ES2848032T3 - Método para recuperar dos o más genes, o productos génicos, que codifican para un inmunorreceptor - Google Patents

Abstract

Método que comprende las siguientes subetapas: recuperar dos o más genes, o productos génicos, o ADNc, que codifican para un inmunorreceptor que tiene dos o más subunidades, dos o más genes, o productos génicos, que están comprendidos en una célula fuente dada, método que comprende las siguientes etapas: a) encapsular células fuente junto con un resto de captura de ARNm en microrreactores, de tal manera que cada microrreactor comprenda una célula fuente y en el que el resto de captura de ARNm es una perla o 10 partícula b) lisar las células en los microrreactores, liberar el ARNm celular en la luz de los microrreactores y posteriormente unir el mismo al resto de captura de ARNm c) lisar o perturbar los microrreactores y someter a transcripción inversa el ARNm unido a los restos de captura de ARNm en disolución para obtener los productos génicos de ADNc correspondientes d) crear un constructo que abarque los dos o más productos génicos que codifican para las subunidades del inmunorreceptor, en el que crear un constructo que abarque los dos o más productos génicos que codifican para las subunidades del inmunorreceptor se logra amplificando el ADNc mediante PCR de extensión solapada en el interior de microrreactores, en el que cada microrreactor contiene un único resto de captura de ARNm resultante de la etapa c), y e) clonar el producto de PCR en un vector plasmídico para obtener un constructo de expresión bi o 25 multicistrónico; f) crear así una biblioteca de plásmidos que contiene el ADNc que codifica para los inmunorreceptores de una población de células fuente dada, y crear una biblioteca de células expresoras, biblioteca en la que cada célula puede expresar dos o más genes, o productos génicos, que codifican para las subunidades del inmunorreceptor recuperado, en el que crear la biblioteca comprende las siguientes etapas: g) transfectar células expresoras con un constructo de expresión bi o multicistrónico, y h) encapsular células expresoras en microrreactores con una célula expresora por microrreactor, y i) cultivar las células encapsuladas en condiciones que permitan la expresión de proteínas y/o la proliferación de las células.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para recuperar dos o más genes, o productos génicos, que codifican para un inmunorreceptor

La presente invención está relacionada con un método para recuperar dos o más genes, o productos génicos, que codifican para un inmunorreceptor.

Los genes que codifican para proteínas de bibliotecas o de recursos naturales pueden aislarse para hacerlos accesibles con fines terapéuticos, de diagnóstico, científicos o comerciales. Esto se aplica, en particular, a los inmunorreceptores.

Los inmunorreceptores codificados por células T y B se ensamblan a partir de familias de segmentos génicos de línea germinal mediante un proceso denominado recombinación somática que da como resultado que cada célula individual exprese un receptor distinto. Estas células pueden experimentar un proceso de mutación somática posterior, denominado maduración por afinidad, que aumenta adicionalmente la variedad de inmunorreceptores. Si tal inmunorreceptor tiene dos o más genes, o productos génicos que codifican para el mismo, como es el caso de los anticuerpos y los receptores de células T, en el que ambos productos génicos contribuyen conjuntamente a la capacidad de los receptores para unirse al antígeno, el mantenimiento del apareamiento original de los dos o más genes, o productos génicos, es clave para garantizar una función auténtica y adecuada de la proteína resultante, una vez que esta última se expresa en un sistema de expresión adecuado.

Los documentos WO2013/188872 y EP 1 516 929 A2 describen métodos para el ligamiento de secuencias de interés. Tal fenómeno es, por ejemplo, crucial en la recuperación de los genes que codifican para inmunoglobulinas individuales del anticuerpoma de un sujeto. En este caso, el mantenimiento del apareamiento original de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina (IgH+IgL), tal como sucede en las células B que se producen de manera natural, es importante para producir una copia recombinante auténtica del anticuerpo respectivo y, por tanto, garantiza su funcionalidad. IgH e IgL son productos de 2 genes distintos y ambos son necesarios para determinar la especificidad de un anticuerpo. Cada célula B expresa un conjunto distinto de IgH+IgL y, por tanto, presenta una especificidad de anticuerpo única.

Otro ejemplo son las proteínas de fusión de receptor de células T, que se han derivado de receptores de células T, y presentan cadenas alfa y beta (a y p), y en las que el apareamiento correcto de las mismas es igualmente un requisito para la funcionalidad.

Aunque existen métodos recombinantes para aislar los genes de inmunoglobulina de células B humanas y generar una gran variedad de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, presentación en fagos, estos métodos conducen a un apareamiento aleatorio de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina.

Los métodos de clonación de anticuerpos que retienen la información del apareamiento de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina original, tal como sucede en las células B aisladas de donantes seleccionados como fuente de variedad, tienen ventajas específicas. En particular, se espera que tales anticuerpos auténticos hayan experimentado procesos de selección in vivo que dan como resultado la ausencia de aquellas especificidades que podrían ser potencialmente dañinas para el huésped.

Además, existe evidencia de que los anticuerpos con apareamiento de IgH e IgL afines, además de expresar la especificidad original de la célula B parental, presentan una mejor estabilidad, una mejor capacidad de expresión y otras propiedades fisicoquímicas favorables en comparación con los anticuerpos formados por IgH e IgL apareadas aleatoriamente. Estas propiedades favorables son importantes para la selección y la producción a gran escala. Históricamente, el desafío de obtener anticuerpos monoclonales, particularmente de células B humanas, se ha resuelto mediante una variedad de tecnologías de clonación de células B celulares, en las que se estimulan células B son para que se dividan y/o produzcan anticuerpos, producción que se requiere para identificar o bien células B individuales o bien mezclas de células B que producen un anticuerpo de interés. La identificación del clon de células B que expresa el anticuerpo de interés puede realizarse luego mediante clonación celular, por ejemplo clonación mediante dilución limitante o mediante la combinación de la estimulación celular con una etapa de clonación molecular y la posterior repetición del proceso de selección usando anticuerpos expresados de manera recombinante usando métodos adecuados establecidos en la técnica.

Estos métodos de clonación celular, por ejemplo la tecnología de hibridomas, son ineficaces con eficiencias de clonación a menudo por debajo del 1% y, por tanto, sólo son factibles en situaciones en las que se expresan anticuerpos de interés en células B muy abundantes (por ejemplo, en infecciones, tras la vacunación). Esto, sin embargo, es una grave limitación porque a menudo los anticuerpos están destinados a producirse contra dianas que no están implicadas en la infección u otros estados que crean una alta abundancia de células B. Se encuentran ejemplos en enfermedades mediadas por el sistema inmunitario, enfermedades neurodegenerativas o cáncer.

Por tanto, se requiere que cualquier tecnología que tenga como objetivo la clonación molecular de repertorios de anticuerpos auténticos, por ejemplo, de una donación de células B, funcione a nivel de una única célula. Sin embargo, hasta la actualidad, esta clonación molecular de anticuerpos de una única célula B no se ha logrado con un rendimiento lo suficientemente alto como para comprender un anticuerpoma completo de 100.000 o más especificidades de anticuerpo distintas a un coste asequible, o en una línea temporal aceptable.

Sumario de la presente invención

La presente invención se refiere a métodos tal como se definen en las reivindicaciones.

Es un objeto de la presente invención facilitar el aislamiento de dos o más genes, o productos génicos, que codifican para un inmunorreceptor.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método que administra un inmunorreceptor que está codificado por dos o más genes, o productos génicos, proteína que tiene ventajas cuando se usa con fines terapéuticos, de diagnóstico, científicos o industriales.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método que es probable que produzca un inmunorreceptor que está codificado por dos o más genes, o productos génicos, proteína que no está, o al menos lo está en un grado muy bajo, sesgada por propiedades distintas de la unión al antígeno deseado.

Otro objeto de la presente invención es permitir el mantenimiento del apareamiento original presente en una única célula, de dos o más genes, o productos génicos, que codifican para un inmunorreceptor durante el aislamiento. Otro objeto de la presente invención es permitir la selección de alto rendimiento de una biblioteca de células que tienen el potencial de expresar un inmunorreceptor codificado por dos o más genes, o productos génicos, o su ARNm.

Realizaciones de la invención

Antes de que la invención se describa con detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a las partes componentes particulares de los dispositivos descritos o las etapas de proceso de los métodos descritos, ya que tales dispositivos y métodos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es con fines de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende ser limitativa. Debe observarse que, tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un(o)”, “una” y “el/la” incluyen referentes en singular y/o en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Además, debe entenderse que, en caso de que se faciliten intervalos de parámetros que estén delimitados por valores numéricos, se considera que los intervalos incluyen estos valores de limitación.

Según un aspecto de la divulgación, se proporciona un método para recuperar dos o más genes, o productos génicos, o ADNc, que codifican para un inmunorreceptor que tiene dos o más subunidades, dos o más genes, o productos génicos, que están comprendidos en una célula fuente dada. Dicho método comprende las siguientes etapas:

a) encapsular células fuente junto con un resto de captura de ARNm en microrreactores

b) lisar las células en los microrreactores, liberar el ARNm celular en la luz de los microrreactores y posteriormente unir el mismo al resto de captura de ARNm

c) someter a transcripción inversa el ARNm unido a los restos de captura de ARNm para obtener los productos génicos de ADNc correspondientes

d) crear un constructo que abarque los dos o más productos génicos que codifican para las subunidades del inmunorreceptor, y

e) clonar el producto de PCR en un vector plasmídico para obtener un constructo de expresión bi o multicistrónico.

De esta manera, se crea una biblioteca de plásmidos que contiene los ADNc que codifican para los inmunorreceptores de una población de células fuente dada.

Tal como se usa en el presente documento, el término “inmunorreceptor” se refiere a una proteína que tiene dos o más subunidades y puede unirse, específicamente, a una molécula diana dada, preferiblemente una proteína. Tal inmunorreceptor es, por ejemplo, un anticuerpo, con sus cadenas pesadas y ligeras, o un receptor de células T, con sus cadenas alfa y beta.

Tal como se usa en el presente documento, el término “molécula diana” abarca moléculas contra las que va a producirse un inmunorreceptor, por ejemplo, con fines terapéuticos, de diagnóstico, analíticos, científicos o industriales. Esto puede incluir péptidos, proteínas, glicoproteínas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, complejos proteína-ácido nucleico y moléculas pequeñas, en particular proteínas receptoras, proteínas citocinas, agregados de proteínas (en particular, agregados patológicos, como Abeta, Tau o a-sinucleína), complejos de proteínas tales como complejos de péptidos antigénicos-CMH y proteínas estructurales.

Tal como se usa en el presente documento, el término “especificidad por una molécula diana dada” define la capacidad de un inmunorreceptor para reaccionar con una diana dada, pero no con otras. La especificidad depende de la composición química, las fuerzas físicas y la estructura molecular en el sitio de unión.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula fuente” se refiere a una célula que tiene el potencial de expresar dicho inmunorreceptor, o su ARNm, es decir, a la célula que es la fuente de los genes que codifican para dicho inmunorreceptor. Esto puede relacionarse, por ejemplo, con una célula o una colección de células aisladas de la naturaleza, por ejemplo, de un donante. Estas células pueden ser, por ejemplo, células B de un donante, en las que cada una de las cuales codifica para otro anticuerpo. De manera similar, las células fuente pueden ser células T de un donante, en las que cada una de las cuales codifica para otro receptor de células T. Así, los dos o más genes, o productos génicos, o ADNc, que codifican para dicho anticuerpo, o receptor de células T, están destinados a recuperarse para su uso adicional.

Tal como se usa en el presente documento, el término “microrreactores” se refiere a entidades físicas que permiten una encapsulación tridimensional de las células fuente. En una realización preferida, estos microrreactores tienen forma esferoidal, flotan libremente y pueden manipularse en microentornos o entornos microfluídicos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “transcripción inversa del ARNm” se refiere, entre otros, a la PCR con transcripción inversa, también denominada RT-PCR, en la que un molde de ARNm monocatenario se transcribe en ADN bicatenario, a veces llamado ADNc.

Es importante comprender que este enfoque permite la recuperación simultánea de dos o más genes, o productos génicos, que codifican para un inmunorreceptor que tiene dos o más subunidades. Así, la combinación específica de las dos o más subunidades se conserva durante todo el proceso que es objeto de la presente invención. Esto se aplica, por ejemplo, a los anticuerpos basados en inmunoglobulina, que consisten en una cadena ligera y una cadena pesada, que son específicas entre sí, es decir, el apareamiento específico de sus cadenas respectivas es obligatorio para una función adecuada del anticuerpo respectivo. Los inventores consideran esta característica una ventaja específica de la invención porque otros métodos de la técnica anterior no proporcionan la conservación del apareamiento específico de cadenas pesadas y ligeras y, por tanto, pueden dar como resultado anticuerpos disfuncionales.

Las células fuente pueden ser células de una colección de células, por ejemplo, una biblioteca de células y/o una colección de células aisladas de la naturaleza, por ejemplo, de un donante. En una realización preferida, dicha colección o biblioteca puede contener hasta 1.000.000 de células distintas (codificando así para hasta 1.000.000 de anticuerpos distintos).

El hecho de que el ARNm que codifica para las diferentes subunidades del inmunorreceptor se une espacialmente en primer lugar mediante la unión a un resto de captura y luego se une físicamente mediante PCR de extensión solapada, y/o el hecho de que el producto de PCR se clona en un constructo de expresión bi o multicistrónico que comprende los dos o más ADNc que codifican para las diferentes subunidades del inmunorreceptor garantiza que los dos o más genes, o productos génicos, se procesen y recuperen en combinación, y dicha combinación específica de las dos o más subunidades se conserva a lo largo de todo el proceso.

La PCR de extensión solapada (denominada en el presente documento oePCR) es una variante de la PCR. Se usa para unir fragmentos de a Dn más pequeños en un polinucleótido más grande (Embleton et al., 1992).

