ES2629339T3 - Tratamiento de enfermedades relacionadas con la paraoxonasa 1 (pon1) por inhibición de transcrito antisentido natural a pon1 - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido que se dirige a un transcrito antisentido natural de la Paraoxonasa 1 (PON1) para uso como un compuesto terapéutico, donde el oligonucleótido modula la expresión de la Paraoxonasa 1 (PON1) y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCION

Tratamiento de enfermedades relacionadas con la paraoxonasa 1 (ponl) por inhibicion de transcrito antisentido natural a pon1 5

CAMPO DE LA INVENCION

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. con n°. 61/187.311 depositada el 16 de junio de 2009 .

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Aspectos de la divulgacion comprenden oligonucleotidos que modulan la expresion y/o la funcion de PON1 y moleculas asociadas.

ANTECEDENTES

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La hibridacion ADN-ARN y ARN-ARN son importantes para muchos aspectos de la funcion del acido nucleico incluyendo replicacion, transcripcion y traduccion del ADN. La hibridacion tambien es fundamental para una variedad de tecnologfas que tanto detectan un acido nucleico particular como alteran su expresion. Los nucleotidos antisentido, por ejemplo, alteran la expresion genica hibridandose con ARN diana, interfiriendo asf con el splicing, la 20 transcripcion, la traduccion y la replicacion de ARN. El ADN antisentido tiene la caracterfstica anadida de que los hfbridos de ADN-ARN sirven de sustrato para la digestion por ribonucleasa H, una actividad que esta presente en la mayorfa de los tipos de celulas. Las moleculas antisentido pueden suministrarse al interior de celulas, como es el caso para oligodesoxinucleotidos (ODN), o pueden expresarse a partir de genes endogenos como moleculas de ARN. La FDA recientemente aprobo un farmaco antisentido, VITRAVENE™ (para el tratamiento de retinitis por 25 citomegalovirus), que refleja que el antisentido tiene utilidad terapeutica.

RESUMEN

La invencion se define por las reivindicaciones. Aquellos aspectos/casos de la presente divulgacion que constituyen 30 la invencion se definen por las reivindicaciones.

Este resumen se proporciona para presentar un resumen de la divulgacion para indicar brevemente la naturaleza y sustancia de la divulgacion. Se presenta en el entendimiento de que no se utilizara para interpretar ni limitar el alcance o significado de las reivindicaciones.

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En un aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos de inhibicion de la accion de un transcrito antisentido natural usando uno o mas oligonucleotidos antisentido dirigidos a cualquier region del transcrito antisentido natural produciendo la regulacion positiva del gen sentido correspondiente. Tambien esta contemplado en el presente documento que la inhibicion del transcrito antisentido natural pueda conseguirse mediante siRNA, ribozimas y 40 moleculas pequenas, que se considera que estan dentro del alcance de la presente divulgacion.

Un aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o la expresion de un polinucleotido de PON1 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 45 50% de identidad de secuencia con un complemento inverso de un polinucleotido que comprende de 5 a 30 nucleotidos consecutivos dentro de los nucleotidos 1 a 534 de la SEQ ID NO: 2 modulando de este modo la funcion y/o la expresion del polinucleotido de PON1 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.

En otro caso preferido, un oligonucleotido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleotidos de PON1, 50 por ejemplo, nucleotidos expuestos en SEQ ID NO: 2, y cualquier variante, alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria a los mismos. Ejemplos de oligonucleotidos antisentido se exponen como las SEQ ID NO: 3 a 7.

Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o la expresion de un polinucleotido del 55 PON1 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con un complemento inverso del antisentido del polinucleotido del PON1; modulando de este modo la funcion y/o la expresion del polinucleotido del PON1 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.

Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o la expresion de un polinucleotido del PON1 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con un oligonucleotido antisentido para un polinucleotido antisentido del PON1; 5 modulando de este modo la funcion y/o la expresion del polinucleotido del PON1 en celulas o tejidos del paciente in vivo o in vitro.

En un caso preferido, una composicion comprende uno o mas oligonucleotidos antisentido que se unen a polinucleotidos de PON1 sentido y/o antisentido.

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En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden uno o mas nucleotidos modificados o sustituidos.

En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden uno o mas enlaces modificados.

15 En otro aspecto mas, los nucleotidos modificados comprenden bases modificadas que comprenden fosforotioato, metilfosfonato, acidos nucleicos peptfdicos, 2'-O-metilo, fluoro- o carbono, metileno u otras moleculas de acido nucleico bloqueado (LNA). Preferentemente, los nucleotidos modificados son moleculas de acido nucleico bloqueado, que incluyen a-L-LNA.

