ES2873959T3 - Combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de CDK y un inhibidor de tiorredoxina reductasa para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina (CDK) y al menos un inhibidor de tiorredoxina reductasa, para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el inhibidor de CDK se selecciona entre alvocidib, riviciclib y voruciclib.

Description

DESCRIPCIÓN

Combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de CDK y un inhibidor de tiorredoxina reductasa para el tratamiento del cáncer

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de CDK y al menos un inhibidor de enzima antioxidante para su uso en el tratamiento del cáncer.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una enfermedad que se caracteriza por el control inusual del crecimiento celular o la división celular descontrolada. La división celular descontrolada es un efecto de una ruptura en el ciclo de vida natural de las células. Hay más de 100 tipos diferentes de cánceres, que se clasifican según el tipo de células inicialmente afectadas, tal como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (células renales), leucemia, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de piel, linfoma no Hodgkin, melanoma y cáncer de cabeza y cuello.

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Este provoca 1 de cada 8 muertes en todo el mundo y se está convirtiendo rápidamente en una pandemia mundial. De acuerdo con World Cancer Research Fund International, las estadísticas del cáncer en todo el mundo en base a GLOBOCAN 2012, se estima que hubo 14,1 millones de casos de cáncer en todo el mundo en 2012, de estos 7,4 millones de casos fueron en hombres y 6,7 millones en mujeres. Se espera que este número aumente a 24 millones para 2035.

Hay muchos tratamientos quimioterapéuticos disponibles para los pacientes con cáncer, pero teniendo en cuenta las estadísticas mundiales de los pacientes con cáncer y la pandemia de la enfermedad, existe una necesidad continua de desarrollar nuevos regímenes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, los inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) son agentes anticancerosos que proporcionan una promesa para el tratamiento de trastornos proliferativos, particularmente cánceres. La CDK es una familia de proteína quinasas y juega un papel esencial en el control del ciclo de vida de la célula y/o proliferación. La desregulación de CDK es una característica que se encuentra en la mayoría de las células cancerosas. Los mamíferos tienen proteínas inhibidoras de CDK de origen natural, que regulan la CDK y, a su vez, regulan el ciclo de vida de la célula. La desregulación de CDK puede deberse a una sobreabundancia de CDK o puede deberse a un mal funcionamiento de las proteínas inhibidoras de CDK de origen natural. Por lo tanto, la inhibición de CDK se ha convertido en una estrategia atractiva hacia desarrollos recientes en quimioterapias para el cáncer. Por lo tanto, los inhibidores de CDK, tales como flavopiridol, seliciclib, olomoucina y purvalanol A, encuentran uso en el tratamiento de cánceres. Por ejemplo, Bible y Kaufmann (Cancer Res., 1997, vol. 57; 3375-3380) describen una sinergia citotóxica entre flavopiridol y varios agentes antineoplásicos, donde la secuencia de administración es importante. Sin embargo, según los avances recientes en la investigación del cáncer, se encuentra que las opciones de tratamiento actuales para el cáncer incluyen la terapia de combinación. El enfoque de la terapia de combinación se dirige a un protocolo que implica la combinación de diferentes agentes contra el cáncer que tienen diferentes mecanismos biológicos. Un protocolo de quimioterapia de combinación óptimo puede resultar en un aumento de la eficacia terapéutica, una disminución de la toxicidad del huésped y una resistencia mínima o retardada al fármaco. Por lo tanto, se han dirigido esfuerzos para combinar inhibidores de CDK conocidos con otros agentes terapéuticos para proporcionar una terapia eficaz contra el cáncer. Por ejemplo, WO 2012/1664497 describe una combinación farmacéutica sinérgica con un inhibidor de CDK y uno o más agentes antineoplásicos en el tratamiento del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. Entre otros agentes terapéuticos, particularmente los agentes quimioterapéuticos, se consideran aquellos agentes que actúan mediante el control de la proliferación, los estados redox y la apoptosis, como se describe en D. Rathkopf y otros. (Clin. Cancer Res, 2009, vol. 15, págs. 7405-7411; " Phase I study of flavopiridol with oxaliplatin and fluorouracil/leucovorin in advance solid tumors"). M.J.Pishavian y otros describe la actividad anticancerígena sinérgica de un inhibidor de CDK4/6 en combinación con un agente quimioterapéutico en células de cáncer de colon humano (American Association for Cancer Res., 2010, 101st Annual meeting; Abstract 5047).

Se sabe que las especies reactivas de oxígeno (ROS) son mediadores de cascadas de señalización intracelular. Las ROS se producen dentro de las células, incluso en condiciones fisiológicas normales, que incluyen radicales libres con electrones desapareados, tales como el anión superóxido, el radical hidroxilo y oxidantes tal como el peróxido de hidrógeno (H²O²), todos los cuales son inherentemente inestables y, a menudo, altamente reactivo. En condiciones fisiológicas normales de los mamíferos, el equilibrio de oxidación-reducción celular (redox) en las células aeróbicas se mantiene mediante ROS y antioxidantes (Free Radic. Biol. Med. 2001, 31, 1287-1312). Sin embargo, en ciertas condiciones, la producción excesiva de ROS puede provocar estrés oxidativo, pérdida de la función celular y, en última instancia, apoptosis o necrosis. Por lo tanto, un equilibrio entre los sistemas intracelulares oxidantes y antioxidantes es vital para la función, la regulación y la adaptación celular a las diversas condiciones de crecimiento. Las células cancerosas están normalmente sometidas a un alto estrés oxidativo y también expresan altos niveles de proteínas antioxidantes. Se ha demostrado que estas proteínas antioxidantes están sobre reguladas en las regiones hipóxicas de ciertos tumores, lo que sugiere que los inhibidores podrían exhibir potencialmente una toxicidad hipóxica mejorada y/o un efecto antiangiogénico indirecto. Además, se sabe que las células cancerosas que se desprenden de su entorno normal, como lo serían durante la metástasis, dependen de la actividad de las enzimas antioxidantes para facilitar su supervivencia. Se encuentra que el nivel de enzimas antioxidantes es alto en ciertos cánceres (tumores). Por lo tanto, al considerar el tratamiento de ciertos cánceres, sería un enfoque prudente disminuir los niveles de enzimas antioxidantes.

Los inhibidores de enzimas antioxidantes son las moléculas que regulan la producción de ROS al prevenir o reducir la oxidación de los objetivos de ROS. Los seres humanos han desarrollado sistemas antioxidantes altamente complejos, que funcionan sinérgicamente y en combinación entre sí para proteger las células y los sistemas de órganos del cuerpo contra el daño debido al nivel de ROS no regulado. Estos antioxidantes se producen de forma endógena o se reciben de fuentes exógenas. En las células de mamíferos, los sistemas de tiorredoxina (Trx) y glutatión son dos sistemas antioxidantes principales dependientes de tiol.

Varios estudios implican que la expresión de Trx desregulada es uno de los potenciadores del crecimiento de las células cancerosas, que se produce tanto mediante la estimulación directa del crecimiento de las células cancerosas o mediante la inhibición de la apoptosis de las células cancerosas. El sistema Trx compuesto por la proteína tiorredoxina activa redox (Trx), la enzima tiorredoxina reductasa (TrxR) y el fosfato dinucleotídico de nicotinamida adenina (NADPH), que está presente en casi todas las células vivas. El sistema funciona en reacciones de intercambio tiol-disulfuro dependientes de tiol que son cruciales para el control del entorno redox intracelular reducido, el crecimiento celular, la defensa contra el estrés oxidativo o el control de la apoptosis y tiene funciones multifacéticas en las células de mamíferos, que incluye las implicaciones en el cáncer. El sistema Trx es un sistema omnipresente de oxidorreductasa con funciones reguladoras antioxidantes y redox. La forma oxidada de Trx se reduce mediante tiorredoxina reductasa (TrxR). La propiedad antioxidante de Trx funciona apagando directamente el oxígeno singlete y eliminando los radicales hidroxilos, o indirectamente reduciendo las proteínas objetivo de las especies reactivas de oxígeno oxidadas.

El glutatión es el principal tiol intracelular no proteico, que proporciona una defensa primaria contra el estrés oxidativo. El sistema de glutatión incluye el glutatión reducido denominado GSH y una forma oxidada de glutatión denominada GSSG; las enzimas necesarias para su síntesis y reciclaje, tales como gamma-glutamato cisteína ligasa (Y-GCL), glutatión sintetasa (GS), glutatión reductasa (GR/GSR) y gamma glutamil transpeptidasa (y-GGT); y las enzimas necesarias para su uso en el metabolismo y en los mecanismos de defensa frente al estrés oxidativo inducido por ROS, como las glutatión s-transferasas (GST) y las glutatión peroxidasas (GPx) (Cent. Nerv. Syst. Agents Med. Chem. 2010, 10 (4), 287-297). El glutatión es el cofactor esencial para muchas enzimas que requieren equivalentes reductores de tiol y ayuda a mantener los sitios activos sensibles a redox en la enzima en el estado reducido necesario. Los sistemas celulares de tiol de orden superior, las metalotioneínas, tiorredoxinas y otras proteínas reguladoras redox están reguladas en última instancia por los niveles de GSH y la relación redox GSH/GSSG. El sistema de glutatión es responsable de eliminar ROS y mantener los tioles proteicos en su estado redox apropiado en el citosol y la mitocondria, que es un mecanismo protector importante para minimizar el daño oxidativo.

Las expresiones de tiorredoxina/tiorredoxina reductasa y glutatión (GSH) se encuentran desreguladas en muchas células cancerosas y, por lo tanto, las células cancerosas normalmente se encuentran bajo un alto estrés oxidativo. De hecho, el nivel de ROS no regulado está relacionado con muchos cánceres, tales como cáncer de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, melanoma, mieloma múltiple, leucemia, linfoma, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y sarcoma (Free Radic. Biol. Med., 2010, 49(11), 1603-1616). Por lo tanto, teniendo en cuenta el papel significativo de la tiorredoxina, el glutatión y otras enzimas antioxidantes en las células cancerosas, las enzimas antioxidantes se consideran un objetivo potencial para el tratamiento de muchos cánceres. Una inhibición de las enzimas antioxidantes conduce a la oxidación de las proteínas antioxidantes dando como resultado condiciones celulares con regulación del nivel de ROS, lo que promueve la apoptosis. Los presentes inventores han considerado combinar los inhibidores de enzimas antioxidantes con inhibidores de CDK para su uso en el tratamiento de cánceres.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina (CDK) y al menos un inhibidor de tiorredoxina reductasa, para su uso en el tratamiento del cáncer, donde el inhibidor de CDK se selecciona de alvocidib, riviciclib y voruciclib.

