[go: up one dir, main page]

TW202302636A - 靶向ｂｃｍａ、ｇｐｒｃ５ｄ及ｃｄ３之三特異性抗體 - Google Patents

靶向ｂｃｍａ、ｇｐｒｃ５ｄ及ｃｄ３之三特異性抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW202302636A
TW202302636A TW111105376A TW111105376A TW202302636A TW 202302636 A TW202302636 A TW 202302636A TW 111105376 A TW111105376 A TW 111105376A TW 111105376 A TW111105376 A TW 111105376A TW 202302636 A TW202302636 A TW 202302636A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antigen
seq
antibody
trispecific
binding
Prior art date
Application number
TW111105376A
Other languages
English (en)
Inventor
里卡多 阿塔爾
斯科特 布魯德
拉傑庫馬爾 甘尼桑
里歐波多 路易斯裘
烏爾里 菲莉帕
寇丹達拉姆 皮拉瑞斯堤
桑賈亞 辛格
丹青 楊
Original Assignee
比利時商健生藥品公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 比利時商健生藥品公司 filed Critical 比利時商健生藥品公司
Publication of TW202302636A publication Critical patent/TW202302636A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文提供結合至BCMA、GPRC5D及CD3之多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段。亦描述能夠編碼所提供之多特異性抗體或多特異性抗原結合片段的相關多核苷酸、表現所提供之多特異性抗體或多特異性抗原結合片段的細胞、以及相關聯之載體及經可偵測標記之多特異性抗體或多特異性抗原結合片段。此外，描述產生並使用所提供之多特異性抗體及多特異性抗原結合片段之方法。本文中進一步提供結合至BCMA之抗體及其抗原結合片段。亦描述能夠編碼所提供之BCMA特異性抗體或抗原結合片段的相關多核苷酸、表現所提供之BCMA特異性抗體或抗原結合片段的細胞、以及相關聯之載體及經可偵測標記之BCMA特異性抗體或抗原結合片段。此外，描述產生並使用所提供之BCMA特異性抗體及抗原結合片段之方法。

Description

靶向BCMA、GPRC5D及CD3之三特異性抗體
相關申請案之交互參照
本申請案主張2021年2月16日申請之美國臨時專利申請案序號63/149,921之優先權。前述申請案之完整內容全文以引用方式併入本文中。
本文提供之本揭露係關於結合B細胞成熟抗原(BCMA)、G蛋白偶聯受體C類5組成員D (GPRC5D)之多特異性抗體、決定簇3 (CD3)、結合BCMA之單株抗體、及產生並使用所述抗體之方法。
多發性骨髓瘤(MM)係第二常見的血液惡性疾病(hematological malignancy)，且構成所有癌症死亡的2%。MM係一種異質性疾病，且大部分係由染色體易位造成，尤其是t(11; 14)、t(4; 14)、t(8; 14)、del(13)、del(17)（Drach等人，(1998) Blood 92(3):802-809；Gertz等人，(2005) Blood 106(8):2837-2840；Facon等人，(2001) Blood 97(6): 1566-1571）。受MM影響的患者可能經歷各種起因於骨髓浸潤、骨破壞、腎衰竭、免疫不全、及癌症診斷之心理負擔的疾病相關症狀。截至2006年，MM的5年相對存活率約為34%，這突顯MM係一種難以治療的疾病，而其目前還沒有治癒選項。
B細胞成熟抗原（亦稱為BCMA、CD269、TNFRSF17 (UniProt Q02223)）係腫瘤壞死受體超家族(tumor necrosis receptor superfamily)的一員，其在分化的漿細胞中優先表現[Laabi等人，(1992) EMBO J 11(11):3897-3904；Madry等人，(1998) Int Immunol 10(11):1693-1702]。BCMA係一種非糖基化I型跨膜蛋白，其參與了B細胞的成熟、生長及存活。BCMA係TNF超家族中下列兩個配體的受體：APRIL（一種增生誘導配體，又名CD256、TNFSF13），其係BCMA的高親和性配體；及B細胞活化因子BAFF（又名THANK、BlyS、B淋巴球刺激因子、TALL-1、及zTNF4），其係BCMA的低親和性配體。APRIL及BAFF顯示結構相似性及重疊性，但具有不同的受體結合特異性。負調節因子TACI亦結合至BAFF及APRIL兩者。APRIL及BAFF與BCMA及/或TACI的配位結合，活化轉錄因子NF-κB並增加促存活(pro-survival) Bcl-2家族成員（例如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1）的表現，及下調促凋亡(pro-apoptotic)因子（例如Bid、Bad、Bik、Bim等等）的表現，從而抑制細胞凋亡並促進存活。這種聯合作用促進B細胞分化、增生、存活、及抗體生產（如在Rickert RC et al., Immunol Rev (2011) 244 (1): 115-133中所綜述）。與該發現一致的是，BCMA亦支持惡性人類B細胞（包括多發性骨髓瘤(MM)細胞）的生長及存活。Novak等人發現MM細胞系及新鮮單離的MM細胞在彼等之細胞表面上表現BCMA及TACI蛋白，且在彼等之細胞表面上具有可變的BAFF-R蛋白表現(Novak et al., (2004) Blood 103(2):689-694)。
抗BCMA抗體用來治療淋巴瘤及多發性骨髓瘤的用途在WO2002066516及WO2010104949中提及。針對BCMA之抗體係描述於例如Gras M-P.等人，Int Immunol. 7 (1995) 1093-1106、WO200124811、及WO200124812中。然而，儘管事實上BCMA、BAFF-R及TACI（亦即屬於TNF受體超家族之B細胞受體）及彼等之配體BAFF及APRIL係對抗癌症的療法之主題，需要更多選項用於治療此類醫療病況。
G蛋白偶聯受體C類5組成員D (GPRC5D)係孤兒、非典型的C類GPCR，其在2001年首次被鑑別（Bräuner-Osborne等人，Biochim Biophys Acta. 1518(3):237-248, 2001）。GPRC5D及其他5組GPCR對C受體而言具有異常短的胺端區，且因此預期其與A類受體構形類似。就此而言，彼等係獨特的，並與C類GPCR具有序列同源性且具有與A類受體相當的預測結構拓撲。尚未描述GPRC5D活化之功能性後果且配體仍然未知。基因具有三個外顯子且係位於人類染色體12p13.3上。GPRC5D受體在各種物種之間係高度保留並與食蟹獼猴(cynomolgus monkey) GPRC5D共有92%同一性。
在WO2016090329、WO2018017786、WO2018147245、及WO2019154890中提及了抗GPRC5D抗體用於治療多發性骨髓瘤之用途。然而，儘管GPRC5D在對抗癌症方面經受療法的事實，但仍需要治療此類醫療病況的進一步選擇。
GPRC5D mRNA主要表現在來自MM患者的所有惡性漿細胞中（Atamaniuk JA等人，Eur J Clin Invest 42(9) 953-960; 2012; Frigyesi-blood及Cohen等人，Hematology 18(6): 348-35; 2013）。GPRC5D表現在患者之間係可變的，並且與漿細胞負荷及諸如Rb-1缺失的基因畸變充分相關（Atamaniuk JA等人，Eur J Clin Invest 42(9) 953-960; 2012）。
殖株抗性係復發難治性骨髓瘤的常見機制。靶向多於一種骨髓瘤腫瘤抗原並接合T細胞可導致有效殺滅惡性漿細胞及微量殘存疾病(minimal residual disease, MRD)陰性。雙BCMA及GPRC5D靶向增強抗體親留力及效力，在異質性細胞群存在下最大化腫瘤抑制、防止腫瘤抗原逃脫（例如，捕獲單獨表現BCMA或GPRC5D不足的MM細胞）、改善腫瘤功效、且可減輕細胞介素釋放症候群(CRS)的潛力。因此，需要靶向BCMA及GPRC5D兩者之治療性抗體，用於治療多發性骨髓瘤及/或相關醫療病況。
在一個態樣中，本文提供結合至BCMA、GPRC5D及CD3或與其等特異性結合之多特異性抗體、及其多特異性抗原結合片段。在一些實施例中，本文提供結合至BCMA、GPRC5D及CD3或與其等特異性結合之三特異性抗體、及其三特異性抗原結合片段。亦描述能夠編碼所提供之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或多特異性抗原結合片段的相關多核苷酸、表現所提供之抗體或多特異性抗原結合片段的細胞、以及相關聯之載體及經可偵測標記之多特異性抗體或多特異性抗原結合片段。此外，描述使用所提供多特異性抗體之方法。舉例而言，該等BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體及多特異性抗原結合片段可用於治療癌症（例如，BCMA及/或GPRC5D表現性癌症）；該等BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體可用來診斷或監測BCMA及/或GPRC5D表現性癌症之進展、消退、或穩定；用來判定病患是否應該進行癌症治療；或者用來判定對象是否罹患BCMA及/或GPRC5D表現性癌症，並因此可適合用BCMA及/或GPRC5D特異性抗癌症治療劑諸如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體來治療。 BCMA x GPRC5D x CD3 多特異性抗體
本文中所述者係結合BCMA、GPRC5D及CD3之經單離多特異性抗體（「BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體」）及其多特異性抗原結合片段。
在較佳實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段係三特異性抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，經單離之BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或其三特異性結合片段包含：(a)第一抗原結合臂，其包含第一重鏈可變域(VH1)及第一輕鏈可變域(VL1)；(b)第二抗原結合臂，其包含第二重鏈可變域(VH2)及第二輕鏈可變域(VL2)；及(c)第三抗原結合臂，其包含第三重鏈可變域(VH3)及第三輕鏈可變域(VL3)。在一些實施例中，該第一抗原結合臂結合至CD3上之表位，該第二抗原結合臂結合至GPRC5D上之表位，且該第三抗原結合臂結合至BCMA上之表位。
在一些實施例中，該三特異性抗體之該第一抗原結合臂、或其三特異性結合片段包含第一重鏈部分(HC1)及輕鏈部分，該第一重鏈部分包含該VH1，該輕鏈部分包含該VL1。該VH1及該VL1形成結合第一抗原之第一抗原結合域。該三特異性抗體之該第二抗原結合臂或其三特異性結合片段包含第二重鏈部分(HC2)，該第二重鏈部分包含該VH2。該HC2之該VH2形成結合第二抗原之第二抗原結合域。該HC1或該HC2進一步偶聯至該第三抗原結合臂，該第三抗原結合臂包含形成結合第三抗原之第三抗原結合域之該VH3。該HC1及HC2各自可選地包含可結晶片段(Fc)域，其中該Fc域包含恆定重鏈區2 (CH2)及CH3。在一些實施例中，該第一抗原係分化簇3 (CD3)，且該第二抗原係B細胞成熟抗原(BCMA)，且該第三抗原係G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)。在一些實施例中，該第一抗原係分化簇3 (CD3)，且該第二抗原係G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)，且該第三抗原係B細胞成熟抗原(BCMA)。在以下實施方式及實例章節中進一步描述該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體、或其三特異性結合片段之一些態樣。
在一些實施例中，該BCMA結合臂結合人類BCMA但不結合食蟹獼猴BCMA。在一些實施例中，該BCMA結合臂結合至一表位，該表位包括來自該BCMA胞外域(ECD)之一或多個殘基。在一些實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體之該BCMA結合臂（或「BCMA特異性臂(BCMA-specific arm)」）係衍生自本文中所述之BCMA抗體（例如，衍生自具有表1中所列示之CDR序列之抗體）。
在一些實施例中，該多特異性抗體之該GPRC5D特異性臂(GPRC5D-specific arm)結合人類GPRC5D但不結合至食蟹獼猴GPRC5D。在一些實施例中，該等BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段之該GPRC5D特異性臂結合人類GPRC5D之胞外域。在一些實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體之該GPRC5D結合臂（或「GPRC5D特異性臂」）係衍生自本文中所述之GPRC5D抗體（例如，衍生自具有表2中所列示之CDR序列的抗體）。
經由TCR/CD3複合體將T淋巴球重新導向至表現BCMA及/或GPRC5D的MM細胞代表一種有吸引力的替代方法。T淋巴球的TCR/CD3複合體係由TCR阿法(α)/貝他(β)或TCR伽馬(γ)/德他(δ)異二聚體、以及共表現於細胞表面之不變CD3次單元（標記為伽馬(γ)、德他(δ)、艾普西龍(ε)、澤塔(ζ)、及艾塔(η)）所組成。在一些實施例中，本文中所述之多特異性抗體或多特異性抗原結合片段結合至CD3ε。在一些實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體之該CD3結合臂（或「CD3特異性臂(CD3-specific arm)」）係衍生自單株抗體CD3B376。在一些實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體之該CD3結合臂（或「CD3特異性臂(CD3-specific arm)」）係衍生自單株抗體SP34，其係小鼠IgG3/λ同型。（K.R. Abhinandan and A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839）。在一些實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體之該CD3結合臂包含表3中所述之重鏈CDR及/或輕鏈CDR或選自表3之任何一個VH域及/或任何一個VL域。
在一些實施例中，該等BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段之該等BCMA、GPRC5D、及/或CD3特異性臂係IgG、或其衍生物。IgG類別在人類中係分成四種同型(isotype)：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。它們的Fc區之胺基酸序列具有超過95%的同源性，但鉸鏈區的胺基酸組成及結構顯示主要差異。Fc區媒介效應功能，諸如抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗體之Fc區結合至免疫效應細胞（諸如自然殺手細胞及巨噬細胞）表面上之Fc受體(FcγR)，導致吞噬或溶解標靶細胞。在CDC中，抗體藉由在細胞表面引發補體級聯反應(complement cascade)來殺滅標靶細胞。
在許多治療性抗體之應用中，Fc媒介之效應功能並非作用機制之一部分。這些Fc媒介之效應功能可能有害並且由於造成偏離機制毒性(off-mechanism toxicity)而可能造成安全風險。修改效應功能可藉由工程改造Fc區以降低其對FcγR或補體因子之結合來達成。IgG對於活化性（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、及FcγRIIIb）和抑制性(FcγRIIb) FcγRs或補體之第一成分(C1q)的結合取決於位在鉸鏈區和CH2域中之殘基。已將突變引入IgG1、IgG2及IgG4中以降低或靜默Fc功能性。
在一個實施例中，抗體包含具有一或多個下列特性之Fc區：(a)在與親系Fc比較時效應功能有所降低；(b)對於FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIb、及/或FcγRIIIa之親和力降低、(c)對於FcγRI之親和力降低、(d)對於FcγRIIa之親和力降低、(e)對於FcγRIIb之親和力降低、(f)對於FcγRIIIb之親和力降低、或(g)對於FcγRIIIa之親和力降低。
在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段係IgG1、或其衍生物。在一些實施例中，舉例來說，該CD3結合臂係自其衍生之該CD3特異性IgG1抗體的Fc區包含在該Fc區中之L234A、L235A、及D265S取代。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其之該CD3特異性抗體或抗原結合片段係IgG4、或其衍生物。在一些實施例中，舉例來說，該CD3結合臂係自其衍生之該CD3特異性IgG4抗體的Fc區包含在該Fc區中之S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段結合初級人類T細胞及/或初級食蟹獼猴T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段活化初級人類CD4+ T細胞及/或初級食蟹獼猴CD4+ T細胞。
除了所述BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體外，亦提供能夠編碼所述BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體之多核苷酸序列。在一些實施例中，提供編碼該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或三特異性結合片段之各抗原結合臂之該重鏈可變域之該一或多個CDR及/或該輕鏈可變域之該一或多個CDR之經單離合成性多核苷酸。
在一些實施例中，提供編碼BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或三特異性結合片段之一或多個重鏈可變域及/或一或多個輕鏈可變域之經單離合成性多核苷酸。在一些實施例中，提供編碼BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或三特異性結合片段之第一、第二、及/或第三抗原結合臂的一或多個肽鏈之經單離合成性多核苷酸。亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現本文中所提供之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體的細胞。在另一實施例中，提供表現該多特異性抗體或多特異性結合片段之經單離細胞。亦描述能夠表現所揭示載體之細胞。此等細胞可為哺乳動物細胞（諸如293細胞、293F細胞、CHO細胞）、昆蟲細胞（諸如Sf7細胞）、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞（諸如大腸桿菌）。所述抗體亦可藉由融合瘤細胞來生產。在一些實施例中，提供用於藉由培養細胞來產生該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或三特異性結合片段的方法。
本文中進一步提供包含該等BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物。 使用BCMA x GPRC5D x CD3 多特異性抗體之方法
亦揭示使用所述BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段之方法。舉例而言，該等BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段可用於治療有需要之對象中的GPRC5D及/或BCMA表現性癌症。在一些實施例中，該GPRC5D及/或BCMA表現性癌症係淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤，包括燜燃型多發性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma, SMM)。在一些實施例中，該GPRC5D及/或BCMA表現性癌症係淋巴瘤之復發性或難治性形式，諸如多發性骨髓瘤之復發性或難治性形式。
所述之治療有需要之對象中之GPRC5D及/或BCMA表現性癌症之方法包括向該對象投予治療有效量之所述BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或其多特異性抗原結合片段。在一些實施例中，該對象為哺乳動物，較佳為人類。在較佳實施例中，提供用於治療患有癌症之對象之方法，其係藉由向有需要之患者投予治療有效量之該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或三特異性抗原結合片段達一段足以治療該癌症的時間。
本文中進一步提供用於抑制癌細胞生長或增生之方法，其係藉由投予治療有效量之該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或三特異性結合片段來抑制癌細胞之生長或增生。
本文中亦提供將T細胞重新導向至GPRC5D及/或BCMA表現性癌細胞之方法，其係藉由投予治療有效量之該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或三特異性結合片段以將T細胞重新導向至癌症。
熟習此項技術者應瞭解，使用所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段之方法可以醫療用途格式指定，例如以BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體及多特異性抗原結合片段的形式用於治療如本文所定義之疾病，特別是用於治療癌症。所屬技術領域中熟習此項技術者亦將理解，使用所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段之方法可以所謂的瑞士型指定，例如以BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體及多特異性抗原結合片段的用途之形式用於製造用於治療如本文所定義之疾病之藥物，特別是用於製造用於治療癌症之藥物。此適用於整個本揭露內容。 BCMA x GPRC5D x CD3 特異性抗體套組
本文中描述包括所揭示之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體的套組。所述套組可用來進行使用本文中所提供之該等BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體之方法，或者所屬技術領域中具有通常知識者所習知之其他方法。在一些實施例中，所述套組可包括本文中所述之抗體及用於治療GPRC5D及/或BCMA表現性癌症之試劑。因此，所述套組可包括本文中所述之多特異性抗體（或其多特異性抗原結合片段）之一或多者及用於容納未使用時之該抗體或片段之容器、及/或該抗體或片段之使用說明、固定至固相撐體(solid support)之抗體或片段、及/或該抗體或片段之可偵測標示形式，如本文中所述。 BCMA 特異性抗體
本文中亦提供結合至BCMA之抗體及其抗原結合片段。亦描述能夠編碼所提供之BCMA特異性抗體及抗原結合片段的相關多核苷酸、表現所提供之抗體及抗原結合片段的細胞、以及相關聯之載體及經可偵測標記之抗體及抗原結合片段。此外，描述使用所提供抗體及抗原結合片段之方法。舉例而言，該等BCMA特異性抗體及抗原結合片段可用於治療癌症（例如，BCMA表現性癌症）；該等BCMA特異性抗體及抗原結合片段可用來診斷或監測BCM表現性癌症之進展、消退、或穩定；用來判定病患是否應該進行癌症治療；或者用來判定對象是否罹患BCMA表現性癌症並因而可用BCMA特異性抗癌症治療劑諸如本文中所述之針對BCMA及CD3的多特異性抗體來進行治療。在以下實施方式及實例章節中進一步描述該BCMA特異性抗體或抗原結合片段之一些態樣。 使用BCMA 特異性抗體之方法
亦揭示使用所述BCMA特異性抗體或抗原結合片段之方法。此節中討論之方法所使用的特定抗體包括具有如表1中所述之抗體的CDR組之抗體（例如，BCMB519）。舉例而言，這些抗體或抗原結合片段可用於治療癌症，例如藉由干擾BCMA-受體交互作用，或者其中該抗體係與毒素共軛，從而使該毒素靶向該BCMA表現性癌症。此外，這些抗體或抗原結合片段可用於偵測生物樣本（諸如血液或血清）中之BCMA之存在；用於定量生物樣本（諸如血液或血清）中之BCMA之量；用於診斷BCMA表現性癌症；決定治療罹患癌症之對象的方法；或者監測對象中之BCMA表現性癌症的進展。在一些實施例中，BCMA表現性癌症可係淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤(MM)，包括燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)。在一些實施例中，該BCMA表現性癌症係淋巴瘤之復發性或難治性形式，諸如多發性骨髓瘤之復發性或難治性形式。所述方法可在該對象接受BCMA表現性癌症之治療前進行，諸如用針對BCMA及CD3之多特異性抗體進行治療。此外，所述方法可在該對象接受BCMA表現性癌症之治療後進行，諸如用本文中所述之針對BCMA及CD3之多特異性抗體進行治療。
所述之偵測生物樣本中之BCMA的方法包括使該生物樣本暴露於本文中所述之BCMA特異性抗體或抗原結合片段之一或多者。
所述之診斷對象中之BCMA表現性癌症的方法亦涉及使該生物樣本暴露於本文中所述之BCMA特異性抗體或抗原結合片段之一或多者；然而，該等方法亦包括定量該樣本中所存在之BCMA之量；將該樣本中所存在之BCMA之量與已知標準品或參考樣本比較；以及用來判定該對象之BCMA水平是否落入與癌症相關聯之BCMA水平。
本文中亦描述監測對象中之BCMA表現性癌症的方法。所述方法包括使該生物樣本暴露於本文中所述之BCMA特異性抗體或抗原結合片段之一或多者；定量該樣本中所存在且由該抗體、或其抗原結合片段所結合的BCMA之量；將該樣本中所存在之BCMA之量與已知標準品或參考樣本比較，或者與先前得自該對象之類似樣本中的BCMA之量比較；以及根據所比較樣本中之BCMA之量的差異來判定對象之BCMA水平是否表示癌症進展、消退或穩定疾病。
得自或衍生自對象的樣本為生物樣本，諸如尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(cells that are not tissue associated)、組織、手術切除之腫瘤組織、活體組織切片、細針穿刺樣本、或組織標本(histological preparation)。
所述BCMA特異性抗體或抗原結合片段可經標示以用於所述方法或所屬領域中具有通常知識者所習知之其他方法中。舉例而言，本文中所述之抗體、或其抗原結合片段可用放射性標記、螢光標記、表位標籤、生物素、發色基(chromophore)標記、ECL標記、酶、釕、 111In-DOTA、 111In-二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、或多-組胺酸或所屬領域中所習知之類似此等標記來加以標示。 BCMA 特異性抗體套組
本文中所述者係包括所揭示之BCMA特異性抗體或其抗原結合片段的套組。所述套組可用來進行使用本文中所提供之BCMA特異性抗體或抗原結合片段之方法、或者所屬技術領域中具有通常知識者已知的其他方法。在一些實施例中，所述套組可包括本文中所述之抗體或抗原結合片段、及用於偵測生物樣本中BCMA之存在的試劑。因此，所述套組可包括本文中所述之抗體（或其抗原結合片段）之一或多者及用於容納未使用時之該抗體或片段之容器、該抗體或片段之使用說明、固定至固相撐體(solid support)之抗體或片段、及/或該抗體或片段之可偵測標示形式，如本文中所述。
定義
各種關於實施方式之態樣的用語係用於說明書與申請專利範圍的各個部分中。這些用語係以其在該項技術領域中之原始意義來使用，除非另有指示。其他經特別定義之用語的解讀係與本說明書中所提供之定義一致。
於本說明書及隨附的申請專利範圍中，除非內文另有明確說明，否則單數形式的「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱。因此，例如對於「一細胞(a cell)」之指稱包括兩或更多個細胞之組合與類似者。
本文中所使用之用語「約(about)」在指稱一可測量的值（諸如數量、持續時間及類似者）時，意欲涵蓋在指定值之高達± 10%內的變異，若此類變異為適合執行所揭示之方法者。除非另有指示，所有用於說明書及申請專利範圍中以表達成分量、特性（諸如分子量、反應條件等）之數目應理解為在所有情況中皆經用語「約(about)」所修飾。因此，除非另有相反指示，以下說明書及隨附申請專利範圍中所提出之數值參數為近似值，其可視本發明所尋求獲得之所欲特性而有所變化。無論如何，且並非意圖限制申請專利範圍的範疇之等效原則的應用，每一個數值參數應至少鑑於所報導的有效位數之數目並藉由應用一般捨入計數來加以詮釋。
儘管闡明本發明內容之廣域範圍的數值範圍及參數為近似值，仍盡可能精確地報導特定實例中所提出的數值。然而，任何數值固有地包含由在它們的個別測試測量值中發現之標準偏差所必然產生的某些誤差。
「單離(isolated)」意指生物組分（諸如核酸、肽或蛋白質）已經與該組分所天然出現於內之生物體中的其他生物組分（即其他染色體及染色體外DNA及RNA、和蛋白質）實質上分開、與該等其他生物組分分開生產、或經純化而遠離該等其他生物組分。已「經單離」之核酸、肽、及蛋白質因而包括藉由標準純化方法純化之核酸及蛋白質。「經單離」核酸、肽、及蛋白質可係組成物之一部分且仍為經單離的，只要此組成物並非該核酸、肽、及蛋白質之原生環境的一部分。該用語亦包含藉由在宿主細胞中重組表現所製備之核酸、肽及蛋白質以及化學合成之核酸。本文中所使用之「經單離(isolated)」抗體或抗原結合片段意指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體或抗原結合片段的抗體或抗原結合片段（例如，特異性結合至BCMA之單離抗體係實質上不含特異性結合BCMA以外之抗原的抗體）。然而，特異性結合至BCMA或GPRC5D之表位、異構體或變體的經單離抗體對於其他相關抗原例如來自其他物種之相關抗原（諸如BCMA或GPRC5D物種同源物）可具有交叉反應性。
「多核苷酸(polynucleotide)」同義地稱為「核酸分子(nucleic acid molecule)」、「核苷酸(nucleotide)」、或「核酸(nucleic acid)」，係指任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸，其可為未經修飾之RNA或DNA或經修飾之RNA或DNA。「多核苷酸(polynucleotide)」包括但不限於單股及雙股DNA、為單股及雙股區之混合物的DNA、單股及雙股RNA、及為單股及雙股區之混合物的RNA、包含可為單股或（更典型地）雙股或單股及雙股區之混合物的DNA及RNA之混雜分子。此外，「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三股區。用語多核苷酸亦包括含有一或多個經修飾鹼基之DNA或RNA及具有為了穩定性或其他理由經修飾之主鏈的DNA或RNA。「經修飾(modified)」鹼基包括例如三苯甲基化(tritylated)鹼基及不常見鹼基諸如肌苷(inosine)。可對於DNA及RNA進行各種修飾；因此，「多核苷酸(polynucleotide)」包含典型在自然界所發現之經化學、酶、或代謝修飾之多核苷酸形式，以及病毒和細胞所特有之DNA及RNA的化學形式。「多核苷酸(polynucleotide)」亦包含相對短之核酸鏈，其通常稱為寡核苷酸。
「實質上相同(substantially the same)」之意義可隨著使用該用語處之上下文而有所不同。由於在重鏈及輕鏈及編碼彼等之基因中可能存在有天然序列變異，可預期在胺基酸序列或編碼本文所述之抗體或抗原結合片段之基因中發現某種程度的變異，此變異對於彼等之獨特結合特性（例如，特異性及親和力）幾乎沒有影響。此預期一部分是由於基因密碼的簡併性(degeneracy of the genetic code)，以及由於保守性胺基酸序列變異（不會可察覺地改變所編碼之蛋白質的本質）之演化成功所致。因此，在提及核酸序列時，「實質上相同(substantially the same)」意指在兩或更多個序列之間有至少65%同一性(identity)。較佳的是，該用語係指在兩或更多個序列間有至少70%同一性，更佳為至少80%同一性，更佳為至少85%同一性，更佳為至少90%同一性，更佳為至少91%同一性，更佳為至少92%同一性，更佳為至少93%同一性，更佳為至少94%同一性，更佳為至少95%同一性，更佳為至少96%同一性，更佳為至少97%同一性，更佳為至少98%同一性，而更佳為至少99%或更高之同一性。兩個序列間之同一性百分比為該等序列所共有之同一性位置數目的函數（即同源性%=同一性位置# /總位置# x 100），並且將需要被導入以最佳排比這兩個序列之缺口(gap)數目及各缺口長度納入考慮。兩個核苷酸或胺基酸序列間的同一性百分比可使用例如E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)之演算法來判定，該演算法已納入ALIGN程式（版本2.0）中，其採用PAM120加權殘基表、缺口長度罰分為12及缺口罰分為4。此外，兩個胺基酸序列間的同一性百分比可使用Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)演算法來決定。
在蛋白質之胺基酸序列內發生不會實質影響蛋白質功能之變異的程度遠低於核酸序列，因為相同的簡併性理論不適用於胺基酸序列。因此，在提及抗體或抗原結合片段時，「實質上相同(substantially the same)」意指抗體或抗原結合片段與所述抗體或抗原結合片段具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。其他實施例所包括的抗體或抗原結合片段具有不與本文中所述之抗體及抗原結合片段共有顯著同一性之架構、支架、或其他非結合區，但的確包含一或多個CDR或其他賦予結合所需且與本文中所述之此類序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的序列。
「殖株(clone)」係自單一細胞或共同源始細胞(ancestor)藉由有絲分裂所衍生之細胞群。「細胞系(cell line)」係能夠在體外穩定生長許多代之初級細胞殖株。在本文中所提供之一些實例中，細胞係藉由DNA轉染細胞加以轉形。
用語「表現(express)」及「生產(produce)」在本文中係同義地使用，並且係指基因產物之生物合成。這些用語涵蓋將基因轉錄成RNA。這些用語亦涵蓋將RNA轉譯成一或多種多肽，並且進一步涵蓋所有天然發生之轉錄後及轉譯後修飾。抗體或其抗原結合片段之表現或生產可在細胞之細胞質內，或者進到細胞外環境中，諸如細胞培養之生長介質。
用語「治療（treating或treatment）」係指任何成功地或有成功跡象地減輕或改善傷害、病理變化或病況，包括任何客觀或主觀參數，諸如症狀之減少、緩解或消退或者使病況對於病患而言更可忍受、減慢退化或衰退速率、使退化終點較不耗弱、改善對象之身體或心理健康、或延長存活時間。治療可藉由客觀或主觀參數來加以評估；包括身體檢查、神經檢查或精神狀況評估的結果。
「有效量(effective amount)」或「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指達到所欲治療結果所需之有效劑量量及時間量。BCMA x GPRC5D x CD3抗體之治療有效量可依不同因素而異，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別、及體重、及抗體在個體中誘發所欲反應之能力。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益效果超過其任何毒性或有害效果之量。
「抗體(antibody)」係指免疫球蛋白之所有同型（IgG、IgA、IgE、IgM、IgD、及IgY），包括各種單體、聚合及嵌合形式，除非另有指定。用語「抗體(antibody)」所具體涵蓋者為多株抗體、單株抗體(mAb)、及類抗體多肽，諸如嵌合抗體及人化抗體。
用語「抗原結合臂(antigen-binding arm)」係指包括結合至抗原（例如BCMA、GPRC5D、或CD3）之抗原結合域之一部分，且可選地包括一或多個其他抗體區（例如，Fc域）。
用語「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」係指含有抗原結合域之抗原結合臂之片段。抗原結合片段包括藉由任何習知技術所提供者，諸如酶切割、肽合成、及重組技術。一些抗原結合片段係由保有親系抗體分子之抗原結合特異性的完整抗體之部分組成。舉例而言，抗原結合片段可包含已知結合特定抗原之抗體的至少一個可變區（重鏈或輕鏈可變區）或一或多個CDR。合適的抗原結合片段之實例包括但不限於雙價抗體(diabody)及單鏈分子以及Fab、F(ab’)2、Fc、Fabc、及Fv分子、單鏈(Sc)抗體、個別抗體輕鏈、個別抗體重鏈、抗體鏈或CDR及其他蛋白質、蛋白質支架間之嵌合融合物、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、由一個重鏈及一個輕鏈所組成之二聚體、由VL、VH、CL及CH1域所組成之單價片段、或如WO2007059782中所述之單價抗體、包含兩個由鉸鏈區之雙硫橋所連接之Fab片段之二價片段、基本上由VH及CH1域所組成之Fd片段；主要由抗體單臂之VL及VH域所組成的Fv片段、dAb片段（Ward等人，Nature 341, 544-546 (1989)）（其主要由VH域組成且亦稱為域抗體(domain antibody)）（Holt等人；Trends Biotechnol. 2003 Nov.; 21(11):484-90)；駱駝或奈米抗體（Revets等人；Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan.; 5(1):111-24)；經單離互補決定區(CDR)、及類似者；及自抗體片段所形成之三特異性抗體。所有抗體同型皆可用來生產抗原結合片段。此外，抗原結合片段可包括非抗體蛋白質架構諸如蛋白質支架，以成功地將多肽區段納入可賦予對所關注之指定抗原的親和力之位向。抗原結合片段可經重組生產，或藉由酶或化學切割完整抗體來生產。片語「抗體或其抗原結合片段(an antibody or antigen-binding fragment thereof)」可用來意謂指定抗原結合片段納入該片語中所指涉之抗體的一或多個胺基酸區段。
用語「抗原結合域(antigen-binding domain)」係指抗原結合臂之蛋白質結構，其展現特定抗原之結合親和力。此蛋白質結構由抗原結合域之互補決定區(CDR)媒介。
用語「CDR」及其複數「CDRs」係指互補決定區(CDR)，其中三個構成輕鏈可變區之結合特徵（CDRL1、CDRL2及CDRL3）及三個構成重鏈可變區之結合特徵（CDRH1、CDRH2及CDRH3）。CDR有助於抗體分子的功能活性並被包含支架或架構區的胺基酸序列分開。確切的定義性CDR邊界及長度有不同的分類及編號系統。因此CDR在本文中可用Kabat、Chothia、AbM、contact或任何其他邊界定義來指稱。儘管邊界不同，這些系統之各者在可變序列內所謂的「超變異區(hypervariable region)」的組成上具有一些程度的重疊。因此根據這些系統的CDR定義在關於相鄰架構區的長度及的邊界區域方面可能不同。請參見例如Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. NIH Publication No. 91-3242 (1991)；Chothia等人，「Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins，」 J. Mol. Biol.196:901 (1987)；及MacCallum等人，「Antibody-Antigen Interactions: Contact Analysis and Binding Site Topography，」J. Mol. Biol. 262:732 (1996))，其等之各者藉此以全文引用方式併入本文中。
一般而言，CDR形成可被歸類為正則結構之圈環結構。用語「正則結構(canonical structure)」係指抗原結合(CDR)圈環所採取的主鏈構形。從比較性結構研究中，發現六個抗原結合圈環中的五個僅具有有限的可用構形類型(repertoire)。各正則結構可藉由多肽主鏈的扭轉角來表徵。因此，抗體之間的對應圈環可能具有非常類似的三維結構，儘管圈環的大部分中具有高度胺基酸序列變異性（Chothia等人，「Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins，」 J. Mol. Biol.196:901 (1987); Chothia等人，「Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions，」I 342:877 (1989)；Martin及Thornton，「Structural Families in Loops of Homologous Proteins: Automatic Classification, Modelling and Application to Antibodies，」 J. Mol. Biol.263:800 (1996)，其等各者之全文以引用方式併入本文中。另外，所採取的圈環結構與其周圍的胺基酸序列之間存在一種關係。特定正則類別的構形係由圈環長度及位於圈環內以及保留性架構內（即在圈環之外）的關鍵位置之胺基酸殘基來判定。因此可基於這些關鍵胺基酸殘基的存在來指派特定正則類別。
用語「多肽(polypeptide)」與用語「蛋白質(protein)」可交換使用，且就其最廣義來說係指二或更多個次單位胺基酸、胺基酸類似物或擬肽物之化合物。次單位可藉由肽鍵連接。在另一實施例中，次單位可藉由其他鍵連接，例如酯、醚等。如本文中所使用之用語「胺基酸(amino acid)」係指天然及/或非天然或合成胺基酸，包括甘胺酸及D和L光學異構物、胺基酸類似物及擬肽物。三或更多個胺基酸的肽通常被稱為寡肽，如果肽鏈很短。若肽鏈很長，肽常被稱為多肽或蛋白質。如本文所使用，用語「Fc」係指抗體之可結晶片段域，其包含兩個恆定重鏈(CH)區，CH2及CH3。在本文中，Fc區之胺基酸殘基一般根據EU編號方案編號(Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969). PMID: 5257969)。此等殘基可根據替代編號方案諸如IMGT及Kabat（Kabat, E.A.等人，Sequences of proteins of immunological interest.第五版-美國衛生及人類服務部門，NIH公開案n 91-3242, pp 662,680,689 (1991)）編號而容易被指派，如所屬技術領域中具有通常知識者將易於理解的。例如，根據EU編號之L234亦可根據Kabat表示為L247。
當「特異性結合(specific binds/binds specifically)」或其衍生用語用於抗體、或抗體片段的上下文時，代表經由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所編碼之域結合至所關注蛋白質之一或多個表位，並且在含有混合分子群體之樣本中不會優先結合其他分子。典型而言，抗體以小於約1x10 -8M之K d結合至同源(cognate)抗原，如由表面電漿共振檢定或細胞結合檢定所測得者。諸如「[抗原]特異性([antigen]-specific)」抗體之片語（例如BCMA特異性抗體）係意欲表達該引述之抗體特異性結合該引述之抗原。在本文中，無論何時使用用語「結合(bind)」，都旨在涵蓋「特異性結合」且該等術語可如所欲地互換。
本文中所用之用語「嵌合(chimeric)」係指抗體、或其抗原結合片段具有衍生自非人類哺乳動物、囓齒動物、或爬蟲動物之抗體胺基酸序列的至少一個可變域之至少一些部分，並且該抗體、或其抗原結合片段之剩餘部分係衍生自人類。
「載體(vector)」是一種複製子(replicon)，諸如質體、噬菌體、黏質體(cosmid)、或病毒，可將另一個核酸區段可操作地插入其中，從而使該區段複製或表現。
如本文中所使用，用語「宿主細胞(host cell)」可為任何類型的細胞，例如初代細胞、培養中之細胞、或來自細胞系之細胞。在特定實施例中，用語「宿主細胞(host cell)」係指經核酸分子轉染的細胞及該細胞的後代或潛在後代。該細胞的後代可能因為例如發生在後繼世代或核酸分子整合至宿主細胞基因體時發生的突變或環境影響，而不與經核酸分子轉染之親代細胞同一。用語「表現(expression)」及「生產(production)」在本文中係同義地使用，並且係指基因產物之生物合成。這些用語涵蓋將基因轉錄成RNA。這些用語亦涵蓋將RNA轉譯成一或多種多肽，並且進一步涵蓋所有天然發生之轉錄後及轉譯後修飾。
用語「對象(subject)」係指人類及非人類動物，包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長動物、小鼠、兔、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、及爬蟲動物。在所述方法之許多實施例中，該對象為人類。
如本文中所使用之用語「重新導向（redirect/redirecting）」係指BCMA x GPRC5D x CD3抗體將T細胞活性自其固有同源特異性有效地傳遞到針對GPRC5D及/或BCMA表現性細胞的反應性之能力。
本文中所用之「樣本(sample)」係指單離自對象之類似流體、細胞、或組織（例如，手術切除之腫瘤組織、活體組織切片，包括細針穿刺）、以及存在於對象內之流體、細胞、或組織的總稱。在一些實施例中，樣本係生物流體。生物流體在生理溫度下一般為液體並且可包括存在於、抽取自、表現自或以其他方式擷取自對象或生物來源之天然出現流體。某些生物流體衍生自特定組織、器官或局部區域而某些其他生物流體可能更全域性或全身性位於對象或生物來源中。生物流體之實例包括血液、血清及漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、糞便、痰、分泌組織及器官之黏膜分泌物、陰道分泌物、腹水（諸如與非實質腫瘤有關之腹水）、胸膜液、心包膜液、腹膜液、腹腔液及其他體腔液、支氣管灌洗收集液及類似者。生物流體亦可包括與對象或生物來源接觸之液體溶液，例如細胞及器官培養基（包括細胞或器官條件培養基）、灌洗液及類似者。本文中所用之用語「樣本(sample)」涵括自對象取出之材料或存在於對象中之材料。可基於所需的經單離樣本在體外執行本發明之相關態樣。
「已知標準品(known standard)」可為具有已知量或濃度之GPRC5D及/或BCMA的溶液，其中該溶液可為天然出現溶液，諸如來自已知患有早期、中期、晚期、進行性、或穩定性癌症之患者的樣本，或者該溶液可為合成溶液，諸如具有已知量之GPRC5D及/或BCMA稀釋於其中的緩衝水。本文中所述之已知標準品可包括單離自對象之GPRC5D及/或BCMA、重組或純化之GPRC5D及/或BCMA蛋白質、或與疾病狀況相關聯之GPRC5D及/或BCMABCMA濃度值。
本文中所用之用語「B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen)」及「BCMA」包括人類B細胞成熟抗原，亦稱為BCMA、CD269、及TNFRSF17 (UniProt Q02223)，其係腫瘤壞死受體超家族的一員，在分化的漿細胞中優先表現。人類BCMA的胞外域係由根據UniProt之胺基酸1至54（或5至51）所組成。如本文中所使用，用語「針對BCMA之抗體(antibody against BCMA)、抗-BCMA抗體(anti-BCMA antibody)」係關於特異性結合至BCMA之抗體。
用語「G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (G-protein coupled receptor family C group 5 member D)」及「GPRC5D」具體包括人類GPRC5D蛋白，例如描述於GenBank登錄號BC069341、NCBI參考序列：NP_061124.1、及UniProtKB/Swiss-Prot登錄號Q9NZD1（亦請參見Brauner-Osborne, H.等人，2001, Biochim. Biophys. Acta 1518, 237-248)。
用語「決定簇3 (cluster determinant 3)」及「CD3」包括人類CD3蛋白多次單元複合物。CD3蛋白質多重次單元複合體由6個不同之多肽鏈組成。這些多肽鏈包括CD3γ鏈(SwissProt P09693)、CD3δ鏈(SwissProt P04234)、兩個CD3ε鏈(SwissProt P07766)、及一個與T細胞受體α及β鏈相關聯之CD3 ζ鏈同二聚體(homodimer) (SwissProt 20963)。用語「CD3」包括任何CD3變異體、異構體及物種同源物，其係由細胞（包括T細胞）所天然表現，或者可表現在經編碼這些多肽之基因或cDNA轉染的細胞上，除非另有註明。
「BCMA x GPRC5D x CD3抗體(BCMA x GPRC5D x CD3 antibody)」為多特異性抗體，可選地為三特異性抗體，其包含三個不同之抗原結合臂，其中一個結合至抗原BCMA，一個結合至抗原GPRC5D，而另一個結合至CD3。「BCMA x CD3抗體(BCMA x CD3 antibody)」為多特異性抗體，可選地為雙特異性抗體，其包含兩個不同之抗原結合臂，其中一個結合至抗原BCMA而另一個結合至CD3。「GPRC5D x CD3抗體(GPRC5D x CD3 antibody)」為多特異性抗體，可選地為雙特異性抗體，其包含兩個不同之抗原結合臂，其中一個結合至抗原GPRC5D而另一個特異性結合至CD3。用語「多特異性抗體(multispecific antibody)」在本文中可廣泛地使用且特別涵蓋具有多表位特異性之抗體。多特異性抗體包括但不限於包含重鏈可變域(V H)及輕鏈可變域(V L)之抗體，其中該V HV L單元具有多表位特異性；具有二或更多個V L及V H域之抗體，其中各V HV L單元結合至不同表位；具有二或更多個單一可變域之抗體，各單一可變域結合至不同表位；全長抗體；及包含一或多個抗體片段之抗體以及包含共價或非共價連接之抗體片段之抗體。
多特異性抗體可為雙特異性抗體、三特異性抗體、雙價抗體、或類似分子（例如請參見 PNAS USA90(14), 6444-8 (1993)以獲得雙價抗體之說明）。本文中所提供之雙特異性抗體、三特異性抗體、雙價抗體(diabody)、及類似者，除了結合BCMA或GPRC5D之一部分外，還可結合任何合適的目標。用語「雙特異性抗體(bispecific antibody)」係理解為具有兩個由不同抗體序列所定義之不同抗原結合臂的抗體。用語「三特異性抗體(trispecific antibody)」係理解為具有三個由不同抗體序列所定義之不同抗原結合臂的抗體。此可理解為不同之目標結合但亦包括對於一個目標中之不同表位的結合。
「參考樣本(reference sample)」係可與另一個樣本（諸如測試樣本）比較之樣本，以允許用於表徵所比較之樣本。參考樣本將具有一些經表徵之性質，該等性質可作為與測試樣本比較之基礎。舉例而言，參考樣本可用來作為GPRC5D或BCMA水平的指標，以用於指示對象患有癌症。參考樣本不必然需要與測試樣本一起分析，因此在一些情況中，參考樣本可為已預先判定以表徵給定病況之一數值或數值範圍，諸如指示對象中之癌症的GPRC5D或BCMA水平。該用語亦包括用於比較目的之樣本，該樣本已知與生理狀態或疾病狀況（諸如GPRC5D或BCMA表現性癌症）相關聯，但具有未知量的GPRC5D或BCMA。
「復發性(relapsed)」係指在先前用治療劑治療之後在一段時間的改善後，疾病或疾病之徵象及症狀的回歸。
「難治性(refractory)」係指對治療沒有反應的疾病。難治性疾病可在治療之前或在開始治療時對該治療具有抗性，或者難治性疾病可在治療期間變成具有抗性。
如在提及GPRC5D及/或BCMA表現性癌症之進展時所使用之用語「進展(progression)」，包括癌症從較不嚴重狀態到較嚴重狀態之改變。此可包括腫瘤數目或嚴重性增加、轉移程度增加、癌症生長或擴散之速度增加、及類似者。舉例而言，「結腸癌進展(the progression of colon cancer)」包括該癌症從較不嚴重狀態進展到較嚴重狀態，諸如從第I期進展到第II期、從第II期進展到第III期等。
如在提及GPRC5D及/或BCMA表現性癌症之消退時所使用之用語「消退(regression)」，包括癌症從較嚴重狀態到較不嚴重狀態之改變。此可包括腫瘤數目或嚴重性減少、轉移程度減少、癌症生長或擴散速度減少、及類似者。舉例而言，「結腸癌消退(the regression of colon cancer)」包括該癌症從較嚴重狀態消退到較不嚴重狀態，諸如從第III期進展到第II期、從第II期到第I期等。
如在提及穩定性GPRC5D及/或BCMA表現性癌症時所用之用語「穩定(stable)」，係意欲描述疾病狀況在臨床相關之時期內並未（或尚未）明顯變化到足以被認為癌症正在進展或癌症正在消退。
本文中所述之實施例不限於特定方法、試劑、化合物、組成物或生物系統，其當然可能有所變化。 多特異性抗體
本文中提供結合至BCMA、GPRC5D及CD3之多特異性抗體、以及其三特異性結合片段。相較於僅靶向這些目標中之一或二者的抗體，此類抗體或抗體片段可以允許更特異性地靶向特定細胞子集。
此可藉由例如製造包含結合至CD3之第一抗原結合臂、結合至GPRC5D之第二抗原結合臂、及結合至BCMA之第三抗原結合臂的分子來達成。該等抗原結合臂可採取允許特異性辨識目標之任何形式，例如該結合臂可係或可包括重鏈可變域、Fv（重鏈可變域與輕鏈可變域之組合）、單鏈Fv (scFv)、Fab、基於纖連蛋白素III型域(fibronectin type III domain)的結合域（諸如來自纖連蛋白素、或基於來自纖連蛋白素的III型域的一致序列、或來自固生蛋白(tenascin)、或基於來自固生蛋白的III型域的一致序列，諸如來自Janssen Biotech, Inc.的Centyrin分子，請參見例如WO2010/051274及WO2010/093627）。在某些實施例中，該三特異性抗體包含三個抗原結合臂。在一些實施例中，該三特異性抗體係由例如以單鏈可變片段的形式融合其他抗原結合臂之抗體（例如，IgG格式）所組成，例如融合至該抗體的重鏈之一者或輕鏈之一者的N或C端。
因此，提供包含三個分別結合BCMA、GPRC5D及CD3之不同抗原結合臂的三特異性分子。
在一些實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體包含 (a)第一抗原結合臂，其包含第一重鏈可變域(VH1)及第一輕鏈可變域(VL1)； (b)第二抗原結合臂，其包含第二重鏈可變域(VH2)及第二輕鏈可變域(VL2)；及 (c)第三抗原結合臂，其包含第三重鏈可變域(VH3)及第三輕鏈可變域(VL3)。
在一些實施例中，該第一抗原結合臂結合至CD3上之表位，該第二抗原結合臂結合至GPRC5D上之表位，且該第三抗原結合臂結合至BCMA上之表位。
在一些實施例中，結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之該VH1之HCDR 1、HCDR2、及HCDR3。在一些實施例中，結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 7之該VL1之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中，結合CD3之該第一抗原結合臂包含：包含GDSVFNNNAAWS (SEQ ID NO: 4)之胺基酸序列之HCDR1、包含RTYYRSKWLYD (SEQ ID NO: 5)之胺基酸序列之HCDR2、及包含GYSSSFDY (SEQ ID NO: 6)之胺基酸序列之HCDR3。在一些實施例中，結合CD3之該第一抗原結合臂包含：包含TGTSSNIGTYKFVS (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列之LCDR1、包含EVSKRPS (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列之LCDR2、及包含VSYAGSGTLL (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列之LCDR3。在一些實施例中，結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之該VH1。在一些實施例中，結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 7之該VL1。
在一些實施例中，結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 16之該VH2之HCDR1、HCDR2、及HCDR3。在一些實施例中，結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 15之該VL2之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中，結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含：包含GFSLTNIRMSVS (SEQ ID NO: 12)之胺基酸序列之HCDR1、包含HIFSNDEKS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列之HCDR2、及包含MRLPYGMDV (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列之HCDR3。在一些實施例中，結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含：包含RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列之LCDR1、包含KISNRFF (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列之LCDR2、及包含MQATQFPHT (SEQ ID NO: 11)之胺基酸序列之LCDR3。在一些實施例中，結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 16之該VH1。在一些實施例中，結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 15的VL1。
在一些實施例中，結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 24之該VH3之HCDR1、HCDR2、及HCDR3。在一些實施例中，結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 23的VL3之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些實施例中，結合BCMA之該第三抗原結合臂包含：包含GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列之HCDR1、包含AISGSGGSTY (SEQ ID NO: 21)之胺基酸序列之HCDR2、及包含DEGYSSGHYYGMDV (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列之HCDR3；以及RASQSISSSFLT (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列之LCDR1。在一些實施例中，結合BCMA之該第三抗原結合臂包含：包含GASSRAT (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列之LCDR2、及包含QHYGSSPMYT (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列之LCDR3。在一些實施例中，結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 24之該VH1。在一些實施例中，結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 23的VL1。
在一些實施例中，結合至CD3表位之抗原結合臂之該VH1及VL1存在於雙價抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、或雙硫鍵穩定性雙價抗體（ds雙價抗體）中。
在一些實施例中，結合至GPRC5D表位之抗原結合臂之該VH2及VL2存在於雙價抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、或雙硫鍵穩定性雙價抗體（ds雙價抗體）中。
在一些實施例中，結合至BCMA表位之抗原結合臂之該VH3及VL3存在於雙價抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、或雙硫鍵穩定性雙價抗體（ds雙價抗體）中。
在一些實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體之第一抗原結合臂包含：包含該VH1之第一重鏈部分(HC1)及包含該VL1之輕鏈部分(LC)，其中該VH1及VL1對形成結合第一抗原之第一抗原結合域。在一些實施例中，該HC1自N至C端包含該VH1、第一重鏈恆定域(CH1)、及第一Fc域。在一些實施例中，該HC1之該VH1及CH1與該LC一起形成片段抗原結合(Fab)域。
在一些實施例中，該第一抗原結合臂之該VH1經由該第一Fc域偶聯至該第三抗原結合臂之該VH3。在一些實施例中，該第一抗原結合臂之第一Fc域經由第一連接子(L1)偶聯至該第三抗原結合臂，藉此形成偶聯之第一及第三抗原結合臂。該偶聯之第一及第三抗原結合臂自N至C端可包含該第一抗原結合臂之該VH1、該CH1域、及該Fc域、該第一連接子、及該第三抗原結合臂。在一些實施例中，該第三抗原結合臂係由該第三抗原結合臂之該VH3及VL3所形成之單鏈可變片段(scFv)。
在一些實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體之該第二抗原結合臂包含第二重鏈部分(HC2)，該第二重鏈部分包含形成結合第二抗原之第二抗原結合域之該第二重鏈可變域(VH2)。在一些實施例中，該第二結合臂自N至C端包含由該VH2及VL2所形成之單鏈可變片段(scFv)、及第二Fc域。
在一些實施例中，該第二抗原結合臂之該VH2經由該第二Fc域偶聯至該第三抗原結合臂之該VH3。在一些實施例中，該第二抗原結合臂之第二Fc域經由連接子偶聯至該第三抗原結合臂，藉此形成偶聯之第二及第三抗原結合臂。該偶聯之第二及第三抗原結合臂自N至C端可包含該第二抗原結合域、該第二Fc域、該第一連接子、及該第三抗原結合臂。在一些實施例中，該第三抗原結合臂係由該第三抗原結合臂之該VH3及VL3所形成之單鏈可變片段(scFv)。
在較佳實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體係包含CD3特異性臂之三特異性抗體，該CD3特異性臂包含：包含該VH1之第一重鏈部分(HC1)及包含該VL1之輕鏈部分(LC)。該VH1及VL1域對形成結合CD3之第一抗原結合域。該三特異性抗體之該第二抗原結合臂包含第二重鏈部分(HC2)，該第二重鏈部分具有形成結合該第二抗原之該第二抗原結合域之該VH2。該CD3特異性結合臂之HC1或該第二抗原結合臂之HC2偶聯至包含該VH3域之該第三抗原結合臂，其形成結合該第三抗原之該第三抗原結合域。在一些實施例中，該第二抗原係BCMA，且該第三抗原係GPRC5D。在一些實施例中，該第二抗原係GPRC5D，且該第三抗原係BCMA。
在一個實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體係包含CD3特異性結合臂之三特異性抗體，該CD3特異性結合臂包含具有該VH1之HC1及具有該VL1之LC。該VH1及VL1對形成結合CD3之該第一CD3特異性抗原結合域。該第二抗原結合臂包含形成結合GPRC5D之該第二抗原結合域之該VH2及VL2。該第三抗原結合臂偶聯至該第二抗原結合臂且包含形成結合BCMA之該第三抗原結合域之該VH3及VL3。
在一個實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體係包含CD3特異性結合臂之三特異性抗體，該CD3特異性結合臂包含具有該VH1之HC1及具有該VL1之LC。該VH1及VL1對形成結合CD3之該第一CD3特異性抗原結合域。該第二抗原結合臂包含形成結合BCMA之該第二抗原結合域之該VH2及VL2。該第三抗原結合臂偶聯至該第二抗原結合臂且包含形成結合GPRC5D之該第三抗原結合域之該VH3及VL3。
在一個實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體係包含CD3特異性結合臂之三特異性抗體，該CD3特異性結合臂包含具有該VH1之HC1及具有該VL1之LC。該VH1及VL1對形成結合CD3之該第一CD3特異性抗原結合域。該第二抗原結合臂包含形成結合GPRC5D之該第二抗原結合域之該VH2及VL2。該第三抗原結合臂偶聯至該第一CD3特異性抗原結合臂且包含形成結合BCMA之該第三抗原結合域之該VH3及VL3。
在一個實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體係包含CD3特異性結合臂之三特異性抗體，該CD3特異性結合臂包含具有該VH1之HC1及具有該VL1之LC。該VH1及VL1對形成結合CD3之該第一CD3特異性抗原結合域。該第二抗原結合臂包含形成結合BCMA之該第二抗原結合域之該VH2及VL2。該第三抗原結合臂偶聯至該第一CD3特異性抗原結合臂且包含形成結合GPRC5D之該第三抗原結合域之該VH3及VL3。
在一些實施例中，該第一抗原結合臂之具有該VH1之HC1及具有該VL1之LC域形成包含該第一抗原結合域之抗原結合片段(Fab)。在一些實施例中，該第二抗原結合臂之該VH2及VL2形成包含該第二抗原結合域之單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，該第三抗原結合臂之該VH3及VL3形成包含該第三抗原結合域之單鏈可變片段(scFv)。
在一個實施例中，該CD3結合臂包含抗原結合片段(Fab)，該BCMA結合臂包含單鏈可變片段(scFv)，且該GPRC5D結合臂包含單鏈可變片段(scFv)。
在一個實施例中，該CD3結合臂包含單鏈可變片段(scFv)，該BCMA結合臂包含抗原結合片段(Fab)，且該GPRC5D結合臂包含單鏈可變片段(scFv)。
在一個實施例中，該CD3結合臂包含單鏈可變片段(scFv)，該BCMA結合臂包含單鏈可變片段(scFv)，且該GPRC5D結合臂包含抗原結合片段(Fab)。
在一些實施例中，該三特異性抗體之該CD3結合臂包含該HC1及該LC。該HC1可包含恆定重鏈區（CH1、CH2、及CH3）及該VH1。該LC可包含該VL1。該VH1及VL1組合以形成該CD3抗原結合域。
在一些實施例中，該三特異性抗體之GPRC5D結合臂包含該HC2。該HC2可包含恆定重鏈區（CH2及CH3）、及附接在該CH2區之N端之單鏈可變片段(scFv)，其中該scFv包含該GPRC5D抗原結合域。
在一些實施例中，該三特異性抗體進一步包含附接至該GPRC5D結合臂之該CH3區之C端的BCMA抗原結合臂以形成GPRC5D/BCMA結合臂。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含第二單鏈可變片段(single-chain variable fragment, scFv)。在一些實施例中，該GPRC5D/BCMA臂可具有以下結構：含有該GPRC5D結合域、CH2及CH3區之scFv，含有該BCMA結合域之scFv。
在一些實施例中，該三特異性抗體之該CD3結合臂包含該HC1及該LC。該HC1可包含恆定重鏈區（CH1、CH2、及CH3）及該VH1。該LC可包含該VL1。該VH1及VL1組合以形成該CD3抗原結合域。
在一些實施例中，該三特異性抗體之BCMA結合臂包含HC2。該HC2可包含恆定重鏈區（CH2及CH3）、及附接在該CH2區之N端之單鏈可變片段(scFv)，其中該scFv包含該BCMA抗原結合域。
在一些實施例中，該三特異性抗體進一步包含附接至該CD3結合臂之CH3區之C端的GPRC5D抗原結合臂，以形成CD3/GPRC5D結合臂。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含第二單鏈可變片段(single-chain variable fragment, scFv)。在一些實施例中，該CD3/GPRC5D臂可具有以下結構：含有該CD3結合域、CH2、及CH3區之Fab，含有該GPRC5D結合域之scFv。
在一些實施例中，本發明之多特異性抗體包括具有全長抗體結構之抗體。本文中所用之「全長抗體(full length antibody)」係指具有兩個全長抗體重鏈及兩個全長抗體輕鏈之抗體。全長抗體重鏈(HC)包括重鏈可變域及恆定域VH、CH1、CH2、及CH3。全長抗體輕鏈(LC)包括輕鏈可變域及恆定域VL及CL。全長抗體可在任一或兩個重鏈中缺乏C端離胺酸(K)。用語「Fab臂(Fab-arm)」或「半分子(half molecule)」係指結合抗原之一個重鏈-輕鏈對。在一些實施例中，該等抗原結合域中之一者係非基於抗體的結合域，例如基於纖連蛋白素III型域(fibronectin type 3 domain)的結合域，例如Centyrin。 BCMA結合臂
本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體包含針對BCMA之抗原結合臂。在一些實施例中，該BCMA結合臂結合人類BCMA。在一些實施例中，該BCMA結合臂結合人類BCMA及食蟹獼猴BCMA。在一些實施例中，該BCMA結合臂結合人類BCMA但不結合食蟹獼猴BCMA。在一些實施例中，該BCMA結合臂結合至一表位，該表位包括來自該BCMA胞外域(ECD)之一或多個殘基。在一些實施例中，該BCMA結合臂結合至BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 162))。
該等BCMA結合臂可以5 x10 -7M或更低（諸如1 x10 -7M或更低、5 x10 -8M或更低、1 x10 -8M或更低、5 x10 -9M或更低、1 x10 -9M或更低、或者5 x10 -10M或更低）之親和力結合至BCMA。在一個實施例中，該BCMA結合臂以約1 x10 -10M至1 x10 -7M之親和力結合至該BCMA。在一個實施例中，該BCMA結合臂以約1 x10 -10M、約2 x10 -10M、約3 x10 -10M、約4 x10 -10M、約5 x10 -10M、約6 x10 -10M、約7 x10 -10M、約8 x10 -10M、約9x10 -10M、約1x10 -9M、約2 x10 -9M、約3 x10 -9M、約4 x10 -9M、約5 x10 -9M、約6 x10 -9M、約7 x10 -9M、約8 x10 -9M、或約9 x10 -9M之親和力結合至該BCMA。在一個實施例中，該BCMA結合臂以約1 x10 -10至5 x10 -10M、約1 x10 -10至8 x10 -10M、約2 x10 -10至9 x10 -10M、約3 x10 -10至10 x10 -10M、約4x10 -10至10x10 -10M、或約5 x10 -10至10 x10 -10M之親和力結合至該BCMA。在一個實施例中，該BCMA結合臂以藉由表面電漿子共振(SPR)檢定所判定之約8.4 x10 -10M之親和力結合至該BCMA。在一個實施例中，該BCMA結合臂以藉由表面電漿子共振(SPR)檢定所判定之約2.1 x10 -10M之親和力結合至該BCMA。
表1提供本文中所述之一些BCMA特異性抗體之實例彙總： 表1. 針對人類BCMA 所產生之例示性mAb 的CDR 序列
