ES2739948T3 - Proteínas variantes con secuencias de aminoácidos Cry1Da1 activas contra lepidópteros - Google Patents

Abstract

Una la proteína insecticida genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en cualquiera de las SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas variantes con secuencias de aminoácidos CryIDal activas contra lepidópteros

Campo de la invención

La invención se refiere de forma general al campo de las proteínas inhibidoras de insectos. Se desvela una clase novedosa de proteínas genomanipuladas que presentan actividad inhibidora de insectos para cultivos y semillas de relevancia agrícola. En particular, la clase desvelada de proteínas inhibidoras genomanipuladas tiene actividad insecticida contra el orden de los lepidópteros de las plagas de insectos. Se proporcionan plantas, partes de plantas y semillas que contienen una construcción de polinucleótido que codifica una o más de las proteínas inhibidoras genomanipuladas desveladas.

Antecedentes de la invención

Helicoverpa zea es una plaga de lepidóptero significativa de principales cultivos agrícolas, que incluyen maíz, algodón y soja. Conocido como gusano de la mazorca de maíz (CEW), gusano del algodón (CBW), y gusano de la soja (SPW), esta especie de insecto polífaga es especialmente difícil de controlar con proteínas insecticidas procedentes de Bacillus thuringiensis (Bt) u otras especies bacterianas. H. zea se considera en riesgo de desarrollo de resistencia a los rasgos de control de insectos actuales, dado su capacidad para alimentarse de muchos cultivos diferentes y la ausencia actual de una estrategia de control de alta dosis. En consecuencia, se necesitan nuevos modos de acción (MoA) para garantizar la durabilidad de las plantas transgénicas protegidas del daño que supone la alimentación del H. zea.

La proteína C ryID al es una proteína activa contra lepidópteros descrita por primera ves en Hofte, y col. "Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a new Lepidoptera-specific crystal protein gene from Bacillus thuringiensis." Nucleic Acids Res. 18(18) (1990): 5545. Esta proteína presenta una excelente actividad insecticida contra las especies de Spodoptera incluida Spodoptera frugiperda (palomilla del maíz, FAW), una plaga de varios cultivos en hilera, que incluyen maíz, algodón y soja. Sin embargo, CrylDal presenta una actividad de baja a moderada frente a una variedad de otras plagas de lepidópteros, incluidos gusanos de la cápsula (por ejemplo, Helicoverpa armigera y H. zea), perforadores (por ejemplo, Ostrinia nubilalis y Diatraea grandiosella) y oruga de la soja (Pseudoplusia includens). Debido a su estrecho espectro insecticida y su incapacidad para proporcionar protección de nivel comercial contra una gama de importantes plagas agrícolas de lepidópteros tales como CEW, la proteína insecticida C ryIDal tiene valor limitado como rasgo de control de insectos en plantas transgénicas. Como resultado, ninguna variedad comercial actual de cultivos protegidos de insectos utiliza CryIDal como protector incorporado a plantas.

A pesar de su estrecho espectro insecticida, C ryIDal es una proteína insecticida interesante porque parece ser que la proteína CryIDal utiliza un MoA alternativo para controlar algunas plagas de lepidópteros. La evidencia de esto surge de estudios con colonias de insectos multirresistentes. Por ejemplo, colonias procedentes del campo de Plutella xylostella (polilla de rombo negro) y Pectinophora gossypiella (gusano rosa algodonero) que son resistentes a la intoxicación por C rylAc retienen la sensibilidad completa a la proteína C ryIDal (Tabashnik, y col. "Cross-Resistance of Pink Bollworm (Pectinophora gossypiella) to Bacillus thuringiensis toxins." Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000): 4582­ 4584; Tabashnik, y col. "Cross-Resistance to Bacillus thuringiensis Toxin CrylJa in a Strain of Diamondback Moth Adapted to Artificial Diet." J. Invert. Pathol. 76: (2000): 81-83). Estas líneas de evidencia indican que CrylDal reconoce receptores lepidópteros del intestino medio diferentes a los que reconocen las proteínas activas contra lepidópteros actualmente desplegadas en cultivos transgénicos, que incluyen Cry1Ac, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1Fa, Cry2Ae y Cry2Ab2. A la vista de este aparentemente novedoso MoA, la optimización de proteínas análogas a CrylDal con una actividad mejorada contra un espectro más amplio de especies de Helicoverpa manteniendo al mismo tiempo, o aumentando, su actividad insecticida contra Spodoptera crearía un protector de alto valor incorporado a plantas para la gestión de la resistencia contra insectos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una proteína insecticida genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en cualquiera de las SEQ ID NO:44, SEQ iD NO:40, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26. La presente invención proporciona además un polinucleótido que codifica la proteína insecticida genomanipulada como se ha descrito anteriormente, en el que dicho polinucleótido está operativamente unido a un promotor heterólogo. En realizaciones adicionales, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende al menos uno de los polinucleótidos anteriormente descritos, en la que la célula hospedadora se seleccionado entre el grupo que consiste en una célula hospedadora bacteriana y una célula hospedadora vegetal, composición inhibidora de insectos que comprende la proteína insecticida genomanipulada así como una semilla que comprende la proteína insecticida genomanipulada o un polinucleótido que codifica la proteína insecticida genomanipulada. En realizaciones relacionadas, la invención proporciona un procedimiento para controlar una plaga de lepidópteros, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la plaga de lepidópteros con una cantidad inhibidora de la proteína insecticida genomanipulada que se ha descrito anteriormente. Además, se proporciona una célula vegetal, planta o parte de planta transgénica que comprende la proteína insecticida genomanipulada que se ha descrito anteriormente. La invención también proporciona un procedimiento para controlar una plaga de lepidópteros, que comprende exponer la plaga a la célula vegetal, planta o parte de planta transgénica que se ha descrito anteriormente, en la que dicha célula vegetal, planta o parte de planta expresa una cantidad inhibidora de lepidópteros de la proteína insecticida genomanipulada. En una realización independiente, la invención proporciona un producto de consumo derivado de la célula vegetal, planta o parte de planta que se ha descrito anteriormente, en la que el producto comprende una cantidad detectable de una proteína insecticida genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos como se ha definido en cualquiera de las SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 26.

Las proteínas genomanipuladas tóxicas para lepidópteros descritas en el presente documento (denominadas como "proteínas de toxina genomanipuladas", "proteínas tóxicas genomanipuladas", o "proteínas insecticidas genomanipuladas") son derivados de la toxina insecticida natural de Bacillus thuringiensisCry1Da1 (SEQ ID NO:2) o del homólogo quimérico de Cry1Da1, TIC844 (SEQ ID NO:14), que comprende el núcleo de la toxina de Cry1Da1 pero sustituye el dominio de protoxina Cry1Ab3 por el dominio de protoxina de Cry1Da1 natural. Cada una de las proteínas insecticidas genomanipuladas contiene al menos una sustituciones de aminoácidos, una adición de aminoácidos, o una deleción de aminoácidos, en comparación con las proteínas estructurales definidas en cualquiera de las SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:14. Las proteínas insecticidas genomanipuladas son especialmente tóxicas para los insectos de especies de Helicoverpa zea (gusano de la mazorca de maíz, gusano de la soja, gusano del algodón) y Spodoptera frugiperda (palomilla del maíz). Aunque las proteínas desnaturalizadas TIC844 (SEQ ID NO:14) y CrylDal (SEQ ID NO:2) presentan poca toxicidad contra H. zea, las proteínas insecticidas genomanipuladas presentan de forma sorprendente e inesperada una actividad insecticida mejorada y un espectro insecticida potenciado contra plagas de insectos lepidópteros entre los que se incluyen H. zea.

Se desvela una proteína insecticida genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en cualquiera de las SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:42, o un fragmento inhibidor de insectos de la misma. La proteína insecticida genomanipulada presenta actividad inhibidora contra una especie de insecto del orden Lepidoptera. Las especies de plagas de lepidópteros diana inhibidas mediante las proteínas tóxicas para lepidópteros incluyen al menos la palomilla del maíz (Spodoptera frugiperda), palomilla de la remolacha (Spodoptera exigua), gusano soldado Berta (Mamestra configurata), oruga negra (Agrotis ipsilon), oruga de la col (Trichoplusia ni), oruga de la soja (Chrysodeixis includens), oruga de la judía aterciopelada (Anticarsia gemmatalis), gusano verde del trébol (Hypena scabra), gusano cogollero (Heliothis virescens), gusano cortador granulado (Agrotis subterranea), gusano soldado (Pseudaletia unipuncta), gusano cortador occidental (Agrotis orthogonia), gusano barrenador europeo (Ostrinia nubilalis), gusano de la navelina (Amyelois transitella), gusano del cuerno de la raíz (Crambus caliginosellus), gusanos de la tela (Herpetogramma licarsisalis), polilla del girasol (Homoeosoma electellum), barrenador menor del maíz (Elasmopalpus lignosellus), polilla de las manzanas (Cydia pomonella), polilla de la uva (Endopiza viteana), polilla de la fruta oriental (Grapholita molesta), polilla del brote del girasol (Suleima helianthana), polilla de rombo negro (Plutella xylostella), polilla del gusano rosado (Pectinophora gossypiella), perforador rosado del tallo (Sesamia inferens), polilla gitana (Lymantria dispar), gusano de las horjas del algodón (Alabama argillacea), rodillo de la hoja del frutal (Archips argyrospila), rodillo europeo (Archips rosana), peroforador del arroz asiático, o perforador del tallo del arroz (Chilo suppressalis), rodillo de la hoja de arroz (Cnaphalocrocis medinalis), gusano del cuerno de la raíz (Crambus caliginosellus), gusano de la tela del pasto (Crambus teterrellus), barrenador del maíz del sudoeste (Diatraea grandiosella)), perforador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis), gusano espinoso (Earias insulana), gusano manchado (Earias vittella), gusano del algodón del viejo mundo (Helicoverpa armigera), gusano de la mazorca de maíz, gusano de la soja o gusano del algodón (Helicoverpa zea), gusano de la tela (Herpetogramma licarsisalis), polilla de la viña europea (Lobesia botrana), minador de la hoja de cítricos (Phyllocnistis citrella), mariposa blanca grande (Pieris brassicae), gusano de la col importado o mariposa blanca pequeña (Pieris rapae), gusano cortador del tabaco u oruga del tabaco (Spodoptera litura), y minador de hoja de tomate(Tuta absoluta).

También se desvela en el presente documento un polinucleótido que codifica una proteína insecticida genomanipulada o fragmento pesticida de la misma, en el que el polinucleótido está operativamente unido a un promotor heterólogo y la proteína insecticida genomanipulada comprende la secuencia de aminoácidos de definida en una cualquiera de la SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:42.

También se desvela en el presente documento un polinucleótido que codifica una proteína insecticida genomanipulada, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que opcionalmente se hibrida en condiciones rigurosas para invertir el complemento de la secuencia de polinucleótido que se define en una cualquiera de las SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 41; o codifica la proteína insecticida genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en cualquiera de las SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:42.