Los ejemplos preferidos de la invención se proporcionan en las reivindicaciones dependientes adjuntas en la presente descripción.

La presente descripción se refiere a una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de CDK y al menos un inhibidor de enzima antioxidante para su uso en el tratamiento del cáncer.

La presente descripción también proporciona una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de CDK y al menos un inhibidor o inhibidores de enzimas antioxidantes seleccionados de inhibidores de glutatión peroxidasa, inhibidores de glutatión reductasa, inhibidores de glutatión transferasa, inhibidores de gamma-glutamato cisteína ligasa, inhibidores de glutatión sintetasa, inhibidores de tiorredoxina reductasa, inhibidores de NADPH oxidasa, inhibidores de catalasa, inhibidores de peroxirredoxina o inhibidores de superóxido dismutasa; en donde dicha combinación se usa en el tratamiento del cáncer.

La descripción se refiere además a una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de CDK y al menos un inhibidor de tiorredoxina reductasa (inhibidor de TrxR) para su uso en el tratamiento del cáncer.

La presente descripción también se refiere a una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de CDK, un inhibidor de TrxR y un inhibidor de enzima antioxidante adicional para su uso en el tratamiento del cáncer.

Otra aplicabilidad de la presente descripción resultará evidente a partir de la descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el efecto de la combinación de un inhibidor de CDK tal como voruciclib y un inhibidor de enzima antioxidante tal como auranofin a concentraciones variables y en diferentes momentos de tiempo en líneas celulares FaDu, en términos de índice de combinación.

La Figura 2 representa el efecto de cada uno de voruciclib y auranofin solos; y de la combinación de voruciclib y auranofin en concentraciones variables, sobre el porcentaje de inhibición del crecimiento celular en líneas celulares FaDu a las 48 h.

La Figura 3 representa el efecto de la combinación de un inhibidor de CDK tal como voruciclib y un inhibidor de enzima antioxidante tal como ebselen a concentraciones variables en líneas celulares FaDu a las 72 h, en términos de índice de combinación.

La Figura 4 representa el efecto de cada uno de voruciclib y ebselen solos; y de la combinación de voruciclib y ebselen en concentraciones variables, sobre el porcentaje de inhibición del crecimiento celular en líneas celulares FaDu a las 72 h.

La Figura 5 representa el efecto de la combinación de un inhibidor de CDK tal como voruciclib y un inhibidor de enzima antioxidante tal como trióxido de arsénico (ATO) a concentraciones variables en líneas celulares FaDu a las 72 h, en términos de índice de combinación.

La Figura 6 representa el efecto de cada uno de voruciclib y ATO solo; y de la combinación de voruciclib y ATO en concentraciones variables, sobre el porcentaje de inhibición del crecimiento celular en líneas celulares FaDu a las 72 h.

La Figura 7 representa el efecto de la combinación de voruciclib y auranofin a concentraciones variables en líneas celulares MDA-MB-231 a las 72 h, en términos de índice de combinación.

La Figura 8 representa el efecto de cada uno de voruciclib y auranofin solos; y de la combinación de voruciclib y auranofin en concentraciones variables, sobre el porcentaje de inhibición del crecimiento celular en líneas celulares MDA-MB-231 a las 72 h.

La Figura 9 representa el efecto de la combinación de voruciclib y ebselen a concentraciones variables en líneas celulares MDA-MB-231 a las 72 h, en términos de índice de combinación.

La Figura 10 representa el efecto de cada uno de voruciclib y ebselen solos; y de la combinación de voruciclib y ebselen en concentraciones variables, sobre el porcentaje de inhibición del crecimiento celular en líneas celulares MDA-MB-231 a las 72 h.

La Figura 11 representa el efecto de la combinación de voruciclib y ATO a concentraciones variables en líneas celulares MDA-Mb-231 a las 72 h, en términos de índice de combinación.

La Figura 12 representa el efecto de cada uno de voruciclib y ATO solo; y de la combinación de voruciclib y ATO en concentraciones variables, sobre el porcentaje de inhibición del crecimiento celular en líneas celulares MDA-MB-231 a las 72 h.

La Figura 13 representa el efecto de la combinación de voruciclib e inhibidor de TrxR sobre el ensayo de crecimiento celular en células hPBMC después de 72 horas de tratamiento con ATO/ebselen o 48 horas con auranofin.

La Figura 14 representa el efecto de la combinación de voruciclib e inhibidor de TrxR sobre el ensayo de crecimiento celular en células MRC5 después de 72 horas de tratamiento con ATO/ebselen o 48 horas con auranofin.

La Figura 15 representa el efecto sobre la producción de ROS después del tratamiento con auranofin y voruciclib solos o en combinación en células FaDu.

La Figura 16 representa el efecto de la combinación de auranofin y voruciclib en el ensayo de tiorredoxina reductasa (TrxR) en células FaDu.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Los términos generales usados en la presente descripción anteriormente y en lo sucesivo preferentemente tienen los siguientes significados dentro del contexto de esta descripción, a menos que se indique de otra manera. Por lo tanto, las definiciones de los términos generales tal como se usan en el contexto de la presente invención se proporcionan a continuación en la presente descripción:

Los términos "un", "una" y "el" se refieren a "uno o más" cuando se usan en la memoria descriptiva objeto, que incluye las reivindicaciones. Así, por ejemplo, la referencia a "una enfermedad" o "una afección" incluye una pluralidad de enfermedades o trastornos.

También debe tenerse en cuenta que el término "o" se emplea generalmente en su sentido que incluye "y/o" a menos que el contenido lo indique claramente de otra manera.

El uso de "(s)" como parte de un término, incluye referencia al término individualmente o en pluralidad, por ejemplo, el término agente (s) terapéutico (s) puede indicar un solo agente terapéutico o dos o más agentes terapéuticos. Como se usa en la presente descripción, el término "y/o" se refiere al menos a uno o ambos de los casos que conecta. Por ejemplo, el término "inhibidor de CDK y/o inhibidor de enzima antioxidante" se refiere a "al menos uno de inhibidor de CDK e inhibidor de enzima antioxidante", que incluye el inhibidor de CDK solo, el inhibidor de enzima antioxidante solo o la combinación del inhibidor de CDK y el inhibidor de la enzima antioxidante.

El término "al menos uno" se refiere a uno, dos, tres o más de los agentes terapéuticos en referencia a los cuales se usa el término. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, el término "al menos un inhibidor de enzima antioxidante" se refiere a "uno o más inhibidores de enzimas antioxidantes", es decir, uno o dos o tres o más inhibidores de enzimas antioxidantes, que pueden usarse en combinación con el inhibidor de CDK en el tratamiento del cáncer.

El término "inhibidor de CDK" como se usa en la presente descripción se refiere a un agente que es capaz de inhibir una o más quinasas dependientes de ciclina (CDk ). Las CDK son una familia de enzimas que se activan en fases específicas del ciclo celular. Las CDK consisten en una subunidad catalítica (la quinasa dependiente de ciclina real o CDK) y una subunidad reguladora (ciclina). Hay al menos nueve CDK, por ejemplo, CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK8, CDK9 y al menos 15 tipos diferentes de ciclinas, por ejemplo, ciclina A, B1, B2, D1, D2, D3, E, H. Cada etapa del ciclo celular está regulada por complejos CDK tales como: transición G1/S (CDK2/ciclina A, CDK4/ciclina D1-D3, CDK6/ciclina D3), fase S (CDK2/ciclina A), fase G2 30 (CDK1/ciclina A), fase de transición G2/M (CDK1/ciclina B). La expresión aberrante y la sobreexpresión de estas quinasas se evidencian en muchas enfermedades como el cáncer.

El término "inhibidor de enzima antioxidante", como se usa en la presente descripción, se refiere a un agente que es capaz de inhibir a una enzima antioxidante. Las enzimas antioxidantes se refieren a moléculas complejas presentes en plantas y animales, que incluye los seres humanos, que inhiben la oxidación de otras moléculas y, por lo tanto, reducen o interrumpen la producción de radicales libres, al oxidarse ellas mismas, es decir, las enzimas antioxidantes son agentes reductores que incluyen, pero no se limitan a, la glutatión peroxidasa, glutatión reductasa, glutatión transferasa, tiorredoxina reductasa, NADP^h oxidasa, catalasa, peroxirredoxina o superóxido dismutasa. Los niveles insuficientes de antioxidantes, o la inhibición de las enzimas antioxidantes, provocan estrés oxidativo y pueden dañar o destruir las células, que desempeña un papel importante en muchas enfermedades, que incluye el cáncer.

El término "combinación farmacéutica" o "combinación", como se usa en la presente descripción, significa la administración combinada de los agentes terapéuticos, que pueden ser agentes anticáncer y/o los agentes que potencian el efecto de los agentes anticáncer. En el contexto de la presente invención, los agentes terapéuticos incluyen un inhibidor de CDK y un inhibidor de enzima antioxidante que pueden administrarse independientemente al mismo tiempo o por separado dentro de intervalos de tiempo de manera que estos intervalos de tiempo permitan que las parejas de la combinación exhiban un efecto sinérgico.

