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ES2708124T3 - Procedimiento para preparar moléculas heteromultiméricas - Google Patents

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ES2708124T3
ES2708124T3 ES10772544T ES10772544T ES2708124T3 ES 2708124 T3 ES2708124 T3 ES 2708124T3 ES 10772544 T ES10772544 T ES 10772544T ES 10772544 T ES10772544 T ES 10772544T ES 2708124 T3 ES2708124 T3 ES 2708124T3
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Austin L Gurney
Aaron Ken Sato
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Oncomed Pharmaceuticals Inc
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Oncomed Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un procedimiento para preparar un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a VEGF y DLL4, en el que el anticuerpo biespecifico comprende un primer y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3, comprendiendo el procedimiento sustituir al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del 5 primer polipeptido de inmunoglobulina y sustituir al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del segundo polipeptido de inmunoglobulina para promover la formacion de un anticuerpo biespecifico, en el que el anticuerpo biespecifico se selecciona del grupo que consiste en: (a) una IgG1 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 253 y 292 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 240 y 282 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con lisina; (b) una IgG2 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de SEQ ID NO:33 se reemplazan con lisina; (c) una IgG3 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 300 y 339 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 287 y 329 de SEQ ID NO:34 se reemplazan con lisina; y (d) una IgG4 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 250 y 289 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 237 y 279 de SEQ ID NO:35 se reemplazan con lisina, en el que el primer polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un primer polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un segundo polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina; y en el que el primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina.

Description

DESCRIPCION
Procedimiento para preparar moleculas heteromultimericas
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Campo de la Invencion
La presente invencion proporciona procedimientos para preparar moleculas heteromultimericas, tales como anticuerpos biespecificos, y composiciones que comprenden dichas moleculas. Los procedimientos incluyen la introduccion de sustituciones en aminoacidos que estan en contacto en la interfaz entre dos polipeptidos. Dichas sustituciones incluyen cambios en los aminoacidos que resultan en interacciones electrostaticas y/o hidrofobas/hidrofilas alteradas entre los polipeptidos que forman las moleculas heteromultimericas. Las sustituciones dan como resultado moleculas multimericas en las que se desfavorecen las moleculas homomultimericas, y se forman preferentemente moleculas heteromultimericas.
Tecnica Anterior
El sello distintivo de los anticuerpos monoclonales es su capacidad para unirse especificamente a un antigeno particular, lo que les permite unirse a su diana in vivo pero no a los sitios negativos para el antigeno. Una vez que se unen a una diana, los anticuerpos monoclonales terapeuticos pueden administrar una carga util toxica, actuar como agonistas o antagonistas de receptores, o como neutralizadores de ligandos. Los anticuerpos monoclonales tambien pueden modificarse para tolerarse inmunologicamente en mayor medida en varias especies. Una de tales modificaciones, que conlleva la sustitucion de aminoacidos en regiones estructurales con aminoacidos encontrados en humanos, es la humanizacion. Los anticuerpos humanizados pueden entonces modificarse aun mas. Una de tales modificaciones es armar el anticuerpo humanizado con mecanismos citotoxicos adicionales, ya sean radioisotopos, toxinas bacterianas, citoquinas inflamatorias, quimioterapeuticos o profarmacos.
Existe un numero creciente de terapias para el cancer aprobadas que son eficaces ya sea como un anticuerpo quimerizado (Rituximab) o lgG1 humanizada (Herceptin y Campath-1H), como conjugado con quimioterapeuticos (Mylotarg) o un radioisotopo (Zevalin y Bexxar). A pesar de este progreso, la eficacia de los anticuerpos monoclonales para el tratamiento del cancer es aun limitada, lo que deja un gran potencial para nuevas mejoras. Una clase de derivados de anticuerpos con la promesa de una potencia mejorada para el tratamiento del cancer son los anticuerpos biespecificos.
Los anticuerpos con una especificidad dual en sus brazos de union generalmente no ocurren en la naturaleza y, por lo tanto, se desarrollaron a traves de la tecnologia de ADN recombinante o fusion celular. La mayoria de los anticuerpos biespecificos estan disenados para reclutar eficazmente celulas efectoras citotoxicas del sistema inmunitario contra celulas diana patogenas. Despues de mas de 15 anos de investigacion exhaustiva, se han desarrollado muchos tipos diferentes de anticuerpos biespecificos, pero solo unos pocos han alcanzado los ensayos clinicos.
Entre los primeros anticuerpos biespecificos se disenaron construcciones para redirigir las celulas T contra las celulas diana del cancer. Las celulas diana se destruyen cuando los linfocitos T citotoxicos (CTL) se unen a las celulas tumorales y se activan simultaneamente por un brazo del anticuerpo biespecifico que interactua con el complejo receptor de celulas T (TCR)-CD3. Los CTL, que se consideran las celulas asesinas mas potentes del sistema inmunologico, no pueden activarse por anticuerpos monoclonales porque carecen de receptores Fey.
Otro tipo de anticuerpo biespecifico es el que se une simultaneamente a las celulas tumorales y un receptor de Fey activador, por ejemplo, CD64/FcyRI en monocitos. La union de este tipo de anticuerpo biespecifico a los receptores Fey puede provocar la activacion de celulas efectoras, sin competirse por la union simultanea de IgG normal.
Un procedimiento para generar anticuerpos biespecificos se ha denominado la estrategia "boton en ojal" (ver, por ejemplo, WO 2006/028936 , WO 98/50431 , US 2002/062010 ). El emparejamiento incorrecto de las cadenas pesadas de Ig se reduce en esta tecnologia mediante la mutacion de aminoacidos seleccionados que forman la interfaz de los dominios CH3 en la IgG humana. En las posiciones dentro del dominio CH3 en las que las dos cadenas pesadas interactuan directamente, se introduce un aminoacido con una pequena cadena lateral (ojal) en la secuencia de una cadena pesada y un aminoacido con una gran cadena lateral (boton) en la de la otra. Como resultado, se ha descrito que la interaccion de proteinas entre botones y ojales conduce a la formacion de hasta el 90% de la IgG humana biespecifica correcta por parte de las celulas huesped de mamiferos transfectadas. El documento WO 2007/147901 describe un procedimiento para producir anticuerpos biespecificos en los que las combinaciones de mutacion del dominio CH3 favorecen la formacion de heterodimeros electrostaticos.
La presente invencion proporciona procedimientos para formar preferentemente moleculas heteromultimericas mediante la mutacion de aminoacidos seleccionados que interactuan en la interfaz entre dos polipeptidos al reemplazar un residuo de aminoacido involucrado en interacciones hidrofilicas con un residuo de aminoacido mas hidrofobico y/o reemplazar un aminoacido involucrado en una interaccion de carga con otro aminoacido. Las moleculas heteromultimericas son anticuerpos biespecificos que se unen especificamente a VEGF y DLL4. Los documentos WO 2008/042236 y WO 2008/060705 divulgan anticuerpos anti-DLL4 y la terapia de combinacion de estos anticuerpos con anticuerpos anti-VEGF.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a VEGF y DLL4, en el que el anticuerpo biespecifico comprende un primer y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3, comprendiendo el procedimiento sustituir al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del primer polipeptido de inmunoglobulina y sustituyendo al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del segundo polipeptido de inmunoglobulina para promover la formacion de un anticuerpo biespecifico, en el que el anticuerpo biespecifico se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una lgG1 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 253 y 292 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 240 y 282 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con lisina;
(b) una lgG2 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de SEQ ID NO:33 se reemplazan con lisina;
(c) una lgG3 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 300 y 339 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 287 y 329 de SEQ ID NO:34 se reemplazan con lisina; y
(d) una lgG4 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 250 y 289 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 237 y 279 de SEQ ID NO:35 se reemplazan con lisina,
en el que el primer polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un primer polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un segundo polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina; y en el que el primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina y el segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina son identicos en secuencia de aminoacidos.
La invencion tambien proporciona un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a VEGF y DLL4, en el que el anticuerpo biespecifico comprende un primer y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3, en el que el anticuerpo biespecifico se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una lgG1 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 253 y 292 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 240 y 282 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con lisina;
(b) una lgG2 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con lisina;
(c) una lgG3 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 300 y 339 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 287 y 329 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con lisina; y
(d) una lgG4 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 250 y 289 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 237 y 279 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con lisina,
en el que el primer polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un primer polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un segundo polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina; y
en el que el primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina y el segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina son identicos en secuencia de aminoacidos.
La invencion tambien proporciona un anticuerpo biespecifico que comprende un primer polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7, y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:9.
La invencion tambien proporciona un polinucleotido que codifica los polipeptidos o anticuerpos mencionados anteriormente.
La invencion tambien proporciona una celula huesped que comprende el polinucleotido mencionado anteriormente. La invencion tambien proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo que comprende cultivar la celula huesped mencionada anteriormente en condiciones que dan como resultado la expresion del anticuerpo o polipeptido.
La invencion tambien proporciona el uso de dichos anticuerpos en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer y en el tratamiento del cancer.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Figura 1: La estructura de los dominios CH2 y CH3 del anticuerpo. La estructura se muestra en vista de cinta usando el programa de software Pymol (DeLano Scientific: LLC, California, EE. UU.) de la estructura del dominio fc del anticuerpo depositada en el PDB (archivo 1FC1) ( Deisenhofer.J. (1981) Biochemistry, 20, 2361-2370 ). Se muestran los dominios CH2 y CH3 de cada cadena en la estructura dimerica. La dimerizacion del fragmento Fc esta mediada a traves de las interacciones entre los dominios CH3.
Figura 2: La interfaz del dimero CH3. Se muestra una vista de estructura de cinta del dominio CH3. A la izquierda hay una imagen del dimero de dos dominios CH3. A la derecha hay una imagen de un solo dominio CH3 con representacion de las cadenas laterales de aminoacidos con potencial para participar en interacciones entre cadenas.
Figura 3: Los aminoacidos seleccionados estan involucrados en las interacciones entre cadenas. Se muestran tres vistas separadas del dominio CH3 dimerizado elegidas para ver mejor los residuos de aminoacidos particulares. La estructura se muestra en vista de cinta usando el programa de software Pymol (DeLano Scientific LLC, California, EE. UU.). Cada vista resalta los aminoacidos seleccionados que se postulan para contribuir al emparejamiento entre cadenas. Los aminoacidos individuales se destacan por la representacion de las cadenas laterales y por la notacion del aminoacido y la posicion. El esquema de numeracion es relativo a la region constante de lgG2 humana.
Figura 4: La alineacion de los isotipos de IgG humana. Se muestra una alineacion de la region constante de los isotipos de IgG humana lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. El dominio CH3 esta indicado por lineas. Los aminoacidos individuales que se destacaron en la Figura 2 y la Figura 3 y se postulan para desempeharfunciones en las interacciones entre cadenas se indican mediante circulos rellenos.
Figura 5: Un formato de ensayo para evaluar la homodimerizacion y la heterodimerizacion. Para determinar la propension relativa de una variante de Fc a homodimerizar o heterodimerizar con otra variante de Fc, generamos una construccion de expresion de "mini-cuerpo" que codifica la region conectora y los dominios CH2-CH3 (aminoacidos 103-326 de la region constante de lgG2 humana) de lgG2 unida a una secuencia de serial N terminal y epitopo FLAG. Esta construccion, cuando se transfectan las celulas dirige la expresion de un dominio Fc dimerico secretado (aqui denominado "minicuerpo"). Como se revelo en el analisis de Western blot, el tamano del minicuerpo es sustancialmente mas pequeno que el tamano de un anticuerpo intacto producido al transfectar celulas con vectores de expresion que codifican cadenas pesadas y ligeras. La formacion de heterodimeros se puede evaluar mediante la transfeccion de una celula con vectores que codifican tanto el anticuerpo intacto como la construccion de dominio Fc del mini-cuerpo. La formacion de heterodimeros dara como resultado una molecula de tamano intermedio que contiene una cadena de minicuerpo y una cadena pesada de longitud completa complejada con una cadena ligera.
Figura 6: Variantes de anticuerpos queforman eficientemente dominios Fc heterodimericos. Se generaron plasmidos de vectores de expresion que codifican minicuerpos marcados con FLAG con dominios CH2 y CH3 de lgG2 humana natural (WT), y variantes (Var1, tambien denominada 13B, y Var2), una cadena pesada de longitud completa con dominios CH2 y CH3 de lgG2 humana natural (WT), o una variante (Var3/13A), y una cadena ligera de longitud completa (L2). Var1 contiene la sustitucion del aminoacido 249 Lys a Glu y la sustitucion del aminoacido 288 Lys a Glu dentro del dominio CH3. El anticuerpo Var2 contiene sustituciones del aminoacido 249 Lys a Glu, del aminoacido 286 Tyr a Phe y del aminoacido 288 Lys a Glu dentro del dominio CH3. El anticuerpo Var3 (tambien denominado 13A) contiene sustituciones del aminoacido 236 Glu a Lys y del aminoacido 278 Asp a Lys. Las celulas HEK293 se transfectaron transitoriamente con combinaciones de vectores de expresion como se indica. Se realizo un analisis Western blot no reductor con un anticuerpo anti-FLAG para revelar el tamano de los productos de anticuerpos secretados. La lgG2 humana natural exhibe facilmente homodimerizacion, como se muestra en el panel derecho donde se detecta facilmente el "minicuerpo" marcado con Flag expresado que contiene el dominio CH2-CH3 humano natural. El anticuerpo Var1 (13B) ha reducido enormemente la capacidad de homodimerizarse. El anticuerpo Var2 exhibe poca o ninguna capacidad para homodimerizarse. En el panel central y en el panel izquierdo, las variantes de minicuerpo se coexpresan con las variantes de cadena pesada de longitud completa, y se producen formas de anticuerpos heterodimeros. La coexpresion de la cadena pesada de longitud completa y el minicuerpo natural da como resultado la production de ambos homodimeros (como lo demuestra claramente el Western blot anti-FLAG en el panel central y las bandas de masa intermedias observadas en el Western blot anti-Fc en el panel derecho). Estos datos muestran que la coexpresion de Var1 (13B) y Var3 (13A) da como resultado una homodimerizacion preferencial, y que la coexpresion de Var2 y Var3 da como resultado una formation casi exclusiva de heterodimero.
Figura 7: La union de un anticuerpo biespecifico se une a dos dianas. Se realizo un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para examinar la capacidad de la variante de anticuerpo biespecifico (Var2-Var3) para unirse a los antigenos. Las placas de ELISA se recubrieron ya sea sin antigeno (-), con anticuerpo anti-FLAG (0,05 mg/ml, cion M2 de SIGMA) o con DLL4 humana recombinante (0,1 mg/ml) (aminoacidos 27-519 con marca carboxi-terminal 8xHis). Las placas recubiertas se incubaron luego con medio de cultivo celular de control (control negativo) o medio condicionado de celulas transfectadas con vectores de expresion que codifican Var2, Var3 y la cadena ligera L2 como se indica. Los resultados muestran que la variante de anticuerpo biespecifico producida por la coexpresion de las cadenas pesadas Var2 y Var3 y la cadena ligera L2 es capaz de unirse a DLL4, el anticuerpo reconocido por el anticuerpo natural original usado para generar Var3, y tambien de unirse al anticuerpo anti-FLAG debido a la marca del epitopo FLAG presentada por el brazo de la variante de cadena pesada Var2.
Figura 8: El Fab Anti-VEGF (219R0302) bloquea parcialmente la proliferacion de celulas HUVEC inducida por VEGF. Las celulas HUVEC del dia 7 se seleccionaron para la inhibition de la proliferacion contra el fragmento Fab 219R0302 del anti-VEGF. Se utilizo M199- 2% FBS como medio de inanition y el volumen se normalizo a la concentration mas baja de la muestra de prueba. Se analizo el Fab 219R0302 contra varios anticuerpos de prueba, bevacizumab (Avastin) y VEGF humano recombinante como control.
Figura 9: El Fab Anti-VEGF (219R0302) bloquea la union del Fc VEGFR2 a superficie biacore de hVEGF. Se genero una superficie VEGF utilizando quimica estandar NHS/EDC en un chip CM5. El Fab 219R0302 o un Fab de control no ligador se hicieron fluir sobre la superficie y luego inmediatamente despues se inyecta VEGFR2. Como se muestra, VEGFR2 se unio bien a VEGF en el experimento del Fab de control y se bloqueo en el experimento del Fab 219R0302.
Figura 10: Las IgG anti-VEGF (219R0302y 219R0202) bloquean la proliferacion de celulas HUVEC inducida por VEGF en un grado similar al bevacizumab (Avastin). Las IgG 21R0302 y 219R0202 se reformatearon a lgG2, se expresaron y se purificaron para pruebas in vitro confirm atari as.
Figura 11: Los anticuerpos anti-VEGF 219R0302 y 219R0202 inhiben el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto de tumor de mama PE13. Se inyectaron 300,000 celulas PE13 viables por via subcutanea en el flanco derecho de los ratones. El 219R0302 indujo un retraso en el crecimiento del tumor mas fuerte que el 219R0202. Avastin mostro el retraso de crecimiento mas potente, que era indistinguible del 219R0302, lo que indica que219R0302 y Avastin tienen una potencia casi equivalente en este modelo. A diferencia de 219R0302, 219R0202 fue estadisticamente diferente tanto de Avastin como de 219R0302.
Figura 12: Formatos de anticuerpos biespecificos. A) Anticuerpo biespecifico de un solo gen (SGBSP). En este formato, cada cadena ligera esta atada a su cadena pesada respectiva a traves de un conector de 30 aminoacidos (6XGGGGS); B) Anticuerpo biespecifico monovalente (MBSP). En este formato, se usa una cadena ligera comun, que puede derivarse de cualquiera de los anticuerpos originales. Una o ambas de las cadenas pesadas deben poder unirse a su diana en combination con una cadena ligera comun.
Figura 13: SGBSP y MBSP son mas del 90% de heterodimeros y el homodimero puede eliminarse variando la relacion Var3/Nar1. A) SGBSP (219R0202_21M18) y MBSP (219R0202 de cadena pesada (13AA/ar3), 21M18 de cadena pesada (13B/Var1), 21M18 de cadena ligera) purificados con proteina A son >90% puros y contienen una pequena fraccion del homodimero Var1 (SBBSP): Homodimero SGBSP 21M18 (13B/Var1); MBSP: 21M18 de cadena pesada (13B/Var1) con 21M18 de cadena ligera). Carril 1: Estandar, Carril 2: 21M18, Carril 3: MBSP, Carril 4: En bianco, Carril 5: SGBSP. Heterodimero MBSP pi ~ 7,1; homodimero MBSP 13A pi ~ 8,3; homodimero MBSP 13B pi ~ 6,2; heterodimero SGBSP pi ~ 7,8; homodimero SGBSP 13A pi ~ 8,6; homodimero SGBSP 13B pi ~ 6,4. B) La fraccion del homodimero MBSP 13B/Var1 se puede minimizar usando al menos un exceso molar de 2:1 veces de la cadena pesada 219R0202 (13A/Var3) a la cadena pesada 21M18 (13B/Var1). 13A:13B Relacion de HC: carril 1, 1:8; carril 2, 1:6; carril 3, 1:4; carril 4, 1:2; carril 5, 1:1; carril 6, 2:1; carril 7, 4:1; carril 8, 6:1; carril 9, 8:1; carril 10, escalera.
Figura 14: Los SGBSP bloquean parcialmente la proliferacion de celulas HUVEC inducida por VEGF. Tanto el SGSPS 219R0302_21M18 como el 219R020221M18 inhibieron parcialmente la proliferacion de HUVEC inducida por VEGF, y este ultimo mostro una actividad significativamente mejor que el primero.
Figura 15: Los anticuerpos biespecificos se unen bien a las celulas transfectadas con hDLL4. LZ1, control de anticuerpos no especificos; SGBSP, 219R020221M18 anticuerpo biespecifico de gen unico; MBSP, 219R0202_21M18 anticuerpo biespecifico monovalente con 21M18 LC comun; Homo 13A, 219R0202 HC (con mutacion 13A) expresado solo con 21M18 LC; Homo 13B, 21M18 HC (con mutacion 13B) expresado solo con 21M18 LC. Las curvas de union se ajustaron a una transformada no lineal para obtener un valor de EC50, que se indica entre parentesis (NF, indica que no hay ajuste).
Figura 16: Tanto los SGBSP como MBSP se unen tanto a VEGF como DLL4 de manera biespecifica. Usando el ensayo de direccionamiento dual, tanto el 219R0302_21M18 como el 219R0202_21M18, tanto los SGBSP (panel A) como el MBSP (panel B) se muestran uniendose tanto a VEGF como a DLL4.
Figura 17: SGBSP muestra inhibicion parcial en el ensayo de proliferacion inducida por VEGF. SGBSP mostro una inhibicion parcial de la proliferacion inducida por VEGF en comparacion con los controles de bevacizumab (Avastin) y rhVEGF.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Se proporcionan procedimientos, composiciones y kits para generar polipeptidos heteromultimericos, tales como anticuerpos biespecificos. La invencion permite la generacion de moleculas heteromultimericas que tienen altos rendimientos. Los detalles de los procedimientos, composiciones y kits se proporcionan en el presente documento. Por "modo de realizacion" se pretende una caracteristica que no necesariamente debe tomarse por si sola para interpretar la invencion.
Un "heteromultimero", "complejo heteromultimerico", "polipeptido heteromultimerico", o "molecula heteromultimerica" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una molecula que comprende al menos un primer polipeptido y un segundo polipeptido, en la que el segundo polipeptido se diferencia en la secuencia de aminoacidos del primer polipeptido en al menos un residuo de aminoacido. El heteromultimero puede comprender un "heterodimero" formado por el primer y segundo polipeptidos o puede formar estructuras terciarias de orden superior en las que estan presentes mas polipeptidos ademas del primer y segundo polipeptidos.
Excepto cuando se indique lo contrario por el contexto, los terminos "primer" polipeptido y "segundo" polipeptido, y sus variaciones, son simplemente identificadores genericos, y no deben tomarse como identificacion de un polipeptido o componente especifico o particular de heteromultimeros de la invencion.
Los terminos "polipeptido", "peptido", "proteina" y "fragmento de proteina" se usan indistintamente en este documento para referirse a un polimero de residuos de aminoacidos. Los terminos se aplican a polimeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacidos son un mimetico quimico artificial de un aminoacido natural correspondiente, asi como a polimeros de aminoacidos naturales y polimeros de aminoacidos no naturales.
El termino "aminoacido" se refiere a aminoacidos naturales y sinteticos, asi como a analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos que funcionan de manera similar a los aminoacidos naturales. Los aminoacidos naturales son aquellos codificados por el codigo genetico, asi como aquellos aminoacidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los analogos de aminoacidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura quimica basica que un aminoacido natural, por ejemplo, un carbono alfa que esta unido a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfoxido, metionina metil sulfonio. Dichos analogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptidicos modificados, pero retienen la misma estructura quimica basica que un aminoacido natural. Los mimeticos de aminoacidos se refieren a compuestos quimicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura quimica general de un aminoacido, pero que funciona de manera similar a un aminoacido natural. Los aminoacidos cargados negativamente incluyen acido aspartico (o aspartato) y acido glutamico (o glutamato). Los aminoacidos cargados positivamente incluyen arginina, histidina y lisina.
Como se usa en este documento, los terminos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el sentido mas amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos siempre que exhiban la actividad biologica deseada) y fragmentos de anticuerpos como se describe en el presente documento. El termino "anticuerpo biespecifico" pretende incluir cualquier anticuerpo que tenga dos especificidades de union diferentes, es decir, el anticuerpo se une a dos epitopos diferentes, que pueden ubicarse en el mismo antigeno diana o, mas comunmente, en antigenos diana diferentes.
