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ES2727334T3 - Métodos y ensayos basados en microARN para el osteosarcoma - Google Patents

Métodos y ensayos basados en microARN para el osteosarcoma Download PDF

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ES2727334T3
ES2727334T3 ES12829323T ES12829323T ES2727334T3 ES 2727334 T3 ES2727334 T3 ES 2727334T3 ES 12829323 T ES12829323 T ES 12829323T ES 12829323 T ES12829323 T ES 12829323T ES 2727334 T3 ES2727334 T3 ES 2727334T3
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ES
Spain
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mir
seq
osteosarcoma
cells
mirna
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ES12829323T
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Takahiro Ochiya
Tomohiro Fujiwara
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3D Matrix Ltd
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
Original Assignee
3D Matrix Ltd
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
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Abstract

Una cantidad eficaz de una molécula antisentido específica para un microARN (miARN) seleccionado de miR-1, miR-10b y miR-133a para su uso en el tratamiento del osteosarcoma en un sujeto que lo necesite.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y ensayos basados en microARN para el osteosarcoma
Antecedentes de la invención
Existen cada vez más pruebas de que los tumores contienen un subconjunto de células con propiedades similares a las células madre. Estas células, con frecuencia denominadas "células madre cancerosas" (CSC) o "células iniciadoras de tumores" (TIC), son responsables de formar la mayor parte del tumor. Estas CSC poseen capacidades tanto de auto-renovación como de diferenciación y se cree que dan lugar a heterogeneidad del tumor. Asimismo, se ha mostrado que están asociadas con las características más letales de los tumores: la resistencia a fármacos y la metástasis. La primera prueba de la existencia de CSC provino de estudios de neoplasias malignas hematológicas en 1994. Más recientemente, se han identificado CSC en varios tumores sólidos, incluyendo cáncer de mama, cerebro, piel, pulmón, colon, pancreático, hígado, cabeza y cuello, próstata, ovárico y gástrico.
El osteosarcoma es la neoplasia maligna ósea primaria más común y representa el 60 % de todos los tumores óseos malignos infantiles. Antes de la quimioterapia multiagente, la amputación proporcionó una tasa de supervivencia a largo plazo de solo -20 %. Desde la década de 1970, la quimioterapia de combinación junto con la cirugía con conservación de la extremidad ha sido el tratamiento principal para el osteosarcoma. Actualmente, se ha señalado que la supervivencia a los 5 años para los pacientes con osteosarcoma es del 50 % al 80 %. Sin embargo, esta tasa de supervivencia no ha mejorado en los últimos 10 años y el 40 % de los pacientes con osteosarcoma mueren a causa de su enfermedad.
Las moléculas de dirección importantes en la tumorigénesis, conocidas como "terapia dirigida", han sido un desarrollo emocionante en el tratamiento del cáncer en los últimos diez años. Sin embargo, actualmente no hay ninguna terapia dirigida disponible para el osteosarcoma. Por lo tanto, existe una gran necesidad de desarrollar nuevos tratamientos para el osteosarcoma.
CD133, también conocida como AC133 y Prominina 1 (PROM1), es una glucoproteína de cinco dominios transmembrana de función desconocida. Fue el primer miembro identificado de la familia prominina de glucoproteínas de cinco dominios transmembrana. En 1997, Yin et al. produjeron un nuevo anticuerpo monoclonal que reconocía el antígeno AC133, un epítopo dependiente de la glucosilación de CD133, y detectaron la expresión de AC133 en células progenitoras positivas para CD34 de sangre de adultos. El ADNc de CD133 codifica una molécula de 5 dominios transmembrana con un extremo N extracelular, un extremo C citoplásmico y dos bucles extracelulares grandes con ocho sitios de consenso para la glucosilación ligada a N. Un rasgo característico de CD133 es su rápida regulación negativa durante la diferenciación celular. Esta característica convierte a CD133 en un marcador de superficie celular único para la identificación y el aislamiento de células madre y células progenitoras en varios tejidos. Según la teoría de las CSC, las CSC expresan algunos de los marcadores de células madre de las células madre normales. Por lo tanto, se cree que las células tumorales que expresan CD133 independientemente o en combinación con otros marcadores de células madre o células progenitoras representan CSC. Hasta ahora, sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes en el fenotipo de CSC que expresan el marcador de superficie celular CD 133 han permanecido desconocidos.
Los microARN (miARN), descubiertos por primera vez en 1993 como un pequeño ARN no codificante de proteínas, son pequeñas moléculas de ARN reguladoras que modulan la expresión de sus genes diana y desempeñan funciones importantes en una diversidad de procesos fisiológicos y patológicos, tales como el desarrollo, la diferenciación, la proliferación celular, la apoptosis y las respuestas a la tensión. La biogénesis de miARN requiere varias etapas de procesamiento post-transcripcional para producir el miARN maduro funcional. Durante los últimos años, se han investigado muchos miARN en diversos cánceres humanos. Se ha mostrado que la desregulación de la expresión de los miARN contribuye al desarrollo del cáncer a través de diversos tipos de mecanismos, incluyendo supresiones, amplificaciones o mutaciones que implican loci de miARN, silenciamiento epigenético, la desregulación de los factores de transcripción que se dirigen a miARN específicos o la inhibición del procesamiento. El perfil de expresión de miARN es cada vez más importante como una herramienta de diagnóstico y pronóstico útil y muchos estudios han indicado que los miARN actúan como oncogenes o como supresores de tumores.
Los miARN humanos miR-1 y miR-133a están ubicados en la misma región cromosómica, en un denominado grupo. Enriquecidos en músculo, son miARN que inhiben la proliferación de células progenitoras y promueven la miogénesis al dirigirse a la histona desacetilasa 4 (HDAC4) y el factor de respuesta sérica (SRF), respectivamente. Se ha señalado que miR-1 está sobreexpresado en individuos con arteriopatía coronaria, mientras que se ha señalado que ambos de estos miARN se expresan en niveles bajos en la hipertrofia cardíaca. A pesar de varios estudios, su importancia en la fisiología muscular y la enfermedad aún no está clara. Recientemente, miR-133a (cuyo nombre no guarda relación con el nombre CD133) se ha considerado prescindible para el desarrollo normal y la función del músculo esquelético. Sin embargo, la relación entre estos miARN y CSC ha sido, hasta ahora, desconocida.
Gougelet et al (International Journal of Cancer 129 (680-690) 2011 identificaron cinco miARN (mir-92a, miR996, miR193a, miR132 y miR422a) en tumores de pacientes que podrían ser útiles en el diagnóstico del osteosarcoma.
Se ha descubierto que el miARN miR-10b humano está asociado positivamente con una neoplasia maligna de alto grado. Esta asociación se mantuvo para diversos tipos de cáncer. miR-10b es uno de los miARN más significativamente regulados positivamente en adenocarcinomas pancreáticos y glioblastomas humanos, dos tipos de cánceres muy metastásicos y/o invasivos. Este miARN se expresa en gran cantidad en células cancerosas metastásicas propagadas como líneas celulares, así como en tumores de mama metastásicos en pacientes, y también está regulado positivamente en los carcinomas hepatocelulares metastásicos en relación con los que no son metastásicos. La importancia de miR-10b en el desarrollo del sarcoma no se ha señalado previamente.
Sumario de la invención
Un aspecto de la invención es una cantidad eficaz de una molécula antisentido específica para un microARN (miARN) seleccionado de miR-1, miR-10b y miR-133a para su uso en el tratamiento del osteosarcoma en un sujeto que lo necesite.
En una realización, la molécula antisentido es ARN estabilizado.
En una realización, el ARN estabilizado es un oligonucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA).
En una realización, la molécula antisentido es ADN.
En una realización, la molécula antisentido tiene una longitud de 20-30 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90 por ciento idéntica a 5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4), 5'-ACAAATTCGGTTCTACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5) o 5-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6).
En una realización, la molécula antisentido tiene una longitud de 21-30 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95 por ciento idéntica a 5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4), 5'-ACAAATTCGGTT CT ACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5) o 5-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6).
En una realización, la secuencia de la molécula antisentido es
5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4),
5'-ACAAATTCGGTTCTACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5) o
5'-CAGCTGG1TGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6).
En una realización, la molécula antisentido tiene una longitud de 20-30 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90 por ciento idéntica a
5-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-CACAAATTCGGTT CT ACAGGGT A-3' (SEQ ID NO: 11) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12).
En una realización, la molécula antisentido tiene una longitud de 21-30 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95 por ciento idéntica a
5'-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-CACAAA1TCGG1T CT ACAGGGT A-3' (SEQ ID NO: 11) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12).
En una realización, la secuencia de la molécula antisentido es
5'-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-CACAAATTCGGTT CT ACAGGGT A-3' (SEQ ID NO: 11) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12).
En una realización, la molécula antisentido está asociada con un vehículo de suministro de ácido nucleico.
En una realización, el osteosarcoma es osteosarcoma metastásico.
Se describe en el presente documento una molécula de ácido nucleico aislada de 20-30 nucleótidos de longitud que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90 por ciento idéntica a
5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4),
5'-ACAAATTCGGTTCTACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5) o
5'-CAGCTGG1TGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6)
Se describe en el presente documento la molécula de ácido nucleico aislada que tiene una longitud de 21-30 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95 por ciento idéntica a
5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4),
5'-ACAAATTCGGTTCTACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6).
La secuencia de la molécula de ácido nucleico aislada puede ser
5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4),
5'-ACAAATTCGGTTCTACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6).
Se describe en el presente documento una molécula de ácido nucleico aislada de 20-30 nucleótidos de longitud que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90 por ciento idéntica a
5'-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-CACAAATTCGGTT CT ACAGGGT A-3' (SEQ ID NO: 11) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12).
La molécula de ácido nucleico aislada puede tener una longitud de 21-30 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95 por ciento idéntica a
5'-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-CACAAA1TCGGTT CT ACAGGGT A-3' (SEQ ID NO: 11) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12).
La secuencia de la molécula de ácido nucleico aislada puede ser
5'-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-CACAAATTCGGTT CT ACAGGGT A-3' (SEQ ID NO: 11) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12).
La molécula de ácido nucleico puede estar asociada con un vehículo de suministro de ácido nucleico.
Un aspecto de la invención es un método para evaluar la resistencia del osteosarcoma a una terapia antineoplásica en una muestra de tejido que comprende células de osteosarcoma; que comprende
aislar de la muestra células que expresan CD133;
medir un primer nivel de expresión por las células que expresan CD133 de al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a;
poner en contacto las células que expresan CD133 con una terapia antineoplásica; y
medir un segundo nivel de expresión por las células que expresan CD133 del al menos un miARN, en donde un segundo nivel de expresión mayor que el primer nivel de expresión indica que el osteosarcoma es resistente a la terapia antineoplásica.
En una realización, la terapia antineoplásica se selecciona del grupo que consiste en cisplatino, doxorrubicina, metotrexato y cualquier combinación de los mismos.
Un aspecto de la invención es un método de detección del osteosarcoma. El método incluye la etapa de realizar en una muestra de tejido de un sujeto un ensayo específicamente capaz de detectar al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a, en donde la detección por el ensayo de la presencia en la muestra del al menos un miARN indica que el sujeto está en riesgo de tener osteosarcoma.
En una realización, el tejido es sangre.
En una realización, el tejido es suero.
Un aspecto de la invención es un método para controlar el osteosarcoma en una muestra de tejido obtenida de un sujeto que tiene osteosarcoma o que ha sido tratado de osteosarcoma; que comprende:
(a) realizar un ensayo específicamente capaz de cuantificar el nivel de expresión de al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a; y
(b) repetir la etapa (a) en una muestra de tejido obtenida posteriormente del sujeto, en donde un nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida posteriormente mayor que el nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida anteriormente indica que el osteosarcoma es progresivo y un nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida posteriormente menor que el nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida anteriormente indica que el osteosarcoma es regresivo.
En una realización, el tejido es sangre.
En una realización, el tejido es suero.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un grupo de siete análisis representativos de FACS de diversas líneas celulares de osteosarcoma humano indicadas basados en su expresión de CD133 (eje X) y CD44 (eje Y).
La Figura 2 es un collage que comprende un análisis de FACS que representa la selección de células SaOS2 CD133alto y CD133bajo (panel superior); cuatro microfotografías que representan la división celular asimétrica en la población CD133alto el día 1 y el día 8 (panel central); y dos análisis de FACS por tinción de PKH para cada población el día 14 (panel inferior). Barras de escala, 50 mm.
La Figura 3 es un grupo de cuatro microfotografías y un gráfico de barras que representa ensayos de formación de esferas en células HOS-GFP CD133alto y CD133bajo recién aisladas. Las fotografías se tomaron el día 5 y se contó el número de esferas en cada pocillo (n = 3 por grupo, **P < 0,01). Barra de escala, 200 pm.
La Figura 4 es un gráfico de barras que representa la sensibilidad al fármaco de poblaciones de células SaOS2 CD133alto y CD133bajo. Se analizaron células viables relativas a doxorrubicina (DOX, 0,03 pM), cisplatino (CDDP, 2,5 pM) y metotrexato (MTX, 0,32 pM) (n = 3 por grupo, *P < 0,05, **P < 0,01).
La Figura 5 es un par de microfotografías y un gráfico de barras que representan ensayos de invasión en poblaciones de células SaOS2 CD133alto y CD133bajo (n = 3 por grupo, **P< 0,01). Barra de escala, 200 pm. La Figura 6 es un gráfico que representa el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de transportadores multirresistentes a fármacos asociados a células madre y genes asociados a metástasis de poblaciones de células SaOS2 CD133alto y CD133bajo. Se utilizó p-actina como control interno. La Figura 7 es un grupo de ocho imágenes fotográficas que representan la tumorigenicidad de poblaciones de células HOS-luc CD133alto y CD133bajo en ratones. La luminiscencia de los tumores con xenoinjertos de células HOS-luc CD133alto (muslos derechos de los animales) y CD133bajo (muslos izquierdos de los animales) se identificó mediante un sistema de captura de imágenes in vivo (IVIS). La población de CD133alto formó tumores desde solo 100 células (n = 5 por grupo).
La Figura 8 es un par de análisis de FACS que representan poblaciones de células CD133alto en muestras clínicas de osteosarcoma.
La Figura 9 es un gráfico que representa la supervivencia sin metástasis en pacientes con osteosarcoma basándose en la expresión de CD133. Los pacientes con alta expresión de CD133 tuvieron una mediana de supervivencia sin metástasis de menos de 60 meses (n = 35, prueba de rangos logarítmicos, P = 0,0262).
La Figura 10 es un diagrama de Venn que representa miARN regulados positivamente y regulados negativamente en células CD133alto y CD133bajo de SaOS2 y HOS.
La Figura 11 es un gráfico de barras que representa miR-1, miR-10b y miR-133a regulados positivamente en poblaciones CD133alto de células SaO2 y HOS en comparación con una población CD133bajo (*P < 0,05, **P< 0,01, ***p< 0,001).
