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WO2012066171A1 - Nanopartículas para la prevención y/o tratamiento de enfermedades de mucosas - Google Patents

Nanopartículas para la prevención y/o tratamiento de enfermedades de mucosas Download PDF

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WO2012066171A1
WO2012066171A1 PCT/ES2011/070780 ES2011070780W WO2012066171A1 WO 2012066171 A1 WO2012066171 A1 WO 2012066171A1 ES 2011070780 W ES2011070780 W ES 2011070780W WO 2012066171 A1 WO2012066171 A1 WO 2012066171A1
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WO
WIPO (PCT)
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nanoparticles
mucosa
muc5ac
disease
mucin
Prior art date
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Ceased
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PCT/ES2011/070780
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English (en)
French (fr)
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Jenny PÁRRAGA MENESES
Giovanni Konat Zorzi
Patrizia Paolicelli
Begoña Seijo Rey
Alejandro SÁNCHEZ BARREIRO
Laura Contreras Ruiz
Yolanda Diebold Luque
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidade de Santiago de Compostela
Universidad de Valladolid
Original Assignee
Universidade de Santiago de Compostela
Universidad de Valladolid
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Publication date
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    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the present invention is within the field of biotechnology, and more specifically of biomedicine. Specifically, it refers to nanoparticles comprising a polynucleotide encoding a modified MUC5AC protein that has the N-terminal end of MUC5AC attached to the dimerization domain located at the C-terminal end, or a plasmid or a genetic construct containing it, and its use for the elaboration of a medicine for the prevention and / or treatment of a disease that has a mucin deficiency.
  • the mucous membranes of the organism are one of the most sensitive elements to both inflammatory and infectious conditions. Within these mucous membranes, one of the most important elements are the mucins. These mucins are a heterogeneous group of high molecular weight glycoproteins and are the fundamental element of the body's mucous secretions. Within this group there are described at least 17 different proteins with different characteristics of both expression and functional.
  • mucins are especially relevant in the case of the ocular mucosa, where the mucins have high importance in the homeostasis of the mucous tissue, as well as in the lubrication of both corneal and conjunctival epithelia during flickering.
  • the mucins act at the ocular level as stabilizers of the tear film preventing the desiccation of the epithelium and as a barrier against the entry of both foreign agents and pathogens. Due to the importance of these mucins, the deficiency in them carries several ocular pathological problems.
  • ocular surface which is considered an established functional unit (Stern et al, 1998. Cornea. 17: 584-589).
  • This ocular surface is a mucous tissue similar to other mucous membranes in the body such as the mucosa of the gastro-intestinal tract, the mucosa of the respiratory tract, the urinary mucosa and the vaginal mucosa.
  • diseases that occur with alteration in the regulation of mucin production are, for example, autoimmune diseases that occur with inflammation. In these cases it can lead, depending on the disease, an overproduction or a subproduction of the mucins characteristic of the ocular surface. This variation of the levels of the mucins, cause that the homeostasis produced by them does not occur and therefore gives rise to serious pathological processes that can influence the visual function.
  • mucin MUC5AC which is specific to the goblet cells of the conjunctiva.
  • the production of mucin by these cells is strongly diminished (up to 90% reduction) in various eye diseases such as for example keratoconjunctivitis sicca, Sjógren's syndrome, pemphigoid, Stevens Johnson's syndrome (Kunert et al, 2001. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42: 2483-2489), in atopic patients with corneal ulcers (Dogru et al, 2005. Cornea 24: S18-S23; Dogru et al, 2005. Curr Eye Res.
  • chitosan is a polymer cited as essential in the formation of nanoparticles by ionic crosslinking. Chitosan nanoparticles are being questioned as there are studies that question their usefulness against simple solutions of bioactive molecules with the polymer (Dyer et al, 2002. Pharm Res. 19: 998-1008). In addition, the possible cytotoxicity of chitosan nanoparticles has also been noted (Loretz and Bernkop-Schnürch, 2007. Nanotoxicology. 1: 139-148).
  • the present invention relates to nanoparticles useful for the preparation of a medicament that allows the recovery of mucin production.
  • Said nanoparticles are associated with a polynucleotide encoding a modified MUC5AC protein, a genetic construct or a vector containing said polynucleotide.
  • This composition allows the recovery of mucin production, so it is useful for the development of a drug for the treatment of diseases of the associated mucous membranes to a mucin deficiency.
  • the present invention demonstrates how the inventors have developed a plasmid that includes a polynucleotide capable of encoding a mucin, which can be associated with nanoparticles.
  • the nanoparticles act as vehicles of the genetic material, without presenting cytotoxic activity, and allow the cells to produce the mucin encoded by the plasmid.
  • the present invention demonstrates the ability of the composition to recover tear production in mice with induced dry eye, demonstrating the usefulness of said composition for the development of medicaments for the treatment of mucosal diseases that occur with mucin deficiency .
  • the composition of the present invention would be used for the treatment of mucosal diseases that occur with mucin deficiency.
  • a plasmid has been associated that integrates a sequence encoding the modified MUC5AC protein (whose sequence is SEQ ID NO: 1), which corresponds to the C and N terminal ends of the native MUC5AC protein.
  • This nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) coding for the modified mucin is substantially shorter (7.7 kilobases) than the coding sequence of the complete mucin (16 kilobases), which has the advantage of greater ease of cloning in plasmids, genetic constructs or vectors.
  • This shorter coding sequence encodes the MUC5AC mucin that has fused the C-terminal and N-terminal ends, and that maintains the most important domains of the original protein such as the dimerization domain (present at the C-terminal end ), the polymerization domain, some of the different glycosylation points in the complete protein, and the signal peptide for its correct conduction through the secretory pathway.
  • This protein therefore, has the N-terminal end of the MUC5AC (amino acids 1-2488) attached to the dimerization domain present at the C-terminal (amino acids 5.220-5.333), eliminating the central region where highly repeated sequences are found. rich in proline, threonine and serine (PTS).
  • said modified MUC5AC protein is useful for treating diseases that occur with mucin deficiency such as dry eye syndrome.
  • a first aspect of the invention relates to polymeric nanoparticles, hereinafter nanoparticles of the invention, comprising a polynucleotide encoding a modified MUC5AC protein that has the N-terminal end of MUC5AC attached to the dimerization domain located at the C-terminal end.
  • modified MUC5AC protein that has the N-terminal end of MUC5AC attached to the dimerization domain located at the C-terminal end refers to a protein that has the N-terminal end of the MUC5AC that includes both the polymerization domain, as the signal peptide for its correct conduction by the secretory pathway, with the dimerization domain of the C-terminal end of the MUC5AC protein.
  • An example of a modified MUC5AC protein presenting the N-terminal end of MUC5AC attached to the dimerization domain located at the C-terminal end is, for example, but not limited to, the sequence protein SEQ ID NO: 1, which has the amino acids 1-2488 of the MUC5AC protein (corresponding to the N-terminal end) attached to amino acids 5,220-5,333 (corresponding to the dimerization domain of the C-terminal end).
  • SEQ ID NO: 1 which has the amino acids 1-2488 of the MUC5AC protein (corresponding to the N-terminal end) attached to amino acids 5,220-5,333 (corresponding to the dimerization domain of the C-terminal end).
  • a polypeptide could have variations in the amino acid sequence with respect to that described by way of example without a substantial alteration in the protein. This means that this variation would not be determinant in the polypeptide neither for its structure nor for its activity.
  • variations are generated by substitutions, deletions or additions.
  • substitutions occur between amino acids that have similar characteristics such as polarity, size or charge, and include, but are not limited to, substitutions between glutamic acid (Glu) and aspartic acid (Asp), between Lysine (Lys) and Arginine (Arg), between asparagine (Asn) and glutamine (Gln), between serine (Ser) and threonine (Thr), and between the amino acids that make up the alanine (Ala), leucine (Leu), valine (Val) and isoleucine group (lie)
  • the variations can be artificially generated variations such as by mutagenesis or direct synthesis.
  • the modified MUC5AC protein having the N-terminal end of MUC5AC attached to the dimerization domain located at the C-terminal end has at least 90%, preferably 95 %, more preferably 98% identity of with respect to SEQ ID NO: 1.
  • the modified MUC5AC protein presenting the N-terminal end of MUC5AC attached to the dimerization domain located at the C-terminal end is SEQ ID NO: 1.
  • a polynucleotide that codes for a modified MUC5AC protein that has the N-terminal end of MUC5AC attached to the dimerization domain located at the C-terminal end would be any polynucleotide that codes for a protein or polypeptide included under the designation " modified MUC5AC protein presenting the N- end MUC5AC terminal linked to the dimerization domain located at the C-terminal end.
  • nucleotide sequence refers to a polymeric form of nucleotides of any length that may be or no, chemically or biochemically modified. They therefore refer to any polyiribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, both chain s match like double strand.
  • the polynucleotide of the invention can be found in nature and obtained by isolation by methods known in the state of the art, or obtained artificially by conventional cloning and selection methods, or by sequencing.
  • the polynucleotide in addition to the coding sequence, can carry other elements such as, but not limited to, introns, non-coding sequences at the 5 'or 3' ends, ribosome binding sites, or stabilizing sequences. These polynucleotides can additionally also include coding sequences for additional amino acids that may be useful, for example, but not limited to increasing the stability of the peptide generated from it or allowing a better purification thereof.
  • the polynucleotide has at least 90%, preferably 95%, more preferably 98% identity with respect to SEQ ID NO: 2. In a more preferred embodiment the polynucleotide is SEQ ID NO: 2.
  • peptide refers to a Polymeric form of amino acids of any length, which may or may not be chemically or biochemically modified.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides or amino acids between two nucleotide or amino acid sequences that are compared. Sequence comparison methods are known in the state of the art and include, but are not limited to, the GAG program, including GAP (Devereux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 287 Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison , (Wl); BLAST or BLASTN, and FASTA (Altschul et al. 1999, J. Mol. Biol. 215: 403-410) Additionally, the Smith Waterman algorithm should be used to determine the degree of identity of two sequences.
  • the polynucleotide encoding the modified MUC5AC protein that has the N-terminal end of MUC5AC attached to the dimerization domain located at the C-terminal end may be included in gene constructs or vectors. Therefore, a preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to nanoparticles comprising a polynucleotide encoding a modified MUC5AC protein that has the N-terminal end of MUC5AC attached to the dimerization domain located at the C-terminal end, where the polynucleotide It is included in a genetic construct or vector.
  • the vector in which the polynucleotide is included is a plasmid.
  • control sequence refers to nucleotide sequences that are necessary to effect the expression of the sequences to which they are linked.
  • control sequences is intended to include, at a minimum, all components whose presence is necessary for expression, and may also include additional components whose presence is advantageous Examples of control sequences are, for example, but not limited to, promoters, transcription initiation signals, transcription termination signals, polyadenylation signals or transcriptional activators.
  • operably linked refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended manner.
  • a control sequence "operably linked" to a polynucleotide is linked in such a way that the expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
  • promoter refers to a region of DNA, generally “upstream” or “upstream” of the transcription start point, which is capable of initiating transcription in a cell.
  • This term includes, for example, but not limited to, constitutive promoters, cell or tissue specific promoters or inducible or repressible promoters. Control sequences depend on the origin of the cell in which the nucleic acid is to be expressed. Examples of prokaryotic promoters include, for example, but not limited to, promoters of the trp, recA, lacZ, lacl, tet, gal, trc, or tac genes of E. coli, or the promoter of the ⁇ -amylase gene of B.
  • subtilis For the expression of a nucleic acid in a prokaryotic cell, the presence of an upstream ribosomal binding site of the coding sequence is also necessary.
  • Appropriate control sequences for the expression of a polynucleotide in eukaryotic cells are known in the state of the art.
  • Both the polynucleotide of the invention and the genetic construct of the invention comprising the polynucleotide can be introduced, for example, into a cloning vector or an expression vector to allow replication or expression.
  • said vector is an appropriate vector for expression of the peptide of the invention.
  • cloning vector refers to a DNA molecule in which another DNA fragment can be integrated, without losing the capacity for self-replication.
  • expression vectors are, but are not limited to, plasmids, cosmids, DNA phages or artificial yeast chromosomes.
  • expression vector refers to a cloning vector suitable for expressing a nucleic acid that has been cloned therein after being introduced into a host cell. Said nucleic acid is generally operatively linked to control sequences.
  • expression refers to the process by which a polypeptide is synthesized from a polynucleotide. It includes transcription of the polynucleotide into a messenger RNA (mRNA) and the translation of said mRNA into a protein or polypeptide. Expression can take place in a host cell, but also by any process of protein expression in vivo.
  • mRNA messenger RNA
  • the nanoparticles can be formed by an ionic interaction mechanism that causes the joint precipitation of the components in the form of nanoclusters as a result of the addition of a cross-linking agent that has an electric charge.
  • the ionic interaction procedure has advantages that do not require the use of chemical elements other than the components of the nanoparticles themselves that can cause toxicity or incompatibility of the system.
  • the use of an ionic crosslinking agent allows the cross-linking of the ionic polymer giving rise to the nanoparticles. This procedure is a fast and reliable, economical and easily scalable process for industrial production.
  • the nanoparticles are formed by:
  • polymers useful for the formation of nanoparticles are, for example, but not limited to, hyaluronic acid or salts thereof, colominic acid or derivatives, glucomannan or derivatives, chondroitin sulfate, queratane sulfate, dextran sulfate, dermatan sulfate, heparin, carrageenan, gellan, albumin, collagen or gelatin.
  • These polymers also include polymers on which modifications have been made such as enzymatic fragmentation, chemical fragmentation or derivatization by, for example, but not limited to, the anionization or cationization of the polymer prior to the preparation of the particles.
  • polymers of (i) can have a natural, semi-synthetic or synthetic origin. It is interesting that the polymers used are natural or semi-synthetic polymers since this allows to minimize the possible rejection of the treated individuals to the nanoparticles. Therefore, in a more preferred embodiment of this aspect of the invention, the polymer of (i) is a natural or semi-synthetic polymer.
  • the naturally occurring polymer with an electric charge (i) is cationized gelatin.
  • ionic crosslinking agents are, for example, but not limited to, phosphates, sulfates, citrates or salts thereof, spermine or salts thereof, or spermidine or salts thereof. These agents have different electrical charges (phosphates, sulfates and citrates anionic charge; spermine and spermidine cationic charge). Among these, one of the best characterized and the best result is tripolyphosphates. Therefore, in another more preferred embodiment of this aspect of the invention, the ionic crosslinking agent (ii) is a tripol phosphate. In an even more preferred embodiment, the ionic crosslinking agent is sodium tripolyphosphate.
