ES2945997T3 - Nanocomplejos aniónicos para la administración de ácidos nucleicos - Google Patents
Nanocomplejos aniónicos para la administración de ácidos nucleicos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2945997T3 ES2945997T3 ES19701001T ES19701001T ES2945997T3 ES 2945997 T3 ES2945997 T3 ES 2945997T3 ES 19701001 T ES19701001 T ES 19701001T ES 19701001 T ES19701001 T ES 19701001T ES 2945997 T3 ES2945997 T3 ES 2945997T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- viral delivery
- nucleic acid
- delivery complex
- cationic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 title claims abstract description 59
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 110
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 104
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 57
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 50
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 46
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 26
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 claims abstract description 26
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 24
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 42
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 16
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 15
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 8
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 8
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 claims description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 102000012605 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Human genes 0.000 claims description 4
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 claims description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 claims description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 18
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 36
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 27
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 11
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 8
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 7
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 6
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 6
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 6
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 6
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108700012912 MYCN Proteins 0.000 description 5
- 101150022024 MYCN gene Proteins 0.000 description 5
- 102000055056 N-Myc Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 4
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 3
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 239000010441 alabaster Substances 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 108010009779 peptide 32 Proteins 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000010408 film Substances 0.000 description 2
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 2
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002479 lipoplex Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 2,2-diaminobutanoic acid Chemical group CCC(N)(N)C(O)=O BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SKWCZPYWFRTSDD-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(azaniumyl)propanoate;chloride Chemical compound Cl.NCC(N)C(O)=O SKWCZPYWFRTSDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical group NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROFNJLCLYMMXCT-UHFFFAOYSA-N 4-aminohexanoic acid Chemical group CCC(N)CCC(O)=O ROFNJLCLYMMXCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QSXYZCXVYQFQAV-UHFFFAOYSA-N C(CCCCCCCCCCCCC)C(N(C)C)CCCCCCCCCCCCCC Chemical compound C(CCCCCCCCCCCCC)C(N(C)C)CCCCCCCCCCCCCC QSXYZCXVYQFQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025678 Ciliary Motility disease Diseases 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001064302 Homo sapiens Lipase member I Proteins 0.000 description 1
- 101001124991 Homo sapiens Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102100030659 Lipase member I Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- ZQAIPBAXQBMAKA-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethyltritriacontan-17-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(CCCCCCCCCCCCCCCC)N(C)C ZQAIPBAXQBMAKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000006453 Phyllogeiton discolor Nutrition 0.000 description 1
- 244000305961 Phyllogeiton discolor Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002560 Polyethylene Glycol 3000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002593 Polyethylene Glycol 800 Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 210000005058 airway cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000254 ciliated cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001246 colloidal dispersion Methods 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N ctk5a5089 Chemical compound NCC(O)=O.NCC(O)=O GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 210000004920 epithelial cell of skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055708 human NOS2 Human genes 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 125000002524 organometallic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 1
- 201000009266 primary ciliary dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- SRLOHQKOADWDBV-NRONOFSHSA-M sodium;[(2r)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl] 2-(2-methoxyethoxycarbonylamino)ethyl phosphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCCNC(=O)OCCOC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC SRLOHQKOADWDBV-NRONOFSHSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002105 tongue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Un complejo de administración no viral que comprende un núcleo catiónico que es una nanopartícula que comprende un péptido que tiene un componente de unión a ácido nucleico policatiónico, un elemento espaciador escindible y un componente de unión al receptor de la superficie celular; un ácido nucleico y opcionalmente un lípido catiónico; y un recubrimiento liposomal aniónico que rodea el núcleo catiónico, comprendiendo dicho recubrimiento lípidos de las células de un sujeto. También formulaciones relacionadas, usos y métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Nanocomplejos aniónicos para la administración de ácidos nucleicos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nanocomplejos no virales adecuados para la administración de materiales biológicamente activos, por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas o moléculas pequeñas, a una célula, y al uso de tales complejos, por ejemplo, en profilaxis, tratamiento y vacunación o investigación de laboratorio in vitro.
Antecedentes de la invención
La administración de genes para terapia u otros fines es bien conocida, particularmente para el tratamiento de enfermedades tales como la fibrosis quística y determinados cánceres. El término se refiere a la administración en una célula de un gen o parte de un gen para corregir alguna deficiencia o defecto. En la presente memoria descriptiva, el término también se usa para hacer referencia a cualquier introducción de material de ácido nucleico en las células diana, e incluye la vacunación génica y la producción in vitro de proteínas comercialmente útiles en las denominadas fábricas de células.
Los sistemas de administración de células se dividen en tres grandes clases, concretamente, los que implican la inyección directa de ADN o ARN desnudo, los que usan virus o virus genéticamente modificados y los que usan agentes de administración no virales. Cada uno tiene sus ventajas y desventajas. Aunque los virus como agentes de administración tienen las ventajas de una alta eficiencia y una alta selectividad celular, tienen las desventajas de la toxicidad, la producción de respuestas inflamatorias y la dificultad para tratar fragmentos grandes de ADN.
En el contexto del tratamiento del cáncer, también puede ser apropiado administrar un gen, u otro compuesto, que no trata de corregir la célula cancerosa defectuosa sino destruirla. Obviamente, en el tratamiento del cáncer, a menudo es especialmente importante que el agente terapéutico se dirija selectivamente a las células cancerosas apropiadas para minimizar el daño a otros tejidos.
Los sistemas de administración de genes no virales se basan en la compactación del material genético en partículas nanométricas mediante la interacción electrostática entre la estructura principal de fosfato cargado negativamente del ADN o el ARN y los lípidos catiónicos, péptidos u otros polímeros (Erbacher, P. et al., Gene Therapy, 1999, 6, 138-145). El uso de vectores de transfección no virales que incluyen lípidos, a diferencia de los virus, puede dar como resultado una menor toxicidad, especialmente una menor inmunogenicidad; mayor seguridad; coste reducido, direccionamiento razonablemente eficiente y una capacidad de empaquetado mejorada, por ejemplo, la capacidad de tratar con grandes fragmentos de material de ácido nucleico. Desafortunadamente, se han observado eficiencias de transfección más bajas. Los vectores de terapia génica no virales han sido objeto de revisiones recientes: (Yin H, Kanasty RL, Eltoukhy AA, Vegas AJ, Dorkin Jr , Anderson DG. Non-viral Vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 2014;15:541-55; Schroeder A, Levins CG, Cortez C, Langer R, Anderson DG. Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery. J Intern Med.
2010;267:9-21; Zhao Y, Huang L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Adv Genet. 2014;88:13-36.
Los complejos conocidos para la administración de genes incluyen lipoplejo para complejos de ácidos nucleicos basados en lípidos, poliplejo para complejos basados en péptidos o polímeros y lipopoliplejo para sistemas híbridos (Felgner et al., Human Gene Therapy 8, 1997, 511-512). Tal como se usa en el presente documento, el término “LPD” es una forma de lipopoliplejo que representa una formulación que comprende un lípido, un péptido de unión a integrina (u otro receptor) y a Dn (u otro ácido nucleico). Los complejos de LPD logran la transfección a través de una ruta mediada por integrina o por otro receptor; no es necesario que tengan una carga positiva general para que pueda reducirse la interacción sérica indeseable. El componente peptídico proporciona una función de empaquetamiento de ácido nucleico, protegiendo al ADN o al a Rn de la degradación intracelular o extracelular, endosomal o de otro tipo. Los componentes lipídicos median en las interacciones con las bicapas lipídicas endosómicas mediante la fusión o permeabilización de la membrana, lo que reduce la degradación endosomal o lisosomal y permite el tráfico de la carga de ácido nucleico en el citoplasma. El componente peptídico puede diseñarse para que sea específico del tipo de célula o específico del receptor de la superficie celular. Por ejemplo, el grado de especificidad por la integrina u otros receptores puede conferir un grado de especificidad celular al complejo LPD. La especificidad resulta del direccionamiento a los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptores de integrina), y pueden lograrse eficiencias de transfección comparables a las de algunos vectores adenovirales. (Du Z, Munye MM, Tagalakis AD, Manunta MD, Hart SL. The role of the helper lipid on the DNA transfection efficiency of lipopolyplex formulations. Sci. Rep. 2014;4:7107; Welser K, Campbell F, Kudsiova L, Mohammadi A, Dawson N, Hart SL, et al. Gene delivery using ternary lipopolyplexes incorporating branched cationic peptides: the role of Peptide sequence and branching. Mol.
2013;10:127-41; Meng QH, Irvine S, Tagalakis Ad , McAnulty RJ, McEwan JR, Hart SL. Inhibition of neointimal hyperplasia in a rabbit vein graft model following non-viral transfection with human iNOS cDNA. Gene Ther.
2013;20:979-86; Manunta MD, McAnulty RJ, McDowell A, Jin J, Ridout D, Fleming J, et al. Airway deposition of nebulized gene delivery nanocomplexes monitored by radioimagin agents. Am J Respir Cell Mol Biol.
2013;49:471-80; Kenny GD, Bienemann AS, Tagalakis AD, Pugh JA, Welser K, Campbell F, et al. Multifunctional receptor-targeted nanocomplexes for the delivery of therapeutics nucleic acids to the brain. Biomaterials.
2013;34:9190-200; Tagalakis AD, Hc L, Saraiva L, Gustafsson KT, Hart SL. Receptor-targeted liposomepeptide nanocomplexes for siRNA delivery. Biomaterials. 2011;32:6302-15; Tagalakis AD, Grosse SM, Meng QH, Mustapa MF, Kwok A, Salehi SE, et al. Integrin-targeted nanocomplexes for tumour specific delivery and therapy by systemic administration. Biomaterials. 2011;32:1370-6; Manunta MD, McAnulty R1 , Tagalakis AD, Bottoms SE, Campbell F, Hailes HC, et al. Nebulisation of receptor-targeted nanocomplexes for gene delivery to the airway epithelium. PLoS One. 2011;6:e26768; Grosse Sm , Tagalakis AD, Mustapa MF, Elbs M, Meng QH, Mohammadi A, et al. Tumor-specific gene transfer with receptor-mediated nanocomplexes modified by polyethylene glycol shielding and endosomally cleavable lipid and peptide linkers. FASEB J. 2010;24:2301-13.
Se han informado péptidos que se dirigen a células epiteliales de las vías respiratorias humanas (WO02/072616). Se han informado péptidos que se dirigen a células dendríticas (documento WO2004/108938).