La Figura 12 es un gráfico que representa la expresión de miR-1, miR-10b y miR-133a en células SAOS2 CD133bajo transfectadas con oligonucleótidos de miARN en comparación con células SAOS2 CD133bajo transfectadas con oligonucleótidos de miR-CN (control negativo) (escala logarítmica, n = 3 por grupo, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).
La Figura 13 es un gráfico que representa ensayos de invasión en células CD133bajo purificadas transfectadas con oligonucleótidos de miR-1, miR-10b y miR-133a o CN (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P< 0,001).
La Figura 14 es un gráfico que representa la resistencia al fármaco en células CD133bajo transfectadas con oligonucleótidos de miR-1, miR-10b, miR-133a o miR-CN (MTX, metotrexato a 0,22 mM; *P < 0,05, **P< 0,01).
La Figura 15 es una representación esquemática de vectores plasmídicos utilizados para la sobreexpresión estable de miR-133a en células CD133bajo. Nrul, Notl, Xbal: sitios de endonucleasas de restricción; Pcmv, promotor de citomegalovirus; MCS, sitio de clonación múltiple; IVS, secuencia intermedia; IRES, sitio interno de entrada al ribosoma; Hygr, gen de resistencia a higromicina; SV40 poli A, cola de poliA de SV40.
La Figura 16 comprende cuatro pares de imágenes fotográficas que representan la tumorigenicidad de células HOS-/uc CD133bajo que expresan de forma estable miR-133a (patas derechas) en comparación con células HOS-luc CD133bajo de control (patas izquierdas). Cada sitio fue inyectado con el número indicado de células (102-105); se realizó evaluación luminiscente 90 días después de la inyección.
La Figura 17 es un gráfico que representa la expresión del ARN mensajero (ARNm) de CD 133 en células SaOS2 CD133bajo transfectadas con oligonucleótidos miR-1, miR-10b y miR-133a. La alteración de estos miARN no alteró los niveles de expresión de CD 133. También se hace una comparación con células CD133alto transfectadas con oligonucleótido miR-CN (control negativo) (n = 3 por grupo).
La Figura 18 es un gráfico que representa la expresión de miR-133a en poblaciones CD133alto de biopsias de pacientes recién resecadas.
La Figura 19 es una serie de microfotografías y un gráfico de barras relacionado que representan los efectos de miARN individuales, y diversas combinaciones de los miARN, sobre la invasividad de células SaOS2 CD133bajo transfectadas con los miARN indicados. Para fines de comparación también se presentan datos para células SaOS2 CD133alto. CN, control negativo.
La Figura 20 es una serie de microfotografías y gráficos de barras relacionados que representan los efectos de miARN individuales, y diversas combinaciones de los miARN, sobre la invasividad de células MNNG/HOS CD133bajo transfectadas con los miARN indicados. CN, control negativo.
La Figura 21 es un gráfico de barras que representa la proliferación de células SaOS2 CD133alto no transfectadas y células SaOS2 CD133bajo transfectadas con los miARN indicados. CN, control negativo. Las células se mantuvieron en cultivo durante 4 d antes del recuento.
La Figura 22 comprende tres gráficos que representan (izquierda) inducción de ARNm para CD133 por doxorrubicina (DOX) y cisplatino (CDDP) en células 143B; (central) inducción de miR-1, miR-10b y miR-133a por DOX en células 143B; y (derecha) inducción de miR-1, miR-10b y miR-133a por CDDP en células 143B (* P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).
La Figura 23 es un par de imágenes fotográficas yuxtapuestas que representan la tumorigenicidad de células HOS-/uc CD133bajo tratadas con cisplatino (CDDP) en ratones. La luminiscencia de los tumores con xenoinjertos de células tratadas con CDDP (tibias derechas de los animales) y células de control tratadas con solución salina (tibias izquierdas de los animales) se identifica mediante el sistema de captura de imágenes in vivo (IVIS). Las células CD133bajo tratadas con CDDP formaron tumores desde tan solo 100 células (n = 5 por grupo).
La Figura 24 es un gráfico que representa la atenuación de la expresión de miR-1, miR-10b y miR-133 en células SaOS2 CD133alto transfectadas con oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA)-1, LNA-10b, LNA-133a y LNA-CN.
La Figura 25 es un gráfico que representa la proliferación celular el día 4 después de la transfección de los oligonucleótidos de LNA-133a y LNA-CN (control negativo) en células CD133alto y CD133 bajo (n = 3 por grupo; ***P < 0,001).
La Figura 26 es un par de gráficos que representan (izquierda) la viabilidad celular de los tipos celulares indicados que crecen en presencia de doxorrubicina (DOX, 0,4 j M, 48 h) o cisplatino (CDDP, 5 j M, 48 h) medida 24 h después de la transfección con LNA-133a o LNA-CN; y (derecha) el porcentaje de células apoptóticas en los tipos celulares indicados que han crecido en presencia (+) o ausencia (-) de cisplatino (CDDp , 5 j M, 48 h) medido 24 h después de la transfección con LNA-133a o LNA-CN.
La Figura 27 es un gráfico que representa ensayos de invasión en poblaciones indicadas de SaOS2 CD133alto y CD133bajo tratadas con LNA (n = 3 por grupo; **P<0,01).
La Figura 28 es un gráfico que representa el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de genes asociados con la gravedad, resistencia a fármacos, y metástasis de osteosarcoma en células CD133alto transfectadas con oligonucleótidos LNA-133a y LNA-CN, Se utilizó p-actina como control interno.
La Figura 29 es un esquema que representa el programa de administración de LNA-133a (LNA) y cisplatino (CDDP) para ratones que portan 143B-/uc. IVIS, sistema de captura de imágenes in vivo.
La Figura 30 es un gráfico que representa la expresión de miR-133a en tumores 143B-/uc según la dosis de LNA-133a (n = 3 por grupo).
La Figura 31 es un gráfico que representa la expresión relativa de miR-133a en ratones que portan tumores 143B-/uc y tratados con solución salina sola, LNA-133a solo, cisplatino (CDDP) solo o LNA-133 más CDDP (*P < 0,05, ***P < 0,001).
La figura 32 es un grupo de cuatro imágenes fotográficas que representan el aspecto macroscópico, el día 36, de ratones que portan tumores 143B-/uc y tratados con solución salina sola, LNA-l33a solo, cisplatino (CDDP) solo o LNA-133 más CDDP. Barra de escala, 10 mm.
La Figura 33 es un gráfico que representa el peso de tumores 143B-/uc, el día 36, de cada grupo de tratamiento indicado (**P< 0,01).
La Figura 34 es un gráfico que representa la supervivencia de ratones que portan tumores 143B-/uc y tratados con solución salina sola, LNA-133a solo, cisplatino (CDDP) solo o LNA-133 más CDDP. Análisis de Kaplan-Meier y prueba de rangos logarítmicos (n = 5 por grupo, P = 0,0013).
La Figura 35 es un esquema que representa una estrategia utilizada para identificar genes diana de miR-133a. IP anti-Ago2, inmunoprecipitación de anticuerpos anti-Ago2.
La Figura 36 es un diagrama de Venn que representa ARN mensajeros (ARNm) diana candidatos de miR-133a según la micromatriz de ADN complementario (ADNc) y el análisis de la base de datos por ordenador.
La Figura 37 es un gráfico que representa la inhibición del crecimiento celular por 10 ARNip en matrices de transfección de células en presencia de cisplatino 72 h después de la transfección (n = 3 por grupo; CN, control negativo; **P< 0,01, ***p< 0,001).
La Figura 38 es un gráfico que representa el ensayo de invasión por 10 ARNip en matrices de transfección de células 72 h después de la transfección (n = 3 por grupo; CN, control negativo; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P< 0,001).
La Figura 39 es un gráfico que representa actividad luciferasa en células SaOS2 cotransfectadas con oligonucleótidos de miR-133a e indicadores de luciferasa para los genes diana de miR-133a potenciales indicados.
La Figura 40 es un gráfico que representa la correlación inversa entre la expresión de CD133 (CD133alto frente a CD133bajo) y ARN mensajero (ARNm) para las dianas indicadas de miR-133a, medida por reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR).
La Figura 41 es un gráfico que representa expresión reducida del ARN mensajero (ARNm) para los genes diana de miR-133a indicados en células SaOS2 CS133bajo 48 h después de la transfección de oligonucleótidos de miR-133a en comparación con oligonucleótidos de miR-CN (control negativo), medida por reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR).
La Figura 42 es un gráfico que representa expresión aumentada de ARN mensajero (ARNm) para SGMS2 en tumores 143B-/uc de ratones tratados con LNA-133a (**P < 0,01).
La Figura 43 es una serie de seis gráficos que representan la supervivencia sin metástasis de pacientes con osteosarcoma en los que se han detectado genes diana de miR-133a SGMS2, UBA2, SNX30, DUSP11, MAST4 y ANXA2, respectivamente. La baja expresión de las dianas directas de miR-133a (excepto para DUSP11) se correlacionó significativamente con un mal pronóstico (análisis de Kaplan-Meier y prueba de rangos logarítmicos; valores de p como se muestra).
Descripción detallada de la invención
Desde la propuesta de la hipótesis de las células madre del cáncer (CSC), se han realizado varios estudios para identificar células madre cancerosas de osteosarcoma. Estas células se han detectado en clones esféricos en condiciones de cultivo independientes de anclaje, privadas de suero, como células de la población lateral (SP) basándose en el flujo de salida del colorante Hoechst 33342 o como células CD117 y stro-1 clasificadas utilizando un marcador de superficie celular. En vista de estos modelos, los inventores identificaron que Prominina-1, el homólogo de ratón de CD133 humano, está muy expresada en una pequeña fracción de células de osteosarcoma. Las células de esta fracción de CD133alto formaron esferas agrupadas en un entorno independiente del anclaje, mostraron potencial de autorrenovación y diferenciación, expresaron marcadores asociados con células madre y mostraron más potencial invasivo en comparación con la fracción de CD133bajo.
Tras la caracterización del fenotipo de CSC de osteosarcoma, los inventores perfilaron la expresión de varios miARN, que distinguen células de la fracción de CD133alto de su descendencia más diferenciada. Entre estos miARN, se encontró que miR-1, miR-1 Ob, miR-133a estaban regulados positivamente en la fracción de CD133alto en comparación con la fracción de CD133bajo de las células del osteosarcoma. Notablemente, los inventores han descubierto que estos miARN promueven la quimiorresistencia y la invasividad de las células del osteosarcoma. Estas observaciones sugieren que miR-1, miR-1 Ob y miR-133a son reguladores de las células madre cancerosas del osteosarcoma. Particularmente en combinación con un sistema de administración de fármacos a medida, nuevos agentes terapéuticos (por ejemplo, nucleótidos antisentido) dirigidos a los miARN son muy prometedores contra el osteosarcoma, añadiéndose a agentes quimioterapéuticos convencionales, tales como metotrexato, cisplatino y doxorrubicina.
Aunque no se utilizan actualmente miARN como productos terapéuticos contra el cáncer o como dianas validadas para productos terapéuticos contra el cáncer, estudios in vivo exitosos apoyan la idea de que podrían utilizarse como productos terapéuticos innovadores para abordar las necesidades no satisfechas. La administración sistémica de anti-miR-10b en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama mostró una reducción significativa en el número y tamaño de las metástasis pulmonares, sin ningún efecto evidente sobre los tumores primarios. Ma et al. (2010) Nat Biotechnol 28: 341-7. Por otra parte, el reciente descubrimiento de miARN como nuevos biomarcadores en suero o plasma representa un nuevo enfoque para la exploración de diagnóstico en sangre. Brase et al. (2010) Mol Cancer 9: 306. Los miARN identificados de acuerdo con la presente invención también tienen potencial como biomarcadores que pueden usarse para una evaluación rápida de la sensibilidad a productos quimioterapéuticas, detección precoz de recidiva local o metástasis a distancia, todos los cuales son factores que afectan al pronóstico para los pacientes con osteosarcoma.
Un aspecto de la invención es una cantidad eficaz de una molécula antisentido específica para un microARN (miARN) seleccionado de miR-1, miR-10b y miR-133a para su uso en el tratamiento del osteosarcoma en un sujeto que lo necesite.
Como se usan en el presente documento, los términos "tratando" y "tratar" se refieren a mejorar o curar una enfermedad o afección indeseable. Por ejemplo, tratar osteosarcoma se refiere a reducir o eliminar la carga de células de osteosarcoma en un sujeto que tiene osteosarcoma.
Un "sujeto" como se usa en el presente documento se refiere a un mamífero. En una realización, un sujeto es un ser humano.
Una cantidad efectiva de una molécula antisentido específica para un microARN se administra al sujeto que necesita tratamiento. Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que es suficiente para lograr un resultado biológico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz para tratar un osteosarcoma es una cantidad suficiente para reducir o eliminar la población de células de osteosarcoma en un sujeto que tiene osteosarcoma. Una cantidad eficaz puede variar dependiendo de factores tales como el tamaño del tumor, el tamaño del sujeto, la condición general del sujeto, la vía de administración, la identidad del agente activo, la composición o formulación del agente activo, y otros factores bien conocidos en las técnicas médicas y farmacéuticas.
Sin pretender quedar ligado a ninguna dosis particular, una cantidad eficaz puede, en general, variar de 0,01 microgramos (ug)/kg de peso corporal a 1000 mg/kg de peso corporal de agente activo por día cuando se administra por vía parenteral de administración. Para la administración oral o entérica, una cantidad eficaz puede, en general, variar de 0,1 pg/kg de peso corporal a 10.000 mg/kg de peso corporal de agente activo por día. Se puede determinar una cantidad eficaz, por ejemplo, basándose en estudios in vitro y estudios in vivo en animales, así como estudios clínicos.
Los microARN (miARN) son ARN no codificantes cortos (20-24 nt) que están implicados en la regulación postranscripcional de la expresión génica en organismos multicelulares al afectar tanto a la estabilidad como a la traducción de ARNm. Los miARN se transcriben mediante ARN polimerasa II como parte de transcritos primarios con caperuza y poliadenilados (pri-miARN) que pueden ser codificantes o no codificantes de proteínas. El transcrito primario se escinde mediante la enzima ribonucleasa III Drosha para producir un miARN precursor (pre-miARN) de tallo-bucle de aproximadamente 70 nt, que se escinde adicionalmente mediante la ribonucleasa Dicer citoplásmica para generar los productos de miARN maduro y miARN* antisentido (miARN*). El miARN maduro se incorpora en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que reconoce ARN mensajeros (ARNm) diana a través de la formación de pares de bases imperfectas con el miARN y con mayor frecuencia da como resultado inhibición de la traducción o desestabilización del ARNm diana.
El miARN se puede seleccionar de miR-1, miR-10b y miR-133a. En una realización, el miARN es miR-1. En una realización, el miARN es miR-10b. En una realización, el miARN es miR-133a. Aunque estos miARN se han descrito en la técnica, antes de la presente invención no se reconocía ni se esperaba que estos miARN particulares estuvieran o pudieran estar asociados con osteosarcoma, incluyendo, en particular, fenotipos resistentes a fármacos y/o agresivamente invasivos o metastásicos de osteosarcoma.
miR-1 se ha descrito como un miARN de 22 nucleótidos de longitud que tiene la secuencia 5'-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3' (SEQ ID NO: 1).
miR-10b se ha descrito como un miARN de 23 nucleótidos de longitud que tiene la secuencia 5'-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3' (SEQ ID NO: 2).
miR-133a se ha descrito como un miARN de 22 nucleótidos de longitud que tiene la secuencia 5'-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3' (SEQ ID NO: 3).