También se desvela en el presente documento una célula hospedadora que comprende el polinucleótido que se define en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 41, en la que la célula hospedadora se selecciona entre el grupo que consiste en una célula hospedadora bacteriana o una célula hospedadora vegetal. Las células hospedadoras bacterianas consideradas incluyen células hospedadoras bacterianas seleccionadas entre el grupo que consiste de Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, y Erwinia, en la que la especie de Bacillus es un Bacillus cereus o un Bacillus thuringiensis, dicha Brevibacillus es un Brevibacillus laterosperous, y dicha Escherichia es una Escherichia coli. Además, las células hospedadoras vegetales consideradas incluyen monocotiledóneas o dicotiledóneas.

Se desvela una composición inhibidora de insectos que comprende una proteína insecticida genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos definida en cualquiera de las SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:42, o un fragmento inhibidor de insectos de la misma. Se contempla que esta composición inhibidora de insectos pueda comprender además al menos un agente inhibidor de insectos diferente de la proteína insecticida genomanipulada. Los agentes inhibidores de insectos considerados incluyen una proteína inhibidora de insectos, una molécula de ARNbc inhibidora de insectos, y una sustancia química inhibidora de insectos. Se contempla que el al menos otro agente pesticida puede mostrar actividad contra una o más especies de plagas de los órdenes Lepidoptera, Coleoptera, Hemiptera, Homoptera, o Thysanoptera.

También se desvela en el presente documento una semilla que comprende una cantidad eficaz inhibidora de insectos de una proteína insecticida genomanipulada que comprende la secuencia de aminoácidos definida en cualquiera de las SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:42; o un polinucleótido definido en cualquiera de las SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 41.

Un procedimiento para controlar una plaga de lepidópteros, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la plaga de lepidópteros con una cantidad inhibidora de una proteína insecticida genomanipulada también se desvela en el presente documento en otra realización.

En otra realización más, se desvela en el presente documento una célula vegetal, planta o parte de planta transgénica que comprende una proteína insecticida genomanipulada. Se proporcionan procedimientos para controlar una plaga de lepidópteros, que comprenden exponer la plaga a la célula vegetal, planta o parte de planta transgénica que comprende una proteína insecticida genomanipulada. También se contemplan productos de consumo derivados de la célula vegetal, planta o parte de planta que comprende una proteína insecticida genomanipulada en la que el producto comprende una cantidad detectable de la proteína insecticida genomanipulada. Los productos de consumo considerados incluyen biomasa vegetal, aceite, grano molido grueso, pienso para animales, harina, copos, salvado, hilazas, cascarilla, y semillas procesadas.

Otro procedimiento desvelado en el presente documento es un procedimiento para producir una semilla que comprende la proteína insecticida genomanipulada, comprendiendo el procedimiento: plantar al menos una semilla que comprende la proteína insecticida genomanipulada; hacer crecer plantas a partir de dicha semilla; y recoger semillas de las plantas, en el que dichas semillas recogidas comprenden la proteína insecticida genomanipulada.

Otro procedimiento adicional desvelado en la presente solicitud es un procedimiento para inhibir plagas de lepidópteros mediante su alimentación con un cultivo vegetal que comprende modificar uno o más restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:14 mediante la sustitución del uno o más restos de aminoácidos para producir una SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:14 modificada; y poner a disposición una cantidad inhibidora de lepidópteros de las SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:14 modificadas dentro, en la superficie, o cerca, de los tejidos de dicho cultivo vegetal; en el que el resto de aminoácido modificado en la SEQ ID n O:2 o la SEQ ID NO:14 se selecciona del grupo que consiste de serina en la posición 282 sustituida por lisina o valina, tirosina en la posición 316 sustituido por serina, isoleucina en la posición 368 sustituida por prolina o arginina, serina en 374 sustituida por arginina, asparagina en la posición 375 sustituida por histidina, e isoleucina en la posición 432 sustituida por leucina.

También se proporcionan moléculas de polinucleótidos recombinantes que codifican las proteínas insecticidas genomanipuladas. Las moléculas de polinucleótidos recombinantes consideradas comprenden una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 41; y, opcionalmente, una secuencia de polinucleótidos que codifica un agente inhibidor de insectos diferente de la proteína insecticida genomanipulada.

Otro procedimiento desvelado en la presente solicitud es un procedimiento para aumentar la actividad contra lepidópteros y potenciar el espectro inhibidor de lepidópteros de una proteína estructural, comprendiendo el procedimiento modificar uno o más restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 14 mediante la sustitución del uno o más restos de aminoácidos para producir una proteína insecticida genomanipulada, en el que el resto de aminoácido modificado en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:14 se selecciona del grupo que consiste de serina en la posición 282 sustituida por lisina o valina, tirosina en la posición 316 sustituido por serina, isoleucina en la posición 368 sustituida por prolina o arginina, serina en 374 sustituida por arginina, asparagina en la posición 375 sustituida por histidina, e isoleucina en la posición 432 sustituida por leucina. En algunas realizaciones de este procedimiento, la proteína insecticida genomanipulada tiene al menos un aumento de ocho veces en la letalidad para Helicoverpa zea con respecto a la proteína estructural.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra los valores de CIM⁵⁰ de la proteína estructural TIC844 (SEQ ID NO: 14) comparados con los de la proteína insecticida genomanipulada TIC844_8 (SEQ ID NO: 26) para dos colonias de Helicoverpa zea (CEW) diferentes, Union City y Benzon.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

SEQ ID NO:1 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry1Dal.

SEQ ID NO:2 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1.

SEQ ID NO:3 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry1Da1_3.

SEQ ID NO:4 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_3.

SEQ ID NO:5 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry1Da1_4.

SEQ ID NO:6 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_4.

SEQ ID NO:7 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry1Da1_5.

SEQ ID NO:8 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_5.

SEQ ID NO:9 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry1Da1_6.

SEQ ID NO:10 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_6.

SEQ ID NO:10 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_6.

SEQ ID NO:11 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry1 Da1_7.

SEQ ID NO: 12 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_7.

SEQ ID NO:13 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC844.

SEQ ID NO:14 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina TIC844.

SEQ ID NO:15 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC844_2.

SEQ ID NO:16 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina TIC844_2.

SEQ ID NO:17 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC844_4.

SEQ ID NO:18 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina TIC844_4toxin.

SEQ ID NO:19 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC844_5.

SEQ ID NO:20 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina TIC844_5.

SEQ ID NO:21 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC844_6.

SEQ ID NO:22 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina TIC844_6.

SEQ ID NO:23 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC844_7.

SEQ ID NO:24 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina TIC844_7.

SEQ ID NO:25 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC844_8.

SEQ ID NO:26 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina TIC844_8.

SEQ ID NO:27 es una secuencia de polinucleótidos diseñada para su uso en la expresión de una proteína Cry1Da1 en plantas.

SEQ ID NO:28 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1.

SEQ ID NO:29 es una secuencia de polinucleótidos diseñada para su uso en la expresión de una proteínaCrylDal_2.nno en plantas.

SEQ ID n O:30 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_2.nno.

SEQ ID NO:31 es una secuencia de polinucleótidos diseñada para su uso en la expresión de una proteínaCrylDal_3.nno en plantas.

SEQ ID n O:32 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_3.nno.

SEQ ID NO:33 es una secuencia de polinucleótidos diseñada para su uso en la expresión de una proteínaCry1Da1_4.nno en plantas.

SEQ ID n O:34 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_4.nno.

SEQ ID NO:35 es una secuencia de polinucleótidos diseñada para su uso en la expresión de una proteínaCry1Da1_5.nno en plantas.

SEQ ID n O:36 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_5.nno.

SEQ ID NO:37 es una secuencia de polinucleótidos diseñada para su uso en la expresión de una proteínaCry1Da1_6.nno en plantas.

SEQ ID n O:38 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_6.nno.

SEQ ID NO:39 es una secuencia de polinucleótidos diseñada para su uso en la expresión de una proteínaCry1Da1_7.nno en plantas.

SEQ ID n O:40 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina Cry1Da1_7.nno.

SEQ ID NO:41 es una secuencia de polinucleótidos diseñada para su uso en la expresión de una proteínaTIC844_9.nno en plantas.

SEQ ID NO:42 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina TIC844_9.nno.

SEQ ID NO:43 es una secuencia de polinucleótidos diseñada para su uso en la expresión de una proteínaTIC844_11.nno en plantas.

SEQ ID NO:44 es una secuencia de aminoácidos de una proteína toxina TIC844_11.nno.

Descripción detallada

En el presente documento se proporcionan proteínas insecticidas genomanipuladas que presentan niveles sorprendentemente elevados de actividad tóxica contra especies de lepidópteros y un espectro insecticida más amplio en comparación con otras proteínas insecticidas contra lepidópteros anteriormente conocidas. Estas proteínas insecticidas genomanipuladas se derivan de proteínas estructurales insecticidas, que sirven como moldes de varias modificaciones de aminoácidos. Los ejemplos de dichas proteínas estructurales insecticidas incluyen, aunque no de forma limitativa, Cry1Da1 y TIC844 (un homólogo de Cry1Da1). TIC844 comprende el núcleo de la toxina de Cry1Da1 pero (es decir, los dominios I, II y III) pero utiliza el dominio de protoxina Cry1Ab3 para garantizar una buena expresión en Bacillus thuringiensis (Bt). La expresión de Cry1 Da1 en Bt es baja cuando se utiliza el dominio de protoxina Cry1 Da1 natural. Sin embargo, como se demuestra en la presente solicitud, la expresión del núcleo de la toxina Cry1Da1 mejora notablemente en cepas acristalíferas de Bt cuando el dominio de protoxina natural se retira y el segmento que codifica el núcleo de la toxina Cry1Da1 se fusiona en marco con un segmento que codifica el dominio de protoxina Cry1Ab3. De forma notable, las proteínas estructurales TIC844 (SEQ ID NO:14) y Cry1Da1 (SEQ ID No :2) no presentan el espectro inhibidor de lepidópteros útil comercialmente ni la mejora en la actividad insecticida contra lepidópteros observada en las proteínas insecticidas genomanipuladas.

Las proteínas insecticidas genomanipuladas desveladas en el presente documento están relacionadas con modificaciones de aminoácidos de tal forma que las proteínas modificadas presentan un espectro inhibidor de lepidópteros mejorado y/o una mejora en la actividad inhibidora de lepidópteros en comparación con la proteína estructural precursora, TIC844 o Cry1Da1. Las expresiones "más activo", "actividad mejorada", "especificidad potenciada", "aumento de potencia tóxica", "aumento en la toxicidad", "mejora en la actividad inhibidora de lepidópteros", "mayor actividad inhibidora de lepidópteros", y "mejora en el espectro inhibidor de lepidópteros" se refiere a una comparación entre la actividad de una proteína insecticida genomanipulada con la actividad de una proteína estructural (TIC844 o Cry1Da1) contra un insecto lepidóptero, en el que la actividad atribuida a la proteína insecticida genomanipulada es mayor que la actividad atribuida a la proteína estructural. En determinadas realizaciones, las proteínas insecticidas genomanipuladas proporcionadas en el presente documento presentan un espectro inhibidor de lepidópteros mejorado y/o una actividad mejorada o mayor de inhibición de la actividad de los lepidópteros cuando se compara con las actividades de las proteínas estructurales TIC844 o Cry1Da1 donde la especie de plaga de lepidópteros incluye, aunque no de forma limitativa, Helicoverpa zea y Spodoptera frugiperda.