ID HC-CDR1 HC-CDR2 HC-CDR3 LC-CDR1 LC-CDR2 LC-CDR3
BCMB519 GFTFSSYAMS (SEQ ID NO 20) AISGSGGSTY (SEQ ID NO 21) DEGYSSGHYYGMDV (SEQ ID NO 22) RASQSISSSFLT (SEQ ID NO 17) GASSRAT (SEQ ID NO 18) QHYGSSPMYT (SEQ ID NO 19)
BCMB69 SGSYFWG (SEQ ID NO 32) SIYYSGITYYNPSLKS (SEQ ID NO 33) HDGAVAGLFDY (SEQ ID NO 34) GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO 39) DDSDRPS (SEQ ID NO 40) QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO 41)
BCMB117 SGSYFWG (SEQ ID NO 32) SIYYSGITYYNPSLKS (SEQ ID NO 33) HDGAVAGLFDY (SEQ ID NO 34) GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO 39) DDSDRPS (SEQ ID NO 40) QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO 41)
BCMB123 SSSYFWG (SEQ ID NO 38) SIYYSGITYYNPSLKS (SEQ ID NO 33) HDGAVAGLFDY (SEQ ID NO 34) GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO 39) DDSDRPS (SEQ ID NO 40) QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO 41)
BCMB128 SGSYFWG (SEQ ID NO 32) SIYYSGITYYNPSLKS (SEQ ID NO 33) HDGATAGLFDY (SEQ ID NO 37) GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO 39) DDSDRPS (SEQ ID NO 40) QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO 41)
BCMB129 SGSYFWG (SEQ ID NO 32) SIYYSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO 36) HDGAVAGLFDY (SEQ ID NO 34) GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO 39) DDSDRPS (SEQ ID NO 40) QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO 41)
BCMB176 SSSYFWG (SEQ ID NO 38) SIYYSGITYYNPSLKS (SEQ ID NO 33) HDGATAGLFDY (SEQ ID NO 37) GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO 39) DDSDRPS (SEQ ID NO 40) QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO 41)
BCMB177 SSSYFWG (SEQ ID NO 38) SIYYSGRTYYNPSLKS (SEQ ID NO 164) HDGATAGLFDY (SEQ ID NO 37) GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO 39) DDSDRPS (SEQ ID NO 40) QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO 41)
一些BCMA特異性抗體或抗原結合片段之特徵可見於例如美國專利第10,072,088號中，其內容以全文引用方式併入本文中。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含表1中所述之抗體中任一者所述之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含表1中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含重鏈可變域及輕鏈可變區，該重鏈可變域包含表1中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈可變區包含表1中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂與包含重鏈及輕鏈之抗體或抗原結合競爭與BCMA之結合，該重鏈包含表1中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表1中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含重鏈，該重鏈包含表1中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含輕鏈，該輕鏈包含表1中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含表1中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表1中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含下列殖株之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3：BCMB519、BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176、或BCMB177。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含下列殖株之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3：BCMB519、BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176、或BCMB177。在一個實施例中，該BCMA結合臂包含殖株BCMB519之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含衍生自如表1中所述之抗體植株的重鏈可變域。在一些例示性實施例中，該BCMA結合臂包含衍生自如表1中所述之抗體植株的重鏈可變域及輕鏈可變域。在一些例示性實施例中，BCMA結合臂包含殖株BCMB519、BCMB69、BCMB117、BCMB123、BCMB128、BCMB129、BCMB176、或BCMB177之的重鏈可變域及輕鏈可變域。在一個實施例中，該BCMA結合臂包含殖株BCMB519之重鏈可變域及輕鏈可變域。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 20之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 21之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 22之重鏈CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 20之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 21之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 22之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 17之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 18之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 19之輕鏈CDR3。該BCMA結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 24實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 24實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 23實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 33之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 34之重鏈CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 33之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 34之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 39之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 40之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 41之輕鏈CDR3。該BCMA結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 42實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 42實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 48實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 38之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 33之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 34之重鏈CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 38之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 33之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 34之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 39之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 40之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 41之輕鏈CDR3。該BCMA結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 43實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 43實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 48實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 33之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 37之重鏈CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 33之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 37之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 39之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 40之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 41之輕鏈CDR3。該BCMA結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 44實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 44實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 48實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 36之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 34之重鏈CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 36之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 34之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 39之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 40之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 41之輕鏈CDR3。BCMA結合臂包含人類架構序列。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 45實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 45實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 48實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 38之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 33之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 37之重鏈CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 38之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 33之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 37之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 39之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 40之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 41之輕鏈CDR3。該BCMA結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 46實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 46實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 48實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 38之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 164之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 37之重鏈CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 38之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 164之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 37之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 39之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 40之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 41之輕鏈CDR3。該BCMA結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 47實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 47實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 48實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
該BCMA結合臂可藉由重組手段而衍生自任何物種。舉例而言，該BCMA結合臂可衍生自小鼠、大鼠、山羊、馬、豬、牛、雞、兔、駱駝、驢、人、或其等之嵌合版本。針對投予至人類之用途，非人類衍生性抗原結合片段可經基因或結構改造以在投予至人類患者時較不具抗原性。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含嵌合型之抗原結合片段。
在一些實施例中，該BCMA結合臂包含人化抗原結合片段。人化抗原結合片段可衍生自含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列）。在大多數情況下，人化抗體或抗原結合片段係人類免疫球蛋白（接受者抗體(recipient antibody)）或抗原結合片段，其中來自該接受者之互補決定區(CDR)的殘基係經來自具有所欲特異性、親和力、及能力之非人類物種（供體抗體）諸如小鼠、大鼠或兔之CDR的殘基置換。一般而言，該人化抗體抗原結合片段將包含實質上所有至少一個及典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應非人類免疫球蛋白之CDR區，並且所有或實質上所有架構區係人類免疫球蛋白序列之架構區。人化抗體抗原結合片段可包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型為人類免疫球蛋白之恆定區。 GPRC5D結合臂
本文中所述之BCMAx GPRC5D x CD3多特異性抗體包含針對GPRC5D之抗原結合臂。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂結合人類GPRC5D。在一些實施例中，GPRC5D結合臂結合人類GPRC5D及食蟹獼猴GPRC5D，較佳地結合其胞外域。在一些實施例中，GPRC5D結合臂結合人類GPRC5D但不結合食蟹獼猴GPRC5D。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂結合至具有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之多肽之一或多個殘基。
表2提供本文中所述之一些GPRC5D特異性抗體之實例彙總： 表2. 針對人類GPRC5D 所產生之例示性mAb 的CDR 序列
ID HC-CDR1 HC-CDR2 HC-CDR3 LC-CDR1 LC-CDR2 LC-CDR3
GC5B680 GFSLTNIRMSVS (SEQ ID NO:12) HIFSNDEKS (SEQ ID NO:13) MRLPYGMDV (SEQ ID NO:14) RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO:9) KISNRFF (SEQ ID NO:10) MQATQFPHT (SEQ ID NO:11)
GC5B81 SYAIS (SEQ ID NO 49) GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO 53) ESRWRGYKLD (SEQ ID NO 57) RASQSISSYLN (SEQ ID NO 61) AASSLQS (SEQ ID NO 64) QQSYSTPLT (SEQ ID NO 67)
GC5B465 GC5B597 GC5B598 NYWMS (SEQ ID NO 50) GISYSGGSKYYASSVKG (SEQ ID NO 54) AAFDFGRRAVRLD (SEQ ID NO 58) RASQSISSYLN (SEQ ID NO 61) AASSLQS (SEQ ID NO 64) QQSYSTPLT (SEQ ID NO 67)
GC5B483 GC5B599 SYFIG (SEQ ID NO 51) IIYPGKSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO 55) VYSFGGRHKALFDY (SEQ ID NO 59) RASQSVSSYLA (SEQ ID NO 62) DASNRAT (SEQ ID NO 65) QQRSNWPLT (SEQ ID NO 68)
GC5B596 GYTMN (SEQ ID NO 52) LINPYNSDTNYAQKLQG (SEQ ID NO 56) VALRVALDY (SEQ ID NO 60) KASQNVATHVG (SEQ ID NO 63) SASYRYS (SEQ ID NO 66) QQYNRYPYT (SEQ ID NO 69)
GC5B382 DYGMH (SEQ ID NO 70) AIKYSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO 77) RAESGPGLDY (SEQ ID NO 84) KSSQSVLYSSNNKNYLA (SEQ ID NO 91) WASTRES (SEQ ID NO 93) QQYYSTPLT (SEQ ID NO 95)
GC5B379 NYWMS (SEQ ID NO 50) GISYSGGSKYYADSVKG (SEQ ID NO 78) AAWDFGRRAVRLDY (SEQ ID NO 85) RASQSISSYLN (SEQ ID NO 61) AASSLQS (SEQ ID NO 64) QQSYSTPLT (SEQ ID NO 67)
GC5B373 SYWIG (SEQ ID NO 71) IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO 79) IGFYGRSFRIFDY (SEQ ID NO 86) RASQSVSSYLA (SEQ ID NO 62) DASNRAT (SEQ ID NO 65) QQRSNWPLT (SEQ ID NO 68)
GC5B376 SYWIG (SEQ ID NO 71) IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO 79) VYSFGGRHKALFDY (SEQ ID NO 59) RASQSVSSYLA (SEQ ID NO 62) DASNRAT (SEQ ID NO 65) QQRSNWPLT (SEQ ID NO 68)
GC5B385 GYAMS (SEQ ID NO 72) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO 80) VDRSFGRSRYTLDY (SEQ ID NO 87) RASQSVSSYLA (SEQ ID NO 62) DASNRAT (SEQ ID NO 65) QQRSNWPLT (SEQ ID NO 68)
GC5B370 SYGIS (SEQ ID NO 73) GIIPIFGNINYAQKFQG (SEQ ID NO 81) VSRRFKRFAYYFDY (SEQ ID NO 88) KSSQSVLYSSNNKNYLA (SEQ ID NO 91) WASTRES (SEQ ID NO 93) QQYYSTPLT (SEQ ID NO 95)
GC5B602 GYSFTGYTMN (SEQ ID NO 74) LINPYNGDTN (SEQ ID NO 82) VALRVALDY (SEQ ID NO 60) KASQNVATHVG (SEQ ID NO 63) SASYRYS (SEQ ID NO 66) QQYNRYPYT (SEQ ID NO 69)
GC5B603 SYAMS (SEQ ID NO 75) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO 80) SNFLPVVFDY (SEQ ID NO 89) RASQSVRKSLA (SEQ ID NO 92) TASNRAT (SEQ ID NO 94) QQYFRAPIT (SEQ ID NO 96)
GC5B601 GFSLTSYNVH (SEQ ID NO 76) VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID NO 83) DGIRLRFAY (SEQ ID NO 90) KASQNVATHVG (SEQ ID NO 63) SASYRYS (SEQ ID NO 66) QQYNRYPYT (SEQ ID NO 69)
一些GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段之特徵可見於例如美國專利第10,562,968號、美國公開案US2020/0231686，其等之各者之內容以全文引用方式併入本文中。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含表2中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含輕鏈可變區，該輕鏈可變域包含表2中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含重鏈可變域及輕鏈可變域，該重鏈可變域包含表2中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈可變域包含表2中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂與包含重鏈及輕鏈之抗體或抗原結合競爭與GPRC5D之結合，該重鏈包含表2中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表2中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含重鏈，該重鏈包含表2中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含輕鏈，該輕鏈包含表2中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含表2中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表2中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含衍生自如表2中所述之抗體植株的重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含衍生自如表2中所述之抗體植株的輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含衍生自如表2中所述之抗體殖株的重鏈CDR1、CDR2、及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含下列植株之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3：GC5B680、GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598、或GC5B597。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含下列植株之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3：GC5B680、GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598、或GC5B597。在一個實施例中，該GPRC5D結合臂包含殖株GC5B680之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些例示性實施例中，該GPRC5D結合臂包含衍生自如表2中所述之抗體植株的重鏈可變域。在一些例示性實施例中，該GPRC5D結合臂包含衍生自如表2中所述之抗體植株的重鏈可變域及輕鏈可變域。在一些例示性實施例中，該GPRC5D結合臂包含下列植株之重鏈可變域及輕鏈可變域：GC5B680、GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598、或GC5B597。在一個實施例中，該GPRC5D結合臂包含殖株GC5B680之重鏈可變域及輕鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D特異性抗體殖株可在體外誘導ADCC，其EC 50為28 nM或更小。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 13之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 14之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 12之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 13之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 14之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 9之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 10之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 11之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 16實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 16實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 15實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 49之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 53之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 57之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 49之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 53之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 57之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 61之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 64之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 67之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 97實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 97實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 101實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 50之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 54之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 58之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 50之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 54之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 58之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 61之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 64之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 67之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 98實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 98實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 101實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 51之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 55之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 59之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 51之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 55之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 59之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 62之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 65之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 68之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 99實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 99實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 102實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 52之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 56之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 60之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 52之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 56之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 60之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 63之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 66之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 69之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 100實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 100實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 103實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 70之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 77之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 84之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 70之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 77之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 84之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 91之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 93之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 95之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 104實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 104實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 113實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 50之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 78之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 85之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 50之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 78之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 85之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 61之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 64之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 67之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 105實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 105實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 101實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 71之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 79之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 86之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 71之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 79之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 86之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 62之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 65之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 68之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 106實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 106實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 102實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 71之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 79之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 59之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 71之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 79之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 59之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 62之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 65之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 68之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 107實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 107實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 102實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 72之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 80之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 87之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 72之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 80之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 87之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 62之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 65之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 68之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 108實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 108實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 102實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 73之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 81之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 88之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 73之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 81之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 88之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 91之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 93之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 95之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 109實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 109實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 113實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 74之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 82之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 60之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 74之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 82之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 60之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 63之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 66之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 69之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 110實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 110實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 103實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 75之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 80之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 89之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 75之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 80之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 89之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 92之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 94之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 96之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 111實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 111實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 114實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 76之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 83之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 90之重鏈CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含：包含SEQ ID NO: 76之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 83之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 90之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 63之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 66之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 69之輕鏈CDR3。該GPRC5D結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 112實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含與SEQ ID NO: 112實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 115實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。
該GPRC5D結合臂可藉由重組手段而衍生自任何物種。舉例而言，GPRC5D抗原結合臂可衍生自小鼠、大鼠、山羊、馬、豬、牛、雞、兔、駱駝、驢、人、或其等之嵌合版本。針對投予至人類之用途，非人類衍生性抗原結合片段可經基因或結構改造以在投予至人類患者時較不具抗原性。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含嵌合型之抗原結合片段。
在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含人化抗原結合片段。人化抗原結合片段可衍生自含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列）。在大多數情況下，人化抗體或抗原結合片段係人類免疫球蛋白（接受者抗體(recipient antibody)）或抗原結合片段，其中來自該接受者之互補決定區(CDR)的殘基係經來自具有所欲特異性、親和力、及能力之非人類物種（供體抗體）諸如小鼠、大鼠或兔之CDR的殘基置換。一般而言，該人化抗體抗原結合片段將包含實質上所有至少一個及典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應非人類免疫球蛋白之CDR區，並且所有或實質上所有架構區係人類免疫球蛋白序列之架構區。人化抗體抗原結合片段可包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型為人類免疫球蛋白之恆定區。 CD3結合臂
本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體包含結合CD3之抗原結合臂。在一些實施例中，該CD3結合臂結合人類CD3。在一些較佳實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體之該CD3特異性臂係衍生自結合及活化人類初級T細胞及/或食蟹獼猴初級T細胞之CD3特異性抗體。在一些實施例中，該CD3結合臂結合在CD3ε之N端的表位。在一些實施例中，該CD3結合臂結合至CD3ε鏈之殘基22至35 (QDGNEEMGGITQTP (SEQ ID NO: 161))。
該CD3結合臂可以5 x10 -7M或更低（諸如1 x10 -7M或更低、5 x10 -8M或更低、1 x10 -8M或更低、5 x10 -9M或更低、或者1 x10 -9M或更低）之親和力結合至CD3。在一些實施例中，該CD3結合臂以約1 x10 -8M、約2 x10 -8M、約3 x10 -8M、約4 x10 -8M、約5 x10 -8M、約6 x10 -8M、約7 x10 -8M、約8 x10 -8M、約9x10 -8M、或約1x10 -8M之親和力結合至該CD3。在一些實施例中，該CD3結合臂以約1 x10 -8M至約3 x10 -8M、約2 x10 -8M至約4 x10 -8M、約1 x10 -8M至約5 x10 -8M、約2 x10 -8M至約6 x10 -8M、或約3 x10 -8M至約8 x10 -8M之親和力結合至該CD3。在一個實施例中，該CD3結合臂以約2.5 x10 -8M之親和力結合至該CD3。在一個實施例中，該CD3結合臂以約3.1 x10 -8M之親和力結合至該CD3。在一些實施例中，該CD3結合親和力係藉由表面電漿子共振(SPR)檢定來判定。
人類CD3ε係被描述於UniProt P07766 (CD3E_HUMAN)。在目前最佳技術中所描述的一種抗CD3ε抗體係SP34 (Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100)。SP34與靈長動物CD3及人類CD3反應。SP34可購自Pharmingen。在目前最佳技術中所描述的進一步抗CD3抗體係UCHT-1（請參見WO2000041474）。在目前最佳技術中所描述之進一步抗CD3抗體係BC-3（Fred Hutchinson Cancer Research Institute；用於GvHD的I/II期試驗，Anasetti et al., Transplantation 54: 844 (1992)）。SP34與UCHT-1及BC-3的不同之處在於SP-34辨識只存在CD3之ε鏈上的表位（請參見Salmeron et al., (1991) J. Immunol. 147: 3047），而UCHT-1及BC-3辨識由ε鏈及γ鏈兩者形成的表位。與抗體SP34具有相同序列的抗體之序列係在WO2008119565、WO2008119566、WO2008119567、WO2010037836、WO2010037837、及WO2010037838中提及。與抗體SP34的VH具有96%同一性的序列係在US8236308 (WO2007042261)中提及。
在一些實施例中，該CD3結合臂接觸包括CD3ε之六個N端胺基酸的表位。在一些實施例中，該多特異性抗體之該CD3特異性結合臂係衍生自小鼠單株抗體SP34，其係小鼠IgG3/λ同型。在一些實施例中，該CD3結合臂包含抗體SP34之CDR。此等CD3結合臂可以5 x10 -7M或更低（諸如1 x10 -7M或更低、5 x10 -8M或更低、1 x10 -8M或更低、5 x10 -9M或更低、或者1 x10 -9M或更低）之親和力結合至CD3。該CD3特異性結合臂可為小鼠單株抗體SP34之臂的人化版本。人類架構適應(HFA)可用來人化CD3特異性臂係自其衍生之抗CD3抗體。
表3提供本文中所述之一些CD3特異性抗體之實例彙總： 表3. 例示性CD3 特異性抗體及抗原結合片段之重鏈及輕鏈
重鏈 輕鏈
CD3B376 CDR 1: GDSVFNNNAAWS (SEQ ID NO: 4) CDR 1: TGTSSNIGTYKFVS (SEQ ID NO: 1)
CDR 2: RTYYRSKWLYD (SEQ ID NO: 5) CDR 2: EVSKRPS (SEQ ID NO: 2)
CDR 3: GYSSSFDY (SEQ ID NO: 6) CDR 3: VSYAGSGTLL (SEQ ID NO: 3)
VH: QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8) VL: QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 7)
重鏈： QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 26) 輕鏈： QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 27)
CD3B219 CDR 1: TYAMN (SEQ ID NO: 117) CDR 1: RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 122)
CDR 2: RIRSKYNNYATYYAASVKG (SEQ ID NO: 118) CDR 2: GTNKRAP (SEQ ID NO: 123)
CDR 3: HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 119) CDR 3: ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 124)
VH: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 120) VL: QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 125)
重鏈：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 121) 輕鏈： QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 126)
一些CD3特異性抗體或抗原結合片段之特徵可見於例如美國專利第10,562,968號及第10,072,088號、美國公開案US2019/0382481號，其等之各者之內容以全文引用方式併入本文中。
在一些實施例中，該CD3結合臂包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含表3中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該CD3結合臂包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含表3中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該CD3結合臂包含重鏈可變域及輕鏈可變域，該重鏈可變域包含表3中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈可變域包含表3中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該CD3結合臂與包含重鏈及輕鏈之抗體或抗原結合片段競爭與CD3之結合，該重鏈包含表3中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表3中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，該CD3結合臂包含重鏈，該重鏈包含表3中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該CD3結合臂包含輕鏈，該輕鏈包含表3中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該CD3結合臂包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含表3中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表3中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，該CD3結合臂包含表3中所述之抗體中任一者之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該CD3結合臂包含表3中所述之抗體中任一者之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該CD3結合臂包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含表3中所述之抗體中任一者之CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表3中所述之抗體中任一者之CDR1、CDR2、及CDR3。在該等多特異性抗體之一些實施例中，該CD3結合臂包含選自表3之重鏈及輕鏈對。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含殖株CD3B376之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，該GPRC5D結合臂包含殖株CD3B219之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，該CD3結合臂包含：包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 5之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 6之重鏈CDR3。在一些實施例中，該CD3結合臂包含：包含SEQ ID NO: 4之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 5之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 6之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 1之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 2之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 3之輕鏈CDR3。CD3結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該CD3結合臂包含與SEQ ID NO: 8實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該CD3結合臂包含與SEQ ID NO: 8實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 7實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。在一些實施例中，該CD3結合臂包含與SEQ ID NO: 26實質上相同或與其同一之重鏈。在一些實施例中，該CD3結合臂包含與SEQ ID NO: 26實質上相同或與其同一之重鏈及與SEQ ID NO: 27實質上相同或與其同一之輕鏈。
在一些實施例中，該CD3結合臂包含：包含SEQ ID NO: 117之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 118之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 119之重鏈CDR3。在一些實施例中，該CD3結合臂包含：包含SEQ ID NO: 117之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 118之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 119之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 123之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 124之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈CDR3。CD3結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該CD3結合臂包含與SEQ ID NO: 120實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該CD3結合臂包含與SEQ ID NO: 120實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 125實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。在一些實施例中，該CD3結合臂包含與SEQ ID NO: 121實質上相同或與其同一之重鏈。在一些實施例中，該CD3結合臂包含與SEQ ID NO: 121實質上相同或與其同一之重鏈及與SEQ ID NO: 126實質上相同或與其同一之輕鏈。
在一些實施例中，該重鏈及/或該輕鏈之CDR係衍生自已知抗CD3抗體（諸如，例如莫羅單抗-CD3 (muromonab-CD3) (OKT3)、奧昔珠單抗(otelixizumab) (TRX4)、替利珠單抗(teplizumab) (MGA031)、維西珠單抗(visilizumab) (Nuvion)、TR-66或X35-3、VIT3、BMA030 (BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、Fl 11-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-l、及WT-31。
在一些實施例中，該CD3結合臂係IgG，或其衍生物。在一些實施例中，該CD3結合臂係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。在CD3結合臂具有IgG4同型之一些實施例中，該CD3結合臂之Fc區中含有S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段結合初級人類T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段結合初級食蟹獼猴T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段結合初級人類及食蟹獼猴T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段活化初級人類CD3+ T細胞。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段活化初級食蟹獼猴CD4+ T細胞。
在一些實施例中，本文中所述之三特異性抗體可採用所屬技術領域中已描述用於三特異性抗體之任何形式。在一些實施例中，本文中所述之三特異性抗體基於雙特異性抗體格式建構。此可藉由將第三抗原結合臂添加至雙特異性抗體來達到。已經描述雙特異性抗體之不同格式並且近來已由下列文獻所綜述：Chames and Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276。在一些實施例中，該三特異性抗體包含為雙價抗體之雙特異性抗體、交叉抗體(cross-body)、或經由如本揭露中所述之受控Fab臂交換所獲得之雙特異性抗體。
在一些實施例中，該等三特異性抗體包括具有互補CH3域以迫使異二聚化的類IgG分子；重組類IgG雙靶向分子，其中該分子之兩側各包含至少兩種不同抗體之Fab片段或該Fab片段的一部分；IgG融合分子，其中全長IgG抗體係融合至額外Fab片段或Fab片段之部分；Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩定化雙價抗體係融合至重鏈恆定域、Fc區、或其部分；Fab融合分子，其中不同之Fab片段係融合在一起；基於ScFv之抗體及基於雙價抗體之抗體及重鏈抗體（例如，域抗體、奈米抗體），其中不同單鏈Fv分子或不同雙價抗體或不同重鏈抗體（例如，域抗體、奈米抗體）係融合至彼此或融合至另一個蛋白質或載劑分子。
在一些實施例中，具有互補CH3域分子之類IgG分子包括Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech)、鈕扣(Knobs-into-Holes) (Genentech)、CrossMAbs (Roche)及靜電匹配者(electrostatically-matched) (Amgen)、LUZ-Y (Genentech)、股交換工程改造域抗體(Strand Exchange Engineered Domain body, SEEDbody) (EMD Serono)、Biclonic (Merus)、DuoBody (Genmab A/S)、及其他不對稱突變（例如，Zymeworks）。
在一些實施例中，重組類IgG雙靶向分子包括Dual Targeting (DT)-Ig (GSK/Domantis)、二合一抗體(Two-in-one Antibody) (Genentech)、交聯單株抗體(Cross-linked Mabs) (Karmanos Cancer Center)、mAb2 (F-Star)及CovX-body (CovX/Pfizer)。
在一些實施例中，IgG融合分子包括雙可變域(Dual Variable Domain, DVD)-Ig (Abbott)、類IgG雙特異性抗體(IgG-like Bispecific) (InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab (MedImmune/AZ)及BsAb (Zymogenetics)、HERCULES (Biogen Idec)和TvAb (Roche)。
在一些實施例中，Fc融合分子包括ScFv/Fc Fusions (Academic Institution)、SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS)、Dual Affinity Retargeting Technology (Fc-DART) (MacroGenics)及Dual(ScFv).sub.2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China)。
在一些實施例中，Fab融合雙特異性抗體包括F(ab)2 (Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab (Genentech)、Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics)、Bivalent Bispecific (Biotecnol)及Fab-Fv (UCB-Celltech)。基於ScFv之抗體、基於雙價抗體之抗體及域抗體包括但不限於Bispecific T Cell Engager (BiTE) (Micromet)、Tandem Diabody (Tandab) (Affimed)、Dual Affinity Retargeting Technology (DART) (MacroGenics)、Single-chain Diabody (Academic)、TCR-like Antibodies (AIT, ReceptorLogics)、Human Serum Albumin ScFv Fusion (Merrimack)及COMBODY (Epigen Biotech)、雙靶向奈米抗體(Ablynx)、僅雙靶向重鏈域抗體(dual targeting heavy chain only domain antibody)。