El antisentido está bien descrito en la bibliografía. En general, los agentes antisentido son moléculas basadas en ácido nucleico que tienen una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la secuencia de una molécula de ácido nucleico diana, por lo que la asociación entre la molécula antisentido y su molécula de secuencia diana da como resultado una cantidad reducida de expresión de la molécula de ácido nucleico diana.
En una realización, la molécula antisentido (anti-miARN) es un ARN estabilizado, es decir, un ARN que, en comparación con ARN de origen natural, es relativamente resistente a la degradación mediada por nucleasa in vitro o in vivo. Se conocen numerosas formas de ácidos nucleicos estabilizados, incluyendo ARN. Algunos ARN estabilizados incluyen extremos poli A 3'-terminales. Se han descrito bien formas químicamente modificadas de ácidos nucleicos, incluyendo, por ejemplo y sin limitación, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos con cadena principal de fosforotioato modificada y ácidos nucleicos de 2'-O-metilo (2'-OMe) y no requieren más descripción aquí. Krutzfeldt et al. (2005) Nature 438:685-9; Ma et al. (2010) Nat Biotechnol 28:341-7.
En una realización, la molécula antisentido es un oligonucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA). Un nucleótido de ácido nucleico bloqueado es un ribonucleótido modificado. El resto de ribosa de un nucleótido de LNA se modifica con un enlace adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4'. El enlace "bloquea" la ribosa en la conformación 3'-endo. Los nucleótidos de LNA fueron desarrollados por primera vez por Imanishi y colaboradores y Wengel y colaboradores. Obika et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38: 8735-8; Koshkin et al. (1998) Tetrahedron 54: 3607-30.
Un oligonucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA) es un polímero de nucleótidos, al menos uno de los cuales es un nucleótido de LNA. Cualquier nucleótido no LNA en un oligonucleótido de LNA puede ser un ribonucleótido o desoxirribonucleótido de origen natural o modificado, o un análogo del mismo, siempre que el oligonucleótido de LNA sea funcional como una molécula antisentido con respecto a su diana prevista. En una realización, cualquier nucleótido no LNA en un oligonucleótido de LNA es un desoxirribonucleótido y al menos el nucleótido 3' terminal es un nucleótido de LNA. En una realización, cualquier nucleótido no LNA en un oligonucleótido de LNA es un desoxirribonucleótido de origen natural y al menos los dos nucleótidos 3' terminales son nucleótidos de LNA. En una realización, un oligonucleótido de LNA se compone exclusivamente de nucleótidos de LNA.
En una realización, la molécula antisentido es ADN.
En una realización, una molécula antisentido específica para miR-1 comprende una secuencia 5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4).
En una realización, la secuencia de una molécula antisentido específica para miR-1 es 5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4).
En una realización, una molécula antisentido específica para miR-10b comprende una secuencia 5'-ACAAATTCGGTTCTACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5).
En una realización, la secuencia de una molécula antisentido específica para miR-10b es 5'-ACAAATTCGGTTCTACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5).
En una realización, una molécula antisentido específica para miR-133a comprende una secuencia 5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6).
En una realización, la secuencia de una molécula antisentido específica para miR-133a es 5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6).
En una realización, una molécula antisentido específica para miR-1 comprende una secuencia 5'-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7).
En una realización, la secuencia de una molécula antisentido específica para miR-1 es 5'-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7).
En una realización, una molécula antisentido específica para miR-10b comprende una secuencia 5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8).
En una realización, la secuencia de una molécula antisentido específica para miR-10b es 5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8).
En una realización, una molécula antisentido específica para miR-133a comprende una secuencia 5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9).
En una realización, la secuencia de una molécula antisentido específica para miR-133a es 5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9).
En una realización, una molécula antisentido específica para miR-1 comprende una secuencia 5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10).
En una realización, la secuencia de una molécula antisentido específica para miR-1 es 5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10).
En una realización, una molécula antisentido específica para miR-10b comprende una secuencia 5'-CACAAATTCGGTTCTACAGGGTA-3' (SEQ ID NO: 11).
En una realización, la secuencia de una molécula antisentido específica para miR-10b es 5'-CACAAATTCGGTT CT ACAGGGT A-3' (SEQ ID NO: 11).
En una realización, una molécula antisentido específica para miR-133a comprende una secuencia 5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12).
En una realización, la secuencia de una molécula antisentido específica para miR-133a es 5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12).
La invención abarca además moléculas antisentido de 20 a 30 nucleótidos de longitud que comprenden una secuencia contigua que es al menos el 90 por ciento idéntica a una cualquiera de las secuencias de moléculas antisentido anteriores. Debe entenderse que tales moléculas antisentido son capaces de hibridar específicamente con o atenuar la expresión de los miARN a los que están dirigidos.
La invención abarca además moléculas antisentido de 21 a 30 nucleótidos de longitud que comprenden una secuencia contigua que es al menos el 95 por ciento idéntica a una cualquiera de las secuencias de moléculas antisentido anteriores. Debe entenderse que tales moléculas antisentido son capaces de hibridar específicamente con o atenuar la expresión de los miARN a los que están dirigidos.
En cada una de las realizaciones anteriores, en una realización, la molécula antisentido incluye uno o más nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA). Asimismo, en una realización, la molécula antisentido está compuesta exclusivamente por nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA).
En una realización, la molécula antisentido específica para un microARN particular está asociada con un vehículo de suministro de ácido nucleico. Como se usa en el presente documento, un "vehículo de suministro de ácido nucleico" se refiere a un vector biológicamente compatible útil para administrar una molécula de ácido nucleico al citoplasma de una célula. La molécula antisentido puede conjugarse con el vehículo de suministro de ácido nucleico. Como alternativa o además, la molécula antisentido puede estar encapsulada por el vehículo de suministro de ácido nucleico. Los ejemplos de vehículos de suministro de ácido nucleico adecuados incluyen liposomas, lípidos, colesterol, hormonas y otras moléculas de dirección. Con respecto a los liposomas, la molécula antisentido puede estar asociada con la superficie externa del liposoma, el interior del liposoma o tanto el exterior como el interior del liposoma.
En una realización, el osteosarcoma es osteosarcoma localizado, por ejemplo, osteosarcoma que está limitado a una extremidad o un hueso.
En una realización, el osteosarcoma es osteosarcoma metastásico.
Un aspecto de la invención es un método para evaluar la resistencia del osteosarcoma a una terapia antineoplásica en una muestra de tejido que comprende células de osteosarcoma. El método incluye las etapas de
aislar de la muestra células que expresan CD133;
medir un primer nivel de expresión por las células que expresan CD133 de al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a;
poner en contacto las células que expresan CD133 con una terapia antineoplásica; y
medir un segundo nivel de expresión por las células que expresan CD133 del al menos un miARN, en donde un segundo nivel de expresión mayor que el primer nivel de expresión indica que el osteosarcoma es resistente a la terapia antineoplásica.
Pueden aislarse células que expresan CD133 de una muestra de tejido usando cualquier medio adecuado. Por ejemplo, se puede preparar una suspensión celular a partir del tejido y después las células pueden someterse a inmunocromatografía con, por ejemplo, perlas magnéticas cargadas con anticuerpo anti-CD133, o por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) usando un anticuerpo anti-CD133 marcado de forma apropiada. Están disponibles en el mercado anticuerpos monoclonales anti-CD133 humano de varios proveedores.
Se puede realizar un nivel de expresión de un miARN utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, el nivel de expresión puede determinarse utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) utilizando cebadores oligonucleotídicos seleccionados de forma apropiada.
Como alternativa o además, el nivel de expresión puede determinarse usando transferencia Northern con una sonda de hibridación seleccionada y marcada de manera apropiada.
Como se usa en el presente documento, una "terapia antineoplásica" se refiere a cualquier modalidad de tratamiento útil para tratar un cáncer. Dichas modalidades incluyen, en general, quimioterapia, radioterapia de haz externo, inmunoterapia, terapia hormonal y combinaciones de las mismas.
Son agentes quimioterapéuticos moléculas pequeñas (peso molecular inferior a aproximadamente 1 kDa) que son bien conocidas en la técnica médica. Los agentes quimioterapéuticos usados habitualmente para el osteosarcoma incluyen cisplatino (cis-diaminodicloroplatino (II), también conocido como CDDP y cisplatino, disponible en el mercado como Platinol y Platinol-AQ), doxorrubicina (también conocida como hidroxidaunorrubicina, disponible en el mercado como Adriamicina) y metotrexato (también conocido como ametopterina). En una realización, la terapia antineoplásica se selecciona de cisplatino, doxorrubicina, metotrexato y cualquier combinación de los mismos. Se pueden usar dos o más de estos agentes en combinación, ya sea simultánea o secuencialmente. Además, puede usarse una cualquiera o una combinación de dichas terapias antineoplásicas en combinación con otra modalidad antineoplásica, por ejemplo, radioterapia de haz externo.
En diversas realizaciones, el osteosarcoma se identifica como resistente a la terapia antineoplásica cuando el segundo nivel de expresión de al menos uno de miR-1, miR-10b y miR-133a es objetivamente mayor que el primer nivel de expresión. En diversas realizaciones, el osteosarcoma se identifica como resistente a la terapia antineoplásica cuando el segundo nivel de expresión de al menos uno de miR-1, miR-10b y miR-133a es al menos 10 por ciento, al menos 20 por ciento, al menos 30 por ciento, al menos 40 por ciento, al menos 50 por ciento, al menos 60 por ciento, al menos 70 por ciento, al menos 80 por ciento, al menos 90 por ciento o al menos 100 por ciento mayor que el primer nivel de expresión.
En una realización, el método comprende además la etapa de ajustar la dosis o cambiar la terapia antineoplásica cuando se encuentra que el osteosarcoma es resistente a la terapia antineoplásica. Por ejemplo, cuando se encuentra que el osteosarcoma es resistente a la terapia antineoplásica, la terapia antineoplásica se puede complementar con o cambiar a otra terapia antineoplásica adecuada.
Un aspecto de la invención es un método de detección del osteosarcoma en una muestra de tejido obtenida de un sujeto. El método incluye la etapa de realizar en una muestra de tejido obtenida de un sujeto un ensayo específicamente capaz de detectar al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a, en donde la detección por el ensayo de la presencia en la muestra del al menos un miARN indica que el sujeto está en riesgo de tener osteosarcoma. En una realización, el miARN es miR-1. En una realización, el miARN es miR-10b. En una realización, el miARN es miR-133a. En una realización, el al menos un miARN es cualquier combinación de miR-1, miR-10b y miR-133a.
Un ensayo específicamente capaz de detectar al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a puede ser, por ejemplo, RT-PCR que utiliza cebadores oligonucleotídicos seleccionados de forma apropiada. Como alternativa o además, el ensayo puede ser transferencia Northern con una sonda de hibridación marcada y seleccionada de forma apropiada.
En una realización, el tejido es sangre. En una realización, el tejido es suero. En una realización, el tejido es plasma.
En una realización, el método incluye además la etapa de verificar la presencia de osteosarcoma, usando cualquier método adecuado, cuando se determina que el sujeto está en riesgo de tener osteosarcoma. Por ejemplo, la verificación de la presencia de osteosarcoma puede incluir la realización de un estudio esquelético o un análisis específico de captura de imágenes óseas usando rayos X u otra técnica adecuada de captura de imágenes óseas, captura de imágenes mediante resonancia magnética (IRM), tomografía computarizada (TC), biopsia y cualquier combinación de los mismos.
Tras un método de selección, un sujeto puede ser tratado de osteosarcoma.
Un aspecto de la invención es un método para controlar el osteosarcoma en una muestra de tejido obtenida de un sujeto que tiene osteosarcoma o que ha sido tratado de osteosarcoma, comprendiendo el método (a) realizar un ensayo específicamente capaz de cuantificar el nivel de expresión de al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a; y
(b) repetir la etapa (a) en una muestra de tejido obtenida posteriormente del sujeto, en donde un nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida posteriormente mayor que el nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida anteriormente indica que el osteosarcoma es progresivo y un nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida posteriormente menor que el nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida anteriormente indica que el osteosarcoma es regresivo.
Un ensayo específicamente capaz de cuantificar el nivel de expresión de al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a puede ser, por ejemplo, RT-PCR que utiliza cebadores oligonucleotídicos seleccionados de forma apropiada.
En una realización, el tejido es sangre. En una realización, el tejido es suero. En una realización, el tejido es plasma.
La dosis de la terapia antineoplásica se puede ajustar o cambiar cuando se encuentra que el osteosarcoma es progresivo. Por ejemplo, cuando se encuentra que el osteosarcoma es progresivo, la terapia antineoplásica se puede complementar con o cambiar a otra terapia antineoplásica adecuada.
La dosis se puede ajustar o cambiar cuando se encuentra que el osteosarcoma es regresivo. Por ejemplo, cuando se encuentra que el osteosarcoma es regresivo, la terapia antineoplásica puede reducirse o incluso suspenderse, o la terapia antineoplásica puede cambiarse a otra terapia antineoplásica adecuada.
La invención, habiendo sido ahora divulgada en general, se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Métodos generales
Purificación de células de osteosarcoma a partir de muestras clínicas nuevas. Se obtuvieron muestras nuevas de osteosarcoma humano de acuerdo con los principios éticos del comité institucional sobre experimentación humana de dos pacientes a los que se les realizó una biopsia incisional de diagnóstico en los sitios primarios de osteosarcoma antes de la quimioterapia neoadyuvante en el Hospital del Centro Nacional del Cáncer de Japón entre octubre de 2010 y junio de 2011. El diagnóstico de osteosarcoma y los subtipos histológicos fueron determinados por patólogos certificados. Se obtuvieron muestras quirúrgicas en el momento de la resección y se recibieron en el laboratorio en 10 minutos, inmediatamente se desagregaron mecánicamente y se digirieron con colagenasa y (gelatina Nitta) y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces. Se obtuvieron suspensiones unicelulares por filtración a través de un filtro de 70 pm (BD Biosciences), las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) que contenía suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10 % (Gibco BRL) y penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml) con CO2 al 5 % en una incubadora humidificada a 37 ° C.
Células y cultivo celular. La línea celular Hu09 de osteosarcoma humano se estableció previamente en el laboratorio del solicitante. Las líneas celulares de osteosarcoma humano SaOS2, U2OS, MG63, Ho S, MNNG/HOS y 143B se adquirieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). La línea celular de riñón embrionario transformado 293 también se obtuvo de la ATCC. Las células SaoS2 y Hu09 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco BRL). Las células U2OS, MG63, HOS, MNNG/HOS, 143B y 293 se cultivaron en DMEM (Invitrogen). Todos los medios se complementaron con un FBS inactivado por calor al 10 % (Gibco BRL) y penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml). Las células se mantuvieron en CO2 al 5 % en un incubador humidificado a 37 °C.
