CN113684279A - 一种诊断骨肉瘤的引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诊断骨肉瘤的引物组、试剂盒及检测方法，属于核酸检测技术领域，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述试剂盒包括快速检测骨肉瘤特异微小RNA的引物组。本发明应用Poly(A)加尾法原理，通过设计特异性引物，应用实时荧光定量PCR技术建立了快速检测骨肉瘤血清特异微小RNA的方法，该方法只需一次加样、一个反应管和一个反应体系在2小时内完成多样品的骨肉瘤血清特异微小RNA的检测，具有快速、高效和准确等优点，该方法节省加样时间、实验成本，具有快速、有效一次性检测多个样本的优势，可以为临床检测及时提供有效数据。

Description

一种诊断骨肉瘤的引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种诊断骨肉瘤的引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

骨肉瘤是发展迅速的骨原发恶性肿瘤。手术、化疗、放疗的联合应用显著提高了骨肉瘤患者的生存率，但骨肿瘤患者的预后仍然很差。大多数骨肉瘤患者最终会死于肺转移。研究结果证明，骨肉瘤的发生和演变与基因突变和表达水平密切相关。因此，研究骨肉瘤潜在的基因分子表达机制，寻找潜在的生物标志物和治疗靶点，对于疾病的早期诊断和新治疗方案的提出至关重要。微小RNA作为血清分子靶标在肿瘤早期诊断中已有初步的应用，但市场上未有骨肉瘤相关微小RNA血清检测的试剂盒。

对于骨肉瘤的尽早诊断对指导临床制定诊疗方案至关重要，可有效减少肿瘤扩散及延长患者生存时间。组织活检是诊断骨肉瘤的传统手段。目前国内临床普遍采用的组织活检流程整体耗时约14-21天，该方法耗时长，远远不能满足临床对骨肉瘤快速诊断和制定诊疗方案的需要。同时，组织取样造成的肿瘤扩散风险更难以控制。因此传统诊断手段无法实现数小时内骨肉瘤的快速诊断及规避有创操作带来的癌灶扩散风险。

近年来，随着人们对微小RNA研究的逐渐加深，微小RNA作为癌症诊断及干预靶标的潜力逐渐展现。基于血清微小RNA的诊断，可通过PCR技术使用特异性识别核酸序列诊断癌症，具有简捷、快速、特异、灵敏的优点。并且该方法在临床肿瘤诊断及治疗方面已建立了一系列的快速检测诊断平台，包括：肝癌、乳腺癌等癌症相关miRNA的鉴定。但目前为止，尚未有利用PCR技术检测血清微小RNA的试剂盒出现，尤其是没有检测骨肉瘤血清特异微小RNA的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种诊断骨肉瘤的引物组、试剂盒及检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法能够快速、高效和准确地检测骨肉瘤血清特异微小RNA，大大缩短了检测时间，节约了检测成本，提高了检测效率。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种快速检测骨肉瘤特异微小RNA的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述特异微小RNA为hsa-miR-338-3p。

本发明还提供上述引物组在制备检测骨肉瘤特异微小RNA的产品中的应用。

进一步的，所述产品通过测定样本中hsa-miR-338-3p的表达水平以诊断骨肉瘤。

进一步的，所述样本包括血清。

进一步的，所述产品包括通过荧光定量PCR来检测hsa-miR-338-3p的水平以诊断骨肉瘤的产品。

进一步的，所述产品具体包括以下使用方法：

步骤1：提取待检样品中的RNA；

步骤2：以提取的RNA为模板，合成cDNA，利用所述引物组进行荧光定量PCR；

步骤3：对扩增产物进行熔解曲线分析，以阴性质控品为对照，鉴定样品中骨肉瘤血清特异微小RNA分子hsa-miR-338-3p。

进一步的，步骤2中所述荧光定量PCR的反应体系由以下组分构成：2U/μL Ace Taq酶1μL，2.5mM dNTP Mixture 4μL，1.5mM Mg²⁺3μL，2.5U/μL RNaseH 1.5μL，SYBRGreen I0.5μL，所述引物组中各引物分别为0.2μL，样本DNA 3μL以及ddH₂O补充至20μL；所述样本DNA的浓度为20-100ng/mL。

进一步的，步骤2中所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min，95℃10s，60℃30s，40个循环。

进一步的，步骤3中所述熔解曲线分析程序为：95℃变性15s；升温范围为60℃-95℃，升温速率为0.11℃/s，以5次/℃连续采集荧光信号，进行熔解曲线分析。

本发明还提供一种快速检测骨肉瘤特异微小RNA的试剂盒，所述试剂盒包括上述快速检测骨肉瘤特异微小RNA的引物组。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明应用Poly(A)加尾法原理，通过设计特异性引物，应用实时荧光定量PCR技术建立了快速检测骨肉瘤血清特异微小RNA的方法，该方法只需一次加样、一个反应管和一个反应体系在2小时内完成多样品的骨肉瘤血清特异微小RNA的检测，具有快速、高效和准确等优点，大大缩短了检测时间，节约了检测成本，提高了检测效率。

(2)相比于其他的PCR，如探针法多重PCR，需同时设计和合成引物和探针，taqman探针的修饰基团费用昂贵，容易相互之间产生干扰。而本发明采用设计特异性引物的实时荧光定量PCR熔解曲线法是非常经济、快速、有效的方法，整个反应过程全封闭、稳定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2中实时荧光定量PCR扩增曲线图，其中灰色线条为内参U6，黑色线条为hsa-miR-338-3p；