本揭露之全長三特異性抗體可使用例如兩個單特異性二價抗體之間的Fab臂交換（或半分子交換）來產生，其藉由於各半分子中之重鏈CH3界面引入取代以利於兩個具有不同特異性之抗體半分子的異二聚體在體外無細胞環境中或者使用共表現形成。該Fab臂交換反應係雙硫鍵異構化反應及CH3域之解離-締合的結果。親本單特異性抗體之鉸鏈區中的重鏈雙硫鍵經還原。親本單特異性抗體中之一者的所得游離半胱胺酸與第二親本單特異性抗體分子之半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵，同時該等親本抗體之CH3域藉由解離-締合而釋出及重新形成。該等Fab臂之CH3域可經工程改造以利於異二聚化而非同二聚化。所得產物係具有兩個Fab臂或半分子之雙特異性抗體，該等Fab臂或半分子各自結合不同表位，例如BCMA（或GPRC5D）上之表位及CD3上之表位。然後可將第三抗原結合臂引入至雙特異性抗體，例如引入至該第一重鏈或第二重鏈之C端，其可結合至第三表位，例如GPRC5D（或BCMA）。
本文中所用之「同二聚化(homodimerization)」係指具有相同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。本文中所用之「同二聚體(homodimer)」係指具有兩個有相同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
本文中所用之「異二聚化(heterodimerization)」係指具有不同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。本文中所用之「異二聚體(heterodimer)」係指具有兩個有不同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
「鈕扣(knob-in-hole)」策略（請參見例如PCT國際公開案第WO 2006/028936號）可用於產生全長三特異性抗體。簡言之，在人類IgG中形成CH3域界面之選定胺基酸可在影響CH3域交互作用的位置處突變，以促進異二聚體形成。將具有小側鏈之胺基酸（孔）引入至結合第一抗原之抗體的重鏈中，並將具有大側鏈之胺基酸（鈕）引入至結合第二抗原之抗體的重鏈中。在共表現這兩個抗體之後，具有「孔」之重鏈與具有「鈕」之重鏈優先交互作用而導致異二聚體形成。形成鈕和孔之例示性CH3取代對係（表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置）：T366Y/F405A、T366W/ F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S及T366W/T366S_L368A_Y407V。
在本文中所述之三特異性抗體或三特異性結合片段之一些實施例中，該等Fc域中之一者包含突變T366S、L368A、及Y407V，且其他Fc域包含突變T366W。在一些實施例中，該第一抗原結合臂（例如，CD3結合臂）之該第一重鏈部分(HC1)之該Fc域包含突變T366S、L368A、及Y407V，且該第二抗原結合臂及/或第三抗原結合臂（例如，該GPRC5D/BCMA結合臂、或BCMA結合臂）之該第二重鏈部分(HC2)之該Fc域包含突變T366W。在一些實施例中，該第二抗原結合臂及/或第三抗原結合臂（例如，該GPRC5D/BCMA結合臂、或BCMA結合臂）之該HC2之該Fc域包含突變T366S、L368A、及Y407V，且該第一抗原結合臂（例如，CD3結合臂）之該HC1之該Fc域包含突變T366W。
可使用其他策略，諸如使用靜電交互作用促進重鏈異二聚化，其係藉由取代一個CH3表面之帶正電荷殘基及第二CH3表面之帶負電荷殘基，如描述於美國專利公開案第US2010/0015133號；美國專利公開案第US2009/0182127號；美國專利公開案第US2010/028637號、或美國專利公開案第US2011/0123532號。在其他策略中，異二聚化可藉由下列取代來促進（表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置）：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如描述於美國專利公開案第US2012/0149876號或美國專利公開案第US2013/0195849號(Zymeworks)。
除了上述方法外，本發明之三特異性抗體可在體外無細胞環境中產生，此係藉由在兩個單特異性同二聚體抗體之CH3區中引入不對稱突變，且在還原條件中（以使雙硫鍵異構化）自兩個親本單特異性同二聚體抗體形成三特異性異二聚體抗體，其係根據描述於國際專利公開案第W02011/131746號中之方法。在該等方法中，第一單特異性二價抗體（例如，抗GPRC5D抗體）及第二單特異性二價抗體（例如，抗CD3抗體）經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性之取代；該等抗體係在足以讓鉸鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該三特異性抗體。培養條件可最佳地被回復為非還原性條件。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol, DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸、及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇、及參(2-羧乙基)膦。舉例而言，可使用在至少20℃之溫度且有至少25 mM之2-MEA存在下或於至少0.5 mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下（例如在7.0之pH下或在7.4之pH下）培養至少90 min。
在一些實施例中，該等三特異性抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物。IgG類別在人類中係分成四種同型(isotype)：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。它們的Fc區之胺基酸序列具有超過95%的同源性，但鉸鏈區的胺基酸組成及結構顯示主要差異。Fc區媒介效應功能，諸如抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗體之Fc區結合至免疫效應細胞（諸如自然殺手細胞及巨噬細胞）表面上之Fc受體(FcγR)，導致吞噬或溶解標靶細胞。在CDC中，抗體藉由在細胞表面引發補體級聯反應(complement cascade)來殺滅標靶細胞。本文中所述之抗體包括具有所述可變域特性與任何IgG同型組合的抗體，包括其中Fc序列已經修飾以致使不同效應功能之經修飾版本。
在許多治療性抗體之應用中，Fc媒介之效應功能並非作用機制之一部分。這些Fc媒介之效應功能可能有害並且由於造成偏離機制毒性(off-mechanism toxicity)而可能造成安全風險。修改效應功能可藉由工程改造Fc區以降低其對FcγR或補體因子之結合來達成。IgG對於活化性（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、及FcγRIIIb）和抑制性(FcγRIIb) FcγRs或補體之第一成分(C1q)的結合取決於位在鉸鏈區和CH2域中之殘基。已將突變引入IgG1、IgG2及IgG4中以降低或靜默Fc功能性。本文中所述之抗體可包括這些修飾。
在一個實施例中，抗體包含具有一或多個下列特性之Fc區：(a)在與親系Fc比較時效應功能有所降低；(b)對於FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIb、及/或FcγRIIIa之親和力降低、(c)對於FcγRI之親和力降低、(d)對於FcγRIIa之親和力降低、(e)對於FcγRIIb之親和力降低、(f)對於FcγRIIIb之親和力降低、或(g)對於FcγRIIIa之親和力降低。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在抗體具有IgG1同型之一些實施例中，該抗體之Fc區中含有L234A、L235A、D265S及/或K409R（多個）取代。在抗體具有IgG4同型之一些實施例中，該抗體之Fc區中含有S228P、L234A、及L235A取代。本文中所述之抗體可包括這些修飾。
在一些實施例中，本文中所述之多特異性抗體之該等Fc域各包含選自L234A、L235A、及D265S之一或多個突變。在一些實施例中，HC1及HC2之該等Fc域各包含突變L234A、L235A、及D265S。
在一些實施例中，本文中所述之多特異性抗體之該重鏈部分之一者之該Fc域進一步包含減少Fc與蛋白質A結合之一或多個突變。在一些實施例中，該重鏈部分之一者之該等Fc域包含突變H435R及/或Y436F。在一些實施例中，該第二抗原結合臂及/或第三抗原結合臂（例如，GPRC5D/BCMA結合臂、或BCMA結合臂）之該HC2之該Fc域包含突變H435R及/或Y436F。
在各種實施例中，該第三抗原結合臂操作性地連接至該第一抗原結合臂或第二抗原結合臂之Fc域。在一些實施例中，連接子係肽連接子並可包括任何天然存在的胺基酸。可被包括至連接子中之例示性胺基酸係Gly、Ser、Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His、及The。連接子應具有足以連接該第三抗原結合臂及該第一抗原結合臂或該第二抗原結合臂之長度，以此方式使彼等相對於彼此形成正確的構形，使得彼等保留所欲活性，諸如與第三抗原（例如，BCMA或GPRC5D）結合。
在本文中所述之三特異性抗體之一些實施例中，該HC1自N至C端包含該第一抗原結合臂之該VH1、CH1域、該Fc域、連接子、及該第三抗原結合臂。
在本文中所述之三特異性抗體之一些實施例中，該HC2自N至C端包含該第二抗原結合臂、該Fc域、連接子、及該第三抗原結合臂。
在各種實施例中，在本文中所述之多特異性抗體中所使用之scFv自N至C端包含VH、連接子、及VL (VH-L-VL)、或該VL、該連接子、及該VH (VL-L-VH)。在一些實施例中，該scFv自N至C端包含該VL、該連接子、及該VH (VL-L-VH)。在一些實施例中，該scFv自N至C端包含該VH、該連接子、及該VL (VH-L-VL)。
連接子可係約5至50個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至40個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至35個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至30個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至25個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約10至20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係約15至20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係6個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係7個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係8個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係9個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係10個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係11個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係12個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係13個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係14個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係15個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係16個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係17個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係18個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係19個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係20個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係21個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係22個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係23個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係24個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係25個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係26個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係27個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係28個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係29個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係30個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係31個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係32個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係33個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係34個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係35個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係36個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係37個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係38個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係39個胺基酸長。在一些實施例中，連接子係40個胺基酸長。可使用之例示性連接子係富含Gly之連接子、含Gly及Ser之連接子、含Gly及Ala之連接子、含Ala及Ser之連接子、及其他可撓性連接子。
其他連接子序列可包括免疫球蛋白鉸鏈區域、衍生自任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈同型之CL或CH1之部分。可使用之例示性連接子係顯示於 表 4。額外連接子係描述於例如國際專利公開案第WO2019/060695號中。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 163之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 127之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 131之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 136之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 152之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 153之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 155之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 156之胺基酸序列。
在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 157之胺基酸序列。 表4. 例示性連接子序列
連接子名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO:
連接子1 GGSEGKSSGSGSESKSTGGS 25
連接子2 GGGSGGGS 127
連接子3 GGGSGGGSGGGS 128
連接子4 GGGSGGGSGGGSGGGS 129
連接子5 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS 130
連接子6 GGGGSGGGGSGGGGS 131
連接子7 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 163
連接子8 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 132
連接子9 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 133
連接子10 IRPRAIGGSKPRVA 134
連接子11 GKGGSGKGGSGKGGS 135
連接子12 GGKGSGGKGSGGKGS 136
連接子13 GGGKSGGGKSGGGKS 137
連接子14 GKGKSGKGKSGKGKS 138
連接子15 GGGKSGGKGSGKGGS 139
連接子16 GKPGSGKPGSGKPGS 140
連接子17 GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS 141
連接子18 GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS 142
連接子19 STAGDTHLGGEDFD 143
連接子20 GEGGSGEGGSGEGGS 144
連接子21 GGEGSGGEGSGGEGS 145
連接子22 GEGESGEGESGEGES 146
連接子23 GGGESGGEGSGEGGS 147
連接子24 GEGESGEGESGEGESGEGES 148
連接子25 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 149
連接子26 PRGASKSGSASQTGSAPGS 150
連接子27 GTAAAGAGAAGGAAAGAAG 151
連接子28 GTSGSSGSGSGGSGSGGGG 152
連接子29 GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS 153
連接子30 GSGS 154
連接子31 APAPAPAPAP 155
連接子32 APAPAPAPAPAPAPAPAPAP 156
連接子33 AEAAAKEAAAKEAAAAKEAAAAKEAAAAKAAA 157
在一個實施例中，BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體之HC1包含與SEQ ID NO: 26實質上相同或與其同一之胺基酸序列。
在一個實施例中，BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體之LC包含與SEQ ID NO: 27實質上相同或與其同一之胺基酸序列。
在一個實施例中，BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體之GPRC5D/BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 28實質上相同或與其同一之胺基酸序列。
在一個實施例中，BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體之CD3/GPRC5D偶聯的HC1包含與SEQ ID NO: 29實質上相同或與其同一之胺基酸序列。
在一個實施例中，BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體之LC包含與SEQ ID NO: 30實質上相同或與其同一之胺基酸序列。
在一個實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 31實質上相同或與其同一之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文提供一種經單離三特異性抗體、或其三特異性結合片段，其包含： a)包含重鏈(HC1)及輕鏈(LC)之CD3結合臂；及 b) GPRC5D/BCMA結合臂， 其中HC1包含與SEQ ID NO: 26實質上相同或與其同一之胺基酸序列，LC包含與SEQ ID NO: 27實質上相同或與其同一之胺基酸序列，且該GPRC5D/BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 28實質上相同或與其同一之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文提供一種經單離三特異性抗體、或其三特異性結合片段，其包含： a)包含重鏈(HC1)及輕鏈(LC)之CD3結合臂；及 b) GPRC5D/BCMA結合臂， 其中HC1包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，LC包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，且該GPRC5D/BCMA結合臂包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文提供一種經單離三特異性抗體、或其三特異性結合片段，其包含： a)包含重鏈(HC1)及輕鏈(LC)之CD3結合臂，其中該HC1進一步包含該GPRC5D結合臂；及 b) BCMA結合臂， 其中HC1包含與SEQ ID NO: 29實質上相同或與其同一之胺基酸序列，LC包含與SEQ ID NO: 30實質上相同或與其同一之胺基酸序列，且該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 31實質上相同或與其同一之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文提供一種經單離三特異性抗體、或其三特異性結合片段，其包含： a)包含重鏈(HC1)及輕鏈(LC)之CD3結合臂，其中該HC1進一步包含該GPRC5D結合臂；及 b) BCMA結合臂， 其中HC1包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，LC包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，且該BCMA結合臂包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
在一個實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體係BGCB463。
在一個實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體係BGCB491。
除了所述BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段外，亦提供能夠編碼所述BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段之多核苷酸序列。亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現本文中所提供之該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段的細胞。亦描述能夠表現所揭示載體之細胞。這些細胞可為哺乳動物細胞（諸如293F細胞、CHO細胞）、昆蟲細胞（諸如Sf7細胞）、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞（諸如 E. coli）。所述抗體亦可藉由融合瘤細胞來生產。所述抗體亦可重組產生。
編碼重組抗原結合蛋白質之多核苷酸亦在本揭露之範疇內。在一些實施例中，所述多核苷酸（及彼等所編碼之肽）包括前導序列(leader sequence)。可採用所屬技術領域中所習知的任何前導序列。前導序列可包括但不限於限制部位(restriction site)或轉譯起始部位(translation start site)。
本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段包括具有單一或多個胺基酸取代、缺失、或添加之變異體，該等變異體保留了所述BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段的生物性質（例如，結合親和力或免疫效應活性）。在本發明之上下文中，下列符號係用來描述突變，除非另有指明；i)取代指定位置中之胺基酸係寫成例如K409R，其代表用精胺酸取代位置409中之離胺酸；且ii)在特定變異體中，使用特定三個或一個字母之代碼（包括代碼Xaa及X）來指示任何胺基酸殘基。因此，用精胺酸取代位置409中之離胺酸被指稱為：K409R，或者用任何胺基酸殘基取代位置409中之離胺酸被指稱為K409X。在位置409中之離胺酸缺失的情況下，其係以K409*指示。具有通常知識者可生產具有單一或多個胺基酸取代、缺失、或添加之變異體。
此等變異體可包括：(a)其中一或多個胺基酸殘基經保守或非保守胺基酸取代之變異體、(b)其中一或多個胺基酸經添加至多肽或自多肽刪除之變異體、(c)其中一或多個胺基酸包括取代基之變異體、及(d)其中多肽係與另一肽或多肽（諸如融合夥伴、蛋白質標籤、或其他化學部分，其可賦予多肽有用性質，諸如例如針對抗體之表位、多組胺酸序列、生物素部分、及類似者）融合之變異體。本文中所述之抗體或抗原結合片段可包括其中來自一個物種之保留性或非保留性位置之胺基酸殘基係經另一物種之對應殘基所取代的變異體。在其他實施例中，非保守性位置之胺基酸殘基係經保守性或非保守性殘基取代。用於獲得此等變異體之技術（包括基因（缺失、突變等）、化學、及酶技術）皆為所屬技術領域中具有通常知識者所習知。
本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD多特異性抗體或抗原結合片段可體現數種抗體同型，諸如IgM、IgD、IgG、IgA、及IgE。在一些實施例中，該抗體同型係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型，較佳為IgG1或IgG4同型。抗體或其抗原結合片段之特異性大部分是由CDR之胺基酸序列及排列來決定。因此，一種同型之CDR可轉移到另一種同型而不會改變抗原特異性。或者，已經建立使融合瘤從生產一種抗體同型轉換到生產另一種（同型轉換）而不會改變抗原特異性之技術。因此，此等抗體同型係在所述抗體或抗原結合片段之範疇內。
本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段用於APRIL結合可具有至少5.9 nM之IC 50值。所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段的IC 50可藉由所屬技術領域中習知之各種方法來判定，諸如基於ELISA的方法或流動式細胞測量術(FACS)。藉由ELISA來測量IC 50的檢定具有盤結合(plate-bound)之BCMA與存在及不存在之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段，並使用各種不同濃度的APRIL。阻斷APRIL與BCMA結合之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段即會「如由ELISA所測，阻斷APRIL」。
亦提供包含本文中所述之多核苷酸的載體。該等載體可為表現載體(expression vector)。含有編碼所關注之多肽的序列之重組表現載體因而被考慮為在本揭露之範疇內。該表現載體可含有一或多個額外序列，諸如但不限於調節序列（例如，啟動子、增強子）、選擇標記、及多腺核苷酸化信號。用於轉形廣泛各種宿主細胞之載體係廣為周知，並且包括但不限於質體、噬菌體質體(phagemid)、黏質體(cosmid)、桿狀病毒、桿粒(bacmid)、人造細菌染色體(BAC)、人造酵母菌染色體(YAC)、以及其他細菌、酵母及病毒載體。
本實施方式之範疇內的重組表現載體包括編碼至少一種與合適調節元件可操作地連接之重組蛋白質的合成性、基因體性、或cDNA衍生性核酸片段。此類調節元件可包括轉錄啟動子、編碼合適mRNA核糖體結合部位之序列、及控制轉錄及轉譯之終止的序列。表現載體（尤其是哺乳動物表現載體）亦可包括一或多種非轉錄元件，諸如複製起源、連接至待表現基因之合適啟動子及增強子、其他5'或3'側翼(flanking)非轉錄序列、5'或3'非轉譯序列（諸如必要的核糖體結合位）、多腺核苷酸化位點、剪切供體及受體位點、或轉錄終止序列。亦可併入賦予在宿主中複製之能力的複製起源。
在用於轉化脊椎動物細胞之表現載體中的轉錄及轉譯控制序列可由病毒來源提供。例示性載體可如以下文獻所述建構：Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)。
在一些實施例中，多特異性抗體編碼序列或抗原結合片段編碼序列係置於強大組成性啟動子的控制之下，諸如下列基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸、及其他。此外，許多病毒啟動子在真核細胞中組成性地發揮作用，並且適合搭配所述實施例使用。此等病毒啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、SV40之早期及晚期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、莫洛尼白血病病毒(Maloney leukemia virus)之長末端重複(LTR)、人類免疫不全病毒(HIV)、艾巴二氏病毒(EBV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、及其他反轉錄病毒、和單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus)之胸苷激酶啟動子。在一個實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或其抗原結合片段編碼序列係置於誘導性啟動子的控制之下，諸如金屬硫蛋白啟動子、四環素誘導性啟動子、多西環素(doxycycline)誘導性啟動子、含有一或多種干擾素刺激反應元件(interferon-stimulated response element, ISRE)之啟動子，諸如蛋白質激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1、及類似者。
本文中所述之載體可含有一或多個內部核糖體進入位點(IRES)。將IRES序列納入融合載體中可有利於增強一些蛋白質之表現。在一些實施例中，載體系統將包括一或多個多腺核苷酸化部位（例如SV40），其可在任一前述核酸序列之上游或下游。載體組分可相鄰地連接，或者以提供用於表現基因產物之最佳間隔的方式來排列（即藉由在ORF之間引入「間隔子(spacer)」核苷酸），或者以其他方式放置。調節元件（諸如IRES模體）亦可經排列以提供用於表現之最佳間隔。
該等載體可包含選擇標記，其為所屬技術領域中所廣為周知。選擇標記包括正向及負向選擇標記，例如抗生素抗藥性基因（例如新黴素抗藥性基因、潮黴素(hygromycin)抗藥性基因、康黴素(kanamycin)抗藥性基因、四環素抗藥性基因、青黴素抗藥性基因、嘌呤黴素(puromycin)抗藥性基因、殺稻瘟菌素(blasticidin)抗藥性基因）、麩胺酸合成酶基因、HSV-TK、用於更昔洛威(ganciclovir)選擇之HSV-TK衍生物、或用於6-甲基嘌呤選擇之細菌嘌呤核苷磷酸化酶基因（Gadi等人，7 Gene Ther. 1738-1743 (2000))。編碼選擇標記或選殖位點之核酸序列可在編碼所關注多肽或選殖位點之核酸序列的上游或下游。
本文中所述之載體可用來以編碼所述抗體或抗原結合片段之基因轉形各種細胞。舉例而言，該等載體可用來產出生產BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段的細胞。因此，另一個態樣的特點在於經載體轉形的宿主細胞，該載體包含編碼結合BCMA、GPRC5D及CD3之抗體或其抗原結合片段（諸如本文中所描述及例示之抗體或抗原結合片段）的核酸序列。
許多用於將外來基因引入細胞之技術皆為所屬技術領域所習知，並且可用來建構重組細胞以依據本文中所描述及例示之各式實施例來實施所述之方法。所使用之技術應提供異源基因序列之穩定轉移至宿主細胞，以使該異源基因序列可由細胞後代所繼承及表現，並且使接受者細胞之必要發育及生理功能不受干擾。可使用之技術包括但不限於染色體轉移（例如，細胞融合、染色體媒介之基因轉移、微細胞媒介之基因轉移）、物理方法（例如，轉染、球形質體(spheroplast)融合、微注射、電穿孔、脂質體載劑）、病毒載體轉移（例如，重組DNA病毒、重組RNA病毒）及類似者（描述於Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)）。磷酸鈣沉澱及聚乙二醇(PEG)誘導之細菌原生質體與哺乳動物細胞融合亦可用來轉形細胞。
適用於表現本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段的細胞較佳為真核細胞，更佳為源自植物、囓齒動物、或人類之細胞，例如但不限於NSO、CHO、CHOK1、perC.6、Tk-ts13、BHK、HEK293細胞、COS-7、T98G、CV-1/EBNA、L細胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髓瘤細胞、及BHK細胞系、及其他者。此外，抗體之表現可使用融合瘤細胞來達成。用於生產融合瘤之方法在所屬技術領域中已充分建立。
經本文中所述之表現載體轉形的細胞可針對本文中所述之抗體或抗原結合片段的重組表現來選擇或篩選。重組陽性細胞經擴增並針對展現所欲表型之次殖株(subclone)進行篩選，所欲表型諸如高表現水平、增強之生長性質、或產出例如由於蛋白質修飾或經修改之轉譯後修飾而具有所欲生化特徵之蛋白質的能力。這些表型可能是因為給定次殖株之固有性質或因為突變。突變可透過使用化學品、UV波長光、放射線、病毒、插入型致突變原、抑制DNA不匹配修復、或此等方法之組合來實現。 使用多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段之治療組成物及治療方法
以上討論之雙特異性抗體（例如以上討論之BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體）可用於治療中。特定而言，該等雙特異性抗體可用於治療癌症。本文中亦提供用於治療哺乳動物中之過度增生性病症的治療組成物，其包含治療有效量之本文中所述之多特異性抗體或多特異性抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體、或其BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗原結合片段。在一個實施例中，該醫藥組成物係用於治療GPRC5D及/或BCMA表現性癌症，包括（但不限於）下列者：GPRC5D及/或BCMA表現性B細胞癌，諸如多發性骨髓瘤(MM)，包括燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)；及其他表現有GPRC5D及/或BCMA但尚未被判定之癌症。在一些實施例中，該GPRC5D及/或BCMA表現性癌症係淋巴瘤之復發性或難治性形式，諸如多發性骨髓瘤之復發性或難治性形式。可用來治療癌症（諸如血液性癌症，包括以上討論之特定癌症）之具體三特異性抗體包括抗體BGCB463及BGCB491。
在一些實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或其結合片段係用於治療R/R多發性骨髓瘤。
在一些實施例中，接受該BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體或其結合片段之對象已接受先前治療。舉例而言，該對象可能已接受一或多種治療劑，諸如蛋白酶體抑制劑(PI)（例如蛋白酶體抑制劑（馬瑞佐米(marizomib)（鹽孢菌醯胺A (salinosporamide A)）、卡非佐米(Carfilzomib)、伊沙佐米(Ixazomib)）、免疫調節藥物(IMiD)、雙特異性劑、CAR-T療法、及/或抗CD38抗體，用於治療多發性骨髓瘤。
本文中所提供之醫藥組成物包含：a)有效量之本發明之多特異性抗體或抗體片段、及b)醫藥上可接受之載劑，其可為惰性或生理活性。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體、或其BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗原結合片段。本文中所用之用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」包括生理相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌和抗真菌劑、及類似者。合適載劑、稀釋劑及/或賦形劑之實例包括下列之一或多者：水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似物，以及其任何組合。在許多情況中，較佳的是將等張劑（諸如糖、多元醇、或氯化鈉）納入該組成物中。特定而言，合適載劑之相關實例包括：(1)達爾伯克氏(Dulbecco)磷酸鹽緩衝鹽水，pH約7.4，含有或未含有約1 mg/mL至25 mg/mL人類血清白蛋白、(2) 0.9%鹽水（0.9% w/v氯化鈉(NaCl)）、及(3) 5% (w/v)葡萄糖；並且亦可含有抗氧化劑（諸如色胺(tryptamine)）及穩定劑（諸如Tween 20 ®）。
本文中之組成物亦可包含視需要用於治療特定病症之額外治療劑。較佳的是，多特異性抗體或抗體片段與補充性活性化合物將具有不會互相不利影響之互補活性。在一些實施例中，該進一步治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。在一些實施例中，該進一步治療劑係化學治療劑、抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞強化子、或其任何組合。在一些實施例中，該進一步治療劑係抗CD38劑，諸如抗CD38抗體（例如，達拉單抗(daratumuab)）。在一些實施例中，該進一步治療劑係免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)，諸如來那度胺(lenalidomide)及泊馬度胺(pomalidomide)。在一些實施例中，該進一步治療劑係免疫檢查點抑制劑，諸如抗PD-1及具有Ig及ITIM域之抗T細胞免疫受體(TIGIT)。在一些實施例中，該進一步治療劑係免疫共刺激劑，諸如靶向CD137之藥劑（例如，CD137共刺激雙特異性抗體）。在一些實施例中，該進一步治療劑係T細胞增強子，諸如IL-2添加物。
本發明之組成物可呈各種形式。這些包括例如液體、半固體、及固體劑量形式，但較佳形式取決於預期投予模式及治療應用。典型較佳組成物係呈可注射或可輸注溶液之形式。較佳投予模式係非經腸（例如，靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下）。在較佳實施例中，本發明之組成物係以推注(bolus)靜脈內投予或藉由在一段時間內連續輸注投予。在另一較佳實施例中，彼等係藉由肌肉內、皮下、關節內、滑膜內、腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內、或病灶周圍途徑來注射，以產生局部以及全身性治療效果。
用於非經腸投予之無菌組成物可藉由將本發明之抗體、抗體片段或抗體共軛物(conjugate)以所需量納入適當溶劑中，接著藉由微過濾進行滅菌來製備。在溶劑或媒劑方面，可使用水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似者，以及其組合。在許多情況中，較佳的是在組成物中包括等滲劑諸如糖、多元醇、或氯化鈉。這些組成物亦可含有佐劑，尤其是潤濕、等張、乳化、分散及穩定劑。用於非經腸投予之無菌組成物亦可製備為無菌固體組成物之形式，其可在使用時溶於無菌水或任何其他注射用無菌介質中。
多特異性抗體或抗體片段亦可經口投予。在經口投予之固體組成物方面，可使用錠劑、丸劑、粉劑（明膠膠囊、囊劑(sachet)）、或粒劑。在這些組成物中，依據本發明之活性成分係於氬氣流下與一或多種惰性稀釋劑（諸如澱粉、纖維素、蔗糖、乳糖、或二氧化矽）混合。這些組成物亦可包含非為稀釋劑之物質，例如一或多種潤滑劑（諸如硬脂酸鎂或滑石）、著色劑、塗層（糖衣錠）或糖釉(glaze)。
在經口投予之液體組成物方面，可使用含有惰性稀釋劑（諸如水、乙醇、甘油、植物油或石蠟油）之醫藥上可接受之溶液、懸浮液、乳液、糖漿及酏劑。這些組成物可包含非為稀釋劑之物質，例如潤濕、增甜、增稠、調味或穩定用產品。
劑量取決於所欲之效果、治療持續期間及所使用之投予途徑；成人口服劑量通常介於每天5 mg到1000 mg，並且單位劑量含有範圍在1 mg到250 mg的活性物質。一般而言，醫師將會視待治療對象之年齡、體重及任何其他特定因素來決定適當劑量。
本文中亦提供用於殺滅GPRC5D及/或BCMA +之方法，其藉由向有需要之患者投予結合該GPRC5D及/或BCMA且能夠徵集T細胞以殺滅該GPRC5D及/或BCMA +細胞（亦即，T細胞重新導向(T cell redirection)）之多特異性抗體。任何本發明之多特異性抗體或抗體片段皆可使用在治療上。例如，在一個實施例中，該BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體可使用在治療上以治療對象中的癌症。
在較佳實施例中，本發明之多特異性抗體或抗體片段係用於治療哺乳動物中之過度增生性病症。在更佳實施例中，以上所揭露並且含有本發明之多特異性抗體或抗體片段的醫藥組成物之一者係用於治療哺乳動物中之過度增生性病症。在一實施例中，該病症係癌症。特定而言，該癌症係GPRC5D及/或BCMA表現性癌症，包括（但不限於）下列者：GPRC5D及/或BCMA表現性B細胞癌，諸如多發性骨髓瘤(MM)，包括燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)；及其他表現有GPRC5D及/或BCMA但尚未被判定之癌症。在一些實施例中，該GPRC5D及/或BCMA表現性癌症係淋巴瘤之復發性或難治性形式，諸如多發性骨髓瘤之復發性或難治性形式。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體、或其BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗原結合片段。
因此，本發明之醫藥組成物可用於治療或預防各種癌症或病症，包括（但不限於）下列者：GPRC5D及/或BCMA表現性癌症，包括（但不限於）下列者：GPRC5D及/或BCMA表現性B/漿細胞癌，諸如急性多發性骨髓瘤(MM)或癌前骨髓瘤(premalignant myeloma)（諸如MGUS（意義不明單株免疫球蛋白症(Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance)）及SMM（燜燃型多發性骨髓瘤(Smoldering Multiple myeloma)））及漿細胞瘤；及其他表現有GPRC5D及/或BCMA但尚未被判定之癌症、或其他漿細胞病症，諸如類澱粉變性及狼瘡。在一些實施例中，該GPRC5D及/或BCMA表現性癌症係淋巴瘤之復發性或難治性形式，諸如多發性骨髓瘤之復發性或難治性形式。
同樣地，本文中進一步提供一種用於抑制所選細胞群體生長之方法，其包含於周邊血液單核細胞(PBMC)存在下，使GPRC5D及/或BCMA表現性目標細胞、或含有此等目標細胞之組織與有效量之本發明之多特異性抗體或抗體片段（單獨或組合其他細胞毒性劑或治療劑）接觸。阻斷配體（APIL、BAFF、及其他者）與BCMA及GPRC5D之結合的BCMAxGPRC5DxCD3抗體可阻斷BCMA及GPRC5D媒介之信號傳導，並導致目標細胞之抑制或細胞死亡。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體、或其BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗原結合片段。
在一些實施例中，本文所描述之方法涉及投予多特異性抗體或包含該多特異性抗體之醫藥組成物，進一步涉及投予另一治療劑。合適的其他治療劑包括但不限於抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞增強子（例如，IL-2添加物）、托西利單抗(tocilizumab)、或其任何組合。在一些實施例中，該進一步治療劑係抗CD38劑，諸如抗CD38抗體（例如，達拉單抗(daratumuab)）。在一些實施例中，該進一步治療劑係免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)，諸如來那度胺(lenalidomide)及泊馬度胺(pomalidomide)。在一些實施例中，該進一步治療劑係免疫檢查點抑制劑，諸如抗PD-1及具有Ig及ITIM域之抗-T細胞免疫受體(TIGIT)。在一些實施例中，該進一步治療劑係免疫共刺激劑，諸如靶向CD137之藥劑（例如，CD137共刺激雙特異性抗體）。在T細胞重新導向抗體（如本文中所述之BCMAx GPRC5D x CD3三特異性抗體）存在的情況下，使用具有條件性促效作用之低親和力CD137結合物可增強抗腫瘤活性並可能改善T細胞持久性。在一些實施例中，該進一步治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。在一些實施例中，該進一步治療劑係化學治療劑。用於抑制所選之細胞群生長的方法可在體外、體內、或離體( ex vivo)實施。
體外用途之實例包括在將自體骨髓移植到同一病患之前先對其處理以殺滅染病或惡性細胞；及防止移移植物抗宿主疾病(GVHD)；處理細胞培養，以殺滅除了未表現目標抗原之所欲變異體以外的所有細胞；或殺滅表現非所欲抗原之變異體。非臨床體外用途之條件可由所屬技術領域中具有通常知識者所輕易決定。
臨床離體使用之實例係於自體骨髓移植治療癌症之前從骨髓移除腫瘤細胞。治療可實施如下。自病患或其他個體獲取骨髓，接著將骨髓在加入本發明之細胞毒性劑的含血清培養基中進行培養。濃度範圍為約10 µM至1 µM，在約37℃下達30分鐘至約48小時。培養的濃度及時間（亦即劑量）之確切條件可由所屬技術領域中具有通常知識者輕易決定。在培養之後，將骨髓細胞用含血清之培養基洗滌，然後依據習知方法藉由靜脈輸液送回病患體內。在病患於收獲骨髓到重新輸回經處理細胞之間的時間內接受其他治療如根除性化學療法(ablative chemotherapy)或全身放射線照射的情況下，該等經處理之骨髓細胞係使用標準醫療設備冷凍儲存於液態氮中。
在臨床體內用途中，向有需要之對象投予治療有效量之多特異性抗體或抗原結合片段。舉例而言，該等BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段可用於治療有需要之對象中的GPRC5D及/或BCMA表現性癌症。在一些實施例中，該GPRC5D及/或BCMA表現性癌症係B細胞癌，諸如多發性骨髓瘤(MM)，包括燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)。在一些實施例中，該GPRC5D及/或BCMA表現性癌症係淋巴瘤之復發性或難治性形式，諸如多發性骨髓瘤之復發性或難治性形式。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體、或其BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗原結合片段。在一些實施例中，該對象為哺乳動物，較佳為人類。在一些實施例中，該多特異性抗體或抗原結合片段將以已測試過無菌性之溶液形式投予。
以上治療方法及用途中之劑量方案係經調整以提供最佳之所欲反應（例如，治療回應）。舉例而言，可投予單次推注、可在一段時間內投予數次分開之劑量、或者可依治療情況之急迫性所示來按比例提高或降低劑量。非經腸組成物可配製為劑量單元形式以增進投予便利性及劑量一致性。
多特異性抗體及片段之有效劑量及劑量方案取決於待治療之疾病及病況並且可由所屬領域中具有通常知識者決定。本發明化合物之治療有效量的例示性、非限定範圍係約0.001至10 mg/kg，諸如約0.001至5 mg/kg，例如約0.001至2 mg/kg，諸如約0.001至1 mg/kg，例如約0.001、約0.01、約0.1、約1或約10 mg/kg。
所屬技術領域中具有通常知識之醫師、藥劑師、或獸醫師可輕易決定並處方所需之醫藥組成物的有效量。舉例而言，醫師或獸醫師可從低於欲達所欲治療效果所需的該醫藥組成物中所採用之多特異性抗體或片段的劑量水平開始，然後逐漸提高劑量直到達到所欲效果。一般而言，本發明之多特異性抗體之合適每日劑量將為該化合物有效產生治療效果之最低劑量的量。投予可係例如非經腸，諸如靜脈內、肌肉內、瘤內（例如，骨髓）、或皮下。在一個實施例中，多特異性抗體或片段可依mg/m 2計算之每周劑量來輸液投予。此等劑量可基於例如以上提供之mg/kg劑量，並且依據下式：劑量(mg/kg)x體重（例如，50至100 kg）提供。此投予可重複例如1至8次，諸如3至5次。該投予可藉由在2至24小時（諸如2至12小時）期間內連續輸注來執行。在一個實施例中，多特異性抗體或片段可藉由在長期間（諸如超過24小時）內緩慢連續輸注來投予，以降低毒性副作用。
在一個實施例中，多特異性抗體或片段可以每周劑量投予，該每周劑量經計算為至多給予八次之固定劑量，諸如當每周給予一次時給予四至六次。此方案可視需要例如在六個月或十二個月之後重複一或多次。此等固定劑量可基於例如以上所提供之mg/kg劑量，並且體重估計為50至100 kg。劑量可藉由測量本發明之多特異性抗體經投予後在血液中之量來判定或調整，其係例如藉由採集生物樣本並使用靶向本發明之多特異性抗體之GPRC5D及/或BCMA抗原結合臂的抗遺傳型抗體(anti-idiotypic antibody)來測量。
在一個實施例中，多特異性抗體或片段可藉由維持療法來投予，諸如例如一周一次進行六個月或更長的期間。
多特異性抗體或片段亦可預防性投予以降低發展癌症之風險、延緩癌症進展事件之開始發生、及/或當癌症處於緩解時降低復發之風險。
如本文中所述之多特異性抗體及其片段亦可以組合療法來投予，即與所欲治療之疾病或病況的其他相關治療劑組合。因此，在一個實施例中，含有抗體之藥物係用於與一或多種進一步治療劑組合，諸如化學治療劑、抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞強化子（例如，IL-2添加物）、或其任何組合。在一些實施例中，該進一步治療劑係抗CD38劑，諸如抗CD38抗體（例如，達拉單抗(daratumuab)）。在一些實施例中，該進一步治療劑係免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)，諸如來那度胺(lenalidomide)及泊馬度胺(pomalidomide)。在一些實施例中，該進一步治療劑係免疫檢查點抑制劑，諸如抗PD-1及具有Ig及ITIM域之抗-T細胞免疫受體(TIGIT)。在一些實施例中，該進一步治療劑係免疫共刺激劑，諸如靶向CD137之藥劑（例如，CD137共刺激雙特異性抗體）。在一些實施例中，該其他治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。此類組合式投予可為同時、分開或依序（以任何順序）進行。針對同時投予，該等劑可作為一個組成物或作為分開之組成物（視情況而定）投予。
在一個實施例中，提供一種用於治療涉及對象中表現GPRC5D及/或BCMA之細胞的病症之方法，該方法包含向有需要之對象投予治療有效量之多特異性抗體或片段（諸如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體），及進行放射性療法。在一個實施例中，提供一種用於治療或預防癌症之方法，該方法包含向有需要之對象投予治療有效量之多特異性抗體或片段（諸如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD抗體），及進行放射性療法。放射性療法可包含放射線照射或者提供給病患相關聯之放射性藥品投予。放射線源可位於受治療病患外部或內部（放射線治療例如可為體外放射治療(external beam radiation therapy, EBRT)或近程放射治療(brachytherapy, BT)之形式）。可用於實施此等方法之放射性元素包括例如鐳、銫-137、銥-192、鋂-241、金-198、鈷-57、銅-67、鎝-99、碘-123、碘-131、錒-225、及銦-111。 套組
本文中亦提供者包括套組，例如包含所述多特異性抗體或其抗原結合片段、及該抗體或片段用於殺滅特定細胞類型之使用說明。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體、或其BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗原結合片段。該等說明可包括對於在體外、體內或離體使用該多特異性抗體或其抗原結合片段之指令。
典型而言，套組將具有內含多特異性抗體或其抗原結合片段之隔間。該多特異性抗體或其抗原結合片段可呈凍乾形式、液體形式、或其他可經修改以被包括在套組中之形式。套組亦可含有實施該套組中之說明上描述之方法所需的額外元件，諸如用於重組凍乾粉劑之滅菌溶液、在向病患投予前用於與該多特異性抗體或其抗原結合片段組合之額外劑、及協助向病患投予該多特異性抗體或其抗原結合片段之工具。 診斷用途
本文中所述之多特異性抗體及片段亦可用於診斷目的。因此，亦提供包含如本文中所界定之多特異性抗體或片段的診斷組成物、及其用途。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體、或其BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種用於診斷癌症之套組，其包含一容器，該容器包含BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體、及一或多種用於偵測該抗體對於GPRC5D及/或BCMA之結合的試劑。試劑可包括例如螢光標籤、酶標籤、或其他可偵測標籤。該等試劑亦可包括用於酶反應之二級或三級抗體或試劑，其中該等酶反應產生可視覺化之產物。舉例而言，本文中所述之多特異性抗體、或其抗原結合片段可用放射性標記、螢光標記、表位標籤、生物素、發色基(chromophore)標記、ECL標記、酶、釕、 111In-DOTA、 111In-二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、或多-組胺酸或所屬領域中所習知之類似此等標記來加以標示。 BCMA 特異性抗體
本文中描述對於BCMA具有特異性之單離抗體及抗原結合片段。在一些實施例中，該等BCMA特異性抗體及抗原結合片段結合人類BCMA。BCMA特異性抗體分子之一般結構可包含抗原結合域，其包括重鏈及輕鏈；及Fc域，其具有各式功能，包括補體固定(complement fixation)及結合抗體受體。
在一些實施例中提供BCMA特異性抗體、或其抗原結合片段，其包含重鏈，該重鏈包含表1中所述之抗體中任一者（例如，BCMB519）之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中提供一種BCMA特異性抗體、或其抗原結合片段，其包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含表1中所述之抗體中任一者（例如，BCMB519）之CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表1中所述之抗體中任一者（例如，BCMB519）之CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，該BCMA特異性抗體、或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO: 20之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 21之重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 22之重鏈CDR3。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含：包含SEQ ID NO: 20之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 21之重鏈CDR2、包含SEQ ID NO: 22之重鏈CDR3、包含SEQ ID NO: 17之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 18之輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO: 19之輕鏈CDR3。該BCMA結合臂可包含人類架構序列。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 24實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該BCMA結合臂包含與SEQ ID NO: 24實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO: 23實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段落中所討論之抗體的重鏈可變域及輕鏈可變域適合於納入多特異性（例如，雙特異性或三特異性）建構體中，該建構體中有一個臂係抗BCMA臂。本文中提供包含在本段中所討論之該BCMA特異性抗體或其抗原結合片段之例示性三特異性建構體。
在一些實施例中，該等BCMA特異性抗體及抗原結合片段結合人類BCMA及食蟹獼猴(cynomolgus monkey) BCMA。在一些實施例中，該等BCMA特異性抗體及抗原結合片段結合人類BCMA但不結合至食蟹獼猴BCMA。在一些實施例中，該等BCMA特異性抗體及抗原結合片段結合至一表位，該表位包括一或多個來自BCMA胞外域(ECD)的殘基。在一些實施例中，該BCMA特異性抗體或抗原結合片段結合至BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 162))。此BCMA特異性抗體或抗原結合片段可以5x10 -7M或更低（諸如1x10 -7M或更低、5x10 -8M或更低、1x10 -8M或更低、5x10 -9M或更低、1x10 -9M或更低、或者5x10 -10M或更低）之親和力結合至BCMA。在一個實施例中，該BCMA特異性抗體或抗原結合片段以約1 x10 -10M至1 x10 -9M之親和力結合至BCMA。在一個實施例中，該BCMA結合臂以約1 x10 -10M、約2 x10 -10M、約3 x10 -10M、約4 x10 -10M、約5 x10 -10M、約6 x10 -10M、約7 x10 -10M、約8 x10 -10M、約9x10 -10M、或約1x10 -9M之親和力結合至該BCMA。在一個實施例中，該BCMA特異性抗體或抗原結合片段以藉由表面電漿子共振(SPR)檢定所判定之約8.4 x10 -10M之親和力結合至BCMA。在一個實施例中，該BCMA特異性抗體或抗原結合片段以藉由表面電漿子共振(SPR)檢定所判定之約2.1 x10 -10M之親和力結合至BCMA。
IgG類別在人類中係分成四種同型(isotype)：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。它們的Fc區之胺基酸序列具有超過95%的同源性，但鉸鏈區的胺基酸組成及結構顯示主要差異。Fc區媒介效應功能，諸如抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗體之Fc區結合至免疫效應細胞（諸如自然殺手細胞及巨噬細胞）表面上之Fc受體(FcγR)，導致吞噬或溶解標靶細胞。在CDC中，抗體藉由在細胞表面引發補體級聯反應(complement cascade)來殺滅標靶細胞。本文中所述之抗體包括具有所述可變域特性與任何IgG同型組合的抗體，包括其中Fc序列已經修飾以致使不同效應功能之經修飾版本。
在許多治療性抗體之應用中，Fc媒介之效應功能並非作用機制之一部分。這些Fc媒介之效應功能可能有害並且由於造成偏離機制毒性(off-mechanism toxicity)而可能造成安全風險。修改效應功能可藉由工程改造Fc區以降低其對FcγR或補體因子之結合來達成。IgG對於活化性（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、及FcγRIIIb）和抑制性(FcγRIIb) FcγRs或補體之第一成分(C1q)的結合取決於位在鉸鏈區和CH2域中之殘基。已將突變引入IgG1、IgG2及IgG4中以降低或靜默Fc功能性。本文中所述之抗體可包括這些修飾。
在一個實施例中，抗體包含具有一或多個下列特性之Fc區：(a)在與親系Fc比較時效應功能有所降低；(b)對於FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIb、及/或FcγRIIIa之親和力降低、(c)對於FcγRI之親和力降低、(d)對於FcγRIIa之親和力降低、(e)對於FcγRIIb之親和力降低、(f)對於FcγRIIIb之親和力降低、或(g)對於FcγRIIIa之親和力降低。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在抗體具有IgG1同型之一些實施例中，該抗體之Fc區中含有L234A、L235A、D265S、及/或K409R取代。在抗體具有IgG4同型之一些實施例中，該抗體之Fc區中含有K409R、S228P、L234A、及L235A取代。本文中所述之抗體可包括這些修飾。
在一些實施例中，如由ELISA所測，所述抗體可能能夠以低奈米莫耳之IC 50抑制APRIL結合。在一些實施例中，如由ELISA所測，所述抗體可能能夠以低奈米莫耳之IC 50抑制BAFF結合。
在一些實施例中，所述抗體結合至BCMA陽性多發性骨髓瘤細胞系。
除了所述之BCMA特異性抗體及抗原結合片段外，亦提供能夠編碼所述抗體及抗原結合片段之多核苷酸序列。亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現本文中所提供之BCMA特異性抗體或抗原結合片段的細胞。亦描述能夠表現所揭示載體之細胞。此等細胞可為哺乳動物細胞（諸如293細胞、293F細胞、CHO細胞）、昆蟲細胞（諸如Sf7細胞）、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞（諸如大腸桿菌）。所述抗體亦可藉由融合瘤細胞來生產。
所述BCMA特異性抗體或抗原結合片段包括所有同型（IgA、IgD、IgE、IgG及IgM）、及四鏈免疫球蛋白結構之合成性多聚體。所述抗體或抗原結合片段亦包括通常在母雞或火雞血清及母雞或火雞蛋黃中所發現之IgY同型。
BCMA特異性抗體及抗原結合片段可藉由重組手段而衍生自任何物種。舉例而言，該等抗體或抗原結合片段可係小鼠、大鼠、山羊、馬、豬、牛、雞、兔、駱駝、驢、駱馬、人、或其等之嵌合版本。針對投予至人類之用途，非人類衍生性抗體或抗原結合片段可經基因或結構改造以在投予至人類病患時較不具抗原性。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係嵌合者。本文中所用之用語「嵌合(chimeric)」係指抗體、或其抗原結合片段具有衍生自非人類哺乳動物、囓齒動物、或爬蟲動物之抗體胺基酸序列的至少一個可變域之至少一些部分，並且該抗體、或其抗原結合片段之剩餘部分係衍生自人類。
在一些實施例中，該等抗體為人化(humanized)抗體。人化抗體可為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列）。大體上，人化抗體為人類免疫球蛋白（接受者抗體(recipient antibody)），其中來自該接受者之互補決定區(CDR)的殘基係經來自具有所欲特異性、親和力、及能力之非人類物種（供體抗體）諸如小鼠、大鼠或兔之CDR的殘基置換。一般而言，該人化抗體將包含實質上所有至少一個及典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應非人類免疫球蛋白之CDR區，並且所有或實質上所有架構區係人類免疫球蛋白序列之架構區。人化抗體可包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型為人類免疫球蛋白之恆定區。
本文中所述之抗體或抗原結合片段可以各種形式出現，但將包括表1中所示之抗體CDR中之一或多者（例如，BCMB519）。
本文中描述結合至BCMA之重組抗體及抗原結合片段。在一些實施例中，該等BCMA特異性抗體或抗原結合片段係人類IgG、或其衍生物。雖然本文中所例示之BCMA特異性抗體或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段，所例示之抗體或抗原結合片段可經嵌合化。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在抗體係IgG1同型之一些實施例中，該抗體包含IgG1 Fc區(SEQ ID NO: 158)。 SEQ ID NO: 158 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在抗體係IgG1同型之一些實施例中，該抗體之Fc區中包含L234A、L235A、及D265S取代（劃底線）(SEQ ID NO: 159)。 SEQ ID NO: 159 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV SVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在抗體係IgG4同型之一些實施例中，該抗體之Fc區中含有S228P、L234A、及L235A取代（劃底線）(SEQ ID NO: 160)。 SEQ ID NO: 160 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
以上段落中所討論之由CDR及/或可變域序列所定義的BCMA特異性抗體可包括這些IgG Fc區。
亦揭示編碼該等結合至BCMA之抗體或抗原結合片段的單離合成性多核苷酸。該等能夠編碼本文中所提供之可變域區段的單離多核苷酸可被包括於相同（或不同）之載體上以生產抗體或抗原結合片段。
編碼重組抗原結合蛋白質之多核苷酸亦在本揭露之範疇內。在一些實施例中，所述多核苷酸（及彼等所編碼之肽）包括前導序列(leader sequence)。可採用所屬技術領域中所習知的任何前導序列。前導序列可包括但不限於限制部位(restriction site)或轉譯起始部位(translation start site)。
本文中所述之BCMA特異性抗體或抗原結合片段包括具有單一或多個胺基酸取代、缺失、或添加之變異體，該等變異體保留了所述PSMA特異性抗體或抗原結合片段的生物性質（例如，結合親和力或免疫效應活性）。在本發明之上下文中，下列符號係用來描述突變，除非另有指明；i)取代指定位置中之胺基酸係寫成例如K409R，其代表用精胺酸取代位置409中之離胺酸；且ii)在特定變異體中，使用特定三個或一個字母之代碼（包括代碼Xaa及X）來指示任何胺基酸殘基。因此，用精胺酸取代位置409中之離胺酸被指稱為：K409R，或者用任何胺基酸殘基取代位置409中之離胺酸被指稱為K409X。在位置409中之離胺酸缺失的情況下，其係以K409*指示。具有通常知識者可生產具有單一或多個胺基酸取代、缺失、或添加之變異體。
此等變異體可包括：(a)其中一或多個胺基酸殘基經保守或非保守胺基酸取代之變異體、(b)其中一或多個胺基酸經添加至多肽或自多肽刪除之變異體、(c)其中一或多個胺基酸包括取代基之變異體、及(d)其中多肽係與另一肽或多肽（諸如融合夥伴、蛋白質標籤、或其他化學部分，其可賦予多肽有用性質，諸如例如針對抗體之表位、多組胺酸序列、生物素部分、及類似者）融合之變異體。本文中所述之抗體或抗原結合片段可包括其中來自一個物種之保留性或非保留性位置之胺基酸殘基係經另一物種之對應殘基所取代的變異體。在其他實施例中，非保守性位置之胺基酸殘基係經保守性或非保守性殘基取代。用於獲得此等變異體之技術（包括基因（缺失、突變等）、化學、及酶技術）皆為所屬技術領域中具有通常知識者所習知。
本文中所述之BCMA特異性抗體或抗原結合片段可體現數種抗體同型，諸如IgM、IgD、IgG、IgA、及IgE。在一些實施例中，該抗體同型係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型，較佳為IgG1或IgG4同型。抗體或其抗原結合片段之特異性大部分是由CDR之胺基酸序列及排列來決定。因此，一種同型之CDR可轉移到另一種同型而不會改變抗原特異性。或者，已經建立使融合瘤從生產一種抗體同型轉換到生產另一種（同型轉換）而不會改變抗原特異性之技術。因此，此等抗體同型係在所述抗體或抗原結合片段之範疇內。
本文中所述之BCMA特異性抗體或抗原結合片段用於APRIL結合可具有低奈米莫耳的IC 50值。所述之BCMA特異性抗體或抗原結合片段的IC 50可藉由所屬技術領域中習知之各種方法來判定，諸如基於ELISA的方法或流動式細胞測量術(FACS)。藉由ELISA來測量IC 50的檢定具有盤結合(plate-bound)之BCMA與存在及不存在之BCMA特異性抗體，並使用各種不同濃度的APRIL。阻斷APRIL與BCMA結合之BCMA抗體即會「如由ELISA所測，阻斷APRIL」。
亦提供包含本文中所述之多核苷酸的載體。該等載體可為表現載體(expression vector)。含有編碼所關注之多肽的序列之重組表現載體因而被考慮為在本揭露之範疇內。該表現載體可含有一或多個額外序列，諸如但不限於調節序列（例如，啟動子、增強子）、選擇標記、及多腺核苷酸化信號。用於轉形廣泛各種宿主細胞之載體係廣為周知，並且包括但不限於質體、噬菌體質體(phagemid)、黏質體(cosmid)、桿狀病毒、桿粒(bacmid)、人造細菌染色體(BAC)、人造酵母菌染色體(YAC)、以及其他細菌、酵母及病毒載體。
本實施方式之範疇內的重組表現載體包括編碼至少一種與合適調節元件可操作地連接之重組蛋白質的合成性、基因體性、或cDNA衍生性核酸片段。此類調節元件可包括轉錄啟動子、編碼合適mRNA核糖體結合部位之序列、及控制轉錄及轉譯之終止的序列。表現載體（尤其是哺乳動物表現載體）亦可包括一或多種非轉錄元件，諸如複製起源、連接至待表現基因之合適啟動子及增強子、其他5'或3'側翼(flanking)非轉錄序列、5'或3'非轉譯序列（諸如必要的核糖體結合位）、多腺核苷酸化位點、剪切供體及受體位點、或轉錄終止序列。亦可併入賦予在宿主中複製之能力的複製起源。
在用於轉化脊椎動物細胞之表現載體中的轉錄及轉譯控制序列可由病毒來源提供。例示性載體可如以下文獻所述建構：Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)。
