ES2891331T3 - Producción de lubricina recombinante - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende: una glicoproteína de lubricina multimérica recombinante expresada a partir de un gen PRG4 humano en un cultivo de células hospedantes, que comprende al menos 30% en peso de restos glicosídicos, en donde al menos el 90% en peso de la glicosilación de la glicoproteína de lubricina es glicosilación del núcleo 1, y que produce un coeficiente de fricción dinámico no superior al 150% del coeficiente de fricción dinámico de la lubricina bovina nativa purificada, medido en un ensayo de fricción de cartílago sobre cartílago.
Description
DESCRIPCIÓN
Producción de lubricina recombinante
Campo de la invención
Las invenciones descritas en el presente documento se refieren a composiciones que comprenden lubricina recombinante de tipo humano. Más particularmente, las invenciones se refieren a formas novedosas de lubricina que tienen excelentes propiedades lubricantes y que pueden formularse y usarse para tratar profiláctica o terapéuticamente diversas afecciones que van, por ejemplo, desde dolor en las articulaciones hasta la enfermedad del ojo seco.
Antecedentes de la invención
El gen del proteoglicano 4 (PRG4) codifica proteínas lubricantes de superficie altamente glicosiladas llamadas lubricina, factor estimulante de megacariocitos (MSF) o proteína de la zona superficial (SZP). (Véase Jay, Curr. Opin. Orthop. 15, 355 (2004); patente de EE.UU. N.° 6.743.774; patente de EE.UU. N.° 6.960.562). La lubricina se expresa a partir del gen PRG4 (SEQ ID NO: 2) con una longitud completa que abarca 12 exones, aunque se han descrito múltiples versiones truncadas de origen natural. Un gran dominio central "similar a mucina" de 940 aminoácidos (codificado por el exón 6) comprende unas 70+ secuencias similares a KEPAPTT y está altamente glicosilado. La glicoproteína comprende restos de glicosilación en el núcleo 2 y una multiplicidad de glicanos en el núcleo 1 (oligosacáridos Gal-GalNAc p (1-3) unidos a O), al menos el último de los cuales se ha mostrado que media en su función fisiológica primaria, la lubricación límite (Jay et al., Glycoconj J 18, 807 (2001)). Se ha demostrado que el PRG4 está presente en la superficie del cartílago, membrana sinovial, tendón y menisco, en la película lagrimal y en otros sitios anatómicos. Se ha mostrado que PRG4 contribuye a la lubricación límite de superficies de cartílago articular yuxtapuestas. Se ha mostrado que PRG4 existe no solo como monómero sino también como dímero y multímero unido por enlaces disulfuro a través de los dominios ricos en cisteína conservados en los extremos tanto N como C, (Schmidt et al., Biochim Biophys Acta. 1790 (5): 375-84 (2009); Kooyman et al., Artículo n.° 255, 56th Ann. Meet of Orthop. Res. Soc., 2010).
En la interfase del cartílago de las articulaciones sinoviales hay al menos dos modos fisicoquímicos de lubricación en acción. Estos se han clasificado como "película fluida" y "límite". Los modos de lubricación operativos dependen de las fuerzas normales y tangenciales sobre los tejidos articulares, de la tasa relativa de movimiento tangencial entre estas superficies y del historial temporal tanto de carga como de movimiento. El coeficiente de fricción, p (una unidad adimensional, relación de la fuerza de fricción medida entre dos superficies en contacto en movimiento relativo a la fuerza normal aplicada), proporciona una medida cuantitativa de la lubricación.
Un tipo de lubricación mediada por fluido o modo de "película fluida" es hidrostático. Al inicio de la carga y típicamente durante un período prolongado, el líquido intersticial dentro del cartílago es presurizado, debido a la naturaleza bifásica del tejido, el líquido también puede ser forzado hacia las rugosidades entre las superficies articulares a través de un mecanismo de exudación. El líquido intersticial presurizado y los depósitos de lubricante atrapado que comprenden ácido hialurónico pueden, por lo tanto, contribuir significativamente al soporte de carga normal con poca resistencia a la fuerza de cizallamiento, lo que facilita un coeficiente de fricción muy bajo. Además, al inicio de la carga y/o el movimiento, pueden ocurrir tipos de lubricación por capa de presión, hidrodinámica y elastohidrodinámica, con presurización, movimiento y deformación que actúan para dirigir el lubricante viscoso desde y/o a través del espacio entre dos superficies en movimiento relativo.
En la lubricación límite, la carga está soportada por el contacto de superficie a superficie, y las propiedades de fricción asociadas están determinadas por las moléculas lubricantes de la superficie, es decir, especies de lubricina. Este modo es importante porque las capas de cartílago enfrentadas hacen contacto sobre /- 10% del área total a través de rugosidades aplanadas y engranadas, y es aquí donde probablemente ocurre la mayor parte de la fricción. La lubricación límite, en esencia, mitiga el "pegado-deslizamiento" (Meyer et al., Nanoscience: Friction and Rheology on the Nanometer Scale, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, River Edge, Nueva Jersey, (2002), págs. 373), es decir, movimientos bruscos espontáneos que pueden ocurrir mientras las superficies del cartílago que soportan peso enfrentadas se deslizan una sobre otra y, por lo tanto, se manifiesta como una disminución de la resistencia tanto al movimiento estable como al inicio del movimiento. Los patrones de desgaste típicos de las superficies del cartílago sugieren que la lubricación límite del cartílago articular es fundamental para la protección y el mantenimiento de la estructura de la superficie articular. Por ejemplo, los ratones sin lubricina muestran desgaste, pero no los ratones recién nacidos, que no soportan peso. (Jay et al., Arthritis and Rheumatism, 56: 3662-3669 (2007).
Con el aumento del tiempo de carga y la disipación de la presión hidrostática, las superficies recubiertas de lubricante soportan una parte cada vez mayor de la carga en relación con el fluido presurizado y, en consecuencia, p puede llegar a estar cada vez más dominado por el modo de lubricación límite. Por lo tanto, un modo de lubricación límite está indicado por un coeficiente de fricción durante el deslizamiento continuo que es invariable con los factores que influyen en la formación de una película de fluido, tales como la velocidad de deslizamiento relativa y la carga axial. Para el cartílago articular, se ha llegado a la conclusión de que seguro que se produce una lubricación límite, aunque se complementa con la presurización del líquido y otros mecanismos. El mecanismo de lubricación en la interfase de la córnea y el párpado durante el parpadeo no implica una carga significativa, por lo que facilita los requisitos
fisicoquímicos para una lubricación eficaz y, por lo tanto, es probable que sea bastante diferente de la lubricación del cartílago. Sin embargo, se ha propuesto que un modo de lubricación límite puede volverse dominante cuando la película lagrimal se ve comprometida, tal como en la enfermedad del ojo seco.
Los dos componentes mecánicos del líquido sinovial que se cree que son responsables de sus notables propiedades de lubricación son la lubricina y el ácido hialurónico (o hialuronato o "HA", en lo sucesivo utilizados indistintamente). Se ha mostrado que la lubricina funciona como lubricante límite en las uniones articulares y protege las superficies cartilaginosas frente a las fuerzas de fricción, adhesión celular y deposición de proteínas. Por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 6.960.562 y 6.743.774 describen un polipéptido lubricante que comprende isoformas de PRG4 sustancialmente puras y métodos para lubricar articulaciones u otros tejidos mediante la administración sistémica o directamente a los tejidos. Se ha mostrado que el HA por sí mismo disminuye p frente a la solución salina (0.12 en 3.3 mg/ml de HA frente a ~0.24 en PBS) en una interfase cartílago-cartílago con lubricación en el modo límite, y la lubricina sola disminuye p a niveles aún más bajos, pero el líquido sinovial que comprende HA en combinación con lubricina puede impartir a las superficies de la interfase un coeficiente de fricción que no se consigue con la lubricina sola o con mezclas sintéticas de HA y lubricina. Ninguna composición sintética de lubricina y HA ha sido capaz todavía de duplicar completamente el bajo coeficiente de fricción impartido por el líquido sinovial en forma nativa. Se ha ensayado e1HA de diversas fuentes y diversos pesos moleculares mezclado con lubricinas expresadas in vitro a partir de sinoviocitos, lubricinas bovinas, lubricinas extraídas del líquido sinovial y "reconstituidas" en HA, y lubricinas expresadas en cantidades de microgramos en los primeros esfuerzos para producirlas usando tecnología de ADN recombinante.
Los intentos anteriores de producción recombinante de lubricina de longitud completa a una escala adecuada para la explotación comercial no han tenido éxito. La tasa de producción muy baja, de una o dos cifras de miligramos por litro, de especies de lubricina humana expresadas a partir de células CHO se considera demasiado baja para sostener un producto comercial. Un enfoque para resolver este problema fue truncar el número de repeticiones en el exón seis y, por lo tanto, reducir la masa de cadenas laterales de glicosilación conservando a la vez al menos alguna capacidad lubricante (véase, p. ej., las patentes de EE.UU. N.° 7.642.236 y 7.893.029). Según se informa, este enfoque daba como resultado una productividad bruta (antes de purificación) de la construcción truncada de tres a cuatrocientos miligramos por litro.
Sumario de la invención
La invención es como se expone en las reivindicaciones.
Se ha descubierto ahora que el gen PRG4 humano puede usarse para producir grandes cantidades comerciales de una nueva forma de lubricina similar a la humana altamente glicosilada, en lo sucesivo denominada simplemente "lubricina", lubricina multimérica, rhlubricina o rhPRG4. Esto se logra como se describe en el presente documento mediante la transfección del gen PRG4 humano (hPRG4) en ciertas células de ovario de hámster chino (CHO) modificadas que se ha descubierto que son competentes para glicosilar postraduccionalmente proteínas expresadas a gran escala, y luego cultivo de las células en volúmenes de medio a escala comercial, por ejemplo, al menos 10 litros, más típicamente al menos 50 litros, preferiblemente al menos 100 litros o al menos 500 litros, y lo más preferiblemente en 1000 litros o más.
La lubricina de esta invención comprende unidades monoméricas de lubricina polidispersas que forman dímeros y multímeros y opcionalmente monómeros libres. Cada unidad está glicosilada de forma intensa y variable, contribuyendo las cadenas laterales de restos glicosídicos en al menos 30%, a menudo 35% o 40%, y posiblemente tan alto como 45% o más de su peso molecular.