Como en la mayoría de las reacciones de PCR, se usan dos cebadores, uno para cada extremo, para amplificar una secuencia de nucleótidos dada. Para unir dos moléculas de ADN, se usan cebadores especiales en los extremos que van a unirse. Para cada molécula, el cebador en el extremo que va a unirse se construye de tal manera que tenga una proyección en 5' complementaria al extremo de la otra molécula. Después de la hibridación cuando se produce replicación, el ADN se extiende mediante una nueva secuencia que es complementaria a la molécula a la que va a unirse. Una vez que la amplificación de las dos moléculas de ADN alcanza una concentración crítica, los dos genes distintos se aparearán en la posición en la que se hibridan las dos secuencias de cebador complementarias.

Las secuencias complementarias solapantes introducidas servirán como cebadores para la elongación del heterodúplex y darán como resultado la fusión de las dos secuencias. Se produce una amplificación adicional del heterodúplex tras la hibridación de los dos cebadores en los extremos libres del heterodúplex recién formado (los que no formaban parte del proceso de ligamiento).

Se lleva a cabo una etapa de amplificación adicional opcional en una segunda PCR usando cebadores anidados específicos para los extremos libres de los dos genes independientes.

Este método tiene la ventaja con respecto a otras técnicas de ligamiento génico al no requerir endonucleasas de restricción (o ligasas). Por tanto, oePCR permite la confirmación/transformación del mero “ligamiento espacial” de dos genes independientes en las perlas de matriz de captura de ARNm en un ligamiento covalente en forma de una molécula de ADN heterodúplex.

Preferiblemente, después de la etapa c) puede llevarse a cabo una etapa de control de calidad adicional, en la que se evalúa la uniformidad de la unión del ARNm a los restos de captura de ARNm. Según una realización particularmente preferida, los restos de captura de ARNm que carecen de ARNm unido y los que forman agregados de dos o más restos se eliminan en esta etapa.

Según un punto de referencia preferido, > 30% de los restos de captura de ARNm tienen un ARNm unido. Más preferiblemente, > 40%, > 50%, > 60%, > 70%, > 80% o, más preferiblemente, > 90% de los restos de captura de ARNm tienen un ARNm unido.

Preferiblemente, después de la etapa d) puede llevarse a cabo una etapa de control de calidad adicional, en la que se evalúa la uniformidad de la distribución de los dos o más genes, o productos génicos, que codifican para las diferentes subunidades. Según un punto de referencia preferido, > 30% de los restos de captura de ARNm contienen un producto de amplificación clonable (ADNc). Más preferiblemente, > 40%, > 50%, > 60%, > 70%, > 80% o, más preferiblemente, > 90% de los restos de captura de ARNm contienen un producto de amplificación clonable.

Preferiblemente, después de la etapa d) puede llevarse a cabo una etapa de control de calidad adicional, en la que se evalúa una tasa de contaminación cruzada, por ejemplo, determinando la diversidad de los genes de IgH e IgL apareados mediante el análisis de secuencias de una muestra representativa de las subunidades unidas, o los genes, respectivamente. Según un punto de referencia preferido, esto último es < 35%. Más preferiblemente, la tasa de contaminación cruzada es < 30%, < 25%, < 20%, < 15%, < 10% o, lo más preferiblemente, < 5% de los restos de captura de ARNm que contienen un producto de amplificación clonable.

En la etapa c), la selección de moléculas de ácido nucleico usadas para capturar el ARNm y realizar la transcripción inversa con cebadores puede estar dominada, por ejemplo, por restos de captura de ARNm. En algunas realizaciones, esto último puede presentar secuencias de ácido nucleico de captura específicas unidas que son complementarias a todo el ARNm de una célula dada, tal como oligo-dT o cebadores hexaméricos aleatorios.

En otras realizaciones, las moléculas de ácido nucleico usadas para el ARNm que capturan un cebado de transcripción inversa pueden diseñarse de tal manera que sólo se transcriban ARNm específicos, por ejemplo, ARNm que codifican para las cadenas HC y LC de una inmunoglobulina.

Según una realización preferida, el método de la invención comprende además, después de la etapa d), la etapa de amplificar el constructo que abarca los dos o más productos génicos que codifican para las subunidades del inmunorreceptor.

Para ello, se usan cebadores de PCR específicos. Para amplificar, por ejemplo, el constructo que codifica para un anticuerpo, pueden usarse cebadores que sean específicos para ADNc de la región variable (“región v”) de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina reordenadas (reordenamiento V(D)J) después de la recombinación de V(D)J (suponiendo que el producto génico de ADNc de cadena ligera siga en el sentido de 3'). Los cebadores de PCR específicos adecuados para este fin se describen, por ejemplo, en Wardemann, et al. (2003).

Asimismo, preferiblemente, después de la etapa c), puede llevarse a cabo una etapa de control de calidad adicional que comprende las etapas de

(i) monitorizar la síntesis de ADNc en los restos de captura de ARNm,

(ii) excluir restos de captura de ARNm agregados.

Este enfoque ayuda a eliminar la interferencia entre dos o más restos de captura de ARNm de diferentes microrreactores, lo que puede provocar una perturbación del apareamiento de HC/LC. La monitorización de la síntesis de ADNc en los restos de captura de ARNm puede llevarse a cabo, por ejemplo, con métodos similares a los usados en la RT-PCR con transcripción inversa, en la que se monitoriza el avance de la RT-PCR, por ejemplo, mediante sondas de ADN que se unen a la matriz, sondas que tienen un indicador fluorescente en un extremo y un extintor en el extremo opuesto.

Según la invención, la creación de un constructo que abarca los dos o más productos génicos que codifican para las subunidades del inmunorreceptor, tal como se establece en la etapa d), se logra amplificando el ADNc mediante PCR de extensión solapada.

Según otra realización preferida de la invención, la etapa de amplificar el constructo abarca el uso de una PCR anidada (también denominada nPCR en el presente documento).

Este enfoque puede no sólo proporcionar un producto de PCR amplificado, de modo que estén disponibles suficientes copias de ADNc para la clonación, tal como se establece en la etapa e) anterior. Además, permite la introducción de sitios de restricción adecuados y proporciona suficiente especificidad para amplificar únicamente los dos o más productos génicos que codifican para las subunidades del inmunorreceptor.

La PCR anidada es una modificación de la reacción en cadena de la polimerasa destinada a reducir la unión inespecífica en productos debido a la amplificación de sitios de unión de cebadores inesperados. La propia reacción en cadena de la polimerasa es el proceso usado para amplificar muestras de ADN, a través de una ADN polimerasa mediada por temperatura. Los productos pueden usarse para secuenciación o análisis, y este proceso es una parte clave de muchos laboratorios de investigación genética, junto con los usos en el análisis de huella de ADN para análisis forense y otros casos de genética humana. La PCR convencional requiere cebadores complementarios a los extremos del a Dn diana. Un problema que se produce habitualmente es que los cebadores se unen a regiones incorrectas del ADN, proporcionando productos inesperados. La reacción en cadena de la polimerasa anidada implica dos conjuntos de cebadores, usados en dos ejecuciones sucesivas de la reacción en cadena de la polimerasa, estando el segundo conjunto destinado a amplificar una diana secundaria dentro del producto de la primera ejecución.

Según otra realización preferida de la invención, el método comprende además la etapa de insertar elementos reguladores en el producto de PCR que soportan la expresión de los ADNc. Tales elementos reguladores son, por ejemplo, sitios de escisión, péptidos señal o promotores.

Según la invención, los microrreactores se lisan, o se perturban, después de la etapa b). Según otra realización descrita, los microrreactores se lisan, o se perturban, después de la etapa d).

En caso de que los microrreactores consistan en alginato (tal como se comenta en otra parte del presente documento), la lisis puede lograrse simplemente añadiendo EDTA (etilendiaminotetraacetato) para reducir el título de cationes bivalentes (por ejemplo, Ca2+) en el medio, que el alginato necesita para mantener su estado gelatinoso. Alternativamente, pueden usarse enzimas alginasas, que digieren los alginatos.

Las alginasas son poli(beta-D-manuronato) liasas que catalizan la escisión de polisacáridos que contienen residuos de beta-D-manuronato, para proporcionar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-alfa-L-eritro-hex-4-enopiranuronosilo en sus extremos. Las alginasas pertenecen a la familia de las liasas, su nombre sistemático es poli(beta-D-1,4-manuronida) liasa. Otros nombres de uso común incluyen alginato liasa I, alginato liasa, alginasa I y alginasa II. Debido a que los restos de captura de ARNm pueden capturar todo el ARNm de una célula fuente dada, la etapa decisiva para garantizar el apareamiento específico de célula de los dos o más genes, o productos génicos, o ADNc, que codifican para las subunidades del inmunorreceptor de interés, se logra tan pronto como todo el ARNm celular se une a los restos de captura de ARNm. Tal como se establece en otra parte del presente documento, este apareamiento específico es obligatorio para una función adecuada del inmunorreceptor de interés respectivo.

Dicho esto, el momento más temprano posible para lisar los microrreactores (sin perder el apareamiento específico de los dos o más genes, o productos génicos, o ADNc, que codifican para las subunidades del inmunorreceptor de interés), es después de la etapa b), porque luego, todo el ARNm celular (incluidos los ARNm que codifican para las subunidades del inmunorreceptor de interés) se captura en un resto de captura de ARNm dado.

Preferiblemente, se usan entre > 1 y < 100 restos de captura de ARNm por microrreactor. Más preferiblemente, se usan entre > 5 y < 50 restos de captura de ARNm por microrreactor.

Según la invención, la transcripción inversa del ARNm unido a los restos de captura de ARNm para obtener el ADNc correspondiente (etapa c) tiene lugar en disolución. En algunas realizaciones de la divulgación, las etapas, (i) la transcripción inversa del ARNm unido a los restos de captura de ARNm para obtener el ADNc correspondiente (etapa c), (ii) la creación de un constructo que abarca los dos o más productos génicos que codifican para las subunidades del inmunorreceptor (etapa d), y/o (iii) la clonación del producto de PCR en un vector plasmídico para obtener un constructo de expresión bi o multicistrónico (etapa e) pueden tener lugar en disolución, es decir, fuera del microrreactor, sin correr el peligro de que se pierda el apareamiento específico de los dos o más genes, o productos génicos, o ADNc, que codifican para las subunidades del inmunorreceptor de interés.

Sin embargo, según otras realizaciones de la divulgación, algunas o todas de estas etapas todavía tienen lugar dentro de los microrreactores.

Según otra realización preferida de la divulgación, los restos de captura de ARNm se emulsionan con cebadores adecuados y al menos una polimerasa después de la etapa b).

Para este fin, el ARNm hibridado con los restos de captura de ARNm (por ejemplo, las perlas magnéticas de poli(dT)), se recoge, lava y emulsiona preferiblemente con cebadores, transcriptasa inversa y ADN polimerasa termoestable para llevar a cabo la RT-PCR, opcionalmente seguida por oePCR.

Tal proceso puede lograrse, por ejemplo, sedimentando las perlas magnéticas de poli(dT) que han capturado el ARNm celular sobre una rejilla magnética, después de las etapas de lavado y resuspensión. A continuación, las perlas pueden suspenderse en una mezcla de RT-PCR adecuada y la suspensión resultante se añade a un recipiente de agitación que contiene una fase oleosa. La emulsión resultante se añade luego a placas o tubos de PCR adecuados y se coloca en un termociclador.

Según otra realización preferida de la invención, el inmunorreceptor es un anticuerpo que tiene al menos dos subunidades, o un receptor de células T que tiene al menos dos subunidades. Mientras que en un anticuerpo, las subunidades son las cadenas pesadas y ligeras, en un anticuerpo similar al receptor de células T, las subunidades son las cadenas alfa y beta.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se referirá a un inmunorreceptor que se basa esencialmente en el concepto de inmunoglobulina. Cuando se aísla de una célula fuente, es decir, una célula que tiene el potencial de expresar dicho inmunorreceptor, dicho anticuerpo todavía está en el formato de Ig convencional (IgG, IgD, IgE, IgA y/o IgM). Preferiblemente, este será también el formato que es objeto del proceso de selección descrito en otra parte del presente documento, proceso en el que se selecciona una biblioteca de células expresoras para una célula que expresa un inmunorreceptor que tiene especificidad por una molécula diana dada.

Sin embargo, esto no significa que el inmunorreceptor que luego se usa con fines terapéuticos, de diagnóstico, analíticos, científicos o industriales todavía tenga ese formato. Bien puede estar presente como un fragmento o derivado del mismo, por ejemplo, como scFv, Fab y/o F(ab). Asimismo, el inmunorreceptor que luego se usa con fines terapéuticos, de diagnóstico, analíticos, científicos o industriales puede ser un nuevo formato de anticuerpo, por ejemplo, un constructo de anticuerpo bi o triespecífico, diacuerpo, anticuerpo de camélido, anticuerpo de dominio, homodímero bivalente con dos cadenas que consisten en scFv, IgA (dos estructuras de IgG unidas por una cadena J y un componente secretor), anticuerpo de tiburón, anticuerpo que consiste en una región de entramado de primates del nuevo mundo más CDR de primates que no son del nuevo mundo, constructo dimerizado que comprende CH3+VL+VH y anticuerpo conjugado ( por ejemplo, anticuerpo o fragmentos o derivados unidos a una toxina, una citocina, un radioisótopo o un marcador). Sin embargo, esta lista no es restrictiva.

El experto sabe cómo traducir un anticuerpo dado que todavía está en el formato de Ig convencional, y que ha demostrado tener especificidad por una diana dada, en un fragmento o derivado del mismo tal como se expuso anteriormente, o en un nuevo formato de anticuerpo tal como se expuso anteriormente.

Otro formato preferido es un “formato de quimera inversa”, en el que la región variable humana se aísla de un anticuerpo humano obtenido con el presente método y se fusiona a una región constante no humana, por ejemplo, una región constante murina. Este formato de quimera inversa proporciona ventajas particulares para aplicaciones de diagnóstico, analíticas, científicas o industriales seleccionadas, en las que se ha establecido una infraestructura completa que se basa en anticuerpos no humanos, en particular anticuerpos murinos o de conejo, incluidos formatos de ensayo, formatos histológicos y formatos de selección y en las que, por ejemplo, se usan anticuerpos anti-ratón marcados para marcar un anticuerpo de detección específico de diana (que es murino y tiene por tanto una región Fc murina). En tal entorno, un anticuerpo de detección completamente humano no sería compatible con el entorno restante.