在一些實施例中，抗體編碼序列或抗原結合片段編碼序列係置於強大組成性啟動子的控制之下，諸如下列基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸、及其他。此外，許多病毒啟動子在真核細胞中組成性地發揮作用，並且適合搭配所述實施例使用。此等病毒啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、SV40之早期及晚期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、莫洛尼白血病病毒(Maloney leukemia virus)之長末端重複(LTR)、人類免疫不全病毒(HIV)、艾巴二氏病毒(EBV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、及其他反轉錄病毒、和單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus)之胸苷激酶啟動子。在一個實施例中，該BCMA特異性抗體或其抗原結合片段編碼序列係置於誘導性啟動子的控制之下，諸如金屬硫蛋白啟動子、四環素誘導性啟動子、多西環素(doxycycline)誘導性啟動子、含有一或多種干擾素刺激回應元件(ISRE)之啟動子，諸如蛋白質激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1、及類似者。
本文中所述之載體可含有一或多個內部核糖體進入位點(IRES)。將IRES序列納入融合載體中可有利於增強一些蛋白質之表現。在一些實施例中，載體系統將包括一或多個多腺核苷酸化部位（例如SV40），其可在任一前述核酸序列之上游或下游。載體組分可相鄰地連接，或者以提供用於表現基因產物之最佳間隔的方式來排列（即藉由在ORF之間引入「間隔子(spacer)」核苷酸），或者以其他方式放置。調節元件（諸如IRES模體）亦可經排列以提供用於表現之最佳間隔。
該等載體可包含選擇標記，其為所屬技術領域中所廣為周知。選擇標記包括正向及負向選擇標記，例如抗生素抗藥性基因（例如新黴素抗藥性基因、潮黴素(hygromycin)抗藥性基因、康黴素(kanamycin)抗藥性基因、四環素抗藥性基因、青黴素抗藥性基因、嘌呤黴素(puromycin)抗藥性基因、殺稻瘟菌素(blasticidin)抗藥性基因）、麩胺酸合成酶基因、HSV-TK、用於更昔洛威(ganciclovir)選擇之HSV-TK衍生物、或用於6-甲基嘌呤選擇之細菌嘌呤核苷磷酸化酶基因（Gadi等人，7 Gene Ther. 1738-1743 (2000))。編碼選擇標記或選殖位點之核酸序列可在編碼所關注多肽或選殖位點之核酸序列的上游或下游。
本文中所述之載體可用來以編碼所述抗體或抗原結合片段之基因轉形各種細胞。例如，載體可用來產生BCMA特異性抗體或抗原結合片段生產細胞。因此，另一個態樣的特點在於經載體轉形的宿主細胞，該載體包含編碼結合BCMA之抗體或其抗原結合片段（諸如本文中所描述及例示之抗體或抗原結合片段）的核酸序列。
許多用於將外來基因引入細胞之技術皆為所屬技術領域所習知，並且可用來建構重組細胞以依據本文中所描述及例示之各式實施例來實施所述之方法。所使用之技術應提供異源基因序列之穩定轉移至宿主細胞，以使該異源基因序列可由細胞後代所繼承及表現，並且使接受者細胞之必要發育及生理功能不受干擾。可使用之技術包括但不限於染色體轉移（例如，細胞融合、染色體媒介之基因轉移、微細胞媒介之基因轉移）、物理方法（例如，轉染、球形質體(spheroplast)融合、微注射、電穿孔、脂質體載劑）、病毒載體轉移（例如，重組DNA病毒、重組RNA病毒）及類似者（描述於Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)）。磷酸鈣沉澱及聚乙二醇(PEG)誘導之細菌原生質體與哺乳動物細胞融合亦可用來轉形細胞。
適用於表現本文中所述之BCMA特異性抗體或抗原結合片段的細胞，較佳為真核細胞，更佳為源自植物、囓齒動物、或人類之細胞，例如但不限於NSO、CHO、CHOK1、perC.6、Tk-ts13、BHK、HEK293細、COS-7、T98G、CV-1/EBNA、L細胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髓瘤細胞、及BHK細胞系、及其他者。此外，抗體之表現可使用融合瘤細胞來達成。用於生產融合瘤之方法在所屬技術領域中已充分建立。
經本文中所述之表現載體轉形的細胞可針對本文中所述之抗體或抗原結合片段的重組表現來選擇或篩選。重組陽性細胞經擴增並針對展現所欲表型之次殖株(subclone)進行篩選，所欲表型諸如高表現水平、增強之生長性質、或產出例如由於蛋白質修飾或經修改之轉譯後修飾而具有所欲生化特徵之蛋白質的能力。這些表型可能是因為給定次殖株之固有性質或因為突變。突變可透過使用化學品、UV波長光、放射線、病毒、插入型致突變原、抑制DNA不匹配修復、或此等方法之組合來實現。 使用BCMA 特異性抗體之治療方法
本文中提供用於治療之BCMA特異性抗體或其抗原結合片段。特定而言，這些抗體或抗原結合片段可用於治療癌症，諸如BCMA表現性癌症、或其他BCMA表現性病症。因此，本發明提供一種治療癌症之方法，該方法包含投予如本文中所述之抗體，諸如BCMA特異性抗體或抗原結合片段。舉例而言，該用法可為藉由干擾BCMA-受體交互作用，或者其中該抗體係與毒素共軛，從而使該毒素靶向該BCMA表現性癌症。在一些實施例中，BCMA表現性癌症或病症包含淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤(MM)，包括燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)，或類澱粉變性、漿細胞白血病、及狼瘡。在一些實施例中，該BCMA表現性癌症係淋巴瘤之復發性或難治性形式，諸如多發性骨髓瘤之復發性或難治性形式。用於這些方法中之抗體包括那些上文所述的抗體，例如具有表1中所述特徵（例如，BCMB519）（例如CDR或可變域序列）及在這些抗體的進一步討論中之特徵之BCMA特異性抗體或抗原結合片段。
在本文中所述之一些實施例中，BCMA特異性抗體之免疫效應(effector)性質可透過由所屬技術領域中具有通常知識者習知或本文中所述之技術所進行之Fc修飾來強化或靜默。舉例而言，Fc效應功能（諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞媒介吞噬作用(ADCP)、向下調控細胞表面受體（例如B細胞受體；BCR）等）可藉由修飾Fc中負責這些活性之殘基來提供及/或控制。
「抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)」或「ADCC」係指一種細胞媒介反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞（例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、及巨噬細胞）辨識目標細胞上的已結合抗體，然後造成目標細胞溶解。
單株抗體誘導ADCC之能力可藉由工程改造其寡醣組分來增強。人類IgG1或IgG3係在Asn297處經N-醣基化並且大部分聚醣係呈廣為周知之雙觸角(biantennary) G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式。由未經工程改造之CHO細胞生產之抗體一般具有約至少85%之聚醣岩藻醣(glycan fucose)含量。自附接至Fc區之雙觸角複合型寡醣移除核心岩藻糖經由改善FcγRIIIa結合且不改變抗原結合或CDC活性來增強抗體之ADCC。此類mAb可使用已報導會導致成功表現相對高量去岩藻糖基化(defucosylated)抗體（帶有雙觸角複合型之Fc寡醣）的不同方法來達成，諸如控制培養滲透壓(Konno et al., Cytotechnology 64:249-65, 2012)、應用變異體CHO系Lec13作為宿主細胞系(Shields et al., J Biol Chem 277:26733-26740, 2002)、應用變異體CHO系EB66作為宿主細胞系（Olivier et al., MAbs; 2(4), 2010；紙本發行前之電子發行版本；PMID:20562582）、應用大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系（Shinkawa等人，J Biol Chem 278:3466-3473, 2003）、引入特異性針對α1,6-岩藻糖基轉移酶(FUT8)基因之小型干擾RNA（Mori等人，Biotechnol Bioeng 88:901-908, 2004）、或共表現β-1,4-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶III及高基氏體α-甘露糖苷酶II或強效α-甘露糖苷酶I抑制劑基夫鹼(kifunensine)（Ferrara等人，J Biol Chem 281:5032-5036, 2006，Ferrara等人，Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006；Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008）。
在本文中所述之一些實施例中，由BCMA抗體所誘發之ADCC亦可藉由抗體Fc中之某些取代而增強。例示性取代為例如在胺基酸位置256、290、298、312、356、330、333、334、360、378、或430處之取代（殘基編號係根據EU索引），如描述於美國專利第6,737,056號。 偵測BCMA 之方法
本文中提供用於偵測生物樣本中之BCMA的方法，其藉由使該樣本接觸本文中所述之抗體、或其抗原結合片段。如本文中所述，該樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞（即游離細胞）、組織（例如手術切除之腫瘤組織、活體組織切片包括細針穿刺）、組織標本、及類似者。在一些實施例中，所述方法包括藉由使生物樣本接觸任何本文中所述之BCMA特異性抗體、或其抗原結合片段來偵測該樣本中之BCMA。
在一些實施例中，該樣本可與超過一種本文中所述之BCMA特異性抗體或抗原結合片段接觸。舉例而言，樣本可與第一BCMA特異性抗體、或其抗原結合片段接觸，接著與第二BCMA特異性抗體、或其抗原結合片段接觸，其中該第一抗體或抗原結合片段與該第二抗體或抗原結合片段並非相同抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，在接觸樣本之前，該第一抗體、或其抗原結合片段可固定至表面（諸如多孔盤、晶片、或類似基材）。在其他實施例中，在接觸樣本之前，該第一抗體、或其抗原結合片段可完全未經固定（或貼附）至任何東西。
所述BCMA特異性抗體及抗原結合片段可經可偵測地標示。在一些實施例中，標示抗體及抗原結合片段有助於經由本文中所述之方法偵測BCMA。許多此等標記係所屬領域中具有通常知識者所熟知者。舉例而言，合適標記包括（但不應將之視為限制於）放射性標記、螢光標記、表位標籤、生物素、發色團(chromophore)標記、ECL標記、或酶。更具體而言，所述標示包括釕、 111In-DOTA、 111In-二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、多組胺酸（HIS標籤）、吖啶染料、花青(cyanine)染料、螢光酮(fluorone)染料、
Figure 02_image001
Figure 02_image003
(oxazin)染料、啡啶染料、玫瑰紅染料、Alexafluor®染料、及類似者。
所述BCMA特異性抗體及抗原結合片段可用於各式檢定中以偵測生物樣本中之BCMA。一些合適檢定包括（但不應將之視為限制於）西方墨點分析、放射免疫檢定、表面電漿共振、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫檢定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)或ELISA檢定。
在本文所述之一些實施例中，偵測對象中之BCMA表現性癌細胞可用來判定該對象可用針對BCMA之治療劑來治療。
BCMA係以可偵測水平存在於血液及血清樣本中。因此，本文中提供用於偵測衍生自血液之樣本諸如血清樣本中之BCMA之方法，其係藉由使該樣本與結合BCMA之抗體或其抗原結合片段接觸。該血液樣本或其衍生物可經稀釋、份化、或以其他方式處理以產出可對其執行所述方法的樣本。在一些實施例中，BCMA可藉由所屬技術領域中所習知之許多檢定來在血液樣本或其衍生物中偵測，諸如（但不限於）西方墨點分析、放射免疫檢定、表面電漿共振、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫檢定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)或ELISA檢定。在一些實施例中，該方法係體外方法。 用於診斷癌症或病症之方法
本文中提供用於診斷對象中之BCMA表現性癌症或病症之方法。在一些實施例中，BCMA表現性癌症或病症包括淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤(MM)，包括燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)，或類澱粉變性、漿細胞白血病、及狼瘡。在一些實施例中，如上所述，偵測生物樣本（諸如血液樣本或血清樣本）中之BCMA提供診斷對象（該樣本自其獲得）中之癌症的能力。或者，在一些實施例中，其他樣本（諸如組織樣本、細針穿刺樣本、切除腫瘤組織、循環細胞、循環腫瘤細胞、及類似者）亦可用來評估該對象（該樣本自其獲得）是否患有癌症。在一些實施例中，可能已經知道該對象（該樣本自其獲得）患有癌症，但該對象所患癌症之類型可能尚未診斷出來或者初步診斷結果可能尚未明朗，因此偵測獲自該對象之生物樣本中之BCMA可讓該癌症之診斷得以作出或明朗化。舉例而言，可能已經知道對象患有癌症，但可能不知道或不清楚該對象之癌症是否為BCMA表現性。
在一些實施例中，所述方法涉及評估對象是否罹患BCMA表現性癌症或病症，其係藉由判定衍生自該對象之生物樣本中所存在之BCMA量；以及比較所觀察到之BCMA量與對照（或參考）樣本中之BCMA量，其中衍生自該對象之樣本中的BCMA量與對照（或參考）樣本中之BCMA量的差異指示該對象罹患BCMA表現性癌症或病症。在另一個實施例中，得自對象之生物樣本中所觀察到之BCMA量可與已知和某些癌症形式或期別相關聯之BCMA水平比較，以判定該對象之癌症的形式或期別。在一些實施例中，衍生自該對象之樣本中的BCMA量係藉由使該樣本與結合BCMA之抗體、或其抗原結合片段（諸如本文中所述之BCMA特異性抗體）接觸來評估。用於評估BCMA之存在的樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞（即游離細胞）、組織（例如手術切除之腫瘤組織、活體組織切片包括細針穿刺）、組織標本、及類似者。在一些實施例中，BCMA表現性癌症或病症包括血液性癌症，諸如多發性骨髓瘤(MM)，包括燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)，或類澱粉變性、漿細胞白血病、及狼瘡。在一些實施例中，該BCMA表現性癌症係淋巴瘤之復發性或難治性形式，諸如多發性骨髓瘤之復發性或難治性形式。在一些實施例中，該對象為人類。
在一些實施例中，診斷BCMA表現性癌症或病症之方法將涉及：使對象之生物樣本與BCMA特異性抗體、或其抗原結合片段（諸如可衍生自表1所提供之抗體及片段者（例如，BCMB519））接觸；定量該樣本中所存在且被該抗體或其抗原結合片段結合的BCMA量；比較該樣本中所存在之BCMA量與已知標準品或參考樣本；以及用來判定該對象之BCMA水平是否落入與癌症或病症相關聯之BCMA水平。在額外實施例中，在該診斷方法之後可接著進行投予或處方BCMA特異性治療之額外步驟。在另一實施例中，在該診斷方法之後可接著進行傳送判定結果以利於癌症或病症治療之額外步驟。在一些實施例中，該BCMA特異性治療可針對BCMA表現性癌症或病症，諸如本文中所述之BCMA x CD3多特異性抗體。
在一些實施例中，所述方法涉及評估對象是否罹患BCMA表現性癌症或病症，其係藉由判定得自該對象之血液或血清樣本中所存在之BCMA量；以及比較所觀察到之BCMA量與對照（或參考）樣本中之BCMA量，其中衍生自該對象之樣本中的BCMA量與對照（或參考）樣本中之BCMA量的差異指示該對象罹患BCMA表現性癌症或病症。
在一些實施例中，該對照（或參考）樣本可衍生自未罹患BCMA表現性癌症或病症之對象。在一些實施例中，該對照（或參考）樣本可衍生自罹患BCMA表現性癌症或病症之對象。在該對照（或參考）樣本係衍生自未罹患BCMA表現性癌症或病症之對象的一些實施例中，觀察到測試樣本中所存在之BCMA量相對於該對照或參考樣本中所觀察到之量增加，指示該受評估對象罹患BCMA表現性癌症或病症。在該對照樣本係衍生自未罹患BCMA表現性癌症或病症之對象的一些實施例中，觀察到測試樣本中所存在之BCMA量相對於該對照或參考樣本中所觀察到之量減少或類似，指示該受評估對象未罹患BCMA表現性癌症或病症。在該對照或參考樣本係衍生自罹患BCMA表現性癌症或病症之對象的一些實施例中，觀察到測試樣本中所存在之BCMA量相對於該對照或參考樣本中所觀察到之量類似，指示該受評估對象罹患BCMA表現性癌症或病症。在該對照或參考樣本係衍生自罹患BCMA表現性癌症或病症之對象的一些實施例中，觀察到測試樣本中所存在之BCMA量相對於該對照或參考樣本中所觀察到之量減少，指示該受評估對象未罹患BCMA表現性癌症或病症。
在一些實施例中，衍生自該對象之樣本中的BCMA量係藉由使該樣本與結合BCMA之抗體、或其抗原結合片段（諸如本文中所述之抗體）接觸來評估。用於評估BCMA之存在的樣本可衍生自血液樣本、血清樣本、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞（即游離細胞）、組織（例如手術切除之腫瘤組織、活體組織切片包括細針穿刺）、組織標本、及類似者。
在各種態樣中，BCMA量係藉由使樣本與結合BCMA之抗體、或其抗原結合片段接觸來判定。在一些實施例中，樣本可由超過一種類型之結合BCMA的抗體、或其抗原結合片段接觸。在一些實施例中，樣本可由結合BCMA之第一抗體、或其抗原結合片段接觸，接著由結合BCMA之第二抗體、或其抗原結合片段接觸。諸如本文中所述之BCMA特異性抗體或抗原結合片段可用於此方法。
BCMA特異性抗體及抗原結合片段之各式組合可用來提供「第一」及「第二」抗體或抗原結合片段以實施所述之診斷方法。在一些實施例中，BCMA表現性癌症或病症包括淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤(MM)，包括燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)。在一些實施例中，該BCMA表現性癌症係淋巴瘤之復發性或難治性形式，諸如多發性骨髓瘤之復發性或難治性形式。
在某些實施例中，BCMA量係藉由下列方法判定：西方墨點分析、放射免疫檢定、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫檢定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)或ELISA檢定。
在所述診斷方法之各式實施例中，使用對照或參考樣本。此樣本可作為陽性或陰性檢定對照組以確保所使用之檢定的正確運作；舉例而言，具有此性質之檢定對照組可能常用於免疫組織化學檢定。或者，該樣本可為來自健康對象之用於生物樣本中之BCMA量的標準參考品。在一些實施例中，所觀察到之受測對象的BCMA水平可與來自已知患有BCMA表現性癌症或病症之對象的樣本中所觀察到之BCMA水平比較。在一些實施例中，該對照對象可能罹患所關注之特定癌症或病症。在一些實施例中，已知該對照對象患有早期癌症，該癌症可為或非為BCMA表現性癌症。在一些實施例中，已知該對照對象患有中期癌症，該癌症可為或非為BCMA表現性癌症。在一些實施例中，已知該對照對象患有晚期癌症，該癌症可為或非為BCMA表現性癌症。
在一些實施例中，用於診斷癌症或病症之方法係體外方法。 用於監測癌症或病症之方法
本文中提供用於監測對象中之BCMA表現性癌症或病症的方法。在一些實施例中，BCMA表現性癌症或病症包括淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤(MM)，包括燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)，或類澱粉變性、漿細胞白血病、及狼瘡。在一些實施例中，該BCMA表現性癌症係淋巴瘤之復發性或難治性形式，諸如多發性骨髓瘤之復發性或難治性形式。在一些實施例中，所述方法涉及評估BCMA表現性癌症或病症是否正在進展、消退、或保持穩定，其藉由判定衍生自該對象之測試樣本中所存在之BCMA的量；以及比較所觀察到之BCMA的量與在較早時間點以類似方式獲自該對象之生物樣本中之BCMA的量，其中測試樣本與較早樣本中之BCMA的量之間的差異提供該癌症是否正在進展、消退、或保持穩定之指示。在此方面，測試樣本之BCMA量相對於較早樣本所觀察到之量增加，可能指示BCMA表現性癌症或病症之進展。反之，測試樣本之BCMA量相對於較早樣本所觀察到之量減少，可能指示BCMA表現性癌症或病症之消退。
因此，測試樣本之BCMA量相對於較早樣本所觀察到之量的差異不顯著可能指示BCMA表現性癌症或病症的穩定疾病狀態。在一些實施例中，衍生自該對象之生物樣本中的BCMA量係藉由使該樣本與結合BCMA之抗體、或其抗體片段（諸如本文中所述之抗體）接觸來評估。用於評估BCMA之存在的樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞（即游離細胞）、組織（例如，手術切除之腫瘤組織、活體組織切片，包括細針穿刺）、組織標本、及類似者。在一些實施例中，該對象為人類。
在一些實施例中，監測BCMA表現性癌症或病症之方法將涉及：使對象之生物樣本與BCMA特異性抗體、或其抗原結合片段（諸如可衍生自表1所提供之抗體及片段者（例如，BCMB519））接觸；定量該樣本中所存在的BCMA量；比較該樣本中所存在之BCMA量與在較早時間點以相同方式得自相同對象之生物樣本中所判定的BCMA量；以及判定該對象之BCMA水平是否隨時間改變。測試樣本之BCMA量相對於較早樣本所觀察到之量增加，可能指示癌症之進展。反之，測試樣本之BCMA量相對於較早樣本所觀察到之量減少，可能指示BCMA表現性癌症或病症之消退。因此，測試樣本之BCMA量相對於較早樣本所觀察到之量的差異不顯著，可能指示BCMA表現性癌症或病症的穩定疾病狀態。在一些實施例中，樣本之BCMA水平可與已知標準品或參考樣本單獨比較，或另外與在較早時間點評估之樣本所觀察到的BCMA水平比較。在額外實施例中，在該診斷方法之後可接著進行投予BCMA特異性治療之額外步驟。在一些實施例中，BCMA特異性治療可針對BCMA表現性癌症或病症，諸如本文中所述之BCMA x CD3多特異性抗體。
在各種態樣中，BCMA量係藉由使樣本與結合BCMA之抗體、或其抗原結合片段接觸來判定。在一些實施例中，樣本可由超過一種類型之結合BCMA的抗體、或其抗原結合片段接觸。在一些實施例中，樣本可由結合BCMA之第一抗體、或其抗原結合片段接觸，接著由結合BCMA之第二抗體、或其抗原結合片段接觸。諸如本文中所述之抗體可用於此方法。
表1所述之抗體及抗原結合片段之各式組合可用來提供「第一」及「第二」抗體或抗原結合片段以實施所述之監測方法。在一些實施例中，BCMA表現性癌症或病症包括血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)或淋巴瘤（例如，多發性骨髓瘤(MM)、燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)，或類澱粉變性、漿細胞白血病、及狼瘡。
在某些實施例中，BCMA量係藉由下列方法判定：西方墨點分析、放射免疫檢定、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫檢定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)或ELISA檢定。在一些實施例中，該方法係體外方法。 用於偵測BCMA 之套組
本文中提供用於偵測生物樣本中之BCMA的套組。這些套組包括本文中所述之一或多種BCMA特異性抗體、或其抗原結合片段，以及套組之使用說明。
所提供之BCMA特異性抗體或抗原結合片段可係在溶液中；經凍乾；經固定至基材、載劑、或盤；或經可偵測地標示。
所述套組亦可包括可用於執行本文中所述之方法的額外組分。舉例來說，該等套組可包含用於自對象獲得樣本之手段、對照或參考樣本（例如來自患有緩慢進展癌症之對象及/或未患有癌症之對象的樣本）、一或多個樣本隔間、及/或描述本發明方法之執行及組織特定對照組或標準品的說明資料。
用於判定BCMA水平之手段可進一步包括例如緩衝液或其他用於判定BCMA水平之檢定中的試劑。該等說明可為例如用於執行該檢定之印刷說明及/或用於評估BCMA表現水平之說明。
所述套組亦可包括用於自對象單離樣本之手段。這些手段可包含可用來自對象獲得流體或組織之一或多個設備項目或試劑。用於自對象獲得樣本之手段亦可包含用於自血液樣本單離血液組分（諸如血清）之手段。較佳的是，該套組係針對人類對象使用而設計。 實施例
本文所提供之揭露亦提供以下非限制性實施例。 實施例1.             一種三特異性抗體或其三特異性結合片段，其包含： (a)第一抗原結合臂，其包含第一重鏈可變域(VH1)及第一輕鏈可變域(VL1)； (b)第二抗原結合臂，其包含第二重鏈可變域(VH2)及第二輕鏈可變域(VL2)； (c)第三抗原結合臂，其包含第三重鏈可變域(VH3)及第三輕鏈可變域(VL3)， 其中該第一抗原結合臂結合至分化簇3 (CD3)上之表位，該第二抗原結合臂結合至G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)上之表位，且該第三抗原結合臂結合至B細胞成熟抗原(BCMA)上之表位。 實施例2.             如實施例1所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中第一抗原結合臂之該VH1及VL1存在於雙價抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、或雙硫鍵穩定性雙價抗體（ds雙價抗體）中，可選地存在於Fab中。 實施例3.             如實施例1或2所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第二抗原結合臂之該VH2及VL2存在於雙價抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fv、Fd、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、或雙硫鍵穩定性雙價抗體（ds雙價抗體）中，可選地存在於scFv中。 實施例4.             如實施例1至3中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合臂之該VH3及VL3存在於抗體片段、雙價抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、或雙硫鍵穩定性雙價抗體（ds雙價抗體）中，可選地存在於scFv中。 實施例5.             如實施例1至4中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之該重鏈可變域(VH1)之重鏈互補決定區(HCDR) 1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 7之該輕鏈可變域(VL1)之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、LCDR2、及LCDR3。 實施例6.             如實施例1至5中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含：包含GDSVFNNNAAWS (SEQ ID NO: 4)之胺基酸序列之HCDR1、包含RTYYRSKWLYD (SEQ ID NO: 5)之胺基酸序列之HCDR2、及包含GYSSSFDY (SEQ ID NO: 6)之胺基酸序列之HCDR3；以及包含TGTSSNIGTYKFVS (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列之LCDR1、包含EVSKRPS (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列之LCDR2、及包含VSYAGSGTLL (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列之LCDR3。 實施例7.             如實施例1至6中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之該VH1及SEQ ID NO: 7之該VL1。 實施例8.             如實施例1至7中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 16之該重鏈可變域(VH2)之重鏈互補決定區(HCDR) 1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 15之該輕鏈可變域(VL2)之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、LCDR2、及LCDR3。 實施例9.             如實施例1至8中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含：包含GFSLTNIRMSVS (SEQ ID NO: 12)之胺基酸序列之HCDR1、包含HIFSNDEKS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列之HCDR2、及包含MRLPYGMDV (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列之HCDR3；以及包含RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列之LCDR1、包含KISNRFF (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列之LCDR2、及包含MQATQFPHT (SEQ ID NO: 11)之胺基酸序列之LCDR3。 實施例10.           如實施例1至9中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 16之該VH2及SEQ ID NO: 15之該VL2。 實施例11.           如實施例1至10中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 24之該重鏈可變域(VH3)之重鏈互補決定區(HCDR) 1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 23之該輕鏈可變域(VL3)之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、LCDR2、及LCDR3。 實施例12.           如實施例1至11中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合BCMA之該第三抗原結合臂包含：包含GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列之HCDR1、包含AISGSGGSTY (SEQ ID NO: 21)之胺基酸序列之HCDR2、及包含DEGYSSGHYYGMDV (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列之HCDR3；以及包含RASQSISSSFLT (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列之LCDR1、包含GASSRAT (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列之LCDR2、及包含QHYGSSPMYT (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列之LCDR3。 實施例13.           如實施例1至12中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 24之該VH3及SEQ ID NO: 23之該VL3。 實施例14.           如實施例1至4中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之該VH1之HCDR1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 7之該VL1之LCDR1、LCDR2、及LCDR3； 結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 16之該VH2之HCDR1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 15之該VL2之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；且 結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 24之該VH3之HCDR1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 23之該VL3之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。 實施例15.           如實施例1至4及14中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含分別為SEQ ID NO: 4、5、6、1、2、3之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。 結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含分別為SEQ ID NO: 12、13、14、9、10、及11之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；且 結合BCMA之該第三抗原結合臂包含分別為SEQ ID NO: 20、21、22、17、18、及19之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。 實施例16.           如實施例1至4、14、及15中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之該VH1及SEQ ID NO: 7之該VL1。 結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 16之該VH2及SEQ ID NO: 15之該VL2；且 結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 24之該VH3及SEQ ID NO: 23之該VL3； 實施例17.           如實施例1至16中任一者所述之三特異性抗體或其三特異性結合片段，該第一抗原結合臂包含可結晶片段(Fc)域，且該第二抗原結合臂或該第三抗原結合臂包含Fc域。 實施例18.           如實施例17所述之三特異性抗體或其三特異性結合片段，其中該等Fc域包含促進該等Fc域之異二聚化之一或多種突變。 實施例19.           如實施例18所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該突變係選自T366S、L368A、T366W、及Y407V（EU編號）。 實施例20.           如實施例17至19中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該等Fc域進一步包含減少Fc與Fcγ受體結合之一或多個突變。 實施例21.           如實施例20所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該Fcγ受體係FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB、FcyRIIIA、及/或FcyRIIIB。 實施例22.           如實施例20或21所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該等Fc域包含選自L234A、L235A、及D265S（EU編號）之一或多個突變。 實施例23.           如實施例17至22中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該等Fc域進一步包含減少Fc與蛋白質A結合之一或多個突變。 實施例24.           如實施例23所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該Fc域包含突變H435R及/或Y436F（EU編號）。 實施例25.           如實施例1至24中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂特異性結合至該CD3ε鏈之殘基22至35 (QDGNEEMGGITQTP (SEQ ID NO: 161))。 實施例26.           如實施例1至25中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂以約1 x10 -8至1 x10 -7M之親和力特異性結合至CD3。 實施例27.           如實施例26所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂以約2 x10 -8至4 x 10 -8M之親和力特異性結合至CD3。 實施例28.           如實施例1至27中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合臂特異性結合BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 162))。 實施例29.           如實施例1至28中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合臂以約1 x10 -10至1 x 10 -7M之親和力特異性結合至BCMA。 實施例30.           如實施例29所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合臂以約2 x10 -10至9 x10 -10M之親和力特異性結合至BCMA。 實施例31.           一種三特異性抗體或三特異性結合片段，其包含結合至分化簇3 (CD3)上之表位之第一抗原結合臂、結合至G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)上之表位之第二抗原結合臂、及結合至B細胞成熟抗原(BCMA)上之表位之第三抗原結合臂， 其中該第一抗原結合臂包含重鏈(HC1)多肽及輕鏈(LC)多肽；且 其中該三特異性抗體或其三特異性結合片段包含單一多肽，該單一多肽包含該第二抗原結合臂及該第三抗原結合臂。 實施例32.           如實施例31所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂之該HC1包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。 實施例33.           如實施例32所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂之該LC包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。 實施例34.           如實施例32或33所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中包含該第二抗原結合臂及該第三抗原結合臂之該多肽包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。 實施例35.           如實施例31所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂包含：包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之HC1、及包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列之LC，且包含該第二抗原結合臂及該第三抗原結合臂之該多肽包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。 實施例36.           一種三特異性抗體或三特異性結合片段，其包含結合至分化簇3 (CD3)上之表位之第一抗原結合臂、結合至G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)上之表位之第二抗原結合臂、及結合至B細胞成熟抗原(BCMA)上之表位之第三抗原結合臂， 其中該第一抗原結合臂包含重鏈(HC1)多肽及輕鏈(LC)多肽，其中該重鏈(HC1)多肽進一步包含該第二抗原結合臂， 其中該三特異性抗體或其三特異性結合片段進一步包含單一多肽，該單一多肽包含該第三抗原結合臂。 實施例37.           如實施例36所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂之該HC1包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。 實施例38.           如實施例36或37所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂之該LC包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。 實施例39.           如實施例36至38中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中包含該第三抗原結合臂之該單一多肽包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。 實施例40.           如實施例36所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂包含：包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列之HC1、及包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列之LC，且包含該第三抗原結合臂之該單一多肽包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。 實施例41.           如實施例1至40中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。 實施例42.           如實施例1至41中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1同型。 實施例43.           一種合成性多核苷酸，其編碼如實施例1至42中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段。 實施例44.           一種醫藥組成物，其包含如實施例1至42中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段及醫藥上可接受之載劑。 實施例45.           如實施例44所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物進一步包含第二治療劑。 實施例46.           如實施例45所述之醫藥組成物，其中該第二治療劑包含抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞強化子、或其任何組合。 實施例47.           一種細胞，其表現如實施例1至42中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段。 實施例48.           如實施例47所述之細胞，其中該細胞係融合瘤。 實施例49.           如實施例47所述之細胞，其中該三特異性抗體係經重組生產。 實施例50.           一種用於治療有需要之對象中癌症之方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之如實施例1至42中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段或如實施例43至46中任一者所述之醫藥組成物。 實施例51.           如實施例50所述之方法，其中投予該三特異性抗體或三特異性結合片段或該醫藥組成物達足以治療該癌症的時間。 實施例52.           一種用於抑制癌細胞生長或增生之方法，該方法包含向該細胞投予有效量之如實施例1至42中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段或如實施例43至46中任一者所述之醫藥組成物，其中該有效量足以抑制該癌細胞之生長或增生。 實施例53.           如實施例52所述之方法，其中該癌細胞係在對象中並且該三特異性抗體或三特異性結合片段或該醫藥組成物係投予至該對象。 實施例54.           如實施例52所述之方法，其中該投予係離體進行。 實施例55.           一種將有需要之對象中之T細胞重新導向BCMA及/或GPRC5D表現性癌細胞之方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之如實施例1至42中任一者之三特異性抗體或三特異性結合片段或如實施例43至46中任一者之醫藥組成物。 實施例56.           如實施例55所述之方法，其中該治療有效量足以將該T細胞反應導向該等癌細胞。 實施例57.           如實施例50至56中任一者所述之方法，其中該癌症係血液性癌症。 實施例58.           如實施例57所述之方法，其中該血液性癌症係BCMA及/或GPRC5D表現性B細胞癌。 實施例59.           如實施例58所述之方法，其中該BCMA及/或GPRC5D表現性B細胞癌係多發性骨髓瘤。 實施例60.           如實施例59所述之方法，其中該BCMA及/或GPRC5D表現性B細胞癌係燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)。 實施例61.           如實施例50至60中任一者所述之方法，其中該癌症係復發性、難治性、或惡性癌症、或其任何組合。 實施例62.           如實施例50至51、53、及55至61中任一者所述之方法，其中該對象已接受先前治療。 實施例63.           如實施例62所述之方法，該先前治療包含蛋白酶體抑制劑、免疫調節藥物、CD38抗體、雙特異性劑、CAR-T療法、或其組合。 實施例64.           如前述實施例50至63中任一者所述之方法，其進一步包含投予第二治療劑。 實施例65.           如實施例64所述之方法，其中該第二治療劑係化學治療劑或靶向抗癌療法。 實施例66.           如實施例65所述之方法，其中該化學治療劑係阿糖胞苷、蒽環素、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2 (IL-2)。 實施例67.           如實施例64所述之方法，其中該第二治療劑係抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞強化子、或其任何組合。 實施例68.           如實施例50至51、53、及55至67中任一者所述之方法，其中該三特異性抗體或三特異性結合片段、或該醫藥組成物係經靜脈內、肌肉內、腹膜內、及/或皮下投予至該對象。 實施例69.           如實施例50至51、53及55至68中任一者所述之方法，其中該三特異性抗體或三特異性結合片段、或該醫藥組成物係經皮下投予至該對象。 實施例70.           一種用於產生如實施例1至42中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段之方法，其中該方法包含培養如實施例47至49中任一者所述之細胞並單離該三特異性抗體或三特異性結合片段。 實施例71.           一種套組，其包含(i)如實施例1至42中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段及/或如實施例43所述之多核苷酸及(ii)其包裝。 實施例72.           一種結合至BCMA之抗體或其抗原結合片段，其包含：具有GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有AISGSGGSTY (SEQ ID NO: 21)之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有DEGYSSGHYYGMDV (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列的重鏈CDR3。 實施例73.           如實施例72之抗體或抗原結合片段，其進一步包含：具有RASQSISSSFLT (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有GASSRAT (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及具有QHYGSSPMYT (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 實施例74.           如實施例72或73之抗體或抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)。 實施例75.           如實施例72至74中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之輕鏈可變域(VL)。 實施例76.           如實施例72至75中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段特異性結合BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 162))。 實施例77.           如實施例72至76中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段以約1 x10 -10至1 x 10 -7M之親和力特異性結合至BCMA。 實施例78.           如實施例77所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段以約2 x10 -10至9 x10 -10M之親和力特異性結合至BCMA。 實施例79.           如實施例72至78中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段。 實施例80.           如實施例72至79中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係重組的。 實施例81.           如實施例72至80中任一者所述之抗原結合片段，其中該抗原結合片段係Fab片段、Fab2片段、或單鏈抗體。 實施例82.           如實施例72至81中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。 實施例83.           如實施例72至82中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1或IgG4同型。 實施例84.           一種醫藥組成物，其包含如實施例72至83中任一者所述之抗體或抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。 實施例85.           如實施例84所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物進一步包含第二治療劑。 實施例86.           如實施例85所述之醫藥組成物，其中該第二治療劑包含抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞強化子、或其任何組合。 實施例87.           一種細胞，其表現如實施例72至83中任一者之抗體或抗原結合片段。 實施例88.           如實施例87所述之細胞，其中該細胞係融合瘤。 實施例89.           如實施例87所述之細胞，其中該抗體係經重組生產。 實施例90.           一種用於治療有需要之對象中癌症之方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之如實施例72至83中任一者所述之抗體或抗原結合片段或如實施例84至86中任一者所述之醫藥組成物。 實施例91.           如實施例90所述之方法，其中投予該抗體或抗原結合片段或該醫藥組成物達足以治療該癌症的時間。 實施例92.           一種用於抑制癌細胞生長或增生之方法，該方法包含向該細胞投予有效量之如實施例72至83中任一者所述之抗體或抗原結合片段或如實施例84至86中任一者所述之醫藥組成物，其中該有效量足以抑制該癌細胞之生長或增生。 實施例93.           如實施例92所述之方法，其中該癌細胞係在對象中並且該抗體或抗原結合片段或醫藥組成物係投予至該對象。 實施例94.           如實施例92所述之方法，其中該投予係離體進行。 實施例95.           如實施例90至94中任一者所述之方法，其中該癌症係血液性癌症。 實施例96.           如實施例95所述之方法，其中該血液性癌症係BCMA表現性B細胞癌。 實施例97.           如實施例96所述之方法，其中該BCMA表現性B細胞癌係多發性骨髓瘤。 實施例98.           如實施例97所述之方法，其中該BCMA表現性B細胞癌係燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)。 實施例99.           如實施例90至98中任一者所述之方法，其中該癌症係復發性、難治性、或惡性癌症、或其任何組合。 實施例100.         如實施例90至91、93、及95至99中任一者所述之方法，其中該對象已接受先前治療。 實施例101.         如實施例100所述之方法，該先前治療包含蛋白酶體抑制劑、免疫調節藥物、CD38抗體、雙特異性藥劑、CAR-T療法、或其組合。 實施例102.         如實施例90至101中任一者所述之方法，其進一步包含投予第二治療劑。 實施例103.         如實施例102所述之方法，其中該第二治療劑係化學治療劑或靶向抗癌療法。 實施例104.         如實施例103所述之方法，其中該化學治療劑係阿糖胞苷、蒽環素、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2 (IL-2)。 實施例105.         如實施例104所述之方法，其中該第二治療劑係抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞強化子、或其任何組合。 實施例106.         如實施例90至91、93、及95至105中任一者所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段或醫藥組成物係經靜脈內、肌肉內、腹膜內、及/或皮下投予至該對象。 實施例107.         如實施例90至91、93、及95至106中任一者所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段、或該醫藥組成物係經皮下投予至該對象。 實施例108.         一種用於產生實施例72至83中任一者所述之抗體或抗原結合片段之方法，其中該方法包含培養如實施例87至89中任一者所述之細胞並單離該抗體或抗原結合片段。 實施例109.         一種合成性多核苷酸，其編碼如實施例72至83中任一者所述之抗體或抗原結合片段。 實施例110.         一種套組，其包含(i)如實施例72至83中任一者所述之抗體或抗原結合片段及/或如實施例109所述之多核苷酸及(ii)其包裝。 實施例111.         一種三特異性抗體或其三特異性結合片段，其包含： a)第一重鏈部分(HC1)，其包含第一重鏈可變域(VH)； b)輕鏈部分(LC)，其包含輕鏈可變域(VL)；及 c)第二重鏈部分(HC2)，其包含第二VH域， 其中 (i)該HC1 VH及該LC VL域形成結合第一抗原之第一抗原結合位點， (ii)該HC2 VH域形成結合第二抗原之第二抗原結合位點， (iii)該HC1或該HC2進一步包含形成結合第三抗原之第三抗原結合位點之第三VH域， (iv)該HC1及HC2各自可選地包含可結晶片段(Fc)域，該可結晶片段域包含CH2-CH3域；且 其中該第一抗原係分化簇3 (CD3)，且 (v)該第二抗原係B細胞成熟抗原(BCMA)，且該第三抗原係G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)；或 (vi)該第二抗原係G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)，且該第三抗原係B細胞成熟抗原(BCMA)。 實施例112.         如實施例111所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2包含形成結合該第三抗原之該第三抗原結合位點之該第三VH域。 實施例113.         如實施例112所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2自N至C端包含形成該第二抗原結合位點之該第二VH域、該Fc域、第一連接子(L1)、及形成該第三抗原結合位點之該第三VH域。 實施例114.         如實施例111至113中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2包含形成結合GPRC5D之該第二抗原結合位點之該第二VH域，且該HC2進一步包含形成結合BCMA之該第三抗原結合位點之該第三VH域。 實施例115.         如實施例111所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC1包含形成結合該第三抗原之該第三抗原結合位點之該第三VH域。 實施例116.         如實施例115所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC1自N至C端包含形成該第一抗原結合位點之該第一VH、CH1域、該Fc域、第一連接子(L1)、及形成該第三抗原結合位點之該第三VH域。 實施例117.         如實施例111、115、及116中任一者之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2包含形成結合BCMA之該第二抗原結合位點之該第二VH域，且該HC1進一步包含形成結合GPRC5D之該第三抗原結合位點之該第三VH域。 實施例118.         如實施例111至117中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中形成該第一抗原結合位點之該HC1 VH及LC VL包含抗原結合片段(Fab)，該抗原結合片段包含該第一抗原結合位點。 實施例119.         如實施例111至118中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2 VH形成包含該第二抗原結合位點之單鏈可變片段(scFv)。 實施例120.         如實施例111至119中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三VH形成包含該第三抗原結合位點之單鏈可變片段(scFv)。 實施例121.         如實施例111至120中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1及HC2之該等Fc域包含促進異二聚化之一或多種不同突變。 實施例122.         如實施例121所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC1之該Fc域包含突變T366S、L368A、及Y407V（EU編號），且該HC2之該Fc域包含突變T366W（EU編號）。 實施例123.         如實施例121所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2之該Fc域包含突變T366S、L368A、及Y407V（EU編號），且該HC1之該Fc域包含突變T366W（EU編號）。 實施例124.         如實施例111至123中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1及/或HC2之該等Fc域進一步包含減少Fc與Fcγ受體結合之一或多個突變。 實施例125.         如實施例124所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該Fcγ受體係FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB、FcyRIIIA、及/或FcyRIIIB。 實施例126.         如實施例124或125所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1及/或HC2之該等Fc域各自包含選自L234A、L235A、及D265S（EU編號）之一或多個突變。 實施例127.         如實施例126所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1及HC2之該等Fc域各自包含突變L234A、L235A、及D265S（EU編號）。 實施例128.         如實施例111至127中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1或HC2之該等Fc域進一步包含減少Fc與蛋白質A結合之一或多個突變。 實施例129.         如實施例128所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1或HC2之該等Fc域包含突變H435R及/或Y436F（EU編號）。 實施例130.         如實施例129所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1之之該Fc域包含突變H435R及Y436F（EU編號）。 實施例131.         如實施例113至114及116至130中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一連接子(L1)包含SEQ ID NO: 25、127至157、及163之胺基酸序列中之任一者。 實施例132.         如實施例131中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一連接子(L1)包含GGSEGKSSGSGSESKSTGGS (SEQ ID NO: 25)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ((G4S)4, SEQ ID NO: 163)之胺基酸序列。 實施例133.         如實施例111至132中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合位點包含：包含GDSVFNNNAAWS (SEQ ID NO: 4)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、包含RTYYRSKWLYD (SEQ ID NO: 5)之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含GYSSSFDY (SEQ ID NO: 6)之胺基酸序列之重鏈CDR3。 實施例134.         如實施例111至133中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合位點包含：包含TGTSSNIGTYKFVS (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、包含EVSKRPS (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含VSYAGSGTLL (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 實施例135.         如實施例111至134中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合位點包含重鏈可變域(VH)，該重鏈可變域含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。 實施例136.         如實施例111至135中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合位點包含輕鏈可變域(VL)，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。 實施例137.         如實施例111至136中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合GPRC5D之該第二或第三抗原結合位點包含：包含GFSLTNIRMSVS (SEQ ID NO: 12)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、包含HIFSNDEKS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含MRLPYGMDV (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列之重鏈CDR3。 實施例138.         如實施例111至137中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合GPRC5D之該第二或第三抗原結合位點包含：包含RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、包含KISNRFF (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含MQATQFPHT (SEQ ID NO: 11)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 實施例139.         如實施例111至138中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合GPRC5D之該第二或第三抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)。 實施例140.         如實施例111至139中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合GPRC5D之該第二或第三抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之輕鏈可變域(VL)。 實施例141.         如實施例111至140中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合BCMA之該第二或第三抗原結合位點包含：包含GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、包含AISGSGGSTY (SEQ ID NO: 21)之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含DEGYSSGHYYGMDV (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列之重鏈CDR3。 實施例142.         如實施例111至141中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合BCMA之該第二或第三抗原結合位點包含：包含RASQSISSSFLT (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、包含GASSRAT (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含QHYGSSPMYT (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 實施例143.         如實施例111至142中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合BCMA之該第二或第三抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)。 實施例144.         如實施例111至143中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合BCMA之該第二或第三抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之輕鏈可變域(VL)。 實施例145.         如實施例119至144中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該scFv自N至C端包含VH、第二連接子(L2)、及VL (VH-L2-VL)；或VL、L2及VH (VL-L2-VH)。 實施例146.         如實施例119至145中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該scFv自N至C端包含該VL、該L2、及該VH (VL-L2-VH)。 實施例147.         如實施例145或146所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第二連接子(L2)包含SEQ ID NO: 25、127至157、及163之胺基酸序列中之任一者。 實施例148.         如實施例145至147中任一者所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該L2包含GGSEGKSSGSGSESKSTGGS (SEQ ID NO: 25)之胺基酸序列。 實施例149.         如實施例111至148中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該第一抗原結合位點特異性結合至該CD3ε鏈之殘基22至35 (QDGNEEMGGITQTP (SEQ ID NO: 161))。 實施例150.         如實施例111至149中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該第一抗原結合位點以約1 x10 -8至1 x10 -7M之親和力特異性結合至CD3。 實施例151.         如實施例150所述之抗體或抗原結合片段，其中該第一抗原結合位點以約2 x10 -8至4 x 10 -8M之親和力特異性結合至CD3。 實施例152.         如實施例111至151中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該第二或第三抗原結合位點特異性結合BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 162))。 實施例153.         如實施例152所述之抗體或抗原結合片段，其中該第二或第三抗原結合位點以約1 x10 -10至1 x 10 -7M之親和力特異性結合至BCMA。 實施例154.         如實施例153所述之抗體或抗原結合片段，其中該第二或第三抗原結合位點以約2 x10 -10至9 x10 -10M之親和力特異性結合至BCMA。 實施例155.         如實施例111至154中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。 實施例156.         如實施例111至155中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1同型。 實施例157.         如實施例111所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC1包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。 實施例158.         如實施例111或157所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該LC包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。 實施例159.         如實施例111、157、或158所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。 實施例160.         如實施例111所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC1包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。 實施例161.         如實施例111或160所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該LC包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。 實施例162.         如實施例111、160、或161所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