En la lubricina humana nativa, las glicosilaciones consisten en el disacárido de GalNAc-Gal (N-acetilgalactosaminagalactosa) unido por O al núcleo 1, al menos 60% del cual está sustituido terminalmente con un ácido siálico, y también la glicosilación del núcleo 2 que implica la adición al núcleo 1 de monosacáridos de GlcNac (N-acetilglucosamina) en varias configuraciones isoméricas. (Véase, p.ej., Estrella et al., Biochem J , 429 (2): 359-67 (2010)).
El material recombinante producido como se describe en el presente documento está enriquecido en glucanos en el núcleo 1, en comparación con la forma nativa de lubricina humana. Su glicosilación comprende al menos 95% de cadenas laterales en el núcleo 1, más probablemente más de 98% o 99%. Además, las cadenas laterales a menudo están sulfatadas en un grado que no se ve en la lubricina humana nativa. Esto distingue al rhPRG4 de esta invención del hPRG4 nativo. Se cree que el aumento del contenido de sulfatación añade cargas negativas adicionales a la glicoproteína mucinosa, lo que puede servir para mejorar su capacidad para repeler biomoléculas cercanas y, por lo tanto, aumentar su lubricidad, y para endurecer la estructura molecular, haciéndola más rígida desde un punto de vista molecular, lo que puede ayudar a su capacidad para funcionar en la reducción de la fricción a nanoescala y mesoescala.
La secuencia del monómero de lubricina de longitud completa (no truncada) (SEQ ID NO: 1) comprende 1404 aminoácidos, o aproximadamente 151 kDa en la proteína del núcleo. La secuencia señal de la lubricina humana son los restos 1-24 de la SEQ ID NO: 1. Por consiguiente, la forma madura de la lubricina humana son los restos 25-1404 de la SEQ ID NO: 1. La reducción exhaustiva del producto recombinante producido como se describe en el presente documento produce una especie monomérica con un peso molecular aparente de aproximadamente 300 kDa-460 kDa,
según se estima en comparación con los patrones de pesos moleculares en una serie de técnicas de determinación de peso molecular que incluyen electroforesis en gel de poliacrilamida con tris-acetato-SDS al 3-8%. El análisis de glicosilación usando técnicas de espectrometría de masas y otros trabajos en combinación sugirieron que el peso molecular real de un monómero recombinante glicosilado (en contraposición al inferido a partir de la movilidad en gel) probablemente está en el intervalo de 220-280 kDa, y es poco probable que exceda aproximadamente 300 kDa. De un total de aproximadamente 329 posibles uniones por O (284 de las cuales son treoninas) potencialmente disponibles como sitios de glicosilación de unión por O en la secuencia del monómero de lubricina, un gran número variable y desconocido están sustituidas (100 a 150, quizás tan alto como 200 o 220). De la glicosilación total, aproximadamente la mitad comprende dos unidades de azúcar (GalNAc-Gal) y la mitad tres unidades de azúcar (GalNAc-Gal-Ácido siálico). La forma más abundante es Gal-GalNac sulfatada, la siguiente más abundante es Gal-GalNac sialilada.
El producto de expresión de lubricina es resistente, aunque no inmune, a la degradación en especies de lubricina monoméricas o diméricas. Los resultados de la reducción exhaustiva implican que comprende enlaces cruzados de disulfuro entre y dentro de las unidades de monómero. Además, el tratamiento con tampones desnaturalizantes sin reducción puede dar como resultado productos de menor peso molecular, lo que sugiere estructuras cuaternarias de orden superior donde las cadenas también se mantienen unidas entre sí por interacción hidrófoba, enlaces de hidrógeno, enredado físico y/u otras asociaciones no covalentes que permiten el autoensamblaje. Los dímeros y multímeros son polidispersos. Las especies moleculares dentro de estos típicamente tienen pesos moleculares de al menos aproximadamente 450-600 kDa, y las especies multiméricas frecuentemente de 2000 kDa o más. Normalmente, algunas especies del complejo no reducido esencialmente no entran en el gel de SDS-PAGE al 3-8% en un experimento de electroforesis. Se cree que la especie más grande del complejo comprende entre tres y cinco, y quizás hasta 20 unidades de monómero.
Sin pretender estar ligado por ninguna teoría, se cree que dichos componentes supramoleculares más grandes se forman en función de la concentración de monómero/dímero. Actualmente, se cree que una concentración de al menos aproximadamente 0.5 mg/ml de monómero/dímero es óptima para la formación espontánea de un complejo mayor. Concentraciones muy por debajo de esta, p.ej., menos de aproximadamente 0.1 mg/ml, comprenden monómeros y dímeros, y solo una pequeña cantidad de complejo; concentraciones muy superiores pueden formar agregados visibles a simple vista como una solución turbia o brumosa. Se pueden usar tensioactivos, o excipientes, preferiblemente tensioactivos no iónicos fisiológicamente compatibles que generalmente se consideran seguros, p.ej., tensioactivos basados en polioxietileno, para prevenir la formación de agregados grandes mientras se permite la formación del complejo, que parece estar siempre presente junto con especies diméricas.
El ensayo de preparaciones que comprenden la lubricina de la invención muestra que sus propiedades lubricantes y de protección del tejido bajo carga pueden exceder a las de la lubricina recombinante conocida hasta ahora en la técnica. Sin desear estar ligados por la teoría, los autores de la invención plantean la hipótesis de que, si bien el fenómeno de pegado-deslizamiento ocurre durante el movimiento de los tejidos no lubricados que interconectan bajo carga, un recubrimiento de la lubricina de la invención puede transferir el cizallamiento fuera de la superficie del cartílago subyacente a capas dentro del recubrimiento de lubricina polidispersa. Es decir, los autores de la invención creen que bajo carga y movimiento alternativo, la superficie subyacente experimenta menos cizallamiento, preservando su integridad, ya que las moléculas de lubricina dentro del revestimiento deslizan unas sobre otras y luego probablemente se reorganizan cuando se retira la carga. (Véase, p.ej., Lee et al., PNAS, 110 (7): E567-574 (2013)). Los autores afirman que el desgaste de la articulación no está directamente relacionado con el coeficiente de fricción, sino más directamente con el desplazamiento de pegado-deslizamiento, y que los diferentes componentes moleculares de la articulación actúan sinérgicamente para prevenir el desgaste.
En cualquier caso, el producto de lubricina de la invención, cuando se ensaya, presenta propiedades lubricantes sobresalientes, lo que da como resultado coeficientes de fricción (tanto estáticos como dinámicos) a menudo dentro del 150%, 120%, 110% o esencialmente iguales a los coeficientes de la lubricina bovina nativa, purificada, medida por el ensayo de lubricación de cartílago sobre cartílago como se describe en el presente documento. En estos ensayos, la glicoproteína similar a la humana de la invención alcanza coeficientes de fricción estáticos de 0.5 o menos e inferiores a 0.2 (dependiendo de las condiciones de ensayo descritas en el presente documento), y coeficientes de fricción cinéticos a menudo de 0.1 o menos, ambos medidos por cojinetes de cartílago sobre cartílago descomprimidos in vitro, con un área de contacto estacionaria. Cuando se combina con ácido hialurónico (HA), estos valores mejoran a por debajo de aproximadamente 0.3 y menos de 0.1 para la medición estática determinada (dependiendo del tiempo de permanencia) y a menos de 0.1 para la medición cinética, bastante cerca del valor aceptado para el líquido sinovial. Por consiguiente, dichas composiciones pueden reducir drásticamente el desgaste de las articulaciones.
Por consiguiente, un aspecto descrito en el presente documento comprende un método para la producción comercial de lubricina. En una realización, el método incluye las etapas de cultivar, en un medio, células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con y que expresan el gen PRG4 humano y glicosilar postraduccionalmente el producto de expresión durante un tiempo y en condiciones de cultivo suficientes para producir una glicoproteína de lubricina, y purificar la glicoproteína de lubricina de dicho medio. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la glicoproteína de lubricina se separa de las proteínas de la célula hospedante y otros contaminantes en el caldo extracelular para purificarla al menos parcialmente. La proteína recombinante solo necesita ser enriquecida a partir del medio de cultivo, en lugar de purificar hasta homogeneidad con el fin de purificarla para los propósitos del método descrito en el presente
documento. El método es suficiente para producir una glicoproteína de lubricina que tiene al menos 30% en peso de restos glicosídicos en una concentración en el medio de al menos 0.4 g/l.
En algunas realizaciones, las células CHO son células CHO-M que comprenden un ácido nucleico que codifica el gen PRG4 humano. En otras realizaciones, las células CHO se transfectan con un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica un elemento de cromatina y se transfectan con un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica el gen PRG4 humano. El elemento de cromatina puede ser un elemento límite, una región de unión a la matriz, una región de control de locus o un elemento de apertura de cromatina universal. En una realización preferida, el elemento de cromatina es una región de unión a la matriz.
En otras realizaciones más, las células CHO se transfectan con un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica un elemento de cromatina y que codifica el gen PRG4 humano y se transfectan con un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica elementos de cromatina y codifica el gen PRG4 humano. En una realización preferida, los elementos de cromatina en el primer y segundo vectores son la región de unión a la matriz.
En algunas realizaciones, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40% o al menos 45% del peso de la glicoproteína de lubricina dimérica o multimérica es el peso de restos glicosídicos. En algunas realizaciones, más de 30%, más de 35%, más de 40% o más de 45% del peso de la glicoproteína de lubricina dimérica o multimérica es el peso de restos glicosídicos. Los restos glicosídicos pueden diferir de los de la lubricina humana nativa ya que la glicosilación de la lubricina de tipo humano recombinante es al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% en peso de glicosilación del núcleo 1. Además, en algunas realizaciones, los restos glicosídicos están enriquecidos en monosacáridos sulfatados en comparación con la lubricina humana nativa.