El término "sinérgico" o "efecto sinérgico" como se usa en la presente descripción se refiere al efecto terapéutico logrado con la combinación de la presente invención; que es mayor que la suma de los efectos que resultan de usar el inhibidor de CDK y el inhibidor o inhibidores de la enzima antioxidante solos o por separado. Ventajosamente, tal sinergia entre los agentes terapéuticos permite el uso de dosis más pequeñas de uno o ambos agentes terapéuticos, proporciona una mayor eficacia a las mismas dosis y/o previene o retrasa la acumulación de resistencia a los fármacos. El método del índice de combinación (CI) de Chou y Talalay se puede usar para determinar la sinergia, el efecto aditivo o antagonista de los agentes terapéuticos usados en la combinación (Cancer Res., 2010, 70, 440). Cuando el valor de CI es menor que 1, existe sinergia entre los agentes usados en la combinación; cuando el valor de CI es igual a 1, hay un efecto aditivo entre los agentes usados en la combinación y cuando el valor de CI es mayor que 1, hay un efecto antagonista entre los agentes. El efecto sinérgico puede lograrse tanto coformulando los agentes terapéuticos contenidos en la combinación farmacéutica o la composición como se describe en la presente descripción o administrando dichos agentes terapéuticos simultáneamente a través de una forma de dosificación unitaria o como formulaciones separadas administradas simultánea o secuencialmente.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva", como se usa en la presente descripción, significa una cantidad del inhibidor de CDK o la del inhibidor de la enzima antioxidante efectiva para producir la respuesta terapéutica deseada en un paciente (sujeto) particular que padece cáncer. En particular, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" incluye la cantidad de agentes terapéuticos que, cuando se administran, lograrán los efectos terapéuticos deseados. En el contexto de la presente invención, los efectos terapéuticos deseados incluyen inhibición, retraso o prevención parcial o total de la progresión del cáncer, que incluye la metástasis del cáncer; inhibición, retraso o prevención de la recurrencia del cáncer, que incluye la metástasis del cáncer; y/o la prevención de la aparición o desarrollo de cáncer (quimioprevención) en un sujeto. Con respecto a la cantidad terapéutica de los agentes terapéuticos, es decir, el inhibidor de CDK y el (los) inhibidor (es) de la enzima antioxidante, también se considera que la cantidad de cada uno de los agentes terapéuticos usados para el tratamiento de un sujeto es lo suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves o no deseados, dentro del alcance del buen juicio médico. La cantidad terapéuticamente efectiva de cada uno de los inhibidores de CDK y los inhibidores de la enzima antioxidante cuando se usan en combinación variará con la edad y la condición física del usuario final, la gravedad del cáncer, la duración del tratamiento, la naturaleza de cualquier otra terapia concurrente, el tipo específico de agente terapéutico empleado para el tratamiento, el portador particular farmacéuticamente aceptable usado en las composiciones farmacéuticas que contienen los agentes terapéuticos (el inhibidor de CDK y/o el (los) inhibidor (es) de la enzima antioxidante) y otros factores relevantes.

El término "sujeto", como se usa en la presente descripción, se refiere a un animal, particularmente un mamífero, y más particularmente, un ser humano. El término "mamífero" usado en la presente descripción se refiere a animales vertebrados de sangre caliente de la clase "Mammalia", que incluye los seres humanos, caracterizados por una cubierta de pelo en la piel y, en las hembras, glándulas mamarias productoras de leche para nutrir a las crías. El término mamífero incluye animales tales como gatos, perros, conejos, osos, zorros, lobos, monos, ciervos, ratones, cerdos y humanos. El término "sujeto" puede usarse indistintamente con el término paciente. En el contexto de la presente invención, la frase "un sujeto que lo necesita" significa un sujeto que necesita el tratamiento para el cáncer. Alternativamente, la frase "un sujeto que lo necesita" significa un sujeto (paciente) diagnosticado con cáncer.

Los términos "tratar", "tratamiento" o "tratado" se refieren al tratamiento terapéutico y las medidas profilácticas para prevenir la recurrencia, en donde el objetivo es inhibir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como el desarrollo o propagación del cáncer. Para los fines de esta invención, los efectos terapéuticos deseados incluyen, con referencia al cáncer en un sujeto, que incluyen: (i) inhibición, retraso o prevención parcial o total de la progresión del cáncer, que incluye la metástasis del cáncer; (ii) inhibición, retraso o prevención de la recurrencia del cáncer, que incluye la metástasis del cáncer; (iii) la prevención de la aparición o desarrollo de cáncer (quimioprevención) en un sujeto (iv) la inhibición de la infiltración de células tumorales en órganos periféricos; (v) mejora del cáncer, es decir, reducción de la gravedad de los síntomas asociados con el cáncer y/o (vi) alivio, hasta cierto punto, de uno o más síntomas asociados con el cáncer.

El término "apoptosis" se refiere al proceso natural de muerte celular programada. Este es un proceso de autodestrucción, en el que la célula usa la maquinaria celular especializada para matarse. Las células se desintegran en partículas unidas a la membrana que luego se eliminan por fagocitosis. La apoptosis es un mecanismo que permite a los metazoos controlar el número de células y eliminar las que amenazan la supervivencia del animal.

El término "farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente descripción significa que el portador, diluyente, excipiente y/o sal usado en la composición debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para el receptor de la misma. "Farmacéuticamente aceptable" también significa que las composiciones o formas de dosificación están dentro del alcance de un juicio médico sólido, adecuadas para su uso en un sujeto, tal como un animal o un ser humano, sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones excesivas, acordes con una relación beneficio/riesgo razonable.

El término "agente (s) terapéutico (s)" como se usa significa "un agente anticanceroso "y/o "un agente que potencia el efecto del agente terapéutico que se usa en combinación". El o los agentes anticancerígenos actúan inhibiendo o previniendo el crecimiento del tumor. El término "agente anticáncer" en general se refiere a los compuestos que evitan que las células cancerosas se multipliquen (es decir, agentes antiproliferativos). En general, el (los) agente (s) anticáncer pueden ser agentes citotóxicos o agentes citostáticos. Los agentes citotóxicos evitan que las células cancerosas se multipliquen al: (1) interferir con la capacidad de la célula para replicar el ADN; y (2) inducir la muerte celular y/o apoptosis en las células cancerosas. Los agentes citostáticos actúan modulando, interfiriendo o inhibiendo los procesos de transducción de señales celulares que regulan la proliferación celular.

De acuerdo con un ejemplo, la presente descripción se refiere a una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de CDK y al menos un inhibidor de enzima antioxidante para su uso en el tratamiento del cáncer.

La presente descripción se refiere a una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de CDK y al menos un inhibidor de tiorredoxina reductasa (inhibidor de TrxR) para su uso en el tratamiento del cáncer.

En otro ejemplo, la presente descripción se refiere a una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de CDK, un inhibidor de TrxR y un inhibidor de enzima antioxidante adicional para su uso en el tratamiento del cáncer. En otro ejemplo más, la presente descripción se refiere a un kit farmacéutico que comprende un recipiente que contiene: (i) un inhibidor de CDK, (ii) uno o dos o más inhibidores de enzimas antioxidantes (iii) un prospecto que comprende instrucciones para usar inhibidores de CDK en combinación con inhibidores de enzimas antioxidantes para el tratamiento del cáncer.

Como se indicó en la presente descripción anteriormente, "al menos un inhibidor de enzimas antioxidantes" se refiere a "uno o más inhibidores de enzimas antioxidantes", es decir, uno o dos o tres o más inhibidores de enzimas antioxidantes, que se pueden usar en combinación con los inhibidores de CDK en el tratamiento del cáncer.

Los siguientes son los inhibidores de CDK palbociclib (PD-0332991, Pfizer), dinaciclib (SCH 727965, Merck & Co.), seliciclib (CYC-202, Cyclacel), milciclib (PHA-848125, Pfizer), LEE-011 (Novartis), bemaciclib (LY2835219, Lilly), 7-hidroxi estaurosporina (UCN-01, Kyowa Hakko Kirin), alvocidib (flavopiridol, Sanofi), JNJ-7706621 (Johnson & Johnson), BMS-387032 (SNS-032, Bristol-Myers Squibb), AT7519M (Astex Therapeutics), riviciclib (Piramal Enterprises Ltd.), voruciclib (Piramal Enterprises Ltd.), roniciclib (BAY-1000394, Bayer), ZK-304709 (Bayer Schering Pharma), ON-123300 (Onconova), CYC- 065 (Cyclacel), LS-007 (Universidad de Australia del Sur), P^hA-793887 (Bayer), TG-02 (SB-1317, S * BIO), olomucina o purvalanol A.

En la presente invención, el inhibidor de CDK se selecciona de: alvocidib, riviciclib y voruciclib.

Dinaciclib (SCH-727965), desarrollado por Merck & Co., es un inhibidor potente y selectivo de CDK1, CDK2, CDK5 y CDK9. Dinaciclib es un fármaco experimental que demuestra actividad contra un amplio panel de líneas de células tumorales que incluyen cánceres de mama, de células pequeñas y no pequeñas de pulmón, de colon y de próstata. Dicho compuesto dinaciclib se refiere a 2-[1-[3-etil-7-(1-oxidopiridin-3-ilmetilamino)pirazolo[1,5-a] pirimidin-5-il]piperidin-2(S)-il]etanol, que se describe en La solicitud PCT No. WO2005077954 Publicada, en donde se describe un proceso para su fabricación.

Milciclib (PHA-848125), desarrollado por Pfizer, es un inhibidor oral de múltiples CDK. El compuesto se encuentra actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento del carcinoma tímico. Dicho compuesto milciclib se refiere a N,1,4,4-tetrametil-8-[4-(4-metilpiperazin-1-il)fenilamino]-4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-h]quinazolina-3-carboxamida, que se describe en La solicitud de patente PCT No. WO2004104007 Publicada, en donde se describe un proceso para su fabricación.

Seliciclib (CYC-202), desarrollado por CNRS, es un inhibidor de CDK de molécula pequeña y se informó que es un inhibidor más potente de CDK2. Seliciclib también conocido como R-roscovitina es el isómero R puro de roscovitina. El compuesto se encuentra actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de cánceres, tales como el linfoma y el cáncer de nasofaringe. Dicho compuesto seliciclib se refiere a (-)-6-(bencilamino)-2-[1(R)-(hidroximetil)propilamino]-9-isopropilpurina, que se describe en La solicitud de patente PCT No. WO1997020842 Publicada, en donde se describe el proceso para su fabricación.

Alvocidib (flavopiridol), desarrollado por Sanofi (originalmente Hoechst Marion Roussel), es un flavonoide sintético en base a un extracto de una planta india. Se informa que alvocidib es un inhibidor de pan-CDK. Alvocidib es actualmente un candidato clínico para el tratamiento de cánceres tales como leucemia mieloide aguda, cáncer de estómago avanzado o cáncer de la unión gastroesofágica, etc. Dicho compuesto alvocidib se refiere a (-)-cis-2-(2-clorofenil) -5,7-dihidroxi-8-(3-hidroxi-1-metilpiperidin-4-il)-4H-1-benzopiran-4-ona clorhidrato, que se describe en la patente de Estados Unidos No. US5284856, en donde se describe el proceso para su fabricación.

Riviciclib, desarrollado por Piramal Enterprises Ltd. es un potente inhibidor de CDK. Riviciclib, un fármaco experimental para el tratamiento del cáncer, se refiere a (+)-2-(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(2R,3S)-2-(hidroximetil)-1-metilpirrolidina-3-il]-4H-cromen-4-ona hidrocloruro, que se describe en la solicitud de patente PCT publicada. No. WO2004004632, en donde se describe el proceso para su fabricación.