  • the nanoparticles may comprise an additional element, which is an ionic polymer of electric charge opposite to the first polymer of the nanoparticles.
  • an ionic polymer of electric charge opposite to the first polymer of the nanoparticles allows a better ionic gelation, and allows to modify the characteristics of the nanoparticles obtained both in size, as in structural characteristics and surface electric charge. Therefore, in a more preferred embodiment of the first aspect of the invention, the nanoparticles are further formed by an element (iii) which is at least one polymer of charge opposite to the polymer (i).
  • polymers may be, for example, but not limited to, hyaluronic acid or salts thereof, colominic acid or derivatives, glucomannan or derivatives, chondroitin sulfate, queratane sulfate, dextran sulfate, dermatan sulfate, heparin, carrageenan, gelane, albumin, collagen or gelatin.
  • the polymer (iii) of opposite charge to the polymer (i) is dextran sulfate or chondroitin sulfate.
  • the polynucleotide Due to the formation of the nanoparticles by ionic crosslinking, the polynucleotide, either independently or included in a vector or a gene construct, can be retained inside them by purely physical entrapment, due to the difference in its size and that of the mesh formed in said crosslinking process. On the other hand, due to the ionic character of the polymers used, either in (i) or in (iii), the polynucleotide can also be attached to the nanoparticles as a result of an electrostatic interaction between it and said polymers.
  • nanoparticle is understood as a stable system, with homogeneous reproducible and modulable characteristics, perfectly distinguishable from self-assembled systems, which are formed as a consequence of a controlled process of ionotropic cross-linking of the polymer provided with the constituent charge thereof mediated by ionic crosslinking agents.
  • the electrostatic interaction that results between the different components of the nanoparticles in the crosslinking process generates characteristic physical entities, which are independent and observable, whose average size is less than 1 ⁇ .
  • Average size in the present invention is understood as the average diameter of the nanoparticles, which can be measured using standard procedures known to a person skilled in the art, such as, but not limited to, the one used in the examples herein. invention.
  • the nanoparticles of the invention have an average size between 1 and 999 nm, preferably between 50 and 600 nm, and more preferably between 100 and 400 nm. This average particle size is influenced by their composition, as well as by the environmental conditions in which they are formed.
  • the nanoparticles can have different surface electric charges (potential Z) depending on their composition, and the proportions of each of the elements.
  • This charge may have positive, negative or 0 values, preferably, the electrical charge of the nanoparticles is between +50 mV and -50mV, more preferably between +45 and OmV, and even more preferably between +40 and + 10mV.
  • the measurement of the electric charge can be carried out by methods known in the state of the art, such as that used in the examples of the present invention.
  • the nanoparticles once they have formed and present the associated polynucleotide, can undergo a lyophilization process to allow their preservation during storage while maintaining their original characteristics and allowing the handling of smaller volumes.
  • This lyophilization may slightly increase the crosslinking of the particles. Freeze-drying requires the prior addition of molecules that act as cryoprotectants or lioprotectors such as, but not limited to, glycols, or sugars such as glucose, sucrose or trehalose at a concentration of between 1 and 5%. Therefore, in another preferred embodiment, the nanoparticles of the invention are in lyophilized form.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the nanoparticles of the invention for the preparation of a medicament or alternatively to the nanoparticles of the invention for use as a medicament.
  • the nanoparticles of the invention have utility in recovering mucin production by body cells. Therefore, another aspect of the invention relates to the use of the nanoparticles of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that has a mucin deficiency, or alternatively to the nanoparticles. of the invention for use as a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that has a mucin deficiency.
  • mucin deficiency diseases that affect the ocular mucosa and / or other mucous membranes of the body, such as limbic insufficiency syndrome, neurotrophic keratitis, herpetic keratitis, alkali burn, burn thermal, radiation burn, Steven-Johnson syndrome, toxic epidermal necrosis, pemphigus, mucous membrane pemphigoid, eye allergies, vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis, sicca keratoconjunctivitis or dry eye syndrome, infectious, immune and irritative-toxic-drug conjunctivitis, Sjógren Syndrome primary or secondary to other autoimmune diseases (such as scleroderma), rodermatitis, atopic keratoconjunctivitis, sicca keratoconjunctivitis or dry eye syndrome, infectious, immune and irritative-toxic-drug conjunctivitis, Sj
  • nanoparticles comprising a plasmid carrying a polynucleotide encoding the modified MUC5AC protein presenting the N-terminal end of MUC5AC bound to the domain dimerization located at the C-terminal end, allows the expression of this mucin.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of the nanoparticles of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that has a mucin deficiency, where the mucosa is the ocular mucosa, or alternatively to the nanoparticles for use as a medicine for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that has a mucin deficiency, where the mucosa is the ocular mucosa.
  • the nanoparticles of the invention allow the recovery of tear production in a disease that is deficient in mucins, and more specifically with a deficiency in the mucin MUC5AC. Therefore, another preferred embodiment relates to the use of the nanoparticles of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a mucosal disease that occurs with a mucin deficiency, where the mucin is MUC5AC, or alternatively to the nanoparticles for use as a medicine for the prevention and / or treatment of a mucosal disease that presents with a mucin deficiency, where the mucin is MUC5AC.
  • the nanoparticles of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a mucosal disease that is present with a mucin deficiency, where the mucosa is The ocular mucosa and the mucin is MUC5AC, or alternatively to the nanoparticles of the invention for use as a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that occurs with a mucin deficiency, where the mucosa is the mucosa eyepiece and the mucin is MUC5AC.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the nanoparticles of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that has a mucin deficiency
  • the disease of a mucosa that has a Mucin deficiency is selected from the list comprising: limbic insufficiency syndrome, neurotrophic keratitis, herpetic keratitis, alkaline burn, thermal burn, radiation burn, Steven-Johnson syndrome, toxic epidermal necrosis, pemphigus, mucous membrane pemphigoid , eye allergies, vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis, sicca keratoconjunctivitis or dry eye syndrome, infectious, immune and irritative-toxic-drug conjunctivitis, primary or secondary Sjógren syndrome (such as scleroderma, mesenupus disease) rheumatoi
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of the nanoparticles of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a mucosal disease that occurs with a mucin deficiency.
  • the disease of a mucosa that is present with a mucin deficiency is dry eye syndrome
  • the nanoparticles of the invention for use as a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that courses with a Mucin deficiency, where the disease of a mucosa that has a mucin deficiency is dry eye syndrome.
  • compositions hereinafter pharmaceutical composition of the invention, comprising the nanoparticles of the invention.
  • the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition further comprises another active ingredient.
  • the pharmaceutical composition further comprises another active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • active substance means any component that potentially provides a pharmacological activity, a metabolic effect, an immunological effect or another different effect on the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of the human being or other animals.
  • the term includes those components that promote a chemical change in the preparation of the drug and are present therein in a modified form intended to provide the specific activity or effect.
  • compositions of the present invention can be formulated for administration to an animal, and more preferably to a mammal, including humans, in a variety of ways known in the state of the art. Thus, they can be, without being limited, in aqueous or non-aqueous solutions, in emulsions or suspensions.
  • non-aqueous solutions are, for example, but not limited to, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, such as olive oil, or injectable organic esters, such as ethyl oleate.
  • aqueous solutions are, for example, but not limited to, water, alcoholic solutions in water, or saline media.
  • Aqueous solutions may be buffered or not, and may have additional active or inactive components.
  • Additional components include salts to modulate ionic strength, preservatives including, but not limited to, antimicrobial agents, antioxidants, chelators, or the like, or nutrients, including glucose, dextrose, vitamins and minerals.
  • preservatives including, but not limited to, antimicrobial agents, antioxidants, chelators, or the like, or nutrients, including glucose, dextrose, vitamins and minerals.
  • nutrients including glucose, dextrose, vitamins and minerals.
  • the compositions can be prepared for administration in solid form.
  • compositions may be combined with various inert carriers or excipients, including but not limited to: binders, such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin; excipients, such as starch or lactose; dispersing agents, such as alginic acid or corn starch; lubricants, such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide; sweetening agents, such as sucrose or saccharin; or flavoring agents, such as peppermint or methyl salicylate.
  • binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin
  • excipients such as starch or lactose
  • dispersing agents such as alginic acid or corn starch
  • lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide
  • sweetening agents such as sucrose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • the composition of the invention is especially advantageous for constituting
  • compositions and / or their formulations can be administered to an animal, including a mammal and, therefore, to the human being, in a variety of ways, including, but not limited to, oral, oral, sublingual, ocular, nasal, pulmonary, otic, intrauterine, parenteral, intraperitoneal, intravenous, intradermal, intrastromal, intraarticular, intrasinovial, intrathecal, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, intracranial, subcutaneous, intraorbital, intracapsular, topical, through transdermal patches, rectal, vaginal, by administering a suppository, percutaneous, spray nasal, surgical implant, internal surgical paint, infusion pump or catheter.
  • the nanoparticles of the invention due to their usefulness in the mucous membranes, have an advantageous administration by different mucosal routes such as, but not limited to, ocular mucosa, mucosa of the entire gastro-intestinal tract including the buccal or oral, mucosa of the respiratory tract , including the nasal and bronchial mucosa, the urinary mucosa and the vaginal mucosa. Therefore, a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising the nanoparticles of the invention for administration via ocular mucosa, mucosa of the entire gastro-intestinal tract, mucosa of the respiratory tract, urinary mucosa and the vaginal mucosa.
  • the nanoparticles can undergo a lyophilization process to allow their preservation during storage while maintaining their original characteristics and allowing the handling of smaller volumes. Therefore, in another preferred embodiment the pharmaceutical composition is in lyophilized form.
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as age, weight, sex or tolerance, of the mammal.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the pharmaceutical composition of the invention that produces the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of said pharmaceutical composition and the therapeutic effect to be achieved.
  • compositions are the vehicles known in the state of the art.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament or alternatively to the pharmaceutical composition of the invention for use as a medicament.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that has a mucin deficiency, or alternatively the pharmaceutical composition. of the invention for use as a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that has a mucin deficiency.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of the pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that occurs with a mucin deficiency, wherein the Mucosa is the ocular mucosa, or alternatively to the pharmaceutical composition for use as a medicine for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that has a mucin deficiency, where the mucosa is the ocular mucosa.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of the pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that occurs with a mucin deficiency, wherein the Mucin is MUC5AC, or alternatively to the pharmaceutical composition for use as a medicine for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that has a mucin deficiency, where the mucin is MUC5AC.
  • the pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a mucosal disease that occurs with a mucin deficiency, where the mucosa it is the ocular mucosa and the mucin is MUC5AC, or alternatively to the pharmaceutical composition of the invention for use as a medicine for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that is present with a mucin deficiency, where the mucosa is the ocular mucosa and the mucin is MUC5AC.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that has a mucin deficiency
  • the disease of a mucosa that has a a mucin deficiency is selected from the list comprising: limbic insufficiency syndrome, neurotrophic keratitis, herpetic keratitis, alkali burn, thermal burn, radiation burn, Steven-Johnson syndrome, toxic epidermal necrosis, pemphigus, membrane pemphigoid mucous membranes, eye allergies, vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis, keratoconjunctivitis sicca or dry eye syndrome, infectious, immune and irritative-toxic-medicative conjunctivitis, primary or secondary Sjógren's syndrome to other autoimmune diseases (such as scleroderma, mesenchyderma
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of the pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease of a mucosa that occurs with a mucin deficiency where the A mucosal disease that occurs with a mucin deficiency is dry eye syndrome, or alternatively to the pharmaceutical composition of the invention for use as a medicament for the prevention and / or treatment of a mucosal disease that courses with a deficiency of mucin, where the disease of a mucosa that has a mucin deficiency is dry eye syndrome.
  • Another aspect of the present invention relates to a process for the preparation of nanoparticles comprising:
  • This production method is a fast, economical, reproducible and scalable method, which allows its industrial implementation.
  • the absence of chemical elements other than the constituents of the nanoparticles, as well as the use of mild conditions for production allows greater safety of the resulting particles.
  • the DNA molecule In order to carry out the association of the DNA molecule, it is dissolved in the dissolution of the polymer or the crosslinking agent, depending on the electrical charge of each of these components. The DNA is incorporated into the solution that has a negative charge.
  • a polymer with a charge opposite to that of step (1) could be incorporated, either in step (3), or subsequently after forming the nanoparticles.
  • the incorporation of the polymers is carried out by means of an aqueous solution thereof at a concentration between 0.1 and 6 mg / mL, preferably between 0.1 and 5 mg / mL.
  • the crosslinking agent is incorporated by an aqueous solution thereof at a concentration of between 0.0625 and 1.5 mg / mL, preferably between 0.25 and 1.5 mg / mL.
  • the nanoparticles After the formation of the nanoparticles, they can undergo a lyophilization process to allow their preservation during storage while maintaining their original characteristics and allowing the handling of smaller volumes. This lyophilization can increase the crosslinking of the particles.
  • the prior addition of molecules that act as cryoprotectants or lioprotectors is necessary, for example, although sugars such as glucose, sucrose or trehalose are not limited to a concentration of between 1 and 5%.
  • FIG. 1 Scheme of plasmids A: plRES2-AcGFP1-MUC5AC-280; and B: pMUCIN5AC-29.
  • MA0151 and MA0153 primers; PMCMV: promoter of cytomegalovirus; pUC ori: origin of pUC replication; HSV TK poly A: thymidine kinase polyadenylation signal from herpex simplex virus; KanR / NeoR: resistance to kanamycin and neomycin; SV40 ori / p: SV40 origin of replication; f1 ori: origin of replication f1; AcGFPI: Aequorea coerulescens green fluorescent protein; IRES: internal ribosome entry site; MUC5AC ORF: reading frame of MUC5AC; SacI: cut-off point of the SacI restriction enzyme; EcoRV: cut-off point of the EcoRV restriction enzyme.
  • Figure 2 Image of agarose gel. Results of the digestion of 0.5 microliters of the preparation of pMUCIN5AC-29 with the SacI and EcoRV enzymes and their respective negative controls (-) without digesting with the enzyme.
  • FIG. 1 Morphological characterization of nanoparticles by transmission electron microscopy.
  • A GCspm137 nanoparticles: TPP;
  • B GCspm137: CS: TPP nanoparticles;
  • C GCspm137 nanoparticles: DS: TPP.