Los vectores de lípidos/péptidos transfectan una variedad de líneas celulares y cultivos celulares primarios con alta eficiencia y baja toxicidad: células epiteliales (40 % de eficiencia), células del músculo liso vascular (50 % de eficiencia), células endoteliales (30 % de eficiencia) y células hematopoyéticas (10 % de eficiencia). Además, se ha demostrado la transfección in vivo del epitelio bronquial del ratón (Manunta MD, McAnulty RJ, Tagalakis AD, Bottoms SE, Campbell F, Hailes HC, et al. Nebulisation of receptor-targeted nanocomplexes for gene delivery to the airway epithelium. PLoS One. 2011;6:e26768; Tagalakis AD, McAnulty RJ, Devaney J, Bottoms SE, Wong JB, Elbs M, et al., A receptor-targeted nanocomplex vector system optimized for respiratory gene transfer. Mol. Ther. 2008;16:907-15. Jenkins et al., Formation of LID vector complexes in water alters physicochemical properties and enhances pulmonary gene expression in vivo, Gene Therapy 2003, 10, 1026-34), pulmón de rata (Jenkins et al., An integrin-targeted non-viral vector for pulmonary gene therapy, Gene Therapy 2000, 7, 393-400) y pulmón de cerdo (Manunta MD, McAnulty RJ, McDowell A, Jin J, Ridout D, Fleming J, et al. Airway deposition of nebulized gene delivery nanocomplexes monitored by radioimaging agents. Am J Respir Cell Mol Biol.
2013;49:471-80; Cunningham et al., Evaluation of a porcine model for pulmonary gene transfer using a novel synthetic vector, J. Gene Med 2002, 4, 438-46) y con una eficiencia comparable a la de un vector adenoviral (Jenkins et al., 2000, tal como anteriormente).
Las formulaciones de vectores de lípidos no virales que complejan ácido nucleico con lípidos catiónicos tienen problemas de penetración tisular deficiente, unión a células mediada por carga no específica e interacciones con proteínas séricas que pueden conducir a respuestas inflamatorias. El uso de un lípido aniónico como alternativa es atractivo porque ofrece la posibilidad de una citotoxicidad más baja, más especificidad de direccionamiento y menos interacción con los componentes séricos. Sin embargo, debido a que los componentes del vector aniónico y el ácido nucleico tienen ambos una carga negativa, es difícil hacer complejos que comprendan estos dos componentes debido a los desafíos inherentes para lograr el autoensamblaje de los complejos.
Las nanopartículas lipídicas catiónicas de la técnica anterior pueden denominarse vectores LPD o LPR, que significan, respectivamente, “liposoma, policatión, ADN” y “liposoma, policatión, ARN”. La presente invención se basa en la producción de lo que podría llamarse nanopartículas de péptidos y lípidos de “doble capa” que consisten en un ácido nucleico y un núcleo de lípido catiónico (que puede ser un núcleo de LPD o LPR convencional hecho de un liposoma catiónico, un péptido catiónico y el ácido nucleico de interés) y un liposoma pegilado aniónico adicional añadido que recubre las nanopartículas de núcleo para formar una nanopartícula de doble capa (por ejemplo, una nanopartícula LPDL o LPRL). Estos nanocomplejos aniónicos pegilados son estables en el suero y muestran una mayor eficiencia de transfección que las nanopartículas aniónicas y muestran una especificidad dirigida al receptor mucho mayor en comparación con sus contrapartes catiónicas. Esto contrasta con las nanopartículas sintéticas catiónicas en las que la pegilación normalmente reduce la eficiencia de transfección.
Los lípidos aniónicos usados para aplicar el recubrimiento aniónico final a la nanopartícula usan lípidos que se producen de manera natural, incluyendo membranas celulares de los glóbulos blancos o los exosomas, para crear nanopartículas aniónicas. El uso de lípidos de células derivadas de donantes, exosomas u otras fuentes, tales como glóbulos rojos o plaquetas, ofrece la oportunidad para el desarrollo de nanomedicinas personalizadas con propiedades de direccionamiento a tejidos específicos. Se ha demostrado el uso de glóbulos blancos y lípidos derivados de exosomas en transfecciones in vitro.
También se demuestra según la invención que los nanocomplejos de la invención muestran una capacidad superior para penetrar a través de la mucosa, lo que los hace especialmente prometedores como agentes para administrar agentes de terapia génica a las células de las vías respiratorias de sujetos que tienen fibrosis quística porque tales individuos tienen niveles anómalamente altos de mucosidad en sus pulmones.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un complejo de administración no viral que, comprende:
A, un núcleo catiónico que es una nanopartícula que comprende: (i) un péptido de fórmula A-B-C en la que A es un componente de unión a ácido nucleico policatiónico, B es un elemento espaciador que es susceptible de escisión dentro de una célula y C es un componente de unión al receptor de la superficie celular, (ii) un ácido nucleico y (iii) un lípido catiónico.
B, un recubrimiento aniónico que es un liposoma que rodea el núcleo catiónico y que comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células de un sujeto, opcionalmente glóbulos rojos o exosomas.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el complejo de administración no viral del primer aspecto de la invención mezclado o junto con un portador farmacéuticamente adecuado.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para elaborar un complejo de administración no viral, que comprende:
A, elaborar un núcleo catiónico que es una nanopartícula que comprende: (i) un péptido de fórmula A-B-C en la que A es un componente de unión a ácido nucleico policatiónico, B es un elemento espaciador que es susceptible de escisión dentro de una célula, y C es un componente de unión al receptor de la superficie celular, (ii) un ácido nucleico y (iii) un lípido catiónico.
B, añadir un recubrimiento aniónico que es un liposoma que rodea el núcleo catiónico y que comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células del sujeto y, opcionalmente glóbulos rojos o exosomas.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un complejo de administración no viral, o una composición farmacéutica, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una afección provocada en un sujeto por un defecto y/o una deficiencia en un gen o para inmunización terapéutica o profiláctica, o para terapia antisentido o ARNi. En el presente documento se da a conocer, pero no forma parte de la invención reivindicada, un quinto aspecto que proporciona un método para el tratamiento de un sujeto que padece cáncer que comprende administrar un complejo de administración no viral del primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención al sujeto.
En un sexto aspecto, la invención proporciona el uso de un complejo de administración no viral del primer aspecto de la invención o composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención para su uso en el tratamiento o la profilaxis de cáncer en un sujeto.
En un séptimo aspecto, la invención proporciona un complejo de administración no viral para su uso como medicamento que comprende:
A, un núcleo catiónico que es una nanopartícula que comprende: (i) un péptido de fórmula A-B-C en la que A es un componente de unión a ácido nucleico policatiónico, B es un elemento espaciador que es susceptible de escisión dentro de una célula y C es un componente de unión al receptor de la superficie celular, (ii) un ácido nucleico y (iii) un lípido catiónico.
B, un recubrimiento aniónico que es un liposoma que rodea el núcleo catiónico y que comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células de un sujeto, opcionalmente glóbulos rojos o exosomas, opcionalmente en el que el complejo de administración no viral tiene uno o más de las características adicionales del primer aspecto.
En el presente documento se da a conocer, pero no forma parte de la invención reivindicada, un octavo aspecto que proporciona una composición farmacéutica que comprende un complejo de administración no viral según el séptimo aspecto.
Breve descripción de las figuras
• La figura 1 muestra los resultados de una comparación de estabilidad entre complejos de administración no virales de la invención y complejos de la técnica anterior tal como se evalúan por cambios en la turbidez en suero al 50 %.
• La figura 2 muestra los resultados de una comparación de estabilidad entre complejos de administración no virales de la invención y complejos de la técnica anterior en tampón PBS.
• La figura 3 muestra los resultados de un experimento de estabilidad de tamaño de partícula de hasta 4 horas para diversos complejos.
• La figura 4 muestra el resultado de un experimento para medir los cambios en el tamaño de partícula (como sustituto de la estabilidad) de diversas partículas de la invención tal como se describe en los ejemplos.
• La figura 5 muestra el potencial zeta de los complejos de administración de la invención.
• La figura 6 muestra el grado de la expresión génica tras la transfección del gen con diversos vectores.
• La figura 7 muestra el grado de la expresión génica después de la transfección de células con diversos vectores. Muestra los resultados de un experimento que replica el que produjo los resultados mostrados en la figura 6.
• La figura 8 muestra datos de citometría de flujo que miden la apoptosis.
• La figura 9 muestra el resultado de un experimento para comparar la eficacia de la translocación de un constructo genético de marcador de GFP.
• La figura 10 muestra los resultados de experimentos de estabilidad comparativa para diversos complejos. • La figura 11 muestra los resultados de experimentos de estabilidad comparativa para diversos complejos. • La figura 12 muestra los resultados de una comparación de las eficiencias de transfección tal como se evalúan usando un constructo indicador GFP. Las fotografías muestran imágenes de células N2A después de la transfección con un complejo de la invención que contiene el constructo indicador. La primera fotografía de cada par muestra campos de contraste de fase de las células y la segunda fotografía de cada par es una fotografía de fluorescencia que muestra (en verde en el original) células transfectadas que emiten luz verde.
• La figura 13 muestra datos de citometría de flujo de las mismas transfecciones celulares tal como se muestran en las imágenes de la figura 12.
• La figura 14 muestra fotografías de células de ratones portadores de tumores que ilustran que las nanopartículas de la invención pueden usarse para dirigirse a las células.
• La figura 15 muestra datos de citometría de flujo que comparan la especificidad de diferentes nanopartículas en a) células N2A, b) células H441 o c) células 16-Hb E.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un complejo de administración no viral que comprende: A, un núcleo catiónico que es una nanopartícula que comprende: (i) un péptido de fórmula A-B-C en la que A es un componente de unión a ácido nucleico policatiónico, B es un elemento espaciador que es susceptible de escisión dentro de una célula y C es un componente de unión al receptor de la superficie celular, (ii) un ácido nucleico y (iii) un lípido catiónico.
B, un recubrimiento aniónico que es un liposoma que rodea el núcleo catiónico y que comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células de un sujeto, opcionalmente glóbulos rojos o exosomas.
Preferiblemente, al menos una proporción del recubrimiento aniónico consiste en lípidos pegilados. Esos lípidos pueden producirse sintéticamente y pueden introducirse con grupos PEG ya unidos en la bicapa lipídica del recubrimiento catiónico. Alternativa o adicionalmente, pueden ser lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células del sujeto que han tenido grupos PEG unidos para convertirlos en derivados pegilados.
Según determinadas realizaciones, el recubrimiento aniónico es al menos el 50, el 60, el 70, el 80 o el 90 % (en peso) previamente extraído de las membranas plasmáticas de células humanas (especialmente células del sujeto que va a tratarse). En algunas realizaciones, al menos el 50, el 60, el 70, el 80 o el 90 % del recubrimiento aniónico puede extraerse de las membranas plasmáticas de células humanas (especialmente células del sujeto que va a tratarse) y la proporción restante del recubrimiento aniónico consiste en lípidos que se han pegilados. Las células humanas pueden ser células humanas primarias (por ejemplo, glóbulos rojos recién separados de un
sujeto) o pueden ser células humanas cultivadas. Los exosomas pueden obtenerse del plasma sanguíneo de un sujeto (o en algunas realizaciones de otro líquido corporal tal como orina, saliva o leche materna) o pueden obtenerse del sobrenadante de un cultivo celular. Las membranas plasmáticas pueden separarse de células humanas o exosomas mediante cualquier técnica convencional, por ejemplo, las descritas en H. Evans (Ed.), Biological Membranes. A Practical Approach, IRL Press, Washington, dC, 1987, págs. 1-35.
