WO2015152417A1 - 目的抗原に対する抗体の作製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、目的抗原に対する抗体を効率良く作製できる方法等を提供することを目的とする。本発明は、目的抗原に対する抗体の作製方法であって、互いに接近することでアポトーシスシグナルを誘導し得るタンパク質ドメインと、目的抗原との融合タンパク質を発現し得る形質転換細胞を、非ヒト動物に移植して生着させた後、該非ヒト動物由来の生体試料から該抗原に対する抗体を回収することを含むことを特徴とする方法である。

Description

目的抗原に対する抗体の作製方法

　本発明は、目的抗原に対する抗体を効率よく作製する方法、及び当該方法に用いる形質転換細胞等に関する。

　ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、血液などの混合溶液中に含まれる微量なタンパク質と特異的に結合できるため、研究や臨床検査における試薬あるいは医薬品などとして産業上有用な物質である。
　抗体分子は、細胞膜上に発現している抗原に対して抗原抗体反応を強く引き起こすため、疾病患者に投与した場合に治療効果を期待するためには、膜タンパク質を認識する抗体であることが望ましい。
　現在までに上市されている疾病治療用の抗体は、大部分が膜タンパク質を認識するモノクローナル抗体であり（非特許文献１）、（１）標的細胞へ結合し、直接的または間接的に細胞死を誘導する（特許文献１）、（２）膜レセプターへのリガンドの結合を阻害して細胞内シグナル伝達を緩和する（特許文献２）、などの作用により治療効果を発揮している。
　そして、これまでに上市された抗体は、一つ一つが創意工夫と膨大な作業を繰り返すことによって得られたものである。
　これら膜タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製した例の多くは、抗原を発現する細胞を免疫賦活剤（アジュバント）と混合し、マウスを免疫して得られたものである（非特許文献２）。そのため、細胞内外に発現する多数のタンパク質の中から目的の抗原を効率良く誘導できるわけではなく、低い確率で誘導された抗体群の中から、目的の抗原に対する抗体を選び出す、という方法であった。これに対し、転移性の高い細胞をマウスの乳腺へ移植することで、効率良く膜タンパク質に対するモノクローナル抗体が誘導されるという方法が報告された（特許文献３）。この方法は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに転移性の高いヒト細胞を生きたまま移植することで、脾臓の肥大化が極端に進み、膜タンパク質に偏って免疫応答が引き起こされる、という方法である。
　モノクローナル抗体を作製する上では、利用するマウスの系統は重要である。一般的には飼育が容易で、抗原に対する免疫応答性の良い野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスが用いられている。しかし、特許文献３記載の方法では、ヒト細胞を移植して免疫誘導を行うため、細胞が生着するには免疫不全であるヌードマウスの利用が必要であった。しかし、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスはＴ細胞の数が野生型（Ｂａｌｂ／ｃ）に比べ大幅に少ないという問題があった。そこで、特許文献３記載の方法よりも効率を向上させるためには、免疫不全ではない非ヒト動物の利用が好ましいと考えられた。
　野生型マウスに、同種由来の高転移性のがん細胞を移植した場合に、細胞は生着し、個体内の様々な臓器に転移していく。野生型マウスには免疫系が正常に機能しているが、同種由来のがん細胞は免疫系に対抗して増殖及び転移する性質を有しているため、速やかに体内にがん細胞が拡散し、マウスの死亡を招く。一例としては、野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスから樹立された、高転移性のマウス乳がん細胞（４Ｔ１）を、野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスの第四乳腺に４×１０^４ｃｅｌｌｓ／乳腺となるよう移植した場合、４週以内にマウスが死亡し始め、６週での８０％以上のマウスが死亡する。
　すなわち、特許文献３記載の方法を応用し、野生型のマウスに同種由来のがん細胞を生着させた場合には、短期間でマウスが死亡してしまうため、効率良く抗体の誘導を行うことが出来ないという問題があり、解決が望まれていた。
　細胞を用いた抗体誘導法に関しては、死細胞を投与する方法が知られている（非特許文献４）。この方法では、あらかじめがん細胞を死滅させ、その死細胞を個体に投与して、がん細胞に対する抗体を誘導させる方法であり、がんワクチンとしての利用例が報告されている。この場合、目的抗原が免疫系に認識されやすくするために、細胞に自発的な（プログラムされた）細胞死、すなわちアポトーシスを引き起こさせ、死滅した細胞を皮下に投与する方法で行われる。
　アポトーシスにより死滅した細胞を投与すると、死細胞はリンパ流に乗ってリンパ節に蓄積する。アポトーシスによって死滅した細胞はその表面にホスファチジルセリンを露出しているため、食細胞（マクロファージや樹状細胞）はこのホスファチジルセリンと結合することで死細胞のみを選択的に貪食する。取り込まれた細胞の成分は、抗原提示されて抗体を誘導することが報告されている（非特許文献５）。
　しかし、生きたがん細胞を個体内へ移植した後に、アポトーシスを誘導させて死滅させ、ワクチンに利用するという方法は報告されていない。これは、ヒトにがん細胞を移植する方法であるために、治療法として認められない行為と考えられるためである。また、非ヒト動物内にがん細胞を生着させ、アポトーシスで死滅させることで目的抗原に対する抗体を効率良く誘導したという報告はない。
　アポトーシスによる細胞死は、個体が発生する段階で不要となった細胞が除去される機構であり、細胞の自殺、すなわちプログラムされた細胞死として知られている。人為的にアポトーシスを誘導させる方法としては、紫外線や放射線、酸化、熱ショック、高浸透圧、重金属が知られているほか、サイトカイン等のタンパク質でも誘導されることが報告されている。サイトカインの中では、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）ファミリーに属するリガンドが、それらの受容体（ＴＮＦ受容体スーパーファミリー）を発現する細胞に結合すると、アポトーシスが誘導される。
　ＴＮＦファミリーには、ＴＮＦ−αやリンフォトキシンα、Ｆａｓリガンド、Ａｐｏ−３、ＴＲＡＩＬ等が含まれる。これらの受容体としては、ＴＮＦと結合するＴＮＦＲ１、Ｆａｓリガンドと結合するＦａｓ、Ａｐｏ−３リガンドと結合するＡｐｏ−３、ＴＲＡＩＬと結合するＤＲ４やＤＲ５等が知られている。リガンドと受容体が結合した場合、受容体は細胞膜上で局所的に多量体となることで、細胞内にシグナルを生じさせることが公知である（非特許文献５）。
　ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインには、約７０アミノ酸残基からなる共通したモチーフ配列が存在し、このモチーフはデスドメインと呼ばれる。デスドメインは他のデスドメインを有する分子と結合し、アダプタータンパク質と呼ばれるＦＡＤＤ（Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ｄｅａｔｈ　ｄｏｍａｉｎ／ＭＯＲＴ１）やＴＲＡＤＤ（ＴＮＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｄｅａｔｈ　ｄｏｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）が集まることによって、細胞内にアポトーシスシグナルが伝達されることが知られている（非特許文献６）。すなわち、リガンドの結合により受容体の多量体化が進み、デスドメインが近づくことによってアポトーシスシグナルが生じることが公知である。
　デスドメインを含む２つ以上の分子が近づくことでアポトーシスが誘導されることを利用し、人工的にアポトーシスを誘導する機能分子を作り出した例が報告されている（非特許文献７）。この場合、エストロゲン受容体の細胞内ドメインにＴＮＦ受容体のデスドメインを融合させた融合タンパク質を作り出し、エストロゲンが結合することで細胞にアポトーシスを誘導することが出来る、としたものである。
　しかしながら、抗体を誘導する目的で目的抗原とデスドメインを有する分子とを融合させた報告はない。また、個体内で新たに誘導された抗体によって、アポトーシスが引き起こされるよう設計したがん細胞についても報告はない。さらに、目的抗原とデスドメインを融合させた分子をがん細胞に発現させ、マウスに生着させた場合に、新たに誘導された抗体によって個体内でアポトーシスが引き起こされ、死滅した細胞が効率的に貪食細胞によって取り込まれることで、目的抗原に対する抗体が効率良く誘導される、といった報告もない。

特開２００１−０１０９７４号公報 特開平７−１８８０５６号公報 国際公開第２０１２／０２６６１５号

日本薬理学雑誌，２００８，ｖｏｌ．１３１，ｐ．１０２−１０８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８９，ｖｏｌ．９，ｐ．１１６５−１１７２ Ｂｌｏｏｄ，１９９４，ｖｏｌ．８３　ｐ．４３５−４４５ Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７，ｖｏｌ．１３，ｐ．５４−６１ Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１９９９，ｖｏｌ，２，ｐ．２５５−２６０ Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００３，ｖｏｌ．１０，ｐ．６６−７５ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９６６，ｖｏｌ．５６，ｐ．４１６４−４１７０