Clasificación celular y citometría de flujo. Se realizó clasificación celular por citometría de flujo en líneas celulares de osteosarcoma y muestras clínicas utilizando anti-CD133/2 humano monoclonal de ratón conjugado con ficoeritrina (PE) (293C3, Miltenyi Biotec) y anti-CD44 humano monoclonal de ratón conjugado con aloficocianina (APC) (eBioscience). lgGlK-PE de ratón de control de isotipo (eBioscience) actuó como control. Las muestras se analizaron y clasificaron en el clasificador celular JSAN (Baybioscience) y el BD FACS Ariall (BD Biosciences). La viabilidad se evaluó utilizando la exclusión de azul de tripano. Los resultados se analizaron con el software FlowJo (Tree Star).
Ensayo de proliferación celular y citotoxicidad. Las tasas de proliferación celular y la viabilidad celular como un indicador de la sensibilidad relativa de las células a doxorrubicina, cisplatino y metotrexato se determinaron utilizando el sistema de ensayo de proliferación celular TetraColor ON E (Seikagaku) según las instrucciones del fabricante. Se sembraron células que crecieron en la fase logarítmica en placas de 96 pocillos (5 x 103/pocillo), se permitió que se unieran durante una noche y después se trataron con dosis variables de doxorrubicina (Sigma), cisplatino (Alexis) y metotrexato (Sigma) durante 72 h. Se utilizaron pocillos por triplicado para cada grupo de tratamiento. La absorbancia se midió a 450 nm con una longitud de onda de referencia a 650 nm en EnVision (Wallac). El número relativo de células viables se expresó como el porcentaje de viabilidad celular.
Formación de esferas. Se sembraron células de osteosarcoma en placas a 5.000-10.000 células/pocillo en 300 pl de medio DMEM/F12 sin suero (Invitrogen), complementado con factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF) 20 ng/ml (Sigma-Aldrich), factor de crecimiento de fibroblastos básicos recombinantes humanos (bFGF) 10 ng/ml (Invitrogen), insulina 4 pg/ml (Sigma-Aldrich), B-27® (1:50; Invitrogen), penicilina 500 unidades/ml (Invitrogen) y estreptomicina 500 pg/ml (invitrogen). Las células se cultivaron en suspensión en placas de fijación ultra baja de 24 pocillos (Corning). Las células se abastecieron con 30 pl de medio complementado cada dos días. Las esferas se contaron el día 5 en pocillos por triplicado. Se llevó a cabo cultivo celular a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %.
Ensayo de invasión. Se realizaron ensayos de invasión utilizando cámaras de invasión BD BioCoat de 24 pocillos con Matrigel (Becton-Dickinson). Se añadieron 1 x 105 células, suspendidas en 500 pl de medio DMEM o RPM11640 sin FBS, a la cámara superior y se añadió medio DMEM o RPMI 1640 con FBS al 10 % a la cámara inferior. Después de incubación durante 24 horas o 36 horas, las células en la superficie superior del filtro se retiraron por completo frotándolas con hisopos de algodón. Los filtros se fijaron en metanol y se tiñeron con azul de toluidina al 1% en tetraborato de sodio al 1% (Sysmex). Después, los filtros se montaron en portaobjetos y se contaron las células en las superficies inferiores. Cada ensayo se realizó por triplicado.
Perfil de miARN. El perfil de expresión de miARN se realizó utilizando micromatrices de miARN fabricadas por Agilent Technologies (Santa Clara, CA), conteniendo cada una 866 miARN humanos (Agilent Technologies [http://www.chem.agilent.com/scripts/PHome.asp]). Se usaron tres muestras de ARN extraídas de forma independiente de células de CD133alto y CD133bajo justo después del aislamiento para análisis de matrices en cada línea celular. Se realizaron marcaje e hibridación de muestras de ARN total según el protocolo del fabricante. Los resultados de las micromatrices se extrajeron usando el software Agilent Feature Extraction (v10.7.3.1) y se analizaron usando el software GeneSpring Gx 11.0.2 (Agilent Technologies).
Muestras clínicas para estudios de correlación de supervivencia de CD133, miR-133a y dianas de miR-133a. Se obtuvieron muestras de tejido de osteosarcoma mediante biopsia incisional de diagnóstico en los sitios primarios de osteosarcoma antes de la quimioterapia neoadyuvante en el Hospital del Centro Nacional del Cáncer de Japón entre junio de 1997 y septiembre de 2010. Se excluyeron los pacientes mayores de 40 años y con tumores primarios ubicados fuera de las extremidades. Cada muestra de tumor nueva se cortó en dos trozos, uno de los cuales se crioconservó inmediatamente en nitrógeno líquido y el otro se fijó con formalina. El diagnóstico de osteosarcoma y los subtipos histológicos fueron determinados por patólogos certificados. Solo se incluyeron muestras de osteosarcoma con los subtipos histológicos osteoblástico, condroblástico, fibroblástico y telangiectásico. La respuesta a la quimioterapia se clasificó como buena si el grado de necrosis tumoral era del 90 % o mayor. Para los estudios de correlación de supervivencia de CD133 y las dianas de miR-133a, se utilizaron 35 muestras de ADNc disponibles de la biblioteca de ADNc, mientras que se utilizó ARN de 48 muestras fijadas en formalina, incluidas en parafina (FFPE) disponibles para el estudio de correlación de miR-133a. La información clínica de los pacientes se incluye en las Tablas 7 y 10 (posteriormente). Todos los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito que autoriza la recogida y el uso de sus muestras para fines de investigación. El protocolo de estudio para obtener información clínica y recoger muestras fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Nacional del Cáncer de Japón.
Aislamiento de RNA y RT-PCR cuantitativa en tiempo real de ARNm y miARN. Se purificó ARN total a partir de células y tejidos tumorales con un Mini Kit RNeasy y un conjunto de DNasa sin RNasa (QIAGEN). Para reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de ARNm, se sintetizó ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). Para cada reacción de qPCR, se mezclaron cantidades iguales de ADNc con Platinum SYBER Green qPCRSuperMix (Invitrogen) y cebadores específicos (Tabla 1). Los niveles de expresión génica se normalizaron por beta actina (ACTB) o gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Para qPCR de miARN, se convirtió miARN en ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de microARN de TaqMan (Applied Biosystems). Se amplificó ARN nuclear pequeño de RNU6B como control interno. Se realizó qPCR utilizando cada sonda específica de miARN incluida con el ensayo de microARN de TaqMan en un sistema de PCR en tiempo real 7300 y software SDS (Applied Biosystems).
Tabla 1. Secuencias de cebadores para análisis de RT-PCR en tiempo real.
Gen Dir/Inv Secuencia (5'-Secuencia-3') SEQ ID NO:
CD133 Dir GGACCCATTGGCATTCTC 13
Inv CAG G ACACAG CAT AG AAT AAT C 14
Oct3/4 Dir AGTGAGAGGCAACCTGGAGA 15
Inv ACACTCGGACCACATCCTTC 16
Nanog Dir CAGTCTGGACACTGGCTGAA 17
Inv CTCGCTGATTAGGCTCCAAC 18
Sox2 Dir TGGTACGGTAGGAGCTTTGC 19
Inv TTTTTCGTCGCTTGGAGACT 20
ABCB1 Dir CATGCTCCCAGGCTGTTTAT 21
Inv GTAACTTGGCAGTTTCAGTG 22
AGCG2 Dir TGCAACATGTACTGGCGAAGA 23
Inv TCTTCCACAAGCCCCAGG 24
ABCC2 Dir ACAGAG GCTGGTGG CAACC 25
Inv ACCATTACCTTGTCACTGTCCATGA 26
ezrina Dir CGGGACAAGTACAAGGCACTGCGGCAGATCCGG 27
Inv CCGGATCTGCCGCAGTGCCTTGTACTTCCG 28
integrina p4 Dir T GACGAT CTGGACAACCTCAAGCA 29
Inv ATCCAATGGTGTAGTCGCTGGTGA 30
MMP13 Dir GATACGTTCTTACAGAAGGC 31
Inv ACCCATCTGG C AAAAT AAAC 32
CXCR4 Dir GGAGGGGATCAGTATATACA 33
Inv GAAGATGATGGAGTAGATGG 34
SGMS2 Dir CAATTCCTT GCTGCTTCTCC 35
Inv GCCTTTGTTTTGCTCCTCAG 36
UBA2 Dir AAAAAGGGT GT GACCGAGTG 37
Inv GCATCTTCTTCCCCAAACAA 38
SNX30 Dir CCT GAACGCCT ACAAGAAGC 39
Inv ATGGTTCCCAGTTTGAGTGC 40 DOLPP1 Dir GAGAGGAGTGAGGCAACAGG 41
Inv ACCCCAGACACAGGTTT GAG 42 DUSP11 Dir G AG ACG CG ACTTTT CAG G AC 43
Inv GATCCAAAGGGGAAAAGCAT 44
CUL4B Dir GTTCTGGCGAAAAATCCAAA 45
Inv TCGAACAATTG CAGCATCA 46
ROD1 Dir CATTCCTGGGGCTAGTGGTA 47
Inv CCAT CT GAACCAAGGCATTT 48
ZNF701 Dir ATCCCGTGGAGTGAAGGTC 49
Inv T CTCCAGCAT CACGTCT CT G 50
MAST4 Dir AG C C CATTTTT CATTTGCAC 51
Inv TCGTCTGGTGTTGGTTGGTA 52
ANXA2 Dir CCT GAGCGTCCAGAAATGG 53
Inv GGACTGTTATTCGCAAGCTGGTT 54
ACTB Dir CAT GAAGT GT GACGTGGACA 55
Inv CACGGAGTACTTGCGCTCAG 56
GAPDH Dir GACTTCAACAGCGACACCC 57
Inv GCCAAATTCGTTGTCATACCA 58
Transfección con miARN sintéticos, LNA y ARNip. Hsa-miR sintéticos (Pre-miR-hsa-miR-1, -10b, -133a y control negativo (CN; Applied Biosystems, Tabla 2) y ácidos nucleicos bloqueados (LNA) (LNA-1, -10b, -133a y control negativo, Exiqon, Tabla 3) se transfectaron en cada tipo de células a 30 nM cada una (concentración final) utilizando DharmaFECT 1 (GE Healthcare). Se transfectaron ARNip sintéticos (Bonac corporation, Tabla 4) en cada tipo de células a 100 nM cada una (concentración final) utilizando DharmaFECT 1 (GE Healthcare). Después de 24 horas de incubación, las células se trataron con agentes quimioterapéuticos para ensayo de citotoxicidad o se volvieron a sembrar en cámaras de invasión para el ensayo de invasión.
Tabla 2. Secuencias de productos de miARN
miARN Con sentido/Antisentido Secuencia (5'-Secuencia-3') SEQ ID NO:
hsa-miR-1-2 Con sentido UGGAAUGUAAAGAAGUAUUGUAU 1
Antisentido UACAUACUUCUUAUGUACCC 59
hsa-miR-10b Con sentido UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG 2
Antisentido ACAGAUUCGAUUCUAGGGGAAU 60
hsa-miR-133a-1 Con sentido UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG 3
Antisentido AGCUGGUAAAAUGGAACCAAAU 61
Tabla 3. Secuencias de productos de LNA
miARN_________Secuencia (5'-Secuencia-3')_____ SEQ ID NO:
hsa-miR-1-2 ACATACTT CTTT ACATTCCA 10
hsa-miR-10b ACAAATTCGGTTCTACAGGGT 11
hsa-miR-133a-1 CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA 12
Tabla 4. Secuencias de ARNip
Gen_____Con sentido/Antisentido Secuencia (5'-Secuencia-3') SEQ ID NO:
SGMS2 Con sentido CCACUAGAGUGGUGGAAAAdTdT 62
Antisentido UUUUCCACCACUCUAGUGGdTdT 63
UBA2 Con sentido GGACUGGGCUGAAGUACAAdTdT 64
Antisentido UUGUACUUCAGCCCAGUCCdTdT 65
SNX30 Con sentido CCGAGAAGUUUGUGGUAAAdTdT 66
Antisentido UUUACCACAAACUUCUCGGdTdT 67
DOLPP Con sentido CUUCCUAAUCCGAGACACAdTdT 68
Antisentido UGUGUCUCGGAUUAGGAAGdTdT 69
DUSP11 Con sentido CCAGAGGAUUUGCCAGAAAdTdT 70
Antisentido UGUGUCUCGGAUUAGGAAGdTdT 71
CUL4B Con sentido GGUGAACACUUAACAGCAAdTdT 72
Antisentido UUGCUGUUAAGUGUUCACCdTdT 73
ROD1 Con sentido GGGAAUGACAGCAAGAAAUdTdT 74
Antisentido AUUUCUUGCUGUCAUUCCCdTdT 75
ZNF701 Con sentido CCAUAAUGAAGGAGGUCUUdTdT 76
Antisentido AAGACCUCCUUCAUUAUGGdTdT 77
ANXA2 Con sentido UGACCAAGAUGCUCGGGAUdTdT 78
Antisentido AUCCCGAGCAUCUUGGUCAdTdT 79
MAST4 Con sentido GGAGGUACCUUCUUCCAAAdTdT 80
Antisentido UAUCAAACUUCCUCUUCUGdTdT 81
Establecimiento de línea celular que expresa de forma estable miR-133a. Se construyeron vectores de miR-133a insertando secuencias de clonación que incluyen la longitud completa de las secuencias de microARN maduras en el vector pIRES-hyg (Clontech). Los vectores de microARN y control se transfectaron en células HOS CD133bajo de osteosarcoma recién aisladas mediante co-precipitación con fosfato de calcio. Los transfectantes se dividieron y se cultivaron en medio selectivo con 200 |jg/ml de higromicina. Se seleccionaron colonias resistentes a higromicina y se expandieron en un medio que contenía higromicina 200 jg/ml. Las secuencias de construcciones de miR-133a se confirmaron mediante secuenciación de ADN (secuenciador ABI 3130, Applied Biosystems) y se confirmó la sobreexpresión de microARN mediante qRT-PCR. RNU6B actuó como el control endógeno.
Experimentos de trasplante de tumores. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Instituto de Investigación en Animales de Laboratorio, Instituto de Investigación del Centro Nacional del Cáncer. Se obtuvieron ratones desnudos o ratones NOD/SCID (CLEA Japón) a las 4 semanas de edad y se les dio al menos 1 semana para adaptarse a su nuevo entorno antes del trasplante de tumor. El día 0, los ratones se anestesiaron con isoflurano al 3% y la pierna derecha se desinfectó con etanol al 70 %. Las células se aspiraron en una jeringa de tuberculina de 1 ml equipada con una aguja 27-G. La aguja se insertó a través de la corteza de la tuberosidad anterior de la tibia con un movimiento rotatorio para evitar la fractura cortical. Una vez que se atravesó el hueso, la aguja se insertó aún más para fracturar la corteza posterior de la tibia. Se inyectó un volumen de 100 ^l de solución que contenía HOS-Luc CD133alto y CD133bajo (102, 103, 104, 105 células por sitio) o 143B-Luc (1,5 x 106) recién aisladas mientras se movía lentamente hacia atrás la aguja.
