cada una de las mutaciones introducidas de AZ15, L351Y_Y407A/ E357L_T366A_K409F_T411N en comparación con IgG1 humano de tipo silvestre (TS) e indicó que las mutaciones heterodiméricas del núcleo importantes eran L351Y_Y407A / T366A_K409F, mientras que E357L, T411N no eran directamente relevantes para la formación y estabilidad de heterodímeros. Las mutaciones del núcleo (L351Y_Y407A / T366A_K409F) se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón 2". El análisis reveló además que los puntos calientes de interfaz importantes que se pierden con respecto a formación de homodímeros de tipo silvestre (TS) son el enlace salino D399-K409, el enlace de hidrógeno Y407-T366 y el empaquetamiento de Y407-Y407. El análisis detallado, proporcionado posteriormente, describe cómo los inventores mejoraron la estabilidad de su variante de Fc original AZ15 y las posiciones y modificaciones de aminoácidos realizadas para conseguir estas variantes de Fc con estabilidad mejorada.

Desarrollo de variantes de Fc usando mutaciones de Armazón 2 y el desarrollo adicional de mutaciones de Armazón 2a.

El análisis por ordenador indicó un empaquetamiento no óptimo de diseños variantes de Fc previos tales como mutaciones de AZ15 K409F_T366A_Y407A y un empaquetamiento reducido general del núcleo hidrófobo debido a la pérdida de las interacciones TS-Y407-Y407. Los heteromultímeros descritos en el presente documento se diseñan con empaquetamiento más óptimo. Algunos de los intentos de diseño positivo descritos en el presente documento se centraron en mutaciones puntuales para compensar déficit de empaquetamiento en la variante de Fc inicial AZ15. Los restos diana incluían las posiciones T366, L351 y Y407. Se ensayaron diferentes combinaciones de las mismas por ordenador y las variantes de Fc mejor clasificadas usando las herramientas computacionales (AZ63-AZ70) se validaron experimentalmente con respecto a expresión y estabilidad como se describe en los Ejemplos 1-4.

La variante de Fc AZ70 es un ejemplo del desarrollo de una variante de Fc en donde el Armazón 2 se modificó dando como resultado mutaciones de Armazón 2a para mejorar la estabilidad y pureza. Esta variante de Fc se diseñó basándose en AZ15 con el objetivo de conseguir mejor empaquetamiento en el núcleo hidrófobo como se ha descrito anteriormente. La variante de Fc AZ70 tiene las mismas mutaciones de núcleo de Armazón 2 (L351Y_Y407A / T366A_K409F) que se han descrito anteriormente excepto que T366 se mutó a T366V en lugar de T366A (FIGURA 33). La mutación L351Y mejora la temperatura de fusión de la variante 366A_409F/407A de 71,5 °C a 74 °C y el cambio adicional de 366A a 366V mejora la Tm a 75,5 °C. (Véase, AZ63, AZ64 y AZ70 en la Tabla 4, con una Tm de 71,5 °C, 74 °C y 75,5 °C, respectivamente). Las mutaciones del núcleo (L351Y_Y407A / T366V_K409F) se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón 2a". Los datos experimentales para la variante de Fc AZ70 mostraron estabilidad significativamente mejorada sobre el diseño negativo inicial de variante Fc AZ15 (Tm 71 °C) en donde AZ70 tiene una Tm de 75,5 °C y un contenido heterodimérico de >90 % (FIGURA 33 y 27).

Desarrollo de variantes de Fc usando mutaciones de Armazón 2 y el desarrollo adicional de mutaciones de Armazón 2b.

La simulación de Dinámica Molecular (MD) y análisis de empaquetamiento mostró una conformación preferida más "abierta" del bucle 399-400, que probablemente se debía a pérdida del enlace salino TS K409-D399. Esto también da como resultado el D399 no satisfecho, que a su vez prefería una interacción de compensación con K392 e indujo una conformación más "abierta" del bucle. Esta conformación en bucle más "abierta" da como resultado un empaquetamiento general reducido y mayor accesibilidad al disolvente de los restos de la interfaz de dominio CH3 del núcleo, lo que a su vez desestabilizó significativamente el complejo heterodimérico. Por lo tanto, uno de los intentos de diseño positivo dirigido fue la unión de este bucle en una conformación de tipo TS, más "cerrada", mediante mutaciones puntuales adicionales que compensan la pérdida del enlace salino D399-K409 y las interacciones de empaquetamiento de K409. Los restos diana incluyeron las posiciones T411, D399, S400, F405, N390, K392 y combinaciones de las mismas. Se ensayaron diferentes estrategias de empaquetamiento, ingeniería genética positiva hidrófoba y electrostática por ordenador con respecto a las posiciones anteriores y se validaron las variantes de Fc mejor clasificadas determinadas usando las herramientas computacionales (AZ71-AZ101) experimentalmente con respecto a expresión y estabilidad como se describe en los Ejemplos 1 a 4.