Un formato de quimera inversa producido a partir de una región variable humana obtenida con el presente método combina las ventajas de la presente invención (calidad de unión superior debido al apareamiento conservado de cadenas pesadas y ligeras) con la compatibilidad del anticuerpo producido con formatos de ensayo convencionales, formatos histológicos o formatos de selección.

Dicha quimera inversa puede generarse de manera similar a los anticuerpos quiméricos, por ejemplo, mediante métodos recombinantes establecidos, tal como se comenta por ejemplo en Boulianne et al. (1984) o Morrisson et al. (1984).

Los receptores de células T (TCR) son moléculas que se encuentran en la superficie de los linfocitos T. Los receptores de células T son responsables de reconocer antígenos unidos a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Los receptores de células T suelen estar componerse de dos cadenas de proteína diferentes, a saber, una cadena alfa (a) y beta (P) (en el 5% de los linfocitos T, el receptor de células T consiste en cadenas gamma y delta (y/8)).

Cuando el TCR interactúa con la diana antigénica y el CMH, el linfocito T se activa a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores, moléculas adaptadoras especializadas y factores de transcripción activados o liberados.

Las proteínas de fusión del receptor de células T recombinante han surgido recientemente como un medio para seleccionar como diana antígenos peptídicos que se presentan como un complejo de péptido y complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) en la superficie celular.

Para este fin, pueden crearse variantes solubles de receptores de células T, por ejemplo, fusionando un TCR con un inmunoestimulador. Estas proteínas de fusión pueden usarse para seleccionar como diana antígenos intracelulares originariamente. Tales antígenos intracelulares no son accesibles mediante otras terapias dirigidas, en particular, no mediante anticuerpos. A través de este enfoque, pueden seleccionarse como diana diversos cánceres mediante el uso de variantes solubles de receptores de células T dirigidas contra antígenos específicos del cáncer (Card et al., 2004).

Según otra realización preferida de la invención, el inmunorreceptor es una proteína terapéutica (por ejemplo, una proteína que se usa en un paciente humano o animal para tratar una enfermedad, o evitar su aparición), una proteína con fines de diagnóstico o científicos (por ejemplo, una proteína que se usa para detectar un analito), o una proteína con fines comerciales (por ejemplo, una proteína que se usa en un proceso industrial, por ejemplo, para el aislamiento o la purificación de un compuesto dado).

Según otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método para crear una biblioteca de células expresoras, biblioteca en la que cada célula puede expresar dos o más genes, o productos génicos, que codifican para las subunidades del inmunorreceptor recuperado según el método de la reivindicación 1, método que comprende las siguientes etapas:

g) transfectar células expresoras con el constructo de expresión bi o multicistrónico, y

h) encapsular las células expresoras en microrreactores

Tal como se comenta en otra parte, estos microrreactores pueden ser, en principio, similares a los usados para las células fuente, es decir, las células que tienen el potencial de expresar el inmunorreceptor de interés, o su ARNm. Sin embargo, estos microrreactores también pueden ser más grandes porque, en una realización preferida, las células expresoras se expanden después de la encapsulación.

Preferiblemente, estas células expresoras son células usadas habitualmente para la expresión heteróloga de proteínas terapéuticas, de diagnóstico, analíticas, científicas o industriales. El término “células expresoras” abarca células bacterianas (como E. coli), células fúngicas (como Pichia, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Arxula o Trichoderma), células de mamíferos (como CHO, COS, HEK, HeLa, 3T3, NSO o HepG2, PER.C6), o células de insectos.

Es importante, en este contexto, que los términos “célula fuente” y “célula expresora” signifiquen dos cosas diferentes. El término célula fuente se refiere a la célula que es la fuente de los genes que codifican para una proteína dada, por ejemplo, una célula o una colección de células aisladas de la naturaleza, por ejemplo, de un donante.

En contraste con ello, el término “célula expresora” se referirá a una célula que se usa realmente en el método según la invención para expresar dicho inmunorreceptor, obtenerlo en grandes cantidades y purificarlo para su uso adicional.

Preferiblemente, en la etapa g) se garantiza que cada célula expresora se transfecta con un constructo de expresión bi o multicistrónico únicamente. Esto puede lograrse, preferiblemente, mediante procesos de dilución limitante bien conocidos por los expertos.

Asimismo, preferiblemente, se garantiza en la etapa h) que sólo se encapsula una célula expresora por cada microrreactor. Esto puede lograrse, preferiblemente, titulando el número de partículas virales por célula de modo que se transduzcan << 100%, por ejemplo el 10% de células o el 30% de células (dilución limitante).

Se prevé que las células expresoras encapsuladas se cultiven en condiciones que permitan la expresión de proteínas y/o la proliferación de las células.

En una realización preferida, se prevé que, antes de la encapsulación en la etapa h), las células transfectadas se incuben en condiciones que permitan la expresión de proteínas. Esta realización permite separar aquellas células que son disfuncionales o que no expresan el transgén, por ejemplo, el inmunorreceptor combinado con un gen marcador (marcador fluorescente/marcador de superficie).

Preferiblemente, después de la etapa g) o h) puede llevarse a cabo una etapa de control de calidad adicional, en la que se comprueba si las células infectadas pueden expresar o no un anticuerpo funcional.

Según otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método de selección de una biblioteca de células expresoras creadas según el método anterior, método que está destinado a detectar una célula (o, respectivamente, su progenie clonal en el microrreactor) que expresa un inmunorreceptor que tiene especificidad por una molécula diana dada, método que comprende al menos una de las siguientes etapas:

i) usar una diana marcada que pueda entrar en los microrreactores y unirse a un inmunorreceptor expresado por la célula expresora comprendida en los mismos, y/o

j) detectar el inmunorreceptor expresado por la célula expresora que se ha escapado de los microrreactores y ahora se encuentra en el sobrenadante en combinación con el fraccionamiento en serie del cultivo del microrreactor Con respecto a esta última opción, puede usarse tecnología de selección establecida que pueda detectar inmunorreceptores en el sentido de la presente invención.

En cuanto al primero, la concentración de inmunorreceptor en el interior de los microrreactores alcanza niveles máximos más rápidamente que en el fluido sobrenadante. Esta retención temporal de inmunorreceptores puede aprovecharse para la selección usando una etapa de lavado para diluir la concentración de inmunorreceptores en el fluido sobrenadante que rodea a los microrreactores antes de la detección dentro del microrreactor de la especificidad del anticuerpo. Los microrreactores que se tiñen positivamente para un antígeno marcado con fluorescencia se separan entonces y, o bien se dejan intactos para, por ejemplo, una selección confirmatoria adicional o bien se perturban para permitir el crecimiento adicional del clon celular específico de/reactivo con el antígeno y la producción de anticuerpo monoclonal.

Con respecto a esto último, el fluido sobrenadante que rodea a los microrreactores obtenido después de sedimentación o centrifugación del cultivo del microrreactor puede someterse a prueba directamente para detectar la presencia de inmunorreceptores con la función u otra propiedad deseada.

En cada caso, el experimento respectivo proporcionará un resultado positivo (“coincidencia”) si el inmunorreceptor expresado por la célula expresora respectiva tiene especificidad por la diana marcada.

Tal marcador para el marcaje de la diana puede consistir, por ejemplo, en un radioisótopo, una enzima, una entidad luminiscente, una entidad fluorescente, una entidad fosforescente, una partícula que contiene metal (por ejemplo, una partícula que contiene oro), una entidad, un anticuerpo o similar. Encontrar un marcador adecuado forma parte completamente de la rutina del experto en la técnica.

Debe entenderse que la presente divulgación implica tres métodos individuales, o subetapas, que están ligados entre sí por el mismo concepto inventivo, a saber (i) un método para recuperar dos o más genes, o productos génicos, o ADNc, que codifican para un inmunorreceptor, (ii) un método de creación de una biblioteca de células expresoras basándose en los genes recuperados, o productos génicos, o ADNc, y (iii) un método de selección de tal biblioteca de células expresoras.

Según la invención, los restos de captura de ARNm son perlas o partículas, preferiblemente perlas o partículas magnéticas. Preferiblemente, los restos de captura de ARNm comprenden secuencias de ADN de oligo-dT unidas a su superficie.

En este contexto, se prefieren perlas magnéticas que comprenden secuencias de ADN de oligo-dT. Un ejemplo de este tipo de perlas son Dynabeads® oligo(dT) 25 proporcionadas por Life Technologies. El uso de perlas de oligo-dT se basa en el apareamiento de bases entre la cola de poli A del ARN mensajero y las secuencias de oligo-dT unidas a la superficie de las perlas. Por tanto, las perlas de oligo-dT pueden usarse para recuperar todo el ARNm de una célula dada. Después de hibridación, el vial se coloca sobre un imán para concentrar las perlas con su ARNm unido en el lateral del tubo. Se desecha el sobrenadante que contiene contaminantes no deseados. El protocolo puede realizarse en 15 minutos, sin necesidad de preparar ARN total ni realizar ninguna otra etapa de purificación. El oligodT unido a la superficie de la perla puede usarse tanto para capturar el ARNm como para actuar como cebador para la transcriptasa inversa durante la síntesis de la primera hebra de ADNc.

Según otra realización preferida de la invención, el vector de expresión bi o multicistrónico es un vector multicistrónico ligado a un péptido 2A con o sin combinación con una secuencia de IRES (sitio interno de entrada al ribosoma).

Se describen vectores multicistrónicos ligados a péptido 2A, por ejemplo, en Szymczak et al. (2004). Sin embargo, el experto comprenderá fácilmente que otras expresiones bi o multicistrónicas adecuadas también están incluidas en el alcance de la presente invención y pueden usarse en su contexto sin la necesidad de etapas inventivas adicionales. Los materiales y las tecnologías para preparar microrreactores en el sentido de la presente invención los conocen bien los expertos en la técnica. En principio, pueden usarse todas las tecnologías que a) produzcan cápsulas de tamaño apropiado y que b) produzcan cápsulas con alta monodispersidad.

Además, en realizaciones preferidas pueden usarse materiales que a) den como resultado cápsulas con la permeabilidad deseada para todos o algunos de los reactivos usados en su presencia, y que b) den como resultado cápsulas que sean estables para todas las condiciones de reacción empleadas en su presencia, y que c) muestren efectos inhibidores bajos o nulos para las reacciones enzimáticas realizadas dentro de la estructura de la cápsula. Resulta evidente que la(s) célula(s) y/o ácido(s) nucleico(s) transformado(s) y/o amplificado(s) no deben poder salir de la cápsula hasta la lisis de la cápsula.

Para poner en práctica el método de la presente invención, puede ser necesario emplear materiales de cápsula que muestren efectos inhibidores bajos o nulos para las reacciones enzimáticas tales como reacciones de amplificación o secuenciación realizadas dentro de la estructura de la cápsula. Los materiales de cápsula con bajos efectos inhibidores apropiados sobre las reacciones de amplificación y secuenciación son los enumerados anteriormente. Muchos materiales de cápsula permiten que proliferen las células encerradas. Además, es deseable emplear un material de cápsula que sea estable frente a todas las condiciones de reacción empleadas. Preferiblemente, las cápsulas no se disgregan por el estrés químico, físico y mecánico inducido, por ejemplo, por el crecimiento de células, lisis celular, amplificación in vitro o secuenciación de ADN. Los materiales de cápsula preferidos son los que se comentan en otra parte del presente documento.

Más preferiblemente, los microrreactores para poner en práctica la presente invención se producen mediante un método para la producción de gotas individuales tal como describen Serp et al. (2000). Otras tecnologías que proporcionan resultados adecuados son la tecnología Flow focusing (enfoque de flujo, Cellena®, Ingeniatrics Tecnologías, SL, Sevilla, España), Gómez-Herreros et al (2012), boquillas de enfoque de flujo incorporadas en dispositivos microfluídicos tal como se describe en Martínez et al (2012), métodos de polimerización en emulsión (One Cell Systems, Inc., EE.UU.) y la tecnología Jet-cutter (corte por chorro) tal como se describe en PrüIJe et al. (1998).

Preferiblemente, las cápsulas para su uso en la invención tienen un tamaño de poro que permite su penetración por parte o la totalidad de los reactivos empleados. Para poner en práctica el método de la presente invención, es ventajoso emplear un material de cápsula que sea permeable a varios reactivos que se necesitan, por ejemplo, para la propagación celular, eliminación de catabolitos, amplificación, marcaje y/o secuenciación y que ayuden a la purificación.

Según la invención, cada microrreactor comprende una célula fuente, por ejemplo una célula B o una célula T. El número de células por microrreactor también se conoce como “grado de ocupación” (GDO). En esta realización, en realidad se lleva a cabo una RT-PCR de una única célula para recuperar el ARNm. La ventaja específica de esta realización es que se trata de un enfoque que permite la recuperación simultánea de dos o más genes, o productos génicos, que codifican para las subunidades de la proteína que tiene dos o más subunidades de una célula, tal como se describió anteriormente.

Sin embargo, hasta ahora no se ha usado una RT-PCR de una única célula para recuperar dos o más genes, o productos génicos, que codifican para las subunidades de la proteína de una célula que forma parte de una colección de células, como una biblioteca o una donación de células B de un donante humano y crear una biblioteca de células expresoras basándose en la misma, porque no fue posible combinar RT-PCR de una única célula con métodos de alto rendimiento.

Por este motivo, se consideró que la RT-PCR de una única célula constituía un obstáculo para la recuperación de dos o más genes, o productos génicos, que codifican para las subunidades de la proteína que tiene dos o más subunidades.

Cada microrreactor comprende una célula fuente. Sin embargo, esto no se aplica a los microrreactores usados para encapsular las células expresoras.