  • Figure 4 Image of the 1% agarose electrophoresis gel loaded with: (A) Free plasmid pMUC5AC-280; (B) GCspm137: TPP nanoparticles, (C) GCspm137: CS: TPP nanoparticles; (D) GCspm nanoparticles: DS: TPP.
  • FIG. 1 Cell viability values obtained using the XTT test in A: human cornea cells (HCE) or B: conjunctiva (IOBA-NHC).
  • C Control not treated;
  • C + positive control of cell death (treated with 1% benzalkonium chloride solution);
  • FIG. 6 Expression of MUC5AC relative to the control, at the mRNA level in 72h post-transfection cells in A: human cornea cells (HCE) or B: human conjunctiva cells (IOBA-NHC).
  • Control Control not treated;
  • Figure 8 Production of tear in animals not subjected to induction of dry and untreated eye (Control), in animals with induced dry eye and untreated (Dry Eye Control), in animals with induced dry eye and treated with free pMUC5AC (Eye Dry + free pMUC5AC), in animals with induced dry eye and treated with white nanoparticles (without associated plasmid) (Dry Eye + white NPs), in animals with induced dry eye and treated with nanoparticles associating pMUC5AC (Dry Eye + pMUC5AC-NPs) and in animals with induced dry eye and treated with commercially available formulation for the treatment of dry eye (Dry Eye + Restasis®).
  • the nanoparticles have been characterized in terms of size, zeta potential (or surface charge) and encapsulation efficiency.
  • the determination of the isoionic or isoelectric point is to measure the concentration of hydrogen ions of a solution of the polymer that has been demineralized by contact with ion exchange resins (Commission on Methods for Testing Photographic Gelatin. PAGI METHOD 10th Ed. 2006).
  • the process consists in placing a 1% solution of the cationized protein in contact with a mixture of cationic acid and anionic basic resins in 1: 2 proportions.
  • the Zeta particle potential has been determined by the laser dispersion anemometry (LDA) technique and using a Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK). For this, the samples were conveniently diluted in a millimolar solution of KCI.
  • TEM transmission electron microscopy
  • the efficiency of association of genetic material with nanoparticles has been determined by the agarose gel electrophoresis technique.
  • a 1% agarose gel was prepared in TAE buffer (Tris-Acetate-EDTA, 40mM Tris, 1% acetic acid, 1 mM EDTA) pH 8 with ethidium bromide (10 mg / mL, 5 ⁇ _) and used a loading buffer and migration marker composed of glycerin (30%).
  • a potential difference of 100 V was applied for 120 minutes and free genetic material was used as a control.
  • the Picogreen® method (Invitrogen, ES) was used, in accordance with the manufacturer's instructions, in supernatants of formulations previously centrifuged in Microfuge 22R centrifuge (Beckman Coultern, US ) at 12,000 rpm at 4 ° C for 30 minutes.
  • Two cell lines were used for cell culture experiments: human corneal HIT (Human Corneal Epithelium) and human IOBA-NHC (Normal Human Conjunctive) conjunctiva cells.
  • HCE cells were cultured in DMEM / F-12 medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 0.5% DMSO, cholera toxin (1 mg / mL), endothelial growth factor (EGF; 100 ⁇ g / mL), insulin (4 mg / mL), streptomycin (0.1 mg / mL) and penicillin (100 U / mL) (Invitrogen, ES).
  • FBS fetal bovine serum
  • DMSO cholera toxin
  • EGF endothelial growth factor
  • insulin 4 mg / mL
  • streptomycin 0.1 mg / mL
  • penicillin 100 U / mL
  • IOBA-NHC cells were cultured in DMEM / F-12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), cholera toxin (1 mg / mL), endothelial growth factor (EGF; 2 ng / mL), insulin ( 10 mg / mL), hydrocortisone (50 ⁇ g / mL), fungizone (250 ⁇ g / mL), streptomycin / penicillin (5000 U / mL) (Invitrogen, ES). The cells were maintained at 37 ° C under a humidified atmosphere of 5% CO2.
  • FBS fetal bovine serum
  • cholera toxin 1 mg / mL
  • EGF endothelial growth factor
  • insulin 10 mg / mL
  • hydrocortisone 50 ⁇ g / mL
  • fungizone 250 ⁇ g / mL
  • streptomycin / penicillin 5000 U / mL
  • the absorbance measurement was carried out at 450 nm with the reference wavelength of 620 nm, in a SpectraMax M5 plate multilector (Molecular Devices, US), expressing the results in% of viability relative to the control.
  • RT-PCR was used, using the glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene as a reference .
  • GPDH glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase
  • the mRNA was extracted and purified with RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany) and quantified with Quant-it RNA Assay Kit (Invitrogen, US) according to the manufacturer's instructions.
  • the cDNA was constructed with SuperScript® Villo cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, US) following the manufacturer's instructions.
  • the parameters of the RT-PCR were: an initial denaturation step at 95 ° C for 10 minutes; a second denaturation and extension step, with 40 cycles, from 15 seconds at 95 ° C and 60 seconds at 60 ° C, using 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, US).
  • the MUC5AC was quantified by ELISA.
  • Analog B of the MUC5AC (AnaSpec, US) was used as standard. For this, 50 [L cell lysates were incubated in 96-well plates with 50 ⁇ of 0.05M bicarbonate buffer pH 9.6 at 37 ° C over night.
  • the plates were washed three times with PBS and blocked with 2% bovine serum albumin (BSA fraction V) (Sigma-Aldrich, Spain) for 1 h at room temperature.
  • BSA fraction V bovine serum albumin
  • the plates were again washed three times with PBS and incubated with 100 ⁇ of anti-MUC5AC mouse antibody (Chemicon, US) (1: 500) which was diluted in PBS containing 0.05% Tween 20. After one hour, the Wells were washed three times with PBS and then 100 ⁇ of anti-mouse donkey IgG conjugated with diluted peroxidase (1: 10,000) in PBS containing 0.05% Tween 20 and 0.1% of BSA After one hour, the plates were washed three times with PBS.
  • BSA fraction V bovine serum albumin
  • the color reaction was developed with the 3,3 ' , 5,5 ' -tetramethylbenzidine peroxide reagent (TMB), as described by the corresponding manufacturer (Invitrogen, ES).
  • TMB 3,3 ' , 5,5 ' -tetramethylbenzidine peroxide reagent
  • the absorbance was read at 450 nm in SpectraMax M5 plate reader (Molecular Devices, US). The values obtained were normalized with respect to the total amount of protein and the results were expressed as mucin production relative to the control.
  • the sequence of the plasmid construct encoding MUC5AC was verified by sequencing.
  • the identification of the mucin encoding plasmid exogenously administered, alone or associated with the nanoparticles, inside human cells of the ocular surface was done by fluorescence microscopy, evaluating the expression of the green GFP fluorescent protein.
  • the assessment of a possible toxic effect on human cells as a result of this administration was carried out by means of a standard toxicity measurement test (XTT).
  • the pEGFP DNA plasmid was purchased from Elim Biopharmaceuticals (US).
  • the DNA plasmid plRES2-AcGFP1 -Mucin-5AC-280 was synthesized in Biomedal (Spain). Sodium tripolyphosphate and sodium citrate were purchased from Sigma Aldrich (Spain).
  • Example 1 Development of a plasmid DNA encoding a mucin and an easily identifiable protein.
  • Plasmid plRES2-AcGFP1 - Mucin-5AC-280 was obtained from a culture of a transformant of strain DH5 alpha. The DNA was extracted and purified using Sigma's "GenElute TM HP Plasmid Megaprep" kit, and finally lyophilized.
  • Figure 1A shows a scheme of said plasmid. The plasmid obtained, plRES2-AcGFP1-Mucin-5AC-280, was tested by transfecting human corneal epithelium (HCE) cells (Araki-Sasaki et al, 1995. Invest Ophthalmol Vis Sci.
  • HCE human corneal epithelium
  • Transfection efficiency was analyzed by fluorescence microscopy, observing the expression of the green fluorescent protein.
  • the production of MUC5AC was studied by ELISA and RT-PCR in real time.
  • Both HCE and IOBA-NHC cells are successfully transfected with plasmid plRES2-AcGFP1 -Mucin-5AC-280, observing cells with green fluorescence, corresponding to GFP expression.
  • MUC5AC expression is detected in transfected HCE and IOBA-NHC cells, by immunofluorescence and Western blotting. This expression is greater in corneal epithelial cells than conjunctival epithelium.
  • the amount of MUC5AC detected by ELISA in transfected HCE cells is -2500% higher than in untransfected cells. In the case of IOBA-NHC cells, this percentage is -1500%.
  • the real-time RT-PCR data support those obtained at the protein level, with an expression of MUC5AC of the order of 10,000 times higher in cells transfected with JetPei-RGD than in control cells, in both cell lines. In the case of lipofectamine, the expression of MUC5AC was still higher. Therefore, the HCE and IOBA-NHC eye cells, after transfection with plasmid plRES2-AcGFP1-MUC5AC-280, are capable of expressing the plasmid, of synthesizing the transduced protein (MUC5AC) and of secreting it.
  • FIG. 1 B shows a scheme of said plasmid.
  • the procedure consisted of the removal of the IRES-GFP region from the plRES2-AcGFP1 -MUC5AC-280 construction by digestion and religation.
  • the deleted region was that between the Sacl site located from the base at position 8370, and the Notl site located from position 9728 of the sequence of plRES2-AcGFP1 -MUC5AC-280.
  • the strategy used was the one described below:
  • Plasmid DNA from clone pMUCIN5AC-29 (SEQ ID NO: 7) was prepared, which was eluted in distilled and sterilized water, and digested separately with the Sacl and EcoRV enzymes, obtaining digestion patterns compatible with those expected (cut with Sacl: 1 fragment of 1,1702 base pairs; cut with EcoRV: 3 fragments of 6,692 base pairs, 3,135 base pairs and 1,875 base pairs, respectively).
  • Photograph 2 shows the results of digesting 0.5 microliters the preparation of pMUCIN5AC-29 with these enzymes (negative controls of the undigested plasmid are included).
  • Example 3 Preparation of nanoparticles associating plasmid plRES2-AcGFP1 -MUC5AC-280 made from cationized gelatin and combinations with anionic polymers.
  • the nanoparticles of plasmid plRES2-AcGFP1-MUC5AC-280 were associated. It is a negatively charged macromolecule, so it was incorporated together with the anionic crosslinker, to avoid the appearance of interactions prior to the formation of the particles.
  • the crosslinking agent used was the anionic tripolyphosphate molecule (TPP).
  • TPP anionic tripolyphosphate molecule
  • aqueous solutions were prepared in milli-Q water of gelatin previously cationized with spermine (1.0 mg / mL).
  • the crosslinking agent was added by using an aqueous solution of TPP (0.125-0.25 mg / mL) in milli-Q water.
  • the anionic polymers of dextran sulfate (DS) (0.1 mg / mL) or chondroitin sulfate (CS) (0.125 mg / mL) were incorporated into the composition.
  • the corresponding genetic material was incorporated in a concentration of 0.05 [Q / [L resulting in a mass ratio between 7.3% and 9% with respect to the constituents of the particles).
  • the bioactive molecule was incorporated into the crosslinker solution and the resulting solution was mixed with the cationized gelatin solution under magnetic stirring, which was maintained for half an hour allowing the complete evolution of the system towards a stable nanoparticular form.
  • the formulations developed and their physical-chemical characteristics (average diameter of the nanoparticles obtained as well as surface electric charge) are shown in Table 1.
  • Example 4 The nanoparticular systems associating plasmid DNA do not exhibit significant cytotoxicity in human cornea and conjunctiva cells.
  • the viability evaluation of cells in contact with nanoparticles made from cationized gelatin and combinations with anionic polymers was carried out in human cornea and conjunctiva cells.
  • the cells were seeded in 96-well plates Costar ® (Corning, US) at a confluence of 10,000 cells per well and were allowed to grow for 24 hours before testing.
  • the cells were incubated for 4h with 20 ⁇ of formulation (nanoparticles), either with 20 ⁇ of 1% benzalkonium chloride solution (positive cell death control) or with 20 ⁇ _ of culture medium (negative control), completing said volumes with DMEM / F-12 medium up to a total volume of 200 ⁇ _.
  • the cells were washed and 200 ⁇ of the respective culture medium was added.
  • the cells were then incubated with 200 ⁇ _ of RPMI medium without phenol red with XTT (0.2 mg / mL) for 15 h.
  • the results were expressed as a percentage of cell viability relative to the untreated control. As can be seen in Figure 5, the systems do not show significant toxicity in any of the cell lines studied.
  • Example 5 The nanoparticular systems associating plasmid DNA are sufficient and necessary to give rise to the production of MUC5AC mRNA in human cornea (HCE) and conjunctiva (IOBA-NHC) cells.
  • HCE human cornea
  • IOBA-NHC conjunctiva
  • cells were plated in 24-well plates Costar ® (Corning, US) at a density between 50,000 and 80,000 cells per well and allowed to grow for 24 hours before transfection. They were then incubated with nanoparticles made from cationized gelatin and combinations with anionic polymers.
  • JetPEI-RDG complexes Polyplus-transfections, US
  • plRES2-AcGFP1-MUC5AC-280 (1/10 ratio) or with pEGFP (1/5 ratio) were used, according to the manufacturer's instructions.
  • the cells were incubated with the systems and controls (1-5 ⁇ g of plasmid per well) for 4 hours in pure DMEM / F-12 medium.
  • the relative quantification of the MUC5AC mRNA according to the previously described procedure, was expressed, expressing the results in MUC5AC mRNA log, normalized with GAPDH, relative to the untransfected control.
  • Figure 6 in both the cell lines and with all the formulations tested, significant levels of MUC5AC mRNA were detected, indicating a successful transfection.
  • Example 6 The nanoparticular systems associating plasmid DNA are sufficient and necessary to give rise to the production by human cornea and conjunctiva cells of the mucin MUC5AC.
  • cells were plated in 24-well plates Costar ® (Corning, US) at a density between 50,000 and 80,000 cells per well and allowed to grow for 24 hours before transfection. They were then incubated with nanoparticles made from cationized gelatin and combinations with anionic polymers.
  • JetPEI-RDG complexes Polyplus-transfections, US
  • plRES2-AcGFP1-MUC5AC-280 (1/10 ratio) or with pEGFP (1/5 ratio) were used, according to the manufacturer's instructions.
  • the cells were incubated with the systems and controls (1-5 ⁇ g of plasmid per well) for 4 hours in pure DMEM / F-12 medium.
