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ES2928681T3 - Conjugados de afinidad-oligonucleótido y usos de los mismos - Google Patents

Conjugados de afinidad-oligonucleótido y usos de los mismos Download PDF

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ES2928681T3
ES2928681T3 ES16778964T ES16778964T ES2928681T3 ES 2928681 T3 ES2928681 T3 ES 2928681T3 ES 16778964 T ES16778964 T ES 16778964T ES 16778964 T ES16778964 T ES 16778964T ES 2928681 T3 ES2928681 T3 ES 2928681T3
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Francois Vigneault
Adrian Wrangham Briggs
Stephen Jacob Goldfless
Brian J Belmont
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Abvitro LLC
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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos y composiciones para la caracterización de células individuales usando conjugados de oligonucleótidos de afinidad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de afinidad-oligonudeótido y usos de los mismos
Antecedentes
Muchos tipos de células pueden identificarse y categorizarse por la abundancia de conjuntos específicos de proteínas expresadas endógenamente y ubicadas en sus membranas plasmáticas. Este fenómeno permite el estudio de las células mediante el uso de un proceso conocido como inmunofenotipado, en el que las células se incuban y se unen a anticuerpos marcados con fluorescencia que son específicos de las proteínas superficiales conocidas de las células. La citometría de flujo se usa habitualmente para medir los niveles de anticuerpos unidos a la superficie para cada célula. Sin embargo, los enfoques basados en citometría de flujo están limitados por la cantidad de fluoróforos que se pueden utilizar simultáneamente en el mismo experimento. Además, la cantidad de fluoróforos que se pueden usar simultáneamente en el mismo experimento utilizando enfoques basados en citometría de flujo está limitada por la superposición espectral. Además, la citometría de flujo no es apta para muchos ensayos biológicamente relevantes y la posterior secuenciación del ADN.
El documento WO2014/144495 A1 del solicitante divulga un método en el que las células se mezclan con antígenos conectados a un polinucleótido y se aíslan en una primera pluralidad de recipientes. Luego, un primer polinucleótido celular y el polinucleótido conectado al antígeno se copian en un soporte sólido que luego se aísla en una segunda pluralidad de recipientes, en donde, mediante pasos de amplificación (que utilizan un polinucleótido con código de barras), se produce un polinucleótido celular con código de barras y un polinucleótido con código de barras que codifica un antígeno.
Sumario
Por lo tanto, se necesitan métodos para caracterizar, por ejemplo, el inmunofenotipado, células individuales sin estas limitaciones. A diferencia de los enfoques basados en citometría de flujo, los métodos descritos en la presente usan una lectura de secuencia para analizar proteínas de células individuales y no están limitados por la cantidad de fluoróforos que se pueden utilizar simultáneamente en el mismo experimento o su superposición espectral. Además, los métodos descritos en la presente son aptos para muchos ensayos biológicamente relevantes y la posterior secuenciación del ADN. Los métodos descritos en la presente utilizan conjugados de afinidad-oligonucleótido (por ejemplo, conjugados de anticuerpo-oligonucleótido). El oligonucleótido del conjugado comprende una secuencia de ID de antígeno (AID) que tiene un código de barras para un antígeno de superficie que la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido une específicamente. Por lo tanto, mediante el uso de los métodos descritos en la presente, se puede analizar un antígeno (por ejemplo, una proteína de superficie) de una única célula sin necesidad de fluoróforos. Por ejemplo, una proteína de superficie de una única célula que se muestra puede identificarse a partir de la secuencia de ID de antígeno. Una o más de las proteínas de superficie de una única célula se pueden utilizar para definir la identidad, las características o la relevancia de la única célula.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para la caracterización de células, como se define en la reivindicación 1 adjunta.
Las realizaciones preferidas de la invención se proporcionan en las reivindicaciones dependientes adjuntas a la misma.
El conjugado de afinidad-oligonucleótido de los métodos descritos en la presente que se puede utilizar para superar los problemas de clasificación celular lenta, el rendimiento objetivo reducido asociado con la clasificación celular, el número limitado de flujos de salida y los contenedores seleccionados que no corresponden a una propiedad cuantificada del conjugado de afinidad-oligonucleótido, tal como la afinidad. El conjugado de afinidad-oligonucleótido ejemplar representado puede reemplazar o mejorar la clasificación con mediciones de una única célula de la unión de tetrámeros en los recipientes. El conjugado de afinidad-oligonucleótido ejemplar representado se puede utilizar en los métodos descritos en la presente para adquirir simultáneamente secuencias de pares de TCR, abundancia de clones y afinidades relativas de tetrámeros.
En la presente se describe un método de caracterización, por ejemplo, inmunofenotipado, células en recipientes (por ejemplo, emulsión) con conjugados de afinidad-oligonucleótido. En algunas realizaciones, el método se utiliza para identificar subconjuntos de células de una manera compatible con el análisis de células individuales basado en emulsión. En algunas realizaciones, el método se utiliza para identificar células inmunitarias específicas para un antígeno de una manera compatible con el análisis de células individuales basado en emulsión. En algunas realizaciones, antes del análisis celular, los anticuerpos específicos de proteínas de superficie se conjugan con oligonucleótidos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos están diseñados para contener un motivo de secuencia que es único para la especificidad diana del anticuerpo conjugado. El oligonucleótido se puede conjugar con la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido (por ejemplo, un anticuerpo) de forma covalente o no covalente (por ejemplo, oligonucleótido de biotina a estreptavidina-anticuerpo).
Un método puede comprender la incubación de células en una mezcla o una solución con uno o más conjugados de afinidad-oligonudeótido. Las células se pueden lavar para eliminar los conjugados de afinidad-oligonucleótido. Luego, las células se encapsulan en recipientes, por ejemplo, una emulsión. Las células pueden estar presentes en los recipientes con una densidad de una única célula por recipientes. Por lo tanto, los conjugados de afinidadoligonucleótido dentro de un recipiente, por ejemplo, una gota, se unen a la superficie celular, por ejemplo, a través de una interacción de proteína de superficie de anticuerpo específico. El método puede comprender la unión de una secuencia de ADN específica del recipiente (por ejemplo, un código de barras único del recipiente) a los oligonucleótidos conjugados por afinidad. Pueden llevarse a cabo análisis adicionales de ADN o ARNm celular, mediciones fenotípicas, pruebas funcionales, clasificación de células u otras reacciones antes, simultáneamente o después de la codificación de barras del oligonucleótido conjugado por afinidad (por ejemplo, con un código de barras de ADN).
Un método puede comprender la extracción de ácidos nucleicos de la emulsión, por ejemplo, después de la experimentación con la emulsión. Los ácidos nucleicos extraídos se pueden preparar para la secuenciación y ser secuenciados (por ejemplo, usando tecnología de secuenciación de próxima generación). Un método puede comprender la secuenciación de moléculas polinucleotídicas de los recipientes que contienen tanto una secuencia de ID de antígeno como una secuencia de código de barras específica de gotitas. La secuencia de ID de antígeno puede definir la proteína de superficie celular específica unida por el anticuerpo conjugado con oligonucleótido. La secuencia de ID de antígeno puede definir el anticuerpo específico del anticuerpo conjugado con oligonucleótido que se une a una proteína de superficie celular particular. Por lo tanto, la secuencia de ID de antígeno puede indicar qué proteína de superficie expresó la célula analizada. En un recipiente que alberga una única célula, todas las secuencias que contienen una secuencia de código de barras específica de gotita compartida se asocian con una única célula. Por lo tanto, se puede analizar que una única célula presenta un conjunto de proteínas de superficie que pueden utilizarse para definir su identidad, características o relevancia.
En un aspecto, se proporciona un método que comprende llevar a cabo una reacción en al menos un único recipiente de una pluralidad de recipientes, comprendiendo la reacción unir un primer polinucleótido con código de barras del recipiente que comprende una secuencia de código de barras del recipiente a un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido en donde el conjugado se une a un antígeno diana de una única célula aislada en al menos un único recipiente de una pluralidad de recipientes, en donde la parte de oligonucleótido comprende una secuencia de identificación de antígeno (AID) y, opcionalmente, en donde el antígeno diana es un antígeno extracelular.
En un aspecto, en la presente se proporciona un método que comprende llevar a cabo una reacción en un recipiente de una pluralidad de recipientes, comprendiendo la reacción unir un polinucleótido con código de barras del recipiente, que comprende una secuencia de código de barras del recipiente, a una parte de oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido, en donde el conjugado de afinidad-oligonucleótido se une a un antígeno diana expresado por una célula en el recipiente de la pluralidad de recipientes.
En algunas realizaciones, el recipiente comprende dos o más recipientes de la pluralidad de recipientes. En algunas realizaciones, el recipiente comprende cada recipiente de la pluralidad de recipientes. En algunas realizaciones, la reacción ocurre en dos o más recipientes de la pluralidad de recipientes. En algunas realizaciones, la célula de cada recipiente procede de una misma muestra. En algunas realizaciones, la célula en un recipiente de una primera pluralidad de recipientes de las dos o más pluralidades de recipientes es de una misma muestra que la célula en un recipiente en una segunda pluralidad de recipientes de las dos o más pluralidades de recipientes. En algunas realizaciones, la parte de oligonucleótido comprende una secuencia de identificación de antígeno (AID).
En algunas realizaciones, la secuencia de identificación de antígeno (AID) es una secuencia conocida.
En algunas realizaciones, el polinucleótido con código de barras del recipiente es de un polinucleótido con código de barras del recipiente molde en el recipiente.
En algunas realizaciones, el método comprende además la secuenciación del oligonucleótido o un amplicón del mismo para obtener información de la secuencia.
En algunas realizaciones, el método comprende además la determinación de una característica de la célula única en base a la información de la secuencia. En algunas realizaciones, la información de secuencia comprende la secuencia de identificación de antígeno (AID). En algunas realizaciones, el método comprende además la determinación de una característica de la célula única en base a la información de la secuencia. En algunas realizaciones, la característica es un fenotipo. En algunas realizaciones, el fenotipo es un inmunofenotipo.
En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto el conjugado de afinidad oligonucleótido con una pluralidad de células que comprenden la célula única. En algunas realizaciones, el contacto es antes de que la célula única se aísle en el recipiente. En algunas realizaciones, el método comprende además el lavado de la pluralidad de células después del contacto.
En algunas realizaciones, el recipiente no comprende un conjugado de afinidad-oligonudeótido que no está unido a un antígeno diana.
En algunas realizaciones, el método comprende además aislar la célula única en el recipiente. En algunas realizaciones, la célula única se une al conjugado de afinidad-oligonucleótido antes del aislamiento.
En algunas realizaciones, el método comprende además la lisis la célula única. En algunas realizaciones, la lisis se realiza después de aislar la célula única en el recipiente.
En algunas realizaciones, la pluralidad de células es una pluralidad de células sin clasificar.
En algunas realizaciones, la secuencia de código de barras del recipiente de un polinucleótido con código de barras del recipiente o amplicón del mismo en un primer recipiente de la pluralidad de recipientes es diferente de la secuencia de código de barras del recipiente de un polinucleótido con código de barras del recipiente o amplicón del mismo en un segundo recipiente de la pluralidad de recipientes. En algunas realizaciones, la secuencia de código de barras del recipiente de cada polinucleótido con código de barras del recipiente o amplicón del mismo en un solo recipiente de la pluralidad de recipientes comprende una misma secuencia de código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, la secuencia de código de barras del recipiente de cada polinucleótido con código de barras del recipiente y amplicón del mismo en cualquier recipiente único de la pluralidad de recipientes es única para la secuencia de código de barras del recipiente de cada polinucleótido con código de barras del recipiente y amplicón del mismo en cualquier otro recipiente único de la pluralidad de recipientes.
En algunas realizaciones, el método comprende además unir un polinucleótido con código de barras del recipiente a un polinucleótido celular de la célula única. En algunas realizaciones, la unión de un polinucleótido con código de barras del recipiente a un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido y la unión de un polinucleótido con código de barras del recipiente a un polinucleótido celular de la célula única se realizan simultáneamente.
En algunas realizaciones, el método comprende además amplificar el oligonucleótido o un complemento del mismo. En algunas realizaciones, el método comprende además amplificar el polinucleótido celular o un complemento del mismo. En algunas realizaciones, la amplificación del oligonucleótido o un complemento del mismo y la amplificación del polinucleótido celular o un complemento del mismo se realizan simultáneamente.
En algunas realizaciones, la secuencia de código de barras del recipiente del polinucleótido celular y la secuencia de código de barras del recipiente del oligonucleótido son las mismas.
En algunas realizaciones, el método comprende además agrupar oligonucleótidos o amplicones de los mismos de dos o más recipientes de la pluralidad de recipientes. En algunas realizaciones, el método comprende además agrupar oligonucleótidos o amplicones de los mismos y polinucleótidos celulares o amplicones de los mismos de dos o más recipientes de la pluralidad de recipientes. En algunas realizaciones, la agrupación es antes de la secuenciación.
En algunas realizaciones, el conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende una pluralidad de conjugados diferentes de afinidad-oligonucleótido. En algunas realizaciones, cada conjugado de afinidad-oligonucleótido de la pluralidad de conjugados de afinidad-oligonucleótido comprende una secuencia única de identificación de antígeno (AID). En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende una secuencia de código de barras molecular de afinidad (AMB) que tiene un código de barras para una única molécula de conjugado de afinidad-oligonucleótido de una pluralidad de moléculas de conjugado de afinidad-oligonucleótido. En algunas realizaciones, cada molécula de conjugado de afinidad-oligonucleótido de la pluralidad de moléculas de conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende una secuencia de código de barras molecular de afinidad (AMB) única.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende una secuencia de fusión y la unión comprende unir el polinucleótido con código de barras del recipiente a la secuencia de fusión. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende una secuencia de unión al cebador. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende una secuencia constante.
En algunas realizaciones, el método comprende además la secuenciación del oligonucleótido, complementos del mismo, productos amplificados del mismo o una combinación de los mismos, produciendo así lecturas de la secuencia del oligonucleótido. En algunas realizaciones, el método comprende además la comparación de una o más lecturas de la primera secuencia de oligonucleótidos con una o más lecturas de la segunda secuencia de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el método comprende además el análisis de las lecturas de la secuencia de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el método comprende además el análisis de secuencias del código de barras del recipiente de las lecturas de secuencias de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el método comprende además el análisis de secuencias de identificación de antígenos (AID) de las lecturas de secuencias de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el método comprende además el análisis de secuencias de códigos de barras moleculares de afinidad (AMB) de las lecturas de secuencias de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el análisis comprende determinar una frecuencia de una o más secuencias de códigos de barras de recipientes, una o más secuencias de AID, una o más secuencias de códigos de barras moleculares de afinidad (AMB), o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el análisis comprende la comparación. En algunas realizaciones, el método comprende además la comparación de secuencias de identificación de antígenos (AID) de lecturas de secuencias de oligonucleótidos con secuencias de códigos de barras moleculares de afinidad (AMB) de lecturas de secuencias de oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, el método comprende además la secuenciación del polinucleótido celular, complementos del mismo, productos amplificados del mismo o una combinación de los mismos, produciendo así lecturas de la secuencia del polinucleótido celular. En algunas realizaciones, en donde el método comprende además la comparación de las lecturas de secuencias de oligonucleótidos con las lecturas de secuencias de polinucleótidos celulares. En algunas realizaciones, el método comprende además la comparación de secuencias de códigos de barras de recipientes de lecturas de secuencias de oligonucleótidos con secuencias de códigos de barras de recipientes de lecturas de secuencias de polinucleótidos celulares. En algunas realizaciones, el método comprende además la comparación de las lecturas de secuencias de polinucleótidos celulares. En algunas realizaciones, el método comprende además el análisis de secuencias del código de barras del recipiente de las lecturas de secuencias de polinucleótidos celulares. En algunas realizaciones, el método comprende además el análisis de secuencias de códigos de barras moleculares de las lecturas de secuencias de polinucleótidos celulares.
En algunas realizaciones, el método comprende además determinar una característica de una célula basándose en el análisis o la comparación. En algunas realizaciones, el método comprende además seleccionar un anticuerpo o TCR en base a las lecturas de la secuencia de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el método comprende seleccionar un anticuerpo o TCR en base a las lecturas de la secuencia de polinucleótidos celulares.
En algunas realizaciones, el polinucleótido con código de barras del recipiente unido al oligonucleótido y el polinucleótido con código de barras del recipiente unido al polinucleótido celular proceden de un mismo polinucleótido con código de barras del recipiente molde en el recipiente. En algunas realizaciones, el polinucleótido con código de barras del recipiente unido al oligonucleótido es un producto de amplificación de un polinucleótido con código de barras del recipiente molde.
En algunas realizaciones, el polinucleótido con código de barras del recipiente unido al polinucleótido celular es un producto de amplificación del polinucleótido con código de barras del recipiente molde.
En algunas realizaciones, cada recipiente de la pluralidad de recipientes comprende una única célula. En algunas realizaciones, el recipiente es un pocillo, una emulsión o una gotita. En algunas realizaciones, el polinucleótido con código de barras del recipiente molde no está unido a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el polinucleótido con código de barras del recipiente molde está unido a un soporte sólido.
En algunas realizaciones, el método comprende además la unión de una secuencia de código de barras molecular de un polinucleótido con código de barras molecular de una pluralidad de polinucleótidos con código de barras molecular al polinucleótido celular, en donde la secuencia de código de barras molecular tiene un código de barras para una molécula de polinucleótido celular individual y sus amplicones.
En algunas realizaciones, la unión comprende ligar el polinucleótido del recipiente al oligonucleótido. En algunas realizaciones, la unión comprende unir el polinucleótido del recipiente al oligonucleótido con una enzima. En algunas realizaciones, la unión comprende hibridar el polinucleótido del recipiente con el oligonucleótido. En algunas realizaciones, la unión comprende además extender el oligonucleótido. En algunas realizaciones, la unión comprende la amplificación de un polinucleótido con código de barras de recipiente molde.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido es de bicatenario. En algunas realizaciones, el oligonucleótido es de monocatenario. En algunas realizaciones, el oligonucleótido es ADN. En algunas realizaciones, el oligonucleótido es ARN.
En algunas realizaciones, el polinucleótido celular comprende una secuencia de región variable. En algunas realizaciones, el método comprende además emparejar secuencias de cadenas naturales que contienen una secuencia de región variable. En algunas realizaciones, el polinucleótido celular es ADN. En algunas realizaciones, el polinucleótido celular es ARN. En algunas realizaciones, el ARN es ARNm.
En algunas realizaciones, la célula única es una célula B. En algunas realizaciones, la célula única es una célula T. En algunas realizaciones, la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido se une a un antígeno extracelular de la célula única. En algunas realizaciones, el antígeno extracelular de la célula única es un antígeno específico de una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, el antígeno extracelular de la célula única es un antígeno específico de una célula T. En algunas realizaciones, el antígeno extracelular es CD4. En algunas realizaciones, el antígeno extracelular es CD8. En algunas realizaciones, el antígeno extracelular de la célula única es un antígeno específico de una célula B. En algunas realizaciones, el antígeno extracelular es una inmunoglobulina.
En algunas realizaciones, la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonudeótido es un anticuerpo o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonudeótido es un péptido. En algunas realizaciones, la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido es una proteína. En algunas realizaciones, la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido es un aptámero. En algunas realizaciones, la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido es una molécula pequeña. En algunas realizaciones, la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido es un fármaco. En algunas realizaciones, la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido es una célula. En algunas realizaciones, la célula es una célula presentadora de antígeno (APC). En algunas realizaciones, la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende un complejo principal de histocompatibilidad (MHC). En algunas realizaciones, el MHC está en forma soluble y/o multimérica (por ejemplo, tetramérica). En algunas realizaciones, el MHC se une a un péptido. En algunas realizaciones, el péptido es un péptido sintético. En algunas realizaciones, el MHC se une a un receptor de células T (TCR) y/o una molécula de unión similar a TCR, como un anticuerpo similar a TCR o inmunoglobulina o receptor de antígeno quimérico, por ejemplo, de la célula única.
En algunas realizaciones, la parte de afinidad se une específicamente a una molécula y/o inmunorreceptor que reconoce antígeno, tal como un anticuerpo o inmunoglobulina o una parte o fusión de los mismos, un inmunorreceptor genomanipulado, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un TCR. En algunas de tales realizaciones, la parte de afinidad comprende un antígeno o epítopo o parte del mismo reconocido por el anticuerpo o receptor tal como el CAR. En algunas realizaciones, la parte de afinidad comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al inmunorreceptor. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a una parte variable y/o de unión a antígeno del receptor, tal como un idiotopo. En algunos aspectos, la molécula de afinidad es un anticuerpo anti-idiotípico o un fragmento del mismo.
En algunas realizaciones, la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende un complejo principal de histocompatibilidad (MHC) o una parte funcional o de unión del mismo. En algunas realizaciones, la parte de afinidad comprende un multímero del MHC, opcionalmente un tetrámero del MHC. En algunas realizaciones, el MHC está en forma soluble. En algunas realizaciones, el MHC se une a un péptido y/o contiene un péptido dentro de un surco del MHC. En algunas realizaciones, el péptido es un péptido sintético. En algunas realizaciones, el MHC se une a un receptor de células T (TCR) de la célula única. En algunas realizaciones, la parte de afinidad comprende un péptido que se une a un anticuerpo o un receptor de antígeno quimérico (CAR) y/o en donde el objetivo es un anticuerpo o un CAR. En algunas realizaciones, la parte de afinidad es o comprende un antígeno o un epítopo reconocido específicamente por el anticuerpo o el receptor de antígeno quimérico y/o comprende un anticuerpo que se une específicamente al mismo, opcionalmente un anticuerpo anti-idiotípico que se une específicamente a una parte de unión al antígeno del mismo.
En un aspecto, se proporciona una composición para la caracterización de células que comprende una pluralidad de recipientes en donde al menos un único recipiente de la pluralidad de recipientes comprende (a) una única célula de una muestra que comprende una pluralidad de células, (b) un polinucleótido con código de barras del recipiente o complemento del mismo que comprende una secuencia de código de barras de un recipiente; (c) un conjugado de afinidad-oligonucleótido en donde una parte de afinidad del oligonucleótido de afinidad se une a un antígeno diana de la célula única, en donde el polinucleótido con código de barras del recipiente o un complemento del mismo se une a una parte del oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido, en donde la parte del oligonucleótido comprende una secuencia de identificación de antígeno (AID), y opcionalmente en donde se realiza la lisis de la célula única.
En un aspecto, se proporciona una composición que comprende una pluralidad de recipientes, cada uno de los cuales comprende una única célula lisada de una muestra que comprende una pluralidad de células, y un conjugado de afinidad-oligonucleótido unido a un antígeno diana de la única célula lisada; en donde el oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende una secuencia de código de barras del recipiente, y en donde un polinucleótido celular de la célula lisada única comprende la misma secuencia de código de barras del recipiente.
En un aspecto, en la presente se proporciona una composición que comprende una pluralidad de recipientes, en donde un recipiente de la pluralidad de recipientes comprende una única célula de una muestra que comprende una pluralidad de células, y un polinucleótido con código de barras del recipiente que comprende una secuencia de código de barras del recipiente en donde el recipiente comprende además un conjugado de afinidad-oligonucleótido que se une a un antígeno diana de la célula única o a una parte de oligonucleótido de la misma.
En algunas realizaciones, una reacción ocurre en dos o más recipientes de la pluralidad de recipientes. En algunas realizaciones, el recipiente comprende cada recipiente de la pluralidad de recipientes. En algunas realizaciones, la pluralidad de recipientes comprende dos o más pluralidades de recipientes. En algunas realizaciones, la célula de cada recipiente procede de una misma muestra. En algunas realizaciones, la célula en un recipiente de una primera pluralidad de recipientes de las dos o más pluralidades de recipientes es de una misma muestra que la célula en un recipiente en una segunda pluralidad de recipientes de las dos o más pluralidades de recipientes. En algunas realizaciones, el polinucleótido con código de barras del recipiente o un complemento del mismo se une al oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonudeótido. En algunas realizaciones, la célula única está lisada.
En un aspecto, en la presente se proporciona una composición que comprende una pluralidad de recipientes, en donde un recipiente de la pluralidad de recipientes comprende una única célula lisada de una muestra que comprende una pluralidad de células, y un conjugado de afinidad-oligonucleótido que comprende una parte de afinidad que se une a un antígeno diana de la única célula lisada, o una parte de oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido; en donde la parte de oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende una secuencia de código de barras del recipiente, y en donde un polinucleótido celular de la única célula lisada comprende la misma secuencia de código de barras del recipiente.
En un aspecto, se proporciona un kit que comprende: un primer contenedor que comprende un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de identificación de antígeno (AID) y una primera secuencia de código de barras molecular de afinidad (AMB), en donde la primera secuencia de AID y la primera secuencia de AMB son secuencias conocidas; un segundo contenedor que comprende un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de identificación de antígeno (AID) y una segunda secuencia de código de barras molecular de afinidad (AMB), en donde la segunda secuencia de AID es una secuencia conocida y es diferente de la primera secuencia de AID y en donde la segunda secuencia de AMB es una secuencia conocida y es diferente de la primera secuencia de AMB; uno o más terceros contenedores que comprenden reactivos aptos para conjugar el primer oligonucleótido con una primera molécula de afinidad y reactivos aptos para conjugar el segundo oligonucleótido con una segunda molécula de afinidad, en donde la primera molécula de afinidad es una molécula configurada para unirse a una primera proteína extracelular de una célula, y la segunda molécula de afinidad es una molécula configurada para unirse a una segunda proteína extracelular de una célula, en donde la primera proteína extracelular es diferente de la segunda proteína extracelular; un conjunto de instrucciones que describen cómo conjugar el primer oligonucleótido con la primera molécula de afinidad y el segundo oligonucleótido con la segunda molécula de afinidad, comprendiendo además opcionalmente el kit un cuarto contenedor que comprende una pluralidad de polinucleótidos con código de barras del recipiente, en donde cada polinucleótido con código de barras del recipiente de la pluralidad de polinucleótidos con código de barras del recipiente comprende una secuencia de código de barras de recipiente única y distinta, y reactivos, y un conjunto de instrucciones que describen cómo unir un polinucleótido con código de barras del recipiente de la pluralidad de polinucleótidos con código de barras del recipiente al primer o al segundo oligonucleótido cuando se conjuga(n) con la primera o segunda molécula de afinidad.
Los métodos y las composiciones divulgados en la presente se pueden utilizar para la identificación de tumores. Por ejemplo, los métodos pueden comprender vincular fenotipos celulares con un repertorio inmunitario en muestras de pacientes para identificar TCR reactivos con tumores. Los métodos y las composiciones divulgados en la presente se pueden utilizar para la terapia celular adoptiva. Por ejemplo, los métodos pueden comprender el análisis genético de las células T sin clasificación. Por ejemplo, los métodos pueden comprender combinar información clonal de células T (usando TCR) con patrones de expresión génica durante la fabricación y el tratamiento del producto. En algunas realizaciones, los métodos divulgados en la presente pueden utilizarse para rastrear, caracterizar, monitorear y/o evaluar células transferidas adoptivamente obtenidas de un paciente antes, durante o después de la terapia celular adoptiva. Los métodos y las composiciones divulgados en la presente se pueden utilizar para identificar TCR frente a objetivos conocidos. Por ejemplo, los métodos pueden comprender la identificación de clones de alta afinidad que pueden responder mucho al antígeno, con una proliferación deficiente. Los métodos y las composiciones divulgados en la presente se pueden utilizar para la multiplexación de muestras de células. Por ejemplo, una emulsión que contiene muestras de células agrupadas en contacto con uno o más conjugados de afinidad-oligonucleótidos puede utilizarse para identificar muestras de células originales mientras se procesan múltiples muestras al mismo tiempo.
Breve descripción de los dibujos
Las características novedosas descritas en la presente exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de las características descritas en la presente mediante referencia a la siguiente descripción detallada que establece ejemplos ilustrativos, en los que se utilizan los principios de las características descritas en la presente y sus dibujos adjuntos, en donde:
La Figura 1 representa un esquema ejemplar de un recipiente de los métodos descritos en la presente.
La Figura 2 representa un diseño ejemplar de una etiqueta de oligonucleótido conjugada con un anticuerpo. Cada bloque coloreado representa una parte de la secuencia de oligonucleótidos completa. La secuencia de fusión se utiliza para la unión enzimática de un código de barras de ADN específico de gotita dentro de la reacción de emulsión. Solo se muestra una disposición posible de las secuencias, aunque otras disposiciones son compatibles con el método descrito.
La Figura 3A representa una cocaptura ejemplar de secuencias de receptores inmunitarios con ARNm y objetivos proteicos adicionales. Los objetivos proteicos de superficie se cuantifican preincubando las células con anticuerpos de tinción marcados con ADN antes de la secuenciación de la emulsión.
La Figura 3B representa un ARNm de CD4 y CD8 ejemplar y mediciones de proteínas en 3.682 pares VaVp de TCR de códigos de barras de gotitas generados a partir de células T humanas sanas.
La Figura 3C representa una concordancia ejemplar entre las mediciones de ARNm y proteínas (cada punto es un código de barras de gotitas vinculado a un par VaVp de TCR).
La Figura 3D representa una tabla ejemplar de detección simultánea de ARNm y proteínas de CD4 y CD8 a partir de células T no clasificadas en emulsión. A partir de 30.000 células T de entrada, se recuperaron 3.682 pares de TCR. Las frecuencias de los pares de TCR denominados CD4+ o CD8+ por el ARNm frente a la proteína (según el recuento molecular, regla de la mayoría) se muestran en una matriz.
La Figura 3E muestra resultados ejemplares de 45.870 pares de TCR de células únicas usando un conjugado de afinidad-oligonucleótido dirigido a CD4 y un conjugado de afinidad-oligonucleótido dirigido a CD8.
La Figura 4 representa un esquema de un método ejemplar que utiliza un conjugado de afinidad-oligonucleótido dirigido a CD4 y un conjugado de afinidad-oligonucleótido dirigido a CD8.
La Figura 5 ejemplifica los resultados de un método de codificación de barras de células inmunitarias únicas en una emulsión.
La Figura 5A es una representación ejemplar de dos corrientes acuosas que contienen células y una mezcla de lisis/reacción (LR) que se pasa al aceite que produce una emulsión monodispersa a más de 8 millones de gotitas por hora.
La Figura 5B es una representación ejemplar que muestra que las células dentro de los recipientes se lisan y se someten a códigos de barras específicos de moléculas y gotitas en una sola reacción.
La Figura 5C es una representación ejemplar que muestra que el ARNm diana se transcribe de forma inversa y se etiqueta con un interruptor de molde con una secuencia adaptadora universal. Posteriormente, se produce la amplificación por PCR de un molde de código de barras de gotitas inicialmente diluido hasta ~ 1 molécula por gotita. Los códigos de barras amplificados se agregan a los ADNc con cambio de molde mediante una extensión de superposición complementaria. Los productos se recuperan de la emulsión y se purifican utilizando una biotina en el cebador RT, antes de los pasos adicionales de procesamiento del banco y la secuenciación de alto rendimiento. La Figura 5D es una representación ejemplar que muestra que el código de barras dual permite agrupar las lecturas de secuenciación en sus moléculas y gotitas de origen, reconstruyendo los emparejamientos de la cadena del receptor natural y minimizando los errores de secuenciación y los sesgos de amplificación.
La Figura 6 ejemplifica los resultados de un método de recuperación de BCR a partir de linfocitos B sanos aislados. La Figura 6A es una representación ejemplar de gotitas en las que se pasaron 3 millones de linfocitos B a una emulsión a 0,2 células/gota, lo que resultó en ~90 % de células ocupadas que contenían células únicas.
La Figura 6B es una representación ejemplar de la precisión de emparejamiento de VhVl. Después de la secuenciación y el código de barras de la emulsión, los datos se enriquecieron con datos de gotas de una única célula y la precisión de emparejamiento de VhVl se calculó utilizando la uniformidad de pares entre clones expandidos.
La Figura 6C es un gráfico ejemplar del porcentaje de código de barras de gotitas frente al isotipo de Ig. Se muestra el isotipo de cadena pesada (isotipo más abundante dentro de cada gotita) y el uso de locus de cadena liviana para 259.368 pares de VhVl filtrados.
La Figura 6D es un gráfico ejemplar de abundancia de rango de los 100 clones de cadena pesada más frecuentes en cada una de las seis fracciones de emulsión independientes. Se marca una frecuencia general del 0,05 %.
La Figura 6E es un gráfico ejemplar de la expresión de Vh frente a Vl dentro de las células según lo calculado por el número de ARNm capturados dentro de cada código de barras de gotitas. Se muestran 5.000 puntos para cada isotipo.
La Figura 6F es un gráfico ejemplar de correlación de mutación de Vh frente a Vl para pares de BCR y distribuciones de densidad dentro de cada isotipo.
La Figura 7 ejemplifica los resultados de un método de descubrimiento de anticuerpos neutralizantes amplios (bNAb) del HIV.
La Figura 7A es un gráfico ejemplar de distribución de isotipos de cadena pesada de 38.620 pares de VhVl recuperados de linfocitos B de un controlador élite de HIV que se introdujeron en emulsión. Una inusual proporción de las cadenas de IgG se alinearon bien con los bNAb previamente conocidos ("similares a PGT").
La Figura 7B es una representación ejemplar de árboles filogenéticos de secuencias completas de aminoácidos VDJ de bNAb conocidos (negro) más los recuperados recientemente (rojo, etiquetados con código de barras de gotitas), con cadenas pesadas (izquierda) y livianas (derecha) representadas por separado. Los anticuerpos PGT122 y PGT123 posiblemente no coincidentes son azules.
La Figura 7C es una representación ejemplar de la actividad de neutralización (IC50, mg/ml) de 8 variantes similares a PGT recientemente descubiertas contra diez cepas de HIV, en comparación con un solución madre de control de PGT121.
La Figura 8 ejemplifica los resultados de un método de caracterización de TIL de un tumor de ovario.
La Figura 8A es una representación ejemplar de gotitas en las que 400.000 células disociadas sin clasificar de un tumor de ovario se introdujeron en la emulsión y los pares BCR y TCR se recuperaron simultáneamente mediante códigos de barras de la emulsión.
La Figura 8B es un gráfico ejemplar de códigos de barras de gotas frente a combinaciones de cadenas receptoras que muestra los números de todas las combinaciones de Vh/Vl y Va/Vp observadas dentro de los códigos de barras de gotitas después del filtrado.
La Figura 8C es un gráfico ejemplar del porcentaje de código de barras de gotitas frente a la distribución de isotipos de cadena pesada de pares de BCR recuperados.
La Figura 8D es un gráfico ejemplar de correlación de mutación de Vh frente a Vl para pares de BCR y distribuciones de densidad dentro de cada isotipo.
La Figura 8E representa gráficos ejemplares de los números de ARNm capturados para pares de TCR y pares de BCR en general (arriba) y para diferentes isotipos (abajo).
La Figura 8F muestra gráficos ejemplares de análisis clonal que muestran la abundancia de rango de los 30 clones de cadena pesada de BCR más frecuentes (arriba) y los 30 clones de cadena beta de TCR más frecuentes en cada una de las seis fracciones de emulsión independientes. Se muestran niveles de frecuencia general de 1 % y 10 %. La Figura 9 ejemplifica un método de inmunofenotipado mediante el uso conjugados de anticuerpo-oligonucleótido. La Figura 9A representa un esquema ejemplar que muestra 2 recipientes, cada uno de los cuales contiene una única célula unida a un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido. (DB1: código de barras de gotitas 1; DB2: código de barras de gotitas 2; MB 1: código de barras molecular 1; MB2: código de barras molecular 2; AID: código de barras de ID de antígeno; AMB1: código de barras molecular de anticuerpo 1; AMB2: código de barra molecular de anticuerpo 2).
La Figura 9B representa un esquema ejemplar que muestra 2 recipientes, cada uno de los cuales contiene moléculas de ARN de una célula lisada de un recipiente de la Figura 9A. Las moléculas de ARN se transcriben de forma inversa y se agregan nucleótidos que no son de molde al final de la molécula de ADNc creada por la transcripción inversa. Los códigos de barras moleculares se hibridan con los nucleótidos contemplados agregados al final de la molécula de ADNc creada por la transcripción inversa.
La Figura 9C representa un esquema ejemplar que muestra 2 recipientes, cada uno de los cuales contiene un polinucleótido con código de barras molde que se amplifica y se une al ADNc de un recipiente de la Figura 9B mediante hibridación y el ADNc se extiende (arriba). Luego se amplifica el ADNc extendido (abajo).
La Figura 9D representa un esquema ejemplar que muestra que las especies de ARN-MB-DB con el mismo código de barras molecular (MB) unido a las mismas secuencias de ARN idénticas probablemente sean el resultado de la duplicación por PCR. Las especies de ARN-MB-DB con dos MB diferentes que están unidos a las mismas secuencias de ARN idénticas (ARN1-MB1-DB y ARN1-MB2-DB) son dos moléculas de ARN independientes de origen y no de duplicación por PCR.
La Figura 9E representa un esquema ejemplar que muestra que la especie DB-AMB-AID con el mismo código de barras molecular de anticuerpo (AMB) unido a una secuencia con el mismo código de barras de gotitas (DB) y código de barras de ID de antígeno (AID) es probablemente el resultado de la duplicación por PCR. Las especies DB1-AMB1-AID1 y DB1-AMB2-AID 1 con dos AMB diferentes unidas a secuencias con el mismo código de barras de gotitas (DB) y código de barras de identificación de antígeno (AID) son dos moléculas de oligonucleótidos independientes de dos moléculas de conjugado de anticuerpo-oligonucleótido independientes, cada una con un anticuerpo que se une específicamente al mismo antígeno diana unido a la misma célula única en un recipiente, y no de la duplicación por PCR. Las especies DB 1- AMBn-AID1 y DB 1-AMBn-AID2 con dos AID diferentes unidos a secuencias con el mismo código de barras de gotitas (DB) y códigos de barras moleculares de anticuerpos (AMB) iguales o diferentes son dos moléculas de oligonucleótidos independientes de dos moléculas de conjugado de anticuerpo-oligonucleótido independientes unidas a la misma célula única en un recipiente, en donde una de las moléculas de conjugado de anticuerpo-oligonucleótido tiene un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno diana y la otra molécula de conjugado de anticuerpo-oligonucleótido tiene un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno diana.
La Figura 10A representa un esquema de un ejemplo de conjugado de afinidad-oligonucleótido de los métodos descritos en la presente.
La Figura 10B representa un esquema de un ejemplo de conjugado de afinidad-oligonucleótido de los métodos descritos en la presente.
La Figura 11A representa un gráfico ejemplar de la señal de unión para dos conjugados de afinidad-oligonucleótido ejemplares de los métodos descritos en la presente que contienen una parte de afinidad que se une a un TCR. La Figura 12A representa un esquema ejemplar de una célula T unida a un conjugado de afinidad-oligonucleótido ejemplar de los métodos descritos en la presente.
La Figura 12B representa un esquema ejemplar de una célula T en una gotita unida a un conjugado de afinidadoligonucleótido ejemplar de los métodos descritos en la presente. Los ácidos nucleicos en la gotita se marcan con una secuencia de identificación de gotita y se incorporan a un banco de secuenciación de próxima generación. La Figura 13 representa un esquema ejemplar de una etiqueta de oligonucleótido conjugada con un tetrámero de conjugado de afinidad-oligonucleótido ejemplar. El ID de tetrámero es una secuencia corta de ADN constante que corresponde a un lote de tetrámero y permite la multiplexación de diferentes objetivos, como objetivos de péptido-MHC, en un solo experimento. El código de barras molecular es una secuencia degenerada que permite el recuento molecular para la cuantificación de tetrámeros unidos.
La Figura 14 representa esquemas de un conjugado de afinidad-oligonucleótido ejemplar generado a partir de reactivos de tetrámeros de MHC marcados con ADN. En una realización, se sintetiza un oligonucleótido de ADN unido a Cy5 y se conjuga con estreptavidina o neutravidina. En una realización, un oligonucleótido de ADN no fluorescente se conjuga con una APC-estreptavidina. En una realización, una mezcla de oligonucleótido de ADN no fluorescente y estreptavidina o neutravidina se conjuga con una APC activada.
La Figura 15 representa un método ejemplar para conjugar un oligonucleótido con una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido utilizando química clic.
La Figura 16 representa un esquema de un flujo de trabajo ejemplar para la preparación y caracterización de oligonucleótidos de afinidad ejemplares.
La Figura 17 representa los resultados de un método ejemplar descrito en la presente utilizando 6 conjugados de afinidad-oligonucleótido diferentes dirigidos a CD3, CD19, CD4, CD8, HLA-DR y CTLA-4. Cada punto es un código de barras de gotita/célula única. La identidad celular se reveló por el tipo de par de receptores recuperados (TCR = célula T; Ig = célula B).
Descripción detallada
Esta descripción detallada se proporciona como información adicional para situar la invención real, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, en un contexto técnico más amplio y a fin de ilustrar posibles herramientas, materiales o desarrollos técnicos relacionados. La información técnica adicional que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención, incluso si se describe como "realización" o "aspecto" de la invención.
Varios aspectos se describen a continuación con referencia a aplicaciones de ejemplo para ilustración. Debe entenderse que se establecen numerosos detalles, relaciones y métodos específicos para proporcionar una comprensión completa de las características descritas en la presente. Sin embargo, un experto en la técnica relevante reconocerá con facilidad que las características descritas en la presente se pueden poner en práctica sin uno o más de los detalles específicos o con otros métodos. Las características descritas en la presente no están limitadas por el orden ilustrado de actos o eventos, ya que algunos actos pueden ocurrir en diferentes órdenes y/o al mismo tiempo que otros actos o eventos. Además, no todos los actos o eventos ilustrados deben implementar una metodología de acuerdo con las características descritas en la presente.
La terminología utilizada en la presente tiene el objetivo de describir casos particulares solamente y no pretende ser limitativa. Como se utiliza en la presente, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" pretenden incluir las formas plurales también, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que los términos "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con", o variantes de los mismos, se utilicen en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, dichos términos están destinados a ser inclusivo de una manera similar al término "que comprende".
Las expresiones "aproximadamente" o "alrededor de" pueden significar dentro de un rango de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la materia, que dependerá, en parte, de cómo se mida o determine el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, según la práctica de la técnica. Alternativamente, "aproximadamente" puede significar un rango de hasta el 20 %, hasta el 10 %, hasta el 5 % o hasta el 1 % de un valor determinado. Alternativamente, en particular con respecto a sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, dentro de 5 veces, y más preferiblemente dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describen valores particulares en la solicitud y en las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, debe suponerse que el término "aproximadamente" significa dentro de un rango de error aceptable para el valor particular. Un objetivo de la invención es proporcionar métodos y composiciones para el fenotipado de células únicas (por ejemplo, células inmunitarias que usan conjugados de afinidad-oligonucleótido (por ejemplo, conjugados de anticuerpo-oligonucleótido) (por ejemplo, en emulsiones).
Definiciones
Por lo tanto, el término "anticuerpo" en la presente se utiliza en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluidos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos funcionales (de unión a antígeno) de los mismos, incluidos fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, incluidos fragmentos variables monocatenarios (scFv) y fragmentos de anticuerpos de dominio único (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanoanticuerpo). El término abarca formas de inmunoglobulinas genomanipuladas y/o modificadas de otro modo, tales como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, anticuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, tándem di-scFv, tándem tri-scFv. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "anticuerpo" abarca fragmentos de anticuerpos funcionales del mismo. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluidos anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluidas IgG y subclases de las mismas, IgM, IgE, IgA e IgD.
Las expresiones "región determinante de la complementariedad" y "CDR", sinónimos de "región hipervariable" o "HVR", se conocen en la técnica para referirse a secuencias no contiguas de aminoácidos dentro de regiones variables de anticuerpos, que confieren especificidad de antígeno y/ o afinidad de unión. En general, existen tres CDR en cada región variable de cadena pesada (CDR- H1, CDR-H2, CDR-H3) y tres CDR en cada región variable de cadena liviana (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). En la técnica se sabe que "regiones marco" y "FR" se refieren a las partes no CDR de las regiones variables de las cadenas pesada y liviana. En general, existen cuatro FR en cada región variable de cadena pesada de longitud completa (FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR- H4) y cuatro FR en cada región variable de cadena liviana de longitud completa (FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4).
Los límites precisos de secuencias de aminoácidos de una CDR o FR dada puede determinarse fácilmente utilizando cualquier un número de esquemas muy conocidos, incluidos aquellos descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5.° Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745." ("Contact" numbering scheme), Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 ("IMGT" numbering scheme), and Honegger A and Plückthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, ("Aho" numbering scheme).