Sin embargo, los microrreactores usados para encapsular una célula fuente pueden comprender además las denominadas células alimentadoras, es decir, células que no tienen el potencial de expresar dicho inmunorreceptor o su ARNm. Sin embargo, cuando se lisan, estas células pueden suministrar ARNm no relacionado con inmunorreceptores que puede ser útil para saturar las entidades de captura de ARNm.

Preferiblemente, los microrreactores comprenden un material seleccionado del grupo que consiste en:

• polímeros formadores de hidrogel, preferiblemente poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(etilenimina), polilisina, poliacrilamidas y/o ácidos acrílicos

• derivados de celulosa, preferiblemente carboximetilcelulosa y ésteres de celulosa, y/o

• polisacáridos, preferiblemente agarosas, alginatos, carragenanos, pectinatos y/o quitosanos Estos tipos de microrreactores también se denominarán “reactores de nanolitros” (NLR) en el presente documento, aunque su volumen no debe estar necesariamente en el rango de nanolitros, sino que puede ser mayor o menor. En una realización particularmente preferida, los microrreactores comprenden hidrogeles de alginato reticulados por cationes metálicos bivalentes o trivalentes. Los microrreactores que comprenden alginato se penetran fácilmente por estructuras globulares como tales enzimas y anticuerpos, y ADN de hebra corta (cebadores). Las moléculas de ADN grandes, similares a hilos, tales como los productos de la PCR, penetran a una tasa mucho menor. Por tanto, se consigue la inmovilización temporal de los productos de PCR obtenidos a partir de una única célula en el microrreactor. Además, los microrreactores que comprenden alginato pueden procesarse mediante análisis de alto rendimiento y separación por citometría de flujo. Más preferiblemente, el material de cápsula de alginato comprende alginato de calcio, bario y/o estroncio. Se encontró sorprendentemente que las microcápsulas de alginato de bario y alginato de estroncio tienen un efecto inhibidor significativamente reducido sobre las enzimas polimerasas necesarias para las reacciones de PCR. Por tanto, el alginato de bario y estroncio permitirá una amplificación mucho mejor que el alginato de calcio.

El proceso de formación de perlas de alginato y encapsulación de células en las misma incluye, por ejemplo, el uso de una mezcla de alginato y las células que van a encapsularse, que se extraen a través de microboquillas de tubo de polímero. El diámetro de perla puede ajustarse arbitrariamente según la geometría de la boquilla y frecuencias de giro de entre 5-28 Hz. Las perlas se emiten desde la microboquilla a través de un espacio de aire hacia un agente de curado (por ejemplo, disolución de CaCb) contenida en un tubo de laboratorio convencional.

Según otra realización preferida, los microrreactores se forman como gotas acuosas en una emulsión de agua/aceite. Estos tipos de microrreactores también se denominarán en el presente documento “gotas de emulsión”. Tales microrreactores pueden crearse, por ejemplo, con el sistema de PCR QX100™ Droplet Digital™ proporcionado por Biorad. En dicho dispositivo, las muestras y el aceite de generación de gotas se cargan en un cartucho de generador de gotas de ocho canales. Luego se aplica vacío al pocillo de gotas, que extrae la muestra y el aceite a través de una boquilla de enfoque de flujo en la que se forman gotas monodispersas.

La discusión anterior se refiere tanto a (i) los microrreactores usados para encapsular las células fuente o para recuperar los dos o más genes o productos génicos o ADNc, que codifican para un inmunorreceptor, así como (ii) a los usados para encapsular las células expresoras, es decir, en ambos casos los microrreactores pueden formarse o bien como gotas acuosas en una emulsión de agua/aceite o bien a partir de polímeros formadores de hidrogel, derivados de celulosa y/o polisacáridos, como agarosas, alginatos, carragenanos, pectinatos y/o quitosanos.

Sin embargo, en una realización preferida, se prevé que los microrreactores usados para (i) se formen como gotas acuosas en una emulsión de agua/aceite, mientras que los microrreactores usados para (ii) sean los de polímeros formadores de hidrogel, derivados de celulosa y/o polisacáridos, como agarosas, alginatos, carragenanos, pectinatos y/o quitosanos.

Según otra realización preferida de la divulgación, los microrreactores tienen un diámetro de entre > 10 pm y < 1000 pm.

Según aún otra realización preferida de la divulgación, los microrreactores tienen un volumen de entre > 0,52 pl y < 523 nl.

Más preferiblemente, los microrreactores usados para (i) tienen un volumen de entre > 0,5 y < 5 nl, mientras que los microrreactores usados para (ii) tienen un volumen de entre > 25 y < 150 nl.

Sin embargo, en una realización preferida, se prevé que los microrreactores usados para (i) se formen como gotas acuosas en una emulsión de agua/aceite, mientras que los microrreactores usados para (ii) sean los de polímeros formadores de hidrogel, derivados de celulosa y/o polisacáridos, como agarosas, alginatos, carragenanos, pectinatos y/o quitosanos. Sin embargo, preferiblemente, los microrreactores usados para encapsular las células fuente pueden ser más pequeños que los usados para encapsular las células expresoras.

La siguiente tabla ofrece una descripción general de los diferentes subtipos de microrreactores usados en el contexto de la presente invención:

Tipos de microrreactores dados a conocer en el presente documento

Gotas de emulsión Reactores NLR

Según todavía otra realización preferida de la divulgación, los microrreactores tienen una forma esferoidal.

Según otra realización preferida de la divulgación, la célula fuente es de una colección de células cuyos miembros comprenden productos génicos para diferentes inmunorreceptores. Preferiblemente, la célula fuente es una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en células B o células T inmaduras o maduras.

En esta realización, la colección de células es, por ejemplo, una colección de células B maduras, por ejemplo, células B de memoria. Tal colección puede ser una colección de células recopiladas a partir de donaciones de células B de diferentes donantes, así como una colección de todas las células B de un donante dado, la fracción de las mismas, o al menos que, como tal, comprende el anticuerpoma, es decir, el conjunto completo de anticuerpos que están codificados por la totalidad de células B maduras de dicho donante, o una fracción de las mismas.

Las células B maduras o inmaduras son tipos de células B en las que el reordenamiento VDJ y el reordenamiento VJ ya han tenido lugar. Esto significa que estas células ya han combinado aleatoriamente segmentos génicos variables, de unión y diversos de tal manera que se obtienen genes reordenados únicos que codifican para una cadena pesada única (VDJ) y una cadena ligera única (VJ).

Preferiblemente, las células B son células B plasmáticas o células B de memoria. Las células B plasmáticas (también conocidas como células plasmáticas, plasmocitos y células B efectoras) son células B grandes que han estado expuestas al antígeno y producen y secretan grandes cantidades de anticuerpos, que ayudan en la destrucción de microbios al unirse a los mismos y haciendo que sean dianas más fáciles para los fagocitos y la activación del sistema del complemento. A veces se les conoce como fábricas de anticuerpos. Una micrografía electrónica de estas células revela grandes cantidades de retículo endoplásmico rugoso, responsable de sintetizar el anticuerpo, en el citoplasma de la célula. Las células experimentan apoptosis cuando se elimina el agente causal que induce la respuesta inmunitaria. Esto sucede debido al cese de la exposición continua a diversos factores estimulantes de colonias que se requieren para la supervivencia.

Las células B de memoria se forman a partir de células B activadas que son específicas para el antígeno encontrado durante la respuesta inmunitaria primaria. Estas células pueden vivir durante mucho tiempo y pueden responder rápidamente tras una segunda exposición al mismo antígeno.

Las células T, o linfocitos T, son un tipo de linfocitos que desempeñan un papel fundamental en la inmunidad mediada por células. Pueden distinguirse de otros linfocitos, tales como las células B, por la presencia de un receptor de células T (TCR) en la superficie celular. Existen diferentes tipos de células T, a saber, células T auxiliares, citotóxicas, de memoria, reguladoras y linfocitos T citolíticos (NKT, natural killer T).

Al igual que las células B, las células T experimentan, durante el desarrollo de los timocitos, esencialmente la misma secuencia de eventos de recombinación ordenada que la descrita para las inmunoglobulinas. La recombinación D-a-J sucede en primer lugar en la cadena p del TCR. Este proceso puede implicar o bien la unión del segmento génico D^p1 a uno de seis segmentos J^p1 o bien la unión del segmento génico D^p2 a uno de siete segmentos J^p2. La recombinación DJ está seguida (como anteriormente) por reordenamientos V^p-a-D^pJ^p. Se delecionan todos los segmentos génicos entre los segmentos génicos V^p-D^p-J^p en el complejo recién formado y se sintetiza el transcrito primario que incorpora el gen de dominio constante (V^p-D^p-J^p-C^p). La transcripción del ARNm retira por corte y empalme cualquier secuencia intermedia y permite la traducción de la proteína de longitud completa para la cadena C^p de TCR. El reordenamiento de la cadena alfa (a) del TCR sigue al reordenamiento de la cadena p y se asemeja al reordenamiento V-a-J descrito para las cadenas ligeras de Ig (véase anteriormente). El ensamblaje de las cadenas p y a da como resultado la formación del ap-TCR que se expresa en la mayoría de las células T. La especificidad de las células T está restringida por CMH, por lo que los ^t C^r reconocen principalmente antígenos de péptidos lineales procesados de manera intracelular en el contexto de moléculas de CMH. Esto contrasta notablemente con el modo de reconocimiento de las células B, que a través de anticuerpos solubles o de membrana reconocen estructuras diana tridimensionales de su antígeno afín sin ninguna implicación de moléculas de CMH, sin el requisito de que se complejen con el CMH. Por tanto, las células T y B representan dos modos de reconocimiento fundamentalmente diferentes del sistema inmunitario específico. Los anticuerpos que presentan un modo de reconocimiento de antígenos restringido por CMH (anticuerpos similares a TCR) parecen no producirse de manera natural, sino que pueden inducirse por la hiperinmunización de animales de laboratorio. Sin embargo, ha sido difícil generar tales especificidades para una amplia variedad de complejos péptido-CMH y con la especificidad y afinidad requeridas.

Según otra realización preferida de la divulgación, las células fuente proceden de uno o más donantes. Preferiblemente, tal donante es un donante humano. Asimismo, tal donante puede ser de conejo, ratón, cerdo, rata, vaca y primates no humanos.

Más preferiblemente, tal donante es un donante que ha mostrado síntomas reducidos o atenuados con respecto a una enfermedad dada, ha demostrado una progresión de la enfermedad retardada o ha resultado ser resistente con respecto a dicha enfermedad. Tal donante puede tener una mayor probabilidad de comprender una célula fuente, por ejemplo, una célula de memoria B, que codifica para una proteína terapéutica, por ejemplo, un anticuerpo, que puede tener un efecto terapéutico, protector o retardante con respecto a dicha enfermedad, por ejemplo, porque es un antagonista de una citocina mediadora del cáncer, porque se une a un patógeno dado o porque se une a un receptor implicado en una respuesta inmunitaria.

Según otra realización preferida de la invención, los dos o más genes, o productos génicos, que codifican para las subunidades de la proteína son el gen de cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) (reordenado como VDJ) y el gen de cadena ligera de inmunoglobulina (Ig) (reordenado como VJ). Estos genes también se denominan V^h y V^l, o genes k y X.

Alternativamente, los dos o más genes, o productos génicos, que codifican para las subunidades de la proteína son el gen de cadena alfa de TCR (reordenado) y el gen de cadena beta de TCR (reordenado). Según otra realización preferida de la invención, el método comprende además la etapa de insertar ADNc que codifica para los subdominios H constante de Ig y/o L constante de Ig en el producto de PCR.

Alternativamente, el método comprende además la etapa de insertar ADNc que codifica para la cadena alfa de TCR y beta de TCR en el producto de PCR.

Se da a conocer además el uso del inmunorreceptor para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad. Dicha enfermedad es, preferiblemente, una enfermedad humana o animal, más preferiblemente una enfermedad neoplásica, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad infecciosa, enfermedad mediada por el sistema inmunitario y/o enfermedad cardiovascular.

Las enfermedades neoplásicas abarcan enfermedades malignas como tumores, cánceres y similares. Las enfermedades mediadas por el sistema inmunitario abarcan enfermedades autoinmunitarias. Las enfermedades neurodegenerativas abarcan enfermedades que afectan a la integridad del sistema nervioso central y/o periférico. Las enfermedades infecciosas abarcan enfermedades provocadas por parásitos, protozoos, procariotas, virus, priones y hongos. Las enfermedades mediadas por el sistema inmunitario abarcan enfermedades que se caracterizan por una disfunción del sistema inmunitario, por ejemplo, porque el sistema inmunitario es hiperactivo o hipoactivo. Las enfermedades cardiovasculares abarcan cualquier enfermedad que afecte al sistema cardiovascular, principalmente cardiopatías, vasculopatías del cerebro y los riñones y arteriopatías periféricas.

Breve descripción de los ejemplos y dibujos

Se dan a conocer detalles, rasgos, características y ventajas adicionales del objeto de la invención en las reivindicaciones dependientes, y la siguiente descripción de las figuras y los ejemplos respectivos, que, a modo de ejemplo, muestran realizaciones preferidas de la presente invención. Sin embargo, estos dibujos no deben entenderse en modo alguno como que limitan el alcance de la invención.

Experimentos

Presentación recombinante de un repertorio completo de anticuerpos (anticuerpoma) de un sujeto humano o de una especie animal.

Se usan células B de memoria humana como material de partida para la presentación recombinante de un anticuerpona humano. El conjunto de células B de memoria de un sujeto conserva las especificidades de anticuerpos y posiblemente también las frecuencias de anticuerpos generadas durante encuentros previos con antígenos (McHeyzer-Williams y Ahmed (1999), Bernasconi et al. (2002).

Alternativamente, todos los tipos de células B tales como células plasmáticas, células preplasmáticas, células B B1 y células B inmaduras o células de hibridoma fuente humano o no humano pueden procesarse mediante esta tecnología.