　このような状況下において、目的抗原に対する抗体を効率良く作製できる方法の開発が望まれていた。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、目的抗原にアポトーシスを引き起こすデスドメインを融合させた融合タンパク質を発現する細胞を作出し、この細胞をマウス等の非ヒト動物に移植して生着させることによって、目的抗原に対する抗体が効率良く誘導できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）目的抗原に対する抗体の作製方法であって、
　互いに接近することでアポトーシスシグナルを誘導し得るタンパク質ドメインと、目的抗原との融合タンパク質を発現し得る形質転換細胞を、非ヒト動物に移植して生着させた後、該非ヒト動物由来の生体試料から該抗原に対する抗体を回収することを含む、
前記方法。
（２）前記細胞が、転移性腫瘍細胞において前記融合タンパク質を発現し得るようにした細胞である、前記（１）記載の方法。
（３）転移性腫瘍細胞は、リンパ節及び／又はリンパ液を介して転移し得る細胞である、前記（２）記載の方法。
（４）転移性腫瘍細胞が、転移性乳がん細胞である、前記（２）又は（３）記載の方法。
（５）前記ドメインが、細胞死受容体の細胞内ドメインに由来するものである、前記（１）~（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）細胞死受容体の細胞内ドメインに由来するドメインが、デスドメインである、前記（５）に記載の方法。
（７）細胞死受容体が、ＴＮＦＲ、Ｆａｓ、ＤＲ３、ＤＲ４及びＤＲ５からなる群より選択される少なくとも１つである、前記（５）又は（６）記載の方法。
（８）目的抗原が、タンパク質である、前記（１）~（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）目的抗原が、膜タンパク質である、前記（１）~（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）膜タンパク質が、膜貫通型タンパク質である、前記（９）記載の方法。
（１１）非ヒト動物が、野生型の非ヒト動物である、前記（１）~（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）非ヒト動物が、齧歯類動物である、前記（１）~（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）齧歯類動物がマウスである、前記（１２）記載の方法。
（１４）前記移植後、１~６ヵ月後に前記抗体の回収を行う、前記（１）~（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）互いに接近することでアポトーシスシグナルを誘導し得るタンパク質ドメインと、目的抗原としてのタンパク質との融合タンパク質を発現し得る、形質転換細胞。
（１６）前記細胞は、転移性腫瘍細胞において前記融合タンパク質を発現し得るようにした細胞である、前記（１５）記載の細胞。
（１７）転移性腫瘍細胞は、リンパ節及び／又はリンパ液を介して転移し得る細胞である、前記（１６）記載の細胞。
（１８）転移性腫瘍細胞が、転移性乳がん細胞である、前記（１６）又は（１７）記載の細胞。
（１９）前記ドメインが、細胞死受容体の細胞内ドメインに由来するものである、前記（１５）~（１８）のいずれか１項に記載の細胞。
（２０）細胞死受容体が、ＴＮＦＲ、Ｆａｓ、ＤＲ３、ＤＲ４及びＤＲ５からなる群より選択される少なくとも１つの受容体の細胞内ドメインに由来するものである、前記（１９）記載の細胞。
（２１）目的抗原が、タンパク質である、前記（１５）~（２０）のいずれか１項に記載の細胞。
（２２）目的抗原が、膜タンパク質である、前記（１５）~（２１）のいずれか１項に記載の細胞。
（２３）膜タンパク質が、膜貫通型タンパク質である、前記（２２）記載の細胞。
　発明の効果
　本発明によれば、目的抗原に対する抗体を効率的に誘導することのできる、新規な抗体作製方法を提供することができる。
　本発明の作製方法では、融合タンパク質を発現する細胞をマウス等の非ヒト動物に移植して生着させた場合、目的抗原に対する抗体が誘導されると、当該細胞がアポトーシスにより死滅し、死滅した細胞は貪食細胞（マクロファージ）に効率的に取り込まれて抗原提示されやすくなる。それにより、目的抗原に対する抗体誘導効率が向上させることができる。また、上記細胞として腫瘍細胞（がん細胞）、より具体的には転移性の腫瘍細胞を用いた場合でも、生着後、移植した非ヒト動物内で誘導された抗体によってアポトーシスが誘導され死滅することから、当該非ヒト動物自体の死亡率を低下させることができ、長期間、抗体誘導をさせることができる点でも、本発明の作製方法は有用性及び実用性に優れた方法である。

本発明の概念図である。膜タンパク質である目的抗原の細胞内に、デスドメインを含む受容体の細胞内ドメインを融合させた、融合タンパク質を示す。デスドメインを持つ受容体は、リガンドの結合により細胞にアポトーシスを引き起こさせる。一方、デスドメインを含む融合タンパク質は、抗体の結合により細胞にアポトーシスを引き起こさせることを示す。 本発明で作製した融合タンパク質の概念図である。ＣＤ２０とＦａｓの細胞内ドメインを結合させたＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤを示す。 高転移性のマウス乳がん細胞である４Ｔ１にＣＤ２０をコードするＤＮＡを組み込んだ発現用プラスミドベクター（ｐＥＦ６−ＣＤ２０）を導入し、ウエスタンブロットによりＣＤ２０過剰発現株が取得できていることを示す図である。 ４Ｔ１にＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤ融合タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ発現用プラスミドベクター（ｐＥＦ６−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤ）を導入し、ウエスタンブロットによりＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤ過剰発現株が取得できていることを示す図である。 アポトーシスを起こした細胞とネクローシスを起こした細胞が、蛍光顕微鏡下で見分けられることを示す図である。アポトーシスの特徴である核の凝集が、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（図中Ｈｏ）のみで染色される場合が初期アポトーシス、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（図中ＰＩ）との両方で染色される場合は後期アポトーシスであることを示す。ネクローシスはＨｏ及びＰＩの両方で染色されるが、核が膨潤していることが特徴であり、見分けられることを示す。 ４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤと抗ＣＤ２０抗体とを反応させた場合に、細胞がアポトーシスによって死滅することを示す図である。 ４Ｔ１−ＣＤ２０と４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤをコントロール抗体あるいは抗ＣＤ２０抗体とを２４時間あるいは４８時間反応させて培養した際の、生存細胞数を解析した結果を示す図である。 ４Ｔ１−ＣＤ２０あるいは４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤを、野生型マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）へ移植した後、飼育したマウスの生存率の結果を示す図である。 本発明で作製したジーンレポーターアッセイ用の融合タンパク質の概念図である。ＣＤ２０とＣＤ３　ｚｅｔａの細胞内ドメインを結合させたＣＤ２０−ＣＤ３ｚを示す。 ＣＤ２０−ＣＤ３ｚをレポーター細胞であるＢＷＺ．３６で発現させた細胞を作製し、その細胞と抗ＣＤ２０抗体とを反応性させた場合に、抗体濃度に依存して細胞内のβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性が上昇し、基質が分解されて発色が上昇することを示す図である。また、ＣＤ２０に結合しない抗体を同じ濃度で添加した場合は、発色の上昇が見られないことを示す。 ４Ｔ１−ＣＤ２０あるいは４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤ移植マウスで誘導された抗ＣＤ２０抗体の力価を、ＢＷＺ．３６−ＣＤ２０−ＣＤ３ｚを用いて解析した結果を示す図である。