Los límites de una CDR o FR determinada pueden variar según el esquema utilizado para la identificación. Por ejemplo, el esquema de Kabat se basa en alineaciones estructurales, mientras que el esquema de Chothia se basa en información estructural. La numeración para los esquemas de Kabat y Chothia se basa en las longitudes de secuencia de la región del anticuerpo más frecuentes, con inserciones acomodadas por letras de inserción, por ejemplo, "30a", y deleciones que aparecen en algunos anticuerpos. Los dos esquemas colocan ciertas inserciones y deleciones ("indels") en diferentes posiciones, lo que resulta en una numeración diferencial. El esquema de Contact se basa en el análisis de estructuras cristalinas complejas y es similar, en muchos aspectos, al esquema de numeración de Chothia.
La Tabla A, a continuación, enumera los límites de posición ejemplares de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 identificados por los esquemas de Kabat, Chothia y Contact, respectivamente. Para CDR-H1, la numeración de residuos se enumera utilizando los esquemas de numeración de Kabat y Chothia. Las FR están ubicadas entre las CDR, por ejemplo, con FR-L1 ubicado entre CDR-L1 y CDR-L2, y así sucesivamente. Se observa que debido a que el esquema de numeración de Kabat mostrado coloca las inserciones en H35A y H35B, el final del circuito CDR-H1 de Chothia cuando se numera utilizando la convención de numeración de Kabat mostrada varía entre H32 y H34, dependiendo de la longitud del circuito.
Tabla A
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Por lo tanto, a menos que se especifique lo contrario, una "CDR" o "región determinante complementaria", o CDR individuales especificadas (por ejemplo, "CDR-H1, CDR-H2), de un anticuerpo dado o región del mismo, como una región variable del mismo, debe entenderse que abarca una región determinante complementaria (específica) tal como se define en cualquiera de los esquemas antes mencionados. Por ejemplo, cuando se establece que una CDR particular (por ejemplo, una CDR-H3) contiene la secuencia de aminoácidos de una CDR correspondiente en una secuencia de aminoácidos de VH o VL dada, se entiende que tal CDR tiene una secuencia de la CDR correspondiente (por ejemplo, CDR-H3) dentro de la región variable, como se define mediante cualquiera de los esquemas mencionados con anterioridad. En algunas realizaciones, se especifican secuencias de CDR especificadas.
Asimismo, a menos que se especifique lo contrario, debe entenderse que una FR o un FR(s) individual(es) especificada(s) (por ejemplo, FR-H1, FR-H2), de un anticuerpo dado o una región del mismo, como una región variable del mismo, abarca una región marco (o específica) como se define en cualquiera de los esquemas conocidos. En algunos casos, se especifica el esquema para la identificación de una CDR, FR o FR o CDR en particular, tal como la CDR definida por el método de Kabat, Chothia o Contact. En otros casos, se proporciona la secuencia particular de aminoácidos de una CDR o FR.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o liviana de anticuerpo que está involucrada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena liviana (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural generalmente tienen estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) conservadas y tres CDR. (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.° ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar un banco de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Entre los anticuerpos proporcionados se encuentran fragmentos de anticuerpos. Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En realizaciones particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos monocatenarios que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una región de cadena liviana variable, como scFv.
A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "TCR" abarca TCR completos así como partes de unión a antígeno o fragmentos de unión a antígeno (también denominados fragmentos de unión a MHC-péptido) de los mismos. En algunas realizaciones, el TCR es un TCR intacto o de longitud completa. En algunas realizaciones, el TCR es una parte de unión a antígeno que es menor que un TCR de longitud completa, pero que se une a un péptido antigénico específico unido a (es decir, en el contexto de) una molécula MHC, es decir, un complejo de MHC-péptido. En algunos casos, una parte de unión a antígeno o fragmento de un TCR puede contener solo una parte de los dominios estructurales de un TCR de longitud completa o intacto, pero aun así puede unirse al epítopo (por ejemplo, complejo MHC-péptido) al cual se une el TCR completo. En algunos casos, una parte de unión a antígeno o un fragmento de un TCR contiene los dominios variables de un TCR, como la cadena a variable y la cadena p variable de un TCR, suficientes para formar un sitio de unión para unirse a un complejo de MHC-péptido específico, donde cada cadena por lo general contiene tres regiones determinantes de la complementariedad. Se incluyen polipéptidos o proteínas que tienen un dominio de unión que es un dominio de unión a antígeno o es homólogo a un dominio de unión a antígeno. Los anticuerpos y TCR injertados en la región determinante de la complementariedad (CDR) y otros anticuerpos y TCR humanizados (incluidas las modificaciones de CDR y las modificaciones de la región marco) también se contemplan en esos términos. Cabe señalar que, si bien se puede hacer referencia solo a las cadenas de inmunoglobulina (por ejemplo, cadenas pesadas y cadenas livianas), la invención divulgada se puede aplicar a muchos otros tipos diferentes de secuencias emparejadas, por ejemplo, pares de cadenas receptoras de linfocitos T (cadenas TCRa y TCRp y cadenas TCRy y TCR8), y no se limita a las inmunoglobulinas.
La capacidad de las células T para reconocer antígenos asociados con varios cánceres u organismos infecciosos la confiere su TCR, que se compone de una cadena alfa (a) y una cadena beta (p) o una cadena gamma (y) y una cadena delta (8). Las proteínas que componen estas cadenas están codificadas por el ADN, que emplea un mecanismo único para generar la tremenda diversidad del TCR. Este receptor de reconocimiento inmunitario de múltiples subunidades se asocia con el complejo CD3 y se une a los péptidos presentados por las proteínas MHC de clase I y II en la superficie de las células presentadoras de antígenos (ApC). La unión de un TCR al péptido antigénico en la APC es un evento central en la activación de las células T, que aparece en una sinapsis inmunológica en el punto de contacto entre la célula T y la APC.
Cada TCR comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) variables, así como regiones marco (FR). La secuencia de aminoácidos de los circuitos de la tercera región determinante de la complementariedad (CDR3) de los dominios variables de la cadena a y p determina en gran medida la diversidad de secuencias de las células T ap que surgen de la recombinación entre los segmentos de genes variables (Vp), de diversidad (Dp) y de unión (Jp) en el locus de la cadena p, y entre segmentos de genes Va y Ja análogos en el locus de la cadena a, respectivamente. La existencia de múltiples segmentos de genes de este tipo en los locus de las cadenas a y p del TCR permite codificar un gran número de secuencias CDR3 distintas. La adición y deleción independiente de nucleótidos en las uniones Vp-Dp, Dp-Jp y Va-Ja durante el proceso de reordenamiento del gen de TCR aumenta aún más la diversidad de secuencias CDR3. En este sentido, la inmunocompetencia se refleja en la diversidad de TCR.
Las inmunoglobulinas (Igs) expresadas por los linfocitos B son, en algunos aspectos, proteínas que constan de cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (IgH) y dos cadenas livianas (IgL), que forman una estructura H2L2. Cada par de cadenas IgH e IgL contiene un dominio hipervariable, que consta de una región Vl y una región Vh, y un dominio constante. Las cadenas IgH de Igs son de varios tipos, m, 8, y, a, y p. La diversidad de Igs dentro de un individuo está determinada principalmente por el dominio hipervariable. Similar al TCR, el dominio V de las cadenas IgH se crea mediante la unión combinatoria de los segmentos de los genes Vh, Dh y Jh. La adición y deleción independiente de nucleótidos en las uniones Vh-Dh, Dh-Jh, y Vh-Jh durante el proceso de reordenamiento del gen Ig aumenta aún más la diversidad de secuencias de dominio hipervariable. Aquí, la inmunocompetencia se refleja en la diversidad de Ig.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o liviana de anticuerpo que está involucrada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena liviana (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural generalmente tienen estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) conservadas y tres CDR. (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.° ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar un banco de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Una "parte de afinidad" se refiere a una parte del conjugado de afinidad-oligonucleótido que interactúa con un antígeno diana. Las partes de afinidad ejemplares incluyen anticuerpos, péptidos, proteínas, aptámeros, moléculas pequeñas, fármacos, células, MHC y otros.
Una "región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo o TCR que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una región determinante de la complementariedad o CDR. Los residuos marco o FR son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable como se define en la presente.
Entre los anticuerpos proporcionados se encuentran fragmentos de anticuerpos. Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En realizaciones particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos monocatenarios que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una región de cadena liviana variable, como scFv.
Los anticuerpos de un dominio único son fragmentos de anticuerpos que comprenden la totalidad o una parte del dominio variable de la cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de la cadena liviana de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de un dominio único es un anticuerpo de dominio único humano. Los fragmentos de anticuerpos pueden fabricarse mediante diversas técnicas, incluidas, entre otras, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción mediante células huésped recombinantes. En algunas realizaciones, los anticuerpos son fragmentos producidos de forma recombinante, como fragmentos que comprenden organizaciones que no ocurren de forma natural, como aquellos con dos o más regiones o cadenas de anticuerpos unidas por enlazadores sintéticos, por ejemplo, enlazadores peptídicos, y/o que pueden no ser producidos por la digestión enzimática de un anticuerpo intacto natural. En algunos aspectos, los fragmentos de anticuerpos son scFv.
También se proporcionan fragmentos de TCR, incluidos fragmentos de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCR es una parte de unión a antígeno del mismo, tal como una variante de un TCR de longitud completa que no contiene la región o regiones transmembrana y/o citoplasmática del mismo, que puede denominarse TCR completamente soluble. En algunas realizaciones, el TCR es un TCR dimérico (dTCR). En algunas realizaciones, el TCR es un TCR monocatenario (scTCR), tal como un scTCR que tiene una estructura según se describe la patente PCT números de publicación WO 03/020763, WO 04/033685 o WO 2011/044186. En ciertas realizaciones, el TCR es un fragmento de TCR monocatenario que comprende una región variable de la cadena alfa unida a una región variable de la cadena beta, tal como un scTv. En algunas realizaciones, un scTv también se denomina scFv.
Un Fv o scFv monocatenario se refiere en algunos aspectos a fragmentos de anticuerpo o TCR que comprenden los dominios de cadena pesada variable (Vh) y cadena liviana variable (Vl) de un anticuerpo o la cadena variable alfa o gamma (Va o Vy) y dominios de cadena variable beta o delta (Vp o V6) de un TCR, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl o los dominios Va y Yp o los dominios Vy y V6 que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno.
Un diacuerpo se refiere en algunos aspectos a pequeños fragmentos de anticuerpo y/o TCR con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden una Vh conectada a una Vl en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl) o una Va conectada a un Yp en la misma cadena polipeptídica (Va-Vp) o una Vy conectada a una V5 en la misma cadena polipeptídica (Vy-V6). Por medio del uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los ejemplos de diacuerpos se describen con más detalle, por ejemplo, en los documentos EP404097 y WO93111161.
Un anticuerpo biespecífico o TCR biespecífico se refiere en algunos aspectos a un anticuerpo o TCR que muestra especificidades para dos tipos diferentes de antígenos. Los términos que se utilizan en la presente incluyen específicamente, sin limitación, anticuerpos y TCR que muestran especificidad de unión para un antígeno objetivo y para otro objetivo que facilita la administración a un tejido particular. De manera similar, los anticuerpos multiespecíficos y los TCR tienen dos o más especificidades de unión.
Un anticuerpo lineal o "TC lineal" se refiere en algunos aspectos a un par de segmentos Fd en tándem (por ejemplo, Vh-Ch i-Vh-Chi o Va-Ca1-Va-Ca1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales y los TCR pueden ser biespecíficos o monoespecíficos, por ejemplo, como describen Zapata et al., Protein Eng.
8(10):1057-1062 (1995).
Un dominio de unión a antígeno se refiere en algunos aspectos a uno o más fragmentos de un anticuerpo o TCR que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Los ejemplos no limitantes de fragmentos de anticuerpos incluidos dentro de tales términos incluyen, entre otros, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios Vl, Vh, Cl y Cm; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que contiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios Vh y Ch1 ; (iv) un fragmento Fv que contiene los dominios Vl y Vh de un solo grupo de un anticuerpo, incluidos scFv, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544546), que contiene un dominio Vh; y (vi) una CDR aislada. Además, en esta definición se incluyen anticuerpos que comprenden una única cadena pesada y una única cadena liviana o TCR con una única cadena alfa o una única cadena beta.
Los restos "F(ab')2" y "Fab'" se pueden producir al tratar una Ig con una proteasa como pepsina y papaína, e incluyen fragmentos de anticuerpos generados al digerir inmunoglobulina cerca de los enlaces disulfuro que existen entre las regiones bisagra en cada una de las dos cadenas pesadas. Por ejemplo, la papaína escinde IgG cadena arriba de los enlaces disulfuro que existen entre las regiones bisagra en cada una de las dos cadenas pesadas para generar dos fragmentos de anticuerpos homólogos en los que una cadena liviana compuesta por Vl y Cl, y un fragmento de cadena pesada compuesto por Vh y CHy1 (región y1 en la región constante de la cadena pesada) están conectados en sus regiones C terminales a través de un enlace disulfuro. Cada uno de estos dos fragmentos de anticuerpos homólogos se denomina 'Fab'. La pepsina también escinde IgG cadena abajo de los enlaces disulfuro que existen entre las regiones bisagra en cada una de las dos cadenas pesadas para generar un fragmento de anticuerpo ligeramente más grande que el fragmento en el que los dos "Fab" mencionados con anterioridad están conectados en la región bisagra. Este fragmento de anticuerpo se llama F('ab')2. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (Ch1) de la cadena pesada. Los fragmentos 'Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo del dominio Ch1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la que el residuo o los residuos de cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se producen originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos.
Fv se refiere en algunos aspectos a un anticuerpo o fragmento de TCR que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno. Esta región consta de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y una cadena liviana o una cadena TCRa y una cadena TCRp o una cadena TCRy y una cadena TCR8 en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl o el dímero Va-Vp o el dímero Vy-VS. Colectivamente, una combinación de una o más de las CDR de cada una de las cadenas Vh y Vl o cadenas Va-Vp o cadenas Vy-VS confiere especificidad de unión a antígeno al anticuerpo o TCR. Por ejemplo, se entendería que, por ejemplo, CDRH3 y CDRL3 podrían ser suficientes para conferir especificidad de unión a antígeno a un anticuerpo o TCR cuando se transfieren a cadenas Vh y Vl o cadenas Va-Yp o cadenas Vy-VS de un anticuerpo seleccionado receptor, TCR o fragmento de unión a antígeno del mismo y esta combinación de CDR puede analizarse para unión, afinidad, etc. Incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque probablemente con una afinidad menor que cuando se combina con un segundo dominio variable. Además, aunque los dos dominios de un fragmento Fv (Vl y Vh o Va y Yp o Vy y VS) están codificados por genes separados, se pueden unir utilizando métodos recombinantes mediante un enlazador sintético que les permite fabricarlos como una única cadena proteica en la que las regiones de la cadena Vl y Vh o Va y Yp o Vy y VS se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Osbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778). También se pretende que tales scFv estén comprendidos dentro del término "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo. Cualquier secuencia VH y Vl de scFv específico puede unirse a un ADNc de la región Fc o secuencias genómicas, para generar vectores de expresión que codifican moléculas de Ig completas (por ejemplo, IgG) u otros isotipos. Vh y Vl también se pueden usar en la generación de Fab, Fv u otros fragmentos de Ig usando química de proteínas o tecnología de ADN recombinante.
Los polipéptidos de unión al antígeno también incluyen dímeros de cadenas pesadas como, por ejemplo, anticuerpos de camélidos y tiburones. Los anticuerpos de camélidos y tiburones comprenden un par homodimérico de dos cadenas de dominios tipo V y tipo C (ninguno tiene una cadena liviana). Dado que la región Vh de una IgG de dímero de cadena pesada en un camélido no tiene que realizar interacciones hidrófobas con una cadena liviana, la región de la cadena pesada que normalmente está en contacto con una cadena liviana se cambia a residuos de aminoácidos hidrofílicos en un camélido. Los dominios Vh de las IgG de dímero de cadena pesada se denominan dominios Vhh. Los Ig-NAR de tiburón comprenden un homodímero de un dominio variable (denominado dominio V-NAR) y cinco dominios constantes similares a C (dominios C-NAR). En los camélidos, la diversidad del repertorio de anticuerpos está determinada por las CDR 1, 2 y 3 de las regiones Vh o Vhh. La CDR3 de la región Vhh del camello se caracteriza por su longitud relativamente larga, con un promedio de 16 aminoácidos (Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9): 1129).
Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo en el que todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos de la CDR derivan de CDR no humanas y todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos de FR derivan de FR humanas. Un anticuerpo humanizado puede incluir opcionalmente al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo no humano se refiere a una variante del anticuerpo no humano que se ha humanizado, normalmente para reducir la inmunogenia para los humanos, mientras que conserva la especificidad y la afinidad del anticuerpo original no humano. En algunas realizaciones, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que derivan los residuos de CDR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Entre los anticuerpos proporcionados están los anticuerpos humanos. Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo con una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un humano o célula humana, o una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpos humanos, incluidos los bancos de anticuerpos humanos. El término excluye formas humanizadas de anticuerpos no humanos que comprenden regiones de unión a antígenos no humanos, tales como aquellas en las que todas o sustancialmente todas las CDR son no humanas.
Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la administración de un inmunógeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición antigénica. Dichos animales contienen normalmente todos o una parte de los locus de inmunoglobulina humana, que reemplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes extracromosómicamente o integrados al azar en los cromosomas del animal. En dichos animales transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena generalmente se han inactivado. Los anticuerpos humanos también pueden derivar de bancos de anticuerpos humanos, incluidos bancos libres de células y de presentación en fagos, que contienen secuencias codificantes de anticuerpos derivadas de un repertorio humano.
Entre los anticuerpos proporcionados están los anticuerpos monoclonales, incluidos fragmentos de anticuerpos monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de o dentro de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos, excepto por las posibles variantes que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando dichas variantes generalmente presentes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un único epítopo en un antígeno. El término no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método en particular. Un anticuerpo monoclonal puede fabricarse mediante una variedad de técnicas, que incluyen, entre otras, la generación a partir de un hibridoma, métodos de ADN recombinante, presentación en fagos y otros métodos de presentación de anticuerpos.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y no se limitan a una longitud mínima. Los polipéptidos, incluidos los anticuerpos y las cadenas de anticuerpos proporcionados y otros péptidos, por ejemplo, enlazadores y péptidos de unión, pueden incluir residuos de aminoácidos que incluyen residuos de aminoácidos naturales y/o no naturales. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, sialilación, acetilación, fosforilación y similares. En algunos aspectos, los polipéptidos pueden contener modificaciones con respecto a una secuencia nativa o natural, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Esas modificaciones pueden ser intencionadas, por ejemplo a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, por ejemplo a través de mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o errores debido a la amplificación por PCR.
Una "secuencia de línea germinal" se refiere a una secuencia genética de la línea germinal (los gametos haploides y las células diploides a partir de las cuales se forman). El ADN de la línea germinal contiene múltiples segmentos de genes que codifican una única cadena pesada o ligera de Ig, o una única cadena TCRa o TCRp, o una única cadena TCRy o TCR8. Estos segmentos de genes se transportan en las células germinales, pero no se pueden transcribir ni traducir hasta que se organizan en genes funcionales. Durante la diferenciación de linfocitos B y linfocitos T en la médula ósea, estos segmentos de genes se barajan aleatoriamente mediante un sistema genético dinámico apto para generar más de 108 especificidades. La mayoría de estos segmentos de genes son publicados y recopilados por la base de datos de línea germinal.
Afinidad se refiere a la constante de equilibrio para la unión reversible de dos agentes y se expresa como Kd. La afinidad de una proteína de unión a un ligando tal como la afinidad de un anticuerpo por un epítopo o tal como la afinidad por un TCR por un complejo de MCH-péptido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nanomolar (nM) a aproximadamente 0,1 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 picomolar (pM), o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 femtomolar (fM). El término "avidez" se refiere a la resistencia de un complejo de dos o más agentes a la disociación después de la dilución.
Un epítopo se refiere en algunos aspectos a una parte de un antígeno u otra macromolécula apta para formar una interacción de unión con el bolsillo de unión de la región variable de un anticuerpo o TCR. Tales interacciones de unión pueden manifestarse como un contacto intermolecular con uno o más residuos de aminoácidos de una o más CDR. La unión al antígeno puede implicar, por ejemplo, una CDR3, un par de CDR3 o, en algunos casos, interacciones de hasta las seis CDR de las cadenas Vh y Vl. Un epítopo puede ser una secuencia peptídica lineal (es decir, "continua") o puede estar compuesto por secuencias de aminoácidos no contiguas (es decir, "conformacionales" o "discontinuas"). Un anticuerpo o TCR puede reconocer una o más secuencias de aminoácidos; por lo tanto, un epítopo puede definir más de una secuencia de aminoácidos distinta. En algunos aspectos, un TCR puede reconocer una o más secuencias de aminoácidos o epítopos en el contexto de un MHC. Los epítopos reconocidos por anticuerpos y TCR pueden determinarse mediante técnicas de mapeo peptídico y análisis de secuencias muy conocidas por los expertos en la técnica. Las interacciones de unión se manifiestan como contactos intermoleculares con uno o más residuos de aminoácidos de una CDR.
En algunas realizaciones, la referencia a un anticuerpo o TCR con unión específica se refiere a una situación en la que un anticuerpo o TCR no mostrará ninguna unión significativa a moléculas distintas del antígeno que contiene el epítopo reconocido por el anticuerpo o TCR. El término también puede aplicarse cuando, por ejemplo, un dominio de unión al antígeno es específico para un epítopo particular que es portado por varios antígenos, en cuyo caso el anticuerpo seleccionado, TCR o fragmento de unión al antígeno del mismo que porta el dominio de unión al antígeno podrá unirse a los diversos antígenos que portan el epítopo. Los términos "se une preferiblemente" o "se une específicamente" significan que los anticuerpos, TCR o fragmentos de los mismos se unen a un epítopo con mayor afinidad que a secuencias de aminoácidos no relacionadas y, si son reactivos de forma cruzada con otros polipéptidos que contienen el epítopo, no son tóxicos a los niveles a los que se formulan para su administración para uso humano. En un aspecto, tal afinidad es al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 6 veces mayor, al menos 7 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 9 veces mayor, 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor, al menos 100 veces mayor o al menos 1000 veces mayor que la afinidad del anticuerpo, TCR o fragmento del mismo para secuencias de aminoácidos no relacionadas. El término "unión" se refiere a una asociación directa entre dos moléculas, debido, por ejemplo, a interacciones covalentes, electrostáticas, hidrofóbicas e iónicas y/o de enlaces de hidrógeno en condiciones fisiológicas, e incluye interacciones tales como puentes de sales y puentes de agua, así como cualquier otro medio convencional de unión.
El término "unión" se refiere a una asociación directa entre dos moléculas, debido, por ejemplo, a interacciones covalentes, electrostáticas, hidrofóbicas e iónicas y/o de enlaces de hidrógeno en condiciones fisiológicas, e incluye interacciones tales como puentes de sales y puentes de agua, así como cualquier otro medio convencional de unión.
"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que son fisiológicamente tolerables y que normalmente no producen una reacción adversa alérgica o similar, como molestias gástricas, mareos y similares, cuando se administran a un ser humano.
"Prevención" se refiere a la profilaxis, la prevención de la aparición de síntomas, la prevención de la progresión de una enfermedad o trastorno asociado con niveles excesivos de proteína o correlacionados con la actividad de la proteína.
"Inhibición", "tratamiento" y "tratar" se utilizan indistintamente y se refieren, por ejemplo, a la estasis de los síntomas, a la prolongación de la sobrevida, a la mejora parcial o total de los síntomas y a la erradicación parcial o total de una afección, enfermedad o trastorno asociado con niveles excesivos de proteína o correlacionados con la actividad de la proteína. Por ejemplo, el tratamiento del cáncer incluye, entre otros, estasis, eliminación parcial o total de un crecimiento o tumor canceroso. El tratamiento o la eliminación parcial incluyen, por ejemplo, una reducción del crecimiento o del tamaño y/o volumen del tumor, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 50 veces o cualquier reducción de veces intermedia. De manera similar, el tratamiento o la eliminación parcial pueden incluir una reducción porcentual en el crecimiento o tamaño y/o volumen del tumor de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o cualquier reducción porcentual intermedia.
Un anticuerpo neutralizante o TCR neutralizante se refiere en algunos aspectos a cualquier anticuerpo o TCR que inhibe la réplica de un patógeno, como un virus o una bacteria, independientemente del mecanismo por el cual se logra la neutralización.
Un repertorio de anticuerpos o repertorio de TCR se refiere a una colección de anticuerpos, TCR o fragmentos de los mismos. Un repertorio de anticuerpos puede usarse, por ejemplo, para seleccionar un anticuerpo particular o seleccionar una propiedad particular, como capacidad de unión, especificidad de unión, capacidad de transporte gastrointestinal, estabilidad, afinidad y similares. El término incluye específicamente bancos de anticuerpos y TCR, incluidas todas las formas de bancos combinatorios, como, por ejemplo, bancos de presentación de fagos de anticuerpos, incluidos, entre otros, los bancos de presentación de fagos de anticuerpos Fv (scFv) y Fab de cadena única de cualquier fuente, incluidos los bancos naturales, sintéticos y semisintéticos.
Una "molécula de ácido nucleico diana", "polinucleótido diana", "molécula de polinucleótido diana" se refiere a cualquier ácido nucleico de interés.
Una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se refiere a una reacción de amplificación in vitro de secuencias de polinucleótidos mediante la extensión simultánea de cebadores de hebras no codificantes de un polinucleótido bicatenario. Las reacciones de PCR producen copias de un polinucleótido molde flanqueado por sitios de unión de cebadores. El resultado, con dos cebadores, es un aumento exponencial en el número de copias del polinucleótido molde de ambas hebras con cada ciclo, porque con cada ciclo se replican ambas cadenas. El dúplex de polinucleótidos tiene terminales correspondientes a los extremos de los cebadores utilizados. La PCR puede comprender una o más repeticiones de desnaturalización de un polinucleótido molde, hibridación de cebadores con sitios de unión de cebadores y extensión de los cebadores mediante una polimerasa de ADN o ARN en presencia de nucleótidos. Las temperaturas particulares, las duraciones en cada paso y las tasas de cambio entre los pasos dependen de muchos factores muy conocidos por los expertos en la técnica. (McPherson et al., IRL Press, Oxford (1991 y 1995)). Por ejemplo, en una PCR convencional que usa ADN polimerasa Taq, un polinucleótido molde bicatenario se puede desnaturalizar a una temperatura > 90 °C, los cebadores se pueden hibridar a una temperatura en el rango de 50 a 75 °C y los cebadores se pueden extender a una temperatura en el rango de 72-78 °C. En algunas realizaciones, la pCr comprende PCR de transcripción inversa (RT-PCR), PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada o similares. En algunas realizaciones, la PCR no comprende la RT-PCR. (Patentes de Estados Unidos n. ° 5.168.038, 5.210.015, 6.174.670, 6.569.627, y 5.925.517; Mackay et al., Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002)). La RT-PCR comprende una reacción de PCR precedida por una reacción de transcripción inversa y se amplifica un ADNc resultante, la PCR anidada comprende una PCR de dos pasos en donde un amplicón de una primera reacción de PCR que utiliza un primer conjunto de cebadores se convierte en la muestra para una segunda reacción de PCR que utiliza un segundo conjunto de cebadores, al menos uno de los cuales se une a una ubicación interna de un amplicón de una primera reacción de PCR. La PCR multiplexada comprende una reacción de PCR, en donde una pluralidad de secuencias de polinucleótidos se somete a PCR en la misma mezcla de reacción en simultáneo. Los volúmenes de reacción de PCR pueden variar entre 0,2 pl y 1000 ml. La PCR cuantitativa comprende una reacción de PCR diseñada para medir una cantidad, abundancia o concentración absoluta o relativa de una o más secuencias en una muestra. Las mediciones cuantitativas pueden incluir la comparación de una o más secuencias o estándares de referencia con una secuencia de polinucleótidos de interés. (Freeman et al., Biotechniques, 26: 112-126 (1999); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17: 9437­ 9447 (1989); Zimmerman et al., Biotechniques, 21: 268-279 (1996); Diviacco et al., Gene, 122: 3013- 3020 (1992); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989)).
"Nucleótido", "nucleósido", "residuo de nucleótido" y "residuo de nucleósido", como se utiliza en la presente, puede significar un residuo de desoxirribonucleótido o ribonucleótido u otro análogo de nucleósido similar capaz de servir como componente de un cebador apto para su uso en una reacción de amplificación (por ejemplo, reacción PCR). Dichos nucleósidos y derivados de los mismos se pueden utilizar como bloques de construcción de los cebadores descritos en la presente, excepto cuando se indique lo contrario. Nada de lo expuesto en la presente solicitud pretende impedir la utilización de derivados de nucleósidos o bases que hayan sido modificadas químicamente para mejorar su estabilidad o utilidad en una reacción de amplificación, siempre que la modificación química no interfiera con su reconocimiento por parte de una polimerasa como desoxiguanina, desoxicitosina, desoxitimidina o desoxiadenina, según corresponda. En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos pueden estabilizar la formación de híbridos. En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos pueden desestabilizar la formación de híbridos. En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos pueden mejorar la especificidad de hibridación. En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos pueden reducir la especificidad de hibridación.
Un "ácido nucleico", o equivalentes gramaticales, se refieren a un único nucleótido o al menos a dos nucleótidos unidos covalentemente.
Un "polinucleótido", o equivalentes gramaticales, se refieren a al menos dos nucleótidos unidos covalentemente. Un polinucleótido comprende una molécula que contiene dos o más nucleótidos. Un polinucleótido comprende formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o ácidos nucleicos peptídicos (PNA), que comprenden bases de purina y pirimidina u otros derivados de bases de nucleótidos naturales, modificados química o bioquímicamente o no naturales. La cadena principal del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos fosfato o azúcares o grupos fosfato modificados o sustituidos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede incluir otras moléculas, como otro polinucleótido hibridado. Los polinucleótidos incluyen secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o ambos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento de gen, un exón, un intrón, ADN intergénico (que incluye, entre otros, ADN heterocromático), ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosomal, ribozimas, ARN pequeño de interferencia (ARNpi), ARNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, DNA aislado de una secuencia, ARN aislado de una secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Los polinucleótidos se pueden aislar de fuentes naturales, recombinantes o sintetizarse artificialmente.
Los polinucleótidos pueden incluir nucleótidos no convencionales, como análogos de nucleótidos o nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, los nucleótidos no convencionales pueden estabilizar la formación de híbridos. En algunas realizaciones, los nucleótidos no convencionales pueden desestabilizar la formación de híbridos. En algunas realizaciones, los nucleótidos no convencionales pueden mejorar la especificidad de hibridación. En algunas realizaciones, los nucleótidos no convencionales pueden reducir la especificidad de hibridación. Los ejemplos de modificaciones de nucleótidos no convencionales incluyen 2' O-Me, 2'-O-alilo, 2'-O-propargilo, 2'-O-alquilo, 2'-fluoro, 2'-arabino, 2'-xilo, 2'-fluoro-arabino, fosforotioato, fosforoditioato, fosforoamidatos, 2'-amino, pirimidina sustituida con alquilo en 5, 3'-desoxiguanosina, pirimidina sustituida con halo en 5, purina sustituida con alquilo, purina sustituida con halo, nucleótidos bicíclicos, 2'MOE, moléculas de APN, moléculas de ALN, moléculas como de ALN, diaminopurina, S2T, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metil-guanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-mannosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-D46-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina y sus derivados.
Un "sujeto", "individuo", "hospedador" o "paciente" se refiere a organismos vivos tales como mamíferos. Los ejemplos de sujetos y hospedadores incluyen, entre otros, caballos, vacas, camellos, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, conejos, cobayas, ratas, ratones (por ejemplo, ratones humanizados), jerbos, primates no humanos (por ejemplo, macacos), seres humanos y similares, no mamíferos, incluidos, por ejemplo, vertebrados no mamíferos, tales como aves (por ejemplo, pollos o patos), peces (por ejemplo, tiburones) o ranas (por ejemplo, Xenopus) e invertebrados de no mamíferos, así como las especies transgénicas de los mismos. En determinados aspectos, un sujeto se refiere a un solo organismo (por ejemplo, ser humano). En determinados aspectos, o se proporciona un grupo de individuos que componen una pequeña cohorte que tiene un factor inmunitario común para estudiar y/o una enfermedad, y/o una cohorte de individuos sin la enfermedad (por ejemplo, control negativo/normal). Un sujeto del que se obtienen muestras puede ser afectado con una enfermedad y/o un trastorno (por ejemplo, una o más alergias, infecciones, cánceres o trastornos autoinmunitarios o similares) y puede compararse con un sujeto de control negativo que no está afectado por la enfermedad.
Un "kit" se refiere a un sistema de administración para suministrar materiales o reactivos para llevar a cabo un método divulgado en la presente. En algunas realizaciones, los kits incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o suministro de reactivos de reacción (por ejemplo, sondas, enzimas, etc., en los recipientes apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, tampones, instrucciones escritas para realizar el ensayo, etc.) de un lugar a otro. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recintos (por ejemplo, cajas) que contienen los reactivos de reacción y/o materiales de soporte pertinentes. Dichos contenidos se pueden administrar al destinatario deseado juntos o por separado. Por ejemplo, un primer recipiente puede contener una enzima para su uso en un ensayo, mientras que un segundo recipiente contiene una pluralidad de cebadores.
Un "polipéptido" se refiere, en algunos aspectos, a una molécula que comprende al menos dos aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido consiste en un único péptido. En algunas realizaciones, un polipéptido comprende dos o más péptidos. Por ejemplo, un polipéptido puede comprender al menos aproximadamente 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 péptidos o aminoácidos. Los ejemplos de polipéptidos incluyen, entre otros, cadenas de aminoácidos, proteínas, péptidos, hormonas, sacáridos polipeptídicos, lípidos, glicolípidos, fosfolípidos, anticuerpos, enzimas, quinasas, receptores, factores de transcripción y ligandos.
Una "muestra" se refiere, en algunos aspectos, a una muestra biológica, ambiental, médica, de sujeto o paciente, o una muestra que contiene un polinucleótido, tal como un polinucleótido diana.
Conjugados de afinidad-oligonucleótido
Un conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende una parte de molécula de afinidad (por ejemplo, un anticuerpo o complejo de MHC-péptido) y una parte de oligonucleótido. Puede utilizarse una secuencia de identificación de antígeno del oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido para identificar uno o más antígenos con los que interactúa específicamente el conjugado de afinidad-oligonucleótido. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se une de forma covalente a la parte de afinidad del conjugado. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se une de forma no covalente a la parte de afinidad del conjugado.
En algunas realizaciones, un conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende una única parte de afinidad. En algunas realizaciones, los conjugados de afinidad-oligonucleótido son conjugados de afinidad-oligonucleótido multivalentes. Por ejemplo, los conjugados de afinidad-oligonucleótido multivalentes pueden comprender dominios de unión al antígeno de al menos dos moléculas de afinidad conjugadas con uno o más oligonucleótidos. Por ejemplo, los conjugados de afinidad-oligonucleótido multivalentes pueden comprender dominios de unión al antígeno de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 1000 moléculas de afinidad conjugadas con uno o más oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, un conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende un único oligonucleótido. En algunas realizaciones, un conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende 2 o más oligonucleótidos. Por ejemplo, un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 1000 oligonucleótidos conjugados con una o más moléculas de afinidad (por ejemplo, un anticuerpo o complejo de MHC-péptido). En algunas realizaciones, un conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende 2 o más oligonucleótidos que contienen la misma secuencia de ID de antígeno (AID). Por ejemplo, un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 1000 oligonucleótidos que contienen la misma secuencia de AID.
Parte de afinidad de conjugados de afinidad-oligonucleótido
Una parte (o dominio) de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende la región, molécula, dominio, parte, fragmento o resto de un conjugado de afinidad-oligonucleótido que se une a un antígeno diana. Por lo tanto, una parte de afinidad confiere la capacidad de unirse o unirse específicamente a un antígeno diana dado, como un dominio extracelular de una proteína de la superficie celular. En algunas realizaciones, una parte de afinidad no interactúa sustancialmente con un antígeno de otro conjugado de afinidad-oligonucleótido que comprende una secuencia ID de antígeno diferente. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una molécula que puede contener un ácido nucleico, o a la que se puede unir un oligonucleótido, sin anular sustancialmente la unión de la parte de afinidad a un antígeno diana.
Una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede ser una molécula de ácido nucleico o puede ser proteica. Las partes de afinidad incluyen, entre otros, ARN, ADN, híbridos de ARN-ADN, moléculas pequeñas (por ejemplo, fármacos), aptámeros, polipéptidos, proteínas, anticuerpos y fragmentos de los mismos, TCR y fragmentos de los mismos, virus, partículas de virus, células, fragmentos de los mismos y combinaciones de los mismos. (Véase, por ejemplo, Fredriksson et al., (2002) Nat Biotech 20:473-77; Gullberg et al., (2004) PNAS, 101:8420-24). Por ejemplo, una parte de afinidad puede ser un ARN monocatenario, un ARN bicatenario, un ADN monocatenario, un ADN bicatenario, un ADN o ARN que comprende una o más regiones bicatenarias y una o más regiones monocatenarias, un híbrido de ARN-ADN, una molécula pequeña, un aptámero, un polipéptido, una proteína, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un TCR, un fragmento de TCR, un MHC, un complejo de MHC-péptido, una partícula de virus, una célula, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido se dirige a una célula. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede dirigirse a una célula T o a una célula B. En algunas realizaciones, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido se dirige a un tipo de célula o subconjunto de células en particular. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede dirigirse a una célula T CD4+ o a una célula T CD8+. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede dirigirse a una célula T que comprende un TCR que reconoce específicamente un antígeno particular. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidadoligonucleótido puede dirigirse a una célula T que comprende un t Cr que reconoce específicamente un complejo de MHC-péptido particular.
En algunas realizaciones, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido se dirige a un dominio extracelular de un objetivo de una célula. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidadoligonucleótido puede dirigirse a un dominio extracelular de un receptor de una célula, por ejemplo, un receptor de células T. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede dirigirse a una región glicosilada de un dominio extracelular de un receptor de una célula. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede dirigirse a una región de unión al ligando de un dominio extracelular de un receptor de una célula. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede dirigirse a una región de un dominio extracelular de un receptor de una célula que no se une a un ligando.
Proteínas
En algunas realizaciones, una parte de afinidad es un polipéptido, una proteína o cualquier fragmento de los mismos. En algunas realizaciones, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido es una proteína. En algunas realizaciones, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido es un péptido. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede ser un anticuerpo, tal como un dominio de unión de un anticuerpo. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede ser un complejo de MHC-péptido. Por ejemplo, una parte de afinidad puede ser un polipéptido purificado, un polipéptido aislado, un polipéptido marcado por fusión, un polipéptido unido o que atraviesa la membrana de una célula o un virus o virión, una proteína citoplasmática, una proteína intracelular, una proteína extracelular, una quinasa, una fosfatasa, una aromatasa, una helicasa, una proteasa, una oxidorreductasa, una reductasa, una transferasa, una hidrolasa, una liasa, una isomerasa, una glicosilasa, una proteína de matriz extracelular, una ligasa, un transportador de iones, un canal, un poro, una proteína apoptótica, una proteína de adhesión celular, una proteína patógena, una proteína expresada anormalmente, un factor de transcripción, un regulador de transcripción, una proteína de traducción, una chaperona, una proteína secretada, un ligando, una hormona, una citocina, una quimiocina, una proteína nuclear, un receptor, un receptor transmembrana, un transductor de señal, un anticuerpo, una proteína de membrana, una proteína de membrana integral, una proteína de membrana periférica, una proteína de la pared celular, una proteína globular, una proteína fibrosa, una glucoproteína, una lipoproteína, una proteína cromosómica, cualquier fragmento de las mismas o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es un polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una proteína sobreexpresada en una célula usando técnicas moleculares, como la transfección. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es un polipéptido recombinante. Por ejemplo, una parte de afinidad puede comprender muestras producidas en células bacterianas (por ejemplo, E. coli), de levadura, de mamífero o de insecto (por ejemplo, proteínas sobreexpresadas por los organismos). En algunas realizaciones, una parte de afinidad es un polipéptido que contiene una mutación, inserción, deleción o polimorfismo. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es un antígeno, como un polipéptido utilizado para inmunizar un organismo o para generar una respuesta inmunitaria en un organismo, por ejemplo para la producción de anticuerpos.
Anticuerpos
En algunas realizaciones, una parte de afinidad en un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de unión de un anticuerpo. Un anticuerpo puede unirse específicamente a una organización espacial y polar particular de otra molécula. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser un anticuerpo purificado, un anticuerpo aislado, un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo marcado por fusión. En algunas realizaciones, un anticuerpo se sobreexpresa en una célula utilizando técnicas moleculares, como la transfección. En algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo recombinante. Un anticuerpo puede unirse específicamente a una organización espacial y polar particular de otra molécula, como una molécula de la superficie celular. Un anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal o un anticuerpo recombinante, y puede prepararse mediante técnicas muy conocidas en la técnica, como la inmunización de un hospedador y la recolección de sueros (policlonal) o mediante la preparación de líneas celulares híbridas continuas y la recolección de la proteína secretada (monoclonal), o mediante la clonación y la expresión de secuencias de nucleótidos, o versiones mutagénicas de las mismas, que codifican al menos las secuencias de aminoácidos necesarias para la unión específica de los anticuerpos naturales. Además, se pueden utilizar agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea apropiado, siempre que se mantenga la afinidad de unión por una molécula particular. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios Vl, Vh, Cl y Cm; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consta de los dominios Vh y Cm; un fragmento Fv que consta de los dominios Vl y Vh de un único grupo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de dominio único (dAb) (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-46), que consta de un dominio Vh; y una CDR aislada y un fragmento de cadena sencilla (scFv) en el que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-26; and Huston et al., (1988) PNAS 85:5879-83). Por lo tanto, los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, F(ab)2, scFv, Fv, dAb y similares. Aunque los dos dominios Vl y Vh están codificados por genes separados, se pueden unir mediante métodos recombinantes mediante un enlazador peptídico artificial que les permite formar una única cadena proteica. Dichos anticuerpos monocatenarios incluyen uno o más restos de unión al antígeno. Estos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos pueden examinarse para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Los anticuerpos pueden ser humanos, humanizados, quiméricos, aislados, de perro, gato, burro, oveja, cualquier planta, animal o mamífero.
MHC
El reconocimiento de estructuras antigénicas por parte del sistema inmunitario celular en algunos casos está mediado por complejos principales de histocompatibilidad (MHC) expresados en la superficie. Las células, como las células presentadoras de antígenos (APC), en algunos aspectos procesan proteínas como antígenos en péptidos cortos, que pueden presentarse en un pliegue de unión de péptido específico de la molécula de MHC y, en algunos aspectos, pueden reconocerse mediante las células T. El reconocimiento específico del epítopo (fragmento de péptido) por parte del receptor de células T (TCR) generalmente requiere una interacción simultánea con la molécula de MHC. Se puede preparar un complejo multimérico estable con subunidades de proteína de MHC que contienen un péptido unido. El complejo de MHC-antígeno puede formar una estructura estable con células T que reconocen el complejo a través de su receptor de antígeno, lo que permite la unión a células T que reconocen específicamente el antígeno. Una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede dirigirse a una célula T. Una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede dirigirse específicamente a una célula T. Una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede dirigirse a un receptor de células T o una molécula similar a TCR, como un CAR similar al TCR. Una parte de afinidad de un conjugado de afinidadoligonucleótido puede dirigirse específicamente a un receptor de células T. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender una molécula de MHC. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender un complejo de MHC-péptido (MHC-p). Una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede tener la fórmula (A-B-P)n, donde A es una cadena a de un MHC clase I o una proteína de MHC clase II, B es una cadena p de una proteína de MHC clase II o microglobulina p2 para una proteína de MHC clase I, y P es un péptido. En algunas realizaciones, n es 1. En algunas realizaciones, n es mayor o igual a 2. Las subunidades de proteína de MHC pueden ser una forma soluble. Por ejemplo, las subunidades de la proteína de MHC soluble pueden derivar de las subunidades de la proteína de MHC natural mediante la deleción de un dominio transmembrana o una parte del mismo. En algunas realizaciones, las subunidades de la proteína de MHC no comprenden un dominio citoplasmático. En algunas realizaciones, las subunidades de la proteína de MHC no comprenden un dominio transmembrana.
El péptido (P) puede tener una longitud de aproximadamente 6 a 12 aminoácidos para complejos con proteínas de MHC de clase I, por ejemplo, aproximadamente de 8 a 10 aminoácidos. El péptido puede tener una longitud de aproximadamente 6 a 20 aminoácidos para complejos con proteínas de MHC de clase II, por ejemplo, aproximadamente de 10 a 18 aminoácidos. Los péptidos pueden tener una secuencia derivada de una amplia variedad de proteínas. Los péptidos pueden ser epítopos de células T. Las secuencias de epítopos de varios antígenos se conocen en la técnica. Alternativamente, la secuencia del epítopo puede determinarse empíricamente, aislando y secuenciando péptidos unidos a proteínas de MHC naturales, mediante la síntesis de una serie de péptidos a partir de la secuencia diana, analizando después la reactividad de las células T a los diferentes péptidos o produciendo una serie de complejos de unión con diferentes péptidos y cuantificando la unión de células T.