1. Captura de ARNm del anticuerpoma por medio de NLR

1.1 Células B de memoria humanas

Se aíslan células B de memoria de células monocíticas de sangre periférica mediante separación celular (separador de células MoFlo XDP, Beckman-Coulter, Nyon, Suiza) usando como criterio de separación, la expresión del marcador de células pan-B CD22, combinado con la ausencia de expresión de IgM, IgD de superficie como marcadores de células B inmaduras. También podrían usarse otras combinaciones de marcadores de superficie tales como CD19, CD27 en combinación o sin combinación con IgG expresada en superficie.

1.2 Coencapsulación de células B de memoria y perlas de matriz de captura de ARNm en reactores de nanolitros Entonces se usan 100.000 células B positivas para CD22, negativas para IgM, IgD, IgA para la encapsulación en NLR junto con las perlas de captura de ARNm Dynabeads. Se usan 20.000 células B sustitutas que expresan IgG humana para el emulsionamiento en gotas de emulsión junto con Dynabeads de captura de ARNm usando el generador de gotas QX100.

1.2.1 Coencapsulación de células productoras de anticuerpos y perlas de matriz de captura de ARNm en reactores de nanolitros

Se encapsularon células productoras de anticuerpos a un grado de ocupación (GDO) de 1 junto con 5 Dynabeads dotadas de oligo-dT (1 célula B y 5-50 Dynabeads por NLR).

Se resuspendieron 20.000 células productoras de anticuerpos en 1,6 ml de tampón de encapsulación y se añadieron 0,5 - 5x106 perlas de matriz de captura de ARNm (Dynabeads). Se añadieron 6,4 ml de disolución de alginato al 2,5% sometida a filtración esterilizante (Pronova) y se mezcló suavemente. Se procesó la suspensión de perlas magnéticas-células-alginato con un encapsulador de ruptura de chorro laminar a través de una boquilla de 150 pm de diámetro a 700 Hz.

Se recogieron gotas en un vaso de precipitados con agitación continua lleno con 100 ml de disolución de endurecimiento. Se permitió que los vehículos de alginato se estabilizaran durante 15 min para formar NLR. Se recuperaron los NLR de la disolución de endurecimiento mediante tamizado y se lavaron dos veces en 80 ml de tampón de encapsulación. Se recogieron los NLR en tampón de encapsulación a 4°C/TA y se sometieron a separación de partículas grandes para eliminar los NLR sin una célula y los que contenían más de 1 célula.

1.3 Lisis de células y captura de ARNm en Dynabeads en el interior de NLR

Se permitió que sedimentase la suspensión de NLR durante 5 min y se aspiró el sobrenadante. Se resuspendieron los NLR obtenidos suavemente en un volumen igual de tampón de lisis recién preparado y se incubaron a TA, 20 RPM durante 30 min para permitir la lisis celular completa.

1.4 Disolución de NLR, lavado y retención de la matriz de captura de ARNm

Se filtró la reacción de lisis, reteniéndose los NLR que se lavaron tres veces con tampón de encapsulación. Los NLR lavados se disolvieron mediante tratamiento con disolución de EDTA y se recogieron perlas de oligo-dT usando un dispositivo magnético proporcionado por el fabricante del kit. Normalmente, el 5-30% de las Dynabeads contienen ARNm en su superficie.

2. Captura de ARNm del anticuerpoma por medio de gotas de emulsión

En otra realización preferida de la invención, se usa una emulsión de agua en aceite para generar microrreactores. Se forma una emulsión de agua en aceite mezclando una fase acuosa con una fase oleosa en presencia de tensioactivos adecuados.

La fase oleosa puede consistir en aceite mineral, aceite de silicona, Tegosoft DEC, un fluido de ingeniería como Novec 7500, FC-40, FC-43, FC-70 u otro aceite fluorado común o cualquier mezcla de los mismos. Como tensioactivo puede usarse un detergente como Triton X-100, Nonidet P-40 (NP-40), Tween 80, Tween 40, Tween 20, ABIL EM 90, ABIL WE 09, dodecilsulfato de sodio o dodecilsulfato de litio o un detergente fluorado como Krytox u otros tensioactivos basados en perfluoropoliéter (PFPE) o cualquier mezcla de los mismos.

Como estabilizadores de microrreactores y potenciadores de la reacción de PCR, pueden añadirse varios aditivos a la fase acuosa de la emulsión de agua en aceite como 2-pirrolidona, polivinilpirrolidona, betaína, DMSO, PEG8000, Pluronic F-68, glicerol, BSA y/o gelatina.

Las emulsiones de agua en aceite pueden producirse de varias maneras. En una realización, (i) pueden formarse gotas agitando en vórtex una mezcla de agua-tensioactivo-aceite con o sin la adición de una o varias perlas de vidrio 0 acero. El diámetro de una perla es de 5 mm, 1 mm o, preferiblemente, 400 nm en promedio. La frecuencia de mezclado puede controlarse mediante el uso de un molino mezclador TissueLyser en lugar de un vórtex, el ajuste de elección puede ser de 15-17 Hz.

En otra realización (ii), pueden producirse emulsiones de agua en aceite mediante el uso de un generador de gotas microfluídico proporcionado por Bio-Rad (PCR QX100™ Droplet Digital™) o Raindance (PCR RainDrop® Digital). En este caso, se usan chips microfluídicos para generar microrreactores de agua en aceite de tamaños uniformes de 1 nl y 1 pl, respectivamente.

En el caso de gotas de emulsión de agua en aceite, puede lograrse la recuperación de restos de captura de ARNm, productos de ADNc o PCR de los microrreactores mediante la adición de disolventes orgánicos. Este disolvente orgánico puede ser etanol, 1-propanol, isopropanol, butanol, hexanol, cloroformo, acetonitrilo, cualquier mezcla de los mismos y/o mezcla con agua. El proceso se describe en Diehl et al (2006).

2.1. Encapsulación celular, lisis celular, captura de ARNm y transcripción inversa

Se recogieron las células que expresan anticuerpos y se diluyeron a 2x106 células por ml en tampón de lisis celular (Tris-HCl 50 mM pH 8,3, Kc I 50 mM, LiCl 50 mM, EdTA 5 mM, DTT 10 mM). Se lavaron una vez Dynabeads de oligo-dT (Life Technologies, n.° de cat. 61006) en tampón de lisis celular, se recogieron las perlas sobre un imán Dynal (Life Technologies, n.° de cat. 12321D) y se desechó el sobrenadante. Se añadieron células a las perlas magnéticas y se mezclaron cuidadosamente, siendo las cantidades finales de células y perlas por 20 pl de 15.000 células y 180.000 perlas. Se mantuvo la mezcla en hielo y se transfirió al generador de gotas QX100 (Bio-Rad). Directamente antes de que comenzase la formación de la emulsión en el cartucho DG8™ (Bio-Rad), se añadió proteinasa K (Applichem, n.° de cat. A4392) a la mezcla de células/Dynabeads hasta una concentración final de 0,2 mg/ml. Se generaron gotas para ocho muestras de 20 pl en paralelo según las instrucciones del fabricante. Como aceite de emulsión, se usó Pico-Surf™ 2 (al 2% en Novec 7500) (Dolomite Microfluidics, n.° de cat. 3200281). Se transfirieron ocho veces 40 pl de emulsiones pipeteando desde el cartucho a dos tubos de reacción de 1,5 ml independientes (dando como resultado 2 muestras de una emulsión de 160 pl). Se lisaron las células encapsuladas (véase la figura 6) mediante incubación a 70°C durante 15 minutos en un bloque térmico. Posteriormente, se pusieron muestras a temperatura ambiente y se permitió que se enfriasen lentamente. Esta etapa de incubación de 15 minutos a temperatura ambiente facilitó la unión del ARNm liberado por la célula a las Dynabeads de oligo-dT. En el siguiente etapa, se recuperaron perlas de oligo-dT con ARNm unido rompiendo la fase oleosa mediante la adición de 1 ml de isopropanol a la emulsión y agitando en vórtex. Se puso la disolución transparente en la parte superior de un filtro de centrífuga (Thermo Scientific, n.° de cat. F2517-5) y se centrifugó durante 30 segundos a 3500 de fcr. Se desechó la fracción no retenida y se lavaron las perlas recogidas una vez en etanol al 70%. Se resuspendieron las Dynabeads de oligo-dT en 300 pl de tampón B del kit de purificación de ARNm (Life Technologies, n.° de cat. 61006) y se transfirieron a un tubo de reacción de 1,5 ml nuevo. Se recogieron las perlas sobre el imán y se reemplazó el tampón por 100 pl de tampón de ADNasa 1x. Posteriormente se añadieron 2 pl de ADNasa I libre de ARNasa (NEB, n.° de cat. M0303S) y se incubó la mezcla durante 10 min a 37°C para digerir el ADN unido a las perlas de oligo-dT. Se detuvo la reacción mediante la adición de 1 pl de EDTA 0,5 M. Se lavaron las perlas dos veces con 300 pl de tampón B del kit de purificación de ARNm (Life Technologies, n.° de cat. 61006) y una vez con 300 pl de tampón de RT 1x de la transcriptasa inversa maxima RT (Life Technologies, n.° de cat. EP0742). Se desechó el sobrenadante y se resuspendieron las perlas de oligo-dT cubiertas con ARNm en una mezcla de transcriptasa inversa que contenía dNTP 0,5 mM, tampón de RT 1x, 20 U de inhibidor de ARNasa RiboLock (Thermo Scientific, n.° de cat. EO0381) y 200 U de transcriptasa inversa Maxima (Life Technologies, n.° de cat. EP0742). Se incubó la reacción durante una hora a 55°C. Posteriormente, se detuvo la reacción elevando la temperatura hasta 85°C durante 5 minutos. Se recuperaron las perlas de oligo-dT, con el ADNc unido covalentemente, usando un imán. Se desechó el sobrenadante, se resuspendieron las perlas en Tris 20 mM pH 8,0 y se almacenaron a 4°C hasta su procesamiento adicional.

2.2. de PCR de extensión solapada en emulsión

Se usaron perlas de ADNc producidas tal como se describe en el ejemplo 2.1 como molde para una PCR de extensión solapada para ligar las secuencias de ADN que codifican para VH y VL de anticuerpo. Para garantizar el ligamiento correcto de las secuencias que pertenecen a un anticuerpo y evitar la interferencia entre secuencias, se realizó esta reacción de PCR en una única emulsión de perlas. Para ello, se diluyeron perlas en una mezcla de reacción de PCR que contenía dNTP 0,25 mM, 0,25 pM de cada cebador (VH4, Vk2, CH, Ck1), BSA al 0,25% p/v, Pluronic F-68 al 2% p/v, tampón A 1x y 1 U de polimerasa de arranque en caliente KAPA Robust (Kapa Biosystems, n.° de cat. KK5515). Se emulsionaron las perlas usando un generador de gotas QX100 y aceite de emulsión Pico-Surf™-1 (Dolomite Microfluidics, n.° de cat. 3200211) tal como se describe en el ejemplo 2.1. Se transfirieron las emulsiones a tubos de PCR de 0,2 ml y se llevó a cabo una reacción de PCR en un termociclador de PCR (Peqlab, termociclador peqSTAR 2x, n.° de cat. 95-07002) usando los siguientes ciclos de temperatura:

° 95°C 3 min

- 5 ciclos

° 95°C 15 s (rampa de 1°C por s)

° 62°C 15 s (rampa de 1°C por s)

° 72°C 15 s (rampa de 1°C por s)

- 30 ciclos

° 95°C 15 s (rampa de 0,5°C por s)

° 57°C 15 segundos (rampa de 0,5°C por s)

° 72°C 15 segundos (rampa de 0,5°C por s)

- 1 ciclo

o 72°C 10'

o 8°C <x>

Una vez completada la reacción de PCR, se rompieron las emulsiones mediante la adición de 20 pl de tampón de TE y 70 pl de cloroformo y se agitaron en vórtex. Se aclararon muestras en una etapa de centrifugación a 14.000 de fcr durante 2 minutos y se retiraron las fases superiores de cada muestra a un tubo nuevo. Se añadió tampón de carga de ADN y se analizaron las muestras en un gel preparativo de agarosa al 1,2%. Fue visible una banda en el tamaño del producto ligado a aprox. 1100 pb (compárese con la figuras 6, 1a PCR). Se cortó la banda y se purificó el ADN del gel usando el kit de extracción en gel MinElute de Qiagen (n.° de cat. 28604) según las instrucciones del fabricante.

2.3. PCR anidada

El producto de PCR ligado purificado obtenido en el ejemplo 2.2 se usó como molde para una reacción de PCR usando un segundo conjunto de cebadores específicos de VH y VL de anticuerpo. La mezcla de reacción de PCR contenía los siguientes componentes en un volumen de reacción de 25 pl: 2 pl de ADN molde, dNTP 0,2 mM, tampón A 1x, 0,2 pM de cada cebador de JH (JH1, JH2, JH3, JH4), Ck20,4 pM, BSA al 0,25% p/v, tampón A 1x y 1 U de polimerasa de arranque en caliente KAPA Robust (Kapa Biosystems, n.° de cat. KK5515). Se llevó a cabo la reacción con el programa de ciclación tal como se describe en el ejemplo 2. Los fragmentos de PCR obtenidos se analizaron mediante gel de agarosa al 1,2% y sólo se observó una única banda en el tamaño esperado de 1070 pb (véase la figura 6, 2a PCR). Este fragmento de PCR representa los fragmentos de anticuerpo IgH+IgL ligados listos para la clonación.

Cebadores para oePCR según Meijer et al. (2006)

VH4 tattcccatggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAG

CH GACSGATGGGCCCTTGGTGG VK2 ggcgcgccatgggaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT

CK1 atatatatgcggccgcTT AACACT CT CCCCT GTT GAA

JH1 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCC

JH2 ggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCC

JH3 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCC

JH4 ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC

CK2 accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT 3. Ligamiento y amplificación de IgVH+IgVL de células B individuales encapsuladas en NLR

En esta etapa, se usaron Dynabeads de oligo-dT individuales que habían capturado cada una el ARNm de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de una única célula B para sintetizar el ADNc como molde para una reacción de PCR posterior. Este ADNc permanece unido covalentemente a las perlas, por tanto, el apareamiento correcto de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, tal como sucedió en la célula individual, se mantiene en la perla Dynabead de oligo-dT. En etapas posteriores, se emulsionaron las perlas Dynabeads de oligo-dT y se usaron en PCR de extensión solapada de inmunoglobulina (H+L) (Ig-oePCR) para ligar físicamente las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina en una cadena de polinucleótido consecutiva.

