ES2630328T3

ES2630328T3 - Anticuerpos anti-OX40 y procedimientos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2630328T3
Application number: ES11820495.7T
Authority: ES
Inventors: Yong-Jun Liu; Kui Shin Voo; Laura Bover; Naoya Tsurushita; J. Yun Tso; Shankar Kumar
Original assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Priority date: 2010-08-23
Filing date: 2011-08-23
Publication date: 2017-08-21
Anticipated expiration: 2031-08-23
Also published as: NZ629913A; EP2609118B1; AU2011293558B2; US9163085B2; DOP2013000045A; IL224886A; EA201390278A1; US20160068604A1; CO6680693A2; PH12013500354B1; DK2609118T3; EA031849B1; KR20140093600A; EP2609118A4; JP2013538057A; EP2933268A1; CN106554417B; US20140308276A1; US20170267773A1; CA2809089A1

Abstract

Un anticuerpo aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une al OX40 humano, que comprende: (A) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEa ID NO: 1; (B) una región variable de cadena pesada eDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEa ID NO: 2; (e) una región variable de cadena pesada eDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEa ID NO: 3; (D) una región variable de cadena ligera eDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEa ID NO: 7; (e) una región de dominio variable de cadena ligera eDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEa ID NO: 8 y (1) una región variable de cadena ligera eDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEa ID NO: 9.

Description

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OESCRIPCION

Anticuerpos anti-OX40 y procedimientos de uso de los mismos Campo de ia invencion

Esta invencion se refiere en general a la modulacion de la activacion del receptor 0X40, y mas particularmente, a la modulation del receptor 0X40 para inhiblr la funcion inmunosupresora de los linfocitos T reguladores de tipo 1 CD4*que producen interleucina 10 (IL-10) ("linfocitos Tr1") y linfocitos T reguladores que expresan Foxp3 * (tambien a veces denominados en el presente documento "linfocitos T reg. Foxp3+"), y a la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos CD4* o de linfocitos indiferenciados y a la produccion de IL-10.

Antecedentes

Los linfocitos Tr1 tienen un papel critico en la tolerancia periferica. Los linfocitos Tr1 son particularmente importantes en la limitation de dafios en los tejidos del huesped durante las respuestas inmunitarias inflamatorias. La generacion de linfocitos Tr1 acompana tanto a las respuestas inmunitarias TH1 como TH2 in vivo e in vitro

Los linfocitos Tr1 se generan a partir de linfocitos T CD4+ indiferenciados durante la respuesta inmunitaria de linfocitos T activada por antigenos. Los linfocitos Tr1 son anergicos en respuesta a la serialization a traves de los receptores TCR, CD28 e IL-2 y pueden suprimir la proliferation de los linfocitos T CD4+ indiferenciados impulsada por antigenos in vivo e in vitro. Los linfocitos Tr1 tienen la capacidad de inhibir el desarrollo de enfermedades autoinmunes y limitar la magnitud de la respuesta inmunitaria a los patogenos microbianos.

Aunque se han estudiado las sefiales moleculares que producen los linfocitos Tr1, se sabe poco sobre las sefiales moleculares que regulan negativamente la generacion de estas celulas. Aunque se han determinado el papel de farmacos inmunosupresores, citocinas, moleculas coestimuladoras y CD en la induction de los linfocitos Tr1, todavia no se han encontrado las sefiales que regulan negativamente la generacion de linfocitos Tr1.

Breve sumario de la invencion

La activacion del receptor 0X40 bloquea la generacion de Tr1 a partir de los linfocitos T CD4* indiferenciados o de memoria, asi como la produccion de IL-10 por los linfocitos Tr1 y la funcion inmunosupresora de los linfocitos Tr1. La activacion del receptor 0X40 tambien bloquea la produccion de IL-10 por los linfocitos T-reg Foxp3+ y la funcion inmunosupresora. Se ha informado de anticuerpos anti-OX40 agonistas aparentes (Weinberg et al., J. Immunother. 29 (2006), 575-585; Piconese et al.. J. Exp. Med. 205 (2008), 825-839; publ de sol. de patente de Estados Unidos N 0 2006/0281072; publ. de sol. de patente de Estados Unidos N.° 2009/0214560; Ruby y Weinberg, Cancer Immunol. Immunother. 58 (2009), 1941-1947).

En el presente documento se presentan anticuerpos agonistas que se unen al receptor 0X40, de forma que el agonista modula la activacion del receptor 0X40 para bloquear la secretion de citocina IL-10 y/o la funcion inmunosupresora general de los linfocitos Tr1 y T-reg Foxp3+. Esencialmente, los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden imitar el ligando 0X40 y activar el receptor 0X40 en los linfocitos Tr1 y/o los linfocitos T reguladores naturales ("nTreg"), a los que tambien se denomina "T-reg Foxp3+".

La invencion se refiere a las realizaciones tal y como se definen en las reivindicaciones. La invencion se refiere a los siguientes puntos:

1. Un anticuerpo aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, que se une al 0X40 humano que comprende:

(a) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEG ID NO: 1;

(b) una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEG ID NO: 2;

(c) una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEG ID NO: 3;

(d) una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEG ID NO: 7; (e)

una region de dominio variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8 y (f) una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9

2. Un anticuerpo aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, de acuerdo con el punto 1, que comprende una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 10 y una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de ia SEQ ID NO: 4.

3. Un anticuerpo aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que el anticuerpo aislado es un anticuerpo monoclonal.

4. Un anticuerpo aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que el anticuerpo aislado es un anticuerpo humanizado.

5. Un anticuerpo humanizado aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, de acuerdo con el punto 4, que

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comprende una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 11 y una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5.

6. Un acido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de union a antigeno de uno cualquiera de los puntos 1

a 5.

7. Una celula huesped que comprende un acido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unidn a antigeno del mismo de uno cualquiera de los puntos 1 a 5.

8. Un procedimiento para producir un anticuerpo, o porcion de unidn a antigeno del mismo, que comprende la etapa de cultivar la celula huesped de acuerdo con el punto 7, comprendiendo el procedimiento preferiblemente ademas recuperar el anticuerpo o porcion de union a antigeno de la celula huesped.

9. Un anticuerpo aislado, o porcion de unidn a antigeno del mismo, de cualquiera de los puntos 1 a 5 para uso como medicamento.

10. Un anticuerpo aislado, o porcion de unidn a antigeno del mismo, del punto 9, en el que el medicamento es para usar en el tratamiento del cancer.

Como se muestra en las solicitudes de patente de Estados Unidos de tramitacion conjunta con numeros de serie 11/659.266 y 12/861.135, OX40L inhibe la generacion y la funcion de los linfocitos Tr1 que producen IL-10 a partirde los linfocitos T CD4+ indiferenciados y de memoria que fueron inducidos por los farmacos inmunosupresores dexametasona y vitamina D3. Se ha descubierto que el OX40L inhibe la generacion y la funcion de los linfocitos T reguladores que producen IL-10. Estos descubrimientos demuestran que la senalizacion del 0X40 por el OX40L inhibe la generacion de linfocitos T inmunosupresores que producen IL-10 humana en cultivo. Esta funcion unica del OX40L no es compartida por otros dos miembros coestimuladores de la familia del INF: el ligando del GITR y el ligando del 4-1BB. El OX40L tambien es un inhibidor potente de la generacion y funcion de los linfocitos Tr1 que producen IL-10 inducidos por dos estimulos fisiologicos que proporcionan el ligando coestimulador inducible y las CD inmaduras. La senalizacion del receptor 0X40 en los linfocitos T humanos por los anticuerpos monoclonales, las moleculas pequenas, o por el OX40L, o las protelnas que tienen al menos 90 por ciento de homologia con ellos, modula y regula la generacion y la funcion de los linfocitos T inmunosupresores que producen IL-10.

El descubrimiento se presta a numerosas aplicaciones de tratamiento. Por ejemplo, se podrian usar anticuerpos agonistas, moleculas pequenas, u OX40L para suprimir la generacion y la funcion de los linfocitos T inmunosupresores que producen IL-10 y por lo tanto se podrian usar para mejorar la respuesta inmunitaria para tratar el cancer y las enfermedades infecciosas, o como adyuvante para vacunas contra el cancer. Los anticuerpos antagonistas de 0X40 u OX40L, o las moleculas pequenas antagonistas, se podrian usar para mejorar la generacion y la funcion de linfocitos T inmunosupresores que producen IL-10 y por lo tanto se podrian usar para el desarrollo de terapias para enfermedades autoinmunes y enfermedades del injerto contra el huesped. Este descubrimiento tambien proporciona procedimientos de alto rendimiento para el cribado de anticuerpos o de moleculas pequenas, ya sea activando el receptor 0X40 (o por el contrario bloqueando la senalizacion de 0X40) en los linfocitos T para el desarrollo de terapias para el cancer, o tambien, enfermedades autoinmunes, y enfermedades del injerto contra el huesped.

En el presente documento se proporcionan anticuerpos monoclonales y humanos (a veces en el presente documento se denominan "anticuerpos anti-OX40" y/u otras variaciones del mismo) que se unen al receptor 0X40 humano. Estos anticuerpos son utiles en el tratamiento o prevencion de enfermedades o afecciones agudas o cronicas en cuya participa el 0X40. En un aspecto, se describe un anticuerpo humano aislado, o una porcion de union a antigeno del mismo, que se une al 0X40 humano y es eficaz como tratamiento contra el cancer o como tratamiento de una enfermedad autoinmune, Cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 divulgados en el presente documento puede usarse como medicamento. Uno o mas cualesquiera de los anticuerpos anti-OX40 se pueden usar para tratar uno o mas de los diversos canceres o enfermedades autoinmunes descritos en el presente documento,

Se proporcionan en el presente documento anticuerpos humanizados aislados que se unen a 0X40. Los anticuerpos aislados que se describen en el presente documento se unen a 0X40, y pueden unirse a 0X40 codificado por los siguientes genes: Numero de acceso del NCBI: NP_003317, numero de acceso de Genpept: P23510, o genes que tienen una homologia del 90 por ciento con los mismos. El anticuerpo aislado proporcionado en el presente documento puede unirse ademas al receptor 0X40 que tiene uno de los siguientes numeros de acceso de GenBank: AAB39944, CAE11757 o AAI05071.

Como se revela en el presente documento, es ejemplar un anticuerpo aislado que se une a 0X40 que comprende:

(a) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1;

(b) una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:

2;

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(c) una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3;

(d) una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 7;

(e) una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8 y

(f) una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9

Ademas, otro ejemplo es un anticuerpo aislado que se une a 0X40 que comprende: (a) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 13; (b) una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 14; (c) una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 15; (d) la region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19; (e) una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 20 y (f) una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 21,

Alternativamente, un anticuerpo aislado puede tener una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1 o 13; una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2 o 14 y/o una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 3 o 15, o una region variable de cadena pesada CDR que tiene un 90 por ciento de bomologia con las mismas.

Ademas, un anticuerpo aislado puede tener una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 7 o 19; una region variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 8 o 20 y/o una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 9 o 21, o una region variable de cadena pesada que tiene un 90 por ciento de homologia con las mismas.

El anticuerpo aislado puede tener una region variable de cadena ligera (“VL”) que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 10, 11,22 o 23, o una secuencia de aminoacidos con al menos un 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 10, 11,22 o 23. El anticuerpo aislado puede tener una region variable de cadena pesada ("VH") que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 4, 5, 16 y 17, o una secuencia de aminoacidos con al menos un 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 4, 5, 16 y 17. Por tanto, como ejemplo, el anticuerpo aislado puede comprender una secuencia pesada variable de la SEQ ID NO: 5 y una secuencia ligera variable de la SEQ ID NO: 11, o una secuencia que tiene un 90 por ciento de homologia con las mismas. Del mismo modo, el anticuerpo aislado puede tener una secuencia pesada variable de la SEQ ID NO: 17 y una secuencia ligera variable de la SEQ ID NO: 23 o una secuencia que tiene un 90 por ciento de homologia con las mismas.

El anticuerpo aislado puede tener una cadena ligera variable codificada por la secuencia de acido nucleico de las SEQ ID NO: 12, o 24, o una secuencia de acido nucleico con al menos un 90 por ciento de identidad con las secuencias de nucleotidos de las SEQ ID NO: 12 o 24 El anticuerpo aislado puede tener una cadena pesada variable codificada por una secuencia de acido nucleico de las SEQ ID NO: 6 o 18, o una secuencia de acido nucleico con al menos un 90 por ciento de identidad con las secuencias de nucleotidos de las SEQ ID NO: 6 o 18.

Tambien se proporcionan en el presente documento anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden tener una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 10 o 22, o una secuencia de aminoacidos con al menos un 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 10 o 22. Se proporcionan ademas anticuerpos monoclonales que tienen una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 4 o 16, o una secuencia de aminoacidos con al menos un 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 4 o 16.

Tambien se proporciona en el presente documento un acido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 revelados en el presente documento, Ademas, en el presente documento se proporcionan celulas huesped, comprendiendo cada una un acido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 descritos en e! presente documento. Se proporcionan ademas procedimientos para producir un anticuerpo (tal como la celula huesped que comprende un acido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente documento) que comprenden cultivar la celula huesped de modo que se produzca el anticuerpo, y/o recuperar el anticuerpo de la celula huesped.

Breve descripcion de los dibujos

Para que pueda entenderse facilmente como se logran las caracteristicas, aspectos y ventajas de la invention antes citados, asi como otros que se pondran de manifesto, puede tenerse una descripcion mas especifica que la resumida brevemente mas arriba por referencia a las realizaciones de la misma que se ilustran en los dibujos que forman parte de esta memoria descriptiva. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que los dibujos adjuntos ilustran algunas realizaciones de la invencion.

La FIG. 1 muestra Treg FOXP3+ infiltrados en los tejidos de linfoma folicular (FL) humano en el mismo lugar que los

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linfocitos B y los monocitos tumorales. Izquierda: Inmunotincion doble de Treg FOXP3* (rojo) y linfocitos B de linfoma CD20* (verde); Derecha: Treg FOXP3+ (rojo) y monocitos/macrofagos/DC CD11c* (verde)

Las FIG. 2A y 2B muestran un aumento del numero de Treg CD4+ FOXP3* en pacientes con FL. Los linfocitos tumorales y las PBMC se obtuvieron de seis pacientes con FL en el diagnostico inicial antes de la terapia. Las PBMC se obtuvieron tambien a partir de seis donantes sanos para comparar. Los porcentajes de linfocitos T reguladores respecto a los linfocitos T CD4* totaies se determinaron mediante analisis por citometria de flujo de Treg CD4* CD25* CD127Sa,° FOXP3 *. La FIG. 2A muestra el analisis por FACS representative de los Treg. Las PBMC de FL y las celulas tumorales de FL se obtuvieron del mismo paciente. La FIG. 2B muestra el porcentaje de Treg de todos los donantes. La barra horizontal indica las medias.

La FIG. 3 muestra e! aislamiento de Treg ICOS* FOXP3* o ICOS FOXP3* de FL. La suspension de celulas individuales se obtiene a partir de una muestra de bazo antes de cualquier tratamiento. Las celulas se descongelaron el dia de ensayo. Los linfocitos T enriquecidos en CD4* CD8 CD14 CD16 CD56 CD11c TCRy8 ' se separaron en subconjuntos de CD25bS|° y CD25alt0. Se clasificaron ademas los Treg CD4* CD25alloFOXP3 * en subconjuntos de ICOS3"0 e ICOSba|° sobre la base de la expresion superficial de ICOS. La expresion intracelular de FOXP3 se determino en todos los subconjuntos.

La FIG. 4 muestra Treg intratumorales que inhiben la proliferacion de los linfocitos T CD4* CD25 infiltrantes en el FL, y la inhibition podria ser bloqueada parcialmente por anticuerpos de neutralization anti-IL-10, Se cultivaron linfocitos T CD4* CD25 infiltrantes de tumores marcados con CFSE con celulas tumorales autologas preactivadas por CD40L recombinante en presencia o ausencia de Treg ICOS* FOXP3* o Treg ICOS FOXP3* autologos o anti-IL-10 (10 pg/ml). Despues de 72 horas de cultivo, la proliferacion de linfocitos CD4* CD25' se determino mediante analisis por citometria de flujo de la dilution de CFSE.

La FIG. 5 A muestra el analisis intracelular de la produccion de citocinas por linfocitos T CD4* indiferenciados determinada por citometria de flujo.

La FIG. 5B muestra la produccion de citocinas por linfocitos T CD4* indiferenciados determinada por ELISA.

La FIG. 5C muestra la funcion supresora de los linfocitos Tr1 que producen IL-10 determinada por la incorporation de [3 ]-timidina.

La FIG. 6A muestra el analisis intracelular de la produccion de citocinas por los linfocitos T CD4* de memoria determinada por citometria de flujo

La FIG. 6B muestra la produccion de IL-10 por los linfocitos T CD4* de memoria determinada por ELISA.

La FIG. 7A muestra el analisis intracelular de la produccion de citocinas por los linfocitos T CD4* indiferenciados determinada por citometria de flujo

La FIG. 7B muestra la produccion de IL-10 por los linfocitos T CD4* indiferenciados determinada por ELISA.

La FIG. 7C muestra el numero de linfocitos T viables contados.

La FIG. 8A muestra el analisis intracelular de la produccion de citocinas por los linfocitos T CD4* indiferenciados determinado por citometria de flujo.

La FIG. 8B muestra la produccion de IL-10 por los linfocitos T CD4* indiferenciados determinada por ELISA.

La FIG. 8C muestra el analisis intracelular de la produccion de citocinas por los linfocitos T CD4* de memoria determinado por citometria de flujo.

La FIG. 8D muestra la produccion de IL-10 por los linfocitos T CD4* de memoria determinada por ELISA.

La FIG. 8E muestra el analisis intracelular de la produccion de citocinas por los linfocitos T CD4* indiferenciados determinada por citometria de flujo

La FIG. 8F muestra la produccion de IL-10 por los linfocitos T CD4* indiferenciados determinada por ELISA.

La FIG. 9 muestra la produccion de IL-10 por los linfocitos T reguladores determinada por ELISA.

La FIG. 10 muestra los resultados del cribado del sobrenadante de los hibridomas anti-OX40 humano contra L-QX40 (rente a los linfocitos L parentales determinados por ELISA.

La FIG. 11 muestra el cribado de anticuerpos monoclonales especificos de 0X40 humanos determinado mediante analisis por citometria de flujo, incluyendo una realizacion de un procedimiento de la presente invention.

La FIG. 12 muestra la confirmation de la especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-hOX40 mediante el uso de celulas SUPM2 que expresan 0X40 (SUPM2-OX40), incluyendo una realizacion de un procedimiento de la

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presente invencion.

La FIG. 13 muestra anticuerpos monoclonales especificos de 0X40 que pueden inhibir la generacion de los linfocitos que producen IL-10 (Tr1) a partir de linfocitos T CD4* estimulados por vit D3 (0,1 pM)/Dex (50 nm), CD32L/ICOSL y anti-CD3/CD28 (0,2 pg/ml), incluyendo una realizacion de un procedimiento de la presente invencion. En A se muestran los datos de la clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) y en B se muestran los porcentajes de celulas que producen IL-10 para todos los tratamientos de anticuerpos monoclonales de 0X40

La FIG. 14 muestra los resultados de anticuerpos monoclonales especificos de hOX40 que inhiben la generacion de linfocitos Tr1 y estimulan tambidn la proliferacion de linfocitos T CD4\ incluyendo una realizacion de un procedimiento de la presente invencion.

Las FIG. 15A, 15B, y 15C detallan la titulacion de anticuerpos monoclonales anti 0X40 por su capacidad para inhibir la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4*, incluyendo una realizacion de un procedimiento de la presente invencion. En la FIG. 15A se muestran datos representatives de la FACS y en la FIG. 15B se muestra el porcentaje de linfocitos Tr1 despues del tratamiento con nueve anticuerpos monoclonales anti-OX40.

Las FIG. 16A, 16B, y 16C muestran anticuerpos monoclonales anti-OX40 especificos que inhiben la generacion de linfocitos Tr1 que producen IL-10 a partir de linfocitos T CD4* y tambien inhiben la production de IL-10 por los Treg IL-1 ICOS+ CD4+ CD25all° CD127' y la funcion inmunosupresora Se estimularon Treg ICOS* CD4+ CD25all° CD127' recien clasificados (Treg ICOS+) con anti-CD3 (0,2 pg/ml) en presencia de celulas CD32L/ICOSL y celulas CD32L/OX40L (FIG. 16A) o anticuerpos monoclonales anti-OX40 o un anticuerpo de control (FIG. 16B) durante cinco dias. Despues, las celulas se volvieron a estimular con anti-CD3/CD28 durante 24 horas y se ensayo el sobrenadante para determinar la cantidad de IL-10 por inmunosorcion ligada a enzimas (ELISA). La FIG. 16C es un ensayo de proliferacion basado en monocitos que muestra que dos de los anticuerpos bloquean la funcion de los Treg ICOS*.

Las FIG. 17A y 17B muestran la identificacion de anticuerpos monoclonales anti-hOX40 que inhiben la generacion de linfocitos Tr1 y bloquean la funcion de Treg FOXP3'fCD4,CD25aito, incluyendo una realizacion de un procedimiento de la presente invencion. Se muestran analisis de citometria de flujo representatives en la FIG. 17A. Se muestran datos de seis anticuerpos monoclonales en la FIG. 17B.

La FIG. 18 demuestra la identificacion de anticuerpos monoclonales anti-hOX40 que no inhiben la generacion de los linfocitos Tr1 pero bloquean la funcion de Treg FOXP3+CD4*CD25all°.

Las FIG. 19A y 19B muestran anticuerpos anti-hOX40 agonistas que bloquean la funcion de los Treg CD4*CD25a"° derivados de linfoma. Se muestran analisis FACS representatives en la FIG. 19A y se muestran datos para todos los experimentos en la FIG. 19B.

La FIG. 20 muestra que los anticuerpos monoclonales anti-hOX40 pueden unirse a los linfocitos T CD4+ de rhesus, Como se muestra, seis de los mAb anti-hOX40 pueden unirse a los linfocitos T CD4+ de rhesus activados y se uniran a 0X40 de rhesus y activaran la senalizacion de 0X40.

La FIG. 21 muestra que cada uno de anticuerpos Hu 106-222 Lote I y II del Ejemplo I se compone de una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa. La pureza de los anticuerpos Hu 106-222 Lote I y II parecia ser de mas de un 95 %,

La FIG. 22 muestra el analisis de la union de los anticuerpos 106-122 de raton, Ch106 y Hu 106-222 (Lote II) a las celulas L/OX40 (Ejemplo I).