La preparación de fragmentos, la identificación de secuencias y la identificación de la secuencia mínima se describen en la patente de Estados Unidos n. ° 5.019.384 y las referencias citadas en la misma. Los péptidos se pueden preparar de diversas formas. Convenientemente, pueden sintetizarse mediante técnicas convencionales que emplean sintetizadores automáticos o pueden sintetizarse de manera manual. Alternativamente, pueden prepararse secuencias de ADN que codifiquen el péptido particular y pueden clonarse y expresarse para proporcionar el péptido deseado. En este caso, una metionina puede ser el primer aminoácido. Además, los péptidos pueden producirse mediante métodos recombinantes como una fusión con proteínas que son uno de los pares de unión específicos, lo que permite la purificación de la proteína de fusión por medio de reactivos de afinidad, seguida de la escisión proteolítica, normalmente en un sitio genomanipulado para producir el péptido deseado (véase, por ejemplo, Driscoll et al. (1993) J. Mol. Bio. 232:342-350). Los péptidos también pueden aislarse de fuentes naturales y purificarse mediante técnicas conocidas, que incluyen, por ejemplo, cromatografía en materiales de intercambio iónico, separación por tamaño, cromatografía de inmunoafinidad y electroforesis.
En algunas realizaciones, las subunidades a y p se producen por separado y se les permite asociarse in vitro para formar un complejo heterodúplex estable (véase, por ejemplo, Altman et al. (1993) o Garboczi et al. (1992)). En algunas realizaciones, las subunidades a y p se expresan juntas en una única célula. En algunas realizaciones, se utiliza una única molécula que tiene las subunidades a y p. Por ejemplo, se puede crear un heterodímero monocatenario fusionando las dos subunidades utilizando un enlazador peptídico corto, por ejemplo, un péptido o enlazador de 15 a 25 aminoácidos (véase, por ejemplo, Bedzyk et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:186l5). Los heterodímeros solubles también se pueden producir mediante el aislamiento de un heterodímero natural y la escisión con una proteasa, por ejemplo, papaína, para producir un producto soluble.
Las subunidades solubles se pueden expresar de forma independiente a partir de una construcción de ADN que codifica una proteína truncada. Para la expresión, las secuencias de ADN se pueden insertar en un vector de expresión apropiado, donde se puede emplear la región de inicio de la transcripción natural o una región de inicio de la transcripción exógena, por ejemplo, un promotor distinto del promotor que está asociado con el gen en el cromosoma que se produce normalmente. El promotor puede introducirse mediante métodos recombinantes in vitro o como resultado de la integración homóloga de la secuencia en un cromosoma. Las regiones de inicio de la transcripción son conocidas para una amplia variedad de hospedadores de expresión. Los hospedadores de expresión pueden implicar procariotas o eucariotas, particularmente E. coli, B. subtilis, células de mamífero, tales como células de CHO, células de COS, células de riñón de mono, células linfoides, líneas celulares humanas y similares.
Las subunidades pueden expresarse en una célula hospedadora adecuada y, si es necesario, solubilizarse. Las dos subunidades pueden combinarse con un péptido y dejarse plegar in vitro para formar un complejo heterodímero estable con dominios de enlace disulfuro intracadena. El péptido puede incluirse en la reacción de plegamiento inicial o puede agregarse al heterodímero vacío en un paso posterior. El sitio de unión al MHC puede estar libre de péptidos antes de la adición del péptido. La excepción serán aquellos casos en los que sea deseable marcar las células T con un complejo de péptido-MHC natural, como aquellos que pueden estar presentes en la superficie de las células que son un objetivo para el ataque autoinmunitario, etc. El heterodímero de MHC se unirá a un péptido en el surco formado por los dos dominios distales de la membrana, ya sea a2 y a1 para la clase I, o a1 y p1 para la clase II. Las condiciones que permiten el plegamiento y la asociación de las subunidades y el péptido son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Altman et al. (1993) and Garboczi et al. (1992)). Como ejemplo de condiciones permisivas, se mezclan cantidades aproximadamente equimolares de subunidades a y p solubilizadas en una solución de urea. El replegamiento se inicia por dilución o diálisis en una solución tamponada sin urea. Los péptidos se cargan en heterodímeros de clase II vacíos a un pH de aproximadamente 5 a 5,5 durante aproximadamente 1 a 3 días, seguido de neutralización, concentración e intercambio de tampón. Sin embargo, un experto en la técnica entenderá fácilmente que las condiciones de plegamiento específicas no son fundamentales para poner en práctica la invención.
En algunas realizaciones, se puede multimerizar un complejo monomérico (a-p-P). Por ejemplo, se puede formar un multímero uniendo los monómeros a una entidad multivalente a través de sitios de unión específicos en la subunidad a o p. En algunas realizaciones, se forma un multímero mediante reticulación química de los monómeros. Se conocen en la técnica diversos reactivos capaces de reticular proteínas, incluidos, entre otros, azidobenzoilhidrazida, N-[4-(p-azidosalicilamino)butil]-3'-[2'-piridilditio]propionamida), suberato de bis-sulfosuccinimidilo, dimetiladipimidato, tartrato de disuccinimidilo, éster de N-Y-maleimidobutiriloxisuccinimida, N-hidroxisulfosuccinimidilo-4-azidobenzoato, [4-azidofenil]-1,3'-ditiopropionato de N-succinimidilo, [4-yodoacetil]aminobenzoato de N-succinimidilo, glutaraldehído, formaldehído y 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo. Un sitio de unión para unirse a una entidad multivalente puede ocurrir de forma natural o puede introducirse mediante ingeniería genética. El sitio puede ser un miembro de un par de unión específico o uno que esté modificado para proporcionar un miembro de un par de unión específico, donde el par complementario tiene una multiplicidad de sitios de unión específicos. La unión al miembro de unión complementario puede ser una reacción química, unión epítopo-receptor o unión haptenoreceptor donde un hapteno está enlazado a la cadena de subunidades. En una realización preferida, una de las subunidades se fusiona con una secuencia de aminoácidos que proporciona un sitio de reconocimiento para una enzima modificadora. La secuencia de reconocimiento habitualmente se fusionará próxima al extremo carboxi de una de las subunidades para evitar posibles obstáculos en el sitio de unión del péptido antigénico. Convenientemente, un casete de expresión incluirá la secuencia que codifica el sitio de reconocimiento.
Las enzimas modificadoras de interés incluyen BirA, varias glicosilasas, farnesil proteína transferasa, proteína quinasas y similares. La subunidad se puede hacer reaccionar con la enzima modificadora en cualquier momento conveniente, por lo general después de la formación del monómero. El grupo introducido por la enzima modificadora, por ejemplo, biotina, azúcar, fosfato, farnesilo, etc., proporciona un miembro de par de unión complementario, o un sitio único para modificaciones adicionales, como reticulación química, biotinilación, etc., que proporcionará un miembro del par de unión complementario. Una estrategia alternativa es introducir un residuo de cisteína no pareado en la subunidad, introduciendo así un sitio único y químicamente reactivo para la unión. El sitio de unión también puede ser un epítopo natural o introducido, donde la pareja de unión multivalente será un anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgM, etc. Cualquier modificación será en un sitio, por ejemplo, C-terminal-proximal, que no interferirá con la unión. Un ejemplo de formación de multímeros es la introducción de la secuencia de reconocimiento para la enzima BirA, que cataliza la biotinilación del sustrato proteico. El monómero con una subunidad biotinilada luego se une a una pareja de unión multivalente, por ejemplo, estreptavidina o avidina, a la que se une la biotina con una afinidad extremadamente alta. La estreptavidina tiene una valencia de 4, lo que proporciona un multímero de (a-p-P)4. La pareja de unión multivalente puede estar libre en solución o puede estar unida a un soporte insoluble. Los ejemplos de soportes insolubles adecuados incluyen perlas, por ejemplo, perlas magnéticas, membranas y placas de microtitulación. Por lo general, están hechos de vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa. La unión a un soporte insoluble es útil cuando se va a utilizar el complejo de unión para la separación de células T.
Células
En algunas realizaciones, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido es una célula. Por ejemplo, una parte de afinidad puede ser una célula intacta, una célula tratada con un compuesto (por ejemplo, un fármaco), una célula fijada, una célula lisada o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una célula única. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidadoligonucleótido puede ser una célula T o una célula B. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una pluralidad de células. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una célula T. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una célula B. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una célula presentadora de antígeno (APC). En algunas realizaciones, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido es un tipo de célula particular o un subconjunto de células. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede ser una célula T CD4+ o una célula T CD8+. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede ser una célula T que comprende un TCR que reconoce específicamente un antígeno particular. Por ejemplo, una parte de afinidad de un conjugado de afinidadoligonucleótido puede ser una célula T que comprende un TCR que reconoce específicamente un complejo de MHC-péptido particular. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una célula.
Moléculas pequeñas
En algunas realizaciones, una parte de afinidad de un conjugado de afinidad-oligonucleótido es una molécula pequeña, tal como un fármaco. Por ejemplo, una molécula pequeña puede ser una molécula macrocíclica, un inhibidor, un fármaco o un compuesto químico. En algunas realizaciones, una molécula pequeña no contiene más de cinco donantes de enlaces de hidrógeno. En algunas realizaciones, una molécula pequeña no contiene más de diez aceptores de enlaces de hidrógeno. En algunas realizaciones, una molécula pequeña tiene un peso molecular de 500 Daltons o menos. En algunas realizaciones, una molécula pequeña tiene un peso molecular de aproximadamente 180 a 500 Daltons. En algunas realizaciones, una molécula pequeña contiene un coeficiente de partición octanol-agua lop P no mayor que cinco. En algunas realizaciones, una molécula pequeña tiene un coeficiente de partición log P de -0,4 a 5,6. En algunas realizaciones, una molécula pequeña tiene una refractividad molar de 40 a 130. En algunas realizaciones, una molécula pequeña contiene de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 átomos. En algunas realizaciones, una molécula pequeña tiene un área de superficie polar de 140 Angstroms2 o menos.
Ácidos nucleicos
En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una forma polimérica de ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina), como ADN o ARN (por ejemplo, ARNm). El ADN incluye ADN bicatenario que se encuentra en moléculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. En algunas realizaciones, una parte de afinidad de polinucleótidos es un ARN pequeño de interferencia (ARNip) monocatenario, bicatenario, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), un cromosoma, un gen, una secuencia genómica no codificante, ADN genómico (por ejemplo, ADN genómico fragmentado), un polinucleótido purificado, un polinucleótido aislado, un polinucleótido hibridado, un sitio de unión del factor de transcripción, ADN mitocondrial, ARN ribosómico, un polinucleótido eucariota, un polinucleótido procariota, un polinucleótido sintetizado, un polinucleótido ligado, un polinucleótido recombinante, un polinucleótido que contiene un análogo de ácido nucleico, un polinucleótido metilado, un polinucleótido desmetilado, cualquier fragmento de los mismos o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es un polinucleótido que comprende una región bicatenaria y un extremo que no es bicatenario (por ejemplo, una región sobresaliente en 5' o 3'). En algunas realizaciones, una parte de afinidad es un polinucleótido recombinante. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es un polinucleótido heterólogo. Por ejemplo, una parte de afinidad puede comprender polinucleótidos producidos en células bacterianas (por ejemplo, E. coli), levadura, de mamífero o de insecto (por ejemplo, polinucleótidos heterólogos para los organismos). En algunas realizaciones, una parte de afinidad es un polinucleótido que contiene una mutación, inserción, deleción o polimorfismo.
En algunas realizaciones, una parte de afinidad es un aptámero. Un aptámero es una molécula de ácido nucleico aislada que se une con alta especificidad y afinidad a un analito diana, tal como una proteína. Un aptámero es una estructura tridimensional mantenida en cierta conformación o ciertas conformaciones que proporcionan contactos químicos para unirse específicamente a su objetivo dado. Aunque los aptámeros son moléculas basadas en ácidos nucleicos, existe una diferencia fundamental entre los aptámeros y otras moléculas de ácidos nucleicos, tales como los genes y el ARNm. En este último, la estructura del ácido nucleico codifica información a través de su secuencia de bases lineal y, por lo tanto, esta secuencia es importante para la función de almacenamiento de información. En completo contraste, la función del aptámero, que se basa en la unión específica de una molécula diana, no depende completamente de una secuencia de base lineal conservada (una secuencia no codificante), sino más bien de una estructura particular secundaria/terciaria/cuaternaria. Cualquier potencial de codificación que pueda poseer un aptámero es totalmente fortuito y no desempeña ninguna función en la unión de un aptámero a su objetivo análogo. Los aptámeros también deben diferenciarse de las secuencias de ácidos nucleicos naturales que se unen a ciertas proteínas. Estas últimas secuencias son secuencias naturales incrustadas en el genoma del organismo que se unen a un subgrupo especializado de proteínas que participan en la transcripción, traducción y transporte de ácidos nucleicos naturales (por ejemplo, proteínas de unión a ácidos nucleicos). Los aptámeros, por otro lado, son moléculas de ácido nucleico cortas, aisladas y no naturales. Aunque se pueden identificar aptámeros que se unen a proteínas de unión a ácidos nucleicos, en la mayoría de los casos dichos aptámeros tienen poca o ninguna identidad de secuencia con las secuencias reconocidas por las proteínas de unión a ácidos nucleicos en la naturaleza. Aún más importante, los aptámeros pueden unirse prácticamente a cualquier proteína (no solo a las proteínas de unión a ácidos nucleicos), así como a casi cualquier objetivo de interés, incluidas pequeñas moléculas, carbohidratos, péptidos, etc. Para la mayoría de los objetivos, incluso las proteínas, no existe una secuencia de ácido nucleico natural a la que se una. Para aquellos objetivos que tienen tal secuencia, por ejemplo, proteínas de unión al ácido nucleico, tales secuencias diferirán de los aptámeros como resultado de la afinidad de unión relativamente baja utilizada en la naturaleza en comparación con los aptámeros de unión estrecha. Los aptámeros pueden unirse específicamente a objetivos seleccionados y modular la actividad de los objetivos o las interacciones de unión, por ejemplo, a través de la unión, los aptámeros pueden bloquear la capacidad de funcionamiento de su objetivo. La propiedad funcional de unión específica a un objetivo es una propiedad inherente a un aptámero. Un aptámero típico tiene un tamaño de 6-35 kDa (20-100 nucleótidos), se une a su objetivo con afinidad micromolar a subnanomolar y puede discriminar objetivos estrechamente relacionados (por ejemplo, los aptámeros pueden unirse selectivamente a proteínas relacionadas de la misma familia de genes). Los aptámeros pueden utilizar interacciones intermoleculares vistas con frecuencia, tales como enlaces de hidrógeno, complementariedades electrostáticas, contactos hidrofóbicos y exclusión estérica para unirse a un objetivo específico. Los aptámeros tienen diversas características deseables para su uso como agentes terapéuticos y diagnósticos, que incluyen alta especificidad y afinidad, baja inmunogenia, eficacia biológica y excelentes propiedades farmacocinéticas. Un aptámero puede comprender una estructura molecular en tallo-bucle formada a partir de la hibridación de polinucleótidos complementarios que están unidos covalentemente (por ejemplo, una estructura de bucle en horquilla). El tallo comprende los polinucleótidos hibridados y el bucle es la región que une covalentemente los dos polinucleótidos complementarios.
En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una pluralidad de partes de afinidad, como una mezcla o banco de partes de afinidad. En algunas realizaciones, una parte de afinidad es una pluralidad de partes de afinidad diferentes. Por ejemplo, una parte de afinidad puede comprender una pluralidad de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 25.000 o 30.000 partes de afinidad.
Parte de oligonucleótidos de conjugados de afinidad-oligonucleótidos
La parte de oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido es un ácido nucleico que se acopla a la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se acopla directamente a la parte de afinidad. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se acopla indirectamente a la parte de afinidad. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se acopla de forma no covalente a la parte de afinidad. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se acopla de forma covalente a la parte de afinidad. En algunas realizaciones, el oligonucleótido es un oligonucleótido sintetizado. En realizaciones preferidas, un oligonucleótido no interactúa sustancialmente con un analito diana de la parte de afinidad directamente.
El oligonucleótido acoplado a la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender una o más secuencias de código de barras. Por ejemplo, el oligonucleótido acoplado a la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender una secuencia de ID de antígeno (AID) y una secuencia de código de barras molecular de antígeno (AMB). Un oligonucleótido puede comprender una secuencia de ID de antígeno (AID), una secuencia de fusión, un sitio del cebador, una secuencia de código de barras molecular, una secuencia constante o cualquier combinación de los mismos.
El oligonucleótido puede contener una modificación química para permitir la conjugación con la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido (por ejemplo, amina, tiol o biotina).
Un oligonucleótido puede comprender una pluralidad de oligonucleótidos. La pluralidad de oligonucleótidos puede estar compuesta por una pluralidad de conjugados de afinidad-oligonucleótido. Por ejemplo, un oligonucleótido puede comprender una pluralidad de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 25000 o 30000 oligonucleótidos . Por ejemplo, una pluralidad de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 25000 o 30000 oligonucleótidos pueden estar compuestos por una pluralidad de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 25000 o 30000 conjugados de afinidad-oligonucleótido.
Un oligonucleótido puede comprender una secuencia de código de barras de oligonucleótidos, una secuencia de fusión de oligonucleótidos, una secuencia de unión al cebador de oligonucleótidos, una secuencia constante de oligonucleótidos o cualquier combinación de las mismas.
Secuencia de ID del antígeno (AID) de oligonucleótido
Un oligonucleótido puede comprender una secuencia de código de barras del antígeno de oligonucleótido o complemento de la misma. Un código de barras del antígeno de oligonucleótido puede permitir la identificación de un complejo de afinidad-oligonucleótido que comprende el código de barras del antígeno de oligonucleótido. Un código de barras del antígeno de oligonucleótido puede permitir la identificación de una parte de afinidad a la que está unido el código de barras del antígeno de oligonucleótido. Se puede utilizar un código de barras del antígeno de oligonucleótido para identificar una parte de afinidad de una pluralidad de partes de afinidad diferentes que se une a diferentes analitos diana. Un código de barras del antígeno de oligonucleótido puede codificarse con código de barras a un complejo de afinidad-oligonucleótido exclusivamente. Un código de barras del antígeno de oligonucleótido puede codificarse con código de barras a una parte de afinidad exclusivamente. Por lo tanto, una secuencia de código de barras de antígeno de oligonucleótido se puede codificar con código de barras a una parte de afinidad específica.
Un código de barras de antígeno de oligonucleótido puede ser una secuencia de código de barras única. Por ejemplo, cualquier código de barras de antígeno de oligonucleótido de una pluralidad de códigos de barras de antígeno de oligonucleótido puede ser una secuencia de código de barras única. El número de secuencias de códigos de barras de antígenos diferentes teóricamente posibles puede depender directamente de la longitud de la secuencia de códigos de barras. Por ejemplo, si se puede utilizar un código de barras de ADN con nucleótidos de adenina, timidina, guanosina y citidina ensamblados aleatoriamente, el número máximo teórico de secuencias de códigos de barras posibles puede ser 1.048.576 para una longitud de diez nucleótidos y puede ser 1.073.741.824 para una longitud de quince nucleótidos. Una secuencia de código de barras de antígeno de oligonucleótido puede comprender una secuencia de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 45 o 50 o más nucleótidos consecutivos. Un oligonucleótido puede comprender dos o más secuencias de códigos de barras de antígenos de oligonucleótidos o complementos de las mismas. Una secuencia de código de barras de antígeno de oligonucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos ensamblada aleatoriamente. Una secuencia de código de barras de antígeno de oligonucleótido puede ser una secuencia degenerada. Una secuencia de código de barras de antígeno de oligonucleótido puede ser una secuencia conocida. Una secuencia de código de barras de antígeno de oligonucleótido puede ser una secuencia predefinida. En una realización preferida, una secuencia de código de barras de antígeno de oligonucleótido es una secuencia única conocida que tiene un código de barras en una parte de afinidad a la que se acopla de tal manera que se puede usar una señal que contiene el código de barras de antígeno de oligonucleótido (por ejemplo, una lectura de secuencia) o un su complemento para identificar una parte de afinidad de una pluralidad de diferentes partes de afinidad que interactúan con diferentes analitos diana.
Por ejemplo, el oligonucleótido acoplado a la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender un código de barras que es una secuencia de ID de antígeno (AID). La secuencia de AID se puede codificar con código de barras a la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido. La secuencia de AID puede tener un código de barras para el antígeno al que se dirige la parte de afinidad. La secuencia de AID se puede usar para identificar la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido y/o el antígeno al que se dirige la parte de afinidad. Por ejemplo, la secuencia de AID puede tener un código de barras para el anticuerpo de un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido. Por ejemplo, la secuencia de AID puede tener un código de barras para el antígeno al que se dirige el anticuerpo de un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido. Por ejemplo, la secuencia de AID se puede usar para inmunofenotipificar células. Por ejemplo, la secuencia de AID puede tener un código de barras para el péptido de un complejo de MHC-péptido.
La secuencia de AID puede ser única para cada antígeno dirigido por la parte de afinidad de los conjugados de afinidad-oligonudeótido. La secuencia de AID puede ser única para la parte de afinidad de los conjugados de afinidad-oligonudeótido. Por ejemplo, la secuencia de AID puede ser única para cada anticuerpo que se une específicamente a un antígeno diana diferente de una célula. En algunas realizaciones, la secuencia de AID es una secuencia definida. En algunas realizaciones, la secuencia de AID es una secuencia conocida. La secuencia de AID para cada oligonucleótido puede determinarse secuenciando el oligonucleótido o los productos de amplificación del oligonucleótido, por ejemplo, mediante secuenciación de próxima generación.
Secuencia de código de barras molecular de oligonucleótidos
Un oligonucleótido puede comprender una secuencia de código de barras molecular de oligonucleótido o complemento de la misma. Un código de barras de oligonucleótido puede permitir la identificación de una molécula de un complejo de afinidad-oligonucleótido que comprende el código de barras de oligonucleótido. Un código de barras molecular de oligonucleótido puede codificarse a una molécula de un complejo de afinidad-oligonucleótido exclusivamente. Un código de barras molecular de oligonucleótido se puede codificar a una molécula de una parte de afinidad exclusivamente. Por lo tanto, una secuencia de código de barras molecular de oligonucleótido se puede codificar a una molécula específica de una parte de afinidad.
Un código de barras molecular de oligonucleótido puede ser una secuencia de código de barras única. Por ejemplo, cualquier código de barras molecular de oligonucleótido de una pluralidad de códigos de barras moleculares de oligonucleótidos puede ser una secuencia de código de barras única. El número de secuencias de códigos de barras moleculares diferentes teóricamente posibles puede depender directamente de la longitud de la secuencia de códigos de barras. Por ejemplo, si se puede utilizar un código de barras de ADN con nucleótidos de adenina, timidina, guanosina y citidina ensamblados aleatoriamente, el número máximo teórico de secuencias de códigos de barras posibles puede ser 1.048.576 para una longitud de diez nucleótidos y puede ser 1.073.741.824 para una longitud de quince nucleótidos. Una secuencia de código de barras molecular de oligonucleótido puede comprender una secuencia de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 45 o 50 o más nucleótidos consecutivos. Un oligonucleótido puede comprender dos o más secuencias de códigos de barras moleculares de oligonucleótidos o complementos de las mismas. Una secuencia de código de barras molecular de oligonucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos ensamblada aleatoriamente. Una secuencia de código de barras molecular de oligonucleótido puede ser una secuencia degenerada. Una secuencia de código de barras molecular de oligonucleótido puede ser una secuencia conocida. Una secuencia de código de barras molecular de oligonucleótido puede ser una secuencia predefinida. En una realización preferida, una secuencia de código de barras molecular de oligonucleótido es una secuencia única que se puede usar para identificar una molécula de parte de afinidad de una pluralidad de moléculas de parte de afinidad que interactuaron con un analito diana.
Por ejemplo, el oligonucleótido acoplado a la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender un código de barras que es una secuencia de código de barras molecular de antígeno (AMB). Una secuencia de código de barras molecular de antígeno (AMB) puede ser única para cada molécula de oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido. Una secuencia de AMB puede permitir el recuento del número de moléculas de oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido que se unen a un antígeno, tal como un antígeno de una célula individual en un recipiente, por ejemplo, una gotita de emulsión. La secuencia de AMB para cada oligonucleótido puede determinarse secuenciando el oligonucleótido o los productos de amplificación del oligonucleótido, por ejemplo, mediante secuenciación de próxima generación.
Secuencia de fusión de oligonucleótidos
El oligonucleótido acoplado a la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender una secuencia de fusión. La secuencia de fusión puede permitir la extensión por PCR de una secuencia de código de barras específica de gotitas en el oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido, por ejemplo, un conjugado de afinidad-oligonucleótido unido a la superficie celular. La secuencia de fusión de cada oligonucleótido de una pluralidad de oligonucleótidos puede ser idéntica. La secuencia de fusión puede comprender una secuencia que es complementaria a una secuencia de un código de barras de gotitas. En algunas realizaciones, la secuencia de fusión se ubica al final del oligonucleótido. En algunas realizaciones, la secuencia de fusión al final del oligonucleótido no se conjuga directamente con una parte de afinidad del conjugado anticuerpo-oligonucleótido. En algunas realizaciones, la secuencia de fusión al final del oligonucleótido comprende un extremo libre.
La secuencia de fusión puede comprender una región complementaria a una región de un polinucleótido marcador en 3', tal como un polinucleótido que comprende un código de barras del recipiente. La secuencia de fusión puede comprender una región complementaria a un complemento de la región del polinucleótido, tal como un polinucleótido que comprende un código de barras del recipiente. Por ejemplo, la secuencia de fusión puede comprender una región 3', tal como una región terminal 3', que es complementaria a un polinucleótido marcador en 3' o un complemento del mismo que contiene un código de barras, tal como un código de barras del recipiente.
Un polinucleótido marcador en 3' puede ser un polinucleótido utilizado para añadir ácidos nucleicos a un extremo 3' de un polinucleótido diana, tal como un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonudeótido. Un polinucleótido marcador en 3' puede ser un polinucleótido utilizado como molde para añadir ácidos nucleicos a un extremo 3' de un polinucleótido diana, tal como un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido. Un polinucleótido marcador en 3' puede ser un polinucleótido que se hibrida con un extremo 3' de un polinucleótido diana, tal como un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido. Un polinucleótido marcador en 3' puede ser un polinucleótido que contiene una región 3', tal como una región terminal 3', que se hibrida con un extremo 3' de un polinucleótido diana, tal como un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido.
En algunas realizaciones, un polinucleótido marcador en 3' es un polinucleótido con código de barras del recipiente. El código de barras del recipiente se puede añadir al oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido. Por ejemplo, el código de barras del recipiente se puede hibridar con el oligonucleótido del conjugado de afinidadoligonucleótido. Un polinucleótido con código de barras del recipiente puede comprender una región 3', tal como una región terminal 3', que se hibrida con un extremo 3' de un oligonucleótido de un conjugado de afinidadoligonucleótido.
En algunas realizaciones, un polinucleótido marcador en 3' es un producto amplificado. En algunas realizaciones, un polinucleótido marcador en 3' es un producto amplificado que se origina a partir de una sola molécula. En algunas realizaciones, un polinucleótido marcador en 3' es un producto amplificado de un polinucleótido con código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, un polinucleótido marcador en 3' es un producto amplificado que se origina a partir de un polinucleótido con código de barras de un solo recipiente. La región 5' a la región 3' que hibrida con un extremo 3' de un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender una región complementaria a un cebador o complemento del mismo. La región 5' a la región 3' que hibrida con un extremo 3' de un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender una región complementaria a un cebador que se puede usar para amplificar el oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido. Por ejemplo, un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador que es complementario de la región 5' a la región 3' que se hibrida con un extremo 3' de un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido o un complemento del mismo y un segundo cebador que es complementario al sitio del cebador del oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido se puede usar para amplificar el oligonucleótido de un conjugado de afinidadoligonucleótido.
La región 5' a la región 3' que hibrida con un extremo 3' de un oligonucleótido de un conjugado de afinidadoligonucleótido puede comprender una región complementaria a un cebador o complemento del mismo que se usó para amplificar el polinucleótido con código de barras del recipiente.
Una secuencia de fusión de oligonucleótidos puede ser al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos consecutivos. Una secuencia de fusión de oligonucleótidos puede ser una secuencia de longitud conocida. Una secuencia de fusión de oligonucleótidos puede ser una secuencia conocida. Una secuencia de fusión de oligonucleótidos puede ser una secuencia predefinida. Una secuencia de fusión de oligonucleótidos puede ser una secuencia desconocida de longitud conocida. Una secuencia de fusión de oligonucleótidos puede ser una secuencia conocida de longitud conocida.
Secuencia constante de oligonucleótidos
El oligonucleótido acoplado a la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender una secuencia constante. La secuencia constante es opcional. La secuencia constante de cada oligonucleótido de una pluralidad de conjugados de afinidad-oligonucleótido puede ser idéntica.
Se puede usar una secuencia constante de oligonucleótidos para aumentar la longitud del oligonucleótido o separar uno o más de un código de barras de oligonucleótidos, fusión de oligonucleótidos y un sitio de unión del cebador de oligonucleótidos entre sí. En algunas realizaciones, un oligonucleótido no comprende una secuencia constante de oligonucleótidos. Por ejemplo, un oligonucleótido se puede acoplar a una parte de afinidad en un extremo del oligonucleótido que comprende un sitio de unión del cebador de oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, una secuencia constante de oligonucleótidos se une a una parte de afinidad de un complejo de afinidad-oligonucleótidos. En algunas realizaciones, una constante de oligonucleótidos se ubica cadena arriba de una secuencia de unión de cebador de oligonucleótidos. Por ejemplo, una secuencia constante de oligonucleótidos se puede ubicar en 5' de una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, una constante de oligonucleótidos se ubica cadena abajo de una secuencia de unión de cebador de oligonucleótidos. Por ejemplo, una secuencia constante de oligonucleótidos se puede ubicar en 3' de una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, una constante de oligonucleótidos se encuentra cadena arriba de un código de barras de oligonucleótidos. Por ejemplo, una secuencia constante de oligonucleótidos se puede ubicar en 5' de un código de barras de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, una constante de oligonucleótidos se ubica cadena abajo de un código de barras de oligonucleótidos. Por ejemplo, una secuencia constante de oligonucleótidos se puede ubicar en 3' de un código de barras de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, una constante de oligonucleótidos se ubica cadena arriba de una secuencia de fusión de oligonucleótidos. Por ejemplo, una secuencia constante de oligonucleótidos se puede ubicar en 5' de una secuencia de fusión de oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, se interpone una secuencia constante de oligonucleótidos entre una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos y una parte de afinidad de un complejo de afinidad-oligonucleótidos. Por ejemplo, una secuencia constante de oligonucleótidos puede situarse a 5' de una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos y unirse a una parte de afinidad de un oligonucleótido. En algunas realizaciones, se interpone una secuencia constante de oligonucleótidos entre una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos y un código de barras de oligonucleótidos. Por ejemplo, una secuencia constante de oligonucleótidos se puede ubicar en 3' de una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos y en 5' de un código de barras de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, se interpone una constante de oligonucleótidos entre una secuencia de fusión de oligonucleótidos y un código de barras de oligonucleótidos. Por ejemplo, una secuencia constante de oligonucleótidos se puede ubicar en 3' de un código de barras de oligonucleótidos y en 5' de una secuencia de fusión de oligonucleótidos.
Una secuencia constante de oligonucleótidos puede ser al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 250, 300, 400, 500 o más nucleótidos consecutivos. Una secuencia constante de oligonucleótidos puede comprender una secuencia no aleatoria de nucleótidos. Una secuencia constante de oligonucleótidos puede ser una secuencia de longitud conocida. Una secuencia constante de oligonucleótidos puede ser una secuencia conocida. Una secuencia constante de oligonucleótidos puede ser una secuencia predefinida. Una secuencia constante de oligonucleótidos puede ser una secuencia desconocida de longitud conocida. Una secuencia constante de oligonucleótidos puede ser una secuencia conocida de longitud conocida.
Sitio de unión del cebador de oligonucleótidos
El oligonucleótido acoplado a la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido puede comprender un sitio del cebador. El sitio del cebador puede comprender una secuencia que sea complementaria a un cebador, tal como un cebador de amplificación. Se puede usar una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos como sitio de unión del cebador para una reacción, tal como amplificación o secuenciación. Una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos puede ser una primera secuencia de unión del cebador para un par de cebadores usados para una reacción, tal como amplificación o secuenciación. Por ejemplo, una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos puede ser un sitio de unión del cebador directo. Por ejemplo, un sitio de unión del cebador de oligonucleótidos puede ser un sitio de unión del cebador inverso. Por ejemplo, un sitio de unión del cebador de oligonucleótido puede ser un sitio de unión del cebador directo y una secuencia de unión del cebador de un polinucleótido con código de barras del recipiente unido al oligonucleótido puede ser una secuencia de unión del cebador inverso. En algunas realizaciones, una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos es una secuencia de unión del cebador universal.
Una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos y una secuencia de unión del cebador de un polinucleótido unido al oligonucleótido (por ejemplo, de un polinucleótido con código de barras del recipiente) pueden comprender temperaturas de fusión que difieren en no más de 6, 5, 4, 3, 2 o 1 grado Celsius. La secuencia de nucleótidos de una secuencia de unión del cebador de oligonucleótido y la secuencia de unión del cebador de un polinucleótido unido al oligonucleótido pueden diferir de tal manera que un polinucleótido que se hibrida con la secuencia de unión del cebador del oligonucleótido no se hibrida con la secuencia de unión del cebador del polinucleótido unido al oligonucleótido. La secuencia de nucleótidos de una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos y una secuencia de unión del cebador de un polinucleótido unido al oligonucleótido pueden diferir de tal manera que un polinucleótido que se hibrida con la secuencia de unión del cebador de un polinucleótido unido al oligonucleótido no se hibrida con la secuencia de unión del cebador del oligonucleótido.
Disposición de elementos de oligonucleótidos
Un oligonucleótido se puede disponer en un orden tal que una secuencia de fusión de oligonucleótidos esté ubicada en un extremo del oligonucleótido. Un oligonucleótido se puede disponer en un orden tal que contenga un código de barras del oligonucleótido cadena arriba de la secuencia de fusión de oligonucleótidos. Un oligonucleótido se puede disponer en un orden tal que contenga una secuencia de unión del cebador de oligonucleótido cadena arriba del código de barras del oligonucleótido. Un oligonucleótido se puede disponer en un orden tal que una secuencia constante de oligonucleótidos esté ubicada cadena arriba o cadena abajo de la secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos. Un oligonucleótido se puede disponer en un orden tal que una secuencia constante de oligonucleótidos esté ubicada cadena arriba de la secuencia de código de barras del oligonucleótido. Un oligonucleótido se puede disponer en un orden tal que una secuencia constante de oligonucleótidos esté ubicada en un extremo del oligonucleótido, por ejemplo, un extremo del oligonucleótido que no contiene la secuencia de fusión de oligonucleótidos. Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en el orden de la secuencia de fusión de oligonucleótidos, la secuencia de código de barras de oligonucleótidos, la secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos y la secuencia constante de oligonucleótidos. Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en el orden de la secuencia de fusión de oligonucleótidos, la secuencia de código de barras de oligonucleótidos, la secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos y la secuencia constante de oligonucleótidos que se propaga hacia desde la parte de afinidad. Por ejemplo, un oligonucleótido se puede disponer en el orden de la secuencia de fusión de oligonucleótidos, la secuencia de código de barras de oligonucleótidos, la secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos y la secuencia constante de oligonucleótidos desde el extremo 5' hasta el extremo 3' o desde el extremo 3' hasta el extremo 5'. Por ejemplo, un oligonucleótido puede comprender una secuencia de fusión de oligonucleótidos en el extremo 5', una secuencia de código de barras de oligonucleótidos única, una secuencia de unión del cebador de oligonucleótidos inverso y una secuencia constante de oligonucleótidos en 3' unida a una parte de afinidad (por ejemplo, a través de un grupo amina primaria unido a el extremo 3') en ese orden. Por ejemplo, un oligonucleótido unido a una parte de afinidad se puede disponer, propagándose hacia la parte de afinidad, en el orden de la secuencia de fusión de oligonucleótidos, la secuencia de código de barras de oligonucleótidos, la secuencia constante del oligonucleótidos y la secuencia del sitio de unión del cebador de oligonucleótidos.
Un oligonucleótido se puede disponer en un orden tal que una secuencia de fusión se sitúe en un extremo del oligonucleótido. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que una secuencia de fusión se sitúe cadena abajo de una secuencia de AID. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que una secuencia de fusión se sitúe cadena abajo de una secuencia de AMB. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que una secuencia de fusión se sitúe cadena abajo de una secuencia constante. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que una secuencia de fusión se sitúe cadena abajo de un sitio del cebador.
Un oligonucleótido se puede disponer en un orden tal que un sitio del cebador se sitúe en un extremo del oligonucleótido. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que un sitio del cebador esté situado cadena arriba de una secuencia de AID. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que un sitio del cebador esté situado cadena arriba de una secuencia de AMB. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que un sitio del cebador esté situado cadena arriba de una secuencia constante. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que un sitio del cebador esté situado cadena arriba de una secuencia de fusión.
Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que contenga una secuencia de AID cadena arriba de la secuencia de fusión. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que contenga una secuencia de AID cadena abajo del sitio del cebador. Una secuencia de AID puede situarse cadena arriba o cadena abajo de una secuencia de AMB. Una secuencia de AID puede situarse cadena arriba o cadena abajo de una secuencia constante. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que contenga una secuencia de AID entre una secuencia de fusión y un sitio del cebador.
Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que contenga una secuencia de AMB cadena arriba de la secuencia de fusión. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que contenga una secuencia de AMB cadena abajo del sitio del cebador. Una secuencia de AMB puede situarse cadena arriba o cadena abajo de una secuencia de AID. Una secuencia de AMB puede situarse cadena arriba o cadena abajo de una secuencia constante. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que contenga una secuencia de AMB entre una secuencia de fusión y un sitio del cebador.
Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que contenga una secuencia constante cadena arriba de la secuencia de fusión. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que contenga una secuencia constante cadena arriba del sitio del cebador. Una secuencia constante puede situarse cadena arriba o cadena abajo de una secuencia de AID. Una secuencia constante puede situarse cadena arriba o cadena abajo de una secuencia de AMB. Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que contenga una secuencia constante entre una secuencia de fusión y un sitio del cebador.
Un oligonucleótido puede disponerse en un orden tal que una secuencia de AMB y/o una secuencia de AID no estén ubicadas en un extremo del oligonucleótido, por ejemplo, un extremo del oligonucleótido que contiene la secuencia de fusión o el sitio del cebador. Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en un orden de la secuencia de fusión, la secuencia de AID, la secuencia de AMB y el sitio del cebador. Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en un orden de la secuencia de fusión, la secuencia de AMB, la secuencia de AID y el sitio del cebador.
Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en un orden de la secuencia de fusión, la secuencia de AID, la secuencia de AMB, la secuencia constante y el sitio del cebador. Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en un orden de la secuencia de fusión, la secuencia de AMB, la secuencia de AID, la secuencia constante y el sitio del cebador. Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en un orden de la secuencia de fusión, la secuencia constante, la secuencia de AID, la secuencia de AMB y el sitio del cebador. Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en un orden de la secuencia de fusión, la secuencia constante, la secuencia de AMB, la secuencia de AID y el sitio del cebador. Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en un orden de la secuencia de fusión, la secuencia de AID, la secuencia constante, la secuencia de AMB y el sitio del cebador. Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en un orden de la secuencia de fusión, la secuencia de AMB, la secuencia constante, la secuencia de AID y el sitio del cebador.
Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en un orden de la secuencia de fusión, la secuencia de AID, la secuencia de AMB, la secuencia constante y el sitio del cebador, propagándose hacia la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonudeótido. Por ejemplo, un oligonucleótido puede disponerse en el orden de la secuencia de fusión, la secuencia de AID, la secuencia de AMB, la secuencia constante y el sitio del cebador, desde el extremo 5' hasta el extremo 3' del oligonucleótido. Por ejemplo, un oligonucleótido puede comprender una secuencia de fusión del extremo 5', una secuencia de AID, una secuencia de AMB, una secuencia constante y un sitio del cebador 3' unido a una parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido (por ejemplo, a través de un grupo amina primaria de un anticuerpo unido al extremo 3' del oligonucleótido) en ese orden.
Preparación del conjugado de afinidad-oligonucleótido
Los conjugados de afinidad-oligonucleótido empleados en los métodos y composiciones descritos en la presente se pueden preparar usando cualquier método conveniente. Una parte de afinidad se puede acoplar directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un enlazador) a un oligonucleótido. Una parte de afinidad se puede acoplar de forma covalente (por ejemplo, mediante reticulación química) o no covalente (por ejemplo, mediante estreptavidina-biotina) a un oligonucleótido. El diseño y la preparación de conjugados de afinidad-oligonucleótido se describen ampliamente en la técnica, incluidas varias partes de afinidad diferentes que pueden usarse, el diseño de oligonucleótidos para ensayos de ligación por proximidad y el acoplamiento de tales oligonucleótidos a las partes de afinidad para formar los conjugados de afinidad-oligonucleótidos. Los detalles y principios descritos en la técnica se pueden aplicar al diseño de los conjugados de afinidad-oligonucleótido para su uso en los métodos de la invención (véase, por ejemplo, el documento WO2007107743 y las patentes de Estados Unidos n. ° 7.306.904 y 6.878.515).
Se puede utilizar una reacción de acoplamiento directo entre un oligonucleótido y una parte de afinidad, por ejemplo, donde cada uno posee un grupo funcional (por ejemplo, un sustituyente o identificador químico) capaz de reaccionar con un grupo funcional en el otro. Los grupos funcionales pueden estar presentes en el oligonucleótido o la parte de afinidad, o pueden introducirse en estos componentes (por ejemplo, mediante reacciones de oxidación, reacciones de reducción, reacciones de escisión y similares). Se han descrito métodos para producir conjugados de ácido nucleico/polipéptido (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n. ° 5.733.523).
Los grupos funcionales de un anticuerpo o un polipéptido que pueden usarse para acoplarse a un oligonucleótido incluyen, entre otros, carbohidratos, grupos tiol (HS-) de aminoácidos, grupos amina (H2N-) de aminoácidos y grupos carboxi de aminoácidos. Por ejemplo, las estructuras de carbohidrato pueden oxidarse a aldehidos y reaccionar con un compuesto que contiene un grupo H2NNH para formar el grupo funcional -C=NH-NH-. Por ejemplo, los grupos tiol se pueden hacer reaccionar con un grupo reactivo con tiol para formar un tioéter o disulfuro. Por ejemplo, los grupos tiol libres de proteínas pueden introducirse en proteínas mediante tiolación o división de disulfuros en residuos de cisteína natural. Por ejemplo, un grupo amino (por ejemplo, de un extremo amino o un grupo amino omega de un residuo de lisina) puede reaccionar con un grupo electrofílico (por ejemplo, un grupo carboxi activado) para formar un grupo amida. Por ejemplo, un grupo carboxi (por ejemplo, un extremo carboxi o un grupo carboxi de un alfa aminoácido diácido) puede activarse y ponerse en contacto con un grupo amino para formar un grupo amida. Otros grupos funcionales ejemplares incluyen, por ejemplo, SPDP, carbodiimida, glutaraldehído y similares.
En una realización ejemplar, un oligonucleótido se acopla covalentemente a una parte de afinidad usando un kit comercial ("All-in-One Antibody-Oligonucleotido Conjugation Kit"; Solulink, Inc.). Por ejemplo, en primer lugar, se puede derivatizar un 3'-amino-oligonucleótido con Sulfo-S-4FB. En segundo lugar, se puede modificar una parte de afinidad con un grupo S-HyNic. En tercer lugar, la parte de afinidad modificada con HyNic se puede hacer reaccionar con el oligonucleótido modificado con 4FB para producir un conjugado de afinidad-oligonucleótido mediado por bisarilhidrazona. El exceso de oligonucleótido modificado con 4FB se puede eliminar aún más a través de una matriz de afinidad magnética. La recuperación de la parte de afinidad general puede ser de al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % libre de la parte de afinidad modificada con HyNic y oligonucleótido modificado con 4FB. El enlace de bis-arilhidrazona puede ser estable tanto al calor (por ejemplo, 94 °C) como al pH (por ejemplo, 3­ 10).