　以下、本発明について、その好ましい態様を具体的に説明する。本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
　なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１４−０７２５８４号明細書（２０１４年３月３１日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
１．概要
　本発明に係る抗体作製方法は、目的抗原にデスドメインを含む配列を融合させた融合タンパク質を構築し、これを発現し得る細胞（好ましくは転移性の腫瘍細胞）を作製して、この細胞を非ヒト動物（好ましくは野生型の非ヒト動物）へ移植して生着させて、目的抗原に対する抗体を効率的に誘導できることを特徴とする方法である。すなわち、この細胞が生着した野生型の非ヒト動物では、誘導された抗体が目的抗原に結合すると、当該細胞がアポトーシスを引き起こして死滅する。死滅した細胞は貪食細胞（マクロファージや樹状細胞）によって取り込まれ、抗原提示されるため、抗体誘導が効率よく起きる。移植した細胞は非ヒト動物の体内で作られた抗体によって死滅するため、当該細胞が腫瘍細胞であっても、当該非ヒト動物の死亡率を低下させることができる。
　すなわち、本発明は、目的抗原に対する抗体の誘導効率を大幅に向上させることの出来る方法である。
　本発明に係る、目的抗原に対する抗体の作製方法は、前述したとおり、互いに接近することでアポトーシスシグナルを誘導し得るタンパク質ドメインと、目的抗原との融合タンパク質を発現し得る形質転換細胞を、非ヒト動物に移植して生着させた後、該非ヒト動物由来の生体試料から該抗原に対する抗体を回収することを含む方法である。
　より具体的には、本発明の作製方法は、
　（１）互いに接近することで、細胞内にアポトーシスシグナルを誘導し得るタンパク質ドメインを、タンパク質等の目的抗原と結合させた、融合タンパク質を作製する工程、
　（２）当該融合タンパク質を発現し得るように、当該タンパク質をコードする遺伝子を導入するなどして形質転換した細胞（転移性腫瘍細胞等）を得る工程、
　（３）当該形質転換細胞を非ヒト動物に移植して生着させる工程、
　（４）その後、非ヒト動物の生体内で誘導及び産生された、目的抗原に対する抗体を、生体試料（例えば、血液、血清等）から回収し、必要に応じ精製等する工程、
　（５）非ヒト動物の脾臓あるいはリンパ節等に存在する抗体生産細胞をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製する工程、
　（６）上記ハイブリドーマ細胞から抗体を回収し、必要に応じ精製等する工程、を含むものである。
　なお、当該方法においては、必要により、適宜、前記融合タンパク質を発現し得る細胞に、目的抗原に対する抗体が結合したときに、当該細胞がアポトーシスにより死滅することを確認する工程も含んでいてもよい。
　本発明において、免疫の目的の「抗原」は、免疫応答を引き起こさせる物質を意味し、移植するがん細胞で発現し、抗原抗体反応を生じる物質であれば特に限定されない。抗原として、タンパク質、核酸、ペプチド、糖類、および脂質などを使用することができるが、タンパク質であることが好ましく、膜タンパク質であることがさらに好ましい。
　本発明において、「膜タンパク質」とは、生体膜に付着しているタンパク質を意味する。本発明の膜タンパク質は、脂質二重膜を貫通し、あるいは脂肪酸鎖等によって脂質二重層に結合する膜内在性タンパク質、及び非共有結合によって脂質二重層の親水性部分や他の膜タンパク質に結び付く表在性膜タンパク質を含む。本発明において、膜タンパク質は、複数回貫通型であってもよいし、一回貫通型であってもよい。
　本発明において、「抗原を発現する」とは、免疫応答を引き起こすことが可能な量の抗原を転移性がん細胞が含むことを意味する。抗原がタンパク質の場合、免疫の目的となる抗原タンパク質をコードする遺伝子とデスドメインを有する遺伝子とを融合させた、融合遺伝子を作製し、この遺伝子を細胞に導入して発現させることが出来る。任意の遺伝子を細胞に導入する方法としては、公知の遺伝子工学的手法を利用してプラスミドなどベクターを用いて行うことができる。この場合、タンパク質に付加された糖鎖も抗原となりうる。抗原は、１種類だけでなく、複数種類を用いてもよい。いずれの場合も細胞内でタンパク質が局在する部位は、特に限定されず、核内、細胞質内、細胞膜上が挙げられる。
　また、抗原の大きさも特に限定されない。抗原としてタンパク質を同種の動物に由来するがん細胞に発現させて移植した場合、タンパク質の立体構造や糖鎖などの修飾が本来の形を保ったまま免疫応答を刺激できるため好適である。
　本発明において、「アポトーシス」とは細胞死の一つの形態であり、外傷などの細胞外の環境の極端な変化によって引き起こされる細胞死であるネクローシスとは区別される細胞死を意味する。アポトーシスは本来、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる細胞死の事であり、プログラムされた細胞死である。
　アポトーシスを起こした細胞は、細胞膜の構造変化が起き、核（クロマチン）が凝縮し、ＤＮＡが１８０ｂｐからなるヌクレオソーム単位で切断され、アポトーシス小体と呼ばれる小型の構造に分解される特徴を有している。ネクローシスでは、細胞内小器官の膨張やＤＮＡのランダムな断片化が観察される。
　アポトーシスが引き起こされた細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２とｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅによる二重染色（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，ｖｏｌ．２７９，ｐ．３３８６５−３３８７４）を行った後に、蛍光顕微鏡下で観察することにより検出できる他、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄＵＴＰ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ）法等、公知の方法で検出することが出来る。
２．アポトーシスに関与する受容体
　本発明において、「アポトーシスを引き起こす」又は「アポトーシスシグナルを誘導する」とは、細胞内にアポトーシスシグナルを生じさせることで、細胞を死滅させることを言う。「アポトーシスシグナル」とは、細胞がアポトーシスにより死滅する過程で働く一連のシグナル伝達機構を意味し、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）経路等の複数の経路が公知である。
　本発明において「アポトーシスに関わる受容体」とは、アポトーシスに関わる事が知られている受容体を意味する。これら受容体の中には、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ１（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）等）やＦａｓ、ＤＲ３（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ　２５）、ＤＲ４（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ　１０Ａ）、ＤＲ５（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ　１０Ｂ）等の、各種の細胞死受容体が公知である。アポトーシスに関わる受容体によるアポトーシスシグナルの発生は、受容体がリガンドの結合により多量体となり、細胞内ドメインの一部分が接近することにより生じることが公知である。細胞死受容体の細胞内ドメインには、デスドメインと呼ばれる約７０アミノ酸残基からなる共通したモチーフ配列が存在し、複数のデスドメインが互いに接近することでアポトーシスシグナルが発生する事が知られている。
３．融合タンパク質
　本発明では、目的抗原と、上記アポトーシスに関わる受容体との融合タンパク質を利用する。「融合タンパク質」とは、本来異なった機能を有するタンパク質を融合させることを意味する。目的抗原がタンパク質の場合、タンパク質をコードするＤＮＡを人工的につなぎ合わせることによって発現させることが出来る。
本発明では、具体的には、互いに接近することで細胞内にアポトーシスシグナルを誘導し得る、細胞死受容体の細胞内ドメインに由来するタンパク質ドメイン（すなわちデスドメインを含む領域）を、目的抗原の細胞内側に融合させた、融合タンパク質を用いる。ここで、目的抗原の細胞内側とは、宿主細胞において目的抗原（例えばタンパク質）を発現させた場合に、細胞膜より内側（細胞質内）に存在し得る当該抗原の少なくとも一部の領域のことをいうが、細胞膜より内側に存在する部分が無い場合は、より細胞質側に位置する少なくとも一部の領域のことをいう。当該融合タンパク質の設計及び作製においては、目的抗原に融合させるデスドメインが細胞質内に存在するように配置する。
　本発明において、マウス、ラット及びヒトのＦａｓのアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号２、４及び６で示される。また、マウス、ラット及びヒトのＦａｓをコードするＤＮＡの塩基配列は、それぞれ順に、配列番号１、３及び５で示される。
　マウス、ラット及びヒトのＴＮＦＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号８、１０及び１２で示される。また、マウス、ラット及びヒトのＴＮＦＲ１をコードするＤＮＡの塩基配列は、それぞれ順に、配列番号７、９及び１１で示される。
　マウス、ラット及びヒトのＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号１４、１６及び１８で示される。また、マウス、ラット及びヒトのＤＲ３をコードするＤＮＡの塩基配列は、それぞれ順に、配列番号１３、１５及び１７で示される。
　ヒトのＤＲ４のアミノ酸配列は、配列番号２０で示される。また、ヒトのＤＲ４をコードするＤＮＡの塩基配列は、それぞれ順に、配列番号１９で示される。
　マウス、ラット及びヒトのＤＲ５のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号２２、２４及び２６で示される。また、マウス、ラット及びヒトのＤＲ５をコードするＤＮＡの塩基配列は、それぞれ順に、配列番号２１、２３及び２５で示される。各アミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、以下に示す通り、所定のアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．）により登録されている。