El procedimiento, inesperadamente, es capaz de producir cantidades comercialmente viables de la glicoproteína de lubricina de longitud completa. Por ejemplo, las células se pueden cultivar durante un tiempo y en condiciones de cultivo suficientes para producir concentraciones de glicoproteína de lubricina en un medio de cultivo de al menos aproximadamente 0.4 gramos o 0.5 gramos de lubricina recombinante por litro, preferiblemente al menos 0.8 gramos por litro, y lo más preferiblemente al menos 1.0 gramo de lubricina por litro de medio de cultivo en un cultivo, por ejemplo, de al menos aproximadamente 10, 50 o 100 litros. El procedimiento, cuando se optimiza, puede producir hasta 2.0, al menos 2.5 o al menos 3.0 gramos de lubricina por litro de cultivo. Dependiendo del desarrollo de un protocolo de purificación optimizado, será posible obtener al menos aproximadamente 200 miligramos de lubricina recombinante purificada por litro, preferiblemente al menos 300 mg/l, más preferiblemente al menos 500 mg/l, y lo más preferiblemente más. Hasta donde los autores de la invención saben, nunca antes se habían logrado estos niveles de productividad en la expresión recombinante de ninguna proteína similar a mucina, o una proteína comparable en tamaño a la lubricina, y ningún intento previo de expresión de PRG4 ha tenido éxito en producir material que tenga las propiedades del producto descrito en el presente documento.
En realizaciones preferidas, las especies de lubricina monoméricas a menudo se copurifican del medio de cultivo en mezcla con las especies de proteínas multiméricas. Las especies multiméricas son ricas en especies de lubricina diméricas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el método produce una mezcla de lubricina recombinante que incluye especies de lubricina monoméricas, diméricas y multiméricas. En algunas realizaciones, la glicoproteína de lubricina comprende al menos cinco cadenas de aminoácidos glicosiladas individuales unidas por enlaces disulfuro o asociadas no covalentemente y tiene un peso molecular de al menos 1200 kDa.
La glicoproteína producida según los métodos descritos en el presente documento, cuando se ensaya usando el protocolo descrito a continuación, produce un coeficiente de fricción que se aproxima a los valores más bajos jamás observados para la lubricina de mamífero nativa purificada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la glicoproteína de lubricina recombinante es una proteína multimérica que produce un coeficiente de fricción estático no mayor de 150% del coeficiente de fricción estático de la lubricina bovina nativa purificada, medido en un ensayo de fricción de cartílago sobre cartílago. En otras realizaciones, la glicoproteína de lubricina recombinante es una proteína multimérica que produce un coeficiente de fricción estático no mayor de 120% del coeficiente de fricción estático de la lubricina bovina nativa purificada, medido en un ensayo de fricción de cartílago sobre cartílago. En otras realizaciones más, la glicoproteína de lubricina recombinante es una proteína multimérica que produce un coeficiente de fricción estático no mayor de 110% del coeficiente de fricción estático de la lubricina bovina nativa purificada medido en un ensayo de fricción de cartílago sobre cartílago.
La invención se dirige a composiciones de una glicoproteína de lubricina multimérica recombinante expresada a partir del gen PRG4 humano en un cultivo de células hospedantes. La glicoproteína de lubricina recombinante tiene al menos 30% en peso de restos glicosídicos y produce un coeficiente de fricción dinámico no mayor de 150% del coeficiente de fricción dinámico de la lubricina bovina nativa purificada medido en un ensayo de fricción de cartílago sobre cartílago.
En algunas realizaciones, la glicoproteína de lubricina recombinante tiene al menos 35%, al menos 40% o al menos 45% en peso de restos glicosídicos.
En algunas realizaciones, la glicoproteína de lubricina recombinante produce un coeficiente de fricción dinámico no mayor de 110% o no mayor de 120% del coeficiente de fricción dinámico de la lubricina bovina nativa purificada medido en un ensayo de fricción de cartílago sobre cartílago.
En la invención, los restos glicosídicos de la lubricina recombinante difieren de los de la lubricina humana nativa ya que la glicosilación de la lubricina recombinante es al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% en peso glicosilación del núcleo 1. Además, en algunas realizaciones, los restos glicosídicos de la lubricina recombinante están enriquecidos en monosacáridos sulfatados en comparación con la lubricina humana nativa.
En algunas realizaciones, la lubricina recombinante es una mezcla de especies monoméricas, diméricas y multiméricas. En algunas realizaciones, la lubricina incluye especies monoméricas. En algunas realizaciones, la lubricina incluye especies diméricas. En algunas realizaciones, la lubricina incluye especies multiméricas. En algunas realizaciones, la lubricina es una mezcla de especies multiméricas y monoméricas.
En algunas realizaciones, la glicoproteína de lubricina comprende al menos cinco cadenas de aminoácidos glicosiladas individuales unidas por enlaces disulfuro o asociadas no covalentemente y tiene un peso molecular de al menos 1200 kDa.
En algunas realizaciones, la composición de glicoproteína de lubricina recombinante incluye además ácido hialurónico o una sal del mismo mezclado con la lubricina.
En otra realización, la invención se dirige a una composición que comprende una solución que comprende 100 gramos de lubricina humana donde la glicosilación de la lubricina es al menos 99% en peso glicosilación del núcleo 1. En la invención, la lubricina es lubricina humana recombinante. En otra realización más, la concentración de lubricina en la solución es de al menos 0.5 g/l. En otra realización más, la solución es un medio de cultivo celular.
Las composiciones de la invención pueden usarse para la preparación de un medicamento para cualquier uso médico o de otro tipo conocido o descubierto en el futuro de la glicoproteína PRG4, incluyendo como recubrimiento para varios dispositivos destinados al contacto con el cuerpo (véase, p.ej., publicaciones de solicitudes de patentes de EE.UU. N.° 2009/0068247 y 2011/0142908); para el tratamiento de una unión articular en un ser humano o animal mediante la mejora de la lubricación articular (publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2004/0229804) o viscosuplementación (publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2008/0287369); para aplicación tópica en la superficie de un tejido, p. ej., durante una cirugía para inhibir la formación posterior de adherencias o tejido conectivo fibrótico (publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2004/0229804); para el tratamiento de la enfermedad del ojo seco (publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2011/0059902); para el tratamiento de la enfermedad de la boca seca (publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2013/0039865); para el tratamiento de la cistitis intersticial (publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2012/0321693); como lubricante vaginal (publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2012/0052077); para una solución para el cuidado y almacenamiento de lentes de contacto (publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2012/0321611) o para inyección sistémica para, por ejemplo, inhibir las adherencias o la motilidad célula-célula dentro de la maculatura (véase, p. ej., solicitud provisional de EE.UU. 61/908.959 presentada el 26 de noviembre, 2013).
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1 y 2 son mapas de plásmidos de vectores usados en el desarrollo del clon de CHO-M que expresa lubricina usado en el procedimiento descrito en el presente documento y que codifica la secuencia de longitud completa de hPRG4.
Las figuras 3 y 4 representan geles de poliacrilamida útiles para evaluar la estructura de la rhlubricina de la invención.
La figura 5 es una representación gráfica de la productividad de una serie de producción de lubricina que mide microgramos de lubricina producidos a lo largo del tiempo por litro de cultivo de células CHO-M transfectadas. Hay tres barras en cada fecha de recolección. La barra de la izquierda es "Curva calib. 24 Jun 14". La barra del medio es "Curva calib. 24 jul 14" y la barra de la derecha es "Curva calib. 25 jul 14".
La figura 6 es un diagrama que muestra los glicanos del núcleo 1 de la rhlubricina de la invención.
La figura 7 es un cromatógrafo, con picos marcados, que muestra la abundancia relativa de los diversos di- y trisacáridos colgantes de restos de SER y THR en la rhlubricina de la invención.
La figura 8 es un diagrama que muestra la gama más amplia de glicanos que se extienden en las estructuras del núcleo 2 en la lubricina nativa extraída del líquido sinovial humano.
La figura 9 es un cromatógrafo, con picos marcados, que muestra la abundancia relativa de los diversos restos de azúcar en la lubricina humana nativa.
Las figuras 10A, 10B y 10C son gráficos de tensión superficial frente a concentraciones de rhPRG4 y/o tensioactivo de polioxietileno que muestran la reducción de la tensión superficial con una concentración mayor de rhPRG4.
Las figuras 11A y 11B representan datos que comparan los coeficientes de fricción estática (figura 11A) y cinética (figura 11B) de la solución de rhPRG4 con PRG4 bovino nativo purificado, solución salina (PBS) y líquido sinovial bovino, con ambas preparaciones de PRG4 de 450 pg/ml. Las designaciones a, b y c significan diferencias estadísticamente significativas en los resultados (p <0.05). n = 7. No hubo diferencia estadísticamente significativa en los resultados para rh-PRG4 (recombinante) y nPRG4 (nativo) como indica la presencia de "b" encima de cada barra en la figura 11B.
Las figuras 12A-B representan datos que comparan los coeficientes de fricción estática (figura12A) y cinética (figura 12B) de una solución de HA más rgPRG4 respecto a solución salina, rgPRG4 y líquido sinovial bovino, con rgPRG4 en 450 pg/ml y HA (1.5 MDa) en 3.33 mg/ml. Las designaciones a, b, c y d encima de cada barra en la figura 12B significan diferencias estadísticamente significativas en los resultados (p <0.05), n = 4.
La figura 13 representa datos que muestran el restablecimiento de la lubricidad en la interfase de superficies de tejidos bovino después de la digestión de PRG4 bovino nativo y la aplicación de rhPRG4.
Las figura 14A-D representan datos que muestran el efecto de rhPRG4 en la lubricación límite en una interfase córneapárpado humanos (figura 14A-estática, figura 14B-cinética) y en interfases córnea humana-PDMS (figura 14C-estática, figura 14D-cinética), de PRG4 bovino nativo y rhPRG4 en 300 pg/ml en solución salina y solución salina sola. Los valores son la media ± EEM (n=6) con un estrés normal promedio de 14.1 ± 2.2 y 16.9 ± 5.3 (media ± DE) para las interfases córnea-párpado (AB) y córnea-PDMS (CD), respectivamente. Estos datos ilustran las propiedades lubricantes prácticamente idénticas de rhPRG4 y PRG4 nativo purificado en tareas de lubricación de baja carga.
La figura 15 es la secuencia de aminoácidos de la lubricina humana de longitud completa que tiene 1404 aminoácidos de longitud. Los residuos de la secuencia señal (1-24) se muestran en negrita.
La figura 16 es la secuencia de ácido nucleico que codifica la lubricina humana de longitud completa.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la invención del presente documento investigaron opciones para la producción de la glicoproteína de lubricina humana conocida usando técnicas de ADN recombinante, con el objetivo de generar un procedimiento de producción que implica el cultivo en suspensión que utiliza células de mamífero en medio de crecimiento sin suero. A diferencia de cualquier esfuerzo previo conocido por los autores de la invención para producir proteínas utilizando técnicas de ADN recombinante, el desafío era producir cantidades comerciales de un biopolímero grande y complejo cuyo valor residía en su propiedades mecánicas a nanoescala, en lugar de sus propiedades bioquímicas, y esas propiedades físicas dependían de la explotación exitosa de los sucesos de glicosilación postraduccional a una escala nunca antes observada en una célula manipulada.