La FIG. 23 representa la estructura esquematica del vector de expresion para el anticuerpo lgG1/kappa Hu106 (vector de expresion). Procediendo en sentido horario desde el sitio Sail en la parte superior, el plasmido contiene la unidad de transcription de la cadena pesada que comienza por el promotor / potenciador temprano inmediato principal del citomegalovirus humano (CMV) (promotor del CMV) para iniciar la transcripcion del gen de la cadena pesada del anticuerpo. A continuacidn del promotor del CMV esta el exon VH, una secuencia genomica que contiene la region constante de cadena pesada gamma-1 humana, incluyendo los exones CH1, de bisagra, CH2 y CH3 con los intrones intermedios, y el sitio de poliadenilacion despues del exon CH3. Despues de la secuencia del gen de la cadena pesada, la unidad de transcripcion de la cadena ligera comienza con el promotor del CMV, seguido por el exon VL y una secuencia genomica que contiene el exon de la region constante de la cadena kappa humana (CL) con una parte del intron anterior, y el sitio de poliadenilacion despues del exon CL. Despues del gen de la cadena ligera esta el promotor temprano del SV40 (promotor del SV40), el gen de la xantina guanina fosforribosiltransferasa (gpt) de E. coliy un segmento que contiene el sitio de poliadenilacion del SV40 (sitio de poii(A) del SV40). Por ultimo, el plasmido contiene una parte del plasmido pl)C19, que comprende el origen de replication bacteriano (pUC ori) y el gen de la beta-lactamasa (beta-lactamasa). En la figura se muestra la localization de los sitios de escision de las enzimas de restriction relevantes.

La FIG. 24 muestra la comparacion de la union a las celulas L/OX40 de los anticuerpos Hu 106-222 Lote I y II (Ejemplo I a continuacidn),

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La FIG. 25 muestra que Hu119-122 se compone de una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa. La pureza de Hu119 parecia ser superior al 95 % (Ejemplo II a continuacion),

La FIG. 26 muestra el resultado del analisis por FACS de los anticuerpos Ch119-122 y Hu119-122 descritos en el presente documento (Ejemplo II a continuacion).

La FIG. 27 muestra que el cion del mAb humanizado anti-OX40 humano (Flu119), y su anticuerpo mutado de union a FcR (Flu119-AA) 119-122 potenciaban la proliferacion de linfocitos T CD4+ indiferenciados. Hu119-122 procuraba mejor actividad estimulante de los linfocitos T que el mAb anti-OX40 humano (raton 119-122). Sin embargo, el mAb quimerico anti-OX40 humano (Ch119, VFI y VL de raton, pero regiones constantes gamma-1 y kappa humanas) no logro potenciar la proliferacion de los linfocitos T,

La FIG. 28 muestra que el cion 106-22 del mAb humanizado anti-OX40 humano mutado de union a FcR (Hu222AA) y el cion 106-222 del mAb quimerico anti-OX40 humano (Ch222) potenciaban la proliferacion de linfocitos T CD4* indiferenciados estimulados anti-CD3. Estos anticuerpos tienen actividad estimulante similar a la del mAb parental de raton anti-OX40 humano (Mouse222). Sin embargo, el Ab completamente humanizado anti-OX40 humano, Flu222, no potenciaba la proliferacion de linfocitos T en comparacion con la lgG1 humana.

Las FIG. 29A y B muestran que el cion 119-122 de mAb de raton anti-OX40 humano bloquea la funcion supresora de los Treg CD4*.

La FIG. 30 proporciona datos que muestran que los anticuerpos anti-OX40 humanos potencian la proliferacion de los linfocitos T CD4+ y CD8+ usando anticuerpos unidos a la placa.

La FIG. 31 muestra anticuerpos humanizado y de raton anti-OX40 humano que requieren reticulacion para potenciar la proliferacion de los linfocitos T.

La FIG. 32 muestra que los anticuerpos anti-OX40 humano bloquean la actividad de los linfocitos nTreg CD4+ FOXP3+ usando anticuerpos unidos a la placa.

La FIG. 33 muestra que una alta concentracion de anticuerpos de raton anti-OX40 humano destruye preferentemente los Treg FOXP3*.

La FIG. 34 muestra que los mAb de raton anti-OX40 humano actuan directamente sobre los linfocitos T efectores o los nTreg para bloquear la funcion supresora de los Treg.

Las figuras, 35A, 35B y 35C muestran los resultados del tratamiento del tumor con mAb anti-hOX40 en ratones con transferencia adaptativa de linfocitos T hOX40*CD8\ El mAb anti-OX40 humano promueve la proliferacion de los linfocitos T y la supervivencia in vivo. El regimen de vacunacion terapeutica se muestra en la figura. 35A. Se muestran imagenes de bioluminiscencia in vivo representativas en la FIG. 35B. Se muestran los resultados del tratamiento de tumores con anticuerpos en la FIG. 35C.

La FIG. 36 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de las secuencias de la VFI de 106-222, de 106-222 humanizado (Flu106) y X61012 aceptora humana (numero de acceso de GenBank) . Los residuos de aminoacidos se muestran en codigo de una letra. Los numeros encima de las secuencias indican las localizaciones de acuerdo con Kabat et al. (“Sequences of Proteins of Immunological Interests" 5a edicion, n° de publication del NIH 91-3242, U.S. Department of FHealth and Fluman Services, 1991). Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento tambien se proporcionan en el listado de secuencias y los numeros de las posiciones pueden ser diferentes. En la Figura 36, las secuencias de las CDR definidas por Kabat et al, (1991) aparecen subrayadas en la VFI de 106-222. Los residuos de la CDR de la VFI de X61012 se omiten en la figura. Se buscaron secuencias de VFI humana homologas a la region estructural de la VH de 106-222 en la base de datos GenBank, y se eligio la secuencia de la VH codificada por el ADNc humano X61012 (VH de X61012) como aceptora para la humanization. Las secuencias de las CDR de la VH de 106-222 se transfirieron primero a las posiciones correspondientes de la VH de X61012. A continuacion, en las posiciones de la region estructural en que el modelo tridimensional de las regiones variables de 106-222 indicaba un contacto importante con las CDR, los residuos de aminoacidos de raton de la VH de 106-222 fueron sustituidos por los residuos humanos correspondientes. Estas sustituciones se llevaron a cabo en las posiciones 46 y 94 (subrayadas en la VH del Hu106). Adem^s, un resto de la region estructural humana que se encontro que era atipico en el correspondiente subgrupo de la region V ha sido sustituido por el residuo mas tipico para reducir la inmunogenicidad potencial. Esta sustitucion se llevo a cabo en la posicion 105 (doble subrayado en la VH de Hu106).

La FIG. 37 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de las secuencias de la VL de 106-222, de 106-222 humanizado (Hu106) y AJ388641 (numero de acceso de GenBank) aceptora humana. Los residuos de aminoacidos se muestran en codigo de una letra. Los numeros encima de las secuencias indican las localizaciones de acuerdo con Kabat et al. (1991). Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento tambien se proporcionan en e! listado de secuencias aunque los numeros de las posiciones pueden ser diferentes. Las secuencias de las CDR definidas por Kabat et al. (1) estan subrayadas en la VH del 106-222. Los residuos de las

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CDR de la VL de AJ388641 se omiten en la figura. Se buscaron secuencias de VL humana homologas a la region estructural de la VL de 106-222 en la base de datos GenBank, y se eligio la secuencia de la VL codificada por el ADNc humano AJ388641 (VL de AJ388641) como aceptora para la humanizacion Las secuencias de las CDR de la VL de 106-222 se transfirieron a las posiciones correspondientes de la VL de AJ388641. No se llevaron a cabo sustituciones en la region estructural en la forma humanizada.

La FIG. 38 muestra la secuencia de nucleotidos del gen de la VH de Hu106 flanqueada por los sitios Spel y Hindlll (subrayados) junto con la secuencia de aminoacidos deducida. Los residuos de aminoacidos se muestran en codigo de una letra. La secuencia del peptido serial esta en cursiva. El residuo de aminoacido N-terminal (Q) de la VH madura esta doblemente subrayado. Las secuencias de las CDR de acuerdo con la definicion de Kabat et al. (1991) estan subrayadas. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento tambien se proporcionan en el listado de secuencias y los numeros de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias. La secuencia del intron esta en cursiva. Se clono el fragmento del gen de la VH de Hu106 digerido con Spel y Hindlll entre los sitios correspondientes en el vector de expresion que se muestra en la Figura 23.

La FIG. 39 muestra la secuencia de nucleotidos del gen de la VL de Hu106-222 flanqueado por sitios Nhel y EcoRI (subrayados) junto con la secuencia de aminoacidos deducida. Los residuos de aminoacidos se muestran en codigo de una letra. La secuencia del peptido serial esta en cursiva. El residuo de aminoacido N-terminal (D) de la VL madura esta doblemente subrayado. Las secuencias de las CDR de acuerdo con la definicion de Kabat et al, (1991) estan subrayadas. La secuencia del intron esta en cursiva, se clono el fragmento del gen de la VL de Hu106 digerido con Nhel y EcoRI entre los sitios correspondientes en el vector de expresion que se muestra en la FIG. 23. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento tambien se proporcionan en el listado de secuencias, aunque los numeros de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias.

La FIG. 40 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de las secuencias de la VH de 119-122, de 119-122 humanizado (Hu119), y Z14189 (numero de acceso de GenBank) aceptora humana. Los residuos de aminoacidos se muestran en codigo de una letra. Los numeros encima de las secuencias indican las localizaciones de acuerdo con Kabat ef a/. (“Sequences of Proteins of Immunological Interests", 5a edicion, n.° de publicacion del NIH 91-3242, U S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de las CDR definidas por Kabat et al. (1991) estan subrayadas en la VH del 119-122. Los residuos de las CDR de la VH de Z14189 se omiten en la figura. Se buscaron secuencias de la VH humana homologas a la region estructural de la VH de 119-122 en la base de datos GenBank, y se eligio la secuencia de la VH codificada por el ADNc Z14189 humano (VH de Z14189) como aceptora para la humanizacion. Las secuencias de la CDR de la VH de 119-122 se transfirieron primero a las posiciones correspondientes de la VH de Z14189. A continuation, en las posiciones de la region estructural en que el modelo tridimensional de las regiones variables de 119-122 indicaba un contacto importante con las CDR, los residuos de aminoacidos de raton de la VH de 119-122 fueron sustituidos por los residuos humanos correspondientes. Estas sustituciones se llevaron a cabo en las posiciones 26, 27, 28, 30 y 47 (subrayadas en la secuencia de la VH de Hu119) como se muestra en la figura, Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento tambien se proporcionan en el listado de secuencias, aunque los numeros de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias.

La FIG. 41 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de las secuencias de la VL de 119-122, 119122 humanizado (Hu119), y M29469 (numero de acceso de GenBank). Los residuos de aminoacidos se muestran en codigo de una letra. Los numeros encima de las secuencias indican las localizaciones de acuerdo con Kabat et at (1991). Las secuencias de las CDR definidas por Kabat et al. (1) estan subrayadas en la VL de 119-122. Los residuos de las CDR de la VL de M29469 se omiten en la secuencia. Se buscaron secuencias de VL humana homologas a las estructuras de la VL de 119-122 en la base de datos GenBank, y se eligio la secuencia de VL codificada por el ADNc humano M29469 (VL de M29469) como aceptora para la humanizacion. Las secuencias de las CDR de la VL de 119-122 se transfirieron a las posiciones correspondientes de la VL de M29469. No hizo falta ninguna sustitution estructural en la forma humanizada. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento tambien se proporcionan en el listado de secuencias, aunque los numeros de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias.

La FIG. 42 muestra la secuencia de nucleotidos del gen de la VH de Hu119 flanqueada por sitios Spel y Hindlll (subrayados) junto con la secuencia de aminoacidos deducida. Los residuos de aminoacidos se muestran en codigo de una letra. La secuencia del peptido serial esta en cursiva. El residuo de aminoacido N-terminal (E) de la VH madura esta doblemente subrayado. Las secuencias de las CDR de acuerdo con la definicion de Kabat et al. (1991) estan subrayadas. La secuencia del intron esta en cursiva. Se clono el fragmento del gen de la VH de Hu119 digerido con Spel y Hindlll entre los sitios correspondientes en el vector de expresion que se muestra en la FIG. 23. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento tambien se proporcionan en el listado de secuencias, aunque los numeros de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias.

La FIG. 43 muestra la secuencia de nucleotidos del gen de la VL de Hu119 flanqueada por sitios Nhel y EcoRI (subrayados) junto con la secuencia de aminoacidos deducida. Los residuos de aminoacidos se muestran en codigo de una letra. La secuencia del peptido serial esta en cursiva. El residuo de aminoacido N-terminal (E) de la VL madura esta doblemente subrayado. Las secuencias de las CDR de acuerdo con la definicion de Kabat et al. (1991) estan subrayadas. La secuencia del intron esta en cursiva. Se clono el fragmento de! gen de la VL de Hu119 digerido

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con Nhel y EcoR! entre los sitios correspondientes en el vector de expresion que se muestra en la figura. 23. Las mismas secuencias que se reivindican en el presente documento tambien se proporcionan en el listado de secuencias, aunque los numeros de las posiciones pueden ser diferentes en el listado de secuencias.

Descripcion detallada

El termino "anticuerpo" incluye una molecula de inmunoglobulina compuesta por cuatro cadenas polipeptidicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada esta compuesta por una region variable de cadena pesada (que en el presente documento se abrevia HCVR o VH) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada esta compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta compuesta por una region variable de cadena ligera ({que en el presente documento se abrevia LCVR o VL) y una region constante de cadena ligera. La region constante de la cadena ligera esta compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir ademas en regiones de hipervariabilidad denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL esta compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

La expresion "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo (o "porcion de anticuerpo") incluye fragmentos de un anticuerpo que mantienen la capacidad de unirse especificamente a un antigeno (por ejemplo, hOX40). Se ha mostrado que la funcion de union al antigeno de un anticuerpo pueden realizarla fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union englobados dentro de la expresion "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab ')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la region de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un unico brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546), que consta de un dominio VH y (vi) una region determinante de la complementariedad aislada (CDR). Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estan codificados por genes separados, pueden unirse, usando procedimientos recombinantes, con un enlazador sintetico que les permite formar una unica cadena de proteina en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al, (1988) Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 85:5879-5883 Dichos anticuerpos de cadena sencilla tambien se pretende que esten englobados dentro de la expresion "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo. Tambien se engloban otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecificos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptidica, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de union a antigeno (vease, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448, Poljak, R. J. et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Aim mas, un anticuerpo o porcion de union a antigeno del mismo puede ser parte de una molecula de inmunoadhesion de mayor tamano, formada por asociacion covalente o no covalente del anticuerpo o porcion de anticuerpo con una o mas de otras proteinas o peptidos. Los ejemplos de dichas moleculas de inmunoadhesion incluyen el uso de la region flanqueada de estreptavidina para elaborar una molecula tetramerica scFv (Kipriyanov, S. M. et al. (1995) “Human Antibodies and Hybridomas” 6: 93-101) y el uso de un residuo de cisteina, un peptido marcador y una marca de polihistidina C-terminal para elaborar moleculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab *)2, pueden prepararse a partir de anticuerpos completos usando tecnicas convencionales, tales como digestion con papaina o pepsina, respectivamente, de anticuerpos enteros. Ademas, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moleculas de inmunoadhesion pueden obtenerse usando tdcnicas de ADN recombinante estandares, como se describe en el presente documento. Las porciones de union a antigeno preferidas son dominios completos o pares de dominios completos.

OX40/ligando de 0X40 (receptor de OX40)/(OX40L) son un par de moleculas coestimuladoras criticas para la proliferation y supervivencia de los linfocitos T, la production de citocinas y la generacion de celulas de memoria. Los experimentos in vitro iniciales demostraron que la sehalizacion a traves de 0X40 en los linfocitos T CD4+ conduce al desarrollo de TH2, pero no de TH1. Estos resultados fueron apoyados por estudios in vivo que muestran que el bloqueo de la interaccion OX40L/OX40 evitaba la induction y el mantenimiento de respuestas inmunitarias alergicas mediadas por TH2. Sin embargo, el bloqueo de la interaccion OX40/OX40L mejora o impide enfermedades mediadas por TH1. Ademas, se mostro que la administracion de OX40L soluble o la transferencia de genes de OX40L a los tumores potencia fuertemente la inmunidad antitumoral en ratones. Estudios recientes sugieren tambien que OX40/OX40L pueden desempehar un papel en la estimulacion de respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T. Como se analiza en el presente documento, la sehalizacion de 0X40 bloquea la funcion inhibidora de los linfocitos T reguladores CD4+ CD25+ naturales y el par OX40/OX40L desempeha un papel critico en la regulation global de la inmunidad periferica frente a la tolerancia.

Las expresiones "numeracion de Kabat", “definiciones de Rabat" y "marcaje de Rabat" se usan indistintamente en el presente documento, Estos terminos, que son reconocidos en la tecnica, se refieren a un sistema de numeracion de

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residuos de aminoacidos que son mas variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porcion de union a antigeno del mismo {Rabat et al (1971) Ann. Acad Sci. 190: 382-391 y, Rabat, E. A. et al. (1991) “Sequences of Immunological Interest'', 5a edicion, U S. Department of Health and Human Services, n.° de publicacion del NIH: 91-3242).

La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresion recombinante transfectado en una celula huesped, anticuerpos aislados de una coleccion de anticuerpos humanos combinatoria recombinante, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico con genes de la inmunoglobulina humana {vease, por ejemplo, Taylor, L. D., et al, (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias genicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunogiobulinas de linea germinal humana (vease Rabat, E. A. et al. (1991) “Sequences of Immunological Interest”, 5a edicion, U S. Department of Health and Human Services, n.° de publicacion del NIH: 91-3242).

Un "anticuerpo aislado" incluye un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigenicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especificamente a hOX40 esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen especificamente a antigenos distintos de hOX40), Un anticuerpo aislado que se une especificamente a hOX40 puede unirse a moleculas de 0X40 de otras especies. Ademas, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos quimicos.

El termino "actividad" incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de union de un anticuerpo por un antigeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 humano que se une a un antigeno 0X40 y/o la potencia de activacion de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 cuya union al receptor de hOX40 activa la actividad biologica de hOX40 o la activacion de la union al receptor en un ensayo celular de L/OX40 .

El termino “R0/r “, como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de velocidad de disociacion para la disociacion de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antigeno El termino ”R</‘, como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociacion de una interaccion anticuerpo-antigeno particular.

La frase "resonancia de plasmon superficial" incluye un fenomeno optico que permite analizar las interacciones bioespecificas en tiempo real mediante la detection de alteraciones en las concentraciones de proteinas dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, vease el Ejemplo 5 y Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Liu, et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnson, B., et al. (1995) J Mol. Recognit. 8:125-131 y Johnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

El termino "vector" incluye una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bude de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector virico, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma virico. Ciertos vectores son capaces de replicacion autonoma en una ceiula huesped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores episomicos de mamifero). Otros vectores (por ejemplo los vectores no episomicos de mamifero) se pueden integrar en el genoma de una celula huesped tras la introduction en la celula huesped, y por lo tanto, se replican junto con el genoma del huesped Ademas, ciertos vectores pueden dirigir ta expresion de genes a los que estan ligados operativamente. En e! presente documento dichos vectores se denominan "vectores de expresion recombinantes” (o simplemente "vectores de expresion"). En general, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en forma de plasmidos. En la presente memoria descriptiva, "plasmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plasmido es la forma mas comunmente usada de vector. Sin embargo, se pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresion, tales como vectores videos (por ejemplo, retrovirus sin capacidad de replicacion, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven para funciones equivalentes.

La frase "celula huesped recombinante" (o simplemente "celula huesped") incluye una celula en la que se ha introducido un vector de expresion recombinante. Debe entenderse que dichos terminos pretenden referirse no solo a la celula en cuestion particular, sino a la progenie de dicha celula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido ya sea a mutaciones o a influencias ambientales, dicha progenie puede no ser identica, de hecho, a la celula parental, pero todavia se incluye dentro del alcance de la expresion "celula huesped" como se usa en el presente documento.

La expresion "anticuerpo monoclonal" (mAb) se refiere a un anticuerpo, o poblacion de anticuerpos similares, obtenidos a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, y no ha de interpretarse como que requiere la production del anticuerpo mediante un procedimiento particular, e incluye pero no se timita a los anticuerpos monoclonales que pueden elaborarse por el procedimiento del hibridoma descrito primero por Rohler y Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975), o por procedimientos de ADN recombinante.

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La expresion “anticuerpo quimerico” (o "inmunoglobulina quimerica") hace referenda a una molecula que comprende una cadena pesada y/o ligera que es identica u homologa a las correspondientes secuendas de °los anticuerpos derivados de una espede concreta o pertenedentes a una dase o subclase de anticuerpo concreto, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es identico u homologo a las secuendas correspondientes de los anticuerpos derivados de otra especie o pertenedentes a otra clase o subclase de anticuerpos concretos, asi como a fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biologica deseada (Cabilly et at. (1984), infra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851).

La expresion “anticuerpo humanizado” hace referenda a formas de anticuerpos que contienen secuendas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos), asi como anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado puede incluir sustituciones conservadoras de aminoacidos o residuos no naturales de la misma o diferentes especies que no alteren de manera significativa su actividad de union y/o biologica. Dichos anticuerpos son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de inmunoglobulinas no humanas. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una region determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como raton, rata, camello, bovino, cabra, o conejo que tengan las propiedades deseadas, Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de las CDR ni de la region estructural importadas. Estas modificaciones se reaiizan para perfeccionar y maximizar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera todos o sustancialmente todos de al menos uno, y en un aspecto dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana.

Opcionalmente, el anticuerpo humanizado tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), o de una inmunoglobulina humana (vease, por ejemplo, Cabilly et al., pat. de EE.UU, n.° 4.816.567; Cabilly et al., patente europea n° 0.125.023 B1; Boss et al., pat. de EE.UU n° 4.816.397; Boss et al., patente europea n° 0.120.694 B1; Neuberger, M. S. et al, documento WO 86/01533.; Neuberger. M. S. et al., patente europea n° 0,194.276 B1; Winter, pat de EE. UU. n° 5.225.539; Winter, patente europea n° 0.239.400 B1; Padlan, E. A. et al., solicitud de patente europea n° 0.519.596 A1; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86: 10029-10033).

En el presente documento, se puede hacer referencia en singular o en plural a cada uno de los anticuerpos descritos y reivindicados, como; "Anticuerpo anti-OX40"; "anticuerpo anti-hOX40"; "anticuerpo monoclonal anti-hOX40"; "anticuerpo anti-OX40 humano"; "mAb anti-OX40 humano"; "mAb anti-hOX40"; "anticuerpo monoclonal especifico de hOX40”; "anticuerpo anti-OX40L"; "anticuerpo anti-hOX40L"; "anticuerpo anti-OX40L humano"; "anticuerpo especifico de 0X40 humano"; "anticuerpo monoclonal especifico de 0X40 humano"; "anticuerpo especifico de 0X40 humano"; "anticuerpo especifico anti-OX40 humano"; " anticuerpo monoclonal especifico anti 0X40 humano"; "anticuerpo especifico de h-OX40"; "anticuerpo monoclonal especifico de h-OX40"; "anticuerpo agonista de hOX40"; "antagonista de hOX40" y/u otras variaciones similares de los mismos.