Supervisión del crecimiento del tumor, metástasis pulmonar y toxicidad con/sin LNA-anti-miR-133a. Para la evaluación de la tumorigenicidad entre células HOS-Luc CD133alto y CD133bajo, Se inyectó a ratones NOD/SCID D-luciferina (150 mg/kg, Promega) mediante inyección intraperitoneal. Diez minutos después, los fotones de luciferasa de luciérnaga se contaron utilizando el sistema de captura de imágenes IVIS (Xenogen Corp.) según las instrucciones del fabricante. Cada condición experimental incluía 5 animales por grupo y supervisión una vez a la semana. Para la evaluación de la administración de LNA-anti-miR-133a en metástasis pulmonar espontánea de ratones modelo de osteosarcoma, se inyectaron a ratones individuales 10 mg/kg de LNA-anti-miR-133a o solución salina a través de la vena de la cola. Se inyectaron LNA los siguientes días 4, 11, 18, 25 y 32 después de la inoculación de células 143B-Luc. Cada condición experimental incluía 10 animales por grupo. El desarrollo de metástasis pulmonar posterior se supervisó una vez a la semana in vivo mediante la captura de imágenes bioluminiscentes descrita anteriormente durante 5 semanas. Todos los datos se analizaron utilizando el software Livinglmage (versión 2.50, Xenogen). El día 36, el tumor primario y el pulmón en 5 ratones de cada grupo se resecaron en la necropsia por los análisis del peso, bioluminiscente e histológico. Se realizaron el examen de sangre, peso del cuerpo completo, así como examen histopatológico del corazón, del hígado y del músculo esquelético para evaluar la toxicidad. Los ratones restantes se observaron durante su periodo de supervivencia.
Recogida e identificación exhaustivas de ARNm diana de miR-133a. Para recoger dianas cadena abajo exhaustivas de miR-133a, se realizaron perfiles de micromatrices de ADNc a partir de dos enfoques experimentales. En primer lugar, se recogieron genes candidatos de un análisis de micromatrices de ADNc realizado a partir del ARN total recogido de células SaOS2 CD133bajo transducidas con miR-133a o control negativo (CN). En segundo lugar, se realizó análisis de micromatrices de ADNc a partir de ARN total de inmunoprecipitación de anticuerpo anti-Ago2 (Ago2-IP) en células CD133bajo transducidas con miR-133a o CN. Los genes regulados negativamente en el método anterior con una disminución de 1,5 veces y los genes regulados positivamente en el método anterior con un aumento de 2,0 veces se definieron como candidatos por referencia a las bases de datos informáticas TargetScanHuman 6.0 (http://www.targetscan.org/).
Ensayos de indicador de luciferasa. Cada fragmento de 3'UTR de SGMS2 (nt 1656-1879 (sitio de unión) de NM_152621), UBA2 (nt 2527-2654 (sitio de unión) de NM_005499), DUSP11 (nt 1180-1572 (sitio de unión) de NM_003584), MAST4 (nt 8017-8096 (sitio de unión) de NM_001164664), SNX30 (nt 6659-7611 (sitio de unión) de NM_001012944) y CDS de ANXA2 (nt 244-743 (sitio de unión) de NM_001002857) se amplificó y clonó en los sitios Xhol y Notl de genes indicadores de luciferasa de luciérnaga y renilla de un vector psiCHECK-2 (Promega). Todos los productos de PCR clonados en el plásmido se verificaron mediante secuenciación de ADN para garantizar que estuvieran libres de mutaciones y en la dirección de clonación correcta. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 5. Para el ensayo de indicador de luciferasa, las células HOS se cotransfectaron con 100 ng de construcciones de luciferasa y moléculas miR-133a sintéticas 100 nM o control (oligonucleótido de ARNip no dirigido, Qiagen). Las actividades de luciferasa de luciérnaga y renilla se midieron utilizando el ensayo de indicador de luciferasa doble (Promega) 48 h después de la transfección. Los resultados se expresaron como actividad de luciferasa de renilla relativa (luciferasa de renilla/luciferasa de luciérnaga).
Tabla 5. Secuencias de cebadores para ensayos de indicador de luciferasa Gen Dir/lnv Secuencia (5'-Secuencia-3') SEQ ID NO: SGMS2-UTR Dir GCTCGAGTMAGCAAAACAAAGGCATCAGC 82
Inv GCGGCCGCAAGGCTTGTCACCAATGAATGA 83 SGMS2mu-UTR Dir AAATGTCAACCATTTTGTGTAAACGATTA 84
Inv AAATG GTT G AC ATTT CTT CATTT ACC AG 85 UBA2-UTR Dir GCTCGAGTAATACCGCCTGGTATGTCTGTG 86
Inv G C G G C C G C AAT GCAGATGCCATTTATTTGGT 87 UBA2mu-UTR Dir TTAT GT CAACCATAAAT GGCAT CT GCATT 88
Inv TTATGGTTGACATAAGTATAGTCGTTAT 89 SNX30-1-UTR Dir GCTCGAGTAACCCTGTTGGACAGGATTGAT 90
Inv G CGG C C G C AATTTTT AAAG AAAG C ATCTTTTATG G 91 SNX30mu-1-UTR Dir T CTTAT CAACCCACTT CAGTCAGAAATGT 92
Inv AGTG GGTT G AT AAG ACTGCG AAC AAT CA 93 DUSP11-UTR Dir GCTCGAGTAAAAACCTGTCCTGGAATTCTACC 94
Inv GCGGCCGCAAGATGGCCTTTGGGTCAATAA 95 (continuación)
Gen Dir/Inv Secuencia (5'-Secuencia-3')________________ SEQ ID NO: DUSP1lmu-UTR Dir CTG G AT CAACG AG CTG GCCT G AAAATT AC 96
Inv GCTCGTTGATCCAGGTAGAATTCCAGGA 97 MAST4-UTR Dir GCTCGAGTAACTCCCCCAGCTAGGAAACAG 98
Inv GCGGCCGCAAAGAGATGGGGCGGTCAGT 99 MAST4mu-UTR Dir GACGTTCAACCGCCATCCCCAGCCCCAAA 100
Inv TGGCGGTTGAACGTCTCTGCCCACGTTC 101 ANXA2-UTR Dir GCTCGAGTAAGCGGGATGCTTTGAACATT 102
Inv GCGGCCGCAACTCCAGCGTCATAGAGATCC 103 ANXA2mu-UTR Dir ATCAATCAACCAGGTGTGGATGAGGTCAC 104
Inv ACCTGGTTGATTGATGGCTGTTTCAATG 105
Inmunohistoquímica. Para la tinción de CD133 y dianas de miR-133a, se prepararon portaobjetos de muestras clínicas de osteosarcoma y tumores xenoinjertados. La peroxidasa endógena se inhibió con H2O2 al 1 % (30 min). Los portaobjetos se calentaron para recuperar el antígeno en citrato de sodio 10 mM (pH 6,0). Posteriormente, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos monoclonal de ratón anti-CD133/2 humano (1:1 Odilution, Miltenyi Biotec), monoclonal de ratón anti-SGMS2 humano (dilución 1:50, Abeam) o de control de isotipo coincidente durante una noche a 4 °C. Se realizó inmunodetección utilizando reactivos de detección de polímeros de peroxidasa ImmPRESS (Vector Laboratories) y el kit de sustrato DAB mejorado con metal (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. La tinción se reveló mediante contratinción con hematoxilina.
Análisis estadístico. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (SPSS, Inc.; Chicago, IL), con la excepción de la significación en gráficos de barras, en cuyo caso los análisis se realizaron aplicando la prueba de t de Student. Las diferencias en la expresión de CD133 entre los diferentes datos clinicopatológicos se analizaron mediante la prueba de Chi cuadrado (x2). Los casos con ACt menor que el valor medio se clasificaron como con alta expresión de CD133, mientras que los casos con ACt mayor que el valor medio se clasificaron como con baja expresión de CD133. El método de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos se utilizaron para comparar la supervivencia de los pacientes con tumores primarios CD133alto y CD133bajo. El periodo de supervivencia se definió como el tiempo desde el diagnóstico hasta la muerte, mientras que los pacientes vivos se censuraron en el momento de su último seguimiento. Para el cálculo de las diferencias en las expresiones de miR-133a y sus dianas, se aplicó el mismo procedimiento. En todos estos análisis, un valor de p de 0,05 o menos se consideró una diferencia significativa.
Ejemplo 1
Un pequeño subconjunto de células de la línea celular de osteosarcoma expresa CD133
Las líneas celulares de osteosarcoma SaOS2, HOS, U2OS, MNNG/HOS, MG63, 143B y Hu09 se examinaron para detectar marcadores de células madre mesenquimales o células madre neurales que se consideraron como el origen del sarcoma. Basu-Roy, U et al. (2011) Oncogene 31:2270-82; Kuhn, NZ et al. (2010) J. Cell. Physiol. 222:268-77. Como resultado, CD133, el homólogo estructural de prominina-1, se encontró en todas las líneas celulares en una población pequeña que variaba entre 0,04 % y 8,47 %, mientras que CD44 se encontró en una gran población (Fig. 1). Se encontró que SaOS2, MNNG/HOS y h Os eran particularmente fuertes en su expresión de CD 133 (8,47, 8,13 y 7,69 por ciento, respectivamente).
Se observó proliferación de células individuales de la población de células recién aisladas utilizando el colorante PKH, que es un colorante fluorescente que se une a las membranas celulares y se segrega en las células descendientes después de cada división celular. Normalmente, la concentración de PKH disminuye con cada división celular, de modo que las células inactivas permanecen PKHalto y las células en división se vuelven progresivamente PKHbajo. Por otra parte, normalmente, el colorante PKH67 se distribuye equitativamente entre las células descendientes, mientras que las células que se dividen rápidamente, por ejemplo, células cancerosas, muestran división asimétrica.
La población de células CD133alto generó poblaciones tanto CD133alto como CD133bajo con diferentes destinos proliferativos: uno que es inactivo (PKHalto) y otro que se divide activamente (PKHbajo). Una sola célula PKH26alto de fracción CD133alto mostró división asimétrica; un pequeño número de células PKH26alto, que se presentaban como células latentes, se observaron rodeadas de células PKH26bajo el día 8, que se identificaron como una fracción con células tanto CD133alto como CD133bajo en el análisis de FACS. Por otro lado, una sola célula PKH67alto de fracción SaOS2 CD133bajo mostró una división simétrica; se observó una colonia con células PKH67bajo, que se identificó como una fracción CD133bajo en el análisis de FACS dos semanas después del aislamiento (Fig. 2). No se observó ninguna diferencia en la división celular según la expresión de CD44.
Se realizaron exámenes adicionales para identificar otros fenotipos de población CD133alto y CD133bajo Se clasificaron un total de 5x103 células CD133alto y CD133bajo y se cultivaron inmediatamente en condiciones de entorno sin suero, independiente de anclaje complementado con factor de crecimiento. En las primeras dos semanas de cultivo, se observaron más esferas de osteosarcoma de células CD133alto que de células CD133bajo (Fig. 3).
Ejemplo 2
Las células CD133alto muestran mayor resistencia a fármacos, invasividad y tumorigénesis
Ya que la resistencia a fármacos es una de las propiedades importantes de las TIC, se observaron poblaciones de células CD133alto y CD133bajo en la condición de tratamiento con doxorrubicina (DOX), cisplatino (CDDP) y metotrexato (MTX), que son productos quimioterapéuticos convencionales contra el osteosarcoma. Las células CD133alto fueron más resistentes a estos productos quimioterapéuticos que las células CD133bajo (Fig. 4). Asimismo, las células CD133alto mostraron mayor capacidad de invasión que las células CD133bajo (Fig. 5). La qRT-PCR de ARNm de células recién aisladas CD133alto y CD133bajo reveló que las células SaOS2 CD133alto expresaron niveles mejorados de Oct3/4, Nanog y Sox-2, que son factores de transcripción que desempeñan un papel crítico en el mantenimiento de la autorrenovación y la pluripotencia de las células madre embrionarias, así como de las CSC o TIC (Levings, PP et al. (2009) Cancer Res. 69:5648-55; Basu-Roy U et al. (2011) Oncogene 31: 2270-82); genes transportadores de resistencia a múltiples fármacos ABCB1, ABCC2, ABCG2\ y genes asociados a metástasis integrina @4, ezrina, MMP-13, y CXCR4 (Tang, N et al. (2008) Clin. Orthop. Relat. Res. 466:2114-30; Osaki, M et al. (2011) Mol. Ther. 19: 1123-30) (Fig. 6). Lo que es más importante, la fracción de HOS CD133alto mostró tumorigenicidad más fuerte in vivo que la fracción de HOS CD133bajo; las células CD133alto pudieron formar tumores a partir de tan solo 100 células, mientras que las células CD133bajo no pudieron (Fig. 7). Los resultados también se muestran en la Tabla 6.
Tipo celular Incidencia del
tumor Número de células
CD133alto 5/5 100.000
5/5 10.000
5/5 1.000
4/5 100
C D ^ 1^ 4/5 100.000
1/5 10.000
1/5 1.000
1/5 100
Ejemplo 3
La expresión de alto nivel del ARN mensajero de CD 133 es un marcador de bajas tasas de supervivencia de pacientes con osteosarcoma
Para evaluar la importancia clínica de CD133, se analizaron líneas celulares establecidas a partir de biopsias de osteosarcoma humano nuevas mediante un citómetro de flujo y se encontró que contenían una población CD133alto a una frecuencia poco habitual <10 % (Fig. 8). Asimismo, un estudio clínico de 35 pacientes con osteosarcoma reveló que los altos niveles de expresión de ARN mensajero (ARNm) de CD133 se correlacionaron con tasas de supervivencia global significativamente peores de los pacientes con osteosarcoma (prueba de rangos logarítmicos, P = 0,0262). Los resultados se muestran en las Fig. 9 y la Tabla 7.