3.1 PCR en emulsión de perlas de matriz individuales en combinación con cebadores de PCR y polimerasa Se llevó a cabo PCR en emulsión usando Dynabeads conjugadas con ADNc según los procedimientos expuestos mediante el sistema de PCR Droplet Digital™. Brevemente, se mezclaron Dynabeads conjugadas con ADNc y mezclas de cebadores con dNTP, tampón y enzima de PCR proporcionados por el kit y se prepararon para la generación de gotas en el sistema de PCR QX200™/QX100™ Droplet Digital™ según la descripción del fabricante. Se usaron muestras para generar gotas de emulsión y posteriormente se realizó la PCR en emulsión. Se recuperaron los productos amplificados después de retirar el aceite y disolver las gotas en tris-EDTA y cloroformo tal como se describe en el protocolo (sistema de PCR Droplet Digital™).

3.2 Protocolo A de PCR

Se realizó la amplificación de regiones pesadas y ligeras variables de inmunoglobulina ligadas a partir de ADNc unido a Dynabeads de oligo-dT mediante PCR en emulsión usando un sistema de cebadores de PCR establecido (Meijer et a/.2006) en un protocolo de PCR de dos etapas que dio como resultado un ensamblaje de cabeza con cabeza de las dos cadenas de inmunoglobulinas conectadas mediante una secuencia de ligador. Esta secuencia de ligador contenía sitios de restricción para la posterior inserción de un promotor bidireccional.

3.3 Protocolo B de PCR

Como alternativa, para el ligamiento de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina se usó un sistema de cebadores de PCR que da como resultado una orientación de “cola con cabeza” de las regiones V-pesada y V-ligera (para más detalles, véase la figura 2). Los cebadores específicos de inmunoglobulina se derivaron de Wardemann et a/. (2003), cuyo contenido se adjunta expresamente en el presente documento. En la figura 2 se muestra un esquema de visión general de este enfoque. La figura 3 muestra un ejemplo de tal PCR variable de Ig.

4. Generación de biblioteca de expresión de anticuerpos

Se clonan el grueso de fragmentos de PCR de casetes de IgH e IgL ligados en un vector plasmídico aceptor usando los sitios de restricción apropiados (NotI/XhoI para el protocolo A de PCR y BSSHII y BsiWI para el protocolo B de PCR). La conversión de este aceptor en un vector que proporciona todos los elementos necesarios para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina de longitud completa se describe en la figura 4.

A partir de este vector plasmídico aceptor, se eleva el casete de expresión de inmunoglobulina a través de los sitios de restricción PmeI y PacI en un vector de transferencia de lentivector. Este vector proporciona un promotor de mamífero (CMV) y un sitio interno de entrada al ribosoma seguido por el gen marcador EGFP. El plásmido de expresión de anticuerpos tricistrónico resultante se usa como vector de transferencia de lentivector (Dull et a/., 1998) para la generación de partículas de lentivector infecciosas que se usan para transfectar células de mamífero convirtiéndolas en células que expresan anticuerpos.

También pueden usarse técnicas de clonación sin restricciones y sin ligamiento para la clonación de bibliotecas. Estas impiden el peligro observado con la restricción de que los constructos génicos se corten en lugares no deseados dando como resultado la expresión de proteínas truncadas (por ejemplo, véase Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3rd, Smith HO. (2009). “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases”. Nature Methods 6(5): 343-345.doi:10.1038/nmeth.1318. PMID19363495.

5. Expresión

5.1 Generación de partículas de lentivector para la transducción de células expresoras

Se generaron partículas de lentivector usando el denominado sistema de empaquetamiento de lentivector de tercera generación según los procedimientos descritos en Dull et al. (1998)

5.2 Transducción de células expresoras

Se transdujeron células CHO K1 convencionales con lentivectores tal como se describe en Dull et al. (1998). Para garantizar que sólo se transdujera una partícula de lentivector por célula CHO, se ajustó la multiplicidad de infección a 0,5 partículas de lentivector por célula. Esto dio como resultado que >10% de las células se transfectaran según se monitorizaba usando el gen marcador GFP.

5.3 Encapsulación de células expresoras individuales en NLR/expansión clonal altamente paralelizada

Se encapsularon células CHO transfectadas con el plásmido de expresión de anticuerpos tricistrónico, usando la expresión del gen marcador (GFP) para la selección positiva con un separador de citómetro, en NLR con un grado de ocupación (GDO) de 0,5. Se cultivaron los NLR en medios de cultivo convencionales dando como resultado la proliferación celular en el interior del NLR.

5.4 Control de ocupación y armonización del crecimiento

12 h después de la encapsulación, se somete el cultivo de NLR a separación de partículas grandes en Biosorter para seleccionar positivamente todos los NLR que contienen una única célula viva que también es positiva para la fluorescencia de GFP. De este modo, se retiran los NLR vacíos y no ocupados y los NLR que contienen un número de células que pueden estar provocadas por una tasa de crecimiento aberrante (por ejemplo, el número de células supera el promedio de otros NLR en un factor de 1,5).

5.5 Cultivo clonal paralelizado de células productoras de anticuerpos recombinantes y selección para la identificación de anticuerpos monoclonales

Se cultivan NLR que contienen células productoras de anticuerpos individuales en medio de cultivo convencional, y la inmunoglobulina producida por los clones de células en crecimiento es detectable (i) en el interior del NLR, por ejemplo usando antígeno de sonda marcada con fluorescencia y (ii) en el fluido sobrenadante del cultivo que rodea al NLR, por ejemplo, usando métodos convencionales tales como inmunotransferencia de tipo Western, ELISA, inmunohistoquímica o ensayos funcionales.

La concentración de inmunoglobulinas en el interior de los NLR alcanza sus niveles máximos más rápidamente que en el fluido sobrenadante. Esta retención temporal de inmunoglobulina se aprovecha para la selección usando una etapa de lavado para diluir la concentración de inmunoglobulina en el fluido sobrenadante que rodea al NLR antes de la detección intra-NLR de la especificidad de anticuerpo. Luego se separan los NLR que se tiñen positivamente para un antígeno marcado con fluorescencia y o bien se dejan intactos, por ejemplo, para una selección confirmatoria adicional, o se perturban para permitir el crecimiento adicional del clon celular específico de/reactivo con el antígeno y la producción de anticuerpo monoclonal.

Como alternativa a la detección intra-NLR de la especificidad de anticuerpo, se somete a ensayo el fluido sobrenadante de las células expresoras para detectar la presencia de anticuerpos de interés. Este método permite someter a ensayo propiedades más complejas de los anticuerpos de interés, tales como actividad biológica, tinción de secciones de tejido, etc.

Para ello, el fluido sobrenadante que rodea al NLR obtenido después de la sedimentación o centrifugación del cultivo NLR se somete a prueba directamente para detectar la presencia de anticuerpos con la función u otra propiedad deseada.

Tras el fraccionamiento en serie y las nuevas pruebas de las fracciones, se identifican NLR individuales que contienen la célula que produjo un clon de anticuerpo de interés. Para este fraccionamiento, se usan recipientes de cultivo celular convencionales hasta el formato de microtitulación. Se recogen los sobrenadantes después de un periodo de cultivo de hasta 24 h. Se obtienen NLR que contienen células productoras de anticuerpos monoclonales en una etapa final mediante deposición de NLR individuales en moldes de microtitulación (formato de 96 pocillos y 384 pocillos) y la recogida del sobrenadante y las pruebas se realizan después de un periodo de cultivo prolongado de 72 h.

6. Expresión y selección de bibliotecas para la recuperación de una línea celular clonal que exprese un anticuerpo de interés.

Se encapsularon células expresoras AB2 que representan el anticuerpo de interés se como células individuales en NLR y se añadieron (cantidades conocidas de) 30 NLR a un cultivo de 210.000 NLR que contenían células expresoras que expresaban un anticuerpo irrelevante. Este cultivo masivo de NLR, que representa la biblioteca de células expresoras, se cultivó en medio de cultivo completo (véase la figura 6).

Posteriormente, se fraccionaron los 210.030 NLR pipeteando el cultivo en 96 pocillos de una placa de microtitulación (1er fraccionamiento del cultivo). Este cultivo se mantuvo durante 3 días para permitir el crecimiento celular, la expresión de anticuerpos y la secreción de anticuerpos en el fluido sobrenadante fuera del NLR.

El día cuatro, se seleccionaron 50 |il del sobrenadante de cultivo de cada uno de los 96 pocillos para detectar la presencia de anticuerpos específicos de antígeno AB2 mediante ELISA. Se identificaron los cultivos positivos tal como se muestra en la figura E2. Se seleccionó un cultivo de NLR positivo a modo de ejemplo (Bh5) para la identificación de clones mediante la colocación de NLR individuales del cultivo Bh5 en placas de microtitulación seguido de una segunda selección ELISA otros 3 días más tarde.

Esto condujo a la identificación de un NLR individual en el pocillo E4, que representa una línea celular clonal que expresa el Acm H5/E4 específico para el antígeno AB2 (véase la figura 7B).

7. Lista de equipos y materiales usados

• Citómetro de flujo de partículas grandes Biosorter, Union Biometrica, Geel, Bélgica

• Encapsulador de ruptura de chorro laminar Nisco, Nisco Engineering AG, Zúrich, Suiza

• Generador de gotas QX100/200, Bio-Rad, Cressier, Suiza

• Alginato, Pronova, Noruega

• Microkit Dynabeads mRNA DIRECT; Life Technologies, Basilea, Suiza

• Tampón de encapsulación: NaCl al 0,9% (p/v); HEPES 2,2 mM pH 7.4

• Tampón de encapsulación: (NaCl al 0,9% (p/v); HEPES 2,2 mM pH 7,4)

• Disolución de endurecimiento: CaCl2100 mM, HEPES 13 mM pH 7.4

• Reactivo de disolución de NLR: EDTA 100 mM

• Tampón de lisis celular/NLR (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5; LiCl 500 mM; ditiotreitol 5 mM; Lauroilsarcosina al 0,1%; Tween20 al 0,1%; desoxicolato al 0,1%)

• Sondas de detección de ARN SmartFlare específicas de inmunoglobulina, Millipore, Zug, Suiza

• Maxima RT, Thermo Scientific, Reinach, Suiza

• Cebadores para oePCR: según Meijers et al. (2006) o Wardemann, et al. (2003), Microsynth, Balgach, Suiza.

• 5-Propargilamino-dCTP-Cy5, Jena Bioscience GmbH Jena, Alemania

• dNTP, Thermo Scientific, Reinach, Suiza.

• ddPCR supermix, Bio Rad, Cressier Suiza

• Aceite generador de gotas, Bio Rad, Cressier Suiza

• Clonación molecular en vectores plasmídicos según métodos convencionales

• Tampón de lisis celular de gota de emulsión: Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KCl 50 mM, LiCl 50 mM, EDTA 5 mM, DTT 10 mM, proteinasa K 0,2 mg/ml

• Inhibidor de ARNasa RiboLock n.° EO0381, Thermo Scientific, Fischer, Reinach, Suiza

• ADN polimerasa de arranque en caliente KAPA Robust, KAPA Biosystems, KE5506, Axon lab, Baden, Suiza.

• dNTP, NEB, Bioconcept, Allschwil, Suiza

• Pluronic F68 al 10% p/v n.° A1288,0100 en agua, Applichem, Axon lab Baden, Suiza.

• Pico-Surf 1, al 2% en Novec 7500 (n.° 3200211, lote 211014, Dolomite, Valve Technology AG, Guettingen, Suiza

• Pico-Surf 2, al 2% en Novec 7500 (n.° 3100281, lote 091014, Dolomite)

• Termociclador peqSTAR 2x, Peqlab, n.° 95-07002

• Agarosa, ultrapura, Invitrogen n.° 15510-027

• Colorante peqGREEN, Peqlab n.° 37-5010, usar a 1:20.000

• Marcador de peso molecular de ADN de 1 kb, NEB, Bioconcept, Allschwil, Suiza n.° N3232S

• Medio de cultivo CHO-K1: F12 de Ham incl. glutamina 2 mM, FBS al 10%, Invitrogen, Zug, Suiza.

• Antígenos peptídicos usados para ELISA (secuencia de proteína del antígeno AB2: stgdadgpggpgipdgpggn;

secuencia de proteína del péptido de control irrelevante: lpttmnyplwsqsyedssnq) escala de 1 mg no purificada, Peptides & Elephants GmbH, Potsdam, Alemania

• Placas para ELISA: placa para EIA/RIA, placa de media área de 96 pocilios, de fondo plano (Costar, Corning)

• Tampón de recubrimiento: Na2CÜ315 mM, NaHCÜ330 mM, pH 9,6

• Tampón de lavado: PBS con Tween al 0,05%

• Disolución de bloqueo: BSA al 2% en PBS

• 2° anticuerpo: específico de Fc de IgG a-humana de cabra (Jackson Immuno, n.° 109-035-098), diluido 1:4000 en BSA al 0,5%/PBS

• Disolución de detección: TMB (Sigma, n.° T2285) diluido 1:20 en ácido cítrico 30 mM, pH 4,1 (Sigma, n.° C2402)

• H2SO41 M (AppliChem, n.° A2699)

Descripción de las figuras:

Figura 1: Microfotografía de coencapsulación en microrreactores

Microrreactores (también denominados “reactores de nanolitros” o “NLR” en el presente documento, aunque estos reactores también pueden tener volúmenes de picolitros) de una única célula (C, célula B sustituta que expresa anticuerpo y el gen marcador GFP para una mejor visibilidad se muestran en este caso) con perlas Dynabeads de matriz de captura de ARNm (DB). Se generaron células B sustitutas mediante transducción estable de células CHO-K1 con lentivectores que portan un casete de expresión de IgG humana bicistrónico atenuado que conduce a bajos niveles de expresión de IgG para coincidir con la expresión de Ig en células B de memoria humanas originales. La atenuación se logró colocando el casete de expresión de anticuerpos bicistrónico detrás del codón de terminación del casete de CMV-promotor-EGFP. Las células B sustitutas, tal como se usan en el presente documento, reflejan fielmente el comportamiento de las células B o células T.