Cuando se emplean grupos de enlace, dichos enlazadores pueden elegirse para proporcionar unión covalente o unión no covalente de la parte de afinidad y oligonucleótido a través del grupo de enlace. Se conocen en la técnica diversos enlazadores adecuados. En algunas realizaciones, el enlazador es al menos aproximadamente 50 o 100 Daltons 100 Daltons. En algunas realizaciones, el enlazador es como máximo aproximadamente 300; 500; 1.000; 10.000 o 100.000 Daltons. Un enlazador puede comprender un grupo funcional en cualquiera de los extremos con una funcionalidad reactiva capaz de unirse al oligonucleótido. Un enlazador puede comprender un grupo funcional en cualquiera de los extremos con una funcionalidad reactiva capaz de unirse a la parte de afinidad. Los grupos funcionales pueden estar presentes en el oligonucleótido, la parte de afinidad y/o el enlazador, o pueden introducirse en estos componentes (por ejemplo, mediante reacciones de oxidación, reacciones de reducción, reacciones de escisión y similares).
Los enlazadores ejemplares incluyen polímeros, cadenas hidrocarbonadas alifáticas, cadenas hidrocarbonadas insaturadas, polipéptidos, polinucleótidos, enlazadores cíclicos, enlazadores acíclicos, carbohidratos, éteres, poliaminas y otros conocidos en la técnica. Los grupos funcionales ejemplares de conectores incluyen grupos funcionales nucleofílicos (por ejemplo, aminas, grupos amino, grupos hidroxi, grupos sulfhidrilo, grupos amino, alcoholes, tioles e hidrazidas), grupos funcionales electrofílicos (por ejemplo, aldehídos, ésteres, vinilcetonas, epóxidos, isocianatos, y maleimidas), y grupos funcionales capaces de reacciones de cidoadición, que forman enlaces disulfuro o se unen a metales. Por ejemplo, los grupos funcionales de los enlazadores pueden ser aminas primarias, aminas secundarias, ácidos hidroxámicos, ésteres de N-hidroxisuccinimidilo, carbonatos de N-hidroxisuccinimidilo, oxicarbonilimidazoles, ésteres de nitrofenilo, ésteres de trifluoroetilo, éteres de glicidilo, vinilsulfonas, maleimidas, azidobenzoilhidrazida, N-[4-(p-azidosalicilamino)butil]-3'-[2'-piridilditio]propionamida), suberato de bis-sulfosuccinimidilo, dimetiladipimidato, tartrato de disuccinimidilo, éster de N-maleimidobutiriloxisuccinimida, N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato, [4-azido-fenil]-1,3'-ditiopropionato de N-succinimidilo, [4-yodoacetil]aminobenzoato de N-succinimidilo, glutaraldehído y succinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato, éster de N-hidroxisuccinimida (SPDP) de ácido 3-(2-piridilditio)propiónico, éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxílico (SMCC) y similares.
En otras realizaciones, los conjugados de afinidad-oligonucleótido se pueden producir utilizando protocolos in vitro que producen conjugados de afinidad-oligonucleótido, por ejemplo producen la parte de afinidad in vitro a partir de vectores que codifican la parte de afinidad. Ejemplos de tales protocolos in vitro de interés incluyen: Protocolos basados en RepA (véase, por ejemplo, Fitzgerald et al., Drug Discov Today (2000) 5:253-58 and WO9837186), protocolos basados en visualización de ribosomas (véase, por ejemplo, Hanes et al., PNAS (1997) 94:4937-42; Roberts et al., Curr Opin Chem Biol (1999) Jun; 3: 268-73; Schaffitzel et al., J Immunol Methods (1999) dic 10; 231:119-35; y WO9854312), etc.
Las técnicas para conjugar moléculas de ácido nucleico con anticuerpos son muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Anion et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drags In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); y Thorpe et al, 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58. Véase también, por ejemplo, la publicación PCT WO 89/12624.) Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico se puede unir covalentemente a lisinas o cisteínas en el anticuerpo, por ejemplo a través de la funcionalidad éster de N-hidroxisuccinimida o maleimida, respectivamente.
Antígenos diana
Un antígeno diana de una parte de afinidad puede ser una molécula de ácido nucleico o puede ser proteináceo, tal como una proteína o péptido diana. Un antígeno diana puede ser un compuesto o composición que está presente en una célula de una muestra. En algunas realizaciones, un antígeno diana puede ser un compuesto o una composición capaz de provocar una respuesta inmunitaria mediada por células (es decir, una respuesta inmunitaria adaptativa), en particular en un mamífero, tal como un ser humano. En algunas realizaciones, un linfocito T puede reconocer un antígeno diana en el contexto de la molécula de MHC. Los antígenos diana incluyen, entre otros, células, extractos de tejidos, lisados de tejidos o células, proteínas, individualmente o como una mezcla, una pluralidad de proteínas, péptidos, mezclas de péptidos, lípidos, carbohidratos, azúcares y similares. Un antígeno diana puede ser característico de una enfermedad, tal como una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmunitaria o un cáncer. Un antígeno diana puede ser, por ejemplo, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno canceroso, etc.
En algunas realizaciones, un antígeno diana es un antígeno viral. Los antígenos virales incluyen, por ejemplo, una proteína de cubierta viral, un antígeno viral de influenza, un antígeno de VIH, un antígeno de hepatitis B o un antígeno de hepatitis C.
En algunas realizaciones, un antígeno diana es un antígeno canceroso (por ejemplo, proteína, péptido, lípido, carbohidrato, etc.) que se expresa única o predominantemente o sobreexpresa por una célula tumoral o célula cancerosa, de modo que el antígeno se asocia con el tumor o cáncer. Un antígeno canceroso puede ser un antígeno canceroso de un solo tipo de cáncer o tumor, de modo que el antígeno canceroso está asociado con o es característico de solo un tipo de cáncer o tumor. Como alternativa, un antígeno canceroso puede ser un antígeno canceroso (por ejemplo, puede ser característico) de más de un tipo de cáncer o tumor. Por ejemplo, un antígeno canceroso puede expresarse tanto en células de cáncer de mama como de próstata y no expresarse en absoluto en células normales, no tumorales o no cancerosas, o expresarse solo mínimamente. Un antígeno canceroso puede ser un antígeno canceroso de melanoma o un antígeno canceroso de mama. Los antígenos cancerosos ejemplares incluyen los del grupo que consiste en gp100. MART-1, NY-ESO-1, un miembro de la familia de proteínas MAGE, por ejemplo, MAGE-A1, mesotelina, tirosinasa, TRP-1, TRP-2, PMSA, Her-2 y p53.
Un antígeno diana puede producirse de forma natural, artificial, sintética o recombinante. Por lo tanto, un antígeno diana puede ser una proteína, polipéptido o péptido sintético, recombinante, aislado y/o purificado. Los métodos para preparar u obtener dichos antígenos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos adecuados de síntesis de novo de polipéptidos y proteínas (por ejemplo, polipéptidos y proteínas antigénicos) se describen Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press. Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press. Oxford. Reino Unido, 2000; y patente de Estados Unidos n. ° 5.449.752. Además, los polipéptidos y proteínas (por ejemplo, polipéptidos y proteínas antigénicos) se pueden producir de forma recombinante usando ácidos nucleicos que codifican el polipéptido o la proteína mediante el uso de métodos recombinantes convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.° ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Las secuencias de nucleótidos de muchos antígenos se conocen en la técnica y están disponibles en la base de datos GenBank del sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Además, un antígeno puede aislarse y/o purificarse de una fuente, como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, por ejemplo, una rata, un ser humano, etc. Los métodos de aislamiento y purificación son muy conocidos en la técnica.
Un antígeno puede ser un antígeno libre, por ejemplo, un péptido antigénico no unido (por ejemplo, un péptido libre), o puede ser un antígeno unido, por ejemplo, un tetrámero de MHC-péptido o un péptido antigénico presentado por una célula portadora que se pulsó con el péptido.
En algunas realizaciones, un analito diana es una proteína unida a la membrana. En una realización, la proteína unida a la membrana es CD4, una proteína de membrana de tipo I clásica con un único dominio transmembrana (TM). (Carr et al., (1989) J. Biol. chem. 264:21286-95). En otra realización, la proteína unida a la membrana es GPR77, una proteína de membrana del receptor acoplado a proteína G (GPCR) de múltiples extensiones. (Cain & Monk, (2002) J. Biol. Chem. 277:7165-69).
Ejemplos adicionales de proteínas unidas a la membrana incluyen, entre otros, GPCR (por ejemplo, receptores adrenérgicos, receptores de angiotensina, receptores de colecistoquinina, receptores de acetilcolina muscarínicos, receptores de neurotensina, receptores de galanina, receptores de dopamina, receptores de opioides, receptores de erotonina, receptores de somatostatina, etc.), canales iónicos (por ejemplo, receptores nicotínicos de acetilcolina, canales de sodio, canales de potasio, etc.), receptores de tirosina quinasas, receptores de serina/treonina quinasas, receptores de guanilato ciclasas, receptores de factores de crecimiento y hormonales (por ejemplo, receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF)) y otros. También se pueden usar variantes mutantes o modificadas de proteínas unidas a la membrana. Por ejemplo, algunas mutaciones puntuales únicas o múltiples de los GPCR conservan la función y están implicadas en la enfermedad (véase, por ejemplo, Stadel et al., (1997) Trends in Pharmacological Review 18:430-37).
Caracterización de células individuales, codificación de barras de polinucleótidos celulares y emparejamiento de cadenas
Los métodos descritos en la presente pueden comprender la caracterización de células utilizando conjugados de afinidad-oligonucleótido. Se puede poner en contacto una pluralidad de células con uno o más conjugados de afinidad-oligonucleótido. Las células se pueden lavar para eliminar los conjugados no unidos. Las células se pueden aislar en recipientes como células individuales. Los conjugados de afinidad-oligonucleótido unidos a células aisladas se pueden modificar para que contengan una secuencia de código de barras del recipiente, por ejemplo, uniendo un polinucleótido con código de barras del recipiente al oligonucleótido de los conjugados.
También se puede introducir un polinucleótido que alberga un código de barras del recipiente durante la formación de los recipientes. Estos polinucleótidos con código de barras del recipiente pueden llevar códigos de barras degenerados, de modo que cada oligonucleótido que contiene un código de barras del recipiente contiene un código de identidad único correspondiente al recipiente en el que se encuentran.
Los oligonucleótidos se pueden amplificar y los productos amplificados de la reacción se pueden recuperar de los recipientes. Los productos amplificados pueden enriquecerse mediante PCR para añadir marcadores de secuenciación de próxima generación (NGS). El banco puede secuenciarse usando una plataforma de secuenciación de alto rendimiento seguida de un análisis de las secuencias con códigos de barras del recipiente y/o secuencias de AID y/o secuencias de AMB. Debido a que cada célula individual se aísla en su recipiente respectivo, para cada código de barras del recipiente observado dos veces, los productos de oligonucleótidos amplificados secuenciados se originaron a partir del mismo recipiente y, por lo tanto, en una sola célula única. Debido a que cada AID de un oligonucleótido tiene un código de barras para la parte de afinidad del conjugado de afinidadoligonucleótido al que está unido y cada célula individual se aísla en su recipiente respectivo, para cada AID observado para secuencias que contienen el mismo código de barras del recipiente, los productos de oligonucleótidos amplificados secuenciados se originaron a partir de un conjugado de afinidad-oligonucleótido particular unido a una única célula en el mismo recipiente. Para cada AMB diferente, individualmente, observado entre un conjunto de secuencias que contienen todas el mismo código de barras del recipiente, los productos de oligonucleótidos amplificados que tienen el AMB en el conjunto secuenciado se originaron a partir de una parte de oligonucleótido individual diferente (en comparación con los otros AMB individuales) de una única molécula de conjugado de afinidad-oligonucleótido unida a una célula en el mismo recipiente, por ejemplo, en los casos en los que se utilizan recipientes de una única célula, que se unen a la única célula en el recipiente. Para cada AMB observado, todos los productos de oligonucleótidos amplificados con secuencias que contenían ese mismo código de barras del recipiente se originaron a partir de una parte de oligonucleótidos de una única (la misma) molécula de conjugado de afinidad-oligonucleótido (por ejemplo, que representa duplicados o amplicones de PCR). Por lo tanto, cada oligonucleótido observado con una combinación dada de un AMB específico y un código de barras del recipiente específico indica una sola molécula de conjugado de afinidad-oligonucleótido unida a una sola célula; por lo tanto, la detección de un número dado (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de múltiples oligonucleótidos secuenciados con dicha combinación de AMB/código de barras del recipiente es indicativo del número (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de conjugados de afinidad-oligonucleótidos unidos a una sola célula, por ejemplo, dentro de la población celular o muestra analizada. Por lo tanto, dicho número puede ser indicativo del número de moléculas en la célula a las que la parte de afinidad dada del conjugado de afinidad-oligonucleótido está diseñada para unirse, por ejemplo, el número de copias expresadas sobre o en la célula individual.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente comprenden además polinucleótidos con código de barras derivados de células y/o polinucleótidos en el recipiente que son distintos de los conjugados de afinidadoligonucleótido y distintos de las partes o copias de los mismos. Por ejemplo, las células individuales encapsuladas en recipientes que están o estuvieron unidos a conjugados de afinidad-oligonucleótido pueden ser lisadas y otros polinucleótidos, tales como los polinucleótidos de o dentro de la célula individual pueden ser codificados con códigos de barra. En algunas realizaciones, una parte de oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido en el recipiente, por ejemplo, uno que está o estuvo unido a una célula individual en el recipiente, y/o una copia o un producto amplificado del mismo, se puede someter a códigos de barra con una secuencia de código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, uno o más polinucleótidos celulares de la célula individual pueden someterse a código de barras con la misma secuencia de código de barras del recipiente; tales como uno o más polinucleótidos celulares adicionales en algunas realizaciones se someten a códigos de barras además con códigos de barras moleculares.
Los pares de cadenas de receptores de linfocitos T y los pares de cadenas de inmunoglobulinas de anticuerpos son tipos de receptores inmunitarios. En algunas realizaciones, el polinucleótido celular es un polinucleótido que codifica una cadena (o parte) de inmunoglobulina de anticuerpo; en algunas realizaciones, es o comprende un polinucleótido que codifica TCR (o parte). En algunas realizaciones, el antígeno unido por el conjugado de afinidad-oligonucleótido es un TCR o anticuerpo o cadena o parte del mismo. En un aspecto, los métodos descritos en la presente comprenden además la generación de bancos de polinucleótidos para la secuenciación y el diagnóstico de alto rendimiento. En un aspecto, los métodos descritos en la presente comprenden además el desarrollo de paneles de bancos derivados de seres humanos para el descubrimiento de anticuerpos y/o TCR a partir de pacientes o cohortes con atributos comunes específicos. La invención divulgada se puede aplicar a múltiples tipos diferentes de secuencias variables emparejadas, por ejemplo, pares de cadenas de receptores de linfocitos T y pares de cadenas de inmunoglobulinas de anticuerpos, junto con la caracterización de células individuales usando conjugados de afinidad-oligonucleótido. Por ejemplo, polinucleótidos complementarios a polinucleótidos celulares, tales como cadenas pesadas y/o livianas, por ejemplo, Vh y/o Vl, cadenas de anticuerpos y/o cadenas alfa y/o beta y/o gamma y/o delta, por ejemplo, las cadenas del receptor de linfocitos T (TCR) Va/Vp y Vy/V8 (tales como aquellas derivadas de sus partes estructurales) pueden introducirse durante la formación de (o incluirse dentro de) los recipientes. Un polinucleótido que alberga un código de barras del recipiente también puede introducirse durante la formación (o incluirse dentro) de un recipiente. Estos polinucleótidos con código de barras del recipiente pueden llevar códigos de barras degenerados, de modo que cada polinucleótido celular que contiene un código de barras del recipiente contiene un código de identidad único correspondiente al recipiente en el que se encuentra durante la reacción o las reacciones. Por lo tanto, en algunas de tales realizaciones, se considera que una pluralidad de polinucleótidos con el mismo código de identidad único se originó a partir del mismo recipiente y, en algunos aspectos, por lo tanto, a partir de una única célula. También puede introducirse una pluralidad de polinucleótidos que albergan un código de barras molecular durante la formación o incluirse en los recipientes. Estos polinucleótidos moleculares con código de barras pueden llevar códigos de barras degenerados, de modo que cada molécula de polinucleótido celular que contiene un código de barras molecular contiene un código de identidad único que corresponde a una molécula de polinucleótido de una única célula de la que proceden. Los millones de células inmunitarias individuales se pueden lisar dentro de la emulsión y los transcritos celulares, tales como Vh y Vl y/o los transcritos de la cadena Va/Vp y/o Vy/VS, se pueden transcribir de forma inversa o copiar usando cebadores, seguidos de etiquetado con un código de barras del recipiente y un código de barras molecular y amplificación por PCR de los polinucleótidos con código de barras. Cada cadena Vh y Vl y/o Va/Vp y/o Yy/YS derivada de una única célula inmunitaria (por ejemplo, un linfocito B o un linfocito T) puede vincularse virtualmente entre sí con la misma identidad del código de barras del recipiente.
Las cadenas Vh y Vl y/o Va/p y/o Vy/VS pueden luego recuperarse de los recipientes y enriquecerse mediante PCR para agregar etiquetas de secuenciación de próxima generación (NGS). El banco puede secuenciarse usando una plataforma de secuenciación de alto rendimiento seguida de un análisis de la diversidad del repertorio, la frecuencia de los anticuerpos, la caracterización de CDR3, el análisis de la filogenia de hipermutación somática, etc. Se puede generar una base de datos de pares correctamente emparejados de Vh y Vl y/o Va/Vp y/o Vy/VS mediante la deconvolución de las secuencias con códigos de barras moleculares y de recipientes. Debido a que cada célula inmunitaria individual se aísla en su respectivo recipiente, por cada código de barras observado dos veces en el recipiente, las transcripciones secuenciadas se originaron a partir de las mismas gotitas de emulsión y, por lo tanto, de una sola célula individual. Por cada código de barras molecular diferente observado, para secuencias que contienen el mismo código de barras del recipiente, las transcripciones secuenciadas se originaron a partir de una molécula de transcripción diferente de una sola célula. Por cada código de barras molecular igual observado, para secuencias que contienen el mismo código de barras del recipiente, las transcripciones secuenciadas se originaron a partir de una misma molécula de transcripción de una sola célula (por ejemplo, duplicados de PCR).
En paralelo a la secuenciación, se puede clonar un banco de cadenas de Vh y Vl y/o Va/Vp y/o Vy/V8 recuperadas de los recipientes en vectores de expresión de anticuerpos y transfectarlas conjuntamente para la detección mediante visualización de levaduras. La clonación de este grupo de bancos idéntico es el método preferido en comparación con la división de una muestra biológica al principio, ya que solo se capturarían algunas células inmunitarias raras en uno u otro ensayo. El banco de cadenas de Vh y Vl y/o Va y Vp y/o Vy y VS derivadas de ser humano puede expresarse independientemente del par correcto o incorrecto que coincida con los ensayos de visualización clásicos. Se puede realizar la visualización de levaduras frente a una o más dianas antigénicas para enriquecer en posibles candidatos a anticuerpo.
Los anticuerpos candidatos positivos que surgen de tecnologías de visualización, tales como una visualización de levaduras, pueden secuenciarse y consultarse frente a la base de datos de códigos de barras de pares emparejados. Cada cadena Vh y/o Va y/o Vy mostrada en las levaduras se puede volver a emparejar con su respectiva cadena Vl o Vp o VS, respectivamente, y cada cadena Vl y/o Vp y/o VS mostrada en las levaduras se puede volver a emparejar con su respectiva cadena Vh o Va o Vy, respectivamente. Estos candidatos correctamente emparejados se pueden sintetizar y expresar genéticamente en líneas celulares de mamífero y validar funcionalmente frente a la diana de interés. Estos candidatos pueden ser anticuerpos y/o TCR completamente humanos.
Muestras
En algunas realizaciones, cualquier muestra que contenga polinucleótidos puede usarse en los métodos descritos en la presente. Cualquier muestra que contenga una célula generalmente puede usarse en los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, una muestra puede ser una muestra biológica de un sujeto o de una muestra derivada del mismo que contiene ARN o ADN. Los polinucleótidos pueden extraerse de la muestra biológica, o la muestra puede someterse directamente a los métodos sin extracción ni purificación de los polinucleótidos La muestra puede ser extraída o aislada de ADN o ARN. Una muestra también puede ser ARN o ADN total extraído de una muestra biológica, un banco de ADNc, ADN vírico o genómico. En una realización, los polinucleótidos se aíslan de una muestra biológica que contiene una variedad de otros componentes, tales como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos no molde. Las moléculas de molde de ácido nucleico pueden obtenerse de cualquier material celular, obtenido de un animal, una planta, una bacteria, un hongo o cualquier otro organismo celular. En determinadas realizaciones, los polinucleótidos se obtienen de una sola célula. Los polinucleótidos se pueden obtener directamente de un organismo o de una muestra biológica obtenida de un organismo. Se puede usar cualquier muestra de tejido o fluido corporal como fuente de ácido nucleico para su uso en la invención. Los polinucleótidos también se pueden aislar de células cultivadas, tales como un cultivo celular primario o una línea celular. Las células o los tejidos a partir de los que se obtienen los ácidos nucleicos de molde pueden infectarse con un virus u otro patógeno intracelular.
En determinadas realizaciones, se pueden aislar células inmunitarias productoras de TCR o anticuerpos de la sangre u otras muestras biológicas de un sujeto u hospedador, tal como de un ser humano u otro animal, tal como un ser humano u otro animal que ha sido inmunizado o que padece una infección, cáncer, una afección autoinmunitaria o cualquier otra enfermedad para identificar un anticuerpo o TCR específico de patógenos, tumores y/o enfermedades de posible importancia clínica. Por ejemplo, el ser humano puede ser diagnosticado con una enfermedad, presentar síntomas de una enfermedad, no ser diagnosticado con una enfermedad o no mostrar síntomas de una enfermedad. Por ejemplo, el ser humano puede ser aquel que estuvo expuesto y/o que puede producir anticuerpos o TCR útiles contra un agente infeccioso (por ejemplo, virus, bacterias, parásitos, priones, etc.), antígeno o enfermedad. Por ejemplo, el animal puede ser aquel que estuvo expuesto y/o que puede producir anticuerpos o TCR útiles contra un agente infeccioso (por ejemplo, virus, bacterias, parásitos, priones, etc.), antígeno o enfermedad. Ciertas células inmunitarias de hospedadores inmunizados producen anticuerpos o TCR hacia uno o más antígenos diana en cuestión y/o uno o más antígenos desconocidos. En la presente invención, el conjunto de linfocitos puede enriquecerse en las células inmunitarias deseadas mediante cualquier método adecuado, tal como la selección y clasificación de las células mediante la selección de células activadas por fluorescencia (FACS), la selección de células activadas magnéticamente (MACS), la exploración u otro método de selección para generar una pluralidad de células inmunitarias a partir de una muestra, tal como un banco de células inmunitarias, antes de que se secuencien las cadenas de anticuerpos, se produzcan anticuerpos o se cree un banco de expresión. En contraste con los métodos de enriquecimiento de la técnica anterior, que proporcionan solo unos pocos subconjuntos de células inmunitarias que expresan diferentes anticuerpos, y por lo tanto, solo unas pocas combinaciones naturales de dominios variables, el banco de células inmunitarias de la presente invención contiene al menos 2 subconjuntos de o células inmunitarias individuales que expresan diferentes anticuerpos o TCR. Por ejemplo, el banco de células inmunitarias de la presente invención puede contener al menos 5, 10, 100, 250, 500, 750, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 25.000, 50.000, 75.000, 10.000, 250.000, 500.000, 750.000, 1.000.000, 2.500.000, 5.000.000, 7.500.000 o 10.000.000 subconjuntos de células inmunitarias individuales que expresan diferentes anticuerpos o TCR. Los métodos de la presente invención maximizan la recuperación de células inmunitarias y proporcionan una diversidad muy alta.
Los linfocitos T se pueden obtener de varias fuentes, incluidas las células mononucleares de sangre periférica, la médula ósea, el timo, la biopsia de tejido, el tumor, el tejido de los ganglios linfáticos, el tejido linfoide asociado al intestino, el tejido linfoide asociado a la mucosa, el tejido del bazo o cualquier otro tejido linfoide y tumores. Los linfocitos T se pueden obtener de líneas de linfocitos T y de fuentes autólogas o alogénicas. Los linfocitos T se pueden obtener de un solo individuo o de una población de individuos, por ejemplo, una población de individuos que padecen la misma enfermedad, tal como un cáncer o una enfermedad infecciosa. En algunas realizaciones, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen mediante aféresis o leucoféresis. El producto de aféresis normalmente contiene linfocitos, incluidos linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una realización, las células recogidas por aféresis o leucoféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En una realización de la invención, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En una realización alternativa, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, o de todos, los cationes divalentes. Como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica, un paso de lavado puede realizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, como por ejemplo mediante el uso de una centrífuga de "flujo continuo" semiautomática. Después del lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de tampones biocompatibles, como por ejemplo, PBS libre de Ca++/Mg++. Como alternativa, los componentes indeseables de la muestra de aféresis pueden eliminarse y las células pueden resuspenderse directamente en medios de cultivo. En otras realizaciones, los linfocitos T se aíslan de los linfocitos de sangre periférica mediante la lisis de los eritrocitos y mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™. Una subpoblación específica de linfocitos T, tales como linfocitos T CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y CD45RO+, puede ser adicionalmente aislada por técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, los linfocitos T CD3+, CD28+ pueden seleccionarse positivamente utilizando perlas magnéticas conjugadas con CD3/CD28 (por ejemplo, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander). En algunas realizaciones, el enriquecimiento de una población de linfocitos T mediante selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. Uno de tales métodos es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a los marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células c D4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye normalmente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. Otro método para preparar los linfocitos T para la estimulación es congelar las células después del paso de lavado, que no requiere el paso de eliminación de monocitos. Deseando no limitarse a la teoría, el paso de congelación y posterior descongelación proporciona un producto más uniforme eliminando los granulocitos y, hasta cierto punto, los monocitos en la población celular. Después del paso de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células se pueden suspender en una solución de congelación. Si bien se conocen en la técnica muchas soluciones y parámetros de congelación que serán útiles en este contexto, un método implica el uso de PBS que contiene un 20 % de DMSO y un 8 % de albúmina de suero humano (HSA) u otro medio de congelación celular adecuado. Luego, se diluye 1:1 con medio para que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10 % y del 4 %, respectivamente. Luego, las células se congelan a -80 °C a una velocidad de 1 °C por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.
En algunas realizaciones, se utilizan células inmunitarias de donantes humanos o no humanos no inmunizados. El repertorio virgen de un animal (el repertorio antes de la exposición al antígeno) proporciona al animal anticuerpos o TCR que pueden unirse con afinidad moderada (Ka de aproximadamente 1 x 10-6 a 1 x 10-7 M) a prácticamente cualquier molécula no propia. La diversidad de secuencia de los sitios de unión del anticuerpo o TCR no se codifica directamente en la línea germinal, sino que se ensambla de manera combinatoria a partir de los segmentos del gen V. Las inmunizaciones hacen que cualquier célula inmunitaria que produce una combinación de Vh-Vl o Va-Vp o Vy-V8 a unirse al inmunógeno para proliferar (expansión clónica) y para segregar el anticuerpo correspondiente como se ha indicado anteriormente. Sin embargo, el uso de células de bazo y/o células inmunitarias u otros linfocitos de sangre periférica (PBL) de un sujeto no inmunizado puede proporcionar una mejor representación del posible repertorio de anticuerpos o TCR, y también permite la construcción de un banco de anticuerpos o TCR contra los linfocitos B o T posterior usando cualquier especie animal.
En algunos casos, para obtener suficiente ácido nucleico para el análisis, se extrae un volumen de sangre de al menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 ml.
En algunos casos, el material de partida es sangre periférica. Las células de la sangre periférica pueden enriquecerse en un tipo de célula en particular (por ejemplo, células mononucleares; glóbulos rojos; células CD4+; células CD8+; células inmunitarias; linfocitos T, linfocitos NK o similares). Las células de la sangre periférica también se pueden agotar selectivamente de un tipo de célula particular (por ejemplo, células mononucleares; glóbulos rojos; células CD4+; células CD8+; células inmunitarias; linfocitos T, linfocitos NK o similares).
En algunos casos, el material de partida puede ser una muestra de tejido que comprenda un tejido sólido, con ejemplos no limitantes que incluyen cerebro, hígado, pulmón, riñón, próstata, ovario, bazo, ganglio linfático (incluyendo las amígdalas), tiroides, páncreas, corazón, músculo esquelético, intestino, laringe, esófago y estómago. En otros casos, el material de partida puede ser células que contienen ácidos nucleicos, células inmunitarias y, en particular, linfocitos B o linfocitos T. En algunos casos, el material de partida puede ser una muestra que contiene ácidos nucleicos, de cualquier organismo, del que se pueda obtener material genético. En algunos casos, una muestra es un líquido, por ejemplo, sangre, saliva, linfa u orina.
Se puede tomar una muestra de un sujeto con una afección. En algunos casos, el sujeto del que se toma una muestra puede ser un paciente, por ejemplo, un paciente con cáncer o un paciente con sospecha de cáncer. El sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo, un ser humano, y puede ser macho o hembra. En algunos casos, la hembra se encuentra en estado de gestación. La muestra puede ser una biopsia tumoral. La biopsia puede ser realizada, por ejemplo, por un proveedor de atención sanitaria, incluido un médico, medico asistente, enfermera, veterinario, dentista, quiropráctico, paramédico, dermatólogo, oncólogo, gastroenterólogo o cirujano.
En algunos casos, los materiales que no son ácidos nucleicos pueden eliminarse del material de partida usando tratamientos enzimáticos (tales como la digestión con proteasas).
En algunos casos, la sangre puede recogerse en un aparato que contiene un quelante de magnesio que incluye, entre otros, EDTA, y se almacena a 4 °C Opcionalmente, se puede añadir un quelante de calcio, incluido, entre otros, EGTA. En otro caso, se añade un inhibidor de la lisis celular a la sangre, incluido, entre otros, formaldehído, derivados de formaldehído, formol, glutaraldehído, derivados de glutaraldehído, un reticulante proteico, un reticulante de ácido nucleico, un reticulante de proteína y de ácido nucleico, reticulantes reactivos de amina primaria, reticulantes reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de disulfuro, reticulantes reactivos de hidratos de carbono, reticulantes reactivos de carboxilo, reticulantes fotorreactivos o reticulantes escindibles.
En algunos casos, cuando el material extraído comprende ARN monocatenario, ARN bicatenario o ADN-ARN híbrido, estas moléculas pueden convertirse en ADN bicatenario usando técnicas conocidas en el campo. Por ejemplo, la transcriptasa inversa se puede emplear para sintetizar ADN a partir de moléculas de ARN. En algunos casos, la conversión de ARN en ADN puede requerir un paso de ligadura previa, para ligar un fragmento enlazador al ARN, permitiendo así el uso de cebadores universales para iniciar la transcripción inversa. En otros casos, se puede usar la cola poli-A de una molécula de ARNm, por ejemplo, para iniciar la transcripción inversa. Después de la conversión en el ADN, los métodos detallados en la presente se pueden usar, en algunos casos, para capturar, seleccionar, marcar o aislar posteriormente una secuencia deseada.
Las moléculas de ácido nucleico incluyen ácido desoxirribonucleico (ADN) y/o ácido ribonucleico (ARN). Las moléculas de ácido nucleico pueden ser sintéticas o derivadas de fuentes naturales. En una realización, las moléculas de ácido nucleico se aíslan de una muestra biológica que contiene una variedad de otros componentes, tales como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos no molde. Las moléculas de molde de ácido nucleico pueden obtenerse de cualquier material celular, obtenido de un animal, una planta, una bacteria, un hongo o cualquier otro organismo celular. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico se obtienen de una única célula. Las muestras biológicas para su uso en la presente invención incluyen partículas o preparaciones víricas. Las moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse directamente de un organismo o de una muestra biológica obtenida de un organismo, por ejemplo, de sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, fluido seminal, saliva, esputo, heces y tejido. Se puede usar cualquier muestra de tejido o fluido corporal como fuente de ácido nucleico para su uso en la invención. Las moléculas de ácido nucleico también se pueden aislar de células cultivadas, tales como un cultivo celular primario o una línea celular. Las células o los tejidos a partir de los que se obtienen los ácidos nucleicos de molde pueden infectarse con un virus u otro patógeno intracelular.
Una muestra también puede ser ARN total extraído de una muestra biológica, un banco de ADNc, ADN vírico o genómico. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico están unidas a otras moléculas diana tales como proteínas, enzimas, sustratos, anticuerpos, agentes aglutinantes, perlas, moléculas pequeñas, péptidos o cualquier otra molécula. En general, el ácido nucleico se puede extraer de una muestra biológica mediante una variedad de técnicas tales como las descritas por Sambrook y Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Tercera Edición, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001). Las moléculas de ácido nucleico pueden ser monocatenarias, bicatenarias o bicatenarias con regiones monocatenarias (por ejemplo, estructuras de tronco y de bucle).
Los procedimientos de extracción de ADN son muy conocidos en la técnica. Un protocolo de aislamiento de ADN clásico se basa en la extracción con disolventes orgánicos, tal como una mezcla de fenol y cloroformo, seguido de la precipitación con etanol (J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, 2a Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: Nueva York, N.Y.). Otros procedimientos incluyen: extracción de ADN mediante precipitación de proteínas (P. Sunnucks et al., Genetics, 1996, 144: 747-756; S. M. Aljanabi et al., Nucl. Acids Res.
1997, 25: 4692-4693), extracción de ADN con sales de bromuro de trimetilamonio (S. Gustincich et al., BioTechniques, 1991, 11: 298-302) y extracción de ADN con tiocianato de guanidinio (J. B. W. Hammond et al., Biochemistry, 1996, 240: 298-300). Hay una variedad de kits disponibles en el comercio para extraer ADN de muestras biológicas (por ejemplo, BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA): Epicentre Technologies (Madison, WI); Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, MN); MicroProbe Corp. (Bothell, WA); Organon Teknika (Durham, NC); y Qiagen Inc. (Valencia, CA)).
Los métodos de extracción de ARN también son muy conocidos en la técnica (por ejemplo, J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 1989, 211d Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: Nueva York) y hay kits para la extracción de a Rn de los fluidos corporales disponibles en el comercio (por ejemplo, Ambion, Inc. (Austin, TX); Amersham Biosciences (Piscataway, NJ); BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA); BioRad Laboratories (Hercules, CA); Dynal Biotech Inc. (Lake Success, NY); Epicentre Technologies (Madison, WI); Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, MN); GIBCO BRL (Gaithersburg, MD); In- vitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA); MicroProbe Corp. (Bothell, WA); Organon Teknika (Durham, NC); Promega, Inc. (Madison, WI); y Qiagen Inc. (Valencia, CA)).
Una o más muestras pueden ser de una o más fuentes. Una o más de las muestras pueden ser de dos o más fuentes. Una o más de las muestras pueden ser de uno o más sujetos. Una o más de las muestras pueden ser de dos o más sujetos. Una o más de las muestras pueden ser del mismo sujeto. Uno o más sujetos pueden ser de la misma especie. Uno o más sujetos pueden ser de diferentes especies. Uno o más sujetos pueden estar sanos. Uno o más sujetos pueden verse afectados por una enfermedad, un trastorno o una afección.
En algunas realizaciones, una muestra es un líquido, tal como sangre, saliva, linfa, orina, líquido cefalorraquídeo, fluido seminal, esputo, heces u homogeneizados de tejidos.
Se puede tomar una muestra de un sujeto con una afección. En algunas realizaciones, el sujeto del que se toma una muestra puede ser un paciente, por ejemplo, un paciente con cáncer o un paciente con sospecha de cáncer. El sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo, un ser humano, y puede ser macho o hembra. En algunas realizaciones, la hembra se encuentra en estado de gestación. La muestra puede ser una biopsia tumoral. La biopsia puede ser realizada, por ejemplo, por un proveedor de atención sanitaria, incluido un médico, medico asistente, enfermera, veterinario, dentista, quiropráctico, paramédico, dermatólogo, oncólogo, gastroenterólogo o cirujano.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos están unidos a otras moléculas diana tales como proteínas, enzimas, sustratos, anticuerpos, agentes aglutinantes, perlas, moléculas pequeñas, péptidos o cualquier otra molécula. En algunas realizaciones, los polinucleótidos no están unidos a un soporte sólido. Los ácidos nucleicos pueden extraerse de una muestra biológica mediante una variedad de técnicas (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Tercera Edición, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)).
En algunas realizaciones, la muestra es saliva. En algunas realizaciones, la muestra es sangre entera. En algunas realizaciones, para obtener una cantidad suficiente de polinucleótidos para el análisis, se extrae un volumen de sangre de al menos aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 ml. En algunas realizaciones, la sangre puede recogerse en un aparato que contiene un quelante de magnesio que incluye, entre otros, EDTA, y se almacena a 4° C. Opcionalmente, se puede añadir un quelante de calcio, incluyendo, incluido, entre otros, EGTA.
En algunas realizaciones, se añade un inhibidor de la lisis celular a la sangre, incluido, entre otros, formaldehído, derivados de formaldehído, formol, glutaraldehído, derivados de glutaraldehído, un reticulante proteico, un reticulante de ácido nucleico, un reticulante de proteína y de ácido nucleico, reticulantes reactivos de amina primaria, reticulantes reactivos de sulfhidrilo, adición de sulfhidrilo o reducción de disulfuro, reticulantes reactivos de hidratos de carbono, reticulantes reactivos de carboxilo, reticulantes fotorreactivos o reticulantes escindibles. En algunas realizaciones, los materiales que no son ácidos nucleicos pueden eliminarse del material de partida usando tratamientos enzimáticos (tales como la digestión con proteasas).
Una pluralidad de muestras puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100, o más muestras. La pluralidad de muestras puede comprender al menos aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1.000, o más muestras. La pluralidad de muestras puede comprender al menos aproximadamente 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000 muestras, 9.000 o 10.000 muestras, o 100.000 muestras, o 1.000. 000 o más muestras. La pluralidad de muestras puede comprender al menos aproximadamente 10.000 muestras.
Uno o más polinucleótidos de una primera muestra pueden ser diferentes de uno o más polinucleótidos de una segunda muestra. Uno o más polinucleótidos de una primera muestra pueden ser diferentes de uno o más polinucleótidos de una pluralidad de muestras. Uno o más polinucleótidos de una muestra puede comprender al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia. En algunas realizaciones, uno o más polinucleótidos de una muestra pueden diferir en menos de aproximadamente 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótido o par de bases. Una pluralidad de polinucleótidos de una o más muestras de la pluralidad de muestras puede comprender dos o más secuencias idénticas. Al menos aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % del total de polinucleótidos de una o más de la pluralidad de muestras puede comprender la misma secuencia. Una pluralidad de polinucleótidos de una o más muestras de la pluralidad de muestras puede comprender al menos dos secuencias diferentes. Al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % del total de polinucleótidos de una o más de la pluralidad de muestras puede comprender al menos dos secuencias diferentes. En algunas realizaciones, uno o más polinucleótidos son variantes entre sí. Por ejemplo, uno o más polinucleótidos pueden contener polimorfismos de un solo nucleótido u otros tipos de mutaciones. En otro ejemplo, uno o más polinucleótidos son variantes de corte y empalme.
Una primera muestra puede comprender una o más células y la segunda muestra puede comprender una o más células. Una o más células de la primera muestra pueden ser del mismo tipo de célula que una o más células de la segunda muestra. Una o más células de la primera muestra pueden ser de un tipo de célula diferente como una o más células diferentes de la pluralidad de muestras.
La pluralidad de muestras puede obtenerse simultáneamente. Se puede obtener una pluralidad de muestras a la vez. La pluralidad de muestras se puede obtener secuencialmente. Se puede obtener una pluralidad de muestras a 10 largo de años, por ejemplo, 100 años, 10 años, 5 años, 4 años, 3 años, 2 años o 1 año de obtención de una o más muestras diferentes. Se pueden obtener una o más muestras en el transcurso de aproximadamente un año después de obtener una o más muestras diferentes. Se pueden obtener una o más muestras en el transcurso de 12 meses, 11 meses, 10 meses, 9 meses, 8 meses, 7 meses, 6 meses, 4 meses, 3 meses, 2 meses o 1 mes de obtención de una o más muestras diferentes. Se pueden obtener una o más muestras en el transcurso de 30 días, 28 días, 26 días, 24 días, 21 días, 20 días, 18 días, 17 días, 16 días, 15 días, 14 días, 13 días, 12 días, 11 días, 10 días, 9 días, 8 días, 7 días 6 días, 5 días, 4 días, 3 días, 2 días o 1 día de obtención de una o más muestras diferentes. Se pueden obtener una o más muestras en el transcurso de aproximadamente 24 horas, 22 horas, 20 horas, 18 horas, 16 horas, 14 horas, 12 horas, 10 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 2 horas o 1 hora de obtención de una o más muestras diferentes. Se pueden obtener una o más muestras en el transcurso de aproximadamente 60 segundos, 45 segundos, 30 segundos, 20 segundos, 10 segundos, 5 segundos, 2 segundos o 1 segundo de obtención de una o más muestras diferentes. Se pueden obtener una o más muestras en menos de un segundo después de obtener una o más muestras diferentes.
Los diferentes polinucleótidos de una muestra pueden estar presentes en la muestra a diferentes concentraciones o cantidades (por ejemplo, diferente número de moléculas). Por ejemplo, la concentración o cantidad de un polinucleótido puede ser superior a la concentración o cantidad de otro polinucleótido en la muestra. En algunas realizaciones, la concentración o cantidad de al menos un polinucleótido en la muestra es al menos aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más veces superior a la concentración o cantidad de al menos otro polinucleótido en la muestra. En otro ejemplo, la concentración o cantidad de un polinucleótido es inferior a la concentración o cantidad de otro polinucleótido en la muestra. La concentración o cantidad de al menos un polinucleótido en la muestra puede ser de al menos aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más veces inferior a la concentración o cantidad de al menos otro polinucleótido de la muestra.
En algunas realizaciones, dos o más muestras pueden contener diferentes cantidades o concentraciones de los polinucleótidos. En algunas realizaciones, la concentración o cantidad de un polinucleótido en una muestra puede ser superior a la concentración o cantidad del mismo polinucleótido en una muestra diferente. Por ejemplo, una muestra de sangre puede contener una cantidad más alta de un determinado polinucleótido que una muestra de orina. Como alternativa, una sola muestra puede dividirse en dos o más submuestras. Las submuestras pueden contener diferentes cantidades o concentraciones del mismo polinucleótido. La concentración o cantidad de al menos un polinucleótido en una muestra puede ser de al menos aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más veces superior a la concentración o cantidad del mismo polinucleótido en otra muestra. Como alternativa, la concentración o cantidad de un polinucleótido en una muestra puede ser inferior a la concentración o cantidad del mismo polinucleótido en una muestra diferente. Por ejemplo, la concentración o cantidad de al menos un polinucleótido en una muestra puede ser de al menos aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más veces inferior a la concentración o cantidad del mismo polinucleótido de otra muestra.
Polinucleótidos diana
En algunos casos, los métodos proporcionados en la presente están dirigidos a la amplificación y secuenciación de una molécula de polinucleótido diana, tal como una molécula de polinucleótido de una célula, un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido, o amplicones del mismo. En algunos casos, los métodos proporcionados en la presente están dirigidos a la amplificación y secuenciación de al menos una región de una molécula de polinucleótido diana. En algunos casos, los métodos proporcionados en la presente están dirigidos a la amplificación y secuenciación de al menos una molécula de polinucleótido diana. En un aspecto, los polinucleótidos diana son oligonucleótidos de conjugados de afinidad-oligonucleótido. En un aspecto, los polinucleótidos diana son ARN. En algunas realizaciones, los polinucleótidos de ARN diana son ARNm. En algunas realizaciones, los polinucleótidos de ARN diana están poliadenilados. En algunas realizaciones, los polinucleótidos de ARN no están poliadenilados. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana son polinucleótidos de ADN. Por ejemplo, los polinucleótidos diana incluyen ADNc. Los polinucleótidos de ADN pueden ser ADN genómico. Los polinucleótidos de ADN pueden comprender exones, intrones, regiones no traducidas o cualquier combinación de los mismos.
En un aspecto, los polinucleótidos diana son ácidos nucleicos genómicos. El ADN derivado del material genético en los cromosomas de un organismo particular puede ser ADN genómico. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen secuencias que comprenden regiones variables de un anticuerpo o TCR producido por una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen secuencias que comprenden una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo producido por una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen secuencias que comprenden una región variable de una cadena liviana de un anticuerpo producido por una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen secuencias que comprenden una región variable de una cadena alfa de un TCR producido por una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen secuencias que comprenden una región variable de una cadena beta de un TCR producido por una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen secuencias que comprenden una región variable de una cadena gamma de un TCR producido por una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen secuencias que comprenden una región variable de una cadena delta de un TCR producido por una célula inmunitaria. Por ejemplo, los polinucleótidos diana pueden incluir un molde de polinucleótido usado para generar productos de una reacción de transcripción inversa o reacción de extensión del cebador, y también incluyen la reacción de transcripción inversa o los propios productos de reacción de extensión del cebador. Por ejemplo, los polinucleótidos diana incluyen polinucleótidos de interés que pueden someterse a una reacción de transcripción inversa o una reacción de extensión del cebador.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen secuencias que comprenden AID de oligonucleótidos de conjugados de afinidad-oligonucleótido. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen secuencias que comprenden AMD de oligonucleótidos de conjugados de afinidad-oligonucleótido. Por ejemplo, los polinucleótidos diana incluyen ARN o ADN. Por ejemplo, los polinucleótidos diana incluyen oligonucleótidos sintetizados. Por ejemplo, los polinucleótidos diana incluyen oligonucleótidos que contienen una AID y/o un AMB.