Los anticuerpos nativos y las inmunoglobulinas son generalmente glicoproteinas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V l) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoacidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651-66, 1985); Novotny and Haber, Proc. Natl Acad Sci. USA 82, 4592-4596 (1985 )). Cinco clases de inmunoglobulina humana se definen en base a su composicion de cadena pesada, y se denominan IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Los anticuerpos de la clase IgG y clase IgA se dividen ademas en subclases, a saber, lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4, e lgA1 e lgA2. Las cadenas pesadas en los anticuerpos IgG, IgA e IgD tienen tres dominios de region constante, que se designan CH1, CH2 y CH3, y las cadenas pesadas en los anticuerpos IgM e IgE tienen cuatro dominios de region constante, CH1, CH2, CH3 y CH4 . Por lo tanto, las cadenas pesadas tienen una region variable y tres o cuatro regiones constantes. La estructura y la funcion de la inmunoglobulina se revisan, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988).
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden solo una porcion de un anticuerpo intacto, en los que la porcion retiene preferiblemente al menos una, preferiblemente la mayor parte o la totalidad, de las funciones normalmente asociadas con esa porcion cuando estan presentes en un anticuerpo intacto.
El termino "anticuerpo monoclonal", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman la poblacion son identicos, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especificos y se unen a un solo antigeno. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que tipicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante en el antigeno. Que un anticuerpo se "une selectivamente" o "se une especificamente" significa que el anticuerpo reacciona o se asocia mas frecuentemente, mas rapidamente, con mayor duracion, con mayor afinidad, o con alguna combinacion de lo anterior con un epitopo que con sustancias alternativas, incluidas las proteinas no relacionadas. "Se une selectivamente" o "se une especificamente" significa, por ejemplo, que un anticuerpo se une a una proteina con un valor de Kd de al menos aproximadamente 0,1 mM, pero mas generalmente de al menos aproximadamente 1 pM. "Se une selectivamente" o "se une especificamente" significa en ocasiones que un anticuerpo se une a una proteina a veces con un valor de Kd de al menos aproximadamente 0,1 pM o mejor, y otras veces de al menos aproximadamente 0,01 pM o mejor. Debido a la identidad de secuencia entre proteinas homologas en diferentes especies, la union especifica puede incluir un anticuerpo que reconozca una proteina marcadora de celulas tumorales en mas de una especie.
El termino "epitopo" o "determinante antigenico" se usan indistintamente en este documento y se refiere a la porcion de un antigeno capaz de ser reconocido y especificamente unido por un anticuerpo particular. Cuando el antigeno es un polipeptido, los epitopos pueden formarse a partir tanto de aminoacidos contiguos como de aminoacidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteina. Los epitopos formados a partir de aminoacidos contiguos se retienen tipicamente con la desnaturalizacion de proteinas, mientras que los epitopos formados por plegamiento terciario se pierden tipicamente con la desnaturalizacion de proteinas. Un epitopo tipicamente incluye al menos 3, y mas generalmente, al menos 5 u 8-10 aminoacidos en una conformacion espacial unica.
Los anticuerpos en este documento incluyen especificamente anticuerpos "quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la (s) cadena (s) son identicas u homologas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, as! como a fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biologica deseada ( Patente de EE . UU. No. 4.816.567 y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una region hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), como raton, rata, conejo o primate no humano que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la region marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aun mas el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y tipicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tipicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones et al, Nature 321:522-525 (1986);Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); yPresta, Curr. Op. Struct Biol. 2:593-596 (1992 ). Vease tambien los siguientes articulos de revision y referencias citadas en los mismos: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem.
Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoacidos que corresponds a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las tecnicas para preparar anticuerpos humanos como se divulga en este documento. Esta definicion de un anticuerpo humano excluye especificamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de union a antigeno no humanos.
Un anticuerpo de "afinidad madurada" es uno con una o mas alteraciones en una o mas de sus CDR que dan como resultado una mejoria en la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparacion con un anticuerpo original que no posee esas alteraciones. Los anticuerpos de afinidad madurada preferidos tendran afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antigeno diana. Los anticuerpos de afinidad madurada se producen mediante procedimientos conocidos en la tecnica. Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992 ), describe la maduracion de la afinidad por el barajado de los dominios VH y VL. Se describe la mutagenesis aleatoria de CDR y/o residuos estructurales por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809- 3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol.
155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
El termino "region Fc", como se usa en este documento, generalmente se refiere a un complejo de dimero que comprende las secuencias polipeptidicas C-terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, en el que una secuencia polipeptidica C-terminal es aquella que se puede obtener mediante digestion con papaina de un anticuerpo intacto. La region Fc puede comprender secuencias Fc nativas o variantes. Aunque los limites de la secuencia Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la secuencia Fc de la cadena pesada de la IgG humana generalmente se extienden desde un residuo de aminoacido en la posicion Cys226 aproximadamente, o desde la posicion Pro230 aproximadamente, hasta el extremo carboxilo de la secuencia Fc. La secuencia Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. Por "polipeptido Fc" en el presente documento se entiende uno de los polipeptidos que forman una region Fc. Se puede obtener un polipeptido Fc a partir de cualquier inmunoglobulina adecuada, como los subtipos lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4, IgA, IgE, IgD o IgM. En algunos modos de realizacion, un polipeptido Fc comprende parte o la totalidad de una secuencia bisagra natural (generalmente en su extremo N). En algunos modos de realizacion, un polipeptido Fc no comprende una secuencia bisagra funcional o natural.
La "region bisagra", "secuencia bisagra" y sus variaciones, como se usa en este documento, incluyen el significado conocido en la tecnica, que se ilustra, por ejemplo, en Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999 ); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415 ; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202 .
Tal como se usa en el presente documento, el termino "hibrida en condiciones rigurosas" pretende describir las condiciones para la hibridacion y el lavado en las que las secuencias de nucleotidos homologas entre si en al menos 60% permanecen tipicamente hibridadas entre si. En algunos modos de realizacion, las condiciones son tales que las secuencias homologas entre si en al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85% o el 90% tipicamente permanecen hibridadas entre si. Tales condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la tecnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridacion rigurosas es la hibridacion en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o mas lavados en 0,2xSSC, 0,1% SDS a 50-65 °C.
El termino "citotoxina" o "agente citotoxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o impide la funcion de las celulas y/o causa la destruccion de las celulas. El termino pretende incluir isotopos radiactivos (por ejemplo, en 211 , I 131 , I 125, Y 90, Re 186 , Re 188, Sm 153, B i212, P 32 e isotopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapeuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etoposido), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimasy sus fragmentos, como enzimas nucleoliticas, antibioticos, y toxinas como toxinas de moleculas pequenas o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluidos los fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o anticancerigenos descritos a continuacion. Otros agentes citotoxicos se describen a continuacion. Un agente tumoricida provoca la destruccion de las celulas tumorales.
"Farmaceuticamente aceptable" se refiere a aprobado o susceptible de aprobacion por una agenda reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de los EE. UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, incluidos los seres humanos.
"Vehiculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehiculo con el que se administra al menos un anticuerpo de la presente divulgacion.
Como se usa en este documento, el termino "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamifero), que incluye, entre otros, humanos, primates no humanos, roedores y similares, que sera el receptor de un tratamiento particular. Tipicamente, los terminos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento en referencia a un sujeto humano.
El termino "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipeptido, polinucleotido, molecula organica pequena u otro farmaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamifero. En el caso del cancer, la cantidad terapeuticamente eficaz del farmaco puede reducir el numero de celulas cancerosas; reducir el tamano del tumor; inhibir o detener la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos, incluida, por ejemplo, la propagacion del cancer en tejidos blandosy huesos; inhibiry detener la metastasis tumoral; inhibiry detener el crecimiento del tumor; aliviar en cierta medida uno o mas de los sintomas asociados con el cancer, reducir la morbilidad y la mortalidad; mejorar la calidad de vida; o una combinacion de tales efectos. En la medida en que el farmaco impida el crecimiento y/o elimine las celulas cancerosas existentes, se puede denominar citostatico y/o citotoxico.
Como se usa en el presente documento, los terminos "polinucleotido" o "acido nucleico" se refieren a un polimero compuesto de una multiplicidad de unidades de nucleotidos (ribonucleotido o desoxirribonucleotido o variantes estructurales relacionadas) unidas mediante enlaces fosfodiester, incluidos, entre otros, ADN o ARN. El termino abarca secuencias que incluyen cualquiera de los analogos de bases conocidos de ADN y ARN. Incluyendo, pero no limitado a, 4 acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilla, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil 2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxioxacilo, 5-metoxioxacacilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ester metilico del acido uracil-5-oxiacetico,acido uracil-5-oxiacetico, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2 tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ester metilico del acido 5-oxiacetico de N-uracilo, acido 5-oxiacetico de uracilo, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y 2,6-diaminopurina.
El termino "vector", como se usa en el presente documento, pretende referirse a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector del fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula huesped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores episomicos de mamiferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamiferos no episomicos) pueden integrarse en el genoma de una celula huesped tras su introduccion en la celula huesped, y de este modo se replican junto con el genoma huesped. Ademas, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresion recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante a menudo estan en forma de plasmidos. En la presente memoria descriptiva, "plasmido" y "vector" se pueden usar indistintamente, ya que el plasmido es la forma de vector mas comunmente utilizada.
Los polipeptidos heteromultimericos se pueden usar para tratar una variedad de trastornos. Un "trastorno" es cualquier afeccion que se beneficiaria del tratamiento con un anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades cronicas y agudas, incluidas aquellas afecciones patologicas que predisponen al mamifero al trastorno en cuestion. Los ejemplos no limitantes de trastornos a tratar en el presente documento incluyen trastornos de proliferacion celular; no leucemias y neoplasias linfoides; trastornos neuronales, gliales, astrocitos, hipotalamicos y otros de tipo glandular, macrofago, epitelial, estromal y blastocelico; y trastornos inflamatorios, inmunologicos y otros relacionados con la angiogenesis. Los terminos "trastorno de proliferacion celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que estan asociados con cierto grado de proliferacion celular anormal. En un modo de realizacion, el trastorno de proliferacion celular es el cancer. "Tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a todo el crecimiento y proliferacion de celulas neoplasicas, ya sean malignas o benignas, y todas las celulas y tejidos precancerosos y cancerosos.
En general, se usan antigenos especificos como dianas para los polipeptidos heteromultimericos. En un modo de realizacion, el antigeno es un antigeno tumoral. Un "antigeno tumoral", como se usa en este documento, incluye cualquier molecula que se expresa diferencialmente en una celula tumoral en comparacion con una celula normal. En algunos modos de realizacion, la molecula se expresa a un nivel detectable o significativamente mas alto o mas bajo en una celula tumoral en comparacion con una celula normal. En algunos modos de realizacion, la molecula exhibe un nivel de actividad biologica detectable o significativamente mas alto o mas bajo en una celula tumoral en comparacion con una celula normal. En algunos modos de realizacion, se sabe o se piensa que la molecula contribuye a una caracteristica tumorigenica de la celula tumoral. Numerosos antigenos tumorales son conocidos en la tecnica. Tambien se puede determinar si una molecula es un antigeno tumoral de acuerdo con tecnicas y ensayos bien conocidos por los expertos en la tecnica, como, por ejemplo, los ensayos clonogenicos, los ensayos de transformacion, los ensayos de formacion de tumores in vitro o in vivo, los ensayos de migracion en gel y el analisis de bloqueo genes, etc.
Los terminos "cancer" o "canceroso" se refieren o describen la condicion fisiologica en mamiferos que se caracteriza tipicamente por un crecimiento/proliferacion celular no regulada. Los ejemplos de cancer incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma (p. Ej., Linfoma no Hodgkin), blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos mas particulars de tales canceres incluyen cancer de celulas escamosas, carcinoma microcitico de pulmon, carcinoma pulmonar no microcitico, adenocarcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon escamoso, cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrointestinal, cancer de pancreas, glioblastoma, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de higado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandula salival, cancer de rinon, cancer de higado, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico y varios tipos de cancer de cabeza y cuello.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a la intervencion clinica en un intento de alterar el curso natural del individuo o la celula que se esta tratando, y se puede realizar ya sea para la profilaxis o durante el curso de la patologia clinica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la aparicion o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los sintomas, la disminucion de cualquier consecuencia patologica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metastasis, disminuir la tasa de progresion de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de la enfermedad, y la remision o mejora del pronostico. En algunos modos de realizacion, los anticuerpos se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.
Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que sea eficaz, en dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapeutico o profilactico deseado. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" de un anticuerpo puede variar segun factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz es tambien una en la que cualquier efecto toxico o perjudicial del anticuerpo se ve compensado por los efectos terapeuticamente beneficiosos.
En un aspecto, se proporcionan polipeptidos heteromultimericos que contienen sustituciones dentro de su dominio CH3 de inmunoglobulina Fc, en los que las sustituciones promueven la heterodimerizacion. Estas sustituciones comprenden la sustitucion de al menos un aminoacido en uno de los polipeptidos que contienen el dominio CH3. En un modo de realizacion, el aminoacido que se sustituye es un aminoacido cargado, o un aminoacido hidrofobo/hidrofilo.
En ciertos modos de realizacion, las sustituciones dentro del primer o segundo polipeptidos ocurren dentro de al menos un aminoacido en el que la cadena lateral se proyecta desde o esta posicionada de otra manera en la interfaz de un primer polipeptido con el segundo polipeptido y, por lo tanto, esta posicionada para interactuar con un aminoacido del segundo polipeptido que tambien se coloca en la interfaz de los dos polipeptidos. Por "interfaz" se entiende el lugar en el que los polipeptidos independientes entran en contacto entre si. En la Tabla 1 se muestran ejemplos pronosticados de aminoacidos ubicados en la interfaz de dos polipeptidos que contienen el dominio CH3. En un modo de realizacion, el cambio de la cadena lateral de aminoacidos de modo que se altera la interaction electrostatica entre el primer y segundo polipeptidos, sirve para estabilizar el heteromultimero y, con ello favorecer la formacion de heteromultimeros frente a la formacion de homomultimeros. Las moleculas de homomultimeros contendran moleculas cargadas similares y naturalmente se repeleran entre si. Las moleculas de heteromultimeros contienen pares de aminoacidos que tienen cadenas laterales que se atraeran, favoreciendo as! la formacion de heteromultimeros.
En un aspecto, se demuestra que la sustitucion de uno o mas de los aminoacidos ubicados en las posiciones 236, 245, 249, 278, 286 y 288, en uno de los polipeptidos que contienen el dominio CH3, conduce a una formacion de heteromultimero preferencial, relativa a la cantidad de homodimero formado. Las posiciones de aminoacidos enumeradas anteriormente son posiciones ubicadas dentro del dominio CH3 de lgG2 cuando los aminoacidos estan numerados comenzando con el inicio del dominio constante de cadena pesada de lgG2 humana (es decir, el extremo N-terminal de la secuencia CH1). La posicion del aminoacido es variable dentro de los cuatro isotipos de IgG, asi como entre IgG, IgA e IgD. Por lo tanto, las posiciones especificas de los aminoacidos no pretenden ser limitantes para el aminoacido ubicado en esa posicion especifica en una inmunoglobulina cualquiera, sino que mas bien pretenden abarcar los residuos de aminoacidos en todos los isotipos de inmunoglobulina en las posiciones correspondientes a las mencionadas para el dominio CH3 de la lgG2 humana. Dicha variabilidad del posicionamiento de aminoacidos dentro de los cuatro isotipos de IgG se muestra en la Tabla 1, y se muestra graficamente en las Figuras 2-4.
La formacion preferencial de polipeptidos heteromultimericos se logra seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de la carga y/o la hidrofobicidad del polipeptido en el sitio diana. Los aminoacidos se pueden agrupar de acuerdo con las similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A.L. Lehninger, en Biochemistry, segunda edition, pp. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975 )):
(1) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) polar sin carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q)
(3) acido: Asp (D), Glu (E)
(4) basico: Lys (K), Arg (R), His (H)
Alternativamente, los residuos naturales se pueden dividir en grupos segun las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofobico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie;
(2) hidrofilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) acido: Asp, Glu;
(4) basico: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientacion de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromatico: Trp, Tyr, Phe.
En algunos modos de realizacion, los aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas se reemplazan con aminoacidos que tienen cadenas laterales acidas, o viceversa. Por ejemplo, los aminoacidos basicos lisina, arginina o histidina se reemplazan con acido aspartico o acido glutamico.
En algunos modos de realizacion, un aminoacido hidrofilo (o al menos un aminoacido relativamente hidrofilo) se sustituye con un aminoacido hidrofobo. Un ejemplo de este tipo de sustitucion es el reemplazo de un residuo de tirosina con una fenilalanina. En ciertos modos de realizacion, el reemplazo da como resultado la eliminacion de una cadena lateral hidroxilo en una posicion de aminoacido especifica en o cerca de la interfaz entre los polipeptidos que contienen el dominio CH3 y aumenta la hidrofobicidad en ese sitio.
Como se usa en este documento, "Var3" y "13A" se usan indistintamente para describir una variante que contiene una sustitucion de lisina por glutamato en la posicion 236 y una lisina por aspartato en la posicion 278. Tambien como se usa en el presente documento, "Var1" y "13B" se usan indistintamente para describir una variante que contiene una sustitucion de glutamato por lisina en la posicion 249 y un glutamato por lisina en la posicion 288.
En un modo de realizacion, el acido nucleico que codifica un aminoacido localizado en la interfaz se altera para que el primer polipeptido cambie la carga del emparejamiento de los iones de aminoacidos. Para lograr esto, el acido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoacido "original" en la interfaz del primer poli peptido se reemplaza con un acido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral cargada opuestamente con respecto al residuo de aminoacido original. Se apreciara que puede haber mas de un residuo original y sustituido correspondiente. El limite superior para el numero de residuos originales que se reemplazan es el numero total de residuos en la interfaz del primer y segundo poli peptido.
Por "acido nucleico original" se entiende el acido nucleico que codifica un primer o segundo poli peptido que se puede "alterar" (es decir, modificarse geneticamente). El acido nucleico original o de partida puede ser un acido nucleico natural o puede comprender un acido nucleico que se haya sometido a una alteracion previa (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo humanizado). Por "alterar" el acido nucleico se entiende que el acido nucleico original se modifica reemplazando al menos un codon que codifica un residuo de aminoacido de interes. Las tecnicas para modificar geneticamente un ADN de esta manera se han revisado en Mutagenesis: a Practical Approach, MJ. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, Reino Unido. (1991 ), e incluyen mutagenesis dirigida al sitio, mutagenesis en casete y mutagenesis por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo. Al modificar un acido nucleico original, un polipeptido original codificado por el acido nucleico original se altera asi de manera correspondiente.
El polipeptido heteromultimerico de la invencion es un anticuerpo biespecifico. En ciertos modos de realizacion, el anticuerpo biespecifico contiene el primer polipeptido que es un polipeptido de cadena pesada emparejado con un polipeptido de cadena ligera, y el segundo polipeptido que es un segundo polipeptido de cadena pesada emparejado con un segundo polipeptido de cadena ligera.
Se contemplan polipeptidos heteromultimericos con mas de dos valencias. Por ejemplo, los anticuerpos triespecificos tambien pueden prepararse usando los procedimientos descritos en el presente documento. (Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991)).
En un modo de realizacion, el procedimiento comprende producir una molecula heteromultimerica, tal como un anticuerpo biespecifico, que utiliza una unica cadena ligera que puede emparejarse con los dos dominios variables de la cadena pesada presences en la molecula biespecifica. Para identificar esta cadena ligera, se pueden emplear varias estrategias. En un modo de realizacion, se identifica una serie de anticuerpos monoclonales a cada antigeno que puede ser atacado con el anticuerpo biespecifico, seguido de una determinacion de cual de las cadenas ligeras utilizadas en estos anticuerpos es capaz de funcionar cuando se combina con la cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos identificados para la segunda diana. De esta manera, se puede identificar una cadena ligera que puede funcionar con dos cadenas pesadas para permitir la union a ambos antigenos. En otro modo de realizacion, las tecnicas de visualizacion, tales como la visualizacion de fagos, pueden permitir la identificacion de una cadena ligera que puede funcionar con dos o mas cadenas pesadas. En un modo de realizacion, se construye una biblioteca de fagos que consta de un repertorio diverso de dominios variables de cadena pesada y un unico dominio variable de cadena ligera. Esta biblioteca tambien puede utilizarse para identificar anticuerpos que se unen a varios antigenos de interes. Por lo tanto, en ciertos modos de realizacion, los anticuerpos identificados compartiran una cadena ligera comun.
En ciertos modos de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos comprenden al menos un Fv de cadena unica (scFv). En ciertos modos de realizacion, el polipeptido heteromultimerico comprende dos scFv. Por ejemplo, un scFv puede fusionarse con uno o ambos de un polipeptido que contiene el dominio CH3 contenido dentro de un poli peptido heteromultimerico. Algunos procedimientos comprenden producir una molecula biespecifica en los que una o ambas regiones constantes de la cadena pesada que comprenden al menos un dominio CH3 se utilizan junto con un dominio Fv de cadena unica para proporcionar la union al antigeno.
Las moleculas heteromultimericas pueden comprender dos brazos de union a antigeno de diferente especificidad. Por ejemplo, pueden generarse moleculas heteromultimericas que comprenden un primer polipeptido que es un brazo de union a antigeno (tal como una molecula de inmunoglobulina clasica) y un segundo polipeptido que es una proteina de fusion de inmunoglobulina. Un ejemplo de proteinas de fusion de inmunoglobulina utiles son las inmunoadhesinas.
Como se usa en el presente documento, el termino "inmunoadhesina" designa moleculas similares a anticuerpos que combinan el "dominio de union" de una proteina heterologa (una "adhesina", por ejemplo, un receptor, ligando o enzima) con el componente efector de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusion de la secuencia de aminoacidos de la adhesina con la especificidad de union deseada, es decir, que no es el sitio de reconocimiento y union de antigeno (sitio de combinacion de antigeno) de un anticuerpo (es decir, es "heterologo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener de cualquier inmunoglobulina, tales como los subtipos lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4, IgA, IgE, IgD o IgM.
Se pueden generar polipeptidos heteromultimericos para unirse a cualquier antigeno o antigenos. En algunos modos de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos se unen a uno o mas antigenos seleccionados del grupo que consiste en: DLL4, VEGF, VEGFR2, Notchl, Notch2, Notch3, Notch4, Notch(pan), JAG1, JAG2, DLL(pan), JAG(pan), EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB(pan), c-Met, IGF-1R, PDGFR, Patched, polipeptidos de la familia Hedgehog, Hedgehog(pan), polipeptidos de la familia WNT, WNT(pan), FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, FZD(pan), LRP5, LRP6, CD20, IL-6, TNFalfa, IL-23, IL-17, CD80, CD86, CD3, CEA, Muc16, PSMA, PSCA, CD44, c-Kit, DDR1, DDR2, RSP01, RSP02, RSP03, RSP04, RSPO(pan), polipeptidos de la familia BMP, BMP(pan), BMPRIa, BMPRIb, y una combinacion de los mismos. Como se usa en este documento, "pan" pretende describir polipeptidos heteromultimericos que se unen a multiples antigenos de la misma familia. Por ejemplo, "Notch(pan)" pretende describir un polipeptido heteromultimerico que se une a mas de uno del grupo de Notchl, Notch2, Notch3 o Notch4.
En un modo de realizacion, el polipeptido heteromultimerico se une especificamente a DLL4 y VEGF.
En un modo de realizacion, se proporcionan anticuerpos que se unen a VEGF. En un modo de realizacion, se proporciona un anticuerpo (219R0302) que se une especificamente a VEGF, en el que el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYTFTNYWMH (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena pesada que comprende SINPSNGGTSYNEKFKR (SEQ ID NO:21) y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYYDNSYAMDY (SEQ ID NO:22); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQDISNYVN (SEQ ID NO:23), una CDR2 de cadena ligera que comprende DASNLQT (SEQ ID NO:24) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYDDLPP (SEQ ID NO:25). En otro modo de realizacion, se proporciona un anticuerpo (219R0202) que se une especificamente a VEGF, en el que el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYTFTNYWMH (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena pesada que comprende SINPSNGGTSYNEKFKR (SEQ ID NO:21) y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYYDNSYAMDY (SEQ ID NO:22); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASQGINNHLAW (SEQ ID NO:26), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNLHS (SEQ ID NO:27) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYDNLPL (SEQ ID NO:28).