  • MUC5AC The expression of MUC5AC at the protein level was evaluated 72h post-transfection. How can appreciate in Figure 7 for both cell lines a significant expression of MUC5AC was obtained, confirming that the systems are effective for transfection in cornea and conjunctiva cells.
  • Example 7 The nanoparticular systems associating plasmid DNA give rise to a biological response capable of restoring functionality in tear production in animals with induced dry eye, similar to that achieved with commercially available formulation for this purpose.
  • Dry eye was induced in C57BL / 6 mice using a technique called drying stress.
  • the animals were treated with scopolamine hydrobromide subcutaneously (0.5mg / 0.2ml_; Sigma-Aldrich, US) three times a day alternating administrations between the right and left leg and subjected to a low air flow humidity.
  • the animals were kept in cages with perforated side walls to allow a flow of air provided by fans (one on each side of the cage). These cages were kept inside a flow hood (AirClean Systems, US) in which the air humidity was maintained below 40%.
  • the tear production in animals was determined by using a sterile cotton thread with a red phenol pH indicator (Zone-Quick, Lacrimedics, US).
  • the contact time of the thread with the eye was thirty seconds.
  • the migration distance of the tear was measured in millimeters, based on the color change that said thread experiences when the tear rises by capillarity. Dry eye induction began five days before administration of the formulations and processing of the controls, and was maintained during the five days of treatment.
  • the F2 formulation (GC137spm: CS: TPP) was concentrated 4 times by centrifugation (10,000g, 30 min, 4 ° C, CR22 Beckman Coulter, US) to a final concentration of 0.2 [ig / ⁇ iL from pMUCIN5AC-29.
  • the nanoparticles were administered in a volume of 5 ⁇ _, 4 times a day for 5 days, in each of the eyes, with an interval of 1 h between administrations ⁇ g per day of pMUCIN5AC-29; 20 ⁇ 9 pMUCIN5AC-29 in total).
  • the animals were immobilized manually for 1 min.
  • the tear production was determined according to the procedure previously described, quantifying the basic tear production values (zero time), those obtained after induction of dry eye (day 5) and those obtained at the end of the treatment (day 10). The results were expressed as mean ⁇ standard error of the mean tear migration in the thread (mm) of experimentally independent groups of 4 animals (total of 8 animals). For the statistical treatment of the results, a one-way variance analysis (ANOVA) was used with repeated measures. The differences were considered significant when (p ⁇ 0.05).

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Abstract

La presente invención se refiere a nanopartículas poliméricas las cuales que comprenden un polinucleótido que codifica para una proteína MUC5AC modificada de modo que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal, o un plásmido o una construcción genética que lo contenga, y a su uso para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad que cursa con una deficiencia de mucinas. También se refiere a una composición farmacéutica que comprenda dichas nanopartículas y a su uso para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad que cursa con una deficiencia de mucinas.

Description

NANOPARTÍCULAS PARA LA PREVENCIÓN Y/O EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DE MUCOSAS.
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología, y más concretamente de la biomedicina. Específicamente, se refiere a nanopartículas que comprenden un polinucleótido que codifica para una proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal, o un plásmido o una construcción genética que lo contenga, y a su uso para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad que cursa con una deficiencia de mucinas.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR Las mucosas del organismo son uno de los elementos más sensibles a afecciones tanto inflamatorias como infecciosas. Dentro de estas mucosas, uno de los elementos de mayor importancia son las mucinas. Estas mucinas son un grupo heterogéneo de glucoproteínas de elevado peso molecular y son el elemento fundamental de las secreciones mucosas del organismo. Dentro de este grupo existen descritas al menos 17 proteínas diferentes con diferentes características tanto de expresión como funcionales.
Estas mucinas son especialmente relevantes en el caso de la mucosa ocular, donde las mucinas presentan elevada importancia en la homeostasis del tejido mucoso, así como en la lubricación de los epitelios tanto corneal como conjuntival durante el parpadeo. Además, las mucinas actúan a nivel ocular como estabilizadores de la película lagrimal previniendo la desecación del epitelio y como barrera frente a la entrada tanto de agentes extraños como de patógenos. Debido a la importancia de estas mucinas, la deficiencia en las mismas lleva aparejados diversos problemas patológicos oculares. Estos problemas afectan fundamentalmente a un conjunto de estructuras presentes en la parte anterior del ojo denominadas en su conjunto "superficie ocular" lo que es considerado una unidad funcional establecida (Stern et al, 1998. Cornea. 17:584-589). Esta superficie ocular es un tejido mucoso similar a otras mucosas del organismo como la mucosa del tracto gastro-intestinal, la mucosa de las vías respiratorias, la mucosa urinaria y la mucosa vaginal. Ejemplos de enfermedades que cursan con alteración en la regulación de producción de mucinas son, por ejemplo, enfermedades autoinmunes que cursan con inflamación. En estos casos se puede dar lugar, en función de la enfermedad, a una superproducción o una subproducción de las mucinas características de la superficie ocular. Esta variación de los niveles de las mucinas, hacen que la homeostasis producida por las mismas no se produzca y por lo tanto dé lugar a procesos patológicos graves que pueden tener influencia en la función visual.
Una de las enfermedades de mayor incidencia, en relación con las mucinas y la superficie ocular es el denominado síndrome de ojo seco. Esta enfermedad afecta, por ejemplo, a un 10% de la población adulta (Viso et al, 2009. Ophthalmic Epidemiol. 16: 15-21 ) alcanzando un 14,6% en la población de más de 65 años (Schein et al, 1997. Am J Ophthalmol. 124:723-728). Esta enfermedad está fuertemente relacionada con el envejecimiento, así como con el sexo ya que afecta mayoritariamente a mujeres. De este modo, la prevalencia de esta enfermedades puede llegar al 40% en mujeres postmenopáusicas (Schaumberg et al, 2003. Am J Ophthalmol. 136:318-326).
Otras enfermedades importantes, que no alcanzan la incidencia del síndrome de ojo seco son las enfermedades alérgicas graves como por ejemplo la queratoconjuntivitis atópica (AKC) o la queratoconjuntivitis vernal (VKC), las cuales pueden alcanzar una incidencia del 4,4% y 3,8% respectivamente, del total de pacientes de alergias oculares en Japón (Uchio et al, 2008. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol. 246:291 -296). En otros estudios, la incidencia alcanza un 40% en el caso de la queratoconjuntivitis atópica y un 46% en el caso de la queratoconjuntivitis vernal, del total de pacientes de alergias oculares en Brasil (Belfort et al, 2000. Acta Ophthalmol Scand. 78: 38-40). En todas estas enfermedades se han visto alteraciones en los niveles de expresión de mucinas (Argüeso et al, 2002. Invest Opththalmol Vis Sci. 43: 1004-101 1 ; Dogru et al, 2005. Curr Eye Res. 30:897-908). Por otro lado, algunas patologías de la mucosa ocular, pueden ser producidas por el uso continuo de lentes de contacto, las cuales pueden dar lugar a inflamación subclínica y por ello a la disminución de la producción de mucinas (Corrales et al, 2009. Optom Vis Sci. 86: 1051 -1058), lo que supone un gran impacto tanto sanitario como social.
Dentro de las mucinas, una de las de mayor relevancia clínica es la mucina MUC5AC, la cual es específica de las células caliciformes de la conjuntiva. La producción de mucina por estas células se encuentra fuertemente disminuida (hasta un 90% de reducción) en diversas enfermedades oculares como por ejemplo la queratoconjuntivitis sicca, el síndrome de Sjógren, el penfigoide, el síndrome de Stevens Johnson (Kunert et al, 2001 . Invest Ophthalmol Vis Sci. 42: 2483-2489), en pacientes atópicos con úlceras corneales (Dogru et al, 2005. Cornea 24: S18-S23; Dogru et al, 2005. Curr Eye Res. 30: 897-908) También puede verse reducida como consecuencia del desarrollo de síntoma de ojo seco secundario a otras enfermedades o tratamientos oculares (Heimann et al, 2001 . Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol. 239: 488-495). Igualmente, la exposición pasiva al humo del tabaco produce una reducción significativa en los niveles de MUC5AC (Rummenie et a,. 2008. Cytokine 43: 200-208).
En la actualidad no existen tratamientos que permitan la recuperación funcional de la superficie ocular inflamada de forma crónica, sino que los tratamientos existentes solo presentan utilidad para aliviar la sintomatología de las enfermedades. Resulta necesaria la búsqueda de un tratamiento que permita la recuperación de la enfermedad, para lo cual una buena aproximación puede ser el tratamiento de la inflamación subyacente, permitiendo una normalización de la superficie ocular que finalmente permita recuperar los niveles de los componentes que se encuentren alterados. Dentro de esta recuperación de los niveles podría encuadrarse una terapia que permita la recuperación funcional de los niveles de las mucinas.
Debido al elevado absentismo laboral producido por las molestias oculares y la disminución de las facultades visuales, así como al daño psicológico asociado a la pérdida de visión que producen estos problemas crónicos, y a la ausencia de tratamientos efectivos, resultaría altamente beneficioso el desarrollo de una terapia génica que permita una recuperación funcional de las células productoras de mucinas. Esto conllevaría un restablecimiento de los niveles de las mismas y por tanto una recuperación de las enfermedades visuales asociadas a este defecto.
El desarrollo de terapias génicas se ha visto perjudicado por la búsqueda de objetivos muy ambiciosos mediante los cuales se ha tratado de conseguir una respuesta sistémica a los tratamientos genéticos. Sin embargo, un tratamiento más local, permitiría un desarrollo más sencillo de la terapia, y con ello unos mejores resultados mediante una respuesta terapéutica eficiente.
Uno de los mayores problemas a los que se ha enfrentado la terapia génica ha sido el desarrollo de vehículos adecuados. La aproximación a una terapia sistémica resulta compleja y difícil, ya que son múltiples las barreras existentes, y de muy diferente naturaleza dentro de un organismo. Sin embargo un enfoque más local permite reducir las barreras y simplifica la búsqueda del vehículo. Aun a pesar de ello, la necesidad de vehículos adecuados ha sido el mayor problema de la terapia génica (Nathan Blow, 2007. Nature. 450: 1 1 17- 1 120). En la actualidad, entre los vehículos más prometedores para el transporte de material genético se encuentran los sistemas nanoparticulares elaborados a base de biomateriales. Estos presentan un gran potencial, aunque hasta la fecha no han proporcionado los resultados esperados. Por ello, resulta necesario el desarrollo de nuevos sistemas capaces de aprovechar su potencial (Friede et al, 2005. Adv Drug Deliv Rev. 57:325-331 ).
Uno de los polímeros más utilizados es el quitosano, el cual es un polímero citado como esencial en la formación de nanopartículas mediante reticulación iónica. Las nanopartículas de quitosano están siendo cuestionadas ya que existen estudios que cuestionan su utilidad frente a simples disoluciones de las moléculas bioactivas con el polímero (Dyer et al, 2002. Pharm Res. 19:998- 1008). Además, también se ha señalado la posible citotoxicidad de las nanopartículas de quitosano (Loretz and Bernkop-Schnürch, 2007. Nanotoxicology. 1 : 139-148).
Existe por tanto la necesidad de desarrollar sistemas nanoparticulares partiendo de materiales y reactivos biocompatibles de baja citotoxicidad que proporcione un alto control en las propiedades físico-químicas de las nanopartículas, que puedan ser obtenidos mediante procedimientos sencillos y eficaces, y que sean capaces de asociar eficazmente material genético y de conseguir un adecuado efecto biológico con el mismo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere nanopartículas útiles para la elaboración de un medicamento que permita la recuperación de la producción de mucinas. Dichas nanopartículas llevan asociadas un polinucleótido que codifica para una proteína MUC5AC modificada, una construcción genética o un vector que contengan dicho polinucleótido. Esta composición permite la recuperación de la producción de mucinas, por lo que presenta utilidad para el desarrollo de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de las mucosas asociadas a una deficiencia de mucinas.
En la presente invención se demuestra cómo los inventores han desarrollado un plásmido que incluye un polinucleótido capaz de codificar una mucina, el cual puede ser asociado a nanopartículas. Cuando el sistema nanoparticular con el plásmido asociado, se pone en contacto con células humanas, las nanopartículas actúan como vehículos del material genético, sin presentar actividad citotóxica, y permiten que las células produzcan la mucina codificada por el plásmido. Además, en la presente invención se demuestra la capacidad de la composición para recuperar la producción de lágrima en ratones con ojo seco inducido, demostrando la utilidad de dicha composición para el desarrollo de medicamentos para el tratamiento de enfermedades de mucosas que cursan con déficit de mucinas. Por otro lado cabe indicar que la similaridad entre las mucinas, permite que una mucina pueda sustituir, al menos parcialmente, la funcionalidad de otras, en caso de deficiencia de alguna de ellas. Por ello la composición de la presente invención serviría para el tratamiento de enfermedades de mucosas que cursan con déficit de mucinas.
En la presente invención se ha asociado un plásmido que integra una secuencia que codifica para la proteína MUC5AC modificada (cuya secuencia es SEQ ID NO: 1 ), la cual se corresponde con los extremos C y N terminal de la proteína MUC5AC nativa. Esta secuencia nucleotídica (SEQ ID NO:2) que codifica para la mucina modificada es sustancialmente más corta (7,7 kilobases) que la secuencia codificante de la mucina completa (16 kilobases), lo que presenta como ventaja una mayor facilidad para su clonaje en plásmidos, construcciones genéticas o vectores. Esta secuencia codificante más corta, codifica para la mucina MUC5AC que presenta fusionados los extremos C-terminal y N-terminal, y que mantiene los dominios de mayor importancia de la proteína original como son el dominio de dimerización (presente en el extremo C-terminal), el dominio de polimerización, algunos de los diferentes puntos de glicosilación existentes en la proteína completa, y el péptido señal para su correcta conducción por la vía secretora. Esta proteína, por tanto, presenta el extremo N terminal de la MUC5AC (aminoácidos 1 -2.448) unido al dominio de dimerización presente en el extremo C-terminal (aminoácidos 5.220-5.333), eliminando la región central donde se encuentran las secuencias altamente repetidas ricas en prolina, treonina y serina (PTS). En la presente invención se demuestra que dicha proteína MUC5AC modificada es útil para tratar enfermedades que cursan con deficiencia de mucinas como por ejemplo el síndrome del ojo seco.
Por todo ello, un primer aspecto de la invención se refiere a nanopartículas poliméricas, de ahora en adelante nanopartículas de la invención, que comprenden un polinucleótido que codifica una proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal.