Como se usa en el presente documento, las expresiones y frases "activo" o "actividad"; "actividad plaguicida" o "pesticida"; o "actividad insecticida", "inhibidor de insectos", "insecticida", o "una cantidad inhibidora de insectos", se refiere a la eficacia de un agente tóxico, tal como una proteína insecticida, en la inhibición (inhibición del crecimiento, alimentación, fecundidad o viabilidad), supresión (supresión del crecimiento, alimentación, fecundidad o viabilidad), control (control de la infestación por la plaga, control de las actividades de alimentación de la plaga sobre un cultivo concreto que contiene una cantidad eficaz de una proteína insecticida genomanipulada desvelada) o destrucción (produciendo la morbilidad, mortalidad o reducción en la fecundidad) de una plaga. De forma similar, una "cantidad inhibidora de lepidópteros" se refiere a una cantidad de agente tóxico, tal como una proteína insecticida, que da como resultado cualquier inhibición mensurable de la viabilidad de los lepidópteros, crecimiento de los lepidópteros, desarrollo de los lepidópteros, reproducción de los lepidópteros, conducta alimentaria de los lepidópteros, conducta de apareamiento y/o cualquier disminución mensurable en los efectos adversos producidos a una planta por la alimentación de los lepidópteros. Se pretende que estos términos incluyan los resultados de proporcionar una cantidad eficaz como plaguicida de un agente tóxico a una plaga donde la exposición de la plaga al agente tóxico da como resultado la morbilidad, mortalidad, reducción en la fecundidad, o reducción del crecimiento. Estos términos también incluyen repulsión de la plaga por la planta, un tejido de la planta, una parte de la planta, semilla, células vegetales, o de la ubicación geográfica concreta donde la planta puede crecer, como resultado de proporcionar una cantidad eficaz como plaguicida del agente tóxico en o sobre la planta. En general, actividad plaguicida se refiere a la capacidad de un agente tóxico para ser eficaz para inhibir el crecimiento, desarrollo, viabilidad, comportamiento de alimentación, comportamiento de apareamiento, fecundidad o cualquier disminución mensurable en los efectos adversos producidos por una alimentación del insecto con esta proteína, fragmento de proteína, segmento de proteína o polinucleótido de una plaga diana en particular, incluidos, aunque no de forma limitativa, los insectos del orden Lepidoptera. La planta puede producir el agente tóxico o este se puede aplicar a la planta o al entorno dentro de la ubicación donde se encuentra la planta.

Una cantidad eficaz como plaguicida de un agente tóxico, cuando se proporciona en la dieta de una plaga diana, presenta actividad plaguicida cuando la plaga ingiere la sustancia tóxica. Un agente tóxico puede ser una proteína plaguicida o uno o más agentes químicos conocidos en la técnica. Los agentes químicos plaguicidas o insecticidas y los agentes proteicos plaguicidas o insecticidas se pueden utilizar en solitario o en combinaciones entre sí. Los agentes químicos incluyen, aunque no de forma limitativa, moléculas de ARNbc que se dirigen a genes específicos para la supresión en una plaga diana, organoclorados, organofosfatos, carbamatos, piretroides, neonicotinoides y rianoides. Los agentes proteicos plaguicidas o insecticidas incluyen las proteínas insecticidas genomanipuladas definidas en la presente solicitud, así como otros agentes tóxicos proteínicos entre los que se incluyen los dirigidos a las especies de plagas de lepidópteros, así como las toxinas proteicas que se utilizan para controlar otras plagas vegetales tales como las proteínas Cry disponibles en la materia para su uso en el control especies de coleópteros, hemípteros y homópteros.

El término "segmento" o "fragmento" se utiliza en el presente documento para describir secuencias consecutivas de aminoácidos o de ácidos nucleicos que son más cortas que la secuencia completa de aminoácidos o ácidos nucleicos que describen las proteínas insecticidas genomanipuladas.

Se pretende que, cuando se hace referencia a una plaga, especialmente una plaga de un cultivo vegetal, signifique plagas de insectos de cultivos vegetales, especialmente aquellas plagas de insectos lepidópteros que se controlan mediante las proteínas insecticidas genomanipuladas desveladas. Sin embargo, la referencia a una plaga también puede incluir plagas de insectos coleópteros, hemípteros y homópteros de plantas, así como nematodos y hongos, cuando los agentes tóxicos dirigidos a dichas plagas se localizan simultáneamente o están presente junto con las proteínas insecticidas genomanipuladas desveladas.

Las proteínas insecticidas genomanipuladas desveladas presentan actividad insecticida frente a plagas de insectos de las especies de lepidópteros, incluidos adultos, pupas, larvas, y neonatos. Los insectos del orden Lepidoptera incluyen, aunque no de forma limitativa, gusanos soldado, gusanos cortadores, orugas y heliotinas de la familia Noctuidae, por ejemplo, palomilla del maíz (Spodoptera frugiperda), palomilla de la remolacha (Spodoptera exigua), gusano soldado Berta (Mamestra configurata), oruga negra (Agrotis Ípsilon), oruga de la col (Trichoplusia ni), oruga de la soja (Pseudoplusia includens), oruga de la judía aterciopelada (Anticarsia gemmatalis), gusano verde del trébol (Hypena scabra), gusano cogollero (Heliothis virescens), gusano cortador granulado (Agrotis subterranea), gusano soldado (Pseudaletia unipuncta), gusano cortador occidental (Agrotis orthogonia); perforadores, gusanos del yeso, gusanos de la tela, gusanos de las coníferas, gusanos de la col y gusanos descarnadores de la vid de la familia Pyralidae, por ejemplo, gusano barrenador europeo (Ostrinia nubilalis), gusano de la navelina (Amyelois transitella), gusano del cuerno de la raíz (Crambus caliginosellus), gusano de la tela (Herpetogramma licarsisalis), polilla del girasol (Homoeosoma electellum), barrenador menor del maíz (Elasmopalpus lignosellus); rodillos, gusanos de los brotes, gusanos de las semillas, y gusanos de la fruta de la familia Tortricidae, por ejemplo, polilla de las manzanas (Cydia pomonella), polilla de la uva (Endopiza viteana), polilla de la fruta oriental (Grapholita molesta), polilla del brote del girasol (Suleima helianthana); y muchos otros lepidópteros económicamente importantes, por ejemplo, polilla de rombo negro (Plutella xylostella), gusano rosa algodonero (Pectinophora gossypiella) y polilla gitana (Lymantria dispar). Otras plagas de insectos del orden Lepidoptera incluyen, por ejemplo, Alabama argillacea (gusano de las hojas del algodón), Archips argyrospila (rodillo de la hoja del frutal), Archips rosana (rodillo europeo) y otras especies de Archips, Chilo suppressalis (perforar del arroz asiático, o perforador del tallo del arroz), Cnaphalocrocis medinalis (rodillo de la hoja de arroz), Crambus caliginosellus (gusano de la tela de la raíz del cuerno), Crambus teterrellus (gusano de la banda del césped), Diatraea grandiosella (perforador del maíz del sudoeste), Diatraea saccharalis (perforador de la caña de azúcar), Earias insulana (gusano espinoso), Earias vittella (gusano manchado), Helicoverpa armigera (gusano americano), Helicoverpa zea (gusano de la mazorca de maíz o gusano del algodón), Heliothis virescens (gusano del tabaco), Herpetogramma licarsisalis (gusanos de la tela), Lobesia botrana (polilla de la viña europea), Phyllocnistis citrella (minador de la hoja de cítricos), Pieris brassicae (polilla blanca grande), Pieris rapae (gusano de la col importada, o mariposa blanca pequeña), Plutella xylostella (polilla de diamante), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Spodoptera litura (gusano cortador del tabaco, oruga del tabaco), y Tuta absoluta (minador de hoja del tomate).

La referencia en esta solicitud a una "molécula de ADN aislado", o un término o expresión equivalente, se entiende que significa que la molécula de ADN es una que está presente en solitario o en combinación con otras composiciones, pero no dentro de su entorno natural. Por ejemplo, elementos de ácido nucleico tales como una secuencia de codificación, secuencias intrónicas, secuencias líder no traducidas, secuencias promotoras, secuencia de terminación de la transcripción, y similares, que se encuentran naturalmente dentro del ADN del genoma de un organismo no se consideran como "aislados" siempre que el elemento esté dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en el que se encuentra de forma natural. Sin embargo, cada uno de estos elementos, y subpartes de estos elementos, estarían "aislados" según el ámbito, de la presente divulgación siempre que el elemento no esté dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en el que se encuentra de forma natural. De forma similar, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida o cualquier variante insecticida de origen natural de dicha proteína sería una secuencia de nucleótidos aislada siempre que la secuencia de nucleótidos no esté comprendida dentro del ADN de la bacteria en la que se encuentra de forma natural la secuencia que codifica la proteína. Una secuencia de nucleótidos sintética que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína insecticida de origen natural se consideraría aislada para los fines de la presente divulgación. Para los fines de la presente divulgación, cualquier secuencia de nucleótidos transgénica, es decir, la secuencia de nucleótidos del ADN introducido en el genoma de las células de una planta o bacteria, o presente en un vector extracromosómico, se consideraría como una secuencia de nucleótidos aislada tanto si está presente dentro del plásmido como en una estructura similar utilizada para transformar las células, dentro del genoma de la planta o bacteria, o presente en cantidades detectables en tejidos, descendencia, muestras biológicas o productos de consumo derivados de la planta o bacteria.

Como se describe adicionalmente en los Ejemplos, rondas repetidas de ingeniería genética, ensayo y selección sobre más de dos mil (2000) variantes de secuencia de aminoácidos de TIC844 y Cry1Da1 dieron como resultado la identificación de algunos restos de aminoácidos que pueden estar sustituidos, insertados o eliminados de la proteína estructural dada para producir proteínas insecticidas genomanipuladas que presentan un espectro inhibidor de lepidópteros y/o una actividad inhibidora de lepidópteros mejorada (es decir, una proteína más tóxica menos insecticida necesaria para obtener el mismo nivel de mortalidad) cuando se compara con el espectro y actividad de las proteínas estructurales iniciales, TIC844 o Cry1Da1. Estas rondas repetidas de ingeniería genética, ensayo y selección también dieron como resultado la identificación de sustituciones de restos de aminoácidos neutros, inserciones o deleciones de las proteínas estructurales TIC844 y Cry1Da1 que no alteran el espectro de inhibición ni la actividad de la proteína inhibidora de insectos. Los restos de aminoácidos específicos de las proteínas estructurales TIC844 y Cry1Dal que se pueden modificar para producir un espectro de inhibición de lepidópteros mejorado y/o una actividad inhibidora de lepidópteros mejorada con respecto a TIC844 o CryIDal se identifican en el presente documento. En determinadas realizaciones, la proteína insecticida genomanipulada proporcionada en el presente documento puede presentar un aumento de aproximadamente ocho veces o más de actividad inhibidora de lepidópteros contra una especie de plaga de lepidópteros que una proteína estructural de la SEQ ID NO: 14 (TIC844) o SEQ ID NO:2 (Cry 1 Da1).