La variante de Fc AZ94 es un ejemplo del desarrollo de una variante de Fc en donde el Armazón 2 se modifica dando como resultado mutaciones del Armazón 2b junto con mutaciones puntuales adicionales para mejorar la estabilidad y pureza. Esta variante de Fc se diseñó basándose en el objetivo de unir el bucle 399-400 en una conformación de tipo TS más "cerrada", y compensar la pérdida del enlace salino D399-K409 como se ha descrito anteriormente. La variante de Fc AZ94 tiene cuatro mutaciones puntuales adicionales del Armazón 2 (L351Y_Y407A / T366A_K409F) y devuelve L351Y a L351 de tipo silvestre dejando (Y407A / T366A_K409F) como las mutaciones del núcleo para esta variante de Fc. Las mutaciones de núcleo Y407A / T366A_K409F se denominan en el presente documento mutaciones de "Armazón 2b". Las cuatro mutaciones puntuales adicionales de AZ94 son K392E_T411E / D399R_S400R. Las mutaciones T411E / D399R se modificaron por ingeniería genética para formar un enlace salino adicional y compensar la pérdida de la interacción K409 / D399 (FIGURA 34). Adicionalmente, este enlace salino se diseñó para evitar la formación de homodímeros desfavoreciendo las interacciones entre cargas en ambos homodímeros potenciales. Se pretendía que las mutaciones adicionales K392E / S400R formaran otro enlace salino y de este modo unieran adicionalmente el bucle 399_400 en una conformación de tipo TS más "cerrada" (FIGURA 34). Los datos experimentales para AZ94 mostraron estabilidad y pureza mejoradas sobre la variante de Fc de diseño negativo inicial AZ15 (Tm 71 °C, >90 % de pureza) en donde la variante de Fc AZ94 tiene una Tm de 74 °C y un contenido heterodimérico o pureza de >95 %.

Desarrollo de variantes de Fc usando mutaciones del Armazón 2 en el diseño de fase tres de heterodímeros variantes de Fc

Las variantes de Fc AZ70 y AZ94 proporcionan una mejora significativa en la estabilidad y pureza sobre las variantes de Fc de diseño negativo inicial tales como AZ15, pero el análisis de los inventores y la comparación de AZ70 y AZ94 indican directamente que pueden realizarse mejoras inesperadas a la estabilidad del heterodímero variante de Fc con modificaciones de aminoácidos adicionales. Por ejemplo, las variantes de Fc AZ70 y AZ94 se diseñaron para dirigir dos regiones no optimizadas distintas en la variante inicial AZ15, lo que se consiguió mejorando el empaquetamiento en el núcleo hidrófobo y realizando mutaciones fuera de los restos de interfaz del núcleo dando como resultado un enlace salino adicional y enlaces de hidrógeno para estabilizar la conformación en bucle de las posiciones 399-401. Las mutaciones puntuales adicionales de las variantes de Fc AZ70 y AZ94 están distantes entre sí y son por tanto independientes y transferibles a otras variantes de Fc diseñadas en torno a las mismas mutaciones del núcleo del Armazón 2, incluyendo mutaciones 2a y 2b. Específicamente, AZ70 solamente porta las mutaciones de núcleo optimizadas L351Y_Y407A / T366A_K409F, pero no enlaces salinos adicionales, mientras que AZ94 comprende cuatro mutaciones electrostáticas adicionales (K392E_T411E/D399R_S400R), pero tiene una mutación menos en la interfaz de núcleo hidrófobo (Y407A/T366A_K409F). Estas mutaciones de Armazón 2b son menos estables que AZ70 (véase, por ejemplo AZ63, que tiene mutaciones de núcleo equivalentes a AZ94 y Tm de 72 °C), pero se compensan por la adición de mutaciones K392E_T411E / D399R_S400R. Los datos de estabilidad y pureza experimentales presentados indican que la combinación de las mutaciones de AZ70, que optimiza el núcleo hidrófobo, y las mutaciones electrostáticas AZ94 deberían mejorar más la estabilidad y pureza de los heterodímeros variantes de Fc. De manera similar los datos experimentales completos para las variantes de Fc de Armazón 2 (AZ63-101) se han analizado para identificar mutaciones puntuales que pueden usarse para mejorar adicionalmente los heterodímeros variantes de Fc AZ70 y AZ94. Estas mutaciones identificadas se analizaron adicionalmente por el enfoque computacional anteriormente descrito y se clasificaron para producir la lista de heterodímeros variantes de Fc adicionales basándose en AZ70 y AZ94 como se muestra en la Tabla 7.