La expresión "proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N- terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal" se refiere a una proteína que presenta el extremo N terminal de la MUC5AC que incluye tanto el dominio de polimerización, como el péptido señal para su correcta conducción por la vía secretora, con el dominio de dimerización del extremo C-terminal de la proteína MUC5AC. Un ejemplo de proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal es, por ejemplo, aunque sin limitarse, la proteína de secuencia SEQ ID NO: 1 , la cual presenta los aminoácidos 1 -2.448 de la proteína MUC5AC (correspondientes al extremo N-terminal) unidos a los aminoácidos 5.220-5.333 (correspondientes al dominio de dimerización del extremo C-terminal). De igual forma que ocurre con muchas proteínas, como por ejemplo entre proteínas homologas en diferentes organismos, un polipéptido podría presentar variaciones en la secuencia aminoacídica respecto a la descrita a modo de ejemplo sin que se produjera una alteración sustancial en la proteína. Esto significa que esta variación no sería determinante en el polipéptido ni para su estructura ni para su actividad. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustituciones se dan entre aminoácidos que presentan similares características como por ejemplo en cuanto a polaridad, tamaño o carga, e incluyen, aunque sin limitarse, sustituciones entre ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp), entre Lisina (Lys) y Arginina (Arg), entre asparagina (Asn) y glutamina (Gln), entre serina (Ser) y treonina (Thr), y entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala), leucina (Leu), valina (Val) e isoleucina (lie). Las variaciones pueden ser variaciones generadas artificialmente como por ejemplo mediante mutagénesis o síntesis directa. Estas variaciones no provocan modificaciones en las características o propiedades esenciales del polipéptido, por lo que dichas variantes mantienen su misma actividad biológica. Por otro lado, adiciones, o deleciones de pocos aminoácidos en los extremos de las secuencias seleccionadas para dar lugar a la proteína del ejemplo tampoco provocarían modificaciones sustanciales en cuanto a tamaño o funcionalidad de la misma, por lo que también se encontrarían dentro de la expresión "proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal". Por todo ello, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal presenta al menos un 90%, preferiblemente un 95%, más preferiblemente un 98% de identidad de con respecto a SEQ ID NO:1 . En una realización más preferida la proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal es SEQ ID NO:1 .
Por otro lado, un polinucleótido que codifica para una proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal sería todo aquel polinucleótido que codifique para una proteína o polipéptido incluido bajo la denominación "proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N- terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal". Debido a la degeneración del código genético, en el cual diversos tripletes de nucleótidos dan lugar a un mismo aminoácido, existen diversas secuencias de nucleótidos que dan lugar a una misma secuencia aminoacídica. Un ejemplo de polinucleótido que codifica para una proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal sería por ejemplo, aunque sin limitarse, el polinucleótido de secuencia SEQ ID NO:2. Los términos "secuencia nucleotídica", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados. Se refieren por tanto a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra. El polinucleótido de la invención puede encontrarse en la naturaleza y obtenerse por aislamiento mediante métodos conocidos en el estado de la técnica, u obtenerse de manera artificial mediante métodos de clonación y selección convencional, o mediante secuenciación. El polinucleótido, adicionalmente a la secuencia codificante, puede llevar otros elementos como por ejemplo aunque sin limitarse, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5' o 3', sitios de unión a ribosomas, o secuencias estabilizadoras. Estos polinucleótidos adicionalmente también pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que puedan ser útiles por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de él o permitir una mejor purificación del mismo.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el polinucleótido presenta al menos un 90%, preferiblemente un 95%, más preferiblemente un 98% de identidad con respecto a SEQ ID NO:2. En una realización más preferida el polinucleótido es SEQ ID NO:2.
Los términos "péptido", "polipéptido", "proteína" o "secuencia aminoacídica" se usan de forma intercambiable en la presente invención, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 287 Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST o BLASTN, y FASTA (Altschul et al. 1999, J. Mol. Biol. 215: 403-410). Adicionalmente, el algoritmo de Smith Waterman debe usarse para determinar el grado de identidad de dos secuencias.
El polinucleótido que codifica para la proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal, puede encontrarse incluido en construcciones génicas o vectores. Por ello una realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a nanopartículas que comprenden un polinucleótido que codifica una proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C- terminal, donde el polinucleótido se encuentra incluido en una construcción genética o un vector. En una realización más preferida de primer aspecto de la invención, el vector en el que se encuentra incluido el polinucleótido es un plásmido.
La construcción genética puede llevar incluidas secuencias de control unidas operativamente al polinucleótido. El término "secuencia de control", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a secuencias nucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias a las que están ligadas. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa. Ejemplos de secuencias de control, son por ejemplo, pero sin limitarse, promotores, señales de inicio de la transcripción, señales de terminación de la transcripción, señales de poliadenilación o activadores transcripcionales.
La expresión "unidos operativamente", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a un polinucleótido, está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una región del ADN, generalmente "aguas arriba" o "upstream" del punto de inicio de la transcripción, que es capaz de iniciar la transcripción en una célula. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimibles. Las secuencias de control dependen del origen de la célula en la que se quiere expresar el ácido nucleico. Ejemplos de promotores procariotas incluyen, por ejemplo, pero sin limitarnos, los promotores de los genes trp, recA, lacZ, lacl, tet, gal, trc, o tac de E. coli, o el promotor del gen α-amilasa de B. subtilis. Para la expresión de un ácido nucleico en una célula procariota también es necesaria la presencia de un sitio de unión ribosomal situado "upstream" de la secuencia codificante. Secuencias de control apropiadas para la expresión de un polinucleótido en células eucariotas son conocidas en el estado de la técnica. Tanto el polinucleótido de la invención como la construcción genética de la invención que comprende el polinucleótido, pueden introducirse, por ejemplo, en un vector de clonación o un vector de expresión para permitir su replicación o su expresión. Preferiblemente, dicho vector es un vector apropiado para la expresión del péptido de la invención. El término "vector de clonación", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ADN en la que se puede integrar otro fragmento de ADN, sin que pierda la capacidad de autorreplicación. Ejemplos de vectores de expresión son, pero sin limitarse, plásmidos, cósmidos, fagos de ADN o cromosomas artificiales de levadura. El término "vector de expresión", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a un vector de clonación adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el mismo tras ser introducido en una célula hospedadora. Dicho ácido nucleico se encuentra, generalmente, unido operativamente a secuencias control.
El término "expresión" se refiere al proceso por el cual se sintetiza un polipéptido a partir de un polinucleótido. Incluye la transcripción del polinucleótido en un ARN mensajero (ARNm) y la traducción de dicho ARNm en una proteína o polipéptido. La expresión puede tener lugar en una célula hospedadora, pero también mediante cualquier proceso de expresión proteica in vivo.
Las nanopartículas pueden formarse mediante un mecanismo de interacción iónica que provoca la precipitación conjunta de los componentes en forma de nanoclusters como consecuencia de la adición de un agente reticulante que presenta carga eléctrica. El procedimiento de interacción iónica presenta como ventajas que no requiere el uso de elementos químicos diferentes a los componentes de las propias nanopartículas que puedan provocar toxicidad o incompatibilidad del sistema. El uso de un agente reticulante iónico permite el entrecruzamiento del polímero iónico dando lugar a las nanopartículas. Este procedimiento es un proceso rápido y fiable, económico y fácilmente escalable para la producción industrial.
Por ello, en otra realización preferida del primer aspecto de la invención, las nanopartículas están formadas por:
i) al menos un polímero dotado de carga eléctrica, y
ii) un agente reticulante iónico. Ejemplos de polímeros útiles para la formación de las nanopartículas son por ejemplo, aunque sin limitarse, acido hialurónico o sales del mismo, ácido colomínico o derivados, glucomanano o derivados, sulfato de condroitina, sulfato de queratano, sulfato de dextrano, sulfato de dermatano, heparina, carragenina, gelano, albúmina, colágeno o gelatina. Dentro de estos polímeros también se incluyen polímeros sobre los que se han realizado modificaciones tales como fragmentación enzimática, fragmentación química o derivatización mediante, por ejemplo, aunque sin limitarse, la anionización o cationización del polímero de forma previa a la elaboración de las partículas. Esto polímeros pueden presentar un origen natural, semisintético o sintético. Resulta interesante que los polímeros utilizados sean polímeros naturales o semisintéticos ya que esto permite minimizar en mayor medida el posible rechazo de los individuos tratados a las nanopartículas. Por ello, en una realización más preferida de este aspecto de la invención, el polímero de (i) es un polímero natural o semisintético.
Dentro de los polímeros de (i), uno de los que proporciona mejores resultados es la gelatina cationizada. Por todo ello, en una realización aun más preferida de este aspecto de la invención, el polímero de origen natural dotado de carga eléctrica (i) es gelatina cationizada.
Ejemplos de agentes reticulantes iónicos son por ejemplo, aunque sin limitarse, fosfatos, sulfatos, citratos o sales de los mismos, espermina o sales de la misma, o espermidina o sales de la misma. Estos agentes presentan diferentes cargas eléctricas (fosfatos, sulfatos y citratos carga aniónica; espermina y espermidina carga catiónica). Dentro de estos, uno de los mejor caracterizados y que mejor resultado proporciona son los tripolifosfatos. Por todo ello, en otra realización más preferida de este aspecto de la invención, el agente reticulante iónico (ii) es un tripol ¡fosfato. En una realización aun más preferida el agente reticulante iónico es tripolifosfato sódico. Opcionalmente, las nanopartículas pueden comprender un elemento adicional, el cual es un polímero iónico de carga eléctrica opuesta al primer polímero de las nanopartículas. La adición de este polímero permite una mejor gelificación iónica, y permite modificar las características de las nanopartículas obtenidas tanto en tamaño, como en características estructurales y carga eléctrica superficial. Por todo ello, en una realización más preferida del primer aspecto de la invención, las nanopartículas están formadas además por un elemento (iii) el cual es al menos un polímero de carga opuesta al polímero (i). Ejemplos de polímeros pueden ser por ejemplo, aunque sin limitarse, acido hialurónico o sales del mismo, ácido colomínico o derivados, glucomanano o derivados, sulfato de condroitina, sulfato de queratano, sulfato de dextrano, sulfato de dermatano, heparina, carragenina, gelano, albúmina, colágeno o gelatina. En una realización aun más preferida el polímero (iii) de carga opuesta al polímero (i) es sulfato de dextrano o sulfato de condroitino.
Debido a la formación de las nanopartículas mediante reticulación iónica el polinucleótido, ya sea de forma independiente o incluido en un vector o una construcción génica, puede quedar retenido en el interior de las mismas mediante atrapamiento puramente físico, debido a la diferencia del tamaño de éste y el de la malla formada en dicho proceso de reticulación. Por otro lado, debido al carácter iónico de los polímeros utilizados, ya sea en (i) o en (iii), el polinucleótido puede quedar también unido a las nanopartículas a consecuencia de una interacción electrostática entre éste y dichos polímeros..
En la presente invención se entiende por "nanopartícula" un sistema estable, de características homogéneas reproducibles y modulables, perfectamente diferenciables de sistemas autoensamblados, que se forman como consecuencia de un proceso controlado de entrecruzamiento ionotrópico del polímero dotado de carga constitutivo de las mismas mediado por agentes reticulantes iónicos. La interacción electrostática que resulta entre los diferentes componentes de las nanopartículas en el proceso de reticulación genera entidades físicas características, que son independientes y observables, cuyo tamaño promedio es inferior a 1 μιπ.
Se entiende por "tamaño promedio" en la presente invención, el diámetro promedio de las nanopartículas, el cual puede medirse utilizando procedimientos estándar conocidos por un experto en la materia, como por ejemplo, aunque sin limitarse, el utilizado en los ejemplos de la presente invención. Las nanopartículas de la invención presentan un tamaño promedio de entre 1 y 999 nm, preferiblemente de entre 50 y 600 nm, y más preferiblemente entre 100 y 400 nm. Este tamaño promedio de las partículas se encuentra influido por la composición de las mismas, así como por las condiciones ambientales en las que se forman.
Las nanopartículas pueden presentar diferentes cargas eléctricas superficiales (potencial Z) en función de la composición de las mismas, y de las proporciones de cada uno de los elementos. Esta carga puede presentar valores positivos, negativos o valor 0, preferiblemente, la carga eléctrica de las nanopartículas es de entre +50 mV y -50mV, más preferiblemente entre +45 y OmV, y aun más preferiblemente entre +40 y +10mV. La medición de la carga eléctrica puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo el utilizado en los ejemplos de la presente invención.