En los ejemplos en el presente documento se describe un método adecuado para obtener exosomas a partir de un cultivo celular.
Según algunas realizaciones, el núcleo catiónico comprende todos los componentes (i), (ii) y (iii).
Según algunas realizaciones, la razón de núcleo catiónico A con respecto a recubrimiento aniónico B está entre 2 y 50, por ejemplo, entre 5 y 40, 5 y 30, 8 y 25 o 10 y 20. Estas razones se calculan preferiblemente en peso. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar a un sujeto que comprende el complejo de administración no viral del primer aspecto de la invención mezclado o junto con un portador farmacéuticamente adecuado.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para elaborar un complejo de administración no viral para su uso en el tratamiento de un sujeto, que comprende:
A, elaborar un núcleo catiónico que es una nanopartícula que comprende: (i) un péptido de fórmula A-B-C en la que A es un componente de unión a ácido nucleico policatiónico, B es un elemento espaciador que es susceptible de escisión dentro de una célula y C es un componente de unión al receptor de la superficie celular, (ii) un ácido nucleico y (iii) un lípido catiónico.
B, añadir un recubrimiento aniónico que es un liposoma que rodea el núcleo catiónico y que comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de células de un sujeto (por ejemplo glóbulos rojos) o exosomas.
Preferiblemente, al menos una proporción de los lípidos del recubrimiento, ya sean lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células del sujeto, o lípidos de otra fuente mezclados con los mismos, son derivados pegilados.
Según algunas realizaciones, el núcleo catiónico comprende todos los componentes (i), (ii) y (iii).
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un complejo de administración no viral, o una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una afección provocada en un sujeto por un defecto y/o deficiencia en un gen o para inmunización terapéutica o profiláctica, o para terapia antisentido o ARNi.
En el presente documento se da a conocer, pero no forma parte de la invención reivindicada, un quinto aspecto que proporciona un método para el tratamiento de un sujeto que padece cáncer que comprende administrar un complejo de administración no viral del primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención al sujeto.
En un sexto aspecto, la invención proporciona el uso de un complejo de administración no viral del primer aspecto de la invención o composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención para su uso en el tratamiento o la profilaxis de cáncer en un sujeto.
En un séptimo aspecto, la invención proporciona un complejo de administración no viral para su uso como medicamento, que comprende:
A, un núcleo catiónico que es una nanopartícula que comprende: (i) un péptido de fórmula A-B-C en la que A es un componente de unión a ácido nucleico policatiónico, B es un elemento espaciador que es susceptible de escisión dentro de una célula y C es un componente de unión al receptor de la superficie celular, (ii) un ácido nucleico y (iii) un lípido catiónico.
B, un recubrimiento aniónico que es un liposoma que rodea el núcleo catiónico y que comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células de un sujeto, opcionalmente glóbulos rojos u opcionalmente exosomas, en el que el complejo de administración no viral tiene uno o más de las características adicionales del primer aspecto.
En el presente documento se da a conocer, pero no forma parte de la invención reivindicada, un octavo aspecto que proporciona una composición farmacéutica que comprende un complejo de administración no viral según el séptimo aspecto.
Debe entenderse que las características de la invención descritas con referencia a un aspecto también se contemplan para su uso con otros aspectos de la invención.
Lípidos catiónicos
Los lípidos catiónicos son lípidos con una carga global positiva en condiciones fisiológicas. Normalmente son derivados de ácidos grasos tales como triglicéridos, diglicéridos, monoglicéridos y fosfolípidos. Según algunas realizaciones de todos los aspectos de la invención, los lípidos contienen un grupo etanolamina que proporciona una carga positiva.
El lípido catiónico para su uso según la invención en todos sus aspectos preferiblemente comprende un catión de fórmula (1):
en la que R1 y R2 son cada uno independientemente una cadena de alquilo insaturado C10-22.
Ventajosamente, R1 y R2 son iguales o diferentes y son cada uno independientemente un grupo alquenilo insaturado C10-22 que incluye uno o dos dobles enlaces C=C insaturados, preferiblemente un doble enlace C=C. Los dobles enlaces C=C son preferiblemente cis-. Opcionalmente, R1 y R2 son cada uno independientemente un grupo alquenilo C12-20, por ejemplo, un grupo alquenilo C14-18. R1 y R2 tienen opcionalmente cadenas de alquilo lineales (es decir, no ramificadas). Por ejemplo, R1 y R2 pueden seleccionarse cada uno independientemente de grupos alquenilo de cadena lineal C12-20 que tienen un doble enlace C=C insaturado; o por ejemplo, R1 y R2 pueden seleccionarse cada uno independientemente de grupos alquenilo de cadena lineal C14-18 que tienen un doble enlace insaturado cis-C=C. Opcionalmente, R1 y R2 son iguales o diferentes y son cada uno independientemente un grupo alquenilo C14, C16 o C18 de cadena lineal insaturado que tiene un doble enlace. Opcionalmente, R1 y R2 se seleccionan de
-(CH2)6-12CH=CH(CH2)1-9CH3, especialmente -(CH2)7-nCH=CH(CH2)1-«CH3
o -(CH2)8-10CH=CH(CH2)1-7CH3, tal como -(CH2)10CH=CH(CH2)1CH3, -(CH2)8CH=CH(CH2)7CH
o -(CH2)10CH=CH(CH2)3CH3. Preferiblemente, el doble enlace es cis y R1 y R2 se seleccionan de -(CH2)6-12CH[Z]=CH(CH2)1-9CH3, especialmente -(CH2)7-nCH[Z]=CH(CH2)1-8CH3 o -(CH2)8-10[Z]CH=CH(CH2)wCH3, tal como -(CH2)10[Z]CH=CH(CH2)CH3 , -(CH2)8[Z]CH=CH(CH2)7CH3
o -(CH2)10[Z]CH=CH(CH2)3CH3. Preferiblemente, R1 y R2 son iguales.
Cada grupo R3 se selecciona independientemente de hidrógeno y alquilo C1-4. Preferiblemente, cada R3 se selecciona independientemente de hidrógeno o metilo. Cada R3 puede ser hidrógeno o cada R3 puede ser metilo. En una realización preferida, cada R3 es metilo.
Además del catión, los lípidos catiónicos pueden comprender un contraión, por ejemplo, un contraión inorgánico, especialmente un anión farmacéuticamente aceptable tal como cloruro o bromuro.
Ejemplos de cationes especialmente adecuados son DTDTMA (ditetradeciltrimetilamonio), DOTMA (2,3-dioleiloxipropil-1-trimentilamonio) y DHDTMA (dihexadeciltrimetilamonio). Los lípidos catiónicos que comprenden los cationes anteriores y los contraaniones de cloruro se ilustran a continuación:
Debe entenderse que el lípido catiónico según todos los aspectos de la invención puede no ser necesariamente el único lípido presente en el núcleo catiónico. También pueden estar presentes otros lípidos que pueden ser neutros, aniónicos o catiónicos. Preferiblemente, el/los lípido(s) catiónico(s) global(es) está(n) presente(s) como el lípido más predominante en el núcleo (en base de razón molar). Preferiblemente, al menos el 60, el 70, el 80, el 85 o el 90 % del lípido total presente en el núcleo catiónico es un lípido catiónico, por ejemplo, al menos el 60, el 70, el 80, el 85 o el 90 % del lípido total presente en el núcleo catiónico puede ser DTDTMA, DOTMA o DHDTMA o mezclas de los mismos.
Péptidos
El péptido para su uso según la invención en todos sus aspectos es de estructura A-B-C en la que:
A es un componente de unión a ácido nucleico policatiónico,
B es un elemento espaciador que comprende la secuencia de aminoácidos RVRR (SEQ ID NO: 1), y
C es un componente de unión al receptor de la superficie celular que comprende la secuencia de aminoácidos LX6HK en la que X6 es Q o P (SEQ ID NO: 2).
El componente de unión a ácido nucleico policatiónico A es cualquier policatión que pueda unirse a ADN o ARN. Un policatión puede ser policatiónico en sí mismo o puede tener cualquier número de monómeros catiónicos siempre que se conserve la capacidad de unirse a ADN o ARN. Por ejemplo, pueden estar presentes de 3 a 100 monómeros catiónicos, por ejemplo, de 10 a 20, por ejemplo de 14 a 18, por ejemplo, aproximadamente 16.
El término “componente de unión a ácido nucleico policatiónico” es bien conocido en la técnica y se refiere a polímeros que tienen al menos 3 residuos de aminoácidos catiónicos repetidos u otra unidad catiónica que porta grupos cargados positivamente, siendo tales polímeros capaces de formar un complejo con un ácido nucleico en condiciones fisiológicas. Un ejemplo de una molécula policatiónica que se une a un ácido nucleico es un oligopéptido que comprende uno o más aminoácidos catiónicos. Un oligopéptido de este tipo puede ser, por ejemplo, una molécula de oligo-lisina, una molécula de oligo-histidina, una molécula de oligo-arginina, una molécula de oligo-ornitina, una molécula de ácido oligo-diaminopropiónico o una molécula de ácido oligodiaminobutírico, o un oligómero combinado que comprende o consiste en cualquier combinación de restos de histidina, arginina, lisina, ornitina, ácido diaminopropiónico y ácido diaminobutírico. Cualquiera de los oligopéptidos anteriores puede tener, por ejemplo, un total de desde 3 hasta 35, por ejemplo, desde 5 hasta 25 residuos, preferiblemente desde 10 hasta 20 residuos, por ejemplo, desde 14 hasta 18 residuos, por ejemplo, 16 residuos.
Se prefiere particularmente una oligo-lisina, por ejemplo, que tiene de desde 3 hasta 35, por ejemplo, desde 2 hasta 25, por ejemplo, desde 10 hasta 20 residuos de lisina, por ejemplo, desde 13 hasta 19, por ejemplo, desde 14 hasta 18, por ejemplo, desde 15 hasta 17 residuos, por ejemplo, 16 residuos, es decir, [K]16, “K” indica lisina (SEQ ID NO: 3).
Otros ejemplos de componentes policatiónicos incluyen dendrímeros y polietilenimina. La polietilenimina (PEI) es un polímero catiónico reticulado no tóxico con potencial de administración de genes (Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, 92, 7297-7301). La polietilenimina puede obtenerse de Fluka (800 kDa) o de Sigma (50 kDa) o, alternativamente, prediluirse para fines de transfección de PolyPlus-tranfection (Illkirch, Francia). Normalmente, PEI es más eficiente cuando se usa en un exceso de 9 veces con respecto al ADN, calculándose la razón de exceso como nitrógeno de PEI: fosfato de ADN, y a un pH de 5 a 8. Tales parámetros pueden optimizarse de una manera familiar para el experto en la técnica.