El "diseño genético" de estas rondas repetitivas incluyeron la identificación de restos relevantes de la proteína estructural para crear una proteína de ensayo modificada, y la clonación y expresión de las proteínas de ensayo modificadas resultantes. La estructura atómica de las proteínas estructurales se usó para guiar y enfoques de complemento semialeatorios para la selección de restos de aminoácidos a modificar para el diseño genético. El "ensayo" en estar rondas repetitivas incluyó la comparación de las actividades contra especies de lepidópteros entre una proteína de ensayo modificada y su proteína estructural precursora. La "selección" de estas rondas repetitivas incluyó identificar proteínas de ensayo modificadas con actividad mejorada (variantes mejoradas) y los restos relevantes que se diseñaron mediante ingeniería para crear estas variantes mejoradas (estas variantes mejoradas se denominan en el presente documento como "proteínas insecticidas genomanipuladas").

Los ejemplos de los procedimientos de ensayo y selección de proteínas insecticidas genomanipuladas incluyen administrar cantidades idénticas de una proteína de ensayo modificada y de una proteína estructural (TIC844 o CryIDal) de una plaga de insecto en condiciones de ensayo controladas y medir y comparar la potencia de la proteína de ensayo y las proteínas estructurales. Otro procedimiento para ensayar y seleccionar proteínas insecticidas genomanipuladas incluye determinar las dosis de proteínas (por ejemplo, concentración de proteínas de la dieta) o una proteína de ensayo modificada y de una proteína estructural (TIC844 o CryIDal) que desencadena respuestas equivalentes en la población de insectos en condiciones de ensayo controladas (es decir, obtener una curva de respuesta a la dosis). Un valor de respuesta a la dosis estadísticamente sólido utilizado para la comparación sería la concentración letal media (CL⁵⁰) necesaria para destruir el 50 % de una población de ensayo o de la concentración de inhibición de la muda ("CIM⁵⁰"), la concentración media necesaria para inhibir la muda en un 50 %).

En ciertos ejemplos, la proteínas insecticidas genomanipuladas descritas en el presente documento incluyen al menos una modificación de aminoácidos en las siguientes posiciones relativas de TIC844 (SEQ ID NO:14) o Cry1Dal (SEQ ID NO:2): serina en la posición 282 sustituida por lisina o valina, tirosina en la posición 316 sustituido por serina, isoleucina en la posición 368 sustituida por prolina o arginina, serina en 374 sustituida por arginina, asparagina en la posición 375 sustituida por histidina, e isoleucina en la posición 432 sustituida por leucina. Las proteínas insecticidas genomanipuladas también pueden incluir al menos dos, tres, cuatro o más de estas sustituciones o deleciones de aminoácidos dentro de la misma secuencia de proteína insecticida genomanipulada.

Las proteínas insecticidas genomanipuladas que incluyen estas modificaciones de aminoácidos incluyen las proteínas definidas tales como SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, y SEQ ID NO:44, y fragmentos inhibidores de insectos de las mismas. Cada una de estas proteínas insecticidas genomanipuladas tiene una masa medida de aproximadamente 132 k Dalton. Las características individuales de las proteínas estructurales insecticidas TIC844 y Cry1Da1 y las proteínas insecticidas genomanipuladas derivadas del anterior se notifican en la Tabla 1.

Los fragmentos de las proteínas insecticidas genomanipuladas descritas en el presente documento pueden ser formas truncadas en las que uno o más aminoácidos se eliminan del extremo N, extremo C, la parte central de la proteína, o combinaciones de los mismos sin una pérdida de actividad inhibidora de insectos. Estos fragmentos deberían retener la actividad inhibidora de insectos de la proteína insecticida genomanipulada precursora.

Las proteínas que se parecen a las proteínas insecticidas genomanipuladas se pueden identificar por comparación entre sí usando varios algoritmos informáticos conocidos en la materia. Por ejemplo, las identidades de la secuencia de aminoácidos de las proteínas relacionadas con las proteínas insecticidas genomanipuladas se pueden analizar utilizando un alineamiento Clustal W usando estos parámetros preconfigurados: Matriz ponderada: blosum, Penalización por abertura de hueco: 10,0, Penalización por extensión de hueco: 0,05, Huecos hidrófilos: On, Restos hidrófilos: GPSNDQERK, Penalización por hueco específico de resto: On (Thompson, y col (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). El porcentaje de identidad de los aminoácidos se calculó adicionalmente mediante el producto del 100 % multiplicado por (identidades de los aminoácidos/longitud de la proteína sujeto). Otros algoritmos de alineamiento también están disponibles en la técnica y proporcionan resultados similares a los obtenidos usando el alineamiento Clustal W.

Como se describe adicionalmente en los Ejemplos de la presente solicitud, las secuencias sintéticas o artificiales que codifican las proteínas estructurales y las proteínas insecticidas genomanipuladas se diseñaron para su uso en plantas. Las secuencias de nucleótidos sintéticos ilustrativos que se diseñaron para su uso en plantas se definen en las SEQ ID NO:27 (Cry1Da1.nno), SEQ ID NO:29 (Cry1Da1_2.nno), SEQ ID NO:31 (Cry1Da1_3.nno), SEQ ID NO:33 (Cry1Da1_4.nno), SEQ ID NO:35 (Cry1Da1_5.nno), SEQ ID NO:37 (Cry1Da1_6.nno), SEQ ID NO:39 (Cry1Da1_7.nno), SEQ ID NO:41 (TIC844_9.nno) y SEQ ID NO:43 (TIC844_11.nno).

Los casetes y vectores de expresión que contienen estas secuencias de nucleótidos sintéticas o artificiales se construyeron y se introdujeron en células vegetales de maíz, algodón y soja, de acuerdo con los procedimientos y técnicas de transformación conocidas en la materia. Las células transformadas se regeneraron a plantas transformadas en las que se observó que se expresaba la proteína insecticida genomanipulada o la proteína estructural. Para someter a ensayo la actividad plaguicida, se realizaron bioensayos en presencia de larvas de plagas de lepidópteros usando discos de hojas de plantas obtenidos de las plantas transformadas.

Se contemplan composiciones de moléculas de ácidos nucleicos recombinantes que codifican las proteínas insecticidas genomanipuladas. Por ejemplo, una proteína insecticida genomanipulada se puede expresar con construcciones de ADN recombinantes en las que una molécula de polinucleótido con un ORF que codifica la proteína insecticida genomanipulada está unido operativamente a elementos de expresión genéticos tales como un promotor y cualquier otro elemento regulador necesario para su expresión en el sistema para el que se pretende las construcciones. Los ejemplos no limitativos incluyen un promotor funcional en plantas unido operativamente a las secuencias que codifican la proteína insecticida genomanipulada sintética para la expresión de la proteína insecticida genomanipulada en plantas o un promotor funcional en Bt unido operativamente a la secuencia que codifica una proteína insecticida para la expresión de la proteína en una bacteria Bt u otra especie de Bacillus. Otros elementos pueden estar unidos operativamente a las secuencias que codifican la proteína insecticida genomanipulada entre los que se incluyen, aunque no de forma limitativa, potenciadores, intrones, líderes no traducidos, etiquetas de inmovilización de proteínas codificadas (etiqueta HIS), péptidos de translocación (es decir, péptidos plástidos transitorios, péptidos de señalización), secuencias de polipéptidos para modificar enzimas después de la traducción, sitios de unión a ribosomas, y sitios diana de ARNi. Las moléculas de polinucleótidos recombinantes proporcionados en el presente documento incluyen, aunque no de forma limitativa, un promotor heterólogo unido operativamente a un polinucleótido tales como las SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 43, que codifican el polipéptido o proteína que tiene la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO:4 (Cry1Da1_3), SEQ ID NO:6 (Cry1Da1_4), SEQ ID NO:8 (Cry1Da1_5), SEQ ID NO:10 (Cry1Da1_6), SEQ ID NO:12 (Cry1Da1_7), SEQ ID NO:16 (TIC844_2), SEQ ID NO:18 (TIC844_4), SEQ ID NO:20 (TIC844_5), SEQ ID NO:22 (TIC844_6), SEQ ID NO:24 (TIC844_7), SEQ ID NO:26 (TIC844_8), SEQ ID NO:32 (Cry1Da1_3.nno), SEQ ID NO:34 (Cry1Da1_4.nno), SEQ ID NO:36 (CrylDal_5.nno), SEQ ID NO:38 (Cry1Da1_6.nno), SEQ ID NO:40 (Cry1Da1_7.nno) y SEQ ID NO:44 (TIC844_11.imo). Un promotor heterólogo también puede estar operativamente unido a las secuencias de codificación del ADN sintético que codifican un plástido de una proteína insecticida genomanipulada dirigida y una proteína insecticida genomanipulada no dirigida. Se contempla que los codones de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína insecticida genomanipulada desvelada en el presente documento se pueden sustituir por codones sinónimos (conocidos en la materia como sustitución silenciosa).

Un molécula de ADN recombinante o una construcción que comprende una secuencia recombinante que codifica una proteína insecticida genomanipulada puede comprender además una región de ADN que codifica uno o más agentes tóxicos que se pueden configurar para expresarse en paralelo o expresarse simultáneamente junto con una secuencia de ADN que codifica una proteína insecticida genomanipulada, una proteína diferente de una proteína insecticida genomanipulada, una molécula de ARNbc inhibidora de insectos, o una proteína auxiliar. Las proteínas auxiliares incluyen, aunque no de forma limitativa, cofactores, enzimas, ligandos, y otros agentes que actúen para ayudar en la eficacia de un agente inhibidor de insectos, por ejemplo, ayudando en su expresión, alterando su estabilidad en plantas, optimizando la energía libre de oligomerización, aumentando su toxicidad, y aumentando su espectro de actividad. Una proteína auxiliar puede facilitar la captación de uno o más agentes inhibidores de insectos, por ejemplo, o potenciar los efectos tóxicos del agente tóxico.

Una molécula de ADN recombinante, o una construcción de ADN recombinante, se puede ensamblar de forma que todas las proteínas o moléculas de ARNbc se expresen desde un promotor o que cada proteína o moléculas de ARNbc esté bajo el control de un promotor independiente o alguna combinación de los mismos. Las proteínas de la presente invención se pueden expresar a partir de un sistema de expresión multigénico en el que una proteína insecticida genomanipulada se expresa desde un segmento nucleótido común que también contiene otros marcos de lectura abiertos y promotores, dependiendo del tipo de sistema de expresión seleccionado. Por ejemplo, un sistema de expresión multigénica en bacterias puede utilizar un único promotor para impulsar la expresión de marcos de lectura abiertos con uniones múltiples/en tándem desde dentro de un mismo operón (es decir, expresión policistrónica). En otro ejemplo, un sistema de expresión multigénica en plantas puede utilizar casetes de expresión con uniones múltiples, expresando cada uno una proteína diferente u otro agente tóxico tal como una o más moléculas de ARNbc.