Tabla 7. Análisis univariantes y multivariantes y la relación entre las variables clinicopatológicas y la expresión de _______________________________________ CD133 en 35 casos_______________________________________ Variable Número de CD133 Bajo CD133 Alto Correlación (:Cp i 33)x2 casos (valor de P) Edad (años) 0,120 0-10 7 6 1
11-20 25 11 14
21 3 1 2
Sexo 0,164 Hombre 23 14 9
Mujer 12 4 8
Sitio 0,319 Fémur 21 12 9
(continuación)
Variable Número de CD133 Bajo CD133 Alto Correlación (CD133)x2 casos (valor de P) Tibia 9 5 4
Húmero 2 1 1
Otros 3 0 3
Histología 0,394 Osteoblástico 16 9 7
Condroblástico 6 4 2
Fibroblástico 2 0 2
Otros, ND* 11 5 6
Metástasis en el momento del
diagnóstico 0,045 Presente 4 0 4
Ausente 31 18 13
Quimioterapia neoadyuvante 0,425 MTX+DOX/CDDP 21 10 11
IFO+DOX/CDDP 13 8 5
Otros 1 0 1
Respuesta a la quimioterapia
neoadyuvante 0,088 Buena (necrosis > 90 %) 11 6 5
Mala (necrosis < 90 %) 20 12 8
ND* 4 0 4
Expresión de ARNm de CD133
Alta 17 0 17
Baja 18 18 0
Ejemplo 4
miR-1, miR-10b y miR-133a están regulados positivamente en células CD133alto en comparación con células CD13baJo
Se ha señalado que los perfiles de expresión de miARN son una herramienta de diagnóstico y pronóstico útil, y muchos estudios han indicado que determinados miARN actúan como un oncogén o un supresor tumoral. Croce, CM (2009) Nat. Rev. Genet. 10:704-10. Con el fin de caracterizar adicionalmente el mecanismo molecular subyacente a los fenotipos CD133alto y CD133bajo, se realizó el perfil de miARN de células SaOS2 y HOS aisladas de osteosarcoma CD133alto y CD133bajo utilizando análisis de micromatrices que contiene 866 miARN humanos validados por secuencia. Los resultados, mostrados en la Fig. 10 y en la Tabla 8, revelaron que 3 miARN estaban regulados positivamente con cambios >2 veces mayores en células CD133alto en comparación con células CD133bajo. Un segundo ciclo de estudio de validación de qPCR reveló que miR-1, miR-10b y miR-133a fueron coherentes con los datos de micromatrices (Fig. 11).
Tabla 8. Perfil de expresión de microARN de células de osteosarcoma CD133alto frente a CD133bajo Factor de cambio (SaOS2 CD133alto D . .. Factor de cambio (FIOS CD133alto miARN frente a C D ^ j Regulación frente a c D ^ j Regulación miARN habitualmente regulados positivamente en SaOS2 y HOS con cambio >2 veces mayor en células CD133alto en comparación con células CD133bajo
hsa-miR-1 7,23 positiva 3,81 positiva hsa-miR-500* 5,39 positiva 3,99 positiva hsa-miR-660 2,09 positiva 2,05 positiva
miARN regulados positivamente en SaOS2 con cambio >2 veces mayor en células CD133alto en comparación con células CD133bajo
hsa-miR-551b 9,49 positiva
hsa-miR-30e 9,19 positiva
(continuación)
Factor de cambio (SaOS2 CD133alto Factor de cambio (FIOS CD133alto miARN frente a CD133bajo) Regulación frente a cD133bajo) Regulación miARN regulados positivamente en SaOS2 con cambio >2 veces mayor en células CD133alto en comparación con células CD133bajo
hsa-miR-148b 8,26 positiva
hsa-miR-193a- 7,77 positiva
3p
hsa-miR-1 7,23 positiva
hsa-miR-221* 6,76 positiva
hsa-miR-24-1* 6,36 positiva
hsa-miR-1825 5,78 positiva
hsa-miR-500* 5,39 positiva
hsa-miR-92a- 4,36 positiva
2*
hsa-miR-1202 3,39 positiva
hsa-miR-424 3,23 positiva
hsa-miR-19b- 2,87 positiva
2*
hsa-miR-29c 2,42 positiva
hsa-miR-494 2,37 positiva
hsa-miR-10b 2,16 positiva
hsa-miR-374a 2,11 positiva
hsa-miR-660 2,09 positiva
hsa-miR-30e* 2,03 positiva
miARN regulados positivamente en SaOS2 con cambio <2 veces mayor en células CD133alto en comparación con células CD133bajo
hsa-miR-1281 9,45 negativa
hsa-miR-195 6,56 negativa
hsa-miR-129- 5,74 negativa
5p
hsa-miR-129- 4,98 negativa
3p
hsa-miR-183 4,89 negativa
hsa-miR-1305 4,76 negativa
hsa-miR-1275 4,65 negativa
hsa-miR-484 4,55 negativa
hsa-miR-1268 4,51 negativa
hsa-miR-186 4,51 negativa
hsa-miR-181a* 4,46 negativa
hsa-miR-744* 2,72 negativa
hsa-miR-96 2,65 negativa
hsa-miR-142- 2,35 negativa
3p
hcmv-miR- 2,31 negativa
US25-2-5p
miARN regulados positivamente en HOS con cambio >2 veces mayor en células CD133alto en comparación con células CD133bajo
hsa-miR-1181 12,78 positiva hsa-miR-133b 7,22 positiva hsa-miR-532- 7,10 positiva (continuación)
tor de cambio (FIOS CD133alto miARN Factor de cambio (SaOS2 CD133alto 0 . . . Fac
frente a CD133bai° ) Regu|ación frente a CD133bajo) Regulación 5p
hsa-miR-338- 6,30 positiva 3p
hsa-miR-9 5,95 positiva hsa-miR-34c- 5,37 positiva 5p
hsa-miR-378* 5,26 positiva hsa-miR-181a* 5,04 positiva hsa-miR-145* 4,97 positiva hsa-miR-1271 4,97 positiva hsa-miR-362- 4,67 positiva 3p
hsa-miR-152 4,63 positiva hsa-miR-663 4,46 positiva hsa-miR-9* 4,15 positiva hsa-miR-340 4,10 positiva hsa-miR-744 4,07 positiva hsa-miR-500* 3,99 positiva hsa-miR-1 3,81 positiva hsa-miR-1305 3,33 positiva hsa-miR-744* 3,11 positiva hsa-miR-629 2,88 positiva hsa-miR-629* 2,71 positiva hsa-miR-145 2,55 positiva hsa-miR-1246 2,47 positiva hsa-miR-21* 2,39 positiva hsa-miR-450a 2,35 positiva hsa-miR-425* 2,31 positiva hsa-miR-148a 2,30 positiva hsa-let-7f-1* 2,26 positiva hsa-miR-301b 2,21 positiva hsa-miR-1826 2,15 positiva hsa-miR-128 2,15 positiva hsa-miR-378 2,14 positiva hsa-miR-126 2,13 positiva hsa-miR-598 2,06 positiva hsa-miR-1915 2,05 positiva hsa-miR-660 2,05 positiva hsa-miR-933 2,02 positiva
miARN regulados positivamente en HOS con cambio <2 veces mayor en células CD133alto en comparación con células CD133bajo
hsv1-mlR-H6 4,60 negativa hsa-miR-1539 4,02 negativa hsa-miR-483- 3,76 negativa 3p
hsa-miR-328 3,72 negativa hsa-miR-132* 3,67 negativa hsa-miR-129* 3,66 negativa hsa-miR-548c- 3,13 negativa (continuación)
. Factor de cambio (SaOS2 CD133alto 0 . .. Factor de cambio (FIOS CD133alto miARN frente a CD133baj°) Regulación frente a CD133bajo) Regulación 5p
hsa-miR-1825 2,05 negativa hsa, Homo sapiens.
miARN y miARN* son las dos cadenas del producto de ARN bicatenario de procesamiento por dicer del miARN precursor del tallo-bucle. miARN es la cadena "guía" que con el tiempo entra en RISC y miARN* es la otra cadena "pasajera". El nivel de miARN* presente en la célula es bajo (< 15 % en relación con el miARN correspondiente). En los casos donde hay una mayor proporción de cadena pasajera presente en la célula, se usa la nomenclatura miARN-3p/miARN-5p en lugar de miARN/miARN* miARN-3p es el miARN procedente de la rama 3' del miARN precursor y miARN-Sp es el miARN procedente de la rama 5' del miARN precursor.
Ejemplo 5
La transfección de células CD133bajo con miR-133 confiere propiedades asociadas con células CD133alto y la alta expresión de miR-133a se correlaciona con un mal pronóstico clínico
Para determinar si estos miARN pueden inhibir estos fenotipos de células iniciadoras de tumores de osteosarcoma, los niveles de expresión de miR-1, miR-10b y miR-133a se manipularon en células CD133bajo (Fig. 12). Estos miARN, especialmente miR-133a, potenciaron la invasividad de células CD133bajo en comparación con los oligonucleótidos de miR-CN (control negativo) (Fig. 13). Resulta interesante que la transfección de todos estos miARN potenció drásticamente la invasión de células CD133bajo (Fig. 13). La proliferación celular y la resistencia a fármacos se potenció ligeramente en células CD133bajo mediante transfección de miR-133 (Fig. 14). Las células HOS CD133bajo estables con sobreexpresión de miR-133a (Fig. 15) mostraron una capacidad más fuerte (> 2 veces) para formar esferas que las células CD133bajo de control en un entorno sin suero de anclaje y pudieron desarrollar tumores con tan solo 100 células in vivo mientras que las células CD133bajo de control no pudieron (Fig. 16 y Tabla 9).
Tabla 9. Desarrollo tumoral in vivo utilizando poblaciones CD133bajo de osteosarcoma que sobreexpresan de forma estable miR-133a
Tipo celular Incidencia del tumor Número de células miR-133a CD133bajo 5/5 100.000
4/4 10.000 5/5 1.000 2/5 100 VV1 CD133bajo 5/5 100.000
1/4 10.000 0/5 1.000 0/5 100 CDDP2 CD133bajo 5/5 100 solución salina3 CD133bajo 0/5 100 1 VV, vector vacío.
2 CDDP, células tratadas con CDDP.
3 Solución salina, células tratadas con solución salina.
La transfección de miR-133a también aumentó los niveles de ARN mensajero (ARNm) de las moléculas que estaban reguladas positivamente en células CD 133alto (véase Fig. 6) pero no ARNm de CD 133, lo que sugiere que miR-133a no afecta la expresión de las moléculas en la ruta corriente arriba de CD133 (Fig. 17). Estos resultados revelaron que miR-133a es un miARN candidato que puede regular los fenotipos de TIC de osteosarcoma. De hecho, la expresión de miR-133a también fue alta en la fracción de CD133alto de biopsias de osteosarcoma (Fig. 18), y la alta expresión de miR-133a se correlacionó significativamente con el mal pronóstico de los pacientes (Tabla 10).
Tabla 10. Análisis univariantes y multivariantes y la relación entre las variables dinicopatológicas y la expresión de miR-133a en 48 casos
Variable Número de casos miR-133a Bajo miR-133a Alto Corre 2.laci ,ón , .(CD133)x2(valor de p) Edad (años) 0,228 0-10 9 9 0
11-20 30 23 7
21 9 8 1
Sexo 1,000 Hombre 31 26 5
Mujer 17 14 3
Sitio 0,566 Fémur 26 22 4
Tibia 16 14 2
Húmero 2 1 1
Otros 4 3 1
Histología 0,142 Osteoblástico 25 23 2
Condroblástico 7 6 1
Fibroblástico 2 2 0
Otros, ND* 14 9 5
Metástasis en el momento del diagnóstico 0,330 Presente 7 5 2
Ausente 41 35 6
Quimioterapia neoadyuvante 0,902 MTX+DOX/CDDP 29 24 5
IFO+DOX/CDDP 18 15 3
Otros 1 1 0
Respuesta a la quimioterapia neoadyuvante 0,173 Buena (necrosis > 90 %) 17 16 1
Mala (necrosis < 90 %) 26 21 5
ND* 5 3 2
Expresión de miR-133a
Alta 8 0 8
Baja 40 40 0
Ejemplo 6
La transfección de células SaOS2 CD133bajo con miARN da como resultado aumento de la proliferación.
Se aislaron células SaOS2 CD133bajo por clasificación celular y después se transfectaron con ARN de control negativo (CN), miR-1 solo, miR-10b solo, miR-133a solo, miR-1 más mirR-10b, mirR-10b más miR-133a, miR-1 más miR-133a o miR-1 más miR-1 Ob más miR-133a. También se aislaron células CD133alto por clasificación celular y después se transfectaron con ARN de control negativo (CN). Cada población de células se mantuvo por separado en cultivo tisular durante 3-7 días y después se estudió con un microscopio óptico para evaluar la proliferación celular. Los resultados se muestran en la Fig. 19. Como resulta evidente a partir de la Fig. 19, células SaOS2 CD133bajas transfectadas con miR-1 solo, miR-10b solo, miR-133a solo, miR-1 más mirR-10b, mirR-10b más miR-133a, miR-1 más miR-133a o miR-1 más miR-1 Ob más miR-133a proliferaron en mayor medida que las células SaOS2 CD133bajo transfectadas con ARN de control negativo. Las células SaOS2 CD133bajo transfectadas con miR-1 más miR-1 Ob más miR-133a proliferaron casi en la misma medida que las células CD133alto transfectadas con ARN de control negativo. Los efectos de las combinaciones fueron al menos aditivos.
Se obtuvieron resultados similares en un experimento con células MNNG/HOS en lugar de células SaOS2 (Fig. 20).
Ejemplo 7
La transfección de células SaOS2 CD133bajo con miARN da como resultado resistencia a fármacos
Se aislaron células SaOS2 CD133bajo por clasificación celular y después se transfectaron con ARN de control negativo (CN), miR-1 solo, miR-10b solo, miR-133a solo o miR-1 más miR-10b más miR-133a, similar al Ejemplo 1. Cada población de células transfectadas se mantuvo después por separado en cultivo tisular durante cuatro días en presencia de doxorrubicina 30 nM, cisplatino 2,5 pM o metotrexato 320 nM, y después se contaron las células. Los resultados se muestran en la Fig. 21. Como resulta evidente a partir de la Fig. 21, las células SaOS2 CD133bajo transfectadas con miR-133a solo o con miR-1 más miR-1 Ob más miR-133a proliferaron en mayor medida que el control negativo en presencia de cisplatino y en presencia de metotrexato. La adición de miR-133a se asoció por tanto con mayor resistencia al cisplatino y metotrexato.
Ejemplo 8
miR-1, miR-10b y miR-133a son inducidos por tratamiento con cisplatino
Las expresiones de miR-1, miR-10b y miR-133a, así como CD133, fueron inducidas por tratamiento con cisplatino. El análisis de qRT-PCR mostró que las células 143B tratadas con DOX o tratadas con CDDP (3 días) expresaban un mayor nivel de miR-1, miR-10b y miR-133a en relación con las células 143B no tratadas (Fig. 22). Además, la expresión de miR-133a se potenció mediante cisplatino en células HOS CD133bajo. Asimismo, la exposición a CDDP aumentó las tumorigenicidad in vivo de población de HOS CD133bajo. Las células HOS CD133bajo tratadas con CDDP pudieron formar tumores con tan solo 100 células por inyección, mientras que las células HOS CD133bajo no tratadas no pudieron (Fig. 23 y Tabla 9). Estos datos indican que los fenotipos de TIC, así como la expresión de ARNm de CD133 y miR-133a, podrían ser potenciados por productos quimioterapéuticos. Por lo tanto, los inventores razonaron que el silenciamiento de miR-133a antes o durante la quimioterapia evitaría el aumento de la expresión de miR-133a, lo que potenciaba los fenotipos de TIC y fue inducido por productos quimioterapéuticos.