En un modo de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos VEGF y DLL4 comprenden un anticuerpo con la misma especificidad que 21M18 y bien 219R0302 o 219R0202. Estos polipeptidos heteromultimericos pueden producirse teniendo la cadena ligera unida a la cadena pesada, o usando una cadena ligera identica. En un modo de realizacion, los anticuerpos comprenden las sustituciones 13A/13B, como se describe en el presente documento, en su region Fc.
En un modo de realizacion, la secuencia de union de VEGF comprende la SEQ ID NO:17 o la SEQ ID NO:18. En un modo de realizacion, la secuencia de union de DLL4 comprende la SEQ ID NO:19. En otro modo de realizacion, el anticuerpo biespecifico comprende la secuencia de union a VEGF que comprende la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO:11 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO:13 o la SEQ ID NO:15; y la secuencia de union de DLL4 que comprende la SEQ ID NO:19. En otro modo de realizacion, el polipeptido heteromultimerico comprende la secuencia de union de VEGF que comprende la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO:11 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO:13; y la secuencia de union de DLL4 que comprende la SEQ ID NO:19. En un modo de realizacion adicional, el polipeptido heteromultimerico comprende la secuencia de union de VEGF que comprende la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO:11 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO:15; y la secuencia de union de DLL4 que comprende la SEQ ID NO:19.
En otro modo de realizacion, la secuencia de union de VEGF comprende un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO:10, 29 y 30. En un modo de realizacion, el polipeptido VEGF es un anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, los polipeptidos o anticuerpos heteromultimericos son anticuerpos intactos tales como anticuerpos monoclonales o humanizados. En otro modo de realizacion, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos, tales como Fab o scFv. En un modo de realizacion, los anticuerpos/polipeptidos anti-VEGF inhiben el crecimiento tumoral.
Los polipeptidos heteromultimericos de la invencion tienen doble especificidad (bivalente) y son capaces de unirse a dos antigenos diferentes simultaneamente. En un modo de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos contienen dos sitios de combinacion de anticuerpos. En otro modo de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos son inmunoadhesinas bivalentes. Los diferentes antigenos pueden ubicarse en diferentes celulas o en la misma celula. La reticulacion del antigeno se puede mostrar in vitro, por ejemplo, proporcionando una superficie solida a la que se ha unido un primer antigeno, agregando un anticuerpo biespecifico especifico para el primer antigeno y un segundo antigeno para el cual la proteina de union tambien es especifica y detectando la presencia del segundo antigeno unido.
Los polipeptidos heteromultimericos pueden, en ciertos modos de realizacion, bloquear la interaccion entre dos receptores y sus respectivos ligandos. Por ejemplo, un anticuerpo biespecifico especifico para DLL4 y VEGF inhibe la migracion celular inducida por VEGF, asi como la senalizacion del receptor Notch. En este caso, la combinacion de dos especificidades de union al receptor es mas eficaz para inhibir la migracion celular que los anticuerpos originales individuales.
Las moleculas heteromultimericas tambien pueden ser monovalentes, lo que significa que tienen un sitio de union a antigeno. En un modo de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos monovalentes poseen un dominio variable, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 esta truncado de manera que no contiene un dominio variable. Estos segundos polipeptidos que contienen el dominio CH3 pueden poseer una etiqueta detectable. En un modo de realizacion, el polipeptido heteromultimerico monovalente contiene un epitopo FLAG. El epitopo FLAG es un epitopo sintetico que consta de ocho residuos de aminoacidos (DYKDDDDK). En otro modo de realizacion, el polipeptido heteromultimerico monovalente es una inmunoadhesina.
En un modo de realizacion, las moleculas heteromultimericas se producen en un primer formato denominado gen unico biespecifico (SGBSP). Para generar SBGSP, se usa un conector de 30 aminoacidos para unir, o enlazar, geneticamente, la cadena ligera a su cadena pesada ( vease, Lee et al. Mol. Immunol. 36:61-71 (1999 ). Por lo tanto, cada unidad de union SGBSP puede usar su propia cadena ligera para formar una unidad de union Fab que se une a su diana respectiva. En un modo de realizacion, los genes individuales tambien comprenden las mutaciones Var3/13A y Var1/13B. En un modo de realizacion, se usan anticuerpos anti-DLL4 y anti-VEGF para producir SGBSP. En un modo de realizacion, las cadenas pesadas 21M18 y 219R0302/219R0202 se producen como SGBSP. En un modo de realizacion adicional, las cadenas pesadas 21M18 y 219R0302/219R0202 se clonan con los mutantes 13B y 13A, respectivamente.
Las moleculas heteromultimericas de la invencion se producen en un segundo formato denominado biespecifico monovalente (MBSP). Los MBSP usan una cadena ligera comun con dos cadenas pesadas diferentes que comprenden las mutaciones Var3/13Ay Var1/13B. Para los MBSP, una o ambas cadenas pesadas deben unirse a su diana en combinacion con una cadena ligera comun. En algunos modos de realizacion, la cadena ligera comun es la cadena ligera original para una de las cadenas pesadas. En un modo de realizacion, se usan anticuerpos anti-DLL4 y anti-VEGF para producir SGBSP. En un modo de realizacion, las cadenas pesadas 21M18 y 219R0302/219R0202 se producen como SGBSP. En un modo de realizacion adicional, las cadenas pesadas 21M18 y 219R0302/219R0202 se clonan con los mutantes 13By 13A, respectivamente.
Para expresar moleculas heteromultimericas de la invencion con combinaciones seleccionadas o aleatorias de dominios V l y V h, genes V que codifican esos dominios se ensamblan en un vector de expresion bacteriano. Por ejemplo, un vector puede ser usado que tiene secuencias que codifican una secuencia serial de secrecion bacteriana y un conector de peptidos y que tiene sitios de restriccion convenientes para la insercion de genes V l y V h. Alternativamente, podria ser deseable ensamblar primero todas las secuencias de codificacion necesarias (por ejemplo, serial de secrecion, V l, V h y el peptido conector) en una sola secuencia, por ejemplo mediante amplificacion por PCR usando cebadores que se solapan, seguido de la ligacion en un plasmido u otro vector. Cuando se desee proporcionar una combinacion especifica de dominios V l y V h, se usan cebadores de PCR especificos para las secuencias que codifican esos dominios. Cuando se desea crear diversas combinaciones de un gran numero de dominios V l y V h, se usan mezclas de cebadores para amplificar secuencias multiples.
Se dispone de vectores para la construccion y expresion de polipeptidos heteromultimericos de la invencion en bacterias que contienen secuencias de serial de secrecion y sitios de clonacion de restriccion convenientes. Las combinaciones de genes V l y V h que codifican los sitios de union especificos para un antigeno particular se aislan a partir de ADNc de hibridomas de celulas B. Alternativamente, combinaciones aleatorias de genes V l y V h se obtienen a partir de ADN genomico y los productos posteriormente cribados para la union a un antigeno de interes. Normalmente, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se emplea para la clonacion, utilizando cebadores que son compatibles con los sitios de restriccion en el vector de clonacion. Vease, por ejemplo, Dreher, M.L. et al. (1991) J. Immunol. Methods 139:197-205 ; Ward, E.S. (1993) Adv. Pharmacol. 24:1-20 ; Chowdhury, P.S. y Pastan, I. (1999) Nat. Biotechnol. 17:568-572 .
En un modo de realizacion, se proporcionan polinucleotidos que expresan los polipeptidos o anticuerpos descritos en el presente documento. En un modo de realizacion, se proporcionan polinucleotidos que se hibridan en condiciones rigurosas con los polinucleotidos que codifican los polipeptidos o anticuerpos. En un modo de realizacion, el polinucleotido comprende las secuencias de las SEQ ID NO:12, 14 o 16.
En un modo de realizacion, los anticuerpos biespecificos se preparan al expresar 1) un primer polipeptido que comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una primera especificidad conectada a un dominio variable de cadena ligera de una segunda especificidad; y 2) un segundo polipeptido que comprende un dominio variable de cadena ligera que corresponde a la primera especificidad conectada al dominio variable de cadena pesada de la segunda especificidad.
Para ciertos polipeptidos heteromultimericos, puede desearse la expresion en otras celulas huesped. Por ejemplo, los polipeptidos heteromultimericos que comprenden dominios constantes a menudo se expresan mas eficientemente en celulas eucariotas, incluidas celulas de levadura, insecto, vertebrado y mamifero. Sera necesario usar tales celulas donde se desee que el producto expresado este glicosilado. Los fragmentos de ADN que codifican el primer y segundo polipeptidos pueden clonarse, por ejemplo, en vectores de HCMV disenados para expresar cadenas ligeras humanas de cadenas pesadas humanas en celulas de mamiferos. (Vease, por ejemplo, Bendig, et al., Patente de Estados Unidos N° 5.840.299 ; Maeda, et al. (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2, 124-134 ). Tales vectores contienen el promotor y potenciador del citomegalovirus humano (HCMV) para la transcripcion de alto nivel de las construcciones de cadena ligera y cadena pesada. En un modo de realizacion preferido, el vector de expresion de la cadena ligera es pKN100 (cortesia del Dr. S. Tarran Jones, MRC Collaborative Center, Londres, Inglaterra), que codifica una cadena ligera kappa humana, y el vector de expresion de la cadena pesada es pG1D105 (cortesia de Dr. S. Tarran Jones), que codifica una cadena pesada gamma-1 humana. Ambos vectores contienen promotores y potenciadores de HCMV, origenes de replicacion y marcadores seleccionables funcionales en celulas de mamiferos y E. coli.
Un marcador seleccionable es un gen que codifica una proteina necesaria para la supervivencia o el crecimiento de celulas huesped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Los marcadores seleccionables tipicos codifican proteinas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotroficas, o (c) suministran nutrientes criticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemase para Bacilli. Un marcador seleccionable particularmente util confiere resistencia al metotrexato. Por ejemplo, las celulas transformadas con el gen de seleccion de DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitive de DHFR. Una celula huesped apropiada cuando se emplea DHFR natural es la linea celular de ovario de hamster chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR, preparada y propagada segun lo descrito por Urlauby Chasin (1980) Proc. Natl Acad Sci. USA77, 4216 . Las celulas transformadas se exponen a continuacion a niveles aumentados de metotrexato. Esto conduce a la sintesis de multiples copias del gen DHFR y, concomitantemente, multiples copias de otros ADN que comprenden los vectores de expresion, como el ADN que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo. En otro ejemplo, las celulas de mieloma mutantes que son deficientes para la timidina quinasa (TK) no pueden usar la timidina suministrada de forma exogena cuando se usa aminopterina para bloquear la sintesis de ADN. Los vectores utiles para la transfeccion llevan un gen TK intacto que permite el crecimiento en medios suplementados con timidina.
Cuando se desea expresar una construccion genica en levadura, un gen de seleccion adecuado para uso en levadura es el gen trp1 presente en el plasmido de levadura YRp7. Stinchcomb et al., 1979 Nature, 282, 39 ; Kingsman et al., 1979, Gene 7, 141 . El gen trp1 proporciona un marcador de seleccion para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No.44076 o PEP4-1. Jones (1977) Genetics 85,12 . La presencia de la lesion de trp 1 en el genoma de la celula huesped de la levadura proporciona un ambiente efectivo para detectar la transformacion por crecimiento en ausencia de triptofano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan con plasmidos conocidos que llevan el gen Leu2.
Las celulas huesped preferidas para la transformacion de vectores y la expresion de anticuerpos de la presente invencion son celulas bacterianas, celulas de levadura y celulas de mamifero, por ejemplo, celulas COS-7, celulas de ovario de hamster chino (CHO) y lineas celulares de origen linfoide tales como celulas de linfoma, mieloma o hibridoma. Las celulas huesped transformadas se cultivan mediante procedimientos conocidos en la tecnica en un medio liquido que contiene fuentes asimilables de carbono, por ejemplo, carbohidratos, como glucosa o lactosa, nitrogeno, por ejemplo, aminoacidos, peptidos, proteinas o sus productos de degradacion, tales como peptonas, sales de amonio o similares, y sales inorganicas, por ejemplo, sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio. Ademas, el medio contiene, por ejemplo, sustancias que promueven el crecimiento, tales como oligoelementos, por ejemplo, hierro, zinc, manganeso y similares.
Las moleculas heteromultimericas encuentran uso en los procedimientos diagnosticos y terapeuticos descritos en este documento. En ciertos modos de realizacion, las moleculas descritas anteriormente se usan para detectar la expresion de una proteina marcadora de celulas tumorales en muestras biologicas como, por ejemplo, una biopsia de tejido del paciente, un derrame pleural o una muestra de sangre. Las biopsias de tejido pueden seccionarse y detectarse proteinas usando, por ejemplo, inmunofluorescencia o inmunohistoquimica. Ademas, se pueden aislar celulas individuales de una muestra y se puede detectar la expresion de proteinas en celulas fijas o vivas mediante analisis FACS. En ciertos modos de realizacion, las moleculas heteromultimericas se pueden usar en matrices de proteinas para detectar la expresion de un marcador de celulas tumorales, por ejemplo, en celulas tumorales, en lisados celulares o en otras muestras de proteinas. En ciertos modos de realizacion, las moleculas heteromultimericas de la presente invencion se usan para inhibir el crecimiento de celulas tumorales poniendo en contacto las moleculas heteromultimericas con celulas tumorales en ensayos basados en celulas in vitro, modelos animales in vivo , etc. En ciertos modos de realizacion, las moleculas heteromultimericas se usan para tratar el cancer en un paciente mediante la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula heteromultimerica contra uno o mas marcadores de celulas tumorales.
En algunos modos de realizacion, la molecula heteromultimerica es un anticuerpo biespecifico humanizado. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos que contienen secuencias minimas de anticuerpos no humanos (p. Ej. Roedor) dentro de la determinacion de antigeno o region hipervariable que comprenden las tres regiones de determinacion complementarias (CDR) dentro de cada cadena de anticuerpo. Dichos anticuerpos se usan terapeuticamente para reducir la antigenicidad y las respuestas HAMA (anticuerpo humano anti-raton) cuando se administran a un sujeto humano. En la practica, los anticuerpos humanizados son tipicamente anticuerpos humanos que tienen un minimo o practicamente ninguna secuencia no humana. Un anticuerpo humano es un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a un anticuerpo producido por un humano.
Los anticuerpos humanizados se pueden producir usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica. Un anticuerpo se puede humanizar sustituyendo las CDR de un anticuerpo humano con las de un anticuerpo no humano (por ejemplo, raton, rata, conejo, hamster, etc.) que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas siguiendo los procedimientos de Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525 ; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327 ; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536 . El anticuerpo humanizado se puede modificar aun mas mediante la sustitucion de un residuo adicional ya sea en la region marco humana variable y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinary optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo.
La eleccion de los dominios variables humanos de la cadena pesada y/o ligera para usarse en la preparacion de anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza en base a la biblioteca completa de secuencias de aminoacidos de dominio variable humanas conocidas. Asi, en ciertos modos de realizacion, la secuencia de aminoacidos humanos que es mas homologa a la del anticuerpo de roedor del cual se toman las CDR se usa como la region marco (FR) humana para el anticuerpo humanizado ( Sims et al., 1993, J. Immunol., 151:2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol., 196:901 ). Otro procedimiento usa una FR particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas y se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes ( Carter et al., 1992, PNAS, 89; 4285 ; Presta et al. ., 1993, J. Immunol., 151:2623 ). En ciertos modos de realizacion, se usa una combinacion de procedimientos para seleccionar la FR variable humana para usarse en la generacion de anticuerpos humanizados.
Ademas, se entiende que los anticuerpos (por ejemplo, de roedor) que van a humanizarse deben conservar una alta afinidad por el antigeno, asi como otras propiedades biologicas favorables. Para lograr este objetivo, los anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante un proceso de analisis de la secuencia original a partir del anticuerpo de roedor a humanizar y las diversas secuencias de humanizacion candidatas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales estan disponibles y son conocidos por los expertos en la tecnica. Los programas informaticos se pueden usar para ilustrary mostrar las estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de anticuerpos candidatas seleccionadas. El uso de tales modelos permite el analisis del posible papel de los residuos en la funcion del anticuerpo a humanizar, es decir, el analisis de residuos que influyen en la capacidad del anticuerpo candidato para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse desde el anticuerpo original al anticuerpo humanizado receptor para que se logren las caracteristicas deseadas del anticuerpo. En general, los residuos en las CDR de la region de determinacion de antigeno (o region hipervariable) se conservan del anticuerpo original (por ejemplo, el anticuerpo de roedor con las propiedades de union a antigeno deseadas) en el anticuerpo humanizado para la union a antigeno. En ciertos modos de realizacion, al menos un residuo adicional dentro de la FR variable se retiene del anticuerpo original en el anticuerpo humanizado. En ciertos modos de realizacion, hasta seis residuos adicionales dentro de la FR variable se conservan del anticuerpo original en el anticuerpo humanizado.
Los aminoacidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras maduras de las inmunoglobulinas se designan Hx y Lx respectivamente, donde x es un numero que designa la posicion de un aminoacido segun el esquema de Kabat, Secuencias de proteinas de interes inmunologico, Departamento de los Estados Unidos de Salud y Servicios Humanos, 1987, 1991. Kabat enumera muchas secuencias de aminoacidos para anticuerpos para cada subgrupo, y enumera los aminoacidos mas comunes para cada posicion de residuo en ese subgrupo para generar una secuencia de consenso. Kabat usa un procedimiento para asignar un numero de residuo a cada aminoacido en una secuencia enumerada, y este procedimiento para asignar numeros de residuo se ha convertido en estandar en el campo. El esquema de Kabat es extensible a otros anticuerpos no incluidos en su compendio alineando el anticuerpo en cuestion con una de las secuencias de consenso segun Kabat por referenda a los aminoacidos conservados. El uso del sistema de numeracion de Kabat identifica facilmente los aminoacidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos. Por ejemplo, un aminoacido en la posicion L50 de un anticuerpo humano ocupa la posicion equivalente a una posicion L50 de aminoacido de un anticuerpo de raton. Ademas, cualquiera de las dos secuencias de anticuerpos puede alinearse de manera unica, por ejemplo, para determinar el porcentaje de identidad, utilizando el sistema de numeracion de Kabat, de modo que cada aminoacido en una secuencia de anticuerpo este alineado con el aminoacido en la otra secuencia que tenga el mismo numero de Kabat. En algunos modos de realizacion, despues de la alineacion, si una region de anticuerpo en cuestion (por ejemplo, la region variable madura completa de una cadena pesada o ligera) se compara con la misma region de un anticuerpo de referenda, el porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones del anticuerpo en cuestion y de referenda es el numero de posiciones ocupadas por el mismo aminoacido tanto en la region del anticuerpo en cuestion como de referenda, dividido entre el numero total de posiciones alineadas de las dos regiones, sin contar los espacios, multiplicado por 100 para convertirse a porcentaje.
Ademas de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos completamente humanos pueden prepararse directamente usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica. Se pueden generar linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que producen un anticuerpo dirigido contra un antigeno diana ( vease, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95 ; y Patente de Estados Unidos 5.750.373 ). Ademas, el anticuerpo humano se puede seleccionar de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos ( Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314 ; Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Los anticuerpos humanos tambien se pueden producir en ratones transgenicos que contienen loci de inmunoglobulina humana que son capaces con la inmunizacion de producir todo el repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena. Este enfoque se describe en las patentes estadounidenses 5.545.807 ; 5.545.806 ; 5.569.825 ; 5.625.126 ; 5.633.425 ; y 5.661.016 .
Esta invencion engloba anticuerpos biespecificos que reconocen especificamente VEGF y DLL4. Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos que son capaces de reconocer y unirse especificamente a al menos dos epitopos diferentes ( vease, por ejemplo, Wu et al., Simultaneous Targeting of Multiple Disease Mediators by a Dual-Variable-Domain Immunoglobulin, Nature Biotech., 25(11):1290-97 ). Los diferentes epitopos pueden estar dentro de la misma molecula (por ejemplo, el mismo polipeptido marcador tumoral) o en moleculas diferentes, de modo que ambos, por ejemplo, pueden reconocer y unirse especificamente a un marcador de celulas tumorales tambien. Los anticuerpos biespecificos pueden ser anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpos.
Los anticuerpos biespecificos ejemplares pueden unirse a dos epitopos diferentes. Los anticuerpos biespecificos tambien se pueden usar para dirigir agentes citotoxicos a celulas que expresan un antigeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de union a antigeno y un brazo que se une a un agente citotoxico o un quelante de radionuclidos, como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Las tecnicas para producir anticuerpos biespecificos son comunes en la tecnica ( Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539 ; Brennan et al., 1985, Science 229:81 ; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120 ; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659 ; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225 ; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547 -1553 ; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368 ; y Patente de Estados Unidos 5.731.168 ). Tambien se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecificos ( Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991 ))
En ciertos modos de realizacion, se proporciona un fragmento del polipeptido heteromultimerico para, por ejemplo, aumentar la penetracion en el tumor. Se conocen varias tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos: Tradicionalmente, estos fragmentos se obtienen a traves de la digestion proteolltica de anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 ; Brennan et al., 1985, Science, 229:81 ). En ciertos modos de realizacion, los fragmentos de anticuerpo se producen de forma recombinante. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli u otras celulas huesped, lo que permite la produccion de grandes cantidades de estos fragmentos. Dichos fragmentos de anticuerpos tambien pueden aislarse a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. El fragmento de anticuerpo tambien puede ser un anticuerpo lineal como se describe en la patente de EE. UU .5.641.870, por ejemplo, y puede ser monoespecifico o biespecifico. Otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos seran evidentes para el experto en la tecnica.
Ademas, puede ser deseable, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpos, modificar una molecula heteromultimerica para aumentar su vida media en suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporacion de un epitopo de union al receptor de rescate en la molecula heteromultimerica mediante la mutacion de la region apropiada o mediante la incorporacion del epitopo en una marca peptidica que luego se fusiona con la molecula heteromultimerica en cualquier extremo o en el medio (p. ej., por sintesis de ADN o peptidos).
Debe apreciarse que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de region variable que proporcione la asociacion del heteromultimero con los polipeptidos de interes. A este respecto, la region variable puede comprender o derivarse de cualquier tipo de mamifero que se pueda inducir para montar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antigeno asociado al tumor deseado. Como tal, la region variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de origen humano, murino, primate no humano (por ejemplo, Macaca fascicularis, macacos, etc.) o lupino. En algunos modos de realizacion, tanto la region variable como la constante de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otros modos de realizacion, las regiones variables de anticuerpos compatibles (generalmente derivadas de una fuente no humana) pueden disenarse o adaptarse especificamente para mejorar las propiedades de union o reducir la inmunogenicidad de la molecula. A este respecto, las regiones variables pueden humanizarse o alterarse de otro modo mediante la inclusion de secuencias de aminoacidos importadas.
Los dominios variables en las cadenas pesada y ligera se alteran al menos al reemplazar parcialmente una o mas CDR y, si es necesario, al reemplazar parcialmente la region marco y con el cambio de secuencia. Aunque las CDR pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del que se derivan las regiones marco, se preve que las CDR derivaran de un anticuerpo de diferente clase y preferiblemente de un anticuerpo de diferente especie. Puede que no sea necesario reemplazar todas las CDR con las CDR completas de la region variable donante para transferir la capacidad de union al antigeno de un dominio variable a otro. Mas bien, puede que solo sea necesario transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de union al antigeno. Dadas las explicaciones expuestas en la patente de EE.UU. Nos. 5.585.089,5.693.761 y 5.693.762 , estara sobradamente al aclance de los expertos en la tecnica, ya sea mediante experimentacion rutinaria o mediante pruebas de prueba y error para obtener un anticuerpo funcional con inmunogenicidad reducida.