Voruciclib, un inhibidor de CDK, se desarrolla por Piramal Enterprises Ltd. para el tratamiento del cáncer. Dicho compuesto voruciclib se refiere a (+)-2-[2-cloro-4-(trifluorometil)fenil]-5,7-dihidroxi-8-[(2R,3S)-2-(hidroximetil)-1-metilpirrolidina-3-il]-4H-cromen-4-ona hidrocloruro, que se describe en la solicitud de Patente PCT Publicada. No. WO2007148158, en donde se describe el proceso para su fabricación.

LEE-011, desarrollado por Novartis, es un inhibidor de CDK4, CDK6 y JAK3. Se están realizando ensayos clínicos para LEE-011 para el tratamiento del cáncer de mama, tumores sólidos, linfoma, melanoma, tumor rabdoide, neuroblastoma, etc., solo o en combinación con otros agentes anticancerosos. Dicho compuesto LEE-011 se refiere a 7-ciclopentil-N,N-dimetil-2-[5-(1-piperazinil)piridin-2-ilamino]-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida, que se describe en la Solicitud de Patente PCT Publicada. No. WO2007140222, en donde se describe el proceso para su fabricación.

Bemaciclib (LY2835219), desarrollado por Lilly, es un inhibidor de la quinasa CDK4, CDK6 y Pim-1. Bemaciclib es un candidato clínico para el tratamiento de cánceres tales como linfoma de células del manto en recaída o refractario, cáncer de mama metastásico, cáncer de pulmón de células no pequeñas; ya sea solo o en combinación con otros agentes anticancerosos. Dicho compuesto bemaciclib se refiere a (N-[5-(4-etilpiperazin-1-ilmetil)piridin-2-il]-5-fluoro-4-(4-fluoro-1-isopropil-2-metil-1H-bencimidazol-6-il) pirimidin-2-amina metanosulfonato, que se describe en la solicitud de Patente PCT Publicada. No. WO2010075074, en donde se describe el proceso para su fabricación. Palbociclib (PD-0332991), desarrollado por Pfizer, es un inhibidor de molécula pequeña potente, altamente específico y activo por vía oral de CDK4 y CDK6. Palbociclib se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento de liposarcoma, cáncer de mama, mieloma múltiple, carcinoma hepatocelular, glioblastoma multiforme, leucemia, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de cabeza y cuello, etc. Dicho compuesto palbociclib se refiere al 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-[5-(1-piperazinil piridin-2-ilamino]pirido[2,3-d]pirimidin-7 (8H)-ona, que se describe en la solicitud de Patente PCT Publicada. No. WO2003062236, en donde se describe el proceso para su fabricación. Los inhibidores de enzimas antioxidantes son: inhibidor de tiorredoxina reductasa (inhibidor de TrxR), inhibidores de glutatión peroxidasa, inhibidores de glutatión reductasa, inhibidores de glutatión transferasa, inhibidores de gammaglutamato cisteína ligasa o inhibidores de glutatión sintetasa.

En la presente invención, el inhibidor de la enzima antioxidante es un inhibidor de tiorredoxina reductasa (inhibidor de TrxR).

Otro inhibidor de la enzima antioxidante es un inhibidor de superóxido dismutasa.

Otro inhibidor de la enzima antioxidante es un inhibidor de la NADPH oxidasa.

Los siguientes son inhibidores de enzimas antioxidantes: ácido azelaico (Bayer Schering), carmustina (Eisai), motexafina gadolinio (National Cancer Institute Pharmacyclics), laromustina (Nanotherapeutics Yale University), auranofin (GlaxoSmithKline), NSC-721641 (cancer Research Technology), trióxido de arsénico (Cell Therapeutics), ebselen (Sanofi), aurotioglucosa (Merck), ciclofosfamida (Bristol-Myers Squibb), menadiona (Bristol-Myers Squibb y Sanofi), 2,4-dinitroclorobenceno (Universidad de California), butionina sulfoximina (BSO, Instituto Nacional del Cáncer), cisplatino (Bristol-Myers Squibb), oxaliplatino (Sanofi), iniparib (Universidad de California), ácido elágico (Sigma Chemical Aldrich), PX-C5 (ProlX), PX-12 (ProlX, Oncothyreon), PX -36 (ProlX), PX-960 (ProlX), PX-916 (ProlX), TH-169 (Universidad de Pittsburgh), TH-223 (Universidad de Pittsburgh), dietilditiocarbamato, DTI-015 (Terapéutica directa), ácido tiomolibdico sal de amonio, ATN-224 (Decuprate, Tactic Pharma), CEU-025 (Universite Laval), CEU-152 (Universite Laval), CEU-169 (Universite Laval), TLK-117 (Telik), IG-1 (Universidad de Jinan), IG-3 (Universidad de Jinan), SK-053 (Academia de Ciencias de Polonia), CPV-159 (Universidad de Puerto Rico), CPV-154 (Universidad de Puerto Rico), CPV-156 (Universidad de Puerto Rico), SR-4 (Beckman Research Institute City of Hope), BE-40644 (MSD) o complejos de oro.

En un ejemplo, el inhibidor de la enzima antioxidante es un inhibidor de TrxR seleccionado de ácido azelaico, carmustina, motexafina gadolinio, laromustina, auranofin, NSC-721641, trióxido de arsénico, ebselen, aurotioglucosa, ciclofosfamida, menadiona, 2,4-dinitroclorobenceno, oxaliplatinobenceno. PX-C5, PX-12, PX-36, PX-960, PX-916, TH-169, TH-223, CEU-025, CEU-152, CEU-169, IG-1, IG-3, SK- 053, CPV-159, CPV-154, CPV-156, BE-40644 o complejos de oro.

En otro ejemplo, el inhibidor de TrxR se selecciona de ácido azelaico, carmustina, motexafina gadolinio, laromustina, auranofin, trióxido de arsénico, ebselen, menadiona, 2,4-dinitroclorobenceno, cisplatino, oxaliplatino, aurotioglucosa u complejos de oro.

Otros inhibidores de enzimas antioxidantes son: un inhibidor de glutatión peroxidasa, inhibidor de glutatión reductasa, inhibidor de glutatión transferasa, inhibidor de gamma-glutamato cisteína ligasa o inhibidor de glutatión sintetasa seleccionado de carmustina, trióxido de arsénico, butionina sulfoximina, DTI-015, 2,4-dinitroximina -053, ácido elágico, TLK-117, SR-4 o complejos de oro.

Otro inhibidor de la enzima antioxidante es un inhibidor de superóxido dismutasa seleccionado de sal de amonio del ácido tiomolíbdico, ATN-224 o dietilditiocarbamato.

El auranofin, desarrollado por GlaxoSmithKline, es un compuesto de oro orgánico lipofílico, biodisponible por vía oral, que tiene actividades antiinflamatorias y antineoplásicas potenciales y se usa para el tratamiento de la artritis reumatoide. El auranofin bloquea la actividad de la tiorredoxina reductasa, por lo que induce estrés oxidativo que conduce a la inducción de apoptosis.

El trióxido de arsénico, desarrollado por Cell Therapeutics, se lanza como Trisenox® para el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda (APL) en recaída o refractaria. Se ha informado que Trisenox® induce la apoptosis al producir especies reactivas de oxígeno y daño mitocondrial in vitro y activa la caspasa in vitro y en seres humanos. Ebselen, desarrollado por Sanofi, es un compuesto selenoorgánico sintético soluble en lípidos que tiene una potente capacidad antioxidante. Se ha informado de ebselen y diselenida de ebselen como sustratos para la tiorredoxina reductasa de mamíferos y sus mecanismos de reacción se han descrito en J. Biol. Chem., 2002, 277, 39456-62. El 2,4-dinitroclorobenceno (DNCB), desarrollado por la Universidad de California, es un inhibidor específico de la tiorredoxina reductasa y podría inducir la oxidación de la tiorredoxina.

Los inhibidores de CDK y/o el (los) inhibidor (es) de la enzima antioxidante contenidos en la combinación farmacéutica o usados en combinación para el tratamiento del cáncer, se pueden usar en forma de sus solvatos, por ejemplo, hidratos, y los solvatos formados con otros solventes de cristalización, como alcoholes, éteres, acetato de etilo, dioxano, dimetilformamida o una alquil cetona inferior, como acetona, o mezclas de los mismos. Los compuestos contenidos en la combinación farmacéutica de la presente descripción se pueden usar en sus formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas físicas son adecuadas para los usos contemplados por la presente descripción.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica, el inhibidor de CDK se usa en combinación con un inhibidor de enzima antioxidante.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica, el inhibidor de CDK se usa en combinación con dos inhibidores de enzimas antioxidantes.

En la combinación farmacéutica, el inhibidor de CDK se usa en combinación con un inhibidor de T rxR.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica, el inhibidor de CDK se usa en combinación con dos inhibidores de TrxR.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica, el inhibidor de CDK se usa en combinación con un inhibidor de TrxR y un inhibidor de enzima antioxidante adicional.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica, el inhibidor de CDK se usa en combinación con un inhibidor de TrxR y un inhibidor de enzima antioxidante seleccionado entre inhibidor de TrxR, inhibidores de glutatión peroxidasa, inhibidores de glutatión reductasa, inhibidores de glutatión transferasa, inhibidores de gamma-glutamato cisteína ligasa o inhibidores de glutatión sintetasa.

En un ejemplo, en la industria farmacéutica, el inhibidor de CDK se usa en combinación con un inhibidor de TrxR y el inhibidor de superóxido dismutasa.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica, el inhibidor de CDK se usa en combinación con un inhibidor de TrxR y un inhibidor de NADPH oxidasa.

En un ejemplo, el inhibidor de CDK es alvocidib.

En otro ejemplo, el inhibidor de CDK es riviciclib.

En otro ejemplo más, el inhibidor de CDK es voruciclib.

En un ejemplo, el inhibidor de la enzima antioxidante es el ácido azelaico.

En otro ejemplo, el inhibidor de la enzima antioxidante es la carmustina.

En otro ejemplo más, el inhibidor de la enzima antioxidante es el auranofin.

En otro ejemplo más, el inhibidor de la enzima antioxidante es el trióxido de arsénico.