20 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos se administran a un paciente por via subcutanea, por via intramuscular, por via intravenosa o por via intraperitoneal.

En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos se administran en una composicion farmaceutica. Un regimen de tratamiento comprende administrar los compuestos antisentido al menos una vez al paciente; sin embargo, este 25 tratamiento puede modificarse para comprender multiples dosis durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede combinarse con uno o varios de otros tipos de terapias.

En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos estan encapsulados en un liposoma o unidos a una molecula portadora (por ejemplo, colesterol, peptido TAT).

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Otros aspectos se describen mas adelante.

Breve descripcion de los dibujos

35 La figura 1 es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm de PON1 despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm del PON1 en celulas HepG2 se incrementan significativamente 48 h despues del tratamiento con 1 de los oligos disenados para Hs.611732 antisentido del PON1. Las barras indicadas como CUR- 40 0709, CUR-0711, CUR-0710, CUR-0707 y CUR-0708 se corresponden con muestras tratadas con SEQ ID NOS: 3 a 7 respectivamente.

Descripcion de la lista de secuencias

45 la SEC ID N°: 1: Paraoxonasa 1 de homo sapiens (PON1), ARNm. (N° de acceso del NCBI NM_000446) la SEC ID N°: 2: Secuencia antisentido de PON1 natural (Hs.611732)

SEQ ID NO: 3 a 7: Oligonucleotidos antisentido * indica enlace fosfotioato.

DESCRIPCION DETALLADA

50

Varios aspectos de la divulgacion se describen a continuacion con referencia a aplicaciones de ejemplos para ilustracion. Debe entenderse que los numerosos detalles, relaciones y procedimientos especfficos se exponen para proporcionar un entendimiento completo de la divulgacion. Un experto en la materia relevante, sin embargo, reconocera facilmente que la divulgacion puede ponerse en practica sin uno o mas de los detalles especfficos o con 55 otros procedimientos. La presente divulgacion no esta limitada por el orden de actos o acontecimientos, ya que algunos actos pueden producirse en diferentes ordenes y/o simultaneamente con otros actos o acontecimientos. Ademas, no todos los actos o acontecimientos ilustrados son requeridos para implementar una metodologfa de acuerdo con la presente divulgacion.

60 Todos los genes, nombres de genes, y productos genicos divulgados en el presente documento pretenden

corresponderse a homologos de cualquier especie para la cual las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento son aplicables. De este modo, los terminos incluyen, aunque sin limitarse a, genes y productos genicos de seres humanos y ratones. Se entiende que, cuando se divulga un gen o producto genico de una especie particular, esta divulgacion pretende ser ejemplar solamente, y no se interpreta como una limitacion, a menos que el 5 contexto en el que aparece lo indique claramente. De este modo, por ejemplo, para los genes divulgados en el presente documento, que en algunos casos se refieren a secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos de mamffero, pretenden englobar genes homologos y/u ortologos y productos genicos de otros animales que incluyen, aunque sin limitarse a, otros mamfferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En casos preferidos, los genes o secuencias de acidos nucleicos son humanos.

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Definiciones

La terminologfa usada en el presente documento es con el fin de describir aspectos particulares solamente y no pretende ser limitante de la divulgacion. Tal como se usan en la presente, se pretende que las formas en singular 15 “un”, “una”, “el” y “la” incluyan tambien las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Ademas, siempre que las expresiones "que incluye", "incluyen", "que tiene", "tiene", "con", o variantes de los mismos se usan en la descripcion detallada y/o las reivindicaciones, dichas expresiones pretenden ser inclusivas de una manera similar a la expresion "que comprende."

20 El termino «aproximadamente» significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como se ha determinado por un experto habitual en la materia, que dependera en parte de como se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medicion. Por ejemplo, «alrededor de» puede significar 1 o mas de 1 de desviacion estandar, conforme a la practica de la tecnica. Como alternativa, “aproximadamente” puede significar un intervalo de hasta el 20%, preferentemente hasta el 10%, mas preferentemente hasta el 5%, y mas preferentemente 25 todavfa hasta el 1% de un valor dado. De manera alternativa, en particular con respecto a los sistemas o procesos biologicos, el termino pueden significar un orden de magnitud de un valor preferentemente comprendido en 5 veces y mas preferentemente, comprendido en 2 veces. En los casos en los que se describen valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se exprese lo contrario, el termino «alrededor de» significa que se debe asumir que el valor se encuentra comprendido en un intervalo de error aceptable para el valor particular.