　マウス由来のＦａｓタンパク質は、３２７アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。Ｆａｓの細胞内ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の第１８７番目~第３２７番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号３１）である。Ｆａｓのデスドメインは配列番号２で示されるアミノ酸配列中の第２２２番目~第３０６番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号３２）である。融合タンパク質を作製する場合には、配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなる領域が含まれていることが好ましく、配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなる領域が含まれていることがより好ましい。
　ラット由来のＦａｓタンパク質は、３２４アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。Ｆａｓの細胞内ドメインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列中の第１８９番目~第３２４番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号３３）である。Ｆａｓのデスドメインは配列番号４で示されるアミノ酸配列中の第２１９番目~第３０３番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号３４）である。
　ヒト由来のＦａｓタンパク質は、３３５アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。Ｆａｓの細胞内ドメインは、配列番号６で示されるアミノ酸配列中の第１９１番目~第３３５番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号３５）である。Ｆａｓのデスドメインは配列番号６で示されるアミノ酸配列中の第２３０番目~第３１４番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号３６）である。
　マウス由来のＴＮＦＲ１タンパク質は、４３３アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。ＴＮＦＲ１の細胞内ドメインは、配列番号８で示されるアミノ酸配列中の第２３６番目~第４５４番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号３７）である。ＴＮＦＲ１のデスドメインは配列番号８で示されるアミノ酸配列中の第３５６番目~第４４１番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号３８）である。
　ラット由来のＴＮＦＲ１タンパク質は、４４０アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。ＴＮＦＲ１の細胞内ドメインは、配列番号１０で示されるアミノ酸配列中の第２３５番目~第４６１番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号３９）である。ＴＮＦＲ１のデスドメインは配列番号１０で示されるアミノ酸配列中の第３６３番目~第４４８番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号４０）である。
　ヒト由来のＴＮＦＲ１タンパク質は、４５５アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。ＴＮＦＲ１の細胞内ドメインは、配列番号１２で示されるアミノ酸配列中の第２３５番目~第４５５番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号４１）である。ＴＮＦＲ１のデスドメインは配列番号１２で示されるアミノ酸配列中の第３５６番目~第４４１番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号４２）である。
　マウス由来のＤＲ３タンパク質は、３８７アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。ＤＲ３の細胞内ドメインは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列中の第１９６番目~第３８７番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号４３）である。ＤＲ３のデスドメインは配列番号１４で示されるアミノ酸配列中の第２９２番目~第３８７番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号４４）である。
　ラット由来のＤＲ３タンパク質は、４０７アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。ＤＲ３の細胞内ドメインは、配列番号１６で示されるアミノ酸配列中の第２１６番目~第４０７番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号４５）である。ＤＲ３のデスドメインは配列番号１６で示されるアミノ酸配列中の第３１３番目~第４０７番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号４６）である。
　ヒト由来のＤＲ３タンパク質は、３９３アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。ＤＲ３の細胞内ドメインは、配列番号１８で示されるアミノ酸配列中の第２２１番目~第４１７番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号４７）である。ＤＲ３のデスドメインは配列番号１８で示されるアミノ酸配列中の第３３２番目~第４１３番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号４８）である。
　ヒト由来のＤＲ４タンパク質は、４４５アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。ＤＲ４の細胞内ドメインは、配列番号２０で示されるアミノ酸配列中の第２６３番目~第４６８番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号４９）である。ＤＲ４のデスドメインは配列番号２０で示されるアミノ酸配列中の第３６５番目~第４４８番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号５０）である。
　マウス由来のＤＲ５タンパク質は、３８１アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。ＤＲ５の細胞内ドメインは、配列番号２２で示されるアミノ酸配列中の第２０２番目~第３８１番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号５１）である。ＤＲ５のデスドメインは配列番号２２で示されるアミノ酸配列中の第２７３番目~第３５６番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号５２）である。
　ラット由来のＤＲ５タンパク質は、２６７アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。ＤＲ５の細胞内ドメインは、配列番号２４で示されるアミノ酸配列中の第１０１番目~第２６７番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号５３）である。ＤＲ５のデスドメインは配列番号２４で示されるアミノ酸配列中の第１７１番目~第２６７番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号５４）である。
　ヒト由来のＤＲ５タンパク質は、３８５アミノ酸残基よりなる１回膜貫通型のタンパク質である。ＤＲ５の細胞内ドメインは、配列番号２６で示されるアミノ酸配列中の第２３２番目~第３８５番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号５５）である。ＤＲ５のデスドメインは配列番号２６で示されるアミノ酸配列中の第３３９番目~第４２２番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号５６）である。
　目的抗原が膜タンパク質の場合、膜タンパク質の全長及び／又は細胞外領域全体、及び／又は細胞外領域の部分配列を利用することが出来る。
　複数回膜貫通型のタンパク質の中には、Ｎ末端とＣ末端の両方が細胞外に存在し、細胞内に末端を持たないタンパク質が存在する。この場合、細胞内ドメインの一部にデスドメインを含むアミノ酸配列を導入する、あるいは、Ｎ末端および／又はＣ末端に膜貫通型ドメインを付加することで、デスドメインを含むアミノ酸配列が細胞内に存在するように適宜設計することが可能である。
　上記の膜貫通型ドメインとは、約２０アミノ酸残基からなるドメインであり、細胞膜を貫通する領域である。膜を貫通するドメインを有するタンパク質であれば利用可能であり、特に限定されるものではないが、例えばマウスＣＤ８ａ（ＣＤ８ａｎｔｉｇｅｎ，ａｌｐｈａ　ｃｈａｉｎ）の膜貫通ドメインが利用できる（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，ｖｏｌ．１７９，ｐ．１１２２−１１２８）。
　マウスＣＤ８ａは、２４７アミノ酸残基からなる一回膜貫通型のタンパク質であり、配列番号５８で示されるアミノ酸配列中の第１９７番目~第２１７番目の２１アミノ酸残基からなる領域（配列番号６４）が膜貫通ドメインとして同定されており、例えば、同配列中の第１８３番目~第２２１番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号６６）を、膜貫通ドメインを含む領域として利用することが出来る。
　ラットＣＤ８ａについては、配列番号６０で示されるアミノ酸配列中の第１９７番目~第２１７番目の２１アミノ酸残基からなる領域（配列番号６８）が膜貫通ドメインとして同定されており、例えば、同配列中の第１８３番目~第２２１番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号７０）を、膜貫通ドメインを含む領域として利用することが出来る。
　ヒトＣＤ８ａについては、配列番号６２で示されるアミノ酸配列中の第１９７番目~第２１７番目の２１アミノ酸残基からなる領域（配列番号７２）が膜貫通ドメインとして同定されており、例えば、同配列中の第１８３番目~第２２１番目のアミノ酸残基からなる領域（配列番号７４）を、膜貫通ドメインを含む領域として利用することが出来る。
　なお、本発明において、マウス、ラット及びヒトのＣＤ８ａアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号５８、６０、及び６２で示され、それらをコードするＤＮＡの塩基配列は、それぞれ順に、配列番号５７、５９、及び６１で示される。
　マウスＣＤ８ａの膜貫通ドメインからなる領域のアミノ酸配列は、配列番号６４で示され、当該領域をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号６３で示され、また、マウスＣＤ８ａの膜貫通ドメインを含む領域のアミノ酸配列は、配列番号６６で示され、当該領域をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号６５で示される。
　ラットＣＤ８ａの膜貫通ドメインからなる領域のアミノ酸配列は、配列番号６８で示され、当該領域をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号６７で示され、また、ラットＣＤ８ａの膜貫通ドメインを含む領域のアミノ酸配列は、配列番号７０で示され、当該領域をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号６９で示される。
　ヒトＣＤ８ａの膜貫通ドメインからなる領域のアミノ酸配列は、配列番号７２で示され、当該領域をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号７１で示され、また、ヒトＣＤ８ａの膜貫通ドメインを含む領域のアミノ酸配列は、配列番号７４で示され、当該領域をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号７３で示される。
　各アミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、所定のアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．）により登録されている。