Los intentos anteriores de producción recombinante de lubricina de longitud completa habían producido solo cantidades bajas de miligramos por litro, y se necesitaba un método para producir al menos aproximadamente de uno a dos gramos por litro. Una revisión de la bibliografía puso de manifiesto que no había informes de producción recombinante exitosa a escala comercial de lubricina de longitud completa, correctamente glicosilada, ni expresión a escala comercial de ninguna mucina o proteína similar a la mucina. La búsqueda puso de manifiesto informes que sugerían que una glicoproteína tan altamente glicosilada como la lubricina era bastante difícil de expresar. Véase, p. ej., la patente de EE.UU. N.° 7.642.236 que expone: "Con el fin de optimizar los parámetros de expresión e investigar la necesidad funcional de todas las aproximadamente 76-78 secuencias similares a KEPAPTT, se diseñaron construcciones de expresión de lubricina que permitieron la síntesis de proteínas de lubricina recombinantes con diversos grados de sustitución de oligosacáridos unidos a O". Los datos de productividad de las líneas celulares recombinantes que expresan las construcciones de lubricina truncadas no se describen en la patente.
Los autores de la invención buscaron y finalmente contrataron a Selexis S.A. de Ginebra, Suiza, para producir cultivos clonales que expresan lubricina, basándose en parte en la capacidad descrita de la tecnología de Selexis, que implica la expresión de reguladores epigenéticos, para mejorar la producción de proteínas difíciles de expresar. (Véase Selexis patentes de EE.UU. N.° 7.129.062 y 8.252.917 y publicaciones de solicitudes de patentes de EE.UU. N.° 2011/0061117, 2012/0231449 y 2013/0143264; Girod et al., Nat Methods 4 (9): 747-53 (2007); Harraghy et al., Curr Gene Ther. 8 (5): 353-66 (2008))).
La aplicación de la tecnología de Selexis dio como resultado el desarrollo de clones que expresaban lubricina con éxito. Después del análisis, ampliación de escala y purificación, se descubrió que los procedimientos de producción recombinante recientemente desarrollados daban como resultado formas de lubricina similar a la humana multiméricas, intensa y diferentemente glicosiladas nunca antes descritas, y rendimientos que estaban en niveles sin precedentes para dichas glicoproteínas similares a mucina de alto peso molecular, glicosiladas. El ensayo de preparaciones ricas en la nueva forma de lubricina recombinante demostraron propiedades inesperadas y permitieron la producción de composiciones lubricantes de tejidos fisiológicamente compatibles mejoradas.
El procedimiento de fabricación de rhlubricina (descrito en el presente documento)
Células hospedantes
El trabajo de producción de clones de Selexis se realizó utilizando su línea de células CHO-M patentada, que contiene elementos basados en ADN que controlan la organización dinámica de la cromatina, denominados regiones de unión a la matriz. La línea celular CHO-M es una línea de células de ovario de hámster chino derivada de células CHO-K1 (ATCC, n.° de Cat. CCL-61, Lote 4765275) adaptada a condiciones de cultivo sin suero y usada para la producción de proteínas recombinantes. Véase Girod et al., Nat Methods 4 (9): 747-53 (2007) y las patentes y publicaciones de EE.UU. de Selexis identificadas anteriormente relacionadas con las regiones de unión a la matriz (MAR) para métodos de uso de MAR para el desarrollo de líneas celulares eucariotas estables de alta expresión, tales como CHO, y de células transfectadas para expresar proteínas implicadas en la translocación de productos de expresión a través de la membrana del RE y/o secreción a través de la membrana citoplasmática. CHO-M se utiliza para la producción de proteínas recombinantes terapéuticas y permite una expresión más alta y estable. Su uso permitió el aislamiento de clones que presentaban el alto nivel de expresión deseado para su uso en la producción de proteínas recombinantes.
Las regiones de unión a la matriz ("MAR") son secuencias de ADN que se unen a armazones nucleares aislados o matrices nucleares in vitro con alta afinidad (Hart et al., CurrOpin GenetDev, 8 (5): 519-25 (1998). Como tales, pueden definir los límites de dominios de cromatina independientes, de modo que solo los elementos reguladores cis que los abarcan controlan la expresión de los genes dentro del dominio. Se ha demostrado que las secuencias de MAR interactúan con potenciadores para aumentar la accesibilidad a la cromatina local (Jenuwein et al., Nature, 385: 269 272 (1997)), y pueden mejorar la expresión de genes heterólogos en líneas de cultivo celular. La cotransfección de un plásmido que lleva el elemento 5' MAR de lisozima de pollo con uno o más vectores de expresión da como resultado una mayor expresión transgénica estable que se demostró que producía un aumento de 20 veces en la expresión en comparación con la construcción de control.
Las MAR son un tipo de "elemento de cromatina" (también denominado en el presente documento elementos genéticos de Selexis o SGE) que se describen en las aplicaciones y publicaciones de Selexis a las que se hace referencia en el presente documento. Los elementos de cromatina o SGE se utilizan para evitar que la cromatina que rodea el sitio de integración de un gen heterólogo en el cromosoma de un hospedante influya en el nivel de expresión del gen incorporado. Los elementos de cromatina incluyen elementos de contorno o elementos aislantes (BE), regiones de unión a la matriz (MAR), regiones de control de locus (LCR) y elementos de apertura de cromatina universales o ubicuos (UCOE). Los SGE dan forma a la cromatina una vez que el vector de expresión se ha integrado en el cromosoma de la célula hospedante y, por lo tanto, mantienen el transgén en un estado transcripcionalmente muy activo.
Las células hospedantes CHO-M se cultivaron en medio SFM4CHO (HyClone), complementado con L-glutamina 8 mM, hipoxantina y timidina (1x HT, Invitrogen). Las células se mantuvieron en agitación (120 rpm, recorrido de 25 mm) en una incubadora humidificada a 37°C y CO2 al 5%.
Construcción del vector
El gen PRG4 que codifica la proteína de lubricina humana de 1404 AA de longitud completa (SEQ ID NO: 2) se insertó en vectores plasmídicos disponibles comercialmente y propiedad de Selexis S.A. (Ginebra, Suiza) para mejorar la expresión génica en células de mamíferos. Otra secuencia que codifica la lubricina humana de longitud completa está disponible con el número de acceso de GenBank NM_005807.3.
Se construyeron dos vectores de expresión. El gen de la lubricina se clonó en vectores de expresión que portaban resistencia a puromicina y otro que portaba resistencia a higromicina. El vector que incluía la resistencia a puromicina se denominó pSVpuro_C+_EF1alpha(KOZAK-ext9) EGFP_BGH pA>X_S29 (2*HindIII, Salí cargados) (Mw = 9861). El vector que incluía la resistencia a higromicina se denominó pSVhygro_C+_EF1alpha(KOZAK-ext9) EGFP_BGH pA> X_29 (2*HindIII, SalI cargados) (Mw = 10299). Los vectores de expresión contenían el gen de la beta-lactamasa bacteriana del transposón Tn3 (AmpR), que confiere resistencia a la ampicilina y el origen de replicación bacteriano ColE1. Como derivados de pGL3Control (Promega), la región de terminación de los vectores de expresión contenía un potenciador de SV40 situado secuencia abajo de la señal de poliadenilación de BGH. Cada vector también incluía un X_29SGE humano secuencia abajo del casete de expresión y un gen integrado de resistencia a puromicina o higromicina bajo el control del promotor de SV40. X_29SGE se refiere a un elemento genético de Selexis ("SGE"), en este caso una región de unión a la matriz (MAR), que se describe en las solicitudes y publicaciones de Selexis a las que se hace referencia en el presente documento Ambos vectores de expresión codificaban el gen de interés (PRG4) bajo el control del promotor hEF-1-alfa acoplado a un potenciador de CMV. Los plásmidos se verificaron por secuenciación.
Los mapas de plásmidos del vector que lleva el gen de resistencia a puromicina y que lleva el gen de resistencia a higromicina se muestran en la figura 1 y figura 2, respectivamente.
Transfección
Las células se transfectaron por microporación usando un MicroPorator™ (NanoEnTek Inc., Corea) que define las condiciones de pulso para las células CHO-M (1250 V, 20 ms y 3 pulsos). La eficiencia de transfección se controló usando un vector que expresa GFP en paralelo y mostró una eficiencia de transfección entre 50-70%. Las células CHO-M se transfectaron primero con el vector de expresión de puromicina-PRG4, y las células transfectadas de
manera estable se seleccionaron primero cultivando en un medio que contenía puromicina. Más particularmente, las diluciones se distribuyeron en placas de 96 pocillos, se alimentaron durante la semana siguiente añadiendo 100 pl de medio de selección de nueva aportación a todos los pocillos (medio SFM4CHO complementado con L-glutamina 8 mM, 1 x HT que incluye 5 pg/ml de puromicina). Se restablecieron veintisiete minimezclas en placas de 24 pocillos 15 días después de la siembra, transfiriendo la suspensión celular completa fuera de los correspondientes 96 pocillos a un pocillo de una placa de 24 pocillos cebado con el mismo medio. En cuatro días, se analizaron los líquidos sobrenadantes de 24 pocillos y se transfirieron 14 minimezclas a placas de 6 pocillos (1 ml de suspensión celular 2 ml de medio de crecimiento de nueva aportación, incluida la selección). Las ocho minimezclas de mejor expresión se expandieron tres días después por suspensión y recolección en tubos de centrifugación (volumen de trabajo de 5 ml) y tres días después se cultivaron en matraces de agitación (volumen de trabajo de 20 ml). Se realizó un pase posterior antes del depósito en banco.
Las mezclas de células resistentes se expandieron en matraces de agitación para generar el material necesario para los estudios preliminares (1-2 mg en total). Las muestras de medios exentos de células se consiguieron por centrifugación del cultivo celular a 800 g durante 5 min. La expresión de PRG4 recombinante se ensayó por análisis de transferencia en mancha. Se aplicaron diez microlitros de medio exento de células (muestra concentrada) sobre una membrana de PVDF (Millipore) y las muestras se dejaron secar en manchas. Se creó una referencia de PRG4 por dilución seriada de PRG4 a 80 pg/ml hasta 2.5 pg/ml. El PRG4 recombinante se detectó mediante un anticuerpo policlonal dirigido contra un péptido sintético de lubricina de PRG4 (Pierce).