En otro ejemplo más, el inhibidor de la enzima antioxidante es ebselen.

En otro ejemplo más, el inhibidor de la enzima antioxidante es la menadiona.

En otro ejemplo más, el inhibidor de la enzima antioxidante es 2,4-dinitroclorobenceno.

En otro ejemplo más, el inhibidor de la enzima antioxidante es cisplatino.

En otro ejemplo más, el inhibidor de la enzima antioxidante es oxaliplatino.

En otro ejemplo más, el inhibidor de la enzima antioxidante es aurotioglucosa.

En otro ejemplo más, el inhibidor de la enzima antioxidante es un complejo de oro.

En un ejemplo, la combinación farmacéutica se usa para tratar cáncer o afecciones cancerosas que incluyen, pero no se limitan a, tumores del tracto gastrointestinal, tumores de mama, tumores de la piel, tumores del cerebro y del sistema nervioso central, tumores de la sangre y sistema linfático, cáncer de cabeza y cuello, tumores del sistema excretor, tumores del sistema esquelético, tumores de la cavidad bucal, tumores del tracto respiratorio, tumores del sistema reproductor o tumores del hígado y órganos digestivos.

Los ejemplos de tumores del tracto gastrointestinal incluyen, pero no se limitan a, colorrectal, esófago, recto, colon, unión rectosigmoide, ano, canal anal, intestino delgado y estómago.

Los ejemplos de tumores de piel incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de piel de células basales, melanoma maligno de la piel, cáncer de piel no melanoma, mesotelioma, carcinoma de piel de células escamosas, sarcoma de Kaposi.

Los ejemplos de tumores del cerebro y del sistema nervioso central incluyen, pero no se limitan a, cerebro, nervios craneales, médula espinal, tumores de las meninges y otras partes del sistema nervioso central, tales como glioblastomas o blastomas de médula.

Los ejemplos de tumores de la sangre y del sistema linfático incluyen, pero no se limitan a, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de burkitt, linfomas relacionados con el SIDA, enfermedades inmunoproliferativas malignas, mieloma múltiple y neoplasias malignas de células plasmáticas, leucemia linfoide, leucemia mieloide, leucemia linfocítica aguda o crónica, leucemia monocítica, otras leucemias de tipo celular específico, leucemia de tipo celular no específica, neoplasias malignas no específicas de tejidos linfoides, hematopoyéticos y afines, tal como linfoma difuso de células grandes, linfoma de células T o linfoma de células T cutáneo.

Los ejemplos de tumores del sistema excretor incluyen, pero no se limitan a, riñón, uréter, vejiga, pelvis renal y otros órganos urinarios.

Los ejemplos de tumores del sistema esquelético incluyen, pero no se limitan a, cartílago articular óseo, cartílago articular y óseo de extremidades y otros sitios.

Los ejemplos de tumores de la cavidad oral incluyen, entre otros, piso de la boca, labios, lengua, encías, paladar, seno puriforme, glándula parótida, glándulas salivales, amígdalas, glándula tiroides, orofaringe, nasofaringe, hipofaringe y otros sitios. de la cavidad bucal.

Los ejemplos de tumores del tracto respiratorio incluyen, pero no se limitan a, cavidad nasal, oído medio, senos accesorios, laringe, tráquea, bronquios y pulmón, tales como cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas.

Los ejemplos de tumores del sistema reproductivo incluyen, pero no se limitan a, cuello uterino, vulva, ovario, vagina, útero y otros sitios asociados con los órganos genitales femeninos, próstata, placenta, testículos, pene y otros sitios asociados con los órganos genitales masculinos.

Los ejemplos de tumores del hígado y órganos digestivos incluyen, pero no se limitan a, hígado, conductos biliares intrahepáticos, vesícula biliar y otras partes del tracto biliar, páncreas y otros órganos digestivos.

En un ejemplo, el cáncer se selecciona de tumores de mama, tumores de piel, cáncer de cabeza y cuello, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del tracto respiratorio.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK y al menos un inhibidor de enzima antioxidante se pueden administrar simultáneamente.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK y al menos un inhibidor de enzima antioxidante se pueden administrar secuencialmente.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK se puede administrar antes de la administración del inhibidor (es) de la enzima antioxidante.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor (es) de la enzima antioxidante se pueden administrar antes de la administración del inhibidor de CDK.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK se puede administrar aproximadamente al mismo tiempo que la administración del inhibidor (es) de la enzima antioxidante.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK y el inhibidor (es) de la enzima antioxidante pueden administrarse una vez al día. En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción; el inhibidor de CDK se administra una vez al día, mientras que el inhibidor (es) de la enzima antioxidante se puede administrar dos veces al día.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción; el inhibidor de CDK se administra dos veces al día, mientras que el inhibidor (es) de la enzima antioxidante se puede administrar una vez al día.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK y el inhibidor (es) de la enzima antioxidante se puede administrar dos veces al día. En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK y al menos un inhibidor de TrxR se pueden administrar simultáneamente.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK y al menos un inhibidor de TrxR se pueden administrar secuencialmente.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK se puede administrar antes de la administración del inhibidor (es) de TrxR.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor (es) de TrxR se puede administrar antes de la administración del inhibidor de CDK.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK se puede administrar aproximadamente al mismo tiempo que la administración del inhibidor (es) de TrxR.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK y el inhibidor (es) de TrxR se pueden administrar una vez al día.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción; el inhibidor de CDK se puede administrar una vez al día, mientras que el inhibidor (es) de TrxR se puede administrar dos veces al día.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción; el inhibidor de CDK se puede administrar dos veces al día, mientras que el inhibidor (es) de TrxR se puede administrar una vez al día.

En un ejemplo, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción, el inhibidor de CDK y el inhibidor (es) de TrxR se pueden administrar dos veces al día.

En un ejemplo, la combinación farmacéutica para el uso de acuerdo con la presente descripción puede ser efectiva para el tratamiento de sujetos ingenuos y en recaída o refractarios que padecen cáncer o afecciones cancerosas. En un ejemplo, el inhibidor de CDK y/o uno o más inhibidores de enzimas antioxidantes pueden administrarse por vías de administración convencionales que incluyen, pero no se limitan a, oral, parenteral, nasal, rectal, sublingual, transdérmica, tópica, aerosol, intraocular o intratraqueal.

En un ejemplo, el inhibidor de CDK y/o uno o más de los inhibidores de la enzima antioxidante se pueden administrar en una forma adecuada para la administración oral, como tabletas, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos, polvos, sellos, emulsiones, cápsulas, jarabes, elixires y similares.

En otro ejemplo, el inhibidor de CDK y/o uno o más de los inhibidores de la enzima antioxidante pueden administrarse por vía parenteral tal como, por vía intramuscular, intratecal, subcutánea, intraperitoneal, inyección intravenosa en bolo o infusión intravenosa. La administración parenteral se puede lograr incorporando el inhibidor de CDK y/o el inhibidor de la enzima antioxidante en una solución o suspensión.

En otro ejemplo, el inhibidor de CDK y/o uno o más de los inhibidores de la enzima antioxidante se pueden administrar por vía rectal. La administración rectal incluye administrar los compuestos en el recto o el intestino grueso. Esto se puede lograr mediante el uso de supositorios o enemas. Las formulaciones de supositorios se pueden preparar mediante métodos conocidos en la técnica.

En un ejemplo, el inhibidor de CDK y/o uno o más de los inhibidores de la enzima antioxidante se pueden administrar en forma de una composición farmacéutica que contiene dicho inhibidor de CDK y/o uno o más de los inhibidores de la enzima antioxidante. y al menos un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica comprende un inhibidor de CDK y/o al menos un inhibidor de enzima antioxidante y uno o más diluyentes, excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. Para la producción de píldoras, tabletas, tabletas recubiertas y cápsulas de gelatina dura, los excipientes farmacéuticamente activos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, lactosa, almidón de maíz o derivados del mismo, goma arábiga, magnesia o glucosa, etc. Para cápsulas de gelatina suave y supositorios, los portadores que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, grasas, ceras, aceites naturales o endurecidos, etc. Los portadores adecuados para la producción de soluciones son, por ejemplo, soluciones inyectables o para emulsiones o jarabes, por ejemplo, agua, solución fisiológica de cloruro de sodio o alcoholes, por ejemplo, etanol, propanol o glicerol, soluciones de azúcar, tales como soluciones de glucosa o soluciones de manitol, o una mezcla de los diversos solventes que se han mencionado. Los diluyentes, excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables usados en la composición farmacéutica pueden ser cualesquier diluyentes, excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables conocidos convencionalmente, que se pueden seleccionar en dependencia de la forma de dosificación y la vía de administración del inhibidor de CDK y los inhibidores de enzimas antioxidantes.

El inhibidor de CDK y/o el inhibidor de la enzima antioxidante se pueden formular en formas de dosificación farmacéuticas mediante el uso de técnicas farmacéuticas convencionales familiares para un experto en la técnica, tales como mediante mezcla, granulación, disolución o liofilización.

En general, las composiciones destinadas a uso farmacéutico se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas, por ejemplo, Remington - The Science and Practice of Pharmacy (21ra edición) (2005)), Goodman & Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics (11na edición) (2006)) y Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (9na ediciónj, y Solid-State Chemistry of Drugs (2da edición) (1999)).

Las composiciones descritas en la presente descripción pueden estar en una forma adecuada para la administración oral, por ejemplo, formas de dosificación sólidas como comprimidos, cápsulas, grageas o gránulos; formas de dosificación líquidas tales como emulsiones, soluciones, suspensiones; para inyección parenteral (que incluye intravenosa, subcutánea, intramuscular, intravascular o infusión) por ejemplo, como una solución, suspensión o emulsión estéril; para administración tópica, por ejemplo, como pomada, crema, gel o loción.

Las composiciones para administraciones orales pueden estar en forma de comprimidos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos, polvos, sellos, emulsiones, cápsulas, jarabes o elixires. Las composiciones administradas por vía oral pueden contener uno o más agentes opcionales, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartamo o sacarina; agentes aromatizantes como menta, aceite de gaulteria o cereza; agentes colorantes; y agentes conservantes, para proporcionar una preparación farmacéuticamente apetitosa. Las membranas selectivamente permeables que rodean un compuesto de conducción osmóticamente activo también son adecuadas para la administración oral de los compuestos (inhibidor de CDK y/o inhibidor de enzima antioxidante) contenidos en la combinación farmacéutica de la presente descripción. Las composiciones adecuadas para la administración oral pueden incluir portadores estándares tales como manitol, lactosa, almidón, almidón de maíz, estearato de magnesio, talco, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Tales portadores son preferentemente de calidad farmacéutica.