Las nanopartículas, una vez se han formado y presentan el polinucleótido asociado, pueden someterse a un proceso de liofilización para permitir su preservación durante el almacenamiento manteniendo sus características originales y permitiendo el manejo de menores volúmenes. Esta liofilización puede aumentar levemente la reticulación de las partículas. Para la liofilización es necesaria la previa adición de moléculas que actúen como crioprotectores o lioprotectores como por ejemplo, aunque sin limitarse, glicoles, o azúcares como glucosa, sacarosa o trealosa a una concentración de entre 1 y 5%. Por todo ello, en otra realización preferida, las nanopartículas de la invención se encuentran en forma liofilizada. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de las nanopartículas de la invención para la elaboración de un medicamento o alternativamente a las nanopartículas de la invención para su uso como medicamento. Como se demuestra en los ejemplos de la presente invención, las nanopartículas de la invención presentan utilidad en la recuperación de la producción de mucinas por células del organismo. Por ello otro aspecto de la invención se refiere al uso de las nanopartículas de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, o alternativamente a las nanopartículas de la invención para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina. Se entiende por "enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina" en la presente invención toda aquella patología que se produce por, o lleva asociada una disminución total o parcial de la producción de mucinas en las mucosas. Dentro de estas enfermedades se incluyen por ejemplo, aunque sin limitarse, enfermedades que afectan a la mucosa ocular y/o a otras mucosas del organismo, como el síndrome de insuficiencia límbica, la queratitis neurotrófica, la queratitis herpética, la quemadura por álcalis, la quemadura térmica, la quemadura por radiación, el síndrome de Steven-Johnson, la necrosis epidérmica tóxica, los pénfigos, el penfigoide de las membranas mucosas, las alergias oculares, la queratoconjuntivitis vernal, la queratoconjuntivitis atópica, la queratoconjuntivitis sicca o síndrome de ojo seco, las conjuntivitis infecciosas, inmunes e irritativas-tóxico-medicamentosas, el Síndrome de Sjógren primario o secundario a otras enfermedades autoinmunes (como la esclerodermia, la mesenquimopatía, el lupus, la artritis reumatoide, las miopatías o la cirrosis viral primaria), la atopia, la enfermedad injerto-contra huésped, la hipofunción glandular salivar y xerostomía, y la ictiosis. En los ejemplos de la presente invención se demuestra que en células presentes en la mucosa ocular, el uso de las nanopartículas que comprenden un plásmido que lleva un polinucleótido que codifica para la proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N-terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal, permite la expresión de esta mucina. Por ello, una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de las nanopartículas de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucosa es la mucosa ocular, o alternativamente a las nanopartículas para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucosa es la mucosa ocular. En la presente invención se demuestra que las nanopartículas de la invención permiten la recuperación de la producción lagrimal en una enfermedad que cursa con deficiencias en mucinas, y más concretamente con deficiencia en la mucina MUC5AC. Por todo ello otra realización preferida se refiere al uso de las nanopartículas de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucina es MUC5AC, o alternativamente a las nanopartículas para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucina es MUC5AC. En una realización más preferida de la invención se refiere al uso de las nanopartículas de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucosa es la mucosa ocular y la mucina es MUC5AC, o alternativamente a las nanopartículas de la invención para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucosa es la mucosa ocular y la mucina es MUC5AC. Otra realización preferida se refiere al uso de las nanopartículas de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina donde la enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina se selecciona de la lista que comprende: síndrome de insuficiencia límbica, queratitis neurotrófica, queratitis herpética, quemadura por álcalis, quemadura térmica, quemadura por radiación, síndrome de Steven-Johnson, necrosis epidérmica tóxica, pénfigos, penfigoide de las membranas mucosas, alergias oculares, queratoconjuntivitis vernal, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis sicca o síndrome de ojo seco, conjuntivitis infecciosas, inmunes e irritativas-tóxico-medicamentosas, Síndrome de Sjógren primario o secundario a otras enfermedades autoinmunes (como la esclerodermia, la mesenquimopatía, el lupus, la artritis reumatoide, las miopatías o la cirrosis viral primaria), atopia, enfermedad injerto-contra huésped, hipofunción glandular salivar, xerostomía, o ictiosis, o alternativamente a las nanopartículas de la invención para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina se selecciona de la lista que comprende: síndrome de insuficiencia límbica, queratitis neurotrófica, queratitis herpética, quemadura por álcalis, quemadura térmica, quemadura por radiación, síndrome de Steven-Johnson, necrosis epidérmica tóxica, pénfigos, penfigoide de las membranas mucosas, alergias oculares, queratoconjuntivitis vernal, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis sicca o síndrome de ojo seco, conjuntivitis infecciosas, inmunes e irritativas-tóxico-medicamentosas, Síndrome de Sjógren primario o secundario a otras enfermedades autoinmunes (como la esclerodermia, la mesenquimopatía, el lupus, la artritis reumatoide, las miopatías o la cirrosis viral primaria), atopia, enfermedad injerto-contra huésped, hipofunción glandular salivar, xerostomía, o ictiosis,. Una realización más preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de las nanopartículas de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina donde la enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina es síndrome de ojo seco, o alternativamente a las nanopartículas de la invención para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina es síndrome de ojo seco.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende las nanopartículas de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención la composición farmacéutica comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización más preferida de este aspecto de la invención la composición farmacéutica comprende, además, otro principio activo. En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica comprende, además, otro principio activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica, un efecto metabólico, un efecto inmunológico u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del ser humano u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
Las composiciones de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al ser humano, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en soluciones acuosas o no acuosas, en emulsiones o en suspensiones. Ejemplos de soluciones no acuosas son, por ejemplo, pero sin limitarse, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, o ásteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Ejemplos de soluciones acuosas, son por ejemplo, pero sin limitarse, agua, soluciones alcohólicas en agua, o medios salinos. Las soluciones acuosas pueden estar tamponadas o no, y pueden tener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, o similares, o nutrientes, incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a: aglutinantes, tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes, tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes, tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes, tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes, tales como menta o salicilato de metilo. La composición de la invención es especialmente ventajosa para constituir una composición líquida o cualquier composición que comprenda las nanopartículas de la invención y que se encuentre en forma de gel, crema, pomada, o bálsamo para su uso tópico. Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al ser humano, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, a oral, bucal, sublingual, ocular, nasal, pulmonar, ótica, intrauterina, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, vía rectal, vía vaginal o uretral, mediante la administración de un supositorio, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter. Las nanopartículas de la invención, debido a su utilidad en las mucosas presentan una administración ventajosa por diferentes vías mucosas como por ejemplo, aunque sin limitarse, mucosa ocular, mucosa del tracto gastro-intestinal completo incluyendo la bucal u oral, mucosa de las vías respiratorias, incluyendo la mucosa nasal y la bronquial, la mucosa urinaria y la mucosa vaginal. Por todo ello una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las nanopartículas de la invención para su administración vía mucosa ocular, mucosa del tracto gastro-intestinal completo, mucosa de las vías respiratorias, la mucosa urinaria y la mucosa vaginal.
Las nanopartículas, pueden someterse a un proceso de liofilización para permitir su preservación durante el almacenamiento manteniendo sus características originales y permitiendo el manejo de menores volúmenes. Por ello, en otra realización preferida la composición farmacéutica se encuentra en forma liofilizada.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia, del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la composición farmacéutica de la invención que produzca el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dicha composición farmacéutica y el efecto terapéutico a conseguir.
Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en las composiciones son los vehículos conocidos en el estado de la técnica. Otro aspecto de la invención se refiere al se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento o alternativamente a la composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, o alternativamente a la composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucosa es la mucosa ocular, o alternativamente a la composición farmacéutica para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucosa es la mucosa ocular.
Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucina es MUC5AC, o alternativamente a la composición farmacéutica para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucina es MUC5AC. En una realización más preferida de la invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucosa es la mucosa ocular y la mucina es MUC5AC, o alternativamente a la composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la mucosa es la mucosa ocular y la mucina es MUC5AC.
Otra realización preferida se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina donde la enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina se selecciona de la lista que comprende: síndrome de insuficiencia límbica, queratitis neurotrófica, queratitis herpética, quemadura por álcalis, quemadura térmica, quemadura por radiación, síndrome de Steven-Johnson, necrosis epidérmica tóxica, pénfigos, penfigoide de las membranas mucosas, alergias oculares, queratoconjuntivitis vernal, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis sicca o síndrome de ojo seco, conjuntivitis infecciosas, inmunes e irritativas-tóxico-medicamentosas, Síndrome de Sjógren primario o secundario a otras enfermedades autoinmunes (como la esclerodermia, la mesenquimopatía, el lupus, la artritis reumatoide, las miopatías o la cirrosis viral primaria), atopia, enfermedad injerto-contra huésped, hipofunción glandular salivar, xerostomía, o ictiosis, o alternativamente a la composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina se selecciona de la lista que comprende: síndrome de insuficiencia límbica, queratitis neurotrófica, queratitis herpética, quemadura por álcalis, quemadura térmica, quemadura por radiación, síndrome de Steven-Johnson, necrosis epidérmica tóxica, pénfigos, penfigoide de las membranas mucosas, alergias oculares, queratoconjuntivitis vernal, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis sicca o síndrome de ojo seco, conjuntivitis infecciosas, inmunes e irritativas-tóxico-medicamentosas, Síndrome de Sjógren primario o secundario a otras enfermedades autoinmunes (como la esclerodermia, la mesenquimopatía, el lupus, la artritis reumatoide, las miopatías o la cirrosis viral primaria), atopia, enfermedad injerto-contra huésped, hipofunción glandular salivar, xerostomía, o ictiosis, . Una realización más preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina donde la enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina es síndrome de ojo seco, o alternativamente a la composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina, donde la enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina es síndrome de ojo seco.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de las nanopartículas que comprende:
1 ) preparar una disolución acuosa de al menos un polímero iónico, 2) preparar una disolución de un reticulante iónico,
3) mezclar mediante agitación las disoluciones de (1 ) y (2) lo que da lugar a la formación de las nanopartículas.
Este método de producción es un método rápido, económico, reproducible y escalable, lo que permite su implantación industrial. Además, la ausencia de elementos químicos diferentes a los constitutivos de las nanopartículas, así como el uso de condiciones suaves para la producción, permite una mayor seguridad de las partículas resultantes. Para llevar a cabo la asociación de la molécula de ADN, ésta se disuelve en la disolución del polímero o del agente reticulante, en función de la carga eléctrica de cada uno de estos componentes. El ADN se incorpora en la disolución que presente carga negativa.
Opcionalmente se podría incorporar un polímero de carga opuesta al del paso (1 ), bien en el paso (3), o bien posteriormente una vez formadas las nanopartículas. La incorporación de los polímeros se lleva a cabo mediante una disolución acuosa del mismo a una concentración de entre 0, 1 y 6 mg/mL, preferiblemente entre 0, 1 y 5 mg/mL. Por otro lado, el agente reticulante se incorpora mediante una disolución acuosa del mismo a una concentración de entre 0,0625 y 1 ,5 mg/mL, preferiblemente entre 0,25 y 1 ,5mg/mL.
Mediante este procedimiento se lleva a cabo la formación de las nanopartículas, permitiendo el control tanto del proceso de entrecruzamiento como del tamaño y la carga superficial de las partículas resultantes. Además se permite la reproducibilidad de las partículas resultantes.
Posteriormente a la formación de las nanopartículas, éstas pueden someterse a un proceso de liofilización para permitir su preservación durante el almacenamiento manteniendo sus características originales y permitiendo el manejo de menores volúmenes. Esta liofilización puede aumentar la reticulación de las partículas. Para la liofilización es necesaria la previa adición de moléculas que actúen como crioprotectores o lioprotectores como por ejemplo, aunque sin limitarse azúcares como glucosa, sacarosa o trealosa a una concentración de entre 1 y 5%.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema de los plásmidos A: plRES2-AcGFP1 - MUC5AC-280; y B: pMUCIN5AC-29. MA0151 y MA0153: cebadores; PMCMV: promotor de citomegalovirus; pUC ori: origen de replicación pUC; HSV TK poly A: señal de poliadenilación de la timidina kinasa del virus herpex simplex; KanR/NeoR: resistencia a kanamicina y neomicina; SV40 ori/p: origen de replicación de SV40; f1 ori: origen de replicación f1 ; AcGFPI : Aequorea coerulescens green fluorescent protein; IRES: sitio interno de entrada al ribosoma; MUC5AC ORF: marco de lectura de MUC5AC; SacI: punto de corte de la enzima de restricción SacI; EcoRV: punto de corte de la enzima de restricción EcoRV.
Figura 2. Imagen de gel de agarosa. Resultados de la digestión de 0,5 microlitros de la preparación de pMUCIN5AC-29 con las enzimas SacI y EcoRV y sus respectivos controles negativos (-) sin digerir con la enzima.
Figura 3. Caracterización morfológica de las nanopartículas por microscopía electrónica de transmisión. (A) nanopartículas GCspm137:TPP; (B) nanopartículas GCspm137:CS:TPP; (C) nanopartículas GCspm137:DS:TPP.
Figura 4. Imagen del gel de electroforesis en agarosa al 1 % cargado con: (A) Plásmido pMUC5AC-280 libre; (B) nanopartículas GCspm137:TPP, (C) nanopartículas GCspm137:CS:TPP; (D) nanopartículas GCspm:DS:TPP.
Figura 5. Valores de viabilidad celular obtenidos mediante el test XTT en A: células humanas de córnea (HCE) o B: de conjuntiva (IOBA-NHC). (C) Control no tratado; (C+) control positivo de muerte celular (tratado con disolución de cloruro de benzalconio 1 %); (F1 ) nanopartículas GCspm137:TPP; (F2) nanopartículas GCspm137:CS:TPP; (F3) nanopartículas GCspm137:DS:TPP.
Figura 6. Expresión de MUC5AC relativa al control, a nivel de ARNm en células 72h post-transfección en A: células humanas de córnea (HCE) o B: células humanas de conjuntiva (IOBA-NHC). (Control) Control no tratado; (JetPEI+pEGFP) Control negativo de transfección; (JetPEI+pMUC5AC) Control positivo de transfección; (F1 ) nanopartículas GCspm137:TPP; (F2) nanopartículas GCspm137:CS:TPP; (F3) nanopartículas GCspm137:DS:TPP" Figura 7. Expresión de la proteína MUC5AC relativa al control en células 72h post-transfección en A: células humanas de córnea (HCE) o B: células humanas de conjuntiva (IOBA-NHC). Control no tratado (Control); Control negativo de transfección (JetPEI+pEGFP); Control positivo de transfección (JetPEI+pMUC5AC); nanopartículas GCspm137:TPP (F1 ); nanopartículas GCspm137:CS:TPP (F2); nanopartículas GCspm137:DS:TPP (F3).
Figura 8. Producción de lágrima en animales no sometidos a inducción de ojo seco y no tratados (Control), en animales con ojo seco inducido y no tratados (Control Ojo Seco), en animales con ojo seco inducido y tratados con pMUC5AC libre (Ojo Seco + pMUC5AC libre), en animales con ojo seco inducido y tratados con nanopartículas blancas (sin plásmido asociado) (Ojo Seco + NPs blancas), en animales con ojo seco inducido y tratados con nanopartículas asociando pMUC5AC (Ojo Seco + pMUC5AC-NPs) y en animales con ojo seco inducido y tratados con formulación comercialmente disponible para el tratamiento del ojo seco (Ojo Seco + Restasis®). Para cada tratamiento se muestran los valores básales de producción de lágrima (tiempo cero; primera columna); los obtenidos tras la inducción de ojo seco (día 5; segunda columna) y los obtenidos al término del tratamiento (día 10; tercera columna). * diferencia significativa con respecto a los valores básales (p<0,05). # diferencia significativa con respecto a los valores en animales con ojo seco inducido (p<0,05) (n=8, divididos en dos grupos independientes de 4 animales cada uno). EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. Materiales y métodos.
Como procedimiento común a los ejemplos detallados a continuación, se ha caracterizado a las nanopartículas desde el punto de vista del tamaño, el potencial zeta (o carga superficial) y la eficacia de encapsulación.