A pesar de las alteraciones en la region variable, los expertos en la tecnica apreciaran que los heteromultimeros modificados pueden comprender anticuerpos, o fragmentos inmunorreactivos de los mismos, en los cuales al menos una fraccion de uno o mas de los dominios de la region constante se han eliminado o alterado de otro modo para proporcionar las caracteristicas bioquimicas deseadas, tales como una mayor localizacion del tumor o una vida media en suero reducida cuando se compara con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una region constante nativa o inalterada. En algunos modos de realizacion, la region constante de los anticuerpos modificados comprendera una region constante humana. Las modificaciones a la region constante comprenden adiciones, eliminaciones o sustituciones de uno o mas aminoacidos en uno o mas dominios. Es decir, los heteromultimeros modificados descritos en el presente documento pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o mas de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o en el dominio constante de cadena ligera (CL). En algunos modos de realizacion, se contemplan regiones constantes modificadas en las que uno o mas dominios se eliminan parcial o totalmente. En algunos modos de realizacion, los anticuerpos modificados comprenderan construcciones de dominio eliminado o variantes en las que se ha eliminado el dominio CH2 completo (construcciones ACH2). En algunos modos de realizacion, el dominio de region constante omitido se reemplazara por un espaciador corto de aminoacidos (por ejemplo, 10 residuos) que proporciona parte de la flexibilidad molecular impartida tipicamente por la region constante ausente.
Se cree que los polipeptidos heteromultimericos que comprenden regiones constantes modificadas como se describe en el presente documento proporcionan funciones efectoras alteradas que, a su vez, afectan el perfil biologico del polipeptido administrado. Por ejemplo, la eliminacion o inactivacion (mediante mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de region constante puede reducir la union del receptor Fc del anticuerpo modificado circulante, aumentando asi la localizacion del tumor. En otros casos, puede ser que las modificaciones de la region constante moderen la union del complemento y, por lo tanto, reduzcan la vida media en suero y la asociacion no especifica de una citotoxina conjugada. Aun otras modificaciones de la region constante se pueden usar para eliminar enlaces disulfuro o restos de oligosacaridos que permiten una mejor localizacion debido al aumento de la especificidad del antigeno o la flexibilidad del anticuerpo. De manera similar, las modificaciones de la region constante de acuerdo con esta invencion pueden hacerse facilmente usando tecnicas de ingenieria molecular o bioquimica bien conocidas dentro del alcance del experto en la tecnica.
La invencion tambien se refiere a moleculas heteromultimericas que comprenden un polipeptido heteromultimerico conjugado a un agente citotoxico. Los agentes citotoxicos incluyen agentes quimioterapeuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas), isotopos radioactivos (es decir, un radioconjugado), etc. Agentes quimioterapeuticos utiles en la la generacion de tales inmunoconjugados incluyen, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercalantes. Entre las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas se pueden usar la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no ligadores de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina, la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfa-sarcina, las proteinas Aleurites fordii, las proteinas diantina, las proteinas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcin, crotin, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restricocin, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.. En algunos modos de realizacion, las moleculas heteromultimericas pueden conjugarse a radioisotopos, tales como 90 Y ,1251,1311,1231,111 In ,105 R h,153 Sm, 67 Cu, 67 Ga, 166 Ho, 177 Lu, 186 Re y 188 Re usando de cualquiera de una serie de quelantes conocidos o con etiquetado directo. En otros modos de realizacion, las composiciones descritas pueden comprender moleculas heteromultimericas acopladas a farmacos, profarmacos o linfocinas tales como interferon. Los conjugados de la molecula heteromultimerica y el agente citotoxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteinas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridididiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (como dimetilo adipimidato HCL), esteres activos (como disuccinimidil suberato), aldehidos (como glutareldehido), compuestos bis-azido (como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como toleno 2,6-diisocianato), y compuestos de fluor bis-activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Tambien se pueden usar conjugados de un anticuerpo y una o mas toxinas de molecula pequena, como caliqueamicina, maitansinoides, tricoteno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad toxina. En algunos modos de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos pueden formar complejos con otros ligandos inmunologicamente activos (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos) en los que la molecula resultante se une tanto a la celula neoplastica como a una celula efectora tal como una celula T.
Independientemente de como se obtienen las cantidades utiles, los polipeptidos heteromultimericos de la presente invencion se pueden usar en cualquiera de una serie de formas conjugadas (es decir, un inmunoconjugado) o no conjugadas. Alternativamente, los polipeptidos heteromultimericos de esta invencion pueden usarse en una forma no conjugada o "desnuda" para aprovechar los mecanismos de defensa natural del sujeto, incluida la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) para eliminar las celulas malignas. La seleccion de que polipeptido heteromultimerico conjugado o no conjugado se utilizara dependera del tipo y estadio del cancer, el uso de un tratamiento complementario (por ejemplo, quimioterapia o radiacion externa) y el estado del paciente. Se apreciara que un experto en la tecnica podria realizar facilmente tal seleccion en vista de las ensenanzas del presente documento.
Los polipeptidos heteromultimericos de la presente invencion pueden ensayarse para determinar la union inmunoespecifica mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan tecnicas como el analisis BIAcore, el analisis FACS, la inmunofluorescencia, la inmunocitoquimica, las transferencias de Western blot, los radioinmunoensayos, ELISA, los inmunoensayos "sandwich", los ensayos de inmunoprecipitacion reacciones de precipitina, reacciones de difusion de gel precipitina, ensayos de inmunodifusion, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion del complemento, ensayos inmunoradiometricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteina A. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York ).
En algunos modos de realizacion, la inmunoespecificidad de un poli peptido heteromultimerico contra un marcador de celulas tumorales se determina usando ELISA. Un ensayo ELISA comprende preparar antigeno, recubrir los pocillos de una placa de microtitulacion de 96 pocillos con antigeno, agregar el anticuerpo contra un marcador de celulas tumorales conjugado a un compuesto detectable como un sustrato enzimatico (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina) al pocillo, incubar por un periodo de tiempo y detectar la presencia del antigeno. En algunos modos de realizacion, la molecula heteromultimerica que se une a un marcador de celulas tumorales no se conjuga a un compuesto detectable, sino que se agrega al pocillo un segundo anticuerpo conjugado que reconoce el polipeptido heteromultimerico contra un marcador de celulas tumorales. En algunos modos de realizacion, en lugar de recubrir el pocillo con el antigeno, el anticuerpo contra un marcador de celulas tumorales puede recubrirse en el pocillo y se puede agregar un segundo anticuerpo conjugado con un compuesto detectable despues de la adicion del antigeno al pocillo recubierto. Un experto en la tecnica conocera los parametros que pueden modificarse para aumentar la serial detectada, asi como otras variaciones de los ELISA conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 11.2.1 ).
La afinidad de union de un polipeptido heteromultimerico por un antigeno de celulas tumorales y la tasa de desactivacion de una interaccion heteromultimero-antigeno pueden determinarse mediante ensayos de union competitiva. Un ejemplo de un ensayo de union competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubacion de un antigeno marcado (por ejemplo, 3 H o 125 I), o un fragmento o variante del mismo, con el polipeptido heteromultimerico de interes en presencia de cantidades crecientes de antigeno no marcado seguido de la deteccion del polipeptido heteromultimerico unido al antigeno marcado. La afinidad del polipeptido heteromultimerico contra un marcador de celulas tumorales y las tasas de desintegracion de la union pueden determinarse a partir de los datos mediante analisis del grafico de Scatchard. En algunos modos de realizacion, el analisis cinetico BIAcore se usa para determinar las tasas de union y desactivacion de un polipeptido heteromultimerico contra un marcador de celulas tumorales. El analisis cinetico BIAcore comprende analizar la union y disociacion de anticuerpos de chips con antigenos marcadores de celulas tumorales inmovilizadas en su superficie.
En otro aspecto de la invencion, los anticuerpos pueden estar ligados quimica o biosinteticamente a agentes antitumorales o agentes productores de senales detectables. Los agentes antitumorales unidos a un anticuerpo incluyen cualquier agente que destruya o dane un tumor al que el anticuerpo se haya unido o en el entorno de la celula a la que se ha unido el anticuerpo. Por ejemplo, un agente antitumoral es un agente toxico, como un agente quimioterapeutico o un radioisotopo. Los agentes quimioterapeuticos adecuados son conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen antraciclinas (por ejemplo, daunomicina y doxorubicina), metotrexato, vindesina, neocarzinostatina, cis-platino, clorambucilo, arabinosido de citosina, 5-fluorouridina, micalanina, ricina y calicicina. Los agentes quimioterapeuticos se conjugan al anticuerpo utilizando procedimientos convencionales (ver, por ejemplo, Hermentin y Seiler (1988) Behring Inst. Mitt. 82, 197-215).
Los agentes que producen senales detectables son utiles in vivo e in vitro para fines de diagnostico. El agente que produce la serial produce una serial medible que es detectable por medios externos, generalmente la medicion de la radiacion electromagnetica. En su mayor parte, el agente productor de serial es una enzima o cromoforo, o emite luz por fluorescencia, fosforescencia o quimioluminiscencia. Los cromoforos incluyen colorantes que absorben la luz en la region ultravioleta o visible, y pueden ser sustratos o productos de degradacion de reacciones catalizadas por enzimas.
La invencion contempla ademas polipeptidos heteromultimericos a los que estan unidos restos diana o informadores. Los restos diana son los primeros miembros de los pares de union. Los agentes antitumorales, por ejemplo, se conjugan a segundos miembros de dichos pares y, por lo tanto, se dirigen al sitio donde se une el anticuerpo. Un ejemplo comun de dicho par de union es la avidina y la biotina. En un modo de realizacion, la biotina se conjuga con un polipeptido heteromultimerico de la invencion, y de este modo proporciona una diana para un agente antitumoral u otro resto que se conjuga a avidina o estreptavidina. Alternativamente, la biotina u otro resto de este tipo esta vinculado a un polipeptido heteromultimerico de la invencion y se usa como informador, por ejemplo, en un sistema de diagnostico en el que un agente productor de serial detectable esta conjugado a avidina o estreptavidina.
Los polipeptidos heteromultimericos pueden administrarse para tratamientos terapeuticos a un paciente que padece un tumor en una cantidad suficiente para prevenir o reducir la progresion del tumor, por ejemplo, el crecimiento, invasividad, metastasis y/o recurrencia del tumor. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una dosis terapeuticamente eficaz. Las cantidades eficaces para este uso dependeran de la gravedad de la enfermedad y del estado general del propio sistema inmunologico del paciente. Los esquemas de dosificacion tambien variaran con el estado de la enfermedad y el estado del paciente, y tipicamente variaran desde una dosis de bolo unico o infusion continua hasta multiples administraciones por dia (por ejemplo, cada 4-6 horas), o segun lo indique el medico que lo trata La condicion del paciente. Los anticuerpos de la invencion se pueden administrar en dosis unicas de hasta 40 mg/kg de peso corporal o mas. Mas preferiblemente, los anticuerpos se administran en dosis que varian de 0,2 mg/kg a 20 mg/kg de peso corporal. Debe observarse, sin embargo, que la presente invencion no se limita a ninguna dosis particular.
La presente invencion se puede usar para tratar cualquier tumor adecuado, que incluye, por ejemplo, tumores de mama, corazon, pulmon, intestino delgado, colon, bazo, rinon, vejiga, cabeza y cuello, ovario, prostata, cerebro, pancreas, piel, hueso, medula osea, sangre, timo, utero, testiculos, cuello uterino o higado.
Las formulaciones se preparan para el almacenamiento y uso combinando un polipeptido heteromultimerico purificado de la presente invencion con un vehiculo farm ace uticamente aceptable (por ejemplo, vehiculo, excipiente) ( Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a edicion, Mack Publishing, 2000 ). Los vehiculos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, tampones no toxicos tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (por ejemplo, cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenol, butilico o bencilico; alquilparabenos, tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 residuos de aminoacidos); proteinas tales como albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos tales como monosacchandes, disacaridos, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, como el sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de proteina Zn); y tensioactivos no ionicos tales como TWEEN o polietilenglicol (PEG).
La composicion farmaceutica de la presente invencion se puede administrar de varias formas para tratamiento local o sistemico. La administracion puede ser topica (por ejemplo, a las membranas mucosas, incluida la administracion vaginal y rectal), como parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, liquidos y polvos; pulmonar (por ejemplo, por inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, incluso por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica); oral; o parenteral, incluida la inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o administracion intracraneal (por ejemplo, intratecal o intraventricular).
La formulacion terapeutica puede estar en forma de dosificacion unitaria. Tales formulaciones incluyen comprimidos, pildoras, capsulas, polvos, granulos, soluciones o suspensiones en agua o medios no acuosos, o supositorios para administracion oral, parenteral o rectal o para administracion por inhalacion. En composiciones solidas tales como tabletas, el ingrediente activo principal se mezcla con un vehiculo farmaceutico. Los ingredientes de comprimidos convencionales incluyen almidon de maiz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, acido estearico, estearato de magnesio, fosfato o gomas dicalcico y otros diluyentes (por ejemplo, agua) para formar una composicion solida de preformulacion que contiene una mezcla homogenea de un compuesto de la presente invencion, o una sal no toxica farmaceuticamente aceptable de los mismos. La composicion de preformulacion solida se subdivide luego en formas de dosificacion unitaria del tipo descrito anteriormente. Los comprimidos, pildoras, etc. de la nueva composicion pueden recubrirse o combinarse de otra manera para proporcionar una forma de dosificacion que ofrezca la ventaja de una accion prolongada. Por ejemplo, la tableta o pildora puede comprender una composicion interna cubierta por un componente externo. Ademas, los dos componentes pueden separarse por una capa enterica que sirve para resistirse a la desintegracion y permite que el componente interno pase intacto a traves del estomago o se retrase en la liberacion. Se puede usar una variedad de materiales para tales capas o recubrimientos entericos, incluyendo tales materiales varios acidos polimericos y mezclas de acidos polimericos con materiales tales como laca, alcohol cetilico y acetato de celulosa.
Las formulaciones farmaceuticas incluyen polipeptidos heteromultimericos de la presente invencion complejados con liposomas ( Epstein y otros, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 ; Hwang, y otros, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 y Patente de los Estados Unidos 4.485; 045 y 4.544.545 ). Los liposomas con tiempo de circulacion mejorado se describen en la Patente de Estados Unidos 5.013.556. Algunos liposomas se pueden generar por evaporacion de fase inversa con una composicion lipidica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a traves de filtros de tamano de poro definido para producir liposomas con el diametro deseado.
Los polipeptidos heteromultimericos tambien se pueden atrapar en microcapsulas. Dichas microcapsulas se preparan, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina y microcapsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nano-particulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones como se describe en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000 ).
Ademas se pueden preparar preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polimeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices estan en forma de articulos conformados (por ejemplo, peliculas o microcapsulas). Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles tales como poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(alcohol de vinilo), polilactidas ( patente de EE . UU. 3.773.919 ), copolimeros de acido L-glutamico y 7 etil-L-glutamato, etilenoacetato de vinilo no degradable, copolimeros de acido lactico-glicolico degradables como LUPRON DEPOT TM (microesferas inyectables compuestas de copolimero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida), acetato de sacarosa isobutirato y poli-D-(-)-3-acido hidroxibutirico.
En algunos modos de realizacion, el tratamiento implica la administracion combinada de un polipeptido heteromultimerico de la presente invencion y un agente quimioterapeutico o coctel de multiples agentes quimioterapeuticos diferentes. El tratamiento con polipeptidos heteromultimericos puede ocurrir antes, simultaneamente o despues de la administracion de quimioterapias. Las quimioterapias contempladas por la invencion incluyen sustancias quimicas o farmacos que son conocidos en la tecnica y estan disponibles comercialmente, tales como doxorubicina, 5-fluorouracilo, arabinosido de citosina ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfan, citoxina, taxol, metotexato , Cisplatino, melfalan, vinblastina, gemcitabina, irinotecan y carboplatino. La administracion combinada puede incluir la administracion conjunta, ya sea en una unica formulacion farmaceutica o utilizando formulaciones separadas, o administracion consecutiva en cualquier orden, pero generalmente dentro de un periodo de tiempo tal que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biologicas simultaneamente. Los esquemas de preparacion y dosificacion de dichos agentes quimioterapeuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o segun lo determine empiricamente el experto en la materia. La preparacion y los esquemas de dosificacion para dicha quimioterapia tambien se describen en Chemotherapy Service Ed., MC Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992).
En otros modos de realizacion, el tratamiento implica la administracion combinada de un polipeptido heteromultimerico de la presente invencion y terapia de radiacion. El tratamiento con polipeptido heteromultimerico puede ocurrir antes, simultaneamente con o despues de la administracion de radioterapia. Cualquier esquema de dosificacion para dicha radioterapia se puede usar segun lo determine el profesional experto.
En otros modos de realizacion, el tratamiento puede involucrar la administracion combinada de polipeptidos heteromultimericos de la presente invencion con anticuerpos contra antigenos asociados a tumores, que incluyen, entre otros, anticuerpos que se unen al receptor de EGF (EGFR) (cetuximab/Erbitux®), el receptor erbB2 (HER2) (trastuzumab/Herceptin®), y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (bevacizumab/Avastin®). Ademas, el tratamiento puede incluir la administracion de una o mas citoquinas, puede ir acompanado de la extirpacion quirurgica de las celulas cancerosas o cualquier otra terapia que el medico tratante considere necesaria.
En otros modos de realizacion, el tratamiento puede implicar la administracion combinada de polipeptidos heteromultimericos de la presente invencion y un segundo agente terapeutico. En algunos modos de realizacion, el segundo agente terapeutico se administra para tratar un efecto secundario causado por la administracion del polipeptido heteromultimerico.
Para el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un polipeptido heteromultimerico de la presente invencion depende del tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y el curso de la enfermedad, la capacidad de respuesta de la enfermedad, si el polipeptido heteromultimerico se administra para fines terapeuticos. o con fines preventives, terapia previa, historial clinico del paciente, etc., todo a discretion del medico tratante. El polipeptido heteromultimerico se puede administrar una vez o durante una serie de tratamientos que duran desde varios dias hasta varios meses, o hasta que se efectue una cura o se logre una disminucion del estado de la enfermedad (por ejemplo, reduction del tamano del tumor). Los horarios de dosificacion optimos se pueden calcular a partir de las mediciones de la acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente y variaran dependiendo de la potencia relativa de un anticuerpo individual. El medico administrador puede determinar facilmente las dosis optimas, las metodologias de dosificacion y las tasas de repeticion. En general, la dosis es de 0.01 pg a 100 mg por kg de peso corporal y se puede administrar una vez o mas diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente. El medico tratante puede estimar las tasas de repeticion para la dosificacion en funcion de los tiempos de residencia medidos y las concentraciones del farmaco en los fluidos corporales o tejidos.
Se proporcionan kits que comprenden los polipeptidos heteromultimericos descritos en el presente documento y que pueden usarse para realizar los procedimientos descritos en el presente documento. En ciertos modos de realizacion, un kit comprende al menos un polipeptido heteromultimerico purificado contra un marcador tumoral en uno o mas recipientes. En ciertos modos de realizacion, un kit comprende al menos dos polipeptidos heteromultimericos. Un experto en la tecnica reconocera facilmente que los anticuerpos descritos de la presente invencion pueden incorporarse facilmente en uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en la tecnica.
Los modos de realizacion de la presente divulgacion pueden definirse adicionalmente mediante referenda a los siguientes ejemplos que describen en detalle la preparation de polipeptidos heteromultimericos de la presente divulgacion y procedimientos para usar polipeptidos heteromultimericos de la presente divulgacion. Sera evidente para los expertos en la materia que pueden realizarse muchas modificaciones, tanto de los materiales como de los procedimientos, sin apartarse del alcance de la presente divulgacion. Siempre que sea posible, se utilizaran los mismos numeros de referenda en todos los dibujos para referirse a partes iguales o similares. Como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/a", "o" y "el/la/los/las" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asi, por ejemplo, la referenda a "un anticuerpo" incluye una pluralidad de tales anticuerpos o uno o mas anticuerpos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la tecnica. Ademas, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reaction, pureza, longitudes de polipeptidos y polinucleotidos, y demas, utilizados en la memoria descriptiva, se modifican por el termino "aproximadamente", a menos que se indique lo contrario. Por consiguiente, los parametros numericos establecidos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas de la presente invencion.
Todos los diversos modos de realizacion u opciones descritos en este documento pueden combinarse en cualquiera y todas las variaciones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Identificacion de interacciones candidatas dentro de la interfaz de dimerizacion de anticuerpos.
Con el fin de comprender mejor la naturaleza de la interfaz de dimerizacion entre los dominios CH3 de la cadena pesada del anticuerpo, se examino la estructura cristalina de un dominio CH3 del anticuerpo (estructura reportada por primera vez por Deisenhofer). J. (1981) Biochemistry, 20, 2361-2370 ). En esta estructura, la dimerizacion de los dos fragmentos Fc esta mediada por interacciones entre cadenas entre los dominios CH3 (Figura 1). La superficie de interaccion del dominio CH3 contiene una region central de residuos hidrofobos flanqueados por residuos tanto de caracter hidrofilo como cargado. Dentro de la region hidrofoba del nucleo hay tirosinas conservadas que presentan grupos hidroxilo para interacciones hidrofilas potenciales, sirviendo asi como residuos hidrofobos y tambien sirviendo para permitir interacciones hidrofilas. La Figura 2 muestra representaciones de la estructura del dominio CH3 dimerizado. Una hebra esta sombreada mas oscura que la otra para mayor claridad. Se muestran las cadenas laterales de los aminoacidos que recubren la superficie de interaccion entre los dominios CH3. La Figura 3 destaca los aminoacidos seleccionados dentro del dominio CH3 involucrados en posibles interacciones entre cadenas en tres vistas separadas de la estructura. Los numeros de posicion de los aminoacidos en la Figura 3 son relativos a la region constante de la lgG2 humana. La Figura 4 muestra una alineacion de los dominios constantes de los isotipos de IgG humana. Se resaltan los residuos particulares que pueden participar en las interacciones entre cadenas y que se indican en la Figura 2. La Tabla 1 enumera la posicion del aminoacido correspondiente a estos residuos que estan potencialmente involucrados en interacciones entre cadenas para cada uno de los isotipos de IgG humana con nomenclatura de numeration en relation con los dominios constantes de la linea germinal de IgG humana.
Tabla 1
Aminoacido Residuo de lgG1 Residuo de lgG2 Residuo de lgG3 Residuo de lgG4
Humana # Humana # Humana # Humana #
Tyr 232 228 279 229
Leu 234 230 281 231
Ser 237 233 284 234
Glu o Asp 239 235 286 236
Glu 240 236 287 237
Lys 243 239 290 240
Gin 245 241 292 242
Ser 247 243 294 244
Thr 249 245 296 246
Leu 251 247 298 248
Lys 253 249 300 250
Asn 273 269 320 270
Lys o Asn 275 271 322 272
Thr 277 273 324 274
Val o Met 280 276 327 277
Asp 282 278 329 279
Asp 284 280 331 281
Ser 286 282 333 283
Phe 288 284 335 285
Tyr 290 286 337 287
Lys o Arg 292 288 339 289
Thr 294 290 341 291
Ejemplo 2: Identification de variantes de Fc que heterodimerizan selectivamente.
Se analizo la capacidad de varios tipos de modificaciones en el dominio CH3 de un anticuerpo para determinar su capacidad para generar anticuerpos heterodimericos espontaneos. Se razono que al reducir selectivamente las interacciones hidrofilicas que ocurren entre cada cadena CH3, podria ser posible hacer que la homodimerizacion del anticuerpo fuera menos favorable, y que al introducir simultaneamente sustituciones que hacen que la homodimerizacion sea desfavorable, pero la heterodimerizacion permisible, podria ser posible generar pares de variantes de Fc que heterodimerizasen selectivamente, pero tienen muy poca propension a homodimerizar.