Las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes o las construcciones de ADN recombinante que comprenden una secuencia recombinante que codifica una proteína insecticida genomanipulada se pueden administrar a las células hospedadoras mediante vectores, por ejemplo, un plásmido, baculovirus, cromosoma sintético, virión, cósmido, fagémido, fago o vector vírico. Dichos vectores se pueden usar para conseguir la expresión estable o transitoria de una secuencia recombinante que codifica una proteína insecticida genomanipulada en una célula hospedadora, o la posterior expresión del polipéptido codificado. Un polinucleótido recombinante exógeno o una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia recombinante que codifica una proteína insecticida genomanipulada y que se introduce en una célula hospedadora se denomina "transgén" en el presente documento.

Las bacterias transgénicas, células de plantas transgénicas, plantas transgénicas y partes de plantas transgénicas que contienen un polinucleótido que codifica una o más de las proteínas insecticidas genomanipuladas se proporcionan en el presente documento. El término "célula bacteriana" o "bacteria" puede incluir, aunque de forma no limitativa, una célula de Agrobacterium, de Bacillus, de Escherichia, de Salmonella, de Pseudomonas, o de Rhizobium. El término "célula vegetal" o "planta" puede incluir, aunque no de forma limitativa, una célula de dicotiledónea o una célula de monocotiledónea. Las plantas y células vegetales contempladas incluyen, aunque no de forma limitativa, una célula vegetal o planta de alfalfa, plátano, cebada, judías, brécol, repollo, brassica, zanahoria, mandioca, de ricino, coliflor, apio, garbanzos, col china, los cítricos, coco, el café, maíz, trébol, algodón, una cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berenjena, eucalipto, lino, ajo, uva, lúpulo, puerro, lechuga, pino Loblolly, mijo, melones, nueces, avena, aceituna, cebolla, plantas ornamentales, palma, hierba de pasto, guisantes, cacahuete, pimiento, guandú, pino, patata, álamo, calabaza, pino radiata, rábano, colza, arroz, portainjertos, centeno, cártamo, arbusto, sorgo, pino del sur, soja, las espinacas, calabazas, fresa, remolacha azucarera, la caña de azúcar, girasol, maíz dulce, liquidámbar, batata, pasto varilla, té, tabaco, tomate, triticale, turmérico, sandía y trigo. En determinadas realizaciones, se proporcionan plantas transgénicas y las partes de plantas transgénicas regeneradas a partir de una célula vegetal transgénica. En determinadas realizaciones, las plantas transgénicas se pueden obtener a partir de una semilla transgénica, por corte, presión, molienda o cualquier otra disociación de la parte de la planta. En determinadas realizaciones, la parte de la planta puede ser una semilla, una cápsula, una hoja, una flor, un tallo, una raíz, o cualquier porción de la misma o una porción no regenerable de una parte de planta transgénica. Tal como se usa en este contexto, una parte "no regenerable" de una parte de planta transgénica es una porción que no se puede inducir para formar una planta completa o que no se puede inducir para formar una planta completa capaz de reproducción sexual y/o asexual. En determinadas realizaciones, una porción no regenerable de una planta o una parte de la planta, es una porción de una semilla transgénica, cápsula, hoja, flor, tallo o raíz.

Se proporcionan procedimientos para fabricar plantas transgénicas que comprenden cantidades inhibidoras de lepidópteros de proteínas insecticidas genomanipuladas. Dichas plantas se pueden fabricar introduciendo un polinucleótido que codifica las proteínas insecticidas genomanipuladas proporcionadas en la presente solicitud en una célula vegetal, y seleccionar una planta derivada de dicha célula vegetal que expresa una cantidad inhibidora de lepidópteros o de insectos de la proteína insecticida genomanipulada. Las plantas se pueden derivar de las células vegetales por regeneración, semilla, polen, o técnicas de transformación de meristemos. Se conocen en la técnica procedimientos para transformar plantas.

Las plantas que expresan las proteínas insecticidas genomanipuladas se pueden cruzar por reproducción con eventos transgénicas que expresan otras proteínas insecticidas y/o la expresión de otros rasgos transgénicos tales como otros rasgos de control de insectos, genes de tolerancia a herbicidas, genes que transmiten rasgos de rendimiento o tolerancia al estrés, y similares, o dichos rasgos se pueden combinar en un único vector de forma que los rasgos están todos vinculados.

Los productos de plantas procesados, en el que el producto procesado comprende una cantidad detectable de una proteína insecticida genomanipulada, un segmento inhibidor de insectos o un fragmento del mismo, o cualquier porción de distinción del mismo, también se desvelan en la presente solicitud. En determinadas realizaciones, el producto procesado se selecciona del grupo que consiste en partes de plantas, biomasa de plantas, aceite, grano molido grueso, azúcar, pienso para animales, harina, copos, salvado, hilazas, cascarilla, semillas procesadas, y semillas. En determinadas realizaciones, el producto procesado no es regenerable. El producto vegetal puede comprender productos de consumo u otros productos de comercio derivados de una planta transgénica o parte de planta transgénica, donde el producto de consumo u otros productos se pueden rastrear en el comercio mediante la expresión de segmentos nucleotídicos o ARN expresado o proteínas que codifican o comprenden partes distinguibles de una proteína insecticida genomanipulada.

Los procedimientos para controlar insectos, en particular infestaciones de cultivos por lepidópteros, con las proteínas insecticidas genomanipuladas también se desvelan en la presente solicitud. Dichos procedimientos pueden comprender hacer crecer una planta que comprende una cantidad inhibidora de insectos lepidópteros mediante la proteína insecticida genomanipulada. En determinadas realizaciones, dichos procedimientos pueden comprender además uno o más de: (i) aplicar cualquier composición que comprende o codifica una proteína insecticida genomanipulada a una planta o semilla que da lugar a una planta; y (ii) transformar una planta o una célula vegetal que da lugar a una planta con un polinucleótido que codifica una proteína insecticida genomanipulada. En general, se contempla que la proteína insecticida genomanipulada se puede proporcionar en una composición, proporcionarse en un microorganismo, o proporcionarse en una planta transgénica para transmitir actividad inhibidora de insectos contra insectos lepidópteros.

En determinadas realizaciones, la proteína insecticida genomanipulada es el principio activo insecticida de una composición inhibidora de insectos preparada mediante el cultivo recombinante de Bacillus o de cualquier otra célula bacteriana recombinante transformada parar expresar una proteína insecticida genomanipulada en condiciones adecuadas para la expresión. Dicha composición se puede preparar mediante desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de dichas células recombinantes que expresan/producen la proteína insecticida genomanipulada. Dicho procedimiento puede dar como resultado un extracto celular de un Bacillus o cualquier otro extracto celular, suspensión de células, homogenado de células, lisado de células, sobrenadante de células, filtrado de células o aglomerado de células bacteriano entomopatógeno. Mediante la obtención de la proteína insecticida genomanipulada así producida, una composición que incluye la proteína insecticida genomanipulada puede incluir células bacterianas, esporas bacterianas, y cuerpos de inclusión paraesporales y se puede formular para varios usos, que incluyen productos de pulverización agrícolas para inhibición de insectos o como formulaciones inhibidoras de insectos en bioensayos de dieta.

En una realización, para reducir la posibilidad de aparición de resistencia, una composición inhibidora de insectos o planta transgénica que comprende una proteína insecticida genomanipulada puede comprender al menos un agente tóxico adicional que presenta actividad inhibidora de insectos contra las mismas especies de insectos lepidópteros, pero que es diferente de la proteína insecticida genomanipulada. Los posibles agentes tóxicos adicionales de dicha composición incluyen una proteína inhibidora de insectos y una molécula de ARNbc inhibidora de insectos. Un ejemplo del uso de dichas secuencias ribonucleotídicas para controlar plagas de insectos se describe en Baum, y col. (publicación de patente de Estados Unidos 2006/0021087 A1). Dicho uno o más polipéptidos adicionales para el control de plagas de lepidópteros se puede seleccionar entre el grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, tales como, aunque no de forma limitativa, CrylA (patente de Estados Unidos n.° 5.880.275), CrylAb, CrylAc, Cry1A.105, CrylAe, C rylB (Publicación de patente de EE.UU. n.° 10/525.318), CrylC (patente de Estados Unidos n.° 6.033.874), CrylD, CrylE, CrylF, y quimeras de CrylA/F (patentes de Estados Unidos números 7.070.982; 6.962.705; y 6.713.063), CrylG, CrylH, CrylI, CrylJ, CrylK, CrylL, Cry2A, Cry2Ab (patente de Estados Unidos n.° 7.064.249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035, y AXMI-045 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0310543 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0104259 A1), AXMI-134 (publicación de patente de Estados Unidos 2013- 0167264 A1), AXMI-150 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0160231 A1), AXMI-184 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209 (publicación de patente de Estados Unidos 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (publicación de patente de Estados Unidos 2014­ 0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (publicación de patente de Estados Unidos 2014- 0196175 A1), AXMI-238 (publicación de patente de Estados Unidos 2014- 0033363 A1), AXMI-270 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0223598 A1), AXMI-345 (publicación de patente de Estados Unidos 2014­ 0373195 A1), DIG-3 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0219570 A1), DIG-5 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0317569 A1), DIG-11 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0319093 A1), AfIP-1A y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0033361 A1), AfIP-1B y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0007292 A1), Pput_1063 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0007292 A1), Pput_1064 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0007292 A1), GS-135 y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2012-0233726 A1), GS153 y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2012-0192310 A1), GS154 y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2012- 0192310 A1), GS155 y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2012-0192310 A1), SEQ ID NO:2 y derivados del mismo como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2012-0167259 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2012-0047606 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2011-0154536 A1, s Eq ID NO:2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2011-0112013 A1, SEQ ID NO:2 y 4 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2010-0192256 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2010-0077507 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2010-0077508 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2009-0313721 A1, SEQ ID NO:2 o 4 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2010-0269221 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de la misma como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.772.465 (B2), CF161_0085 y derivados del mismo como se describe en el documento WO2014/008054 A2, Las proteínas tóxicas para lepidópteros y sus derivados se describen en las publicaciones de patente de Estados Unidos US2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1, y US2012-0117690 A1; SEQ ID NO:2 y derivados de la misma como se describe en el documento US7510878(B2), SEQ ID NO:2 y derivados de la misma como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7812129(B1); y similares.

En otras realizaciones, una composición inhibidora de insectos o planta transgénica puede comprender además al menos un agente tóxico adicional que presenta actividad inhibidora de insectos para una plaga de insectos que no queda inhibida mediante las proteínas insecticidas genomanipuladas de la presente invención (tales como plagas de coleópteros, hemípteros y homópteros), para ampliar el espectro de inhibición de insectos obtenido.

Dicho agente tóxico adicional para el control de plagas de coleópteros se puede seleccionar entre el grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, tales como, aunque no de forma limitativa, Cry3Bb (patente de Estados Unidos n.° 6.501.009), variantes de CrylC, variantes de Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0167264 A1) AXMI-184 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0004176 A1), AXMI-205 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0298538 A1), axmi207 (publicación de patente de Estados Unidos 2013- 0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (publicación de patente de Estados Unidos 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0196175 A1), AXMI-279 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0223599 A1), AXMI-R1 y variantes del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0319092 A1), eHIPs (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2010/0017914), IP3 y variantes del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2012-0210462 A1), y u>-Hexatoxin-Hv1a (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2014-0366227 A1).