Como se divulga en la solicitud de patente de EE.UU. n° 11/659.266 titulada “Methods to Treat Disease States by Influencing the Signaling of OX-40-Receptors and High Throughput Screening Methods and Identifying Substrates Thereof’, se descubrio que una funcion de OX40L es la regulacion negativa de la generacion de linfocitos Tr1 inducida por los agentes inmunosupresores Dex y vit D3, ICOSL, o DC inmaduras. Este descubrimiento demuestra un mecanismo general por el que OX40L potencia la inmunidad e inactiva la tolerancia inmunologica.

Con el uso de analisis inmunohistotogico (FIG. 1), la tincion intracelular (FIG. 2), y la clasificacion de celulas (FIG. 3), se ha demostrado que tanto los Treg ICOS* que producen IL-10 como los ICOS- que producen TGF-|3 se infiltraban en los tejidos de FL humanos. Estos Treg FOXP3* derivados de FL pueden inhibir fuertemente la proliferacion de linfocitos T FOXP3' CD4+ CD25 infiltrantes de tumor en respuesta a las celulas de linfoma autologas preactivadas por el ligando CD40' (FIG. 4). La actividad supresora de los Treg ICOS* podria bloquearse parcialmente por un anticuerpo anti-IL-10 neutralizante, lo que confirma el papel de los Treg ICOS* que producen IL-10 en FL (FIG. 4). En el experimento de la FIG. 2, se obtuvieron celulas tumorales y PBMC de 7 pacientes con un diagnostico inicial antes de la terapia. Tambien se obtuvieron PBMC de 7 donantes sanos para comparar. Los porcentajes de linfocitos T reguladores respecto a los linfocitos T CD4+ totales se determinaron mediante analisis por citometria de flujo de Treg CD4* CD25* CD127ba)0 FOXP3 \ La FIG. 2A proporciona un analisis por FACS representative de los Treg, mientras que la FIG. 2B muestra el porcentaje de Treg reguladores de todos los donantes.

Tambien se descubrio que OX40L inhibe la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ inducida por Dex y vit D3. Se sabe que una combinacion de los farmacos inmunosupresores Dex y vit D3 induce consistentemente la diferenciacion de los linfocitos T CD4+ indiferenciados en linfocitos Tr1, Para investigar si OX40L puede inhibir la generacion y funcion de los linfocitos Tr1, se cultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados con anticuerpos monoclonales anti-CD3 mas anti-CD28 en presencia o ausencia de celulas L transfectadas con OX40L en cuatro condiciones de cultivo diferentes, incluyendo: (1) Tr1 (Dex y D3 vit); (2) TH1 (IL-12); (3) TH2 (IL-4); o (4) neutro (medio solo) durante 7 dias (FIG. 5A). Se analizo la production de IL-10 por los linfocitos T cebados por tincion intracelular de citocinas y ELISA.

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En I os experimentos de la FIG. 5A, se llevo a cabo un analisis intracelular de la production de citocinas por los linfocitos T CD4+ indiferenciados mediante citometria de flujo Se cultivaron linfocitos T indiferenciados CD44 con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de IL-2 en las celulas L parentales o en celulas OX40L-L con las citocinas recombinantes o reactivos indicados durante 7 dias. Los porcentajes de linfocitos T que producen citocinas respectivos se indican en cada perfil de transferencia puntual (dot blot). Los resultados muestran que OX40L inhibe la generation de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ indiferenciados inducidos por las diferentes senales de polarization Como se muestra en la FIG. 5A, se generaron entre el 2 % y el 4 % de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4* indiferenciados cultivados en condiciones neutras o de TH1 o TH2. Se generaron mas de un 15 % de linfocitos Tr1 en cultivo con Dex mas vit D3. La adicion de OX40L bloqueaba completamente la generation de linfocitos Tr1, pero promovia la generation de linfocitos T que producen TNF- a en todas las condiciones de cultivo.

Estos datos fueron confirmados por los datos de los ELISA (FIG. 5B). En los experimentos de la FIG. 5B, se midio por ELISA la produccion de citocinas por linfocitos CD4+ indiferenciados en los sobrenadantes despues de la reestimulacion con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 horas. Se cultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de IL-2 en celulas L parentales o celulas OX40L-L con las citocinas recombinantes o reactivos indicados durante 7 dias. Los datos se muestran como media ± error estandar de la media (SEM) de cuatro experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generation de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ indiferenciados inducidos por las diferentes senales de polarization.

Los linfocitos T CD4+ indiferenciados sensibilizados con la condition Tr1 (Dex mas Vit D3) eran anergicos y tenian la capacidad de suprimir la proliferation de los linfocitos T CD4+ indiferenciados en respuesta a anticuerpos monoclonales anti-CD3 mas anti-CD28 (FIG. 5C). En el experimento de la FIG, 5C, se midio la funcion de supresion de los linfocitos T por la incorporation de [3H]-timidina. Las mezclas de las poblaciones de linfocitos T indicadas se volvieron a estimularon con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28. Las barras de error representan el SEM de los pocillos por triplicado. Se ha descubierto que los linfocitos T CD4* indiferenciados sensibilizados con la misma condition Tr1 en presencia de OX40L proliferaban vigorosamente y no conseguian inhibir la proliferation de los linfocitos T CD4+ indiferenciados en respuesta a anticuerpos monoclonales anti-CD3 mas anti-CD28. Los datos sugieren que OX40L bloquea la generation de linfocitos Tr1 funcionales a partir de linfocitos T CD44 indiferenciados inducidos por Dex y vit. D3.

Se ha descubierto que los linfocitos Tr1 se pueden generar a partir de linfocitos T CD4+ CD45RA CD45RO* de memoria, y que OX40L puede inhibir la generation de linfocitos Tr1 a partir de los linfocitos T CD4* de memoria. Se cultivaron linfocitos T CD4* CD45RA CD45RCT* durante 7 dias con anticuerpos monoclonales anti-CD3 mas anti- CD28 en presencia o ausencia de celulas L transfectadas con OX40L con las condiciones Tr1 (Dex mas vit D3). En los experimentos de la FIG. 6A, se llevo a cabo un analisis intracelular de la produccion de citocinas por los linfocitos T CD4* de memoria mediante citometria de flujo. Se cultivaron linfocitos T CD4+ CD45RO+ CD25' de memoria con anticuerpos monoclonales anti-CD3, anti-CD28 e IL-2 en las celulas L parentales o celulas OX40L-L en presencia o ausencia de Dex mas D3 vit durante 7 dias. Los porcentajes de linfocitos T que producen citocinas respectivos se indican en cada perfil de transferencia puntual (dot blot). Los resultados muestran que OX40L inhibe la generation de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ de memoria en condiciones de Dex mas vit. D3. La FIG, 6A muestra que se generaba un gran numero de linfocitos Tr1 (> 20 %) a partir de linfocitos T CD44 de memoria en cultivo con Dex mas vit, D3. La adicion de OX40L bloqueaba completamente la generation de linfocitos Tr1 y promovia la generation de linfocitos T CD4+ de memoria que producen TNF-a.

La capacidad de Dex mas vit. D3 para promover la produccion de IL-10 en los linfocitos T CD4+ de memoria, y que esta capacidad puede ser inhibida por OX40L, fueron confirmados por analisis ELISA de IL-10 (FIG, 6B). En los experimentos de la FIG. 6B, se midio mediante ELISA la produccion de IL-10 por los linfocitos T CD4+ de memoria en los sobrenadantes despues de la reestimulacion con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 horas. Los datos se muestran en terminos de la media ± SEM de cuatro experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generation de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ de memoria en condiciones con Dex mas D3 vit.

Se descubrio ademas que OX40L inhibe la generation de linfocitos Tr1, mientras que otros miembros de la familia TNF(GITR1 y 4-1BBL) no lo hacen. Dentro de la superfamilia del TNF, OX40L, el ligando de receptor de TNF inducido por glucocorticoides (GITR1), y el ligando 4-LBB (4-1 BBL) tienen una funcion coestimulante para kis linfocitos T. Para investigar si OX40L era unico en la inhibition de los linfocitos Tr1, se cultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados con anticuerpos monoclonales anti-CD3 mas anti-CD28 con Dex mas vit D3, con celulas L parentales o celulas L transfectadas con OX40L, GITR1 o 4-1 BBL durante 7 dias Aunque OX40L, GITR1, y 4-1 BBL promueven todos la generation de celulas que producen TNF- a, solamente OX40L inhibia la generation de linfocitos Tr1 (FIG. 7A y 7B).

En los experimentos de la FIG. 7A, se llevo a cabo un analisis intracelular de la produccion de citocinas por linfocitos T CD44 indiferenciados mediante citometria de flujo. Se cultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 e IL-2 en celulas L parentales, celulas OX40L-L, celulas GITR1-L o celulas 4- 1BBL-L en presencia de Dex mas vit D3 durante 7 dias. Los porcentajes de linfocitos T que producen citocinas

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respectivos se indican en cada perfil de transferencia puntual (dot blot). Los resultados muestran que OX40L, pero no GITR1 ni 4-1BBL, inhibe la generacion de linfocitos Tr1.

En los experimentos de la FIG. 7B, se midio la IL-10 producida por los linfocitos CD4+ en los sobrenadantes despues de la reestimulacion con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 h por ELISA. Los datos se muestran en terminos de la media ± SEM de cuatro experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L, pero no GITR1 ni 4-1 BBL, inhibe la generacion de linfocitos Tr1.

OX40L, GITR1 y 4-1 BBL promovian todos un aumento del numero total de linfocitos T (FIG. 7C). En los experimentos de la FIG. 7C, se conto el numero de linfocitos T viables. Los datos se muestran en terminos de la media ± SEM de cuatro experimentos independientes.

Como entenderan los expertos en la tecnica, los resultados de las FIG. 7A, 7B, 7C muestran que GX40L. pero no GITR1 ni 4-1 BBL, inhibe la generacion de linfocitos Tr1 Estos datos sugieren que, entre los tres miembros de la superfamilia del TNF conocidos por coestimular linfocitos T, OX40L tiene una funcion novedosa y unica en la inhibition de la generacion de linfocitos Tr1.

Se descubrio ademas que OX40L inhibe la generacion de linfocitos Tr1 inducidos por ICOSL o las DC inmaduras. ICOS y CD28 representan los dos receptores coestimuladores positivos dentro de la familia de CD28 expresados en los linfocitos T. La serialization mediante ICOS de los anticuerpos agonistas o ICOSL se ha mostrado que estimula a los linfocitos T CD4+ a producir IL-10 Para investigar si OX40L puede inhibir la capacidad de ICOS de inducir la produccion de IL-10 por los linfocitos T CD4+, se cultivaron linfocitos T CD4" indiferenciados y de memoria con anti- CD3 en presencia de celulas L transfectadas con ICOSL o celulas L transfectadas con ICOSL en presencia de OX40L durante 7 dias.

En los experimentos de la FIG, 8A, se llevo a cabo un anaiisis intracelular de la produccion de citocinas por linfocitos T CD4+ indiferenciados mediante citometria de flujo. Se cultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados durante 7 dias en celulas L parentales, en una mezcla de celulas ICOSL-L y celulas L, o en una mezcla de celulas ICOSL-L y celulas OX40L-L, que se prerrecubieron con anticuerpo monoclonal anti-CD3 Los porcentajes de linfocitos T que producen citocinas respectivos se indican en cada perfil de transferencia puntual (dot blot). Los resultados muestran que OX40L inhibe la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ indiferenciados inducidos por ICOSL.

En los experimentos de la FIG. 8B, se midio por ELISA la produccion de IL-10 en los linfocitos CD4+ indiferenciados en los sobrenadantes despues de la reestimulacion con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 h. Se cultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados durante 7 dias en celulas L parentales, en una mezcla de celulas ICOSL-L y celulas L, o en una mezcla de celulas ICOSL-L y celulas OX40L-L, que se prerrecubrieron con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los datos se muestran en terminos de la media ± SEM de tres experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4* indiferenciados inducidos por ICOSL.

En los experimentos de la FIG. 8C, se llevo a cabo un anaiisis intracelular de la produccion de citocinas por los linfocitos T CD4+ de memoria mediante citometria de flujo. Se cultivaron linfocitos T CD4+ de memoria durante 7 dias en celulas L parentales, en una mezcla de celulas ICOSL-L y celulas L, o en una mezcla de celulas ICOSL-L y celulas OX40L-L, que se prerrecubrieron con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los porcentajes de linfocitos T productores de citocinas respectivos se indican en cada perfil de transferencia puntual. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos CD4* de memoria inducidos por ICOSL.

En los experimentos de la FIG. 8D, se midio por ELISA la produccion de IL-10 por kis linfocitos T CD4+ de memoria en los sobrenadantes despues de lareestimulacion con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 h. Se cultivaron linfocitos T CD4* de memoria durante 7 dias en celulas L parentales, en una mezcla de celulas ICOSL-L y celulas L, o en una mezcla de celulas ICOSL-L y celulas OX40L-L, que se prerrecubrieron con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los datos se muestran en terminos de la media ± SEM de tres experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ de memoria inducidos por ICOSL.

Los resultados de los experimentos de las FIG, 8A, 8B, 8C, y 8D muestran que ICOSL promovia significativamente la generacion de linfocitos Tr1 a partir tanto de linfocitos T CD4* indiferenciados como de memoria. La adicion de OX40L inhibia completamente la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4* tanto indiferenciados como de memoria, mientras que promovia fuertemente la generacion de celulas que producen TNF-a.

Se sabe que las DC inmaduras o DC tratadas con IFN-a o IL-10 pueden inducir a linfocitos T CD4" indiferenciados a diferenciarse en linfocitos Tr1. Se investigb si OX40L podia inhibir la generacion de linfocitos Tr1 inducidos por DC. Como se muestra en la FIG. 8E, las DC inmaduras o DC tratadas con IL-10 o IFN- a inducian todas la generacion de mas de un 10 % de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4* indiferenciados. Por el contrario, las DC activadas por CD40L inducen una fuerte respuesta TH1, acompafiada por la generacion de aproximadamente un 3 % de linfocitos Tr1. La adicion de OX40L recombinante a cultivos de DC-linfocitos T inhibia completamente la generacion de linfocitos Tr1 inducidos por DC inmaduras y DC tratadas con IL-10 e IFN-a. Ademas, OX40L tambien inhibia la generacion del numero residual de linfocitos Tr1 inducidos por DC maduras activadas por CD40L. En los

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experimentos de la FIG. 8E, se llevo a cabo un analisis intracelular de la production de citocinas por los linfocitos T CD4+ indiferenciados mediante citometria de fiujo. Se cocultivaron linfocitos T CD4* indiferenciados en presencia o ausencia de OX40L recombinante soluble durante 7 dias con DC inmaduras o DC cultivadas con IFN-a, IL-10 y CD40L. Los porcentajes de linfocitos T que producen citocinas respectivos se indican en cada perfil de transferencia puntual (dot blot). Los resultados muestran que OX40L inhibe la generation de linfocitos Tr1 a partir de los linfocitos T CD4’" inducidos por DC.

La capacidad de OX40L de inhibir la generation de linfocitos Tr1 inducidos por DC se confirmo por los datos de

ELISA (FIG. 8F). En los experimentos de la FIG. 8F, se midio la production de IL-10 por los linfocitos CD4*

indiferenciados en los sobrenadantes despues de la reestimulacion con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti- CD28 durante 24 horas mediante ELISA. Se cocultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados en presencia o ausencia de OX40L recombinante soluble durante 7 dias con DC inmaduras o DC cultivadas con IFN-a, IL-10 y CD40L. Los datos se muestran en terminos de la media ± SEM de tres experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generation de linfocitos Tr1 a partir de los linfocitos T CD4+ inducidos por DC. Por tanto, estos datos demuestran que OX40L podria inhibir la generation de linfocitos Tr1 inducidos por senales mas fisiologicas proporcionadas por ICOSL y DC.

Anteriormente se ha sugerido que los linfocitos T reguladores estan altamente representados en el area del linfoma de linfocitos B no de Hodgkin y que los linfocitos B estan implicados en la quimiotaxis de los linfocitos T reguladores en el area del linfoma. Se investigo si influir en la serialization de los receptores 0X40, por ejemplo a traves de OX40L, podria proporcionar una terapia contra el linfoma de linfocitos B. Se usaron muestras crioconservadas de pacientes con linfoma de linfocitos B para estimar la capacidad de OX40L de desactivar los linfocitos Tr1 Las

muestras utilizadas eran de linfoma folicular obtenido a partir de una muestra de bazo antes de cualquier

tratamiento. Se descongelaron las celulas, procurando 400x10s celulas congeiadas 127x10s celulas vivas y 33,9x106 celulas muertas (79 % de viabilidad). Se identificaron un nurnero suficiente de celulas CD25+ por tincion con FACS. En los experimentos de la FIG. 9, se determino por ELISA la secretion de IL-10 en los Treg ICOS* que producen IL- 10. Se cultivaron los linfocitos Treg en dos condiciones diferentes. En la condition 1, se cultivaron las celulas CD25+/+ COS con anti-CD3 en presencia de IL-2 (900 pl/ml) en celulas L parentales o celulas OX40L-L con el anticuerpo anti-ICOS durante 3-6 dias. En la condition 2, se cultivaron las celulas CD25*/COS* con anti-CD3 en presencia de IL-2 (900 pl/ml) en celulas L ICOS-L o una mezcla de OX40L-L y celulas L ICOS-L durante 3-6 dias, Se midio mediante ELISA la production de citocinas en los sobrenadantes. Los resultados muestran que OX40L inhibia en gran medida la production de IL-10 por linfocitos Treg.

Los hallazgos de que OX40L tiene la capacidad de inhibir la generation y funcion de los linfocitos Tr1 inducidos por los farmacos inmunosupresores Dex mas vit D3, ICOSL o DC, destacan un mecanismo novedoso por el cual OX40L promueve la inmunidad e inactiva la tolerancia durante las diferentes formas de respuestas inmunitarias mediadas por CD4 o CD8, tal como comprenderia un experto en la tdcnica. La capacidad de OX40L de inhibir la generation de linfocitos Tr1 durante las respuestas tanto TH1 inducida por IL-12 como TH2 inducida por IL-4 sugiere que OX40L puede controlar la magnitud de las respuestas inmunitarias mediadas por TH1 o TH2. Ademas, la capacidad de OX40L de inhibir la generation de linfocitos Tr1 parece ser una propiedad unica de OX40L, porque los otros dos miembros de la familia de TNF, GITR1 y 4-1BBL, no tienen esta propiedad funcional. Ademas, la capacidad de OX40L de inhibir la production de IL-10 en los linfocitos Treg identifica a OX40L como un tratamiento potente para el linfoma de linfocitos B y otros tipos de cancer.

Se han identificado muchas moleculas que promueven la generation de linfocitos Tr1, como IL-10, IFN-a, ICOSL y compuestos inmunosupresores tales como Dex mas vit. D3. OX40L representa un potente inhibidor para la generation de linfocitos Tr1 no solo a partir de linfocitos T CD4+ indiferenciados, sino tambien a partir de linfocitos T CD4+ de memoria y linfocitos T reguladores. Esta novedosa propiedad de OX40/OX40L puede explicar un informe reciente que muestra que la senalizacion de 0X40 permite a los linfocitos T autorreactivos anergicos adquirir funciones de celulas efectoras. El tratamiento dirigido a OX40/OX40L proporciona por lo tanto la posibilidad de tratar enfermedades alergicas y autoinmunes humanas y asi como enfermedades humanas infecciosas y cancer, incluyendo pero no limitado a melanoma, cancer de cerebro, cancer de huesos, una leucemia, un linfoma, neoplasia derivada de celulas epiteliales (carcinoma epitelial) tal como carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, cancer gastrointestinal tal como cancer de labio, cancer de boca, cancer de esofago, cancer de intestino delgado y cancer de estomago, cancer de colon, cancer de higado, cancer de vejiga, cancer de pancreas, cancer de ovario, cancer de cuello uterino, cancer de pulmon, cancer de mama y cancer de piel, tal como canceres espinocelular y de celulas basales, cancer de prdstata, carcinoma de celulas renales y otros canceres conocidos.

Los trastornos o afecciones que pueden prevenirse o tratarse por los anticuerpos y procedimientos descritos en la presente invention incluyen la prevention o el tratamiento de cancer, tal como leucemia cutanea de linfocitos T, tumores de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer de vejiga, gliomas de alto grado, metastasis cerebral, melanoma, cancer de piel, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de prostata, cancer de colon, leucemia, sindrome mielodisplasico (una afeccion preleucemica) y mieloma multiple. En general, la metastasis de cualquier tipo de cancer puede prevenirse o tratarse con los compuestos y procedimientos descritos en el presente documento. Los anticuerpos tambien pueden usarse para prevenir o tratar afecciones angiogenicas proliferates incluyendo telangectasia, angiomas venosos, hemangioblastoma. Otros trastornos, enfermedades o afecciones incluyen enfermedades vincas, algunas de las cuales tradicionalmente pueden considerarse "intratables". Los

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anticuerpos, por ejemplo, tambien se pueden usar para clasificar las cepas de un solo patogeno. Los investigadores pueden utilizar los anticuerpos descritos en el presente documento para identificar y rastrear celulas o moleculas especificas en un organismo.

De forma general, los terminos "cancer" y "canceroso" hacen referenda o describen la afeccion fisiologica en mamiferos que se caracteriza tipicamente por crecimiento celular no regulado. Mas especificamente, los canceres que pueden tratarse o prevenirse usando uno cualquiera o mas de los anticuerpos descritos en el presente documento o una variante de los mismos, incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma espinoceluiar, cancer de pulmon (incluyendo carcinoma pulmonar microcltico, carcinoma pulmonar no microcitico, adenocarcinoma del pulmdn y carcinoma escamoso de pulmon), cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrico o de estomago (incluyendo cancer gastrointestinal y cancer del estroma gastrointestinal), cancer pancreatico, glioblastoma, cancer del cuello uterino, cancer de ovario, cancer de higado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandulas salivares, cancer de rinon o renal, cancer de higado, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello, melanoma, melanoma de extension superficial, melanoma lentigo maligno, melanomas lentiginosos acrales, melanomas nodulares, asi como linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no de Hodgkin de bajo grado/folicular (NHL); NHL linfocitico pequeho (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblastico de alto grado; NHL linfoblastico de alto grado; NHL de celulas pequenas no hendidas de alto grado; NHL con enfermedad voluminosa; linfoma de celulas del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocitica cronica (CLL); leucemia linfoblastica aguda (ALL); tricoleucemia; leucemia mieloblastica cronica y trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD), asi como la protiferacidn vascular anormal asociada a la facomatosis, edema (como el asociado a los tumores cerebrales) y el sindrome de Meigs.