Las células de las minimezclas de mejor rendimiento a continuación se supertransfectaron (transfección adicional de la población de minimezclas ya seleccionada), utilizando el segundo marcador de selección, el casete de resistencia a higromicina. Se utilizó el mismo protocolo de transfección que se ha descrito antes. Un día después de esta segunda transfección, se inició la selección en medio SFM4CHO, nuevamente complementado con L-Glutamina 8 mM y 1x HT, pero incluyendo 1000 pg/ml de higromicina. Después de un intercambio de medio, en el espacio de cuatro días las tres mezclas se transfirieron a placas de 6 pocillos; las tres (3) mezclas se expandieron a tubos de centrifugación (volumen de trabajo de 5 ml) cuatro días después y a matraces de agitación (volumen de trabajo de 20 ml) en el espacio de tres días.
Generación de clones
A continuación, las mezclas supertransfectadas se cultivaron y se analizó el potencial de crecimiento en experimentos múltiples y en serie en un intento de maximizar las propiedades celulares.
En el primer experimento, tres mezclas supertransfectadas (denominadas P01ST, P05ST y P14ST) se transfirieron a placas de 6 pocillos después del intercambio de medio en la concentración de 100 células/ml (2 placas para cada mezcla), en medio semisólido (2x medio SFM4CHO (HyClone) y CloneMatrix (Genetics), que incluyen L-glutamina 8 mM, 1 x HT y Cell Boost 5™ (HyClone), (sin selección). Las células cultivadas se cribaron 16 días después, (sistema ClonePix™ (Molecular Devices)) y se seleccionaron 22 candidatos y se transfirieron a placas de 96 pocillos con el medio de crecimiento descrito anteriormente (pero sin selección). Los 18 candidatos en crecimiento se restablecieron en placas de 24 pocillos seis días después, transfiriendo la suspensión celular completa fuera de los correspondientes 96 pocillos a un pocillo de una placa de 24 pocillos (cebada con 1 ml de medio). En el espacio de tres días, se analizaron los líquidos sobrenadantes de 24 pocillos y se transfirieron 12 candidatos a placas de 6 pocillos (1 ml de suspensión celular 2 ml de medio de crecimiento de nueva aportación que incluye selección). Los siete mejores candidatos de expresión se expandieron cinco días después al cultivo en suspensión en tubos de centrifugación (volumen de trabajo de 5 ml) en medio (sin selección) y en el espacio de cinco días en matraces de agitación (volumen de trabajo de 20 ml).
Se depositaron en bancos todas las líneas celulares. Se comparó el rendimiento de los tres mejores candidatos en matraces de agitación (siembra de 3x105 células/ml, volumen de cultivo de 20 ml) dentro del cultivo discontinuo alimentado (estrategia de alimentación - 16% del volumen original de solución CB5 (HyClone), 52 mg/ml, alimentado los días 0, 3, 4, 5, 6, 7). El día 8, los cultivos contenían de 4.22 x 106 a 4.95 x 106 células/ml y viabilidad de 94% a 96%. Se contaron las poblaciones de células de estas mezclas y se diluyeron para la siembra en placa de células individuales (concentración 1 célula/pocillo, dos placas). Se alimentaron colonias individuales añadiendo 100 pl de medio de crecimiento por pocillo después de 11 días (sin selección). Después de 17 días, se restablecieron 99 clones en placas de 24 pocillos transfiriendo la suspensión celular completa de los 96 pocillos correspondientes a un pocillo de una placa de 24 pocillos (cebada con 1 ml de medio). En el espacio de cuatro días, 24 se transfirieron a placas de 6 pocillos (3 ml de medio de crecimiento de nueva aportación, que incluye selección). Ocho clones se expandieron para cultivo en suspensión en tubos de centrifugación (volumen de trabajo de 5 ml) después de cuatro días y los ocho clones se expandieron para matraces de agitación (volumen de trabajo de 20 ml) después de un intercambio de medio (medio SFM4CHO, complementado con L-glutamina 8 mM y 1x HT). Se realizó un pase posterior antes de depósito en banco de todos los candidatos.
La comparación del rendimiento de los cinco mejores candidatos se realizó en matraces de agitación (sembrando 3 x 105 células/ml, volumen de cultivo de 20 ml) con cultivo discontinuo alimentado (estrategia de alimentación A 16% del volumen original de solución CB5 (HyClone), 52 mg/ml, alimentado los días 0, 3, 4, 5, 6, 7). El día tres, el número de células en los cultivos respectivos estaba en el intervalo de 1.61 x 106 a 3.46 x 106 células/ml con tiempos de
duplicación en el intervalo de 19.8 a 30.7 horas. El día 8, las concentraciones de células variaban de 4.02 x 106 a 9.48 x 106 células/ml con una viabilidad celular en el intervalo de 88.6% a 97.7%.
En el segundo experimento, se trataron tres mezclas supertransfectadas diferentes (denominadas P14STcp08, P05ST11 y P14ST33) con el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente. Esto dio como resultado cuatro líneas celulares clonales. Una vez más, se comparó el rendimiento de estos clones en matraces de agitación, lo que dio como resultado concentraciones de células el día 8 en el intervalo de 3.5 x 106 a 9.48 x 106 células/ml y viabilidad entre 75.3% y 88.1%.
Un clon de la primera ronda de selección del sistema ClonePix™ descrito anteriormente (P14ST15) que presentaba el día ocho 6.03 x 106 células/ml y viabilidad de 95.5% se descongeló en un matraz de agitación (volumen de trabajo de 20 ml). El candidato se transfirió a una sola placa después de un pase posterior, a la concentración de 200 células/ml (1 placa) en el medio semisólido descrito anteriormente más CloneMatrix, que incluye L-glutamina 8 mM, 1x HT y Cell Boost 5™, sin selección. Las células en placa se cribaron usando el sistema ClonePix™ 12 días después, se recogieron 84 clones y se transfirieron a placas de 96 pocillos (sin selección). Se alimentaron colonias individuales añadiendo 100 pl de medio de crecimiento por pocillo. El cribado de los líquidos sobrenadantes de 96 pocillos tuvo lugar 18 días después de la siembra en placa. Los mejores 24 clones en crecimiento se restablecieron en placas de 24 pocillos, transfiriendo la suspensión celular completa fuera de los 96 pocillos correspondientes a un pocillo de una placa de 24 pocillos (cebada con 1 ml de medio (sin selección). En el espacio de tres días se analizaron 24 líquidos sobrenadantes de los pocillos y se transfirieron 12 clones a placas de 6 pocillos (1 ml de suspensión celular 2 ml de medio de crecimiento de nueva aportación, que incluye la selección). Los seis clones de mejor expresión se expandieron cuatro días después al cultivo en suspensión en tubos de centrifugación (volumen de trabajo de 5 ml) y en el espacio de cuatro días en matraces de agitación (volumen de trabajo de 20 ml). Se realizaron dos pases posteriores antes del depósito en banco. Se depositaron seis líneas celulares clonales.
Se comparó el rendimiento de los seis mejores candidatos en matraces de agitación como se ha descrito anteriormente. El día 8, las densidades celulares estaban en el intervalo entre 9.04 x 106 y 6.40 x 106 células/ml y las viabilidades estaban entre 74.6% y 93.1%.
Crioconservación y ensayo
Después de múltiples pases de las mezclas clonales (de 6 a 31), las mezclas se crioconservaron en viales con 6x106 células/vial y se almacenaron en nitrógeno líquido. La ausencia de micoplasma para todas las líneas celulares se confirmó usando el kit de detección de micoplasma Venor®Gem (Minerva Biolabs). Los ensayos de esterilidad se inocularon e incubaron según el protocolo del fabricante (Heipha, Caso-Bouillon TSB). Se confirmó la esterilidad para todas las minimezclas y minimezclas supertransfectadas.
Cultivos de escala aumentada
La línea celular designada P05ST11 -cp05 se seleccionó para el aumento de escala. Para un experimento de 200 litros, se utilizaron las siguientes condiciones y protocolo:
La expresión de rhPRG4 aumenta a la par con la densidad de células viables (VCD) del día 1 al 8 en un cultivo de 200 litros. La VCD alcanza una meseta el día 8 luego comienzan a caer, lo que generalmente se observa una vez que las condiciones ya no son óptimas para las demandas metabólicas de un sistema de cultivo celular denso. A pesar de esto, la expresión de rhPRG4 continúa constante y su expresión en el sistema de cultivo con VCD de 12-14 x 106 células/ml alcanzó una concentración máxima el día 13 de cultivo. La figura 5 muestra la cantidad acumulada de lubricina recombinante a lo largo del tiempo medida usando el área bajo la curva de un gráfico de HPLC e interpretando esta área en comparación con tres curvas de calibración diferentes hechas por purificación por HPLC de muestras diluidas en serie de lo que se cree que es lubricina al menos 99% pura. Como se ilustra, este procedimiento estimó la producción de lubricina recombinante cercana a 2.5 g/ml. Los experimentos de producción adicionales variaron en su rendimiento aparente medido por diversas técnicas. Un experimento produjo lubricina en un nivel de 1.5 g/litro medido por ELISA competitivo. Otro produjo una lectura de 1.4 g/litro.
Purificación de PRG4 recombinante
El objetivo del desarrollo del protocolo de purificación es retener la función lubricante del producto de lubricina expresado y sus complejos multiméricos a la vez que se separa de los contaminantes, se evita la agregación y se mantiene un alto rendimiento. Esto fue un desafío debido a la alta glicosilación de la lubricina, su alto peso molecular, su propiedad de antiadherencia y lubricación de la superficie, y su tendencia a formar complejos y agregarse para formar micropartículas insolubles a medida que aumenta la pureza. Los primeros experimentos sugerían que debido a que el título de lubricina en el medio recolectado era alto, podría ser necesaria la cromatografía en modo de flujo a través para evitar pérdidas en la purificación. Se desarrolló una estrategia para extraer contaminantes por adsorción cromatográfica a la vez que se retenía el producto de lubricina en el flujo a través. Durante el curso del desarrollo se descubrió que el rendimiento era sensible al uso de componentes tensioactivos no iónicos tales como, por ejemplo, derivado de polioxietileno de monolaurato de sorbitán. La omisión de dicho tensioactivo en la mezcla de lubricina daba como resultado una pérdida significativa de producto durante la ultrafiltración/diafiltración y una filtración de 0.2 pm después de las etapas de separación cromatográfica. El uso de tan solo 0.1% en peso de tensioactivo mejoraba enormemente el rendimiento. Por ensayo y error, se descubrió que concentraciones más bajas de tensioactivo lograban retener la función y mejorar el rendimiento.