本發明亦可由下列編號的條項來定義。 條項1.         一種三特異性抗體或其三特異性結合片段，其包含： a)第一重鏈(HC1)； b)輕鏈(LC)；及 c)第二重鏈(HC2)， 其中 (i)該HC1及該LC形成特異性結合第一抗原之第一抗原結合位點， (ii)該HC2包含特異性結合第二抗原之第二抗原結合位點， (iii)該HC1或該HC2進一步包含特異性結合第三抗原之第三抗原結合域， (iv)該HC1及HC2各包含可結晶片段(Fc)域，該可結晶片段域包含CH2-CH3域；且 其中該第一抗原係分化簇3 (CD3)，且 (v)該第二抗原係B細胞成熟抗原(BCMA)，且該第三抗原係G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)；或 (vi)該第二抗原係G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)，且該第三抗原係B細胞成熟抗原(BCMA)。 條項2.         如條項1所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2包含特異性結合該第三抗原之該第三抗原結合位點。 條項3.         如條項2所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2自N至C端包含該第二抗原結合位點、該Fc域、連接子、及該第三抗原結合位點。 條項4.         如條項1至3中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2包含特異性結合GPRC5D之第二抗原結合位點，且該HC2進一步包含特異性結合BCMA之第三抗原結合位點。 條項5.         如條項1所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC1包含特異性結合該第三抗原之該第三抗原結合位點。 條項6.         如條項5所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC1自N至C端包含與該第一抗原結合位點相關聯之重鏈可變域(VH)、CH1域、該Fc域、連接子、及該第三抗原結合位點。 條項7.         如條項1、5、及6中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2包含特異性結合BCMA之第二抗原結合位點，且該HC1進一步包含特異性結合GPRC5D之第三抗原結合位點。 條項8.         如條項1至7中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合位點包含抗原結合片段(Fab)。 條項9.         如條項1至8中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第二抗原結合位點包含單鏈可變片段(scFv)。 條項10.       如條項1至9中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合位點包含單鏈可變片段(scFv)。 條項11.       如條項1至10中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1及HC2之該等Fc域包含促進異二聚化之一或多種不同突變。 條項12.       如條項11所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC1之該Fc域包含突變T366S、L368A、及Y407V（EU編號），且該HC2之該Fc域包含突變T366W（EU編號）。 條項13.       如條項11所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2之該Fc域包含突變T366S、L368A、及Y407V（EU編號），且該HC1之該Fc域包含突變T366W（EU編號）。 條項14.       如條項1至13中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1及/或HC2之該等Fc域進一步包含減少Fc與Fcγ受體結合之一或多個突變。 條項15.       如條項14所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該Fcγ受體係FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB、FcyRIIIA、及/或FcyRIIIB。 條項16.       如條項14或15所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1及/或HC2之該等Fc域各自包含選自L234A、L235A、及D265S（EU編號）之一或多個突變。 條項17.       如條項16所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1及HC2之該等Fc域各自包含突變L234A、L235A、及D265S（EU編號）。 條項18.       如條項1至17中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1或HC2之該等Fc域進一步包含減少Fc與蛋白質A結合之一或多個突變。 條項19.       如條項18所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1或HC2之該等Fc域包含突變H435R及/或Y436F（EU編號）。 條項20.       如條項19所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中HC1之該Fc域包含突變H435R及Y436F（EU編號）。 條項21.       如條項3及5至18中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該連接子包含GGSEGKSSGSGSESKSTGGS (SEQ ID NO: 25)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ((G4S)4, SEQ ID NO: 163)之胺基酸序列。 條項22.       如條項1至21中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合CD3之該第一抗原結合位點包含：包含GDSVFNNNAAWS (SEQ ID NO: 4)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、包含RTYYRSKWLYD (SEQ ID NO: 5)之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含GYSSSFDY (SEQ ID NO: 6)之胺基酸序列之重鏈CDR3。 條項23.       如條項1至22中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合CD3之該第一抗原結合位點包含：包含TGTSSNIGTYKFVS (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、包含EVSKRPS (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含VSYAGSGTLL (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 條項24.       如條項1至23中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合CD3之該第一抗原結合位點包含重鏈可變域(VH)，該重鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。 條項25.       如條項1至24中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合CD3之該第一抗原結合位點包含輕鏈可變域(VL)，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。 條項26.       如條項1至25中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合GPRC5D之該第二或第三抗原結合位點包含：包含GFSLTNIRMSVS (SEQ ID NO: 12)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、包含HIFSNDEKS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含MRLPYGMDV (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列之重鏈CDR3。 條項27.       如條項1至26中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合GPRC5D之該第二或第三抗原結合位點包含：包含RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、包含KISNRFF (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含MQATQFPHT (SEQ ID NO: 11)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 條項28.       如條項1至27中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合GPRC5D之該第二或第三抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)。 條項29.       如條項1至28中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合GPRC5D之該第二或第三抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之輕鏈可變域(VL)。 條項30.       如條項1至29中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合BCMA之該第二或第三抗原結合位點包含：包含GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、包含AISGSGGSTY (SEQ ID NO: 21)之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含DEGYSSGHYYGMDV (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列之重鏈CDR3。 條項31.       如條項1至30中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合BCMA之該第二或第三抗原結合位點包含：包含RASQSISSSFLT (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、包含GASSRAT (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含QHYGSSPMYT (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 條項32.       如條項1至31中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合BCMA之該第二或第三抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)。 條項33.       如條項1至32中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合BCMA之該第二或第三抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之輕鏈可變域(VL)。 條項34.       如條項1至33中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合位點特異性結合至該CD3ε鏈之殘基22至35 (QDGNEEMGGITQTP (SEQ ID NO: 160))。 條項35.       如條項34所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合位點以約2.5 x10-8 M之親和力特異性結合至CD3。 條項36.       如條項34所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合位點以約3.1 x10-8 M之親和力特異性結合至CD3。 條項37.       如條項1至36中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第二或第三抗原結合位點特異性結合BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 161))。 條項38.       如條項37所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第二或第三抗原結合位點以約2.1 x10-10 M之親和力特異性結合至BCMA。 條項39.       如條項37所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第二或第三抗原結合位點以約8.4 x10-10 M之親和力特異性結合至BCMA。 條項40.       如條項1至39中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。 條項41.       如條項1至40中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其係IgG1同型。 條項42.       如條項1所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC1包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。 條項43.       如條項1或42所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該LC包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。 條項44.       如條項1、42、或43所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。 條項45.       如條項1所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC1包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。 條項46.       如條項1或45所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該LC包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。 條項47.       如條項1、45、或46所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該HC2包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。 條項48.       一種三特異性抗體或其三特異性結合片段，其包含： a)特異性結合CD3之第一抗原結合位點， b)特異性結合GPRC5D之第二抗原結合位點，及 c)特異性結合BCMA之第三抗原結合位點。 條項49.       如條項48所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合CD3之該第一抗原結合位點包含：包含GDSVFNNNAAWS (SEQ ID NO: 4)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、包含RTYYRSKWLYD (SEQ ID NO: 5)之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含GYSSSFDY (SEQ ID NO: 6)之胺基酸序列之重鏈CDR3。 條項50.       如條項48或49所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合CD3之該第一抗原結合位點包含：包含TGTSSNIGTYKFVS (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、包含EVSKRPS (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含VSYAGSGTLL (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 條項51.       如條項48至50中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合CD3之該第一抗原結合位點包含重鏈可變域(VH)，該重鏈可變域包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。 條項52.       如條項48至51中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合CD3之該第一抗原結合位點包含輕鏈可變域(VL)，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。 條項53.       如條項48至52中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合GPRC5D之該第二抗原結合位點包含：包含GFSLTNIRMSVS (SEQ ID NO: 12)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、包含HIFSNDEKS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含MRLPYGMDV (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列之重鏈CDR3。 條項54.       如條項48至53中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合GPRC5D之該第二抗原結合位點包含：包含RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、包含KISNRFF (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含MQATQFPHT (SEQ ID NO: 11)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 條項55.       如條項48至54中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合GPRC5D之該第二抗原結合位點包含重鏈可變域(VH)，該重鏈可變域包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。 條項56.       如條項48至55中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合GPRC5D之該第二抗原結合位點包含輕鏈可變域(VL)，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。 條項57.       如條項48至56中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合BCMA之該第三抗原結合位點包含：包含GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、包含AISGSGGSTY (SEQ ID NO: 21)之胺基酸序列之重鏈CDR2、及包含DEGYSSGHYYGMDV (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列之重鏈CDR3。 條項58.       如條項48至57中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合BCMA之該第三抗原結合位點包含：包含RASQSISSSFLT (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、包含GASSRAT (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及包含QHYGSSPMYT (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 條項59.       如條項48至58中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合BCMA之該第三抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)。 條項60.       如條項48至59中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中特異性結合BCMA之該第三抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之輕鏈可變域(VL)。 條項61.       如條項48至60中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合位點特異性結合至該CD3ε鏈之殘基22至35 (QDGNEEMGGITQTP (SEQ ID NO: 160))。 條項62.       如條項61所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合位點以約2.5 x10-8 M之親和力特異性結合至CD3。 條項63.       如條項61所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合位點以約3.1 x10-8 M之親和力特異性結合至CD3。 條項64.       如條項48至63中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合位點特異性結合BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 161))。 條項65.       如條項64所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合位點以約2.1 x10-10 M之親和力特異性結合至BCMA。 條項66.       如條項64所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合位點以約8.4 x10-10 M之親和力特異性結合至BCMA。 條項67.       如條項48至66中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。 條項68.       如條項48至67中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其係IgG1同型。 條項69.       一種三特異性抗體或其三特異性結合片段，其包含： a)第一重鏈(HC1)； b)輕鏈(LC)；及 c)第二重鏈(HC2)， 其中HC1包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，LC包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，且該HC2包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。 條項70.       一種三特異性抗體或其三特異性結合片段，其包含： a)第一重鏈(HC1)； b)輕鏈(LC)；及 c)第二重鏈(HC2)， 其中HC1包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，LC包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，且該HC2包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。 條項71.       一種醫藥組成物，其包含如條項1至70中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段及醫藥上可接受之載劑。 條項72.       一種細胞，其表現如條項1至70中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段。 條項73.       如條項72所述之細胞，其中該細胞係融合瘤。 條項74.       如條項72所述之細胞，其中該三特異性抗體係經重組生產。 條項75.       一種用於治療有需要之對象中癌症之方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之如條項1至70中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段或如條項71所述之醫藥組成物。 條項76.       如條項75所述之方法，其中投予該三特異性抗體或三特異性結合片段或該醫藥組成物達足以治療該癌症的時間。 條項77.       一種用於抑制癌細胞生長或增生之方法，該方法包含向該細胞投予有效量之如條項1至70中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段或如條項71所述之醫藥組成物，其中該有效量足以抑制該癌細胞之生長或增生。 條項78.       如條項77所述之方法，其中該癌細胞係在對象中並且該三特異性抗體或三特異性結合片段或該醫藥組成物係投予至該對象。 條項79.       如條項77所述之方法，其中該投予係離體進行。 條項80.       一種將有需要之對象中之T細胞重新導向BCMA及/或GPRC5D表現性癌細胞之方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之如條項1至70中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段或如條項71所述之醫藥組成物。 條項81.       如條項80所述之方法，其中該治療有效量足以將該T細胞反應導向該等癌細胞。 條項82.       如條項75至81中任一項所述之方法，其中該癌症係血液性癌症。 條項83.       如條項82所述之方法，其中該血液性癌症係BCMA及/或GPRC5D表現性B細胞癌。 條項84.       如條項83所述之方法，其中該BCMA及/或GPRC5D表現性B細胞癌係多發性骨髓瘤。 條項85.       如條項75至84中任一項所述之方法，其進一步包含投予第二治療劑。 條項86.       如條項85所述之方法，其中該第二治療劑係化學治療劑或靶向抗癌療法。 條項87.       如條項86所述之方法，其中該化學治療劑係阿糖胞苷、蒽環素、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2 (IL-2)。 條項88.       一種用於產生如條項1至70中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段之方法，其中該方法包含培養如條項72至74中任一項所述之細胞並單離該三特異性抗體或三特異性結合片段。 條項89.       一種合成性多核苷酸，其編碼如條項1至70中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段之該HC1、該LC、及/或該HC2。 條項90.       一種套組，其包含(i)如條項1至70中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段及/或如條項89所述之多核苷酸及(ii)其包裝。 條項91.       一種抗體、或其抗原結合片段，其特異性結合至BCMA，該抗體或其抗原結合片段包含：具有GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有AISGSGGSTY (SEQ ID NO: 21)之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有DEGYSSGHYYGMDV (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列的重鏈CDR3。 條項92.       如條項91所述之抗體或抗原結合片段，其進一步包含：具有RASQSISSSFLT (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有GASSRAT (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及具有QHYGSSPMYT (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。 條項93.       如條項91或92所述之抗體或抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)。 條項94.       如條項91至93中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之輕鏈可變域(VL)。 條項95.       如條項91至94中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段特異性結合BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 161))。 條項96.       如條項95所述之抗體或結合片段，其中該抗體或抗原結合片段以約2.1 x10-10 M之親和力特異性結合至BCMA。 條項97.       如條項95所述之抗體或結合片段，其中該抗體或抗原結合片段以約8.4 x10-10 M之親和力特異性結合至BCMA。 條項98.       如條項91至97中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段。 條項99.       如條項91至98中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係重組的。 條項100.     如條項91至99中任一項所述之抗原結合片段，其中該抗原結合片段係Fab片段、Fab2片段、或單鏈抗體。 條項101.     如條項91至100中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。 條項102.     如條項91至101中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其係IgG1或IgG4同型。 條項103.     一種醫藥組成物，其包含如條項91至102中任一項所述之抗體或抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。 條項104.     一種細胞，其表現如條項91至102中任一項所述之抗體或抗原結合片段。 條項105.     如條項104所述之細胞，其中該細胞係融合瘤。 條項106.     如條項104所述之細胞，其中該抗體係經重組生產。 條項107.     一種用於治療有需要之對象中癌症之方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之如條項91至102中任一項所述之抗體或抗原結合片段或如條項103所述之醫藥組成物。 條項108.     如條項107所述之方法，其中投予該抗體或抗原結合片段或該醫藥組成物達足以治療該癌症的時間。 條項109.     一種用於抑制癌細胞生長或增生之方法，該方法包含向該細胞投予有效量之如條項91至102中任一項所述之抗體或抗原結合片段或如條項103之醫藥組成物，其中該有效量足以抑制該癌細胞之生長或增生。 條項110.     如條項109之方法，其中該癌細胞係在對象中並且該抗體或抗原結合片段或該醫藥組成物係投予至該對象。 條項111.     如條項109所述之方法，其中該投予係離體進行。 條項112.     如條項107至111中任一項所述之方法，其中該癌症係血液性癌症。 條項113.     如條項112所述之方法，其中該血液性癌症係BCMA表現性B細胞癌。 條項114.     如條項113所述之方法，其中該BCMA表現性B細胞癌係多發性骨髓瘤。 條項115.     如條項107至114中任一項所述之方法，其進一步包含投予第二治療劑。 條項116.     如條項115所述之方法，其中該第二治療劑係化學治療劑或靶向抗癌療法。 條項117.     如條項116所述之方法，其中該化學治療劑係阿糖胞苷、蒽環素、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2 (IL-2)。 條項118.     一種用於產生如條項91至102中任一項所述之抗體或抗原結合片段之方法，其中該方法包含培養如條項104至106中任一項所述之細胞並單離該抗體或抗原結合片段。 條項119.     一種合成性多核苷酸，其編碼如條項91至102中任一項所述之抗體或抗原結合片段。 條項120.     一種套組，其包含(i)如條項91至102中任一者所述之抗體或抗原結合片段及/或如條項119所述之多核苷酸及(ii)其包裝。 實例
下列實例係提供用來增補前述揭露及提供對於本文中所述之申請標的之更佳理解。不應將這些實例視為限制所述之申請標的。應瞭解本文中所述之實例及實施例僅用於說明性之目的，並且根據該等實例及實施例之各式修飾或變化將為所屬領域中具有通常知識者所顯而易知且應被納入本發明之真實範疇內，而且在不偏離本發明之真實範疇下可作出這些修飾或變化。 實例1 ：目標驗證
開發BCMAx GPRC5D x CD3三特異性抗體之科學原理為有效地根除來自MM患者之骨髓及其他器官之惡性殖株漿細胞。此係透過投予三特異性抗體來達成，該抗體可同時結合至在效應T細胞上表現之TCR共受體CD3ε及在B細胞譜系細胞（大多係漿母細胞及成熟血漿細胞(8)）上表現之目標蛋白GPRC5D及BCMA。藉由使該T細胞及癌細胞接近，BCMA x GPRC5D x CD3三特異性抗體促進T細胞之活化，雖後藉由分泌的穿孔素及儲存於CTL之分泌囊泡中之顆粒酶媒介之癌細胞溶解（圖1B）。
此等方法之機械優勢(mechanistic advantage)包括其等能夠將CD3+ T細胞吸引到漿細胞附近，而無需考慮TCR特異性或依賴抗原呈現細胞表面上之主要組織相容性複合物(MHC) I類分子活化，而通過下調MHC類分子來規避基於T細胞之已知MoR療法之能力。 目標選擇 /驗證
T細胞媒介之治療方法的潛在成功依賴於在腫瘤細胞表面上發現特異性抗原的存在。在最常見的漿細胞標記物中，BCMA及GPRC5D展現出對兩個目標之選擇性表現模式及已確立之臨床概念驗證(proof of concept, PoC)。
BCMA（亦稱為CD269；基因名稱TNFRSF17）係一種20 kDa、僅在B細胞譜系上表現之I型膜蛋白，在B細胞成熟中扮演關鍵角色，且在漿細胞分化期間被選擇性地誘導(9,10)。BCMA結合2個配體：APRIL (CD256)及BAFF (CD257; 11)。BCMA受體係具有54個胺基酸細胞外域之184個胺基酸蛋白質。除了在細胞表面上表現外，BCMA在跨膜域藉由γ分泌酶活性切割，產生~6 kDa的可溶性BCMA蛋白片段(12)。在MM患者血清樣本(13)中測量高水平之可溶性BCMA並與血漿細胞計數(14)相關。γ分泌酶之抑制導致人類初級B細胞(12)及MM細胞系及骨髓單核細胞(13)中之BCMA表面蛋白表現顯著增加。BCMA已被確立為MM中之經驗證目標，具有數個經核准之治療劑(15-17)。
GPRC5D係一種基於序列同源評分而分類為C型G蛋白偶聯受體(GPCR)之7次跨膜受體蛋白。GPRC5D係一種孤兒受體，其配體及信號傳導機制尚未確定。GPRC5D受體係具有典型7次跨膜結構之354個胺基酸蛋白質，不同於其他家族成員(18)，其具有一個短的27個胺基酸N端。GPRC5D mRNA主要在具有漿細胞表型之細胞中表現，並且亦在具有MM (19-23)之對象之所有惡性血漿細胞中表現。患有MM之對象之GPRC5D表現的水平與血漿細胞負荷及基因畸變（諸如Rb-1缺失(19)）密切相關。 目標表現
BCMA及GPRC5D mRNA及蛋白質表現受限於有限的細胞類型。BCMA在成熟B細胞及血漿細胞上表現，而GPRC5D表現進一步僅限於免疫細胞上的漿細胞表型。除了免疫細胞表現外，GPRC5D mRNA在硬角質組織中表現。相較於正常健康對象CD138 +細胞，來自骨髓瘤患者之骨髓CD138 +細胞上之GPRC5D mRNA水平提高，並且BCMA之高mRNA水平大部分受限於包括漿細胞之成熟B細胞(10,13,19,21-26)。正常組織中之BCMA (13,25)及GPRC5D (19,21,22)蛋白質表現主要在漿細胞中藉由免疫組織化學(IHC)染色發現。此外，亦在硬角質組織（諸如毛囊(27)）中偵測到GPRC5D表現。MM患者骨髓單核細胞在BCMA及GPRC5D表現方面展現殖株異質性(21,22)。詳細的目標表現概況描述於實施例2中。
重要的是，BCMA及GPRC5D在MM來源之CD138 +骨髓細胞上之選擇性表現及其對中靶/脫腫瘤(on-target/off-tumor)毒性之低風險將其等指定為T細胞媒介之治療劑之潛在目標(10,13,20-22)。 實例2 ：BGCB463 三特異性抗體之分子設計、序列、及結構
BGCB463係一種免疫球蛋白(Ig) G1三特異性抗體，其可同時地或個別地結合至T淋巴細胞（T細胞）上之分化簇3受體複合物(CD3ɛ)之表位次單元、及GPRC5D（G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D）及腫瘤細胞上之BCMA（B細胞成熟抗原，TNFRSF17）。該抗體在恆定區(Fc)中具有L234A、L235A、及D265S之突變（根據EU編號）以消除與Fc受體之交互作用，並且已使用鈕扣平台突變增強異二聚化。抗CD3ɛ「孔」鏈亦包含「RF」突變（H435R，Y436F；根據EU編號）以破壞單體及同二聚化孔鏈之蛋白質A結合。分子包含「孔，RF」鏈上之抗CD3ɛ Fab區及「鈕」鏈上之抗GPRC5D scFv v-區。開發該三特異性抗體以評估靶向GPRC5D及BCMA及CD3之雙腫瘤對T細胞重新導向之治療潛力。BGCB463之繪示描繪於圖1A中。
該三特異性BGCB463抗體係藉由該抗CD3重鏈(HC) A及輕鏈(LC)與該抗GPRC5D、抗BCMA重鏈B共表現所產生。該抗CD3可變區係藉由用重組CD3ε蛋白對人化大鼠[OmniRat (OMT TM)]進行免疫基因轉殖所發現。在BGCB463中特徵化之該抗GPRC5D可變區(VR000038761)係衍生自mAb GC5B680，其係藉由用編碼GPRC5D之DNA對人化小鼠[Ablexis]進行免疫基因轉殖所發現。親本v-區(VR000029832)在該HC框架3區中含有「NSS」模體，其呈現出N-連接醣基化之風險且其表示來自IGHV2-26*01生殖系之突變。將位點突變回生殖系序列「STS」以消除N-連接醣基化之風險，並且此改變導致最終的可變區VR000038761。在BGCB463中特徵化之該抗BCMA可變區(VR000003260)係衍生自mAb BCMB519，其係藉由用重組BCMA蛋白對人化小鼠[Ablexis]進行免疫基因轉殖所發現。對此v-區沒有進行進一步修改。在最終分子中，該等抗GPRC5D及抗BCMA v-區兩者均經格式化為單鏈可變片段(scFv)。
如由BGCB463之cDNA序列所推導，並藉由肽映射及質譜法確認BGCB463重鏈及輕鏈之胺基酸序列如下所示（表5）。在各鏈中，根據ABM編號定義3個互補決定區(CDR)，以粗體及劃底線表示。BGCB463重鏈1之位置1處之Gln殘基、BGCB463輕鏈之位置1處之Gln殘基、及BGCB463重鏈2之位置1之Asp構成該等成熟鏈之N端。包含BGCB463 IgG1 AAS之兩條重鏈皆具有以下點突變：L234A、L235A、及D265S。來自BGCB463之重鏈1特徵在於「孔」突變：T366S、L368A、Y407V，及該RF突變：H435R、Y436F，而重鏈2特徵在於「鈕」突變：T366W。鈕扣突變促進該Fc之異二聚化。「RF」突變破壞與蛋白質A之結合。FcγR受體靜默(AAS)之突變及鈕扣突變在以下序列中劃底線。 表5. BGCB463 之胺基酸序列
區域 AA序列 SEQ ID NO.
輕鏈1 QSALTQPASV SGSPGQSITI SC TGTSSNIG TYKFVS WYQQ HPDKAPKVLL Y EVSKRPS GV SSRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDQADYHC VSYAGSGTLL FGGGTKLTVL GQPKAAPSVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV AWKADSSPVK AGVETTTPSK QSNNKYAASS YLSLTPEQWK SHRSYSCQVT HEGSTVEKTV APTECS 27
重鏈1 QVQLQQSGPR LVRPSQTLSL TCAIS GDSVF NNNAAWS WIR QSPSRGLEWL G RTYYRSKWL YD YAVSVKSR ITVNPDTSRN QFTLQLNSVT PEDTALYYCA R GYSSSFDY W GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPE AAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVV SVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSL SC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFL VSKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNRFT QKSLSLSPGK 26
重鏈2 DIVMTQTPLS SPVTLGQPAS ISC RSSQSLV HSDGNTYLS W LQQRPGQPPR LLIY KISNRF F GVPDRFSGS GAGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC MQATQFP HT FGQGTKLE IKGGSEGKSS GSGSESKSTG GSQVTLKESG PVLVKPTETL TLTCTVS GFS LTNIRMSVS W IRQPPGKALE WLA HIFSNDE KS YSTSLKSR LTISRDTSKS QVVLTLTNVD PVDTATYYCA R MRLPYGMDV WGQGTTVTVS SEPKSSDKTH TCPPCPAPE A AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV SVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS L WCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGKGGSEGKS SGSGSESKST GGSEIVLTQS PGTLSLSPGE RATLSC RASQ SISSSFLT WY QQKPGQAPRL LIY GASSRAT GIPDRFSGGG SGTDFTLTIS RLEPEDFAVY YC QHYGSSPM YT FGQGTKLE IKGGSEGKSS GSGSESKSTG GSEVQLLESG GGLVQPGGSL RLSCAAS GFT FSSYAMS WVR QAPGKGLEWV S AISGSGGST Y YADSVKGRF TISRDNSKNT LYLQMNSLRA EDTAVYYCAK DEGYSSGHYY GMDV WGQGTT VTVSS 28
實例3 ：BGCB463 三特異性抗體之免疫原性風險評估
使用來自EpiVax Epimatrix電腦模擬之免疫原性預測程式之T調節(T reg)調整評分來分析該三特異性抗體序列之潛在免疫原性（表6）。EpiVax程式化計算基本上計算與「超類型」之各者內最常見的HLA分子之結合潛力。報告提供的結果代表＞90%的全球人類群體，而無需個別地測試各單倍型。EpiVax評分係藉由聚集在給定蛋白質序列內所含有之所有預測的T細胞表位之EpiMatrix評分並調整預期的T細胞表位含量及蛋白質長度來計算。Epivax評分解釋如下：EpiVax評分＜ -20係「理想」；EpiVax評分-20至+20係「可接受」；且EpiVax評分＞ +20係「不可接受」。 表6 ：BGCB463 之免疫原性評估
BGCB463 鏈資訊 可變區之胺基酸序列 SEQ ID NO. EpiVax 評分 EpiVax 評分解釋
輕鏈1 (CD3B376) VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVL 7 -44.88 理想
重鏈1 (CD3B376) VH QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSS 8 +65.28 不可接受
重鏈2 N端scFv (GC5B680 N68S, S69T) VL DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYKISNRFFGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQATQFPHTFGQGTKLEIK 15 -3.12 可接受
重鏈2 N端scFv (GC5B680 N68S, S69T) VH QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLTNIRMSVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISRDTSKSQVVLTLTNVDPVDTATYYCARMRLPYGMDVWGQGTTVTVSS 16 -11.65 可接受
重鏈2 C端scFv (BCMB519) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGGGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSPMYTFGQGTKLEIK 23 -52.88 理想
重鏈2 C端scFv (BCMB519) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDEGYSSGHYYGMDVWGQGTTVTVSS 24 -54.35 理想
實例4 ：BGCB463 三特異性抗體之結合特性第1部分.材料及方法 細胞系
評估GPRC5D及BCMA結合特性之細胞系係多發性骨髓瘤衍生之H929及MM.1R。另外，產生了CRISPR剔除的H929套件（H929-GPRC5D-KO單株系D11）、H929-BCMA-KO、及H929-GPRC5D/BCMA-KO。亦開發類似的MM.1R剔除以用於評估GPRC5D及BCMA結合。所有系均來源於內部(ABS)，並用完全RPMI培養基培養，該培養基包含RPMI 1640培養基、GlutaMAX™補充劑、HEPES、熱失活的(HI) FBS、非必需胺基酸(NEAA)、丙酮酸鈉、及2-ME（全部為ThermoFisher）。
使用過表現人類GPRC5D（單株H1B5）及人類BCMA（單株H1/B5）之K562單株細胞系。此外，使用表現食蟹獼猴GPRC5D及食蟹獼猴BCMA之K562-Fluc-GFP細胞（單株M1C11）。將兩種細胞系皆維持在IMDM、10% FBS、2 mM麩醯胺酸、及2 mg/mL G418（全部為ThermoFisher）中。 藉由 FACS結合之細胞
BGCB463.003及BGCB463.004、或B23B251（IgG1-AAS同型對照）用作未經標記分子或直接與Alexa Fluor 647偶聯。BGCB463.003藉由瞬時轉染來表現，而BGCB463.004則自穩定的轉染池表現。
對於BGCB463與人類及食蟹獼猴泛T細胞之結合，選擇三種人類供體(Hemacare)，快速解凍、再懸浮，並將其以1x10 6個細胞/mL等分至96孔盤中。然後洗滌細胞，必要時阻斷Fc (Innovex)，並用活性染料(Invitrogen)染色。BGCB463及其對應同型（B23B251）在完全培養基中稀釋至2 µM之初始濃度，對劑量反應曲線執行1:3連續稀釋，一式兩份。將細胞與分子在4℃或37℃下一起培養1小時。必要時，亦如上文所述用90%類血清(Sigma)執行培養。
為了判定來自可溶性BCMA (sBCMA)之潛在干擾，從BDS（1個池）獲得已知濃度之患者血清，並用BGCB463及H929細胞培養。對於培養，用正常血清將患者血清稀釋至檢定sBCMA，同時維持90%總人類血清。
利用ForeCyt軟體，對單態活群體進行門控，並對各樣本計算AlexaFluor 647通道之中值螢光強度(MFI)。將原始數據輸出至Excel (Office 365, Microsoft)，將重複數據平均，並在Prism軟體(v. 8.0, Graphpad)中進一步分析。需要時，減去同型背景。在本文中，對各供體之各分子計算劑量反應曲線圖及EC 50。最後，計算各個各別物種之所有三個供體之平均值以獲得該等物種之平均EC 50。 時程結合
評估GPRC5D及BCMA時程動力學結合之細胞系係上文所提及之H929及MM.1R KO套件。BGCB463與上述細胞系結合的FACS分析基於1小時37℃結合之劑量-反應曲線在不同的最終濃度下進行，使得濃度之至少一者接近接近EC 50。選擇三個具有5倍差異的最終濃度，所有都經過1小時、3小時、5小時、及24小時的培養。在37℃下評估完全RPMI中的BGCB463結合。
首先將BGCB463或伴隨的B23B251同型對照在完全RPMI中以2X濃度稀釋，並在37℃下培養。接著，獲取細胞並使用Vi-Cell XR (Beckman Coulter)計數，然後將其添加至主要深孔盤中以產生每個時間點~1E5個細胞。在各時間點，移除細胞並轉移至含有冷FACS緩衝液（含有0.2% BSA (BD) + 2 mM EDTA (ThermoFisher)之染色緩衝液）之圓底96孔盤中。然後藉由離心（1200 RPM，5分鐘）將盤洗滌三至四次，接著進行緩衝液抽吸。在用FACS緩衝液再洗滌兩次後，將細胞在冰上用Alexa Fluor 647山羊抗人類IgG1 (H+L) (Jackson Immuno)染色30分鐘。在培養之後，將細胞用冷的FACS緩衝液再洗滌三次，然後再懸浮於含有Sytox Green之FACS緩衝液中以標記所有死細胞(ThermoFisher)。然後在染色後三小時內在Intellicyt iQue Screener Plus (Sartorius)上運行盤。 使用 Incucyte活細胞成像之 T細胞活化及殺滅檢定
為了判定測試分子對T細胞活化及腫瘤細胞之殺滅潛力的影響，使用Incucyte活細胞成像系統(Sartorious)。內部所產生之H929-Fluc-GFP細胞系用作人類供體泛T細胞之目標細胞(Hemacare)。將檢定以1:1、3:1、及5:1之T細胞與目標比設置在96孔盤中，經過多次實驗。在40nM或10nM之起始濃度下添加測試分子（BGCB463及B23B251）且在完全培養基中以1:4連續稀釋。最少以一式兩份測試所有分子。用抗人類CD25-Alexa Fluor 647 (Biolegend)監測T細胞活化狀態的偵測。將盤中之細胞標準化為溫度，然後置入包含在37℃培養箱內之Incucyte（模型S3）活細胞成像系統中。在相位、綠色、及紅色通道中以每孔四個影像每3小時捕獲一次，達大約5天。使用樣本影像，在Incucyte分析軟體(Sartorious, v.2019B Rev2)中建立分析定義以產生綠色（目標細胞）之目標計數及紅色（活化的T細胞）通道之計數或總積分強度。
使用來自Incucyte軟體分析所產生之綠色通道（目標細胞）的原始計數，使用以下原始數據公式，針對對應盤上所有未經處理的孔之平均值計算各濃度及時間點之目標細胞溶解百分比，匯出至Excel (Microsoft, Office 365)： (100-(GPRC5D測試濃度 /未經處理之平均值 ) x 100)。
為了自動化，使用由Data Sciences開發之Shiny Application應用程式將原始數據進行轉換及傳輸，以快速計算數據並轉移至Prism軟體中，其中呈現數據之圖形表示。一旦轉移至Prism軟體(Graphpad Software, v.8.0.0)中，繪製數據並計算平均值的標準誤差以及細胞溶解及T細胞活化隨時間之曲線。對於T細胞活化，使用來自紅色通道(CD25-AF647)複製物之原始計數或總積分強度，並在Prism軟體中進一步繪圖以產生劑量反應及活化圖。 第2部分.結果 T細胞及細胞系劑量反應結合
首先，藉由使用4參數擬合在37℃下1小時自劑量反應曲線測量有效濃度(EC)範圍，判定三特異性分子之GPRC5D及BCMA結合臂的基於FACS之結合。此係使用細胞的H929套件（WT、GPRC5D-KO、BCMA-KO、及GPRC5D/BCMA KO）、及類似的MM.1R套件來評估。對於WT H929（圖2A至圖2D，表7），基於細胞之EC 50大約為13nM，且對於WT MM.1R為2.4nM（圖3A至圖3D，表8）。觀察到明顯的親留力影響，因為在測試目標結合臂的單價結合之GPRC5D-KO及BCMA-KO系中之EC 50及Bmax皆降低（表7）。接著，使用來自三個隨機供體之純化的泛T細胞來判定CD3結合Fab臂之基於細胞之EC 50。如圖4A至圖4C中所示，對於CD3B376 (BGCB463)臂之基於細胞之EC 50係大約329nM（表9）。接著，在4℃下評估劑量反應性結合以移除任何潛在生物效應。如圖5A至圖5C所示，相較於37℃，結合在4℃下更強（50至100nM），其可能指示內化。此外，將BGCB463的兩個表現批次（來自瞬時轉染之BGCB463.003及來自穩定的轉染池之BGCB463.004）與H929、MM.1R、及泛T細胞的結合直接比較，沒有發現差異（圖6A至圖6C）。 表7 ：基於H929 套件細胞之有效濃度
EC 50(nM) H929 H929 GPRC5D KO H929 BCMA KO EC 90(nM) H929 H929 GPRC5D KO H929 BCMA KO
運行1 14.0 106.4 195.4 運行1 240.1 722.6 1861.4
運行2 8.3 63.9 128.8 運行2 356.2 200.3 871.8
運行3 28.7 220.8 65.2 運行3 45776.5 1996.4 1237.5
運行4 無擬合 無擬合 無擬合 運行4 無擬合 無擬合 無擬合
運行5 2.4 456.8 48.8 運行5 9450.2 4130.3 281.2
平均 13.3 212.0 109.5 平均 13955.7 1762.4 1063.0
表8 ：基於MM.1R 套件細胞之有效濃度
EC 50(nM) MM.1R MM.1R GPRC5D KO MM.1R BCMA KO EC 90(nM) MM.1R MM.1R GPRC5D KO MM.1R BCMA KO
運行1 3.2 無擬合 無擬合 運行1 128.1 無擬合 無擬合
運行2 1.2 無擬合 16.6 運行2 13.9 無擬合 198.7
運行3 3.4 141.6 35.3 運行3 75.5 2070.4 969.9
運行4 1.6 489.9 7.2 運行4 8.6 8298.7 38.2
平均 2.4 315.8 19.7 平均 56.5 5184.5 402.2
表9 ：基於T 細胞之有效濃度
EC 50(nM) 捐贈者1 捐贈者2 捐贈者3 EC 90(nM) 捐贈者1 捐贈者2 捐贈者3
運行1 769.8 572.5 548.9 運行1 10735.6 7046.4 6008.2
運行2 無擬合 無擬合 無擬合 運行2 無擬合 無擬合 無擬合
運行3 293.1 261.9 359.9 運行3 2864.8 2267.3 4148.3
運行4 209.9 192.1 254.8 運行4 1698.0 1418.4 2173.5
運行5 102.6 132.4 250.7 運行5 493 860 2600
平均 343.9 289.7 353.6 平均 3947.9 2898.0 3732.5
總平均 329.1 總平均 3526.1
時程結合
接著，藉由評估在該等細胞之H929及MM.1R KO套件上的時程動力學FACS結合來判定BGCB463的表面穩定性。如圖7A至圖7D中所示，H929細胞上的結合動力學在24小時內係穩定的。此外，相較於在單一KO中所評估之單價結合臂，三特異性分子之二價結合具有較強的信號，這如同上文一樣與可能的親留力效應一致。此等結果反映在MM.1R套件中（圖8A至圖8D）。 物種 /異種同源物交叉反應性
亦使用基於FACS之細胞結合在37℃下1小時來剖析兩個目標結合scFv臂對食蟹獼猴之交叉反應性。為此，使用穩定表現人類及食蟹獼猴GPRC5D或BCMA之K562細胞。如圖9A至圖9E中所示，GC5B680 scFv臂之基於細胞的EC 50對於人類GPRC5D係大約30nM，並在食蟹獼猴GPRC5D上在約400nM時約弱10倍。相比之下，BCMB519 scFv臂之基於細胞的EC 50對於人類BCMA係大約145nM，而在高達2 µM時與食蟹獼猴BCMA沒有可偵測的結合。
為了進一步判定食蟹獼猴交叉反應性，用於結合之K562細胞亦用於與人類泛T細胞之細胞毒性。如圖10A及圖10B中所示，相較於人類GPRC5D，對食蟹獼猴GPRC5D的較弱結合與較弱的細胞毒性及對應的較低T細胞活化與表現食蟹獼猴GPRC5D之K562相關。在人類及食蟹獼猴BCMA中觀察到類似的模式，然而，T細胞對食蟹獼猴BCMA基本上沒有反應。 90%人類血清中之結合
為了更好地理解體內之結合，在90%人類血清存在下，在37℃下評估結合達1小時。用H929細胞測試該GPRC5D及BCMA結合scFv臂（圖11），而用人類泛T細胞測試該CD3結合Fab（圖12）。在兩種細胞類型中，BGCB463結合不受血清存在影響。 時程細胞毒性
為了評估體外殺滅動力學，使用Incucyte（一種基於影像之平台）獲取動力學殺滅數據。相較於標準的基於FACS之終點檢定，追蹤隨時間推移之目標細胞殺滅及T細胞活化，給出更詳細及定性之細胞毒性活性讀數。如圖13A及圖13B中所示，除了以3:1 E:TT比測試的最低濃度(1pM)以外，BGCB463在72小時左右在所有濃度下均達到顯著的最大殺滅。為了擴展這些數據，亦測試了5:1 E:T及1:1 E:T比（圖14A至圖14F）。在5:1 E:T時，所有測試的濃度在48至72小時達到最大殺滅，其中最大殺滅之時間與濃度成反比。在1:1 E:T時，所有濃度亦獲得最大殺滅，但在較晚時間點具有相同濃度依賴性。 使用患者血清之 sBCMA結合干擾
對可溶性BCMA (sBCMA)之潛在干擾進行評估對於支持模型化及MABEL劑量預測係必要的。選擇患者血清作為可溶性BCMA的生理來源，並藉由在正常血清中稀釋進行檢定。如圖15A至圖15D中所示，即使是最高水平的613 ng/mL也不影響BGCB463與H929細胞的結合。此為具有不同水平的sBCMA之所有患者血清的情況。 第3部分.討論及結論
給定面板之時間過程結合的目的係判定分子在給定時間內在細胞表面上是否穩定，但需要注意的是，這種方法無法區分內化與表面染色。BGCB463在該等細胞之H929及MM.1R KO套件上測試的所有濃度下均維持穩定的或增加的信號。因此，BGCB463穩定地呈現在血液細胞目標的表面上。
亦測量BGCB463與食蟹獼猴BCMA及GPRC5D之交叉反應性。與細胞毒性相對應的人類相比，食蟹獼猴上的GPRC5D結合弱約10倍。另一方面，BCMA結合在至多2 µM時不具有交叉反應，其與觀察到無功能活性相關。
利用時程細胞毒性來評估殺滅動力學並對BGCB463如何介導T細胞重新導向給出更詳細的視圖。觀察到隨著時間接近最大細胞溶解之殺滅取決於分子的濃度及E:T比兩者。
由於BCMA以可溶形式存在並且在患者中升高，因此在具有不同sBCMA水平的患者血清存在下評估結合係非常關鍵的。數據所示，sBCMA不干擾BGCB463與H929細胞上表面BCMA之結合。 實例5 ：BGCB463 三特異性抗體之生物物理評估
執行BGCB463之生物物理評估之範圍，包括結合、蛋白質特性、2週高濃度穩定性、及化學和物理穩定性。評估之列表及其結果顯示於表10中。 表10 ：BGCB463 之生物物理評估及結果
mAb TMP 特性 結果 註解
人類CD3臂之結合親和力 (SPR) KD = 3.1E-8 M 抗原：重組CD3δε異二聚體建構體 N/A
人類BCMA臂之結合親和力 (SPR) KD = 8.4E-10 M 抗原：BCMW37 N/A
Fcγ受體結合(SPR) 與人類FcγR1、FcγRIIIa V158、FcγRIIIa F158、FcγRIIa、或FcγRIIb無可測量之結合。 與食蟹獼猴FcγR1、FcγRIII、FcγRIIa、或FcγRIIb無可測量之結合 確認的靜默Fc設計
FcRn結合(SPR) pH 6.0： hFcRn KD = 954 nM cyFcRn KD = 826 nM 相對於pH 6.0，在pH 7.4下解離更快 N/A
血清干擾 (Octet) 50%人類血清中之締合速率無顯著變化 k a緩衝液/ k a血清= 1.6 - BCMA k a緩衝液/ k a血清= 1.0 - CD3 N/A
GPRC5D結合表位 未判定 N/A
CD3結合表位 涵蓋CD3ε鏈之殘基22至35 (QDGNEEMGGITQTP (SEQ ID NO: 161))之線性表位 藉由HDX-MS判定親本抗體CD3B376針對CD3εγ之表位序列
BCMA結合表位 涵蓋BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 162))之線性表位 HDX-MS數據顯示殘基17至18及21至26係由BGCB465保護。
完整的Ab質量，釋放 （質譜法） 156,431.5 Da N/A
醣型概況（質譜法） 具有主要醣型G0F/G0F之一般IgG1概況 N/A
同二聚體之水平 （質譜法） 未偵測到HD1 & HD2 N/A
其他產物相關雜質之水平 （質譜法） 在AA 486至495之間對HC2 (BCMA scFv)進行輕微切割。CD3 LC及CD3臂之組合VH+CH1 (pQ1-S222)的輕微損失。 N/A
N連接gly（非Fc） （質譜法） 未預測或觀察到 N/A
O連接gly位點 （質譜法） 未觀察到 N/A
醣化（相對豐度%） （質譜法） HC1 (CD3) - 9.5%, LC1 (CD3) - 6.4%, HC2 (GPRC5D x BCMA) - 7.5% 由於由非零基線導致的高估，醣化值代表上限
游離Cys （質譜法） 未預測或觀察到 N/A
N端延長/截短 （質譜法） 未觀察到 N/A
構形穩定性 (DSC) Tm 1= 63.2℃ Tm 2= 68.0℃ Tm 3= 72.2℃ 在10 mM組胺酸pH 6.5中測量
純度%（2步驟純化） (AUC) 96.39%單體 在10 mM組胺酸pH 6.4中測量
血清穩定性 (SEC-FDS) 在t 0時，人類血清中聚集增加3.7%，在37℃下在人類血清中2天之後聚集增加1.2%。 使用經Alexa488標記之GPRC5DxCD3藉由粒徑篩析層析法評估
IgG交互作用 (SPR) 未觀察到IgG交互作用 N/A
非特異性結合 未觀察到非特異性結合 N/A
等電點 (cIEF) pI = 9.51 酸性/主要/鹼性峰面積%：44.8/54.9/0.3 N/A
相對疏水性(aHIC) 低表面疏水性（疏水性指數＜ 0.6），具有寬峰 N/A
黏度 5.48 cP 在10 mM組胺酸pH 6.5中以150 mg/mL判定
在組胺酸緩衝液pH 6.5中之可濃縮性及回收率% 將樣本濃縮至176.5 mg/mL，回收率89.4% N/A
單體%（初始） (AUC) 96.6% 在組胺酸pH 6.5中判定
單體% 2週，4℃ (AUC) 84.7% 在組胺酸pH 6.5中判定
單體% 2週，40℃ (AUC) 66.3% 在組胺酸pH 6.5中判定
強制降解之後的完整MS （質譜法） 所有應力樣本均符合預期質量。 高pH應力導致輕微的BCMA scFv切割連同CD3 LC的輕微損失。 化學氧化處理造成在HC2 (scFv)臂上至多3次氧化及在CD3 HC上至多2次氧化。 無
強制降解之後的尺寸 (aSEC) 在生理（2週37C）及氧化壓力之後，樣本維持＞ 98%單體； 在pH 8.5、5、及3.5應力之後的樣本顯示89至91%單體； 在40℃下2週之後，高濃度樣本顯示HMW顯著增加，僅具有63%單體。 隨著時間的推移，高濃度聚集的增加很明顯，並且需要進行後續配方研究以減輕聚集傾向
強制降解的純度 （R及NR GXII） NR GXII：所有應力樣本維持≥99%單體，生理（2週37C）(97%)、高濃度40C 2週(95.9%)、及高pH (76.1%)樣本除外。 GXII降低：所有應力樣本維持≥99%單體，40C 2週(97.9%)及高pH (89.7%)除外。 無
強制降解之後的結合親和力 (SPR) 在所有測試之應力條件下保留對CD3之親和力。 在所有測試之應力條件下，對BCMA之親和力在KD及活性物質%之誤差範圍內。 N/A
基礎氧化水平 6.8%於M94 (GC5B680 scFv LCDR3)中 4.7%於M232 (GC5B680 scFv HCDR3)中 對於所有其他CDR殘基＜1% 無
Met/Trp（氧化壓力改變） 68.1%於M94 (GC5B680 scFv LCDR3)中 15.1%於M232 (GC5B680 scFv HCDR3)中 67.9%於M600 (BCMB519 scFv LCDR3)中 無
基礎脫醯胺水平 CDR中＜ 1% 無
脫醯胺位點（應力改變） 無顯著變化 無
基礎異構化水平 CDR中＜ 1% 無
異構化位點（應力改變） HC-CDR1 CD3B2186中之20% D27異構化 注意：在所有CD3B376候選者中均觀察到在pH應力下之D27異構化，並且認為不影響活性。
實例6 ：BGCB491 三特異性抗體之分子設計、序列、及結構
BGCB491係一種免疫球蛋白(Ig) G1三特異性抗體，其可同時地或獨立地結合至T淋巴細胞（T細胞）上之分化簇3受體複合物(CD3ɛ) (Uniprot ID: P07766)、及GPRC5D（G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D，Uniprot ID: Q9NZD1）及腫瘤細胞上之BCMA（B細胞成熟抗原，TNFRSF17，Uniprot ID: Q02223）。該抗體特徵在於恆定區(Fc)中之L234A、L235A、及D265S之突變以消除與Fc受體之交互作用，並且使用鈕扣平台突變增強異二聚化 1。該抗CD3ɛ「孔」鏈亦特徵「RF」突變(H435R, Y436F)以破壞單體及同二聚化孔鏈之蛋白質A結合 2。該分子包含「孔，RF」鏈上之抗CD3ɛ Fab區及融合至C端上之抗GPRC5D scFv v-區。「鈕」鏈特徵在於抗BCMA scFv。開發該三特異性抗體以評估靶向GPRC5D及BCMA及CD3之雙腫瘤對T細胞重新導向之治療潛力。BGCB491之繪示描繪於圖16中。
該三特異性BGCB491抗體係藉由融合至C端抗GPRC5D scFv之抗CD3重鏈(HC) A及抗CD3輕鏈(LC)與融合至含有重鏈B之「鈕(knob)」之抗BCMA scFv共表現所產生。該抗CD3可變區(VR000017350)係藉由用重組CD3ε蛋白對人化大鼠[OmniRat (OMT TM)]進行免疫基因轉殖所發現。在BGCB491中特徵化之該抗GPRC5d可變區(VR000038761)係衍生自mAb GC5B680，其係藉由用編碼GPRC5d之DNA對人化小鼠[Ablexis]進行免疫基因轉殖所發現。親本v-區(VR000029832)在該HC框架3區中含有「NSS」模體，其呈現出N-連接醣基化之風險且其表示來自IGHV2-26*01生殖系之突變。將位點突變回生殖系序列「STS」以消除N-連接醣基化之風險，並且此改變導致最終的可變區VR000038761。在BGCB491中特徵化之該抗BCMA可變區(VR000003260)係衍生自mAb BCMB519，其係藉由用重組BCMA蛋白對人化小鼠[Ablexis]進行免疫基因轉殖所發現。對此v-區沒有進行進一步修改。在最終分子中，該等抗GPRC5D及抗BCMA v-區兩者均經格式化為單鏈可變片段(scFv)。
如由BGCB491之cDNA序列（SEQ ID No: 165、166、及167）所推導，並藉由肽映射及質譜法確認BGCB491重鏈及輕鏈之胺基酸序列如下所示（表11）。在各鏈中，根據ABM編號定義3個互補決定區(CDR)，以粗體及劃底線表示。BGCB491重鏈1之位置1處之Gln殘基、BGCB491輕鏈之位置1處之Gln殘基、及BGCB491重鏈2之位置1之Glu殘基構成該等成熟鏈之N端。包含BGCB491 IgG1 AAS之兩條重鏈皆具有以下點突變：L234A、L235A、及D265S。來自BGCB491之重鏈1特徵在於「孔」突變：T366S、L368A、Y407V，及該RF突變：H435R、Y436F，而重鏈2特徵在於「鈕」突變：T366W。鈕扣突變促進該Fc之異二聚化 3。「RF」突變破壞與蛋白質A之結合。FcγR受體靜默(AAS)之突變及鈕扣突變在以下序列中劃底線。 表11. BGCB491 之胺基酸序列
區域 AA序列 SEQ ID NO.