Tambien se proporcionan en el presente documento procedimientos para tratar o prevenir un trastorno inmune. . Estos procedimientos comprenden administrar una cantidad eficaz del anticuerpo a un sujeto necesitado de dicho tratamiento. En algunas realizaciones, el trastorno inmune es un trastorno inmune o un trastorno autoinmune. El trastorno es asma, dermatitis atopica, rinitis alergica, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, GVHD y/o lupus sistemico eritematoso. En algunas realizaciones, el trastorno es una enfermedad asociada a un virus, bacteria u otro agente infeccioso.

Ademas, los anticuerpos y procedimientos que se describen en el presente documento se pueden usar para prevenir o tratar enfermedades y afecciones inflamatorias, tales como osteoartritis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedades autoinmunes, tales como lupus y enfermedad autoinmune mixta. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser utiles en el tratamiento de una variedad de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo a un sujeto que lo necesite, en el que la enfermedad autoinmune o enfermedad inflamatoria es una cualquiera o mas de las siguientes enfermedades: diabetes sacarina insulinodependiente (IDDM), diabetes sacarina, esclerosis multiple, encefalomielitis autoinmune experimental, encefalomielitis diseminada aguda, artritis, artritis reumatoide, artritis autoinmune experimental, miastenia grave, tiroiditis, enfermedad de Hashimoto, mixedema primario, tirotoxicosis, anemia perniciosa, gastritis autoinmune atrofica, enfermedad de Addison, menopausia prematura, infertilidad masculina, diabetes juvenil, sindrome de Goodpasture, penfigo vulgar, penfigoide, oftalmia simpatica, uveitis facogenica, anemia hemolitica autoinmune, leucopenia idiopatica, cirrosis biliar primaria, hepatitis cronica activa Hb5.ve, cirrosis criptogenica, colitis ulcerosa, sindrome de Sjogren, escleroderma, granulomatosis de Wegener, poli/dermatomiositis, LE discoide, lupus eritematoso sistemico, enfermedad de Crohn, psoriasis, espondilitis anquilosante, sindrome de anticuerpos antifosfolipidos, anemia aplasica, hepatitis autoinmune, enfermedad cellaca, enfermedad de Graves, sindrome de Guillain-Barre (GBS), purpura trombocitopenica idiopatica, sindrome de opsoclono-mioclono (OMS). Neuritis optica, tiroiditis de Ord, penfigo, poliartritis, cirrosis biliar primaria, sindrome de Reiter, enfermedad de Takayasu, arteritis temporal, anemia hemolitica autoinmune por anticuerpos calientes, granulomatosis de Wegener, alopecia universal, enfermedad de Behget, enfermedad de Chagas. Sindrome de fatiga cronica, disautonomia, endometriosis, hidradenitis supurativa, cistitis intersticial, neuromiotonia, sarcoidosis, esclerodermia, colitis ulcerosa, vitiligo, vulvodinia, enfermedades inflamatorias de la piel, dermatitis de contacto alergica, gastritis por H. pylory, enfermedad inflamatoria nasal cronica, arteriosclerosis y enfermedad del injerto contra el huesped.

Mas especificamente, una "enfermedad autoinmune" tal como se usa en el presente documento es una enfermedad o trastorno que surge de y dirigido contra los propios tejidos u organos de un individuo o un segregado o manifestation de los mismos o afeccion resultante de ello. La enfermedad autoinmune puede hacer referencia a una afeccion que resulta de, o se agrava por, la production por linfocitos B de anticuerpos que son reactivos con los tejidos y los antigenos normales del cuerpo. Ademas, una enfermedad autoinmune es una que puede implicar la secretion de un autoanticuerpo que es especifico de un epitopo de un autoantigeno (por ejemplo un antigeno nuclear).

Las enfermedades o trastornos autoinmunes que se pueden tratar y/o prevenir mediante uno cualquiera o mas de los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, artritis (artritis reumatoide, como artritis aguda, artritis reumatoide cronica, gota o artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inmunologica aguda,

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artritis inflamatoria cronica, artritis degenerativa, artritis inducida por coiageno de tipo II, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferate, artritis psoriasica, enfermedad de Still, artritis vertebral y artritis reumatoide de inicio juvenil, artrosis, artritis cronica progresiva, artritis deformante, poliartritis cronica primaria, artritis reactiva, y espondilitis anquilosante), enfermedades de la piel hiperproliferativas inflamatorias, psoriasis, tales como psoriasis en placas, psoriasis en gotas, psoriasis pustulosa y psoriasis de las unas, atopia incluyendo enfermedades atopicas tales como fiebre del heno y sindrome de Job, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto cronica, dermatitis exfoliativa, dermatitis alergica, dermatitis de contacto alergica, dermatitis herpetiforme, dermatitis numular, dermatitis seborreica, dermatitis no especlfica, dermatitis de contacto irritante primaria y dermatitis atopica, sindrome de hiper-IgM ligado al cromosoma X, enfermedades inflamatorias intraoculares alergicas, urticarias, tales como urticaria alergica cronica y urticaria idiopatica cronica, incluyendo urticaria cronica autoinmune, miositis, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrolisis epidermica toxica, esclerodermia (incluyendo esclerodermia sistemica), esclerosis, como esclerosis sistemica, esclerosis multiple (MS) como MS espino-optica, MS primaria progresiva (PPMS) y EM remitente recidivante (RRMS), esclerosis sistemica progresiva, aterosclerosis, arteriosclerosis, esclerosis diseminada, esclerosis ataxica, neuromielitis optica (NMO),

enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales autoinmunomediadas, colitis tales como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscopica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrosante, colitis transmural y enfermedad inflamatoria autoinmune del intestino), inflamacion intestinal, pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, sindrome de dificultad respiratoria, incluyendo sindrome de dificultad respiratoria del adulto o agudo (ARDS), meningitis, inflamacion de toda o parte de la uvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematologico autoinmune, espondilitis reumatoide, sinovitis reumatoide, angioedema hereditario, dano a los nervios craneales como en la meningitis, herpes gestacional, penfigoide gestacional, prurito de escroto, insuficiencia ovarica prematura autoinmune, perdida repentina de la audicion debida a una afeccion autoinmune, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxia y rinitis alergica y atopica, encefalitis, tales como la encefalitis de Rasmussen y encefalitis limbica y/o del tronco encefalico, uveitis, tales como uveitis anterior, uveitis anterior aguda, uveitis granulomatosa, uveitis no granulomatosa, uveitis facoantigenica, uveitis posterior, o uveitis autoinmune, glomerulonefritis (GN) con y sin sindrome nefrotico como glomerulonefritis cronica o aguda tal como GN primaria, GN inmunomediada, GN membranosa (nefropatia membranosa), GN membranosa idiopatica o nefropatia membranosa idiopatica, GN membranoproliferativa o proliferativa membranosa (MPGN), incluyendo GN de tipo I y tipo II y rapidamente progresiva, nefritis proliferativa, insuficiencia endocrina poliglandular autoinmune, balanitis incluyendo balanitis circunscrita plasmocelular,

balanopostitis, eritema anular centrifugo, eritema discromico persistente, eritema multiforme, granuloma anular, liquen nitido, liquen escleroso y atrofico, liquen simple cronico, liquen espinuloso, liquen piano, ictiosis lamelar, hiperqueratosis epidermolitica, queratosis premalignas, pioderma gangrenoso, afecciones y respuestas alergicas, reaccion alergica, eccema, incluyendo eccema alergico o atopico, eccema asteatosico, eccema dishidrotico, y eccema palmoplanar vesicular, asma, tal como asma bronquial, asma bronquial y asma autoinmune, afecciones que implican la infiltracion de linfocitos T y respuestas inflamatorias cronicas, reacciones inmunitarias contra antigenos extrahos, tales como los grupos de sangre fetales ABO durante el embarazo, enfermedad inflamatoria pulmonar cronica, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesidn de los leucocitos, lupus, incluyendo lupus nefritico, lupus cerebral, lupus pediatrico, lupus no renal, lupus extrarrenal, lupus discoide y lupus eritematoso discoide, lupus alopecico, lupus eritematoso sistemico (SLE), tal como SLE cutaneo o SLE cutaneo subagudo, sindrome de lupus neonatal (NLE) y lupus eritematoso diseminado, diabetes sacarina de inicio juvenil (de tipo I), incluyendo diabetes sacarina insulinodependiente (IDDM) pediatrica, diabetes sacarina de inicio en adulto (diabetes de tipo II), diabetes autoinmune, diabetes insipida idiopatica, retinopatia diabetica, nefropatia diabetica, trastorno diabetico de las grandes arterias, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis, incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis, vasculitis de grandes vasos (incluyendo polimialgia reumatica y arteritis de celulas gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos medianos (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa/periarteritis nodosa), poliarteritis microscopica, immunovasculitis, vasculitis del SNC, vasculitis cutanea, vasculitis por hipersensibilidad, vasculitis necrosante como la vasculitis sistemica necrosante, y vasculitis asociadas a ANCA, tales como vasculitis o sindrome de Churg-Strauss (CSS) y vasculitis de vasos pequehos asociada a ANCA, arteritis temporal, anemia aplasica, anemia aplasica autoinmune, anemia positiva de Coombs. Anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolitica o anemia hemolitica inmunitaria incluyendo anemia hemolitica autoinmune (AIHA), anemia perniciosa (anemia pemiciosa), enfermedad de Addison, anemia o aplasia pura de globulos rojos (PRCA), deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapedesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del SNC, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, sindromes de lesion organica multiple tales como los derivados de septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por complejos de antigeno-anticuerpo, enfermedad antimembrana basal glomerular, sindrome de anticuerpos antifosfolipidos, neuritis alergica, enfermedad/sindrome de Behget, sindrome de Castleman, sindrome de Goodpasture, sindrome de Reynaud, sindrome de Sjogren, sindrome de Stevens-Johnson, penfigoide tales como penfigoide ampollar y penfigoide cutaneo, penfigo (incluyendo penfigo vulgar, penfigo foliaceo, penfigo de penfigoide mucomembranoso y penfigo eritematoso), poliendocrinopatias autoinmunes, enfermedad o sindrome de Reiter, lesion termica, preeclampsia, un trastorno por complejo inmunitario tal como nefritis por complejo inmunitario, nefritis mediada por anticuerpos, polineuropatias, neuropatia cronica, como polineuropatias de IgM o neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (como la desarrollada por los pacientes

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con infarto de miocardio, por ejemplo), incluyendo purpura trombocitopenica trombotica (TTP), purpura postransfusion (PTP), trombocitopenia inducida por heparina y trombocitopenia autoinmune o inmunomediada tal como purpura trombocitopenica idiopatica (PTI), incluyendo PTF cronica o aguda, escleritis como queratoescleritis idiopatica, epiescieritis, enfermedad autoinmuntiaria del testiculo y el ovario incluyendo orquitis y ovaritis autoinmunes, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunes incluyendo tiroiditis tales como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis cronica (tiroiditis de Hashimoto ), o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmune, hipotiroidismo idiopatico. Enfermedad de Grave, sindromes poliglandulares tales como sindromes poliglandulares autoinmunes (o sindromes de endocrinopatia poliglandular), sindromes paraneoplasicos, incluyendo sindromes paraneoplasicos neurologicos como sindrome miastenico de Lambert-Eaton o sindrome de Eaton-Lambert, sindrome del hombre rigido o sindrome de la persona rigida, encefalomielitis como encefalomielitis alergica y encefalomielitis alergica experimental (EAE), miastenia grave, como miastenia grave asociada a timoma, degeneracidn cerebelosa, neuromiotonia, sindrome de opsoclono u opsoclono- mioclono (OMS) y neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal, sindrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis cronica, hepatitis lupoide, hepatitis de celulas gigantes, hepatitis activa cronica o hepatitis activa cronica autoinmune, neumonitis intersticial linfoide (LIP), bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, sindrome de Guillain-Barre, enfermedad de Berger (nefropatia por IgA), nefropatia idiopatica por IgA, dermatosis por IgA lineal, dermatosis neutrofilica febril aguda, dermatosis pustulosa subcorneal, dermatosis acantolitica transitoria, cirrosis como cirrosis biliar primaria y neumonocirrosis, sindrome de enteropatia autoinmune, enfermedad celiaca o enfermedad celiaca, esprue celiaco (enteropatia por gluten), esprue resistente, esprue idiopatico, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrofica (ALS; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad autoinmune del oido como la enfermedad autoinmune del oido interno (AIED), perdida de la audicion autoinmune, policondritis como policrondritis resistente o en recidiva o recidivante, proteinosis alveolar pulmonar, sindrome de Cogan/queratitis intersticial no sifilitica,

paralisis de Bell, enfermedad/sindrome de Sweet, rosacea autoinmune, dolor asociado a zoster, amiloidosis, una linfocitosis no cancerosa, una iinfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de linfocitos B monoclonales (por ejemplo, gammapatia monoclonal benigna y gammapatia monoclonal de significado incierto, MGUS), neuropatia periferica, sindrome paraneoplasico, canalopatias tales como epilepsia, migrafia, arritmias, trastornos musculares, sordera, ceguera, paralisis periodica y canalopatias del SNC, autismo, miopatia infiamatoria, glomeruloesclerosis focal o segmentaria o focal y segmentaria (FSGS), oftalmopatia endocrina, uveorretinitis, coriorretinitis, trastorno de hepatologico autoinmune, fibromialgia, insuficiencia endocrina multiple, sindrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gastrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades autoinmunes desmielinizantes y polineuropatia desmieiinizante infiamatoria cronica, sindrome de Dressier, alopecia areata, alopecia total, sindrome de CREST (calcinosis, fenomeno de Raynaud, dismotiiidad esofagica, esclerodactilia y telangiectasia), infertilidad autoinmune masculina y femenina, por ejemplo, debido a anticuerpos antiespermatozoides, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Chagas, fiebre reumatica, aborto recurrente, pulmon de granjero, eritema multiforme, sindrome poscardiotomia, sindrome de Cusbing, pulmon de los criadores de pajaros, angiitis granulomatosa alergica, angiitis linfocitica benigna, sindrome de Alport, alveolitis como alveolitis alergica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reaccion a la transfusion, lepra, malaria, enfermedades parasitarias como leishmaniasis, kipanosomiasis, esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis, sindrome de Sampter, sindrome de Capian, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocardica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopatica, fibrosis quistica, endoftalmitis, eritema elevatum diutinium, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofilica, sindrome de Shulman, sindrome de Felty, flariasis, ciclitis como ciclitis cronica, ciclitis heterocronica, iridociclitis (aguda o cronica) o ciditis de Fuch, purpura de Henoch- Schonlein,

infeccion por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), SCID, sindrome de inmunodeficiencia adquirida (AIDS), infeccidn por ecovirus, sepsis, endotoxemia, pancreatitis, tiroxicosis, infeccion por parvovirus, infeccion por el virus de la rubeola, sindromes despues de la vacunacion, infeccion de rubeola congenita, infeccion por el virus de Epstein- Barr, paperas, sindrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmune, corea de Sydenham, nefritis postestreptococica, tromboangeitis obliterante, tirotoxicosis, tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de celulas gigantes, neumonitis por hipersensibilidad cronica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidemica, sindrome nefrotico idiopatico, nefropatia de cambios minimos, lesion familiar benigna e isquemia por reperfusion, reperfusion en trasplante de organos, autoinmunidad de la retina, inflamacion de las articulaciones, bronquitis, enfermedad obstructiva cronica de las vias respiratorias/pulmonar, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleroticos, asperniogenesis, hemolisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, oftalmia final facoanafilactica, enteritis alergica, eritema nudoso leproso, paralisis facial idiopatica, sindrome de fatiga cronica, fiebre reumatica, enfermedad de Haniman-Rich, perdida de audicion neurosensorial, hemoglobinuria paroxistica, hipogonadismo, ileitis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, mixedema primario idiopatico, nefrosis, oftalmia simpatica, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tiroiditis de Quervain, atrofia esplenica adquirida, timoma no maligno, vitiligo, sindrome de choque toxico, intoxicacion alimentaria, afecciones que implican la infiltration de linfocitos T, deficiencia de adhesion de leucocitos, respuestas inmunitarias asociadas a la hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapedesis leucocitaria, sindrome de lesion organica multiple, enfermedades mediadas por complejos de antigeno-anticuerpo, enfermedad por anticuerpos antimembrana basal glomerular, neuritis alergica, poliendocrinopatias autoinmunes, ovaritis, mixedema primario, gastritis atrofica autoinmune,

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oftalmia simpatica, enfermedades reumaticas, enfermedad mixta del tejido conectivo, sindrome nefrotico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, sindrome poliglanduiar autoinmune de tipo !, hipoparatiroidismo idiopatico dei adulto (AOIH), miocardiopatia como miocardiopatia dilatada, epidermolisis ampollosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, sindrome nefrotico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crdnica, sinusitis de etmoides, frontal, maxiiar o esfenoide, un trastorno relacionado con eosinofilos, tales como eosinofilia, eosinofilia por infiltracion puimonar, sindrome de eosinofilia-mialgia,

sindrome de Loftier, neumonia eosinofilica cronica, eosinofilia puimonar tropical, aspergilosis bronconeumonica, aspergiloma, o granulomas que contienen eosinofilos, anafilaxis, espondiloartritis seronegativas, enfermedad autoinmune poliendocrina, colangitis esclerosante, escleritis, epiescleritis, candidiasis mucocutanea cronica, sindrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, sindrome de Wiskott-Aldrich, sindrome de ataxia-telangiectasia, angiectasia, trastornos autoinmunes asociados a la enfermedad del colageno, reumatismo, enfermedad neurologica, linfadenitis, reduccion de la respuesta de la tension arterial, disfuncion vascular, lesion de los tejidos, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral y enfermedad de acompanamiento de vascularizacion, trastornos de hipersensibilidad alergica, glomerulonefritis, lesion por reperfusion, trastornos de reperfusion isquemica, lesion por reperfusion de los tejidos de miocardio o de otro tipo, traqueobronquitis linfomatosa, dermatosis inflamatorias, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, insuficiencia organica multiple, enfermedades ampollosas, necrosis cortical renal, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, sindromes asociados a la transfusion de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, narcolepsia, inflamacion aguda grave, inflamacion crdnica intratable, pielitis, hiperplasia endarterial, ulcera peptica, valvulitis y endometriosis.

Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden tener una variedad de usos academicos, medicos y comerciales. Los anticuerpos $e pueden usar en diferentes tipos de pruebas de diagnostico, por ejemplo, para detectar una amplia variedad de enfermedades o la presencia de farmacos (productos farmaceuticos), toxinas u otras proteinas incluyendo las hormonas, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser utiles en pruebas para detectar la enfermedad, por ejemplo, en el suero o la sangre de los pacientes. La enfermedad puede incluir enfermedades relacionadas con 0X40 o enfermedades o indicaciones no relacionadas con 0X40 incluyendo diversos tipos de cancer, enfermedad inflamatoria o autoinmune. Los anticuerpos tambien se pueden usar en la radioinmunodeteccion y la radioinmunoterapia del cancer, y algunos nuevos procedimientos de ensayo pueden utilizar estos anticuerpos descritos para actuar solo en las membranas celulares de celulas de tipos especificos, es decir, cancerosas.

Los anticuerpos descritos en el presente documento podrian ser parte de un kit u otro paquete de diagnostico. Por tanto, se proporciona en el presente documento un kit de diagnostico, o articulo de fabricacion, para usar con el procedimiento de pretratamiento descrito en la presente memoria El kit de diagnostico puede comprender uno cualquiera o mas de lo siguiente: material de referenda antagonista/anticuerpo/farmaco; anticuerpo neutralizante de control positivo (preferiblemente de cabra o mono cangrejero); columna de proteina A + G (por ejemplo columna de proteina MG); reactivo de deslipidacion; tampon(es) de purificacion por afinidad de inmunoglobulinas (por ejemplo, tampones de union, eiucion y neutralization); suero de complemento; diluyente de ensayo para las celulas; manual de instrucciones o bibliografia; vial de celulas congeladas (por ejemplo, celulas WIL2); reactivo de marcaje de ceiulas (como CELL TITER GLO.RTM.), etc. A modo de ejemplo, el kit de diagnostico puede incluir, pero no se limita a: (a) reactivo de deslipidacion; (b) tampones (por ejemplo, tampones de union y eiucion) para la purificacion por afinidad de las inmunoglobulinas; y (c) manual de instrucciones que instruye al usuario del kit de diagnostico para usar el kit para pretratar una muestra biologica de un sujeto con enfermedad autoinmune o cancer antes de realizar un bioensayo basado en celulas (tal como un ensayo de anticuerpos neutralizantes) en la muestra ( por ejemplo, para evitar el problema de interferencia del suero). El kit de diagnostico comprende ademas opcionalmente uno cualquiera o mas de: material de referencia de farmaco, control positivo de anticuerpo neutralizante, suero de complemento, diluyente de ensayo para las celulas, y reactivo de marcaje de celulas, etc.

Los anticuerpos y otros descubrimientos descritos en el presente documento tambien proporcionan procedimientos de cribado de alto rendimiento. Mas especificamente, y como conocen los expertos en la tecnica, se facilitan procedimientos de alto rendimiento para el cribado de anticuerpos monoclonales antagonistas o agonistas o moleculas pequenas que se unen a receptores de 0X40, y que pueden inhibir la generacidn y funcidn de los linfocitos Tr1 o promover la generation y funcion de los linfocitos Tr1. En uno de dichos procedimientos, se transfecto una linea celular de linfocitos T humanos (SU-DHL-1) que tiene la capacidad de producir IL-10 con el gen de 0X40- humano (SUOX40). Se cultivaron 100.000 celulas SUOX40 con 100.000 fibroblastos de raton (celulas L) o

100.000 fibroblastos de raton que expresan el ligando de 0X40 humano (celulas L con ligando de 0X40) en placas de 96 pocillos. Despues de 48 horas de cultivo, se recogieron los sobrenadantes del cultivo para medir la IL-10 mediante un ELISA especifico de IL-10. En un experimento representative, 100,000 celulas SUOX40 produjeron hasta 6000 pg/ml de IL-10 cultivadas en ausencia de ligando de 0X40. En presencia de ligando de 0X40, las

100.000 celulas SUOX40 producian menos de 1000 pg/ml de IL-10. Este procedimiento de cultivo puede usarse para el cribado de, entre otras cosas, los anticuerpos monoclonales antagonistas o pequenas moleculas que bloquean la capacidad del ligando de 0X40 de inhibir la production de IL-10 por las celulas SUOX40. Como alternativa, este procedimiento de cultivo puede modificarse sustituyendo las celulas L que expresan ligando de 0X40 por anticuerpos monoclonales agonistas potenciales o pequenas moleculas especificas de 0X40 para determinar, entre otras cosas, su capacidad para inhibir la produccion de IL-10 por las celulas SUOX40.