El péptido de elemento espaciador B comprende ventajosamente tres o más aminoácidos, por ejemplo, cuatro o más, por ejemplo, cinco o más, por ejemplo, diez aminoácidos o más, por ejemplo, hasta doce aminoácidos. El elemento espaciador puede comprender, por ejemplo, desde 4 hasta 10 aminoácidos, tal como desde 6 hasta 8 aminoácidos. Los aminoácidos pueden producirse de manera natural o no producirse de manera natural. Pueden tener configuración L o D. Los aminoácidos pueden ser iguales o diferentes, pero generalmente debe evitarse el uso de múltiples residuos de lisina (u otros aminoácidos catiónicos adecuados para su uso en el componente de unión a ácido nucleico policatiónico de un complejo de vector) en el espaciador ya que secuencias de oligo-lisina tienen actividad como componente de unión a ácido nucleico policatiónico.
El péptido de elemento espaciador B incluye ventajosamente una porción escindible que es susceptible de escindirse dentro de una célula. Un péptido de elemento espaciador B que incluye una porción escindible que es
susceptible de escisión dentro de una célula puede ser susceptible de escisión dentro del endosoma, lisosoma y/o citoplasma de una célula. En el presente documento, por susceptible de escisión se entiende que el elemento es susceptible de escisión durante una escala de tiempo durante la cual los componentes A y C permanecen intactos. El elemento B se escinde más rápidamente de lo que tienen efecto las rutas de degradación de los péptidos celulares. La porción escindible normalmente incluye de desde 3 hasta 6 aminoácidos, por ejemplo, 4 aminoácidos. El elemento espaciador B incluye ventajosamente la secuencia de aminoácidos RVRr como porción escindible. La secuencia de aminoácidos RVRR es susceptible de escisión enzimática por la proteasa endosomal furina. Ventajosamente, la porción escindible del péptido de elemento espaciador B está unida al componente de unión al ácido nucleico A.
El péptido de elemento espaciador B puede comprender adicionalmente un ligador, que es preferiblemente o bien un péptido, es decir, comprende residuos de aminoácidos, o bien un grupo de polietilenglicol, o una mezcla de los dos. Los aminoácidos pueden producirse de manera natural o no producirse de manera natural. Pueden tener configuración L o D. El ligador puede tener dos o más aminoácidos. Puede comprender, por ejemplo, tres o más aminoácidos, por ejemplo, cuatro o más, por ejemplo, cinco o más, por ejemplo, hasta diez aminoácidos. El ligador normalmente incluye de desde 2 hasta 7 aminoácidos, por ejemplo desde 3 hasta 5 aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser iguales o diferentes. El ligador puede comprender, por ejemplo, el dipéptido glicinaglicina (GG) o glicina-alanina (GA). El ligador puede comprender un espaciador hidrófobo. El ligador puede incluir la secuencia de aminoácidos XSX en la que X es ácido g-aminocaproico (g-Ahx), también conocido como ácido 6-aminohexanoico, un aminoácido sintético, es decir, que no se produce de manera natural. El ácido aminocaproico funciona como un espaciador hidrófobo. Los ejemplos de ligadores adecuados incluyen GG, GA, XSXGG (SEQ ID NO: 4) y XSXGA (SEQ ID NO: 5). Los ligadores particularmente preferidos son XSXGA (SEQ ID NO: 5) y GA. Preferiblemente, el ligador está al final del péptido de elemento espaciador B que está unido al componente de unión al receptor de la superficie celular C.
El péptido de elemento espaciador B comprende ventajosamente una porción escindible que comprende la secuencia RVRR (SEQ ID NO: 1) que está unida al componente de unión al ácido nucleico A y un ligador que está unido al componente de unión al receptor de la superficie celular C. El elemento espaciador B puede, por ejemplo, incluir o consistir en la secuencia de aminoácidos RVRR (SEQ ID NO: 1), RVRRGA (SEQ ID NO: 6), RVRRGC (SEQ ID NO: 7), RVRRXSX (SEQ ID NO: 8), RVRRXSXGA (SEQ ID NO: 9) o RVRRXSXGC (SEQ ID NO: 10), especialmente RVRRGA (SEQ ID NO: 6) o RVRRXSXGA (SEQ ID NO: 9).
Preferiblemente, el componente de unión al receptor de la superficie celular C comprende un péptido. Cuando el componente de unión al receptor de la superficie celular C comprende un péptido, el péptido puede tener una longitud de hasta 20 aminoácidos, o puede ser más largo. El péptido generalmente tiene al menos 5 aminoácidos pero puede tener menos. Generalmente, el péptido tiene cualquier número de aminoácidos de desde 6 hasta 20 inclusive. Generalmente, se prefiere que el péptido tenga 15 aminoácidos o menos, más preferiblemente 12 aminoácidos o menos. Generalmente, se prefiere que el péptido tenga 5 o más aminoácidos, por ejemplo, 6 o más aminoácidos. Lo más preferiblemente, el péptido tiene de 7 a 10 aminoácidos.
El componente de unión al receptor de la superficie celular C comprende una porción de unión al receptor que comprende una secuencia de aminoácidos que se une a los receptores de la superficie celular. El componente de unión al receptor de la superficie celular C comprende ventajosamente una porción de unión al receptor que puede unirse a las células epiteliales de las vías respiratorias humanas (HAE). Los ejemplos de péptidos de unión a células HAE se describen en el documento WO 02/072616. La porción de unión al receptor comprende opcionalmente la secuencia de aminoácidos LX6HK en la que X6 es Q o P (SEQ ID NO: 2). Preferiblemente X6 es P. El componente de unión al receptor de la superficie celular C comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos YGLPHKF (SEQ ID NO: 11).
El componente de unión al receptor de la superficie celular C comprende ventajosamente un péptido que comprende una región cíclica. Los péptidos cíclicos pueden formarse mediante la provisión de al menos dos residuos de cisteína en el péptido, lo que permite la formación de un enlace disulfuro. Por consiguiente, los componentes de unión al receptor de la superficie celular C preferidos consisten en o comprenden un péptido que tiene dos o más residuos de cisteína que pueden formar uno o más enlaces disulfuro. Preferiblemente, los residuos de cisteína flanquean la porción de unión al receptor primario.
El componente de unión al receptor de la superficie celular C comprende opcionalmente la secuencia de aminoácidos CYGLPHKFCG (SEQ ID NO: 12).
El péptido de estructura A-B-C puede comprender, por ejemplo, un policatión de unión a ácido nucleico, tal como polilisina, unido a RVRR (SEQ ID NO: 1), la porción escindible de un elemento espaciador, seguido de una porción ligadora que comprende la secuencia de aminoácidos XSXGA (SEQ ID NO: 5) o GA unida a un componente de unión al receptor de la superficie celular YGLPHKF (SEQ ID NO: 11), opcionalmente flanqueado por dos residuos de cisteína.
Los péptidos particulares adecuados para su uso según la invención son:
Péptido 35: K16-RVRR-XSXGA-CYGLPHKFCG (SEQ ID NO: 13); y
Péptido 32: K16-RVRR-GA-CYGLPHKFCG (SEQ ID NO: 14).
Recubrimiento aniónico
El recubrimiento aniónico según la presente invención en todos sus aspectos es preferiblemente un liposoma de bicapa lipídica que comprende lípidos aniónicos. Se entiende que el recubrimiento aniónico no necesita comprender exclusivamente lípidos aniónicos, sino simplemente que el número de cargas negativas de lípidos aniónicos en el recubrimiento es mayor que el número de cargas positivas en otros lípidos del recubrimiento aniónico.
Según la invención, el recubrimiento aniónico comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células del sujeto, por ejemplo glóbulos rojos o exosomas o derivados de los mismos. En algunas realizaciones, los lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células del sujeto constituyen al menos el 50 % (por ejemplo, al menos el 60, el 70, el 80 o el 90 %) de los lípidos del recubrimiento aniónico en peso. El lípido extraído de una fuente de este tipo puede purificarse sustancialmente o puede permanecer mezclado con otros componentes de la membrana plasmática (por ejemplo, proteínas y azúcares). Según algunas realizaciones, el recubrimiento aniónico es sustancialmente (por ejemplo, al menos el 50, el 60, el 70, el 80 o el 90 %) membrana plasmática “en bruto” tal como se extrae de una célula o exosoma. Si ese es el caso, se apreciará que los componentes no lipídicos tienen potencial antigénico y, por tanto, se prefiere que la célula o el exosoma sea autólogo (es decir, obtenido del sujeto individual al que va a administrarse el complejo de administración no viral).
En algunas realizaciones, el recubrimiento aniónico comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática del mismo tipo celular que el que va a ser la diana del complejo de administración viral. En algunas realizaciones, la membrana plasmática puede extraerse directamente de las células. En otras realizaciones, las células pueden multiplicarse en primer lugar en cultivo antes de recoger su membrana plasmática. En otras realizaciones, la membrana plasmática puede recogerse de exosomas vertidos en un medio en el que se han cultivado células o extraerse de material acelular recogido de un sujeto (por ejemplo, del plasma sanguíneo de un sujeto). En algunas realizaciones, la membrana plasmática puede recogerse de un sujeto diferente del sujeto que va a tratarse. En otras realizaciones, la membrana plasmática puede recogerse del mismo sujeto que el que va a tratarse.
Debe entenderse que el lípido aniónico según todos los aspectos de la invención puede no ser necesariamente el único lípido presente en el recubrimiento de lípido aniónico. También pueden estar presentes otros lípidos que sean neutros, aniónicos o catiónicos. Sin embargo, debe predominar una carga negativa global en los lípidos del recubrimiento aniónico. La preponderancia de lípidos cargados negativamente en las membranas plasmáticas asegurará una carga negativa general.
El recubrimiento catiónico consiste principalmente en lípido, pero puede contener otro material, por ejemplo, material derivado de la célula o exosomas en los que el lípido se extrae de un plasmalema. Preferiblemente, al menos el 70, el 80 o el 90 % en peso del recubrimiento catiónico es lípido. Preferiblemente, al menos el 2, el 3 o el 5 % (en peso o razón molar) del lípido del recubrimiento catiónico es lípido pegilado. El lípido pegilado puede ser una fracción del lípido extraído de un plasmalema, pero en la mayoría de las realizaciones será un lípido prepegilado mezclado con lípido extraído de un plasmalema.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención implican el uso de lípidos que se han extraído previamente (es decir, no se reivindica la etapa de extraer el lípido). En otras realizaciones, los métodos de la invención incluyen la etapa adicional de extraer el lípido pero no reivindican las etapas de obtener las células del sujeto. En otras realizaciones, los métodos de la invención incluyen las etapas de obtener células del sujeto y extraer el lípido de la membrana plasmática de esas células.