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Tal como se usa en el presente documento, el termino “ARNm” significa (el) los transcrito(s) de ARNm actualmente conocidos de un gen elegido como diana, y cualquier transcrito adicional que pueda ser dilucidado.

Por “oligonucleotidos antisentido” o “compuesto antisentido” se indica una molecula de ARN o de ADN que se une a 35 otro ARN o ADN (ARN, ADN diana). Por ejemplo, si este es un oligonucleotido de ARN, se une a otra diana de ARN por medio de interacciones ARN-ARN y altera la actividad del ARN diana Un oligonucleotido antisentido puede regular positivamente o regular negativamente la expresion y/o funcion de un polinucleotido particular. La definicion pretende comprender cualquier molecula de ARN o ADN extraha que es util desde un punto de vista terapeutico, de diagnostico u otro. Dichas moleculas incluyen, por ejemplo, moleculas de ARN o ADN antisentido, ARN de 40 interferencia (iARN), micro ARN, moleculas de ARN sehuelo, siRNA, ARN enzimatico, ARN de edicion terapeutica y ARN agonista y antagonista, compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia gufa externa (EGS), agentes de splicing alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. Por lo tanto, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.

45

En el contexto de esta divulgacion, el termino "oligonucleotido" se refiere a un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN) o mimeticos de los mismos. El termino “oligonucleotido” tambien incluye oligomeros lineales o circulares de monomeros o enlaces naturales y/o modificados, que incluyen desoxirribonucleosidos, ribonucleosidos, formas sustituidas y alfa-anomeras de los mismos, acidos nucleicos 50 peptfdicos (PNA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), fosforotioato, metilfosfonato y similares. Los oligonucleotidos son capaces de unirse especfficamente a un polinucleotido diana por medio de un patron regular de interacciones monomero a monomero, tales como tipo de apareamiento de bases de Watson-Crick, tipos de apareamiento de bases de Hoogsteen o Hoogsteen inversa, o similares.

55 El oligonucleotido puede ser “quimerico”, es decir, estar compuesto de diferentes regiones. En el contexto de esta divulgacion los compuestos "quimericos" son oligonucleotidos, que contienen dos o mas regiones qufmicas, por ejemplo, una o mas regiones de ADN, una o mas regiones de aRn, una o mas regiones de PNA, etc. Cada region qufmica esta compuesta por al menos una unidad monomerica, es decir, un nucleotido en el caso de un compuesto de oligonucleotidos. Estos oligonucleotidos normalmente comprenden al menos una region donde el oligonucleotido 60 se modifica con el fin de presentar una o mas propiedades deseadas. Las propiedades deseadas del oligonucleotido

incluyen, aunque sin limitarse a, por ejemplo, resistencia a la degradacion por nucleasas incrementada, captacion celular incrementada y/o afinidad de union por el acido nucleico diana incrementada. Las diferentes regiones del oligonucleotido pueden, por lo tanto, tener diferentes propiedades. Los oligonucleotidos quimericos de la presente divulgacion pueden formarse como estructuras mixtas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, 5 oligonucleosidos y/o analogos de oligonucleotido, tal como se ha descrito anteriormente.

El oligonucleotido puede estar compuesto de regiones que pueden enlazarse en “registro”, es decir, cuando los monomeros se enlazan consecutivamente, como en ADN nativo, o se enlazan mediante espaciadores. Se pretende que los espaciadores constituyan un "puente" covalente entre las regiones y tengan, en casos preferidos, una 10 longitud que no supere aproximadamente los 100 atomos de carbono. Los espaciadores pueden portar diferentes funcionalidades, por ejemplo, tener carga positiva o negativa, portar propiedades de union a acido nucleico especiales (intercaladores, ligantes de surcos, toxinas, fluoroforos, etc.), ser lipofilos, inducir estructuras secundarias especiales como, por ejemplo, peptidos que contienen alanina que inducen helices alfa.

15 Tal como se usa en el presente documento, "PON1" y "Paraoxonasa 1" son incluyentes de todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificadoras y no codificadoras, cadenas de polinucleotido sentido y antisentido, etc.