Ejemplo 9
El antisentido para miR-133a reduce la proliferación de células CD133h'ph
Para evaluar si el silenciamiento de miR-133a puede suprimir los fenotipos malignos de osteosarcoma, se realizaron experimentos opuestos a los del Ejemplo 8 mediante la introducción de ácido nucleico bloqueado (LNA) anti-miR-133a. El LNA es una clase de análogos de ácido nucleico que poseen afinidad muy alta y excelente especificidad hacia ADN y ARN complementarios, y los oligonucleótidos de LNA se han aplicado como moléculas antisentido tanto in vitro como in vivo. Elmen, J et al. (2008) Nature 452:896-9; Obad, S et al. (2011) Nat. Genet. 43:371-8. Se aisló una población CD133alto de células SaOS2 y HOS mediante clasificación celular y se transfectó con LNA-anti-miR-133a (LNA-133a) y LNA-control negativo (LNA-CN). Como control, las células SaOS2 y HOS CD133bajo aisladas también se transfectaron con LNA-CN. La eficacia de LNA-133a para el silenciamiento de miR-133a se confirmó mediante análisis de RT-PCR en tiempo real (Fig. 24). Las células SaOS2 y HOS CD133alto transfectadas con LNA-133a tuvieron supresión de la tasa de proliferación hasta el mismo nivel de células CD133bajo transfectadas con LNA-CN (Fig. 25).
Ejemplo 10
Las células CD133alto transducidas con LNA-133a muestran sensibilidad a fármacos potenciada e invasividad reducida
Las células CD133alto transducidas con LNA-133a mostraron una sensibilidad potenciada a DOX y CDDP en el nivel de células CD133bajo transducidas con LNA-CN. Estos resultados se validaron contando células teñidas con Hoechst que mostraban condensación nuclear apoptótica y fragmentación en células CD133alto. Hubo una tasa significativamente mayor de muerte celular apoptótica en células CD133alto transducidas con LNA-133a en comparación con las células CD133alto de control (Fig. 26). Asimismo, LNA-133a redujo la capacidad de invasión de las poblaciones de SaOS2 y HOS CD133alto (Fig. 27) y la expresión de las moléculas asociadas con fenotipos CD133alto (Fig. 28). En conjunto, estas observaciones sugieren que el silenciamiento de células miR-133a CD133alto puede reducir el fenotipo maligno de TIC de osteosarcoma, incluyendo resistencia a fármacos e invasión.
Ejemplo 11
El silenciamiento de miR-133a in vivo es eficaz para el tratamiento del osteosarcoma y muestra eficacia sinérgica en combinación con CDDP
Para extender los hallazgos in vitro y determinar si el silenciamiento de miR-133a podría ser una opción terapéutica eficaz para el tratamiento del osteosarcoma, se examinó el efecto de LNA-133a en un modelo de metástasis pulmonar espontánea de osteosarcoma. Experimentalmente, se implantaron 1,5 x 106 células de 143B transfectadas con gen de luciferasa de luciérnaga (143B-lucj ortotópicamente en la tibia proximal derecha de ratones desnudos atímicos. El crecimiento de tumor implantado y la presencia de metástasis distantes se analizaron semanalmente para determinar la bioluminiscencia de luciferasa utilizando un sistema de captura de imágenes in vivo (IVIS). Se realizó un nuevo protocolo de tratamiento de administración intravenosa (i.v.) de LNA-133a (10 mg kg_1) 24 h antes de la inyección intraperitoneal (i.p.) de CDDP (2,5 mg kg-1) (Fig. 29) para reducir la resistencia a fármacos y para prevenir la inducción de fenotipos de TIC por quimioterapia, que se observaron en experimentos in vitro. Antes del estudio animal de este protocolo, los inventores confirmaron niveles reducidos de miR-133a en tejidos de osteosarcoma de ratones tratados con LNA-133a en comparación con los de ratones tratados con solución salina (Fig. 30). Para evaluar la eficacia del nuevo protocolo de tratamiento, los resultados se compararon con tres grupos de control (n = 10 cada uno): un grupo de control salino, un grupo de LNA y un grupo de CDDP. A las 5 semanas, la mitad de los ratones de cada grupo se sacrificaron para un análisis adicional; los ratones restantes se supervisaron para determinar la supervivencia.
Resultados. La expresión de miR-133a de los tumores se redujo en presencia de LNA-133a (Fig. 31). Los ratones a los que se administró LNA-133a (10 mg kg-1 i.v.) y CDDP (2 mg kg-1 i.p.) mostraron un crecimiento tumoral significativamente menor en comparación con los otros grupos (Fig. 32 y 33). No se observaron diferencias significativas en el crecimiento tumoral en presencia o en ausencia de CDDP solo (Figs. 32 y 33). Asimismo, se observó metástasis pulmonar en 10/10 (100 %) del grupo de solución salina, 7/10 (70 %) del grupo de LNA, 8/10 (80 %) del grupo de CDDP y solo 3/10 (30 %) del grupo de combinación (LNA-133a CDDP) el día 35 (T abla 11).
Tabla 11. Resultado del tratamiento con LNA en ratones portadores de osteosarcoma Grupo Peso del tumor (media) (g) Metástasis pulmonar Luminiscencia del pulmón (media) Ctrl. 3,928 10/10 5047
LNA 3,143 7/10 1744
CDDP 3,957 8/10 2855
LNA CDDP 1,901 3/10 582
La luminiscencia promedio en la región del tórax se redujo significativamente en ratones tratados con la combinación de LNA-133a y CDDP. Tanto el número como el tamaño de la metástasis pulmonar en cada lóbulo se validaron en el ensayo de luciferasa y en el examen histopatológico.
De forma destacable, se encontró que el efecto de la terapia de combinación (LNA-133a CDDP) mostraba inhibición sinérgica de la metástasis pulmonar.
Asimismo, la terapia de combinación (LNA-133a CDDP) extendió significativamente el periodo de supervivencia de los ratones portadores de tumores (prueba de rangos logarítmicos, P = 0,0084, Fig. 34). A pesar de la secuencia altamente conservada de miR-133a humano maduro y miR-133a murino (por ejemplo, N.° de referencia de GenBank NR_029676; 5'-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3'; SEQ ID NO: 3), todos los ratones mostraron efectos tóxicos mínimos en diversos tejidos, incluyendo corazón, hígado y músculo esquelético durante el periodo de observación. Por tanto, la administración sistémica de LNA-133a es eficaz para la supresión del crecimiento tumoral y la metástasis pulmonar en el modelo de xenoinjerto para osteosarcoma muy metastásico en presencia de cisplatino.
Ejemplo 12
Identificación de dianas génicas para miR-133a
Los ejemplos anteriores establecen que miR-133a regula la neoplasia maligna de TIC de osteosarcoma CD133alto y la inhibición de la expresión de miR-133a en células de osteosarcoma inhibe el desarrollo del tumor. Con el fin de entender los mecanismos regulados por miR-133a en TIC de osteosarcoma CD133alto, el perfil de expresión de ARNm candidato se realizó mediante dos análisis de micromatrices diferentes junto con predicciones por ordenador (Fig. 35). Los inventores detectaron 1812 genes regulados negativamente con al menos una reducción de 1,2 veces en el primer análisis de micromatrices de ARN total recogido de células SaOS2 CD133bajo transducidas con miR-133a o CN, mientras que se detectaron 4976 genes regulados positivamente con al menos un aumento de 2,0 veces en el segundo análisis de micromatrices de la expresión de ARNm en ARN recogido de inmunoprecipitación de anticuerpo anti-Ago2 en células CD133bajo transducidas con miR-133a o CN (Fig. 36). Posteriormente, se recogieron 226 genes por ambos métodos (Tabla 12), y se identificaron 20 genes en TargetScanHuman 6.0, una de las bases de datos informáticas públicamente disponibles (Fig. 36).
Tabla 12. Dianas génicas predichas para miR-133a mediante dos análisis de micromatriz de ADNc y predicción por ordenador
Factor de Factor de Referencia de aumento, reducción, Símbolo génico Nombre del gen GenBank complejo miR- transfección de 133a-Ago2 miR-133a PGAP1 NM_024989 Unión post-GPI a proteínas 1 7,60 -0,42 C1orf118 XR_041258 fase abierta de lectura 118 del 7,19 -0,28 cromosoma 1
DYNLT3 NM_006520 dinema, cadena ligera, tipo Tetex 3 7,17 -0,42 AGFG1 NM_001135187 ArfGAP con repeticiones FG 1 6,69 -0,28 WDR44 NM_019045 Dominio repetido WD 44 6,36 -0,43 FLYWCH1 NM_020912 Dedo de cinc tipo FLYWCH 1 5,62 -0,32 CARKD NM_018210 dominio de carbohidrato quinasa que 5,50 -0,66 contiene
CUL4B NM_003588 culina 4B 5,30 -0,40 ETS1 NM_005238 homólogo 1 del oncogén E26 del virus 5,29 -0,74 de la eritroblastosis v-ets (aviar)
HDAC6 NM_006044 histona desacetilasa 6 5,20 -0,36 C19orf10 NM_019107 fase abierta de lectura 10 del 5,17 -0,36 cromosoma 19
RASA2 NM_006506 activador 2 de proteína RAS p21 5,15 -0,44 KIAA1958 NM_133465 KIAA1958 5,14 -0,28 LOC645851 NR_024395 LOC645851 hipotético 5,09 -0,37 TBPL1 NM_004865 tipo TBP 1 4,86 -0,33 SNX26 NM_052948 nexina de clasificación 26 4,73 -0,27 SCRN1 NM_001145513 secemina 1 4,72 -0,55 LOC100132672 XR_038504 similar a la 3 que contiene dominio de 4,61 -0,36 glucosiltransferasa 8
AP4S1 NM_001128126 complejo proteico relacionado con el 4,39 -0,59 adaptador 4, subunidad sigma 1
SF3B3 NM_012426 factor de corte y empalme 3b, subunidad 4,34 -0,27
3, 130 kDa
LMBR1 NM_022458 homólogo de la región de extremidad 1 4,31 -0,40 (ratón)
HERC4 NM_022079 dominio hect y RLD 4 4,26 -0,69 ADAMTS1 NM_006988 Metalopeptidasa ADAM con motivo 4,17 -0,47 trombospondina de tipo 1, 1
CYB5R4 NM_016230 citocromo b5 reductasa 4 4,14 -0,29 LHFPL2 NM_005779 tipo compañero de fusión de HMGIC de 4,11 -0,30 lipoma 2
FAM13A0S NR_002806 cadena opuesta de FAM13A (no 4,04 -0,28 codificante proteínas)
RALGAPA1 NM_194301 proteína activadora de Ral GTPasa, 4,00 -0,53 subunidad alfa 1 (catalítica)
TNFRSF13C NM_052945 superfamilia del receptor del factor de 3,99 -0,44 necrosis tumoral, miembro 13C
L0C100131829 AK124002 proteína hipotética LOC100131829 3,95 -0,43 Clorf58 NM_144695 fase abierta de lectura 58 del 3,92 -0,54 cromosoma 1
TNFRSF10D NM_003840 superfamilia del receptor del factor de 3,75 -0,45 necrosis tumoral, miembro 10d, señuelo
con dominio de muerte truncado
ZDHHC17 NM_015336 dedo de cinc, que contiene tipo DFIFIC 3,68 -0,36
17
(continuación)
Factor de Factor de Símbolo génico Referencia de Nombre del gen aumento, reducción,
GenBank complejo miR- transfección de 133a-Ago2 miR-133a LOC729603 NR_003288 pseudogén de proteína de unión a calcio 3,62 -0,34 P22
SNX30 NM_001012994 miembro de la familia de nexina de 3,55 -0,41 clasificación 30
TSTD2 NM_139246 que contiene dominio de tipo tiosulfato 3,52 -0,38 sulfurtransferasa (rodaneso) 2
SPRYD4 NM_207344 que contiene dominio SPRY 4 3,51 -0,35 PTPMT1 NM_175732 proteína tirosina fosfatasa, mitocondrial 1 3,50 -0,38 KLHDC4 NM_017566 que contiene dominio kelch 4 3,43 -0,43 SLC30A7 NM_133496 familia de transportador de soluto 30 3,38 -0,48 (transportador de cinc), miembro 7
TCEA3 NM_003196 factor de elongación de la transcripción A 3,32 -0,39 (SI I), 3
GORASP1 NM_031899 proteína de apilación de reensamblaje 3,17 -0,51 del golgi 1, 65 kDa
RBM15B NM_013286 proteína de motivo de unión a ARN 15B 3,13 -0,80 PDGFRB NM_002609 receptor del factor de crecimiento 3,13 -0,37 derivado de plaquetas, polipéptido
ITPRIPL2 NM_001034841 tipo proteína de interacción con el 3,09 -0,34 receptor de inositol 1,4,5-trifosfato 2
FBX03 NM_033406 proteína de caja F 3 3,01 -0,35 FAM122B NM_001166600 familia con similitud de secuencia 122B 3,00 -0,30 MINPP1 NM_004897 inositol polifosfato fosfatasa múltiple, 1 2,98 -0,28 SPOPL NM_001001664 tipo proteína de tipo speckle POZ 2,94 -0,47 FAM86B1 NM_001083537 familia con similitud de secuencia 86, 2,85 -0,44 miembro B1
LOC100128071 XM_001724939 similar a hCG41624 2,83 -0,31 CCNT1 NM_001240 ciclina T1 2,82 -0,53 AP2M1 NM_004068 complejo proteico relacionado con el 2,80 -0,44 adaptador. 2, subunidad mu 1
AKIRIN1 NM_024595 akirina 1 2,73 -0,27 CHMP5 NM_016410 proteína modificadora de cromatina 5 2,69 -0,61 PPM1K NM_152542 proteína fosfatasa 1K (que contiene el 2,67 -0,53 dominio PP2C)
MICALL2 NM_182924 tipo MICAL 2 2,66 -0,29 DGKZ AK123378 diacilglicerol quinasa, zeta 104 kDa 2,65 -0,39 SCARNA16 NR_003013 ARN específico de cuerpos de Cajal 2,65 -0,50 pequeño 16
SERPINE1 NM_000602 inhibidor de serpina peptidasa, clado E 2,65 -0,61 (nexina, inhibidor del activador de
plasminógeno de tipo 1), miembro 1
STARD13 NM_178006 que contiene dominio de transferencia de 2,58 -0,28 lípidos relacionado con StAR (START)
13
R0D1 NM_005156 ROD1 regulador de la diferenciación 1 2,55 -0,36 (S. pombe)
VEGFC NM_005429 factor de crecimiento endotelial vascular 2,45 -0,35 C MYH9 NM_002473 miosina, cadena pesada 9, no muscular 2,43 -0,39 CCNJ NM_019084 ciclina J 2,41 -0,26 (continuación)
Factor de Factor de Referencia de aumento, reducción, Símbolo génico GenBank Nombre del gen complejo miR- transfección de 133a-Ago2 miR-133a WDR66 NM_144668 Dominio repetido WD 66 2,38 -0,32 CSRNP1 NM_033027 proteína nuclear rica en cisteína-serina 1 2,34 -0,28 MYBL1 NM_001144755 tipo homólogo del oncogén vírico de la 2,32 -0,29 mieloblastosis v-myb (aviar) 1
EME2 BC041011 homólogo 2 de endonucleasa meiótica 2,31 -0,44 esencial 1 (S. pombe)
MGC27382 AK091757 MGC27382 hipotético 2,27 -0,33 MMP14 NM_004995 metalopeptidasa de la matriz 14 2,27 -0,42 (insertada en la membrana)
WASH1 NM_182905 homólogo de la familia de proteína WAS 2,26 -0,32
1
RIMS2 NM_014677 reguladora de la exocitosis de la 2,25 -0,45 membrana sináptica 2