Además de los tensioactivos no iónicos utilizados en el procedimiento de purificación, se pueden mezclar formas fisiológicamente compatibles de excipientes, tales como [(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS) y/o lisina con soluciones de la lubricina de la invención y pueden tener efectos beneficiosos en la estabilización de soluciones, p. ej., para evitar o reducir la agregación de lubricina en soluciones que contienen una concentración superior a 0.4 o 0.6 mg/ml.
Los ensayos iterativos dieron como resultado el desarrollo de un procedimiento de purificación que se expone a continuación.
El medio clarificado por sedimentación (100 ml) se diluyó con 5 ml de Tris 200 mM, MgCl240 mM, pH 8,2 y se mezcló con 400 unidades de Benzonase (250 unidades/pl, Novagen) para eliminar los polinucleótidos solubles. La solución se mezcló durante cuatro horas a temperatura ambiente, luego se mezcló con 37.8 g de urea para ajustar la concentración de urea a 6 M y dar como resultado 120 ml de solución. A esta se le añadió NaOH 1 N para ajustar a pH 11 y Tween 20 al 0.01% (monolaurato de sorbitán, Sigma).
El material post-Benzonase se trató a continuación usando resina de intercambio aniónico GE Q Big Beads™ con pH de 11 en presencia de urea 6 M y Tween 20 al 0.01% en modo de flujo continuo (FT) donde los contaminantes se unen a la resina y el producto no. La columna se desinfectó primero con NaOH 0.1 N; luego se cargó con NaPO4 100 mM, NaCl 1.5 M, pH 7.2; y se volvió a equilibrar con tris-borato 200 mM, urea 6 M, pH 10. La columna de 30 ml de volumen (XK 26 x 6 cm) después se cargó con 120 ml de solución a 4 ml/ml de resina con un caudal de 20 ml/min (240 cm/h), seguido de un lavado con tampón de equilibrio - Tris-borato 100 mM, NaCl 100 mM, urea 6 M, Tween 20 al 0.01%, pH 11. Poco después de la carga, el producto se recogió a través del lavado (volumen total 290 ml) hasta adición de una solución de separación NaOH 0.1 N NaCl 1 M.
Esta mezcla de lubricina del flujo a través parcialmente purificada se ajustó de pH con citrato 1 M a pH = 7.5 y se pasó a través de una columna de hidroxiapatita (BioRad CHT), volumen de columna - 14 ml (XK 16 x 7 cm), carga de columna - 21 ml de carga/ml de resina, Caudal = 10 ml/min (300 cm/h). La columna se desinfectó primero con NaOH 0.1 N y NaCl 1 M, se cargó con NaPO4500 mM, pH 6.5; reequilibrio con NaPO4500 mM/Urea 6 M, pH 7.4; y se cargó con el flujo a través de 290 ml de la etapa anterior. A esto le siguió un lavado con tampón de equilibrio, NaPO415 mM, Urea 6 M, Tween 20 al 0.01%, pH 7.4, para producir 305 ml de flujo a través que contiene el producto.
El flujo a través de la columna de hidroxiapatita se ajustó a pH 4.8 con citrato 1 M y se diluyó con agua, luego se pasó a través de una resina GE SP Big Bead, volumen de columna - 6 ml (XK 1.6 x 3 cm), carga de columna - 58 ml de carga/ml de resina, Caudal = 6.7 ml/min (200 cm/h). La columna se desinfectó primero con NaOH 0.5 N, se cargó con NaPO4 100 mM, NaCl 1.5 M, pH 7.4; reequilibrio con citrato de Na 50 mM/urea 6 M, Tween 20 al 0.01%, pH 4.8; y se cargó con los 350 ml de flujo a través de la etapa anterior. A esto le siguió un lavado con tampón de equilibrio, citrato de sodio 50 mM/urea 6 M, Tween 20 al 0.01%, pH 4.8, para producir 378 ml de flujo a través que contenía el producto. A continuación, se neutralizó el flujo a través con NaOH 10 N (pH 7.2).
Para la concentración e intercambio de tampón, la mezcla de producto del flujo a través posterior al intercambio catiónico se filtró usando una membrana de hoja plana de 0.01 m2 TangenX de corte exclusión de peso molecular de 50 kDa (TangenX Technology Corporation), canal de cribado LP. El tampón de diafiltración era NaPO410 mM, NaCl 150 mM, pH 7.2 (PBS) y Tween 20 al 0.1%. Después de desinfección con NaOH 0.1 N; un enjuagado con agua MilliQ; y equilibrado con NaPO4 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.2, la membrana se cargó con 15000 ml/m2; Flujo cruzado 70 ml/min; presión transmembrana = 0.42-0.49 kg/cm2 (6-7 psi); flujo de permeado = 5-6 ml/min para concentrar la solución a aproximadamente 50 ml.
Por último, la mezcla de productos post UFDF se sometió a filtración de 0.2 gm a través de una membrana Sartorius Sartopore 2, 150-0.015 m2 con una carga de membrana de ~17000 ml/m2 y un caudal de 45-50 ml/min. La membrana se cebó primero con NaPO4 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4, luego se filtró el producto, seguido de un filtro Chase con ~40 ml de tampón y finalmente el filtro se drenó.
Actualmente se están examinando excipientes adicionales para mejorar la recuperación del UFDF y la filtración de 0.2 gm del producto purificado final. Este procedimiento puede producir grandes cantidades de producto por litro de medio recolectado de al menos 96% de pureza. Las estrategias de purificación alternativas resultarán evidentes para los expertos en la técnica.
Caracterización del producto de lubricina
Electroforesis
El peso molecular de la cadena principal de aminoácidos de lubricina de longitud completa es 150918 Daltons. El grado y el tipo de glicosilación varía de una molécula a otra. Se cree que el PRG4 recombinante elaborado como se describe en el presente documento como una especie dimérica tiene un peso molecular medio superior a aproximadamente 450 kDa. Los monómeros deben tener un peso de 220-280 kDa y no más de aproximadamente 300 kDa.
La figura 3 representa un gel teñido con Coomassie (sistema de electroforesis en gel de poliacrilamida Tris-Ac 3-8% NuPAGE® SDS-PAGE, Invitrogen) de rhPRG4, tanto no reducido cuando se purifica como reducido y alquilado. Todas las bandas numeradas se confirmaron como lubricina por MS/MS, que tenía una secuencia de aminoácidos que coincidía con el PRG4 de homo sapiens (número de acceso de UniProt Q92954; SEQ ID NO: 1). Como se ilustra, la lubricina recombinante producida como se ha descrito anteriormente (NR) contiene una banda principal que tiene pesos moleculares aproximados, estimados en comparación con los patrones de peso molecular, de ~460 kDa, una ligeramente por encima de ella y una en la parte superior del gel que no pudo migrar en el gel.
La identificación de los constituyentes del procesamiento postraduccional se realizó mediante digestión de rhPRG4 con neuraminidasa (NaNasa 1) y O-glicosidasa DS simultáneamente para exponer el peso molecular del núcleo de aminoácidos de rhPRG4 como se muestra en la hilera marcada como L-NO en la figura 4. El peso molecular previsto del núcleo es de 151 kDa, que se confirma experimentalmente mediante esta SDS-PAGE al 4-12%. La digestión con neuraminidasa sola tenía un efecto de disminución en el peso molecular, lo que ilustra que la glicosilación es rematada de forma incompleta por el ácido neuramínico. La digestión con O-glicosidasa DS, que elimina los restos de (3(1 -3) GalNAc-Gal unidos a O y neuraminidasa, implica que este lote de proteína está glicosilado aproximadamente en un
30% en peso. La digestión con O-glicanasa sola probablemente solo es eficaz para eliminar algunos restos de GalNAC-Gal sin rematar.
Análisis de glicosilación
Para caracterizar aún más la proteína, se realizó y comparó el análisis espectrométrico de masas de los O-glicanos de la lubricina recombinante y la lubricina sinovial normal. Brevemente, se aisló lubricina sinovial del líquido sinovial usando cromatografía de DEAe . La lubricina recombinante y sinovial se separaron por SDS-PAGE usando geles de T ris-acetato al 3-8% antes de transferencia a una membrana de PVDF. A continuación, se liberaron los O-glicanos de las transferencias de lubricina por p-eliminación reductora seguida de limpieza para análisis de LC-MS/MS. Los O-glicanos se separaron mediante cromatografía de carbono grafitizado poroso antes del análisis de MS/MS en modo negativo utilizando un método dependiente de datos en un espectrómetro de masas de trampa de iones lineal, LTQ (Thermo Scientific).
El análisis de la muestra de lubricina recombinante identificó solo estructuras de O-glicano del núcleo 1 (figura 6). El cromatógrafo de iones extraído que muestra los glicanos identificados se muestra en la figura 7. La estructura sialilada, [M-H] - 675, se muestra como dos picos principales. Estos son el mismo isómero siendo el segundo pico en el tiempo de retención de 21.4 min un derivado químico creado durante el proceso de p-eliminación. Se identificaron tres isómeros de la estructura sulfatada ([M-H]-464). También se identificaron varios isómeros de la estructura monosulfatada monosialilada. La estructura disialilada era de muy baja abundancia y no se puede observar en el cromatógrafo. En la Tabla 1 se muestra una estimación de la proporción de cada uno de los glicanos identificados (para la clave de las estructuras de los azúcares, véase la figura 6). Este análisis combina todos los isómeros, derivados y aductos para cada una de las estructuras de la Tabla 1.
Tabla 1. El porcentaje de cada uno de los glicanos identificados en la lubricina recombinante. Los datos incluyen todos los isómeros, derivados y aductos para cada una de las estructuras dadas en la tabla.
La lubricina sinovial humana normal tiene una gama más amplia de glicanos que se extienden hacia las estructuras del núcleo 2 (figura 8). Las más abundantes de estas estructuras se muestran en la figura 9 en el cromatógrafo de iones extraídos.