Ejemplo 7: Efecto de CH3 heterodimérico en la unión de FcgR

Como un ejemplo prototípico de la actividad de Fc heterodimérico con FcgR, se ensayaron dos anticuerpos variantes con región Fc heterodimérica A:K409D_K392D/B:D399K_D356K (Control 1 (het 1 en la Figura 35)) y A:Y349C_T366S_L368A_Y407V/B:S354C_T366W (Control 4 (het 2 en la Figura 35)) con brazos de Fab de unión a Her2 en un ensayo de SPR descrito en el Ejemplo 4 para unión con FcgR. Como se muestra en la Figura 35, los inventores observan que ambas regiones Fc heterodiméricas se unen con los diferentes receptores Fcgamma con la misma fuerza relativa que la región Fc IgG1 de tipo silvestre, pero en general, la región Fc heterodimérica se unió a cada uno de los FcgR ligeramente mejor que el anticuerpo de tipo silvestre. Esto indica que las mutaciones en la interfaz de CH3 de Fc pueden influir en la fuerza de unión de la región Fc con respecto a receptores Fcgamma a través de los dominios CH2 como se observa en las simulaciones de dinámica molecular y análisis de los inventores.

Ejemplo 8: Efecto de las mutaciones asimétricas en CH2 de un Fc heterodimérico en la unión de FcgR

Se sabe que la mutación de Serina en la posición 267 en el dominio CH2 de la región Fc a un ácido Aspártico (S267D) potencia la unión con los receptores Fcgamma IIbF, IIbY y IIaR cuando se introducen de una manera homodimérica en las dos cadenas del dominio CH2. Esta mutación puede introducirse en solamente uno de los dominios CH2 en una molécula Fc heterodimérica para obtener aproximadamente la mitad de la mejora de la fuerza de unión en relación con cuando esta mutación se introduce en un Fc de CH2 homodimérico como indican los datos presentados en la Figura 36A. Por otro lado, la mutación E269K en un dominio CH2 homodimérico de Fc evita la unión de la región Fc con FcgR. Los inventores presentan un esquema para la manipulación potenciada de la fuerza de unión de la región Fc con respecto a los receptores Fcg por la introducción asimétrica de estas mutaciones favorables y desfavorables en una de las dos cadenas en el dominio CH2 del Fc. La introducción de la mutación E269K de una manera asimétrica en una cadena CH2 en un Fc heterodimérico actúa como un conductor de polaridad bloqueando la unión del FcgR en la cara en donde esté presente, dejando al mismo tiempo la otra cara del Fc interaccionar con el FcgR de una manera normal. Los resultados de esta experimentación se presentan en la Figura 36A. La oportunidad para alterar de forma selectiva la fuerza de unión mediante ambas cadenas de Fc de una manera independiente proporciona oportunidad aumentada para manipular la fuerza de unión y selectividad entre Fc y los receptores Fcg. Por lo tanto, dicho diseño asimétrico de mutaciones en el dominio CH2 permite a los inventores introducir estrategias de diseño positivas y negativas para favorecer o desfavorecer ciertos modelos de unión, proporcionando mayores oportunidades para introducir selectividad.

En un experimento posterior, los inventores han alterado el perfil de selectividad del mutante de Fc base S239D_D265S_I332E_S298A que muestra fuerza de unión aumentada con los receptores Fcgamma IIIaF y IIIaV mientras continúa mostrando unión más débil con los receptores Fcgamma IIaR, IIbF y IIbY. Esto se muestra en el perfil de unión mostrado en la Figura 36B. Introduciendo mutaciones asimétricas E269K en la cadena A y evitando la mutación I332E en la cadena B, los inventores pueden generar un nuevo perfil de unión de FcgR que debilita adicionalmente la unión con el receptor IIa y IIb y hace al Fc más específico para la unión con el receptor IIIa.

En otro ejemplo mostrado en la Figura 36C, las mutaciones asimétricas se destacan en relación con el Fc homodimérico e implica la mutación S239D/K326E/A330L/I332E/S298A en el dominio CH2. En relación con el Fc IgG1 de tipo silvestre, esta variante muestra unión aumentada con el receptor IIIa pero también se une con los receptores IIa y IIb de forma ligeramente más fuerte que el Fc de tipo silvestre. La introducción de estas mutaciones de una manera asimétrica A:S239D/K326E/A330L/I332E y B:S298^areduciendo a la vez la unión con IIIa, también aumenta la unión del receptor IIa/IIb, perdiendo selectividad en el proceso. Introduciendo una mutación E269K asimétrica en esta variante heterodimérica, es decir A:S239D/K326E/A330L/I332E/E269K y B:S298A, la unión IIa/IIb se reduce de nuevo a niveles de tipo silvestre. Esto destaca el hecho de que el uso de mutaciones asimétricas en el dominio CH2 de Fc puede proporcionar oportunidades significativas para diseñar selectividad de FcgammaR mejorada.

Los reactivos empleados en los ejemplos están disponibles en el mercado o pueden prepararse usando instrumentación, métodos o reactivos conocidos en la técnica disponibles en el mercado. Los ejemplos anteriores ilustras diversos aspectos de la invención y práctica de los métodos de la invención.

Ejemplo 9: Unión de FcRn determinada por SPR.

La unión con FcRn se determinó mediante SPR en dos orientaciones diferentes.