Por lo tanto, se creo una serie de pares de variantes y se evaluo su capacidad para formar selectivamente anticuerpos heterodimericos. Las sustituciones de aminoacidos se introdujeron en una cadena pesada truncada (denominada minicuerpo) que contiene el conector y la region CH2-CH3 de una cadena pesada, o una cadena pesada del anticuerpo de longitud completa. El uso de dos cadenas pesadas de diferentes tamahos permitio la visualizacion de las especies de heterodimeros como una molecula de masa molecular intermedia y proporciono un ensayo para evaluar la propension relativa de los anticuerpos variantes a formar heterodimeros. Este formato de ensayo se representa en forma de caricatura en la Figura 5. Se probaron varias variantes de pares de anticuerpos. Las sustituciones de aminoacidos se introdujeron en vectores de expresion de anticuerpos que variaron la identidad de los aminoacidos seleccionados que tienen el potencial de participar en interacciones entre cadenas. Los vectores de expresion que codifican estas secuencias de anticuerpos variantes se transfectaron luego, solos o en combinacion con otras cadenas asociadas, a celulas de mamifero (celulas HEK 293 humanas). Despues de 48 horas, se recogieron los medios acondicionados de las celulas transfectadas y se sometieron a un analisis Western blot y se sondaron con un anticuerpo dirigido hacia el dominio Fc humano.
Como se muestra en la Figura 6, se diseharon pares de variantes en las que cada variante tenia poca o ninguna propension a la homodimerizacion, pero cuando se coexpresaban podian contribuir de manera eficiente a la formacion de heterodimeros. La coexpresion de la variante de anticuerpo Var2 (que contiene sustituciones de aminoacidos 249 K a E; 286 Y a F; y 288 K a E) con la variante de anticuerpo Var3 (13A) (que contiene sustituciones de aminoacidos 236 E a K; 278 D a K) da como resultado la formacion casi exclusiva de heterodimero. La combinacion simultanea tanto de la alteracion de los aminoacidos cargados para manipular las fuerzas atractivas y repulsivas para favorecer la heterodimerizacion, como de la alteracion de las interacciones de aminoacidos dentro del "nucleo" de la interfaz de dimerizacion del anticuerpo, se logro aqui mediante la eliminacion de las interacciones hidroxilo mediadas por la tirosina central a traves de su reemplazo por el residuo de aminoacido fenilalanina no polar, para reducir la propension a la homodimerizacion. Esta combinacion de manipulaciones permite tanto la reduccion efectiva de la homodimerizacion como la retencion de la heterodimerizacion.
Ejemplo 3: Union del anticuerpo biespecifico a dos dianas diferentes
Se realizo un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para examinar la capacidad de la variante de anticuerpo biespecifico (Var2-Var3) para unirse a los antigenos. Las placas de ELISA se recubrieron ya sea sin antigeno (-), con anticuerpo anti-FLAG (0,05 mg/ml, cion M2 de SIGMA) o con ligando tipo Delta 4 humano recombinante (0,1 mg/ml) (aminoacidos 27-519 con marca carboxi-terminal 8xHis). Las placas recubiertas se incubaron luego con medio de cultivo celular de control (control negativo) o medio condicionado de celulas transfectadas con vectores de expresion que codifican Var2, Var3 y la cadena ligera L2 como se indica. Despues de permitir que se produjera la union durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron y el anticuerpo unido se detecto mediante el uso de un anticuerpo secundario de anti-IgG humana conjugado con HRP. La variante de anticuerpo biespecifico producida por la coexpresion de variantes Var2 y Var3 posee actividad funcional (Figura 7). La cadena pesada Var3 (13A) y la cadena ligera emparejada son capaces de unirse a DLL4, el antigeno reconocido por el anticuerpo homodimerico primario utilizado para desarrollar Var3, y el brazo de Is cadena pesada de Var2 muestra una marca de epitopo FLAG y es capaz de interactuar con anticuerpos anti- FLAG mediante ELISA. Por lo tanto, el anticuerpo biespecifico es capaz de interactuar con dos dianas diferentes, estando cada cadena pesada involucrada en una interaccion distinta.
Ejemplo 4: Desarrollo de anticuerpos anti-VEGF.
Los ratones se inmunizaron con VEGF humano y se aislaron los bazos. Las cadenas pesadas se amplificaron por PCR y se insertaron en una biblioteca de fagemidos de genes kappa de cadena ligera humanos. En laa biblioteca de fagemidos se recuperaron y seleccionaron resultados en relacon con el VEGF humano en tres rondas sucesivas. Se aislo un panel de Fab de VEGF (+) y se analizo en una serie de ensayos para encontrar antagonistas de VEGF (ensayo de proliferacion de celulas HUVEC, ensayo de bloqueo de Biacore).
En un ensayo de proliferacion de celulas HUVEC, un Fab de VEGF (+) (219R0302) inhibio parcialmente la proliferacion de celulas HUVEC inducida por VEGF (Figura 8). Brevemente, las celulas HUVEC congeladas (Lonza CC-2517) se sometieron a pases en ECGM (Lonza CC-3124) y se introdujeron en mini-bancos de germoplasma. Las celulas se descongelaron directamente a partir de celulas HUVEC de mini-bancos en medio de crecimiento, M199+FBS inactivado por calor al 10% (Gibco Cat#10082139)+50 pg/ml de EGS (BD:354006)+1X heparina 1 mM L-GIn. Para realizar un ensayo de proliferacion, se precubrio una placa de 96 pocillos (Greiner Bio-One Cat#655098) con 50 pi de 10 pg/ml de solucion de colageno de cola de rata, tipo I (BD: 354236, el colageno I se preparo en acido acetico 0,02N) a 4 °C durante la noche. Al dia siguiente, la placa se aspiro completamente para eliminar la solucion de colageno I y se lavo una vez con 200 pi de DPBS. Las celulas HUVEC se tripsinizaron fuera del matraz utilizando el reactivo de subclonacion de celulas endoteliales (Lonza: CC-5034). Todas las celulas se recogieron del matraz y se aislaron mediante centrifugacion a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. Las celulas se resuspendieron en medios de inanicion/ensayo (M199+2% H. I.FBS+1XHeparina+1 mM L+5 unidades/ml Heparin-Gin) a una densidad de 10 5 celulas/ml. Las celulas se sembraron en la placa de ensayo a 5000/pocillo, 50 pl/pocillo. Las celulas se dejaron reposar durante 3 horas en una incubadora a 37°C. Las celulas se lavaron cuidadosamente una vez con DPBS mediante la adicion gota a gota de DPBS 200 pi, y luego se agregaron 100 pi de medio de inanicion. Las celulas se dejaron incubar a 37°C durante la noche. A la manana siguiente (ensayo d=0), los anticuerpos de prueba (o control): Avastin y LZ1) se prepararon en combinacion con rhVEGF (R&D 293-VE-010). En los casos en que se probo una titulacion de diferentes concentraciones de anticuerpos, se prepararon diluciones de 5 veces (a partir de 20 pg/ml de concentracion final) en combinacion con rhVEGF (5 ng/pl de concentracion final) en medios de ensayo. Estas soluciones se preincubaron a 37 °C durante 2 horas. El medio de la placa de ensayo se aspiro cuidadosamente y se agregaron a las celulas 100 pi de las mezclas de Ab:VEGF. Despues de 3-4 dias de incubacion en una incubadora a 37 °C, se agrego una mezcla adicional de Ab+rhVEGF (la misma concentracion final para Ab y rhVEGF) a cada pocillo y se dejo incubar durante otros 4 dias. En el dia 7, se agregaron 20 pi de reactivo Alamar Blue (lnvitrogenCat#DAL1025) a 200 pi de cultivo y se incubaron a 37 °C durante 5 a 6 horas. La placa se leyo con un lector de microplacas de fluorescencia (Ex=530nm/Em=590nm).
Los Fab tambien se analizaron para ver si bloqueaban la interaccion VEGF-VEGFR2 utilizando Biacore 2000. Brevemente, VEGF se inmovilizo en un chip CM5 usando quimica basada en aminas estandar (NHS/EDC). Los Fabs anti-VEGF o Fab de control se hicieron fluir sobre la superficie a 25 pg/ml y, inmediatamente despues, se hizo fluir VEGFR2 recombinante sobre la superficie a 10 pg/ml. Tras seleccion y secuenciacion adicionales, tambien se descubrio una variante de cadena ligera adicional de este Fab (219R0202) y se demostro que tenia propiedades similares (datos no mostrados). Las secuencias para el 219R0302 y el 219R0202 se muestran como las SEQ ID NO:10-16. El Fab 219R0302 bloqueo completamente la union de VEGFR2 a un VEGF en un experimento de bloqueo de Biacore (Figura 9).
Ambas IgG se reformatearon a lgG2, se expresaron y se purificaron para pruebas in vitro confirm atari as. Tanto el 219R0202 como el 219R0302 inhibieron completamente la activacion inducida por VEGF de celulas HUVEC casi en la misma medida que el bevacizumab (Avastin) (Figura 10), un agente anti-VEGF aprobado.
Las afinidades de IgG se determinaron utilizando un instrumento Biacore 2000. En resumen, las proteinas recombinantes se inmovilizaron en un chip CM5 usando quimica estandar basada en aminas (NHS/EDC). Para cada Fab e IgG, se inyectaron diferentes concentraciones (100-1 nM) sobre la superficie y se recogieron datos cineticos a lo largo del tiempo. Los datos se ajustaron utilizando la ecuacion de ajuste global simultanea para producir constantes de afinidad (KD) para cada Fab e IgG. Se determinaron las afinidades de VEGF humano y de raton 219R0202/219R0302 y se compararon con Avastin. A diferencia de Avastin, 219R0202 y 219R0302 se unen a VEGF tanto humano como de raton (Tabla 2). Este data sugiere que el epitopo 219R0202/219R0302 no es igual que Avastin, que solo se une al VEGF humano.
Tabla 2: 219R0302 y 219R0202 se unen a VEGF humano y de raton
IgG hVEGF (nM) mVEGF (nM)
219R0302 2,1 21
219R0202 1,5 23
Avastin 1,3 NB
Ambos anticuerpos tambien se analizaron en un modelo de xenoinjerto de tumor de mama (UM-PE13) y mostraron una inhibicion significativa del crecimiento del tumor (Figura 11). Brevemente, UM-PE13, una linea de xenoinjerto de tumor de mama, se determino en la Universidad de Michigan. Se utilizaron ratones NOD/SCID machos inmunocomprometidos para el establecimiento de xenoinjertos de tumores UM-PE13. Se inyectaron 300,000 celulas viables por via subcutanea en el flanco derecho de los ratones. Una vez que el tumor habia alcanzado un tamano de entre 65 y 200 m m 3, los ratones fueron aleatorizados. Como se muestra en la Figura 11,219R0302 indujo un retraso en el crecimiento del tumor mas fuerte que 219R0202. Avastin mostro el retraso de crecimiento mas potente, que era indistinguible del 219R0302, lo que indica que 219R0302 y Avastin tienen una potencia casi equivalente en este modelo. A diferencia de 219R0302, 219R0202 fue estadisticamente diferente tanto de Avastin como de 219R0302.
Ejemplo 5: Desarrollo de formatos de anticuerpos biespecfficos.
Utilizando las mutaciones de heterodimerizacion descubiertas (13A/13B, Figura 12A), se utilizaron dos formatos para generar un anticuerpo biespecifico dirigido a hDLL4 (21M18) y VEGF (219R0302, 219R0202).
En el primer formato denominado gen unico biespecifico (SGBSP), se uso un conectorde 30 aminoacidos (5xGGGGS) para unir geneticamente la cadena ligera a su cadena pesada como lo hizo con anterioridad Lee et al. (Mol. Immunol.
36:61-71 (1999 )) (Figura 12B). Al hacerlo, cada unidad de union usa su propia cadena ligera para formar una unidad de union Fab que se une a su diana respectiva. Cuando se combinan con las mutaciones biespecificas (13A/13B) descritas anteriormente, dos genes individuales diferentes se reunen para formar un anticuerpo biespecifico.
En el segundo formato llamado Biespecifico Monovalente (MBSP), se utilizo una cadena ligera comun en concierto con dos cadenas pesadas diferentes, una que alberga la mutacion 13Ay la otra que alberga la mutacion 13B (Figura 12C). Para este enfoque, una o ambas de las cadenas pesadas deben poder unirse a su diana en combinacion con una cadena ligera comun. En algunos casos, la cadena ligera comun es la cadena ligera original para una de las cadenas pesadas.
Ambos formatos de anticuerpos se construyeron utilizando 21M18 (DLL4 anti-humano) y 219R0302/219R0202 (anti-VEGF) como bloques de construccion. Las cadenas pesadas 21M18 y 219R0202/0302 se clonaron con los mutantes Fc 13B y 13A, respectivamente. Una vez expresado y purificado, cada anticuerpo biespecifico se analizo para determinar la actividad anti-DLL4 y anti-VEGF en comparacion con el anticuerpo de control.
Para evaluar el doble direccionamiento en el Biacore, se genero una superficie de VEGF de alta densidad como se describio anteriormente y el biespecifico se hizo fluir sobre ella a una alta concentracion para saturar la superficie (25 pg/ml). Inmediatamente despues de la union biespecifica a la superficie, la proteina de fusion DLL4-Fc se hizo fluir sobre la misma superficie a 10 pg/ml. Si ambos brazos del biespecifico son funcionales, entonces DLL4 deberia unirse al brazo anti-DLL4 no unido del biespecifico unido.
Ejemplo 6: Desarrollo de anticuerpo anti-DLL4/anti-VEGF de gen unico biespecifico (SGBSP)
Se creo un SGBSP utilizando 21M18y bien 219R0302 o 219R0202. Ambos SGBSP se expresaron bien y se purificaron mediante cromatografia de proteina A. Para evaluar el nivel de especies homodimericas versus heterodimericas, cada SGBSP se analizo utilizando un enfoque isoelectrico. Dado que las especies homodimericas (homodimeros 13A/13B) tienen diferentes pi de las especies heterodimericas, el gel muestra claramente que ambos SGBSP eran heterodimeros en mas del 90% en base a densitometria de gel (Figura 13A).
Para analizar su actividad anti-VEGF, los anticuerpos se analizaron en el mismo ensayo de proliferacion inducida por VEGF. Como se muestra en la Figura 14, los SGBSP tanto del 219R0302J21M18 como del 219R0202_21M18 inhibieron parcialmente la proliferacion de celulas HUVEC inducida por VEGF, y este ultimo mostro una actividad significativamente mejor que el primero. Dado que la unidad de union de VEGF es monomerica en el contexto de la biespecifica, se espera una actividad reducida debido a la perdida de avidez en comparacion con Avastin o los anticuerpos originales (219R0302/219R0202).
Los SGBSP tanto 219R0302_21M18 como 219R0202_21M18 tarn bien se analizaron respecto a su afinidad de VEGF. La afinidad de union de 219R020221M18 SGBSP fue aproximadamente 5 veces mas debil (6,9 nM) que la de 219R0202 (1,5 nM), lo que concuerda con una perdida de avidez (Tabla 3). La afinidad de union de SGBSP de 219R030221M18 fue aproximadamente 4 veces mas debil (7,6 nM) que la de 219R0302 (2,1 nM), lo que concuerda con una perdida de avidez (Tabla 3).
Tabla 3: SGBSP y MBSP VEGF Biacore Analysis.
IgG VEGF (nM)
219R0302 2,1
219R0202 1,5
219R0302_21M18 SGBSP 7,6
219R0202_21M18 SGBSP 6,9
219R0202_21M18 MBSP 21
El SGBSP de 219R0202_21M18 tambien se probo para determinar su union a celulas transfectadas con DLL4 humano en un ensayo de union FACS (Figura 15). Cuando se comparo con 21M18, hubo una perdida de aproximadamente 5 veces en la actividad de union de DLL4 debido a la perdida de avidez. En resumen, las celulas HEK293 humanas se transfectaron utilizando el reactivo de transfeccion Fugene 6 segun lo recomendado por el fabricante (Roche Inc.). Las celulas se transfectaron con un vector de expresion de ADNc que codifica DLL4 humano de longitud completa, asi como un segundo vector que codifica una proteina fluorescente verde, pcDNA-GFP, para marcar las celulas transfectadas transitoriamente. Veinticuatro a cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, las celulas se incubaron con diferentes concentraciones de SGBSP durante 1 hora a 37 °C. Las celulas se enjuagaron dos veces con medio de tincion (HBSS con 2% de FCS) y se incubaron con un anticuerpo secundario fluorescente, IgG antihumano de cabra H/L-ficoeritrina (PE), a una dilucion 1:200 en PBS durante 1 hora. Las celulas se analizaron por citometria de flujo utilizando un instrumento FACS Caliber (BD Bioscience). La union especifica de SBGSP se evaluo determinando la presencia de celulas positivas para la serial de GFP y la serial de PE.
Usando el ensayo de doble direccionamiento descrito anteriormente, los SGBSP tanto 219R0302_21M18 como 219R0202_21M18 mostraron union tanto a VEGF como a DLL4 como se esperaba (Figura 16A). El SGBSP tambien mostro una inhibicion parcial de la proliferacion inducida por VEGF (Figura 17). Por lo tanto, los ensayos confirman que las mutaciones biespecificas efectivamente reunieron cada unidad de union de una manera heterodimerica y que cada brazo de union es funcional.
Ejemplo 7: Desarrollo de anticuerpo anti-DLL4/anti-VEGF monovalente biespecifico (MBSP)
En el segundo ejemplo, se creo un MBSP utilizando la cadena pesada 21M18, la cadena pesada comun a 219R0302/219R0202 y la cadena ligera 21M18. El MBSP se expreso bien y se purified por cromatografia de proteina A. Para evaluar el nivel de especies homodimericas versus heterodimericas, el MBSP se analizo utilizando un enfoque isoelectrico. Dado que las especies homodimericas (homodimero 13A/13B) tienen diferentes pi del heterodimerico, el analisis de gel IEF mostro que el MBSP era heterodimero en mas del 90% en base a densitometria de gel (Figura 13A). Como se muestra en la Figura 13B, el homodimero 21M18 13B restante podria eliminarse aumentando la relacion de 21R0202 de cadena pesada (13A) a 21M18 de cadena pesada (13B).
Dado que la unidad de union de VEGF es monomerica y ha perdido su LC original en el contexto de la biespecifica, se espera una actividad de union reducida debido a la perdida de avidez y de la contribucion de la cadena ligera a la union. Como confirmacion de esta observacion, la afinidad de union de MBSP fue aproximadamente 14 veces mas debil (21 nM) que la de 219R0202 (1,5 nM), lo cual concuerda con la perdida de avidez y de la union de la cadena ligera en comparacion con el anticuerpo original (Tabla 3).
El MBSP tambien se probo para determinar la union a celulas transfectadas con DLL4 humanas en un ensayo de union FACS (Figura 15). Cuando se compare con 21M18, hubo una perdida de aproximadamente 3 veces en la actividad de union de DLL4 debido a la perdida de avidez.
Usando el ensayo de doble direccionamiento como se describio anteriormente, el MBSP mostro la union tanto a VEGF como DLL4 como se esperaba (Figura 16B). Este ensayo confirmo que las mutaciones biespecfficas efectivamente reunieron cada unidad de union de una manera heterodimerica y que cada brazo de union es funcional.
SECUENCIAS
Secuencia Var 1 (13B) (SEQ ID NO:1) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita )
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN.SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K
Secuencia Var 1 (13B) - sin CH1 o bisagra (SEQ ID NO:4) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita)
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia Var 1 (13B) - solo CH3 (SEQ ID NO:5) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita )
KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDG SFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQRSLSLSPGK
Secuencia Var 2 (SEQ ID NO:2)
■ a s t k g p s v f p l a p c s r s t s e s t a a l g g l v k d y f p e p v t v s w n s g a l t s g v h t f p a v l q s s g l y s l SSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLFSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K
Secuencia Var 2 - sin CH1 o bisagra (SEQ ID NO:6)
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV
v s v l t v v h q d w l n g k e y k c k v s n k g l p a p i e k t i s k t Kg q p r e p q v y t e p p s r e e m t k n q v s l t c LVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLFSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia Var 2 - solo CH3 (SEQ ID NO:7)
KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDG SFFLFSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia Var3 (13A) (SEQ ID NO:3) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita)
AS IKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K
Secuencia Var3 (13A) - sin CH1 o bisagra (SEQ ID NO:8) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita)
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia Var3 (13A) - solo CH3 (SEQ ID NO:9) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita)
KTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
219R0302/0202 VH Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 10)
QVQLKQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKLRPGQGFEWIGDINPSNGGTSYNEKFK RKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTIHYYDNSYAMDYWGQGTSVTVSSAST
219R0302/0202 HC Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:11)
QVQLKQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKLRPGQGFEWIGDINPSNGGTSYNEKFK
r k a t l t v d k s s s t a y m q l s s l t s e d s a v y y c t ih y y d n s y a m d y w g q g t s v t v s s As t k g p s v f p LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSN
f g t q t y t c n v d h k p s n t k v d k t v e r k c c v e c p p c p a p p v a g p s v f l f p p k p k d t l m is r t p e v t c VVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNK
GLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
219R0302/0202 HC Secuencia de ADN (SEQ ID NO:12)
CAGGTGCAATTGAAGCAGTCTGGGGCTGAAGTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTG CAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGCACTGGGTGAAGGTGAGGCCTGGACAAG GCTTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCCAGCAATGGTGGTACTAGCTACAATGAGAAGTTCAAG AGAAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAC
a t c t g a g g a c t c t g c g g t c t a t t a c t g t a c Aa t a c a c t a c t a t g a t a a t t c c t a t g c t a t g g a c t ACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCT CTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACAGGCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTGAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAAC TTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAC AGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAG TGTTCCTCTTCCCCCCAAAAGCCAAGGACACCCTCATGATCTCGCGGACCCCTGAGGTCACGTGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTACCCCAGCGAGATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
219R0302 LC Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:13)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYVNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGR GSGTHFTFTISSLQPEDLATYYCQQYDDLPPTFGRGTKLEiKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
219R0302 LC Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 14)
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATOAC
t t g c g a g g c g a g t c a g g a c a t t a g c a a c t a t g t a a a t t g g t a t c a a c a a a a a c c a g g g a a a g c c c CTAAGCTGCTGAT.CTACGATGCATCCAAOTTGCAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGG
g g a t c t g g g a g a c a t t t t a c t t t g a g c a t c a g c a g c c t g c a g c c t g a a g a t c t g g c a a c a t a t t a
c t g t c a a g a a t a t g a t g a t g t t c c t c c c a c t t t t g g c a g a g g g a c c a a g c t g g a g a t c a a a c g t a
c g g t g g c t g c a c c a g c t g t c g t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c
t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a CGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGAGAGCACCTACA
GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
219R0202 LC Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:15)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINNHLAWYQQKPGKVPKSLIYAASNLHSGVPSKFSGS GSGTHFTLIISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
219R0202 LC Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 16)
GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCAC TTGTCGGGCGAGTCAGGGCATCAATAATCATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCC CTAAGTCCCTCATATATGCTGCATCCAATCTCCATAGTGGCGTCCCATCAAAGTTCAGCGGCAGT GGATCTGGGACACACTTCACTCTCATCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTA CTGTCAACAGTATGATAATCTCCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTA CGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCC TCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAA CGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGAGAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAGAAAGAGCTTCAAGAGGGGAGAGTGT
219R0202_SG (Var3/13A) Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 17) (la secuencia conectora esta subrayada en negrita ) (las sustituciones de 13A se muestran en negrita)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINNHLAWYQQKPGKVPKSLIYAASNLHSGVPSKFSGS GSGTHFTLIISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGAELVKPG ASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKLRPGQGFEWIGDINPSNGGTSYNEKFKRKATLTVDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCTIHYYDNSYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GGLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
219R0302_SG (Var3/13A) Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 18) (la secuencia conectora esta subrayada en negrita) (las sustituciones de 13A se muestran en negrita)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYVNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGR GSGTHFTFTISSLQPEDLATYYCQQYDDLPPTFGRGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGAELVKPG ASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKLRPGQGFEWIGDINPSNGGTSYNEKFKRKATLTVDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCTIHYYDNSYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFN S T FRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
21M18_SG (Var1/13B) Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:19) (la secuencia conectora esta subrayada en negrita) (las sustituciones de 13B se muestran en negrita)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPDR FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVK KPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISSYNGATNYNQKFKGRVTFTTDTSTS TAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHK PSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKT KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSF FLY SELTVDKSRWQQGNVFS C SVMHEALHNHY TQKS LS L S PGK
21R0302/0202 CDR1 de cadena pesada (SEQ ID NO:20)
GYTFTNYWMH
219R0302/0202 CDR2 de cadena pesada (SEQ ID NO:21)
SINPSNGGTSYNEKFKR
219R0302/0202 CDR3 de cadena pesada (SEQ ID NO:22)
HYYDNSYAMDY
219R0302 CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO:23)
QASQDISNYVN
219R0302 CDR2 de cadena ligera (SEQ ID NO:24)
DASNLQT
219R0302 CDR3 de cadena ligera (SEQ ID NO:25)
QQYDDLPP
219R0202 CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO:26)
RASQGINNHLAW
219R0202 CDR2 de cadena ligera (SEQ ID NO:27)
AASNLHS
219R0202 CDR3 de cadena ligera (SEQ ID NO:28)
QQYDNLPL
219R0302 VL Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:29)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYVNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGR GSGTHFTFTISSLQPEDLATYYCQQYDDLPPTFGRGTKLEIKRT
219R0202 VL Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NQ:30)
DIQLTQSPS5LSASVGDRVC1TCRASQG1NNHLAWYQQKPGKVPKSL1YAASNLH3GVPSKFSGS GSGTHFTLIISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRT

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para preparar un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a VEGF y DLL4, en el que el anticuerpo biespecifico comprende un primer y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3, comprendiendo el procedimiento sustituir al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del primer polipeptido de inmunoglobulina y sustituir al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del segundo polipeptido de inmunoglobulina para promover la formacion de un anticuerpo biespecifico, en el que el anticuerpo biespecifico se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una lgG1 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 253 y 292 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 240 y 282 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con lisina;
(b) una lgG2 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de SEQ ID NO:33 se reemplazan con lisina;
(c) una lgG3 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 300 y 339 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 287 y 329 de SEQ ID NO:34 se reemplazan con lisina; y
(d) una lgG4 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 250 y 289 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 237 y 279 de SEQ ID NO:35 se reemplazan con lisina,
en el que el primer polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un primer polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un segundo polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina; y en el que el primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina y el segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina son identicos en secuencia de aminoacidos.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo biespecifico comprende una lgG2 humana, en donde los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 son glutamato, y en donde los aminoacidos en las posiciones en el el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondiente a las posiciones 236 y 278 de la SEQ ID NO:33 es lisina.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo biespecifico comprende una primera secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; y una segunda secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:9.