HSPG2 NM_005529 proteoglucano de heparán sulfato 2 2,25 -0,45 HDAC8 NM_018486 histona desacetilasa 8 2,21 -0,34 AK2 NM_013411 adenilato quinasa 2 2,20 -0,30 SRRM2 NM_016333 matriz con repeticiones de 2,19 -0,28 serina/arginina 2
LOC731419 XM_001132610 proteína hipotética LOC731419 2,19 -0,32 SYNGR3 NM_004209 sinaptogirina 3 2,11 -0,33 PRUNE2 NM_015225 homólogo de prune 2 (Drosophila) 2,11 -0,38 MLKL NM_152649 tipo de dominio de quinasa de linaje 2,10 -0,30 mixto
DST NM_001723 distonina 2,10 -0,44 PBXIP1 NM_020524 proteína que interacciona con caja 2,03 -0,78 homeótica de leucemia de pre-linfocitos
B 1
ANTXR2 NM_058172 receptor de toxina de carbunco 2 1,98 -0,61 NSF NM_006178 factor sensible a N-etilmaleimida 1,98 -0,32 APH1A NM_001077628 homólogo A de defectuoso en faringe 1,98 -0,34 anterior 1 (C. elegans)
RASA1 NM_002890 activador de la proteína RAS p21 1,95 -0,46 (proteína activadora de GTPasa) 1
BAIAP2 NM_017451 proteína 2 asociada a BAI1 1,91 -0,29 GARNL3 NM_032293 tipo dominio Rap/RanGAP activador de 1,90 -0,49 GTPasa 3
CKLF NM_016951 factor de tipo quimiocina 1,89 -0,38 SN0RD17 NR_003045 ARN nucleolar pequeño, caja C/D 17 1,88 -0,27 TRIT1 NM_017646 ARNt isopenteniltransferasa 1 1,88 -0,43 FILIP1L NM_182909 tipo proteína que interacciona con 1,88 -0,36 filamina A 1
VAMP2 NM_014232 proteína de membrana asociada a la 1,87 -0,31 vesícula 2 (sinaptobrevina 2)
TBL1X NM_005647 tipo transducina (beta) ligada a 1X 1,87 -0,30 LOC729314 XR_037423 similar a la proteína 1 de tipo POM121 1,85 -0,63 RHD NM_016124 grupo sanguíneo Rh, antígeno D 1,84 -0,28 HERC2 NM_004667 dominio hect y RLD 2 1,81 -0,36 KIAA1967 NM_021174 KIAA1967 1,78 -0,32 YIPF2 NM_024029 familia del dominio Yip1, miembro 2 1,71 -0,48 MLL5 NM_182931 leucemia de linaje mieloide/linfoide o 1,71 -0,41 (continuación)
Factor de Factor de ión, Símbolo gé Nombre del gen mento, reduccn Referencia de auico GenBank complejo miR- transfección de 133a-Ago2 miR-133a mixto 5 (homólogo de trithorax,
Drosophila)
DUSP11 NM_003584 fosfatasa 11 de especificidad doble (que 1,70 -0,28 interacciona con el complejo 1 de
ARN/RNP)
ABL2 NM_001100108 homólogo de oncogén vírico de leucemia 1,68 -0,30 murina de Abelson v-abl 2 (arg, gen
relacionado con Abelson)
RBMX2 NM_016024 proteína de motivo de unión a ARN, 1,65 -0,37 ligado a X 2
ALS2CR8 NM_024744 región cromosómica de esclerosis lateral 1,65 -0,30 amiotrófica 2 (juvenil), candidato 8
EDH1 NM_005896 isocitrato deshidrogenasa 1 (NADP+), 1,65 -0,31 soluble
NT5C3L NM_052935 5'-nucleotidasa, tipo citosólico III 1,63 -0,40 ERMP1 NM_024896 metalopeptidasa de retículo 1,59 -0,86 endoplásmico
GPSM1 NM_015597 modulador de señalización de proteína G 1,53 -0,47
1 (tipo AGS3, C. elegans)
ARHGEF10L NM_018125 tipo factor de intercambio de nucleótidos 1,52 -0,32 de guanina de Rho (GEF) 10
MFN2 NM_014874 mitofusina 2 1,52 -0,32 CG030 NR_026928 CG030 hipotético 1,49 -0,30 UBXN7 NM_015562 proteína de dominio UBX 7 1,49 -0,35 CCDC45 NM_138363 que contiene dominio superenrollado 45 1,47 -0,39 ZNF701 NM_018260 proteína de dedo de cinc 701 1,46 -0,68 LOC642406 AK024257 similar a tipo proteína asociada a 1,46 -1,34 contactina 3B
PHF8 NM_015107 proteína de dedo de PFID 8 1,44 -0,28 MED23 NM_015979 subunidad de complejo mediador 23 1,42 -0,29 ARHGAP11B NM_001039841 proteína activadora de GTPasa Rho 11B 1,42 -0,29 MYST4 NM_012330 MYST histona acetiltransferasa 1,41 -0,31 (leucemia monocítica) 4
SYT17 NM_016524 sinaptotagmina XVII 1,40 -0,39 DPM2 NM_003863 polipéptido de doliquil-fosfato 1,30 -0,35 manosiltransferasa 2, subunidad
reguladora
TUB NM_003320 homólogo de tubby (ratón) 1,30 -0,27 TBPL1 NM_004865 tipo TBP 1 1,30 -0,28 FAM40B NM_020704 familia con similitud de secuencia 40, 1,30 -0,62 miembro B
D0LPP1 NM_020438 doliquil pirofosfato fosfatasa 1 1,29 -0,34 HIST1H2BM NM_003521 grupo de histonas 1, H2bm 1,29 -0,35 ZBTB7A NM_015898 que contiene dedo de cinc y dominio 1,28 -0,28 BTB SLC30A7 NM_133496 familia de transportador de soluto 30 1,25 -0,36 (transportador de cinc), miembro 7
HCRTR1 NM_001525 receptor 1 de hipocretina (orexina) 1,22 -0,27 DNAJB6 NM_005494 homólogo de DnaJ (Hsp40), subfamilia 1,22 -0,56 B, miembro 6
QPRT NM_014298 quinolinato fosforribosiltransferasa 1,20 -0,32 (continuación)
Factor de Factor de Referencia de aumento, reducción, Símbolo génico GenBank Nombre del gen complejo miR- transfección de 133a-Ago2 miR-133a CCDC75 NM_174931 que contiene dominio superenrollado 75 1,20 -0,29 NPTXR NM_014293 receptor de pentraxina neuronal 1,19 -0,63 RHOB NM_004040 familia del gen homólogo de ras, 1,19 -0,48
miembro B
CDH7 NM_004361 cadherina 7, tipo 2 1,17 -0,34 COL5A1 AK057231 colágeno, tipo V, alfa 1 1,17 -0,50 SGMS2 NM_152621 esfingomielina sintasa 2 1,16 -0,32 LOC643802 XM_001716860 similar a la fosfoproteína 10 de fase M 1,15 -0,53
(ribonucleoproteína nucleolar pequeña
U3)
BCL11A NM_018014 LLC de linfocitos B/linfoma 11A (proteína 1,14 -0,28
de dedos de cinc)
GEN1 NM_182625 homólogo de Gen 1, endonucleasa 1,14 -0,28
(Drosophila)
ZP1 NM_207341 glucoproteína 1 de la zona pelúcida 1,12 -0,30
(receptor de espermatozoide)
EFTUD1 NM_024580 factor de elongamiento Tu que contiene 1,12 -0,47
unión a GTP 1
REEP6 NM_138393 proteína accesoria de receptor 6 1,10 -0,58 UBA2 NM_005499 enzima activadora de modificador de tipo 1,08 -0,38
ubiquitina 2
BRIP1 NM_032043 proteína de interacción con BRCA1 C- 1,06 -0,27
terminal 1
KPTN NM_007059 kaptina (proteína de unión a actina) 1,06 -0,57 DZIP1 NM_014934 proteína de interacción con DAZ 1 1,04 -0,35 MGC16275 NR_026914 proteína hipotética MGC16275 1,04 -0,29 APTX NM_017692 aprataxina 1,03 -0,29 P2RX4 NM_002560 receptor purinérgico P2X, canal iónico 1,02 -0,29
activado por ligando, 4
PCDH24 NM_017675 protocadherina 24 1,00 -0,37
En general, se seleccionaron diez candidatos potenciales para genes diana de miR-133a con estos datos combinados. A continuación, la expresión de estas moléculas se redujo utilizando el sistema de atenuación de genes inducido por ARNip para investigar si estos candidatos son dianas funcionalmente importantes de miR-133a en células de osteosarcoma. Como resultado, la atenuación de cuatro candidatos (ANXA2, DUSP11, MAST4 y ROD1) en células SaOS2 CD133bajo potenció la resistencia a fármacos (Fig. 37), y la atenuación de cinco candidatos (ANXA2, DUSP11, SGMS2, SNX30 y UBA2) potenció la invasividad de células SaOS2 CD133bajo (Fig. 38).
Por supuesto, el efecto de la atenuación de estos genes diana potenciales sería similar al efecto ejercido por miR-133a en estos mismos genes, dando como resultado mayor resistencia al fármaco y mayor invasividad de células SaOS2 CD133bajo. Por el contrario, se esperaría que el silenciamiento de miR-133a en células SaOS2 CD133bajo fuera permisivo para la expresión de los genes diana potenciales, de este modo reduciendo la resistencia a fármacos y reduciendo la invasividad de células SaOS2 CD133bajo.
Para validar si estas moléculas están reguladas por miR-133a, el fragmento de 3'UTR (región no traducida) que contiene sitios de unión a miR-133a potenciales se clonó cadena abajo de una secuencia codificante de luciferasa y el indicador de luciferasa y los oligonucleótidos de miR-133a se cotransfectaron en células SaOS2. Como control, el indicador de luciferasa y los oligonucleótidos NO se cotransfectaron en células SaOS2. Las actividades de luciferasa se redujeron en aproximadamente 39-73 % en las células cotransfectadas con miR-133a en comparación con las células cotransfectadas con los oligonucleótidos CN (Fig. 39). A partir de los resultados de este ensayo, se encontró que ANXA2, DUSP11, MAST4, SGMS2, SNX30 y UBA2 actúan como dianas directas de miR-133a.
De hecho, se ha sugerido previamente que estos genes diana o genes de su familia actúan como supresores tumorales en otros cánceres determinados. Gostissa, M et al. (1999) EMBO J. 18:6462-71; Caprara, G et al. (2009) J. Cell. Mol. Med. 13:2158-70; Nguyen, LN et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12:6952-9. Se ha indicado que ANXA2

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una cantidad eficaz de una molécula antisentido específica para un microARN (miARN) seleccionado de miR-1, miR-10b y miR-133a para su uso en el tratamiento del osteosarcoma en un sujeto que lo necesite.
2. La molécula antisentido para su uso según la reivindicación 1, en donde:
(a) la molécula antisentido es ARN estabilizado, opcionalmente en donde el ARN estabilizado es un oligonucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA); o
(b) la molécula antisentido es ADN.
3. La molécula antisentido para su uso según la reivindicación 1, en donde la molécula antisentido tiene una longitud de 20-30 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90 por ciento idéntica a
5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4),
5'-ACAAATTCGGTTCTACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6); opcionalmente
en donde la molécula antisentido tiene una longitud de 21-30 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95 por ciento idéntica a
5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4),
5'-ACAAATTCGGTTCTACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5) o
5-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6); opcionalmente, además,
en donde la secuencia de la molécula antisentido es
5'-ACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 4),
5'-ACAAATTCGGTTCTACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 5) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAA-3' (SEQ ID NO: 6).
4. La molécula antisentido para su uso según la reivindicación 1, en donde la molécula antisentido tiene una longitud de 20-30 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90 por ciento idéntica a
5'-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-CACAAATTCGGTT CT ACAGGGT A-3' (SEQ ID NO: 11) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12); opcionalmente
en donde la molécula antisentido tiene una longitud de 21-30 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95 por ciento idéntica a
5'-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-CACAAATTCGGTT CT ACAGGGT A-3' (SEQ ID NO: 11) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12); opcionalmente, además,
en donde la secuencia de la molécula antisentido es
5'-AUACAUACUUCUUUACAUUCCA-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-ATACATACTTCTTTACATTCCA-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-CACAAATTCGGTT CT ACAGGGT A-3' (SEQ ID NO: 11) o
5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3' (SEQ ID NO: 12).
5. La molécula antisentido para su uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la molécula antisentido está asociada con un vehículo de suministro de ácido nucleico y/o en donde el osteosarcoma es osteosarcoma metastásico.
6. Un método para evaluar la resistencia del osteosarcoma a una terapia antineoplásica en una muestra de tejido que comprende células de osteosarcoma, que comprende:
aislar de la muestra células que expresan CD133;
medir un primer nivel de expresión por las células que expresan CD 133 de al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a;
poner en contacto las células que expresan CD133 con una terapia antineoplásica; y
medir un segundo nivel de expresión por las células que expresan CD133 del al menos un miARN, en donde un segundo nivel de expresión mayor que el primer nivel de expresión indica que el osteosarcoma es resistente a la terapia antineoplásica.
7. El método de la reivindicación 6, en donde la terapia antineoplásica se selecciona del grupo que consiste en cisplatino, doxorrubicina, metotrexato y cualquier combinación de los mismos.
8. Un método de detección del osteosarcoma en una muestra de tejido de un sujeto, que comprende:
realizar un ensayo específicamente capaz de detectar al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a, en donde la detección por el ensayo de la presencia en la muestra del al menos un miARN indica que el sujeto está en riesgo de tener osteosarcoma.
9. El método de la reivindicación 8, en donde el tejido es sangre o suero.
10. Un método para controlar el osteosarcoma en una muestra de tejido obtenida de un sujeto que tiene osteosarcoma o que ha sido tratado de osteosarcoma, que comprende:
(a) realizar un ensayo específicamente capaz de cuantificar el nivel de expresión de al menos un microARN (miARN) seleccionado del grupo que consiste en miR-1, miR-10b y miR-133a; y
(b) repetir la etapa (a) en una muestra de tejido obtenida posteriormente del sujeto, en donde un nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida posteriormente mayor que el nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida anteriormente indica que el osteosarcoma es progresivo y un nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida posteriormente menor que el nivel de expresión del al menos un miARN en la muestra obtenida anteriormente indica que el osteosarcoma es regresivo.
11. El método de la reivindicación 10, en donde el tejido es sangre o suero.
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