Dicho agente tóxico adicional para el control de plagas de hemípteros se puede seleccionar entre el grupo que consiste en proteínas activas contra hemípteros tales como, aunque no de forma limitativa, TIC1415 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0097735 A1), TIC807 (patente de Estados Unidos n.° 8609936), TIC834 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0269060 A1), a X m I-036 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0137216 A1), y AXMI-171 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0055469 A1). Polipéptidos adicionales para el control de plagas de insectos de coleópteros, lepidópteros y hemípteros se pueden encontrar en el sitio web de nomenclatura de la toxina de Bacillus thuringiensis mantenido por Neil Crickmore (en la world wide web en btnomenclature.info).

Las secuencias que codifican proteínas insecticidas genomodificados y las secuencias que tienen un porcentaje de identidad notable con las proteínas insecticidas genomanipuladas se pueden identificar usando procedimientos conocidos de los expertos en la técnica en la técnica tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación térmica e hibridación. Por ejemplo, las proteínas insecticidas genomanipuladas se pueden usar para producir anticuerpos que se unen específicamente a proteínas relacionadas, y se pueden usar para cribar y encontrar otras proteínas que están estrechamente relacionadas.

Asimismo, las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas insecticidas genomanipuladas se pueden usar como sondas y cebadores para cribado para identificar otros miembros de la clase usando procedimientos de amplificación e hibridación con ciclos térmicos o isotérmicamente. Por ejemplo, los oligonucleótidos derivados de las secuencias definidas en la SEQ ID NO: 3 se pueden usar pata determinar la presencia o ausencia de un transgén insecticida genomanipulado en una muestra de ácido desoxirribonucleico derivada de un producto de consumo. Dada la sensibilidad de algunos procedimientos de detección de ácidos nucleicos que utilizan oligonucleótidos, se anticipa que los oligonucleótidos derivados de las secuencias definidas en cualquiera de la SEQ ID NO: 3 se pueden usar para detectar la proteína insecticida genomanipulada respectiva en productos de consumo derivados de fuentes combinadas donde solo una fracción del producto de consumo se deriva de una planta transgénica que contiene cualquiera de SEQ ID NO: 3.

Ejemplos

EJEMPLO 1

Diseño de proteínas de ensayo modificadas y preparación de la muestra para prueba de bioensayo con insectos

Este Ejemplo ilustra los procedimientos utilizados para identificar los restos de aminoácidos relevantes en las proteínas estructurales a modificar para crear proteínas de ensayo modificadas, y la clonación y expresión de las proteínas de ensayo modificadas resultantes.

Se utilizaron diferentes técnicas de diseño molecular en una estrategia escalonada para construir variantes mejoradas de Cry1Da1 que tengan un espectro inhibidor de lepidópteros mejorado y/o una actividad inhibidora de lepidópteros mejorada, en comparación con las proteínas estructurales de Cry1 Da1 y TIC844, un homólogo de Cry1Da1. El primer escalón, o ronda de diseño inicial, estaba principalmente basada en hipótesis. Los escalones segundo y tercero fueron rondas de diseño basadas estadísticamente. Por ejemplo, en el segundo escalón de diseño, mutaciones estadísticamente no perjudiciales se combinaron con mutaciones posiblemente beneficiosas para producir mutaciones dobles que cumplieran criterios estadísticos definidos. En el tercer escalón de diseño, todos los datos de los ensayos anteriores se analizaron usando procedimientos de estadística múltiple. Solamente las mutaciones que mostraban una mejora estadísticamente significativa en más de un procedimiento estadístico se seleccionaron para la combinación final de mutaciones. Las variantes diseñadas en este escalón contenían uno o dos mutaciones positivas más que las variantes anteriores con un positivo confirmado. Por tanto, el tercer escalón de diseño enriqueció significativamente las variantes activas en comparación con el primer y segundo escalón. Como se demuestra en los Ejemplos posteriores, el uso de la estrategia de diseño en tres escalones identificó mutaciones tanto individuales como sinérgicas que proporcionaban una mejora significativa en la actividad contra CEW para algunas variantes mejoradas con respecto a las estructuras principales de TIC844 y Cry1Da1.

Los procedimientos que se utilizaron para crear las proteínas de ensayo modificadas incluyeron, aunque de forma no limitativa, modificaciones semialeatorias, modificaciones directas o variantes en el alineamiento de TIC844/Cry1Da1 con otras proteínas naturales de Bacillus thuringensis (Bt) y diseño asistido por estructura/función. Los ejemplos de las técnicas de diseño molecular incluyen las siguientes.

Unión al receptor. La susceptibilidad de las plagas de lepidópteros, especialmente el gusano de la mazorca de maíz (CEW, Helicoverpa zea) a las variantes mejoradas de Cry1 Da1/TIC844 se puede atribuir a diferentes receptores diana intestinales. Los diseños que se utilizaron para mejorar la unión a los receptores del intestino, aumentando de esta forma la toxicidad, incluyeron: (1) mutar cada posición en los bucles apicales del dominio II a todos los tipos de aminoácidos; y (2) intercambiar todas las posibles combinaciones de los bucles apicales del dominio II por los de otros homólogos de CrylDal (por ejemplo, Cry1Db1, Cry1Dc1) y toxinas de tres dominios activas en CEW (por ejemplo, Cry1Bb1, Cry1Ja1 y Cry2Ab2).

Estrategias basadas en alineamiento. El alineamiento de CrylDal con otros homólogos (por ejemplo, CrylDbl y CrylDcl) se usó para identificar regiones de variabilidad. Como resultado del alineamiento, se identificaron ciento cincuenta y (150) posiciones y doscientos noventa y cinco (295) mutaciones individuales únicas. Estas posiciones se localizaron entre los tres dominios. Las posiciones a cuatro (4) aminoácidos de distancia se agruparon conjuntamente. Solamente las mutaciones de las mismas secuencias precursoras se nombraron para cada grupo de posiciones, consiguiendo ciento treinta y dos (132) variantes únicas.

Estrategias de mutagénesis superficial. Los polinucleótidos que codifican las posiciones de superficie en los dominios II y III de las proteínas estructurales se mutagenizaron con un barrido. Los restos de aminoácidos se modificaron a alanina cuando la alanina no estaba ya presente en la proteína estructural. En las posiciones de superficie donde los restos naturales eran lisina, se introdujeron mutaciones de arginina además de las mutaciones de alanina. El fundamento de las mutaciones de lisina a arginina se basaba en la observación de que las toxinas activas en lepidópteros tienden a tener muy poca lisina y mucha arginina y, por lo tanto, se teorizó que cambiar las posiciones de superficie de la lisina en los dominios II y III a arginina aumentaría la actividad contra lepidópteros de la proteína de ensayo modificada.

Alteración de eventos proteolíticos. Se teorizó que el proceso proteolítico era un aspecto importante de la actividad de las toxinas de tres dominios en los intestinos de los insectos lepidópteros. Para estudiar esto, se realizaron varios conjuntos de mutaciones para alterar potencialmente cualquier escisión proteolítica. Los sitios de escisión potenciales se encuentran en el extremo N y entre el dominio III y la protoxina. Las posiciones mutacionales incluían regiones bucle previstas desde el extremo N al principio de la hélice 4, y desde el extremo C del dominio III hasta ~40 aminoácidos dentro de la protoxina. En general, se teorizó que los restos de lisina fomentaban la proteolisis bien mediante el reconocimiento del sitio proteolítico o mediante el aumento en la flexibilidad de la proteína, convirtiéndola de esta en más susceptible a la escisión proteolítica. Además, tripsina y quimiotripsina son dos proteasas que están ampliamente aceptadas como proteasas viables en los intestinos medios de los lepidópteros. Los restos de lisina proporcionan sitios de reconocimiento para restos de tripsina y la tirosina proporcionan sitios de reconocimiento para la quimiotripsina. Por tanto, las posiciones mutacionales seleccionadas en los sitios de escisión potencial se mutaron a uno de glicina, lisina o tirosina.

Potenciales mutaciones de punto caliente para otras toxinas activas en CEW. Se analizaron los datos de actividad y ausencia de actividad contra CEW para un conjunto grande de proteínas (incluyendo quimeras, fragmentos y secuencias naturales). La información recopilada a partir de un análisis estadístico de estos datos se utilizó para identificar potenciales mutaciones específicas o posiciones para mutación que probablemente aumentaran la actividad contra CEW de las proteínas de ensayo modificadas resultantes.

Las proteínas de ensayo modificadas que resultaron de las metodologías de diseño molecular anteriormente descritas se clonaron usando procedimientos conocidos en la técnica en un vector de expresión plásmido recombinante Bt en dirección 3' de un promotor de expresión específico de la esporulación y se transformó en una célula hospedadora Bt acristalífera.

EJEMPLO 2

Ensayo de proteínas de ensayo modificados en bioensayos de dieta contra plagas de lepidópteros

Este Ejemplo ilustra el ensayo de las proteínas de ensayo modificadas creadas a partir de los esfuerzos de diseño descritos en el Ejemplo 1.

A partir de los esfuerzos de diseño descritos en el Ejemplo 1, se produjeron aproximadamente dos mil quinientas (2.500) cepas de Bt recombinantes que expresaban más de dos mil trescientas (2.300) proteínas de ensayo modificadas diferentes. Estas proteínas de ensayo modificadas se expresaron en Bt y se analizaron para determinar la toxicidad en diferentes especies de Lepidoptera. Los ensayos de alimentación se realizaron con larvas neonatas (<24 horas después de la eclosión de varias especies de lepidópteros, que incluyen gusano de la mazorca de maíz (CEW, Helicoverpa zea) y palomilla del maíz (FAW, Spodoptera frugiperda). Los huevos de insecto para el ensayo de CEW se obtuvieron de dos colonias de laboratorio diferentes: Benson Research, Carlisle, PA y Monsanto Company, Union City, TN. Todas las proteínas de ensayo modificadas expresadas se sometieron a ensayo sobre CEW y algunas de estas proteínas de ensayo modificadas demostraron una mejora en la actividad contra c Ew en comparación con sus proteínas estructurales precursores que se sometieron a ensayo sobre FAW, además de realizar bioensayos adicionales para confirmar la actividad sobre CEW.

Se conocen en la materia varios protocolos para bioensayo y puntuación de la mortalidad y reducción del crecimiento de los insectos. Se usaron variaciones de los procedimientos, tales como los que se describen en la publicación de solicitud de patente PCT n.° WO 2012/139004 y en la patente de Estados Unidos n.°7.927.598.

EJEMPLO 3

Las proteínas de ensayo modificadas mostraron una mejora en la actividad contra CEW

Este Ejemplo ilustra el descubrimiento de un espectro de inhibición de lepidópteros mejorado y/o una mejora o aumento de la actividad inhibidora de lepidópteros para algunas de las proteínas de ensayo modificadas cuando se comparan con las actividades de las proteínas estructurales TIC844 o Cry1Da1 en múltiples rondas de ensayo.