4. Un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a VEGF y DLL4, en el que el anticuerpo biespecifico comprende un primer y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3, en el que el anticuerpo biespecifico se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una lgG1 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 253 y 292 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con glutamato o aspartato, y
en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 240 y 282 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con lisina;
(b) una lgG2 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con glutamato o aspartato, y
en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con lisina;
(c) una lgG3 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 300 y 339 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con glutamato o aspartato, y
en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 287 y 329 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con lisina; y
(d) una lgG4 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 250 y 289 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 237 y 279 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con lisina,
en el que el primer polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un primer polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un segundo polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina; y en el que el primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina y el segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina son identicos en secuencia de aminoacidos.
5. El anticuerpo biespecifico de la reivindicacion 4, que comprende una lgG2 humana, en donde los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 son glutamato, y
en el que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de la SEQ ID NO:33 son lisina.
6. Un anticuerpo biespecifico de la reivindicacion 4, que comprende una primera secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7; y una segunda secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:9.
7. El anticuerpo biespecifico de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, que es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.
8. Un anticuerpo biespecifico que comprende un primer polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que tiene una secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7, y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que tiene una secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:9.
9. Un polinucleotido aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4-8.
10. Una celula huesped que comprende un polinucleotido de la reivindicacion 9.
11. Un procedimiento para preparar un anticuerpo que comprende cultivar la celula huesped de la reivindicacion 10 en condiciones que dan como resultado la expresion del anticuerpo o polipeptido.
12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4-8 para su uso en el tratamiento del cancer.
13. Uso del anticuerpo de las reivindicaciones 4-8 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
14. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 12, o el uso de la reivindicacion 13, en el que el tratamiento del cancer comprende un segundo agente terapeutico o multiples agentes terapeuticos.
15. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 14, en el que el segundo agente terapeutico es un agente quimioterapeutico.
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Families Citing this family (598)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
SI1523496T1 (sl) 2002-07-18 2011-11-30 Merus B V Rekombinantno proizvajanje zmesi protiteles
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
WO2007109321A2 (en) 2006-03-20 2007-09-27 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
EP2009101B1 (en) 2006-03-31 2017-10-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
DK2006381T3 (en) 2006-03-31 2016-02-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCEDURE FOR REGULATING ANTIBODIES BLOOD PHARMACOKINETICS
US7750124B2 (en) 2006-09-29 2010-07-06 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Anti-human DLL4 antibodies and compositions
AU2008234248C1 (en) 2007-03-29 2015-01-22 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
JP5931336B2 (ja) 2007-07-02 2016-06-08 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド がんを処置および診断するための組成物および方法
CA2698343C (en) 2007-09-04 2018-06-12 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
EP2740490A1 (en) * 2007-10-03 2014-06-11 Cornell University Treatment of proliferative disorders using antibodies to PSMA
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP2398504B1 (en) 2009-02-17 2018-11-28 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
DK2417156T3 (en) 2009-04-07 2015-03-02 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CA2781519A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
US20110172398A1 (en) * 2009-10-02 2011-07-14 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy
EP3485908B1 (en) 2009-10-16 2021-08-18 Mereo BioPharma 5, Inc. Therapeutic combination and use of dll4 antagonist antibodies and anti-hypertensive agents
US8772459B2 (en) 2009-12-02 2014-07-08 Imaginab, Inc. J591 minibodies and Cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (PSMA) and methods for their use
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
CN110066339A (zh) 2010-04-20 2019-07-30 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
DK2560683T4 (da) 2010-04-23 2022-08-29 Hoffmann La Roche Fremstilling af heteromultimeriske proteiner
ES2659406T3 (es) 2010-05-06 2018-03-15 Novartis Ag Composiciones y procedimientos de uso para anticuerpos terapéuticos contra la proteína 6 relacionada con las lipoproteínas de baja densidad (LRP6)
US9290573B2 (en) 2010-05-06 2016-03-22 Novartis Ag Therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (LRP6) multivalent antibodies
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
TR201802772T4 (tr) 2010-11-17 2018-03-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Kan pıhtılaşma faktörü VIII in işlevi için alternatif işleve sahip multi-spesifik antijen bağlayıcı molekül.
LT2647707T (lt) 2010-11-30 2018-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Citotoksiškumą indukuojantis terapinis agentas
AR085091A1 (es) 2011-01-26 2013-09-11 Kolltan Pharmaceuticals Inc Anticuerpos anti-kit y sus usos
US10689447B2 (en) * 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
JP5764677B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-19 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗原結合タンパク質
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
ES2608835T3 (es) 2011-04-13 2017-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas de fusión Fc que comprenden nuevos enlazadores o disposiciones
SG194510A1 (en) 2011-04-22 2013-12-30 Emergent Product Dev Seattle Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositionsand methods
US20140255405A1 (en) * 2011-05-27 2014-09-11 Dutalys Removal of Monomeric Targets
US9260519B2 (en) 2011-06-17 2016-02-16 President And Fellows Of Harvard College Frizzled 2 as a target for therapeutic antibodies in the treatment of cancer
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
EP2543680A1 (en) * 2011-07-07 2013-01-09 Centre National de la Recherche Scientifique Multispecific mutated antibody Fab fragments
CN106167526A (zh) 2011-07-15 2016-11-30 昂考梅德药品有限公司 Rspo结合剂和其应用
WO2013026839A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
AU2015268749B2 (en) * 2011-09-23 2017-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. VEGF/DLL4 binding agents and uses thereof
HRP20190044T1 (hr) * 2011-09-23 2019-02-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Agensi koji vežu vegf/dll4 i njihove uporabe
SG11201401422VA (en) 2011-10-27 2014-09-26 Genmab As Production of heterodimeric proteins
US11851476B2 (en) 2011-10-31 2023-12-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
MX2014005411A (es) 2011-11-04 2015-02-12 Novartis Ag Construcciones prolongadas de la vida media de la proteina relacionada con lipoproteina de baja densidad 6 (lrp6).
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
AU2012340826A1 (en) 2011-11-21 2014-05-29 Genentech, Inc. Purification of anti-c-met antibodies
MX350957B (es) 2011-11-23 2017-09-27 Medimmune Llc Moleculas de union especificas para her3 y usos de las mismas.
RU2693264C2 (ru) 2012-02-03 2019-07-01 Ф.Хоффман-Ля Рош Аг Молекулы биспецифических антител и т-клетки, трансфецированные антигеном, и их применение в медицине
PE20142422A1 (es) 2012-04-05 2015-01-21 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos contra tweak humana e il 17 humana y usos de los mismos
ES2743399T3 (es) 2012-04-20 2020-02-19 Merus Nv Métodos y medios para la producción de moléculas heterodiméricas similares a Ig
US9090694B2 (en) 2012-04-30 2015-07-28 Janssen Biotech, Inc. ST2L antibody antagonists
WO2013184912A2 (en) 2012-06-06 2013-12-12 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Binding agents that modulate the hippo pathway and uses thereof
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
CA2878868A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Austin L. Gurney Rspo3 binding agents and uses thereof
SG11201500489YA (en) 2012-07-25 2015-02-27 Kolltan Pharmaceuticals Inc Anti-kit antibodies and uses thereof
PL3489261T3 (pl) 2012-08-24 2021-08-16 The Regents Of The University Of California Przeciwciała i szczepionki do stosowania w leczeniu nowotworów z ekspresją ROR1 i w hamowaniu przerzutu
US10358492B2 (en) 2012-09-27 2019-07-23 Merus N.V. Bispecific IgG antibodies as T cell engagers
RU2015117393A (ru) 2012-10-08 2016-12-10 Роше Гликарт Аг Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения
WO2014062659A2 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating ocular diseases
AU2013337811A1 (en) 2012-10-31 2015-05-14 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a DLL4 antagonist
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
EP2914629A1 (en) 2012-11-05 2015-09-09 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
BR112015010436A2 (pt) 2012-11-07 2017-08-22 Pfizer Anticorpos anti-notch3 e conjugados anticorpo-fármaco
US20170275367A1 (en) 2012-11-21 2017-09-28 Janssen Biotech, Inc. Bispecific EGFR/C-Met Antibodies
PL2922872T3 (pl) 2012-11-21 2019-03-29 Janssen Biotech, Inc. Bispecyficzne przeciwciała przeciwko egfr/c-met
JP6144771B2 (ja) * 2012-11-21 2017-06-07 ファームアブシン インコーポレイテッド Ｖｅｇｆｒ−２とｄｌｌ４を標的とする二重標的抗体及びこれを含む薬学的組成物
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
KR102545617B1 (ko) 2012-11-28 2023-06-20 자임워크스 비씨 인코포레이티드 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도
US9327014B2 (en) 2012-12-04 2016-05-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Immunotherapy with binding agents
KR20200024345A (ko) 2013-01-10 2020-03-06 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
US10047163B2 (en) 2013-02-08 2018-08-14 Abbvie Stemcentrx Llc Multispecific constructs
ES2870802T3 (es) 2013-02-12 2021-10-27 Bristol Myers Squibb Co Métodos de replegado de proteínas a elevado pH
US10183967B2 (en) 2013-02-12 2019-01-22 Bristol-Myers Squibb Company Tangential flow filtration based protein refolding methods
EA201891502A1 (ru) 2013-02-26 2018-12-28 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
RU2015140915A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
US9944700B2 (en) 2013-03-13 2018-04-17 Novartis Ag Notch2 binding molecules for treating respiratory diseases
CA2900955A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Met-binding agents and uses thereof
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res Munich Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
CN105358575B (zh) 2013-03-15 2020-09-22 詹森生物科技公司 干扰素α和ω抗体拮抗剂
KR20160006168A (ko) 2013-03-18 2016-01-18 바이오서오엑스 프로덕스 비.브이. 인간화 항-cd134(ox40) 항체 및 이의 용도
JP2016528167A (ja) 2013-04-29 2016-09-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ヒトＦｃＲｎ結合改変抗体及び使用方法
KR102266819B1 (ko) 2013-04-29 2021-06-18 에프. 호프만-라 로슈 아게 Fc-수용체 결합 개질된 비대칭 항체 및 이의 사용 방법
TWI653243B (zh) 2013-04-29 2019-03-11 赫孚孟拉羅股份公司 遏止ＦｃＲｎ結合之抗ＩＧＦ－１Ｒ抗體及其治療血管性眼疾之用途
ME03675B (me) 2013-07-05 2020-10-20 Genmab As Humanizovana ili himerna anтi-cd3 antiтela
CN105518028B (zh) * 2013-07-09 2019-08-13 Abl生物公司 与dll4和vegf特异性结合的新型双靶向蛋白及其用途
WO2015048008A2 (en) 2013-09-24 2015-04-02 Medimmune, Llc Binding molecules specific for her3 and uses thereof
ES2881306T3 (es) 2013-09-27 2021-11-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método para la producción de heteromultímeros de polipéptidos
RU2016115866A (ru) 2013-10-11 2017-11-16 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифические антитела с обменянными доменами и одинаковыми вариабельными доменами легкой цепи
LT3065774T (lt) 2013-11-06 2021-09-10 Janssen Biotech, Inc. Anti-ccl17 antikūnai
KR102357961B1 (ko) 2013-12-17 2022-02-08 제넨테크, 인크. 항-cd3 항체 및 이의 사용 방법
CA2932958A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use
PL3089996T3 (pl) 2014-01-03 2021-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste przeciwciała przeciw haptenowi/przeciw receptorowi występującemu w barierze krew-mózg, ich kompleksy i ich zastosowanie jako przenośniki wahadłowe występujące w barierze krew-mózg
BR112016015589A2 (pt) 2014-01-06 2017-10-31 Hoffmann La Roche módulos de trânsito monovalentes para a barreira hematoencefálica
BR112016016416A2 (pt) 2014-01-15 2017-10-03 Hoffmann La Roche VARIANTES DE REGIÕES-"Fc" COM 'FcRn' MODIFICADAS E PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO DE PROTEÍNA "A" MANTIDAS
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
SG11201607109QA (en) 2014-02-28 2016-09-29 Merus Nv Antibodies that bind egfr and erbb3
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
SI3110849T1 (sl) 2014-02-28 2021-01-29 Merus N.V. Protitelo, ki veže ERBB-2 in ERBB-3
ME03558B (me) 2014-03-14 2020-07-20 Novartis Ag Molekuli anti-lag-3 antiтela i njihove upotrebe
WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
EP3126389B1 (en) 2014-04-02 2024-10-23 F. Hoffmann-La Roche AG Method for detecting multispecific antibody light chain mispairing
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
PT3126521T (pt) * 2014-04-04 2019-06-27 Crown Bioscience Inc Taicang Gene de fusão hnf4g-rspo2
MX380176B (es) 2014-04-07 2025-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula ligada a antigeno inmunoactivada.
WO2015157634A1 (en) 2014-04-11 2015-10-15 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb antibodies and methods of use thereof
ES2955736T3 (es) 2014-05-06 2023-12-05 Hoffmann La Roche Producción de proteínas heteromultiméricas usando células de mamífero
US11505605B2 (en) 2014-05-13 2022-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
CN106659782B (zh) 2014-05-23 2021-11-09 塞尔德克斯医疗公司 一种用于嗜酸性粒细胞或肥大细胞相关病症治疗的抗体
EA201692476A1 (ru) 2014-05-28 2017-07-31 Займворкс Инк. Модифицированные антигенсвязывающие полипептидные конструкции и их применение
TWI713453B (zh) 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑
WO2015197736A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-brdu antibodies and methods of use
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
ES2774428T3 (es) 2014-07-11 2020-07-21 Genmab As Anticuerpos que se unen a AXL
WO2016014565A2 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
BR112017001242A2 (pt) 2014-07-21 2017-12-05 Novartis Ag tratamento de câncer usando um receptor antigênico quimérico a cd33
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
US20170209492A1 (en) 2014-07-31 2017-07-27 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
KR102411972B1 (ko) 2014-08-04 2022-06-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
JP6919118B2 (ja) 2014-08-14 2021-08-18 ノバルティス アーゲー ＧＦＲα−４キメラ抗原受容体を用いる癌の治療
MY189028A (en) 2014-08-19 2022-01-20 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
RS60305B1 (sr) 2014-09-05 2020-07-31 Janssen Pharmaceutica Nv Agensi koji vezuju cd123 i njihove upotrebe
MY192918A (en) 2014-09-09 2022-09-15 Janssen Biotech Inc Combination therapies with anti-cd38 antibodies
JP6796059B2 (ja) 2014-09-12 2020-12-02 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー Ｗｎｔシグナリングアゴニスト分子
EP3193935A4 (en) 2014-09-16 2018-03-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Treatment of fibrotic diseases
CA2961636A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Boris ENGELS Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3204415B1 (en) 2014-10-09 2020-06-17 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
MX389663B (es) 2014-10-14 2025-03-20 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas.
MX382902B (es) 2014-10-31 2025-03-13 Oncomed Pharm Inc Inhibidor de la vía noth en combinación con un agente inmunoterapéutico para usarse en el tratamiento de cáncer.
SI3215528T1 (sl) 2014-11-06 2019-11-29 Hoffmann La Roche Variante regije Fc s spremenjeno vezavo FcRn in postopki uporabe
EP3215524B1 (en) 2014-11-06 2021-01-13 F.Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties
LT3789402T (lt) 2014-11-20 2022-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Kompleksinė terapija, naudojant t ląsteles aktyvinančias bispecifines antigeną surišančias molekules ir pd-1 ašį surišančius antagonistus
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
RS60615B1 (sr) 2014-11-20 2020-08-31 Hoffmann La Roche Zajednički laki lanci i postupci upotrebe
CN107074955B (zh) 2014-11-20 2021-06-22 豪夫迈·罗氏有限公司 针对FolR1和CD3的T细胞活化性双特异性抗原结合分子
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała
EP3227338A4 (en) 2014-12-04 2018-05-16 Janssen Biotech, Inc. Anti-cd38 antibodies for treatment of acute myeloid leukemia
DK3233907T3 (da) 2014-12-19 2021-06-07 Genmab As Bispecifikke heterodimeriske proteiner hos gnavere
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
IL254817B2 (en) 2015-04-08 2023-12-01 Novartis Ag Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car) - expressing cell
WO2016172583A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
JP7103751B6 (ja) * 2015-04-28 2022-08-15 ザイムワークス，インコーポレイテッド 修飾された抗原結合ポリペプチド構築物及びその使用
CA2985125A1 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (psma) bispecific binding agents and uses thereof
CR20170526A (es) 2015-05-20 2018-04-03 Janssen Biotech Inc ANTICUERPOS ANTI-CD38 PARA EL TRATAMIENTO DE AMILOIDOSIS DE CADENA LIGERA y OTRAS ENFERMEDADES MALIGNAS HEMATOLÓGICAS POSITIVAS PARA CD38
US10323094B2 (en) 2015-06-16 2019-06-18 Genentech, Inc. Humanized and affinity matured antibodies to FcRH5 and methods of use
MY192978A (en) 2015-06-22 2022-09-20 Janssen Biotech Inc Combination therapies for heme malignancies with anti-cd38 antibodies and survivin inhibitors
HUE066300T2 (hu) 2015-06-24 2024-07-28 Janssen Biotech Inc Immunmoduláció és szolid tumorok kezelése CD38-hoz specifikusan kötõdõ antitestekkel
ES2809728T3 (es) 2015-06-24 2021-03-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-tau(pS422) humanizados y procedimientos de uso
EP3345928B1 (en) 2015-07-10 2020-06-24 Merus N.V. Human cd3 binding antibody
LT3319993T (lt) 2015-07-10 2020-05-11 Genmab A/S Axl specifiniai antikūno-vaistokonjugatai, skirti vėžiui gydyti
IL256562B2 (en) 2015-07-15 2024-07-01 Genmab As Human CD3 antibodies or chimeras
US20180222982A1 (en) 2015-07-29 2018-08-09 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to pd-1
DK3317301T3 (da) 2015-07-29 2021-06-28 Immutep Sas Kombinationsterapier omfattende antistofmolekyler mod lag-3
EP3878465A1 (en) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
CA2994825A1 (en) 2015-08-05 2017-02-09 Janssen Biotech, Inc. Anti-cd154 antibodies and methods of using them
ES3020458T3 (en) 2015-08-07 2025-05-22 Imaginab Inc Antigen binding constructs to target molecules
PT3337824T (pt) 2015-08-17 2020-09-10 Janssen Pharmaceutica Nv Anticorpos anti-bcma, moléculas de ligação a antigénio biespecíficas que ligam bcma e cd3, e suas utilizações
BR112017026543A2 (pt) 2015-08-26 2018-08-14 Bison Therapeutics Inc plataforma de anticorpo multiespecífico e métodos relacionados
HK1258125A1 (zh) 2015-09-04 2019-11-08 The California Institute For Biomedical Research 胰岛素免疫球蛋白融合蛋白
WO2017053469A2 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Aptevo Research And Development Llc Cd3 binding polypeptides
WO2017053705A1 (en) 2015-09-23 2017-03-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treatment of cancer
MX2018003905A (es) 2015-09-30 2018-09-06 Janssen Biotech Inc Anticuerpos agonistas que se unen específicamente a cd40 humana y métodos de uso.
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
EP3356417A1 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules binding mesothelin and cd3
WO2017055393A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xtim-3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN107949574A (zh) 2015-10-02 2018-04-20 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性t细胞活化性抗原结合分子
WO2017055314A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
WO2017055385A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xgd2 bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3150637A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
EP3356821B1 (en) 2015-10-02 2019-10-23 H. Hoffnabb-La Roche Ag Cellular based fret assay for the determination of simultaneous binding
US20180282410A1 (en) 2015-10-02 2018-10-04 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-cd3xrob04 bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN107849137B (zh) 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ceaxcd3 t细胞活化性抗原结合分子
WO2017055392A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xcd44v6 bispecific t cell activating antigen binding molecules
PE20180773A1 (es) 2015-10-02 2018-05-07 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos para pd1 y tim3
BR112018008068A2 (en) 2015-10-23 2018-11-13 Merus N.V. binding molecules that inhibit cancer growth
CN114891102A (zh) 2015-10-29 2022-08-12 豪夫迈·罗氏有限公司 抗变体Fc区抗体及使用方法
EP3371220A2 (en) 2015-11-02 2018-09-12 Janssen Pharmaceutica NV Anti-il1rap antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind il1rap and cd3, and uses thereof
PL3827845T3 (pl) 2015-11-03 2022-07-11 Janssen Biotech, Inc. Formulacje podskórne przeciwciał anty-cd38 i ich zastosowania
SI3370768T1 (sl) 2015-11-03 2022-04-29 Janssen Biotech, Inc. Protitelesa, ki se specifično vežejo na PD-1, in njihove uporabe
JP6931329B2 (ja) 2015-11-18 2021-09-01 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
EP3378488A4 (en) 2015-11-18 2019-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR IMPROVING THE HUMORAL IMMUNE REACTION
MX2018006333A (es) 2015-12-01 2018-08-01 Genmab Bv Anticuerpos anti-receptor de muerte 5 (dr5) y metodos de uso de los mismos.