４．アポトーシス誘導
　本発明では、目的抗原と、デスドメインを含む細胞死受容体の細胞内ドメインとを融合させた融合タンパク質をコードするＤＮＡ（融合タンパク質遺伝子）を、所望の宿主細胞、好ましくはがん細胞、特に転移性のがん細胞に導入することにより、当該融合タンパク質を発現し得る形質転換細胞を作製する。遺伝子の導入は、細胞への人為的な遺伝子導入操作を言い、その方法としては、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルス感染による方法等の公知の方法が利用できる。形質転換細胞における目的タンパク質の発現は、ウエスタンブロット法等の公知の検出方法で確認することが出来る。
　本発明では、目的抗原に対する抗体が結合した場合に、目的抗原の細胞内側に融合させたデスドメインが互いに接近し、アポトーシスシグナルが発生することで細胞死が誘導される。上述した融合タンパク質を発現する形質転換細胞がアポトーシスを起こして死滅するものであるかどうかを、当該細胞を移植する前にあらかじめ確認するには、例えば、目的抗原に結合する市販のポリクローナル抗体が利用できる。さらに、目的抗原の細胞外側にタグを付加した場合には、タグを認識する抗体（タグ抗体）を利用することでも上記確認をすることができる。
　本発明において「タグ」とは、目印のために付ける標識のことであり、放射性同位元素、蛍光色素、遺伝子マーカーなど、実験的に判別同定できる構造や形質を総称する。本発明では、目的抗原の細胞外ドメインに、特定の構造やアミノ酸残基を持つ物質を利用することが出来る。タグとしては、公知のものが利用でき、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグあるいはＦＬＡＧタグ等が利用できるが、限定されるものではない。
　前記形質転換細胞がアポトーシスを起こして死滅したかどうかは、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２とＰｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅとの二重染色を行った後、蛍光顕微鏡下で観察することで確認することが出来る。
５．抗体誘導
　本発明では、上述した融合タンパク質を発現する形質転換細胞をマウス等の非ヒト動物（実験動物）へ移植し、生着させる。この生着させる工程は、前掲の特許文献３（国際公開第２０１２／０２６６１５号）に記載の方法が利用可能である。
　本発明において、「生着する」とは、実験動物に移植した形質転換細胞（形質転換がん細胞等）がその部位に留まり増殖し、細胞塊を作ることを意味する。例えば、形質転換細胞（形質転換がん細胞等）を実験動物内に生着させるためには、当該細胞を移植した後に、当該動物を飼育するだけでよい。以下、形質転換細胞の移植及び生着について、転移性がん細胞を例に挙げて説明するが、他の形質転換細胞についても同様の説明が適宜適用できる。
　転移性がん細胞は、移植され、生着した後に、個体内に広がっていく。がん細胞が広がっていく過程では、原発巣の周辺に細胞が浸潤して広がる現象と、リンパ節を通り個体内へ広がっていく現象が生じる。特に、原発巣とは異なる臓器へ遠隔転移する場合には、リンパ節を通ってがん細胞が広がると考えられている。前掲の特許文献３に記載の方法を用いた場合には、リンパ節を介して細胞が転移する間に免疫誘導が行われ、転移する細胞の細胞膜上に発現するタンパク質に対して抗体が誘導される。
　転移性がん細胞を実験動物に移植する工程においては、従来公知の方法により、がん細胞を当該動物に移植することができる。
　転移性がん細胞の移植を行う方法としては、細胞懸濁液の他、シート状や多層構造など、二~三次元構造様に培養した細胞を実験動物に注入する方法が挙げられる。
　移植に用いる転移性がん細胞数は特に限定されないが、少なくとも０．１×１０^６個であることが好ましく、免疫応答が効果的に行われる範囲において、より多数の細胞を用いることが好ましい。
　転移性がん細胞の生着率を向上させるために、足場材料と混合した細胞懸濁液を注入することが好ましい。
　足場材料としては、生着させるがん細胞が生育するための足場となる材料であれば特に限定されず、好ましくはラミニン、エンタクチン、コラーゲン、フィブリン、アガロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸などを成分として構成されたゲル、ハイドロゲル、および樹脂などが挙げられる。
　足場材料としては、形成されるゲルの硬さや移植後の細胞増殖の良さの観点で、ラミニン／エンタクチンとコラーゲンを主成分とするゲルが好ましく、マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）がより好ましい。マトリゲルとしては、好ましくは、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，ｖｏｌ．４４，ｐ．６７１−６７３に開示されたグロースファクターリデューストマトリゲルなどが挙げられる。
　転移性がん細胞を移植する部位については、移植した細胞が生着しやすい器官や組織であれば特に限定されない。
　転移性を有するがん細胞を移植する器官としては、例えば当該がん細胞が単離されたがんの原発巣が属する器官、および転移巣が属する器官が挙げられる。本発明において、原発巣が属する器官への移植を同所移植といい、転移巣が属する器官への移植を異所移植という。
　転移巣が属する器官とは、これまでに当該がん細胞の転移巣形成が報告されている器官のほか、統計的なデータから、同種のがんにおいて遠隔転移が予測される器官も含む。
　転移性がん細胞として、例えば、乳がん細胞を用いる場合には、乳房への同所移植が可能であるが、骨、肺、リンパ節、皮膚、肝臓、胸膜、および脳などの転移が頻繁に発生する器官への異所移植も利用できる。移植する器官としては、好ましくは同所移植であり、例えば乳がん細胞では乳房である。
６．抗原提示と抗体産生
　本発明においては、（１）上述したように実験動物で初めに目的抗原に対する抗体が誘導されると、（２）その抗体は、移植した形質転換細胞で発現する目的抗原（融合タンパク質中の抗原部分）に結合する。その後、（３）当該抗体に結合した融合タンパク質中のデスドメインが細胞内で互いに接近することにより、細胞内でアポトーシスシグナルが誘導され、当該細胞はアポトーシスを起こして死滅する。（４）このアポトーシスを起こした細胞は、マクロファージ（貪食細胞）や樹状細胞等によって積極的に貪食されることにより、目的抗原が効率的に取り込まれて抗原提示されやすくなり、最終的にＴ細胞やＢ細胞を介して、目的抗原に対する抗体が、より効率的に生産される。（５）このようにして生産された抗体が、また、上記（２）~（４）の過程を繰り返すことにより、さらに一層、目的抗原に対する抗体が効率的に生産される。また、本発明では、上記抗体産生に用いた形質転換細胞は、アポトーシスにより死滅するため、形質転換細胞に用いる宿主細胞として、転移性がん細胞などの各種腫瘍細胞を用いた場合でも、形質転換細胞を移植した実験動物の死亡率を効果的に低減することができる。これにより、長期にわたり抗体誘導及び産生を行うことができる。
　なお、マクロファージ（貪食細胞）がアポトーシスにより死滅した細胞を取り込むことについては、次とおりである。すなわち、細胞が正常に分裂している場合では、細胞膜に存在するホスファチジルセリンは細胞の内側に存在する。しかし、アポトーシスが引き起こされアポトーシス小体となると、膜が反転し、ホスファチジルセリンが細胞外に露出される。このホスファチジルセリンを標的として、ホスファチジルセリン受容体を持つ貪食細胞により、アポトーシスを起こした細胞が積極的に取り込まれる（Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，１９９８，ｖｏｌ．５，ｐ．５５１−５６２）。
　細胞の転移はリンパ節と血液の双方を経由して行われると想定されているが、アポトーシスを起こした細胞が抗原提示されるためには、リンパ節に存在することが必要である。アポトーシスを起こした細胞は、血液及びリンパ節中の両方ともＣＤ１６９陽性マクロファージによって貪食されることが報告されている。しかし、血液中で貪食された場合には抗原提示されず免疫寛容が誘導される。一方、リンパ節に存在する場合には、抗原提示が行われることが知られている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１１，ｖｏｌ．３４，ｐ．８５−９５）。
７．転移性がん細胞
　転移性がん細胞（転移性腫瘍細胞）としては、例えば、骨、肺、リンパ節、皮膚、肝臓、胸膜、脳、乳房、乳腺、膀胱、大腸、または結腸の転移性を有するがん細胞などが挙げられ、転移性乳がん細胞が特に好ましい。本発明において、転移性がん細胞は樹立された細胞でもよいし、転移性がん細胞を有する動物から採取したがん細胞であってもよい。また、転移性がん細胞の由来は、細胞を採取可能な生体であれば特に限定されず、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ニワトリ、ヒトなどが挙げられ、より好ましくはマウスである。
　転移性を有する細胞の中でも遠隔転移を引き起こしやすい細胞が好ましく、リンパ節及び／又はリンパ液を介して転移する細胞が好ましい。
　リンパ節を介して転移するがん細胞としては、好ましくは転移性を有するがん細胞であり、より好ましくは転移性を有する乳がん細胞であり、さらに好ましくは高転移性を有する乳がん細胞である。高転移性を有する乳がん細胞としては、具体的には、４Ｔ１やＭＭＴ０６０５６２、ＦＭ３Ａ等が挙げられ、好ましくは４Ｔ１である。
　乳がん細胞以外の、高転移性を有するがん細胞としては、Ｂ１６−Ｆ１０（黒色腫腫瘍）、Ｌｅｗｉｓ　Ｌｕｎｇ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（肺がん）、Ｃｏｌｏ２６（大腸がん）などが挙げられる。
　転移性がん細胞として、転移性が細胞に本来備わっているほか、遺伝子を導入する、ホルモンやサイトカインなどの増殖因子を投与する、紫外線や薬剤で遺伝子変異を誘発する、および自然突然変異や後天的にクロマチンの修飾が変わった細胞を分離するなど、当業者に適宜採用される手段により、転移性を獲得するように調製したがん細胞を用いることもできる。
　転移性がん細胞は、単一種類のがん細胞であってもよく、複数種のがん細胞であってもよいが、単一種類のがん細胞を用いることが好ましく、中でも、株化されたがん細胞を用いることが好ましい。
　転移性を有するがん細胞など、本発明において形質転換細胞が移植される動物（実験動物）は、移植した細胞が生着して、液性免疫応答が機能する非ヒト動物であれば、特に限定されない。
　実験動物の種類は特に限定されず、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ニワトリなどが挙げられるが、好ましくはマウス、ラット、モルモットなどの齧歯類であり、より好ましくはマウスである。さらに、齧歯類において好ましくは野生型の動物であり、より好ましくは野生型マウスである。本発明の方法によれば、野生型の実験動物に、前記形質転換細胞としてがんがん細胞（特に転移性腫瘍細胞）を移植した場合でも、当該動物は早期に死滅することなく生存できるので、より効率的に目的抗原に対する抗体を作製することができる。
　実験動物としては、近交系やクローズドコロニー系のマウスが利用できる。野生型マウスとして、具体的には、Ｂａｌｂ／ｃやＣ５７ＢＬ／６、ＩＣＲ系統などが挙げられ、中でも、Ｂａｌｂ／ｃのメスは、免疫応答性が良く、飼育もしやすいため好適である。また、実験動物として、ヒト抗体産生マウスなどの遺伝子改変動物を使用することもできる。
　転移性の細胞を乳腺へ投与して免疫する公知の方法（前掲の特許文献３）では、ヒト乳がん細胞を免疫不全のマウスへ移植することで、少なくとも１０週以上、多くの場合で１５週以上の長期間に渡り生存が確認されている。
　一方、マウス乳がん細胞を野生型（Ｂａｌｂ／ｃ）マウスへ移植した場合には、４週以内にマウスが死亡し始め、６週での８０％以上のマウスが死亡する。
　本発明においては、目的抗原に対する抗体が移植した細胞に結合した場合、アポトーシスによる細胞死が誘導される。６週での生存率は６０~８０％であり明確な延命期間が観察される。生存期間が長いことにより、免疫応答が刺激され続け目的抗原を認識する抗体の誘導効率が高まる。
　上記に加え、がん細胞を採取した動物と同種の動物へ移植し、免疫応答を行わせる場合は、公知の方法（前掲の特許文献３）よりも優位性がある。移植した細胞表面に存在するタンパク質の大部分は、自己の体組織成分であるために、個体が発生する段階で免疫寛容になっている。すなわち、他動物由来のタンパク質を強制発現させた場合には、発現させたタンパク質のみが異物と判断され、目的抗原に対する抗体が優位に誘導されやすいと想定される。
８．細胞膜上の膜タンパク質を認識する抗体のスクリーニング
　例えば、移植した実験動物の尾静脈から回収した血液内に含まれる抗体の力価を解析することで、目的抗原に対する抗体が誘導されているかを解析することが出来る。解析する方法としては、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）やウエスタンブロット、フローサイトメーター等、公知の方法が利用できる。なお、上記回収及び解析は、移植後、１ヵ月以降後に行うのが好ましく、より好ましくは１ヵ月~６ヶ月後である。
　ＥＬＩＳＡやウエスタンブロットで解析する場合には、細胞から目的抗原タンパク質を精製する、及び／又は、部分タンパク質の発現と精製が必要である。フローサイトメーターで解析する場合は、目的抗原を発現する生きた細胞がそのまま利用できるが、１つのサンプルを解析するために、短くても１分以上かかるのが普通である。モノクローナル抗体を取得する際には、数万種類以上のハイブリドーマ細胞の中から、数個の目的抗原と結合する抗体を生産するハイブリドーマ細胞を選び出すことが必要であり、フローサイトメーターによる解析は抗体の解析には向かない。
　本発明では、上記に代わる方法として、ジーンレポーターアッセイを用いたスクリーニング手法を用いた。この方法では、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，ｖｏｌ．６，ｐ．３６９−３７６及びＷＯ２０１２１０８４２４に記載されているＣＤ３　ｚｅｔａの細胞内ドメインを目的抗原と融合させた融合タンパク質をコードする遺伝子を作製し、レポーター細胞であるＢＷＺ．３６細胞で発現させることで、抗体が目的抗原に結合した場合に、ＢＷＺ．３６細胞内でレポータータンパク質が転写、翻訳されるという仕組みである。
　ＣＤ３　ｚｅｔａ（Ｔ−ｃｅｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ＣＤ３　ｚｅｔａ　ｃｈａｉｎ）は、ＴＣＲ（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）複合タンパク質のサブユニットの一つであり、ＣＤ３　ｚｅｔａが２分子近接することにより細胞内にシグナルを伝達することが知られている。また、ＢＷＺ．３６細胞はマウスＴ細胞由来の細胞でありＣＤ３　ｚｅｔａの二量体化によって生じるシグナルが、ＩＬ−２プロモーターに作動可能に連結されており、レポーター遺伝子として大腸菌由来のＬａｃＺが組み込まれている。ＬａｃＺからβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅが翻訳される。大腸菌由来のβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅは至適ｐＨ７．３であり、ほとんどの動物細胞が持つ内在性のβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ｐＨ５以下）とは、至適ｐＨの差を利用して選択的に活性を測定することが可能である。この時、ＣＰＲＧ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｓａｌｔ）等が利用できる。
　すなわち、目的抗原とＣＤ３　ｚｅｔａの細胞内ドメインとを融合たせたタンパク質をＢＷＺ．３６細胞で発現させると、目的抗原と抗体とが反応した場合に、細胞内にβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅが翻訳され、その活性を測定することで目的抗原と抗体との反応性を解析することが出来る。
　本発明によれば、膜タンパク質等の目的抗原に対し、従来よりも高い免疫応答を引き起こすことができる。目的抗原に対する抗体を生産している実験動物から、抗体を採取（回収）することが出来る。例えば、当該実験動物の脾臓やリンパ節から、抗体産生細胞であるＢ細胞を取り出し、その後当該Ｂ細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させることにより、モノクローナル抗体細胞を樹立することもできる。
　抗体の採取方法は特に限定されるものではなく、公知の任意の手法を採用することができる。例えば、抗体産生細胞を培養して抗体を産生させる、または、抗体産生細胞から抗体遺伝子をクローニングして組換え等を行うことにより、バクテリアや酵母、動物細胞、ウイルスなどで抗体を製造することができる。培養はｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うほか、マウスなど実験動物の腹腔に細胞を投与して腹水を得る方法により行うことができる。抗体遺伝子をクローニングする場合は、前述した方法と同様に、各細胞のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法により抗体のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を増幅する。増幅した後は、目的の抗体をコードする遺伝子を構築し、抗体の発現に適したベクターおよび細胞を用いて、抗体を産生し取得する。
　抗体として免疫グロブリンを取得した場合には、酵素で切断することにより、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’_２などの抗体断片を製造することができる。具体的には、パパインを用いてＦａｂを、ペプシンを用いてＦ（ａｂ）’_２を調製する。
　以上の方法により、安定的に、目的の分子に対する様々な構造の抗体を製造することができる。
　本発明によれば、高い免疫応答を引き起こすことができるため、本発明の抗体の製造方法は、目的抗原、特に膜タンパク質を認識する親和性の高い抗体の生産に非常に有用である。
　以下に、実施例および比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