輕鏈1 QSALTQPASV SGSPGQSITI SC TGTSSNIG TYKFVS WYQQ HPDKAPKVLL Y EVSKRPS GV SSRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDQADYHC VSYAGSGTLL FGGGTKLTVL GQPKAAPSVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV AWKADSSPVK AGVETTTPSK QSNNKYAASS YLSLTPEQWK SHRSYSCQVT HEGSTVEKTV APTECS 30
重鏈1 QVQLQQSGPR LVRPSQTLSL TCAIS GDSVF NNNAAWS WIR QSPSRGLEWL G RTYYRSKWL YD YAVSVKSR ITVNPDTSRN QFTLQLNSVT PEDTALYYCA R GYSSSFDY W GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPE AAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVV SVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSL SC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFL VSKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNRFT QKSLSLSPGK GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS DIVMTQTPLS SPVTLGQPAS ISC RSSQSLV HSDGNTYLS W LQQRPGQPPR LLIY KISNRF F GVPDRFSGS GAGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC MQATQFP HTF GQGTKLE IKGGSEGKSS GSGSESKSTG GSQVTLKESG PVLVKPTETL TLTCTVS GFS LTNIRMSVS W IRQPPGKALE WLA HIFSNDE KS YSTSLKSR LTISRDTSKS QVVLTLTNVD PVDTATYYCA R MRLPYGMDV WGQGTTVTVS S 29
重鏈2 EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSC RASQSIS SSFLTW YQQK PGQAPRLLIY GASSRAT GIP DRFSGGGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC Q HYGSSPMYT F GQGTKLEIKG GSEGKSSGSG SESKSTGGSE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAAS GFTFSS YAMS WVRQAP GKGLEWVS AI SGSGGSTY YA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAK DEG YSSGHYYGMD V WGQGTTVTV SSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV V SVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SL WCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK 31
實例7 ：BGCB491 三特異性抗體之免疫原性風險評估
使用來自EpiVax Epimatrix電腦模擬之免疫原性預測程式 4之T調節(T reg)調整評分來分析該三特異性抗體序列之潛在免疫原性（表12）。EpiVax程式化計算基本上計算與「超類型」之各者內最常見的HLA分子之結合潛力。報告提供的結果代表＞90%的全球人類群體，而無需個別地測試各單倍型。EpiVax評分係藉由聚集在給定蛋白質序列內所含有之所有預測的T細胞表位之EpiMatrix評分並調整預期的T細胞表位含量及蛋白質長度來計算。EpiVax評分解釋如下：EpiVax評分＜ -20係「理想」；EpiVax評分-20至+20係「可接受」；且EpiVax評分＞ +20係「不可接受」。 表12 ：BGCB491 之免疫原性評估
BGCB491 鏈資訊 可變區之胺基酸序列 SEQ ID NO. EpiVax 評分 EpiVax 評分解釋
輕鏈1 (CD3B376) VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVL 7 -44.88 理想
重鏈1 (CD3B376) VH QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSS 8 +65.28 不可接受
重鏈2 N端 scFv (GC5B680 N68S, S69T) VL DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYKISNRFFGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQATQFPHTFGQGTKLEIK 15 -3.12 可接受
重鏈2 N端 scFv (GC5B680 N68S, S69T) VH QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLTNIRMSVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISRDTSKSQVVLTLTNVDPVDTATYYCARMRLPYGMDVWGQGTTVTVSS 16 -11.65 可接受
重鏈2 C端 scFv (BCMB519) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGGGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSPMYTFGQGTKLEIK 23 -52.88 理想
重鏈2 C端 scFv (BCMB519) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDEGYSSGHYYGMDVWGQGTTVTVSS 24 -54.35 理想
實例8 ：三特異性抗體比較研究
如上所述，BGCB463及BGCB491在以下一系列研究中進行測試。 三特異性抗體僅介導目標陽性細胞之殺滅
針對BCMA +GPRC5D +細胞（圖17A）及BCMA -GPRC5D -細胞（圖17B）測試BGCB463、BGCB491、及三個對照組（BGCB4821（CD3x空x空））、BGCB483（CD3x空xBCMA）、BGCB484（CD3xGPRC5Dx空））。效應物與目標(E:T)比為3:1；n =1個T細胞供體，培養72小時，最高濃度53 nM，1至5稀釋度。對於細胞毒性及T細胞活化兩者進行測試。結果顯示BGCB463及BGCB491僅介導BCMA +GPRC5D +細胞之殺滅（如圖17A中所示），而BCMA -GPRC5D -細胞不受影響（如圖17B中所示）。 三特異性抗體在消耗殖株 (CRISPR)細胞系中具有活性
在初次培養後72及96小時，BGCB463及BGCB491消耗H929 WT、GPRC5D KO、及BCMA KO細胞系（圖18A）。該E:T比係3:1，n =5個T細胞供體；培養72(5)及96(4)小時；最高濃度532 mM，1至5稀釋度梯度。EC 50值顯示於下表13中。 表13 ：用BGCB463 及BGCB491 進行72/96 小時細胞毒性測試之EC 50 值
培養時間 BGCB463 BGCB491 細胞類型
72 小時 細胞毒性
EC 50值(nM) 0.007 0.006 H929 WT
2.055 0.322 H929-GPRC5D KO
0.539 4.517 H929-BCMA KO
96 小時
EC 50值(nM) 0.003 0.003 H929 WT
1.580 0.226 H929-GPRC5D KO
0.269 2.759 H929-BCMA KO
GBCB463及BGCB491亦觸發T細胞活化，同時消耗CRISPR細胞。兩種抗體在如上相同之H929 WT、GPRC5D KO、及BCMA KO細胞中皆顯示72及96小時後之T細胞活化增加（圖18B及表14）。 表14 ：用BGCB463 及BGCB491 進行72/96 小時T 細胞測試之EC 50 值
培養時間 BGCB463 BGCB491 細胞類型
72 小時 T 細胞活化
EC 50值(nM) 0.009 0.011 H929 WT
3.139 0.520 H929-GPRC5D KO
0.517 3.110 H929-BCMA KO
96 小時
EC 50值(nM) 0.007 0.009 H929 WT
3.507 0.480 H929-GPRC5D KO
0.445 3.458 H929-BCMA KO
三特異性抗體可消耗淋巴瘤（僅 BCMA）細胞系
用H929、RAMOS、及GRANTA-519細胞系在細胞毒性及T細胞活化檢定中測試BGCB463及BGCB491。結果顯示兩種抗體確實消耗了RAMOS及GRANTA-519系，儘管需要更高濃度的兩種抗體（圖19，表15中之EC 50值）。E:T係5:1，n=1個T細胞供體；僅培養72小時；最高濃度為53 nM；及1至5稀釋度。 表15 ：用BGCB463 及BGCB491 之淋巴瘤細胞系消耗之EC 50 值
BGCB463 BGCB491 細胞系
細胞毒性
EC 50值(nM) 0.004 0.005 H929 WT
n/a 2.813 Ramos
80.980 8.584 Granta-519
T 細胞活化
EC 50值(nM) 0.012 0.022 H929 WT
17.580 1.387 Ramos
3.300 1.644 Granta-519
三特異性抗體消耗全血檢定中之目標陽性細胞
用H292細胞在細胞毒性及T細胞活化全血檢定中測試GBCB463及BGCB491。結果顯示細胞毒性及T細胞活化（圖20及表16中之EC50值）。E:T係5:1，n=2個全血供體；培養48小時；最高濃度為532 nM；及1至5稀釋度。 表16 ：用BGCB463 及BGCB491 之全血細胞消耗之EC 值
EC 值(nM) BGCB463 BGCB491
細胞毒性
EC 20 0.159 0.084
EC 50 0.574 0.648
EC 90 4.412 16.380
T 細胞活化
EC 20 0.044 0.027
EC 50 0.297 0.544
EC 90 6.199 63.160
三特異性抗體抑制小鼠中之腫瘤生長
若給予足夠高的劑量，則顯示BGCB463在MM.1S及RPMI 8226異種移植小鼠模型中抑制腫瘤生長：在該MM.1S模型中2 µg或10 µg（圖21A）或在該RPMI 8226模型中5 µg或10 ug（圖21B）。相較於對照條件，腫瘤停止生長或顯示出生長減少。
此外，在H929預防性異種移植小鼠模型中，BGCB463及BGCB491兩者皆顯示出抑制腫瘤生長。相較於PBS對照組，0.5 µg及5 µg劑量兩者均減緩了在H929-BCMA KO及H929-GPRC5D KO模型中的腫瘤生長，較高的5 µg濃度顯示出更大的效果（圖22）。 DRC泛 T結合
在1小時、37℃DRC泛T結合檢定中，對BGCB463及BGCB491進行測試。使用兩個人類泛T細胞供體，且測試分子具有2uM起始濃度、1:3稀釋度及11點DRC。經由Alexa Fluor®647 AffiniPure山羊抗人類IgG (H+L)之二次偵測。使用Intellicyte Ique Screener plus來執行FACS。結果顯示於圖23中，BGCB491具有0.1903之EC 50且最高為188194，BGCB463具有0.1258之EC 50且最高為303269。所展示之EC 50值在CD3結合臂之預期參數範圍內。 DRC H929套件結合
在1小時、37℃DRC套件結合檢定中，針對H929 WT、H929 BCMA-KO、H929 GPRC5D-KO、及H929 BCMA/GPRC5D雙KO細胞，對BGCB463及BGCB491進行測試。結果顯示於圖24A至圖24D中，全部具有空對照(BGCB510)。EC值顯示於表17中。結果顯示，與BGCB463相比，BGCB491已增加BCMA媒介之結合及降低GPRC5D媒介之結合。 表17 ：H929 套件結合中之BGCB463 及BGCB491 之EC 值(uM)
BGCB463 BGCB491
H929 WT
EC 50 n/a 0.270
EC 90 n/a 25.049
H929 BCMA-KO
EC 50 11.7 3.183
EC 90 n/a n/a
H929 GPRC5D-KO
EC 50 0.504 0.210
EC 90 8.385 3.896
三特異性抗體分析研究
下表18提供BGCB463及BGCB491上之各種分析。 表18 ：BGCB463 及BGCB491 三特異性抗體之分析彙總
分析 BGCB463 BGCB491
純度(AUC)（在3步驟純化後） 96.4%單體 98.9%單體
構形穩定性（DSC， 組胺酸，pH 6.5） 溫度= 63℃、68℃、72℃ 溫度= 63℃、68℃、72℃
測得的pI (cIEF) pI: 9.51 pI: 9.56
aHIC之相對疏水性 中等疏水性 相對低疏水性(HI = 0.38)
PTM分析(LC-MS) ＜10% CDR PTM ＜5% CDR PTM
結合親和力(SPR) KD: CD3 (31.3 ± 8.7nM)；BCMA (844 ± 128pM) KD: BCMA (2.12E-10 M)；CD3 (2.51E-08 M)
血清干擾(Octet) 結合不受影響 結合不受影響
血清穩定性（SEC-FDS， 穩定的批次） 在37℃下培養7天後，HMW增加~12% 在37℃下培養7天後，HMW增加~5%
非特異性結合(SPR) 無 無
可濃縮性(concentratability) ~180 mg/mL，89%回收，97%單體 ~180 mg/mL，91%回收，97.5%單體
在150 mg/mL下之黏度 5.48 cP 6.3 cP
HCLF：在4℃& 40℃下2週後 之單體%(AUC) 在4℃& 40℃下2週後，在180 mg/mL下之聚集增加至15%及34% 在40℃下2週後，在180 mg/mL下之聚集增加至36%及34%，在4℃下HMW不增加
生理應力：37℃，2 mg/mL， PBS pH7.4 無物理/化學/親和力變化 HMW沒有增加，LMW顯著增加（15%，藉由SEC，~18%藉由GXII）：對CD3之結合活性降低18%，BCMA結合不受影響
PTM 誘導應力 pH 8.5，1週， 40℃ 20% D27異構化(CD3, HCDR1)，結合不受影響；其他CDR殘基中之＜10%脫醯胺/異構化 ~12% D27異構化(CD3, HCDR1)；LMW增加（~15%藉由SEC，~20%藉由GXII）：結合不受影響
pH 5，1週， 40℃ CDR PTM不增加 無顯著變化
pH 3.5，6小時， 室溫 CDR PTM不增加 無顯著變化
化學氧化 68% M94氧化；15% M232氧化；68% M600；CD3結合不受影響，BCMA結合2倍釋放 97% M94氧化(GC5B680, LCDR3)；99% M600 (BCMB519 LCDR3)；CD3結合不受影響，BCMA結合親和力略受影響（~2至3倍釋放）
金屬氧化 CDR PTM不增加 無顯著變化
實例9 ：BGCB491 三特異性抗體之生物物理評估
表19A提供重組抗原結合、物種交叉反應性、表位鑑別、Fc受體結合、及BGCB491之生物物理內在性質屬性。表19B提供BGCB491之額外特性。 表19A ：BGCB491 之生物物理評估及結果列表
mAb TMP 特性 結果 註解
結合
人類CD3臂之結合親和力(SPR) K D= 2.5×10 -8M 抗原：重組CD3εγ異二聚體建構體(CD3W200)
人類BCMA及GPRC5D 臂之結合親和力(SPR) 人類BCMA: K D= 2.1×10 -10M；抗原：BCMW37。 人類GPRC5D：由於缺乏該跨膜目標之代表性可溶性試劑，因此沒有可用於GPRC5D之SPR數據。使用基於細胞之方法在H929-BCMA-KO細胞上評估親和力結合（參見實例11） 使用BCMW37抗原之親本BCMA結合：K D= 2.8×10 -10M作為scFv；EC 50= 2.3至3.2 nM作為scFv結合至H929及MM.1R細胞；親本GPRC5D與H929及MM.1R細胞之結合：EC 50= 6至24 nM作為Fab
BCMB519 scFv與食蟹獼猴BCMA之交叉反應性(SPR) 至多300 nM之無/低結合 自含有BCMB519 scFv之BCMB601收集結合數據
Fcγ受體結合(SPR) 無顯著結合 如所預期之hIgG1-AAS靜默架構
FcRn結合(SPR) pH 6.0: hFcRn K D= 485 nM；cyFcRn K D= 314 nM 在pH 7.4之快速解離
血清干擾(Octet) k a緩衝液/ k a血清＜2.0 50%人類血清中與bt-BCMA及bt-CD3之締合速率無顯著變化。由於缺乏代表性可溶性試劑而未判定GPRC5D。
GPRC5D結合表位 未判定 N/A
CD3結合表位 涵蓋CD3ε鏈之殘基22至35 (QDGNEEMGGITQTP(SEQ ID NO: 161))之線性表位（P07766，CD3E_人類） 藉由HDX-MS判定親本抗體CD3B376針對CD3W220之表位序列
BCMA結合表位 涵蓋BCMA BCMW37之殘基17至26 (LLHACIPCQL(SEQ ID NO: 162))之線性表位 HDX-MS數據顯示BCMW37之殘基17至18及21至26係由BGCB465（含有相同抗BCMA scFv）保護
蛋白質特性
完整的Ab質量，釋放(MS) 155,978.8 Da N/A
醣型概況(MS) 具有主要醣型G0F/G0F之一般IgG1概況 N/A
（多個）同二聚體之水平(MS) 未偵測到HD1及HD2 N/A
其他產物相關雜質之水平(MS) 未觀察到 N/A
N連接gly（非Fc）(MS) 未預測或觀察到 N/A
O連接gly位點(MS) 未觀察到 N/A
醣化（相對豐度%）(MS) HC1 (CD3)，16.7%；LC1 (CD3)，5.4%；HC2 (GPRC5DxBCMA)，8.1% 由於由非零基線導致的高估，醣化值代表上限
游離Cys (MS) 未預測或觀察到 N/A
N端延長/截短(MS) 未觀察到 N/A
構形穩定性(DSC) T m1= 62.9℃；T m2= 68.3℃；T m3= 71.9℃ 在10 mM組胺酸pH 6.5中測量；T m1由CD376-Fab域貢獻；T m2由該分子之數個部分貢獻；T m3由CH3域貢獻
純度%（2步驟純化） (AUC) 98.9%單體 在10 mM L-組胺酸pH 6.5中測量
血清穩定性(SEC-FDS) 在37℃下培養7天後，HMW增加~5% 使用經Alexa 488標記之BCMAxGPRC5DxCD3三特異性藉由SEC評估
非特異性結合 未觀察到非特異性結合 N/A
等電點(cIEF) pI = 9.56；酸性/主要/鹼性峰面積%：46/54/0 N/A
相對疏水性(aHIC) 低疏水性（疏水性指數0.38），但峰寬且拖尾 N/A
黏度 6.3 cP 在10 mM L-組胺酸pH 6.5中以150 mg/mL判定
2 週高濃度穩定性（4 及40℃ ，目標150 mg/mL ）
在L-組胺酸緩衝液pH 6.5中之可濃縮性及回收率% 將樣本濃縮至183.5 mg/mL，回收率91% N/A
單體%（初始）(AUC) 97.5% 在10 mM L-組胺酸pH 6.5中判定
2週、4℃之單體% (AUC) 95.4% 在10 mM L-組胺酸pH 6.5中判定
2週、40℃之單體% (AUC) 62.8% 在10 mM L-組胺酸pH 6.5中判定
化學(PTM) 及物理穩定性
強制降解之後的完整MS (MS) 化學氧化處理導致各HC上之4次氧化。在生理應力下，從所有域觀察到片段。脫醯胺應力主要導致來自GPRC5D的片段，雖然亦觀察到來自BCMA scFv的2個片段。 N/A
強制降解之後的尺寸(aSEC) 完整的單體%：釋放= 100.0；*生理性= 96.0；熱= 63.7；pH 8.5 = 83.2；pH 5.0 = 99.3；pH 3.5 = 100.0；化學氧化= 98.5；金屬氧化= 97.6 隨著時間的推移，在40℃下高濃度聚集的增加很明顯，並且需要進行後續配方研究以減輕聚集傾向。在pH 8.5及生理應力之後觀察到切割。
強制降解的純度 （R及NR GXII） NR GXII完整的%：釋放=100；生理性= 82；熱= 99；pH 8.5 = 82；pH 5.0 = 99；pH 3.5 = 100；化學氧化= 100；金屬氧化= 100 在pH 8.5及生理應力之後觀察到切割。
強制降解後的CD3結合(SPR) 親和力(M) /活性%： 釋放= 2.51×10 -8/ 100； 生理性= 1.93×10 -8/ 82； 熱= 2.58×10 -8/ 100； pH 8.5 = 2.16×10 -8/ 93； pH 5.0 = 2.26×10 -8/ 88； pH 3.5 = 2.17×10 -8/ 94； 化學氧化= 2.27×10 -8/ 93； 金屬氧化= 2.33×10 -8/ 98 在所有測試之應力條件下保留對CD3之親和力。在pH 8.5應力之後的活性物種%降低。
強制降解之後的BCMA結合(SPR) 親和力(M) /活性%： 釋放= 2.12×10 -10/ 100； 生理性= 1.43×10 -10/ 110； 熱= 2.81×10 -10/ 137； pH 8.5 = 1.60×10 -10/ 114； pH 5.0 = 2.07×10 -10/ 154； pH 3.5 = 1.75×10 -10/ 116； 化學氧化= 5.37×10 -11/ 131； 金屬氧化= 2.15×10 -10/ 110 N/A
基礎氧化水平 2.4%於M94 (GC5B680 scFv LCDR3)中；1.3%於M166 (GC5B680 scFv HCDR1)中；1.9%於M232 (GC5B680 scFv HCDR3)中；4.4%於M600 (BCMB519 scFv LCDR3)中 N/A
Met/Trp（氧化壓力改變） 96.9%於M94 (GC5B680 scFv LCDR3)中；14.0%於M166 (GC5B680 scFv HCDR1)中；14.3%於M232 (GC5B680 scFv HCDR3)中；99.2%於M600 (BCMB519 scFv LCDR3)中 N/A
基礎脫醯胺水平 CDR中＜ 1% N/A
脫醯胺位點（應力改變） 無顯著變化 N/A
基礎異構化水平 CDR中＜ 1% N/A
異構化位點（應力改變） CD3B376 HCDR1中之11.7% D27異構化；BCMB519 scFv LCDR3中之5.3% D731異構化 注意：在所有CD3B376候選者中均觀察到在pH應力下之D27異構化，並且認為不影響活性。
AAS、L234A、L235A、及D265S；Ab，抗體；aHIC，分析疏水性交互作用層析法；aSEC，分析粒徑篩析層析法；AUC，分析超速離心；bt，生物素化；CDR，互補決定區；Chem Ox，化學氧化；cIEF，毛細管等電聚焦；cy或cyno，食蟹獼猴；Cys，半胱胺酸，DSC，微差掃描熱量法；EC 50，50%有效濃度；Fab，片段抗原結合；Fc，可結晶片段；FcRn，新生兒Fc受體；FDS，螢光偵測系統；gly，醣基化；h，人類；HC，重鏈；HCDR，重鏈互補決定區；HD，同二聚體；HDX，氫氘交換；HMW，更高的分子量；Ig，免疫球蛋白；k a，締合常數；K D，平衡解離常數；LC，輕鏈；LCDR，輕鏈互補決定區；mAb，單株抗體；Met，甲硫胺酸；Metal Ox，用金屬氧化；MS，質譜法；N/A，未評估；NME，新分子實體；NR GXII，非還原的毛細管電泳；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；pI，等電點；PS20，聚山梨醇酯20；ref，參考；R GXII，還原的毛細管電泳；scFv，單鏈可變片段；SEC，粒徑篩析層析法；SPR，表面電漿子共振；T m，熔融溫度；TMP，目標藥品；Trp，色胺酸。 表19B ：BGCB491 中之結合臂之額外特性
前導參數 特性
BCMA: BCMB519 親和力 K D= 0.28 nM作為scFv (SPR) EC 50= 2.3至3.2 nM作為scFv (H929 & MM.1R)
表位 線性表位a.a. 17至26 (LLHACIPCQL)
功能 阻斷BAFF及APRIL結合 #無促效活性 #
GPRC5D: GC5B680 親和力 EC 50= 6至24 nM作為Fab (H929 & MM.1R)
CD3: CD3B376 親和力 EC 50= 3.4 µM*（T細胞）
表位 N端表位a.a. CD3ε鏈之22至35 (QDGNEEMGGITQTP)
脫靶(off-target)概況 Retrogenix 乾淨、無脫靶命中（BCMA & GPRC5D結合物）
*T細胞：EC 50由於在最高測試2 µM濃度下之不飽和結合曲線而基於固定點外推判定 實例10 ：BGCB491 之目標臂及CD3 臂結合特性 BGCB491之內源性腫瘤細胞系結合
使用流動式細胞測量術來評估BGCB491體外之BCMA及GPRC5D臂結合。在1小時37℃培養之後，在一組H929-WT、H929-BCMA-KO、H929-GPRC5D-KO、及H929-BCMA/GPRC5D-KO細胞系上測試BGCB491及同型對照。
BGCB491顯示WT上以及各剔除(KO)系之特異性結合線驗證各個別目標結合臂之結合（圖25，表20）。 表20 ：來自5 個獨立實驗之H929 WT 及KO 套件結合之ECx 值
運行1 運行2 運行3 運行4 運行5 Med
H929-WT
EC 20(nM) 15 NFC N/A 4 8 8
EC 50(nM) 270 NFC N/A 34 66 66
EC 90(nM) 25,000 NFC N/A 878 1,912 1,912
H929-BCMA-KO （GPRC5D 臂）
EC 20(nM) NFC 19 NFC NFC NFC NFC
EC 50(nM) NFC 66 NFC NFC NFC NFC
EC 90(nM) NFC 489 NFC NFC NFC NFC
H929-GPRC5D-KO （BCMA 臂）
EC 20(nM) 33 17 23 10 12 17
EC 50(nM) 210 54 224 50 53 54
EC 90(nM) 3,900 345 7,900 645 535 645
EC x，x%有效濃度；KO，剔除；Med，中值；N/A，未評估；NFC，不完整曲線；WT，野生型。
在三特異性抗體BGCB491上執行24小時動力學結合實驗。使用流動式細胞測量術來評估H929 WT及MM.1R WT細胞系在50、10、2 nM之24小時、37℃培養下之結合動力學（參見圖40）。如圖40中所示，在兩種細胞上在24小時期間皆觀察到穩定的結合概況。 BGCB491之初級 T細胞結合
使用流動式細胞測量術來評估BGCB491之CD3臂（亦即，CD3B376）與來自7種不同健康人類之CD3 +泛T細胞的結合。CD3B376之基於細胞之EC 50由於在1小時缺乏飽和動力學而無法判定（圖26）。使用CD3B376x空對照抗體（亦即，GCDB381）分子執行生物資訊性外推（圖27），其在2 µM的最高濃度劑量反應範圍內飽和以限制非線性回歸曲線之頂部，以產生能夠估計EC x值的完整曲線（表21）。 表21 ：基於來自生物資訊性外推之固定飽和點，估計BGCB491 與T 細胞結合之ECx 值
供體 估計EC 20(µM) 95% 信賴區間 估計EC 50(µM) 95% 信賴區間
D203727 0.222 (0.193, 0.255) 3.37 (3.01, 3.77)
D316144 0.279 (0.237, 0.329) 4.99 (4.26, 5.85)
D327645 0.188 (0.153, 0.230) 3.36 (2.86, 3.94)
中值 0.222 3.37
EC x，x%有效濃度；D，供體。
儘管使用弱的CD3結合臂，但BGCB491在整個120小時內，對3個泛T細胞供體在Incucyte上執行的動力學細胞毒性檢定中，以1:1及1:3 E:T比顯示出強大的亞皮莫耳效力及最大的細胞毒性。在時程細胞毒性檢定中，使用Incucyte S3來評估在整個120小時內，在3個泛T細胞供體之H929-GFP細胞中，BGCB491之動力學目標細胞毒性及T細胞活化概況。除了以1:3 E:T比測試的最低濃度(10 pM)以外，BGCB491在72小時左右在所有濃度下達到顯著的最大細胞毒性（圖42）。從動力學圖中，對於1:1 E:T比（圖43）及1:3 E:T比（圖44），在72、93、及120小時時間點提取細胞溶解百分比及T細胞活化之資訊。BGCB491在兩種E:T比中皆顯示出穩健的亞皮莫耳(subpicomolar)殺滅效力（表22）。更深入的細胞毒性特性在實例12中說明。 表22 ：動力殺滅檢定中衍生自H929-GFP 細胞溶解百分比之平均ECx 值
E:T 1:1 E:T 1:3
72 小時
EC 20(pM) 2.1 1.1
EC 50(pM) 12.7 6.3
EC 90(pM) 212.6 93
93 小時
EC 20(pM) 0.7 1.6
EC 50(pM) 0.9 5.5
EC 90(pM) 1.4 39
120 小時
EC 20(pM) 0.4 2.3
EC 50(pM) 0.7 5.2
EC 90(pM) 1.8 18.9
EC x，x%有效濃度；E:T，效應物與目標比；GFP，綠螢光蛋白。
綜上所述，BGCB491係靶向該TCR CD3之完全人類三特異性mAb，其具有1個結合臂及腫瘤細胞表面抗原BCMA或GPRC5D，其餘2個結合域。BGCB491顯示可接受之內在生物物理性質，並與所有測試之BCMA、GPRC5D、及雙BCMA-GPRC5D表現性細胞系結合。 實例11 ：治療藥理學第1部分.體外研究 測試細胞系中之 BCMA及 GPRC5D受體蛋白表面表現及密度
4個雙目標（亦即，BCMA-GPRC5D）陽性細胞系（亦即，MM.1S、H929、JIM-3、及OPM-2）及2個雙目標陰性細胞系（亦即，MV-4-11及OCI-AML-3）之子集係使用經藻紅素(PE)標記之市售BCMA抗體及內部GPRC5D抗體藉由螢光活化細胞分選(FACS)表徵蛋白質表現。相較於同型對照組，所有目標陽性細胞系之表現模式均有顯著變化，而目標陰性細胞系未顯示任何表現（表23）。選擇在其表面上具有各種水平之目標蛋白表現之此6種細胞系用於進一步體外及活體內功能檢定。 表23 ：測試細胞系中BCMA 及GPRC5D 受體密度之彙總
細胞系 GPRC5D （檢定-1 ） GPRC5D （檢定-2 ） GPRC5D （平均值） BCMA （檢定-1 ） BCMA （檢定-2 ） BCMA （平均值）
MM.1S 2,091 4,899 3,495 1,870 2,237 2,053
H929 2,443 1,995 2,219 6,955 6,908 6,932
OPM-2 12,109 8,159 10,134 5,703 4,411 5,057
JIM-3 1,438 1,528 1,483 922 1,533 1,228
MV-4-11 37 92 64 72 52 62
OCI-AML-3 19 67 43 89 85 87
使用QuantiBRITE套組在目標陽性及目標陰性細胞上量化目標受體密度。上文列出2個個別實驗的個別值及平均值。 與內源性 BGMA-GPRC5D表現性細胞系之 BGCB491結合
接著，藉由施加流動式細胞測量術方法判定BGCB491（BCMAxGPRC5DxCD3三特異性mAb）結合概況。BGCB491及BCMAxGPRC5Dx空對照抗體以劑量依賴性方式結合至BCMA-GPRC5D表現性MM細胞（EC 50值：MM.1S, 33.39 nM；H929, 185.50 nM；JIM-3, 78.45 nM；OPM-2, 10.07 nM；圖41）而CD3x空x空對照抗體顯示在此等細胞上無顯著結合。測試的抗體均未與雙目標陰性細胞系MV-4-11及OCI-AML-3結合，表示BGCB491具有特異性。 MM細胞系及 T細胞活化之 BGCB491媒介之 T細胞依賴性細胞毒性
使用基於FACS之方法使用T細胞媒介之細胞毒性檢定來評估BGCB491之體外細胞毒性及T細胞活化潛力。BGCB491係在各種細胞系（BCMA-GPRC5D雙陽性：MM.1S、H929、JIM-3、OPM-2；及BCMA-GPRC5D雙陰性：MV-4-11及OCI-AML-3）上測試，使用來自6個健康供體之泛T細胞(CD3 +)。因為該Fc受體在一些測試細胞上表現，所以在檢定中添加2 mg/mL的Fc阻斷劑。另外，BCMAxGPRC5Dx空及CD3x空x空用作陰性對照組。在培養72小時之後，BGCB491在體外有效殺滅BCMA-GPRC5D-雙陽性細胞系（圖28A，表24）。發現BGCB491係一種有效的三特異性抗體，藉由所有雙目標陽性細胞系中之CD3 +CD25 +活T細胞所測量，細胞毒性之EC 50值範圍為0.002至0.312 nM且T細胞活化為0.008至1.070 nM。一如預期，僅在雙目標陽性細胞中觀察到伴隨的T細胞活化（圖28B，表24）。當用雙目標陰性細胞系MV-4-11及OCI-AML-3測試時，BGCB491不誘導細胞毒性或T細胞活化，證明細胞毒性特異性。BCMAxGPRC5Dx空及CD3x空x空對照組沒有顯示出顯著的細胞毒性，除了MM.1S細胞系，其中CD3x空x空抗體在高濃度(＞100 nM)下顯示出一些活性。 表24 ：使用來自多個健康供體之T 細胞之細胞毒性及T 細胞活化之ECx 值之彙總
MM.1S H929 JIM-3 OPM-2 MV-4-11 OCI-AML-3
細胞毒性
EC 20(nM) 0.001 0.002 0.094 0.009 NA NA
EC 50(nM) 0.002 0.005 0.312 0.019 NA NA
EC 90(nM) 0.012 0.015 2.078 0.058 NA NA
最大細胞毒性(%) 92.580 94.470 61.220 81.320 NA NA
CD3 T 細胞活化
EC 20(nM) 0.002 0.002 0.242 0.006 NA NA
EC 50(nM) 0.010 0.008 1.070 0.062 NA NA
EC 90(nM) 0.145 0.057 11.303 2.726 NA NA
最大活化(%) 75.030 85.900 30.850 45.950 NA NA
EC x，x%有效濃度；NA，不具活性。 顯示來自6個T細胞供體之各細胞系之細胞毒性及T細胞活化之平均EC x值。EC x值係根據4PL模型事後估計，供體為隨機效應。使用Δ方法計算95%信賴區間。非線性混合效應R套件用於模型擬合。 H929 CRISPR剔除細胞產生及目標表現 CRISPR剔除H929細胞系中之BCMA及GPRC5D受體蛋白之表現及密度
接著，為了評估BGCB491殺滅單目標表現性細胞的潛力，在細胞毒性檢定中使用H929簇集之規律間隔的短回文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) KO細胞系（亦即，H929-BCMA-KO及H929-GPRC5D-KO）。此等細胞係如圖25之圖例中所述進行序列確認，並使用經PE標記之市售BCMA抗體及內部經PE標記之GPRC5D抗體藉由FACS表徵蛋白質表現。表現概況指示完全剔除H929-BCMA-KO細胞系中之BCMA表現及H929-GPRC5D-KO細胞系中之GPRC5D表現。 BGCB491媒介之H929 CRISPR KO殖株細胞系之細胞毒性及T細胞活化
接著，使用來自4個健康供體之泛T細胞(CD3 +)在CRISPR KO及野生型(WT)細胞系（亦即，H929-WT、H929-GPRC5D-KO、及H929-BCMA-KO）上測試BGCB491抗體，以使用基於FACS之方案評估其殖株消耗潛力。另外，BCMAxGPRC5Dx空及CD3x空x空用作陰性對照組。BGCB491在培養72小時之後有效殺滅所有3種細胞系（亦即，H929-WT、H929-GPRC5D-KO、及H929-BCMA-KO）並在體外活化T細胞（圖29）。由於親留力，相較於單目標表現性CRISPR KO細胞系，BGCB491在雙目標表現性H929-WT細胞中展現出顯著的效力。BCMAxGPRC5Dx空及CD3x空x空未顯示出顯著的細胞毒性或T細胞活化。使用4種不同的健康T細胞供體之平均EC 50值彙總在表25A中。一如預期，泰克利單抗（BCMAxCD3雙特異性抗體）及塔奎達單抗（GPRC5DxCD3雙特異性抗體）用作陽性對照組並表現。表25B顯示H929細胞之每個細胞之受體密度值。 表25A ：使用CRISPR KO H929 細胞之細胞毒性及T 細胞活化之BGCB491 EC 50 值之彙總
估計 BGCB491 CD3x 空x 空 BCMAxGPRC5Dx 空 泰克利單抗 塔奎達單抗
細胞毒性
H929-WT
EC 50(nM) 0.007 NA NA 0.275 0.243
最大細胞毒性(%) 93.012 NA NA 92.072 92.741
H929-GPRC5D-KO
EC 50(nM) 0.330 NA NA 0.198 NA
最大細胞毒性(%) 94.243 NA NA 93.017 NA
H929-BCMA-KO
EC 50(nM) 4.789 NA NA NA 0.761
最大細胞毒性(%) 65.822 NA NA NA 84.664
CD3 T 細胞活化
H929-WT
EC 50(nM) 0.011 NA NA 0.334 0.233
最大細胞毒性(%) 82.147 NA NA 80.196 85.399
H929-GPRC5D-KO
EC 50(nM) 0.487 NA NA 0.253 NA
最大細胞毒性(%) 81.084 NA NA 79.450 NA
H929-BCMA-KO
EC 50(nM) 4.131 NA NA NA 0.633
最大細胞毒性(%) 63.379 NA NA NA 78.888
CRISPR，簇集之規律間隔的短回文重複序列；EC 50，50%有效濃度；；E:T，效應物與目標；Fc，可結晶片段；KO，剔除；NA，不具活性。 顯示來自4個T細胞供體之各細胞系（H929-WT、H929-GPRC5D-KO、及H929-BCMA-KO）之細胞毒性及T細胞活化之平均EC 50值。EC 50值係根據4PL模型事後估計，供體為隨機效應。使用Δ方法計算95%信賴區間。非線性混合效應R套件用於模型擬合。泰克利單抗及塔奎達單抗用作陽性對照組。 表25B ：H929 細胞之受體密度
細胞 H929-WT H929-GPRC5D-KO H929-BCMA-KO
受體密度 BCMA 5381 3926 1
GPRC5D 1574 19 957
針對健康人類全血中摻有雙目標陽性 H929細胞之 BGCB491之細胞毒性及 T細胞活化潛力（ MABEL檢定）
MABEL檢定用於表徵BGCB491在更為生理相關的環境中之影響。在此，將雙目標陽性H929細胞添加至人類健康全血中以確立細胞毒性、T細胞活化、及細胞介素參數。該H929細胞系係基於人類全血環境中48小時之相容性來選擇。在培養48小時之後，BGCB491在此共培養的全血檢定中有效殺滅雙目標陽性H929細胞並活化T細胞（圖30）。當使用來自7個不同健康供體之全血進行測試時，BGCB491之細胞毒性平均EC 50值為0.274 nM，且CD3 +T細胞活化之值為0.376 nM（表26）。BCMAxGPRC5Dx空及CD3x空x空未顯示出顯著的細胞毒性或T細胞活化。使用基於10-plex Meso Scale Discovery (MSD)的方案對來自3個不同的全血供體之細胞介素進行量化（圖31，表27）。陽性對照組泰克利單抗及塔奎達單抗顯示出特異性活性。 表26 ：MABEL 檢定之細胞毒性及T 細胞活化ECx 值(nM)
BGCB491 CD3x 空x 空 BCMAx GPRC5Dx 空 泰克利單抗 塔奎達單抗
細胞毒性
EC 20 0.063 (0.027, 0.146) NA NA 1.273 (0.715, 2.268) 1.272 (0.843, 1.919)
EC 30 0.112 (0.049, 0.253) NA NA 1.549 (0.877, 2.733) 1.744 (1.186, 2.566)
EC 50 0.274 (0.123, 0.612) NA NA 2.106 (1.196, 3.707) 2.866 (1.978, 4.151)
EC 90 2.804 (1.142, 6.883) NA NA 4.675 (2.513, 8.699) 10.379 (6.471, 16.646)
最大 49.765 (41.946, 57.583) NA NA 50.309 (41.780, 58.837) 44.761 (35.940, 53.582)
CD3 +T 細胞活化
EC 20 0.042 (0.018, 0.098) NA NA 1.043 (0.692, 1.574) 0.677 (0.436, 1.050)
EC 30 0.098 (0.043, 0.223) NA NA 1.378 (0.926, 2.051) 0.927 (0.624, 1.377)
EC 50 0.376 (0.168, 0.839) NA NA 2.135 (1.446, 3.152) 1.521 (1.052, 2.199)
EC 90 12.150 (4.684, 31.514) NA NA 6.641 (4.249, 10.378) 5.491 (3.196, 9.436)
最大 43.685 (34.087, 53.282) NA NA 37.993 (31.416, 44.570) 40.780 (33.202, 48.357)
CD4+T 細胞活化
EC 20 0.031 (0.013, 0.071) NA NA 0.830 (0.529, 1.302) 0.585 (0.370, 0.924)
EC 30 0.069 (0.030, 0.156) NA NA 1.124 (0.733, 1.725) 0.812 (0.540, 1.220)
EC 50 0.248 (0.110, 0.556) NA NA 1.814 (1.199, 2.744) 1.361 (0.934, 1.982)
EC 90 6.820 (2.815, 16.522) NA NA 6.263 (3.781, 10.375) 5.191 (2.921, 9.224)
最大 52.423 (44.614, 60.232) NA NA 48.005 (41.702, 54.308) 52.079 (45.784, 58.374)
CD8 +T 細胞活化
EC 20 0.034 (0.016, 0.071) NA NA 0.903 (0.632, 1.291) 0.506 (0.337, 0.760)
EC 30 0.068 (0.034, 0.138) NA NA 1.189 (0.840, 1.683) 0.693 (0.472, 1.018)
EC 50 0.206 (0.105, 0.406) NA NA 1.831 (1.300, 2.577) 1.137 (0.784, 1.648)
EC 90 3.674 (1.550, 8.708) NA NA 5.610 (3.837, 8.201) 4.102 (2.585, 6.508)
最大 61.800 (51.931, 71.669) NA NA 63.628 (57.194, 70.062) 66.038 (59.506, 72.571)
EC x，x%有效濃度；；E:T，效應物與目標；MABEL，最小預期生物效應水平；Max，最大值；NA，不具活性。 將BGCB491以各種濃度在目標細胞(H929)存在下添加至全血中並培養48小時。將目標細胞以5:1之最佳E:T比摻入全血中。使用7個健康人類供體全血樣本（供體ID：10145、10403、10420、10083、10463、10493、及10145）進行研究。EC x值係根據4PL模型事後估計，供體為隨機效應。使用Δ方法計算95%信賴區間（在括號之間指示）。非線性混合效應R套件用於模型擬合。最大細胞毒性/活化值係百分比。 表27 ：MABEL 檢定之個別細胞介素EC 50 值。
細胞介素 BGCB491 泰克利單抗 塔奎達單抗
EC 50(nM) 最大(95% CI) (pg/mL) EC 50(nM) 最大(95% CI) (pg/mL) EC 50(nM) 最大(95% CI) (pg/mL)
INF-γ 0.172 24,856.5 0.994 32,357.6 2.144 35,384.7
TNF-α 0.398 886.8 1.721 819.9 3.474 935.7
IL-1β 0.156 36.5 1.621 35.1 1.336 30.2
IL-2 0.585 1,385.4 1.409 1,270.2 3.911 1,725.4
IL-4 0.156 14.4 1.529 15.1 1.408 11.9
IL-6 0.104 572.3 1.235 549.8 1.209 440.7
IL-10 0.924 472.6 7.694 495.6 1.2 365.8
IL-13 0.254 144.4 0.769 146.3 0.832 145.7
95% CI，95%信賴區間；EC 50，50%有效濃度；IL：介白素；IFN：干擾素；MABEL，最小預期生物效應水平；Max，最大濃度；MSD，Meso Scale Discovery；TNF，腫瘤壞死因子。 收集來自上述細胞毒性實驗之H929細胞上清液（圖30，3個T細胞供體），且使用基於MSD之多重檢定（目錄號：K15049D）分析細胞介素水平。最大細胞介素水平表示為pg/mL（在括弧之間的95%信賴區間）。 MM患者骨髓 CD138+細胞之 BGCB491媒介之細胞毒性
為了評估BGCB491在來自MM患者之初級樣本中的效力，使用來自4個不同MM患者之冷凍骨髓單核細胞及來自健康供體之T細胞在細胞毒性檢定中測試此三特異性mAb。將相等數目之外源T細胞及骨髓單核細胞（亦即，100,000；E:T比=1:1）混合，並用BGCB491、CD3x空x空、泰克利單抗、或塔奎達單抗培養48小時。使用基於流動式細胞測量術之方法測量抗體媒介之漿細胞消耗及T細胞活化潛力。在與健康正常T細胞共培養48小時之後，BGCB491以劑量依賴性方式誘導所有患者樣本之CD138 +漿細胞消耗（圖32）。一如預期，T細胞活化數據與細胞毒性數據有良好相關性。此數據證實BGCB491在離體共培養檢定中對初級MM骨髓細胞係具有細胞毒性的。漿細胞消耗及T細胞活化之供體特異性EC x值列於表28中。CD3x空x空對照抗體在3個樣本中進行測試，對於所有4個分子具有足夠的細胞，並且在較高濃度(＞1 nM)下顯示出一些最小的非特異性漿細胞消耗及T細胞活化。一如預期，泰克利單抗及塔奎達單抗用作陽性對照組並表現。 表28 ：使用初級MM 骨髓單核細胞之細胞毒性及T 細胞活化之BGCB491 ECx 值彙總
EC x 細胞毒性 T 細胞活化
BGCB491 泰克利單抗 塔奎達單抗 BGCB491 泰克利單抗 塔奎達單抗
BM MNC ID # 626
EC 20(nM) 0.281 0.164 0.080 0.062 0.196 0.081
EC 30(nM) 0.598 0.242 0.169 0.139 0.320 0.126
EC 50(nM) 1.961 0.443 0.545 0.488 0.689 0.255
EC 90(nM) 42.630 2.138 11.300 12.760 5.047 1.582
BM MNC ID # 649
EC 20(nM) 0.345 0.111 0.387 0.005 0.090 0.068
EC 30(nM) 0.650 0.200 0.713 0.028 0.201 0.118
EC 50(nM) 1.762 0.506 1.858 0.381 0.712 0.278
EC 90(nM) 23.400 5.599 22.310 330.900 19.050 2.586
BM MNC ID # 652
EC 20(nM) 0.073 ~0.6316 0.304 0.005 0.106 0.015
EC 30(nM) 0.108 ~0.7015 0.482 0.009 0.137 0.024
EC 50(nM) 0.202 ~0.7440 0.990 0.019 0.204 0.051
EC 90(nM) 1.017 ~0.9663 6.421 0.153 0.576 0.334
BM MNC ID # 653
EC 20(nM) 0.071 0.114 0.203 0.013 0.033 0.028
EC 30(nM) 0.145 0.223 0.482 0.030 0.064 0.058
EC 50(nM) 0.446 0.641 1.877 0.120 0.179 0.181
EC 90(nM) 8.183 9.900 63.680 4.355 2.627 3.407
平均
EC 20(nM) 0.192 0.130 0.244 0.021 0.106 0.048
EC 30(nM) 0.375 0.222 0.461 0.051 0.180 0.082
EC 50(nM) 1.093 0.530 1.317 0.252 0.446 0.191
EC 90(nM) 18.808 5.879 25.928 87.042 6.825 1.977
BM，骨髓；EC x，x%有效濃度；E:T，效應物與目標；MM：多發性骨髓瘤；MNC，單核細胞。 將BGCB491以各種濃度在健康T細胞存在下以1:1 E:T比添加至MM BM MNC中並培養48小時。使用4個MM患者骨髓樣本（供體ID：MM BM MNC-626、649、652、及653）進行研究。在此實驗中，泰克利單抗及塔奎達單抗用作陽性對照組。EC x值係根據4PL模型事後估計，供體為隨機效應。使用Δ方法計算95%信賴區間。非線性混合效應R套件用於模型擬合。 在各種 E:T比及培養時間下之 BGCB491細胞毒性潛力
此外，使用T細胞媒介之細胞毒性檢定測試BGCB491目標細胞之細胞毒性潛力，以數種E:T比及不同培養時間來了解其在臨床環境中消耗骨髓瘤細胞之能力。作為測試細胞系，H929細胞與T細胞（供體ID：20063323）混合，在BGCB491、BCMAxGPRC5Dx空、及CD3x空x空存在下獲得5:1、3:1、1:1、及0.5:1之E:T比，並執行培養72小時。對於時程實驗，選擇3:1及1:1 E:T比以用於測試24、48、72、96、120、144、及168小時之培養。在H929細胞中，BCMA及GPRC5D之每個細胞之受體密度分別為5381及1574。BGCB491在所有測試之E:T比下均有效殺滅H929細胞，對於細胞毒性及T細胞活化具有相當的EC 50值（圖33A，表29）。BGCB491從測試之最早時間點（24小時）開始起始目標細胞細胞毒性，且其效力及功效隨著時間而增加，直至培養72小時，幾乎達到平台期（圖33B）。BGCB491在所有測試之時間點均有效殺滅H929細胞，細胞毒性之EC 50值在0.001與0.022 nM之間，且T細胞活化之值在0.005與0.067 nM之間（3:1 E:T比）。對於1:1 E:T比檢定，細胞毒性之EC 50值範圍在0.004與0.025 nM之間，T細胞活化之值範圍在0.006與0.083 nM之間（圖33B，表30）。此數據指示該三特異性mAb BGCB491非常有效且可在T細胞計數為限制性的情況下受益。然而，在72小時培養檢定中，在較低的0.5:1之E:T比下，最大細胞毒性百分比遠低於(~20%)在其他測試條件下。有趣的是，看看更長的培養時間是否在此等較低的T細胞計數下可改善最大細胞毒性。在分開的研究中，BGCB491顯示出與來自多個供體之表現CD3之初級人類T細胞有可測量的低親和力結合（圖26），在1:1及1:3 E:T比兩者下對H929細胞具有強烈的細胞毒性（圖43，圖44）。 表29 ：在E:T 比檢定中之細胞毒性及T 細胞活化之BGCB491 ECx 值之彙總
E:T 比 EC x 細胞毒性 CD3 +T 細胞活化
5:1 EC 20(nM) 0.007 0.008
EC 50(nM) 0.014 0.022
EC 90(nM) 0.040 0.097
3:1 EC 20(nM) 0.006 0.005
EC 50(nM) 0.023 0.027
EC 90(nM) 0.192 0.343
1:1 EC 20(nM) 0.008 0.004
EC 50(nM) 0.038 0.031
EC 90(nM) 0.445 0.993
0.5:1 EC 20(nM) 0.013 0.005
EC 50(nM) 0.088 0.033
EC 90(nM) 1.919 0.662
CD，分化簇；EC x，x%有效濃度；E:T，效應物與目標。 將BGCB491在來自1個健康供體（供體ID：20063323）之泛T細胞存在下，以各種E:T比（5:1、3:1、1:1、及0.5:1）進行測試達72小時。測量目標細胞死亡及T細胞活化並表示為細胞毒性百分比及CD25 +CD3 +T細胞百分比。EC x值係根據4PL模型事後估計，供體為隨機效應。使用Δ方法計算95%信賴區間。非線性混合效應R套件用於模型擬合。 表30 ：在時程檢定中之細胞毒性及T 細胞活化之BGCB491 ECx 值之彙總
終點 EC x 培養時間（小時）
24 48 72 96 120 144 168
E:T 比3:1
細胞毒性 EC 20(nM) 0.005 0.002 0.001 0.001 0 0.001 0.001
EC 50(nM) 0.022 0.006 0.002 0.001 0.001 0.002 0.001
EC 90(nM) 0.258 0.033 0.007 0.004 0.005 0.004 0.003
CD3 +T細胞活化 EC 20(nM) 0.011 0.004 0.002 0.001 0.001 0.001 0.001
EC 50(nM) 0.067 0.015 0.007 0.006 0.005 0.01 0.008
EC 90(nM) 1.255 0.121 0.064 0.087 0.102 0.307 0.385
E:T 比1:1
細胞毒性 EC 20(nM) 0.004 0.003 0.002 0.001 0.002 0.003 0.003
EC 50(nM) 0.019 0.025 0.007 0.004 0.004 0.006 0.006
EC 90(nM) 0.224 0.585 0.039 0.017 0.013 0.017 0.019
CD3 +T細胞活化 EC 20(nM) 0.008 0.004 0.002 0.002 0.002 0.003 0.003
EC 50(nM) 0.083 0.024 0.009 0.006 0.006 0.009 0.01
EC 90(nM) 3.117 0.448 0.086 0.047 0.04 0.056 0.066
CD，分化簇；EC x，x%有效濃度；E:T，效應物與目標。 對於時程檢定，將BGCB491以3:1及1:1之E:T比，在各種時間點（24、48、72、96、120、144、及168小時），使用4種不同T細胞供體（供體ID：20062105、20063309、20061963、及20063310）進行測試。測量目標細胞死亡及T細胞活化並表示為細胞毒性百分比及CD25 +CD3 +T細胞百分比。EC x值係根據4PL模型事後估計，供體為隨機效應。使用Δ方法計算95%信賴區間。非線性混合效應R套件用於模型擬合。 不存在目標細胞之情況下 BGCB491對 T細胞活化的影響
為了評估BGCB491在不存在目標接合之情況下是否促進非所欲之T細胞活化，T細胞活化檢定中測試BGCB491的影響。在第一研究中，將6個正常健康供體T細胞樣本在各種濃度之BGCB491存在下培養72小時（圖34A）。在第二研究中使用更具生理相關性之檢定格式，其中健康人類全血中不存在BCMA-GPRC5D陽性細胞，並且在此將BGCB491以不同濃度添加至6個正常健康供體全血樣本中達48小時（圖34B）。然後藉由流動式細胞測量術對CD25陽性CD3 +、CD4 +、及CD8 +T細胞及各種血細胞（圖34C；嗜中性球、單核球、B細胞、NK細胞、血漿清除劑）之細胞死亡百分比進行評分來測量T細胞活化及細胞毒性效應。在不存在BCMA-GPRC5D表現性目標細胞（圖34B及C）的情況下，BGCB491對T細胞或非特異性細胞死亡之活化無顯著影響。在濃度＞ 10 nM下觀察到最小T細胞活化。 第2部分.體內研究
BGCB491之抗腫瘤功效在RPMI 8226（研究A）中及H929-CRISPR-KO（研究B）人類MM異種移植物中進行評估。為了提供適合於植入人類腫瘤及人類T細胞的宿主，將雌性NSG（亦即，非肥胖糖尿病[NOD]嚴重組合免疫缺陷[ scid]γ或NOD.Cg- Prkdc scidIl2rg tm1Wjl /SzJ）小鼠用於兩項研究。
在研究A中，小鼠在第0天SC植入RPMI 8226細胞。在腫瘤細胞植入後第18天以腹膜內(IP)植入人類泛T細胞。用媒劑治療，在第19天開始IP投予BGCB491、泰克利單抗、或塔奎達單抗，且持續每週兩次達總共8次治療。研究B係作為預防研究在第-1天IP注射人類擴增之泛T細胞。將H929-BCMA-KO細胞SC植入NSG小鼠之左側腹中，而在第0天將H929-GPRC5D-KO細胞SC植入右側腹中。用媒劑（亦即，磷酸鹽緩衝鹽水[PBS]）治療，在第1天開始BGCB491、泰克利單抗、或塔奎達單抗，且每週投予兩次達7次治療。
在研究A（回歸模型）中，在第38天計算RPMI 8226異種移植物之百分比Δ腫瘤生長抑制(tumor growth inhibition, TGI)，此時＞70%經媒劑處理的對照動物仍在研究中。在RPMI 8226細胞中，BCMA及GPRC5D之每個細胞之受體密度分別為2317及486。BGCB491在0.4 mg/kg（相當於20公克小鼠大約8 µg）、1 mg/kg（20 µg/小鼠）、及2.5 mg/kg（50 µg/小鼠）時觀察到統計學上顯著的ΔTGI，分別導致ΔTGI值為90.5%、106.2%、及111.2%（所有組相對於媒劑對照組之p＜0.05）（圖35）。0.1 mg/kg（2 µg/小鼠）之最低劑量導致38.4% ΔTGI (p=0.035)，其被視為無效。相較於經PBS處理之對照小鼠，泰克利單抗分別以0.4 mg/kg之85% ΔTGI、1 mg/kg之105.6% ΔTGI、及2.5 mg/kg之111.9% ΔTGI抑制腫瘤生長，而塔奎達單抗則以2.5 mg/kg給藥抑制77.2% ΔTGI之RPMI 8226腫瘤生長（所有組相對於經PBS處理之對照組之p＜0.05）。
在RPMI 8226模型中，BGCB491媒介之腫瘤消退在治療停止後繼續觀察多於2週。在第60天（最後給藥後19天）評估相較於初始腫瘤負荷之腫瘤消退(tumor regression, TR)百分比。在1及2.5 mg/kg之BGCB491觀察到腫瘤消退，分別導致80.27% (p＜0.0001)及100% (p＜0.0001)之TR值。0.4 mg/kg劑量在第60天具有28.7%之TR，但不具統計學意義。同樣地，泰克利單抗誘發之TR在1 mg/kg為68.88% (p=0.0025)及在2.5 mg/kg為100% (p＜0.0001)。在72小時培養檢定中使用RPMI 8226細胞進行的體外測試中，相較於單獨的泰克利單抗或塔奎達單抗，BGCB491顯示出不具加成效果之類似的細胞毒性概況。
在研究B（預防性模型）中，在腫瘤植入後第22天計算TGI百分比，此時＞ 70%動物仍在研究中。相較於經PBS處理之對照組，BGCB491在0.1、0.25、及0.5 mg/kg時觀察到針對BCMA-KO腫瘤之統計學上顯著的TGI，分別導致89.2%、91.1%、及83.6% TGI（所有p值＜ 0.05；圖36）。泰克利單抗在測試之劑量水平（0.1 mg/kg，17.2% TGI；及0.25 mg/kg，19.9% TGI）均無功效，而塔奎達單抗在0.1及0.25 mg/kg劑量水平皆抑制腫瘤生長100% (p＜0.05)。針對抗GPRC5D-KO腫瘤，BGCB491治療在0.1、0.25、及0.5 mg/kg劑量水平產生100% TGI之顯著功效（所有組之p＜0.05）。0.025 mg/kg劑量具有22.09% TGI之輕微影響，其未被視為具有生物學意義(34)。泰克利單抗在0.1及0.25 mg/kg劑量水平下(p＜0.05)以100% TGI抑制H929-GPRC5D-KO腫瘤生長，塔奎達單抗則無此效果。在H929 BCMA-KO細胞中，BCMA及GPRC5D之每個細胞之受體密度分別為1及957。在H929 GPRC5D-KO細胞中，BCMA及GPRC5D之每個細胞之受體密度分別為3926及19。
在治療後監測動物直至表現出移植物抗宿主疾病(GvHD)相關的發病跡象，此時將動物安樂死並結束研究。
綜上所述，該三特異性mAb BGCB491在許多MM細胞系中展現出功效，並且能夠消耗表現單目標或雙目標之殖株群體。BGCB491亦能夠在更加生理的環境（如全血檢定）殺滅目標表現性細胞。重要的是，BGCB491能夠以劑量依賴性方式消耗MM患者漿細胞。BGCB491功效亦反映在體內小鼠異種移植模型中之腫瘤生長的顯著減少。最終，目標陰性細胞沒有非特異性T細胞活化或細胞毒性。此等結果指示BGCB491可在治療MM患者中具有顯著的治療潛力。
在進一步體內研究中，BGCB491之抗腫瘤功效在MM.1S（研究C）人類MM異種移植物中進行評估。為了提供適合於植入人類腫瘤及人類T細胞的宿主，將雌性NSG（亦即，非肥胖糖尿病[NOD]嚴重組合免疫缺陷[ scid]γ或NOD.Cg- Prkdc scidIl2rg tm1Wjl /SzJ)）小鼠用於研究。
在研究C中，小鼠在第0天SC植入MM.1S細胞。在腫瘤細胞移植後第13天，將人類擴增的泛T細胞腹膜內(IP)植入，並用媒劑治療，在第15天開始IP投予BGCB491、泰克利單抗、或塔奎達單抗，且持續每週兩次達總共7次治療。
腫瘤植入後第34天計算百分比腫瘤生長抑制(TGI)，此時＞ 70%動物仍在研究中。相較於經PBS處理之對照組，BGCB491在0.025、0.1、0.5、及1 mg/kg時觀察到針對MM.1S腫瘤之統計學上顯著的TGI，分別導致66.9%、91.2%、99.7%、及100% TGI（所有p值＜ 0.05； 圖 45）。泰克利單抗在兩種測試之劑量水平（0.1 mg/kg，73.7% TGI；及0.5 mg/kg，92.3% TGI (p＜0.05)）抑制腫瘤生長。塔奎達單抗在0.025 mg/kg有效，具有90.9% TGI，且在0.1 mg/kg為99.4% (p＜0.05)。
治療停止後2週，BGCB491媒介之腫瘤消退。在第51天（最後給藥後14天）評估相較於初始腫瘤負荷之腫瘤消退(TR)百分比。在0.5及1 mg/kg之BGCB491觀察到腫瘤消退，導致各者100%之TR值（8個已確立腫瘤中8個完全消退）。0.4 mg/kg劑量在第60天具有28.7%之TR，但不具統計學意義。泰克利單抗未誘發任何腫瘤消退，但0.1 mg/kg之塔奎達單抗導致100% TR之已確立之MM.1S腫瘤。 實例12 ：治療對人類及其他物種之親和力
該CD3結合臂（亦即，CD3B376）結合至食蟹獼猴CD3。簡言之，在將人類及食蟹獼猴周邊血液單核細胞(PBMC)與GCDB381（亦即，二價IgG1-AAS抗體中之CD3B376 Fab）、CD3B891（亦即，CD3B376x空，IgG1-AAS雙特異性抗體）、或空對照組培養之後，藉由流動式細胞測量術測量結合。
該BCMA（BCMB601，含有BCMB519 scFv）結合臂未結合至食蟹獼猴BCMA（表19A）。
作為BGCB463分子的一部分，評估該GPRC5D（亦即GC5B680）及BCMA結合臂與食蟹獼猴的交叉反應性，該分子使用與BGCB491相同的結合臂。使用基於FACS之細胞結合在37℃下1小時與穩定表現人類或食蟹獼猴GPRC5D或BCMA之K562對兩個目標結合scFv臂來分析對食蟹獼猴之交叉反應性。GC5B680 scFv臂之基於細胞的EC 50值針對人類GPRC5D表現性細胞係大約30 nM，且在食蟹獼猴GPRC5D表現性細胞上弱約10倍（大約400 nM）。相比之下，BCMB519 scFv臂之基於細胞的EC 50值對於人類BCMA係大約145 nM，而在高達2 µM時與食蟹獼猴BCMA沒有可偵測的結合。 實例13 ：脫靶毒性評估
使用Retrogenix™細胞微陣列（未觀察到脫靶可靠性）及功能選擇性TAA –細胞系檢定分別評估由於與腫瘤抗原結合臂相關之脫靶結合或功能活性導致的潛在風險。
BGCB491之CD3臂的選擇性藉由在不存在目標表現性細胞的情況下缺乏細胞毒性及T細胞活化來證明（圖34A至圖34C；請參見實例12）。 GPRC5D脫靶結合評估
在篩選針對固定的HEK293細胞之結合，個別表現5,868個全長人類血漿膜及細胞表面連接之人類分泌蛋白質庫（包括所有已知的G蛋白偶聯受體家族C第5組[GPRC5]家族成員）及371個異二聚體時，判定GPRC5D結合物（GC5B1257.001，抗GPRC5D GC5B680 scFv-Fc）與其主要目標GPRC5D特異性結合。沒有鑑別出脫靶交互作用，證明BGCB491中所含有之GPRC5D結合域的目標特異性。 BCMA脫靶結合評估
在篩選針對固定的HEK293細胞之結合，個別表現5,475個全長人類血漿膜及細胞表面連接之人類分泌蛋白質庫及371個異二聚體時，判定BCMA結合物（BCMB601.001，抗BCMA BCMB519 scFv-Fc）與其主要目標BCMA (TNFRSF17)特異性結合。沒有鑑別出脫靶交互作用，證明BGCB491中所含有之BCMA結合域的目標特異性。 腫瘤相關抗原陰性細胞系中之功能選擇性
在體外功能檢定中進一步表徵BGCB491之抗原特異性，使用一組缺乏GPRC5D、BCMA、及CD3之表現（如由流動式細胞測量術所證實）的5種癌細胞系，但藉由轉錄物預測表現＞50%之已知細胞表面蛋白。在與健康供體來源的T細胞的共培養研究中，當添加至具有表現GPRC5D及BCMA之目標細胞（亦即，H929細胞）之共培養物中時，評估BGCB491對於抗體依賴性、T細胞媒介之顆粒酶B、干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α及介白素(IL)-2之誘導。此等數據可支持BGCB491對GPRC5D及BCMA之抗原特異性。 實例14 ：局部耐受性
在分別用0.1或0.01 mg/kg BGCB491 SC在2至2.5 mL中以0.05及0.5 mg/mL處理之迷你豬的PK研究中，評估皮膚反應（請參見實施例16中之Göttingen迷你豬藥物動力學）。未觀察到皮膚反應。 實例15 ：臨床前物種中之藥物動力學小鼠的藥物動力學
BGCB491之血清及腫瘤PK性質在NSG MM.1S異種移植小鼠模型中以0.5及0.1 mg/kg之單次IV注射之後進行表徵。 食蟹獼猴藥物動力學