IL257696B2 (en) 2015-12-09 2024-11-01 Hoffmann La Roche Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
EP3389712B1 (en) 2015-12-17 2024-04-10 Novartis AG Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
EP3390453A2 (en) 2015-12-17 2018-10-24 Janssen Biotech, Inc. Antibodies specifically binding hla-dr and their uses
JP2019502695A (ja) 2015-12-17 2019-01-31 ノバルティス アーゲー ＰＤ−１に対する抗体分子とＣ−Ｍｅｔ阻害剤との組合せおよびその使用
MA44140A (fr) 2015-12-22 2021-05-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Récepteur d'antigène chimérique (car) contre la mésothéline et anticorps contre l'inhibiteur de pd-l1 pour une utilisation combinée dans une thérapie anticancéreuse
JP6954842B2 (ja) 2015-12-25 2021-10-27 中外製薬株式会社 増強された活性を有する抗体及びその改変方法
JP7219005B2 (ja) 2015-12-28 2023-02-07 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
WO2017125897A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 Novartis Ag Multispecific molecules targeting cll-1
EP3408671B1 (en) * 2016-01-25 2023-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for assaying t-cell dependent bispecific antibodies
CA3016287A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
EP3431102A4 (en) 2016-03-14 2019-09-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CELL DAMAGING THERAPEUTIC MEDICAMENT FOR USE IN CANCER THERAPY
US11291721B2 (en) 2016-03-21 2022-04-05 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
FI3433280T3 (fi) 2016-03-22 2023-06-06 Hoffmann La Roche Proteaasin aktivoimia t-solubispesifisiä molekyylejä
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
SI3443096T1 (sl) 2016-04-15 2023-07-31 Novartis Ag Sestavki in postopki za selektivno izražanje himerni antigenskih receptorjev
JP7320943B2 (ja) 2016-04-28 2023-08-04 中外製薬株式会社 抗体含有製剤
JP6675017B2 (ja) 2016-05-02 2020-04-01 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ コントースボディ−単鎖標的結合物質
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
AU2018276419A1 (en) 2016-06-02 2019-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Type II anti-CD20 antibody and anti-CD20/CD3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3464375A2 (en) 2016-06-02 2019-04-10 Novartis AG Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
CA3029003A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Regents Of The University Of California Cancer treatment combinations
JP2019527678A (ja) 2016-06-28 2019-10-03 ユーエムセー・ユトレヒト・ホールディング・ベー・フェー ＣＤ３８に特異的に結合する抗体によるＩｇＥ媒介疾患の治療
WO2018007314A1 (en) 2016-07-04 2018-01-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel antibody format
UA128304C2 (uk) 2016-07-14 2024-06-05 Ґенмаб А/С Мультиспецифічне антитіло до cd40 і cd137
CN120285179A (zh) 2016-07-15 2025-07-11 诺华股份有限公司 使用与激酶抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗和预防细胞因子释放综合征
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
IL264486B2 (en) 2016-07-28 2025-04-01 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors and PD-1 inhibitors
SG11201900885VA (en) 2016-08-01 2019-02-27 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
SG11201900744SA (en) 2016-08-12 2019-02-27 Janssen Biotech Inc Fc engineered anti-tnfr superfamily member antibodies having enhanced agonistic activity and methods of using them
CN109863170B (zh) 2016-08-12 2024-08-16 詹森生物科技公司 具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体及其他含Fc结构域分子
WO2018060301A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against cd3
JP6785372B2 (ja) 2016-09-30 2020-11-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性分子の機能分析のためのｓｐｒに基づく二重結合アッセイ
EP3523331A1 (en) 2016-10-07 2019-08-14 Novartis AG Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
JOP20190097A1 (ar) 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv الجلوبولينات المناعية واستخداماتها
EP3535291A1 (en) 2016-11-01 2019-09-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2018093821A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
WO2018094282A1 (en) * 2016-11-18 2018-05-24 The Regents Of The University Of California Engineered antibodies and uses thereof
MX2019005772A (es) 2016-11-23 2019-10-02 Bioverativ Therapeutics Inc Anticuerpos mono y biespecíficos que se unen al factor de coagulación ix y al factor de coagulación x.
EP4043485A1 (en) 2017-01-26 2022-08-17 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
KR20250140128A (ko) 2017-02-10 2025-09-24 젠맵 비. 브이 폴리펩티드 변이체 및 그의 용도
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
TW201834688A (zh) * 2017-02-24 2018-10-01 日商中外製藥股份有限公司 藥學組成物、抗原結合分子、治療方法以及篩選方法
WO2018158719A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 Novartis Ag Engineered heterodimeric proteins
CN116836285A (zh) 2017-03-09 2023-10-03 健玛保 针对pd-l1的抗体
SG11201908127WA (en) 2017-03-10 2019-10-30 Hoffmann La Roche Method for producing multispecific antibodies
CA3058343A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Merus N.V. Erbb-2 and erbb-3 binding bispecific antibodies for use in the treatment of cells that have an nrg1 fusion gene
EP3601354A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
BR112019018767A2 (pt) 2017-04-03 2020-05-05 Hoffmann La Roche anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, usos, método para tratar uma doença em um indivíduo e invenção
WO2018184965A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates of il-2 with an anti-pd-1 and tim-3 bispecific antibody
PT3606946T (pt) 2017-04-03 2022-10-17 Hoffmann La Roche Imunoconjugados de um anticorpo anti-pd-1 com uma il-2 mutante ou com il-15
WO2018187227A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Concologie, Inc. Methods for treating cancer using ps-targeting antibodies with immuno-oncology agents
CN116375876A (zh) 2017-04-05 2023-07-04 豪夫迈·罗氏有限公司 特异性结合pd1和lag3的双特异性抗体
CN113527499A (zh) * 2017-04-09 2021-10-22 轩竹生物科技有限公司 有共同轻链的双互补位和多互补位抗体和使用方法
BR112019021411A2 (pt) 2017-04-13 2020-05-05 Hoffmann La Roche métodos para tratar ou retardar a progressão do câncer e para melhorar a função, usos de um imunoconjugado, de um agonista, de um antagonista, composições, kit e invenção
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN108866635B (zh) * 2017-05-09 2021-11-26 安升（上海）医药科技有限公司 多特异性蛋白药物及其文库、以及制备方法和应用
US12195551B2 (en) 2017-05-17 2025-01-14 Merus N.V. Combination of an ErbB-2/ErbB-3 bispecific antibody with endocrine therapy for breast cancer
EP3630836A1 (en) 2017-05-31 2020-04-08 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
MX2019014577A (es) 2017-06-05 2020-07-29 Janssen Biotech Inc Anticuerpos que se unen especificamente a pd-1 y metodos de uso.
BR112019025583A2 (pt) 2017-06-05 2020-06-16 Janssen Biotech, Inc. Anticorpos multiespecíficos geneticamente modificados e outras proteínas multiméricas com mutações assimétricas na região ch2-ch3
CN111328335A (zh) 2017-06-07 2020-06-23 根马布私人有限公司 基于突变igg六聚体的治疗性抗体
EP3641812A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis AG Antibody molecules to cd73 and uses thereof
AU2018292618A1 (en) 2017-06-27 2019-12-19 Novartis Ag Dosage regimens for anti-TIM-3 antibodies and uses thereof
AR112603A1 (es) 2017-07-10 2019-11-20 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos inhibidores de punto de control
EP3652209A2 (en) 2017-07-11 2020-05-20 Compass Therapeutics LLC Agonist antibodies that bind human cd137 and uses thereof
KR20250025039A (ko) 2017-07-20 2025-02-20 노파르티스 아게 항-lag-3 항체의 투여 요법 및 그의 용도
JP7290013B2 (ja) 2017-08-04 2023-06-13 ジェンマブ エー／エス Ｐｄ－ｌ１およびｃｄ１３７に結合する結合物質ならびにその使用
HUE071182T2 (hu) 2017-08-09 2025-08-28 Merus Nv EGFR és CMET kötõ antitestek
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
UA128389C2 (uk) 2017-09-29 2024-07-03 Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся Мультиспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка має активність заміщувати кофакторну функцію фактора коагуляції крові viii (fviii), та фармацевтичний склад, який містить згадану молекулу як активний інгредієнт
CN111246885B (zh) 2017-10-20 2024-06-11 豪夫迈·罗氏有限公司 从单特异性抗体生成多特异性抗体的方法
MX2020004100A (es) 2017-10-30 2020-07-24 Hoffmann La Roche Metodo para generacion in vivo de anticuerpos multiespecificos a partir de anticuerpos monoespecificos.
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
JP7092881B2 (ja) 2017-11-01 2022-06-28 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ＴｒｉＦａｂコントースボディ
AU2018361430B2 (en) 2017-11-01 2025-08-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody variant and isoform with lowered biological activity
CN111295392A (zh) 2017-11-01 2020-06-16 豪夫迈·罗氏有限公司 Compbody–多价靶结合物
EP3703746A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Novel tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
SG11202002903XA (en) 2017-11-01 2020-04-29 Hoffmann La Roche Bispecific 2+1 contorsbodies
AU2018368731A1 (en) 2017-11-16 2020-05-14 Novartis Ag Combination therapies
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
JP6522727B2 (ja) * 2017-12-15 2019-05-29 矢崎総業株式会社 メッキ繊維及びワイヤハーネス
CA3085596A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Surrozen, Inc. Anti-frizzled antibodies and methods of use
US11746150B2 (en) 2017-12-19 2023-09-05 Surrozen Operating, Inc. Anti-LRP5/6 antibodies and methods of use
US11773171B2 (en) 2017-12-19 2023-10-03 Surrozen Operating, Inc. WNT surrogate molecules and uses thereof
CN111527107B (zh) 2017-12-21 2024-10-01 豪夫迈·罗氏有限公司 结合hla-a2/wt1的抗体
CN111491951B (zh) 2017-12-22 2024-05-24 豪夫迈·罗氏有限公司 通过疏水相互作用色谱法耗尽轻链错配的抗体变体
EP3737692A4 (en) 2018-01-09 2021-09-29 Elstar Therapeutics, Inc. CALRETICULIN AND MODIFIED T-LYMPHOCYTES BINDING CONSTRUCTIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
US12398209B2 (en) 2018-01-22 2025-08-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers with antagonistic anti-PD-1 antibodies
JP2021510740A (ja) 2018-01-24 2021-04-30 ゲンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変種およびそれらの用途
CA3090249A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
MX2020007527A (es) 2018-02-06 2020-09-09 Hoffmann La Roche Tratamiento de enfermedades oftalmologicas.
MX2020008289A (es) 2018-02-08 2020-09-25 Genentech Inc Moleculas biespecificas de union al antigeno y metodos de uso.
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
JP7466442B2 (ja) 2018-02-14 2024-04-12 中外製薬株式会社 抗原結合分子および組合せ
EP3765493A2 (en) 2018-03-12 2021-01-20 Genmab A/S Antibodies
US20210009711A1 (en) 2018-03-14 2021-01-14 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
AR114789A1 (es) 2018-04-18 2020-10-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
CN108752478B (zh) * 2018-05-03 2021-05-25 沣潮医药科技（上海）有限公司 全人源抗人EGFR和Notch2/3多特异性抗体、其制备方法及用途
MX2020011552A (es) 2018-05-03 2020-11-24 Genmab Bv Combinaciones de variantes de anticuerpos y usos de las mismas.
AU2019270624B2 (en) 2018-05-16 2024-05-02 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers and enhancing efficacy of T cell redirecting therapeutics
AU2019272575A1 (en) 2018-05-21 2020-12-10 Compass Therapeutics Llc Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by NK cells
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
EA202092849A1 (ru) 2018-05-24 2021-03-16 Янссен Байотек, Инк. Моноспецифические и мультиспецифические антитела к tmeff2 и их применение
JOP20200303A1 (ar) 2018-05-24 2020-11-23 Janssen Biotech Inc عوامل ربط psma واستخداماتها
JOP20190116A1 (ar) 2018-05-24 2019-11-24 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتل التمايز 33 (cd33)، والأجسام المضادة ثنائية النوعية لتكتل التمايز 33 (cd33)/تكتل التمايز 3 (cd3) واستخداماتها
RS66901B1 (sr) 2018-05-24 2025-07-31 Janssen Biotech Inc Anti-cd3 antitela i njihova upotreba
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
SG11202011461TA (en) 2018-06-01 2020-12-30 Compugen Ltd Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibodies and methods of use
AU2019284911A1 (en) 2018-06-13 2020-12-17 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
US20210238268A1 (en) 2018-06-19 2021-08-05 Atarga, Llc Antibody molecules to complement component 5 and uses thereof
EP3810194A1 (en) 2018-06-22 2021-04-28 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
US20240254252A1 (en) 2018-07-13 2024-08-01 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
CA3106146A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Variants of cd38 antibody and uses thereof
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
JP7523349B2 (ja) 2018-08-29 2024-07-26 中外製薬株式会社 抗体半分子、および抗体半分子のホモ二量体形成を抑制する方法
MA53812A (fr) 2018-10-04 2021-08-11 Genmab Holding B V Compositions pharmaceutiques comprenant des anticorps anti-cd37 bispécifiques
KR102467349B1 (ko) 2018-10-29 2022-11-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 항체 제형
CN120983617A (zh) 2018-11-06 2025-11-21 健玛保 抗体配制剂
MX2021005594A (es) 2018-11-13 2021-10-22 Compass Therapeutics Llc Constructos multiespecificos de union contra moleculas de puntos de control y usos de los mismos.
JP2022513708A (ja) 2018-12-05 2022-02-09 モルフォシス・アーゲー 多重特異性抗原結合分子
TWI874341B (zh) 2018-12-18 2025-03-01 美商健生生物科技公司 產生異二聚體抗體之方法
WO2020128972A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
JP2022513255A (ja) 2018-12-20 2022-02-07 ノバルティス アーゲー ＨＤＭ２－ｐ５３相互作用阻害剤とＢＣＬ２阻害剤との組み合わせ及び癌を処置するためのその使用
TWI881476B (zh) 2018-12-21 2025-04-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合cd3之抗體
SG11202106393SA (en) 2018-12-24 2021-07-29 Sanofi Sa Pseudofab-based multispecific binding proteins
US20220073630A1 (en) 2018-12-28 2022-03-10 Hoffmann-La Roche, Inc. A peptide-mhc-i-antibody fusion protein for therapeutic use in a patient with amplified immune response
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
AU2020208828A1 (en) 2019-01-15 2021-08-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibody compositions and methods for the treatment of juvenile idiopathic arthritis
PE20211977A1 (es) 2019-01-18 2021-10-05 Janssen Biotech Inc Receptores de antigenos quimericos de gprc5d y celulas que los expresan
US20220064278A1 (en) 2019-01-23 2022-03-03 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF Antibody Compositions for Use in Methods for the Treatment of Psoriatic Arthritis
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
ES3032659T3 (en) 2019-02-15 2025-07-23 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
ES2982474T3 (es) 2019-02-15 2024-10-16 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidin-1,6-diona sustituidos y usos de estos
GB2598218B (en) 2019-02-21 2024-05-08 Marengo Therapeutics Inc Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
CN119661722A (zh) 2019-02-21 2025-03-21 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
EP3927747A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
CA3131016A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Andreas Loew Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2020172598A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
US20220088075A1 (en) 2019-02-22 2022-03-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
US11459391B2 (en) 2019-02-26 2022-10-04 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies and patient stratification with bispecific anti-EGFR/c-Met antibodies
MA55305A (fr) 2019-03-11 2022-01-19 Janssen Biotech Inc Anticorps bispécifiques anti-v béta 17/anti-cd123
CN113825765A (zh) 2019-03-14 2021-12-21 詹森生物科技公司 用于制备抗il12/il23抗体组合物的制造方法
MA55282A (fr) 2019-03-14 2022-01-19 Janssen Biotech Inc Procédés de fabrication pour la production de compositions d'anticorps anti-tnf
CA3133388A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Methods for producing anti-tnf antibody compositions
CA3133383A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Methods for producing anti-tnf antibody compositions
PH12021552414A1 (en) 2019-03-29 2022-07-25 Atarga Llc Anti fgf23 antibody
CN113677701B (zh) 2019-03-29 2025-02-07 豪夫迈·罗氏有限公司 产生亲合结合多特异性抗体的方法
CN113646622B (zh) 2019-03-29 2024-11-12 豪夫迈·罗氏有限公司 用于多价分子的功能分析的基于spr的结合测定
KR20220002899A (ko) 2019-04-19 2022-01-07 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-psma/cd3 항체로 전립선암을 치료하는 방법
JP2022531128A (ja) 2019-04-25 2022-07-06 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ポリペプチド鎖交換による抗体由来ポリペプチドの生成
JP7688584B2 (ja) 2019-04-25 2025-06-04 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ポリペプチド鎖の交換により活性化される治療用多重特異性ポリペプチド
TW202106713A (zh) 2019-04-25 2021-02-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 具延長半衰期之可活化治療性多特異性多肽
KR20220017892A (ko) 2019-05-08 2022-02-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 T세포 매개 면역의 조절을 위한 물질 및 방법
US20220315661A1 (en) 2019-05-09 2022-10-06 Genmab B.V. Dosage regimens for a combination of anti-dr5 antibodies for use in treating cancer
EP3969907B1 (en) 2019-05-13 2025-09-24 F. Hoffmann-La Roche AG Interference-suppressed pharmacokinetic immunoassay
JOP20210304A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاجات مركبة باستخدام الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR)/ مستقبل عامل نمو خلايا الكبد (c-Met) ومثبطات كيناز التيروسين الخاصة بمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) من الجيل الثالث
WO2020245676A1 (en) 2019-06-03 2020-12-10 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibody compositions, and methods for the treatment of psoriatic arthritis
AU2020291208A1 (en) * 2019-06-11 2022-01-06 Antlera Therapeutics Inc. Multivalent FZD and Wnt binding molecules and uses thereof
CA3140297A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 Simon Auslaender Method for the generation of a protein expressing cell by targeted integration using cre mrna
HUE071032T2 (hu) 2019-06-26 2025-07-28 Hoffmann La Roche Emlõs sejtvonalak SIRT-1 gén kiiktatásával
WO2021001289A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates comprising a mutant interleukin-2 and an anti-cd8 antibody
US12435131B2 (en) 2019-07-11 2025-10-07 Tavotek Biotherapeutics (Hong Kong) Limited Agents that interfere with thymic stromal lymphopoietin (TSLP)-receptor signaling
EP3997122A1 (en) 2019-07-12 2022-05-18 Janssen Pharmaceutica NV Binding agents and uses thereof
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
US12077585B2 (en) 2019-07-26 2024-09-03 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising kallikrein related peptidase 2 antigen binding domains and their uses
PE20220394A1 (es) 2019-07-31 2022-03-18 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se fijan a gprc5d
EP4004045A1 (en) 2019-07-31 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to gprc5d
PH12022550348A1 (en) 2019-08-15 2022-12-12 Janssen Biotech Inc Materials and methods for improved single chain variable fragments
CN114786679A (zh) 2019-10-21 2022-07-22 诺华股份有限公司 具有维奈托克和tim-3抑制剂的组合疗法
CN114786680A (zh) 2019-10-21 2022-07-22 诺华股份有限公司 Tim-3抑制剂及其用途
US20220411529A1 (en) 2019-11-06 2022-12-29 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
MX2022005983A (es) 2019-11-18 2022-09-07 Janssen Biotech Inc Receptores del antígeno quimérico anti-cd79, células car-t, y usos de estos.
CA3163104A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Chimeric antigen receptors and uses thereof
CN110964119A (zh) * 2019-12-05 2020-04-07 沣潮医药科技（上海）有限公司 抗疟二聚体免疫粘附素、药物组合物和用途
US20210188990A1 (en) 2019-12-11 2021-06-24 Cilag Gmbh International Multispecific binding molecules comprising ltbr and edb binding domains and uses thereof
EP4076663A1 (en) 2019-12-18 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-ccl2 antibodies
PE20221282A1 (es) 2019-12-18 2022-09-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a hla-a2/mage-a4
MX2022007759A (es) 2019-12-20 2022-07-19 Novartis Ag Combinacion del anticuerpo anti tim-3 mbg453 y anticuerpo anti tgf-beta nis793, con o sin decitabina o el anticuerpo anti pd-1 spartalizumab, para el tratamiento de mielofibrosis y sindrome mielodisplasico.
US11913945B2 (en) 2020-01-02 2024-02-27 Hoffmann-La Roche Inc. Method for determining the amount of a therapeutic antibody in the brain
GB2609554B (en) 2020-01-03 2025-08-20 Marengo Therapeutics Inc Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
PE20230113A1 (es) 2020-01-16 2023-01-27 Genmab As Formulaciones de anticuerpos anti-cd38 y usos de las mismas
EP4090335A1 (en) 2020-01-17 2022-11-23 Novartis AG Combination comprising a tim-3 inhibitor and a hypomethylating agent for use in treating myelodysplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia
US20210222244A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for single cell secretomics
IL295129A (en) 2020-01-30 2022-09-01 Umoja Biopharma Inc Bispecific transduction enhancer
WO2021155916A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
JOP20220184A1 (ar) 2020-02-12 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاج مصابي السرطان ممن لديهم طفرات تخطي c-Met إكسون14
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
BR112022016633A2 (pt) 2020-02-27 2022-12-13 Novartis Ag Métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
UY40280A (es) 2020-03-13 2023-07-31 Janssen Biotech Inc Dominios de unión a antígeno que se unen a la proteina cd33 de la superficie de células mieloides
AU2021236906A1 (en) 2020-03-18 2022-08-18 Genmab A/S Antibodies binding to B7H4
EP4135848A2 (en) 2020-04-15 2023-02-22 F. Hoffmann-La Roche AG Immunoconjugates
MX2022012752A (es) 2020-04-15 2023-01-16 Voyager Therapeutics Inc Compuestos de union a tau.
CN115916840A (zh) 2020-04-16 2023-04-04 詹森生物科技公司 用于监测多特异性分子的形成物的反相高效液相色谱（rp-hplc）的系统、材料和方法
KR20230028242A (ko) 2020-04-24 2023-02-28 마렝고 테라퓨틱스, 인크. T 세포 관련 암 세포에 결합하는 다중기능성 분자 및 그것의 용도
JP2023524068A (ja) 2020-04-30 2023-06-08 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー サイトカイン関連有害事象を治療する方法
US20230227570A1 (en) 2020-05-08 2023-07-20 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
EP4149524A1 (en) 2020-05-11 2023-03-22 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy with modified pbmcs and an immunoconjugate
IL298046A (en) 2020-05-11 2023-01-01 Janssen Biotech Inc Methods for treating multiple myeloma
KR20230017841A (ko) 2020-05-27 2023-02-06 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Cd3 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도
GB202008860D0 (en) 2020-06-11 2020-07-29 Univ Oxford Innovation Ltd BTLA antibodies
AU2021291407A1 (en) 2020-06-19 2022-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3
WO2021255143A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and folr1
AR122657A1 (es) 2020-06-19 2022-09-28 Hoffmann La Roche Moléculas de unión al dominio fc de activación inmunitaria
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
TWI852680B (zh) 2020-06-19 2024-08-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與 cd3 及 cd19 結合之抗體
MX2022015852A (es) 2020-06-23 2023-01-24 Novartis Ag Regimen de dosificacion que comprende derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona.