图2为实施例2中实时荧光定量PCR熔解曲线图，其中灰色线条为内参U6，黑色线条为hsa-miR-338-3p；

图3为实施例2中hsa-miR-338-3p在健康人和骨肉瘤患者血清中的表达量比较。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

一种快速检测骨肉瘤特异微小RNA的试剂盒的组成和检测方法

1、试剂盒的组成

(1)引物组：用于检测骨肉瘤特异微小RNA,hsa-miR-338-3p的扩增引物对包括根据Poly(A)加尾法原理,即PCR产物的3'末端添加一个"A"，故可以与有突出"T"的引物相连特性设计的特异引物hsa-miR-338-3p-F和通用下游引物。

hsa-miR-338-3p基因的扩增引物对为：

hsa-miR-338-3p-F(SEQ ID NO:1)：5’-CGCAACAATATCCTGGTGCTGAGTG-3’；

通用下游引物(SEQ ID NO:2)：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

PCR引物由北京艾德莱生物科技有限公司合成。

(2)试剂盒的配制过程

配制20μL PCR反应体系(如表1所示)：

表1 20μL PCR反应体系

2、试剂盒检测骨肉瘤血清特异微小RNA的方法

步骤1：提取样品的核酸：采用微小RNA提取试剂盒(购自艾德莱生物科技有限公司)提取待检血清样品中的微小RNA；

步骤2：以提取的微小RNA为模板，采用miRNA第一链合成试剂盒(购自艾德莱生物科技有限公司)，合成cDNA；所述cDNA模板的浓度为20-100ng/mL；以U6作为相对定量内参，利用上述引物组进行实时荧光定量PCR，实时荧光定量PCR反应体系如上述表1所示，加入0.2mL光学PCR反应管中，然后轻轻将盖盖好；

PCR反应程序为：95℃10min，95℃10s，60℃30s，40个循环。

步骤3：对扩增产物进行熔解曲线分析，以基于正常人表达水平的阴性质控品为对照，以U6作为相对定量内参，以鉴定血清样品中骨肉瘤特异微小RNA,hsa-miR-338-3p。熔解曲线分析程序为：95℃变性15s；升温范围为60℃-95℃，升温速率为0.11℃/s，以5次/℃连续采集荧光信号，进行熔解曲线分析。

实施例2

利用实施例1所述的试剂盒检测骨肉瘤血清特异微小RNA的方法

1、样本

收集正常人血清临床样本，再利用实施例1所述的方法获取cDNA，将其制作成阴性cDNA样本。本实施例中采用的临床样本为骨肉瘤患者血清样本，对于骨肉瘤组织分型及病灶部位并无限制。

2、血清中骨肉瘤特异微小RNA,hsa-miR-338-3p的检测

先按实施例1中表1配制PCR反应液，设置3个平行，进行分装于2mL反应管中，并分别加入待测模板，盖好管盖后放入Applied Biosystems StepOnePlus 96荧光实时PCR仪，采用以下反应程序进行PCR反应：95℃ 10min，95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环。实时荧光PCR扩增曲线如图1所示。

扩增结束后即使用Applied biosystems StepOnePlus real Time PCRInstrument仪器进行熔解曲线检测，熔解过程为95℃变性15s；升温范围为60℃-95℃，升温速率为0.11℃/s，以5次/℃连续采集荧光信号，进行熔解曲线分析。熔解曲线分析结果如图2所示。

3、统计方法

每个实验重复3次，数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS21.0统计软件进行统计分析。两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、实验结果

如图3所示，与正常人群相比，骨肉瘤患者血液中骨肉瘤特异微小RNA,hsa-miR-338-3p表达水平有降低趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。

通过以上实验结果发现：在同一反应体系中，在2小时内完成骨肉瘤血清特异微小RNA检测，并且应用Poly(A)加尾法原理设计的特异引物通过实时荧光PCR检测骨肉瘤血清特异微小RNA，hsa-miR-338-3p，能够准确区分骨肉瘤患者及正常人。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 核工业总医院

<120> 一种诊断骨肉瘤的引物组、试剂盒及检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcaacaata tcctggtgct gagtg 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (10)

1.一种快速检测骨肉瘤特异微小RNA的引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述特异微小RNA为hsa-miR-338-3p。

2.一种根据权利要求1所述的引物组在制备检测骨肉瘤特异微小RNA的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品通过测定样本中hsa-miR-338-3p的表达水平以诊断骨肉瘤。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样本包括血清。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过荧光定量PCR来检测hsa-miR-338-3p的水平以诊断骨肉瘤的产品。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品具体包括以下使用方法：

步骤1：提取待检样品中的RNA；

步骤2：以提取的RNA为模板，合成cDNA，利用所述引物组进行荧光定量PCR；

步骤3：对扩增产物进行熔解曲线分析，以阴性质控品为对照，鉴定样品中骨肉瘤血清特异微小RNA分子hsa-miR-338-3p。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2中所述荧光定量PCR的反应体系由以下组分构成：2U/μL Ace Taq酶1μL，2.5mM dNTP Mixture 4μL，1.5mM Mg²⁺3μL，2.5U/μLRNaseH 1.5μL，SYBRGreen I0.5μL，所述引物组中各引物分别为0.2μL，样本DNA 3μL以及ddH₂O补充至20μL；所述样本DNA的浓度为20-100ng/mL。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2中所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃10min，95℃10s，60℃30s，40个循环。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3中所述熔解曲线分析程序为：95℃变性15s；升温范围为60℃-95℃，升温速率为0.11℃/s，以5次/℃连续采集荧光信号，进行熔解曲线分析。

10.一种快速检测骨肉瘤特异微小RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的快速检测骨肉瘤特异微小RNA的引物组。

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