BGCB491之PK性質在雌性食蟹獼猴(n=3)中之單次劑量非GLP PK研究之後進行表徵。以0.5 mg/kg（10 mM組胺酸，pH 6.5）之劑量水平將BGCB491以IV投予至食蟹獼猴。使用MSD之合格的電化學發光免疫檢定(ECLIA)來定量總BGCB491的濃度。藉由最大血清濃度(C max)及1個劑量間隔之血清濃度相對於時間曲線(AUC)下的面積所評估之BGCB491全身性藥物暴露顯示於表31中，且BGCB491血清濃度繪示於圖37中。 表31 ：在食蟹獼猴中0.5 mg/kg 之單次IV 劑量之後的個別及平均(SD) 總BGCB491 PK 參數估計值（第2 組；n=3/ 組）
ID C max AUC last AUC inf CL V z T 1/2
(µg/mL) （µg· 天/mL ） （µg· 天/mL ） （mL/ 天/kg ） (mL/kg) （天）
2501 9.39 35.61 35.81 13.96 74.51 3.70
2502 8.49 32.73 32.95 15.17 137.01 6.26
2503 9.22 47.95 48.74 10.26 126.52 8.55
平均值 9.03 38.76 39.17 13.13 112.68 6.17
SD 0.48 8.08 8.41 2.56 33.47 2.43
AUC inf，外推至無限大之血清濃度-時間曲線下之面積；AUC last，直至最後一次取樣點之血清濃度-時間曲線下面積；CL，全身性清除率；C max，最大血清濃度；IV，靜脈內；PK，藥物動力學；SD，標準偏差；T 1/2，終期消除半衰期；V z，總全身性清除率。 Göttingen迷你豬藥物動力學
BGCB491之PK性質在雄性Göttingen迷你豬（n=4/組）中之單次劑量非GLP PK研究之後進行表徵。將BGCB491以0.1 mg/kg之劑量水平IV投予至迷你豬，或以0.1或0.01 mg/kg之劑量水平SC投予（10 mM組氨酸，pH 6.5）。使用MSD之合格的ECLIA來定量總BGCB491的濃度。使用迷你豬PK研究來估計BGCB491之吸收率(ka)及SC生體可用率(F)參數。在約0.01至0.1 mg/kg之劑量範圍內，藥物暴露（C max及AUC inf）以近似劑量比例的方式隨劑量而增加。藉由C max及1個劑量間隔之AUC所評估之BGCB491全身性藥物暴露顯示於表32中，且BGCB491血清濃度繪示於圖39A中。 表32 ：在雄性迷你豬中BGCB491 之單次劑量之後的個別及平均(SD) 總BGCB491 PK 參數估計值（n=4/ 組）
ID C max T max a AUC last AUC inf CL V z T 1/2
(µg/mL) （天） （µg· 天/mL ） （µg· 天/mL ） （mL/ 天/kg ） (mL/kg) （天）
第1 組：0.01 mg/kg SC
1001 0.0512 2.00 0.9688 1.3280 - - 15.80
1002 0.0515 0.25 0.3699 0.5884 - - 6.73
1003 0.0473 3.00 0.5145 1.0341 - - 12.54
1004 0.0587 1.00 0.5769 0.9630 - - 10.12
平均值 0.0522 1.50 0.6075 0.9784 - - 11.30
SD 0.0047 0.25-3.00 0.2560 0.3042 - - 3.83
第2 組：0.1 mg/kg SC
2001 0.6308 2.00 10.1287 13.5595 - - 15.22
2002 0.6264 2.00 7.1009 9.1614 - - 8.23
2003 0.4533 7.00 5.4560 7.9707 - - 9.52
2004 0.4717 4.00 5.9607 11.4536 - - 14.90
平均值 0.5455 3.00 7.1616 10.5363 - - 11.97
SD 0.0962 2.00-7.00 2.0943 2.4802 - - 3.61
第3 組：0.1 mg/kg IV
3001 1.6311 - 6.1690 8.5061 11.7563 97.0290 5.72
3002 1.8074 - 13.3265 20.4865 4.8813 154.0263 21.87
3003 1.8519 - 6.7074 9.8693 10.1324 95.3027 6.52
3004 1.6333 - 11.7039 16.0389 6.2348 148.9873 16.56
平均值 1.7309 - 9.4767 13.7252 8.2512 123.8363 12.67
SD 0.1154 - 3.5773 5.5730 3.2273 32.0250 7.87
AUC inf，外推至無限大之血清濃度-時間曲線下之面積；AUC last，直至最後一次取樣點之血清濃度-時間曲線下面積；CL，全身性清除率；C max，最大血清濃度；IV，靜脈內；PK，藥物動力學；SD，標準偏差；T 1/2，終期消除半衰期；T max，達最大血清濃度之時間；V z，總全身性清除率。 所有動物之外推AUC＞20%。 a呈現T max之中值及範圍。 參考文獻1      Ridgway, J. B., Presta, L. G. & Carter, P. 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng 9, 617-621, doi:10.1093/protein/9.7.617 (1996). 2      Tustian, A. D., Endicott, C., Adams, B., Mattila, J. & Bak, H. Development of purification processes for fully human bispecific antibodies based upon modification of protein A binding avidity. MAbs 8, 828-838, doi:10.1080/19420862.2016.1160192 (2016). 3      Von Kreudenstein, T. S. et al. Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability: quality by molecular design. MAbs 5, 646-654, doi:10.4161/mabs.25632 (2013). 4      De Groot, A. S. & Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clinical immunology 131, 189-201, doi:10.1016/j.clim.2009.01.009 (2009). 5.     Usmani SZ, Berdeja JG, Truppel-Hartmann A, et al. KarMMa-4: Idecabtagene vicleucel (ide-cel, bb2121), a BCMA-directed CAR T-cell therapy in high-risk newly diagnosed multiple myeloma. J Clin Oncol. 2021; 39(15_suppl):TPS8053. doi: 10.1200/JCO.2021.39.15_suppl.TPS8053 6.     Berdeja JG, Krishnan AY, Oriol A, et al. Updated results of a phase 1, first-in-human study of talquetamab, a G protein-coupled receptor family C group 5 member D (GPRC5D) x CD3 bispecific antibody, in relapsed/refractory multiple myeloma (MM). J Clin Oncol. 2021; 39(15_suppl):8008. doi: 10.1200/JCO.2021.39.15_suppl.8008 7.     Usmani SZ, Berdeja JG, Madduri D, et al. Ciltacabtagene autoleucel, a B-cell maturation antigen (BCMA)-directed chimeric antigen receptor T-cell (CAR-T) therapy, in relapsed/refractory multiple myeloma (R/R MM): updated results from CARTITUDE-1. J Clin Oncol. 2021; 39(15_suppl):8005. doi: 10.1200/JCO.2021.39.15_suppl.8005 8.     Maus MV, June CH. Zoom Zoom: racing CARs for multiple myeloma. Clin Cancer Res. 2013; 19(8):1917-1919. doi:10.1158/1078-0432.CCR-13-0168 9.     Darce JR, Arendt BK, Chang SK, Jelinek DF. Divergent effects of BAFF on human memory B cell differentiation into Ig-secreting cells. J Immunol. 2007; 178(9):5612-5622. doi:10.4049/jimmunol.178.9.5612 10.   Tai YT, Anderson KC. Targeting B-cell maturation antigen in multiple myeloma.Immunotherapy. 2015; 7(11):1187-1199. doi:10.2217/imt.15.77 11.   Patel DR, Wallweber HJ, Yin J, et al. Engineering an APRIL-specific B cell maturation antigen. J Biol Chem. 2004; 279(16):16727-16735. doi:10.1074/jbc.M312316200 12.   Laurent SA, Hoffmann FS, Kuhn PH, et al. γ-Secretase directly sheds the survival receptorBCMAfrom plasma cells. Nat Commun. 2015; 6:7333。2015年6月11日發表。doi:10.1038/ncomms8333 13.   Pillarisetti K, Powers G, Luistro L, et al. Teclistamab is an active T cell-redirecting bispecific antibody against B-cell maturation antigen for multiple myeloma. Blood Adv. 2020;4(18):4538-4549. doi:10.1182/bloodadvances.2020002393 14.   Sanchez E, Li M, Kitto A, et al. Serum B-cell maturation antigen is elevated in multiple myeloma and correlates with disease status and survival. Br J Haematol. 2012;158(6):727-738. doi:10.1111/j.1365-2141.2012.09241.x 15.   Huehls AM, Coupet TA, Sentman CL. Bispecific T-cell engagers for cancer immunotherapy. Immunol Cell Biol. 2015;93(3):290-296. doi:10.1038/icb.2014.93 16.   Strohl WR, Naso M. Bispecific T-cell redirection versus chimeric antigen receptor (CAR)-T cells as approaches to kill cancer cells. Antibodies (Basel). 2019;8(3):41。2019年7月3日發表。doi:10.3390/antib8030041 17.   Shah N, Chari A, Scott E, Mezzi K, Usmani SZ. B-cell maturation antigen (BCMA) in multiple myeloma: rationale for targeting and current therapeutic approaches. Leukemia. 2020;34(4):985-1005. doi:10.1038/s41375-020-0734-z 18.   Bräuner-Osborne H, Jensen AA, Sheppard PO, Brodin B, Krogsgaard-Larsen P, O'Hara P. Cloning and characterization of a human orphan family C G-protein coupled receptor GPRC5D. Biochim Biophys Acta. 2001;1518(3):237-248. doi:10.1016/s0167-4781(01)00197-x 19.   Atamaniuk J, Gleiss A, Porpaczy E, et al. Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest. 2012;42(9):953-960. doi:10.1111/j.1365-2362.2012.02679.x 20.   Frigyesi I, Adolfsson J, Ali M, et al. Robust isolation of malignant plasma cells in multiple myeloma. Blood. 2014;123(9):1336-1340. doi:10.1182/blood-2013-09-529800 21.   Smith EL, Harrington K, Staehr M, et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Sci Transl Med. 2019;11(485):eaau7746. doi:10.1126/scitranslmed.aau7746 22.   Pillarisetti K, Edavettal S, Mendonça M, et al. A T-cell-redirecting bispecific G-protein-coupled receptor class 5 member D x CD3 antibody to treat multiple myeloma. Blood. 2020;135(15):1232-1243. doi:10.1182/blood.2019003342 23.   Verkleij CPM, Broekmans MEC, van Duin M, et al. Preclinical activity and determinants of response of the GPRC5DxCD3 bispecific antibody talquetamab in multiple myeloma. Blood Adv. 2021;5(8):2196-2215. doi:10.1182/bloodadvances.2020003805 24.   Kodama T, Kochi Y, Nakai W, et al. Anti-GPRC5D/CD3 bispecific T-cell-redirecting antibody for the treatment of multiple myeloma. Mol Cancer Ther. 2019;18(9):1555-1564. doi:10.1158/1535-7163.MCT-18-1216 25.   Carpenter RO, Evbuomwan MO, Pittaluga S, et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clin Cancer Res. 2013;19(8):2048-2060. doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-2422 26.   Seckinger A, Delgado JA, Moser S, et al. Target Expression, Generation, Preclinical Activity, and Pharmacokinetics of the BCMA-T Cell Bispecific Antibody EM801 for Multiple Myeloma Treatment. Cancer Cell. 2017;31(3):396-410. doi:10.1016/j.ccell.2017.02.002 27.   Inoue S, Nambu T, Shimomura T. The RAIG family member, GPRC5D, is associated with hard-keratinized structures. J Invest Dermatol. 2004;122(3):565-573. doi:10.1046/j.0022-202X.2004.12628.x 28.   Rajkumar SV, Harousseau JL, Durie B, et al. Consensus recommendations for the uniform reporting of clinical trials: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 1. Blood. 2011;117(18):4691-4695. doi:10.1182/blood-2010-10-299487 29.   Rodriguez-Abreu D, Bordoni A, Zucca E. Epidemiology of hematological malignancies. Ann Oncol. 2007;18 Suppl 1:i3-i8. doi:10.1093/annonc/mdl443 30.   Michels TC, Petersen KE. Multiple myeloma: diagnosis and treatment. Am Fam Physician. 2017;95(6):373-383. 31.   Gandhi UH, Cornell RF, Lakshman A, et al. Outcomes of patients with multiple myeloma refractory to CD38-targeted monoclonal antibody therapy. Leukemia. 2019;33(9):2266-2275. doi:10.1038/s41375-019-0435-7 32.   Dimopoulos MA, San-Miguel J, Belch A, et al. Daratumumab plus lenalidomide and dexamethasone versus lenalidomide and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: updated analysis of POLLUX. Haematologica. 2018;103(12):2088-2096. doi:10.3324/haematol.2018.194282 33.   Kumar SK, Callander NS, Adekola K, et al. Multiple Myeloma, Version 3.2021, NCCN clinical practice guidelines in oncology. J Natl Compr Canc Netw. 2020;18(12):1685-1717。2020年12月2日發表。doi:10.6004/jnccn.2020.0057 34.   Johnson JI, Decker S, Zaharevitz D, et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br J Cancer. 2001;84(10):1424-1431. doi:10.1054/bjoc.2001.1796 35.   Chiu A, Xu W, He B, et al. Hodgkin lymphoma cells express TACI and BCMA receptors and generate survival and proliferation signals in response to BAFF and APRIL. Blood. 2007; 109(2):729-739. doi:10.1182/blood-2006-04-015958 36.   Avery DT, Kalled SL, Ellyard JI, et al. BAFF selectively enhances the survival of plasmablasts generated from human memory B cells [published correction appears in J Clin Invest. 2004 Apr; 113(7):1069]. J Clin Invest. 2003; 112(2):286-297. doi:10.1172/JCI18025 37.   O’Connor BP, Raman VS, Erickson LD, et al. BCMA is essential for the survival of long-lived bone marrow plasma cells. J Exp Med. 2004; 199(1):91-98. doi:10.1084/jem.20031330 38.   Bu DX, Singh R, Choi EE, et al. Pre-clinical validation of B cell maturation antigen (BCMA) as a target for T cell immunotherapy of multiple myeloma. Oncotarget. 2018; 9(40):25764-25780。2018年5月25日發表。doi:10.18632/oncotarget.25359 39.   Carpenter RO, Evbuomwan MO, Pittaluga S, et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clin Cancer Res. 2013; 19(8):2048-2060. doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-2422 40.   Laâbi Y, Gras MP, Carbonnel F, et al. A new gene, BCM, on chromosome 16 is fused to the interleukin 2 gene by a t(4;16)(q26;p13) translocation in a malignant T cell lymphoma. EMBO J. 1992;11(11):3897-3904. 41.   Laabi Y, Gras MP, Brouet JC, Berger R, Larsen CJ, Tsapis A. The BCMA gene, preferentially expressed during B lymphoid maturation, is bidirectionally transcribed. Nucleic Acids Res. 1994;22(7):1147-1154. doi:10.1093/nar/22.7.1147 42.   Kalled SL. The role of BAFF in immune function and implications for autoimmunity. Immunol Rev. 2005;204:43-54. doi:10.1111/j.0105-2896.2005.00219.x 43.   Ng LG, Sutherland AP, Newton R, et al. B cell-activating factor belonging to the TNF family (BAFF)-R is the principal BAFF receptor facilitating BAFF costimulation of circulating T and B cells. J Immunol. 2004;173(2):807-817. doi:10.4049/jimmunol.173.2.807 44.   Venkateshaiah SU, Bam R, Li X, Khan S, Ling W, Randal SS, Yaccoby S. GPRC5D is a cell surface plasma cell marker whose expression is high in myeloma cells and reduced following coculture with osteoclasts. Blood. 2013;122(21):3099. doi: 10.1182/blood.V122.21.3099.3099 45.   Kamperschroer C, Shenton J, Lebrec H, Leighton JK, Moore PA, Thomas O. Summary of a workshop on preclinical and translational safety assessment of CD3 bispecifics. J Immunotoxicol. 2020;17(1):67-85. doi:10.1080/1547691X.2020.1729902 46.   Li J, Piskol R, Ybarra R, et al. CD3 bispecific antibody-induced cytokine release is dispensable for cytotoxic T cell activity. Sci Transl Med. 2019;11(508):eaax8861. doi:10.1126/scitranslmed.aax8861 47.   Leong SR, Sukumaran S, Hristopoulos M, et al. An anti-CD3/anti-CLL-1 bispecific antibody for the treatment of acute myeloid leukemia. Blood. 2017;129(5):609-618. doi:10.1182/blood-2016-08-735365 48.   Singh A, Dees S, Grewal IS. Overcoming the challenges associated with CD3+ T-cell redirection in cancer. Br J Cancer. 2021;124(6):1037-1048. doi:10.1038/s41416-020-01225-5 49.   Jain T, Litzow MR. Management of toxicities associated with novel immunotherapy agents in acute lymphoblastic leukemia. Ther Adv Hematol. 2020;11:2040620719899897。2020年1月20日發表。doi:10.1177/2040620719899897 50.   Ling J, Zhou H, Jiao Q, Davis HM. Interspecies scaling of therapeutic monoclonal antibodies: initial look. J Clin Pharmacol. 2009;49(12):1382-1402. doi:10.1177/0091270009337134 51.   Woo S, Jusko WJ. Interspecies comparisons of pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant human erythropoietin. Drug Metab Dispos. 2007;35(9):1672-1678. doi:10.1124/dmd.107.015248 52.   Li J, Stagg NJ, Johnston J, et al. Membrane-proximal epitope facilitates efficient T cell synapse formation by anti-FcRH5/CD3 and is a requirement for myeloma cell killing. Cancer Cell. 2017;31(3):383-395. doi:10.1016/j.ccell.2017.02.001 53.   ClinicalTrials.gov. NCT02879695: Blinatumomab and nivolumab with or without ipilimumab in treating patients with poor-risk relapsed or refractory CD19+ precursor B-lymphoblastic leukemia. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02879695。存取：2021年6月23日。 54.   Guillerey C, Nakamura K, Pichler AC, et al. Chemotherapy followed by anti-CD137 mAb immunotherapy improves disease control in a mouse myeloma model. JCI Insight. 2019;5(14):e125932。2019年6月13日發表。doi:10.1172/jci.insight.125932
本文所述的所有專利、已公開申請案和參考文獻的教示該等文獻全文以引用的方式併入本文中。
儘管已具體顯示並描述例示實施例，但所屬技術領域中具有通常知識者將理解可於其中進行形式及細節之各種改變而不脫離由隨附申請專利範圍所涵蓋的本實施例範疇。 序列之列表 SEQ ID NO: 1CD3B376 LCDR1 TGTSSNIGTYKFVS SEQ ID NO: 2CD3B376 LCDR2 EVSKRPS SEQ ID NO: 3CD3B376 LCDR3 VSYAGSGTLL SEQ ID NO: 4CD3B376 HCDR1 GDSVFNNNAAWS SEQ ID NO: 5CD3B376 HCDR2 RTYYRSKWLYD SEQ ID NO: 6CD3B376 HCDR3 GYSSSFDY SEQ ID NO: 7CD3B376 VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVL SEQ ID NO: 8CD3B376 VH QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 9GC5B680 LCDR1 RSSQSLVHSDGNTYLS SEQ ID NO: 10GC5B680 LCDR2 KISNRFF SEQ ID NO: 11GC5B680 LCDR3 MQATQFPHT SEQ ID NO: 12GC5B680 HCDR1 GFSLTNIRMSVS SEQ ID NO: 13GC5B680 HCDR2 HIFSNDEKS SEQ ID NO: 14GC5B680 HCDR3 MRLPYGMDV SEQ ID NO: 15GC5B680 VL DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYKISNRFFGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQATQFPHTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 16GC5B680 VH QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLTNIRMSVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISRDTSKSQVVLTLTNVDPVDTATYYCARMRLPYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 17BCMB519 LCDR1 RASQSISSSFLT SEQ ID NO: 18BCMB519 LCDR2 GASSRAT SEQ ID NO: 19BCMB519 LCDR3 QHYGSSPMYT SEQ ID NO: 20BCMB519 HCDR1 GFTFSSYAMS SEQ ID NO: 21BCMB519 HCDR2 AISGSGGSTY SEQ ID NO: 22BCMB519 HCDR3 DEGYSSGHYYGMDV SEQ ID NO: 23BCMB519 VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGGGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSPMYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 24BCMB519 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDEGYSSGHYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 25連接子 GGSEGKSSGSGSESKSTGGS SEQ ID NO: 26BGCB463重鏈1 QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 27BGCB463輕鏈1 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 28BGCB463重鏈2 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYKISNRFFGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQATQFPHTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLTNIRMSVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISRDTSKSQVVLTLTNVDPVDTATYYCARMRLPYGMDVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGGGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSPMYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDEGYSSGHYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 29BGCB491重鏈1 QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYKISNRFFGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQATQFPHTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLTNIRMSVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISRDTSKSQVVLTLTNVDPVDTATYYCARMRLPYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 30BGCB491輕鏈 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 31BGCB491重鏈2 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGGGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSPMYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDEGYSSGHYYGMDVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 32BCMA CDR SGSYFWG SEQ ID NO: 33BCMA CDR SIYYSGITYYNPSLKS SEQ ID NO: 34BCMA CDR HDGAVAGLFDY SEQ ID NO: 35BCMA CDR SSSYYWG SEQ ID NO: 36BCMA CDR SIYYSGSTYYNPSLKS SEQ ID NO: 37BCMA CDR HDGATAGLFDY SEQ ID NO: 38BCMA CDR SSSYFWG SEQ ID NO: 39BCMA CDR GGNNIGSKSVH SEQ ID NO: 40BCMA CDR DDSDRPS SEQ ID NO: 41BCMA CDR QVWDSSSDHVV SEQ ID NO: 42BCMA VH QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSA SEQ ID NO: 43BCMA VH QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSA SEQ ID NO: 44BCMA VH QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGATAGLFDYWGQGTLVTVSSA SEQ ID NO: 45BCMA VH QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSA SEQ ID NO: 46BCMA VH QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGATAGLFDYWGQGTLVTVSSA SEQ ID NO: 47BCMA VH QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGRTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGATAGLFDYWGQGTLVTVSSA SEQ ID NO: 48BCMA VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL SEQ ID NO: 49GPRC5D CDR SYAIS SEQ ID NO: 50GPRC5D CDR NYWMS SEQ ID NO: 51GPRC5D CDR SYFIG SEQ ID NO: 52GPRC5D CDR GYTMN SEQ ID NO: 53GPRC5D CDR GIIPIFGTANYAQKFQG SEQ ID NO: 54GPRC5D CDR GISYSGGSKYYASSVKG SEQ ID NO: 55GPRC5D CDR IIYPGKSDTRYSPSFQG SEQ ID NO: 56GPRC5D CDR LINPYNSDTNYAQKLQG SEQ ID NO: 57GPRC5D CDR ESRWRGYKLD SEQ ID NO: 58GPRC5D CDR AAFDFGRRAVRLD SEQ ID NO: 59GPRC5D CDR VYSFGGRHKALFDY SEQ ID NO: 60GPRC5D CDR VALRVALDY SEQ ID NO: 61GPRC5D CDR RASQSISSYLN SEQ ID NO: 62GPRC5D CDR RASQSVSSYLA SEQ ID NO: 63GPRC5D CDR KASQNVATHVG SEQ ID NO: 64GPRC5D CDR AASSLQS SEQ ID NO: 65GPRC5D CDR DASNRAT SEQ ID NO: 66GPRC5D CDR SASYRYS SEQ ID NO: 67GPRC5D CDR QQSYSTPLT SEQ ID NO: 68GPRC5D CDR QQRSNWPLT SEQ ID NO: 69GPRC5D CDR QQYNRYPYT SEQ ID NO: 70GPRC5D CDR DYGMH SEQ ID NO: 71GPRC5D CDR SYWIG SEQ ID NO: 72GPRC5D CDR GYAMS SEQ ID NO: 73GPRC5D CDR SYGIS SEQ ID NO: 74GPRC5D CDR GYSFTGYTMN SEQ ID NO: 75GPRC5D CDR SYAMS SEQ ID NO: 76GPRC5D CDR GFSLTSYNVH SEQ ID NO: 77GPRC5D CDR AIKYSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 78GPRC5D CDR GISYSGGSKYYADSVKG SEQ ID NO: 79GPRC5D CDR IIYPGDSDTRYSPSFQG SEQ ID NO: 80GPRC5D CDR AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 81GPRC5D CDR GIIPIFGNINYAQKFQG SEQ ID NO: 82GPRC5D CDR LINPYNGDTN SEQ ID NO: 83GPRC5D CDR VIWAGGSTNYNSALMS SEQ ID NO: 84GPRC5D CDR RAESGPGLDY SEQ ID NO: 85GPRC5D CDR AAWDFGRRAVRLDY SEQ ID NO: 86GPRC5D CDR IGFYGRSFRIFDY SEQ ID NO: 87GPRC5D CDR VDRSFGRSRYTLDY SEQ ID NO: 88GPRC5D CDR VSRRFKRFAYYFDY SEQ ID NO: 89GPRC5D CDR SNFLPVVFDY SEQ ID NO: 90GPRC5D CDR DGIRLRFAY SEQ ID NO: 91GPRC5D CDR KSSQSVLYSSNNKNYLA SEQ ID NO: 92GPRC5D CDR RASQSVRKSLA SEQ ID NO: 93GPRC5D CDR WASTRES SEQ ID NO: 94GPRC5D CDR TASNRAT SEQ ID NO: 95GPRC5D CDR QQYYSTPLT SEQ ID NO: 96GPRC5D CDR QQYFRAPIT SEQ ID NO: 97GPRC5D VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARESRWRGYKLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 98GPRC5D VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISYSGGSKYYASSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAAFDFGRRAVRLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 99GPRC5D VH EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYFIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGKSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVYSFGGRHKALFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 100GPRC5D VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNSDTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARVALRVALDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 101GPRC5D VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 102GPRC5D VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 103GPRC5D VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVATHVGWYQQKPGKAPKRLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCQQYNRYPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 104GPRC5D VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSAIKYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRAESGPGLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 105GPRC5D VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISYSGGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAAWDFGRRAVRLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 106GPRC5D VH EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARIGFYGRSFRIFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 107GPRC5D VH EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVYSFGGRHKALFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 108GPRC5D VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVDRSFGRSRYTLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 109GPRC5D VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGNINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVSRRFKRFAYYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 110GPRC5D VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGDTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARVALRVALDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 111GPRC5D VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSNFLPVVFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 112GPRC5D VH QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLTSYNVHWIRQPPGKALEWLAVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMRAEDTATYYCARDGIRLRFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 113GPRC5D VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 114GPRC5D VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRKSLAWYQQKPGQAPRLLIYTASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYFRAPITFGQGTKVEIKK SEQ ID NO: 115GPRC5D VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQNVATHVGWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNRYPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 116GPRC5D MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILESLAILGIVVTILLLLAFLFLMRKIQDCSQWNVLPTQLLFLLSVLGLFGLAFAFIIELNQQTAPVRYFLFGVLFALCFSCLLAHASNLVKLVRGCVSFSWTTILCIAIGCSLLQIIIATEYVTLIMTRGMMFVNMTPCQLNVDFVVLLVYVLFLMALTFFVSKATFCGPCENWKQHGRLIFITVLFSIIIWVVWISMLLRGNPQFQRQPQWDDPVVCIALVTNAWVFLLLYIVPELCILYRSCRQECPLQGNACPVTAYQHSFQVENQELSRARDSDGAEEDVALTSYGTPIQPQTVDPTQECFIPQAKLSPQQDAGGV SEQ ID NO: 117CD3 CDR 1 TYAMN SEQ ID NO: 118CD3 CDR 2 RIRSKYNNYATYYAASVKG SEQ ID NO: 119CD3 CDR 3 HGNFGNSYVSWFAY SEQ ID NO: 120CD3 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 121CD3重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 122CD3 CDR 1 RSSTGAVTTSNYAN SEQ ID NO: 123CD3 CDR 2 GTNKRAP SEQ ID NO: 124CD3 CDR 3 ALWYSNLWV SEQ ID NO: 125CD3 VL QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL SEQ ID NO: 126CD3輕鏈 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 127連接子 GGGSGGGS SEQ ID NO: 128連接子 GGGSGGGSGGGS SEQ ID NO: 129連接子 GGGSGGGSGGGSGGGS SEQ ID NO: 130連接子 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS SEQ ID NO: 131連接子 GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 132連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 133連接子 GSTSGSGKPGSGEGSTKG SEQ ID NO: 134連接子 IRPRAIGGSKPRVA SEQ ID NO: 135連接子 GKGGSGKGGSGKGGS SEQ ID NO: 136連接子 GGKGSGGKGSGGKGS SEQ ID NO: 137連接子 GGGKSGGGKSGGGKS SEQ ID NO: 138連接子 GKGKSGKGKSGKGKS SEQ ID NO: 139連接子 GGGKSGGKGSGKGGS SEQ ID NO: 140連接子 GKPGSGKPGSGKPGS SEQ ID NO: 141連接子 GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS SEQ ID NO: 142連接子 GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS SEQ ID NO: 143連接子 STAGDTHLGGEDFD SEQ ID NO: 144連接子 GEGGSGEGGSGEGGS SEQ ID NO: 145連接子 GGEGSGGEGSGGEGS SEQ ID NO: 146連接子 GEGESGEGESGEGES SEQ ID NO: 147連接子 GGGESGGEGSGEGGS SEQ ID NO: 148連接子 GEGESGEGESGEGESGEGES SEQ ID NO: 149連接子 GSTSGSGKPGSGEGSTKG SEQ ID NO: 150連接子 PRGASKSGSASQTGSAPGS SEQ ID NO: 151連接子 GTAAAGAGAAGGAAAGAAG SEQ ID NO: 152連接子 GTSGSSGSGSGGSGSGGGG SEQ ID NO: 153連接子 GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS SEQ ID NO: 154連接子 GSGS SEQ ID NO: 155連接子 APAPAPAPAP SEQ ID NO: 156連接子 APAPAPAPAPAPAPAPAPAP SEQ ID NO: 157連接子 AEAAAKEAAAKEAAAAKEAAAAKEAAAAKAAA SEQ ID NO: 158Ig1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 159Ig1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 160Ig4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 161CD3表位 QDGNEEMGGITQTP SEQ ID NO: 162BCMA表位 LLHACIPCQL SEQ ID NO: 163連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 164BCMA CDR SIYYSGRTYYNPSLKS SEQ ID NO: 165具有劃底線的信號肽編碼區之BGCB491重鏈1基因之核苷酸序列。 atggccaggaagtccgctctgctcgctctggcacttctgcttctgggatttggacctgcttgggctcaggtgcagctgcagcagtctggccctagactcgtgcggccttcccagaccctgtctctgacctgtgccatctccggcgactccgtgttcaacaacaacgccgcctggtcctggatccggcagtctccatctcgcggtctggagtggctcggtcgcacctactaccgctctaaatggctgtacgactacgccgtgtccgtgaagtcccggatcaccgtgaaccctgacacctcccggaaccagttcaccctgcagctgaactccgtgacccctgaggacaccgccctgtactactgcgccagaggctactcctcctccttcgactattggggccaaggcaccctcgtgaccgtgtcctctgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgccgggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtgagcgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtgtcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtcctgcgccgtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtgagcaagctcaccgtggacaagagcagatggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccggttcacgcagaagtctctctccctgtctccgggaaaaggaggcggaggatctggcggaggtggaagtggcggaggcggttctggtggtggtggatctgacatcgtgatgacccagacacctctgagcagccccgttacattgggccagcctgcctccatctcctgcagatcctctcagtccctggtgcactctgacggcaacacctacctctcttggctgcagcagaggcctggacagcctcctagactgctgatctacaagatctccaaccggttcttcggcgtgcccgacagattttctggatctggcgctggcaccgacttcaccctgaagatttccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtactactgtatgcaggccacacagttccctcacacctttggccagggcaccaagctggaaatcaagggcggatctgagggaaagtccagcggctccggcagcgaaagcaagtccaccggcggaagccaagtgaccctgaaagaaagcggccctgtgctggtcaagcccaccgaaacactgaccctgacctgtaccgtgtccggcttctccctgaccaatatccggatgtccgtgtcctggatcagacagcctcctggcaaggctctggaatggctggcccacatcttctccaacgacgagaagtcctactccaccagcctgaagtcccggctgaccatctccagagacacctccaagtctcaggtggtgctgacactgaccaacgtggaccctgtggataccgccacctactactgcgccagaatgagactgccctacggcatggatgtgtggggccagggaacaaccgtgaccgtttcttct SEQ ID NO: 166具有劃底線的信號肽編碼區之BGCB491輕基因之核苷酸序列。 atggctagatccgcactgctcattctggctctgcttctgcttggactgttctctcctggagcatggggacagtctgctctgacccagcctgcctccgtgtctggctctcccggccagtccatcaccatcagctgtaccggcacctcctccaacatcggcacctacaagttcgtgtcctggtatcagcaacaccccgacaaggcccccaaagtgctgctgtacgaggtgtccaagcggccctctggcgtgtcctccagattctccggctccaagtctggcaacaccgcctccctgaccatcagcggactgcaggctgaggaccaggccgactaccactgtgtgtcctacgctggctctggcaccctgctgtttggcggaggcaccaagctgactgtcctgggtcagcccaaggctgcacccagtgtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggccgatagcagccccgtcaaggcgggagtcgaaaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca SEQ ID NO: 167具有劃底線的信號肽編碼區之BGCB491重鏈2基因之核苷酸序列。 atggccaggaagtccgctctgctcgctctggcacttctgcttctgggatttggacctgcttgggctgagatcgtgctgacccagtctcctggcacactgtcactgtctccaggcgagagagctaccctgtcctgtagagccagccagtctatctcctcctccttcctgacctggtatcagcagaagcctggacaggcccctcggctgttgatctacggtgcttcttccagagccacaggcatccctgacagattctctggcggcggatctggcaccgacttcaccctgacaatctcccggctggaacctgaggacttcgccgtgtactactgccagcactacggcagcagccccatgtacacatttggccagggcaccaagctggaaatcaagggcggatctgagggaaagtccagcggctccggcagcgaaagcaagtccaccggcggaagcgaggttcagctgctggaatctggcggaggattggttcagcctggcggttctctgagactgtcttgtgccgcttccggcttcaccttctccagctacgctatgtcctgggtccgacaggctcctggcaaaggactggaatgggtgtccgccatctctggctctggcggcagcacctactacgccgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaactccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgctaaggacgagggctactcctccggccactactacggaatggatgtgtggggccagggcaccacagtgacagtctcttctgagcccaaatctagcgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgccgggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtgagcgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtgtcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagatggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagtctctctccctgtctccgggaaaa
無