Figura 2: Visión general esquemática de la estrategia de PCR de la región v de inmunoglobulina

1a PCR: PCR de extensión solapada (oePCR) para la amplificación y el ligamiento de cadenas ligeras y pesadas variables de inmunoglobulina en una orientación de “cola con cabeza” de las regiones V-pesada y V-ligera. Los cebadores ligadores para OE-PCR tenían la siguiente configuración.

Cadena pesada variable de Ig: cebador ligador 3' SalI JH: tattcgcactgcgcggcGTCGACgc-(secuencias específicas de la familia JH)

Cadena ligera kappa variable de Ig: cebador ligador 5' XbaI Vk: gccgcgcagtgcgaataTCTAGAtgt-(secuencias específicas de la familia FW1-V-kappa), cebador ligador 5' XbaI Vl: gccgcgcagtgcgaataTCTAGAtgt-(secuencias específicas de la familia FW1-V-lambda).

Los cebadores adicionales usados fueron cebadores 5'L(SP)-VH(1-6) y 3'C^k 543 y 3’CX. Las letras mayúsculas indican los sitios de restricción usados para la inserción del casete de polinucleótido que proporciona la parte constante de IgH, un sitio de escisión para la escisión proteolítica posterior y un péptido señal para la secreción de IgKappa/lambda en una etapa de clonación posterior (ver a continuación). Las letras minúsculas indican las secuencias de ligador usadas en la PCR de extensión solapada para ligar constructos de cadena pesada y ligera. 2a PCR: Se llevó a cabo una PCR anidada (nPCR) para una mayor amplificación e inserción de sitios de restricción en el producto de PCR mediante los cebadores para facilitar la clonación en vectores de expresión.

Se usaron cebadores 5' que contenían el sitio de restricción BSSHII (letras mayúsculas) según esta configuración: 5' cebador BSSHII VH-FW1: attttttttGCGCGCtgt-( secuencias específicas de la familia pesada FW1-V-); se usaron los cebadores 3' : los cebadores BsiWI J^k de 3' publicados en Wardemann et al. (2003).

Figura 3: Amplificación de cadenas ligeras y pesadas variables de inmunoglobulina ligadas a partir de células que expresan anticuerpos encapsuladas (individuales).

Se usó un protocolo de PCR de dos etapas para amplificar las cadenas ligeras y pesadas variables derivadas de una única célula mediante ADNc unido a matriz sólida (perlas Dynabeads de oligo-dT).

(A) 1a amplificación por PCR de la región variable de cadenas ligeras y pesadas seguida de extensión solapada en un único tubo/reacción de una etapa en ADNc unido por perlas Dynabeads de oligo-dT (carril 2). Como control, se llevó a cabo el mismo procedimiento usando células que no expresan un anticuerpo (carril 1).

(B) 2a PCR (anidada) en productos de PCR de primera tanda que muestran la presencia de una cadena pesada y ligera de inmunoglobulina ligada derivada de células que expresan anticuerpos (carril 2) pero no de células de control (carril 1).

Figura 4: Descripción esquemática de las etapas de clonación para generar el plásmido de expresión de anticuerpos tricistrónicos.

I. El producto de PCR de IgVH+IgVL ligado se inserta en un vector lanzadera que proporciona el péptido señal de inmunoglobulina y la región constante de Ig kappa/lambda.

II. Mediante clonación molecular, se inserta un casete de polinucleótido que proporciona la parte constante de IgH, un sitio de escisión para la escisión proteolítica posterior y un péptido señal para la secreción de Ig kappa/lambda.

III. El casete de expresión bicistrónico resultante se transporta a un vector de transferencia de lentivector mediante clonación molecular para producir el vector de expresión tricistrónico final usado para generar partículas de lentivector.

Figura 5: Propagación clonal de células expresoras en reactores de nanolitros y detección de producción de anticuerpos.

A) Agrupación de células clonales (CCC) que surge de una única célula expresora CHO ocho días después de la encapsulación en un reactor de nanolitros (NLR). Se transformó la célula mediante una partícula de lentivector que codifica para el casete de expresión de anticuerpo tricistrónico-EGFP antes de la encapsulación.

B) Producción de anticuerpo (IgG completa) por agrupación de células clonales (clon AB2). Inmunotransferencia de tipo Western de anticuerpo purificado con proteína G recuperado del fluido en el interior del NLR. Se ejecutó PAGE en condiciones reductoras que mostraba la expresión de cadenas pesadas y ligeras de Ig.

Figura 6: RT-PCR de una única célula de alto rendimiento de ARNm de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina.

A) Gotas que contienen células que expresan anticuerpos y perlas de captura de ARNm antes de la lisis celular (etapa 1: encapsulación celular). Se encapsularon células y perlas Dynabeads de oligo-dT en tampón de lisis, en aceite de emulsión Pico-Surf 2, el volumen por gota es de aproximadamente 1 nl, la fotografía se tomó directamente después de la encapsulación y antes de la lisis celular.

B) Separación activada por fluorescencia de perlas de captura cargadas con ADNc singlete en el sentido de 5' de la PCR de gotas digitales. La puerta cuadrada define la población de perlas singlete.

C) La PCR de gotas digitales de una única perla revela la presencia de una población importante de perlas de captura que contienen secuencias amplificadas tanto de IgH como de IgL (círculo de línea discontinua). La presencia de ADNc de IgH e IgL se monitoriza mediante la liberación de un fluoróforo extinguido específico para cualquier cadena de Ig mediante la reacción de PCR (IgH = eje Y, IgL = eje X). La PCR de gotas se analizó usando el analizador de gotas QX100.

D) PCR de extensión solapada que demuestra la generación de IgH e IgL ligadas derivadas de perlas de captura de ARNm individuales. La 1a PCR realizada en gotas de emulsión y la segunda PCR (anidada) realizada de manera masiva.

Figura 7: Propagación de un cultivo NLR que representa la biblioteca de células expresoras de anticuerpos A) Foto de cultivo de NLR compuesto por células expresoras encapsuladas individuales.

B) Fotomicrografía de una sección del cultivo de NLR masivo en el día 1.

C) Fotomicrografía fluorescente de NLR tomada el día 4 de cultivo que muestra agrupaciones de células clonales positivas para GFP (flechas) que crecen en el interior de los NLR que fueron el resultado de la expansión clonal de una única célula expresora encapsulada.

Figura 8: Identificación y aislamiento de una línea celular clonal que expresa un Acm de interés.

A) Se mezclaron 30 NLR que portaban células expresoras AB2 con un exceso de más de 300 veces de NLR que portaban células expresoras irrelevantes y se cultivaron en placa en 80 pocillos de una placa de 96 pocillos. 4 días después de la encapsulación y la siembra en placa, se sometió a ensayo el fluido sobrenadante de los cultivos NLR mediante ELISA específico de antígeno AB2 y se detectaron pocillos de cultivo positivos para AB2. Se seleccionó el cultivo H5 para la clonación (flecha).

B) Singularización e identificación de NLR de la línea celular clonal E4. Se colocaron NLR individuales del cultivo masivo H5 en pocillos de cultivo individuales. Después de 3 días, se sometió a ensayo el fluido sobrenadante mediante AB2-ELISA y se identificó el pocillo E4 demostrando el aislamiento de una línea celular clonal que expresaba un anticuerpo monoclonal específico de AB2.

Se ejecutaron controles positivos (+) en los pocillos A1 y A2.

Bibliografía

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Wardemann et al., Science 301, 1374 (2003)

Boulianne et al., Nature 312, 643 - 646, (1984)

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Card et al., Cancer Immunol Immunother. Abr; 53(4): 345-57 (2004)

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Dull et a l, J. Virol 72(11) (1998)

Diehl et al. Nature Methods, 3, 551-559 (2006).)

Cebadores usados

Primera PCR:

Cadena pesada variable de Ig:

Cebadores directos:

1. 5' SP-VH1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG

2. 5' SP-VH3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG

3. 5' SP-VH4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG

4. 5' SP-VH5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG

Cebador inverso:

5. 3'CHg1 adaptador-GTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG

6. 3’Cp adaptador-CH1 -GGGAATTCTCAGAGGAGACGA

Cadena kappa variable de Ig:

Cebadores directos:

7. 5' SP Vk1/2 adaptador inverso-ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG

8. 5' SP Vk3 adaptador inverso-CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG

9. 5' SP V^k4 adaptador inverso-ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG

Cebador inverso:

10. 3' C^k 543 GTTT CTCGTAGTCTGCTTT GCTCA

Cadena lambda variable de Ig:

Cebadores directos:

11. 5' SP VX1 adaptador i nverso-GGTCCTGGGCCCAGTCT GTGCTG

12. 5' SP VX2 adaptador inverso-GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG

13. 5' SP VX3 adaptador i nverso-GCTCTGTGACCTCCTAT GAGCTG

14. 5' SP VX4/5 adaptador inverso-GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG

15. 5' SP VX6 adaptador i nverso-GTT CTTGGGCCAATTTT ATGCTG

16. 5' SP VX7 adaptador inverso -GGTCCAATTCYCAGGCT GTGGTG

17. 5' SP VX8 adaptador i nverso-GAGTGGATT CTCAGACT GTGGTG

Cebador inverso:

18. 3' CX CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG

PCR de extensión solapada:

Cebadores directos:

19. 5' BSSH2 VH1/5 CTGCAGCGCGCGTACAT TCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG

20. 5' BSSH2 VH3 CTGCAGCGCGCGTACATTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAG

21. 5' BSSH2 VH4 CTGCAGCGCGCGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG

22. 5' BSSH2 VH3-23 CTGCAGCGCGCGTACATTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAG

23. 5' BSSH2 VH4-34 CTGCAGCGCGCGTACATTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTG Cebadores inversos:

24. 3'BsiWI Jk 1/2/4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC

25. 3'BsiWI Jk3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTC

26. 3'XhoICX CTCCTCACTCGAGGGY GGGAACAGAGT G

Cebadores ligadores oePCR

Cadena pesada variable de Ig:

28. 3' SalI JH tattcgcactgcgcggcGTCGACgc-(secuencias específicas de la familia JH) Cadena ligera variable de Ig:

29. 5' Xbal Vk gccgcgcagtgcgaataTCTAGAtgt-(secuencias específicas de la familia FW1-V-kappa) 30. 5' Xbal Vl gccgcgcagtgcgaataTCTAGAtgt-(secuencias específicas de la familia FWI-V-lambda) nPCR

Cebadores 5':

BSSHII VH-FW1 attttttttGCGCGCtgt-(secuencias específicas de la familia pesada FW1-V) Cebadores 3'

3' cebadores BsiWI Jk (véase la tabla a continuación)

Los sitios de restricción se muestran en negrita.

<110> Memo Therapeutics

<120> Método para recuperar dos o más genes, o productos génicos, que codifican para un inmunorreceptor <130> MD 41125

<160> 68

<170> Macro de excel

<210> 1

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-VH3 en sentido 5' de primera PCR de IgH

<211> 27

<400> 1

cccagatggg tcctgtccca ggtgcag

<210>2

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-VH1 en sentido 5' de primera PCR de IgH

<211> 24

<400> 2

acaggtgccc actcccaggt gcag

<210>3

<212>ADN

<213> artificial

<220> Cebadores directos SPVH1 en 5' de cadena pesada variable de Ig

<211> 25

<400> 3

acaggtgccc actcccaggt gcag

<210>4

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebadores de oePCR CK2

<211> 52

<400> 4

accgcctcca ccggcggccg cttattaaca ctctcccctg ttgaagctct t

<210>5

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebadores de oePCR CK1

<211> 37

<400> 5

atatatatgc ggccgcttaa cactctcccc tgttgaa

<210>6

<212>ADN

<213> artificial

<220> Pan Vk en sentido 5' de segunda PCR de Igk

<211> 28

<400> 6

atgacccagw ctccabycwc cctg

<210>7

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-Vk1/2 en sentido 5' de primera PCR de Igk

<211> 26

<400> 7

atgaggstcc cygctcagct gctgg

<210>8

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-Vk4 en sentido 5' de primera PCR de Igk

<211> 25

<400> 8

atttctctgt tgctctggat ctctg

<210>9

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebador de nPCR 5'

<211> 18

<400>9

attttttttg cgcgctgt

<210> 10

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-Vk5 en sentido 5' de primera PCR de IgH <211> 24

<400> 10

caaggagtct gttccgaggt gcag

<210> 11

<212>ADN

<213> artificial

<220> Cl en antisentido 3' de primera PCR de IgI

<211> 24

<400> 11

caccagtgtg gccttgttgg cttg

<210> 12

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-VH4/6 en sentido 5' de primera PCR de IgH <211> 27

<400> 12

cccagatggg tcctgtccca ggtgcag

<210> 13

<212>ADN

<213> artificial

<220> XhoI-Cl en antisentido 3' de segunda PCR de IgI <211> 28

<400> 13

ctcctcactc gagggyggga acagagtg

<210> 14

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-Vk3 en sentido 5' de primera PCR de Igk <211> 28

<400> 14

ctcttcctcc tgctactctg gctcccag

<210> 15

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-VH1/5 en sentido 5' de segunda PCR de IgH <211> 40

<400> 15

ctgcaaccgg tgtacat tc cgaggtgcag ctggtgcag

<210> 16

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-Vk 2-24 en sentido 5' de PCR específica de Igk <211> 40

<400> 16

ctgcaaccgg tgtacatggg gatattgtga tgacccagac

<210> 17

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-Vk 2-28 en sentido 5' de PCR específica de Igk <211> 40

<400> 17

ctgcaaccgg tgtacatggg gatattgtga tgactcagtc

<210> 18

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-Vk 3-15 en sentido 5' de PCR específica de Igk <211> 40