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Los anticuerpos anti-OX40 descritos en el presente documento pueden usarse como un ensayo o en un ensayo para analizar o medir la actividad de un farmaco u otra molecula que se encuentra en un organismo o muestra organica. Tambien podrian usarse en un ensayo cuantitativo para medir la cantidad de una sustancia en una muestra. Los bioensayos e inmunoensayos son algunas de las muchas variedades de ensayos bioquimicos especializados para los que podrian usarse estos anticuerpos. Los anticuerpos anti-OX40 revelados en el presente documento se pueden usar en otros ensayos para medir procesos tales como actividad enzimatica, captura de antigeno, actividad de citoblastos y union competitiva a proteina.

Se generaron celulas L que expresan GITR1, OX40L, 4-1BBL, ICOSL humanas mediante transduccion mediada por retrovirus, tal como conocen los expertos en la tecnica. En pocas palabras, se amplified la secuencia de codificacion de longitud completa de GITR1 (n° de acceso NM_005092), OX40L {n° de acceso NM 003326), 4-1BBL (n° de acceso NM_003811), ICOSL (n° de acceso NM_015259) humanas por RT-PCR con ARN preparado a partir de PBMC estimuladas con HSV-1. Posteriormente, los ADNc se clonaron en un vector retroviral pMIGW2 basado en MSCV y los plasmidos resultantes se verificaron mediante digestion con enzimas de restriccion y secuenciacion de ADN. Para producir retrovirus recombinante, se cotransfecto cada vector con los constructos de empaquetamiento pCL-gp (gag/pol) y pHCMV-VSVG (glicoproteina de cubierta de VSV) en celulas HEK293T. Dos dias mas tarde, los sobrenadantes de cultivo que contenian el virus se recolectaron y se usaron para infectar celulas L CD32 a un MOI de 100. Bajo esta condicion, se transdujeron de manera productiva > 95 % de las celulas.

Se cultivaron monocitos CD14+ aislados (pureza> 94 %) en presencia de 100 ng/ml de GM-CSF y 50 ng/ml de IL-4 (ambos de R&D) durante 5 dias, tal como conocen los expertos en la tecnica. Las DC inmaduras resultantes se lavaron y se cultivaron durante 24 h con IFN-a (1000 U/ml, PBL Biomedical Laboratories), IL-10 (10 ng/ml, R&D) y celulas L transfectadas por CD40L irradiadas (relacion de DC a celulas L, 4:1), obteniendo DC maduras, tal como conocen los expertos en la tecnica.

Se aislaron linfocitos T CD4+ indiferenciados y linfocitos T CD4* de memoria (cada uno de pureza> 99 %) a partir de PBMC usando CD4* T cell Isolation Kit II (kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ II) (Miltenyi Biotec) seguido por clasificacion de celulas (fraccion de CD4+ CD45RA* CD45RO" CD25- como linfocitos T indiferenciados y fraccion de CD4+ CD45RA' CD45RO+ CD25' como linfocitos T de memoria), tal como conocen los expertos en la tecnica. Se cocultivaron 4x104 linfocitos T CD4+ indiferenciados alogenicos recien purificados con DC inmaduras o cultivadas (relacion de DC a T, 1:10) en presencia o ausencia de OX40L humano recombinante (R&D, 100 ng/ml) en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo redondo durante 7 dias, tal como conocen los expertos en la tecnica. Se cultivaron tambien los linfocitos T CD4+ purificados con IL-12 (10 ng/ml, R&D), IL-4 (25 ng/ml, R&D), o la combinacion de dexametasona (5x108 M, Life Technologies) y 1-alfa,25-dihidroxivitamina D3 (10 M) durante 7 dias en presencia de anticuerpo monoclonal soluble anti-CD28 (CD28.2, 1 pg/ml) e IL-2 (50 U/ml, I + D) en celulas L CD32/OX40L, celulas L CD32/GITR1-L, celulas L CD32/4-1BBL-L irradiadas o celulas CD32-L parentales que se habian prerrecubierto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT3, 0,2 pg/ml) en placas de cultivo de 48 pocillos (relacion entre linfocitos T y celulas L, 2,5: 1), tal como conocen los expertos en la tecnica. En algunos experimentos, se cultivaron los linfocitos T CD4+ durante 7 dias en las celulas L CD32, en la mezcla de celulas L CD32 y CD32/ICOSL (relacion 1: 1), o en una mezcla de celulas L CD32/ICOSL y celulas L CD32/OX40L (relacion 1:1) prerrecubiertas con anticuerpo monoclonal anti-CD3 (0,2 pg/ml) en placas de cultivo de 48 pocillos, tal como conocen los expertos en la tecnica. Se uso RPMI 1640 y se complemento con FCS al 10 %, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, penicilina G y estreptomicina para los cultivos, como conocen los expertos en la tecnica.

Se recogieron los linfocitos T cultivados y se lavaron, y luego se reestimularon con anticuerpo anti-CD3 (5 pg/ml) unido a las placas y anti-CD28 (2 pg/ml) soluble a una concentracion de 1x10s celulas/ml durante 24 h, como conocen los expertos en la tecnica. Los niveles de IL-4, IL-10, TNF-a, y IFN-a en los sobrenadantes se midieron por ELISA (todos ios kits de R&D), tal como conocen los expertos en la tecnica. Para la production intraceiular de citocinas, los linfocitos T cultivados se reestimularon con 50 ng/ml de PMA mas 2 pg/ml de ionomicina durante 6 h. Se ahadio brefeldina A (10 pg/ml) durante las ultimas 2 h, tal como conocen los expertos en la tecnica. Las celulas se tineron con una combinacion de anticuerpos monoclonales marcados con PE anti-IL-4 o anti-TNF-a o anticuerpos monoclonales marcados con FITC anti-IFN-a y anti-IL-10 marcados con ACP (todos de BD) usando el kit FIX y PERM (CALTAG), tal como conocen los expertos en la tecnica,

Se recogieron los linfocitos T y resuspendieron en un medio que contiene EDTA para disociar los agrupamientos, como conocen los expertos en la tecnica. Las celulas viables se contaron mediante exclusion con azul de tripano de las celulas muertas, como conocen los expertos en la tecnica. Para el ensayo de la funcion supresora, se reestimularon a continuation linfocitos T CD4+ indiferenciados (A) y linfocitos Tr1 generados a partir de linfocitos T CD4T indiferenciados por anticuerpos monoclonales anti-CD3, anticuerpos monoclonales anti-CD28, IL-2, Dex, y vit D3 en presencia de celulas L parentales (B) o celulas L con OX40L (C), estos tres tipos de celulas y sus mezclas a una relacion de 1:1, durante 5 dias mediante cultivo en presencia de anticuerpo monoclonal anti-CD3 5 pg/ml y anticuerpo monoclonal anti-CD28 1 pg/ml, tiempo despues del cual se evaiuo la proliferation celular mediante la incorporation de [3H]-timidina, como conocen los expertos en la tecnica.

Generacion de anticuerpos monoclonales anti-OX40 humano especificos

Hemos generado varios anticuerpos monoclonales agonistas de raton contra 0X40 humano. Se confirmo la

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especificidad de union a antigeno de los anticuerpos mediante citometria de flujo (FIG. 10-12). Se valido la actividad agonista de los anticuerpos mediante ensayos funcionales. Se encontro que nueve de los 20 anticuerpos especificos anti-OX40 podian bloquear la generacion de linfocitos Tt1 mediada por vitamina D3/dexametasona a partir de linfocitos T CD4+ (FIG. 13). potenciar la proliferacion de linfocitos T CD4+ (FIG. 14), y suprimir la produccion de IL-10 por Treg ICOS* CD4* CD25* FOXP3a"° (FIG. 16). Se titularon los anticuerpos y se encontro que cinco poseian una actividad potente de supresion de la generacion de linfocitos Tr1 a concentraciones de tan solo 4 ng/ml (FIG. 15),

Los anticuerpos de 0X40 inhiben la funcion de los Treg CD44 CD25al,oF0XP3*

Algunos de los anticuerpos monoclonales de 0X40 inhiben la funcion supresora de los Treg FOXP3* (FIG. 17). De los cinco anticuerpos (119-8B, 119-43, 119-122, 119-173B, y 106-222) que inhiben potentemente la produccion de IL-10 a partir de linfocitos Tr1 y Treg CD4+ CD25all° CD127' FOXP3 *, tres (119 -43, 119-122, y 106-222) eran potentes en el bloqueo de la funcion de Treg CD4+ CD25alt0 CD127TOXP34 (FIG. 17), sin embargo, dos (119-33 y 120-140A) de ios 11 anticuerpos que no tienen actividad frente a la produccion de IL-10, bioquean sin embargo la funcion de Treg CD4* CD25* FOXP3a"° (FIG. 18).

Anticuerpos monoclonales anti-OX40 humano

La generacion de anticuerpos monoclonales anti-OX40 humano se llevo a cabo, por ejemplo, mediante la inmunizacion de ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad con una linea celular de raton transfectada con 0X40 humano siguiendo los protocolos establecidos. Se establecieron y analizaron adicionalmente los clones de hibridoma que secretaban anticuerpo monoclonal que tenia especificamente las celulas OX40+.

Se disefio un cribado exhaustivo para detectar los clones que desencadenan la senalizacion de 0X40 (es decir, anticuerpos agonistas) mediante la inhibicion de la generacion y la funcion de los linfocitos Tr1. Esos clones se purificaron adicionalmente. Los anticuerpos agonistas contra hOX40 pueden ser humanizados y usarse en protocolos clinicos para terapia antitumoral humana, ya sea solos o en combinacion con vacunacion antitumoral y otros adyuvantes. Varios tipos de tumores diferentes podrian ser el bianco de estos anticuerpos, incluyendo melanoma, linfoma y cancer de mama.

En otra realization, se usaron ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad para inmunizacion en la almohadilla de la pata o subcutanea, Cada raton se inyecto con 5 millones de celulas L murinas transfectadas con 0X40 humano (L-OX40) 6 veces a intervalos de 3 dias. Tres dias despues de la sexta inyeccion, los ratones se sacrificaron y se retiraron los ganglios linfaticos popliteos (cuando la inmunizacion fue en la almohadilla de la pata) o el bazo (cuando la inmunizacion fue subcutanea) y se fusionaron las celulas con celulas de mieloma SP2.0 o de mieloma NSO en una relation de 1 a 1 para generar clones de hibridoma usando protocolos establecidos. Los clones de hibridoma que secretaban anticuerpo monoclonal se cribaron para determinar la especificidad de union a las celulas L-hOX40 mediante ensayos ELISA. Los sobrenadantes de hibridoma que se unian a las celulas L-hOX40 y no a las celulas L parentales se analizaron ademas para determinar la union a las celulas L-hOX40 y SUPM2-L-hOX40 por citometria de flujo,

En el experimento de la FIG. 10, se cribaron sobrenadantes de hibridoma de hOX40 contra L-hOX40 frente a celulas L parentales por ELISA. Se seieccionaron veinte anticuerpos monoclonales especificos de hOX40, Se recubrieron veinte millones de celulas L o celulas L que expresan 0X40 humano (L-hOX40) sobre una placa de 96 pocillos mezclando las cefulas con cloruro de magnesio y calcio al 0,01 % en PBS y se dejo que secaran durante la noche en una campana de flujo laminar. Las placas se congelaron entonces a -20 °C durante al menos un dia antes de su uso. Para los ensayos de union a anticuerpos, se rehidrataron las celulas congeladas con PBS y se lavaron con tampon de lavado que contenia PBS mas 0,05 % de Tween 20, y se bloquearon con BSA al 2 % en tampon de lavado. Se usaron entonces las celulas acondicionadas para determinar la union a los sobrenadantes de los anticuerpos anti-OX40 Se detecto entonces la union de los anticuerpos a las celulas con un anticuerpo secundario, anti-fragmento Fc de la IgG de raton conjugado con HRP Los sobrenadantes de hibridoma especificos de hOX40 reconocen las celulas L que expresan 0X40 pero no las celulas L parentales.

En el experimento de la FIG. 11, se cribaron anticuerpos monoclonales especificos de hOX40 por citometria de flujo. Se mezclaron un numero igual (100k) de celulas L y L-hOX40 en tampon de FACS (FCS al 1 % /EDTA 2 mM/PBS) y se incubaron con 0,5 pg de anticuerpos purificados por FPLC (proteina A de HiTrap/tampon de elucion Gentle Ag/Ab). Se lavaron entonces las ctiulas y se tiheron con un anticuerpo secundario, anti-IgG de raton conjugado con PE. Dos picos indican tincion positiva y negativa por el anticuerpo monoclonal anti-hOX40. Un solo pico sugiere ausencia de union o union inespecifica de los anticuerpos. Se confirmaron veinte anticuerpos monoclonales especificos de hOX40 por citometria de flujo

En el experimento de la FIG. 12, se confirmo la especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-hOX40 mediante el uso de celulas SUPM2 que expresan hOX40 (SUPM2-hOX40). Se mezclaron un numero igual (100k) de celulas SUPM2 y SUPM2-hOX40 en tampon de FACS (FCS al 1 %/EDTA 2 mM/PBS) y se usaron para determinar la union al anticuerpo monoclonal anti-hOX40 como en la FIG. 11. La especificidad de union de cada anticuerpo se analizo por citometria de flujo. Dos picos indican tincion positiva y negativa por el anticuerpo monoclonal anti-hOX40, mientras que un solo pico sugiere ausencia de union o union inespecifica de los anticuerpos. Se reconfirmaron

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En el experiment de la FIG. 13, se ha tratado de identificar anticuerpos monoclonales especificos de 0X40 humano que puedan inhibir la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4+ estimulados por VitD3 (10 micromoles mM)/Dex (50 nanoM), CD32L/ICOSL y anti-CD3/CD28 (0,2 microgramos/ml). Se anadieron anticuerpos monoclonales anti-hOX40 el dia 0 de cultivo celular y se sometieron los linfocitos T CD4* despues de 7 dias de estimulacion a tincion intracelular de IL-10 seguida de analisis por citometria de flujo. Se muestran los datos representatives de clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) en A. Y se muestran los porcentajes de linfocitos Tr1 para todos los tratamientos de anticuerpos monoclonales anti-hOX40 en B. Usando celulas obtenidas a partir de este experiment, se ha tratado de identificar anticuerpos monoclonales especificos de hOX40 que estimulen la proliferacion de linfocitos T CD4* (FIG. 14, las celulas se contaron el dia 7 despues de la estimulacion) e inhiban la generacion de Tr1 a partir de CD4+ (FIG. 13).

Con el fin de identificar dichos anticuerpos monoclonales de hOX40 por su capacidad para inhibir la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4\ se generaron linfocitos Tr1 y se cultivaron como se describe en los experimentos de la FIG. 13 anteriormente. Se muestran los datos representatives de FACS en A y se muestra el porcentaje de linfocitos Tr1 despues del tratamiento con nueve anticuerpos monoclonales anti-hOX40 en B. Cinco anticuerpos monoclonales especificos de hOX40 inhibian fuertemente la generacion de linfocitos Tr1 a una concentration de 4 ng/ml (FIG. 15).

En el experimento de las FIG. 16A, 16B, y 16C, se estimularon linfocitos T ICOS* CD4* CD127CD25 a"° recien clasificados con anti-CD3 (0,2 pg/ml) en presencia de celulas CD32L/ICOSL y celulas CD32L/hOX40L o anticuerpos monoclonales anti-hOX40 o anticuerpo de control durante 5 dias. Se contaron entonces las celulas y se reestimularon 5 x 104 celulas con anti-CD3/CD28 durante 24 horas y se ensayo en los sobrenadantes la secretion de IL-10 con un kit de Elisa. Se identificaron los anticuerpos monoclonales especificos de hOX40 que inhiben la generacion de Tr1 a partir de linfocitos T CD4* y tambien inhiben la produccidn de IL-10 a partir de linfocitos T ICOS*CD4*CD25all° naturalmente. Se cultivaron Treg ICO +ICOS CD4* CD127"CD25alt0Srecien clasificados marcados con linfocitos CD4 +CD25ba'° marcados con CFSE en presencia de monocitos irradiados y mAb anti-CD3 (0.3 pg/ml) y anti-hOX40. Despues de 3,5 dias de cultivo, se valoro la proliferacion celular por dilucion de CFSE en las celulas por FACS (FIG. 16C)

Las FIG. 17 A y 17B muestran la identification de anticuerpos monoclonales anti-hOX40 que inhiben la generacion de linfocitos Tr1 y bloquean la funcion de Treg FGXP3+CD4+CD25ato Se cultivaron linfocitos T FOXP3* CD4+ CD127‘ CD25alt0 (3,5 x 104) con celulas CD4* CD25bajo marcadas con CFSE (7 x 104) en presencia de monocitos irradiados (7 x 104, 6000 rad) y 0,3 pg/ml de anticuerpos anti-CD3 y diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-hOX40. Despues de 3 a 4 dias de cultivo, se valoro la proliferacion celular por dilucion del CFSE en las celulas mediante analisis de citometria de flujo. Se indica el porcentaje de celulas divididas. Se muestran los analisis representativos de citometria de flujo en la FIG. 17A. Se muestran los datos de 6 anticuerpos monoclonales en la FIG. 17B.

En el experimento de la FiG. 18, se cultivaron linfocitos T FOXP3+ CD4* CD127 CD25al,° (3,5 x 104) con celulas CD4* CD25ba|° marcadas con CFSE (7 x 104i en presencia de monocitos irradiados (7 x 104, 6000 rad) y 0,3 pg/ml de anticuerpos anti-CD3 y diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-OX40. Despues de 3 a 4 dias de cultivo, se valoro la proliferacion celular por dilucion de tinte CFSE en las celulas por FACS. Los datos son representativos de dos experimentos. Se identificaron anticuerpos monoclonales anti-hOX40 que no inhiben la generacion de Tr1 pero bloquean la funcion de Treg FOXP3’GD4+CD25al,°.

En el experimento de las FIG. 19A y 19B, se cultivaron linfocitos T CD4+CD25a"° derivados de linfoma con linfocitos CD4+ CD25ba|° marcados con CFSE (7 x 104' aislados de donantes sanos en presencia de monocitos alogenicos irradiados (7 x 104, 6000 rad) y 0,3 microgramos/ml de anticuerpo anti-CD3 y 25 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-hOX40. Despues de 3 a 4 dias de cultivo, se valoro la proliferacion celular por dilucion de CFSE por FACS. Se muestran los analisis de FACS representativos en la FIG. 19A y se muestran los datos para todos los experimentos en la FIG. 19B. Se ha descubierto que los anticuerpos agonistas de hOX40 bloquean la funcion de los Treg CD4*CD25a"°derivados de linfoma.

La FIG. 20 muestra la identificacion de anticuerpos agonistas de 0X40 que se unen especificamente a 0X40 humano y de rhesus. Se obtuvieron cdlulas mononucleares de sangre periferica de Rhesus por centrifugation de Ficoll. Se obtuvieron linfocitos T CD4+ por microperlas de CD4. Se estimularon linfocitos T CD4* con 10 pg/ml de lectina de Phaseolus vulgaris (PFIA). Dos dias despues de la estimulacion, las celulas se tineron con mAb anti- hOX40 seguido de anticuerpo de cabra contra IgG de raton-APC y CD69-PE. 106-317 sirvio como control negativo. Se muestra que seis mAb anti-hOX40 que activan fuertemente la proliferacion de linfocitos T podian unirse a linfocitos T CD4+ de Rhesus activados. Estos resultados indican que la toxicidad de estos seis anticuerpos monoclonales anti-hOX40 puede ensayarse en monos.

S6lo siete de 500 clones positivos anti-OX40 humano obtenidos usando los protocolos de fusion convencionales exhibieron las propiedades de activation de 0X40, incluyendo, pero no limitado a, la capacidad de bloquear la generacion de Tr1 que producen IL-10 y la funcion de supresion de nTreg como se divulga en la Tabla 1 .

: Cion de anticuerpo monoclonal Bloqueo de IL-10 Bloqueo de nTreg

1: 106-108 - -

1: 106-317 - -

: 106-107 -

4: 106-148 - -

5: 119-204A

6: 119-220C - +

: 119-33A - +

8: 119-58 - +

9: 119-181A +

10: 119-157A - +

11: 120-140A -f

12: 119-8B + -

13: 119-173B + -

14: 106-132 + +

15: 106-222 + +

16: 119-43 + +

17: 119-122 + +

18: 119-69A + +

19: 120-56 + +

20: 120-270 + +

Los clones de hibridoma 106-222 y 119-122 se seleccionaron sobre la base de tres criterios

1. Inhiben la generacion de linfocitos Tr1 a partir de linfocitos T CD4* (Treg inducible)

5 2. Revierten la funcion supresora de los linfocitos nTreg FOXP3*

3. Exhiben inhibicion dependiente de la dosis de la desactivacion de linfocitos Tr1 y reversion de la funcion de Treq FOXP3'

Anticuerpos quimericos y humanizados

La humanization (tambien llamada remodelacion o injerto de CDR) es una tecnica establecida para la reduction de 10 la inmunogenicidad de anticuerpos monoclonaies a partir de fuentes xenogenicas (incluyendo pero no limitado a, roedores) y para la mejora de su activation del sistema inmunitario humano. Aunque es conocida la mecanica de la production del anticuerpo monoclonal genomanipulado usando las tecnicas de la biologia molecular, el simple injerto de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de roedores en estructuras humanas no siempre reconstituye la afinidad de union y la especificidad del anticuerpo monoclonal original.

15 Para humanizar un anticuerpo, el disefio del anticuerpo humanizado se convierte en el paso critico en ia reproduction de la funcion de la molecula original. Este disefio incluye diversas opciones: la extension de las CDR, las regiones estructurales humanas a usar y la sustitucion de los residuos procedentes del anticuerpo monoclonal de roedor en las regiones estructurales humanas (retromutaciones). Las posiciones de estas retromutaciones se han

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identificado principalmente por analisis de secuencia/estructural o por analisis de un modelo de homologia de la estructura 3D de las regiones variables.

Recientemente, se han usado colecciones en fagos para modificar los aminoacidos de las posiciones seleccionadas, Del mismo modo, se han usado muchos enfoques para elegir las estructuras humanas mas apropiadas para injertar las CDR de roedores. Los primeros experimentos usaron un subconjunto limitado de anticuerpos monoclonales humanos bien caracterizados (a menudo, pero no siempre donde estaba disponible la estructura), independientemente de la identidad de las secuencias con el anticuerpo monoclonal de roedor (el llamado enfoque de region estructural fija). Algunos grupos usan regiones variables con alta identidad de las secuencias de aminoacido con las regiones variables de roedor (homologia o mejor ajuste); otros usan secuencias de consenso o de linea germinal mientras que aim otros seleccionan fragmentos de las secuencias estructurales dentro de cada region variable de cadena ligera o pesada de varios anticuerpos monoclonales humanos diferentes. Tambien hay enfoques para la humanizacion desarroliados que reemplazan los residuos de roedor en superficie por los residuos que se encuentran con mayor frecuencia en los anticuerpos monoclonales humanos ("remodelacion de superficie" o "revestimiento") y los que usan diferentes definiciones de las extensiones de las CDR. Los anticuerpos humanizados se describen a continuacion. Sin embargo, se describe tambien en el presente documento un anticuerpo quimerico que comprende las regiones variables pesadas y ligeras de SEC ID NO: 4 y 10, o SEQ ID NO: 16 y 22.