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
PH12023550015A1 (en) 2020-07-16 2024-03-11 Novartis Ag Anti-betacellulin antibodies, fragments thereof, and multi-specific binding molecules
EP4185388A1 (en) 2020-07-23 2023-05-31 Genmab B.V. A combination of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
TW202221028A (zh) 2020-07-29 2022-06-01 美商健生生物科技公司 包括hla-g抗原結合域之蛋白及其用途
CN116322776A (zh) 2020-08-03 2023-06-23 詹森生物科技公司 用于病毒治疗剂中的多向生物转运的材料和方法
EP4188549A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Novartis AG Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
AU2021322046A1 (en) 2020-08-06 2023-02-02 BioNTech SE Binding agents for coronavirus S protein
WO2022035722A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for producing bioengineered virus specific lymphocytes
GB2616354A (en) 2020-08-26 2023-09-06 Marengo Therapeutics Inc Methods of detecting TRBC1 or TRBC2
CA3190766A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
AU2021331075A1 (en) 2020-08-26 2023-04-06 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
EP4204020A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
US20230321285A1 (en) 2020-08-31 2023-10-12 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
EP4208200A2 (en) 2020-09-02 2023-07-12 Genmab A/S Antibody therapy
BR112023004319A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma difuso de grandes células b
JP2023541860A (ja) 2020-09-10 2023-10-04 ジェンマブ エー／エス びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
CA3190376A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
CA3190349A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
CN116406293A (zh) 2020-09-10 2023-07-07 健玛保 用于治疗滤泡性淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
BR112023004296A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma de célula b grande difusa em um indivíduo humano
WO2022056197A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Janssen Biotech, Inc. Immune targeting molecules and uses thereof
WO2022056192A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Janssen Biotech, Inc. Methods and compositions for modulating beta chain mediated immunity
KR20230068415A (ko) 2020-09-24 2023-05-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 유전자 녹아웃을 갖는 포유류 세포주
CN116438198A (zh) 2020-10-02 2023-07-14 健玛保 能够结合ror2的抗体以及结合ror2和cd3的双特异性抗体
UY39467A (es) 2020-10-13 2022-04-29 Janssen Biotech Inc Inmunidad mediada por células t de bioingeniería, materiales y otros métodos para modular el grupo de diferenciación iv y / o viii
TW202233672A (zh) 2020-10-22 2022-09-01 美商健生生物科技公司 包括類δ配體３（ＤＬＬ３）抗原結合區之蛋白質及其用途
TW202233674A (zh) 2020-10-28 2022-09-01 美商健生生物科技公司 用於調節δγ鏈介導之免疫的組成物及方法
TWI888665B (zh) 2020-11-04 2025-07-01 美商建南德克公司 抗cd20/抗cd3雙特異性抗體之皮下給藥
US12351643B2 (en) 2020-11-04 2025-07-08 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies
EP4245317A4 (en) 2020-11-10 2024-11-06 Shanghai Qilu Pharmaceutical Research and Development Centre Ltd. BISPECIFIC ANTIBODY FOR CLAUDIN 18A2 AND CD3 AND APPLICATION OF BISPECIFIC ANTIBODY
CA3198447A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
PE20240819A1 (es) 2020-12-17 2024-04-18 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de estos
EP4263595A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 F. Hoffmann-La Roche AG Precursor proteins and kit for targeted therapy
JP2024501662A (ja) 2020-12-22 2024-01-15 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｘｂｐ１を標的とするオリゴヌクレオチド
IL304067A (en) 2021-01-06 2023-08-01 Hoffmann La Roche Combined treatment using PD1-LAG3 bispecific antibody and CD20 T cell bispecific antibody
WO2022148853A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
AU2022214491A1 (en) 2021-01-28 2023-09-14 Janssen Biotech, Inc. Psma binding proteins and uses thereof
JP2024505049A (ja) 2021-01-29 2024-02-02 ノバルティス アーゲー 抗ｃｄ７３及び抗ｅｎｔｐｄ２抗体のための投与方式並びにその使用
US11639396B2 (en) 2021-02-16 2023-05-02 Janssen Biotech, Inc. Antibody binding to a linker peptide
US20220267438A1 (en) 2021-02-16 2022-08-25 Janssen Pharmaceutica Nv Trispecific antibody targeting bcma, gprc5d, and cd3
EP4295154A1 (en) 2021-02-18 2023-12-27 F. Hoffmann-La Roche AG Method for resolving complex, multistep antibody interactions
WO2022189942A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Janssen Biotech, Inc. Treatment of cancers lacking egfr-activating mutations
JP2024512386A (ja) 2021-03-12 2024-03-19 ジェンマブ エー／エス 非活性化抗体バリアント
CN117098781A (zh) 2021-03-24 2023-11-21 詹森生物科技公司 靶向cd22和cd79b的抗体
CA3214307A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof
MX2023011267A (es) 2021-03-24 2023-12-14 Janssen Biotech Inc Anticuerpo triespecífico dirigido a cd79b, cd20, y cd3.
WO2022206872A1 (zh) 2021-03-31 2022-10-06 江苏恒瑞医药股份有限公司 截短的taci多肽及其融合蛋白和用途
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
KR20240004462A (ko) 2021-04-08 2024-01-11 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Tcr에 결합하는 다기능성 분자 및 이의 용도
MX2023012408A (es) 2021-04-30 2023-10-31 Hoffmann La Roche Dosis para tratamiento conjunto con anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3 y conjugado anticuerpo farmaco anti-cd79b.
TW202244059A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
JP2024519212A (ja) 2021-05-07 2024-05-09 ジェンマブ エー／エス Ｂ７ｈ４およびｃｄ３に結合する二重特異性抗体を含む薬学的組成物
TW202306990A (zh) 2021-05-12 2023-02-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 特異性結合ｒａｎｋｌ和ｎｇｆ的抗原結合分子及其醫藥用途
CN117120478A (zh) 2021-05-14 2023-11-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种抗原结合分子
US12291575B2 (en) 2021-05-14 2025-05-06 Genentech, Inc. Methods for treatment of CD20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
TW202309094A (zh) 2021-05-18 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於識別癌症患者以進行組合治療之方法
CA3221735A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-ccl2 antibodies
US20240262924A1 (en) 2021-06-21 2024-08-08 Genmab A/S Combination dosage regime of cd137 and pd-l1 binding agents
KR20240028452A (ko) 2021-07-02 2024-03-05 제넨테크, 인크. 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물
CN117957251A (zh) 2021-07-09 2024-04-30 詹森生物科技公司 用于制备抗tnf抗体组合物的制造方法
KR20240034215A (ko) 2021-07-09 2024-03-13 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-il12/il23 항체 조성물을 생산하기 위한 제조 방법
IL309997A (en) 2021-07-09 2024-03-01 Janssen Biotech Inc Production methods for the production of anti-TNF antibody compositions
CA3225715A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Xin Ye Antigen-binding molecule specifically binding to hgfr and egfr, and pharmaceutical use thereof
CN117730102A (zh) 2021-07-22 2024-03-19 豪夫迈·罗氏有限公司 异二聚体Fc结构域抗体
CN117715939A (zh) 2021-07-27 2024-03-15 莫佛塞斯公司 抗原结合分子的组合
MX2024001214A (es) 2021-07-28 2024-02-12 Hoffmann La Roche Metodos y composiciones para tratar cancer.
US20250270314A1 (en) 2021-08-02 2025-08-28 Tavotek Biotech (Suzhou) Ltd Anti-cdh17 monoclonal and bispecific antibodies and uses thereof
US20250277051A1 (en) 2021-08-02 2025-09-04 Hangzhou Unogen Biotech, Ltd Anti-cd38 antibodies, anti-cd3 antibodies, and bispecific antibodies, and uses thereof
KR20240051280A (ko) 2021-09-06 2024-04-19 젠맵 에이/에스 Cd27과 결합할 수 있는 항체, 그의 변이체 및 그의 용도
AU2022344595A1 (en) 2021-09-13 2024-05-02 Janssen Biotech, Inc CD33 X Vδ2 MULTISPECIFIC ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
EP4405396A2 (en) 2021-09-20 2024-07-31 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
CN117813323A (zh) 2021-09-23 2024-04-02 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗klb抗体及用途
US20250019455A1 (en) 2021-09-24 2025-01-16 Pharmaceutica Nv Proteins comprising cd20 binding domains, and uses thereof
US20240400670A1 (en) 2021-09-30 2024-12-05 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-il23 antibody fusion protein and uses thereof
JP7503215B2 (ja) 2021-10-08 2024-06-19 ジェンマブ エー／エス Ｃｄ３０及びｃｄ３に結合する抗体
EP4429706A1 (en) 2021-10-14 2024-09-18 F. Hoffmann-La Roche AG Alternative pd1-il7v immunoconjugates for the treatment of cancer
EP4416174A1 (en) 2021-10-14 2024-08-21 F. Hoffmann-La Roche AG New interleukin-7 immunoconjugates
WO2023069888A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 Tavotek Biotherapeutics (Hong Kong) Limited ANTI-EGFR ANTIBODIES, ANTI-cMET ANTIBODIES, ANTI-VEGF ANTIBODIES, MULTISPECIFIC ANTIBODIES, AND USES THEREOF
EP4426734A1 (en) 2021-11-01 2024-09-11 Janssen Biotech, Inc. Compositions and methods for the modulation of beta chain-mediated immunity
AU2022380722A1 (en) 2021-11-03 2024-06-20 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers and enhancing efficacy of bcmaxcd3 bispecific antibodies
US20250034559A1 (en) 2021-11-17 2025-01-30 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
CA3239224A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Janssen Biotech, Inc. Compositions comprising enhanced multispecific binding agents for an immune response
EP4437344A1 (en) 2021-11-25 2024-10-02 F. Hoffmann-La Roche AG Quantification of low amounts of antibody sideproducts
US20230183360A1 (en) 2021-12-09 2023-06-15 Janssen Biotech, Inc. Use of Amivantamab to Treat Colorectal Cancer
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
WO2023122723A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 The Broad Institute, Inc. Panels and methods for diagnosing and treating lung cancer
WO2023139293A1 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Novimmune Sa Composition and methods for the selective activation of cytokine signaling pathways
KR20240135663A (ko) 2022-01-28 2024-09-11 젠맵 에이/에스 미만성 대 b-세포 림프종을 치료하기 위한 조합 요법에서의 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
US20230303693A1 (en) 2022-01-28 2023-09-28 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
US20250043022A1 (en) 2022-02-07 2025-02-06 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Antigen-binding molecule specifically binding to psma and cd3, and pharmaceutical use thereof
TW202342057A (zh) 2022-02-07 2023-11-01 美商健生生物科技公司 用於減少用ｅｇｆｒ／ｍｅｔ雙特異性抗體治療之患者的輸注相關反應之方法
TW202342548A (zh) 2022-02-07 2023-11-01 美商威特拉公司 抗獨特型(anti-idiotype)抗體分子及其用途
JP2025508692A (ja) 2022-02-11 2025-04-10 江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司 免疫複合体及びその使用
EP4490192A1 (en) 2022-03-07 2025-01-15 Novimmune S.A. Cd28 bispecific antibodies for targeted t cell activation
US12122850B2 (en) 2022-03-14 2024-10-22 LamKap Bio gamma AG Bispecific GPC3xCD28 and GPC3xCD3 antibodies and their combination for targeted killing of GPC3 positive malignant cells
CA3245807A1 (en) 2022-03-14 2025-06-13 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Antigen-binding molecule specifically binding to GPRC5D and CD3 and its medical use
WO2023174521A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137
KR20240164782A (ko) 2022-03-23 2024-11-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체와 화학요법의 병용 치료
TW202346337A (zh) 2022-03-29 2023-12-01 美商恩格姆生物製藥公司 Ilt3及cd3結合劑以及其使用方法
WO2023198839A2 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
KR20250004776A (ko) 2022-04-13 2025-01-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체의 약학 조성물 및 사용 방법
JP2025513335A (ja) 2022-04-19 2025-04-24 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 改良された産生細胞
AR129136A1 (es) 2022-04-26 2024-07-17 Novartis Ag Anticuerpos multiespecíficos que se dirigen a il-13 e il-18
IL316628A (en) 2022-05-12 2024-12-01 Genmab As Binding agents capable of binding to CD27 in combination therapy
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
EP4522757A2 (en) 2022-05-13 2025-03-19 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
JP2025517572A (ja) 2022-06-03 2025-06-05 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 改良された産生細胞
AU2023287212A1 (en) 2022-06-23 2024-12-19 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Antigen-binding molecule specifically binding to dll3 and cd3, and pharmaceutical use thereof
JP2025522814A (ja) 2022-06-30 2025-07-17 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 胃癌又は食道癌を治療するための抗ｅｇｆｒ／抗ｍｅｔ抗体の使用
TW202435912A (zh) 2022-08-03 2024-09-16 美商航海家醫療公司 用於穿過血腦屏障之組合物及方法
KR20250046283A (ko) 2022-08-05 2025-04-02 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 Gucy2c 및 cd3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자 및 이의 의약적 용도
KR20250069606A (ko) 2022-09-15 2025-05-19 보이저 테라퓨틱스, 인크. 타우 결합 화합물
TW202423969A (zh) 2022-10-10 2024-06-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 Ｇｐｒｃ５ｄ ｔｃｂ及蛋白酶體抑制劑之組合療法
TW202430211A (zh) 2022-10-10 2024-08-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 Ｇｐｒｃ５ｄ ｔｃｂ及ｉｍｉｄ之組合療法
TW202423970A (zh) 2022-10-10 2024-06-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 Ｇｐｒｃ５ｄ ｔｃｂ及ｃｄ３８抗體之組合療法
WO2024079069A1 (en) 2022-10-12 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for classifying cells
CN120476144A (zh) 2022-10-21 2025-08-12 诺夫免疫股份有限公司 用于免疫检查点依赖性T细胞活化的PD-L1xCD28双特异性抗体
WO2024089551A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Janssen Biotech, Inc. Msln and cd3 binding agents and methods of use thereof
WO2024094660A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Genmab A/S Cd38 antibodies and uses thereof
KR20250096769A (ko) 2022-11-01 2025-06-27 상하이 치루 파마슈티컬 리서치 앤 디벨롭먼트 센터 리미티드 글리피칸-3에 대한 이중특이성 항체 및 이의 용도
AU2023375177A1 (en) 2022-11-02 2025-06-19 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers
EP4612179A1 (en) 2022-11-02 2025-09-10 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating richter's syndrome
WO2024100170A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a*02/foxp3
JP2025539760A (ja) 2022-11-15 2025-12-09 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗原結合分子
EP4619427A1 (en) 2022-11-15 2025-09-24 F. Hoffmann-La Roche AG Recombinant binding proteins with activatable effector domain
AU2023404602A1 (en) 2022-11-29 2025-05-29 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Cldn18.2/4-1bb binding protein and medical use thereof
CN120548192A (zh) 2023-01-20 2025-08-26 豪夫迈·罗氏有限公司 免疫缀合物
CN120569410A (zh) 2023-01-25 2025-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 与csf1r和cd3结合的抗体
WO2024163009A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating urothelial bladder cancer
TW202436339A (zh) 2023-01-31 2024-09-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療選自非小細胞肺癌或三陰性乳癌的癌症之用途
WO2024168061A2 (en) 2023-02-07 2024-08-15 Ayan Therapeutics Inc. Antibody molecules binding to sars-cov-2
AU2024217296A1 (en) 2023-02-09 2025-09-25 Janssen Biotech, Inc. Anti-v beta 17/anti-cd123 bispecific antibodies
CN120826234A (zh) 2023-03-06 2025-10-21 豪夫迈·罗氏有限公司 抗EGFRvIII/抗CD3抗体与肿瘤靶向性4-1BB激动剂的组合疗法
CN120835901A (zh) 2023-03-13 2025-10-24 豪夫迈·罗氏有限公司 采用pd1-lag3双特异性抗体和hla-g t细胞双特异性抗体的组合疗法
WO2024189544A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with bi-specific anti-egfr/c-met antibodies and anti-pd-1 antibodies
CN120917044A (zh) 2023-04-03 2025-11-07 豪夫迈·罗氏有限公司 激动性拆分型抗体
CN120882744A (zh) 2023-04-03 2025-10-31 豪夫迈·罗氏有限公司 一体化激动性抗体
TW202506178A (zh) 2023-04-05 2025-02-16 丹麥商珍美寶股份有限公司 包含與ｃｄ３０和ｃｄ３結合之抗體之醫藥組成物
KR20250163373A (ko) 2023-04-11 2025-11-20 바이오레이 파마슈티컬 씨오., 엘티디. 항-ror1 항체 및 그 약물 접합체
WO2024213754A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Genmab A/S Methods of treating lymphoma with bispecific antibodies against cd3 and cd20
AR132623A1 (es) 2023-05-08 2025-07-16 Hoffmann La Roche PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE INTERFERÓN a DIRIGIDAS Y MÉTODOS DE USO
AR132668A1 (es) 2023-05-12 2025-07-16 Genmab As Anticuerpos capaces de unirse a ox40, variantes de los mismos y usos de los mismos
AR132687A1 (es) 2023-05-16 2025-07-23 Hoffmann La Roche Inmunoconjugados de il-2 regulados por pd-1 y sus usos
CA3228195A1 (en) 2023-05-23 2025-06-30 Janssen Biotech Inc Methods for treatment of non-small cell lung cancer (nsclc)
WO2024263195A1 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Genentech, Inc. Methods for treatment of liver cancer
WO2024263904A1 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Genentech, Inc. Methods for treatment of liver cancer
TW202509077A (zh) 2023-06-30 2025-03-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 與纖維母細胞活化蛋白α及死亡受體４結合之抗體
WO2025021838A1 (en) 2023-07-26 2025-01-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
AR133412A1 (es) 2023-07-30 2025-09-24 Janssen Biotech Inc Moléculas que se unen a la calreticulina mutante y usos de estas
WO2025034715A1 (en) 2023-08-07 2025-02-13 Janssen Biotech, Inc. Gucy2c antibodies and uses thereof
US20250136688A1 (en) 2023-08-07 2025-05-01 Janssen Biotech, Inc. Stabilized cd3 antigen binding agents and methods of use thereof
WO2025032508A1 (en) 2023-08-07 2025-02-13 Janssen Biotech, Inc. Enpp3 and cd3 binding agents and methods of use thereof
WO2025032069A1 (en) 2023-08-09 2025-02-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Mono and multispecific anti-trem2 antibodies, methods and uses thereof
WO2025032071A1 (en) 2023-08-09 2025-02-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Mono and multispecific anti-trem2 antibodies, methods and uses thereof
WO2025036892A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Morphosys Ag Cycat halfbody molecules comprising sterically occluding moieties
WO2025042742A1 (en) 2023-08-18 2025-02-27 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising antibodies that bind bcma and cd3 and methods of treatment
WO2025052273A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating non-small cell lung cancer
WO2025051895A1 (en) 2023-09-06 2025-03-13 Novimmune Sa Combination therapy with a cea x cd28 bispecific antibody and blocking anti-pd-1 antibodies for enhanced in vivo anti-tumor activity
WO2025059162A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Car-engager containing il-2 variants to enhance the functionality of car t cells
WO2025056180A1 (en) 2023-09-15 2025-03-20 BioNTech SE Methods of treatment using agents binding to epcam and cd137 in combination with pd-1 axis binding antagonists
WO2025079020A1 (en) 2023-10-12 2025-04-17 Janssen Biotech, Inc. First line treatment in egfr exon 20 insertion-mutated advanced non-small cell lung cancer
WO2025082777A1 (en) 2023-10-17 2025-04-24 Morphosys Ag Dual-targeting of muc16 and mesothelin co-expressing tumor cells by functional complementation of cycat® halfbody molecules
WO2025085610A1 (en) 2023-10-18 2025-04-24 Janssen Biotech, Inc. Combination treatment of prostate cancers with two bispecific antibodies
TW202535406A (zh) 2023-10-30 2025-09-16 美商壯生和壯生企業創新公司 用於治療肺癌之a2a受體拮抗劑
WO2025114541A1 (en) 2023-11-30 2025-06-05 Genmab A/S Antibodies capable of binding to ox40 in combination therapy
WO2025122634A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2025120583A2 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Janssen Biotech, Inc. CD33 ANTIBODIES, CD33/Vδ2 MULTISPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2025125386A1 (en) 2023-12-14 2025-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies that bind to folr1 and methods of use
WO2025151018A1 (ko) * 2024-01-12 2025-07-17 주식회사 노벨티노빌리티 C-kit 및 vegf에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도
WO2025153988A1 (en) 2024-01-16 2025-07-24 Janssen Biotech, Inc. Use of amivantamab to treat colorectal cancer
WO2025158277A1 (en) 2024-01-22 2025-07-31 Janssen Biotech, Inc. Use of amivantamab to treat head and neck cancer
WO2025181189A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
WO2025191459A1 (en) 2024-03-11 2025-09-18 Janssen Biotech, Inc. Use of bispecific anti-egfr/c-met antibodies to treat solid tumors
WO2025202147A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukin-7 immunoconjugates
WO2025221736A2 (en) 2024-04-15 2025-10-23 Janssen Biotech, Inc. Ltbr binding molecules and uses thereof
WO2025219504A1 (en) 2024-04-19 2025-10-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of ophthalmologic diseases
WO2025226541A2 (en) 2024-04-26 2025-10-30 Janssen Biotech, Inc. Klk2xcd3 antibody and an anti-cancer agent for treating prostate cancer
WO2025231408A2 (en) 2024-05-03 2025-11-06 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma with car-t cells and bispecific antibodies
WO2025233825A1 (en) 2024-05-06 2025-11-13 Janssen Pharmaceutica Nv Enrichment of cells expressing a bird linker
WO2025237931A1 (en) 2024-05-15 2025-11-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant binding proteins with conditionally activatable t cell and nk cell recruiting effector domains
WO2025243243A1 (en) 2024-05-24 2025-11-27 Janssen Biotech, Inc. Bispecific antibody targeting emr2 (cd312) and the t-cell receptor trbv19

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US573168A (en) * 1896-12-15 silberman
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
ES2236634T3 (es) 1997-04-07 2005-07-16 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-vegf.
EP0979281B1 (en) 1997-05-02 2005-07-20 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) * 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6833441B2 (en) * 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
SI1523496T1 (sl) 2002-07-18 2011-11-30 Merus B V Rekombinantno proizvajanje zmesi protiteles
CN1511850A (zh) * 2002-12-31 2004-07-14 王小宁 Mhc-肽抗体多聚体的制备方法
US7354578B2 (en) 2003-06-06 2008-04-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of tumor regression with VEGF inhibitors
US7758859B2 (en) 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
JP4818917B2 (ja) 2003-08-08 2011-11-16 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 腫瘍および罹患細胞のアポトーシスを誘発するための二重特異性抗体
CA2577082A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
EP1810979B1 (en) 2004-09-22 2012-06-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. STABILIZED HUMAN IgG4 ANTIBODIES
US20060134121A1 (en) 2004-10-29 2006-06-22 Gavin Thurston DII4 antagonists, assays, and therapeutic methods thereof
US8048418B2 (en) 2004-10-29 2011-11-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with combination of Dll4 antagonists and VEGF antagonists
JP5620626B2 (ja) * 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
AU2006236439B2 (en) * 2005-04-15 2012-05-03 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US7774903B2 (en) 2005-08-16 2010-08-17 Lummus Corporation Roller gin apparatus, method and system
WO2007028110A2 (en) * 2005-09-01 2007-03-08 Vasgene Therapeutics, Inc. Methods for using and identifying modulators of delta-like 4
AR056142A1 (es) 2005-10-21 2007-09-19 Amgen Inc Metodos para generar el anticuerpo igg monovalente
DK1962895T3 (da) * 2005-12-16 2013-03-04 Regeneron Pharma TERAPEUTISK ANVENDELSE AF EN Dll4-ANTAGONIST OG EN VEGF-HÆMMER TIL HÆMNING AF TUMORVÆKST
WO2007110205A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
US20080014196A1 (en) 2006-06-06 2008-01-17 Genentech, Inc. Compositions and methods for modulating vascular development
CA2654000A1 (en) 2006-06-06 2008-05-22 Genentech, Inc. Anti-dll4 antibodies and methods using same
WO2007147901A1 (en) * 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
ES2399075T3 (es) 2006-08-30 2013-03-25 Genentech, Inc. Anticuerpos multiespecíficos
US7750124B2 (en) 2006-09-29 2010-07-06 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Anti-human DLL4 antibodies and compositions
US20110076279A1 (en) * 2006-10-20 2011-03-31 Schering Corporation Fully human anti-vegf antibodies and methods of using
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
AU2008315414A1 (en) 2007-10-25 2009-04-30 Philogene, Inc. Antibodies specific to pro-angiogenic isoforms of vascular endothelial growth factor (VEGF)
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) * 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
CN102076355B (zh) * 2008-04-29 2014-05-07 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2010124009A2 (en) 2009-04-21 2010-10-28 Schering Corporation Fully human anti-vegf antibodies and methods of using
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
AU2010270844A1 (en) 2009-07-08 2011-12-22 Amgen Inc. Design of stable and aggregation free antibody Fc molecules through CH3 domain interface engineering
US20110172398A1 (en) 2009-10-02 2011-07-14 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy
WO2011047442A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Garvan Institute Of Medical Research Modified variable domain molecules and methods for producing and using same
SG10201501562VA (en) 2010-03-02 2015-04-29 Abbvie Inc Therapeutic dll4 binding proteins
HRP20190044T1 (hr) 2011-09-23 2019-02-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Agensi koji vežu vegf/dll4 i njihove uporabe
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof

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