1. Flujo de la variante heterodimérica sobre FcRn: en este experimento, se prepararon superficies de alta densidad de aproximadamente 5000 RU usando acoplamiento de NHS/EDC convencional. Se inyectaron 100 nM de TS y cada variante por triplicado a 50 ^l/minuto durante 120 segundos con disociación de 600 segundos en tampón de ejecución MES pH 6.

2. Flujo de FcRn sobre variantes heterodiméricas capturadas de forma indirecta: en este experimento de SPR, se usó una superficie de IgG anti humano de cabra para capturar indirectamente los anticuerpos (aproximadamente 400 RU cada uno), seguido de una inyección de una serie de diluciones de FcRn triples (concentración alta de 6000 nM). El tampón de ejecución fue MES 10 mM/NaCl 150 mM/EDTA 3,4 mM/Tween 200,05 a pH 6. No hubo unión significativa de FcRn con la superficie policlonal de cabra. Todas las variantes muestran sensogramas similares a TS. La Tabla 8 posterior muestra la Kd determinada por la inmovilización indirecta con FcRn (2) fluido.

T l K rmin r l inm iliz i n ir n F Rn fl i

Ejemplo 10: Unión específica de un heterodímero de Fc descrito en el presente documento

Se demostró unión biespecífica usando un heterodímero de Fc con las mutaciones Cadena A: L351Y_F405A_Y407V, Cadena B: T366L_K392m_T394W y scFv anti HER2 y anti HER3 fusionados con el extremo N terminal de la Cadena A y Cadena B del heterodímero de Fc. Las variantes resultantes variante HER2/HER3 biespecífica y las dos variantes h ER2, HER3 monoespecíficas monovalentes se ilustran en la Figura 40A. Para ensayar la unión biespecífica, se incubó un intervalo de dosis de las dos variantes monovalentes (monovalente anti HER2 y monovalente anti HER2, ilustrado en la Figura 40A) y el heterodímero anti HER2/HER3 biespecífico con células de melanoma MALME-M3 seguido de análisis de FACS para determinar la afinidad de unión aparente de cada molécula (mostrada en la Figura 40B). El sistema de ensayo se preparó de acuerdo con los protocolos descritos en: "Antitumor activity of a novel bispecific antibody that targets the ErbB2/ErbB3 oncogenic unit and inhibits heregulin-induced activation of ErbB3", McDonagh CF ^{e t al.,} Mol Cancer Ther. 11(3): 582-93(2012).

Ejemplo 11: Expresión y purificación de anticuerpos monoespecíficos bivalentes con dominios Fc heterodiméricos y cuantificación de pureza por CL/EM

Se generaron variantes heterodiméricas AZ133 (A: L351Y/F405A/Y407V, B: T366L/K392M/T394W), AZ138 (A: F405A/Y407V, B: T366L/K392M/T394W), AZ3002 (A: T350V/L351Y/F405A/Y407V, B: T350V/T366L/K392M/T394W), AZ3003 (A: T350V/L351Y/F405A/Y407V, B: T350V/T366L/K392L/T394W), y otras construcciones AZ AZ3000-AZ3021 y se purificaron como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2. Para estimar la robustez de la formación de heterodímeros y el efecto del exceso de una de las cadenas heterodiméricas en la pureza heterodimérica, los heterodímeros seleccionados se expresaron de forma transitoria usando 3 relaciones de ADN diferentes de las dos cadenas pesadas A y B (por ejemplo, relaciones A:B=1:1,5; 1:1; 1,5:1).

Los genes que codifican las cadenas pesada y ligera heterodiméricas se construyeron mediante síntesis génica usando codones optimizados para expresión humana/de mamífero, como se describe en detalle en el Ejemplo 1. Las secuencias de Fab se generaron a partir de un Ab que se une a Her2/neu conocido (Carter P. ^{e t al.} (1992) Humanization of an anti P185 Her2 antibody for human cancer therapy. ^{P ro c N a tl A c a d S c i} 89, 4285) y el Fc fue un isotipo IgG1 (SEQ ID NO: 1). La variante se expresó por coexpresión transitoria como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2 usando 3 relaciones diferentes de Cadena Pesada A y Cadena Pesada B de 1:1,5, 1:1 y 1,5:1. Las muestras se purificaron por cromatografía de afinidad de proteína A y filtración en gel preparatoria (véase Ejemplo 2 para detalles). Las muestras purificadas se desglucosilaron con PNGasaF durante una noche a 37 °C. Antes del análisis de MS las muestras se inyectaron en una columna Poros R2 y se eluyeron en un gradiente con ACN 20-90 %, FA 0,2 % en 3 minutos. El pico de la columna LC se analizó con un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap XL (Tensión del Cono: 50 V, lente del tubo: 215 V; Resolución de FT: 7.500) y se integró con el software Promass para generar perfiles de peso molecular.

Las alturas pico relativas para el heterodímero y los homodímeros se usaron para estimar la pureza heterodimérica (véase Figura 39).