Durante la exposición de algunos de los siguientes ejemplos se hace referencia a resultados obtenidos mediante las siguientes técnicas:
La gelatina con espermina ha sido sintetizada según el método descrito por Seki et al, (2006. Journal of Pharmaceutical Sciences. 95, 1393-1401 ). Para ello se preparó una disolución de gelatina al 1 % p/v (100mg de gelatina 10 mi de tampón fosfato 0, 1 M, pH 5,3), a la que se añadieron 1620 mg de espermina y 267,5 mg de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etil-carbodiimida hidroclorhidrato (EDC). Seguidamente se ajustó el pH (pH=4,5) a un valor de pH=5 con NaOH, y el conjunto se dejó reaccionar durante 18 h en baño termostatizado, a 37±1°C. Posteriormente el conjunto se dializó y se liofilizó, obteniendo así la gelatina cationizada con espermina que se empleó en los experimentos que se recogen en los correspondientes ejemplos. La determinación del punto isoiónico o isoeléctrico consiste en medir la concentración de iones hidrógeno de una solución del polímero que ha sido desmineralizada mediante el contacto con resinas de intercambio iónico (Commission on Methods for Testing Photographic Gelatin. PAGI METHOD 10th Ed. 2006). El proceso consiste en colocar una solución al 1 % de la proteína cationizada en contacto con una mezcla de resinas ácida catiónica y básica aniónica en proporciones 1 :2. Previamente estas resinas de intercambio se trataron mediante lavados con agua milliQ a 35 °C y, a continuación, se pusieron en contacto con la solución de proteína modificada bajo agitación a 35 °C, durante 30 minutos. A continuación se decanta la solución y se mide el pH a 35°C. El valor obtenido indica el punto isoiónico o isoeléctrico de la proteína. Como control se han empleado gelatinas comerciales de puntos isoeléctricos 9 El tamaño de partícula ha sido determinado mediante la técnica de espectroscopia de correlación fotónica (PCS) y haciendo uso, para ello, de una Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK) obteniendo el tamaño medio de la población y el índice de polidispersión de la misma. Para ello las muestras fueron convenientemente diluidas en agua mili- Q.
El potencial Zeta partícula ha sido determinado mediante la técnica de anemometría por dispersión de láser (LDA) y haciendo uso, para ello, de una Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK). Para ello las muestras fueron convenientemente diluidas en una disolución milimolar de KCI.
Para la evaluación de la morfología de las nanopartículas, se ha empleado microscopía electrónica de transmisión (TEM) en un JEOL JEM-101 1 (Jeol, Japón) utilizando ácido fosfotúngstico al 1 % como agente de contraste.
La eficiencia de asociación de material genético a las nanopartículas ha sido determinada mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa. Para ello se preparó un gel de agarosa al 1 % en tampón TAE (Tris-Acetato-EDTA, Tris 40mM, Ácido acético 1 %, EDTA 1 mM) pH 8 con bromuro de etidio (10 mg/mL, 5 μΙ_) y se utilizó un tampón de carga y marcador de migración compuesto de glicerina (30%). Se aplicó una diferencia de potencial de 100 V durante 120 minutos y se empleó material genético libre como control.
Para el análisis cuantitativo de la asociación del plásmido a las nanoestructuras, se utilizó el método del Picogreen® (Invitrogen, ES), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en sobrenadantes de las formulaciones previamente centrifugadas en centrífuga Microfuge 22R (Beckman Coultern, US) a 12.000 rpm a 4°C durante 30 minutos. Para los experimentos de cultivos celulares fueron empleadas dos líneas: células humas de córnea HCE (Human Corneal Epithelium) y células humanas de conjuntiva IOBA-NHC (Normal Human Conjunctiva). Las células HCE fueron cultivadas en medio DMEM/F-12 suplementado con 15% de suero fetal bovino (FBS), 0,5% de DMSO, toxina colérica (1 mg/mL), factor de crecimiento endotelial (EGF; 100 μg/mL), insulina (4 mg/mL), estreptomicina (0, 1 mg/mL) y penicilina (100 U/mL) (Invitrogen, ES). Las células IOBA-NHC fueron cultivadas en medio DMEM/F-12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), toxina colérica (1 mg/mL), factor de crecimiento endotelial (EGF; 2 ng/mL), insulina (10 mg/mL), hidrocortisona (50 μg/mL), fungizona (250 μg/mL), estreptomicina/penicilina (5000 U/mL) (Invitrogen, ES). Las células fueron mantenidas a 37°C bajo una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
Para los ensayos de viabilidad celular, fue empleado el test XTT que está basado en la conversión de la sal tetrazólica en un formazán soluble por las células viables (n=3, experimentos independientes realizados en octuplicados). La medida de absorbancia fue realizada a 450 nm con la longitud de onda de referencia de 620 nm, en un multilector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices, US), expresando los resultados en % de viabilidad relativa al control.
Para la cuantificación relativa de la expresión del ARNm correspondiente a la MUC5AC-, fue empleada la RT-PCR, utilizando el gen de la gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como referencia.. El ARNm fue extraído y purificado con RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany) y cuantificado con Quant-it RNA Assay Kit (Invitrogen, US) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc fue construido con SuperScript®Villo cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, US) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los parámetros de la RT-PCR fueron: un paso inicial de desnaturalización a 95°C durante 10 minutos; un segundo paso de desnaturalización y extensión, con 40 ciclos, de 15 segundos a 95°C y 60 segundos a 60°C, haciendo uso de 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, US). La MUC5AC fue cuantificada por ELISA. Se utilizó como estándar el análogo B de la MUC5AC (AnaSpec, US). Para ello se incubaron en placas de 96 pocilios, 50[ L de lisados celulares con 50μί de tampón bicarbonato 0,05M pH 9,6 a 37°C over night. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS y bloqueadas con 2% de albúmina de suero bovino (BSA fracción V) (Sigma-Aldrich, España) durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas fueron nuevamente lavadas tres veces con PBS e incubadas con 100μί de anticuerpo de ratón anti- MUC5AC (Chemicon, US) (1 :500) que fue diluido en PBS conteniendo 0,05% de Tween 20. Después de una hora, los pocilios fueron lavados tres veces con PBS y, a continuación, se añadió sobre ellos 100 μί de IgG de burro anti-ratón conjugada con peroxidasa diluido (1 :10.000) en PBS conteniendo 0,05% de Tween 20 y 0,1 % de BSA. Después de una hora, las placas fueron lavadas tres veces con PBS. La reacción de color fue desarrollada con el reactivo peróxido de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), tal y como describe el correspondiente fabricante (Invitrogen, ES). La absorbancia fue leída a 450 nm en lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices, US). Los valores obtenidos fueron normalizados con respecto a la cantidad total de proteína y los resultados se expresaron como producción de mucinas relativa al control. La secuencia de la construcción plasmídica codificadora de MUC5AC se verificó por secuenciación.
La identificación del plásmido codificador de mucina administrado de forma exógena, sólo o asociado a las nanopartículas, en el interior de células humanas de la superficie ocular se hizo mediante microscopía de fluorescencia, evaluando la expresión de la proteína verde fluorescente GFP. La valoración de un posible efecto tóxico sobre las células humanas como consecuencia de esa administración se realizó mediante un test de medida de la toxicidad estándar (XTT).
La medida de la cantidad de mucina producida en las células como consecuencia de la administración de la invención se hizo mediante dos técnicas complementarias: RT-PCR a tiempo real y un test de ELISA. Reactivos:
Los siguientes polímeros, tal y como se utilizan en los ejemplos, fueron adquiridos a diferentes casas comerciales: gelatina (Nitta Gelatin Canadá Inc., Canadá), sulfato de condroitino (Calbiochem, US), sulfato de dextrano (Sigma- Aldrich, España). El plásmido de ADN pEGFP fue adquirido a Elim Biopharmaceuticals (US). El plásmido de ADN plRES2-AcGFP1 -Mucin-5AC- 280 fue sintetizado en Biomedal (España). El tripolifosfato sódico y citrato de sodio fueron adquiridos a Sigma Aldrich (España).
Ejemplo 1. Desarrollo de un plásmido ADN codificador de una mucina y de una proteína fácilmente identificable. Se desarrolló un plásmido ADN codificador de una mucina, concretamente la mucina MUC5AC, y de una proteína fácilmente identificable, concretamente la proteína verde fluorescente GFP. Ello tuvo lugar a partir de oligonucleótidos sintéticos, de la secuencia de ADN conteniendo la región codificante de un polipéptido de secuencia derivada de la proteína humana MUC5AC. La secuencia de ADN, optimizada para su expresión en células de mamífero, se clonó en un vector de clonación bacteriano, se secuenció y transfirió al vector de expresión plRES2-AcGFP1 , que ya contiene la secuencia que codifica para GFP (Clontech). Concretamente, a partir de la ORF (Open Reading Frame) diseñada, se sintetizó una secuencia de 7660 pares de bases, que además incorporaba una secuencia Kozak (GCCACCATG), dos codones de stop adicionales (TAATAG) y dianas para la enzima de restricción SacI (GAGCTC) en ambos extremos. Esta secuencia se insertó en el vector de clonación de E. coli pUC57, dando lugar al plásmido de 10437 pares de bases pUC57-MUC5AC (SEQ ID NO:3). Finalmente, una vez secuenciada la región de pUC57-MUC5AC correspondiente a MUC5AC, se escindió el fragmento SacI de 7754 pares de bases que la contiene y se clonó éste, en la orientación adecuada, en el vector plRES2-AcGFP1 linealizado con Sacl, obteniéndose el plásmido plRES2- AcGFP1 -Mucin-5AC-280 (SEQ ID NO:4). La secuencia en torno a los puntos de inserción en las dianas Sacl se verificó mediante secuenciación con los cebadores:
MA0151 5'-GTAGGCGTGTACGGTGGGAGG-3' (SEQ ID NO:5).
MA0153 5'-CCTTATTCCAAGCGGCTTCGGCC-3' (SEQ ID NO:6). El plásmido plRES2-AcGFP1 - Mucin-5AC-280, se obtuvo a partir de un cultivo de un transformante de la cepa DH5 alfa. El DNA fue extraído y purificado utilizando el kit "GenElute™ HP Plasmid Megaprep", de Sigma, y finalmente liofilizado. La Figura 1A muestra un esquema de dicho plásmido. Se procedió a testar el plásmido obtenido, plRES2-AcGFP1 - Mucin-5AC-280, mediante la transfeccion de células humanas de epitelio de la córnea (HCE) (Araki-Sasaki et al, 1995. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36:614-621 ) y de la conjuntiva (IOBA-NHC) (Diebold Y et al, 2003. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44: 4263-4274) utilizando el plásmido desnudo y asociado a agentes de transfeccion estándar: Lipectamina™2000 (Invitrogen) y Jet-PEI™-RGD (Polyplus-transfection). Para ello, se sembraron 80.000 células/pocilio en placas de 24 pocilios y 24 horas después de incubaron con los complejos plásmido (1 g/pocillo) - agente de transfeccion durante 4 horas, tras lo cual se procedió a añadir medio fresco completo. A las 72 horas de la transfeccion se estudió la viabilidad celular de los cultivos transfectados mediante el test de toxicidad celular XTT. La eficiencia de transfeccion se analizó por microscopía de fluorescencia, observando la expresión de la proteína verde fluorescente. La producción de MUC5AC se estudió por ELISA y RT-PCR a tiempo real. Tanto las células HCE como IOBA-NHC son transfectadas con éxito con el plásmido plRES2-AcGFP1 -Mucin-5AC-280, observándose células con fluorescencia verde, correspondiente a la expresión de GFP. Se detecta expresión de MUC5AC en células HCE e IOBA-NHC transfectadas, mediante inmunofluorescencia y Western blotting. Esta expresión es mayor en células de epitelio corneal que del epitelio conjuntival. La cantidad de MUC5AC detectada por ELISA en las células HCE transfectadas es un -2500% mayor que en células sin transfectar. En el caso de las células IOBA-NHC, este porcentaje es del -1500%.
Los datos de la RT-PCR a tiempo real apoyan los obtenidos a nivel de proteína, con una expresión de MUC5AC del orden de 10.000 veces superior en células transfectadas con JetPei-RGD que en células control, en ambas líneas celulares. En el caso de la lipofectamina, la expresión de MUC5AC fue todavía superior. Por lo tanto, las células oculares HCE e IOBA-NHC, tras la transfección con del plásmido plRES2-AcGFP1 - MUC5AC-280, son capaces de expresar el plásmido, de sintetizar la proteína transducida (MUC5AC) y de secretarla.
Ejemplo 2. Desarrollo de un plásmido ADN codificador de una mucina.
A partir del plásmido plRES2-AcGFP1 -MUC5AC-280 se desarrolló un plásmido ADN codificador de la mucina MUC5AC, eliminando la región correspondiente a la expresión de la proteína verde fluorescente GFP. La figura 1 B muestra un esquema de dicho plásmido. El procedimiento consistió en la eliminación de la región IRES-GFP de la construcción plRES2-AcGFP1 -MUC5AC-280 mediante digestión y religación. La región eliminada fue la contenida entre el sitio Sacl localizado a partir de la base en posición 8370, y el sitio Notl localizado a partir de la posición 9728 de la secuencia de plRES2-AcGFP1 -MUC5AC-280. La estrategia utilizada fue la descrita a continuación:
1 . Digestión parcial con Sacl del plásmido plRES2-AcGFP1 -MUC5AC-280 y purificación de la forma lineal del plásmido (13.061 pares de bases)
2. Digestión con Notl y tratamiento con polimerasa de T4 para crear extremos romos. Purificación del fragmento Notl-Sacl de 1 1 .706 pares de bases resultante. 3. Ligación, transformación en E. coli DH5 alfa e identificación mediante PCR de colonias de candidatos con la construcción pMUC5AC deseada.
4. Selección de dos clones positivos, extracción de ADN plasmídico y secuenciación para verificar la eliminación de la secuencia IRES-GFP.
Se preparó ADN plasmídico del clon pMUCIN5AC-29 (SEQ ID NO:7), que fue eluído en agua destilada y esterilizada, y digerido por separado con las enzimas Sacl y EcoRV, obteniéndose patrones de digestión compatibles con los esperados (corte con Sacl: 1 fragmento de 1 1 .702 pares de bases; corte con EcoRV: 3 fragmentos de 6.692 pares de bases, 3.135 pares de bases y 1 .875 pares de bases, respectivamente). La fotografía 2 muestra los resultados de digerir 0,5 microlitros la preparación de pMUCIN5AC-29 con estas enzimas (se incluyen controles negativos del plásmido sin digerir). Ejemplo 3: Preparación de nanopartículas asociando el plásmido plRES2- AcGFP1 -MUC5AC-280 elaboradas a base de gelatina cationizada y de combinaciones con polímeros aniónicos.