Los polinucleótidos diana pueden obtenerse a partir de prácticamente cualquier fuente y se pueden preparar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los polinucleótidos diana pueden aislarse directamente sin amplificación utilizando métodos conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, la extracción de un fragmento de ADN genómico o ARNm de un organismo o una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria) para obtener polinucleótidos diana. Un polinucleótido diana también puede abarcar el ADNc generado a partir del ARN (tal como el ARNm) a través de la PCR de transcripción inversa. En algunos casos, un polinucleótido diana es una molécula de ARN. En algunos casos, un polinucleótido diana es una molécula de ARNm, o un ADNc producido a partir de la molécula de ARNm. En algunos casos, un polinucleótido diana es una molécula de ARNm o molécula de ADNc producida a partir de la molécula de ARNm, a partir de una sola célula inmunitaria. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm o moléculas de ADNc producidas a partir de las moléculas de ARNm a partir de células inmunitarias individuales. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican una secuencia de anticuerpos de una sola célula inmunitaria. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican secuencias de anticuerpos de cadena pesada de células inmunitarias individuales. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican una secuencia de anticuerpo de cadena pesada de una sola célula inmunitaria. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican secuencias de anticuerpos de cadena liviana de células inmunitarias individuales. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican una secuencia de anticuerpo de cadena liviana de una sola célula inmunitaria. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican secuencias variables de anticuerpos de células inmunitarias individuales. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican una secuencia de anticuerpo variable de una sola célula inmunitaria. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican secuencias de anticuerpos de cadena liviana variable de células inmunitarias individuales. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican una secuencia de anticuerpo de cadena liviana variable de una sola célula inmunitaria. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican secuencias de anticuerpos de cadena pesada variable de células inmunitarias individuales. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican una secuencia de anticuerpo de cadena pesada variable de una sola célula inmunitaria. En algunos casos, un polinucleótido diana puede ser un ácido nucleico libre de células, por ejemplo, ADN o ARN. En algunos casos, los polinucleótidos diana son moléculas de ARNm que codifican secuencias de TCR de cadena alfa, beta, gamma y/o delta variable de células inmunitarias individuales.
Los métodos descritos en la presente pueden usarse para generar un banco de polinucleótidos a partir de uno o más polinucleótidos diana para la secuenciación. En algunas realizaciones, pueden generarse bancos a partir de dos o más regiones de un polinucleótido diana. En algunas realizaciones, pueden generarse bancos de métodos a partir de dos o más polinucleótidos diana. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana son ácidos nucleicos genómicos o ADN derivado de cromosomas. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen secuencias que comprenden una variante, tal como un polimorfismo o una mutación. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen ADN y no ARN. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen ARN y no ADN. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana incluyen ADN y ARN. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es un polinucleótido monocatenario. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es un polinucleótido bicatenario. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es una cadena sencilla de un polinucleótido bicatenario.
Los polinucleótidos diana pueden sintetizarse u obtenerse a partir de cualquier muestra biológica y prepararse usando métodos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana se aíslan directamente sin amplificación. Los métodos para el aislamiento directo son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes incluyen la extracción de ADN genómico o ARNm de una muestra biológica, un organismo o una célula. En algunas realizaciones, se purifican uno o más polinucleótidos diana a partir de una muestra biológica. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana no se purifica a partir de la muestra biológica en la que está contenido. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana se aísla de una muestra biológica. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana no se aísla de la muestra biológica en la que está contenido. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana puede ser un ácido nucleico libre de células. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana puede ser un ácido nucleico fragmentado. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana puede ser un ácido nucleico transcrito. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es un polinucleótido modificado. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es un polinucleótido no modificado.
En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido.
En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana comprende una pluralidad de oligonucleótidos de una pluralidad de conjugados de afinidad-oligonucleótido. En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1.000 o más oligonucleótidos de una pluralidad de conjugados de afinidad-oligonucleótido. En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana comprende una pluralidad de oligonucleótidos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1.000 o más conjugados de afinidadoligonucleótido. En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1.000 o más oligonucleótidos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1.000 o más conjugados de afinidadoligonucleótido.
En algunas realizaciones, un polinucleótido diana comprende una secuencia de AID. En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1.000 o más secuencias de AID. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana comprende una secuencia de AMB. En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana comprende al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000,16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1 x 106,2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 2 x 107,3 x 107, 4 x 107, 5 x 107,6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108,5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5 x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 4 x 1012, 5 x 1012, 6 x 1012, 7 x 1012, 8 x 1012 o 9 x1012 o más secuencias de AMB.
En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es un polinucleótido de una sola célula. En algunas realizaciones, los polinucleótidos diana son de células individuales. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es un polinucleótido de una muestra que contiene una pluralidad de células.
En algunas realizaciones, un polinucleótido diana codifica una secuencia de biomarcador. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana codifica dos o más secuencias de biomarcador. En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana codifica una secuencia de biomarcador. En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana codifica dos o más secuencias de biomarcador. En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana codifica 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más secuencias de biomarcador.
En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana comprende un panel de secuencias de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana comprende un panel de secuencias de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, una pluralidad de polinucleótidos diana comprende un panel de secuencias de TCR. Por ejemplo, un panel de secuencias de inmunoglobulina puede ser secuencias de Vh y/o Vl. En algunas realizaciones, un panel de secuencias de inmunoglobulina o TCR contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de inmunoglobulina o TCR. En algunas realizaciones, un panel de secuencias de inmunoglobulina o
TCR contiene al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450,
500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000 , 800.000 , 900.000, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x
107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x
108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x
1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5 x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 4 x 1012, 5 x 1012, 6 x 1012, 7 x 1012, 8 x 1012 o 9 x 1012 secuencias de inmunoglobulina o TCR. En algunas realizaciones, un panel de secuencias de inmunoglobulina o
TCR contiene como máximo aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400,
450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000 , 700.000, 800.000 , 900.000, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 107, 2 x 107, 3 x 107,4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x
108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x
1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5 x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 4 x 1012, 5 x 1012, 6 x 1012, 7 x 1012, 8 x 1012 o 9 x1 secuencias de inmunoglobulina o TCR. En algunas realizaciones, un panel de secuencias de inmunoglobulina o
TCR contiene aproximadamente 10-20, 10-30, 10-40, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100, 50­
60, 50-70, 50-80, 50-90, 50-100, 100-200, 100-300, 100-400, 100-300, 100-400, 100-500, 100-600, 100-700, 100­
800, 100-900, 100-1.000, 500-600, 500-700, 500-800, 500-900, 500-1.000, 1.000-2.000, 1.000-3.000, 1.000-4.000,
1.000- 3.000, 1.000-4.000, 1.000-5.000, 1.000-6.000, 1.000-7.000, 1.000-8.000, 1.000-9.000, 1.000-10.000, 5.000­ 6.000, 5.000-7.000, 5.000-8.000, 5.000-9.000, 5.000-10.000, 1-1 x 105, 1-2 x 105, 1-3 x 105, 1-4 x 105, 1-5 x 105, 1-6 x 105, 1-7 x 105, 1-8 x 105, 9 x 105, 1-1 x 106, 1-2 x 106, 1-3 x 106, 1-4 x 1061-5 x 106, 1-6 x 106, 1-7 x 106, 1-8 x 106,
9 x 106, 1 x 107, 1-2 x 107, 1-3 x 107, 1-4 x 107, 1-5 x 107,1-6 x 107, 1-7 x 107, 1-8 x 107, 1-9 x 107,1-1 x 108, 1-2 x 108,
1-3 x 108,1 -4 x 108, 1-5 x 108,1 -6 x 108, 1-7 x 106, 1-8 x 108,1-9 x 108, 1-1 x 109, 1-2 x 109, 1-3 x 109,1 -4 x 109, 1-5 x
109, 1-6 x 109,1 -7 x 109, 1-8 x 109,1 -9 x 109, 1-1 x 1010, 1-2 x 1010, 1-3 x 1010, 1-4 x 1010, 1-5 x 1010, 1-6 x 1010, 1-7 x
1010, 1-8 x 1010, 1-9 x 1010, 1-1 x 1011, 1-2 x 1011, 1-3 x 1011, 1-4 x 1011, 1-5 x 1011, 1-6 x 1011, 1-7 x 1011, 1-8 x 1011,
1-9 x 1011, 1-1 x 1012, 1-2 x 1012, 1-3 x 1012, 1-4 x 1012, 1-5 x 1012, 1-6 x 1012, 1-7 x 1012, 1-8 secuencias de inmunoglobulina o TCR.
En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150,
200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000 o 20.000 bases o pares de bases de longitud. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,
750, 800, 850, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000 o 20.000 bases o pares de bases de longitud. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es como máximo aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,
150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000 o 20.000 bases o pares de bases de longitud. En algunas realizaciones, un polinucleótido diana es de aproximadamente 10-20, 10-30, 10-40, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100, 50-60, 50-70, 50­
80, 50-90, 50-100, 100-200, 100-300, 100-400, 100-300, 100-400, 100-500, 100-600, 100-700, 100-800, 100-900,
100-1.000, 500-600, 500-700, 500-800, 500-900, 500-1.000, 1.000-2.000, 1.000-3.000, 1.000-4.000, 1.000-3.000,
1.000- 4.000, 1.000-5.000, 1.000-6.000, 1.000-7.000, 1.000-8.000, 1.000-9.000, 1.000-10.000, 5.000-6.000, 5.000­ 7.000, 5.000-8.000, 5.000-9.000, o 5.000-10.000 bases o pares de bases de longitud. En algunas realizaciones, la longitud promedio de los polinucleótidos diana, o fragmentos de los mismos, puede ser inferior a aproximadamente
100, 200, 300, 400, 500 u 800 pares de bases, o inferior a aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,
100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 nucleótidos, o inferior a aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kilobases. En algunas realizaciones, una secuencia diana de un molde relativamente corto, tal como una muestra que contiene un polinucleótido diana, es de aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,
75, 80, 85, 90, 95 o 100 bases. En determinadas realizaciones, los datos de secuenciación se alinean con secuencias conocidas o previstas utilizando una base de datos que contiene secuencias o secuencias de inmunoglobulina o TCR asociadas con una enfermedad o afección.
En algunas realizaciones, un método comprende además determinar una secuencia de línea germinal del primer polinucleótido celular, el segundo polinucleótido celular, o ambos, en donde el primer polinucleótido celular comprende una secuencia de IgH o Vh, y en donde el segundo polinucleótido celular comprende una secuencia de IgL o Vl, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar una varianza de la secuencia de IgL IgH, Vh, Vl o cualquier combinación de las mismas a partir de una secuencia de aquellas de la línea germinal. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar al menos uno del número total de secuencias únicas de IgH; el número total de secuencias únicas de IgL; el número total de secuencias únicas de IgH e IgL; el número total de secuencias únicas emparejadas de IgL e IgH; la frecuencia de una secuencia de IgH o una secuencia de IgL; o la frecuencia de una combinación de una secuencia de IgH y una secuencia de IgL frente a una u otras más.
En algunas realizaciones, el método comprende además determinar una secuencia de línea germinal del primer polinucleótido celular, el segundo polinucleótido celular, o ambos, en donde el primer polinucleótido celular comprende una secuencia de TCRa o Va, y en donde el segundo polinucleótido celular comprende una secuencia de TCRp o Vp, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar una varianza de la secuencia del TCRa, TCRp, Va, Vp, o cualquier combinación de las mismas a partir de una secuencia de aquellas de la línea germinal.
En algunas realizaciones, el método comprende además determinar al menos uno del número total de secuencias únicas de TCRa; el número total de secuencias únicas de TCRp; el número total de secuencias únicas de TCRa y TCRp; el número total de secuencias únicas emparejadas de TCRp y TCRa; la frecuencia de una secuencia de TCRa o una secuencia de TCRp; o la frecuencia de una combinación de una secuencia de TCRa y una secuencia de TCRp frente a una u otras más. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar una secuencia de línea germinal del primer polinucleótido celular, el segundo polinucleótido celular, o ambos, en donde el primer polinucleótido celular comprende una secuencia de TCRy o Vy, y en donde el segundo polinucleótido celular comprende una secuencia de TCR5 o V8, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar una varianza de la secuencia del TCRy, TCRS, Vy, VS o cualquier combinación de las mismas a partir de una secuencia de aquellas de la línea germinal. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar al menos uno del número total de secuencias únicas de TCRy; el número total de secuencias únicas de TCRS; el número total de secuencias únicas de TCRy y TCRS; el número total de secuencias únicas emparejadas de TCRS y TCRy; la frecuencia de una secuencia de TCRy o una secuencia de TCRS; o la frecuencia de una combinación de una secuencia de TCRy y una secuencia de TCRS frente a una u otras más. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar al menos uno del número total de secuencias de un primer gen; el número total de secuencias de un segundo gen; el número total de secuencias únicas de un primer gen; el número total de secuencias únicas de un segundo gen; o la frecuencia de una secuencia de un primer gen o una secuencia de un segundo gen.
En algunas realizaciones, el método comprende además la selección de un anticuerpo o TCR basándose en una cantidad total de uno o más pares de secuencias de IgL e IgH emparejadas individualmente, o secuencias de TCRa y TCRp, o secuencias de TCRy y TCRS, y una varianza de una línea germinal. En algunas realizaciones, el método comprende además la selección de un anticuerpo o TCR basándose en una o más secuencias de IgL o de IgH, secuencias de TCRa y de TCRp, o secuencias de TCRy y de TCRS, y una varianza de una línea germinal. En algunas realizaciones, el método comprende además la selección de un anticuerpo o TCR basándose en uno o más de los patrones de secuencia, análisis de varianza, dinámica o frecuencia. En algunas realizaciones, el método comprende además seleccionar un anticuerpo o TCR basándose en la frecuencia.
Clonación y expresión de anticuerpos y TCR
"Banco de expresión de anticuerpos" o "banco de expresión de TCR" o "banco de expresión", como se usan en la presente, pueden referirse a una colección de moléculas (es decir, dos o más moléculas) bien a nivel de ácido nucleico o de proteína. Por lo tanto, este término puede referirse a una colección de vectores de expresión que codifican una pluralidad de moléculas de anticuerpo o TCR (es decir, a nivel de ácido nucleico) o puede referirse a una colección de moléculas de anticuerpo o de t Cr tras haberse expresado en un sistema de expresión apropiado (es decir, a nivel de proteína). Como alternativa, los vectores de expresión/el banco de expresión pueden estar contenidos en células hospedadoras adecuadas en las que puedan expresarse. Las moléculas de anticuerpo que son codificadas o expresadas en los bancos de expresión de la invención pueden estar en cualquier formato apropiado, por ejemplo, pueden ser moléculas de anticuerpos o de TCR enteros, o pueden ser fragmentos de anticuerpos o de TCR, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, anticuerpos scFv), anticuerpos Fv, anticuerpos Fab', fragmentos (Fab')2, diacuerpos, etc. La expresión "que codifica/n" y "codificación", como una secuencia de ácido nucleico "que codifica'V'codificante de" o una secuencia codificante de ADN o una secuencia de nucleótidos "que codifica'V'codificante de" una enzima particular, así como otros términos sinónimos, se refiere a una secuencia de ADN que se transcribe y se traduce a una enzima cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Una "secuencia promotora" es una región reguladora del ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (en dirección 3'). El promotor es parte de la secuencia de ADN. Esta región de secuencia tiene un codón de inicio en su extremo 3'. La secuencia del promotor incluye el número mínimo de bases con elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Sin embargo, después de que la ARN polimerasa se une a la secuencia y se inicia la transcripción en el codón de inicio (extremo 3' con un promotor), la transcripción continúa en dirección 3'. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción(definido convenientemente mediante mapeo con la nucleasa S1), así como los dominios de unión a proteínas (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.
Las moléculas de anticuerpo o de TCR identificadas por, derivadas de, seleccionadas de o que se pueden obtener a partir de los bancos de expresión de anticuerpos o TCR de la invención forman un aspecto adicional más de la invención. De nuevo, estas moléculas de anticuerpo o de TCR pueden ser proteínas o ácidos nucleicos que codifican moléculas de anticuerpo o de TCR, cuyos ácidos nucleicos pueden incorporarse, a su vez, a un vector de expresión apropiado y/o estar contenidos en una célula hospedadora adecuada.
El conjunto de ADNc puede someterse a una reacción de PCR con polinucleótidos que se hibridan con una región constante de la cadena pesada de genes de anticuerpos y polinucleótidos que se hibridan con el extremo 5' de la región de la cadena Vh o Va o Vy de genes de anticuerpo o TCR. El grupo de ADNc puede someterse a una reacción de PCR con polinucleótidos que se hibridan con una región constante de la cadena pesada, o cadena alfa o gamma de genes de anticuerpos o de TCR y polinucleótidos que se hibridan con la región 5' al extremo 5' de la región de la cadena VH o Va o Vy de un polinucleótido con código de barras que comprende una secuencia de anticuerpo o de TCR. También se puede configurar una reacción de PCR para la amplificación del grupo de cadenas Vl o Vp o V8 de, por ejemplo, las clases kappa y lambda. El conjunto de ADNc puede someterse a una reacción de PCR con polinucleótidos que se hibridan con una región constante de la cadena liviana de genes de anticuerpos y polinucleótidos que se hibridan con el extremo 5' de la región de la cadena Vl o Vp o VS de genes de anticuerpo o TCR. El grupo de ADNc puede someterse a una reacción de PCR con polinucleótidos que se hibridan con una región constante de la cadena liviana de genes de anticuerpos y polinucleótidos que se hibridan con la región 5' al extremo 5' de la región de la cadena Vl o Vp o VS de un polinucleótido con código de barras que comprende una secuencia de anticuerpo o de TCR. Dichos oligonucleótidos o cebadores pueden diseñarse basándose en la información de la base de datos de secuencias de genes de inmunoglobulina o TCR conocida y disponible para el público en general.
En algunas realizaciones, las secuencias de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS pueden obtenerse convenientemente de un banco de secuencias de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS producidas mediante la amplificación por PCR usando uno o más cebadores que no son específicos de los genes de cadena pesada o liviana y, en particular, para una o ambas regiones terminales de los polinucleótidos Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS. En algunas realizaciones, las secuencias de Vh y Vl se pueden obtener convenientemente a partir de un banco de secuencias de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS producidas mediante amplificación por PCR usando cebadores específicos de una región del polinucleótido con código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, las secuencias de Vh y Vl pueden obtenerse convenientemente de un banco de secuencias de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS producidas mediante la amplificación por PCR usando cebadores específicos de la familia del gen C o cebadores específicos del gen C. En algunas realizaciones, las secuencias de Vh y Vl pueden obtenerse convenientemente de un banco de secuencias de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS producidas mediante la amplificación por PCR usando un conjunto de cebadores con un primer cebador específico de una región del polinucleótido con código de barras del recipiente y un segundo cebador o una pluralidad de segundos cebadores que son cebadores específicos de la familia del gen C o cebadores específicos del gen C. En algunas realizaciones, las secuencias de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS pueden obtenerse convenientemente de un banco de secuencias de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS producidas mediante la amplificación por PCR usando un conjunto de cebadores con un primer cebador específico de una región del polinucleótido con código de barras del recipiente y un segundo cebador específico de una secuencia universal.
En algunas realizaciones, tras la transcripción inversa, las secuencias de ADNc resultantes pueden amplificarse mediante PCR usando uno o más cebadores específicos de los genes de inmunoglobulina y, en particular, para una o ambas regiones terminales de los polinucleótidos Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS. En algunas realizaciones, las secuencias de Vh y Vl pueden obtenerse de un banco de secuencias de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS producidas mediante la amplificación por PCR usando cebadores específicos de la familia del gen V o cebadores específicos del gen V (Nicholls et al., J. Immunol. Meth., 1993, 165:81; WO93/12227) o diseñarse de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica basándose en la información de secuencias disponible. (Las secuencias de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS se pueden ligar, en general, con una secuencia espaciadora intermedia (por ejemplo, que codifica un espaciador peptídico flexible en fase), formando un casete que codifica un anticuerpo monocatenario). Las secuencias de la región V pueden clonarse convenientemente como ADNc o productos de amplificación por PCR para células de expresión de inmunoglobulina. Las regiones de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS se secuencian, opcionalmente, en los métodos descritos en la presente y, en particular, tras ciertos pasos como se indica (por ejemplo, después de la PCR de una única célula; tras la visualización en superficies de células de mamífero o de otro tipo, tras el rastreo FACS y similares). Se puede usar la secuenciación, entre otras razones, para verificar que el nivel de diversidad se encuentre en un nivel aceptable. La secuenciación puede incluir la secuenciación de alto rendimiento, la secuenciación profunda (en la que se secuencia el mismo gen a partir de una pluralidad de muestras individuales para identificar diferencias en las secuencias) o combinaciones de las dos.
En algunas realizaciones, no es necesario unir físicamente las combinaciones naturales de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y V8 usando los métodos descritos en la presente. En algunas realizaciones, los ADNc, los polinucleótidos con código de barras o los ADNc con código de barras amplificados por PCR no están unidos físicamente. En algunas realizaciones, los ADNc, los polinucleótidos con código de barras o los ADNc con código de barras amplificados por PCR no se unen físicamente en la misma reacción o recipiente.
En algunas realizaciones, las combinaciones naturales de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS se unen físicamente, usando, además de los cebadores de ADNc, un cebador o una pluralidad de cebadores para el extremo 5' del gen Vh o Va o Vy y otro cebador o pluralidad de cebadores para el extremo 5' del gen Vl o Vp o VS. Estos cebadores también contienen colas complementarias de secuencia adicional, para permitir el autoensamblaje de los genes Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS. Después de la amplificación por PCR y la unión, la posibilidad de obtener productos mixtos, en otras palabras, regiones variables mezcladas, es mínima, porque las reacciones de amplificación y unión se realizaron dentro de cada célula. Además, el riesgo de mezcla se puede reducir por la utilización de reactivos voluminosos tales como nucleótidos marcados con digoxigenina para garantizar además que los pares de ADNc de la región V no abandonan el compartimento celular y se entremezclan, sino que permanecen dentro de la célula para la amplificación por PCR y la unión. Las secuencias amplificadas se unen mediante la hibridación de secuencias terminales complementarias. Después de la unión, se pueden recuperar secuencias de las células para usarlas en otros pasos del método que se describen en la presente. Por ejemplo, el ADN recuperado puede amplificarse por PCR usando cebadores terminales, si es necesario, y clonarse en vectores que pueden ser plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos, vectores víricos o combinaciones de los mismos, como se detalla a continuación. Se pueden incorporar sitios de enzimas de restricción convenientes en las secuencias hibridadas para facilitar la clonación. Estos vectores también se pueden guardar como un banco de regiones variables unidas para su posterior uso.
Para proporcionar combinaciones adicionales de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS, se puede seleccionar un sistema de expresión. Por ejemplo, los sistemas de expresión de bacteriófagos permiten la recombinación aleatoria de secuencias de cadenas pesadas y livianas. Los expertos en la materia conocen otros sistemas de expresión adecuados.
Cabe señalar que, en el caso de las secuencias de Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS no derivadas de ser humano, en algunas realizaciones, puede ser preferible quimerizar estas secuencias con un Fc completamente humano. Como se usa en la presente, "quimerización " se refiere a una inmunoglobulina o TCR, en donde las regiones variables de cadena pesada y liviana o Va y Vp o Vy y VS no son de origen humano y en donde las regiones constantes de cadena pesada y liviana o Va y Vp o Vy y VS son de origen humano. Esto se ve afectado al amplificar y clonar los dominios variables en un Fc humano. El Fc humano puede ser parte del vector, o en una molécula separada, y también se podría usar el banco de Fc. En una realización preferida, las moléculas quimerizadas que crecen en células de mamífero tales como células CHO, se seleccionan con FACS dos veces para enriquecer la población celular en células que expresan el anticuerpo de interés. Los anticuerpos quimerizados o TCR se caracterizan, ya sea mediante secuenciación seguida de caracterización funcional, o mediante caracterización funcional directa o cinética. El crecimiento, la detección y la caracterización se describen en detalle a continuación.
Es importante señalar que las reacciones de PCR descritas anteriormente se describen para clonar los anticuerpos en forma de IgG. Se prefieren estos, ya que, en general, se asocian con una respuesta inmunitaria más madura y, en general, muestran una afinidad más alta que los anticuerpos IgM, lo que los hace más deseables para ciertas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Como es evidente, sin embargo, se pueden diseñar polinucleótidos que permitirán la clonación de una o más de las otras formas de moléculas de inmunoglobulina, por ejemplo, IgM, IgA, IgE e IgD, si se desea o es apropiado.
Una vez que se ha identificado un anticuerpo o TCR, y la población apropiada de dichas células se ha aislado en un momento apropiado y, opcionalmente, enriquecido como se ha descrito anteriormente, no es necesario generar de inmediato los bancos de expresión de anticuerpos o TCR, siempre que el material genético contenido en las células se pueda mantener intacto, lo que permite la creación del banco en una fecha posterior. Por lo tanto, por ejemplo, las células, un lisado celular o un ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ADN derivado de los mismos, pueden almacenarse hasta una fecha posterior mediante métodos apropiados, por ejemplo, mediante congelación, y generarse bancos de expresión en una fecha posterior cuando se desee.
Una vez que se ha generado el banco de vectores de expresión, las moléculas de anticuerpo codificadas pueden expresarse en un sistema de expresión apropiado y detectarse usando técnicas apropiadas que son muy conocidas y están documentadas en la técnica. Por lo tanto, el procedimiento de la invención definido anteriormente puede comprender los pasos adicionales de expresar el banco de vectores de expresión en un sistema de expresión apropiado y rastrear el banco expresado en busca de anticuerpos con propiedades deseadas.
Como se indica en la presente, los polinucleótidos preparados mediante los métodos de la divulgación que comprenden secuencias de anticuerpos o TCR que codifican polinucleótidos pueden incluir, entre otros, aquellos que codifican la secuencia de aminoácidos de un fragmento de anticuerpo o de TCR, por sí mismo, la secuencia no codificante para el anticuerpo o TCR completo, o una parte del mismo, la secuencia codificante para un anticuerpo o TCR, fragmento o parte, así como secuencias adicionales, tales como la secuencia codificante de al menos un péptido de fusión o líder señal, con o sin las secuencias codificantes adicionales mencionadas anteriormente, tales como al menos un intrón, junto con secuencias no codificantes adicionales, incluidas, entre otras, secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas, no traducidas, que desempeñan un papel en la transcripción, el procesamiento del ARNm, incluyendo las señales de corte y empalme y poliadenilación (por ejemplo, la unión al ribosoma y la estabilidad del ARNm); una secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. Por lo tanto, la secuencia que codifica un anticuerpo puede fusionarse con una secuencia marcadora, tal como una secuencia codificante de un péptido que facilite la purificación del anticuerpo o TCR fusionado que comprende un fragmento o una parte de anticuerpo o TCR.
Los productos primarios de la PCR se pueden someter luego opcionalmente a una reacción de PCR secundaria con nuevos conjuntos de polinucleótidos que se hibridan con los extremos 5' y 3' de los dominios variables Vh, Vl kappa y Vl lambda o Va y Vp o Vy y V8 de los anticuerpos o TCR (según sea apropiado, dependiendo de si la reacción de PCR primaria con la que se usan los nuevos conjuntos de polinucleótidos se diseñó para amplificar partes de los genes de anticuerpos de cadena pesada o liviana o genes de TCR de Va o Vp o genes de TCR de Vy o VS). Estos polinucleótidos incluyen ventajosamente secuencias de ADN específicas para un conjunto definido de enzimas de restricción (es decir, sitios de enzimas de restricción) para la posterior clonación. Las enzimas de restricción seleccionadas deben seleccionarse de modo que no se corten dentro de los segmentos de gen V de anticuerpo o TCR humanos. Dichos polinucleótidos pueden diseñarse en función de la información de la base de datos de secuencias de genes de inmunoglobulina o TCR y de enzimas de restricción conocida y disponible para el público en general. Sin embargo, los sitios de enzimas de restricción preferidos que se deben incluir son Ncol, Hind III, MluI y Notl. Los productos de dichas reacciones de PCR secundarias son repertorios de varios fragmentos/dominios de anticuerpos de V-pesada, V-liviana kappa y V- liviana lambda. Por lo tanto, este tipo de reacción de PCR secundaria, en general, se lleva a cabo cuando el formato de banco de expresión de interés es un formato scFv o Fv, en donde solo están presentes los dominios Vh y Vl o Va y Vp o Vy y VS de un anticuerpo o TCR.
Los productos de PCR también pueden someterse a una reacción de PCR con nuevos conjuntos de cebadores que se hibridan con los extremos 5' y 3' de los polinucleótidos con código de barras. Estos polinucleótidos pueden incluir ventajosamente secuencias de ADN específicas de un conjunto definido de enzimas de restricción (es decir, sitios de enzimas de restricción) para su posterior clonación. Las enzimas de restricción seleccionadas deben seleccionarse de modo que no se corten dentro de los segmentos de gen V de anticuerpo o TCR humanos. Dichos polinucleótidos pueden diseñarse en función de la información de la base de datos de secuencias de genes de inmunoglobulina o TCR y de enzimas de restricción conocida y disponible para el público en general. Sin embargo, los sitios de enzimas de restricción preferidos que se deben incluir son Ncol, Hind III, MluI y Notl. Los productos de dichas reacciones de PCR secundarias son repertorios de diversos fragmentos/dominios de anticuerpos Vh, Vl kappa y Vl lambda o fragmentos/dominios de TCR Va y Vp o Vy y VS.
También se pueden usar con este sistema fragmentos Fv o Fab de cadenas pesadas o livianas, o cadenas Va o Vp o cadenas Vy o VS, o anticuerpos o TCR monocatenarios. Una cadena pesada o liviana, o una cadena Va o Vp, o una cadena Vy o VS se pueden mutagenizar, seguido de la adición de la cadena complementaria a la solución. Luego, se permite que las dos cadenas se combinen y formen un fragmento de anticuerpo funcional. La adición de secuencias aleatorias no específicas de cadena liviana o pesada, o Va o Vp, o Vy o VS permite la producción de un sistema combinatorio para generar un banco de diversos miembros.
Los bancos de dichos repertorios de fragmentos clonados que comprenden las regiones variables de cadena pesada o cadena Va o cadena Vy, o los fragmentos de las mismas, y/o las regiones variables de cadena liviana o cadena Vp o cadena VS, o fragmentos de las mismas, de genes de anticuerpos o TCR derivados de los linfocitos B o T de hospedadores con inmunodeficiencia como se definen en la presente forman aspectos adicionales de la invención. Estos bancos que comprenden regiones variables clonadas pueden insertarse opcionalmente en vectores de expresión para formar bancos de expresión.
En algunas realizaciones, las reacciones de PCR pueden configurarse para retener la totalidad o parte de las regiones constantes de las diversas cadenas de anticuerpos o TCR contenidas en la población de células inmunitarias aisladas. Esto es deseable cuando el formato del banco de expresión es un formato Fab, en donde el componente de cadena pesada o alfa o gamma comprende los dominios Vh o Va o Vy y Ch o Ca o Cy, y el componente de cadena liviana o de cadena Vp o de cadena VS comprende los dominios de cadena Vl o Vp o Vs y Cl o Cp o CS. De nuevo, los bancos de dichos fragmentos clonados que comprenden la totalidad o parte de las regiones constantes de cadenas de anticuerpo o TCR forman aspectos adicionales de la invención.
Estos ácidos nucleicos pueden comprender convenientemente secuencias además de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, un sitio de clonación múltiple que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasas puede insertarse en el ácido nucleico para ayudar al aislamiento del polinucleótido. Asimismo, se pueden insertar secuencias traducibles para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia de marcador de hexa-histidina proporciona un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención, excluyendo la secuencia codificante, es opcionalmente un vector, adaptador o enlazador para la clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención.
Se pueden añadir secuencias adicionales a dichas secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar al aislamiento del polinucleótido o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y enlazadores es muy conocido en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel, citado anteriormente; o Sambrook, citado anteriormente).
Los bancos divulgados en la presente pueden usarse en una variedad de aplicaciones. Como se usa en la presente, un banco comprende una pluralidad de moléculas. En algunas realizaciones, un banco comprende una pluralidad de polinucleótidos. En algunas realizaciones, un banco comprende una pluralidad de cebadores. En algunas realizaciones, un banco comprende una pluralidad de lecturas de secuencias de uno o más polinucleótidos, amplicones o conjuntos de amplicones. Un banco se puede almacenar y usar varias veces para generar muestras para su análisis. Algunas aplicaciones incluyen, por ejemplo, el genotipado de polimorfismos, el estudio del procesamiento del ARN y la selección de representantes clónicos para realizar la secuenciación de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente. Pueden generarse bancos que comprenden una pluralidad de polinucleótidos, tales como cebadores, o bancos para secuenciación o amplificación, en donde una pluralidad de polinucleótidos comprende al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1.000.000, 50.000.000, 100.000.000 o más códigos de barras moleculares o códigos de barras del recipiente. En algunas realizaciones, los bancos de polinucleótidos comprenden una pluralidad de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1.000. 000, 50.000.000, 100.000.000 o más polinucleótidos únicos, en donde cada polinucleótido único comprende uno o más códigos de barras moleculares y códigos de barras del recipiente.
Códigos de barras
Un código de barras molecular, como un código de barras molecular de antígeno, comprende información que es exclusiva de una única molécula, como un único oligonucleótido de un complejo de afinidad-oligonucleótido o una molécula de polinucleótido de una única célula o de un solo recipiente. Un código de barras del recipiente comprende información que es única para polinucleótidos de una única célula o de un solo recipiente, en comparación con polinucleótidos de una única célula diferente o presente en un solo recipiente diferente. En algunas realizaciones, la información única comprende una secuencia única de nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia de código de barras molecular o de código de barras del recipiente puede determinarse mediante la determinación de la identidad y del orden de la secuencia única o aleatoria de nucleótidos que comprende el código de barras molecular o un código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, la información única no se puede usar para identificar la secuencia de un polinucleótido diana. Por ejemplo, un código de barras molecular se puede unir a un polinucleótido diana, pero el código de barras molecular no se puede usar para determinar el polinucleótido diana al que está unido. En algunas realizaciones, la información única no es una secuencia conocida enlazada a la identidad de la secuencia de un polinucleótido diana. Por ejemplo, un código de barras del recipiente puede estar unido a uno o más polinucleótidos diana, pero el código de barras del recipiente no se puede usar para determinar a cuál de los uno o más polinucleótidos diana está unido. En algunas realizaciones, la información única comprende una secuencia aleatoria de nucleótidos. En algunas realizaciones, la información única comprende una o más secuencias únicas de nucleótidos en un polinucleótido. En algunas realizaciones, la información única comprende una secuencia de nucleótidos degenerada o un código de barras degenerado. Un código de barras degenerado puede comprender una secuencia o composición de bases de nucleótidos variable. Por ejemplo, un código de barras degenerado puede ser una secuencia aleatoria. En algunas realizaciones, una secuencia de complemento de un código de barras molecular o un código de barras del recipiente también es una secuencia de código de barras molecular o de código de barras del recipiente.
Un código de barras puede comprender cualquier longitud de nucleótidos. Por ejemplo, cualquiera de los códigos de barras descritos en la presente puede tener una longitud dentro de un rango de 2 a 36 nucleótidos, de 4 a 36 nucleótidos, o de 6 a 30 nucleótidos, o de 8 a 20 nucleótidos, de 2 a 20 nucleótidos, de 4 a 20 nucleótidos, o de 6 a 20 nucleótidos. En determinados aspectos, las temperaturas de fusión de los códigos de barras dentro de un conjunto están dentro de los 10 °C entre sí, dentro de los 5 °C entre sí o dentro de los 2 °C entre sí. En determinados aspectos, las temperaturas de fusión de los códigos de barras dentro de un conjunto no están dentro de los 10 °C entre sí, dentro de los 5 °C entre sí o dentro de los 2 °C entre sí. En algunos aspectos, los códigos de barras son miembros de un conjunto de hibridación cruzada mínima. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de cada miembro de dicho conjunto puede ser lo suficientemente diferente de la de todos los demás miembros del conjunto, por lo que ningún miembro puede formar un dúplex estable con el complemento de cualquier otro miembro en condiciones de hibridación rigurosas. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de cada miembro de un conjunto de hibridación cruzada mínima difiere de las de cada otro miembro en al menos dos nucleótidos. Las tecnologías de código de barras se describen en Winzeler et al. (1999) Science 285:901; Brenner (2000) Genome Biol.1:1 Kumar et al. (2001) Nature Rev. 2:302; Giaever et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:793; Eason et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:11046; y Brenner (2004) Genome Biol. 5:240.
Por ejemplo, un código de barras puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 o 1.000 nucleótidos. Por ejemplo, un código de barras puede comprender como máximo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 o 1.000 nucleótidos. En algunas realizaciones, un código de barras tiene una longitud particular de nucleótidos. Por ejemplo, un código de barras puede ser de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 o 1.000 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, cada código de barras en una pluralidad de códigos de barras tiene al menos aproximadamente 2 nucleótidos. Por ejemplo, cada código de barras en una pluralidad de códigos de barras puede ser al menos de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 o 1.000 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, cada código de barras en una pluralidad de códigos de barras tiene como máximo aproximadamente 1.000 nucleótidos. Por ejemplo, cada código de barras en una pluralidad de códigos de barras puede ser como máximo de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 o 1.000 nucleótidos de longitud.
El número de códigos de barras moleculares puede ser superior al número total de moléculas que se deben marcar en una pluralidad de recipiente. El número de códigos de barras del recipiente puede ser superior al número total de moléculas que se deben marcar en una pluralidad de recipientes. Por ejemplo, el número con códigos de barras moleculares o códigos de barras del recipiente puede ser de al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces superior al número total de moléculas que se deben marcar en una pluralidad de recipientes.
El número de códigos de barras moleculares diferentes puede ser superior al número total de moléculas que se deben marcar en una pluralidad de recipiente. En algunas realizaciones, el número de códigos de barras moleculares diferentes es al menos aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces superior al número total de moléculas que se deben marcar en una pluralidad de recipientes.
El número de códigos de barras moleculares diferentes de un solo recipiente puede ser superior al número de moléculas diferentes que se deben marcar en el recipiente individual. En algunas realizaciones, el número de códigos de barras moleculares diferentes de un solo recipiente es al menos aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces superior al número de moléculas diferentes que se deben marcar en el recipiente individual.
El número de códigos de barras del recipiente diferentes puede ser inferior al número total de moléculas que se deben marcar en una pluralidad de recipientes. En algunas realizaciones, el número de códigos de barras del recipiente diferentes es al menos aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces inferior al número total de moléculas que se deben marcar en una pluralidad de recipientes.
El número de moléculas del producto amplificado de una molécula de polinucleótido con código de barras del recipiente de un solo recipiente puede ser superior al número de moléculas diferentes que se deben marcar en el recipiente individual. En algunas realizaciones, el número de moléculas de producto amplificado de una molécula de polinucleótido con código de barras del recipiente de un solo recipiente es al menos aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces superior al número de moléculas diferentes que se deben marcar en el recipiente individual.
El número de moléculas de polinucleótido con código de barras del recipiente de un solo recipiente puede ser inferior al número de moléculas diferentes que se deben marcar en el recipiente individual. En algunas realizaciones, el número de moléculas de polinucleótido con código de barras del recipiente de un solo recipiente es al menos aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces inferior al número de moléculas diferentes que se deben marcar en el recipiente individual.
El número de moléculas de polinucleótido con código de barras del recipiente de un solo recipiente puede ser una molécula. El número de moléculas de polinucleótido con código de barras del recipiente no amplificado de un solo recipiente puede ser una molécula.
En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de los diferentes los códigos de barras moleculares tienen la misma concentración. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40
%, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de los diferentes los códigos
de barras de recipiente tienen la misma concentración.
En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %,
20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 %
de los diferentes los códigos de barras moleculares tienen una concentración diferente. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40
%, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de los diferentes los códigos
de barras del recipiente tienen una concentración diferente.
Los códigos de barras moleculares o códigos de barras del recipiente de una población con códigos de barras moleculares o códigos de barras del recipiente pueden tener al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80,
90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más secuencias diferentes. Por ejemplo, los códigos de
barras moleculares o códigos de barras del recipiente de una población pueden tener al menos 2.000, 3.000. 4.000,
5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000,
1.000. 000,o más secuencias diferentes. Por lo tanto, se puede usar una pluralidad de códigos de barras moleculares o códigos de barras del recipiente para generar al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200,
300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más secuencias diferentes de uno o más polinucleótidos, tales como polinucleótidos diana. Por ejemplo, se puede usar una pluralidad de códigos de barras moleculares o códigos de
barras del recipiente para generar al menos 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7
x 106, 8 x 106, 9 x 106,1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x
1011, 4 x 1011, 5 x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 2 x 1012, 3 x 10124 x 1012, 5 x 1012, 6 x 1012, 7 x
1012, 8 x 1012, 9 x 1012 o más secuencias diferentes de uno o más polinucleótidos, tales como polinucleótidos diana.
Por ejemplo, se puede usar una pluralidad de códigos de barras moleculares o códigos de barras del recipiente para generar al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600,
700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000 , 600.000 , 700.000 , 800.000, 900.000, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x
108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108,1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x
1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 4 x 1012, 5 x 1012, 6 x 1012, 7 x 1012, 8 x 1012,
9 x 1012 o más secuencias diferentes de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80,
90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2
x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x
109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5 x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 4 x 1012, 5 x 1012, 6
x 1012, 7 x 1012, 8 x 1012, 9 x 1012 o más polinucleótidos diana.
En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares para agrupar o reunir secuencias. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares para agrupar o reunir secuencias, en
donde las secuencias de cada compartimento contienen el mismo código de barras molecular. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares o códigos de barras del recipiente para agrupar o
reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimento comprenden un conjunto de amplicones. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares para agrupar o reunir secuencias, en
donde las secuencias de cada compartimento comprenden una pluralidad de secuencias en donde los polinucleótidos a partir de los que se generó la pluralidad de secuencias derivaron de la misma molécula de polinucleótido en una reacción de amplificación.
En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, en
donde las secuencias de cada compartimento contienen el mismo código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimento comprenden uno o más conjuntos de amplicones. En algunas realizaciones, se
usan uno o más códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias en cada compartimento comprenden una pluralidad de secuencias en donde los polinucleótidos a partir de los que se generó
la pluralidad de secuencias se derivaron de los polinucleótidos de un solo recipiente o de una sola célula.
En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID para agrupar o reunir secuencias. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento contienen la misma secuencia de AID. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias en cada compartimiento comprenden uno o más conjuntos de amplicones. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento comprenden una pluralidad de secuencias en donde los polinucleótidos a partir de los que se generó la pluralidad de secuencias se derivaron de los polinucleótidos de un solo recipiente o de una sola célula.
En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento contienen la misma secuencia de AMB. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias en cada compartimiento comprenden uno o más conjuntos de amplicones. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento comprenden una pluralidad de secuencias en donde los polinucleótidos a partir de los cuales se generó la pluralidad de secuencias derivaron de los polinucleótidos de un único recipiente o de una única célula.
En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento contienen la misma secuencia de AID. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento contienen la misma secuencia de AID y una secuencia de AMB diferente. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento contienen la misma secuencia de AID y la misma secuencia de AMB. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento comprenden uno o más conjuntos de amplicones. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias en cada compartimiento comprenden una pluralidad de secuencias en donde los polinucleótidos a partir de los cuales se generó la pluralidad de secuencias derivaron del mismo polinucleótido en una reacción de amplificación y de la misma célula o recipiente único.
En algunas realizaciones, se utilizan uno o más códigos de barras del recipiente y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias. En algunas realizaciones, se utilizan uno o más códigos de barras del recipiente y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimento contienen el mismo código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, se utilizan uno o más códigos de barras del recipiente y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimento contienen el mismo código de barras del recipiente y una secuencia de AMB diferente. En algunas realizaciones, se utilizan uno o más códigos de barras del recipiente y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimento contienen el mismo código de barras del recipiente y la misma secuencia de AMB. En algunas realizaciones, se utilizan uno o más códigos de barras del recipiente y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento comprenden uno o más conjuntos de amplicones. En algunas realizaciones, se utilizan uno o más códigos de barras del recipiente y secuencias de AMB para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias en cada compartimiento comprenden una pluralidad de secuencias en donde los polinucleótidos a partir de los cuales se generó la pluralidad de secuencias derivaron del mismo polinucleótido en una reacción de amplificación y de la misma célula o recipiente único.