Los anticuerpos monoclonales humanizados se derivaran del anticuerpo anti-OX40 de murino,

El anticuerpo humanizado aislado anti-OX40 puede tener una CDR1 variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o 13. El anticuerpo anti-OX 40 humanizado aislado puede tener una CDR2 variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 o 14. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una CDR3 variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3 o 15.

El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una CDR1 variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 7 o 19. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una CDR2 variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8 o 20. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una CDR3 variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de ia SEQ ID NO: 9 o 21.

El anticuerpo anti-OX40 humanizado puede tener una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 11 o 23, o una secuencia de aminoacidos con al menos un 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoacidos de la SEQ ID NO: 11 o 23. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5 o 17, o una secuencia de aminoacidos con al menos un 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 5 o 17.

El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una region variable de cadena ligera codificada por la secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 12 o 24, o una secuencia de acido nucleico con al menos un 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoacidos de la SEQ ID NO: 12 o 24. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una region variable de cadena pesada codificada por una secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 6 o 18, o una secuencia de acido nucleico con al menos un 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6 o 18

Expresion de anticuerpos anti-OX40 humanizados

Un anticuerpo, o porcion de anticuerpo, de la invencion se puede preparar por expresion recombinante de genes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas en una celula huesped. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, se transfecta una celula huesped con uno o mas vectores de expresion recombinantes portadores de fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina del anticuerpo de tal forma que las cadenas ligeras y pesadas se expresan en la celula huesped y, preferibiemente, se secretan en el medio en el que se cultivan las celulas huesped, de cuyo medio se pueden recuperar los anticuerpos. Se usan metodologias de ADN recombinante estandares para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpos, incorporar estos genes en vectores de expresion recombinantes e introducir los vectores en celulas huesped, tales como las descritas en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), “Molecular Cloning; A Laboratory Manual", segunda edicion, Cold Spring Harbor, NY, (1989), Ausubel, F. M et al. (eds.) "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates, (1989) y en la pat, de EE.UU. N° 4.816.397 de Boss et al.

Los anticuerpos y fragmentos y variantes de anticuerpos se pueden producir a partir de una variedad de celulas animales, preferibiemente de celulas de mamiferos, siendo preferidas en particular las celulas de murino y humanas. Tambien, los sistemas de expresion de ADN recombinante podrian incluir los que utilizan celulas huesped y constructos de expresion que han sido disehados para producir altos niveles de una proteina particular. Dichas celulas huesped y constructos de expresion pueden incluir Escherichia coli, que aiberga constructos de expresion derivados de plasmidos o virus (bacteriofagos); levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris que albergan constructos de expresion episomicos o integrados cromosomicamente; celulas de insecto y virus tales

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como celulas Sf9 y baculovirus y celulas de mamiferos que albergan constructed de expresion episomicos o integrados cromosomicamente (incluyendo pero no limitado a, retroviricos) (dichos procedimientos, por ejemplo, se pueden ver en el manuscrito de Verma et aJ. Immunol. Methods 216:165-181, 1998). Los anticuerpos tambien se pueden producir en plantas {dichos procedimientos, por ejemplo, pueden verse en la patente de los Estados Unidos. N° 6.046.037; Ma et al. Science 268: 716-719, 1995) o mediante la tecnologia de presentacion en fagos (dichos procedimientos, por ejemplo, se pueden ver en Winter et al, Annu.. Rev. Immunol 12: 433-455, 1994).

Los anticuerpos anti-OX40 humano que presentaban un nivel de actividad y especificidad/afinidad de union que son deseables pueden manipularse adicionalmente mediante tecnicas de ADN recombinante estandares, por ejemplo para convertir los genes de la region variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmentos Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, se liga operativamente un fragmento de ADN que codifica una VL o VFt con otro fragmento de ADN que codifica otra proteina, tal como una region constante de anticuerpo o un ligador flexible. La expresion "ligado operativamente", como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de tal manera que las secuencias de aminoacidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en fase.

En otro aspecto, el ADN aislado que codifica la region VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa ligando operativamente el ADN que codifica la VH con otra molecula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de region constante de cadena pesada humana son conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E. A, et al. (1991) “Sequences of Immunological Interest”, 5a edicion, U.S Department of Health and Human Services, n.° de publicacion del NIH: 91-3242) y pueden obtenerse fragmentos de ADN que engloban estas regiones por amplificacion por PCR estandar. La region constante de cadena pesada puede ser una region constante de lgG-1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD y cualquier variante alotipica de las mismas como se describe en Kabat (Kabat, E, A., et al. (1991) 'Sequences of Immunological Interest”, 5a edicion, U.S. Department of Health and Human Services, n.° de publicacibn del NIH: 913242), pero mas preferiblemente es una region constante de lgG1 o lgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede ligarse operativamente con otra molecula de ADN que codifica solo la region constante de cadena pesada CH1,

Ademas, un anticuerpo humanizado unido a antigeno de superficie puede interaccionar con las celulas portadoras de FcR. Dicha interaccion puede desencadenar una funcion efectora tal como ADCC y/o potenciar la serialization debido a la reticuiacion mediada por Fc. La interaccion puede ser beneficiosa o perjudicial para la terapia. Dichos efectos secundarios dahinos incluyen escalofrios, fiebre, hipotensibn, y en algunos casos, disnea (Thisttethwaite JR Jr., Cosimi AB, Delmonico FL, et al.).

Ciertos efectos perjudiciales se pueden originar en el complejo de proteina que se encuentra en la superficie de un linfocito T, Tras la activacion del linfocito T, el complejo de proteina participa en la transduccion de las sehales generadas a traves de un receptor de antigeno. En resumen, la activacion del linfocito T inicia una cascada de eventos que incluyen un aumento de la reticuiacion de los receptores de antigeno La reticuiacion del receptor puede contribuir a la fuerte sehalizacion mitogenica que conduce a la induction de ciertas citocinas tales como factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleucina-2 (IL-2) e interferon gamma (IFN-y) Estas citocinas son conocidas por ser toxicas si se generan en grandes cantidades.

Por ejemplo, actualmente se usan mAb anti-CD3 en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, incluyendo diabetes sacarina de tipo I, en la que los linfocitos T median el ataque contra los islotes pancreaticos, que producen insulina (Kaufman A, y Herold K. “Anti-CD3 mAbs for treatment of type 1 diabetes" Diabetes Metab Res Rev 2009; 25: 302-306) Los anticuerpos anti-CD3 son conocidos por inhibir la lisis de las dianas por los linfocitos T y por potenciar la reticuiacion del receptor de antigenos CD3. Ademas, junto con su actividad mitogenica potente, el anticuerpo anti-CD3 es conocido por ser un potente inductor de citocinas, especificamente, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleucina-2 (IL-2) e interferon gamma (IFN -y). La enorme liberation de citocinas, en particular TNF-a, por los linfocitos T en respuesta al farmaco (Chatenoud L.) produce efectos toxicos. Estos efectos secundarios no deseados se han atribuido a la reticuiacion de los linfocitos T portadores de moieculas CD3 y celulas portadoras de FcR que se unen a la portion Fc de los anticuerpos. La reticuiacion activa tanto los linfocitos T como las celulas portadoras de FcR, conduciendo a la liberacion masiva de citocinas como se menciono anteriormente.

Del mismo modo, podrian producirse posibles efectos secundarios no deseados al usar anticuerpos anti-OX40. Por ejemplo, los anticuerpos anti-OX40 que se unen a linfocitos T que expresan 0X40 tambien pueden unirse a celulas portadoras de FcR y desencadenar la production de citocinas que pueden ser beneficiosas o perjudiciales para los pacientes tratados con el anticuerpo. Para superar este problema potencial, se han diseriado y presentado en el presente documento procedimientos de mutation de la porcion de FcR de los anticuerpos anti-OX40 para evitar los efectos toxicos y proporcionar las mutaciones a la porcion de FcR que puedan ser deseables.

Es conocido el sitio de la igG1 humana que interacciona con FcR (CD16, CD32 y CD64). Reside en el dominio CH2 superior. Los aminoacidos mas importantes son los dos residuos de Leu en las posiciones 234 y 235. Mediante la mutacion de estos dos residuos a dos residuos de Ala, se anulan las interacciones de IgG 1 con todos los FcR El anti-CD3 humanizado que incorpora estas mutaciones (HuOKT3AA) es un farmaco mucho mas seguro y tiene un mecanismo de action que es diferente que el de HuOKT3. Vease, p.ej.. la pat. de EE.UU. N° 6.491.916.

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Las posiciones del mutante AA se muestran a continuation:

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—A—P—n—L—L—G—G—P— CH2 superior de lgG1 de tipo silvestre

—A—P—E—A—A—G—G—P— A A CH2 superior de lgG1 mutante

Hu222AA y Hu122AA descritos en el presente documento pueden contener estas mutaciones. Si el sistema de ensayo contiene celulas portadoras de FcR, se pueden ver las diferencias entre el tipo silvestre y el mutante AA. De lo contrario, los dos anticuerpos deberian comportarse igual.

El ADN aislado que codifica la region VL puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa {tambien en un gen de cadena ligera de Fab) ligando operativamente el ADN que codifica VL con otra molecula de ADN que codifica la region constante de cadena ligera CL. Las secuencias de los genes de la region constante de cadena ligera humana son conocidas en la tecnica {vease, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) “Sequences of Immunological Interest", 5a edition, U.S. Department of Health and Human Services, n.° de publicacibn del NIH: 913242) y pueden obtenerse fragmentos de ADN que engloban estas regiones mediante amplification por PCR estandar. La region constante de cadena ligera puede ser una region constante kappa o lambda.

Para crear un gen de scFv, se ligan operativamente los fragmentos de ADN que codifican VH y VL con otro fragmento que codifica un ligador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly.sub, 4- Ser).sub.3, de manera que la secuencias de VH y VL se pueden expresar como una proteina monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas por el ligador flexible (vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al (1988) Proc Natl. Acad Sci. USA. 85: 5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552554.

Se contemplan la modification o modificaciones de las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del anticuerpo. Las variantes de las secuencias de aminoacidos del anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleotidos apropiados en el acido nucleico del anticuerpo, o mediante sintesis de peptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoacidos del anticuerpo. Se realiza cualquier combination de delecion, insercion y sustitucion para llegar al constructo final, a condition de que el constructo final posea las caracteristicas deseadas. Se pueden introducir alteraciones de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos del anticuerpo en cuestion en el momento en que se elabore esa secuencia.

Un procedimiento util para la identification de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferidas para la mutagenesis se denomina "mutagenesis de barrido con alanina", como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Aqui, se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplazan por un aminoacido neutro o cargado negativamente (mas preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interaction de los aminoacidos con el antigeno. Aquellas localizaciones de aminoacidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces, introduciendo mas u otras variantes en, o para, los sitios de sustitucion. Por tanto, aunque el sitio para introducir una variation en la secuencia de aminoacidos esta predeterminado, la naturaleza de la mutacion en si no tiene que estar predeterminada Por ejemplo, para analizar la actuation de una mutacion en un sitio dado, se realiza mutagenesis de barrido con ala o aleatoria en el codon o region diana y se criban las inmunoglobulinas expresadas para detectar la actividad deseada.

Las inserciones en las secuencias de aminoacidos incluyen fusiones amino- y/o carboxiterminales en el intervalo de longitud de un residuo a polipeptidos que contienen cien o mas residuos, asi como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoacidos individuales o multiples Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado con un polipeptido citotoxico. Otras variantes de insercion de la molecula de anticuerpo incluyen la fusion con los extremos N o C del anticuerpo de una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipeptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo. Otro tipo de variante de aminoacido del anticuerpo altera el patron de glicosilacion original del anticuerpo. Dicha alteration incluye la delecion de uno o mbs restos de carbohidrato que se encuentran en el anticuerpo y/o la adicion de uno o mas sitios de glicosilacion que no estan presentes en el anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitucion de aminoacidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoacido en la molecula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interes para la mutagenesis de sustitucion incluyen las regiones hipervariables, pero tambien se contemplan alteraciones en FR. Las sustituciones conservatives se muestran en la Tabla 1 de la pat. de EE.UU. N° 7.812.133, col. 43, I. 55 a Col. 44 I. 49 y bajo el titulo de "sustituciones preferidas”. Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biologica, entonces se introducen cambios mas sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1 o, como se describe mas adelante en referenda a las clases de aminoacidos, pueden introducirse y cribarse los productos.

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Ademas, se logran modificaciones sustanciales en ias propiedades biologicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptidico en la zona de sustitucion, por ejemplo en conformacion de lamina o helice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrofobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) acidos: Asp, Glu; (4) basicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientacion de la cadena: Gly, Pro y (6) aromaticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservativas conllevaran el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase

Para expresar los anticuerpos, o porciones de anticuerpo, descritos en el presente documento, se insertan ADN que codifican cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, obtenidas como se describio anteriormente, se insertan en vectores de expresion de tal modo que los genes esten ligados operativamente a secuencias de control de la transcripcion y la traduccion. En este contexto, la expresion "ligado operativamente" pretende significar que un gen de anticuerpo se liga en un vector de tal modo que las secuencias de control de la transcripcion y la traduccion dentro del vector sirvan para su funcion pretendida de regular la transcripcion y traduccion del gen de anticuerpo. Las secuencias del vector de expresion y de control de expresion se eligen para ser compatibles con la celula huesped de expresion usada. El gen de la cadena ligera de anticuerpo y el gen de la cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, mas tipicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresion. Los genes de anticuerpos se insertan en el vector de expresion mediante procedimientos estandares (por ejemplo, ligamiento de sitios de restriction complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligamiento de extremos romos si no hay sitios de restriccion presentes).

Como se muestra en la FIG. 23, una de dichas estructuras esquematicas del vector de expresion para el anticuerpo Hu 106-222 lgG1/kappa. Procediendo en sentido horario desde el sitio Sail en la parte superior, el plasmido contiene la unidad de transcripcion de la cadena pesada que comienza por el promotor / potenciador temprano inmediato principal del citomegalovirus humano (CMV) {promotor del CMV) para iniciar la transcripcion del gen de la cadena pesada del anticuerpo. A continuation del promotor del CMV esta el exon VH, una secuencia genomica que contiene la region constante de cadena pesada gamma-1 humana, incluyendo los exones CH1, de bisagra, CH2 y CH3 con los intrones intermedios, y el sitio de poliadenilacion despues del exon CH3. Despues de la secuencia del gen de la cadena pesada, la unidad de transcripcion de la cadena ligera comienza con el promotor del CMV, seguido por el exon VL y una secuencia genomica que contiene el exon de la region constante de la cadena kappa humana (CL) con una parte del intron anterior, y el sitio de poliadenilacion despues del exon CL. Despues del gen de la cadena ligera esta el promotor temprano del SV40 (promotor del SV40), el gen de la xantina guanina fosforribosiltransferasa (gpt) de E. coli y un segmento que contiene el sitio de poliadenilacion del SV40 (sitio de poli(A) del SV40). Por ultimo, el plasmido contiene una parte del plasmido pUC19, que comprende el origen de replicacion bacteriano (pUC ori) y el gen de la beta-lactamasa (beta-lactamasa). En la figura se muestra la localizacion de los sitios de escision de las enzimas de restriccion relevantes.

El vector de expresion recombinante puede codificar un peptido serial que facilite la secrecion de la cadena de anticuerpo en una celula huesped. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de tal modo que el peptido serial este ligado en fase con el extremo amino del gen de cadena de anticuerpo. El peptido serial puede ser un peptido serial de inmunoglobulina o un peptido serial heterologo (es decir, un peptido serial de una protelna no inmunoglobulina).

Como se senalo anteriormente, ademas de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresion recombinantes divulgados en el presente documento portan secuencias reguladoras que controlan la expresion de los genes de cadena de anticuerpo en una celula huesped. La expresion "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlen la transcripcion o traduccion de los genes de cadena de anticuerpo, Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology” 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Se apreciara que el diseno del vector de expresion, incluyendo la seleccion de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped a transformar, el nivel de expresion de proteina deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresion en celulas huesped de mamifero incluyen elementos videos que dirigen altos niveles de expresion de proteinas en celulas de mamiferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador de CMV), de virus de simio 40 (SV40 ) (tal como el promotor/potenciador de SV40), de adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para una descripcion adicional de elementos reguladores viricos, y secuencias de los mismos, vease, por ejemplo, la pat. de EE.UU. N° 5.168.062 de Stinski, la pat. de EE. UU. N° 4.510.245 de Bell et al. y la pat. de EE. UU. N° N° 4,968.615 de Schaffner et al., la pat. de EE. UU. N° 5,464.758 de Bujard et al. y la pat. de EE. UU. N° 5.654.168 de Bujard et al.

Ademas de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicacion del vector en celulas huesped (por ejemplo, origenes de replicacion) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la seleccion de celulas huesped en las que se ha introducido el vector (veanse, por ejemplo, las pat. de EE.UU n.° 4 399.216, 4.634 665 y 5.179.017, todas de Axel et al ). Por ejemplo, tipicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula huesped

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en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en celulas huesped dhfr.sup- con seleccion/amplificacion con metotrexato) y el gen neo (para selection con G418).

Para la expresion de las cadenas ligeras y pesadas, se transfecta el vector o vectores de expresion que codifican las cadenas pesadas y ligeras en una celula huesped mediante tecnicas estandares, Las diversas formas del termino "transfection" pretenden englobar una amplia variedad de tecnicas comunmente usadas para la introduction de ADN exbgeno en una celula huesped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporation, precipitation con fosfato de calcio, transfection con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teoricamente posible expresar los anticuerpos en celulas huesped procariotas o eucariotas, la expresion de anticuerpos en celulas eucariotas, y lo mas preferentemente celulas huesped de mamifero, es la mas preferida debido a que dichas celulas eucariotas, y en particular celulas de mamiferos, son mas propensos que las celulas procariotas a ensamblarse y secretar un anticuerpo correctamente plegado e inmunologicamente activo. Las celulas huesped de mamifero para expresar los anticuerpos recombinantes descritos en el presente documento incluyen las celulas de ovario de hamster chino (celulas CHO) (tales como celulas CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl Acad. Sci. USA. 77: 4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), celulas de mieloma NS0, celulas COS y celulas SP2. Cuando se introducen vectores de expresion recombinantes que codifican genes de anticuerpo en celulas huesped de mamifero, se producen los anticuerpos cultivando las celulas huesped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas huesped o, la secretion del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se hacen crecer las celulas huesped, Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando procedimientos de purification de proteinas estandares.

Las celulas huesped tambien se pueden usar para producir porciones de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moleculas de scFv. Se entendera que las variaciones sobre el procedimiento anterior estan dentro del alcance de la presente invention. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una celula huesped con ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo de esta invention. La tecnologia de ADN recombinante tambien puede usarse para eliminar algunas o todas las moleculas de ADN que codifican una o ambas cadenas ligera y pesada que no son necesarios para la union a 0X40. Las moleculas expresadas a partir de dichas moleculas de ADN truncadas tambien se engloban en los anticuerpos de la invention. Ademas, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una ligera son un anticuerpo de la invention y la otra cadena pesada y ligera son especificas de un antigeno distinto de 0X40 mediante reticulation de un anticuerpo de la invention con un segundo anticuerpo mediante procedimientos de reticulation quimica estandares.

Composiciones farmaceuticas y administration farmaceutica

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invention pueden incorporate a composiciones farmaceuticas adecuadas para administration a un sujeto. Tipicamente, la composition farmaceutica comprende un anticuerpo o portion de anticuerpo de la invention y un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, “vehiculo farmaceuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares que sean fisiologicamente compatibles. Los ejemplos de vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen uno o mas de agua, solution saiina, solution salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asi como combinaciones de los mismos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo azucares, polialcohoies tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composition. Los vehiculos farmaceuticamente aceptables pueden comprender ademas cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida util o eficacia del anticuerpo o portion de anticuerpo.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo descritos en el presente documento pueden incorporate a una composition farmaceutica adecuada para la administration parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutanea, intraperitoneal, intramuscular). Las composiciones pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de administration liquidas, semisolidas y solidas, tales como soluciones liquidas (por ejemplo, soluciones inyectables o para infusion), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administration y la aplicacion terapeutica Las composiciones tipicas estan en forma de soluciones inyectables o para infusion, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunizacion pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El anticuerpo puede administrarse por infusion o inyeccion intravenosa o inyeccion intramuscular o subcutanea.

La via y/o modo de administration variaran dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehiculo que evitara una liberation rapida del compuesto, tal como una formulation de liberation controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polimeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhidridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos procedimientos para la preparation de dichas formulaciones estan patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

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Pueden incorporarse tambien ingredientes activos suplementarios a las composiciones. En ciertas realizaciones, se coformula y/o coadministra un anticuerpo o porcion de anticuerpo descrito en la presente memoria con uno o mas agentes terapeuticos adicionales que son utiles para el tratamiento de trastornos en los que la inactivacion de 0X40 es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo o porcion de anticuerpo anti-OX40 de la invencion puede coformularse y/o coadministrarse con uno o mas anticuerpos adicionales que se unen a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citocinas o que se unen a moleculas de la superficie celular). Ademas, uno o mas anticuerpos divulgados en el presente documento pueden usarse en combinacion con dos o mas de los agentes terapeuticos anteriores. Dichas terapias de combinacion pueden utilizar ventajosamente dosificaciones mas bajas de los agentes terapeuticos administrados, evitando asi posibles toxicidades o complicaciones asociadas a las diversas monoterapias. Se apreciara por el experto en la tecnica que cuando se usan los anticuerpos de la invencion como parte de una terapia de combinacion, puede ser deseable una dosis mas baja de anticuerpo que cuando el anticuerpo se administra en monoterapia a un sujeto (por ejemplo, puede lograrse un efecto terapeutico sinergico mediante el uso de la terapia de combinacion lo que, a su vez, permite el uso de una dosis mas baja del anticuerpo para conseguir el efecto terapeutico deseado).

Los anticuerpos descritos en el presente documento, o porciones de union a antigeno de los mismos se pueden usar solos o en combinacion para tratar dichas enfermedades. Se debe entender que estos anticuerpos o porcion de union a antigeno de los mismos se pueden usar solos o en combinacion con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapeutico, seleccionandose dicho agente adicional por el experto en la tecnica para su uso previsto. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapeutico reconocido en la t6cnica que sea util para el tratamiento de la enfermedad o afeccion que se trata mediante el anticuerpo revelado en el presente documento. El agente adicional tambien puede ser un agente que confiera un atributo beneficioso a la composicion terapeutica por ejemplo, un agente que afecte a la viscosidad de la composicion.