Las proteínas de ensayo modificadas creadas a partir de los esfuerzos de diseño descritos en el Ejemplo 1 y sometidas a ensayo en el bioensayo con insectos que se describe en el Ejemplo 2 se estudiaron en rondas repetidas en las que las actividades sobre las especies de lepidópteros de las proteínas de ensayo modificadas se compararon con sus respectivas proteínas estructurales precursoras (es decir, TIC844 o Cry1Da1). En una primera ronda, trescientas setenta (370) proteínas de ensayo modificadas diferentes demostraron una mayor toxicidad contra CEW con respecto a TIC844 o Cry1Da1 en bioensayos de dieta. En cada uno de estos bioensayos de dieta, se proporcionaron cantidades idénticas de la proteína (tanto la proteína de ensayo modificada como la proteína estructural) a los CEW en condiciones de ensayo controladas en monodosis. La potencia de las proteínas de ensayo modificadas y de las proteínas estructurales se determinó por medida y comparación de la mortalidad y reducción del crecimiento observados en cada uno de los bioensayos con la proteína de ensayo modificada con la mortalidad y reducción del crecimiento observados en cada uno de los bioensayos con la proteína estructural precursora.

De las trescientas setenta (370) proteínas de ensayo modificadas que demostraron un aumento de toxicidad contra CEW en comparación con las proteínas estructurales en cribados de ensayo en monodosis, aproximadamente ciento ochenta (180) se estas se analizaron adicionalmente en bioensayos con FAW para determinar si estas proteínas de ensayo modificadas mantenían o presentaban mayor actividad contra FAW en comparación con sus proteínas estructurales precursoras. Aproximadamente de cuarenta (40) a cincuenta (50) de estas proteínas de ensayo modificadas presentaron una actividad contra FAW similar o mejor que sus proteínas estructurales precursoras. Estas proteínas de ensayo modificadas cribadas adicionalmente también se estudiaron en bioensayos con CEW adicionales para confirmar la actividad contra CEW. Estas rondas de selección y ensayo de proteínas de ensayo modificadas que demostraron una mejora en la actividad contra CEW manteniendo o mejorando la actividad contra FAW dio como resultado una lista final de variantes mejoradas (que se denominan en el presente documento como "proteínas insecticidas genomanipuladas"). La Tabla 2 identifica estas proteínas insecticidas genomanipuladas y las mutaciones de aminoácidos en cada proteína insecticida genomanipulada. La Tabla 2 también demuestra la actividad de las proteínas estructurales y de las proteínas insecticidas genomanipuladas contra CEW y FAW (la actividad insecticida se demostró con el valor de CL⁵⁰ (la concentración de toxina que necesaria para destruir el 50 % de una población de insectos durante una exposición de duración fija. Cuanto menor sea el valor de la CL⁵⁰, mayor será la toxicidad) y el valor de la CIM⁵⁰ (la concentración necesaria para inhibir la muda en un instar específico del 50 % de las larvas durante una exposición de duración fija). Esta Tabla demuestra que las proteínas insecticidas genomanipuladas tienen una actividad contra CEW mejorada, manteniendo o mejorando la actividad contra FAW.

Tabla 2. Mutaciones de aminoácidos y datos de actividad para las proteínas estructurales y proteínas insecticidas genomanipuladas.

Demostrando adicionalmente el espectro inhibidor de lepidópteros mejorado y la actividad inhibidora de lepidópteros mejorada de las proteínas insecticidas genomanipuladas, la letalidad de la proteína insecticida genomanipulada TIC844_8 con respecto a su proteína estructural precursora se demuestra en la Figura 1. El diagrama de barras de la Figura 1 demuestra los valores de CIM⁵⁰ de TIC844_8 comparados con los de la proteína estructural TIC844 para dos colonias de CEW diferentes, Union City y Benzon. Los resultados de los bioensayos resultados gráficamente en la Figura 1 se calcularon a partir de preparaciones de bioensayo purificadas en gradiente de sacarosa. El motivo de realizar estos bioensayos secundarios con una preparación de las proteínas en gradiente de sacarosa en posición a las preparaciones espora-cristal fue garantizar que la actividad mejorada de TIC844_8 persistía con una purificación más extensa. Además, la colonia Union City se sometió a ensayo para confirmar la mejora en la actividad observada con la colonia Benzon. Como se demuestra en la Figura 1, las mutaciones en tres restos de TIC844_8 (S282VY316S_I368P), transmitió una mejora de 8 veces en la letalidad sobre CEW, con respecto a TIC844, para la colonia Union City y una mejora de 50 veces en la letalidad sobre CEW, con respecto a TIC844, para la colonia Benzon.

Demostrando más adicionalmente espectro inhibidor de lepidópteros mejorado y la actividad inhibidora de lepidópteros mejorada de las proteínas insecticidas genomanipuladas, los perfiles de actividad insecticida de TIC844 y TIC844_8 derivados de los bioensayos con dieta, realizados contra un amplio espectro de especies de insectos lepidópteros, se muestran en la Tabla 3. Los insectos contra los que se realizan los bioensayos de la Tabla 3 incluyen oruga negra (BCW, Agrotis Ípsilon), gusano de la mazorca de maíz (CEW, Helicoverpa zea), palomilla del maíz (FAW, Spodoptera frugiperda), gusano soldado meridional (SAW, Spodoptera eridiania), oruga de la col (CLW, Trichoplusia ni), barrenador europeo del maíz (ECB, Ostrinia nubilalis), barrenador del maíz del sudoeste (SWC, Diatraea grandiosella), gusano cogollero (TBW, Heliothis virescens), oruga del frijol aterciopelado (VBC, Anticarsia gemmatalis), oruga de la soja (SBL, Chrysodeixis includes), y barrenador de la caña de azúcar (SCB, Diatraea saccharalis). Esta Tabla 3 demuestra la mejora en el espectro inhibidor de lepidópteros de TIC844_8 en comparación con la proteína estructural precursora TIC844, específicamente con actividad mejorada contra CEW y VBC.

Tabla 3. Espectro de actividad insecticida para TIC844 y TIC8448.

* Activa contra las especies de insectos indicadas.

La mejora en el espectro inhibidor de lepidópteros de las proteínas insecticidas genomanipuladas se demuestra adicionalmente en la Tabla 4 que representa el perfil de actividad contra insectos de algunas proteínas insecticidas genomanipuladas a partir de los estudios de bioensayos de dieta. Los insectos contra los que se realizan los bioensayos de la Tabla 4 incluyen gusano del algodón del viejo mundo (CBW, Helicoverpa armígera), gusano cortador del tabaco (TCW, Spodoptera litura), gusano soldado de la remolacha (BAW, Spodoptera exigua), gusano rosa algodonero (PBW, Pectinophora gossypiella), perforador rosado del tallo (PSB, Sesamia inferens) y gusano manchado (SBW, Earias vitella). Los resultados mostrados en la Tabla 4 demuestran la mejora en el espectro inhibidor de lepidópteros de las proteínas insecticidas genomanipuladas relacionadas en comparación con la proteína estructural Cry1Da1, específicamente con una actividad mejorada contra CBW, PBW (resistente a Cry1Ac), PBW (recogida en el campo) y SBW.

Tabla 4. Comparación del perfil de actividad en insectos para CryIDal y proteínas insecticidas diseñadas.

EJEMPLO 4

Síntesis de genes que codifican proteínas insecticidas genomanipuladas y proteínas estructurales para su expresión en plantas

Este Ejemplo ilustra la síntesis de polinucleótidos que codifican proteínas insecticidas genomanipuladas y proteínas estructurales para su expresión en plantas.

Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas estructurales y proteínas insecticidas genomanipuladas para su expresión en plantas se diseñaron y se sintetizaron de acuerdo con los procedimientos generalmente descritos en la patente de Estados Unidos n.° 5.500.365, evitando algunas secuencias con problemas importantes tales como ATTTA y secuencias de poliadenilación ricas en A/T vegetales conservando al mismo tiempo la secuencia de aminoácidos de la proteína estructural original o de la proteína insecticida genomanipulada. Las secuencias de nucleótidos de estos genes que codifican proteínas insecticidas genomanipuladas y proteínas estructurales para su expresión en plantas se relacionan a continuación en la Tabla 5.

Tabla 5. Secuencias de polinucleótidos diseñadas para su uso en plantas que codifican proteínas estructurales y proteínas insecticidas genomanipuladas.

continuación

EJEMPLO 5

Casetes de expresión para la expresión de proteínas insecticidas genomanipuladas en plantas

Este Ejemplo ilustra la construcción de casetes de expresión que comprenden secuencias polinucleotídicas diseñadas para su uso en plantas que codifican proteínas estructurales y proteínas insecticidas genomanipuladas.

Se construyó una variedad de casetes de expresión en plantas con las secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas estructurales y proteínas insecticidas genomanipuladas diseñadas para su expresión en plantas proporcionadas en la Tabla 5. Dichos casetes de expresión son útiles para la expresión transitoria en protoplastos o la transformación de células vegetales. Los casetes de expresión típicos se diseñaron con respecto a la eventual colocación de la proteína dentro de la célula. Un conjunto de casetes de expresión se diseñó de una forma que permitía que la proteína se tradujera y permaneciera en el citosol. Otro conjunto de casetes de expresión se diseñó para tener un péptido de tránsito contiguo a la proteína toxina para permitir el direccionamiento a un orgánulo de la célula tal como el cloroplasto o el plástido. Todos los casetes de expresión se diseñaron para comenzar en el extremo 5' con un promotor, que puede estar compuesto de múltiples elementos promotores, elementos potenciadores, u otros elementos de expresión conocidos por los expertos en la materia operativamente unidos para estimular la expresión del transgén. La secuencia de promotor va seguida normalmente y es contigua con una o más secuencias líder en 3' al promotor. Una secuencia intrónica se proporciona habitualmente en 3' respecto a la secuencia líder para mejorar la expresión del transgén. Una secuencia codificante de la toxina o péptido de tránsito y secuencia codificante de la toxina se sitúa habitualmente en 3' respecto de la configuración de promotor, líder e intrón operativamente unidos. Una secuencia 3'UTR se proporciona habitualmente en 3' de la secuencia de codificación para facilitar la terminación de la transcripción y para proporcionar secuencias importantes para la poliadenilación del transcrito resultante. Todos los elementos descritos anteriormente estaban operativamente unidos y dispuestos en secuencia, frecuentemente con secuencias adicionales provistas para la construcción del casete de expresión.

EJEMPLO 6

Vectores de transformación que contienen un casete de expresión de una proteína estructural o una proteína insecticida genomanipulada

Este Ejemplo ilustra la incorporación de proteínas estructurales o proteínas insecticidas genomanipuladas a tejidos vegetales.