En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento contienen la misma secuencia de AID. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias en cada compartimiento contienen la misma secuencia de AID y un mismo código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento comprenden uno o más conjuntos de amplicones. En algunas realizaciones, se utilizan una o más secuencias de AID y códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias en cada compartimiento comprenden una pluralidad de secuencias en donde los polinucleótidos a partir de los cuales se generó la pluralidad de secuencias derivaron del mismo polinucleótido en una reacción de amplificación y de la misma célula o recipiente único.
En algunas realizaciones, se utilizan uno o más códigos de barras moleculares y códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias. En algunas realizaciones, se utilizan uno o más códigos de barras moleculares y códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias en cada compartimiento contienen el mismo código de barra molecular y un mismo código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, se utilizan uno o más códigos de barras moleculares y códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias de cada compartimiento comprenden uno o más conjuntos de amplicones. En algunas realizaciones, se utilizan uno o más códigos de barras moleculares y códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, en donde las secuencias en cada compartimiento comprenden una pluralidad de secuencias en donde los polinucleótidos a partir de los cuales se generó la pluralidad de secuencias derivaron del mismo polinucleótido en una reacción de amplificación y de la misma célula o recipiente único. En algunas realizaciones, uno o más códigos de barras moleculares y códigos de barras del recipiente no se usan para alinear secuencias.
En algunas realizaciones, uno o más códigos de barras moleculares no se usan para alinear secuencias. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares para alinear secuencias. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares para agrupar o reunir secuencias, y se usa una región específica de la diana para alinear secuencias. En algunas realizaciones, uno o más códigos de barras del recipiente no se usan para alinear secuencias. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras del recipiente para alinear secuencias. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, y se usa una región específica de la diana para alinear secuencias. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares y códigos de barras del recipiente para alinear secuencias. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares y códigos de barras del recipiente para agrupar o reunir secuencias, y se usa una región específica de la diana para alinear secuencias.
En algunas realizaciones, las secuencias alineadas contienen la misma AID. En algunas realizaciones, las secuencias alineadas contienen el mismo AMB. En algunas realizaciones, las secuencias alineadas contienen la misma AID y AMB. En algunas realizaciones, las secuencias alineadas contienen la misma AID y código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, las secuencias alineadas contienen el mismo AMB y código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, las secuencias alineadas contienen el mismo código de barras molecular. En algunas realizaciones, las secuencias alineadas contienen el mismo código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, las secuencias alineadas contienen el mismo código de barras molecular y código de barras del recipiente. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares o códigos de barras del recipiente para alinear secuencias, en donde las secuencias alineadas comprenden dos o más secuencias de un conjunto de amplicones. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares o códigos de barras del recipiente para alinear secuencias, en donde las secuencias alineadas comprenden una pluralidad de secuencias en donde los polinucleótidos a partir de los que se generó la pluralidad de secuencias derivaron de la misma molécula de polinucleótido en una reacción de amplificación. En algunas realizaciones, se usan uno o más códigos de barras moleculares o códigos de barras del recipiente para alinear secuencias, en donde las secuencias alineadas comprenden una pluralidad de secuencias en donde los polinucleótidos a partir de los que se generó la pluralidad de secuencias derivaron de una sola célula o un solo recipiente.
Generación de gotitas
La división de una muestra de una pluralidad de células en pequeños volúmenes de reacción, asociados al código de barras molecular y del recipiente de polinucleótidos de, o derivados de, una célula individual de la pluralidad de células puede permitir una secuenciación de alto rendimiento de un repertorio de secuencias, tales como las secuencias de biomarcadores.
La división de una muestra de una pluralidad de células en pequeños volúmenes de reacción, asociados al código de barras molecular y del recipiente de polinucleótidos de, o derivados de, una célula individual de la pluralidad de células puede permitir una secuenciación de alto rendimiento de un repertorio de secuencias, tales como secuencias que representan un porcentaje del transcriptoma de un organismo. Por ejemplo, un repertorio de secuencias puede comprender una pluralidad de secuencias que representan al menos aproximadamente el 0,00001 %, 0,00005 %, 0,00010 %, 0,00050 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % del transcriptoma de un organismo.
La división de una muestra de células inmunitarias en pequeños volúmenes de reacción, asociados al código de barras molecular y del recipiente de polinucleótidos de, o derivados de, una célula inmunitaria individual de la pluralidad de células inmunitarias puede permitir la secuenciación de alto rendimiento de un repertorio de secuencias de cadenas pesadas y livianas. Estos métodos también pueden permitir el emparejamiento de las cadenas pesadas y livianas después de la secuenciación basada en las secuencias con códigos de barras. La división de una muestra en pequeños volúmenes de reacción como se describe en la presente también puede permitir el uso de cantidades reducidas de reactivos, lo que reduce el coste de materiales del análisis.
En algunos casos, la reacción de transcripción inversa y/o la reacción de amplificación (por ejemplo, PCR) se llevan a cabo en gotitas, tales como en la PCR digital de gotitas. En determinados aspectos, la invención proporciona compartimentos fluídicos para contener todo o una parte de un material diana. En algunas realizaciones, un compartimento es una gotita. Aunque se hace referencia a "gotitas" a lo largo de la memoria descriptiva, ese término se usa indistintamente con el compartimiento de fluido y la partición de fluido a menos que se indique lo contrario. Salvo los casos en los que se indique lo contrario, "gotita" se usa por conveniencia, y se puede usar cualquier partición o compartimiento de fluido. Las gotitas usadas en la presente pueden incluir composiciones de emulsión (o mezclas de dos o más fluidos inmiscibles), tal como se describe en la patente de Estados Unidos n. ° 7.622.280. Las gotitas se pueden generar mediante dispositivos descritos en el documento WO/2010/036352. El término emulsión, como se usa en la presente, puede referirse a una mezcla de líquidos inmiscibles (tal como aceite y agua). Las emulsiones en fase oleosa y/o de agua en aceite permiten la compartimentación de mezclas de reacción dentro de gotitas acuosas. Las emulsiones pueden comprender gotitas acuosas dentro de una fase oleosa continua. Las emulsiones proporcionadas en la presente pueden ser emulsiones de aceite en agua, en las que las gotitas son gotitas de aceite dentro de una fase acuosa continua. Las gotitas proporcionadas en la presente están diseñadas para evitar la mezcla entre compartimentos, protegiendo cada compartimento su contenido de la evaporación y uniéndose con el contenido de otros compartimentos.
Las mezclas o emulsiones descritas en la presente pueden ser estables o inestables. Las emulsiones pueden ser relativamente estables y tener una coalescencia mínima. La coalescencia se produce cuando las gotitas pequeñas se combinan para formar progresivamente gotas más grandes. En algunos casos, menos del 0,00001 %, 0,00005 %, 0,00010 %, 0,00050 %, 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 2,5 %, 3%, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10% de las gotitas generadas por un generador de gotitas se une con otras gotitas. Las emulsiones también pueden tener una floculación limitada, un proceso mediante el que la fase dispersa sale de la suspensión en escamas.
Se pueden generar gotitas con un diámetro medio de aproximadamente, menos de aproximadamente, o más de aproximadamente, o de al menos aproximadamente 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 200, 300, 400 o 500 micrómetros. Las gotitas pueden tener un diámetro medio de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 500, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 500, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 micrómetros. Se sabe que los métodos microfluídicos para producir gotitas de emulsión usando el enfoque de flujo cruzado de microcanales o la agitación física producen emulsiones monodispersas o polidispersas. Las gotitas pueden ser gotitas monodispersas. Las gotitas se pueden generar de modo que el tamaño de las gotitas no varíe en más de más/menos el 5 % del tamaño medio de las gotitas. En algunos casos, las gotitas se generan de manera que el tamaño de las gotitas no varíe en más de más/menos el 2 % del tamaño medio de las gotitas. Un generador de gotitas puede generar una población de gotitas a partir de una sola muestra, en donde ninguna de las gotitas varía en tamaño en más de más/menos aproximadamente el 0,1%, 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 5,5 %, 6 %, 6,5 %, 7 %, 7,5 %, 8 %, 8,5 %, 9 %, 9,5 % o 10 % del tamaño medio de la población total de gotitas.
Una mayor estabilidad mecánica puede ser útil para manipulaciones microfluídicas y procesamiento fluídico de mayor cizalla (por ejemplo, en capilares microfluídicos o mediante giros de 90 grados, tales como válvulas, en la trayectoria fluídica). Las gotitas o cápsulas antes y después de tratarse térmicamente pueden ser estables mecánicamente a las manipulaciones con pipetas y a la centrifugación convencionales.
Una gotita puede formarse haciendo fluir una fase oleosa a través de una muestra acuosa. La fase acuosa puede comprender una solución tamponada y reactivos para realizar una reacción de amplificación, que incluyen células, nucleótidos, análogos de nucleótidos, polinucleótidos con códigos de barras moleculares, cebadores de polinucleótidos con códigos de barras del recipiente, ácidos nucleicos de molde y enzimas, tales como una ADN polimerasa, ARN polimerasa y/o transcriptasa inversa.
La fase acuosa puede comprender una solución tamponada y reactivos para realizar una reacción de amplificación con o sin una superficie sólida, tal como una perla. La solución tamponada puede comprender aproximadamente, más que aproximadamente o menos de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100 o 200 mM de Tris. En algunos casos, la concentración de cloruro de potasio puede ser de aproximadamente, más de aproximadamente o menos de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200 mM. La solución tamponada puede comprender aproximadamente Tris 15 mM y KCl 50 mM. Los nucleótidos pueden comprender moléculas de desoxirribonucleótido trifosfato, que incluyen dATP, dCTP, dGTP y dTTP, a concentraciones de aproximadamente, más de aproximadamente, o menos de aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 o 700 pm cada una. En algunos casos, el dUTP se añade dentro de la fase acuosa a una concentración de aproximadamente, más de aproximadamente o menos de aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 o 700, 800, 900 o 1.000 pm. En algunos casos, se añade cloruro de magnesio o acetato de magnesio (MgCb) a la fase acuosa a una concentración de aproximadamente, más de aproximadamente o menos de aproximadamente 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 o 5,0 mM. La concentración de MgCb puede ser de aproximadamente 3,2 mM. En algunos casos, se usa acetato de magnesio o magnesio. En algunos casos, se usa sulfato de magnesio.
Se puede usar un agente bloqueador no específico, tal como BSA o gelatina de piel bovina, en donde la gelatina o la BSA está presente en un intervalo de concentraciones del aproximadamente 0,1 al 0,9 % p/v. Otros posibles agentes bloqueadores pueden incluir betalactoglobulina, caseína, leche en polvo u otros agentes bloqueadores comunes. En algunos casos, las concentraciones preferidas de BSA y gelatina son del aproximadamente 0,1 % p/v.
Los cebadores para la amplificación dentro de la fase acuosa pueden tener una concentración de aproximadamente, más de aproximadamente o menos de aproximadamente 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7 o 2,0 |jm. La concentración del cebador dentro de la fase acuosa puede ser de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0, de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1,0, de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 1,0, de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1,0 o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,0 jm. La concentración de los cebadores puede ser de aproximadamente 0,5 jm. Los intervalos proporcionables para las concentraciones de ácido nucleico diana en la PCR incluyen, entre otros, entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 500 ng.
En algunos casos, la fase acuosa también puede comprender aditivos que incluyen, entre otros, ácidos nucleicos de bloqueo/de fondo no específicos (por ejemplo, ADN de esperma de salmón), bioconservantes (por ejemplo, azida de sodio), potenciadores de la PCR (por ejemplo, betaína, trehalosa, etc.) e inhibidores (por ejemplo, inhibidores de la ARNsa). Otros aditivos pueden incluir, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, (mono)hidrato de betaína (N,W,W-trimetilglicina = [caroxi-metil]trimetilamonio), trehalosa, 7-desaza-2'-desoxiguanosina trifosfato (dC7GTP o 7-desaza-2'-dGTP), BSA (albúmina de suero bovino), formamida (metanamida), cloruro de tetrametilamonio (TMAC), otros derivados de tetralquilamonio (por ejemplo, cloruro de tetraetilamonio (TEA-Cl) y cloruro de tetrapropilamonio (TPrA-Cl), detergente no iónico (por ejemplo, Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (NP-40)) o PREXCEL-Q. En algunos casos, la fase acuosa puede comprender 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aditivos diferentes. En otros casos, la fase acuosa puede comprender al menos 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aditivos diferentes.
En algunos casos, se puede añadir un copolímero de bloques de óxido de etileno/óxido de propileno no iónico a la fase acuosa a una concentración de aproximadamente 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 % o 1,0 %. Los biotensioactivos comunes incluyen tensioactivos no iónicos tales como Pluronic F-68, Tetronics y Zonyl FSN. Pluronic F-68 puede estar presente a una concentración de aproximadamente 0,5 % p/v.
En algunos casos, el cloruro de magnesio se puede sustituir por el sulfato de magnesio, a concentraciones similares. La solución tamponada se puede sustituir por una amplia selección de tampones de PCR comerciales, comunes, de diversos proveedores.
La emulsión se puede formular para producir gotitas altamente monodispersas que tengan una película interfacial de tipo líquido que se puede convertir calentando en microcápsulas que tienen una película interfacial de tipo sólido; dichas microcápsulas pueden comportarse como biorreactores capaces de retener su contenido a través de un proceso de reacción tal como la amplificación por PCR. La conversión en la forma de microcápsula puede ocurrir tras el calentamiento. Por ejemplo, dicha conversión puede ocurrir a una temperatura superior a aproximadamente 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C, 90 °C o 95 °C. En algunos casos, este calentamiento se produce mediante un termociclador. Durante el proceso de calentamiento, se puede usar una capa de fluido o aceite mineral para evitar la evaporación. El exceso de aceite de fase continua puede o no puede eliminarse antes del calentamiento. Las cápsulas biocompatibles pueden ser resistentes a la coalescencia y/o floculación en una amplia selección de procesos térmicos y mecánicos. Tras la conversión, las cápsulas se pueden almacenar a aproximadamente, más de aproximadamente o menos de aproximadamente 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C o 40 °C. Estas cápsulas pueden ser útiles en aplicaciones biomédicas, tales como la encapsulación digitalizada y estable de macromoléculas, en particular, fluidos biológicos acuosos que contienen una mezcla de ácidos nucleicos o proteínas, o ambos juntos; administración de fármacos y vacunas; bancos biomoleculares; aplicaciones clínicas de generación de imágenes y otras.
Las microcápsulas pueden contener uno o más polinucleótidos, y pueden resistir la coalescencia, en particular, a altas temperaturas. Por consiguiente, las reacciones de amplificación por PCR pueden producirse a una densidad muy alta (por ejemplo, número de reacciones por unidad de volumen). En algunos casos, pueden producirse más de 100.000, 500.000, 1.000.000, 1.500.000, 2.000.000, 2.500.000, 5.000.000 o 10.000.000 por ml. En algunos casos, las reacciones se producen en un solo pocillo, por ejemplo, un pocillo de una placa de microtitulación, sin mezclarse entre los volúmenes de reacción. Las microcápsulas también pueden contener otros componentes necesarios para permitir que se produzca una transcripción inversa, una extensión del cebador y/o una reacción de PCR, por ejemplo, cebadores, sondas, dNTP, ADN o ARN polimerasas, etc. Estas cápsulas presentan resistencia a la coalescencia y a la floculación a través de una amplia selección de procesos térmicos y mecánicos.
En algunos casos, el paso de amplificación se lleva a cabo mediante la realización de una PCR digital, tal como una PCR digital microfluídica o una pCr digital de gotitas.
Las gotitas se pueden generar usando sistemas o dispositivos microfluídicos. Como se utiliza en la presente, el prefijo "micro" (por ejemplo, como "microcanal" o "microfluídico"), en general, se refiere a elementos o artículos que tienen anchos o diámetros de menos de aproximadamente 1 mm y menos de aproximadamente 100 micrones (micrómetros) en algunos casos. En algunos casos, el elemento o artículo incluye un canal a través del que puede fluir un fluido. Además, "microfluídico", como se utiliza en la presente, se refiere a un dispositivo, aparato o sistema que incluye al menos un canal a microescala.
Los sistemas y dispositivos microfluídicos se han descrito en una variedad de contextos, normalmente, en el contexto del análisis de laboratorio miniaturizado (por ejemplo, clínico). También se han descrito otros usos. Por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente internacional n. ° WO 01/89788; WO 2006/040551; WO 2006/040554; WO 2004/002627; WO 2008/063227; WO 2004/091763; WO 2005/021151; WO 2006/096571; WO 2007/089541; WO 2007/081385 y WO 2008/063227.
Una gotita generalmente incluye una cantidad de un primer fluido de muestra en un segundo fluido portador. Con los métodos de la invención, se puede usar cualquier técnica conocida en la materia para formar gotitas. Un método ilustrativo implica hacer fluir una corriente del fluido de muestra que contiene el material diana (por ejemplo, una célula inmunitaria) de manera que interseccione con dos corrientes opuestas de fluido portador que fluye. El fluido portador es inmiscible con el fluido de muestra. La intersección del fluido de muestra con las dos corrientes opuestas del fluido portador que fluye produce la división del fluido de muestra en gotitas de muestra individuales que contienen el material diana.
El fluido portador puede ser cualquier fluido que sea inmiscible con el fluido de muestra. Un fluido portador ilustrativo es el aceite. En determinadas realizaciones, el fluido portador incluye un tensioactivo.
El mismo método puede aplicarse para crear gotitas individuales que contienen otros reactivos, tales como los reactivos para una reacción de amplificación, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o una reacción de amplificación no basada en la PCR, tal como la amplificación por desplazamiento de múltiples cadenas u otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Los reactivos adecuados para realizar reacciones de amplificación basadas en PCR son conocidos por los expertos en la materia, e incluyen, entre otros, ADN polimerasas, cebadores directos e inversos, trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP) y uno o más tampones.
En determinadas realizaciones, se forman compartimentos fluídicos proporcionando una primera partición de fluido (por ejemplo, una gotita) que comprende un material diana (por ejemplo, una célula inmunitaria y/o un soporte sólido tal como una perla) y un segundo fluido (por ejemplo, como corriente fluida o dentro de gotitas). El primer y segundo fluido se fusionan para formar una gotita. La fusión se puede lograr mediante la aplicación de un campo eléctrico a los dos fluidos. En determinadas realizaciones, el segundo fluido contiene reactivos para llevar a cabo una reacción de amplificación, tal como una reacción en cadena de la polimerasa o una reacción de amplificación.
En determinados aspectos, la invención proporciona un método para crear un banco de secuencias de anticuerpos de cadena pesada y liviana y/o secuencias de TCR de cadena alfa y beta y/o secuencias de TCR de cadena gamma y delta con un código de barras único que incluye la obtención de una pluralidad de construcciones de ácido nucleico en la que cada construcción incluye un N-mero único y un N-mero funcional. El N-mero funcional puede ser un N-mero aleatorio, un cebador de PCR, un cebador universal, un anticuerpo, un extremo de adhesión o cualquier otra secuencia. El método puede incluir la creación de M conjuntos de un número N de compartimentos de fluido, cada uno de los cuales contiene una o más copias de una construcción única. El método puede crear bancos de códigos de barras de mayor complejidad mediante la adición de una construcción adicional a cada compartimiento de un conjunto, y su repetición para que cada conjunto produzca N x M compartimentos, conteniendo cada uno un par único de construcciones. Los pares se pueden hibridar o ligar para producir nuevas construcciones. En cada construcción en un banco de códigos de barras, cada N-mero único puede adaptarse para su identificación por secuenciación, hibridación de sondas, otros métodos o una combinación de métodos.
Bancos de gotitas
En general, un banco de gotitas está formado por una serie de elementos del banco que se agrupan en una sola colección. Los bancos pueden variar en cuanto a su complejidad desde un único elemento del banco a 1 x 1015 elementos del banco o más. Cada elemento del banco es uno o más componentes dados a una concentración fija. El elemento puede ser, entre otros, células, perlas, aminoácidos, proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos o compuestos químicos de moléculas pequeñas. El elemento puede contener un identificador, tal como un código de barras molecular, un código de barras del recipiente o ambos.
Un elemento del banco de células puede incluir, entre otros, hibridomas, linfocitos B, linfocitos T, células primarias, líneas celulares cultivadas, células cancerosas, células madre o cualquier otro tipo de célula. Los elementos del banco celular se preparan encapsulando una serie de células, desde una a decenas de miles, en gotitas individuales. El número de células encapsuladas generalmente viene dado por las estadísticas de Poisson a partir de la densidad numérica de las células y del volumen de la gotita. Sin embargo, en algunos casos, el número se desvía de las estadísticas de Poisson como se describe en Edd et al., Lab Chip, 8(8): 1262-1264, 2008. La naturaleza diferenciada de las células permite la preparación de los bancos en masa con una pluralidad de variantes celulares, tales como las células inmunitarias que producen un anticuerpo o TCR cada una, todas presentes en un solo medio de partida, y luego ese medio se divide en cápsulas de gotitas individuales que contienen una célula como máximo. Las células dentro de las gotitas individuales se lisan, los polinucleótidos de cadena pesada y liviana y/o los polinucleótidos de cadena alfa y beta y/o los polinucleótidos de cadena gamma y delta de las células lisadas se codifican con códigos de barras moleculares y códigos de barras del recipiente, y se amplifican y luego se combinan o se agrupan para formar un banco que consiste en elementos del banco de cadena pesada y liviana y/o cadena alfa y beta y/o cadena gamma y delta.
Un elemento de banco basado en perlas contiene una o más perlas, y también puede contener otros reactivos, tales como anticuerpos, enzimas u otras proteínas. En caso de que todos los elementos del banco contengan diferentes tipos de perlas, pero los mismos medios circundantes, los elementos del banco pueden prepararse a partir de un solo fluido de partida o tener una variedad de fluidos de partida. En el caso de los bancos celulares preparados en masa a partir de una colección de variantes, los elementos del banco se prepararán a partir de una variedad de fluidos de partida. Es deseable tener exactamente una célula por gotita, conteniendo solo unas cuantas gotitas más de una célula al comenzar con una pluralidad de células. En algunos casos, se pueden lograr variaciones de las estadísticas de Poisson para proporcionar una carga mejorada de gotitas, de modo que haya más gotitas con exactamente una célula por gotita y pocas excepciones de gotitas vacías o que contengan más de una célula.
En algunas realizaciones, es deseable tener exactamente un polinucleótido con código de barras del recipiente por gotita con solo unas cuantas gotitas que contienen más de un polinucleótido con código de barras del recipiente cuando se parte de una pluralidad de polinucleótidos con código de barras del recipiente. En algunos casos, se pueden lograr variaciones de las estadísticas de Poisson para proporcionar una carga mejorada de gotitas, de modo que haya más gotitas con exactamente un polinucleótido con código de barras del recipiente por gotita y pocas excepciones de gotitas vacías o que contengan más de un polinucleótido con código de barras del recipiente.
Los ejemplos de bancos de gotitas son colecciones de gotitas que tienen diferentes contenidos, que varían desde perlas, células, moléculas pequeñas, ADN, cebadores, anticuerpos y polinucleótidos con código de barras. Las gotitas varían en tamaño desde aproximadamente 0,5 micrómetros hasta 500 micrómetros de diámetro, lo que corresponde a aproximadamente 1 picolitro a 1 nanolitro. Sin embargo, las gotitas pueden ser tan pequeñas como de 5 micrómetros y tan grandes como de 500 micrómetros. Preferiblemente, las gotitas son inferiores a 100 micrómetros, de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 100 micrómetros de diámetro. El tamaño más preferido es de aproximadamente 20 a 40 micrómetros de diámetro (10 a 100 picolitros). Las propiedades preferidas examinadas de los bancos de gotitas incluyen el equilibrio de la presión osmótica, el tamaño uniforme y los intervalos de tamaño.
Las gotitas comprendidas dentro del banco de gotitas proporcionado por la presente invención son preferiblemente de tamaño uniforme. Es decir, el diámetro de cualquier gotita dentro del banco variará menos del 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o 0,5 % en comparación con el diámetro de otras gotitas dentro del mismo banco. El tamaño uniforme de las gotitas en el banco puede ser crítico para mantener la estabilidad y la integridad de las gotitas, y también puede ser esencial para el uso posterior de las gotitas dentro del banco para los diversos ensayos biológicos y químicos descritos en la presente.
La presente divulgación proporciona un banco de gotitas que comprende una pluralidad de gotitas acuosas dentro de un fluido inmiscible, en donde cada gotita es preferiblemente de tamaño esencialmente uniforme y comprende un elemento del banco diferente. La invención proporciona un método para formar el banco de gotitas que comprende proporcionar un solo fluido acuoso que comprende diferentes elementos del banco, encapsular cada elemento del banco en una gotita acuosa dentro de un fluido inmiscible.
En determinadas realizaciones, diferentes tipos de elementos (por ejemplo, células o perlas), se agrupan en una sola fuente contenida en el mismo medio. Después de la agrupación inicial, los elementos se encapsulan en gotitas para generar un banco de gotitas en donde cada gotita con un tipo diferente de perla o célula es un elemento del banco diferente. La dilución de la solución inicial permite el proceso de encapsulación. En algunas realizaciones, las gotitas formadas contendrán un solo elemento o no contendrán nada, es decir, estarán vacías. En otras realizaciones, las gotitas formadas contendrán múltiples copias de un elemento del banco. Los elementos que se encapsulan son generalmente variantes de un tipo. En un ejemplo, los elementos son células inmunitarias de una muestra de sangre, y cada célula inmunitaria se encapsula para amplificar y codificar con código de barras las secuencias de anticuerpos de los nucleótidos en las células inmunitarias.
Por ejemplo, en un tipo de banco de emulsiones, hay elementos del banco que tienen diferentes partículas, es decir, células o polinucleótidos con código de barras en un medio diferente y se encapsulan antes de la agrupación. En un ejemplo, un número específico de elementos del banco, es decir, número n de células diferentes o polinucleótidos con código de barras, está contenido dentro de diferentes medios. Cada uno de los elementos del banco se emulsiona y se agrupa por separado, momento en el que cada uno del número n de elementos del banco diferentes se combinan y se agrupan en una sola agrupación. La agrupación resultante contiene una pluralidad de gotitas de emulsión de agua en aceite que contienen cada una un tipo diferente de partícula.
En algunas realizaciones, las gotitas formadas contendrán un solo elemento del banco o no contendrán nada, es decir, estarán vacías. En otras realizaciones, las gotitas formadas contendrán múltiples copias de un elemento del banco. Al contenido de las perlas le sigue una distribución de Poisson, en la que existe una distribución de probabilidad diferenciada que expresa la probabilidad de que ocurra un número de eventos en un período de tiempo fijo si estos eventos ocurren con una velocidad media conocida e independientemente del tiempo transcurrido desde el último evento. Los aceites y tensioactivos usados para crear los bancos impiden el intercambio del contenido del banco entre las gotitas.
Cebadores
En general, se pueden usar uno o más pares de cebadores en una reacción de amplificación; un cebador de un par de cebadores puede ser un cebador directo y un cebador de un par de cebadores puede ser un cebador inverso. En algunos casos, se puede usar un primer par de cebadores en la reacción de amplificación; un cebador del primer par puede ser un cebador directo complementario a una secuencia de una primera molécula de polinucleótido diana y un cebador del primer par puede ser un cebador inverso que puede ser complementario a una segunda secuencia de la primera molécula de polinucleótido diana, y un primer locus diana puede residir entre la primera secuencia y la segunda secuencia. En algunas realizaciones, el primer locus diana comprende una secuencia Vh o Va o Vy. En algunas realizaciones, el primer locus diana comprende una secuencia de AID y/o una secuencia de AMB.
En algunos casos, se puede usar un segundo par de cebadores en la reacción de amplificación; un cebador del segundo par puede ser un cebador directo complementario a una primera secuencia de una segunda molécula de polinucleótido diana y un cebador del segundo par puede ser un cebador inverso complementario a una segunda secuencia de la segunda molécula de polinucleótido diana, y un segundo locus diana puede residir entre la primera secuencia y la segunda secuencia. En algunas realizaciones, el segundo locus diana comprende una secuencia Vl o Vp o V5.
En algunos casos, se puede usar un tercer par de cebadores en la reacción de amplificación; un cebador del tercer par puede ser un cebador directo complementario a una primera secuencia de una tercera molécula de polinucleótido diana y un cebador del tercer par puede ser un cebador inverso complementario a una segunda secuencia de la tercera molécula de polinucleótido diana, y un tercer locus diana puede residir entre la primera secuencia y la segunda secuencia. En algunas realizaciones, el tercer locus diana comprende un código de barras, tal como un código de barras molecular o código de barras del recipiente.
La longitud del cebador directo y el cebador inverso pueden depender de la secuencia del polinucleótido diana y del locus diana. Por ejemplo, la longitud y/o Tm del cebador directo y del cebador inverso se pueden optimizar. En algunos casos, un cebador puede tener aproximadamente, más de aproximadamente o menos de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 nucleótidos de longitud. En algunos casos, un cebador es de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40, de aproximadamente 15 a aproximadamente 45, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50, de aproximadamente 15 a aproximadamente 55, de aproximadamente 15 a aproximadamente 60, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, de aproximadamente 20 a aproximadamente 35, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50, de aproximadamente 20 a aproximadamente 55 o de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud.
Un cebador puede ser un ADN monocatenario antes de unirse a un polinucleótido molde. En algunos casos, el cebador inicialmente comprende una secuencia bicatenaria. La longitud apropiada de un cebador puede depender del uso previsto del cebador, pero puede variar de aproximadamente 6 a aproximadamente 50 nucleótidos, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nucleótidos. En general, las moléculas de cebador corto pueden requerir temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con un molde. En algunas realizaciones, un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del ácido nucleico molde, pero puede ser suficientemente complementario para hibridarse con un molde. En algunos casos, un cebador puede ser parcialmente bicatenario antes de unirse a un polinucleótido de molde. Un cebador con secuencia bicatenaria puede tener un bucle en horquilla de aproximadamente, más de aproximadamente o menos de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16., 17, 18, 19 o 20 bases. Una parte bicatenaria de un cebador puede ser de aproximadamente, más de aproximadamente, menos de aproximadamente o al menos de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 pares de bases. El diseño de cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia diana dada es muy conocido en la técnica.
Los cebadores pueden incorporar características adicionales que permitan la detección o inmovilización del cebador, pero no modifique una propiedad básica del cebador (por ejemplo, que actúa como un punto de inicio de la síntesis del ADN). Por ejemplo, los cebadores pueden contener una secuencia de ácido nucleico adicional en el extremo 5' que no está hibridada con un ácido nucleico diana, pero que facilita la clonación o amplificación adicional, o la secuenciación de un producto amplificado. Por ejemplo, la secuencia adicional puede comprender un sitio de unión al cebador, tal como un sitio de unión al cebador universal. Una región del cebador que es suficientemente complementaria a un molde para hibridarse puede denominarse en la presente una región de hibridación.
En otro caso, un cebador utilizado en los métodos y en las composiciones que se describen en la presente puede comprender uno o más nucleósidos universales. Son ejemplos no limitantes de nucleósidos universales el 5-nitroindol y la inosina, como se describe en las publicaciones de solicitud de Estados Unidos n. ° 2009/0325169 y 2010/0167353.
Los cebadores pueden diseñarse de acuerdo con parámetros conocidos para evitar estructuras secundarias y la autohibridación. Diferentes pares de cebadores pueden hibridarse y fundirse a aproximadamente las mismas temperaturas, por ejemplo, dentro de 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C o 10 °C de otro par de cebadores. En algunos casos, inicialmente se usan más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 500, 1.000, 5.000, 10.000 o más cebadores. Dichos cebadores pueden hibridarse con los polinucleótidos diana descritos en la presente.
Los cebadores pueden prepararse mediante una variedad de métodos que incluyen, entre otros, la clonación de secuencias apropiadas y la síntesis química directa usando métodos muy conocidos en la técnica (Narang et al., Methods Enzymol. 68:90 (1979); Brown et al., Methods Enzymol. 68:109 (1979)). Los cebadores también se pueden obtener de fuentes comerciales. Los cebadores pueden tener una temperatura de fusión idéntica. Los cebadores pueden tener temperaturas de fusión no idénticas. Las longitudes de los cebadores pueden extenderse o acortarse en el extremo 5' o en el extremo 3' para producir cebadores con las temperaturas de fusión deseadas. Uno de los cebadores de un par de cebadores puede ser más largo que el otro cebador. Las longitudes de hibridación en 3' de los cebadores, dentro de un par de cebadores, pueden diferir. Asimismo, la posición de hibridación de cada par de cebadores puede diseñarse de modo que la secuencia y la longitud de los pares de cebadores produzcan la temperatura de fusión deseada. Una ecuación para determinar la temperatura de fusión de los cebadores inferiores a 25 pares de bases es la Regla de Wallace (Tm=2(A+T)+4(G+C)). También se pueden usar programas informáticos para diseñar los cebadores. La Tm (temperatura de fusión o de hibridación) de cada cebador puede calcularse usando programas informáticos. La temperatura de hibridación de los cebadores se puede recalcular y aumentar después de cualquier ciclo de amplificación, incluyendo, entre otros, los ciclos 1, 2, 3, 4, 5, ciclos 6-10, ciclos 10-15, ciclos 15-20, ciclos 20-25, ciclos 25-30, ciclos 30-35 o ciclos 35-40. Tras los ciclos iniciales de amplificación, la mitad 5' de los cebadores puede incorporarse a los productos de cada locus de interés; por lo tanto, la Tm se puede recalcular basándose tanto en las secuencias de la mitad 5' como de la mitad 3' de cada cebador.
Un sitio de cebador incluye el área del molde con el que se hibrida un cebador. En algunas realizaciones, los cebadores son capaces de actuar como un punto de inicio para la síntesis de ácido nucleico dirigida por molde. Por ejemplo, los cebadores pueden iniciar la síntesis de ácido nucleico dirigida por molde cuando cuatro nucleótidos diferentes y un agente de polimerización o una enzima, tal como la ADN o ARN polimerasa o la transcriptasa inversa. Un par de cebadores incluye 2 cebadores: un primer cebador con una región cadena arriba 5' que se hibrida con un extremo 5' de una secuencia de molde, y un segundo cebador con una región cadena abajo 3' que se hibrida con el complemento del extremo 3' de la secuencia de molde. Un conjunto de cebadores incluye dos o más cebadores: un primer cebador o una primera pluralidad de cebadores con una región cadena arriba 5' que se hibrida con un extremo 5' de una secuencia de molde o una pluralidad de secuencias de molde, y un segundo cebador o una segunda pluralidad de cebadores con una región cadena abajo 3' que se hibrida con el complemento del extremo 3' de la secuencia de molde o la pluralidad de secuencias de molde. En algunas realizaciones, un cebador comprende una secuencia específica de la diana. En algunas realizaciones, un cebador comprende una secuencia con código de barras de muestra. En algunas realizaciones, un cebador comprende una secuencia de cebado universal. En algunas realizaciones, un cebador comprende una secuencia de cebado de PCR. En algunas realizaciones, un cebador comprende una secuencia de cebado de PCR usada para iniciar la amplificación de un polinucleótido. (Dieffenbach, "PCR Primer: A Laboratory Manual", 2a edición (Cold Spring Harbor Press, Nueva York (2003)). El sitio o la secuencia de unión al cebador universal permite la unión de un cebador universal a un polinucleótido y/o amplicón. Los cebadores universales son muy conocidos en la técnica, e incluyen, entre otros, -47F (M13F), alfaMF, AOX3', AOX5', BGHr, CMV-30, CMV-50, CVMf, LACrmt, lamgda gt10F, lambda gt 10R, lambda gt11F, lambda gt11R, M13 rev, M13Forward(-20), M13Reverse, machos, p10SEQPpQE, pA-120, pet4, pGAP directo, pGLRVpr3, pGLpr2R, pKLAC14, pQEFS, pQERS, pucU1, pucU2, reversA, seqIREStam, seqIRESzpet, seqori, seqPCR, seqplRES-, seqpIRES+, seqpSecTag, seqpSecTag+, seqretro+PSI, SP6, T3-prom, T7-prom y T7-termlnv. Como se utiliza en la presente, la unión puede referirse a interacciones covalentes y a interacciones no covalentes. La unión del cebador universal con el sitio de unión al cebador universal se puede usar para la amplificación, detección y/o secuenciación del polinucleótido y/o del amplicón. El sitio de unión del cebador universal puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1.000 nucleótidos o pares de bases. En otro ejemplo, el sitio de unión del cebador universal comprende al menos aproximadamente 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 8.500, 9.000, 9.500 o 10.000 nucleótido o pares de bases. En algunas realizaciones, el sitio de unión del cebador universal comprende 1-10, 10-20, 10-30 o 10-100 nucleótidos o pares de bases. En algunas realizaciones, el sitio de unión del cebador universal comprende a partir de aproximadamente 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, 2-90, 2-80, 2-70, 2-60, 2-50, 2-40, 2-30, 2­ 20, 2-10, 1-900, 1-800, 1-700, 1-600, 1-500, 1-400, 1-300, 1-200, 1-100, 2-900, 2-800, 2-700, 2-600, 2-500, 2-400, 2­ 300, 2-200, 2-100, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-10, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10­ 30, 10-20, 10-10, 5-900, 5-800, 5-700, 5-600, 5-500, 5-400, 5-300, 5-200, 5-100, 10-900, 10-800, 10-700, 10-600, 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-100, 25-900, 25-800, 25-700, 25-600, 25-500, 25-400, 25-300, 25-200, 25-100, 100-1000, 100-900, 100-800, 100-700, 100-600, 100-500, 100-400, 100-300, 100-200, 200-1000, 200-900, 200-800, 200-700, 200-600, 200-500, 200-400, 200-300, 300-1000, 300-900, 300-800, 300-700, 300-600, 300-500, 300-400, 400-1000, 400-900, 400-800, 400-700, 400-600, 400-500, 500-1000, 500-900, 500-800, 500-700, 500-600, 600­ 1000, 600-900, 600-800, 600-700, 700-1000, 700-900, 700-800, 800-1000, 800-900 o 900-1.000 nucleótidos o pares de bases.
Los cebadores pueden tener una longitud compatible con su uso en la síntesis de productos de extensión de cebadores. Un cebador puede ser un polinucleótido que tiene una longitud de 8 a 200 nucleótidos. La longitud de un cebador puede depender de la secuencia del polinucleótido de molde y del locus del molde. Por ejemplo, se puede optimizar la longitud y/o la temperatura de fusión (Tm) de un cebador o conjunto de cebadores. En algunos casos, un cebador puede tener aproximadamente, más de aproximadamente o menos de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, los cebadores tienen una longitud de aproximadamente 8-100 nucleótidos, por ejemplo, 10-75, 15-60, 15-40, 18-30, 20­ 40, 21-50, 22-45, 25-40, 7-9, 12-15, 15-20, 15-25, 15-30, 15-45, 15-50, 15-55, 15-60, 20-25, 20-30, 20-35, 20-45, 20­ 50, 20-55 o 20-60 nucleótidos de longitud o cualquier longitud de entre medio. En algunas realizaciones, los cebadores son como máximo de aproximadamente 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 nucleótidos de longitud.
En general, se pueden usar uno o más pares de cebadores en una reacción de amplificación exponencial; un cebador de un par de cebadores puede ser un cebador directo y un cebador de un par de cebadores puede ser un cebador inverso. En algunas realizaciones, se puede usar un primer par de cebadores en la reacción de amplificación exponencial; un cebador del primer par puede ser un cebador directo complementario a una secuencia de un primera molécula de polinucleótido de molde y un cebador del primer par puede ser un cebador inverso complementario a una segunda secuencia de la primera molécula de polinucleótido de molde, y un primer locus de molde puede residir entre la primera secuencia y la segunda secuencia. En algunas realizaciones, se puede usar un segundo par de cebadores en la reacción de amplificación; un cebador del segundo par puede ser un cebador directo complementario a una primera secuencia de una segunda molécula de polinucleótido diana y un cebador del segundo par puede ser un cebador inverso complementario a una segunda secuencia de la segunda molécula de polinucleótido diana, y un segundo locus diana puede residir entre la primera secuencia y la segunda secuencia. En algunas realizaciones, el segundo locus diana comprende una secuencia variable de anticuerpo de cadena liviana. En algunas realizaciones, se puede usar un tercer par de cebadores en la reacción de amplificación; un cebador del tercer par puede ser un cebador directo complementario a una primera secuencia de una tercera molécula de polinucleótido molde y un cebador del tercer par puede ser un cebador inverso complementario a una segunda secuencia de la tercera molécula de polinucleótido molde, y un tercer locus molde puede residir entre la primera secuencia y la segunda secuencia.
Uno o más cebadores pueden hibridarse a al menos una parte de una pluralidad de polinucleótidos de molde. Uno o más cebadores pueden hibridarse al extremo 3' y/o al extremo 5' de la pluralidad de polinucleótidos de molde. Uno o más cebadores pueden hibridarse a una región interna de la pluralidad de polinucleótidos de molde. La región interna puede ser de al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1.000 nucleótidos de los extremos 3' o los extremos 5' de la pluralidad de polinucleótidos de molde. Uno o más cebadores pueden comprender un panel fijo de cebadores. Uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores personalizados. Uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de control. Uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de genes constitutivos. Uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal. El cebador universal puede hibridarse a un sitio de unión del cebador universal. En algunas realizaciones, uno o más cebadores personalizados se hibridan con un SBC, una región específica de la diana, complementos de los mismos o cualquier combinación de los mismos. Uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal. Uno o más cebadores pueden diseñarse para amplificar o realizar la extensión del cebador, transcripción inversa, extensión lineal, amplificación no exponencial, amplificación exponencial, PCR o cualquier otro método de amplificación de uno o más polinucleótidos diana o de molde.
La región específica de la diana puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1.000 nucleótidos o pares de bases. En algunas realizaciones, la región específica diana comprende al menos aproximadamente 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 8.500, 9.000, 9.500 o 10.000 nucleótidos o pares de bases. En algunas realizaciones, la región específica diana comprende al menos aproximadamente 5-10, 10-15, 10-20, 10-30, 15-30, 10-75, 15-60, 15-40, 18-30, 20-40, 21-50, 22-45, 25-40, 7-9, 12-15, 15-20, 15-25, 15-30, 15-45, 15-50, 15-55, 15-60, 20-25, 20-30, 20-35, 20-45, 20-50, 20-55, 20-60, 2-900, 2-800, 2-700, 2-600, 2-500, 2-400, 2-300, 2-200, 2-100, 25­ 900, 25-800, 25-700, 25-600, 25-500, 25-400, 25-300, 25-200, 25-100, 100-1000, 100-900, 100-800, 100-700, 100600, 100-500, 100-400, 100-300, 100-200, 200-1000, 200-900, 200-800, 200-700, 200-600, 200-500, 200-400, 200­ 300, 300-1000, 300-900, 300-800, 300-700, 300-600, 300-500, 300-400, 400-1000, 400-900, 400-800, 400-700, 400­ 600, 400-500, 500-1000, 500-900, 500-800, 500-700, 500-600, 600-1000, 600-900, 600-800, 600-700, 700-1000, 700-900, 700-800, 800-1000, 800-900 o 900-1000 nucleótidos o pares de bases.
Los cebadores pueden diseñarse de acuerdo con parámetros conocidos para evitar estructuras secundarias y la autohibridación. En algunas realizaciones, diferentes pares de cebadores pueden hibridarse y fundirse a aproximadamente las mismas temperaturas, por ejemplo, dentro de 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C o 10 °C de otro par de cebadores. En algunas realizaciones, uno o más cebadores de una pluralidad de cebadores pueden hibridarse y fundirse a aproximadamente las mismas temperaturas, por ejemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 °C de otro cebador de la pluralidad de cebadores. En algunas realizaciones, uno o más cebadores de una pluralidad pueden hibridarse y fundirse a diferentes temperaturas que otro cebador de la pluralidad de cebadores.
Una pluralidad de cebadores para uno o más pasos de los métodos descritos en la presente puede comprender una pluralidad de cebadores que comprende aproximadamente, como máximo aproximadamente o al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1.000. 000, 50.000.000, 100.000.000 cebadores diferentes. Por ejemplo, cada cebador de una pluralidad de cebadores puede comprender una secuencia o región específica diana o molde diferente.
Transcripción inversa
En algunos casos, los polinucleótidos diana se preparan a partir de un ARN mediante transcripción inversa. En algunos casos, los polinucleótidos diana se preparan a partir de un ADN mediante la extensión del cebador, tal como usando una polimerasa.