Ejemplo 12: Estructura cristalina de los heteromultímeros AZ3002 y AZ3003:

Se expresaron transitoriamente construcciones Fc heterodiméricas de AZ3002 y AZ3003 en CHO y se purificaron hasta su homogeneidad por pA y SEC. Los heterodímeros de Fc purificados se cristalizaron a 18 °C después de ~24 horas de incubación mediante el método de difusión de vapor de gota pendiente a una relación de 2:1 sobre una solución de aguas madre compuesta de etilenglicol 5 % (v/v), polietilenglicol 3350 18 % (p/v) y yoduro de amonio 0,15 M con la ayuda de microsiembra. Los cristales se crioprotegieron aumentando la concentración de etilenglicol al 30 % (v/v) y posteriormente se enfriaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Se recogieron datos de difracción de ambos cristales a 100 K, usando oscilaciones de 0,5 grados para 200 grados totales, y se procesaron con XDS1. La estructura de AZ3002 se resolvió mediante reemplazo molecular con Phaser usando p Db ID: 2J6E como una proteína de consulta2. La estructura de AZ3002 se usó después para resolver AZ3003 de manera similar. Para acomodar la relación recíproca, perfectamente coincidente del heterodímero asimétrico presente en la unidad asimétrica cristalográfica (por ejemplo, la ocupación de la molécula A puede describirse igualmente por la molécula B y viceversa), se modelaron dos pares de heterodímeros posibles, cada uno con 0,5 ocupaciones atómicas, con Coot, refinado con Refmac34 Se presenta estadística de refinamiento de estructuras y procesamiento de datos de difracción en la Tabla 9.

Tabla 9

AZ3002 AZ3003

Recogida de datos

Sincrotrón CSLS CSLS

Línea de haz CMCF-BM CMCF-BM

Longitud de onda (A) 0,98005 0,98005

Grupo espacial P212121 P212121

Dimensiones celulares

a, ^{b, c} (A) 49,54, 74,92, 148,92 49,67, 74,72, 148,93

«,P,Y (°) 90, 90, 90 90, 90, 90

Resolución (A) 47-1,75(1,84-1,75)* 47-2,10(2,21-2,10)

Rsim Rmezcla 0,043(0,413) 0,074 (0,502)

_{/ / u /} 26 (3,9) 15,9(4,0)

Compleción (%) 100(100) 99,9 (99,9)

Redundancia 7,3 (7,4) 6,8 (7,0)

Refinamiento

Resolución (A) 1,75 2,10

N.° de reflejos, libres 53.467 (2849) 42.940(1557)

Rtrabajo/Rlibre 18,7/21,8 18,9/23,7

N.° de átomos

Cadenas proteicas 6704 6710

Carbohidrato/ion 440/4 440/4

Disolvente 679 510

Factores B

Proteína 25,6 31,4

Carbohidrato/ion 48,6/21,0 59,4 / 30,4

(continuación)

AZ3002 AZ3003

Disolvente 27,4 30,4

Desviaciones de RMS

Longitudes de enlace (A) 0,011 0,011

Ángulos de enlace (°) 1,78 1,74

Datos de Ramachandran

Más favorecidos (%, N.°) 97,1 (807) 94,5 (785)

Permitidos adicionalmente

N.°) ^ 2,8 (23) 4,7 (39)

No permitidos (%, N.°) 0,1 (1) _____________0 A Í 7 __________________________ 1. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 125-132 (2010).

2. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta CrystaNogrD.Biol.CrystaNogr 63, 32-41 (2007).

3. Emsley, P. y Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr.D.Biol. Crystallogr.

60, 2126-2132 (2004).

4. Murshudov, G. N., Vagin, A. A. y Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximumlikelihood method. Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 53, 240-255 (1997).____________________________________ Se muestra una superposición de las estructuras cristalinas en la Figura 42. La estructura cristalina de los heterodímeros AZ3002 y AZ3003 muestran muy buena coincidencia con modelos por ordenador (RMSD de todos los átomos=0,706 A, RMSD de cadena principal=0,659 A para el dominio CH3) y confirma las conformaciones predichas de los restos de empaquetamiento del núcleo críticos.

Ejemplo 13: Análisis de glucosilación de AZ3003

El heterodímero AZ3003 se expresó y se purificó como se ha descrito en el Ejemplo 11. Los glucanos se analizaron con Preparación de N-Glucanos Rápida GlykoPrep™ con InstantAB™ (Prozyme) usando el protocolo convencional del fabricante.

Los resultados se muestran en la Figura 43 e ilustran que AZ3003 tiene un patrón de glucosilación típico.

Ejemplo 14: Evaluación de estabilidad de AZ3003 en condiciones de degradación forzadas

La estabilidad del heterodímero AZ3003 se evaluó por incubación en condiciones de degradación forzadas. La estabilidad de un mAb en condiciones de degradación forzadas puede ser una buena estimación para la estabilidad a largo plazo y de formulación.