Las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento pueden incluir una "cantidad terapeuticamente eficaz" o una "cantidad profilacticamente eficaz" de un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la invencion. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" hace referenda a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapeutico deseado. La cantidad eficaz del anticuerpo o porcion de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o porcion de anticuerpo de desencadenar una respuesta deseada en el individuo. Es una cantidad terapeuticamente eficaz tambien aquella en que los efectos toxicos o perjudiciales del anticuerpo o porcion de anticuerpo se compensan por los efectos terapeuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilacticamente eficaz’’ hace referenda a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapeutico deseado.

Se pueden ajustar los regimenes de dosificacion para proporcionar la respuesta deseada optima (por ejemplo, una respuesta terapeutica o profilactica). Por ejemplo, se puede administrar un unico bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o incrementar la dosis de forma proporcional segun requieran las exigenctas de la situacion terapeutica, Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificacion por su facilidad de administration y uniformidad de dosificacion. La forma unitaria de dosificacion como se usa en el presente documento hace referencia a unidades fisicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamiferos que se van a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehiculo farmaceutico requerido. Las especificaciones de las formas unitarias de dosificacion estan dictadas y son directamente dependientes de (a) las caracteristicas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico o profilactico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de formulation farmaceutica de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Ejemplo I

Se purificaron anticuerpos monoclonales 106-222 lgG1/kappa quimericos y humanizados (Ch222 y Hu222, respectivamente) a partir de sobrenadantes de cultivo de los correspondientes transfectantes estables de NSO usando una columna de proteina A como se describe en los Apendices A y B. Hu222 se eluyo de la columna de dos maneras diferentes. En pocas palabras, el lote I de Hu222 se eluyo con tampon de pH bajo y el lote II con tampon de elucion Gentle Ag/Ab de Pierce. El rendimiento de Hu222 era mejor cuando se usaba el tampon de pH bajo para la elucion. Ch222 se eluyo de la columna con tampon de elucion Gentle Ag/Ab.

Los anticuerpos Hu222 del lote I y II purificados se caracterizaron por PAGE-SDS junto con 106-222 de raton de acuerdo con procedimientos estandares. Cinco pg de cada anticuerpo se analizo en condiciones reductoras. Como se muestra en la FIG. 21, cada uno de los anticuerpos Hu222 del lote I y II esta compuesto por una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa. La pureza de los anticuerpos Hu222 del lote I y II parecia ser de mas del 95 %.

Se analizo la contamination por endotoxinas en los anticuerpos humanizados con el kit de lisado de amebocitos de Limulus de Lanza (LAL) QCL-1000. El nivel de endotoxina era menor de 0,5 UE/mg de proteina tanto para los anticuerpos Hu222 del lote I como II.

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Caracterizacion de Hu106-222 por union a celulas L/OX40

Se examino la union de anticuerpos 106-222, Ch 106-222 y Hu 106-222 de raton de 0X40 en un ensayo de union FACS con celulas L/hOX40 esencialmente de acuerdo con el protocolo suministrado por la Dra. Laura Bover. Se detectaron los anticuerpos untdos a las celulas L/hOX40 L con anticuerpo de de cabra anti-IgG de raton marcado con PE (para 106-222 de raton) o anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con PE (para Ch106 y Hu 106).

La FIG. 22 muestra el analisis en los anticuerpos 106-222, Ch106 y Hu106-222 de raton (Lote II) de la union a celulas L/OX40. La curva de valoracion de Hu106-222 (Lote II) era casi identica a la de Ch106-222, lo que indica que la afinidad de union al antigeno de 106-222 de raton se mantiene en Hu106-222. La curva de valoracion de 106-222 de raton era similar a las de Ch106 y Hu106; sin embargo, debido a la diferencia de los anticuerpos secundarios, los datos solo indican que la afinidad de 106-222 de raton es similar a la de Hu106-222.

La FIG, 24 muestra la comparacion entre los anticuerpos Hu106-222 del lote I y II por la union a celulas L/hOX40 Aunque se necesita un analisis mas detallado, la afinidad de los dos lotes de Hu106-222 parecia ser similar, si no identica, entre si, Por tanto, la elucion acida de Hu106-222 de una columna de proteina A no parece afectar a su afinidad.

Purificacion de Ch106-222

Se hizo crecer el transfectante estable C8 de NS0 en 500 ml de medio SFM de hibridoma de Invitrogen en una botellas de rotacion hasta el agotamiento. Se centrifugo e! cultivo en un tubo de centrifuga de 250 ml de Coming (n° de Cat. 430776) en una centrifuga Allegra X-12R de Beckman Coulter (2000 rpm durante 15 minutos). Se cargo el sobrenadante del cultivo se cargo en una columna de 1 ml HiTrap MabSelect SuRe de GE Healthcare (n° de cat. 11034-95) usando una bomba PI de Pharmacia Se lavo la columna con solution salina tamponada con Tris (Pierce, n° de cat. 28379) y se eluyo con tampon de elucion Gentle Ag/Ab de Pierce (n° de cat. 21027). Se recogieron las fracciones (aproximadamente 1 ml) y se leyeron sus DO a 280 nm.

N° de fraccion: DO a 280 nm

3: 0,12

4: 0,30

5: 0,18

6: 0,11

Las fracciones 3 a 6 se combinaron (volumen = 3,0 ml, DO a 280 nm = 0,14). Las fracciones combinadas se desalaron en una columna media Sephadex G25 de 10 ml en PBS. Se recogieron fracciones de 1 ml.

N° de fraccion: DO a 280 nm

5: 0,09

6: 0,19

7: 0,12

8: 0,12

9: 0,00

Las fracciones 6 a 9 se combinaron (volumen = 3,0 ml, DO a 280 nm = 0,11). Las fracciones combinadas se dializaron durante la noche en PBS. Despues de la dialisis, el volumen era de 3,0 ml y la DO a 280 nm era 0,19. Esta preparation se denomina Ch106, lote 8/31/09, con una concentration de 0,13 mg/ml.

Purificacion de Hu106-222

Se hizo crecer el transfectante estable 1-C6 de NS0 en 500 ml de medio SFM de hibridoma de Invitrogen en una botella de rotacion hasta el agotamiento, Se centrifugo el cultivo en un tubo de centrifuga de 250 ml de Coming (n.° de cat. 430776) en una centrifuga Allegra X-12R de Beckman Coulter (2000 rpm durante 15 minutos).

Lote 1: Se cargaron 150 ml del sobrenadante del cultivo sobre una columna HiTrap MabSelect SuRe de GE Healthcare de 1 ml (n° de cat. 11-034-95) utilizando una bomba PI de Pharmacia La coiumna se lavo con PBS y el anticuerpo unido se eluyo con glicina-HCI 0,1 M, NaCI 0,1 M (pH 3,0). Se recogieron las fracciones eiuidas (1 mi cada una) en tubos que contenian 50 pi de Tris-HC11 M (pH 8,0).

N° de fraccion: DO a 280 nm

2: 0,88

3: 2,84

4: 1,29

5: 0,63

6: 0,18

Las fracciones 2 a 5 se combinaron (volumen = 4,2 ml, DO a 280 nm = 1,59) Las fracciones combinadas se dializaron durante la noche en PBS, Despues de la dialisis, el volumen era de 4,2 ml y la DO a 280 nm era 1,54. La solucion de anticuerpo (lote 18/09/09 I; 1,1 mg/ml) se esterilizo por filtrado.

Lote II:

5 Se cargo el sobrenadante del cultivo restante (350 ml) sobre una columna HiTrap MabSelect SuRe de GE Healthcare de 1 ml usando una bomba PI de Pharmacia. La columna se lavo con solucion salina tamponada con Tris y se eluyo con tampon de elucidn Gentle Ag/Ab. Se recogieron las fracciones {aproximadamente 1 ml) y se leyeron sus DO a 280 nm.

N° de fraccion: DO a 280 nm

7: 0,12

3: 0,85

4: 2,17

5: 1,47

6: 1,02

7: 0,81

8: 0,66

9: 0,54

10: 0,44

11: 0,46

Las fracciones 3 a 7 se combinaron (volumen = 4,2 ml, DO a 280 nm = 1,22). La columna se lavo de nuevo con 10 solucion salina tamponada con Tris y el anticuerpo se eluyo con glicina-HCI 0,1 M, NaCI 0,1 M (pH 3,0) para examinar si la elucion con tampon de elucion Gentle Ag/Ab era eficaz

N° de fraccion: DO a 280 nm

1: 0,05

: 0,05

3: 1,23

4: 0,49

5: 0,10

Las fracciones 3 a 7 eluidas con tampon de elucion Gentle Ag/Ab se combinaron y se desalaron en una columna Sephadex G25 media de 10 ml en PBS. Se recogieron fracciones de 1 ml.

N° de fraccion: DO a 280 nm

4: 0,38

5: 0,96

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40

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N° de fraccion: DO a 280 nm

6: 1,38

7: 1,33

8: 1,10

9: 0,12

Las fracciones 5 a 8 se combinaron (volumen = 4,0 ml, DO a 280 nm = 1,12). Las fracciones combinadas se dializaron durante la noche en PBS. Despues de la dialisis, el volumen era de 4,0 ml y la DO a 280 nm era 1,12. La solucion de anticuerpo (lote 18/09/09 II; 0,8 mg/ml) se esterilizo por filtracion.

El procedimiento de elucion rico en sal con tampon de elucion Gentle Ag/Ab de Pierce no era tan eficaz como el procedimiento de bajo pH para eluir el anticuerpo de lgG1 humana unido de la columna de proteina A. Como los anticuerpos no se eluyeron en un pico estrecho con el tampon de elucion Gentle Ag/Ab, fue necesario combinar muchas fracciones para recoger la IgG eluida y desalar las fracciones combinadas antes de la dialisis. El mal perfil de elucion con tampon de elucion Gentle Ag/Ab y la etapa de purificacion adicional afectaron al rendimiento del anticuerpo, Se aconseja usar el procedimiento de elucion rico en sal solo si la IgG a purificar es labil a acido.

Ejemplo II

Purificacion de anticuerpos CM19-122 y Hull9-122

Se purifico el anticuerpo monoclonal quimerico 119-122 lgG1/kappa (Ch 119) a partir de sobrenadante de cultivo del correspondiente transfectante estabie de NS0 (cion G11) cultivado en medio SFM de hibridoma (Invitrogen) usando una columna de proteina A. Despues de eluir con tampon de elucion Gentle Ag/Ab de Pierce, se cambio el tampon de Ch119 a PBS por filtracion en gel y despues dialisis. La concentracion de Ch119 era 0,21 mg/ml.

Se purified anticuerpo monoclonal humanizado 119-122 lgG1/kappa (Hu122) del sobrenadante de cultivo del correspondiente transfectante estabie de NS0 (cion 2F5) cultivado en medio SFM de hibridoma usando una columna de proteina A. Se eluyo Hu106-222 de la columna con tampon de pH bajo, se neutralize con Tris-HCI 1 M (pH 8,0) y se dializo en PBS. La concentracion de Hu122 era 1,6 mg/ml.

Se caracterizo el Hu106-222 purificado por PAGE-SDS junto con 119-122 de raton de acuerdo con procedimientos estandar. Se analizaron cinco pg de cada anticuerpo en condiciones reductoras. Como se muestra en la FIG. 25, el Hu119-122 esta compuesto por una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa. La pureza de Hu119 parecia ser mas del 95 %.

Caracterizacion de Hu119-122 por la union a celulas L/hOX40

Se examino la union de anticuerpos 119-122, Ch119-122 y Hu119-122 de raton a 0X40 en un ensayo de union FACS con celulas L/OX40 esencialmente de acuerdo con el protocolo suministrado por la Dra. Laura Bover. Se detectaron los anticuerpos unidos a las celulas L/OX40 con anticuerpo de cabra anti-igG de raton marcado con PE (para 119-122 de raton) o anticuerpo de cabra anti-igG humana marcado con PE (para Chl19-122 y Hu119-122),

La FIG. 26 muestra el resultado del analisis FACS. La curva de valoracion de Hu119-122 era similar a la de Ch119- 122, lo que sugiere que la afinidad de union a antigeno de 119-122 de raton se mantiene en Hu119-122. Sin embargo, los valores de MCF a concentraciones de anticuerpos mas alias de Ch109-122 y Hu119- 122 coinciden con las curvas correspondientes. Despues de ajustar las condiciones experimentales, el analisis por FACS se debe repetir.

Ejemplo III

Para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-OX40 humano humanizados de potenciar la proliferacion de linfocitos T, se realizaron ensayos de proliferacion usando celulas CD32-L recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y linfocitos T CD4+ indiferenciados recien clasificados. La FIG. 27 muestra que el cion 119-122 de mAb anti-OX40 humano (Hu122), y su anticuerpo mutado de union a FcR (Hu122-AA) potenciaban la proliferacion de linfocitos T CD4+ indiferenciados. Hu122 procuraba mejor actividad estimulante de linfocitos T que el mAb de raton anti-OX40 humano parental (122 de raton). (FIG. 27).

El cion 106-222 de mAb mutado humanizado anti-OX40 de union a FcR (Hu222-AA) y el cion 106-222 de mAb quimerico anti-OX40 humano (Ch222) potenciaban la proliferacion de linfocitos T CD4+ indiferenciados estimulados por anti-CD3. Estos anticuerpos tienen actividad estimulante similar a la del mAb de raton anti-OX40 humano parental (106-222 de raton). Sin embargo, el Ab totalmente humanizado anti-OX40 humano, Hu106, no potenciaba la proliferacion de linfocitos T. (FIG. 28)

Para evaluar la capacidad de los anticuerpos humanizados anti-OX40 humano de bloquear la funcion supresora de

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linfocitos T reguladores (Treg) CD4\ se realizaron ensayos de proliferacion usando linfocitos T CD4+ indiferenciados recien clasificados y Treg CD4+ CD25all° D127 Se encontro que el anticuerpo quimerico Ch122 y el anticuerpo humanizado mutado de union a Fc (Hu122-AA) exhibian mejor potencia que el mAb de raton anti-OX40 humano parental (122 de raton) en el bloqueo de la funcion supresora de Treg CD4*. {FIG. 29 A-B)

En el experimento de la FIG. 27, se estimularon linfocitos T CD4+CD25ba'°CD127,CD45ROCD45RA+indiferenciados con celulas L que expresan CD32 (CD32-L) recubiertas con 4 concentraciones de anticuerpos anti-CD3 mas 2 pg/ml de anticuerpos de cion 119 de Ab anti-OX40 humano o anticuerpos de control. Tres dias despues de la estimulacion, se anadio el radioisotopo tritio y se cultivaron durante 16-18 boras adicionales antes de la cosecha de celulas, Los datos son representatives de los experimentos de dos donantes. Las celulas CD32-L que expresan ligando hOX40 (CD32-L/hOX40L) sirven como control positivo, mientras que lgG1 humanas y de raton sirven como controles negativos.

En el experimento de la FIG. 28, se estimularon linfocitos T CD4^ indiferenciados recien clasificados con celulas CD32-L recubiertas con 4 concentraciones de anticuerpos anti-CD3 mas 2 pg/ml de anticuerpos de cion 106-222 de mAb anti-OX40 humano (Hu222) o anticuerpos de control. Tres dias despues de la estimulacion, se anadio el radioisotopo tritio y se cultivaron durante 16-18 horas adicionales antes de la cosecha de celulas. Los datos son representatives de experimentos de dos donantes. CD32-L/hOX40L sirve como control positivo, mientras que !gG1 humana y de raton sirven como controles negativos.

En el experimento de la FIG. 29, se cultivaron linfocitos T CD4+ indiferenciados recien clasificados en presencia de Treg CD4+ CD25allt> CD1270ai° a tres relaciones de Treg/efectores T y se estimularon con celulas CD32-L recubiertas con 0,2 pg/ml de anticuerpos anti-CD3 mas 10 pg/ml de anticuerpos del cion 119-122 de mAb anti-OX40 humano o anticuerpos de control. Tres dias despues de la estimulacion, se anadio el radioisotopo tritio y se cultivaron durante 16-18 horas adicionales antes de la cosecha de celulas. Los datos son representatives de tres experimentos. CD32- L/hOX40L sirve como control positivo, mientras que lgG1 humana y de raton sirven como controles negativos.

Ejemplo IV

Dado que los anticuerpos se encontraran con las celulas mononucleares de sangre periferica total (PBMC) cuando se les administra a los pacientes mediante inyeccion intravenosa, se probo la capacidad de los anticuerpos anti- 0X40 humano de estimular la proliferacion de linfocitos T usando PBMC como las celulas presentadoras de antigeno (APC) en los ensayos de proliferacion. Sin embargo, se obtuvieron datos muy variables con los mAb de raton anti-OX40 humano usando las PBMC como APC que no se observan cuando se usan monocitos como APC, lo que sugiere que los anticuerpos requieren algun tipo de reticulacion para la actividad. Para probar esta posibilidad, las placas se recubrieron con los mAb anti-OX40 humano y anti-CD3, se lavaron, y se usaron para estimular la proliferacion de linfocitos T CD4+ o CD8* en ausencia de celulas accesorias. La FIG. 30 muestra los resultados de que los anticuerpos anti-OX40 humano potencian la proliferacion de linfocitos T CD4+ y CD8+.

Se estimularon 1 x 10s linfocitos T CD4* CD25Ba'° CD45RO' CD45RA* T indiferenciados (FIG. 30A) o linfocitos T CD3+ CD8+ (FIG. 30B) con mAb anti-CD3 (3 pg/ml) y de raton anti-OX40 humano (2 pg/ml) unidos a la placa. Se anadio timidina tritiada en el tercer dia de cultivo y las celulas se recolectaron despues de otras 15 horas de incubacion. La proliferacion de linfocitos T se evaluo mediante la incorporacion de timidina. Se obtuvieron mAb anti- 0X40 humano a partir de tres fusiones de hibridoma. Los numeros despues del numero de fusion denotan un anticuerpo especifico. lgG1 de raton y 119-42 sirvieron como controles negativos. Cada tratamiento se realizo por triplicado. Se muestran los datos representatives de 4 donantes de linfocitos T. (FIG. 30C). Las tres versiones de mAb humanizados anti-OX40 humano [Hu106-222 y Hu119-122; Hu106-222AA y Hu119-122AA (AA denota que dos de los residuos de union a Fc se mutaron al aminoacido alanina); y Ch119-122 (similar a 119-122 humanizado, excepto porque se mantuvo la region variable "paratopo" de raton)] estimulaban la proliferacion de linfocitos T CD4+ indiferenciados. Anti-CD28 sirvio como control positivo.

Como se muestra en la FIG. 30, los paneles A y B muestran que los mAb anti-OX40 humano unidos a la placa estimulaban potentemente la proliferacion de linfocitos T CD4f indiferenciados y de linfocitos T CD8* en un intervalo de 10 a 40 veces. Se ampliaron los estudios para los mAb anti-OX40 humano humanizados y se encontro que las tres versiones de los anticuerpos humanizados, tanto totalmente humanizado, como quimerico y los mutantes AA en los que los residuos responsables de la union a! receptor de Fc se alteraban a alanina, eran potentes estimulantes de la proliferacion de linfocitos T CD4+ indiferenciados (FIG. 30C).

La FIG. 31 muestra anticuerpos anti-OX40 humano de raton y humanizados que requieren reticulacion con el fin de potenciar la proliferacion de linfocitos T. Se estimularon linfocitos T CD4* indiferenciados recien clasificados con mAb anti-CD3 unido a la placa (3 pg/ml) mas anti-OX40 humano unido a la placa o soluble humanizado (2 pg/ml) en ausencia de celulas accesorias. Se afiadio timidina tritiada en el tercer dia de cultivo y las celulas se recolectaron despues de otras 15 horas de incubacion. La proliferacion de linfocitos T se evaluo mediante la incorporacion de timidina. lgG1 de raton y anti-CD28 sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente. Se muestran datos representatives de dos donantes. Se estimularon linfocitos T CD4+ indiferenciados con anti-CD3 unido a la placa en ausencia de celulas accesorias. El dia siguiente, se afiadio mAb 119-122 anti-OX40 humano (2 pg/ml) solo o en combination con la misma cantidad de un anticuerpo secundario contra Fc. Se evaluo la proliferacion celular

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como se describe en el panel A.

La potencia de los mAb anti-OX40 humano humanizados Hu106-222 y Hu119-122 era comparable a la de anti- CD^. En contraste, cuando se afiadio anticuerpo anti-OX40 humano soluble al cultivo de llnfocitos T, se anulo el efecto estimulante. (FIG. 31 A). Sin embargo, cuando se anadio mAb 119-122 anti-OX40 humano soluble junto con un fragmento F(ab')2 de cabra anti-IgG de raton, anticuerpo secundario especlfico del fragmento Fc, se restauro el efecto estimulante (FIG. 31B). Estos resultados demuestran que los mAb anti-OX40 humano requieren reticulation para sus actividades biofogicas.

Para evaluar la capacidad de los mAb anti-OX40 humano agonistas de bloquear la funcion supresora de nTreg CD4+ CD25altoCD12T, se realizaron ensayos de proliferation en presencia de linfocitos T efectores CD4 * CD25bai° CD127 + CD45RO+ (Tef) y nTreg CD4\ Mediante el uso del sistema unido a la placa en que se recubrian mAb anti-OX40 humano junto con anti-CD3 sobre una placa y en ausencia de celulas accesorias, doce (222, 132, 8B, 33 A, 43, 58B, 122, 157A, 173B, 220C, 140A, 270) de los mAb de raton anti-OX40 humano inhibian potentemente la supresion de nTreg (FIG. 32A y 32B). Aunque la relation entre nTreg y linfocitos T efectores usada en estos ensayos era de 1:1, estos anticuerpos fueron capaces de estimular los linfocitos T efectores a proliferar de 10 a 35 por ciento por encima del porcentaje alcanzado por los linfocitos T efectores en ausencia de nTreg. Los mAb anti-OX40 humano humanizados revertian tambien la funcion supresora de nTres a niveles similares (FIG. 32C). Estos resultados tornados en conjunto sugieren que los mAb de raton anti-OX40 humano son potentes estimulantes de 0X40, lo que da como resultado un potenciamiento significativo de la proliferacion de linfocitos T y la inhibition de la funcion supresora de nTreg. Ademas, los mAb anti-OX40 humano humanizados mantenian las actividades biologicas potentes de sus anticuerpos de raton parentales.