　融合タンパク質の作製
（１）細胞
　４Ｔ１及びＲＡＪＩは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。それぞれの細胞は、１０％（ｖ／ｖ）の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）で８０％コンフルエントを越えないよう３７℃、５％ＣＯ_２下で４８~７２時間培養および継代を行った。
（２）遺伝子のクローニング
　本発明においては、４回膜貫通型のタンパク質であるＣＤ２０を例として実験を行った。ＣＤ２０タンパク質をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿０２１９５０．３）はＲＡＪＩから増幅した。
　ＲＡＪＩを培養し、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　２μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を５０℃で１時間行ってｃＤＮＡを合成し、８５℃、５分間の加熱により、反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ　ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、ＣＤ２０の遺伝子を増幅した。
　プライマー配列

　ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および５８℃、２分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
　得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ）で切断し、ｐＥＦ６−ｍｙｃ／ＨｉｓＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。ＣＤ２０遺伝子を組み込んだベクターをｐＥＦ６−ＣＤ２０と以後記載する。
　Ｆａｓの細胞内ドメイン領域のクローニングを行った。Ｆａｓタンパク質をコードする遺伝子はＭＣＦ７より増幅した。上記と同じ方法でｍＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの調製を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ　ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、Ｆａｓの細胞内領域（１８７番目から３２７番目のアミノ酸）を増幅した。
　プライマー配列

　ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および５８℃、１分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
　得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（ＮｏｔＩ及びＸｂａＩ）で切断し、上記記載のｐＥＦ６−ＣＤ２０へ組み込んだ。組み込んだベクターをｐＥＦ６−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤと以後記載する（図２）。
　本発明において、Ｆａｓの細胞内ドメインを融合させたＣＤ２０タンパク質をＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤと記載する。ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤのアミノ酸配列は配列番号２８、この遺伝子をコードするＤＮＡ配列は配列番号２７で示した。