<400> 18

ctgcaaccgg tgtacattca gaaatagtga tgacgcagtc

<210> 19

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-VH4-34 en sentido 5' de segunda PCR de IgH

<211> 40

<400> 19

ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tacagcagtg

<210> 20

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-VH4 en sentido 5' de segunda PCR de IgH

<211> 39

<400> 20

ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tgcaggag

<210> 21

<212>ADN

<213> artificial

<220> Agel-Vk 4-1 en sentido 5' de PCR específica de Igk

<211> 40

<400> 21

ctgcaaccgg tgtacattcg gacatcgtga tgacccagtc

<210> 22

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-Vk 1-5 en sentido 5' de PCR específica de Igk

<211> 41

<400> 22

ctgcaaccgg tgtacattct gacatccaga tgacccagtc

<210> 23

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-VH3 en sentido 5' de segunda PCR de IgH

<211> 39

<400> 23

ctgcaaccgg tgtacattct gaggtgcagc tggtggag

<210> 24

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-VH3-23 en sentido 5' de segunda PCR de IgH

<211> 38

<400> 24

ctgcaaccgg tgtacattct gaggtgcagc tgttggag

<210> 25

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-Vk 1D-43 en sentido 5' de PCR específica de Igk

<211> 41

<400> 25

ctgcaaccgg tgtacattgt gccatccgga tgacccagtc

<210> 26

<212>ADN

<213> artificial

<220> Cebadores directos de PCR de extensión solapada de VH434 de BSSH2 en 5' <211> 40

<400> 26

ctgcagcgcg cgtacattcc caggtgcagc tacagcagtg

<210> 27

<212>ADN

<213> artificial

<220> Cebadores directos de PCR de extensión solapada de VH4 de BSSH2 en 5' <211> 39

<400> 27

ctgcagcgcg cgtacattcc caggtgcagc tgcaggag

<210> 28

<212>ADN

<213> artificial

<220> Cebadores directos de PCR de extensión solapada de VH1/5 de BSSH2 en 5' <211> 39

<400> 28

ctgcagcgcg cgtacattcc gaggtgcagc tggtgcag

<210> 29

<212>ADN

<213> artificial

<220> Cebadores directos de PCR de extensión solapada de VH3 de BSSH2 en 5' <211> 39

<400> 29

ctgcagcgcg cgtacattct gaggtgcagc tggtggag

<210> 30

<212>ADN

<213> artificial

<220> Cebadores directos de PCR de extensión solapada de VH323 de BSSH2 en 5' <211> 39

<400> 30

ctgcagcgcg cgtacattct gaggtgcagc tgttggag

<210> 31

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-Vl7/8 en sentido 5' de segunda PCR de Ig I

<211> 38

<400> 31

ctgctaccgg ttccaattcy cagrctgtgg tgacycag

<210> 32

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-VI2 en sentido 5' de segunda PCR de IgI

<211> 38

<400> 32

ctgctaccgg ttcctgggcc cagtctgccc tgactcag

<210> 33

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-Vl1 en sentido 5' de segunda PCR de IgI

<211> 39

<400> 33

ctgctaccgg ttcctgggcc cagtctgtgc tgackcag

<210> 34

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-V14/5 en sentido 5' de segunda PCR de IgI

<211> 37

<400> 34

ctgctaccgg ttctctctcs cagcytgtgc tgactca

<210> 35

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-V13 en sentido 5' de segunda PCR de IgI

<211> 38

<400> 35

ctgctaccgg ttctgtgacc tcctatgagc tgacwcag

<210> 36

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-V16 en sentido 5' de segunda PCR de IgI

<211> 38

<400> 36

ctgctaccgg ttcttgggcc aattttatgc tgactcag

<210> 37

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebadores de oePCR CH

<211> 20

<400> 37

gacsgatggg cccttggtgg

<210> 38

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-V18 en sentido 5' de primera PCR de Igl

<211> 23

<400> 38

gagtggattc tcagactgtg gtg

<210> 39

<212>ADN

<213> artificial

<220> BsiWI-Jk5 en antisentido 3' de PCR específica de Igk

<211> 30

<400> 39

gccaccgtac gtttaatctc cagtcgtgtc

<210> 40

<212>ADN

<213> artificial

<220> BsiWI-Jk 3 en antisentido 3' de segunda PCR de Igk

<211> 30

<400> 40

gccaccgtac gtttgatatc cactttggtc

<210> 41

<212>ADN

<213> artificial

<220> BsiWI Jkl1/2/4 en antisentido 3' de PCR específica de Igk

<211> 30

<400> 41

gccaccgtac gtttgatytc caccttggtc

<210> 42

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebador ligador de cadena ligera kappa variable de Ig 5\222 XbaI Vl <211> 26

<400> 42

gccgcgcagt gcgaatatct agatgt

<210> 43

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-V13 en sentido 5' de primera PCR de IgI

<211> 23

<400> 43

gctctgtgac ctcctatgag ctg

<210> 44

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebadores de oePCR JH1

<211> 30

<400> 44

ggaggcgctc gagacggtga ccagggtgcc

<210> 45

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebadores de oePCR JH3

<211> 30

<400> 45

ggaggcgctc gagacggtga ccagggttcc

<210> 46

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebadores de oePCR JH2

<211> 30

<400> 46

ggaggcgctc gagacggtga ccattgtccc

<210> 47

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebadores de oePCR JH4

<211> 30

<400> 47

ggaggcgctc gagacggtga ccgtggtccc

<210> 48

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebadores de oePCR VK2

<211> 45

<400> 48

ggcgcgccat gggaatagct agccgatgtt gtgatgactc agtct

<210> 49

<212>ADN

<213> artificial

<220> C|i-CH1 en antisentido 3' de primera PCR de IgH

<211> 21

<400> 49

gggaattctc agaggagacg a

<210> 50

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-V17 en sentido 5' de primera PCR de IgI

<211> 23

<400> 50

ggtccaattc ycaggctgtg gtg

<210> 51

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-V12 en sentido 5' de primera PCR de IgI

<211> 23

<400> 51

ggtcctgggc ccagtctgcc ctg

<210> 52

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-Vl 1 en sentido 5' de primera PCR de IgI

<211> 24

<400> 52

ggtcctgggc ccagtctgtg ctg

<210> 53

<212>ADN

<213> artificial

<220> L V14/5 en sentido 5' de primera PCR de IgI

<211> 23

<400> 53

ggtctctctc scagcytgtg ctg

<210> 54

<212>ADN

<213> artificial

<220> Ck 494 en antisentido de segunda PCR de Igk

<211> 23

<400> 54

gtgctgtcct tgctgtcctg ctc

<210> 55

<212>ADN

<213> artificial

<220> L-V16 en sentido 5' de primera PCR de IgI

<211> 23

<400> 55

gttcttgggc caattttatg ctg

<210> 56

<212>ADN

<213> artificial

<220> Cebador inverso adaptador 3'CHg1 de cadena pesada variable de Ig <211> 23

<400> 56

gttgtccacc ttggtgttgc tgg

<210> 57

<212>ADN

<213> artificial

<220> Ck 543 en antisentido 3' de primera PCR de Igk

<211> 24

<400> 57

gtttctcgta gtctgctttg ctca

<210> 58

<212> PRT

<213> artificial

<220> Antígenos peptídicos usados para ELISA (secuencia de proteína de antígeno AB2) <211> 20

<400> 58

Ser Thr Gly Asp Ala Asp Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly

Pro Gly Gly Asn

<210> 59

<212> PRT

<213> artificial

<220> secuencia de péptido de control

<211>4

<400> 59

Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln <210> 60

<212>ADN

<213> artificial

<220> cebadores de oePCR VH4

<211> 35

<400> 60

tattcccatg gcgcgccsag gtgcagctgg tggag

<210> 61

<212>ADN

<213> artificial

<220> Cebador ligador de cadena pesada variable de Ig 3\222 SalI JH:

<211> 25

<400> 61

tattcgcact gcgcggcgtc gacgc

<210> 62

<212>ADN

<213> artificial

<220> SalI JH1/2 en antisentido 3' de segunda PCR de IgH

<211> 33

<400> 62

tgcgaagtcg acgcctgagg agacggtgac cag

<210> 63

<212>ADN

<213> artificial

<220> SalI JH3 en antisentido 3' de segunda PCR de IgH

<211> 34

<400> 63

tgcgaagtcg acgctgaaga gacggtgacc attg

<210> 64

<212>ADN

<213> artificial

<220> SalI JH6 en antisentido 3' de segunda PCR de IgH

<211> 33

<400> 64

tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc gtg

<210> 65

<212>ADN

<213> artificial

<220> JH4/5 en antisentido 3' de segunda PCR de IgH

<211> 31

<400> 65

tgcgaagtcg acgctgagga gacgtgacca g

<210> 66

<212>ADN

<213> artificial

<220> Agel-Vk 3-11 en sentido 5' de PCR específica de Igk <211> 32

<400> 66

ttgtgctgca accggtgtac attcagaaat tc

<210> 67

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-Vk 3-20 en sentido 5' de PCR específica de Igk <211> 46

<400> 67

ttgtgctgca accggtgtac attcagaaat tgtgttgacg cagtct <210> 68

<212>ADN

<213> artificial

<220> AgeI-Vk 1-9 en sentido 5' de PCR específica de Igk <211> 47

<400> 68

ttgtgctgca accggtgtac attcagacat ccagttgacc cagtct

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Método que comprende las siguientes subetapas:

recuperar dos o más genes, o productos génicos, o ADNc, que codifican para un inmunorreceptor que tiene dos o más subunidades, dos o más genes, o productos génicos, que están comprendidos en una célula fuente dada, método que comprende las siguientes etapas:

a) encapsular células fuente junto con un resto de captura de ARNm en microrreactores, de tal manera que cada microrreactor comprenda una célula fuente y en el que el resto de captura de ARNm es una perla o partícula

b) lisar las células en los microrreactores, liberar el ARNm celular en la luz de los microrreactores y posteriormente unir el mismo al resto de captura de ARNm

c) lisar o perturbar los microrreactores y someter a transcripción inversa el ARNm unido a los restos de captura de ARNm en disolución para obtener los productos génicos de ADNc correspondientes d) crear un constructo que abarque los dos o más productos génicos que codifican para las subunidades del inmunorreceptor, en el que crear un constructo que abarque los dos o más productos génicos que codifican para las subunidades del inmunorreceptor se logra amplificando el ADNc mediante PCR de extensión solapada en el interior de microrreactores, en el que cada microrreactor contiene un único resto de captura de ARNm resultante de la etapa c), y

e) clonar el producto de PCR en un vector plasmídico para obtener un constructo de expresión bi o multicistrónico;

f) crear así una biblioteca de plásmidos que contiene el ADNc que codifica para los inmunorreceptores de una población de células fuente dada, y

crear una biblioteca de células expresoras, biblioteca en la que cada célula puede expresar dos o más genes, o productos génicos, que codifican para las subunidades del inmunorreceptor recuperado, en el que crear la biblioteca comprende las siguientes etapas:

g) transfectar células expresoras con un constructo de expresión bi o multicistrónico, y

h) encapsular células expresoras en microrreactores con una célula expresora por microrreactor, y i) cultivar las células encapsuladas en condiciones que permitan la expresión de proteínas y/o la proliferación de las células.

2. Método según la reivindicación 1, en el que, antes de la encapsulación en la etapa h), las células transfectadas se incuban en condiciones que permitan la expresión de proteínas.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, método que comprende además la subetapa de seleccionar la biblioteca creada de células expresoras para una célula que expresa un inmunorreceptor que tiene especificidad por una molécula diana dada, selección de biblioteca que comprende al menos una de las siguientes etapas:

j) usar una diana marcada que pueda entrar en los microrreactores y unirse a un inmunorreceptor expresado por la célula expresora comprendida en los mismos, y/o

k) detectar el inmunorreceptor expresado por la célula expresora que se ha escapado de los microrreactores y ahora se encuentra en el sobrenadante en combinación con el fraccionamiento en serie del cultivo del microrreactor.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, método que comprende además, después de la etapa d), la etapa de amplificar el constructo que abarca los dos o más productos génicos que codifican para las subunidades del inmunorreceptor.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, método que comprende además, después de la etapa c), las etapas de

(i) monitorizar la síntesis de ADNc mediante transcripción inversa en los restos de captura de ARNm, y (ii) excluir restos de captura de ARNm agregados.

6. Método según la reivindicación 4, en el que la etapa de amplificar el constructo abarca el uso de una PCR anidada.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, método que comprende además la etapa de insertar elementos reguladores en el producto de PCR.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, método en el que

• el inmunorreceptor es un anticuerpo que tiene al menos dos subunidades, o un receptor de células T que tiene al menos dos subunidades, y/o

• el inmunorreceptor es una proteína terapéutica, una proteína con fines de diagnóstico o científicos, o una proteína con fines comerciales, y/o

• el vector de expresión bi o multicistrónico es un vector multicistrónico ligado a un péptido 2A con o sin combinación con una secuencia IRES (sitio interno de entrada del ribosoma).

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los microrreactores comprenden un material seleccionado del grupo que consiste en:

• polímeros formadores de hidrogel, preferiblemente poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(etilenimina), polilisina, poliacrilamidas y/o ácidos acrílicos

• derivados de celulosa, preferiblemente carboximetilcelulosa y ésteres de celulosa, y/o

• polisacáridos, preferiblemente agarosas, alginatos, carragenanos, pectinatos y/o quitosanos

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula fuente es una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en células B o células T inmaduras o maduras.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los dos o más genes, o productos génicos, que codifican para las subunidades del inmunorreceptor son

• el gen de cadena pesada de Ig (reordenado como VDJ) y el gen de cadena ligera de Ig (reordenado como VJ), o

• el gen de cadena alfa de TCR (reordenado) y el gen de cadena beta de TCR (reordenado).

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, método que comprende además la etapa de insertar ADNc que codifica para

• subdominios H constante de Ig y/o L constante de Ig, o

• cadena alfa de TCR y cadena beta de TCR

en el producto de PCR.