Para ungüentos y cremas, el ingrediente activo (inhibidor de CDK y/o inhibidor de enzima antioxidante) se puede formular en base de aceite en agua o agua en aceite.

Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso, normalmente se emplean soluciones estériles del ingrediente activo (inhibidor de CDK y/o inhibidor de enzima antioxidante), y el pH de las soluciones debe ajustarse y tamponarse adecuadamente.

Además, el efecto anticanceroso de los compuestos (inhibidor de CDK y/o inhibidores de enzimas antioxidantes) contenidos en la composición farmacéutica puede retrasarse o prolongarse mediante una formulación adecuada. Por ejemplo, se puede preparar un sedimento lentamente soluble del compuesto e incorporarlo en una tableta o cápsula. La técnica se puede mejorar haciendo sedimentos de diferentes velocidades de disolución y llenando cápsulas con una mezcla de los sedimentos. Los comprimidos o cápsulas pueden recubrirse con una película que resista la disolución durante un período de tiempo predecible. Incluso las preparaciones parenterales pueden tener una acción prolongada, disolviendo o suspendiendo el compuesto en portadores aceitosos o emulsionados que le permiten dispersarse sólo lentamente en el suero.

Aunque las dosis efectivas del inhibidor de la CDK y/o del inhibidor de la enzima antioxidante usadas para la administración varían en dependencia de la gravedad de la enfermedad (cáncer), la gravedad de los síntomas, la edad, el sexo, el peso corporal y la diferencia de sensibilidad del sujeto (el paciente), el modo, el tiempo, el intervalo y la duración de la administración, la naturaleza y el tipo de formulación, etc. En ciertos ejemplos, el inhibidor de CDK y/o uno o más inhibidores de enzimas antioxidantes se pueden administrar en un marco de tiempo en el que ambos agentes siguen activos. Un experto en la técnica podrá determinar dicho marco de tiempo determinando la vida media de los agentes terapéuticos administrados. Como se indicó anteriormente en la presente descripción, en la combinación farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente descripción; el inhibidor de CDK y uno o más inhibidores de enzimas antioxidantes pueden administrarse simultánea o secuencialmente y cuando se administran secuencialmente en cualquier orden. El inhibidor de CDK y los inhibidores de enzimas antioxidantes pueden administrarse de manera que el efecto farmacocinético máximo de un compuesto coincida con el efecto farmacocinético máximo del otro.

En un ejemplo, el inhibidor de CDK y el inhibidor de la enzima antioxidante pueden administrarse ambos una vez al día. En otro ejemplo, el inhibidor de CDK y el inhibidor de la enzima antioxidante pueden administrarse ambos dos veces al día. En un ejemplo adicional, el inhibidor de CDK se puede administrar una vez al día, mientras que los inhibidores de la enzima antioxidante se pueden administrar dos veces al día. En otro ejemplo más, el inhibidor de la enzima antioxidante se puede administrar una vez al día, mientras que el inhibidor de CDK se puede administrar dos veces al día. Sin embargo, la cantidad de cada agente anticanceroso cuando se usa en combinación será típicamente menor que una cantidad que produciría un efecto terapéutico si se administrara solo. Por conveniencia, la dosis diaria total se puede dividir y administrar en porciones durante el día, si se desea.

La dosificación de los agentes terapéuticos (inhibidor de CDK e inhibidores de enzimas antioxidantes) a administrar debe seleccionarse para producir el efecto deseado. Una dosificación adecuada del inhibidor de CDK puede ser de aproximadamente 10 mg/día a aproximadamente 2000 mg/día. Una dosificación adecuada del inhibidor de la enzima antioxidante puede ser de aproximadamente 10 mg/día a aproximadamente 3000 mg/día.

En un ejemplo, el inhibidor de CDK se puede administrar desde aproximadamente 50 mg/día hasta aproximadamente 1000 mg/día. En otro ejemplo, el inhibidor de la enzima antioxidante se puede administrar desde aproximadamente 50 mg/día hasta aproximadamente 2000 mg/día.

Las combinaciones proporcionadas por esta descripción se han evaluado en ciertos sistemas de ensayo y en varios programas administrativos diferentes in vitro. Los detalles experimentales son los que se proporcionan a continuación en la presente descripción. Los datos presentados en la presente descripción indican claramente que el inhibidor de la enzima antioxidante, particularmente un inhibidor de TrxR cuando se combina con un inhibidor de CDK, exhibe un efecto sinérgico. Está claramente indicado que los agentes terapéuticos cuando se usan en combinación en el tratamiento del cáncer dan como resultado un aumento de la apoptosis o citotoxicidad en las células proliferativas que cuando las células se tratan solo con el inhibidor de CDK o solo con el inhibidor de la enzima antioxidante, particularmente el inhibidor de TrxR.

En un aspecto, la presente descripción se refiere a un kit farmacéutico ("el kit") que comprende un recipiente que contiene: (i) un inhibidor de CDK, (ii) uno o dos o más inhibidores de enzimas antioxidantes, y (iii) un prospecto que comprende instrucciones para el uso de inhibidores de CDK en combinación con inhibidores de enzimas antioxidantes para el tratamiento del cáncer.

El kit puede contener dos o más recipientes separados para el inhibidor de CDK y los inhibidores de enzimas antioxidantes. El prospecto incluye información acerca de la indicación, uso, dosis, dirección de administración, contraindicaciones, precauciones y advertencias. El recipiente adecuado que se puede usar incluye una botella, un vial, una ampolla, una jeringa o un blíster. El kit farmacéutico puede comprender opcionalmente un recipiente adicional que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, agua para inyección, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa.

La presente descripción, particularmente el uso del inhibidor de CDK en combinación con uno o más inhibidores de enzimas antioxidantes, se ha evaluado mediante el uso de ciertos métodos/sistemas de ensayo y en varios programas administrativos diferentes in vitro e in vivo. Los detalles experimentales son los que se proporcionan a continuación en la presente descripción.

Los expertos en la técnica reconocerán que son posibles varias variaciones. La descripción se describirá ahora con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la descripción.

En la presente descripción se usan las siguientes abreviaturas o términos:

ATM: Aurotiomalato

ATO: Trióxido de arsénico

CI: Índice de combinación

CDK: Quinasa dependiente de ciclina

Inhibidor de CDK: Inhibidor de quinasa dependiente de ciclina

DCFDA: Diacetato de 2',7-diclorofluorescina

DCF: 2',7-diclorofluorescina

DMSO: Dimetilsulfóxido

DNCB: 2,4-dinitroclorobenceno

DPBS: Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco

FBS: Suero bovino fetal

MCT: Tubo de microcentrífuga

NADPH: Fosfato de dinucleótido de adenina de nicotinamida

PI: Yoduro de propidio

ROS: Especies reactivas de oxígeno

TBHP: Peróxido de hidrógeno terc-butílico

Trx: Tiorredoxina

TrxR: Tiorredoxina reductasa

Inhibidor de TrxR: Inhibidor de tiorredoxina reductasa

Temperatura ambiente: 20-35 °C

rpm: Revoluciones por minuto

ml: Mililitro

min: Minutos

mg: Miligramo

nm: Nanómetro

jl: Microlitro

|jM: Micromolar

°C: Grado centígrado

h: Hora

Ejemplos

La actividad de las combinaciones farmacéuticas que comprenden inhibidor de CDK e inhibidor de enzima antioxidante se puede determinar de acuerdo con cualquier método de ensayo in vitro o in vivo efectivo.

Ejemplo 1:

Estudio in vitro de la combinación de un inhibidor de CDK con un inhibidor de tiorredoxina reductasa en diferentes líneas celulares

Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la combinación de voruciclib (inhibidor de CDK) con inhibidores de tiorredoxina reductasa (inhibidores de TrxR) sobre el crecimiento celular en líneas celulares FaDu y MDA-MB-231.

Protocolo para el ensayo CGI:

Requerimientos:

• Células (adherentes) Recuento de células > 3000 células/pocillo.

• Placa blanca delta de 96 pocillos (Nunc, cat. # 136101)

• 1X DPBS (Gibco, cat. # A12856-01)

• Yoduro de propidio

• DMSO

• Azul tripán (Sigma, cat. # T8154)

• Tripsina (Sigma, cat. # T3924)

• FBS (Hyclone, cat. # SH30071.03)

Equipo:

• Agitador de placas

• Frigorífico -80 °C

• Spectamax para leer las placas

• Incubadora

Protocolo:

Tripsinización de células

El medio se retiró del matraz que contenía las células y se añadieron al matraz 2-3 ml de 1X DPBS estéril. A continuación, se retiró el DPBS del matraz y se añadieron al matraz 2 ml de tripsina. El matraz se mantuvo en la incubadora durante unos segundos. A continuación, se comprobó si las células se habían desplazado y, si se habían desplazado, se añadieron al matraz 2 ml de suero. A continuación, se añadieron al matraz 5-6 ml de medio y se agitó. El medio se recogió del matraz y se centrifugó a 600 rpm durante 10 min.

Recuento celular

Se decantó la solución sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 10 ml de medio. A un MCT de 1,7 ml; se añadieron 50 |_il de azul tripán, 40 |_il de medio y 10 |_il de suspensión celular. Después, la solución se agitó con vórtex y se cargaron 10 |_il de esta solución en un hemocitómetro. Las células se contaron en cámaras del hemocitómetro y se calcularon adicionalmente para obtener un recuento de > 3000 células/pocillo/200 |_il.

Siembra de la placa

La solución madre celular se preparó mediante el uso de los respectivos medios y FBS, y se añadieron 200 |_il de la solución madre celular a cada pocillo (excepto los pocillos de medio de control) de la placa de 96 pocillos tratada con delta blanca mediante el uso de una pipeta multicanal. A los pocillos de medio de control, se añadieron 200 |_il de medio. A continuación, las placas se incubaron a 37 °C durante 12-16 h.

Tratamiento farmacológico

El fármaco (el agente terapéutico), es decir, el inhibidor de CDK y el inhibidor de la enzima antioxidante, se diluyeron por separado hasta 10 veces mediante el uso de DMSO. El medio de las placas se cambió antes de la adición del fármaco a las placas y luego estas placas se colocaron en la incubadora. Se añadió simultáneamente 1 |_il del inhibidor de CDK e inhibidor de enzima antioxidante a los pocillos respectivos y se colocó en el agitador de placas durante 15-30 minutos. A continuación, las placas se volvieron a colocar en la incubadora durante 72 horas o el tiempo de incubación que se decidió.