Los métodos descritos en la presente se pueden usar en PCR de transcripción inversa acoplada (PCR de transcripción inversa). Por ejemplo, la transcripción inversa y la PCR se pueden llevar a cabo en dos pasos distintos. En primer lugar, se puede sintetizar una copia de ADNc del ARNm de muestra usando un cebador polinucleótido dT, un cebador específico de la secuencia, un cebador universal o cualquier cebador descrito en la presente.
La transcripción inversa y la PCR se pueden llevar a cabo en una única reacción de recipiente cerrado. Por ejemplo, se pueden emplear tres cebadores, uno para la transcripción inversa y dos para la PCR. El cebador para la transcripción inversa puede unirse al ARNm 3' en la posición del amplicón de PCR. Aunque no es esencial, el cebador de transcripción inversa puede incluir residuos de ARN o análogos modificados, tales como las bases de ARN 2'-O-metilo que no formarán un sustrato para la RNasa H cuando se hibriden con el ARNm.
La temperatura para llevar a cabo la reacción de transcripción inversa depende de la transcriptasa inversa que se use. En algunos casos, se utiliza una transcriptasa inversa termoestable y la reacción de transcripción inversa se lleva a cabo de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 75 °C, a aproximadamente 37 °C a aproximadamente 50 °C, a aproximadamente 37 °C a aproximadamente 55 °C, a aproximadamente 37 °C a aproximadamente 60 °C, a aproximadamente 55 °C a aproximadamente 75 °C, a aproximadamente 55 °C a aproximadamente 60 °C, a aproximadamente 37 °C, o a aproximadamente 60 °C. En algunos casos, se utiliza una transcriptasa inversa que transfiere 3 o más nucleótidos terminales no molde a un extremo del producto transcrito.
Una reacción de transcripción inversa y la reacción de PCR descritas en la presente pueden llevarse a cabo en varios formatos conocidos en la técnica, tal como en tubos, placas de microtitulación, dispositivos microfluídicos o, preferiblemente, gotitas.
Una reacción de transcripción inversa se puede llevar a cabo en volúmenes que varían de 5 pl a 100 pl, o en volúmenes de reacción de 10 pl a 20 pl. En gotitas, los volúmenes de reacción pueden variar de 1 pl a 100 nl, o de 10 pl a 1 nl. En algunos casos, la reacción de transcripción inversa se lleva a cabo en una gotita que tiene un volumen que es aproximadamente o inferior a 1 nl. En algunos casos, una reacción de PCR está en una gotita que tiene un intervalo de volumen de reacción de 1 pl a 100 nl, preferiblemente de 10 pl a 1 nl. En algunos casos, la reacción de PCR se lleva a cabo en una gotita que tiene un volumen que es aproximadamente o inferior a 1 nl. En algunos casos, una reacción de transcripción inversa y una reacción de PCR se llevan a cabo en la misma gotita que tiene un volumen de reacción de 1 pl a 100 nl o de 10 pl a 1 nl. En algunos casos, la reacción de transcripción inversa y la reacción de PCR se llevan a cabo en una gotita que tiene un volumen que es de aproximadamente o inferior a 1 nl o un volumen que es de aproximadamente o inferior a 1 pl. En algunos casos, una reacción de transcripción inversa y una reacción de PCR se llevan a cabo en una gotita diferente. En algunos casos, una reacción de transcripción inversa y una reacción de PCR se llevan a cabo en una pluralidad de gotitas, cada una con un volumen de reacción que varía de 1 pl a 100 nl o de 10 pl a 1 nl. En algunos casos, la reacción de transcripción inversa y la reacción de PCR se llevan a cabo en una pluralidad de gotitas, cada una con un volumen que es de aproximadamente o inferior a 1 nl.
En algunos casos, una primera reacción de PCR es en una primera gotita que tiene un intervalo de volumen de reacción de 1 pl a 100 nl, preferiblemente de 10 pl a 1 nl, y una segunda reacción de PCR es en una segunda gotita que tiene un volumen de reacción en un intervalo de 1 pl a 100 nl, preferiblemente de 10 pl a 1 nl. En algunos casos, una primera reacción de PCR es en una primera gotita que tiene un volumen que es de aproximadamente o inferior a 1 nl, y una segunda reacción de PCR es en una segunda gotita que tiene un volumen que es de aproximadamente o inferior a 1 nl.
En algunos casos, una primera reacción de PCR y una segunda reacción de PCR se llevan a cabo en una pluralidad de gotitas, cada una con un volumen de reacción que varía de 1 pl a 100 nl o de 10 pl a 1 nl. En algunos casos, una primera reacción de PCR y una segunda reacción de PCR se llevan a cabo en una pluralidad de gotitas, cada una con un volumen que es de aproximadamente o inferior a 1 nl.
Los polinucleótidos diana, tal como el ARN, pueden transcribirse de forma inversa en ADNc usando uno o más cebadores de transcripción inversa. Uno o más cebadores de transcripción inversa pueden comprender una región complementaria a una región del ARN, tal como una región constante (por ejemplo, una región constante de cadena pesada o liviana o una cola poli-A de ARNm). En algunas realizaciones, los cebadores de transcripción inversa pueden comprender un primer cebador de transcripción inversa con una región complementaria a una región constante de un primer ARN, y un segundo cebador de transcripción inversa con una región complementaria a una región constante de un segundo ARN. En algunas realizaciones, los cebadores de transcripción inversa pueden comprender un primer cebador de transcripción inversa con una región complementaria a una región constante de un primer ARN, y uno o más cebadores de transcripción inversa con una región complementaria a una región constante de uno o más ARN, respectivamente.
En algunas realizaciones, los cebadores de transcripción inversa no comprenden un código de barras.
Los cebadores de transcripción inversa pueden comprender además una región que no sea complementaria a una región del ARN.
En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN se encuentra en 5' con respecto a una región de los cebadores que es complementaria al ARN. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN se encuentra en 3' con respecto a una región de los cebadores que es complementaria al ARN. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN es una región saliente 5'. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN comprende un sitio del cebador para la amplificación y/o una reacción de secuenciación. Usando uno o más cebadores descritos en la presente, las moléculas de ARN se transcriben de manera inversa usando reactivos adecuados conocidos en la técnica.
Después de realizar las reacciones de transcripción inversa de las moléculas de ARN, las moléculas de ADNc resultantes pueden codificarse con un código de barras molecular y un código de barras del recipiente y amplificarse mediante una o más reacciones de PCR, tal como una primera y/o una segunda reacción de PCR. La primera y/o la segunda reacción de PCR pueden utilizar un par de cebadores o una pluralidad de pares de cebadores. La primera y/o la segunda reacción de PCR pueden utilizar una pluralidad de cebadores directos/inversos y un cebador inverso. La primera y/o la segunda reacción de PCR pueden utilizar una pluralidad de cebadores directos/inversos y un cebador directo. Un primer y/o un segundo cebador de una pluralidad de cebadores directos/inversos puede ser un cebador directo/inverso que contenga una región complementaria a las moléculas de ADNc o moléculas de ADNc con código de barras. Un primer y/o un segundo cebador de una pluralidad de cebadores directos/inversos puede ser un cebador directo/inverso que contenga una región complementaria a las moléculas de ADNc con código de barras.
En algunas realizaciones, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende uno o más cebadores directos/inversos en donde cada uno de los cebadores directos/inversos de la pluralidad de cebadores directos/inversos comprende una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de V de los ADNc o los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de V de los ADNc o ADNc con código de barras y uno o más cebadores directos/inversos que comprenden una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de V de los ADNc o los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un primer y/o un segundo cebador directo/inverso que comprenden una región complementaria a una primera y/o una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de V de los ADNc o los ADNc con código de barras y un segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de V de los ADNc o los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un primer y/o un segundo cebador directo/inverso que comprenden una región complementaria a una primera y/o una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de V de los ADNc o los ADNc con código de barras, un segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de V de los ADNc o ADNc con código de barras, y un tercer cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una tercera región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de V de los ADNc o ADNc con código de barras, etc. Los cebadores de la pluralidad de cebadores directos/inversos se pueden utilizar para hibridarse a todas las posibles regiones cadena arriba o cadena abajo de todos los segmentos de V expresados por las células, tales como linfocitos B o linfocitos T inmunitarios, de la muestra.
En algunas realizaciones, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende uno o más cebadores directos/inversos en donde cada uno de los cebadores directos/inversos de la pluralidad de cebadores directos/inversos comprende una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de C de los ADNc o los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de C de los ADNc o ADNc con código de barras y uno o más cebadores directos/inversos que comprenden una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de C de los ADNc o los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un primer y/o un segundo cebador directo/inverso que comprenden una región complementaria a una primera y/o una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de C de los ADNc o los ADNc con código de barras y un segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de C de los ADNc o los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un primer y/o un segundo cebador directo/inverso que comprenden una región complementaria a una primera y/o una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de C de los ADNc o los ADNc con código de barras, un segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de C de los ADNc o ADNc con código de barras, y un tercer cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una tercera región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un segmento de C de los ADNc o ADNc con código de barras, etc. Los cebadores de la pluralidad de cebadores directos/inversos se pueden utilizar para hibridarse a todas las posibles regiones cadena arriba o cadena abajo de todos los segmentos de C expresados por las células, tales como linfocitos B o linfocitos T inmunitarios, de la muestra.
En algunas realizaciones, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende uno o más cebadores directos/inversos en donde cada uno de los cebadores directos/inversos de la pluralidad de cebadores directos/inversos comprende una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras molecular de los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras molecular de los ADNc con código de barras y uno o más cebadores directos/inversos que comprenden una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras molecular de los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un primer y/o un segundo cebador directo/inverso que comprenden una región complementaria a una primera y/o una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras molecular de los ADNc con código de barras y un segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras molecular de los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un primer y/o un segundo cebador directo/inverso que comprenden una región complementaria a una primera y/o una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras molecular de los ADNc con código de barras, un segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras molecular de los ADNc con código de barras, y un tercer cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una tercera región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras molecular de los ADNc con código de barras, etc. La pluralidad de cebadores directos/inversos se pueden utilizar para hibridarse a todas las posibles regiones cadena arriba o cadena abajo de todos los códigos de barras moleculares expresados por las células, tales como linfocitos B o linfocitos T inmunitarios, de la muestra.
En algunas realizaciones, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende uno o más cebadores directos/inversos en donde cada uno de los cebadores directos/inversos de la pluralidad de cebadores directos/inversos comprende una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras del recipiente de los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras del recipiente de los ADNc con código de barras y uno o más cebadores directos/inversos que comprenden una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras del recipiente de los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un primer y/o un segundo cebador directo/inverso que comprenden una región complementaria a una primera y/o una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras del recipiente de los ADNc con código de barras y un segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras del recipiente de los ADNc con código de barras. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un primer y/o un segundo cebador directo/inverso que comprenden una región complementaria a una primera y/o una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras del recipiente de los ADNc con código de barras, un segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una segunda región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras del recipiente de los ADNc con código de barras, y un tercer cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una tercera región cadena arriba o cadena abajo con respecto a un código de barras del recipiente de los ADNc con código de barras, etc. Los cebadores en la pluralidad de cebadores directos/inversos se pueden utilizar para hibridarse a todas las posibles regiones cadena arriba o cadena abajo de todos los códigos de barras de recipientes expresados por las células, tales como linfocitos B o linfocitos T inmunitarios, de la muestra.
Los cebadores directos/inversos de la pluralidad de cebadores directos/inversos comprenden además una región que no es complementaria a una región del ARN. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN se encuentra en 5' con respecto a una región de los cebadores directo/inverso que es complementaria al ARN (es decir, una región cadena arriba o cadena abajo de un segmento V). En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN se encuentra en 3' con respecto a una región de los cebadores directo/inverso que es complementaria al ARN. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN es una región saliente 5'. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN comprende un sitio del cebador para la amplificación y/o una segunda reacción de secuenciación. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN comprende un sitio del cebador para la amplificación y/o una tercera reacción de secuenciación. En algunas realizaciones, la región que no es complementaria a una región del ARN comprende un sitio del cebador para una segunda y una tercera reacción de secuenciación. En algunas realizaciones, la secuencia del sitio del cebador para la segunda y la tercera reacción de secuenciación es la misma. Usando uno o más cebadores directo/inverso y un cebador inverso como se describe en la presente, las moléculas de ADNc se amplifican usando reactivos adecuados conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, una región es complementaria a una región del ARN, tal como la región constante o una cola poli-A del ARNm.
En algunas realizaciones, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende uno o más cebadores directos/inversos en donde cada uno de los cebadores directos/inversos de la pluralidad de cebadores directos/inversos comprende una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo con respecto a un recipiente del código de barras de los oligonucleótidos con código de barras de los conjugados de afinidad-oligonucleótido. En algunas realizaciones, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende uno o más cebadores directos/inversos en donde cada uno de los cebadores directos/inversos en la pluralidad de cebadores directos/inversos comprende una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo a una AID de los oligonucleótidos con código de barras de los conjugados de afinidad-oligonucleótido. En algunas realizaciones, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende uno o más cebadores directos/inversos en donde cada uno de los cebadores directos/inversos en la pluralidad de cebadores directos/inversos comprende una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo a un AMB de los oligonucleótidos con código de barras de los conjugados de afinidad-oligonucleótido. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una región cadena arriba o cadena abajo de un código de barras del recipiente, AID y/o AMB de los oligonucleótidos con código de barras de conjugados de afinidad-oligonucleótido y uno o más de otros cebadores directos/inversos que comprenden una región complementaria a una o más regiones cadena arriba o cadena abajo de un código de barras del recipiente, AID y/o AMB de los oligonucleótidos con código de barras de conjugados de afinidad-oligonucleótido. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un primer y/o segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una primera y/o segunda región cadena arriba o cadena abajo de un código de barras del recipiente, AID y/o AMB de los oligonucleótidos con código de barras de conjugados de afinidad-oligonucleótido y un segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una segunda región cadena arriba o cadena abajo de un código de barras del recipiente, AID y/o AMB de los oligonucleótidos con código de barras de conjugados de afinidad-oligonucleótido. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores directos/inversos comprende un primer y/o segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una primera y/o segunda región cadena arriba o cadena abajo de un código de barras del recipiente, AID y/o AMB de los oligonucleótidos con código de barras de conjugados de afinidad-oligonucleótido, un segundo cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una segunda región cadena arriba o cadena abajo de un código de barras del recipiente, AID y/o AMB de los oligonucleótidos con código de barras de conjugados de afinidad-oligonucleótido, y un tercer cebador directo/inverso que comprende una región complementaria a una tercera región cadena arriba o cadena abajo de un código de barras del recipiente, AID y/o AMB de los oligonucleótidos con código de barras de conjugados de afinidadoligonucleótido, etc.
Amplificación
Después de añadir un código de barras del recipiente a un polinucleótido diana, el polinucleótido diana se puede amplificar. Por ejemplo, después de que se haya añadido un código de barras del recipiente a un oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonudeótido, el oligonucleótido se puede amplificar. Por ejemplo, después de que se haya añadido un código de barras del recipiente al polinucleótido celular, el polinucleótido celular con código de barras del recipiente se puede amplificar.
Una reacción de amplificación puede comprender uno o más aditivos. En algunos casos, el uno o más aditivos son dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, (mono)hidrato de betaína (N,W,W-trimetilglicina = [caroxi-metil]trietilamonio), trehalosa, 7-desaza-2'-desoxiguanosina trifosfato (dC7GTP o 7-desaza-2'-dGTP), BSA (albúmina de suero bovino), formamida (metanamida), cloruro de tetrametilamonio (TMAC), otros derivados de tetralquilamonio (por ejemplo cloruro de tetraetilamonio (TEA-Cl) y cloruro de tetrapropilamonio (TPrA-Cl), detergente no iónico (por ejemplo, Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (NP-40)) o PREXCEL-Q. En algunos casos, una reacción de amplificación comprende 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aditivos diferentes. En otros casos, una reacción de amplificación comprende al menos 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aditivos diferentes.
Las reacciones de termociclado se pueden realizar en muestras contenidas en volúmenes de reacción (por ejemplo, gotitas). Las gotitas pueden ser polidispersas o, preferiblemente, monodispersas, generadas por agitación, ultrasonidos o microfluídicamente a través de una unión al canal T u otros medios por los que están familiarizados con la técnica. Las densidades pueden superar las 20.000 gotitas/40 ul (gotitas de 1 nl), 200.000 gotitas/40 ul (gotitas de 100 pl). Las gotitas pueden permanecer intactas durante el termociclado. Las gotitas pueden permanecer intactas durante el termociclado a densidades superiores a aproximadamente 10.000 gotitas/pl, 100.000 gotitas/pl, 200.000 gotitas/pl, 300.000 gotitas/pl, 400.000 gotitas/pl, 500.000 gotitas/pl, 600.000 gotitas/pl, 700.000 gotitas/pl, 800.000 gotitas/pl, 900.000 gotitas/pl o 1.000.000 gotitas/pl. En otros casos, dos o más gotitas no se unen durante el termociclado. En otros casos, más de 100 o más de 1.000 gotitas no se unen durante el termociclado.
Se puede utilizar cualquier ADN polimerasa que catalice la extensión del cebador, incluidas, entre otras, ADN polimerasa de E.coli, fragmento Klenow de ADN polimerasa 1 de E.coli, ADN polimerasa T7, ADN polimerasa T4, polimerasa Taq, ADN polimerasa Pfu, ADN polimerasa Vent, bacteriófago 29, REDTaq™, ADN polimerasa genómica o secuenasa. En algunos casos, se utiliza una ADN polimerasa termoestable. También se puede realizar una PCR inicial en caliente en donde la reacción se calienta hasta 95 °C durante dos minutos antes de la adición de la polimerasa o la polimerasa se puede mantener inactiva hasta el primer paso de calentamiento en el ciclo 1. La PCR inicial en caliente se puede utilizar para minimizar la amplificación inespecífica. Se puede usar cualquier número de ciclos de PCR para amplificar el ADN, por ejemplo, aproximadamente, más de aproximadamente o menos de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 ciclos. El número de ciclos de amplificación puede ser de aproximadamente 1-45, 10-45, 20-45, 30-45, 35-45, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 20-35, 25-35, 30-35 o 35­ 40.
La amplificación de ácidos nucleicos diana se puede realizar mediante cualquier medio conocido en la técnica. Los ácidos nucleicos diana pueden amplificarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la amplificación isotérmica del ADN. Los ejemplos de técnicas de PCR que se pueden usar incluyen, entre otras, PCR cuantitativa, PCR fluorescente cuantitativa (QF-PCR), PCR fluorescente multiplex (MF-PCR), PCR en tiempo real (PCR de transcripción inversa), PCR de una sola célula, PCR de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP), PCR-RFLP/PCR-RFLP de transcripción inversa, PCR de inicio en caliente, PCR anidada, PCR de colonias de polimerasa in situ, amplificación por círculo rodante (RCA) in situ, PCR digital (dPCR), PCR digital de gotitas (ddPCR), PCR de puente, PCR en picolitros y PCR de emulsión. Otros métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación de la transcripción, la PCR de sonda de inversión molecular (MIP), la replicación de secuencias autosostenida, la amplificación selectiva de las secuencias de polinucleótidos diana, la reacción en cadena de la polimerasa cebada con secuencias de consenso (CP-PCR), la reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente (AP-PCR), la PCR cebada con polinucleótidos degenerados (DOP-PCR) y la amplificación de secuencias basada en ácidos nucleicos (NABSA). Otros método de amplificación que se pueden usar en la presente incluyen los descritos en las patentes de Estados Unidos n. ° 5.242.794; 5.494.810; 4.988.617; y 6.582.938, además de incluir la amplificación de ARN mediada por la replicasa Q beta. La amplificación puede ser una amplificación isotérmica, por ejemplo, amplificación lineal isotérmica.
En algunas realizaciones, la amplificación no se produce en un soporte sólido. En algunas realizaciones, la amplificación no se produce en un soporte sólido en una gotita. En algunas realizaciones, la amplificación se produce en un soporte sólido cuando la amplificación no está en una gotita.
Secuenciación
Tras realizar uno o más de los métodos o de los pasos del método descritos en la presente, se puede secuenciar un banco de polinucleótidos generados.
La secuenciación se puede realizar mediante cualquier método de secuenciación conocido en la técnica. En algunas realizaciones, la secuenciación se puede realizar a un alto rendimiento. Las tecnologías de secuenciación de próxima generación adecuadas incluyen la plataforma 454 Life Sciences (Roche, Branford, CT) (Margulies et al., Nature, 437, 376-380 (2005)); el analizador del genoma de lllumina, el ensayo de mutilación de GoldenGate o ensayos de metilación de Infinium, es decir, la matriz de perlas 27K de metilación humana Infinium o la matriz de metilación VeraCode GoldenGate (Illumina, San Diego, CA; Bibkova et al., Genome Res. 16, 383-393 (2006); y las patentes de Estados Unidos n. ° 6.306.597, 7.598.035, 7.232.656), o la secuenciación de ADN mediante ligadura, el sistema SOLiD (Applied Biosystems/life Technologies; las patentes de Estados Unidos n.° 6.797.470, 7.083.917, 7.166.434, 7.320.865, 7.332.285, 7.364.858 y 7.429.453); o la tecnología de secuenciación de ADN de una sola molécula en tiempo real de Helicos (Harris et al., Science, 320, 106-109 (2008); las patentes de Estados Unidos n. ° 7.037.687, 7.645.596 y 7.169.560 y 7.769.400), la tecnología para una sola molécula en tiempo real (SMRTTm) de Pacific Biosciences, y la secuenciación (Soni et al., Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)). Estos sistemas permiten la secuenciación multiplexada en paralelo de muchos polinucleótidos aislados de una muestra (Dear, Brief Funct. Genomic Proteomic, 1(4), 397-416 (2003) and McCaughan et al., J. Pathol., 220, 297-306 (2010)). En algunas realizaciones, los polinucleótidos se secuencian mediante secuenciación por ligadura de sondas modificadas con colorante, pirosecuenciación o secuenciación de una sola molécula. La determinación de la secuencia de un polinucleótido se puede realizar mediante métodos de secuenciación tales como la secuenciación de una sola molécula de Helioscope™, la secuenciación del ADN de Nanopore, la secuenciación masiva de distintivos en paralelo de Lynx Therapeutics (MPSS), pirosecuenciación 454, la secuenciación en tiempo real de una sola molécula (RNAP), secuenciación Illumina (Solexa), secuenciación SOLiD, Ion Torrent™, la secuenciación de semiconductores iónicos, la secuenciación SMRT™ de una sola molécula, la secuenciación de colonias de polimerasa, la secuenciación de ADN Nanoball y el enfoque de VisiGen Biotechnologies. Como alternativa, la determinación de la secuencia de polinucleótidos puede usar plataformas de secuenciación, que incluyen, entre otras, Genome Analyzer IIx, HiSeq, y MiSeq ofrecidas por Illumina, la tecnología en tiempo real para una sola molécula (SMRT™), tal como el sistema PacBio RS ofrecido por Pacific Biosciences (California) y el secuenciador Solexa, la tecnología de secuenciación de una sola molécula en tiempo real (SMRT™) tal como el secuenciador HeliScope™ ofrecido por Helicos Inc. (Cambridge, MA). La secuenciación puede comprender la secuenciación MiSeq. La secuenciación puede comprender la secuenciación HiSeq. En algunas realizaciones, determinar la secuencia de un polinucleótido comprende la secuenciación de extremos pareados, la secuenciación mediante nanoporos, la secuenciación de alto rendimiento, la secuenciación Shotgun, la secuenciación del terminador con colorante, la secuenciación del ADN de múltiples cebadores, el avance de cebadores, la secuenciación didesoxi de Sanger, la secuenciación de Maxim-Gilbert, la pirosecuenciación, la secuenciación de una sola molécula en tiempo real o cualquier combinación de las mismas. Como alternativa, la secuencia de un polinucleótido puede determinarse mediante microscopía electrónica o una matriz de transistores de efecto de campo sensibles a los productos químicos (chemFET).
Un método puede comprender además la secuenciación de uno o más polinucleótidos del banco. Un método puede comprender además alinear una o más secuencias de polinucleótidos, lecturas de secuencias, secuencias de amplicones o secuencias de conjuntos de amplicones del banco entre sí.
La alineación puede comprender comparar una secuencia de prueba, tal como una secuencia leída, con una o más secuencias de prueba, secuencias de referencia o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la alineación puede usarse para determinar una secuencia de consenso a partir de una pluralidad de secuencias o secuencias alineadas. En algunas realizaciones, la alineación comprende determinar una secuencia de consenso a partir de una pluralidad de secuencias que tienen cada una un código de barras molecular o un código de barras del recipiente idénticos. En algunas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada con fines comparativos es al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %, de la longitud de una secuencia de referencia. La comparación real de las dos o más secuencias se puede realizar mediante métodos muy conocidos, por ejemplo, usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de dicho algoritmo matemático se describe en Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90-5873-5877 (1993). Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0), como se describe en Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se puede utilizar cualquier parámetro relevante de los programas respectivos (por ejemplo, NBLAST). Por ejemplo, los parámetros para la comparación de secuencias se pueden establecer en una puntuación = 100, longitud de palabra = 12, o se pueden variar (por ejemplo, W = 5 o W = 20). Otros ejemplos incluyen el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989), ADvAnCE, a Da M, BLAT y FASTA. En algunas realizaciones, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede lograr usando, por ejemplo, el programa GAP en el paquete informático GCG (Accelrys, Cambridge, UK).
La secuenciación puede comprender la secuenciación de al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más nucleótidos o pares de bases de los polinucleótidos. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende la secuenciación de al menos aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más nucleótidos o pares de bases de los polinucleótidos. En otros ejemplos, la secuenciación comprende la secuenciación de al menos aproximadamente 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000 o más nucleótidos o pares de bases de los polinucleótidos.
La secuenciación puede comprender al menos aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más lecturas de secuencia por serie. Como se utilizan en la presente, una lectura de secuencia comprende una secuencia de nucleótidos determinada a partir de una secuencia o un flujo de datos generados por una técnica de secuenciación. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende la secuenciación de al menos aproximadamente 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000 o más lecturas de secuenciación por serie. La secuenciación puede comprender más de, menos de o igual a aproximadamente 1.000.000.000 de lecturas de secuencia por serie. La secuenciación puede comprender más de, menos o igual a aproximadamente 200.000.000 lecturas por serie.
Enzimas
Los métodos y kits divulgados en la presente pueden comprender una o más enzimas. Los ejemplos de enzimas incluyen, entre otras, ligasas, transcriptasas inversas, polimerasas y nucleasas de restricción.
En algunas realizaciones, la unión de un adaptador a polinucleótidos comprende el uso de una o más ligasas. Los ejemplos de ligasas incluyen, entre otras, ADN ligasas tales como ADN ligasa I, ADN ligasa III, ADN ligasa IV y ADN ligasa T4 y ARN ligasas tales como ARN ligasa I T4 y ARN ligasa II T4.
Los métodos y kits divulgados en la presente pueden comprender además el uso de una o más transcriptasas inversas. En algunas realizaciones, la transcriptasa inversa es una transcriptasa inversa del HIV-1, la transcriptasa inversa del M-MLV, la transcriptasa inversa del AMV y la transcriptasa inversa de la telomerasa. En algunas realizaciones, la transcriptasa inversa es la transcriptasa inversa del M-MLV.
En algunas realizaciones, los métodos y kits divulgados en la presente comprenden el uso de una o más proteasas. En algunas realizaciones, los procedimientos y kits divulgados en la presente comprenden el uso de una o más polimerasas. Los ejemplos de polimerasas incluyen, entre otras, ADN polimerasas y ARN polimerasas. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa I, ADN polimerasa II, holoenzima ADN polimerasa III y ADN polimerasa IV. Las ADN polimerasas disponibles en el comercio incluyen, entre otras, ADN polimerasa Bst 2.0, ADN polimerasa WarmStart™ Bst 2.0, ADN polimerasa Bst, ADN polimerasa IV Sulfolobus, ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa 9°N™m, ADN polimerasa Deep VentR™ (exo-), Ad N polimerasa Deep VentR™, emo KlenTaq™, Ad N polimerasa Taq LongAmp®, a Dn polimerasa OneTaq®, ADN polimerasa Phusion®, ADN polimerasa de alta fidelidad Q5™, ADN polimerasa y Therminator™, ADN polimerasa Therminator™, ADN polimerasa Therminator™ II, ADN polimerasa Therminator™ III, ADN polimerasa VentR®, ADN polimerasa VentR® (exo-), ADN polimerasa Bsu, ADN polimerasa phi29, ADN polimerasa T4, ADN polimerasa T7, Transferasa terminal, polimerasa Taq Titanium®, ADN polimerasa Taq KAPA y ADN polimerasa de inicio en caliente Taq KAPA.
En algunas realizaciones, la polimerasa es una ARN polimerasa tal como ARN polimerasa I, ARN polimerasa II, ARN polimerasa III, polimerasa Poli (A) de E.coli, ARN polimerasa phi6 (RdRP), polimerasa Poli (U), ARN polimerasa SP6 y ARN polimerasa T7.
Reactivos adicionales
Los métodos y kits divulgados en la presente pueden comprender el uso de uno o más reactivos. Los ejemplos de reactivos incluyen, entre otros, reactivos de PCR, reactivos de ligadura, reactivos de transcripción inversa, reactivos enzimáticos, reactivos de hibridación, reactivos de preparación de muestras, reactivos de captura de afinidad, soportes sólidos tales como perlas y reactivos para la purificación y/o el aislamiento de ácido nucleico.
En otras realizaciones, los métodos, los kits y las composiciones divulgados en la presente pueden comprender un soporte. En algunas realizaciones, los métodos, los kits y las composiciones divulgados en la presente no comprenden un soporte. Por lo general, un soporte sólido comprende uno o más materiales que comprenden una o más superficies rígidas o semirrígidas. En algunas realizaciones, el soporte es un soporte no sólido. El soporte o sustrato puede comprender una membrana, un papel, un plástico, una superficie recubierta, una superficie plana, un vidrio, un portaobjetos, un chip o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, una o más superficies de un soporte son esencialmente planas, aunque, en algunas realizaciones, puede ser deseable separar físicamente las regiones de síntesis para diferentes compuestos con, por ejemplo, pocillos, regiones elevadas, pasadores, zanjas grabadas o similares. En algunas realizaciones, los soportes sólidos comprenden perlas, resinas, geles, microesferas u otras configuraciones geométricas. Como alternativa, los soportes sólidos pueden comprender chips de sílice, micropartículas, nanopartículas, placas y matrices. El soporte sólido puede comprender el uso de perlas que se autoensamblan en micropocillos. Por ejemplo, el soporte sólido comprende la tecnología de matriz de perlas de Illumina. Como alternativa, el soporte sólido comprende la tecnología de matriz de perlas de Abbott Molecular y el sistema FlexiPlex™ de Applied Microarray. En otros ejemplos, el soporte sólido es una placa. Los ejemplos de placas incluyen, entre otras, placas de múltiples matrices MSD, placas MSD Multi-Spot®, microplaca, microplaca ProteOn, AlphaPlate, placa DELFIA, IsoPlate y LumaPlate. En algunas realizaciones, un soporte puede comprender una pluralidad de perlas. En algunas realizaciones, un soporte puede comprender una matriz. En algunas realizaciones, un soporte puede comprender un portaobjetos de vidrio. Los métodos, sustratos y técnicas aplicables a polímeros (patentes de Estados Unidos n. ° 5.744.305; 5.143.854; 5.242.974; 5.252.743; 5.324.633; 5.384.261; 5.405.783; 5.424.186; 5.451.683; 5.482.867; 5.491.074; 5.527.681; 5.550.215; 5.571.639; 5.578.832; 5.593.839; 5.599.695; 5.624.711; 5.631.734; 5.795.716; 5.831.070; 5.837.832; 5.856.101; 5.858.659; 5.936.324; 5.968.740; 5.974.164; 5.981.185; 5.981.956; 6.025.601; 6.033.860; 6.040.193; 6.090.555; 6.136.269; 6.269.846 y 6.428.752; publicación de patente de Estados Unidos n. ° 20090149340, 20080038559, 20050074787; y en las publicaciones PCT n. ° WO 00/58516, WO 99/36760 y WO 01/58593). La unión de los polinucleótidos a un soporte puede comprender la reticulación de amina-tiol, la reticulación de maleimida, N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida, Zenon o SiteClick. La unión de los ácidos nucleicos marcados al soporte puede comprender la unión de biotina a la pluralidad de polinucleótidos y el recubrimiento de una o más perlas con estreptavidina. En algunas realizaciones, el soporte sólido es una perla. Los ejemplos de perlas incluyen, entre otras, perlas de estreptavidina, perlas de agarosa, perlas magnéticas, Dynabeads®, microperlas MACS®, perlas conjugadas con anticuerpos (por ejemplo, microperla anti-inmunoglobulina), perlas conjugadas con proteína A, perlas conjugadas con proteína G, perlas conjugadas con proteína A/G, perlas conjugadas con proteína L, perlas conjugadas con polinucleótido dT, perlas de sílice, perlas de tipo sílice, microperlas anti-biotina, microperlas antifluorocromadas y perlas magnéticas terminadas en carboxi BcMag™. El diámetro de las perlas puede ser de aproximadamente 5 pm, 10 pm, 20 pm, 25 pm, 30 pm, 35 pm, 40 pm, 45 pm o 50 pm. El soporte sólido puede ser una matriz o micromatriz. El soporte sólido puede comprender regiones diferenciadas. El soporte sólido puede ser una matriz, por ejemplo, una matriz direccionable.
Un soporte sólido puede comprender casi cualquier material sólido o insoluble, y a menudo se selecciona una composición de soporte sólida que sea insoluble en el agua. Por ejemplo, un soporte sólido puede comprender o consistir esencialmente en gel de sílice, vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado (CPG)), nylon, Sephadex®, Sepharose®, celulosa, una superficie metálica (por ejemplo, acero, oro, plata, aluminio, silicio y cobre), un material magnético, un material plástico (por ejemplo, polietileno, polipropileno, poliamida, poliéster, difluoruro de polivinilideno (PVDF)) y similares. Los ejemplos de perlas para su uso de acuerdo con las realizaciones pueden incluir un resto de afinidad que permita que la perla interaccione con una molécula de ácido nucleico. Una fase sólida (por ejemplo, una perla) puede comprender un miembro de un par de unión (por ejemplo, avidina, estreptavidina o un derivado de las mismas). Por ejemplo, la perla puede ser una perla recubierta con estreptavidina, y una molécula de ácido nucleico para la inmovilización en la perla puede incluir un resto de biotina. En algunos casos, cada molécula de polinucleótido puede incluir dos restos de afinidad, tales como biotina, para estabilizar aún más el polinucleótido. Las perlas pueden incluir características adicionales para su uso en la inmovilización de ácidos nucleicos o que se pueden usar en un proceso de detección o selección cadena abajo. Por ejemplo, la perla puede incluir una parte de afinidad, un marcador fluorescente o un inactivador fluorescente. En algunos casos, la perla puede ser magnética. En algunos casos, el soporte sólido es una perla. Los ejemplos de perlas incluyen, entre otras, perlas de estreptavidina, perlas de agarosa, perlas magnéticas, Dynabeads®, microperlas MACS®, perlas conjugadas con anticuerpos (por ejemplo, microperla anti-inmunoglobulina), perlas conjugadas con proteína A, perlas conjugadas con proteína G, perlas conjugadas con proteína A/G, perlas conjugadas con proteína L, perlas conjugadas con polinucleótido dT, perlas de sílice, perlas de tipo sílice, microperlas anti-biotina, microperlas antifluorocromadas y perlas magnéticas terminadas en carboxi BcMag™. Las perlas o partículas pueden ser hinchables (por ejemplo, perlas poliméricas tales como la resina Wang) o no hinchables (por ejemplo, CPG). En algunas realizaciones, una fase sólida es esencialmente hidrófila. En algunas realizaciones, una fase sólida (por ejemplo, una perla) es esencialmente hidrófoba. En algunas realizaciones, una fase sólida comprende un miembro de un par de unión (por ejemplo, avidina, estreptavidina o un derivado de las mismas) y es esencialmente hidrófoba o esencialmente hidrófila. En algunas realizaciones, una fase sólida comprende un miembro de un par de unión (por ejemplo, avidina, estreptavidina o un derivado de las mismas) y tiene una capacidad de unión superior a aproximadamente 1.350 picomoles de agente de captura libre (por ejemplo, biotina libre) por mg de soporte sólido. En algunas realizaciones, la capacidad de unión de la fase sólida que comprende un miembro de un par de unión es superior a 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.250, 1.300, 1.350, 1.400, 1.450, 1.500, 1.600, 1.800, 2.000 picomoles de agente de captura libre por mg de soporte sólido. Otros ejemplos de perlas que son adecuados para la invención son coloides de oro o perlas tales como perlas de poliestireno o perlas de sílice. Se puede usar esencialmente cualquier radio de perla. Los ejemplos de perlas pueden incluir perlas que tienen un radio que varía entre 150 nanómetros y 10 micrómetros. También se pueden usar otros tamaños.
Los métodos y kits divulgados en la presente pueden comprender el uso de uno o más de tampones. Los ejemplos de tampones incluyen, entre otros, tampones de lavado, tampones de ligadura, tampones de hibridación, tampones de amplificación y tampones de transcripción inversa. En algunas realizaciones, el tampón de hibridación es un tampón disponible en el comercio, tal como solución Hyb de TMAC, solución de hibridación de SSPE y tampón de hibridación de ECONO™. Los tampones divulgados en la presente pueden comprender uno o más detergentes.
Los métodos y kits divulgados en la presente pueden comprender el uso de uno o más de portadores. Los portadores pueden potenciar o mejorar la eficacia de una o más reacciones divulgadas en la presente (por ejemplo, la reacción de ligadura, transcripción inversa, amplificación, hibridación). Los portadores pueden disminuir o prevenir la pérdida inespecífica de las moléculas o cualquiera de sus productos (por ejemplo, un polinucleótido y/o amplicón). Por ejemplo, el portador puede reducir la pérdida inespecífica de un polinucleótido a través de la absorción a las superficies. El portador puede reducir la afinidad de un polinucleótido a una superficie o sustrato (por ejemplo, recipiente, tubo Eppendorf, punta de pipeta). Como alternativa, el portador puede aumentar la afinidad de un polinucleótido a una superficie o sustrato (por ejemplo, perla, matriz, vidrio, portaobjetos, chip). Los portadores pueden proteger al polinucleótido de la degradación. Por ejemplo, los portadores pueden proteger una molécula de ARN de las ribonucleasas. Como alternativa, los portadores pueden proteger una molécula de ADN de una ADNasa.
Los ejemplos de portadores incluyen, entre otros, polinucleótidos tales como ADN y/o ARN, o polipéptidos. Los ejemplos de portadores de ADN incluyen plásmidos, vectores, ADN poliadenilado y polinucleótidos de ADN. Los ejemplos de portadores de ARN incluyen ARN poliadenilado, ARN de fago, ARN de fago MS2, ARN de E.coli, ARN de levadura, ARNt de levadura, ARN de mamífero, ARNt de mamífero, ribonucleótidos sintéticos poliadenilados cortos y polinucleótidos de ARN. El portador de ARN puede ser un ARN poliadenilado. Como alternativa, el portador de ARN puede ser un ARN no poliadenilado. En algunas realizaciones, el portador es de una bacteria, levadura o virus. Por ejemplo, el portador puede ser un polinucleótido o un polipéptido derivado de una bacteria, de una levadura o de un virus. Por ejemplo, el portador es una proteína de Bacillus subtilis. En otro ejemplo, el portador es un polinucleótido de Escherichia coli. Como alternativa, el portador es un polinucleótido o péptido de un mamífero (por ejemplo, ser humano, ratón, cabra, rata, vaca, ovejas, cerdo, perro o conejo), ave, anfibio o reptil.
Los métodos y kits divulgados en la presente pueden comprender el uso de uno o más de agentes de control. Los agentes de control pueden incluir polinucleótidos de control, enzimas inactivas, competidores inespecíficos. Como alternativa, los agentes de control comprenden hibridación brillante, controles de sonda brillante, moldes de ácido nucleico, controles de adiciones, controles de amplificación por PCR. Los controles de amplificación por PCR pueden ser controles positivos. En otros ejemplos, los controles de amplificación por PCR son controles negativos. Los controles de molde de ácido nucleico pueden ser de concentraciones conocidas. Los agentes de control pueden comprender uno o más marcadores.
Los controles de adiciones pueden ser moldes que se añaden a una reacción o muestra. Por ejemplo, se puede añadir un molde de adición a una reacción de amplificación. El molde de adición se puede añadir a la reacción de amplificación en cualquier momento después del primer ciclo de amplificación. En algunas realizaciones, el molde de adición se añade a una reacción de amplificación después del ciclo número 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50. El molde de adición se puede añadir a la reacción de amplificación en cualquier momento antes del último ciclo de amplificación. El molde de adición puede comprender uno o más nucleótidos o pares de bases de ácido nucleico. El molde de adición puede comprender ADN, ARN o cualquier combinación de los mismos. El molde de adición puede comprender uno o más marcadores.
En la presente se divulgan moléculas, materiales, composiciones y componentes que se pueden usar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en la preparación o son productos de métodos y composiciones divulgados en la presente. Se entiende que cuando se divulgan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, y aunque la referencia específica a cada una de varias combinaciones colectivas e individuales y la permutación de estas moléculas y compuestos puede no divulgarse explícitamente, cada uno se contempla específicamente y se describe en la presente. Por ejemplo, si se divulga y describe un nucleótido o un ácido nucleico, y se describe una serie de modificaciones que se pueden realizar a varias moléculas, incluyendo el nucleótido o el ácido nucleico, se contemplan específicamente todas y cada una de las combinaciones y permutaciones del nucleótido o del ácido nucleico y las modificaciones que son posibles, a menos que se indique específicamente al contrario. Este concepto se aplica a todos los aspectos de la presente solicitud incluidos, entre otros, los pasos de los métodos para elaborar y usar los métodos y las composiciones que se divulgan. Por lo tanto, si hay una variedad de pasos adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada una de estos pasos adicionales se puede realizar con cualquier realización específica o combinación de realizaciones específicas de los métodos divulgados, y que cada combinación se contempla específicamente y se debe considerar como divulgada.
Aunque algunas realizaciones descritas en la presente se han mostrado y descrito en la presente, dichas realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. A los expertos en la materia, se les ocurrirán numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin apartarse de la divulgación proporcionada en la presente. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones descritas en la presente para poner en práctica los métodos descritos en la presente.
A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente divulgación. Las siguientes referencias contienen realizaciones de los métodos y de las composiciones que se pueden usar en la presente. "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 18a edición, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-9119102); Benjamin Lewin, "Genes IX", publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), "The Encyclopedia of Mol. Biology", publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), "Mol. Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference", publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Los procedimientos convencionales de la presente divulgación se describen, por ejemplo, en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); o Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol. 152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl (eds.), Academic Press Inc., San Diego, USA (1987)). Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et al., ed.
John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5. ° edición (2005), and Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1.° edición, 1998).
EJEMPLOS
Ejemplo 1: inmunotipificación de linfocitos T individuales en una población de linfocitos T
Los métodos de inmunofenotipificación descritos en la presente se validaron mediante el análisis de la expresión de proteínas de superficie y ARNm de CD4 y CD8 en linfocitos T humanos. Canónicamente, se prevé que los linfocitos T maduros sean del subtipo CD4 o del subtipo CD8. Un subtipo CD4 debe expresar el ARNm de CD4 y la proteína CD4 juntos, pero debe expresar el ARNm de CD8 o la proteína CD8. Un subtipo CD8 debe expresar el ARNm de CD8 y la proteína CD8 juntos, pero debe expresar el ARNm de CD4 o la proteína CD4.
Se incubaron 30.000 linfocitos T con un anticuerpo-oligonucleótido específico de CD4 que comprende una secuencia de ID de antígeno CD4 y un anticuerpo-oligonucleótido específico de CD8 que comprende una secuencia de ID de antígeno CD8. El contenido de ARNm de CD4, CD8 y TCR de los linfocitos T también se analizó en un experimento de emulsión de una sola célula. El receptor de linfocitos T alfa, el receptor de linfocitos T beta, el ARNm de CD4 y CD8 se transcribieron inversamente a ADNc y se fusionó una secuencia de código de barras específica de gotitas con el ADNc y los oligonucleótidos conjugados con anticuerpos a través de una reacción en cadena de la polimerasa. Este ADN se extrajo de la emulsión y se analizó con secuenciación de próxima generación.