Se prepararon nanopartículas de gelatina cationizada según un procedimiento de reticulación iónica en presencia de un polianión. Para ello se procedió previamente a cationizar gelatina del tipo A (MW= 137 kDa) con espermina (SPM), en presencia de clorhidrato de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida (EDC). El punto isoeléctrico final de la gelatina fue de 1 1 ,08. Se procedió a la asociación a las nanopartículas del plásmido plRES2-AcGFP1 - MUC5AC-280. Se trata de una macromolécula cargada negativamente, por lo que se incorporó junto al reticulante aniónico, para evitar la aparición de interacciones previas a la formación de las partículas. El agente reticulante utilizado fue la molécula aniónica tripolifosfato (TPP). Para ello se prepararon disoluciones acuosas en agua mili-Q de gelatina previamente cationizada con espermina (1 ,0 mg/mL). El agente reticulante se adicionó mediante el empleo de una solución acuosa de TPP (0, 125-0,25 mg/mL) en agua mili-Q. Opcionalmente fueron incorporados en la composición los polímeros aniónicos sulfato de dextrano (DS) (0,1 mg/mL) o sulfato de condroitino (CS) (0, 125 mg/mL). El correspondiente material genético se incorporó en una concentración de 0,05 [ Q/[ L dando lugar a una relación de masas comprendida entre un 7,3 % y un 9 % con respecto a los constituyentes de las partículas). Para ello, la molécula bioactiva se incorporó a la disolución del reticulante y la disolución resultante se mezcló con la disolución de gelatina cationizada bajo agitación magnética, la cual se mantuvo durante media hora permitiendo la completa evolución del sistema hacia una forma nanoparticular estable. Las formulaciones desarrolladas y sus características físico-químicas (diámetro medio de las nanopartículas obtenidas así como carga eléctrica superficial) se recogen en la Tabla 1 .
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Tabla 1. Características físico-químicas de las nanopartículas asociando pMUC5AC-280 elaboradas a base de gelatina cationizada con espermina (GCspm137) empleando tripolifosfato sódico (TPP) como agente reticulante y de combinaciones con sulfato de condroitina (CS) o sulfato de dextrano (DS) (n=3).
La asociación del plásmido a las nanopartículas desarrolladas se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa. En la figura 3 se puede verificar la morfología esférica y tamaño nanométrico homogéneo de los sistemas formados. Como puede comprobarse en la figura 4, las bandas correspondientes al plásmido incorporado en la elaboración de las nanopartículas no migran en el gel como ocurre con el control de plásmido libre, lo cual indica que se encuentra eficazmente asociado a las nanopartículas.
Ejemplo 4. Los sistemas nanoparticulares asociando plásmido ADN no presentan citotoxicidad significativa en células humanas de córnea y conjuntiva.
La evaluación de la viabilidad de las células en contacto con nanopartículas elaboradas a base de gelatina cationizada y de combinaciones con polímeros aniónicos se llevó a cabo en células humanas de córnea y conjuntiva. Para ello las células fueron sembradas en placas de 96 pocilios Costar ® (Corning, US) a una confluencia de 10.000 células por pocilio y se dejaron crecer durante 24h antes del ensayo. Las células fueron incubadas durante 4h con 20 μί de formulación (nanopartículas), o bien con 20 μί de disolución de cloruro de benzalconio 1 % (control positivo de muerte celular) o con 20 μΙ_ de medio de cultivo (control negativo), completando dichos volúmenes con medio DMEM/F- 12 hasta un volumen total de 200 μΙ_. Pasado ese tiempo, las células fueron lavadas y se añadió 200 μΙ_ del respectivo medio de cultivo. A continuación, las células fueron incubadas con 200 μΙ_ de medio RPMI sin rojo fenol con XTT (0,2 mg/mL) durante 15h. Los resultados fueron expresados en porcentaje de viabilidad celular relativa al control no tratado. Como se puede apreciar en la figura 5, los sistemas no presentan toxicidad significativa en ninguna de las líneas celulares estudiadas.
Ejemplo 5. Los sistemas nanoparticulares asociando plásmido ADN son suficientes y necesarios para dar lugar a la producción de mRNA de MUC5AC en células humanas de córnea (HCE) y conjuntiva (IOBA-NHC). Para los estudios de transfección las células fueron sembradas en placas de 24 pocilios Costar ® (Corning, US) a una densidad comprendida entre 50.000 y 80.000 células por pocilio y se dejaron crecer durante 24h antes de la transfección. A continuación se incubaron con nanopartículas elaboradas a base de gelatina cationizada y de combinaciones con polímeros aniónicos. Como control positivo se emplearon complejos de JetPEI-RDG (Polyplus- transfections, US) con plRES2-AcGFP1 -MUC5AC-280 (relación 1/10) o con pEGFP (relación 1/5), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células fueron incubadas con los sistemas y los controles (1 -5 μg de plásmido por pocilio) durante 4h en medio DMEM/F-12 puro. Se procedió a la cuantificación relativa del ARNm de MUC5AC, de acuerdo con el procedimiento previamente descrito, expresando los resultados en log de mRNA de MUC5AC, normalizados con GAPDH, relativos al control sin transfectar. Como se puede apreciar en la figura 6, en ambas las líneas celulares y con todas las formulaciones ensayadas, fueron detectados niveles significativos de ARNm de MUC5AC, indicando una transfección exitosa.
Ejemplo 6. Los sistemas nanoparticulares asociando plásmido ADN son suficientes y necesarios para dar lugar a la producción por células humanas de córnea y conjuntiva de la mucina MUC5AC.
Para los estudios de transfección las células fueron sembradas en placas de 24 pocilios Costar ® (Corning, US) a una densidad comprendida entre 50.000 y 80.000 células por pocilio y se dejaron crecer durante 24h antes de la transfección. A continuación se incubaron con nanopartículas elaboradas a base de gelatina cationizada y de combinaciones con polímeros aniónicos. Como control positivo se emplearon complejos de JetPEI-RDG (Polyplus- transfections, US) con plRES2-AcGFP1 -MUC5AC-280 (relación 1/10) o con pEGFP (relación 1/5), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células fueron incubadas con los sistemas y los controles (1 -5 μg de plásmido por pocilio) durante 4h en medio DMEM/F-12 puro. La expresión de la MUC5AC a nivel proteico fue evaluada 72h pos-transfección. Como se puede apreciar en la figura 7 para ambas líneas celulares se obtuvo una expresión significativa de MUC5AC, confirmando que los sistemas son efectivos para la transfección en células de córnea y conjuntiva. Ejemplo 7. Los sistemas nanoparticulares asociando plásmido ADN dan lugar a una respuesta biológica capaz de restablecer la funcionalidad en la producción de lágrima en animales con ojo seco inducido, de modo similar al conseguido con formulación comercialmente disponible para esta finalidad.
Se procedió a inducir ojo seco en ratones C57BL/6 mediante la técnica denominada estrés por desecación. Concretamente, los animales fueron tratados con hidrobromuro de escopolamina por vía subcutánea (0,5mg/0,2ml_; Sigma-Aldrich, US) tres veces al día alternando las administraciones entre la pata derecha e izquierda y sometidos a un flujo de aire de baja humedad. Para ello, los animales se mantuvieron en jaulas con paredes laterales perforadas para permitir un flujo de aire proporcionado por ventiladores (uno en cada lado de la jaula). Dichas jaulas fueron mantenidas dentro de una campana de flujo (AirClean Systems, US) en la que se mantuvo la humedad del aire por debajo del 40%. La producción de lágrima en los animales se determinó mediante el empleo de un hilo de algodón estéril con indicador de pH rojo de fenol (Zone- Quick, Lacrimedics, US). Para ello, el tiempo de contacto del hilo con el ojo fue de treinta segundos. La distancia de migración de la lágrima fue medida en milímetros, basándose en el cambio de color que dicho hilo experimenta al subir por capilaridad la lágrima. La inducción de ojo seco se inició cinco días antes a la administración de las formulaciones y el procesado de los controles, y se mantuvo durante los cinco días de tratamiento.
Para el tratamiento se administró la formulación F2 (GC137spm:CS:TPP) concentrada 4 veces mediante centrifugación (10.000g, 30 min, 4 °C, CR22 Beckman Coulter, US) hasta una concentración final de 0,2[ig/\iL de pMUCIN5AC-29. Las nanopartículas fueron administradas en un volumen de 5μΙ_, 4 veces al día durante 5 días, en cada uno de los ojos, con un intervalo de 1 h entre las administraciones ^g por día de pMUCIN5AC-29; 20μ9 pMUCIN5AC-29 en total). Una vez administradas las formulaciones se inmovilizó manualmente a los animales durante 1 min.
En el estudio se emplearon cinco grupos de animales control:
- Animales no sometidos a inducción de ojo seco y no tratados.
- Animales con ojo seco inducido y no tratados.
- Animales con ojo seco inducido y tratados con pMUC5AC libre.
- Animales con ojo seco inducido y tratados con nanopartículas blancas (sin plásmido asociado).
- Animales con ojo seco inducido y tratados con formulación comercialmente disponible para el tratamiento del ojo seco (Restasis®, Allergan Inc., USA).
Para la evaluación de la eficacia del tratamiento se determinó la producción de lágrima de acuerdo con el procedimiento previamente descrito, cuantificando los valores básales de producción de lágrima (tiempo cero), los obtenidos tras la inducción de ojo seco (día 5) y los obtenidos al término del tratamiento (día 10). Los resultados se expresaron como promedio ± error estándar de la media de la migración de lágrima en el hilo (mm) de grupos experimentalmente independientes de 4 animales (total de 8 animales). Para el tratamiento estadístico de los resultados se empleó el análisis de variancia de una vía (ANOVA) con medidas repetidas. Las diferencias se consideraron significativas cuando (p<0,05).
Tal y como puede apreciarse en la Figura 8, después de la inducción de ojo seco todos los animales presentan disminución en el nivel de producción de lágrima en relación a sus niveles básales (p<0,05). La funcionalidad en la producción de lágrima es únicamente restablecida mediante el tratamiento con nanopartículas pMUCIN5AC-29 libre, nanopartículas asociando pMUCIN5AC- 29 y con la formulación comercial Restasis ® (emulsión de ciclosporina 0,05%), si bien el restablecimiento es mejor en el caso de las nanopartículas o la formulación comercial.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Nanopartículas poliméricas que comprenden un polinucleótido que codifica para una proteína MUC5AC modificada que presenta el extremo N- terminal de MUC5AC unido al dominio de dimerización situado en el extremo C-terminal.
2. Nanopartículas según la reivindicación 1 donde el polinucleótido presenta un 90% de identidad con respecto a SEQ ID NO:2.
3. Nanopartículas según la reivindicación 2 donde el polinucleótido presenta un 95% de identidad con respecto a SEQ ID NO:2.
4. Nanopartículas según la reivindicación 3 donde el polinucleótido presenta un 98% de identidad con respecto a SEQ ID NO:2.
5. Nanopartículas según la reivindicación 4 donde el polinucleótido es SEQ ID NO:2.
6. Nanopartículas según cualquiera de las reivindicación 1 a 5 donde el polinucleótido se incluye en una construcción genética o un vector.
7. Nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 formada por al menos:
i) al menos un polímero dotado de carga eléctrica, y
ii) un agente reticulante iónico.
8. Nanopartículas según la reivindicación 7 donde el polímero de (i) es gelatina cationizada.
9. Nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 donde el agente reticulante iónico es tripolifosfato.
10. Nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde además comprende un elemento (iii) el cual es al menos un polímero dotado de carga eléctrica opuesta a la del polímero de (i).
1 1 . Nanopartículas según la reivindicación 10 en la que el polímero del elemento (iii) es sulfato de dextrano o sulfato de condroitino.
12. Nanopartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 donde las nanopartículas se encuentran liofilizadas.
13. Uso de nanopartículas según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la elaboración de un medicamento.
14. Uso de nanopartículas según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina.
15. Uso de nanopartículas según la reivindicación 14 donde la mucosa es la mucosa ocular.
16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 donde la deficiencia de mucina es una deficiencia en MUC5AC.
17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 donde la enfermedad se selecciona de la lista que comprende síndrome de insuficiencia límbica, queratitis neurotrófica, queratitis herpética, quemadura por álcalis, quemadura térmica, quemadura por radiación, síndrome de Steven-Johnson, necrosis epidérmica tóxica, pénfigos, penfigoide de las membranas mucosas, alergias oculares, queratoconjuntivitis vernal, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis sicca o síndrome de ojo seco, conjuntivitis infecciosas, inmunes e irritativas-tóxico-medicamentosas, Síndrome de Sjógren primario o secundario a otras enfermedades autoinmunes, atopia, enfermedad injerto-contra huésped, hipofunción glandular salivar, xerostomía o ictiosis.
18. Uso según la reivindicación 17 donde la enfermedad es síndrome de ojo seco.
19. Composición farmacéutica que comprende nanopartículas según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19 que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
21 . Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 que además comprende otro principio activo.
22. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 para su administración vía mucosa ocular, mucosa del tracto gastrointestinal completo, mucosa de las vías respiratorias, la mucosa urinaria y la mucosa vaginal.
23. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, la cual se encuentra en forma liofilizada.
24. Uso de una composición farmacéutica según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 para la elaboración de un medicamento.
25. Uso de una composición según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad de una mucosa que cursa con una deficiencia de mucina.
26. Uso según la reivindicación 25 donde la mucosa es la mucosa ocular.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 25 ó 26 donde la deficiencia de mucina es una deficiencia en MUC5AC.
28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27 donde la enfermedad se selecciona de la lista que comprende síndrome de insuficiencia límbica, queratitis neurotrófica, queratitis herpética, quemadura por álcalis, quemadura térmica, quemadura por radiación, síndrome de Steven-Johnson, necrosis epidérmica tóxica, pénfigos, penfigoide de las membranas mucosas, alergias oculares, queratoconjuntivitis vernal, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis sicca o síndrome de ojo seco, conjuntivitis infecciosas, inmunes e irritativas-tóxico-medicamentosas, Síndrome de Sjógren primario o secundario a otras enfermedades autoinmunes, atopia, enfermedad injerto-contra huésped, hipofunción glandular salivar, xerostomía o ictiosis.
29. Uso según la reivindicación 28 donde la enfermedad es síndrome de ojo seco.
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