Pegilación
El recubrimiento aniónico comprende preferentemente lípidos pegilados. La pegilación es el procedimiento de unión covalente de polietilenglicol (PEG) a un lípido. Pueden usarse PEG de diversas longitudes según todos los aspectos de la invención. Por ejemplo, la invención en todos los aspectos puede usar de PEG 500 a PEG 5000, por ejemplo, de PEG 700 a PeG 4000, por ejemplo, de PEG 800 a PEG 3000, por ejemplo, de PEG 1000 a PEG 2500, por ejemplo, de PEG 1800 a p Eg 2200 (según por convención, el número designa el peso molecular promedio de la molécula de PEG). Según la invención, los lípidos pegilados pueden introducirse en la bicapa lipídica aniónica del recubrimiento de la partícula mezclando lípidos prepegilados, por ejemplo, PEG2000-DPPE, PEG2000-DOPE, PEG2000-DSPE, en una bicapa lipídica formada a partir de lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática. Alternativa o adicionalmente, los lípidos de la membrana plasmática. En cualquier
caso, la proporción de moléculas pegiladas puede ser preferiblemente de al menos el 2, el 5, el 10, el 20 o el 30 % del número total de moléculas lipídicas según determinadas realizaciones. En otras realizaciones, no se pegilan más del 1, el 2 o el 3 % del número total de moléculas lipídicas. En algunas realizaciones, el número total de moléculas lipídicas que están pegiladas se encuentra entre el 1 y el 5 %, por ejemplo, entre el 1 y el 3 % o entre el 1 y el 2 % o entre el 1,5 y el 3 %. La pegilación del recubrimiento puede llevarse a cabo usando cualquier método disponible comercialmente, por ejemplo, por coformulación usando lípidos en evaporación rotatoria para producir liposomas mediante una película delgada o mediante un procedimiento de deshidratación/rehidratación. La pegilación normalmente aumenta la semivida del complejo in vivo. En la mayoría de las realizaciones, los lípidos pegilados se añadirán al recubrimiento aniónico mezclando los lípidos prepegilados con el resto de los componentes del recubrimiento. Los lípidos pegilados suelen ser solubles en agua, pero debido a que el componente lipídico del lípido pegilado se estabiliza cuando se inserta en una bicapa lipídica, es posible añadir lípidos pegilados a un recubrimiento aniónico de bicapa de liposomas según la invención simplemente añadiendo lípidos pegilados a la disolución acuosa en la que se suspenden los complejos nacientes de la invención Puede usarse cualquier método disponible de pegilación de lípidos según todos los aspectos de la invención. Una variedad de agentes de pegilación están disponibles comercialmente, por ejemplo, de ThermoScientific. Ácido nucleico
Según determinadas realizaciones, el ácido nucleico es un ARNm. Según otras realizaciones, es un ARN de interferencia (ARNi). El ARNi puede ser micro ARN de interferencia (miARN) o ARN de interferencia pequeño (ARNip). En algunas realizaciones, el ARNi puede ser antiviral o anticancerígeno. Por ejemplo, puede ser un ARNip que silencia un gen regulado por incremento de manera diferencial en células cancerosas.
Según determinadas realizaciones, el ácido nucleico puede tener una longitud de entre 15 y 30 pares de bases, o entre 50 y 500 pares de bases (por ejemplo, una longitud de entre 18 y 28, 60 y 400, 200 y 500, 300 y 500 pares de bases). El ARN puede ser monocatenario o bicatenario.
Según otras realizaciones, el ácido nucleico es ADN.
Según realizaciones relacionadas con el tratamiento de la fibrosis quística, el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica para el regulador de conductancia transmembranario de fibrosis quística (CFTR), opcionalmente unida operativamente a una secuencia promotora activa en células epiteliales de pulmón humano. En tales realizaciones, el componente de unión a la superficie celular preferiblemente se une a la superficie celular de las células epiteliales de pulmón humano. En tales realizaciones, el recubrimiento aniónico comprende preferiblemente una composición lipídica en la que dichos lípidos varían de la composición lipídica del plasmalema de las células epiteliales de pulmón humano en no más del 20 %. Opcionalmente, el recubrimiento aniónico puede derivarse, al menos en parte, de células epiteliales de pulmón humano (por ejemplo, una línea celular de epitelio de pulmón humano o un cultivo primario, que opcionalmente puede ser autólogo con el sujeto que va a tratarse).
Tamaño de partícula del complejo de administración no viral
Se prefiere según todos los aspectos de la invención que los complejos de administración no virales tengan un tamaño de partícula de menos de 500 nm, por ejemplo, menos de 250 nm, por ejemplo, menos de 100 nm. En una población de partículas habrá alguna variación en el tamaño de partícula, pero los criterios anteriores se considerarán cumplidos si al menos el 80 % de las partículas son de menos de 500 nm, por ejemplo, menos de 250 nm, por ejemplo, menos de 100 nm.
Portadores farmacéuticos
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender complejos de administración no virales de la invención mezclados con un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un excipiente adecuado para una vía de administración específica. La composición también puede proporcionarse en un dispositivo adecuado de almacenamiento o administración. Por ejemplo, la composición puede formularse con excipientes (por ejemplo, polvos y/o propulsores de aerosoles) adecuados para administración por inhalación para administración a los pulmones. En tales realizaciones, puede envasarse opcionalmente en un bote de inhalador. Puede formularse en una disolución para inyección i.v. y, opcionalmente, envasarse en una jeringa u otro dispositivo de inyección. Puede formularse en forma de crema, ungüento o loción para administración sobre la piel u otra superficie corporal o puede formularse para inyección intratumoral o intraperitoneal.
Enfermedades que van a tratarse
Las enfermedades específicas contempladas para su tratamiento mediante los complejos de administración no virales y/o las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen enfermedades respiratorias que incluyen fibrosis quística, discinesia ciliar primaria, EPOC y asma, y también cáncer tanto del sistema respiratorio como en
otros sitios del cuerpo. Según todos los aspectos de la invención, el componente de unión al receptor de la superficie celular puede seleccionarse opcionalmente para unirse a un tipo de célula elegido con referencia a la enfermedad que va a tratarse. Según algunas realizaciones, el tipo de célula es un tipo de célula epitelial, por ejemplo, un tipo de célula epitelial respiratoria tal como una célula columnar ciliada, una célula caliciforme o una célula basal; un tipo de células epiteliales de la piel, un tipo de células epiteliales nasales o intestinales, o un tipo de células epiteliales de los vasos sanguíneos, glándulas submandibulares, encías, lengua, paladar, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, recto, ano, vesícula biliar, tiroides, vaso linfático, piel, mesotelio, ovarios, trompas de Falopio, endometrio uterino, cuello uterino, vagina, epidídimo, conducto deferente, laringe, tráquea, riñón, próstata, nariz o córnea.
Ejemplos
A menos que se indique lo contrario, los disolventes y los reactivos para la síntesis eran de calidad para reactivo de proveedores comerciales y se usaron sin purificación adicional. Se obtuvo CH2Cl2 seco usando columnas de alúmina anhidra usando el procedimiento descrito en Pangborn, AB; Giardello, MA; Grubbs, R. H.; Rosen, R. K.; Timmers, F. J. Organometallics 1996, 15, 1518-1520. Todas las reacciones sensibles a la humedad se realizaron bajo una atmósfera de nitrógeno o argón usando objetos de cristal secados al horno. Las reacciones se monitorizaron mediante CCF en placas de F254 Kieselgel 60 con detección por UV, tinciones con permanganato de potasio y ácido fosfomolíbdico. La cromatografía en columna ultrarrápida se llevó a cabo usando gel de sílice (tamaño de partícula 40-63 μm). Se registraron los espectros de 1H RMN de H y 13C RMN en máquinas Bruker AMX300 MHz, Avance-500 MHz y Avance-600 MHz. Las constantes de acoplamiento se miden en hercios (Hz) y, a menos que se especifique lo contrario, los espectros se adquirieron a 298 K. Los espectros de masas se registraron en espectrómetros de masas Thermo Finnegan MAT 900XP, Micromass Quattro LC electrospray y VG70-SE. Los espectros infrarrojos se registraron en un espectrómetro Shimadzu FTIR-8700.
En los siguientes ejemplos, los liposomas se indican usando la abreviatura “Cnn DXXX nn”, donde Cnn es el lípido catiónico, por ejemplo, C14 (DTDTMA), C18 (DOTMA) o C16 (DHDTMA); DXXX es el fosfolípido, por ejemplo, DOPE (fosfatidil etanolamina o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (fosfatidilcolina o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) o DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina); y nn es el péptido, por ejemplo, ME27 (27), péptido 35 (35), Y (Y) o péptido 32 (32).
Lípidos
• DTDTMA (C14), DOTMA (C18) y DHDTMA (C16) se prepararon según el método descrito en Hurley CA, Wong JB, Hailes HC y Tabor AB, Assymetric Synthesis of Dialkyloxy-3-alkylammonium Cationic Lipids. J. Org. Chem. 2004, 69:980-983.
• DOPE está disponible de Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, EE.UU.
• DSPC está disponible de Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, EE.UU.
• DOPC está disponible de Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, EE.UU.
Síntesis de péptidos
Los péptidos descritos (tabla 1A) se sintetizaron usando instrumentos y técnicas convencionales.
Tabla 1A: secuencia peptídica
Tabla 1B - Masa peptídica
Péptido Masa (g.mof1)
Secuencias peptídicas lineales: el péptido se sintetizó en una escala de 20 μmol usando jeringas de 2 ml con fritas de teflón y un volumen de acoplamiento de 500 μl. Para estas secuencias se usaron resina de NovaSyn TGT precargada con Fmoc-Gly o resina de Fmoc-Gly-2-Cl-Trt. Se sintetizó Fmoc-Peg4-COOH siguiendo un procedimiento descrito previamente (véase síntesis de Fmoc-Haa4-COOH en la página 82 del documento WO 2005/117985 - Fmoc-Haa4-COOH fue el nombre dado a Fmoc-Peg4-COOH en esa memoria descriptiva). La resina de TGT se hinchó inicialmente durante 10 min, sin embargo, la resina de 2-Cl-Trt necesitó un tiempo de hinchamiento inicial prolongado (algunas horas) en DMF. El acoplamiento de rutina se realizó con HBTU (en DMF) y DIPEA (en NMP) usando un exceso de cuatro veces de reactivos. Se escindió Fmoc con una disolución al 40 % de piperidina en DMF durante 3 min y una disolución al 20 % durante 10 min. Los ciclos de síntesis consistieron en un tiempo de acoplamiento de 40 min, 3 min para la desprotección de Fmoc con piperidina al 40 %, otros 10 min para la desprotección de Fmoc con piperidina al 20 % y etapas de lavado. Después de la síntesis y el último ciclo de lavado con DMF, los péptidos se lavaron con DCM, metanol y dietil éter (3 veces cada uno) usando la función “manual”/”vacío” del equipo Syro. Se aplicó succión durante algún tiempo más para ayudar a evaporar el éter.