〔圖1A 〕至〔圖1B 〕描繪BGCB463三特異性抗體（圖1A）及建議作用模式（圖1B）。 〔圖2A 〕至〔圖2D 〕將BGCB463（圓形）或陰性對照B23B251（三角形）全部用H929野生型(WT)（圖2A）、H929-GPRC5D剔除(KO)（圖2B）、H929-BCMA KO（圖2C）、及H929-GPRC5D/BCMA KO（圖2D）細胞在2 µM之起始濃度下在37℃下培養1小時。在用經AF647標記之材料進行二次偵測後，分析該MFI信號以產生EC 50及EC 90。曲線代表五個獨立實驗。EC 50或EC 90值係此等的平均值。 〔圖3A 〕至〔圖3D 〕將BGCB463（圓形）或陰性對照B23B251（三角形）全部用MM.1R WT（圖3A）、MM.1R -GPRC5D KO（圖3B）、MM.1R -BCMA KO（圖3C）、及MM.1R -GPRC5D/BCMA KO（圖3D）細胞在2 µM之起始濃度下在37℃下培養1小時。在用經AF647標記之材料進行二次偵測後，分析該MFI信號以產生EC 50及EC 90。曲線代表五個獨立實驗。 〔圖4A 〕至〔圖4C 〕將BGCB463（圓形）或陰性對照B23B251（三角形）全部用泛T細胞（3個隨機供體，圖4A至圖4C）在2 µM之起始濃度下在37℃下培養1小時。在用經AF647標記之材料進行二次偵測後，分析該MFI信號以產生EC 50及EC 90。數據代表兩個個別運行，兩者皆具有三個供體。 〔圖5A 〕至〔圖5C 〕將BGCB463用泛T細胞（3個隨機供體，圖5A、圖5B、及圖5C）在2 µM之起始濃度下在4℃（圓形）或37℃（三角形）下培養1小時。在用經AF647標記之材料進行二次偵測後，分析該MFI信號以產生EC 50。 〔圖6A 〕至〔圖6C 〕將BGCB463.003（圓形）、BGCB463.004（正方形）、及陰性對照B23B251（三角形）用來自3個供體之H929（圖6A）、MM.1R（圖6B）、及Pan T（圖6C）細胞進行測試。將分子在2 µM的起始濃度下在37℃下培養1小時。在用經AF647標記之材料進行二次偵測後，分析該MFI信號。 〔圖7A 〕至〔圖7D 〕將H929（圖7A）、H929-GPRC5D KO（圖7B）、H929-BCMA KO（圖7C）、及H929-GPRC5D/BCMA KO（圖7D）細胞全部在BGCB463的三個最佳化濃度下在37℃下培養1小時、3小時、5小時、及24小時。然後將細胞洗滌並在冰上用AF647抗人類IgG培養30分鐘。所讀出者係AF647信號之MFI。 〔圖8A 〕至〔圖8D 〕將MM.1R WT（圖8A）、MM.1R -GPRC5D KO（圖8B）、MM.1R -BCMA KO（圖8C）、及MM.1R -GPRC5D/BCMA KO（圖8D）細胞全部在BGCB463的三個最佳化濃度下在37℃下培養1小時、3小時、5小時、及24小時。 然後將細胞洗滌並在冰上用AF647抗人類IgG培養30分鐘。所讀出者係AF647信號之MFI。 〔圖9A 〕至〔圖9E 〕將BGCB463（圓形）或陰性對照B23B251（三角形）全部用表現人類GPRC5D（圖9A）、人類BCMA（圖9B）、食蟹獼猴GPRC5D（圖9C）或食蟹獼猴BCMA（圖9D）之K562細胞在2 µM之起始濃度下在37℃下培養1小時。在用AF647抗人類IgG進行二次偵測後，分析該MFI信號以產生EC 50及EC 90（圖9E）。數據代表兩個獨立實驗。 〔圖10A 〕至〔圖10B 〕將BGCB463（圓形）或陰性對照B23B251（三角形）在10nM之起始濃度下用表現人類或食蟹獼猴GPRC5D之K562細胞或100 nM對於作為目標細胞之表現人類/食蟹獼猴BCMA之K562培養。圖10A中之人類活化及細胞毒性。圖10B中之食蟹獼猴活化及細胞毒性。以3:1之效應與目標(E:T)比添加人類泛T細胞（1個供體），並在37℃下培養72小時。使用活/死可固定染料判定細胞毒性，並使用BV421偶聯的抗CD25測量CD25。 〔圖11 〕在培養基（含有10%FBS之RPMI）或含有90%人類血清之RPMI存在下，將H929細胞與濃度漸增之BGCB463或陰性對照B23B251用AF647抗人類IgG在37℃下培養1小時。BGCB463結合不受血清存在影響。 〔圖12 〕在培養基（含有10%FBS之RPMI）或含有90%人類血清之RPMI存在下，將T細胞與濃度漸增之BGCB463或陰性對照B23B251用AF647抗人類IgG在37℃下培養1小時。數據代表兩個實驗中所測試之三個供體。BGCB463結合不受血清存在影響。 〔圖13A 〕至〔圖13B 〕將H929-GFP細胞與來自3個供體之BGCB463及人類泛T細胞以3:1之E:T比培養，添加抗CD25-AF647以追蹤T細胞活化（圖13A）。基於經處理相對於未經處理的孔中之GFP信號計算細胞溶解百分比（圖13B）。持續培養約140小時，每三小時獲取一次影像。 〔圖14A 〕至〔圖14F 〕將H929-GFP細胞與來自四個供體之BGCB463、或B23B251（同型對照）分子及人類泛T細胞以1:1及5:1之E:T比培養，添加抗CD25-AF647以追蹤T細胞活化。基於經處理相對於未經處理的孔中之GFP信號計算細胞溶解百分比。持續培養約140小時，每三小時獲取一次影像。BGCB463，1:1之比，細胞溶解（圖14A）。BGCB463，1:1之比，總積分強度（圖14B）。BGCB463，5:1之比，細胞溶解（圖14C）。BGCB463，5:1之比，總積分強度（圖14D）。B23B251，5:1之比，細胞溶解（圖14E）。B23B251，5:1之比，總積分強度（圖14F）。 〔圖15A 〕至〔圖15D 〕使用患者血清判定可溶性BCMA干擾。供體1（圖15A）；供體2（圖15B）；供體3（圖15C）；及正常血清（圖15D）。將具有已知水平之sBCMA的患者血清與經直接標記之BGCB463-AF647及B23B251-AF647同型對照在37℃下在H929細胞上培養（90%血清至10%培養基）1小時。將50%及10%患者血清用正常血清分別稀釋至50%及10%之最終濃度。 〔圖16 〕描繪BGCB491三特異性抗體。 〔圖17A 〕至〔圖17B 〕針對BCMA +GPRC5D +細胞（圖17A）及BCMA -GPRC5D -細胞（圖17B）測試BGCB463、BGCB491及三個對照組（BGCB482（CD3x空x空））、BGCB483（CD3x空xBCMA）、BGCB484（CD3xGPRC5Dx空））。效應物與目標(E:T)比為3:1；n =1個T細胞供體，培養72小時，最高濃度53 nM，1至5稀釋度。對於細胞毒性及T細胞活化兩者進行測試。 〔圖18A 〕至〔圖18B 〕在初次培養後72及96小時，BGCB463及BGCB491消耗H929 WT、GPRC5D KO、及BCMA KO細胞系（圖18A）。該E:T比係3:1，n =5個T細胞供體；培養72(5)及96(4)小時；最高濃度532 mM，1至5稀釋度梯度。兩種抗體在如上相同的H929 WT、GPRC5D KO、及BCMA KO細胞中皆顯示72及96小時之T細胞活化增加（圖18B）。 〔圖19 〕用H929、RAMOS、及GRANTA-519細胞系在細胞毒性及T細胞活化檢定中測試BGCB463及BGCB491。E:T係5:1，n=1個T細胞供體；僅培養72小時；最高濃度為53 nM；及1至5稀釋度。 〔圖20 〕用H292細胞在細胞毒性及T細胞活化全血檢定中測試GBCB463及BGCB491。E:T係5:1，n=2個全血供體；培養48小時；最高濃度為532 nM；及1至5稀釋度。 〔圖21A 〕至〔圖21B 〕若給予足夠高的劑量，則顯示BGCB463在MM.1S及RPMI 8226異種移植小鼠模型中抑制腫瘤生長：在該MM.1S模型中2ug或10ug（圖21A）或在該RPMI 8226模型中5ug或10 ug（圖21B）。 〔圖22 〕在H929預防性異種移植小鼠模型中，BGCB463及BGCB491顯示抑制腫瘤生長。相較於PBS對照組，0.5ug及5ug劑量兩者均減緩了在H929-BCMA KO及H929-GPRC5D KO模型中的腫瘤生長，較高的5ug濃度顯示出更大的效果。 〔圖23 〕在1小時、37℃DRC泛T結合檢定中，對BGCB463及BGCB491進行測試。使用兩個人類泛T細胞供體，且測試分子具有2uM起始濃度、1:3稀釋度及11點DRC。 〔圖24A 〕至〔圖24D 〕在1小時、37℃DRC套件結合檢定中，針對H929 WT（圖24A）、H929-BCMA KO（圖24B）、H929-GPRC5D KO（圖24C）、及H929-BCMA/GPRC5D雙KO（圖24D）細胞對BGCB463、BGCB491、及空對照組進行測試。 〔圖25 〕BGCB491在H929 WT、H929-BCMA KO細胞、H929-GPRC5D KO細胞、及/或H929-BCMA/GPRC5D雙KO細胞上在37℃下培養1小時之後之代表性結合概況。以●指示BGCB491，且以■指示陰性對照CD3x空x空BGCB510。曲線代表5個獨立實驗。H929-GPRC5D-KO殖株H15係異型的KO系，具有2個30%及61%分佈的基因拷貝。H929-BCMA-KO殖株J8係異型的KO系，具有2個相等50%分佈的基因拷貝。 〔圖26 〕BGCB491在7個供體細胞製劑上在37℃下培養1小時之後之初級T細胞結合概況。MFI，平均螢光強度。 〔圖27 〕用CD3B376x空對照抗體(GCDB381)外推代表性生物資訊結合曲線。 〔圖28A 〕至〔圖28B 〕BCMA-GPRC5D雙陽性及BCMA-GPRC5D雙陰性細胞系之BGCB491媒介之（圖28A）細胞毒性及（圖28B）T細胞活化。在來自6個健康供體（供體ID：20063323、20063309、20062062、20063310、20062105、及20061963）之泛T細胞及Fc阻斷劑(2 mg/mL)存在下，以各種濃度（0.00005至533.33 nM，X軸）添加BGCB491、BCMAxGPRC5Dx空、及CD3x空x空，且培養72小時。在此等研究中測試3:1之最佳E:T比（對於E:T比評估，請參見圖33A至圖33B）。使用Prism 8藉由將單獨的4PL模型擬合至觀察到的數據而產生圖。數據點沿著所產生之擬合曲線緊密對準，並且在T細胞供體（繪製6個供體平均值）之間幾乎沒有觀察到變異性。在圖28A中，測量目標細胞死亡並在Y軸上表示為細胞毒性百分比。在圖28B中，將T細胞活化測量為CD25+CD3+ T細胞百分比。 〔圖29 〕BGCB491媒介之H929 CRISPR KO殖株細胞細胞毒性及T細胞活化。在來自4個健康供體（供體ID：20063323、20063309、20062062、及20063310）之泛T細胞及Fc阻斷劑(2 mg/mL)存在下，以各種濃度（0.00005至533.33 nM，X軸）添加BGCB491、BCMAxGPRC5Dx空、及CD3x空x空，且培養72小時。在此等研究中測試3:1之E:T比。使用Prism 8藉由將單獨的4PL模型擬合至觀察到的數據而產生圖。數據點沿著所產生之擬合曲線緊密對準，並且在T細胞供體（繪製4個供體平均值）之間幾乎沒有觀察到變異性。上排為測量目標細胞死亡且表示為細胞毒性百分比，以及將T細胞活化測量為表現CD3+陽性細胞之CD25百分比（Y軸）顯示在下排中。 〔圖30 〕在摻有(spiked with) H929 MM細胞的全血中之BGCB491媒介之目標細胞細胞毒性（MABEL檢定）。MABEL，最小預期生物效應水平。將BGCB491、BCMAxGPRC5Dx空、及CD3x空x空以各種濃度（0.00005至533.33 nM，X軸）添加至來自7個健康供體（供體ID：10145、10403、10420、10083、10463、10493、及10145；T細胞源）的全血中，其係在以5:1之經調整的E:T比之H929目標骨髓瘤細胞存在下達48小時。使用Prism 8藉由將單獨的4PL模型擬合至觀察到的數據而產生圖。數據點沿著所產生之擬合曲線緊密對準，並且在T細胞供體（繪製7個供體平均值）之間幾乎沒有觀察到變異性。測量目標細胞死亡且表示為細胞毒性百分比，並將T細胞活化測量為CD25+CD3+細胞百分比。在此實驗中，測試泰克利單抗、或塔奎達單抗作為陽性對照。 〔圖31 〕來自MABEL檢定之BGCB491之細胞介素概況。MSD，Meso Scale Discovery。將BGCB491、BCMAxGPRC5Dx空、及CD3x空x空以各種濃度（0.00005至533.33 nM，X軸）添加至來自3個健康供體之全血中。收集來自上述細胞毒性實驗之H929細胞上清液（圖7；3個T細胞供體；供體ID：10083、10463、及10493）且使用基於MSD之多重檢定（目錄號：K15049D）分析細胞介素水平。將細胞介素水平測量為pg/mL。使用Prism 8藉由將單獨的4PL模型擬合至觀察到的數據而產生圖。數據點沿著所產生之擬合曲線緊密對準，並且在T細胞供體（繪製3個供體平均值）之間幾乎沒有觀察到變異性。在此實驗中，測試泰克利單抗、或塔奎達單抗作為陽性對照。 〔圖32 〕BGCB491對人類初級MM CD138+細胞的細胞毒性潛力。MNC，單核細胞。來自4種不同骨髓瘤患者之冷凍骨髓衍生之單核細胞（MM BM MNC-626、649、652、及653）用於評估BGCB491血漿細胞消耗（上排）及T細胞活化（下排）潛力。將來自正常健康供體（供體ID: 20063309）之T細胞外源添加至患者BM MNC樣本（1:1之E:T比），並用BGCB491、CD3x空x空、泰克利單抗、或塔奎達單抗（0.00005至533.33 nM，X軸）培養48小時。觀察到回應於BGCB491處理的活漿細胞(CD138+)損失及伴隨之T細胞上之CD25上調。在供體之間觀察到總初始血漿細胞計數之可變性。列出個別目標受體密度值及百分比目標陽性群體。 〔圖33A 〕至〔圖33B 〕在各種E:T比及培養時間（H929細胞系）下之BGCB491細胞毒性潛力。（圖33A）將BGCB491、BCMAxGPRC5Dx空、及CD3x空x空在來自1個健康供體（供體ID：20063323）之泛T細胞存在下，以4種不同E:T比（5:1、3:1、1:1、及0.5:1）測試72小時。（圖33B）將BGCB491以3:1及1:1之E:T比，在各種時間點（24小時-圓形、48小時-向上三角形、72小時-向下三角、96小時-六邊形、120小時-菱形、144小時-星形、及168小時-方形），使用4種不同T細胞供體（供體ID：20062105、20063309、20061963、及20063310）進行測試。測量目標細胞死亡及T細胞活化並表示為細胞毒性百分比及CD25+CD3+ T細胞百分比。使用Prism 8藉由將單獨的4PL模型擬合至觀察到的數據而產生圖。數據點沿著所產生之擬合曲線緊密對準，並且在T細胞供體之間幾乎沒有觀察到變異性：繪製1個（圖33A）及4個（圖33B）供體平均值。 〔圖34A 〕至〔圖34C 〕於目標細胞不存在下，BGCB491對T細胞活化的影響。使用（圖34A）6個正常健康供體T細胞（供體ID：20063323、20063309、20062062、20063310、20062105、及20061963）或（圖34B）6個正常供體全血樣本（供體ID：10274、10402、10427、10470、10500、及10509）執行T細胞活化檢定。（圖34C）針對各種子集測量非特異性細胞毒性。以各種濃度（0.00005至533.33 nM，X軸）添加BGCB491、BCMAxGPRC5Dx空、及CD3x空x空達72小時（圖34A）及48小時（圖34B，圖34C）。 〔圖35 〕BGCB491、泰克利單抗、及塔奎達單抗在T細胞人化NSG小鼠皮下(SC) RPMI 8226異種移植物中之抗腫瘤功效（研究A）。KO，剔除；NSG，非肥胖糖尿病(NOD)嚴重組合免疫缺乏(scid)γ或NOD.Cg Prkdc scidIl2rg tm1Wjl /SzJ；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；SEM，平均值的標準誤差。以0.1、0.4、1、及2.5 mg/kg之BGCB491對攜帶已確立SC RPMI 8226腫瘤之T細胞人化NSG小鼠進行腹膜內(IP)給藥。泰克利單抗係以0.4、1、及2.5 mg/kg IP給藥。塔奎達單抗係以2.5 mg/kg IP給藥。在第19、21、25、28、31、34、38、及41天投予治療（由X軸下方之黑線指示）。每週測量腫瘤體積兩次，並將結果呈現為各組之平均腫瘤體積±SEM。以圖形方式表示每組之數據，其中至少70%的動物留在研究中。 〔圖36 〕BGCB491、泰克利單抗、及塔奎達單抗在T細胞人化NSG小鼠皮下(SC) H929-BCMA-KO及H929-GPRC5D-KO異種移植物中之抗腫瘤功效（研究B）。KO，剔除；NSG，非肥胖糖尿病(NOD)嚴重組合免疫缺乏(scid)γ或NOD.Cg Prkdc scidIl2rg tm1Wjl /SzJ；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；SEM，平均值的標準誤差。以0.025、0.1、0.25、及0.5 mg/kg之BGCB491對攜帶H929-BCMA-KO（左側腹）及H929-GPRC5D-KO（右側腹）腫瘤之T細胞人化NSG小鼠進行腹膜內(IP)給藥。泰克利單抗及塔奎達單抗係以0.1及0.25 mg/kg IP給藥。在第1、5、9、13、16、19、及22天投予治療（由X軸下方之黑線指示）。每週測量腫瘤體積兩次，並將結果呈現為各組之平均腫瘤體積± SEM。以圖形方式表示每組之數據，其中至少70%的動物留在研究中。 〔圖37 〕至〔圖38 〕雌性食蟹獼猴（圖37）及預測模型（圖38）中單次靜脈內(IV) 0.5 mg/kg劑量之後的個別BGCB491血清濃度-時間曲線。BQL，低於定量界限。圖中未顯示濃度低於最低可量化濃度之數據點。 〔圖39A 〕至〔圖39B 〕平均值(SD) BGCB491濃度-在雄性迷你豬及模型預測中單次劑量的BGCB491之後的時間曲線。BQL，低於定量界限；SD，標準偏差。圖中未顯示濃度低於最低可量化濃度之數據點。第1組：劑量= 0.01 mg/kg，皮下(SC)投予。第2組：劑量= 0.1 mg/kg，SC。第3組：劑量= 0.1 mg/kg，IV。 〔圖40 〕在24小時、37℃培養之BGCB463在H929 WT及MM.1R WT細胞系上之動力學結合概況。MFI：平均螢光強度。 〔圖41 〕與內源性BCMA-GPRC5D表現性細胞係之BGCB491結合。Geo，幾何。以各種濃度（0.096至1,000 nM，X軸）添加BGCB491、BCMAxGPRC5Dx空、及CD3x空x空，且在37℃下培養1小時。使用Prism 8藉由將單獨的4PL模型擬合至觀察到的數據而產生圖。結合強度表示為幾何平均值（Y軸）。 〔圖42 〕使用來自3個T細胞供體之T細胞以（圖42A）1:1及（圖42B）1:3 E:T比之BGCB491及CD3B2271（空對照）之動力學細胞毒性及T細胞活化。Incucyte上之CD25測量係T細胞計數及CD25表現（總積分強度）之量度。CD25係T細胞活化之後期標記物，一般在活化後24小時可偵測到並在約96小時達到峰值。就時間而言，其不一定與細胞毒性一致。\基於經處理相對於未經處理的孔中之綠螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)信號計算細胞溶解百分比。 〔圖43 〕BGCB491及CD3B2271（空對照）以1:1之效應對目標(E:T)比，在72小時、93小時、及120小時時間點之細胞溶解及T細胞活化百分比。 〔圖44 〕BGCB491及CD3B2271（空對照）以1:3之E:T比，在72小時、93小時、及120小時時間點之細胞溶解及T細胞活化百分比。 〔圖45 〕JNJ-79635322、泰克利單抗、及塔奎達單抗在T細胞人化NSG小鼠皮下MM.1S異種移植物中之抗腫瘤功效（研究C）。NSG，非肥胖糖尿病(NOD)嚴重組合免疫缺乏( scid)γ或NOD.Cg- Prkdc scidIl2rg tm1Wjl /SzJ；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；SEM，平均值的標準誤差。以0.025、0.1、0.5、及1 mg/kg之BGCB491對攜帶已確立SC MM.1S腫瘤之T-細胞人化NSG小鼠進行IP給藥。塔奎達單抗係以0.025及0.1 mg/kg IP給藥。泰克利單抗係以0.1及0.5 mg/kg之IP給藥，在第15、19、22、26、30、34、及37天投予治療（由X軸下方之黑線指示）。每週測量腫瘤體積兩次，並將結果呈現為各組之平均腫瘤體積± SEM。以圖形方式表示每組之數據，其中至少70%的動物留在研究中。在治療後監測動物直至表現出移植物抗宿主疾病(GvHD)相關的發病跡象，此時將動物安樂死並在第51天結束研究。 〔圖46A 〕至〔圖46B 〕BCMA先導(BCMB519)顯示出與具有理想scFv生物物理性質之泰克利單抗相當的結合及細胞毒性。 〔圖47 〕相較於具有理想scFv生物物理性質的塔奎達單抗，GPRC5d先導(GC5B680)顯示出特異性的及改良的結合。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079

Claims (110)

  1. 一種三特異性抗體或其三特異性結合片段，其包含： (a)第一抗原結合臂，其包含第一重鏈可變域(VH1)及第一輕鏈可變域(VL1)； (b)第二抗原結合臂，其包含第二重鏈可變域(VH2)及第二輕鏈可變域(VL2)； (c)第三抗原結合臂，其包含第三重鏈可變域(VH3)及第三輕鏈可變域(VL3)， 其中該第一抗原結合臂結合至分化簇3 (CD3)上之表位，該第二抗原結合臂結合至G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)上之表位，且該第三抗原結合臂結合至B細胞成熟抗原(BCMA)上之表位。
  2. 如請求項1所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中第一抗原結合臂之該VH1及VL1存在於雙價抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、或雙硫鍵穩定性雙價抗體（ds雙價抗體）中，可選地存在於Fab中。
  3. 如請求項1或2所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第二抗原結合臂之該VH2及VL2存在於雙價抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fv、Fd、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、或雙硫鍵穩定性雙價抗體（ds雙價抗體）中，可選地存在於scFv中。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合臂之該VH3及VL3存在於抗體片段、雙價抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、或雙硫鍵穩定性雙價抗體（ds雙價抗體）中，可選地存在於scFv中。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之該重鏈可變域(VH1)之重鏈互補決定區(HCDR) 1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 7之該輕鏈可變域(VL1)之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、LCDR2、及LCDR3。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含：包含GDSVFNNNAAWS (SEQ ID NO: 4)之胺基酸序列之HCDR1、包含RTYYRSKWLYD (SEQ ID NO: 5)之胺基酸序列之HCDR2、及包含GYSSSFDY (SEQ ID NO: 6)之胺基酸序列之HCDR3；以及包含TGTSSNIGTYKFVS (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列之LCDR1、包含EVSKRPS (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列之LCDR2、及包含VSYAGSGTLL (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列之LCDR3。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之該VH1及SEQ ID NO: 7之該VL1。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 16之該重鏈可變域(VH2)之重鏈互補決定區(HCDR) 1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 15之該輕鏈可變域(VL2)之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、LCDR2、及LCDR3。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含：包含GFSLTNIRMSVS (SEQ ID NO: 12)之胺基酸序列之HCDR1、包含HIFSNDEKS (SEQ ID NO: 13)之胺基酸序列之HCDR2、及包含MRLPYGMDV (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列之HCDR3；以及包含RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 9)之胺基酸序列之LCDR1、包含KISNRFF (SEQ ID NO: 10)之胺基酸序列之LCDR2、及包含MQATQFPHT (SEQ ID NO: 11)之胺基酸序列之LCDR3。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 16之該VH2及SEQ ID NO: 15之該VL2。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 24之該重鏈可變域(VH3)之重鏈互補決定區(HCDR) 1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 23之該輕鏈可變域(VL3)之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、LCDR2、及LCDR3。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合BCMA之該第三抗原結合臂包含：包含GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列之HCDR1、包含AISGSGGSTY (SEQ ID NO: 21)之胺基酸序列之HCDR2、及包含DEGYSSGHYYGMDV (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列之HCDR3；以及包含RASQSISSSFLT (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列之LCDR1、包含GASSRAT (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列之LCDR2、及包含QHYGSSPMYT (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列之LCDR3。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 24之該VH3及SEQ ID NO: 23之該VL3。
  14. 如請求項1至4中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之該VH1之HCDR1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 7之該VL1之LCDR1、LCDR2、及LCDR3； 結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO: 16之該VH2之HCDR1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 15之該VL2之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；且 結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 24之該VH3之HCDR1、HCDR2、及HCDR3以及SEQ ID NO: 23之該VL3之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  15. 如請求項1至4及14中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含分別為SEQ ID NO: 4、5、6、1、2、3之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3； 結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含分別為SEQ ID NO: 12、13、14、9、10、及11之HCDR1、該HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；且 結合BCMA之該第三抗原結合臂包含分別為SEQ ID NO: 20、21、22、17、18、及19之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  16. 如請求項1至4、14及15中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中結合CD3之該第一抗原結合臂包含SEQ ID NO: 8之該VH1及SEQ ID NO: 7之該VL1； 結合GPRC5D之該第二抗原結合臂包含SEQ ID NO:16之該VH2及SEQ ID NO:15之該VL2；且 結合BCMA之該第三抗原結合臂包含SEQ ID NO: 24之該VH3及SEQ ID NO: 23之該VL3。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂包含可結晶片段(Fc)域，且該第二抗原結合臂或該第三抗原結合臂包含Fc域。
  18. 如請求項17所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該等Fc域包含促進該等Fc域之異二聚化之一或多種突變。
  19. 如請求項18所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該等突變係選自T366S、L368A、T366W、及Y407V（EU編號）。
  20. 如請求項17至19中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該等Fc域進一步包含減少Fc與Fcγ受體結合之一或多個突變。
  21. 如請求項20所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該Fcγ受體係FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB、FcyRIIIA、及/或FcyRIIIB。
  22. 如請求項20或21所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該等Fc域包含選自L234A、L235A、及D265S（EU編號）之一或多個突變。
  23. 如請求項17至22中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該等Fc域進一步包含減少Fc與蛋白質A結合之一或多個突變。
  24. 如請求項23所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該Fc域包含突變H435R及/或Y436F（EU編號）。
  25. 如請求項1至24中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂特異性結合至該CD3ε鏈之殘基22至35 (QDGNEEMGGITQTP (SEQ ID NO: 161))。
  26. 如請求項1至25中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂以約1 x10 -8至1 x10 -7M之親和力特異性結合至CD3。
  27. 如請求項26所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂以約2 x10 -8至4 x 10 -8M之親和力特異性結合至CD3。
  28. 如請求項1至27中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合臂特異性結合BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 162))。
  29. 如請求項1至28中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合臂以約1 x10 -10至1 x 10 -7M之親和力特異性結合至BCMA。
  30. 如請求項29所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第三抗原結合臂以約2 x10 -10至9 x10 -10M之親和力特異性結合至BCMA。
  31. 一種三特異性抗體或其三特異性結合片段，其包含結合至分化簇3 (CD3)上之表位之第一抗原結合臂、結合至G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)上之表位之第二抗原結合臂、及結合至B細胞成熟抗原(BCMA)上之表位之第三抗原結合臂， 其中該第一抗原結合臂包含重鏈(HC1)多肽及輕鏈(LC)多肽；且 其中該三特異性抗體或其三特異性結合片段包含單一多肽，該單一多肽包含該第二抗原結合臂及該第三抗原結合臂。
  32. 如請求項31所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂之該HC1包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。
  33. 如請求項32或33所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂之該LC包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。
  34. 如請求項31至33中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中包含該第二抗原結合臂及該第三抗原結合臂之該多肽包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。
  35. 如請求項31所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂包含：包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之HC1、及包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列之LC，且包含該第二抗原結合臂及該第三抗原結合臂之該多肽包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。
  36. 一種三特異性抗體或其三特異性結合片段，其包含結合至分化簇3 (CD3)上之表位之第一抗原結合臂、結合至G蛋白偶聯受體家族C第5組成員D (GPRC5D)上之表位之第二抗原結合臂、及結合至B細胞成熟抗原(BCMA)上之表位之第三抗原結合臂， 其中該第一抗原結合臂包含重鏈(HC1)多肽及輕鏈(LC)多肽，其中該重鏈(HC1)多肽進一步包含該第二抗原結合臂， 其中該三特異性抗體或其三特異性結合片段進一步包含單一多肽，該單一多肽包含該第三抗原結合臂。
  37. 如請求項36所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂之該HC1包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。
  38. 如請求項36或37所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂之該LC包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
  39. 如請求項36至38中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中包含該第三抗原結合臂之該單一多肽包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
  40. 如請求項36所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該第一抗原結合臂包含：包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列之HC1、及包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列之LC，且包含該第三抗原結合臂之該單一多肽包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
  41. 如請求項1至40中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4（人類）同型。
  42. 如請求項1至41中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係（人類）IgG1同型。
  43. 一種合成性多核苷酸，其編碼如請求項1至42中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段。
  44. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至42中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段及醫藥上可接受之載劑。
  45. 如請求項44所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物進一步包含第二治療劑。
  46. 如請求項45所述之醫藥組成物，其中該第二治療劑包含抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞強化子、或其任何組合。
  47. 一種細胞，其表現如請求項1至42中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段。
  48. 如請求項47所述之細胞，其中該細胞係融合瘤。
  49. 如請求項47或48所述之細胞，其中該三特異性抗體係經重組生產。
  50. 一種用於治療有需要之對象中癌症之方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之如請求項1至42中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段或如請求項44至46中任一項所述之醫藥組成物。
  51. 如請求項50所述之方法，其中投予該三特異性抗體或三特異性結合片段或該醫藥組成物達足以治療該癌症的時間。
  52. 一種用於抑制癌細胞生長或增生之方法，該方法包含向該細胞投予有效量之如請求項1至42中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段或如請求項44至46中任一項所述之醫藥組成物，其中該有效量足以抑制該癌細胞之生長或增生。
  53. 如請求項52所述之方法，其中該癌細胞係在對象中並且該三特異性抗體或三特異性結合片段或該醫藥組成物係投予至該對象。
  54. 如請求項52所述之方法，其中該投予係離體進行。
  55. 一種將有需要之對象中之T細胞重新導向BCMA及/或GPRC5D表現性癌細胞之方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之如請求項1至42中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段或如請求項44至46中任一項所述之醫藥組成物。
  56. 如請求項55所述之方法，其中該治療有效量足以將該T細胞反應導向該等癌細胞。
  57. 如請求項50至56中任一項所述之方法，其中該癌症係血液性癌症。
  58. 如請求項57所述之方法，其中該血液性癌症係BCMA及/或GPRC5D表現性B細胞癌。
  59. 如請求項58所述之方法，其中該BCMA及/或GPRC5D表現性B細胞癌係多發性骨髓瘤。
  60. 如請求項58或59所述之方法，其中該BCMA及/或GPRC5D表現性B細胞癌係燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)。
  61. 如請求項50至60中任一項所述之方法，其中該癌症係復發性、難治性、或惡性癌症、或其任何組合。
  62. 如請求項50至51、53、及55至61中任一項所述之方法，其中該對象已接受先前治療。
  63. 如請求項62所述之方法，其中該先前治療包含蛋白酶體抑制劑、免疫調節藥物、CD38抗體、雙特異性劑、CAR-T療法、或其任何組合。
  64. 如請求項50至63中任一項所述之方法，其進一步包含投予第二治療劑。
  65. 如請求項64所述之方法，其中該第二治療劑係化學治療劑或靶向抗癌療法。
  66. 如請求項65所述之方法，其中該化學治療劑係阿糖胞苷、蒽環素、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2 (IL-2)。
  67. 如請求項64所述之方法，其中該第二治療劑係抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞強化子、或其任何組合。
  68. 如請求項50至51、53、及55至67中任一項所述之方法，其中該三特異性抗體或三特異性結合片段、或該醫藥組成物係經靜脈內、肌肉內、腹膜內、及/或皮下投予至該對象。
  69. 如請求項50至51、53、及55至68中任一項所述之方法，其中該三特異性抗體或三特異性結合片段、或該醫藥組成物係經皮下投予至該對象。
  70. 一種用於產生如請求項1至42中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段之方法，其中該方法包含培養如請求項47至49中任一項所述之細胞並單離該三特異性抗體或三特異性結合片段。
  71. 一種套組，其包含(i)如請求項1至42中任一項所述之三特異性抗體或三特異性結合片段及/或如請求項43所述之多核苷酸及(ii)其包裝。
  72. 一種結合至BCMA之抗體或其抗原結合片段，其包含：具有GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 20)之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有AISGSGGSTY (SEQ ID NO: 21)之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有DEGYSSGHYYGMDV (SEQ ID NO: 22)之胺基酸序列的重鏈CDR3。
  73. 如請求項72所述之抗體或抗原結合片段，其進一步包含：具有RASQSISSSFLT (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、具有GASSRAT (SEQ ID NO: 18)之胺基酸序列之輕鏈CDR2、及具有QHYGSSPMYT (SEQ ID NO: 19)之胺基酸序列之輕鏈CDR3。
  74. 如請求項72或73之抗體或抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)。
  75. 如請求項72至74中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之輕鏈可變域(VL)。
  76. 如請求項72至75中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段特異性結合BCMA BCMW37鏈之殘基17至26 (LLHACIPCQL (SEQ ID NO: 162))。
  77. 如請求項72至76中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段以約1 x10 -10至1 x 10 -7M之親和力特異性結合至BCMA。
  78. 如請求項77所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段以約2 x10 -10至9 x10 -10M之親和力特異性結合至BCMA。
  79. 如請求項72至78中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段。
  80. 如請求項72至79中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係重組的。
  81. 如請求項72至80中任一項所述之抗原結合片段，其中該抗原結合片段係Fab片段、Fab2片段、或單鏈抗體。
  82. 如請求項72至81中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
  83. 如請求項72至82中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1或IgG4同型。
  84. 一種醫藥組成物，其包含如請求項72至83中任一項所述之抗體或抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
  85. 如請求項84所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物進一步包含第二治療劑。
  86. 如請求項85所述之醫藥組成物，其中該第二治療劑包含抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞強化子、或其任何組合。
  87. 一種細胞，其表現如請求項72至83中任一項所述之抗體或抗原結合片段。
  88. 如請求項87所述之細胞，其中該細胞係融合瘤。
  89. 如請求項87所述之細胞，其中該抗體係經重組生產。
  90. 一種用於治療有需要之對象中癌症之方法，該方法包含向該對象投予治療有效量之如請求項72至83中任一項所述之抗體或抗原結合片段或如請求項84至86中任一項所述之醫藥組成物。
  91. 如請求項90所述之方法，其中投予該抗體或抗原結合片段或該醫藥組成物達足以治療該癌症的時間。
  92. 一種用於抑制癌細胞生長或增生之方法，該方法包含向該細胞投予有效量之如請求項72至83中任一項所述之抗體或抗原結合片段或如請求項84至86中任一項所述之醫藥組成物，其中該有效量足以抑制該癌細胞之生長或增生。
  93. 如請求項92所述之方法，其中該癌細胞係在對象中並且該抗體或抗原結合片段或該醫藥組成物係投予至該對象。
  94. 如請求項92所述之方法，其中該投予係離體進行。
  95. 如請求項90至94中任一項所述之方法，其中該癌症係血液性癌症。
  96. 如請求項95所述之方法，其中該血液性癌症係BCMA表現性B細胞癌。
  97. 如請求項96所述之方法，其中該BCMA表現性B細胞癌係多發性骨髓瘤。
  98. 如請求項97所述之方法，其中該BCMA表現性B細胞癌係燜燃型多發性骨髓瘤(SMM)。
  99. 如請求項90至98中任一項所述之方法，其中該癌症係復發性、難治性、或惡性癌症、或其任何組合。
  100. 如請求項90至91、93、及95至99中任一項所述之方法，其中該對象已接受先前治療。
  101. 如請求項100所述之方法，其中該先前治療包含蛋白酶體抑制劑、免疫調節藥物、CD38抗體、雙特異性劑、CAR-T療法、或其組合。
  102. 如請求項90至101中任一項所述之方法，其進一步包含投予第二治療劑。
  103. 如請求項102所述之方法，其中該第二治療劑係化學治療劑或靶向抗癌療法。
  104. 如請求項103所述之方法，其中該化學治療劑係阿糖胞苷、蒽環素、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2 (IL-2)。
  105. 如請求項102所述之方法，其中該第二治療劑係抗CD38劑、免疫調節醯亞胺藥物(IMiD)、免疫檢查點抑制劑、免疫共刺激劑、γ分泌酶抑制劑、T細胞強化子、或其任何組合。
  106. 如請求項90至91、93、及95至105中任一項所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段或該醫藥組成物係經靜脈內、肌肉內、腹膜內、及/或皮下投予至該對象。
  107. 如請求項90至91、93、及95至106中任一項所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段、或該醫藥組成物係經皮下投予至該對象。
  108. 一種用於產生如請求項72至83中任一項所述之抗體或抗原結合片段之方法，其中該方法包含培養如請求項87至89中任一項所述之細胞並單離該抗體或抗原結合片段。
  109. 一種合成性多核苷酸，其編碼如請求項72至83中任一項所述之抗體或抗原結合片段。
  110. 一種套組，其包含(i)如請求項72至83中任一項所述之抗體或抗原結合片段及/或如請求項109所述之多核苷酸及(ii)其包裝。
TW111105376A 2021-02-16 2022-02-15 靶向ｂｃｍａ、ｇｐｒｃ５ｄ及ｃｄ３之三特異性抗體 TW202302636A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163149921P 2021-02-16 2021-02-16
US63/149,921 2021-02-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202302636A true TW202302636A (zh) 2023-01-16

Family

ID=80445956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111105376A TW202302636A (zh) 2021-02-16 2022-02-15 靶向ｂｃｍａ、ｇｐｒｃ５ｄ及ｃｄ３之三特異性抗體

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20220267438A1 (zh)
EP (1) EP4294528A2 (zh)
JP (1) JP2024507180A (zh)
KR (1) KR20230146578A (zh)
CN (1) CN117279953A (zh)
AR (1) AR124882A1 (zh)
AU (1) AU2022221884A1 (zh)
BR (1) BR112023016121A2 (zh)
CA (1) CA3211163A1 (zh)
CL (2) CL2023002382A1 (zh)
CO (1) CO2023011907A2 (zh)
CR (1) CR20230398A (zh)
DO (1) DOP2023000158A (zh)
EC (1) ECSP23069904A (zh)
IL (1) IL305144A (zh)
MX (1) MX2023009566A (zh)
PE (1) PE20241170A1 (zh)
TW (1) TW202302636A (zh)
UY (1) UY39634A (zh)
WO (1) WO2022175255A2 (zh)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PH12021551676A1 (en) * 2019-01-18 2022-03-07 Janssen Biotech Inc Gprc5d chimeric antigen receptors and cells expressing the same
WO2023236889A1 (zh) * 2022-06-06 2023-12-14 山东先声生物制药有限公司 靶向bcma、gprc5d和t细胞的多特异性抗体及其应用
KR20250057914A (ko) * 2022-09-09 2025-04-29 베이징 맵웍스 바이오테크 컴퍼니 리미티드 다중-특이적 항체 결합 bcma, gprc5d 및 cd3 및 이의 용도
TW202430211A (zh) * 2022-10-10 2024-08-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 Ｇｐｒｃ５ｄ ｔｃｂ及ｉｍｉｄ之組合療法
CN117924485A (zh) * 2022-10-25 2024-04-26 上海祥耀生物科技有限责任公司 一种抗gprc5d的多特异性抗体
TW202434644A (zh) 2023-02-07 2024-09-01 大陸商上海齊魯製藥研究中心有限公司 三特異性抗原結合分子及其應用
WO2024168192A1 (en) * 2023-02-10 2024-08-15 Celgene Corporation Assessment of bcma in biological samples
IL322992A (en) * 2023-02-28 2025-10-01 Janssen Biotech Inc Compositions containing bispecific gprc5d/cd3 antibody
WO2024251154A1 (zh) * 2023-06-06 2024-12-12 信达生物制药(苏州)有限公司 抗gprc5d/bcma/cd3三特异性抗体的制备及其用途
WO2025043111A2 (en) * 2023-08-23 2025-02-27 Forte Subsidiary, Inc. Multispecific immune cell engager
WO2025059362A1 (en) * 2023-09-13 2025-03-20 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapies with a cell therapy expressing a gprc5d-targeting car and related methods and uses
US20250127728A1 (en) 2023-10-05 2025-04-24 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained Ionizable Cationic Lipids and Lipid Nanoparticles
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
WO2025092742A1 (zh) * 2023-10-30 2025-05-08 美国礼至生物医药股份有限公司 结合bcma的抗体以及包含其的多特异性抗体
WO2025119153A1 (zh) * 2023-12-04 2025-06-12 山东先声生物制药有限公司 一种多特异性抗体的组合物及其制备方法和应用
WO2025134049A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Janssen Biotech, Inc Trispecific antibody targeting bcma, gprc5d and cd3 for the treatment of al amyloidosis
WO2025134050A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Janssen Biotech, Inc Trispecific antibody targeting bcma, gprc5d and cd3 for the treatment of multiple myeloma
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025250739A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Janssen Biotech, Inc. Chimeric antigen receptor with spacer domains derived from human igg

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020142000A1 (en) 1999-01-15 2002-10-03 Digan Mary Ellen Anti-CD3 immunotoxins and therapeutic uses therefor
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
AU6232899A (en) 1999-10-06 2001-05-10 Campina Melkunie B.V. Use of transforming growth factor beta and growth factors in the treatment and prevention of diseases of the intestinal mucosa
EP2301971A1 (en) 2001-02-20 2011-03-30 ZymoGenetics, L.L.C. Antibodies that bind both BCMA and TACI
EP1789446A2 (en) 2004-09-02 2007-05-30 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
CN101198698B (zh) 2005-03-31 2014-03-19 中外制药株式会社 通过调节多肽缔合制备多肽的方法
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
EP3770174A1 (en) 2005-10-11 2021-01-27 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
US10155816B2 (en) 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
PT2520590T (pt) 2007-04-03 2018-11-14 Amgen Res Munich Gmbh Domínio de ligação específico de espécies cruzadas
RU2561457C2 (ru) 2007-04-03 2015-08-27 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх Cd3-эпсилон-связывающий домен с межвидовой специфичностью
WO2008119566A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
CA2738566C (en) 2008-10-01 2024-04-30 Micromet Ag Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens
DK2356153T3 (en) 2008-10-01 2016-07-04 Amgen Res Munich Gmbh Bispecific single CHAIN ​​PSMAXCD3 ANTIBODY THAT ARE SPECIFICALLY TO ALL SPECIES
EP2352765B1 (en) 2008-10-01 2018-01-03 Amgen Research (Munich) GmbH Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
RS55218B1 (sr) 2008-10-31 2017-02-28 Janssen Biotech Inc Kompozicije fibronektin tip iii skalno baziranih domena, metode i upotrebe
MX2011008566A (es) 2009-02-12 2011-11-29 Janssen Biotech Inc Composiciones supercontigo basadas en el dominio de fibronectina tipo iii, metodos y usos.
NZ594985A (en) 2009-03-10 2013-07-26 Biogen Idec Inc Anti-bcma (b-cell maturation antigen, cd269, tnfrsf17) antibodies
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
US9150663B2 (en) 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
WO2013063702A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
CN113429484A (zh) 2014-12-05 2021-09-24 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向g-蛋白偶联受体的抗体和使用方法
IL298041B2 (en) 2015-08-17 2025-10-01 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-BCMA antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind BCMA and CD3, and uses thereof
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
SG11201907321TA (en) 2017-02-07 2019-09-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-gprc5d antibody and molecule comprising the antibody
US20190092818A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Kite Pharma, Inc. Chimeric polypeptides and uses thereof
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
CA3100118A1 (en) * 2018-05-16 2019-11-21 Janssen Biotech, Inc. Bcma/cd3 and gprdc5d/cd3 bispecific antibodies for use in cancer therapy
JP2021525243A (ja) * 2018-05-21 2021-09-24 コンパス セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー Ｎｋ細胞による標的細胞の殺傷を増進するための組成物および方法
JP7530299B2 (ja) * 2018-05-24 2024-08-07 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ３抗体及びその使用
JOP20190116A1 (ar) 2018-05-24 2019-11-24 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتل التمايز 33 (cd33)، والأجسام المضادة ثنائية النوعية لتكتل التمايز 33 (cd33)/تكتل التمايز 3 (cd3) واستخداماتها
PH12021551676A1 (en) 2019-01-18 2022-03-07 Janssen Biotech Inc Gprc5d chimeric antigen receptors and cells expressing the same
US20210284731A1 (en) * 2020-03-13 2021-09-16 Janssen Biotech, Inc. Methods and materials for modulating an immune response
TW202227494A (zh) * 2020-09-11 2022-07-16 美商健生生物科技公司 多特異性免疫靶向分子及其用途
EP4211170A4 (en) * 2020-09-11 2024-10-09 Janssen Biotech, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING BETA-CHAIN-MEDIATED IMMUNITY
CN112028996B (zh) * 2020-10-30 2021-01-22 南京北恒生物科技有限公司 靶向bcma的单域抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022221884A1 (en) 2023-10-05
ECSP23069904A (es) 2023-10-31
CA3211163A1 (en) 2022-08-25
KR20230146578A (ko) 2023-10-19
MX2023009566A (es) 2023-10-24
WO2022175255A2 (en) 2022-08-25
BR112023016121A2 (pt) 2023-11-28
DOP2023000158A (es) 2024-02-29
JP2024507180A (ja) 2024-02-16
EP4294528A2 (en) 2023-12-27
WO2022175255A3 (en) 2022-09-29
UY39634A (es) 2022-08-31
CR20230398A (es) 2023-11-15
IL305144A (en) 2023-10-01
AR124882A1 (es) 2023-05-17
PE20241170A1 (es) 2024-05-28
CL2023002382A1 (es) 2024-03-15
CO2023011907A2 (es) 2023-09-18
US20220267438A1 (en) 2022-08-25
CN117279953A (zh) 2023-12-22
CL2024002524A1 (es) 2025-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220267438A1 (en) Trispecific antibody targeting bcma, gprc5d, and cd3
JP7621324B2 (ja) 抗ｂｃｍａ抗体、ｂｃｍａ及びｃｄ３に結合する二重特異性抗原結合分子、並びにそれらの使用
CN109715667B (zh) 抗-gprc5d抗体、结合gprc5d和cd3的双特异性抗原结合分子及其用途
US11697684B2 (en) Tri-specific binding molecules that specifically bind to multiple cancer antigens
US12103977B2 (en) Trispecific antibody targeting CD79b, CD20, and CD3
US20250215081A1 (en) Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
US20250282881A1 (en) Antibodies and bispecific binding proteins that bind ox40 and/or pd-l1
EA044685B1 (ru) Антитела к gprc5d, биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связывают gprc5d и cd3, и их применение