　融合タンパク質の発現
（１）細胞への遺伝子導入
　実施例１で作製したｐＥＦ６−ＣＤ２０及びｐＥＦ６−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて４Ｔ１に導入した。４Ｔ１は、高転移性を有するマウス乳がん細胞である。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行った。ブラストサイジンＳ塩酸塩が１０μｇ／ｍＬとなるよう添加した実施例１（１）記載の培地で細胞を培養し、３~５日毎に培地を交換して薬剤耐性を持つ細胞を選択した。得られた耐性株の中からＣＤ２０及びＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤ融合タンパク質を過剰発現している細胞を選び出すため、融合タンパク質のＣ末端に付加されているｍｙｃタグ配列を認識する抗体を用いて検出を行った。培養した４Ｔ１及び遺伝子導入した細胞それぞれを８０％コンフルエントとなるよう９６ウエルプレートに植え、３７℃、５％　ＣＯ_２下で１６時間培養した。
　培養上清を除去後、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン溶液（ＷＡＫＯ社製）を１００μＬ添加し、１０分間室温で反応させた。ホルマリン溶液を除去後、ＰＢＳ（−）（０．０１Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、１３８ｍＭ　ＮａＣｌ、２．７ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、風乾させることで各々の細胞を固定化したプレートを作製した。
　抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社、クローン９Ｅ１０）をＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈し、一次抗体として固定化プレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
　二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで５，０００倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
　最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルソフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に希釈し、この溶液の１０，０００分の１量の３５％（ｗ／ｖ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して、シグナルを観察し、４Ｔ１よりもシグナルの高い株を選択した。
（２）ウエスタンブロット
　上記（１）で得られた細胞を１０ｃｍシャーレに９０％コンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。細胞に２×ＲＩＰＡ　Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２％（ｗ／ｖ）ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．２％（ｗ／ｖ）ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）を２００μＬ添加し１分間氷上に放置した後、スクレーパーで細胞溶液を回収した。超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ社）で３０秒間細胞を破砕し、抽出液を得た。それぞれの細胞について抽出液を作製し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を測定後、同じタンパク質量となるよう調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後、トランスブロットＳＤセル（バイオラッド社）を用い、メーカー推奨のプロトコールに従いＰＶＤＦメンブレン（ＰＩＥＲＣＥ社）にタンパク質を転写した。ＴＢＳ−Ｔに５％（ｗ／ｖ）となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で３０分間ブロッキングを行い、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄を行った。ｃ−ｍｙｃ抗体をＴＢＳ−Ｔで１μｇ／ｍＬに希釈し、メンブレンと１時間、室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで１０，０００倍に希釈した。メンブレンと室温で３０分反応させた後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。メンブレンをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に浸したのち、ラップしてＬＡＳ−３０００（富士フィルム社）でシグナルを検出した。
　４Ｔ１細胞にｐＥＦ６−ＣＤ２０を導入した細胞の解析結果を図３に、ｐＥＦ６−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤを導入した細胞の解析結果を図４にそれぞれ示した。両方の遺伝子ともに効率良く４Ｔ１で発現していることが示された。以降、これらの細胞を４Ｔ１−ＣＤ２０あるいは４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤと呼ぶことがある。

　アポトーシス誘導試験
（１）蛍光顕微鏡による形態観察
　実施例２で作製した４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤにおいて、ＣＤ２０の細胞外ドメインを認識する抗体によってアポトーシスが誘導されるかを解析した。
　ＣＤ２０の細胞外ドメインと結合する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（リツキシマブ、中外製薬社製）５μｇ／ｍＬを１００μＬずつ、９６ｗｅｌｌプレート（ＴＰＰ社製）に入れ、室温で１時間プレートに吸着させた。吸着後、ウエルをＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、上記の細胞１×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞を添加し、２０時間培養した。
　Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を１μｇ／ｍＬ、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を２．５μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で１０分間インキュベートした後、Ａｘｉｏｖｅｒｔ　２００Ｍ蛍光顕微鏡（ＺＥＩＳＳ社製）を用いて解析した。アポトーシスによる細胞死は、凝集したクロマチンおよび／またはＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２で染色される断片化した核により特定することが出来る（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，５６，ｐ．２１６１−２１６６）。アポトーシスを起こした細胞とネクローシスを起こした細胞を見分けた結果を図５に示した。生きた細胞では、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２及びＰｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅではほとんど染色されない。一方、アポトーシスが起き始めた初期の状態では、細胞膜の透過性が上昇していくために、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２での染色が観察される。さらにアポトーシスが進むと、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅも透過できるようになる。この場合、両蛍光色素で染まる細胞の形態は、細胞が小さくなったアポトーシス小体の形態で観察される。ネクローシスを起こした細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２及びＰｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅの両方で染色されるが、アポトーシス小体は見られず、細胞が膨張した形態をとる。
　４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤを、抗ＣＤ２０抗体と反応させた結果を図６に示した。通常の培養状態においては、細胞は増殖し続けるが、抗ＣＤ２０抗体を添加することによって、明確にアポトーシスによる細胞死が誘導されたことが示されている。
（２）増殖試験
　上記実施例３（１）に記載した条件と同じ方法で、９６ｗｅｌｌプレートに抗ＣＤ２０抗体あるいはＣＤ２０と結合しない抗体（ハーセプチン、中外製薬社製）を吸着させ、４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤを５×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞を添加した。２４時間及び４８時間後にＣｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｉ（ＭＴＴ）（ロッシュ社製）を用いて細胞の増殖を解析した。操作は当該キットに添付された説明書の記載に基づいて行い、５５０ｎｍ及び６９０ｎｍの吸収をプレートリーダーで測定した結果を図７に示した。２４時間及び４８時間後ともに、抗ＣＤ２０抗体を吸着させたプレート上で細胞の像齲蝕が明確に抑制された。
　以上の結果から、４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤは、細胞外ドメインを認識する抗ＣＤ２０抗体でアポトーシスが引き起こされ、死滅したことが示されている。

　免疫誘導試験
（１）細胞の移植
　４Ｔ１−ＣＤ２０及び４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤを野生型のＢａｌｂ／ｃマウスの第４乳腺へ移植し、ＣＤ２０に対する抗体誘導を行った。操作はＷＯ２０１２／０２９９９０に記載の方法で実施した。
　４Ｔ１は、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の乳がん細胞であり、Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳腺へ移植した場合、速やかに生着し、増殖し、転移により個体内に広がっていく（ＷＯ２０１２／０２６６１５）。
　野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳腺１ヶ所あたり、４×１０^３個となるよう、４Ｔ１−ＣＤ２０及び４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤを移植した。４Ｔ１−ＣＤ２０は１０匹、４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤは２１匹のマウスにそれぞれ移植を行った。実験の結果を図８に示す。
　４Ｔ１−ＣＤ２０では３０日を過ぎたころからマウスが死亡し始め、４７日目に全てのマウスが死滅した。一方、４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤでは、４２日目からマウスが死亡し始め、５０日後でも６０％のマウスが生存していた。４Ｔ１−ＣＤ２０で形成される腫瘍のサイズは３．５ｃｍ^３越えたところで死亡し、肺や膵臓等へ遠隔転移が見られた。一方、４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤの場合には、腫瘍サイズは５ｃｍ^３以上まで成長しているが、死亡したマウスでも肺や膵臓等への明確な遠隔転移は観察されなかった。
　これらの結果は、４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤが抗ＣＤ２０抗体を誘導し、誘導された抗体によってアポトーシスが引き起こされたことによって生きた細胞の数が減少したことが理由であると予測された。

＜抗血清解析用細胞の樹立＞
　４Ｔ１−ＣＤ２０あるいは４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤを移植した野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスそれぞれで誘導されている目的抗原（ＣＤ２０）に対する抗体の力価を解析する。この際、細胞膜上に存在するタンパク質を認識する抗体の誘導効率を評価するため、細胞表面に抗原を発現する細胞を用い、抗体が結合した際に細胞内にシグナルが発生し、結合を評価できる実験系を用いた（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，ｖｏｌ．６，ｐ．３６９−３７６）。
（１）遺伝子のクローニング
　ＣＤ３　ｚｅｔａのＤＮＡをコードする遺伝子は、東京大学大学院新領域創成科学研究科の山本一夫教授より分譲頂いた。また、ｐＭＸ−ＩＢレトロウイルスベクターは東京大学医科学研究所付属先端医療研究センターの北村俊雄教授から使用ライセンスを購入した。
　ｐＥＦ６−ＣＤ２０を鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ　ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、ＣＤ２０の遺伝子を増幅した。
　プライマー配列

　ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および５８℃、２分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
　得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩ）で切断し、ｐＭＸ−ＩＢベクターへ組み込んだ。ＣＤ２０遺伝子を組み込んだベクターをｐＭＸ−ＣＤ２０と以後記載する。
　ＣＤ３　ｚｅｔａの細胞内ドメイン領域は、Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζ（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２，ｖｏｌ．１６９，ｐ．１２６−１３６）を鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ　ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、Ｆａｓの細胞内領域（１８７番目から３２７番目のアミノ酸）を増幅した。
　プライマー配列

　ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および５８℃、１分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
　得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（ＮｏｔＩ及びＸｂａＩ）で切断し、上記記載のｐＭＸ−ＣＤ２０へ組み込んだ。組み込んだベクターをｐＭＸ−ＣＤ２０−ＣＤ３ｚ−ＩＢと以後記載する（図９）。
　本発明において、ＣＤ３　ｚｅｔａの細胞内ドメインを融合させたＣＤ２０タンパク質をＣＤ２０−ＣＤ３ｚと記載する。ＣＤ２０−ＣＤ３ｚのアミノ酸配列は配列番号３０、この遺伝子をコードするＤＮＡ配列は配列番号２９で示した。