Formación de enlaces disulfuro en resina: para formar puentes disulfuro en la resina, la resina se colocó en una jeringa con frita de PE y se hinchó en DMF. Después de eliminar el exceso de DMF, se añadió una disolución de yodo recién preparada en una cantidad mínima de DMF (por ejemplo, 500 μl para una jeringa de 2 ml, 10 eq de yodo para carga de resina) y la jeringa se agitó con vórtex durante 4 h durante 20 s cada 4 min. Se eliminó la disolución de reactivo y se lavó la resina de 10 a 20 veces con DMF y 3 veces con cada uno de DCM, metanol y éter.
Escisión y desprotección: las jeringas se transfirieron a la campana extractara de humos para su escisión. La escisión se realizó con un cóctel de TFA al 95 %, TIS al 2,5 % y H2O al 2,5 %. Se añadió una cantidad mínima de cóctel recién preparado para cubrir la resina (por ejemplo, < 500 μl en las jeringas de 2 ml). Después de 4 h, las disoluciones de escisión se pasaron a tubos de polipropileno (PP) usando un émbolo y las resinas se lavaron con otra pequeña cantidad de cóctel de escisión (por ejemplo, 200 μl en las jeringas de 2 ml). A continuación, los péptidos se precipitaron con éter (por ejemplo, a las fracciones combinadas de las jeringas de 2 ml se añadieron unos 4 ml de éter dietílico). Los tubos de PP se mantuvieron en el congelador durante al menos 15 min, luego se centrifugaron a 3000 rpm durante 3 min y la disolución se decantó del sedimento de péptido. La centrifugación y la decantación se repitieron dos veces con aproximadamente 2 ml de éter. Finalmente, los péptidos se disolvieron en agua o tBuOH/agua (4:1) y se liofilizaron. Algunas secuencias de péptidos mostraron una solubilidad muy baja y, en ocasiones, fueron necesarios varios procedimientos de liofilización/disolución con diferentes mezclas de disolventes (agua, tBuOH o acetonitrilo) para obtener un péptido esponjoso.
El péptido se analizó mediante HPLC de fase inversa y se purificó mediante HPLC de fase inversa hasta una pureza >90 %. Los espectros de masas se registraron usando Micromass Quattro ES-MS (Software: Masslynx) y las masas se registran en la tabla 1B.
El péptido 35, K16Y y el péptido 32 se adquirieron de AMS Bio Ltd., Birmingham, RU, y se sintetizaron usando química de síntesis de péptidos semiautomática. El péptido se analizó mediante HPLC de fase inversa y se purificó cuando fue necesario mediante HPLC de fase inversa hasta una pureza del 85 %. Las masas moleculares relativas se dan en la tabla 1B.
Se adquirió K16 tal como se describió anteriormente (Hart et al., Lipid-mediated enhancement of transfection by a nonviral integrin-targeting vector. Hum Gene Ther., 1998, 9, 575-585). Las masas moleculares relativas se dan en la tabla 1B.
Todos estos péptidos liofilizados se diluyeron a 10 mg/ml en agua y se almacenaron a -20 °C durante varios meses. Una vez descongelados, se mantienen alícuotas de péptidos a 4 °C durante varias semanas.
ARNm
Se adquirió ARNm que codifica para luciferasa de luciérnaga (CleanCap FLuc mRNA) de TriLink Biotech, San Diego, CA. Se usaron tanto ARNm sin modificaciones como ARNm con modificaciones de pseudouridina.
Obtención de imágenes de partículas
El tamaño de las nanopartículas de RLP que contenían péptidos con lípidos se determinó en diferentes razones en peso de liposoma con respecto a ARNm (p/p) mediante dispersión de luz dinámica usando un NanoZS Zetasizer (Malvern). Los complejos se prepararon tal como se describió anteriormente excepto que se formularon en agua libre de nucleasas en lugar de Opti-MEM. Se analizaron muestras de 1 ml (que contenían 1,5 |ig de ARNm) para determinar su tamaño y potencial zeta. El tamaño se registró como el promedio de la distribución de partículas basada en la intensidad.
Preparación de diversos nanocomplejos no virales de la invención
Razón en peso para la preparación de LPRL-RTN (lípido/péptido/ARNm/lípido - nanopartículas dirigidas al receptor, d D = mezcla DOTMA-DOPE)
Composición del recubrimiento de liposomas de la invención.
Se prepararon LPRL1-RTN a LPRL7-RTN usando componentes tal como se indica en la tabla anterior usando los métodos descritos en el presente documento y se colocaron en solución salina tamponada con fosfato normal (Thermofisher (anteriormente Life Technologies), n. ° de catálogo 14190-094), tampón PBS, durante hasta 4 horas. A continuación, se analizó el tamaño de las partículas tal como se describió anteriormente.
Producción de exosomas
Los exosomas pueden recogerse de cualquier líquido corporal adecuado o de un medio de cultivo celular. Como ejemplo para ilustrar cómo pueden recogerse los exosomas de un cultivo celular, la línea celular U937 se cultivó en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %. Las células U937 se cultivaron en
suspensión y se expandieron en matraces verticales T75 en aproximadamente 30 ml de medio. Los cultivos se sometieron a pase cada 3-4 días y se añadieron nuevos medios cada dos días si era necesario. La línea celular se expandió hasta que hubo al menos ocho matraces T75 para tener un número suficiente de células (de 1,5 x 106 a 2,0 x 106 células por matraz).
Para la extracción de exosomas, U937 debe cultivarse en medios acondicionados para evitar la contaminación del suero FBS que es rico en exosomas fetales bovinos. Las líneas celulares U937 se cultivaron en medios tal como se describió anteriormente. Al menos 2 días antes de la recolección de exosomas, se cambiaron a medios acondicionados. Los protocolos de extracción y purificación se tomaron de Thery et al., 2006 - isolating and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids, Current Protocols in Cell Biology.
El medio acondicionado (medio libre de exosomas) se preparó tal como sigue:
1. A medio de 1640 RPMI se añadió FBS al 20 %.
2. Este medio completo se centrifugó en tubos de policarbonato de 38 ml a 100.000 g a 4 °C durante la noche en una ultracentrífuga (ultracentrífuga Optima XPN-100 de Beckman Coulter).
3. Se eliminó el sobrenadante asegurándose de que el sedimento (no siempre presente) no se alterara y se esterilizó por filtración con filtros de 0,22 μm.
4. Este medio acondicionado se diluyó con volúmenes iguales de medio de 1640 RPMI que no contiene FBS. 5. El medio acondicionado puede almacenarse a 4 °C hasta 4 semanas.
Extracción de lípidos celulares
Este protocolo para recoger fosfolípidos del cultivo celular se adaptó del método de Bligh y Dyer (1959) J. Biochem, Physiol. 37(8):911-7. Esencialmente, se mezclaron razones específicas de cloroformo, metanol y agua para garantizar la separación de la fase líquida en función de las interacciones hidrófobas/hidrófilas de las proteínas, los hidratos de carbono y los lípidos presentes en las membranas celulares.
1. Se centrifugaron células U937 a una densidad de 3 x 106 durante 5 minutos a 1200 g en un tubo Falcon de 15 ml. El sobrenadante se descartó y el sedimento celular se lavó tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Se añadió 1 ml de PBS al sedimento y se resuspendió.
3. Adaptado del método de Bligh y Dyer, este procedimiento debe realizarse en una campana de vacío:
o Se añadieron 1,25 ml de cloroformo usando una jeringa Hamilton al sedimento celular y se agitó con vórtex.
o Luego se añadieron 2,5 ml de metanol y se agitó la muestra con vórtex.
o Se añadieron 1,25 ml de cloroformo y se agitó la muestra con vórtex.
o Finalmente se añadieron 1,25 ml de dH2O y se agitó la muestra con vórtex.
4. La mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 1200 g a 4 °C. Se observaron tres fases distintas: la fase superior que contiene la región metanol/agua, todas las moléculas polares estarán en esta región, una pequeña banda, esto se conoce como disco de proteína y contiene las diversas proteínas que se encuentran en las células, la fase inferior contiene la cloroformo con moléculas no polares tales como lípidos.
5. La fase de metanol se eliminó usando una jeringa y luego, usando una jeringa Hamilton, el cloroformo se eliminó cuidadosamente aplicando presión positiva mientras se perforaba el anillo de proteína. Antes de añadir el cloroformo, el tubo de ensayo se limpió a fondo, se dejó secar y luego se pesó con una báscula científica precisa (MC1 Analytic AC 120S). La disolución de cloroformo-lípido se almacenó en un matraz de fondo redondo y se tapó con un tapón de vidrio a 4 °C.
6. La mezcla de cloroformo-lípido se sometió a evaporación rotatoria a vacío hasta que se observó una película lipídica delgada. Luego se pesó el tubo de ensayo y se calculó la diferencia entre el tubo de ensayo vacío y el tubo de ensayo que contenía la película lipídica. Esto dio un valor aproximado para la masa de los lípidos extraídos.
7. Se preparó DOPE con la misma masa que los lípidos derivados de células y los dos se mezclaron en cloroformo en una razón de 1:1 y luego se sometieron al mismo protocolo de evaporación, hidratación y sonicación descrito en Bligh y Dwyer.
Extracción de exosomas
La extracción de exosomas se realizó siguiendo el protocolo de Thery et al., 2006 con un procedimiento de purificación adicional. Era importante usar tantas células como fuera posible para garantizar un alto rendimiento en la extracción de exosomas. Normalmente, 150 ml de sobrenadante de cultivo celular fueron suficientes.
1. Se centrifugaron las líneas celulares U937 cultivadas en el medio acondicionado tal como se describió anteriormente durante 2 días a 1500 g en tubos Falcon durante 10 minutos; se recogió el sobrenadante y se descartó el sedimento.
2. Se transfirió el sobrenadante a tubos de policarbonato de 38 ml y se centrifugó en una ultracentrífuga a 10.000 g durante 30 minutos a 4 °C, se recogió el sobrenadante y se descartó el sedimento de restos celulares.
3. Se centrifugó el sobrenadante a 110.000 g durante 70 minutos a 4 °C. Luego se descartó el sobrenadante con mucho cuidado; debe observarse un pequeño sedimento blanco tenue en el fondo del tubo. A continuación, el sedimento se mezcló con 300 μl de PBS y luego se transfirió a un tubo Eppendorf.
4. Se purificaron adicionalmente los exosomas usando el reactivo de aislamiento de exosomas total (ThermoFisher, número de catálogo 4478359). Brevemente, la disolución de exosoma/PBS se mezcló completamente con la mitad del volumen del reactivo del kit y se almacenó en posición vertical durante la noche a 4 °C.