Casi todos los códigos de barras de gotas (relacionados con una sola célula) se asociaron con la ID del antígeno específico de CD4 o con la ID del antígeno específico de CD8. Se halló una coincidencia sustancial entre el ARNm y las asignaciones basadas en proteínas de superficie (Figura 3)
Ejemplo 2
La secuenciación del repertorio inmunitario tiene amplias aplicaciones en inmunología básica, autoinmunidad, enfermedades infecciosas y oncología. Si bien muchos estudios han investigado la diversidad de BCR y TCR en la sangre circulante, existe un interés creciente en los receptores inmunitarios de TIL, cuyas funciones son muy relevantes para el crecimiento o la regresión del cáncer y, sin embargo, son variables y a menudo no están caracterizadas. Un paso fundamental hacia una mejor comprensión de TIL será la recuperación y caracterización funcional de sus BCR y TCR, ya que eso puede permitir la identificación de nuevos antígenos asociados a tumores. Los antígenos tumorales se requieren de manera crítica para el desarrollo de vacunas contra el cáncer, comprender la función de los inhibidores de puntos de control y avanzar en la terapia de linfocitos T receptores de antígenos quiméricos (CAR-T) en tumores sólidos. Sin embargo, a pesar de décadas de progreso técnico en la inmunosecuenciación, ningún estudio ha recuperado BCR (cadenas pesadas y livianas) y TCR (cadenas alfa y beta) emparejados de forma natural y de longitud completa de una muestra heterogénea, tal como un tumor sin cultivo in vitro o clasificación de células, pasos que restringen y sesgan el repertorio observado. El obstáculo técnico es particularmente alto ya que las células inmunitarias primarias no cultivadas pueden contener 100 veces menos ARN receptor que las células estimuladas in vitro. Para permitir un análisis completo de BCR y TCR emparejados de forma natural a partir de muestras heterogéneas complejas, se desarrolló un método basado en emulsión de microfluidos para el aislamiento paralelo y la codificación en barras de ADN de un gran número de células individuales. Se aíslan hasta un millón de células por hora en gotitas de emulsión individuales de ~65 picolitros. Dentro de las gotitas, las células se lisan, el ARNm diana se transcribe de forma inversa con cebadores específicos diana y un proceso de código de barras de ADN de dos pasos une los códigos de barras específicos de la molécula y de las gotitas a los ADNc. Después de la recuperación posterior y la secuenciación de próxima generación, la estrategia de código de barras dual permite agrupar las lecturas de secuencias tanto en sus moléculas como en sus células de origen. Esto permite una amplia corrección de errores y sesgos de amplificación, el recuento de clones tanto a nivel de ARNm como celular, la determinación de isotipos de cadenas pesadas y, lo que es más importante, la recuperación de secuencias V(D)J de longitud completa y emparejadas de forma natural de BCR y TCR simultáneamente con un rendimiento extremadamente alto.
Los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) son fundamentales para las respuestas inmunitarias contra el cáncer, pero son difíciles de estudiar debido a su abundancia, fenotipos y funciones impredecibles. Los inventores desarrollaron un método para la caracterización profunda de TIL sin necesidad de clasificación celular, estimulación o cultivo. El método de código de barras de una sola célula basado en emulsión captura secuencias de receptores de linfocitos B y linfocitos T (BCR y TCR) emparejadas de forma natural a partir de linfocitos entre millones de células de entrada. A diferencia de los enfoques anteriores, las regiones variables recuperadas son de longitud completa y pueden ir acompañadas de ARNm y proteínas dianas adicionales. El método se validó con 3 millones de linfocitos B de sangre humana sana y 350.000 linfocitos B de un paciente con HIV antes de procesar 400.000 células sin clasificar de un adenocarcinoma de ovario, recuperando BCR y TCR emparejados de más de 11.000 TIL. Nuestros resultados representan el muestreo más profundo de cualquier repertorio emparejado de BCR o TCR, así como la primera demostración de secuenciación simultánea de ARN y mediciones de proteínas de células individuales en emulsión.
Ejemplo 3: recuperación a gran escala de pares de VhVl de linfocitos B a partir de una muestra de sangre sana
La tecnología se desarrolló inicialmente y se evaluó la capacidad de emparejamiento y el rendimiento con 3 millones de linfocitos B aislados mediante enriquecimiento de perlas negativas de sangre periférica de un voluntario sano. La emulsión se dividió en seis fracciones separadas que se procesaron en paralelo y no se volvieron a mezclar antes de la secuenciación. La emulsión se cargó a 0,2 células por gotita, proporcionando una expectativa de Poisson de que ~90 % de las gotitas ocupadas contenían células individuales, lo que fue compatible con las observaciones de las gotitas de la emulsión (Figura 6A). Después de la ruptura de la emulsión y los pasos adicionales de procesamiento del banco, se realizó una secuenciación de 325+300 pb de extremo emparejado con Illumina MiSeq. Para procesar los datos de secuenciación, los códigos de barras moleculares y de gotitas se utilizaron juntos para recopilar lecturas de réplicas de PCR de cada molécula de ARNm original y determinaron un consenso para cada ARNm manteniendo solo las secuencias de ARNm creadas a partir de al menos dos lecturas. Las lecturas directas e inversas se unieron para generar productos de longitud completa que comprendían la UTR 5', la secuencia V(D)J completa y la región constante suficiente para la determinación del isotipo. Las secuencias de cadena pesada y liviana de inmunoglobulina reorganizadas se anotaron con IMGT High-VQuest y/o IgBLAST.
El conjunto de datos resultante contenía 324.988 códigos de barras de gotitas que se asociaron con al menos un ARNm de cadena pesada (Vh) y cadena liviana (Vl), con 229.869 linajes clonales de Vh distintos presentes según lo estimado por el análisis de agrupamiento de cadenas pesadas. Dado que este conjunto sin procesar incluye datos de gotitas multicelulares y unicelulares, los datos de gotitas unicelulares se enriquecieron mediante el filtrado de códigos de barras de gotitas vinculados a secuencias V(D)J de cadena liviana o pesada no unánimes (Figura 6B). Este paso es posible por la gran diversidad de repertorios inmunitarios típicos, en los que los ARNm de Vh o Vl de dos células aleatorias casi nunca coincidirán. El conjunto de datos enriquecido resultante comprendía 259.368 códigos de barras de gotitas de VhVl y contenía 182.745 linajes clonales de Vh, lo que representa cómodamente el muestreo más profundo de un repertorio inmunológico emparejado hasta la fecha. La precisión de los emparejamientos de VHVL mediante la identificación de incidencias de expansión clonal se estimó directamente, ya que las células relacionadas clonalmente deberían mostrar uniformidad en sus emparejamientos de VHVL. Se identificaron 2.604 clones de VH que se observaron en más de una fracción de emulsión con alta confianza de ser células expandidas clonalmente. La uniformidad de las secuencias de VL emparejadas con estos clones de VH en las fracciones fue muy alta e indicó una precisión de emparejamiento del 96,1 %, lo que permitió una alta confianza en todo el conjunto de datos filtrado de 259368 pares de VHVL. Las secuencias de VH y VL de fracciones cruzadas se asociaron invariablemente con diferentes códigos de barras moleculares y de gotitas en cada fracción y, por lo tanto, no representaron contaminación cruzada del banco. El análisis puede subestimar la precisión del emparejamiento ya que se sabe que algunos linfocitos B expresan múltiples cadenas livianas. El 75,0 % de los 259.368 códigos de barras de gotitas de VhVl filtrados o "pares de VhVl" contenían IgM y/o IgD (Figura 6C), que con frecuencia se observaron juntos como se preveía dado el fenotipo típico IgM+ lgD+ de los linfocitos B vírgenes. También se hallaron fracciones menores, pero sustanciales de pares de VhVl de IgA (18,3 %) e IgG (6,6 %). Todos los isotipos de Vh se emparejaron con IgK o IgA en una relación de ~3:2. Entre los 182.745 linajes clonales de Vh, la expansión de clones se evaluó de dos maneras: el número de códigos de barras de gotitas asociados con un clon y la observación del clon en fracciones de emulsión. Los clones observados en múltiples códigos de barras de gotitas podrían reflejar expansión clonal o gotitas de múltiples códigos de barras, que se prevé en ~37% de las gotitas dada la dispersión inicial de A = 1 Poisson de códigos de barras en gotitas. Sin embargo, es probable que cualquier clon representado por > 8 códigos de barras de gotas se expanda genuinamente (probabilidad de Poisson en una sola gota < 10-6). Mientras que en general el 6,0 % de los clones se observaron en más de una fracción, para los clones observados en más de 8 códigos de barras de gotitas (0,7 % en total), el 99 % de ellos se observaron en más de una fracción. Los 100 clones más frecuentes (30-137 códigos de barras de gotitas cada uno, Figura 6D) se observaron todos en al menos cinco de seis fracciones. Una combinación de recuento de códigos de barras y análisis de fracciones independientes permite la detección de linajes expandidos raros entre un vasto fondo de clones no expandidos. Sin embargo, cabe destacar que incluso el clon expandido más abundante estaba presente en menos de una célula entre mil, lo que ejemplifica la enorme diversidad de repertorios inmunitarios periféricos humanos.
El número de ARNm capturados de cada cadena de VH y VL dentro de los pares como una estimación del nivel de expresión (Figura 6E). En general, se capturaron menos de diez ARNm de cadena pesada (media 2,0) y cadena liviana (media 4,0) por código de barras de gotitas, se observó una pequeña población de códigos de barras de gotitas con docenas a cientos de ARNm de cadena pesada y liviana capturados por célula, casi exclusivamente de células que expresan IgG y IgA. Curiosamente, el grado de mutación de Vh y Vl dentro de los pares se correlacionó fuertemente tanto dentro de cada isotipo (por ejemplo, Vh frente a Vl para IgG) como entre isotipos (por ejemplo, IgG frente a IgM) (Figura 6F). Además, casi todos los pares de IgG e IgA estaban sustancialmente mutados en sus cadenas de Vh y Vl, mientras que los pares de IgM e IgD en su mayoría mostraban poca mutación en Vh o Vl. Estos resultados son compatibles con el mecanismo de activación de linfocitos B que conduce al cambio de clase de IgM e IgD a IgG o IgA, aumento de la expresión de inmunoglobulina e hipermutación somática que afecta a los locus de la cadena pesada y liviana en la célula. Además de esta observación de que las cadenas de Vh altamente mutadas tienden a emparejarse con cadenas de Vl altamente mutadas, este método es apto para generar un gran número de BCR emparejados de forma natural y de longitud completa a partir de repertorios de linfocitos B humanos en reposo.
Ejemplo 4: recuperación de pares de VhVl de baja frecuencia conocidos de un controlador élite de HIV.
Como validación adicional de la sensibilidad de emparejamiento y la exactitud del ensayo, se procesó una muestra en la que ya se conocen públicamente varios emparejamientos naturales de VhVl raros (< 1 célula en 10.000). Se obtuvieron linfocitos B periféricos de un paciente controlador de élite de HIV cuyos linfocitos B de memoria se han extraído mucho en los últimos años en busca de anticuerpos que muestren la actividad de neutralización del HIV. Se procesaron 350.000 linfocitos B para generar un total de 38.620 pares de VhVl filtrados. Curiosamente, este individuo mostró una mayor proporción de IgG que la muestra sana anterior (Figura 7A) o repertorios típicos de linfocitos B periféricos sanos. Las secuencias de Vh de este conjunto de datos se compararon con todos los anticuerpos ampliamente neutralizantes (bNAb) informados de este individuo, que incluye PGT121, y se hallaron ocho secuencias de Vh cercanas o idénticas, lo que indica que esta familia de bNAb representa menos del 0,03 % de los linfocitos B circulantes. Fundamentalmente, todas las cadenas livianas emparejadas con estas cadenas pesadas eran del linaje bNAb previsto y similarmente raro, mostrando el mismo reordenamiento IgA-V3-21/J3 y la inserción de triple codón distintivo como se informó con anterioridad, lo que respalda la alta exactitud y sensibilidad de nuestro método. Además, en un árbol filogenético de todos los pares de VhVl similares a PGT121 conocidos y recién generados de este individuo (Figura 7B), los árboles de Vh y Vl muestran una topología sorprendentemente similar con secuencias de Vh y Vl emparejadas que ocupan posiciones similares a un espejo, lo que probablemente refleja una historia filogenética compartida. Los pares de variantes descubiertos aquí encajan bien con esta regla. Curiosamente, dos anticuerpos publicados PGT122 y PGT123 aparecen como excepciones; no se encontró respaldo para estos dos emparejamientos, pero en su lugar se encontraron pares similares a PGT122Vh:PGT123Vl y similares a PGT123Vh:PGT122Vl, abordando el emparejamiento no verificado en el informe original. Se sintetizó el ADN que codifica las regiones V(D)J completas de 8 nuevos pares de VhVl similares a PGT, se expresaron los anticuerpos como IgG completos y se analizó su capacidad para neutralizar múltiples pseudocepas de HIV (Figura 7C). Los anticuerpos se expresaron bien y todos mostraron una fuerte actividad neutralizante contra el virus, lo que demuestra la utilidad de nuestro enfoque para generar rápidamente variantes de anticuerpos funcionales emparejados de forma natural a partir de una muestra biológica relevante.
Ejemplo 5: pares de receptores de linfocitos B y linfocitos T de linfocitos que se infiltran en el tumor
Habiendo validado el código de barras de la emulsión para la recuperación de alto rendimiento de los receptores emparejados, los receptores inmunitarios se recuperaron directamente de un tumor. Se tomó una muestra de adenocarcinoma de ovario extirpado disociado con proteasa y se introdujeron 400.000 células sin clasificar en la emulsión. La tinción con CD3/CD19 de una alícuota separada de la muestra sugirió cantidades sustanciales de linfocitos B infiltrantes (~5 %) y T (~20 %) entre el material. La dispersión de una sola célula en la emulsión fue similar a la de las células purificadas, aunque se observaron algunas aglomeraciones limitadas y una amplia variación en el tamaño y la forma de las células dentro de las gotitas, como se preveía dada la heterogeneidad del tipo de células de la muestra (Figura 8A).
Los cebadores dirigidos a las regiones constantes de las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T se usaron juntos con los cebadores de BCR utilizados anteriormente, y después de la secuenciación y el filtrado estricto se recuperaron miles de códigos de barras de gotas vinculados a productos de BCR o TCR. Para evaluar la precisión de las células individuales, se contaron todas las combinaciones posibles de los cuatro locus diana (Vh, Vl, Va, Vp) dentro de los códigos de barras de gotitas (Figura 8B). La gran mayoría (97,9 %) de los códigos de barras de gotitas con más de una cadena diana contenían emparejamientos biológicamente previstos de BCR Vh+Vl o TCR Va+Vp, y solo el 2,1 % contenía combinaciones mixtas de BCR-TCR. Dado que el código de barras de los productos no está sesgado con respecto a la cadena diana, este resultado permite un alto grado de confianza en los pares resultantes de 6.056 BCR VhVl y 5.217 TCR YaYp. Los BCR mostraron un sorprendente dominio de IgG (> 80 %) en comparación con otros isotipos (Figura 8C), aunque todos estaban presentes (IgE < 0,05 % solamente). Las cadenas liviana kappa y lambda estaban presentes en relaciones similares a los conjuntos de datos de sangre periférica.
De manera similar a la sangre periférica, se observó una correlación entre el isotipo del BCR y el nivel de mutación de las cadenas de Vh y Vl, con pares de IgG e IgA mostrando mayor mutación de Vh y Vl que IgD e IgM, y una correlación general de mutación entre Vh y Vl dentro de cada isotipo (Figura 8D). Curiosamente, mientras que los pares de IgD, IgM e IgA mostraron distribuciones mutacionales muy similares entre los conjuntos de datos del tumor y de la sangre periférica, la fracción de IgG del tumor también contenía una proporción sustancial de secuencias con poco o nada de mutación que no se observó en la sangre periférica. Para los TCR y para los BCR que contenían IgD, se observaron números similares de ARNm capturados por código de barras de gotitas a los resultados de BCR de sangre periférica (Figura 8E, en su mayoría < 10 por código de barras de gotitas). En marcado contraste, los pares de IgM, IgA e IgG derivados de tumores mostraron un nivel de expresión promedio aumentado de 10 a 100 veces con cientos o miles de ARNm diana capturados en muchos de los códigos de barras de gotitas. Luego, se evaluó la diversidad de los repertorios de TIL-TCR y BCR capturados (Figura 8F). Entre los 5.217 pares de TCR totales, se observaron 2.423 clones beta de TCR distintos. Siete clones estaban presentes con una frecuencia >1 % y el clon superior representaba el 16,9 % de todos los códigos de barras de gotitas. Entre los 6.056 pares de BCR totales, se observaron 1.518 clones de cadena pesada distintos, con 15 clones con una frecuencia >1 % pero ninguno >5 %. Si bien esto representa una diversidad sustancialmente más restringida que el repertorio de BCR periférico sano (donde no había ningún clon presente con una frecuencia superior al 0,06 %), la presencia de mucho clones con cambio de clase, mutados y altamente expresados en la muestra tumoral demuestra la necesidad de un enfoque de muestreo profundo y sensible para la caracterización de TIL. Este método permite la recuperación rápida de un gran número de pares de receptores inmunitarios de TIL, de linfocitos B y T simultáneamente, sin necesidad de clasificación previa o activación exógena de poblaciones de TIL definidas.
Ejemplo 6: captura de marcadores fenotípicos adicionales de interés
El emparejamiento de cadenas de receptores mediante códigos de barras de gotitas permite posiblemente la captura de dianas adicionales además de los receptores inmunitarios. Para investigar esta posibilidad, los linfocitos T sanos en poblaciones de CD4+ y CD8+ se separaron mediante enriquecimiento con perlas magnéticas y se introdujeron 20.000 células de cada tipo en corridas de emulsión separadas, con cebadores dirigidos a cadenas alfa y beta de TCR y ARNm de CD4 y CD8. Después de la secuenciación, el 47,0 % de los 3.861 códigos de barras de gotitas que contenían TCR Va y Vp ("pares de TCR") de células CD4+ aisladas se enlazaron con el ARNm de CD4, mientras que solo el 0,3 % se enlazaron con el ARNm de CD8. Por el contrario, el 50,6 % de los 2.235 pares de TCR de células CD8+ aisladas estaban enlazados con el ARNm de CD8, mientras que solo el 0,6 % estaban enlazados con el ARNm de CD4. Esto demuestra la alta especificidad pero la sensibilidad limitada de un enfoque basado en ARNm para el fenotipado celular, similar a un informe anterior. En cambio, las proteínas, como los receptores de la superficie celular, suelen estar presentes en un número mucho mayor (entre 1.000 y 100.000 por célula) que sus ARNm codificantes, lo que hace que sean más fáciles de detectar y que tengan una relevancia más directa en el fenotipo celular. Para medir los niveles de proteína diana en cada célula, se conjugaron etiquetas de ADN de oligonucleótido personalizadas con anticuerpos anti-humanos CD4 y CD8, y se incubaron los anticuerpos marcados con una mezcla no separada de linfocitos T CD4+ y CD8+ antes de la entrada de 30.000 células en una emulsión (Figura 3A). Las etiquetas de ADN llevan etiquetas de secuencias específicas de anticuerpos, así como códigos de barras moleculares y complementariedad de secuencias con los códigos de barras de gotitas amplificadas, lo que permite la codificación de gotitas de emulsión y el recuento molecular de manera similar a la que se hace para los ARNm. Las etiquetas de ADN se dirigieron al igual que los ARNm de TCR, CD4 y CD8 simultáneamente. Después de la secuenciación y el filtrado, se identificaron 3.682 códigos de barras de gotitas con pares VaVp de TCR de alta confianza. En consonancia con el experimento anterior, aproximadamente la mitad (52 %) de los pares de TCR pudieron asignarse al estado CD4 o CD8 basándose en el ARNm (Figura 3B-C). Sin embargo, más del 95 % de los códigos de barras de gotitas pudieron ser asignados a CD4 o CD8 basándose en el estado de las proteínas, con recuentos moleculares promedio por gotita considerablemente mayores para las proteínas CD4/8 (media de 20,5) que para los ARNm de CD4/8 (media de 1,0). La concordancia entre las señales del ARNm y de las proteínas fue alta (Figura 3D): el 96,0% de las gotitas que fueron convocadas por ARNm y proteínas coincidieron. En algunos casos raros, se detectaron proteínas tanto CD4 como CD8, probablemente como resultado de gotitas que contenían dos o más células. El código de barras de emulsión permite, por primera vez, la vinculación directa de los receptores inmunitarios de una sola célula con el ARNm y los marcadores de proteínas de interés, todo ello con un alto rendimiento. La aplicación de este enfoque a TIL con un conjunto de marcadores ampliado y relevante para la inmuno-oncología, como el anti-PD-1 y el anti-CTLA-4, está garantizada.
Ejemplo 7: muestras de humanos
La muestra de sangre para la validación del repertorio saludable se recolectó bajo la aprobación del Proyecto Genoma Personal. Las PBMC para el experimento de bNAb de HIV se obtuvieron del donante 17, un donante infectado con HIV-1 de la cohorte del Protocolo G de IAVI. Todas las muestras de HIV humano se recolectaron con consentimiento informado por escrito según protocolos clínicos aprobados por el Comité Nacional de Ética de la República de Ruanda, la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Emory, el Comité de Ética de Investigación de la Universidad de Zambia, el Comité de Ética de Investigación de Charing Cross, el Comité Científico y Ético de la UVRI, el Comité de Ética de Investigación de la Universidad de Nueva Gales del Sur. Vincent's Hospital y Eastern Sydney Area Health Service, el Comité de Ética e Investigación del Kenyatta National Hospital, el Comité de Ética de Investigación de la Universidad de Ciudad del Cabo, la Junta de Revisión Institucional Internacional, el Comité de Ética de la Universidad de Mahidol, la Junta de Revisión Institucional del Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed (WRAIR) y el Comité "National d'Ethique des Sciences de la Vie et de la Sante" (CNESVS) de Costa de Marfil. Se obtuvo un adenocarcinoma de ovario extirpado, disociado y crioconservado de un solo donante de Conversant Biologies con consentimiento informado por escrito según un protocolo aprobado por el IRB.
Ejemplo 8: preparación de células
Para el estudio de 3 millones de linfocitos B sanos, se extrajeron 50 ml de sangre en tubos Vacutainer CPT de preparación celular con heparina sódica (BD), se centrifugaron durante 20 minutos a 1800 x g, se lavaron dos veces en tampón de preparación celular (1x PBS complementado con suero bovino fetal al 2 % y EDTA 2 mM), mediante centrifugación a 200 x g para eliminar las plaquetas, y las PBMC resultantes se crioconservaron en medio RPMI-1640 (Life Technologies) suero bovino fetal al 20 % DMSO al 10 % a -80 °C hasta que se necesitaran. Antes de la generación de la emulsión, las PBMC se descongelaron, se lavaron dos veces en tampón de preparación de células y se contaron. Los linfocitos B se aislaron utilizando un kit de enriquecimiento de linfocitos B humanos basado en selección negativa (Stem Cell Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se pasaron a través de un filtro de células de 20 |jm y se diluyeron a 6,2 x 106 células/ml (experimento de 3 millones de linfocitos B) o 3,1 x 106 células/ml (experimentos de tumor de ovario y donante PGT) en tampón de preparación celular.
Ejemplo 9: código de barras de receptor inmunitario en emulsión
La plataforma de generación de emulsión constaba de tres Mitos P-Pumps (Dolomite Microfluidics) impulsadas por un solo compresor de aire, cada una con un sensor de caudal de flujo de Mitos, para permitir el flujo controlado por ordenador de dos fases acuosas y una fase continua de aceite fluorofílico en un chip pequeño de 2 reactivos de Dolomite de cuarzo revestido de fluorófilo. Un canal de entrada acuoso contenía las células a la densidad requerida para producir el nivel deseado de ocupación de células por gotita, mientras que el segundo canal acuoso contenía la mezcla de lisis y reacción, que consistía en oligonucleótidos y tampón de reacción AbPair™ (www.abvitro.com/catalog AV2070-1S and AV2080-1S), 5 unidades/ml de transcriptasa inversa basada en MuMLV (Thermo Scientific) y 0,1 unidades/ml de polimerasa de PCR Herculase II. Se usó una jeringa de microlitros Hamilton de 100 ml para sobrecargar un circuito de muestra de tubería PEEK de 100 ml de diámetro interno en dos inyecciones de ~100 ml cada una de mezcla LR. Se usó una jeringa Hamilton Gastight de 100 ml para cargar ~110 ml de la suspensión celular en un circuito de tubo de FEP de ~100 ml y 0,2 jm de diámetro interno. La emulsión se formó mediante chorro de flujo enfocado de las fases acuosas a caudales de flujo idénticos a través del chip de 2 reactivos con flujo de aceite simultáneo desde los dos canales de aceite en el chip. La emulsión que salía del canal de salida del chip goteó en tubos de tira de PCR de 0,2 ml (Eppendorf) en un bloque frío, después de lo cual se eliminó el exceso de aceite mediante pipeteo desde el fondo del tubo, se añadieron 40 ml de solución de superposición (25 mM de Na-EDTA, pH 8,0) y los tubos se transfirieron a un termociclador estándar para la reacción de marcado de transcritos. Durante un paso de transcripción inversa (RT) de 45 minutos, el ARN se transcribe inversamente a 42 °C con cebadores de RT específicos de la diana, con la adición basada en un cambio de molde de una secuencia adaptadora universal que contiene un código de barras molecular aleatorio. Después de RT, las emulsiones se sometieron a 40 ciclos de termociclado (cada ciclo: 82 °C durante 10 segundos, 65 °C durante 25 segundos) para realizar la amplificación por PCR de los moldes de código de barras de gotitas, que se diluyeron en la mezcla de reacción y lisis inicial a 30.000 cp/ml, generando una concentración en la mezcla final de 15.000 cp /ml o ~1 por gota de ~65 pl. Un extremo del código de barras de gotitas comprende sitio del cebador de lectura 2 ("P7") de Illumina, mientras que el otro extremo coincide con la secuencia común del oligonucleótido adaptador universal. Por lo tanto, durante la PCR, los ADNc con cambio de molde pueden hibridarse con cadenas de código de barras de gotitas amplificadas y empalmarse por extensión de superposición para producir productos de longitud completa que contienen secuencias de código de barras diana, molecular y de gotitas.
Ejemplo 10: ruptura de emulsión, limpieza, PCR cadena abajo, agrupación y secuenciación
Después del termociclado, la solución de superposición se eliminó mediante pipeteo y se añadieron 40 ml de solución para romper la emulsión (FC-40:perfluorooctanol 1:1) junto con 15 ml de solución de limpieza de lisado (12,5 ml de proteasa de Qiagen, 2,5 ml de Na-EDTA 0,5 M, pH 8,0). Después de invertir 10 veces para romper la emulsión, la mezcla se incubó durante 15 minutos a 50 °C y 3 minutos a 95 °C para inactivar la proteasa. Después de la centrifugación a 15.000 x g durante 1 minuto para aislar la fase acuosa, el material recuperado se purificó rigurosamente para eliminar los oligonucleótidos, los reactivos y el exceso de productos de PCR con código de barras de gotitas. Dado que los productos de longitud completa contienen biotina debido a la biotinilación en 5' del cebador RT, se pueden separar de manera eficiente del exceso de productos de PCR de código de barras de gotitas mediante la limpieza en perlas de estreptavidina, lo que minimiza los artefactos de recombinación de PCR cadena abajo, un problema frecuente en los enfoques de extensión por superposición. Los primeros productos se purificaron usando perlas AMPure XP (Agencourt) siguiendo las instrucciones del fabricante en una relación de 1:1, seguido de una limpieza usando perlas de estreptavidina (New England Biolabs) siguiendo también las instrucciones del fabricante, seguido de elución en agua desionizada a 95 °C, seguido de una segunda limpieza con perlas AMPure XP en una relación de 1:1. Luego, los productos se ingresaron en una PCR de enriquecimiento diana en la que se usaron cebadores específicos para las regiones constantes de las dianas del receptor de linfocitos B o T junto con un cebador específico para el extremo universal de la secuencia de código de barras de gotita. Este cebador inverso también contenía un código de barras de índice de seis bases para la secuenciación multiplexada en el instrumento MiSeq según las instrucciones del fabricante. Por lo tanto, en este paso solo se amplifican las secuencias diana con código de barras de gotitas de longitud completa. Todas las dianas se amplificaron primero juntas durante siete ciclos de 98 °C 10 segundos; 64 °C 20 segundos; 72 °C 15 segundos, utilizando la polimerasa Q5 Hot Start (New England Biolabs) en las condiciones recomendadas por el fabricante, incluido un paso de activación de la polimerasa a 98 °C de 2 minutos al comienzo de la reacción. A eso le siguió la limpieza con AMPure XP en una relación de perlas:PCR de 1,5:1. Luego se realizó un segundo ciclo de siete dirigido a cada cadena (Vh, Vl, Va, Vp) por separado, utilizando las mismas condiciones de termociclado que antes, seguido de limpieza con AMPure XP. Luego se realizó una PCR final con las mismas condiciones de termociclado y de 5 a 15 ciclos (según el rendimiento evaluado por qPCR) para añadir los adaptadores de secuenciación Illumina de longitud completa y generar suficiente material para la cuantificación TapeStation D1000 (Agilent). Luego, los bancos se agruparon y secuenciaron en la plataforma V32 x 300bp MiSeq (Illumina).
Ejemplo 11: modificaciones a la plataforma MiSeq
La reconstrucción de la región V(D)J variable completa de BCR o TCR requiere unir las dos lecturas de Illumina de extremos emparejados. Para mejorar este proceso, la lectura directa del kit de 2 x 300 pb se amplió a 325 pb. Se usó phiX enriquecido al 10 % para aliviar los problemas de diversidad limitada del banco, ya que los bancos de receptores inmunitarios tienen una diversidad limitada en los sitios de cebadores de la región constante.
Ejemplo 12: descripción general del procesamiento bioinformático de lecturas
Las lecturas de Illumina MiSeq se procesaron mediante el uso de ductos personalizados creados en torno al paquete pRESTO (versión 0.4) para generar secuencias de consenso completas para las moléculas de ARNm de cada gotita, anotadas con IgBLAST y/o IMGT/HighV-QUEST, y alineadas, filtradas y procesadas posteriormente con guiones personalizados y el paquete Change-O para generar estadísticas.
Ejemplo 13: procesamiento de lectura y anotación, asignación de isotipo.
El procesamiento de lectura sin procesar, la anotación de V(D)J y la asignación clonal se realizaron con ductos personalizados utilizando los paquetes pRESTO y Change-O. En resumen, las lecturas sin procesar de 325+300 pb de extremos emparejados de Illumina se controlaron en cuanto a la calidad, se recortaron con cebadores y se identificaron códigos de barras específicos de gotitas (DB) y específicos de moléculas (MB) a través de coincidencias aproximadas de sitios de cebadores. Juntos, DB y MB especifican de forma única una molécula de origen, y este identificador molecular único (UMI) se utilizó para agrupar lecturas de réplicas de PCR acordadas (mínimo de dos) procedentes de la misma molécula para generar un consenso para cada secuencia de ARNm. El cebado específico de isotipo se confirmó mediante la coincidencia aproximada de regiones constantes específicas de isotipo conocido dentro de secuencias recortadas con cebador. Los segmentos de la línea germinal V(D)J y la estructura de reordenamiento se determinaron mediante el uso de IgBLAST y se confirmaron con IMGT/HighV-QUEST según correspondía, se analizaron por Change-O y los guiones personalizados.
Los clones se asignaron a través de la agrupación de enlace único dentro de los grupos de secuencias V(D)J funcionales que coincidían con el gen IGHV, el gen IGHJ y la longitud de la unión, tal como se implementó en Change-O. Para el conjunto de datos de 3 millones de células circulantes, se utilizó una distancia intraclonal ponderada de 4,0, usando un modelo de transición/transversión simetrizado como el límite de distancia del vecino más cercano dentro de los clones.
Ejemplo 14: filtrado de inclusión del receptor inmunitario de gotitas y cálculo de fidelidad de emparejamiento La precisión de la recuperación de la secuencia de linfocitos B de las gotitas se puede evaluar de dos maneras con este método de código de barras: mediante la coincidencia de secuencia de ARNm intragotitas y mediante la coincidencia de emparejamiento de fracciones cruzadas. Dentro de cada gotita, se capturan múltiples ARNm por locus; las secuencias V(D)J expresadas de una célula deben coincidir. La presencia de más de un VDJ productivo y una secuencia VJ productiva por gotita se marca bioinformáticamente como inclusión putativa de receptor inmunitario u ocupación multicelular, utilizando un límite de diversidad de secuencia del 2 % (diferencias medias de nucleótidos por pares pi55 <0,02) de múltiples segmentos de V(D)J alineados para definir la coincidencia de secuencia. Se construyeron secuencias de consenso de cadena pesada y liviana para cada gotita excluida alélicamente, y se usaron para la definición de clones y el análisis de emparejamiento de fracciones cruzadas. Para el conjunto de datos de 3 millones de linfocitos B circulantes, cada linaje de Vh está asociado con uno (en el caso ideal) de >20.000 clones de cadena liviana en el conjunto de datos. Entre 259.368 gotitas excluidas del locus inmunitario con pares de VhVl, 10.870 grupos de reordenamiento del locus pesado de VDJ estaban presentes en al menos dos de las seis fracciones de emulsión separadas físicamente. Estos grupos representan linajes expandidos o reordenamientos independientes pero similares de los mismos exones VJ. Cuando un reordenamiento de VDJ se empareja con un reordenamiento VJ uniforme en dos repeticiones, ambos experimentos produjeron de forma independiente un verdadero positivo (33.157 de 35.922 posibles comparaciones por pares para 2.604 clones con reordenamientos más raros). Por lo tanto, la precisión para cada réplica es del 96,1 % (0,923A0,5).
Ejemplo 15: descubrimiento de la secuencia candidata de bNAb de HIV
Se descubrieron nuevos anticuerpos ampliamente neutralizantes (BNAb) emparejados de forma natural contra el HIV mediante la extracción de nuestros 38.620 pares de VhVl en busca de similaridades con HCDR3 de bNAb conocidos, secuencias VDJ y linajes del donante 17 seleccionados de la bibliografía utilizando tblastx, MUSCLE y PhyML, seguido de una inspección manual de árboles filogenéticos de la secuencia completa de aminoácidos V(D)J para seleccionar candidatos a anticuerpos intercalados con secuencias de bNAb conocidas.
Ejemplo 16: expresión y purificación de la proteína de bNAb de HIV
Las secuencias de anticuerpos se sintetizaron y clonaron en vectores de cadena pesada y liviana descritos con anterioridad. Los plásmidos de cadena liviana y pesada se cotransfectaron (relación 1:1) en células 293 FreeStyle usando 293fectin (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los sobrenadantes de anticuerpos se recogieron cuatro días después de la transfección y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A. Los anticuerpos purificados cambiaron de tampón a PBS antes de utilizarlos en otros ensayos..
Ejemplo 17: ensayos de neutralización y producción de pseudovirus
Los pseudovirus se generaron por transfección de células 293T con un plásmido que expresa Env de HIV-1 y un plásmido de estructura genómica deficiente en Env (pSG3AEnv). Los pseudovirus se recolectaron 72 horas después de la transfección para su uso en ensayos de neutralización. La actividad neutralizante se evaluó utilizando una ronda única de ensayo de pseudovirus de replicación y células diana TZM-Bl. Brevemente, las células TZM-Bl se sembraron en una placa de fondo plano de 96 pocillos. A esa placa se añadió pseudovirus, que se preincubó con diluciones en serie de anticuerpo durante 1 hora a 37 °C. La expresión del gen informador de luciferasa se cuantificó 72 horas después de la infección tras la lisis y la adición de sustrato de luciferasa Bright-Glo (Promega). Para determinar los valores de IC50, las curvas de respuesta a la dosis se ajustaron mediante regresión no lineal.
Ejemplo 18: identificación de cadena diana de tumor de ovario
Tras la captura simultánea de BCR y TCR a partir del tejido tumoral disociado de ovario en emulsión, las lecturas se filtraron utilizando códigos de barras moleculares y de gotitas como se describió con anterioridad, pero luego se buscó la presencia de cada uno de los cuatro posibles tipos de cadenas diana (BCR Vh, BCR Vl, TCR Va, TCR Vp). Las cadenas diana se conservaron si estaban respaldadas por al menos dos ARNm, cada uno con al menos dos lecturas de secuenciación. Todos los códigos de barras de gotitas que contenían solo pares BCR VhVl o TCR VaVp se siguieron analizando. Los clones de la cadena pesada de BCR y de la cadena beta de TCR se nombraron en base a distintas secuencias de aminoácidos de CDR3.
Ejemplo 19: detección de proteínas en emulsión mediante tinción de anticuerpos marcados con ADN
Se diseñaron oligonucleótidos de ADN monocatenario de 200 pb para contener secuencias únicas de ID de antígeno de 5 pb y se modificaron con un grupo amino de 5' (Integrated DNA Technologies). Los anticuerpos monoclonales de ratón, CD4 anti-humano (BioLegend, n. ° 300516) y CD8a (BioLegend, n. ° 301018) se conjugaron con etiquetas de oligonucleótidos de ADN utilizando el kit Thunder-Link (Innova Biosciences) según el protocolo del fabricante. Para el marcaje celular antes de la emulsión, se diluyeron dos millones de linfocitos T seleccionados negativamente de sangre periférica en 400 ml de tampón celular EDTA 2 mM azida de sodio al 0,05 %. Se añadió ADN monocatenario de esperma de salmón a las células hasta una concentración final de 200 mg/ml y las células se rotaron a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se añadió a las células una mezcla de anticuerpos marcados con ADN de CD4 y CD8a (cada uno hasta una concentración final de 5 nM) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células se lavaron tres veces con tampón celular EDTA 2 mM azida de sodio al 0,05 % 200 mg/ml de ADN monocatenario de esperma de salmón. Las células se resuspendieron en tampón celular azida de sodio al 0,05 % antes de entrar en el análisis de la emulsión. Se utilizaron 30.000 células para la secuenciación de la emulsión.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la caracterización de células, que comprende realizar una reacción en al menos un único recipiente de una pluralidad de recipientes, la reacción comprende unir un primer polinucleótido con código de barras del recipiente, que comprende una secuencia de código de barras del recipiente, a una parte del oligonucleótido de un conjugado de afinidad-oligonucleótido, en donde una parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido se une a un antígeno diana expresado por una única célula aislada en al menos un único recipiente de la pluralidad de recipientes, en donde la parte de oligonucleótido comprende una secuencia de identificación de antígeno (AID), y opcionalmente en donde el antígeno diana es un antígeno extracelular.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la única célula es de una pluralidad de células de una única muestra, preferiblemente en donde al menos un único recipiente es un pocillo, una emulsión o una gotita.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de AID tiene un código de barras para el antígeno diana o la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además poner en contacto una pluralidad de células que comprenden la célula única con el conjugado de afinidad-oligonucleótido antes de aislar la célula única en al menos un recipiente único.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la primera secuencia de código de barras del recipiente del primer polinucleótido con código de barras del recipiente o un amplicón del mismo en cualquier recipiente único de la pluralidad de recipientes es única para el recipiente único.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además lisar la célula única en al menos un recipiente único y unir un segundo polinucleótido con código de barras del recipiente que comprende una segunda secuencia de código de barras del recipiente a un polinucleótido celular de la célula única, y opcionalmente unir el primer polinucleótido con código de barras del recipiente y el segundo polinucleótido con código de barras del recipiente simultáneamente, preferiblemente en donde la parte del oligonucleótido del primer o segundo conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende además al menos una de una secuencia de código de barras molecular de afinidad (AMB), una secuencia de unión al cebador, un secuencia de fusión, o una secuencia constante.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el método comprende además (a) secuenciar la parte del oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido junto con el polinucleótido con código de barras del recipiente unido, complementos del mismo, productos amplificados del mismo o una combinación de los mismos, produciendo así lecturas de la secuencia del oligonucleótido y/o (b) secuenciar el polinucleótido celular junto con el polinucleótido con código de barras del recipiente unido, complementos del mismo, productos amplificados del mismo, o una combinación de los mismos, produciendo así lecturas de la secuencia del polinucleótido celular.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el método comprende además (a) comparar las lecturas de secuencia del oligonucleótido con las lecturas de secuencia del polinucleótido celular, (b) las secuencias de código de barras del recipiente de las lecturas de secuencia del oligonucleótido con las lecturas de secuencia de código de barras del recipiente de las lecturas de secuencia del polinucleótido celular, (c) secuencias de identificación de antígeno (AID) de lecturas de secuencia del oligonucleótido con secuencias de código de barras molecular de afinidad (AMB) de lecturas de secuencia del oligonucleótido o (d) lecturas de secuencia del polinucleótido celular; y/o analizar secuencias de códigos de barras del recipiente de las lecturas de secuencia del polinucleótido celular o secuencias de códigos de barras moleculares de lecturas de secuencias de polinucleótidos celulares, preferiblemente en donde el método comprende además determinar una característica de una célula basada en el análisis o la comparación.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde la primera secuencia de código de barras del recipiente del primer polinucleótido con código de barras del recipiente unido a la parte del oligonucleótido del conjugado de afinidad-oligonucleótido y el segundo código de barras del recipiente del segundo polinucleótido con código de barras del recipiente unido al polinucleótido celular son iguales y/o proceden de un mismo polinucleótido con código de barras del recipiente de molde en al menos un único recipiente.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en donde el método comprende además unir un polinucleótido con código de barras molecular que comprende una secuencia de código de barras molecular al polinucleótido celular, en donde la secuencia de código de barras molecular tiene un código de barras en el polinucleótido celular y/o amplicones del mismo.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en donde la unión del primer polinucleótido con código de barras del recipiente a la parte de oligonucleótido o la unión del segundo polinucleótido con código de barras del recipiente al polinucleótido celular comprende una reacción de ligación, una reacción enzimática, una reacción de hibridación, una reacción de extensión o una reacción de amplificación.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el antígeno extracelular de la célula única es un antígeno específico o expresado por una célula inmunitaria, opcionalmente un linfocito T o un linfocito B, preferiblemente en donde el antígeno extracelular se selecciona del grupo que consiste en CD154, CD4, CDS, CD137, CD40L, CD80, CD86, CD11c, CD25, CD69, CD44, CD125, CD2, CD3, CD5, CD14 y CD19.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido es un anticuerpo o fragmento del mismo, un péptido, una proteína, un aptámero, una molécula pequeña, un fármaco o una célula, preferiblemente en donde la parte de afinidad del conjugado de afinidad-oligonucleótido comprende uno de un complejo principal de histocompatibilidad (MHC) o una parte funcional o de unión del mismo, o un péptido que se une a un anticuerpo o un receptor de antígeno quimérico (CAR).
14. Una composición para la caracterización de células, que comprende una pluralidad de recipientes, en donde al menos un único recipiente de la pluralidad de recipientes comprende:
(a) una única célula de una muestra que comprende una pluralidad de células,
(b) un polinucleótido con código de barras del recipiente o un complemento del mismo que comprende una secuencia de código de barras del recipiente;
(c) un conjugado de afinidad-oligonucleótido, en donde una parte de afinidad de afinidad-oligonucleótido se une a un antígeno diana de la célula única, en donde el polinucleótido con código de barras del recipiente o un complemento del mismo se une a una parte del conjugado de afinidad-oligonucleótido, en donde la parte del oligonucleótido comprende una secuencia de identificación de antígeno (AID); y
opcionalmente en donde se lisa la única célula.
15. Un kit para hacer conjugados de afinidad-oligonucleótido, que comprende:
(a) un primer contenedor que comprende un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de identificación de antígeno (AID) y una primera secuencia de código de barras molecular de afinidad (AMB), en donde la primera secuencia de AID y la primera secuencia de AMB son secuencias conocidas;
(b) un segundo contenedor que comprende un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de identificación de antígeno (AID) y una segunda secuencia de código de barras molecular de afinidad (AMB), en donde la segunda secuencia de AID es una secuencia conocida y es diferente de la primera secuencia de AID, y en donde la segunda secuencia de código de barras molecular de afinidad (AMB) es una secuencia conocida y es diferente de la primera secuencia de código de barras molecular de afinidad (AMB); (c) uno o más terceros contenedores que comprenden reactivos aptos para conjugar el primer oligonucleótido con una primera molécula de afinidad y reactivos aptos para conjugar el segundo oligonucleótido con una segunda molécula de afinidad; en donde la primera molécula de afinidad es una molécula configurada para unirse a una primera proteína extracelular de una célula, y la segunda molécula de afinidad es una molécula configurada para unirse a una segunda proteína extracelular de una célula, en donde la primera proteína extracelular es diferente de la segunda proteína extracelular; y
(d) un conjunto de instrucciones que describen cómo conjugar el primer oligonucleótido con la primera molécula de afinidad y el segundo oligonucleótido con la segunda molécula de afinidad;
en donde el kit opcionalmente comprende además:
(e) un cuarto contenedor que comprende una pluralidad de polinucleótidos con código de barras del recipiente, en donde cada polinucleótido con código de barras del recipiente de la pluralidad de polinucleótidos con código de barras del recipiente comprende una secuencia con código de barras de recipiente única y distinta; y
(f) reactivos, y un conjunto de instrucciones que describen cómo unir un polinucleótido con código de barras del recipiente de la pluralidad de polinucleótidos con código de barras del recipiente al primer o segundo oligonucleótido cuando se conjuga con la primera o segunda molécula de afinidad.
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