（２）レトロウイルスによる遺伝子導入
　レトロウイルスパッケージング細胞であるＰｌａｔ−Ｅ細胞（Ｍｏｒｉｔａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，２０００）１×１０^６個を６−ｗｅｌｌプレートにＤ１０培地２ｍＬでまき、８０~９０％コンフルエントな状態まで一晩培養した。その後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｍＬを用いて、４μｇのプラスミドをトランスフェクションした。方法はメーカーのプロトコールに従った。すなわち、無血清培地であるＯＰＴＩ−ＭＥＭ　Ｉ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）２５０μｌにプラスミドを懸濁した（溶液（ｉ））。同時に、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ　Ｉ　２４０μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を１０μｌ加え、室温で５分間静置した（溶液（ｉｉ））。その後、溶液（ｉ）と（ｉｉ）を混ぜ２０分間室温でインキュベートした後、混合液を細胞に滴下しトランスフェクションを行った。トランスフェクション後４８時間培養し、この培養上清を２，３７０ｘｇ、４℃で１０ｍｉｎ遠心して回収し、レトロウイルス溶液とした。
　５×１０^４個のＢＷＺ．３６細胞を６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに２ｍＬでまき、各ウェルにポリブレンを終濃度１０μｇ／ｍＬ加えた。３時間培養した後に、レトロウイルス溶液を２ｍＬ／ｗｅｌｌで添加して４８時間培養した。安定して遺伝子導入された株を樹立するため、実施例２（１）記載の方法と同様の方法で薬剤選択を行った。樹立した細胞をＢＷＺ．３６−ＣＤ２０−ＣＤ３ｚと以後記載する。
（３）ジーンレポーターアッセイ
　目的抗原の膜タンパク質の細胞外ドメインと結合する抗体により、ＢＷＺ．３６−ＣＤ２０−ＣＤ３ｚ内にシグナルが発生し、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性が確認されるかどうかを解析した。
　９６ｗｅｌｌプレートにＢＷＺ．３６−ＣＤ２０−ＣＤ３ｚを１×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞を添加し、２０時間培養した。培養後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ−４５０　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ（Ｄｙｎａｌ社）を１．５×１０^４ｂｅａｄｓ／ｗｅｌｌとなるように添加し、１６時間培養した。その後、ＣＰＲＧ基質溶液（０．１５ｍＭ　Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，１００ｍＭ　２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，９ｍＭ　ＭｇＣｌ_２，０．１２５％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４，ＰＢＳ（−））を１００μＬ添加して細胞を溶解させ、３７℃で４時間発色させた後に、１Ｍ　Ｎａ_２ＣＯ_３を７５μＬ添加して反応を停止させた。５７４ｎｍと６６０ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定し、６６０ｎｍの値をバックグラウンドとしてシグナルを解析した。
　ＢＷＺ．３６−ＣＤ２０−ＣＤ３ｚに対し、抗ＣＤ２０抗体の濃度を０．２５、０．５、１、２μｇ／ｍＬとした場合に観察される吸光度を解析した結果を図１０に示す。抗ＣＤ２０抗体を添加した場合には、抗体濃度の上昇に従って吸光度が上昇したが、ＣＤ２０を認識しないコントロール抗体（抗ｍｙｃ−Ｔａｇ抗体）を添加した場合には吸光度が上昇しなかった。この結果は、抗ＣＤ２０抗体がＣＤ２０の細胞外ドメインに結合することでＢＷＺ．３６−ＣＤ２０−ＣＤ３ｚ内にシグナルが生じていることを示している。

＜マウス抗血清の解析＞
　実施例４で４Ｔ１−ＣＤ２０及び４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤを移植したマウスの移植後４０日目に各２匹ずつ抗血清を回収し、２０、１００、５００及び１０００倍にＰＢＳ（−）で希釈した。これらを実施例５（３）で樹立したＢＷＺ．３６−ＣＤ２０−ＣＤ３ｚを用いることで、抗血清中の細胞膜上に存在するＣＤ２０外ドメインと反応する抗ＣＤ２０抗体の力価を解析した。実験結果を図１１に示す。
　４Ｔ１−ＣＤ２０を移植したマウスに対し、４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤを移植したマウスでは明確に抗血清の力価が上昇していた。吸光度のシグナルが０．８付近のほぼ同じ値を示す希釈倍率を比較した所、４Ｔ１−ＣＤ２０では２０倍希釈であったところが、４Ｔ１−ＣＤ２０−ｍｆａｓＤＤでは１００倍（Ｍｏｕｓｅ　Ｎｏ．１）あるいは５００倍（Ｍｏｕｓｅ　Ｎｏ．２）であった。このことから、抗血清の力価は、５から２５倍に上昇する、ということを示している。

　本発明によれば、従来の方法では取得が困難であった抗体も効率よく作製することができる。また、本発明によれば、抗原が本来有する立体構造に対する抗体を得ることができるため、抗原に対して十分な中和能力を持つ抗体を得ることができる。
　したがって、本発明は、臨床検査や治療用の新規な抗体として、新たな材料を市場へ提供することができる。

　配列番号２７：組換えＤＮＡ
　配列番号２８：組換えペプチド
　配列番号２９：組換えＤＮＡ
　配列番号３０：組換えペプチド
　配列番号７５：合成ＤＮＡ
　配列番号７６：合成ＤＮＡ
　配列番号７７：合成ＤＮＡ
　配列番号７８：合成ＤＮＡ
　配列番号７９：合成ＤＮＡ
　配列番号８０：合成ＤＮＡ
　配列番号８１：合成ＤＮＡ
　配列番号８２：合成ＤＮＡ

Claims (23)

1. 　目的抗原に対する抗体の作製方法であって、
   　互いに接近することでアポトーシスシグナルを誘導し得るタンパク質ドメインと、目的抗原との融合タンパク質を発現し得る形質転換細胞を、非ヒト動物に移植して生着させた後、該非ヒト動物由来の生体試料から該抗原に対する抗体を回収することを含む、
   前記方法。
2. 　前記細胞が、転移性腫瘍細胞において前記融合タンパク質を発現し得るようにした細胞である、請求項１記載の方法。
3. 　転移性腫瘍細胞は、リンパ節及び／又はリンパ液を介して転移し得る細胞である、請求項２記載の方法。
4. 　転移性腫瘍細胞が、転移性乳がん細胞である、請求項２又は３記載の方法。
5. 　前記ドメインが、細胞死受容体の細胞内ドメインに由来するものである、請求項１~４のいずれか１項に記載の方法。
6. 　細胞死受容体の細胞内ドメインに由来するドメインが、デスドメインである、請求項５に記載の方法。
7. 　細胞死受容体が、ＴＮＦＲ、Ｆａｓ、ＤＲ３、ＤＲ４及びＤＲ５からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５又は６記載の方法。
8. 　目的抗原が、タンパク質である、請求項１~７のいずれか１項に記載の方法。
9. 　目的抗原が、膜タンパク質である、請求項１~８のいずれか１項に記載の方法。
10. 　膜タンパク質が、膜貫通型タンパク質である、請求項９記載の方法。
11. 　非ヒト動物が、野生型の非ヒト動物である、請求項１~１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 　非ヒト動物が、齧歯類動物である、請求項１~１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 　齧歯類動物がマウスである、請求項１２記載の方法。
14. 　前記移植後、１~６ヵ月後に前記抗体の回収を行う、請求項１~１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 　互いに接近することでアポトーシスシグナルを誘導し得るタンパク質ドメインと、目的抗原としてのタンパク質との融合タンパク質を発現し得る、形質転換細胞。
16. 　前記細胞は、転移性腫瘍細胞において前記融合タンパク質を発現し得るようにした細胞である、請求項１５記載の細胞。
17. 　転移性腫瘍細胞は、リンパ節及び／又はリンパ液を介して転移し得る細胞である、請求項１６記載の細胞。
18. 　転移性腫瘍細胞が、転移性乳がん細胞である、請求項１６又は１７記載の細胞。
19. 　前記ドメインが、細胞死受容体の細胞内ドメインに由来するものである、請求項１５~１８のいずれか１項に記載の細胞。
20. 　細胞死受容体が、ＴＮＦＲ、Ｆａｓ、ＤＲ３、ＤＲ４及びＤＲ５からなる群より選択される少なくとも１つの受容体の細胞内ドメインに由来するものである、請求項１９記載の細胞。
21. 　目的抗原が、タンパク質である、請求項１５~２０のいずれか１項に記載の細胞。
22. 　目的抗原が、膜タンパク質である、請求項１５~２１のいずれか１項に記載の細胞。
23. 　膜タンパク質が、膜貫通型タンパク質である、請求項２２記載の細胞。

Images