5. A continuación, la disolución se centrifugó durante 1 hora a 10.000 g a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y luego se resuspendió el sedimento de exosomas en 100 ul de PBS y se sonicó para formar liposomas.
Producción de núcleo catiónico.
La formación de complejos de lípido/péptido/ácido nucleico requiere la adición del ácido nucleico y el péptido al lípido catiónico en disolución acuosa. Para liposomas catiónicos tales como DOTMA:DOPE, el lípido de núcleo se mezcló completamente en primer lugar con el péptido en disolución acuosa y luego se añadió el ácido nucleico. A continuación, los componentes se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente para formar los complejos de núcleo. Las razones en masa de los componentes se dan en la tabla anterior.
Aplicación de liposoma de recubrimiento.
Según la invención, el recubrimiento exterior del complejo de administración es aniónico (en su carga neta, puede contener compuestos lipídicos individuales que tengan diversas cargas). Para los ejemplos, se prepararon recubrimientos exteriores que eran aniónicos y también los que eran catiónicos con fines de comparación. En primer lugar, se preparó el liposoma de recubrimiento usando técnicas convencionales de preparación de liposomas (deshidratación, rehidratación y sonicación) y luego se aplicó al núcleo mezclando completamente una disolución acuosa de los complejos de núcleo con los liposomas.
Ejemplo 1: comparación de estabilidad - turbidez
Se midió la absorbancia de los complejos por triplicado en ausencia y presencia de diferentes concentraciones de suero (0-50 % v/v) a 500 nm en un espectrofotómetro FLUOstar Optima con una cantidad correspondiente de suero solo como referencia. Se formaron nanocomplejos con 1 μg de ADN o ARNip, se incubaron a 37 °C y se analizaron en puntos de tiempo regulares durante un periodo de 30 minutos. La turbidez relativa se determinó dividiendo la absorbancia de la muestra entre el valor del tiempo cero en agua.
Resultados
La Figura 1 muestra los resultados y demuestra que mientras que los liposomas DOTMNDOPE simples y las partículas de liposomas catiónicos (LPR) de la técnica anterior son inestables durante 30 minutos, las partículas de PRL aniónicas según la invención conservan la estabilidad durante el transcurso del experimento de 30 minutos.
Ejemplo 2: comparación de estabilidad - tamaño de partícula
Se llevó a cabo un experimento de comparación de estabilidad durante 7 horas usando partículas LPR de la técnica anterior y complejos de PRL de la invención.
Resultados
Tal como puede observarse en la figura 2, las partículas de PRL aniónicas de la invención muestran una estabilidad durante 7 horas que está ausente en las partículas de la técnica anterior.
Ejemplo 3 - comparación de estabilidad - tamaño de partícula
Se llevó a cabo un experimento de comparación de estabilidad durante 4 horas usando diversas partículas de LPR de la invención que tenían composiciones tal como se describieron anteriormente.
Resultados
La figura 3 muestra los resultados y la figura 4 presenta un resumen de los mismos. Puede observarse que cualquier aumento de tamaño es muy pequeño, lo que sugiere una buena estabilidad. Se observa que los complejos que parecen ser menos estables (pero que todavía tienen una buena estabilidad con respecto a las partículas de LPR de la técnica anterior) son aquellos que tienen un nivel bajo (1 %) de lípido pegilado.
Ejemplo 4 - comparación de estabilidad - potencial zeta
El potencial zeta (potencial electrocinético) es una medida de la estabilidad de las dispersiones coloidales. Un valor más alto indica un mayor grado de repulsión electrostática entre las partículas adyacentes. Los valores que tienen una magnitud inferior a 5 (es decir, de desde 0 hasta ± 5) se consideran inestables y propensos a la coagulación y/o floculación. Se considera que los valores con una magnitud superior a 10 tienen un nivel razonable de estabilidad.
Método
El potencial zeta se midió tal como se describió anteriormente.
Resultados
Los resultados se muestran en la figura 5. Puede observarse que para todas las muestras de partículas de la invención, las partículas tienen un potencial zeta que sugiere estabilidad en lugar de coagulación/floculación. Ejemplo 5 - eficiencia de transfección
Se transfectaron células de neuroblastoma cultivadas con ARNip de MYCN usando partículas de la técnica anterior (DD, AT1, AT2, GK24, AT3) o de la invención (LPRL1 a LPRL7). Se ha medido el porcentaje de células que expresan ARNm de MYCN y los resultados se muestran en la figura 6 y (por duplicado) en la figura 7. Puede observarse que los complejos no virales de la invención efectúan con éxito la transfección.
Ejemplo 6 - ensayo de apoptosis
Este experimento ilustra cómo la rápida expansión de las células de neuroblastoma que son impulsadas a expandirse rápidamente por el oncogén MYCN puede llevarse a la apoptosis mediante el silenciamiento génico de MYCN mediante el uso del ARNip de MYCN del ejemplo 5. Después de la transfección con el constructo de ARNip de MYCN en diversos complejos de transfección, las células se suspendieron en disolución de yoduro de propidio y se analizaron por citometría de flujo. La figura 8 muestra los histogramas del citómetro de flujo contenidos. La proporción de células que mostraban niveles sub-G1 de ADN se midió aplicando la ventana indicada a los histogramas. La figura 8a muestra los resultados para complejos catiónicos no virales de una sola capa de la técnica anterior (complejos “LPR”). Puede observarse que el 24,5 % de las células tienen ADN sub-G1 indicativo de apoptosis. La figura 8b muestra los resultados de los complejos aniónicos de una sola capa de la técnica anterior (complejo “PRL”). Puede observarse que el 37,3 % de las células tienen ADN sub-G1 indicativo de apoptosis. La figura 8c muestra los resultados de los complejos aniónicos de doble capa de la invención (complejos “LPRL”). Puede observarse que el 57,6 % de las células tienen ADN sub-G1 indicativo de apoptosis. Esto es evidencia de una eficiencia de transfección superior de los complejos de la invención en comparación con la técnica anterior.
Ejemplo 7 - complejos en el moco de fibrosis quística
En los pacientes con fibrosis quística, existe un desafío para lograr que cualquier vector de terapia génica llegue intacto a las células diana debido a la acumulación de moco extracelular. Este experimento demuestra que los complejos de la invención pueden hacer frente a ese desafío. Se llevó a cabo un ensayo de penetración de RTN en moco Transwell en placas de 24 pocillos con Transwell (insertos de membrana de poliéster de 6,5 mm y 3,0 um de poro, Corning, RU) y se mantuvieron en una incubadora a 37 °C. Se añadió tampón Tris a cada pocillo (disolución receptora) y el Transwell se colocó encima del tampón. Se añadió encima 1 μl de moco de CF o no
de CF (normal) (Epithelix Sari, Ginebra, Suiza) y se esparció por cada Transwell. La placa se incubó durante 30 minutos para equilibrar el moco. Se prepararon RTN de ARNip de 140 ng/μl y se añadieron 3 ul a cada Transwell. Después de 5, 10, 15, 30, 45, 60 y 120 minutos, se recogieron 100 μl del tampón Tris y se pipetearon en una placa de 96 pocillos. El ARNip se midió en un lector de microplacas FLUOstar OPTIMA. La penetración acumulativa de RTN a través del moco se calculó y representó gráficamente en la figura 9. Puede observarse que los complejos de la invención muestran una buena penetración del moco de CF.
Ejemplo 8 - datos de estabilidad
Las figuras 10 y 11 muestran datos de estabilidad tal como se mide por cambios en la turbidez, medidos tal como se describe en el ejemplo 1 y llevados a cabo en suero al 50 %. Los complejos aniónicos y los complejos aniónicos de LPRL de la invención muestran una agregación asociada a la turbidez reducida que los complejos catiónicos de la técnica anterior en suero al 50 %. La figura 10 muestra datos de complejos de doble capa que contienen ADN de la invención, mientras que la figura 11 muestra datos de complejos de doble capa que contienen ARNip de la invención. Puede observarse que ambas clases de complejos son estables.
Ejemplo 9 - transfección con proteína indicadora GFP
Se transfectaron las líneas celulares ME27 con un constructo de ácido nucleico-proteína indicadora GFP (pEGFP de Clontech™ bajo un promotor de CMV) usando complejos de la técnica anterior o de la invención. Los constructos usados son “D-D” (DOTMNDOPE), AT1 y LPDL1 a LPDL6 de cada par en la figura 12 que muestra una vista de contraste de fase de las células y la segunda fotografía muestra la fluorescencia de las células. El número de células fluorescentes y su intensidad de fluorescencia (la intensidad de fluorescencia media se cuantificó y se muestra en la figura 13). Esto muestra que el porcentaje de células positivas fue al menos tan alto usando el complejo de transfección de la invención en comparación con las de la técnica anterior y, con la excepción de la réplica de “LPDL5”, la intensidad de fluorescencia fue mayor para los complejos de la invención. La figura 13 muestra datos de citometría de flujo de las mismas transfecciones que se muestran en la figura 12. Ejemplo 10 - direccionamiento intravenoso a tumores
Se usaron ratones NSG que se sometieron a injerto con células Kelly como modelos de xenoinjerto. La lectura fue si los complejos se dirigieron selectivamente a las células tumorales. Se dirigieron a los tumores los complejos aniónicos (RTN) de la invención o, para comparación, los complejos catiónicos de la técnica anterior. Los complejos que contenían el péptido ME27 dirigido a integrina y la formulación catiónica contenían lípido DOTMNDOPE y PEG2000 al 1 % (es decir, AT1): péptido ME27: ARNip marcado con dy677; la formulación aniónica contenía un núcleo de DOTMNDOPE: péptido ME27: ARNip marcado con dy677 y luego tenía lípido aniónico en la capa exterior.
La figura 14 muestra (en verde en el original) la transfección dirigida de las células Kelly.
Ejemplo 11 - análisis de citometría de flujo de la eficiencia de transfección
La especificidad de cada nanocomplejo se midió comparando las eficiencias de transfección de nanocomplejos de direccionamiento y no direccionamiento en 3 líneas celulares. El panel A de la figura 15 muestra los datos de citometría de flujo para N2a. En general, D:D tuvo la eficiencia general más alta en comparación con los otros nanocomplejos, sin embargo, también fue el menos específico ya que su complejo no de direccionamiento transfectó más del 45 %. Las eficiencias de transfección para todos los demás nanocomplejos que contienen exosomas o aniónicos se mejoraron en gran medida por el resto de direccionamiento. El panel B muestra resultados similares para la línea celular H441. Sin embargo, para D:D la presencia del péptido de direccionamiento fue más significativa que en N2a. De hecho, el lipoplejo mostró un mejor rendimiento que el complejo de no direccionamiento. Los exosomas que tenían la eficiencia de transfección segunda más alta en N2a fueron ligeramente menos eficientes que el cmd-L:D catiónico, el péptido de direccionamiento fue ligeramente menos significativo en H441 con exosomas. El panel C muestra los datos de citometría de flujo para células 16-HBE. Los resultados reflejan los de N2a, nuevamente D:D tuvo la transfección más alta y fue el menos específico, mostrando los exosomas la eficiencia de transfección segunda más alta. En las tres líneas celulares, los nanocomplejos aniónicos tenían una mayor especificidad que los nanocomplejos catiónicos. De los liposomas aniónicos, los exosomas mostraron la menor especificidad en todas las líneas celulares.