Los procedimientos para producir una planta transgénica que expresa un segmento de ácido nucleico que codifica una proteína estructural o una proteína insecticida genomanipulada se pueden realizar utilizando variaciones de los procedimientos bien conocidos en la materia. En general, el procedimiento comprende transformar una célula hospedadora adecuada con un segmento de ADN que contiene un promotor unido operativamente a una región de codificación que codifica una o más de las proteínas insecticidas genomanipuladas o las proteínas estructurales. Dicha región de codificación está por lo general unida operativamente a una región de terminación de la transcripción, por lo que el promotor puede impulsar la traducción de la región de codificación en la célula y proporcionar, de esta forma, a la célula la capacidad de producir el polipéptido in vivo. Vectores, plásmidos, cósmidos, y segmentos de ADN para su uso en la transformación de dichas células generalmente comprenderán operones, genes, o secuencias derivadas de genes, tanto de origen natural como sintéticamente derivadas y, especialmente, las que codifican las proteínas insecticidas genomanipuladas desveladas. Estas construcciones de ADN pueden incluir además estructuras tales como promotores, potenciadores, polienlazadores, u otras secuencias génicas que tienen actividad de regulación sobre los genes concretos de interés. La planta transgénica, partes de plantas y células vegetales resultantes se sometieron a ensayo para determinar la expresión y la bioactividad de la proteína codificada.

Los Ejemplos de procedimientos que se pueden modificar para obtener plantas transgénicas que expresan proteínas activas en lepidópteros incluyen las que describen, por ejemplo, proteínas CrylA (patente de Estados Unidos n.° 5.880.275), CrylB (solicitud de patente de Estados Unidos n.° l0/525318), CrylC (patente de Estados Unidos n.° 6.033.874), quimeras CrylA/F (patentes de Estados Unidos números 7.070.982; 6.962.705 y 6.713.063), y una proteína Cry2Ab (patente de Estados Unidos n.° 7.064.249).

EJEMPLO 7

Actividad en lepidópteros de las proteínas insecticidas genomanipuladas en maíz transformado de forma estable

Este Ejemplo ilustra la actividad inhibidora presentada por las proteínas insecticidas genomanipuladas contra plagas de lepidópteros cuando se expresan en plantas de maíz y se proporcionan como dieta a la respectiva plaga de insectos.

Plantas de maíz transgénicas R0 que expresan las proteínas Cry1Da1 y Cry1Da1_7.nno se produjeron usando vectores que contenían los casetes de expresión descritos en el Ejemplo 6. Plantas de maíz transgénicas F1 se hicieron crecer a partir de semillas producidas por orejetas de polinización de plantas no transformadas comerciales de germoplasma natural con polen de los transformantes R0.

Se indujo a las células transformadas a formar plantas por procedimientos conocidos en la materia. Los bioensayos que utilizan discos de hojas de planta se realizaron análogamente a los descritos en la patente de Estados Unidos n.° 8.344.207. Se usó una planta no transformada para obtener tejido de un control negativo. Se evaluaron múltiples eventos de transformación para cada vector binario, y los resultados se tabularon.

La actividad insecticida de las plantas de maíz transgénicas que expresaban las proteínas CryIDal y Cry1Da1_7.nno en F1 y R0 se proporciona en la Tabla 6, además de nada de actividad contra plantas de maíz transgénicas que expresan las proteínas CryIDal y Cry1Da1_7.nno en F1 en el campo. Específicamente, la Tabla 6 demuestra el perfil de actividad en lepidópteros de Cry1Da1_7.nno comparada con la proteína estructural precursora CryIDal cuando se estudia contra CEW, FAW, y SWC. Como se puede observar en la Tabla 6, a diferencia de CryIDal, Cry1Da1_7.nno demuestra actividad contra ambas CEW y FAW en R0 y F1 en los bioensayo y en F1 en las pruebas de campo.

Tabla 6. Perfil de actividad insecticida para CryIDal y Cry1Da1_7.nno expresadas en plantas de maíz.

EJEMPLO 8

Actividad en lepidópteros de las proteínas insecticidas genomanipuladas en algodón transformado de forma estable

Este Ejemplo ilustra la actividad inhibidora presentada por las proteínas insecticidas genomanipuladas contra plagas de lepidópteros cuando se expresan en plantas de algodón y se proporcionan como dieta a la respectiva plaga de insectos.

Plantas de algodón que expresan las proteínas Cry1Da1_7.nno y TIC844_11.nno se produjeron usando vectores que contenían los casetes de expresión descritos en el Ejemplo 6. Se indujo a las células transformadas a formar plantas por procedimientos conocidos en la materia. El tejido de la hoja de algodón se usó en el bioensayo descrito en el Ejemplo 7 y se estudiaron contra CBW, FAW, gusano cogollero (TBW, Heliothis virescens), y SBL. La Tabla 7 muestra la actividad observada contra estas especies de lepidópteros en la generación Ro del algodón transformada de manera estable. Como se puede observar en la Tabla 7, Cry1Da1_7.nno y TIC844_11.nno demostraron actividad contra dos o más plagas de especies de lepidópteros en la generación Ro del algodón transformada de manera estable.

Tabla 7. Perfil del bioensayo de actividad para Cry1Da1_7.nno, y TIC844_11.nno expresado en algodón de la generación R ⁰ .

Se usaron eventos de transformación seleccionados para producir plantas R¹. Las plantas R¹ que expresaban Cry1Da1_7.nno se analizaron para determinar la resistencia a CBW, fAw y SBL. En el bioensayo se utilizaron tejidos de hojas, cuadrados y cápsulas, además de los ensayos de campo realizados en invernaderos de malla. La Tabla 8 muestra la actividad observada en estos ensayos. Como se demuestra en la Tabla 8, Cry1Da1_7.nno demostró actividad contra CBW, FAW y SBL en bioensayos y ensayos de campo.

Tabla 8. Perfil de actividad en insectos de Cry1Da1_7.nno expresado en algodón de la generación R ¹ .

EJEMPLO 9

Actividad en lepidópteros de las proteínas insecticidas genomanipuladas en soja transformada de forma estable

Este Ejemplo ilustra la actividad inhibidora presentada por las proteínas insecticidas genomanipuladas contra plagas de lepidópteros cuando se expresan en plantas de soja y se proporcionan como dieta a la respectiva plaga de insectos.

Se produjeron plantas de soja que expresaban las proteínas Cry1Da1_7.nno, TIC844_9.nno y TIC844_11.nno usando vectores que contenían los casetes de expresión descritos en el Ejemplo 6. El tejido de las hojas se recogió y se usó en el bioensayo descrito en el Ejemplo 7 o, como alternativa, se usó tejido liofilizado en la dieta de insecto para el bioensayo. El bioensayo se realizó contra varias especies de lepidópteros, incluyendo SAW, SBL y gusano de la maceta de soja (SPW, Helicoverpa zea). La Tabla 9 muestra la actividad observada contra estas plagas de lepidópteros en la generación R0 de la soja transformada de manera estable. Como se puede observar en la Tabla 9, Cry1Da1_7.nno y TIC844_11.nno demostró actividad contra SPW, SAW y SBL. TIC844_9.nno (TIC844 más alanina adicional para la clonación) no demostró actividad contra SPW.

Tabla 9. Perfil del bioensayo de actividad para Cry1 Da1_7.nno, TIC844_9.nno y TIC844_11.nno expresado en soja de la generación R ⁰ .

Se usaron eventos de transformación seleccionados para producir plantas R¹. Las plantas R¹ que expresaban CrylDal_7.nno se analizaron para determinar la resistencia a SAW, SBL, SPW y oruga del frijol aterciopelado (VBC, Anticarsia gemmatalis). El tejido de las hojas se recogió de las plantas de la generación R¹ y se usó en un bioensayo de alimentación. La Tabla 10 muestra la actividad observada en estos ensayos. Como se demuestra en la Tabla 10, Cry1Da1_7.nno demostró actividad contra SPW, SAW y SBL.

Tabla 10. Perfil del bioensayo de actividad para Cry1Da1 7.nno expresado en soja de la generación R ¹ .

La Tabla 11 muestra los resultados de los ensayos de campo realizados en invernaderos de malla con plantas de soja de la generación R¹ que expresan CrylDal_7.nno. Las especies utilizadas para infestar plantas en los invernaderos de malla incluyen gusano soldado negro (BLAW, Spodoptera cosmioides), polilla del brote de judía (BSM, Crocidosema aporema), gusano de Sudamérica (SAPW, Helicoverpa gelotopoeon), oruga del girasol (SFL, Rachiplusia nu) y VBC. La Tabla 11 muestra la actividad observada en estos ensayos. Como se demuestra en la Tabla 11, Cry1Da1_7.nno demostró actividad contra BLAW, SAPW y SFL.

Tabla 11. Perfil de actividad de Cry1Da1_7.nno expresado en soja de la generación R ¹ sometida a ensayo en ensayos de campo en invernaderos de malla.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una la proteína insecticida genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en cualquiera de las SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:26.

2. La proteína insecticida genomanipulada de la reivindicación 1, en la que la proteína insecticida genomanipulada presenta actividad inhibidora contra una especie de insecto del orden Lepidoptera.

3. Un polinucleótido que codifica la proteína insecticida genomanipulada de la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido está operativamente unido a un promotor heterólogo.

4. Un polinucleótido que codifica una proteína insecticida genomanipulada, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos:

a. como se define en cualquiera de las SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:25; o b. que codifica la proteína insecticida genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en cualquiera de las SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 26.

5. Una célula hospedadora que comprende al menos un polinucleótido definido en la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en la que la célula hospedadora se seleccionado entre el grupo que consiste en una célula hospedadora bacteriana y una célula hospedadora vegetal.

6. La célula hospedadora de la reivindicación 5, en la que célula bacteriana hospedadora se selecciona del grupo que consiste en Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, y Erwinia.

7. Una composición inhibidora de insectos que comprende la proteína insecticida genomanipulada de la reivindicación 1.

8. La composición inhibidora de insectos de la reivindicación 7, que comprende además al menos un agente inhibidor de insectos diferente de la proteína insecticida genomanipulada.

9. La composición inhibidora de insectos de la reivindicación 8, en la que el al menos un agente inhibidor de insectos se selecciona entre el grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, una molécula de ARNbc inhibidora de insectos, y una sustancia química inhibidora de insectos.

10. Una semilla que comprende:

a. la proteína insecticida genomanipulada de la reivindicación 1; o

b. un polinucleótido que codifica la proteína insecticida genomanipulada de la reivindicación 1.

11. Un procedimiento para controlar una plaga de lepidópteros, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la plaga de lepidópteros con una cantidad inhibidora de la proteína insecticida genomanipulada de la reivindicación 1.

12. Una célula vegetal, planta o parte de planta transgénica, que comprende la proteína insecticida genomanipulada de la reivindicación 1.

13. Un procedimiento de control de una plaga de lepidópteros, que comprende exponer la plaga a la célula vegetal, planta o parte de planta transgénica de la reivindicación 12, en la que dicha célula vegetal, planta o parte de planta expresa una cantidad inhibidora de lepidópteros de la proteína insecticida genomanipulada.

14. Un producto de consumo derivado de la célula vegetal, planta o parte de planta de la reivindicación 12, en la que el producto comprende una cantidad detectable de una proteína insecticida genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos como se ha definido en cualquiera de las SEQ ID NO:44, SeQ ID NO:40, Se Q ID NO: 12 o SEQ ID NO: 26.