La muestra heterodimérica purificada (expresión y purificación como se describen en el Ejemplo 11) se concentró a 100 mg/ml sin señales de agregación. La muestra se diluyó en el tampón apropiado y se evaluó en condiciones de degradación forzadas como se describe en la Tabla 10 posterior. Las muestras tratadas se analizaron por SDS-PAGE y HPLC-SEC.

Se realizó SDS-PAGE en condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR) con geles de gradiente premoldeados obtenidos de LONZA. Las bandas proteicas se visualizaron tiñendo con Azul Brillante de Coomassie G-250.

Se realizó SEC-HPLC analítico usando una columna de HPLC Phenomenex, BIOSEP-SEC-S4000 o BioRad Bio-Sil TSK 4000 a un caudal de 0,8 ml/minuto con fosfato sódico 10 mM, NaCl 0,14 M, isopropanol 10 % como un tampón de ejecución. Esto permitió la cuantificación de especies de peso molecular superior e inferior potenciales.

Tabla 10: Condiciones de degradación forzada usadas para degradar AZ3003

(continuación

Los resultados se muestran en la Figura 44 y demuestran que el heterodímero AZ3003 es estable y muestra un perfil de estabilidad que es coherente con el de mAb convencionales en la industria.

Ejemplo 15: Evaluación de purificación corriente abajo de AZ3003

Se realizó una evaluación de la capacidad de fabricación de AZ3003 para evaluar el comportamiento de AZ3003 usando el esquema de proceso de purificación de anticuerpos convencional en la industria como se muestra en la Figura 45. Este proceso implica una plataforma de tres etapas en columna que comprende la cromatografía de afinidad de Proteína A para capturar el producto, seguido de cromatografía de intercambio catiónico (CEX) para retirada de agregados, proteína A lixiviada y HCP y finalmente, cromatografía de intercambio aniónico (AEX) en el modo de flujo continuo para capturar virus, ADN y contaminantes con carga negativa. Esta valoración se usa para identificar problemas de fabricación potenciales (por ejemplo, estabilidad del proceso, estabilidad del producto y calidad) con un candidato o candidatos farmacológicos temprano en el estadio de investigación/desarrollo.

Durante la evaluación de la capacidad de fabricación, se evaluaron el comportamiento cromatográfico, la estabilidad proteica y la calidad del producto usando el proceso de purificación convencional en la industria mostrado en la Figura 46. La Tabla 11 (posterior) enumera los criterios principales usados para la evaluación, es decir rendimiento por etapas, contenido de agregados de Alto Peso Molecular (HMW) y volumen de elución. Altos rendimientos por etapas y bajos volúmenes de elución durante la purificación indican una proteína estable, con buen comportamiento. El control del contenido de HMW y su retirada durante la purificación es vital ya que la presencia de agregados proteicos (especies de HMW) en el producto final puede conducir a actividad reducida, reacciones inmunogénicas en el paciente y/o formación de partículas durante un periodo de validez del producto farmacéutico. Es deseable una expresión de Mab con contenido de HMW inicial mínimo (<4 %), Ya que altos niveles de agregados requerirán etapas de purificación adicionales para su retirada, aumentando de este modo el tiempo y el coste de fabricación.

T l 11 ri ri rin i l r l l i n l i f ri i n

Se usaron procesos de purificación industrial convencionales para verificar la estabilidad, comportamiento cromatográfico y calidad del producto de AZ3003.

1.1 Captura de Proteína A

Se filtró a 0,22 |im CM que expresaba AZ3003 usando un filtro de cuello de botella (PES) de Millipore y se aplicó a una columna de Mab Select SuRe (1,6 x 25 cm) equilibrada con 5 CV de Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,14 M, pH 7,5. Después de cargar, la columna se lavó exhaustivamente con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia A280 alcanzó una línea basal estable. Se eluyó AZ3003 con tampón de acetato 0,1 M, pH 3,6 y se valoró inmediatamente a pH 5,2 mediante la adición de un volumen 1/10 de base de tris 1 M.

Después de la etapa de elución, la columna se lavó con acetato 0,1 M, pH 3,0. El análisis de SDS-PAGE muestra que todo el Mab se unió a la columna ya que no se detectó Mab en el FT de la columna. Se detectó Mab altamente purificado en el tampón de elución de pH 3,6. La etapa de captura y purificación inicial usando cromatografía de afinidad de proteína A produce un producto con >90 % de pureza.

1.2 Estudio de retención de pH bajo

La siguiente etapa en el proceso corriente abajo es la retención de pH bajo, que se realiza para inactivar virus. Después de elución de la columna de Proteína A, el Mab (~10 mg/ml, pH 4,0) se valoró a pH 3,6 con ácido acético 10 % y se incubó a RT con agitación durante 90 minutos. La estabilidad de AZ3003 frente al tratamiento de pH bajo se evaluó por SDS-PAGE, SEC-HPLC y por mediciones de turbidez a A410 nm. AZ3003 toleró bien la etapa de retención de pH bajo, no mostrando cambios en SDS-PAGE o SEC-HPLC. Además, no se detectó aumento de la turbidez después de incubación de 90 minutos, lo que indica la ausencia de la formación de agregados insolubles que puede ser problemática durante la purificación (es decir obstrucción de filtros y columnas en el proceso, pérdida de producto). Estos datos muestran que AZ3003 es estable para la etapa de retención de pH bajo.