Figura 15. Datos de citometría de flujo que comparan la especificidad de los diferentes nanocomplejos en A) células N2a, B) células H441 y C) células 16-HBE. Los resultados muestran la comparación entre complejos de liposoma: ADN, complejos no de direccionamiento y complejos de direccionamiento. D.D (DOTMA: DOPE), CMD-L (liposoma derivado de la membrana celular), CMD-L:D (liposoma derivado de la membrana celular: DOPE). (± desviación est., n = 3). Los valores de probabilidad p < 0,05, p < 0,01 y p < 0,001 se asignaron como *, **, y ***, respectivamente.
Claims (15)
1. Complejo de administración no viral, que comprende:
A, un núcleo catiónico que es una nanopartícula que comprende:
(i) un péptido de fórmula A-B-C en la que A es un componente de unión a ácido nucleico policatiónico, B es un elemento espaciador que es susceptible de escisión dentro de una célula, y C es un componente de unión al receptor de la superficie celular,
(ii) un ácido nucleico, y
(iii) un lípido catiónico,
B, un recubrimiento aniónico que es un liposoma que rodea el núcleo catiónico y que comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células de un sujeto, opcionalmente glóbulos rojos o exosomas.
2. Complejo de administración no viral según la reivindicación 1, en el que al menos el 80 % en peso del recubrimiento aniónico se ha extraído previamente de la membrana plasmática de las células o exosomas del sujeto.
3. Complejo de administración no viral según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el recubrimiento aniónico comprende lípidos pegilados.
4. Complejo de administración no viral según la reivindicación 3, en el que los lípidos pegilados son lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células o exosomas del sujeto que se derivatizaron posteriormente con PEG.
5. Complejo de administración no viral según cualquier reivindicación anterior, en el que el ácido nucleico es un ARN de interferencia pequeño que regula por disminución la expresión de un gen que se regula por incremento de manera diferencial en células tumorales.
6. Complejo de administración no viral según las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ácido nucleico codifica para el regulador de conductancia transmembranario de fibrosis quística (CFTR).
7. Complejo de administración no viral según las reivindicaciones 1 a 6, en el que el componente de unión a la superficie celular se une a células epiteliales de pulmón.
8. Complejo de administración no viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la razón de núcleo catiónico A con respecto a recubrimiento aniónico B está entre 5 y 30, opcionalmente entre 10 y 25.
9. Composición farmacéutica que comprende el complejo de administración no viral según una de las reivindicaciones 1 a 8, mezclado o junto con un portador farmacéuticamente adecuado.
10. Método para elaborar un complejo de administración no viral, que comprende:
A, elaborar un núcleo catiónico que es una nanopartícula que comprende:
(i) un péptido de fórmula A-B-C en la que A es un componente de unión a ácido nucleico policatiónico, B es un elemento espaciador que es susceptible de escisión dentro de una célula, y C es un componente de unión al receptor de la superficie celular,
(ii) un ácido nucleico, y
(iii) un lípido catiónico,
B, añadir un recubrimiento aniónico que es un liposoma que rodea el núcleo catiónico y que comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células del sujeto, opcionalmente glóbulos rojos o exosomas.
11. Complejo de administración no viral según una de las reivindicaciones 1 a 8, o composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una afección provocada en un sujeto por un defecto y/o una deficiencia en un gen, o para inmunización terapéutica o profiláctica, o para terapia antisentido o ARNi.
12. Complejo de administración no viral según una de las reivindicaciones 1 a 5, 7 u 8, o composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de cáncer en un sujeto.
13. Complejo de administración no viral según una de las reivindicaciones 1 a 4, o 6 a 8 o composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de fibrosis quística en un sujeto.
14. Complejo de administración no viral para su uso según la reivindicación 13, en el que el recubrimiento aniónico comprende al menos el 80 % en peso que se ha extraído de las células o exosomas del sujeto y en el que al menos el 1 % en peso consiste en lípidos pegilados.
15. Complejo de administración no viral para su uso como medicamento, que comprende:
A, un núcleo catiónico que es una nanopartícula que comprende:
(i) un péptido de fórmula A-B-C en la que A es un componente de unión a ácido nucleico policatiónico, B es un elemento espaciador que es susceptible de escisión dentro de una célula, y C es un componente de unión al receptor de la superficie celular,
(ii) un ácido nucleico, y
(iii) un lípido catiónico,
B, un recubrimiento aniónico que es un liposoma que rodea el núcleo catiónico y que comprende lípidos extraídos previamente de una membrana plasmática de las células de un sujeto, opcionalmente glóbulos rojos o exosomas, opcionalmente en el que el complejo de administración no viral tiene una o más de las características adicionales según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB1800370.7A GB201800370D0 (en) | 2018-01-10 | 2018-01-10 | Anionic nanocomplexes for nucleic acid delivery |
| PCT/GB2019/050066 WO2019138235A1 (en) | 2018-01-10 | 2019-01-10 | Anionic nanocomplexes for nucleic acid delivery |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2945997T3 true ES2945997T3 (es) | 2023-07-11 |
Family
ID=61190490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19701001T Active ES2945997T3 (es) | 2018-01-10 | 2019-01-10 | Nanocomplejos aniónicos para la administración de ácidos nucleicos |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11793756B2 (es) |
| EP (1) | EP3737357B1 (es) |
| ES (1) | ES2945997T3 (es) |
| GB (1) | GB201800370D0 (es) |
| WO (1) | WO2019138235A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2022296780A1 (en) * | 2021-06-22 | 2023-12-07 | Bio-Trip B.V. | Nucleic acid containing nanoparticles |
| EP4124348A1 (en) * | 2021-07-30 | 2023-02-01 | 4basebio UK Ltd | Nanoparticles for cell delivery |
| WO2024065649A1 (zh) * | 2022-09-30 | 2024-04-04 | 谛邈生物科技（新加坡）有限公司 | 一种向外泌体中高效装载dna的方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5908777A (en) * | 1995-06-23 | 1999-06-01 | University Of Pittsburgh | Lipidic vector for nucleic acid delivery |
| GB0106315D0 (en) | 2001-03-14 | 2001-05-02 | Ich Productions Ltd | Transfection complexes |
| US20030203865A1 (en) * | 2001-04-30 | 2003-10-30 | Pierrot Harvie | Lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
| EP2284266B1 (en) * | 2002-11-14 | 2013-11-06 | Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc. | siRNA targeting tp53 |
| GB0313132D0 (en) | 2003-06-06 | 2003-07-09 | Ich Productions Ltd | Peptide ligands |
| WO2005117985A2 (en) | 2004-06-02 | 2005-12-15 | Ucl Biomedica Plc | Lipopolyplex construct with an integrin binding peptide for delivery of nucleic acids, peptides or drugs |
| WO2014052634A1 (en) * | 2012-09-27 | 2014-04-03 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Lipid coated nanoparticles containing agents having low aqueous and lipid solubilities and methods thereof |
-
2018
- 2018-01-10 GB GBGB1800370.7A patent/GB201800370D0/en not_active Ceased
-
2019
- 2019-01-10 US US16/961,188 patent/US11793756B2/en active Active
- 2019-01-10 ES ES19701001T patent/ES2945997T3/es active Active
- 2019-01-10 WO PCT/GB2019/050066 patent/WO2019138235A1/en not_active Ceased
- 2019-01-10 EP EP19701001.0A patent/EP3737357B1/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019138235A8 (en) | 2019-11-28 |
| WO2019138235A1 (en) | 2019-07-18 |
| EP3737357A1 (en) | 2020-11-18 |
| US20210052496A1 (en) | 2021-02-25 |
| GB201800370D0 (en) | 2018-02-21 |
| US11793756B2 (en) | 2023-10-24 |
| EP3737357B1 (en) | 2023-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1863558B (zh) | 具有向核内转移能力的聚精氨酸修饰的脂质体 | |
| Qin et al. | Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for improving brain delivery and therapeutic efficacy on brain glioma in animals | |
| ES2212305T3 (es) | Polinucleotidos encapsulados en liposomas, composicion y procedimiento. | |
| JP7333635B2 (ja) | ｍＲＮＡを細胞に送達するための改善した脂質－ペプチドナノ複合体製剤 | |
| ES2295018T3 (es) | Encapsulacion de complejos bioactivos en liposomas. | |
| US20050163832A1 (en) | Intracellular delivery of therapeutic agents | |
| ES2286857T3 (es) | Complejo de plasmido condensado-liposoma para transfeccion. | |
| CN103930398A (zh) | 具有改进的细胞内动力学的阳离子脂质 | |
| ES2945997T3 (es) | Nanocomplejos aniónicos para la administración de ácidos nucleicos | |
| US9399016B2 (en) | Materials and complexes for the delivery of biologically-active materials to cells | |
| Ravula et al. | Gemini lipopeptide bearing an ultrashort peptide for enhanced transfection efficiency and cancer-cell-specific cytotoxicity | |
| Tao et al. | Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposome: bio-behavioral study | |
| US20250332275A1 (en) | Branched Polypeptide Carrier for Efficient Nucleic Acid Delivery and Its Variants | |
| WO2023093596A1 (zh) | 一种用于有效递送核酸的环状多肽载体及其变化形式 | |
| KR20220117133A (ko) | 양이온성 분자 수송체 및 SARS-CoV-2 mRNA의 이온 복합체를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 예방 백신 조성물 | |
| Ding et al. | Hydroxyethylated cationic cholesterol derivatives in liposome vectors promote gene expression in the lung | |
| US20190084923A1 (en) | Lipids and complexes for the delivery of biologically-active material to cells | |
| CN116199666B (zh) | 两亲性化合物及其药物组合物 | |
| KR101647178B1 (ko) | 효소 절단성 링커 또는 올리고 라이신을 포함하는 폴리에틸렌글리콜-리피드를 이용한 안정화된 플라스미드-지질 입자 | |
| Sun et al. | New amphiphilic N-phosphoryl oligopeptides designed for gene delivery | |
| Liang et al. | Peptides: potential delivery systems for mRNA | |
| Rosales-Mendoza et al. | RNA-based vaccines against SARS-CoV-2 | |
| WO2003084985A1 (fr) | Peptide chimiquement modifie a l'aide de polyethyleneglycol | |
| Gholami et al. | Preparation and transfection evaluation of modified multifunctional envelope-type nano device-DNA nanocomplexes based on low molecular weight protamine. | |
| EP1790657A1 (en) | pH-switchable transmembrane peptides as stimulators of membrane fusion |