La FIG. 32 muestra que los mAb anti-OX20 humano bloquean la actividad de nTreg CD4+ FOXP3+. Los linfocitos T efectores CD4* CD25 CD45RO+ marcados con CFSE y Treg CD4+ FOXP3+ derivaban del mismo donante sano, Se estimularon los linfocitos T con Ab anti-CD28 soluble (0,5 pg/ml) y anti-CD3 (3 g/pl) unido a la placa y mAb anti- 0X40 humano (2 yg/ml). La proliferacion de linfocitos T efectores se evaluo por citometria de flujo por dilution de CFSE. La relacion entre nTreg y linfocitos T efectores era 1:1. !gG1 de raton sirvio como control negativo. Los linfocitos T CD4* indiferenciados sirvieron como linfocitos T de control para demostrar la inhibicion especifica de la proliferacion de linfocitos T efectores por nTreg. La FIG. 32A son datos de FACS representatives que muestran la proliferacion de linfocitos T efectores en presencia de linfocitos T CD4\ nTreg o nTreg mas mAb 119-33A anti-OX40 humano. La FIG. 32B muestra el porcentaje de proliferacion de linfocitos T efectores en presencia de nTreg despues del tratamiento con un mAb de raton anti-OX40-humano (20 probados). La FIG. 32C muestra que las tres versiones de mAb anti-OX40 humano humanizados restauraban la proliferacion de linfocitos T efectores.

Un informe reciente sugiere que la activacion de 0X40 puede inducir la apoptosis de una linea de linfocitos T humanos que expresan 0X40 (Yoshiaki Takahashi et al., 200B, AIDS Research and human retriviruses, 24). Por lo tanto, se probb el efecto de concentraciones crecientes de! mAb 106-222 anti-OX40 humano mas una dosis fija baja de anti-CD3 sobre la supervivencia de tres subconjuntos de linfocitos T en presencia de monocitos. La FIG. 33 A muestra que las altas concentraciones del mAb 106-222 anti-OX40 humano (20-30 pg/ml) preferentemente destruian nTreg FOXP3* activados, mientras que los linfocitos T CD4* indiferenciados y de memoria activados eran resistentes o menos susceptibles a este efecto. Para probar si el mAb anti-OX40 humano actua directamente sobre los Treg para inducir la muerte celular, se realizaron nuevos experimentos en ausencia de celulas accesorias. La FIG. 33B muestra que la senalizacion fuerte de 0X40 en combinacion con anti-CD3 destruia especificamente nTreg en ausencia de celulas accesorias. Para confirmar si los efectos destructores mediados por mAb anti-OX40 humano imitaban la activacion de 0X40 por el Irgando 0X40 natural, se uso una linea celular de fibroblasto L de raton que sobreexpresaba hOX40L y se uso para estimular nTreg en presencia de una dosis baja de anti-CD3, y se obtuvieron efectos similares sobre la destruccion de nTreg (FIG. 33C), Estos resultados sugieren que la activacion fuerte de 0X40 destruye Treg que expresan 0X40.

Especificamente, la FIG. 33 muestra que una alta concentracion de mAb anti-OX40 humano destruye preferentemente Treg FOXP3+. En la FIG. 33A, se cultivaron subconjuntos de linfocitos T (indiferenciados, CD4* CD25ba,° CD127+ CD45RO' CD45RA+, de memoria, CD4* CD25ba)° CD127+ CD45RA CD45RO+ y nTregs CD4* CD25al<° CD127ba‘°) cada uno con una relacion igual de monocitos CD14+ en presencia de anti-CD3 soluble (0,3 pg/ml) y concentraciones crecientes del mAb 106-22 anti-OX40 humano. La viabilidad celular se determino despues de 3 dias de cultivo mediante analisis por citometria de flujo, seleccionando linfocitos viables. Se muestran los datos de dos donantes de linfocitos T. Las FIG. 33B y 33C muestran que una fuerte activacion de 0X40 destruye los Treg CD4*FOXP3*. La FIG. 33B muestra que se estimularon Treg CD4*FOXP3’ con anti-CD3 unido a la placa (2 pg/ml) mas mAb 119-122 soluble (30 pg por millon de celulas) o anticuerpo de control de lgG1 de raton. Se contaron las celulas vivas negativas a azul de tripano despues de un dia de cultivo con un hemocitometro. La FIG. 33C muestra que se estimularon Treg CD4+ FOXP3* con anti-CD3 soluble (0,2 pg/ml) mas celulas L o celulas L que expresan el ligando hOX40 (L/hOX40L). Las celulas vivas se contaron despues de un dia de estimulacion.

A continuacion, se trato de determinar si el mAb anti-OX40 humano actua directamente sobre los linfocitos T para bloquear la funcion supresora de nTreg. Se preactivaron linfocitos T efectores CD4+ o nTreg durante la noche con anti-CD3 y se sometieron entonces a pulsos de mAb anti-OX40 humano durante 4 horas. Se lavaron entonces los linfocitos T efectores, se marcaron con CFSE y se cocultivaron con nTregs en presencia de un numero igual de

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monocitos CD14' y anti-CD3. Del mismo modo, se lavaron los nTreg preestimulados y se cultivaron con celulas efectoras T marcadas con CFSE no tratadas.

La FIG. 34 muestra que los mAb anti-OX40 humano actuan directamente sobre los linfocitos T para bloquear la funcion supresora de Treg. La FIG. 34A muestra que el mAb anti-OX40 humano actua directamente sobre los finfocitos T de memoria efectores para conferir resistencia a la supresion por nTreg Se estimularon linfocitos T CD4+ CD25baj0 CD127+ CD45RACD45RO* de memoria con anti-CD3 unido a la placa (0,8 pg/ml) en medio de cultivo (RPMI/10 % de FCS/P/S mas IL-2 a 30 Ul/ml ) durante 12 horas, se sometieron entonces a pulsos con mAb anti- 0X40 humano (119 a 122, 22 pg por 0,5 millones de celulas) en medio de cultivo durante 4 horas, se lavo 3 veces y se cultivaron 8 x 104 linfocitos T efectores marcados con CFSE con relaciones decrecientes de nTreg. La proliferacion de linfocitos T efectores se evaluo mediante citometria de flujo por dilucion de CFSE. El mAb anti-OX40 humano actua sobre los Treg haciendolos incapaces de suprimir la proliferacion de linfocitos T efectores (FIG. 34B). Se preestimularon nTreg CD4* CD25alt0 CD127ba'° con anti-CD3 unido a la placa (2 pg/ml) en medio de cultivo durante 12 horas, se sometieron entonces a pulsos con mAb anti-OX40 humano, 119-122 o 106-222 o un anticuerpo de control, anti-ICOS o lgG1 de raton, como se describe en el panel A, se lavaron y se cultivaron con linfocitos T de memoria efectores marcados con CFSE. La proliferacion de linfocitos T efectores se evaluo mediante citometria de flujo por dilucion de CFSE.

Los linfocitos T efectores tratados con mAb anti-OX40 humano se volvieron resistentes a la supresion por linfocitos nTreg. (FIG. 34 A). Por el contrario, la proliferacion de las celulas efectoras tratadas con anticuerpo de control de lgG1 de raton se mantuvo susceptible a la supresion por nTreg. La FIG. 34B muestra que los nTreg tratados con mAb anti-OX40 humano no eran capaces de suprimir la proliferacion de linfocitos T efectores. Por el contrario, los nTreg tratados con anticuerpos de control, tales como anti-ICOS o lgG1 de raton, mantuvieron la supresion. Estos resultados sugieren que los mAb anti-OX40 humano actuan directamente tanto sobre linfocitos T efectores como sobre nTreg para restaurar la proliferacion de linfocitos T efectores.

Ejemplo V

Los datos preliminares suplementarios in vivo mostraron que el anticuerpo anti-OX40 humano que funciona en ratones potencia la proliferacion de los linfocitos T y ei rechazo tumoral en ratones. Se mostro previamente que los mAb anti-OX40 humano pueden activar especificamente la cascada de NF-kB en linfocitos T CD8+ de raton transducidos con 0X40 humano. Para determinar si los mAb anti-hOX40 pueden potenciar el rechazo tumoral al potenciar la supervivencia de linfocitos T efectores CD8+ y la proliferacion clonal in vivo, se transfirieron adaptativamente linfocitos T transgenicos Pmel CD8* transducidos con el gen de la luciferasa y hOX40 en ratones albinos C57BL/6 portadores de tumores MC38 no pigmentados. Despues de la transferencia adoptiva de los linfocitos T transducidos, se trataron los ratones con Ab. Se encontro que migraban significativamente mas linfocitos T Pmel OX40+luciferasa+ humanos al pulmon en el dia 4 en ratones tratados con mAb anti-hOX40 que en los ratones tratados con anticuerpo de control lgG1 (FIG. 35B), lo que indica que la activacion de hOX4Q en ratones promovia la proliferacion de linfocitos T CD8\ El dia 8 (datos no mostrados) y el dia 12 despues del tratamiento, se encontro que el mismo grupo de ratones tratados con mAb anti-hOX40 retenia significativamente mas linfocitos T Pmel luciferasa+ en el sitio del tumor que el grupo de control de ratones tratados con lgG1 (FIG. 35B), indicando de nuevo que la activacion de hOX40 en ratones promovia la supervivencia de linfocitos T CD8*. Finalmente, los tamahos de los tumores de los ratones que recibieron linfocitos T hOX40*Pmel CD8+y posteriormente tratados con mAb anti-hOX40 eran significativamente menores que los de los ratones que recibieron linfocitos T Pmel no transducidos y tratados con mAb anti-hOX40 o linfocitos T Pmel hOX40 + seguido de tratamiento con anticuerpo lgG1 de control de ratonsimilar. Estos resultados muestran que la activacion de 0X40 humano en ratones da como resultado efectos biologicos similares a los de 0X40 de raton (Gough et MJ, 2008). Por lo tanto, los datos demuestran la capacidad de mAb anti-OX40 humano de estimular la proliferacion de linfocitos T CD+ y la supervivencia in vivo y potenciar el rechazo tumoral.

El mAb anti-OX40 humano promueve la proliferacion y supervivencia de linfocitos T in vivo.

El regimen de vacunacion terapeutico se muestra en la FIG. 35A. Se implantaron por via subcutanea (SC) 5 x 105 celulas tumorales MC38/gp100 no pigmentadas (dia 0) a ratones albinos C57BL/6 en grupos de 5. En el dia 6, se indujo la linfopenia mediante la administracion de una dosis de 350 cGy de radiacidn. En el dia 7, se transfirieron adoptivamente 1 x 10s linfocitos T Pmel-1 transducidos con luciferasa con o sin expresion de 0X40 humano en ratones portadores de tumor (n = 5 por grupo), seguido de la inyeccion intravenosa de 5 x 10s DC sometidas a pulsos de peptido gp100. Se administro por via intraperitoneal IL-2 humana recombinante durante 3 dias despues de la transferencia de linfocitos T. Los anticuerpos se administraron en los dias 7, 9 y 11 con 100, 50 y 50 pg, respectivamente, por inyeccion por raton (FIG. 35B, Las imagenes de bioluminiscencia in vivo mostraron acumulacion de linfocitos T pmel-1 CD8* que expresan luciferasa en los sitios de pulmon y tumor en los dias 4 y 12. Se muestran dos de los cinco ratones por grupo en el dia 4 y el dia 12 (FIG. 35C). Los tumores respondieron a los tratamientos usando mAb anti-hOX40. El tarnaho del tumor se midio cada 3 dias Pmel-1 y Pmel-1 mas lgG1 de raton sirvieron como control.

5

10

15

20

25

30

<110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM

<120> ANTICUERPOS ANTI-OX40 Y PROCEDIMIENTOS DE USO DE LOS MISMOS

<130> 07P53W02

<140>

<141 >

<150> 61/380.827 <151 > 08/09/2010

<150> 61/375.999 <151 > 23/08/2010 <160> 24

<170> Patentln version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 1

Asp Tyr Ser Met His 1 5

<210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp.

<400>2

Trp lie Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Mus sp.

<40Q>3

Pro Tyr Tyr Asp Tyr val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 4 <211 >122 <212> PRT

<213> Mus sp. <400 4

Gin: lie Gin Leu val Gin Ser Gly Pro i Glu Leu i Lys Lys Pro Gly Gl

1: 5 10 15

Thr: Val Lys He Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr



: 20 25 30

Ser: Met His Trp val Lys Gl n Ala Pro Gl y Lys Gly Leu Lys Trp Met


: 35 40 45

Gly: Trp Tie Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50: 55 60

Lys: Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65: 70 75 80

Leu: Gin lie Asn Asn leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys




: 85 90 95

Aid: Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr val Ser Tyr ryr Ala Met Asp Tyr Trp



: 100 105 110

Gly: His Gly Thr Ser va 1 Thr val Ser Ser

: 115 120

5 <210> 5

<211> 122 <212> PRT

<213> Secuenda artificial 220.

10 <223> Descripcion de secuencia artificial: Polipeptido sintetico

<400> 5

Gin: val Gin Leu val Gl n Ser Gly Ser Gl u Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1: 5 10 15

Ser: Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gl y Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr


: 20 25 30

Ser: Met His Trp Val Arg Gl n Ala Pro Gly Gl n Gly Leu Lys Trp Met


: 35 40 45

Gly: Trp lie Asn Thr Gl u Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Al a Asp Asp Phe

50: 55 60

Lys: Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu ASp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65: 70 75 80

Leu: Gl n lie Ser Ser 85 Leu Lys Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr IV Cys

Al a: Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met: Asp Tyr Trp



: 100 105 110

Gly: Gin Gly Thr Thr val Thr Val Ser Ser

115 120

<210 6 <211 > 458 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial 220.

<223> Descripcion de secuencia artificial: Polinucleotido sintetico <400>6

actagtacca: ccatggcttg ggtgtggacc t. tgctat tcc tgatggcagc tgcccaaagt 60

atccaagcac: aggttcagtt ggtgcagtct ggatctgagc tgaagaagcc tggagcctca 120

gtcaaggttt: cctgcaaggc ttctggttat accttcacag actatteaat gcactgggtg 180

cgacaggctc: caggacaagg tttaaagtgg atgggctgga taaacactga gactggtgag 240

ccaacatatg: cagatgacct caagggacgg tttgtcttct ctttggacac ctctgtcagc 300

actgcctait: tgcagatcag cagcctcaaa gctgaggaca cggclgtgta Ltactgtgct 360

aatccctact: atgattacgt ctcttactat gctatggact actggggtca gggaaccacg 420

gtcaccgtct: cctcaggtaa gaatggcctc tcaagctt 458

<210> 7 <211 > 11

<212> PRT

<213> Mus sp,

<400 7

Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10

5 <210> 8

<211> 7 <212> PRT <213> Mus sp.

<400> 8

Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr 10 1 5

<210> 9

<211>9

<212> PRT

<213> Mus sp.

15 <400> 9

Gin Gin Hi's Tyr Ser Thr Pro Arg Thr

1 5

<210> 10 <211 > W7 20 <212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 10

Asp He val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser val Arg 15 10 15

Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser val Gin Ala 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala val Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

<210> 11 <211 > 107 <212> PRT

5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencia artificial: Polipeptido sintetico

<400> 11

ASp: lie Gin Met Thr G1 n Ser Pro Ser Ser Leu Ser A i a Ser val Gl y

1: 5 10 15

ASp: Arg val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin ASp val Ser Thr Al a


: 20 25 30

val: Al a Trp 35 Tyr Gl n Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala pro Lys 45 Leu Leu II e

Tyr: Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gl y

50: 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

<210> 12 <211> 416 <212> ADN

5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Description de secuencia artificial: Polinucleotido sintetico <400> 12

gctagcacca ccatggagic acagattcag gtctttgtat tcgtgttict ctggttgtct 60 gglgttgacg gagacal.lca galgacccag Lctccatcct ccctgLccgt alcagtggga 120 gacagggtca ccatcacctg caaggccagt caggatgtga gtactgctgt agcctggtat 180 caacagaaac caggaaaagc ccctaaacta ctgatltact cggcatccta cctctacact 240 ggagtcccii cacgcticag iggcagtgga tctgggacgg attlcacttt caccaitagc 300 agtcigcagc cigaagatai tgcaacatat tactgtcagc aacattaiag tactccicgg 360 acgttcggtc agggcaccaa gctggaaatc aaacgtaagt agaatccaaa gaattc 416

10 <210> 13

<211>5 <212> PRT <213> Mus sp <400> 13

Ser His Asp Mel Ser

1 5

15

<210> 14 <211 > 17 <212> PRT <213> Mus sp.

20 <400> 14

Ala lie Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tvr Pro Asp Thr Mel Glu

1 5 10 15

Arg

<210> 15

<211> 11 <212> PRT <213> Mus sp.

5 <400 15

Hi5 Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr 15 10

<210> 16 <211 > 120 <212> PRT 10 <213>Mussp,

<400> 16

Glu: Val Girt Leu Val Gl u Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gl u

1: 5 10 15

Ser: Leu Lys Leu Ser cys Gl u Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser Hi s


: 20 25 30

Asp: Met. Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Gl u Lys Arg Leu Gl U Leu val


: 35 40 45

Ala: Al a lie Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro ASp Thr Pvtet

: 50 55 60

Glu: Arg Arg Phe lie lie Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr

65: 70 75 80

Leu: Gl n r^et Ser Ser Leu Arg Ser Glu ASp Thr A la Leu Tyr Tyr Cys




: 85 90 95

Ala: Arg Hi s Tyr ASp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Al a Tyr Trp Gly Gl n



: 100 105 110

Gly: Thr Leu Val Thr val Ser Ala

: 115 120

<210> 17 <211> 120 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencia artificial: Polipeptido sintetico <400> 17

Gl d: Val Gl n Leu val Gl u Ser Gl y Gl y Gly Leu Val Gin Pro Gl y Gly

1: 5 10 15

Ser: Leu Arg Leu Ser Cys Al a Ala Ser Gl U Tyr Gl u Phe Pro Ser Hi s


: 20 25 30

Asp: Me t Ser Trp Val Arg Gl n Al a Pro Glv Lys Gly Leu Gl u Leu val


: 35 40 45

Ala
Ala: He Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met

: 50 55 60

Gl u: Arg Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Al a Lys Asn Ser L.eu Tyr

65: 70 75 80

Leu: Gl n Mel Asn Ser Leu Arg Ala Gl u Asp Thr Al a Val Tyr Tyr Cys




: 85 90 95

Al a: Arg Hi s Tyr Asp Asp ryr Tyr Al a Trp Phe Ala Tyr Trp Gl y Gin


: 100 105 110

Gly: Thr Met Val Thr Val Ser Ser


: 115 120

5 <210 18

<211> 451 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220

10 <223> Descripcion de secuencia artificial: Polinucleotido sintetico

<400> 18

actagtacca ccatggacll cgggclcagc tlggttLtcc ttgtccilal tttaaaaagt. 60 glacagtgtg aggtgcagct ggtggagrct gggggaggcL Lagtgcagcc tggagggtcc 120 ctgagactct cctgtgcagc ctctgaatac gagttccctt cccatgacat. gtcttggglc ISO cgccaggctc. cggggaaggg gctggagltg glcgcagcca t. laat.agt.ga t.gglggiagc 2-10 acctactatc cagacaccal ggagagacga Ltcaccatci ccagagacaa Igccaagaac 300 tcactglacc tgcaaalgaa cagl.ct.gagg gccgaggaca cagccgtgla Llactgtgca 360 agacactatg atgattacta cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tatggtcact 420 gtctcttcag gtgagtccta acttcaagct L 451

<210> 19

<211> 15 <212> PRT <213> Mus sp.

5 <400 19

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met Mis

1 5 10 ' 15

<210> 20 <211>7 <212> PRT 10 <213>Mussp.

<400> 20

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5

<210> 21 <211>9

15 <212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 21

Gin His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 22 20 <211 > 111

<212> PRT <213> Mus sp.

<400> 22

Asp: He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala val Ser Leu Gly

1: 5 10 15

Gin: Arg Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser


: 20 25 30

Gly: Tyr Ser Tyr Met Hi s Trp Tyr Gin Gl n Lys Pro Gly Gl n Pro Pro

: 35 40 45

Lys: Leu Leu He Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gl u Ser Gl y val Pro Ala

50: 55 60

Arg: Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie Hi s

65: 70 75 80

Pro: Val Glu Gl u Glu 85 ASp Ala Ala Thr sSr T yr Cys Gin Hi s Ser 95 Arg

Gl u: Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Gl u Leu Lys



: 100 105 110

<210> 23 <211> 111 <212> PRT

5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Description de secuencia artificial: Polipeptido sintetico <400> 23

GiU: I IG va i Leu inr GI n ser pro Ala Tnr Leu ser Leu ser pro Gly

1: 5 10 15

Glu: Arg Al a Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser val Ser Thr Ser


: 20 25 30

Gly: Tyr Ser Tyr Met Hi s Trp Tyr Gin Gl n Lys Pro Gly Gl n A1 a Pro


: 35 <50 45

Arg: L.eu Leu lie Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gl u Ser Gly val Pro Ala

50: 55 60

Arg: Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser

65: 70 75 80

Ser: i.eu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin His Ser Arg




: 85 90 95

Glu: Leu pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu He Lys

100 10S 110

<210 24 <211 >428 <212> ADN

5 <213> Secuencia artificial

<220

<223> Description de secuencia artificial: Polinucleotido sintetico <400> 24

gctagcacca: ccatggagac agacacactc ctgttatggg tactgctgct ctgggttcca 60

ggttccactg: gtgaaattgt gctgacacag tctcctgcta ccttatcttt gtctccaggg 120

gaaagggcca: cccictcatg cagggccagc aaaagtgtica gtacaticigg ctatagt tat 180

atgcactggt: accaacagaa accaggacag gctcccagac tcctcatcta tcttgcatcc 240

aacctagaat: ctggggtccc tgccaggttc ag tggcagtg gg LcLgggac agacttcacc 300

ctcaccatca: gcagcctaga gcctgaggat tt tgcagttt attactgtca gcacagtagg 360

gagcttccgc: tcacgttcgg cggagggacc aaggtcgaga tcaaacgtaa giacactttt 420

ctgaattc: 428

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, que se une al 0X40 humano, que comprende: (A) una region variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1; (B) una region variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2; (C) una region variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3; (D) una region variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 7; (e) una region de dominio variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8 y (f) una region variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9.
2. Un anticuerpo aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 10 y una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4.
3. Un anticuerpo aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo aislado es un anticuerpo monoclonal.
4. Un anticuerpo aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo aislado es un anticuerpo humanizado.
5. Un anticuerpo humanizado aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, de acuerdo con la reivindicacion 4, que comprende una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 11 y una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia al menos 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5.
6. Un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de union a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Una celuia huesped que comprende un acido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Un procedimiento para producir un anticuerpo, o porcion de union a antigeno del mismo, que comprende la etapa de cultivar la celuia huesped de la reivindicacion 7, comprendiendo ademas el procedimiento preferentemente recuperarel anticuerpo o porcion de union a antigeno de la celuia huesped.
9. Un anticuerpo aislado, o porcion de union a antigeno de! mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso como un medicamento,
10. Un anticuerpo aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, para uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el medicamento es para uso en el tratamiento del cancer.