1.3 Cromatografía de intercambio catiónico (CEX)

Se investigó CEX como la segunda etapa en el proceso de purificación. Se evaluaron dos resinas: Fractogel EMD SO3 (M) de Merk/Millipore y SP HP de Ge Lifesciences.

Fractogel EMD SO3 (M), pH 5,2: el grupo de Mab Select SuRe (35 mg) se valoró a pH 5,2 mediante la adición de 10 % (v/v) de base tris 1 M y después se diluyó 2 veces con tampón de equilibrio, acetato 20 mM, pH 5,2. Este grupo se aplicó a una columna de Fractogel EMD SO3 (M) equilibrada con 5 CV de acetato 20 mM, pH 5,2. La columna se lavó con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia A280 alcanzó una línea basal estable. El Mab se eluyó de la columna con un gradiente salino lineal de NaCl de 0 a 600 mM, pH 5,2 sobre 10 CV. Los contaminantes restantes se extrajeron de la columna con acetato 20 mM, NaCl 1 M, pH 5,2 seguido de tratamiento con NaOH 1 N. Se realizó análisis de SDS-PAGE y SEC-HPLC para controlar los niveles de HMW y su retirada de la principal fracción de Mab en esta columna. El rendimiento por etapas (basado en las lecturas de ^a280 nm) fue del 73 %.

SP HP, pH 5,2: el grupo de Mab Select SuRe (50 mg) se valoró a pH 5,2 por la adición de 10 % (v/v) de base tris 1 M, y después se diluyó igualmente con tampón de equilibrio, acetato 20 mM, pH 5,2. Este grupo se aplicó a una columna de SP HP (1,6 x 2,5 cm/5 ml) equilibrada con 5 Cv de acetato 20 mM, pH 5,2 (Figura 21). La columna se lavó con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia A280 alcanzó una línea basal estable. El Mab se eluyó de la columna con un gradiente salino lineal de NaCl de 0 a 600 mM, pH 5,2 sobre 10 CV. Los contaminantes restantes se extrajeron de la columna con acetato 20 mM, NaCl 1 M, pH 5,2 seguido de NaOH 1 N. Se realizó análisis de SDS-PAGE y SEC-HPLC para controlar los niveles de agregación y su separación en esta columna.

El rendimiento de la etapa (basándose en lecturas de A280 nm) fue del 87 %.

1.4 Cromatografía de intercambio aniónico (AEX)

Se han usado ampliamente intercambiadores de aniones (por ejemplo amina cuaternaria, Q) en la purificación de anticuerpos monoclonales. El medio de AEX se maneja en modo de flujo continuo, apareciendo el Mab en el FT permitiendo a la vez la retención de HCP, ADN, virus y endotoxina.

El grupo de Fractogel SO3 M pH 5,2 (25 mg) se valoró a pH 7,0, con la base tris 1 M y se aplicó a 1 ml de HiTrap Q FF equilibrado con 5 CV de fosfato 10 mM, pH 7,0. La columna se lavó con tampón de equilibrio. Sin embargo en este caso, no se alcanzó una línea basal estable. En consecuencia la columna se lavó con PBS para eluir cualquier Mab unido residualmente. Después la columna se lavó con fosfato 10 mM, NaCl 1 M, pH 7,0 para retirar cualquier contaminante unido. Esta etapa necesita optimización adicional de modo que esté presente toda la fracción de Mab en el flujo continuo. El rendimiento de la etapa (basándose en lecturas de A280 nm) fue del 82 % con una pureza estimada >98 % por SEC-HPLC.

1.5 Análisis por SDS-PAGE de la purificación corriente abajo

Se realizó SDS-PAGE (Figura 35) en eluatos de cada etapa de la purificación para controlar la retirada de contaminante durante todo el proceso y para evaluar la calidad y pureza del producto final. El análisis en gel mostró el patrón de migración esperado para un Mab en condiciones no reductoras y reductoras. La comparación en el gel de los grupos de las dos resinas de CEX no muestra diferencias importantes en el perfil del producto. Los grupos finales de CEX, CHT y HIC pH 5,0 y pH 7,0 tienen todos un aspecto similar con respecto a pureza y bandas contaminantes.

1.7 Estimación de la pureza por SEC-HPLC

Se evaluó el AZ3003 purificado después de las etapas de cromatografía en tres columnas Proteína A; CEX; AEX modo de flujo continuo; mediante SEC (exclusión por tamaño)-HPLC en condiciones nativas (Figura 46).