Terminación

Se aspiraron suavemente 200 |_il de medio de cada pocillo y luego se añadieron 100 |_il de 1X DPBS a temperatura ambiente a cada pocillo. La solución madre de trabajo de PI (solución madre 1 mg/ml) se preparó mediante el uso de 140 |_il de PI y 20 ml de 1X DPBS para una placa. A continuación, se eliminó 1X DPBS de los pocillos y se añadieron a cada pocillo 200 |_il de la solución madre de trabajo de PI. Estas placas se mantuvieron en la oscuridad durante 5­ 10 min a temperatura ambiente en un agitador, después de lo cual las placas se almacenaron a -80 °C hasta la lectura de la placa.

Lectura de placas

La placa se leyó en Spectamax. El máximo de excitación de fluorescencia es 535 nm y el máximo de emisión es 617 nm.

A] Estudio in vitro de la combinación de un inhibidor de CDK con un inhibidor de tiorredoxina reductasa en líneas celulares FaDu

Materiales:

Líneas celulares: En este estudio se usaron las líneas celulares de FaDu para carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) obtenidas de la ATCC (American Tissue type Culture Collection), Estados Unidos.

Método:

El análisis del índice de combinación (CI) y la inhibición del crecimiento celular se llevó a cabo mediante el uso del método de ensayo CGI. El método de ensayo se describió en detalle en la presente descripción anteriormente como "protocolo para el ensayo CGI".

El inhibidor de TrxR, auranofin, se usó en 9 concentraciones diferentes en intervalos log 3 que varían de 0,003 a 30 |jM (es decir, a concentraciones de 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 y 30 jM). Los inhibidores de TrxR, ebselen y trióxido de arsénico (ATO) se usaron en 8 concentraciones diferentes en intervalos log 3 que varían de 0,03 a 100 jM (es decir, a concentraciones de 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 y 100 jM). El inhibidor de CDK, voruciclib, se usó en 8 concentraciones diferentes en intervalos log 3 que varían de 0,03 a 100 jM.

Los estudios de combinación de inhibidor de CDK con inhibidor de TrxR, auranofin se llevaron a cabo a las 12, 24, 48 y 72 h y se determinó el momento en el que se obtuvo la sinergia óptima. Además, se estudió el % de inhibición del crecimiento celular en este momento. Este método se repitió para otras combinaciones del inhibidor de CDK con inhibidores de TrxR, ebselen y ATO.

Los valores de EC⁵⁰ de los inhibidores de TrxR, ebselen y ATO se determinaron a las 72 h y los valores de EC⁵⁰ del inhibidor CDK, voruciclib y el inhibidor de TrxR, auranofin se determinaron a las 48 h.

Los estudios de combinación involucraron el uso de una concentración fija del inhibidor de CDK (voruciclib) con concentraciones variables del inhibidor de TrxR en diferentes momentos, como se menciona en la Tabla-1:

Tabla 1:

Resultados:

Los valores de EC⁵⁰ para voruciclib, auranofin, ebselen y ATO se proporcionan en la Tabla-2.

Tabla -2:

Los resultados de los estudios de combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, auranofin en diferentes momentos de tiempo de 12, 24, 48 y 72 h en líneas celulares FaDu se representan como gráfico Fracción afectada/ índice de combinación (gráfico Fa/CI) en la Figura 1. El % de inhibición del crecimiento celular correspondiente a la Figura 1C (a las 48 h) se representa en detalle en la Figura 2 a concentraciones variables de voruciclib.

El resultado de los estudios de combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, ebselen a las 72 h en líneas celulares FaDu se representa como un gráfico Fa/CI en la Figura 3. El % de inhibición del crecimiento celular correspondiente a la Figura 3 se representa en detalle en la Figura 4 a concentraciones variables de voruciclib. El resultado de los estudios de combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, ATO a las 72 h en líneas celulares FaDu se representa como gráfico Fa/CI en la Figura 5. El % de inhibición del crecimiento celular correspondiente a la Figura 5 se representa en detalle en la Figura 6 a concentraciones variables de voruciclib.

Conclusión:

La combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, auranofin, muestra un efecto sinérgico en diferentes momentos de tiempo en las líneas celulares FaDu, de esta forma se obtiene la sinergia óptima a las 48 h.

La combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, ebselen, muestra un efecto sinérgico óptimo en las líneas celulares FaDu a las 72 h.

La combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, ATO muestra un efecto sinérgico óptimo en las líneas celulares FaDu a las 72 h.

B] Estudio in vitro de la combinación de un inhibidor de CDK con un inhibidor de tiorredoxina reductasa en líneas celulares MDA-MB-231

Materiales:

Líneas celulares: En este estudio se usaron las líneas celulares de MDA-MB-231 para cáncer de mama triple negativo (TNBC) obtenidas de ATCC (American Tissue type Culture Collection), Estados Unidos.

Método:

El análisis del índice de combinación y la inhibición del crecimiento celular se llevó a cabo mediante el uso del método de ensayo CGI. El método de ensayo se describió en detalle en la presente descripción anteriormente como "protocolo para el ensayo CGI".

El inhibidor de TrxR, auranofin, se usó en 9 concentraciones diferentes en intervalos log 3 que varían de 0,003 a 30 |jM (es decir, a concentraciones de 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 y 30 jM). Los inhibidores de TrxR, ebselen y ATO se usaron en 8 concentraciones diferentes en intervalos log 3 que varían de 0,03 a 100 jM (es decir, a concentraciones de 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 y 100 jM). El inhibidor de CDK, voruciclib, se usó en 8 concentraciones diferentes en intervalos log 3 que varían de 0,03 a 100 jM.

Los estudios de combinación del inhibidor de CDK con cada uno de los inhibidores de TrxR, auranofin, ebselen y ATO se llevaron a cabo a las 12, 24, 48 y 72 h y se determinó el momento en el que se obtuvo la sinergia óptima. Además, se estudió el % de inhibición del crecimiento celular en este momento.

Los valores de EC⁵⁰ del inhibidor de CDK, voruciclib y los inhibidores de TrxR, auranofin, ebselen y ATO se determinaron a las 72 h.

Los estudios de combinación involucraron el uso de una concentración fija del inhibidor de CDK (voruciclib) con concentraciones variables del inhibidor de TrxR, como se menciona en la Tabla-3:

Tabla-3:

Resultados:

Los valores de EC⁵⁰ para voruciclib, auranofin, ebselen y ATO se proporcionan en la Tabla-4.

Tabla -4:

El resultado de los estudios de combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, auranofin a las 72 h en líneas celulares MDA-MB-231 se representa como gráfico Fa/ en la Figura 7. El % de inhibición del crecimiento celular correspondiente a la Figura 7 se representa en detalle en la Figura 8 a concentraciones variables de voruciclib.

El resultado de los estudios de combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, ebselen a las 72 h en líneas celulares MDA-MB-231 se representa como gráfico Fa/CI en la Figura 9. El % de inhibición del crecimiento celular correspondiente a la Figura 9 se representa en detalle en la Figura 10 a concentraciones variables de voruciclib. El resultado de los estudios de combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, ATO a las 72 h en líneas celulares MDA-MB-231 se representa como gráfico Fa/CI en la Figura 11. El % de inhibición del crecimiento celular correspondiente a la Figura 11 se representa en detalle en la Figura 12 a concentraciones variables de voruciclib. Conclusión:

La combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, auranofin, muestra un efecto sinérgico óptimo en las líneas celulares MDA-MB-231 a las 72 h.

La combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, ebselen, muestra un efecto sinérgico óptimo en las líneas celulares MDA-MB-231 a las 72 h.

La combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, ATO, muestra un efecto sinérgico óptimo en las líneas celulares MDA-MB-231 a las 72 h.

Ejemplo 2:

Estudio in vitro de la combinación de un inhibidor de CDK con un inhibidor de tiorredoxina reductasa sobre el crecimiento celular y la citotoxicidad en células normales

Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la combinación de voruciclib (inhibidor de CDK) con inhibidores de tiorredoxina reductasa (inhibidores de TrxR) en células hPBMC y MRC5.

A) Estudio in vitro de la combinación de un inhibidor de CDK con un inhibidor de tiorredoxina reductasa sobre el crecimiento celular y la citotoxicidad en células hPBMC

Materiales:

Células: En este estudio se usaron las hPBMC (células mononucleares de sangre periférica humana).

Método:

El análisis de la inhibición del crecimiento celular se llevó a cabo mediante el uso del método de ensayo CGI. El método de ensayo se describe en detalle en el Ejemplo 1 como "protocolo para el ensayo CGI".

El inhibidor de TrxR, auranofin, se usó en 8 concentraciones diferentes en intervalos log 3 que varían de 0,003 a 30 |jM (es decir, a concentraciones de 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 y 30 jM). Los inhibidores de TrxR, ebselen y ATO se usaron en 8 concentraciones diferentes en intervalos log 3 que varían de 0,03 a 100 jM (es decir, a concentraciones de 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 y 100 jM).

Los estudios de combinación se llevaron a cabo con una concentración fija de inhibidor de CDK con concentraciones variables de los inhibidores de TrxR, auranofin, ebselen y ATO. El estudio se realizó de 6 a 8 concentraciones diferentes del inhibidor de CDK, voruciclib, en intervalos que varían de 0,5 a 20 jM (es decir, a concentraciones de 0,5, 1,2, 4, 8, 10 y 20 jM ) tanto para 72 h de ebselen y a To o 48 h de auranofin.

Resultados:

El resultado de los estudios de combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, auranofin a las 48 h o ebselen a las 72 h en células hPBMC se representa en las Figuras 13A, 13B, 13C y 13D respectivamente. El % de inhibición del crecimiento celular en células hPBMC se representa en las Figuras a concentraciones variables de auranofin o ebselen.

Conclusión:

El estudio de combinación muestra que el auranofin o el ebselen en concentraciones más bajas requieren >8 jM de voruciclib para comenzar a mostrar una inhibición significativa del crecimiento celular en las células hPBMC.

B) Estudio in vitro de la combinación de un inhibidor de CDK con un inhibidor de tiorredoxina reductasa sobre el crecimiento celular y la citotoxicidad en células MRC5

Materiales:

Células: En este estudio se usaron las MRC5 (células de fibroblastos de pulmón humano normal).