El patrón de glicosilación de la rhlubricina es muy diferente del de la glicoproteína humana nativa, como puede apreciarse fácilmente, por ejemplo, a partir de una comparación de la figura 7 con la figura 9. En la lubricina sinovial nativa, la estructura del núcleo 1 sialilado es el glicano más abundante, pero hay glicosilación significativa del núcleo 2 de varios tipos y sólo cantidades menores de polisacáridos sulfatados. En la glicoproteína recombinante, el núcleo 1 sialilado y no modificado constituye más de la mitad de los glicanos, y la estructura del núcleo 1 sulfatado constituye aproximadamente un tercio de los O-glicanos identificados, con los tres posibles isómeros identificados.
Propiedades fisicoquímicas de la rhlubricina
Propiedades similares a los tensioactivos (anfipáticos)
Un atributo importante del rhPRG4 es su capacidad para recubrir superficies tanto biológicas como no biológicas mediante adsorción fisicoquímica. El PRG4 nativo es tensioactivo e incorpora dominios globulares terminales separados por el gran dominio similar a mucina. Estos pueden separarse en dominios polares y no polares dentro de su estructura. El dominio central de la mucina, como se muestra en los estudios del aparato de fuerza superficial de la lubricina del líquido sinovial humano, puede volver a plegarse sobre sí mismo, lo que sugiere que las glicosilaciones se dirigen hacia afuera a medida que se logra esta orientación. En general, el dominio de mucina se vuelve más hidrófilo que sus extremos N o C. La importancia de esto se confirma con el conocimiento de que la digestión de las glicosilaciones eliminará la capacidad lubricante (Jay et al., J Glycobiol2001). Esta naturaleza anfipática también está presente en el rhPRG4. Puede medirse fácilmente mediante la evaluación de una reducción en la tensión interfacial entre una interfase alifática y acuosa.
En un experimento diseñado para ensayar las propiedades tensioactivas de la rhlubricina preparada usando el procedimiento descrito en el presente documento, se presentó una concentración creciente de rhPRG4 en una solución de PBS que estaba cubierta por ciclohexano hidrófobo sin diluir. Un anillo de Du Noüy colocado en la subfase acuosa que contenía rhPRG4 se empujó hacia arriba y se registró la tensión crítica (H) donde el anillo atraviesa la interfase. Las mediciones se recogieron cinco veces a cada concentración en un tensiómetro Attension Sigma 702ET.
Se representó una curva de respuesta a la dosis de concentración de rhPRG4 frente a ri, véase la figura 10 A. Como se ilustra, a medida que aumenta la concentración de rhPRG4 en la subfase acuosa que contiene PBS, la tensión interfacial disminuye.
Debido a que la solución de rhlubricina contenía tensioactivo no iónico residual (Tween 20), se repitió el experimento para investigar si este era responsable de la reducción drástica de la tensión superficial inducida por la adición del producto recombinante, primero usando varias concentraciones del tensioactivo solo y luego con concentraciones muy bajas del rhPRG4 de la invención. Se añadieron cantidades de microlitros del tensioactivo y PRG4 a 15 ml de la subfase acuosa. Los resultados se muestran en la figura 10B y figura 10C. Como se ilustra, el PRG4 solo (figura 10C) reduce la tensión superficial mejor que el tensioactivo comercial solo al 0.1% (figura 10B). Así, el rhPRG4 que contenía Tween al 0.1% y el que no contenía Tween redujeron la tensión interfacial de PBS y ciclohexano más que Tween al 0.1% solo cuando todos tenían las mismas cantidades de la solución de interés añadidas.
Estos datos muestran que incluso a bajas concentraciones, el rhPRG4 puebla preferentemente la interfase acuosaalifática, reduciendo la tensión interfacial. Este fenómeno recapitula la interacción de unión a la superficie que se requiere en la reducción de la fricción e imita el comportamiento de la lubricina nativa. Además, la actividad de reducción de la tensión interfacial se puede utilizar como un procedimiento de control de calidad de la producción de rhPRG4.
Propiedades lubricantes
Lubricación de cartílago
Se prepararon muestras osteocondrales recientes (n = 16) para el ensayo de fricción del surco patelofemoral de articulaciones de babillas bovinas esqueléticamente maduras, como se ha descrito anteriormente. Brevemente, se recogieron núcleos (radio = 6 mm) y anillos (radio exterior = 3.2 mm y radio interior = 1.5 mm) de bloques osteocondrales, ambos con orificios centrales (radio = 0.5 mm) para permitir la despresurización del fluido. Las muestras se enjuagaron enérgicamente durante la noche en PBS a 4°C para eliminar el líquido sinovial residual de la superficie articular, y esto se confirmó mediante el ensayo de presencia de lubricación. A continuación, las muestras se congelaron en PBS con inhibidores de proteinasa a -80°C, se descongelaron y se volvieron a agitar durante la noche en PBS para reducir de la superficie aún más cualquier PRG4 residual en la superficie. A continuación, las muestras se sumergieron completamente en aproximadamente 0.3 ml de los respectivos lubricantes de ensayo (descritos a continuación) a 4°C durante la noche antes del ensayo de lubricación del día siguiente, y se enjuagaron nuevamente con PBS después de cada ensayo antes de incubación en el siguiente lubricante de ensayo.
Se utilizó un instrumento de ensayo Bose Electroforce® (ELF 3200, Eden Prairie, Minnesota) para analizar la capacidad de lubricación límite de cada una de las formas de PRG4 y controles, utilizando un ensayo de fricción de cartílago sobre cartílago establecida. Brevemente, todas las muestras se comprimieron a una velocidad constante de 0.002 mm/s hasta el 18% del espesor total del cartílago y se dejaron relajar de la tensión durante 40 minutos para permitir la despresurización del fluido intersticial. A continuación, las muestras se rotaron a una velocidad eficaz conocida por mantener la lubricación en modo límite en una interfase de cartílago-cartílago despresurizada (0.3 mm/s) a ± 2 revoluciones. Después de dejar en un período estacionario previo al deslizamiento de 1200, 120, 12 y 1.2 segundos, las muestras se rotaron después de cada período estacionario posterior, /- 2 revoluciones. A continuación, se repitió la secuencia de ensayo en el sentido de giro opuesto, -/+ 2 revoluciones.
Dos secuencias de ensayo evaluaron la capacidad de lubricación límite del cartílago del rhPRG4, tanto solo como en combinación con HA. En ambas secuencias de ensayo, el PBS sirvió como lubricante de control negativo y el líquido sinovial bovino como lubricante de control positivo. Tanto el rhPRG4 como el PRG4 bovino nativo purificado se prepararon en PBS en una concentración de 450 pg/ml, y el HA (1.5MDA Lifecore Biomedical, Chaska, MN) también se preparó en PBS en una concentración fisiológica de 3.33 mg/ml. Los lubricantes se ensayaron en un supuesto orden creciente de capacidad lubricante (coeficiente de fricción decreciente). En la secuencia de ensayo 1, rhPRG4 frente a nbPRG4, la secuencia fue PBS, rhPRG4, nbPRG4, líquido sinovial (n = 7); en la secuencia de ensayo 2, rhPRG4 frente a rhPRG4 HA, la secuencia fue PBS, rhPRG4, rhPRG4 HA, líquido sinovial (n = 4).
Los dos coeficientes de fricción; estático (pestático, Neq) (resistencia de inicio del movimiento desde una condición estática) y cinético (<pcinético, Neq>) (resistencia del movimiento de deslizamiento constante) se calcularon para cada lubricante como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en las figuras 11 y 12. Los datos se presentan como media ± EEM. Se utilizó ANOVA para evaluar el efecto del lubricante y el período estacionario previo al deslizamiento como un factor repetido en pestático,Neq y <pcinético,Neq>, con pruebas a posteriori de Tukey en <Pcinético,Neq> en un período estacionario previo al deslizamiento de 1.2 s. El análisis estadístico se implementó con Systat12 (Systat Software, Inc., Richmond, CA).
Como se muestra en la figura 11, no había significación estadística entre la propiedad lubricante medida, los coeficientes cinéticos de fricción, del PRG4 recombinante y los valores ligeramente más bajos del PRG4 bovino nativo. Como se muestra en la figura 12, el rhPRG4 en combinación con HA mejora la lubricidad tanto estática (figura 12A) como cinética (figura 12B) en comparación con el rhPRG4 solo. Todas las mediciones fueron las más altas en PBS y las más bajas en el líquido sinovial bovino, siendo las de rh-PRG4 y rhPRG4+HA intermedias. La solución mixta de
rhPRG4+HA tenía una tendencia hacia un coeficiente de fricción significativamente más bajo que el rhPRG4 solo (p = 0.075) y era estadísticamente similar al líquido sinovial bovino (0.021 ± 0.001, p = 0.20).
También se han realizado esfuerzos para asegurar la eliminación de la lubricina nativa del cartílago bovino destinado a usarse como cojinetes utilizando una digestión enzimática de dos horas con hialuronidasa. La digestión con hialuronidasa está destinada a eliminar el PRG4 nativo (P <0.050) de la zona superficial de los explantes de cartílago. Este tratamiento elimina el PRG4 de la superficie sin afectar significativamente a las características mecánicas del cartílago articular. La aplicación de rhPRG4 a estas superficies y la comparación de la respuesta de fricción con los controles de BSF y PBS muestra que se puede restablecer un COF bajo con el rhPRG4 de la invención. La figura 13 muestra los valores de COF para explantes de cartílago de cóndilo medial bovino tratados con hialuronidasa con rhPRG4, BSF y PBS como lubricantes que intervienen. Los explantes osteocondrales se ensayaron siguiendo los lubricantes mencionados anteriormente siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Como se muestra, el PRG4 de tipo humano recombinante restableció un COF bajo (rhPRG4 N = 18; BSF N = 6; PBS (N = 8).
Lubricación de la superficie ocular
Se obtuvieron córneas humanas normales con 3 mm de esclerótica del Southern Alberta Lions Eye Bank. Se recogieron párpados humanos de cadáveres recientes del programa de donación de cuerpos de la Universidad de Calgary. La aprobación para el uso y apropiación de estos tejidos se obtuvo de un Comité de Ética en Investigación de la Salud. Las córneas (n=6) se almacenaron en un medio de almacenamiento corneal basado en sulfato de condroitina (Optisol-GS) a 4°C y se usaron en el plazo de 2 semanas. Los párpados (n=6) se congelaron y descongelaron en el momento de su uso.
La pureza de la especie de rhPRG4 se estimó que era de 50% por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico Tris-acetato al 3-8% NUPAGE. La concentración de la preparación de rhPRG4 enriquecida se analizó y se ajustó para tener en cuenta el nivel de pureza.