AZ3003 muestra un único pico que se eluye dentro de la región de 150 kDa esperada para IgG1 nativo. La pureza se estimó a >98 %.

1.8 Rendimientos de proceso para la purificación de AZ3003

Los rendimientos de proceso se calcularon para el proceso de purificación corriente abajo y se enumeran en la Figura 46. Los rendimientos de etapa para AZ3003 fueron típicos para IgG usando el proceso de purificación en tres columnas convencional en la industria.

AZ3003 se purificó exitosamente a partir de CM usando el proceso de purificación convencional en la industria (resina de afinidad de Proteína A, CEX, seguido de AEX).

Estos resultados indicaron que AZ3003 es comparable con mAb convencionales en rendimiento de recuperación general (véase Kelley B. ^{B io te chn o l. P rog .} 2007, ^23, 995-1008) y agregación mínimamente observada. AZ3003 también se evaluó con respecto a retención de pH bajo y CHT (hidroxiapatita cerámica) e HIC (cromatografía de interacción hidrófoba) (Fenil HP pH 5 y pH 7) con buena recuperación sin agregados. La Figura 46 ilustra que el heterodímero candidato se purificó exitosamente a partir de CM usando el proceso de purificación convencional en la industria (resina de afinidad de Proteína A, CEX, seguido de AEX).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una construcción de Fc heteromultimérica aislada que comprende un dominio CH3 heterodimérico modificado, comprendiendo el dominio CH3 heterodimérico modificado:

un primer polipéptido de dominio CH3 modificado y un segundo polipéptido de dominio CH3 modificado;

en donde además el dominio CH3 heterodimérico tiene una temperatura de fusión (Tm) de al menos 74 °C y una pureza de al menos 95 %;

en donde además la construcción de Fc heteromultimérica está basada en una inmunoglobulina de tipo G 1 humana (IgG1); y

en donde además la numeración de restos de aminoácidos es de acuerdo con el índice de EU como se expone en Kabat.

2. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

a) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W; o

b) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T366L, K392L y T394W; o

c) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W; o

d) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405A y Y407V, y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T366I, K392L y T394W.

3. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el primer y el segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado comprenden cada uno una sustitución T350V.

4. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el primer y el segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado comprenden una sustitución de aminoácidos en la posición S400, preferentemente S400Z, en donde Z es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido con carga negativa.

5. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende una sustitución de aminoácidos que es S400E o S400R.

6. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en donde al menos uno del primer y el segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado comprende una sustitución de aminoácidos en la posición N390, preferentemente N390Z, en donde Z es un aminoácido con carga positiva o un aminoácido con carga negativa.

7. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende una sustitución de aminoácidos que es S400E y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende una sustitución de aminoácidos que es N390R.

8. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde uno de los polipéptidos de dominio CH3 modificado comprende la sustitución de aminoácidos Q347R y el otro polipéptido de dominio CH3 modificado comprende la sustitución de aminoácidos K360E.

9. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

a) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, L351Y, F405A e Y407V; y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, T366L, K392M y T394W; o

b) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, L351Y, F405A e Y407V; y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, T366L, K392L y T394W; o

c) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400R, F405a e Y407V; y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, T366L, K392M y T394W; o

d) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400E, F405A e Y407V; y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, T366L, N390R, K392M y T394W; o

e) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400E, F405A e Y407V; y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, L351Y, T366L, N390R, K392M y T394W; o

f) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos Q347R, T350V, L351Y, S400E, F405A e Y407V; y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, K360E, T366L, N390R, K392M y T394W; o

g) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400R, F405^ae Y407V; y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, T366L, N390D, K392M y T394W; o

h) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400R, F405^ae Y407V; y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, T366L, N390E, K392M y T394W; o

i) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400E, F405A e Y407V; y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, T366L, N390R, K392L y T394W; o

j) el primer polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos Y349C, T350V, L351Y, S400E, F405A e Y407V; y el segundo polipéptido de dominio CH3 modificado comprende las sustituciones de aminoácidos T350V, S354C, T366L, N390R, K392M y T394W.

10. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la construcción de Fc heteromultimérica es un anticuerpo terapéutico que comprende un dominio variable o fragmento del mismo, en donde el dominio variable o fragmento del mismo se une específicamente a al menos un antígeno.

11. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el al menos un antígeno es un antígeno de cáncer.

12. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la construcción de Fc heteromultimérica es un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico.

13. La construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la construcción de Fc heteromultimérica se conjuga a un agente terapéutico.

14. Una composición que comprende la construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una célula hospedadora de mamífero que comprende ácido nucleico que codifica la construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

16. Un método ^{in v itro} de expresión del heteromultímero aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el primer y el segundo polipéptidos de dominio CH3 modificado se coexpresan a partir de una única célula, preferentemente a partir de una célula de mamífero.

17. Una construcción de Fc heteromultimérica aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, para su uso para tratar una enfermedad, trastorno o infección en un paciente que lo necesite.