Método:

El análisis de la inhibición del crecimiento celular se llevó a cabo mediante el uso del método de ensayo CGI. El método de ensayo se describe en detalle en el Ejemplo 1 como "protocolo para el ensayo CGI".

El inhibidor de TrxR, auranofin, se usó en 8 concentraciones diferentes en intervalos log 3 que varían de 0,003 a 30 |jM (es decir, a concentraciones de 0,01,0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 y 30 jM). Los inhibidores de TrxR, ebselen y ATO se usaron en 8 concentraciones diferentes en intervalos log 3 que varían de 0,03 a 100 jM (es decir, a concentraciones de 0,03, 0,1, 0,3, 1,3, 10, 30 y 100 jM).

Los estudios de combinación se llevaron a cabo con una concentración fija de inhibidor de CDK con concentraciones variables de los inhibidores de TrxR, auranofin, ebselen y ATO. El estudio se realizó de 6 a 8 concentraciones diferentes del inhibidor de CDK, voruciclib, en intervalos que varían de 0,5 a 20 jM (es decir, a concentraciones de 0,5, 1,2, 4, 8, 10 y 20 jM ) para 72 h de ebselen y ATO; o 48 h de auranofin.

Resultados:

El resultado de los estudios de combinación de voruciclib y el inhibidor de TrxR, auranofin a las 48 h o ebselen y ATO a las 72 h en células MRC5 se representa en las Figuras 14A, 14B y 14C, respectivamente. El % de inhibición del crecimiento celular en células MRC5 se representa en las Figuras a concentraciones variables de auranofin/ebselen/ATO.

Conclusión:

El estudio muestra que no existe un efecto sinérgico en la inhibición del crecimiento celular de las células MRC5 cuando se administra en combinación con voruciclib y el inhibidor de TrxR, auranofin/ebselen/ATO sobre una dosis única de voruciclib solo.

Ejemplo 3:

Estudio in vitro de la combinación de un inhibidor de CDK con un inhibidor de tiorredoxina reductasa, auranofin sobre la producción de ROS en células cancerosas

Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la combinación de voruciclib con inhibidores de tiorredoxina reductasa, auranofin, sobre la producción de ROS en células cancerosas.

Protocolo para el ensayo de detección de especies reactivas de oxígeno celular (ROS) mediante el uso de DCFDA: Requerimientos:

• Células (adherentes) recuento de células >25000 células/pocillo.

• DCFDA - Kit de ensayo de detección de especies reactivas de oxígeno celular (ab113851)

• Diluciones de fármacos.

• Base de polímero de fondo óptico de 96 pocillos negro (No cat. # 165305)

• 1X DPBS (Gibco cat. # A12856-01)

• Triphan Blue. (Sigma cat. # T8154)

• Tripsina (Sigma cat. # T3924)

• FBS (Hyclone cat. # SH30071.03)

• Medios respectivos.

• Papel de aluminio.

Equipo:

• Agitador de placas.

• Frigorífico -80 °C.

• Lector de placas de fluorescencia.

• Incubadora.

Protocolo:

Tripsinización de células

El medio se retiró del matraz que contenía las células y se añadieron al matraz 2-3 ml de 1X DPBS estéril. A continuación, se retiró el DPBS del matraz y se añadieron al matraz 2 ml de tripsina. El matraz se mantuvo en la incubadora durante unos segundos. A continuación, se comprobó si las células se habían desplazado y, si se habían desplazado, se añadieron al matraz 2 ml de suero. A continuación, se añadieron al matraz 5-6 ml de medio y se agitó. El medio se recogió del matraz y se centrifugó a 600 rpm durante 10 min.

Recuento celular

Se decantó la solución sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 10 ml de medio. A un MCT de 1,7 ml; se añadieron 50 pl de azul tripán, 40 pl de medio y 10 pl de suspensión celular. Después, la solución se agitó con vórtex y se cargaron 10 pl de esta solución en un hemocitómetro. Las células se contaron en las cámaras del hemocitómetro y se calcularon adicionalmente para obtener un recuento de > 25000 células/pocillo/200 pl.

Siembra de la placa

La solución madre celular se preparó mediante el uso de los respectivos medios y FBS, y se añadieron 200 pl de la solución madre celular a cada pocillo (excepto los pocillos del medio de control) de la placa de 96 pocillos con base de polímero negro mediante el uso de una pipeta multicanal. A los pocillos de medio de control, se añadieron 200 pl de medio. A continuación, las placas se incubaron a 37 °C durante 12-16 h.

Tratamiento de fármacos y terminación

El fármaco (el agente terapéutico), es decir, el inhibidor de CDK y el inhibidor de la enzima antioxidante, se diluyeron por separado hasta 10 veces mediante el uso de DMSO. Se retiró el medio de las placas y se añadieron 100 pl/pocillo de tampón 1X. El tampón 1X y las células teñidas se eliminaron mediante la adición de 100 pl/pocillo de solución de DCFDA diluida. Las placas se mantuvieron en la oscuridad en una incubadora durante 45 minutos a 37 °C. Se eliminó la solución de DCFDA y se añadieron 100 pl/pocillo de tampón 1X o PBS 1X. Se añadió simultáneamente 1 pl de inhibidor de CDK e inhibidor de la enzima antioxidante a los pocillos respectivos y se colocó en el agitador de placas durante unos minutos. A continuación, las placas se volvieron a colocar en la incubadora durante 6 h.

Lectura de placas

La placa se leyó en Spectamax. El máximo de excitación de fluorescencia es 485 nm y el máximo de emisión es 535 nm.

Materiales:

(i) Líneas celulares: las líneas celulares de FaDu para carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) se obtuvieron de ATCC (American Tissue type Culture Collection), Estados Unidos. Las líneas celulares de MDA-MB-231 para cáncer de mama triple negativo (TNBC) se obtuvieron de ATCC (American Tissue type Culture Collection), Estados Unidos.

(ii) Diacetato de 2',7-diclorofluorescina (DCFDA), un colorante fluorogénico que mide los niveles de hidroxilo, peroxilo y otras especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la célula.

Método:

El análisis de la producción de ROS se llevó a cabo mediante el uso del método de ensayo DCFDA. El método de ensayo se describió en detalle en la presente descripción anteriormente como "protocolo para el ensayo de detección de especies reactivas de oxígeno celular (ROS) mediante el uso de DCFDA".

Las células FaDu/MDAMB-431 se trataron con diversas concentraciones (pM) de auranofin o voruciclib solas o en combinación. A continuación, las células se cultivaron durante 3 a 4 horas y se marcaron con 20 pM de DCFDA. Las células de FaDu/MDAMB-431 tratadas se analizaron en un lector de placas fluorescentes frente a las células de control positivo que se trataron con 50 pM de peróxido de hidrógeno de terc-butilo (TBHP).

Resultados:

El efecto de la producción de ROS después del tratamiento con auranofin y voruciclib solos o en combinación en células FaDu se muestra en la Figura 15. Los datos se representan como media SEM (N=2) del % de cambio en el nivel de ROS (eje Y) frente a varias concentraciones (pM) de auranofin o voruciclib o una combinación de ambos (eje X), ve: Control positivo; células tratadas con 50 pM de peróxido de hidrógeno de terc-butilo (TBHP), Control: portador del control, A: auranofin, P: voruciclib.

Conclusión:

El estudio indicó claramente que hubo un aumento significativo en el nivel de ROS, es decir, ~100 % para auranofin como agente único y~80 % para voruciclib respectivamente en comparación con el control no tratado. Además, se encontró un aumento adicional en el nivel de ROS en el tratamiento de combinación en el que la concentración de voruciclib fue de 0,1 y 1,0 pM.

Ejemplo 4:

Estudio in vitro sobre el efecto de voruciclib en combinación con inhibidores de TrxR sobre la actividad de TrxR en células cancerosas

Objetivo: El objetivo de este estudio fue determinar la participación de TrxR en células FaDu tanto tratadas como no tratadas (auranofin o voruciclib como agente único o en combinación), lo que puede proporcionar información sobre el mecanismo de acción de la combinación.

Materiales:

(i) Líneas celulares: las líneas celulares de FaDu para carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) se obtuvieron de ATCC (American Tissue type Culture Collection), Estados Unidos.

(ii) DTNB: Ácido ditio nitro benzoico

(iii) ATM: Aurotiomalato

Método:

El ensayo TrxR se realizó en placas de seis pocillos con 1 M de células por pocillo. Las células se trataron con varias concentraciones de auranofin o voruciclib y en combinación de ambos. La actividad TrxR se midió en lisados celulares mediante el uso de DTNB (Ácido ditio nitro benzoico). El DTNB se redujo a TNB (Ácido tio nitro benzoico) con o sin un inhibidor específico de TrxR, el aurotiomalato (ATM). La actividad de TrxR se calculó en base a la diferencia en la pendiente obtenida de la cinética lineal de la reducción de DTNB con o sin tratamiento con ATM. Resultados:

El efecto de la combinación de auranofin y voruciclib sobre el ensayo de actividad TrxR en células FaDu se representa en la Figura 16. Los datos se representan como media ± s Em (N=2) del % de actividad TrxR (eje Y) y varias concentraciones (pM) de Auranofin o voruciclib o una combinación de ambos (eje X); PC -Control Positivo, C-Portador del control.

Conclusión:

El estudio mostró que hubo una reducción dependiente de la concentración en la actividad de TrxR cuando las células se trataron con auranofin. Además, el estudio reveló que no hubo ningún efecto de voruciclib sobre la actividad de TrxR, ya sea como agente único o cuando se combina con auranofin.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación farmacéutica que comprende un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina (CDK) y al menos un inhibidor de tiorredoxina reductasa, para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el inhibidor de CDK se selecciona entre alvocidib, riviciclib y voruciclib.

2. La combinación farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de tiorredoxina reductasa se selecciona entre auranofin, ebselen y trióxido de arsénico.

3. La combinación farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor de tiorredoxina reductasa es auranofin.

4. La combinación farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor de tiorredoxina reductasa es ebselen.

5. La combinación farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor de tiorredoxina reductasa es trióxido de arsénico.

6. La combinación farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el inhibidor de CDK es alvocidib.

7. La combinación farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el inhibidor de CDK es riviciclib.

8. La combinación farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el inhibidor de CDK es voruciclib.