Las muestras de tejido se montaron en un Bose ELF3200 con accionadores axiales y giratorios, y sensores de par y carga axial. La córnea resecada se fijó al extremo de un tapón de caucho de silicona semiesférico (radio = 6 mm) aplicando adhesivo de cianoacrilato (Superglue) a la esclerótica. Se colocó una funda de caucho de silicona alrededor del aparato de tapón de córnea, que servía para contener el fluido lubricante. A continuación, este aparato se unió al accionador giratorio del Bose ELF3200 formando así la superficie de articulación inferior. Se perforó un anillo (radio exterior = 3.2 mm, radio interior = 1.5 mm) del material PDMS modelo (UntrSylgard 184 de ~0.4 mm de espesor, Dow Corning) o de tejido de párpado humano y se pegó a un soporte de anillo. Este soporte de anillo se unió luego al accionador lineal, formando así la superficie de articulación superior.
Después de montar las muestras, se pusieron 0.3 ml de lubricante de prueba sobre la córnea para formar un baño de lubricante y se dejó que las superficies de articulación se equilibraran con el lubricante de ensayo durante un mínimo de cinco minutos. Las muestras de tejido se ponen en contacto en tres posiciones axiales determinadas manualmente para corresponder con cargas axiales de 0.3±0.02, 0.5±0.03 y 0.7±0.03 N, lo que da como resultado presiones axiales en el intervalo de 12.2 a 28.5 kPa basado en un área de contacto de (24.6 milímetros2). Una vez en contacto en una posición axial dada, las muestras se sometieron a cuatro revoluciones en ambas direcciones a cuatro velocidades de deslizamiento efectivas diferentes (vef = 30, 10, 1.0, 0.3 mm/s) donde vef = w-ref y ref= 2/3[(ro3 - r¡3)/ (ro2 - n2)j. La carga axial y el par se recogieron a 20 Hz durante las rotaciones. Hubo un tiempo de permanencia de 12 segundos entre cada revolución. Cada secuencia de ensayo, descrita a continuación, incluía una etapa de preacondicionamiento en donde los tejidos se sometieron al protocolo de ensayo descrito en un baño de solución salina.
Para determinar la capacidad de lubricación límite de la preparación de rhPRG4 en una interfase córnea-párpado humanos (ensayo 1) y córnea humana - polidimetilsiloxano (PDMS, ensayo 2), se utilizó la siguiente secuencia de ensayo: PRG4 300 pg/ml en solución salina, rhPRG4 300 pg/ml en solución salina, luego solución salina (Sensitive Eyes Saline Plus, Bausch & Lomb).
Para evaluar la efectividad de los lubricantes de ensayo en las dos interfases, se calcularon los coeficientes de fricción estático y cinético. Como se ilustra en la figura 14, tanto PRG4 como rhPRG4, de manera significativa y similar, redujeron la fricción en una interfase de córnea humana - PDMS (véanse las figuras 14C y 14D) y en las interfases de córnea - párpado (figuras 14A y 14B).
Claims (15)
1. Una composición que comprende:
una glicoproteína de lubricina multimérica recombinante expresada a partir de un gen PRG4 humano en un cultivo de células hospedantes, que comprende al menos 30% en peso de restos glicosídicos, en donde al menos el 90% en peso de la glicosilación de la glicoproteína de lubricina es glicosilación del núcleo 1, y que produce un coeficiente de fricción dinámico no superior al 150% del coeficiente de fricción dinámico de la lubricina bovina nativa purificada, medido en un ensayo de fricción de cartílago sobre cartílago.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde la glicoproteína de lubricina se caracteriza por producir un coeficiente de fricción dinámico no mayor del 120% del coeficiente de fricción dinámico de la lubricina bovina nativa purificada medido en un ensayo de fricción de cartílago sobre cartílago.
3. La composición de la reivindicación 1, en donde la glicoproteína de lubricina se caracteriza por producir un coeficiente de fricción dinámico no mayor del 110% del coeficiente de fricción dinámico de la lubricina bovina nativa purificada medido en un ensayo de fricción de cartílago sobre cartílago.
4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la glicoproteína de lubricina comprende al menos el 35% en peso de restos glicosídicos.
5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la glicoproteína de lubricina comprende al menos el 40% en peso de restos glicosídicos.
6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la glicoproteína de lubricina comprende al menos el 45% en peso de restos glicosídicos.
7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde al menos el 95% en peso de la glicosilación de la glicoproteína de lubricina es glicosilación del núcleo 1.
8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde al menos el 99% en peso de la glicosilación de la glicoproteína de lubricina es glicosilación del núcleo 1.
9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde los restos glicosídicos están enriquecidos en cadenas laterales de sacáridos sulfatados en comparación con la lubricina humana nativa.
10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además una especie de lubricina monomérica mezclada con especies de lubricina multiméricas.
11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, que comprende además una especie de lubricina dimérica.
12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende además una especie de lubricina que tiene un peso molecular de al menos 1200 kDa y que comprende al menos cinco cadenas de aminoácidos glicosiladas individuales unidas por enlaces disulfuro o asociadas no covalentemente.
13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende además ácido hialurónico o una sal del mismo mezclado con dicha glicoproteína de lubricina.
14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para su uso como medicamento.
15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para su uso en el tratamiento de la enfermedad del ojo seco.
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| US20220127319A1 (en) | 2019-01-15 | 2022-04-28 | Cornell University | Recombinant mucins, and compositions and methods for using the same |
| WO2020247440A1 (en) * | 2019-06-03 | 2020-12-10 | Lubris Llc | Use of prg4 to treat cancer |
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| US20250282981A1 (en) | 2022-04-27 | 2025-09-11 | Lubris Llc | Methods of making polymer films |
| CN115177790A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-10-14 | 天津大学 | 透明质酸和润滑素蛋白协同修饰胶原蛋白基质的制备方法 |
| CN115154667A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-10-11 | 天津大学 | 一种基于重组润滑素蛋白修饰的胶原蛋白基质的制备方法 |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2243827B2 (en) * | 1996-08-30 | 2017-11-22 | Life Technologies Corporation | Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof |
| US6530956B1 (en) * | 1998-09-10 | 2003-03-11 | Kevin A. Mansmann | Resorbable scaffolds to promote cartilage regeneration |
| US6960562B2 (en) | 1999-04-23 | 2005-11-01 | Rhode Island Hospital, A Lifespan Partner | Tribonectin polypeptides and uses thereof |
| US6743774B1 (en) | 1999-04-23 | 2004-06-01 | Rhode Island Hospital | Tribonectins |
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| ATE437233T1 (de) | 2001-01-26 | 2009-08-15 | Selexis Sa | Matrix-anheftungsregionen und verfahren zu deren verwendung |
| TW200307011A (en) | 2002-04-18 | 2003-12-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Hyaluronic acid modifier |
| US7415381B2 (en) | 2003-01-09 | 2008-08-19 | Rhode Island Hospital, A Lifespan Partner | Joint friction sensing |
| WO2005000331A2 (en) | 2003-06-04 | 2005-01-06 | Mucosal Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment and prevention of degenerative joint disorders |
| KR101078202B1 (ko) * | 2003-08-14 | 2011-11-01 | 와이어쓰 엘엘씨 | 재조합 루브리신 분자 및 이의 용도 |
| IN2014DN02484A (es) | 2003-10-24 | 2015-05-15 | Selexis Sa | |
| US20090155200A1 (en) | 2004-04-20 | 2009-06-18 | Jay Gregory D | Methods of promoting cartilage healing or cartilage integration |
| JP2008507553A (ja) | 2004-07-23 | 2008-03-13 | ミューコサル セラピューティクス リミテッド ライアビリディ カンパニー | 粘性補給のための組成物および方法 |
| EP1827478A4 (en) | 2004-12-03 | 2009-08-05 | Mucosal Therapeutics Llc | METHODS OF TREATING JOINED OR SICK JOINTS |
| US20070111327A1 (en) | 2005-05-05 | 2007-05-17 | Jay Gregory D | Methods of detecting lubricin |
| US8795723B2 (en) | 2005-09-09 | 2014-08-05 | Angelini Pharma Inc. | Sustained drug release compositions |
| SG176501A1 (en) * | 2006-08-23 | 2011-12-29 | Selexis Sa | Matrix attachment regions (mars) for increasing transcription and uses thereof |
| CN101541308B (zh) | 2006-09-28 | 2012-02-01 | 哈达斯特医疗研究服务和开发有限公司 | 甘油磷脂用于关节润滑的用途 |
| WO2008143816A1 (en) | 2007-05-15 | 2008-11-27 | Mucosal Therapeutics | Compositions and methods for reducing friction between the surface of tendons or other soft tissues |
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| US20090104148A1 (en) * | 2007-09-18 | 2009-04-23 | Jay Gregory D | Treatment and prevention of joint disease |
| US8506944B2 (en) | 2008-05-07 | 2013-08-13 | The Regents Of The University Of California | Replenishment and enrichment of ocular surface lubrication |
| SI2915529T1 (sl) | 2008-05-07 | 2017-09-29 | The Regents Of The University Of California | Terapevtska regeneracija in obogatitev lubrikacije okularne površine |
| CN102438645A (zh) | 2009-01-13 | 2012-05-02 | 卢布里斯有限责任公司 | 阴道上皮界面润滑的治疗调节 |
| CA3110817C (en) | 2009-05-22 | 2023-08-15 | Lubris, Llc | Application and uses of prg4 and therapeutic modulation thereof |
| CA2771110C (en) | 2009-08-13 | 2019-02-26 | Singularis, Inc. | Prg4 treatment for interstitial cystitis |
| JP2013505013A (ja) | 2009-09-18 | 2013-02-14 | セレクシス エス．エー． | 強化導入遺伝子発現およびプロセッシングの産物および方法 |
| WO2011091000A2 (en) | 2010-01-19 | 2011-07-28 | Singularis, Inc. | Oral care compositions and methods |
| US20130116186A1 (en) | 2011-10-04 | 2013-05-09 | Rhode Island Hospital, A Lifespan Partner | Lubricin injections to maintain cartilage health |
| US9982027B2 (en) | 2013-10-22 | 2018-05-29 | Lubris Llc | Control of rheological properties of mixed hyaluronate/lubricin solutions |
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| US20180161393A1 (en) | 2015-01-26 | 2018-06-14 | Lubris Llc | Prg4 for treating gout and its symptoms |
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