Tal como se usa en el presente documento, las palabras "Paraoxonasa 1", PON1, A-esterasa, esterasa aromatica 1, 20 ESA, K-45, MVCD5, pOn, PON-1, arildialkilfosfatasa de suero 1, paraoxonasa/arilesterasa 1 de suero, se utilizan de manera indistinta en la presente solicitud.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion “oligonucleotido especffico para” u “oligonucleotido que se dirige a” se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una 25 parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana. La estabilidad de los complejos y los duplex puede determinarse mediante calculos teoricos y/o ensayos in vitro. Ensayos a modo de ejemplo para determinar la estabilidad de complejos y duplex de hibridacion se describen en los ejemplos mas adelante.

30 Tal como se usa en el presente documento, la expresion “acido nucleico diana” engloba ADN, ARN (que comprende pre-ARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y tambien ADNc derivado de dicho ARN, secuencias codificantes, no codificantes, polinucleotidos sentido o antisentido. La hibridacion especffica de un compuesto oligomerico con su acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico. Esta modulacion de la funcion de un acido nucleico diana por compuestos, que se hibridan especfficamente con el, se denomina 35 generalmente “antisentido”. Las funciones de ADN con las que interferiran incluyen, por ejemplo, la replicacion y transcripcion. Las funciones de ARN con las que interferiran incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocacion del ARN al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna del ARN, splicing del ARN para dar una o mas especies de ARNm, y actividad catalftica que puede acoplarse en o facilitarse por el ARN. El efecto global de dicha interferencia con las funciones del acido nucleico diana es la modulacion de la expresion de 40 un producto codificado u oligonucleotidos.

La interferencia de ARN "iARN" esta mediada por moleculas de ARN bicatenario (dsARN) que tienen homologfa especffica de secuencia con sus secuencias de acido nucleico "diana" En ciertos casos de la presente divulgacion, los mediadores son duplex de ARN “interferente pequeno” (siRNA) de 5-25 nucleotidos. Las siRNA derivan del 45 procesamiento de dsARN por una enzima ARNasa conocida como Dicer. Los productos duplex de siRNA son reclutados en un complejo siRNA de multiprotefna llamado RISC (o en espanol: Complejo Silenciador Inducido por ARN). Sin desear cenirse a ninguna teorfa particular, se cree entonces que un RISC es guiado a un acido nucleico diana (adecuadamente ARNm), en el que el duplex de siRNA interactua de una forma especffica de secuencia para mediar en la escision en un modo catalftico Los ARN interferentes pequenos que pueden usarse de acuerdo con la 50 presente divulgacion pueden sintetizarse y usarse de acuerdo con procedimientos que son bien conocidos en la tecnica y que seran familiares para el experto en la materia. Los aRn interferentes pequenos para su uso en los procedimientos de la presente divulgacion comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleotidos (nt). En los ejemplos de aspectos no limitantes, los siRNA pueden comprender aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nt, aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nt, aproximadamente 10 55 a aproximadamente 30 nt, aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nt, o aproximadamente 20-25 nucleotidos.

La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se facilita usando programas informaticos que alinean automaticamente secuencias de acido nucleico e indican regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se usan para comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales 60 como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acidos nucleicos de un

intervalo de especies permite la seleccion de secuencias de acidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para permitir una determinacion del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando Southern blots a grados de astringencia variables, tal como es muy conocido en la tecnica, es posible obtener una 5 medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico correspondientes en otras especies. Un experto en la materia se dara cuenta de que hay libertad considerable en la seleccion de regiones apropiadas de genes para su uso en la presente divulgacion.

10

Por “ARN enzimatico” se indica una molecula de ARN con actividad enzimatica (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260,3030-3035). Los acidos nucleicos enzimaticos (ribozimas) actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union se produce a traves de la parte de union diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. De este modo, el 15 acido nucleico enzimatico reconoce primero y luego se une a ARN diana mediante apareamiento de bases, y una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana.

Por “ARN senuelo” se indica una molecula de ARN que imita el dominio de union natural para un ligando. El ARN senuelo compite, por lo tanto, con la diana de union natural para la union de un ligando especffico. Por ejemplo, se 20 ha mostrado que la sobreexpresion de ARN de respuesta de activacion en trans (TAR) de HIV puede actuar como un "senuelo" y se une de forma eficiente a la protefna tat de HIV, impidiendo de este modo que se una a secuencias TAR codificadas por el ARN de HIV Esto se indica que es un ejemplo especffico. Los expertos en la materia reconoceran que esto es solo un ejemplo, y facilmente pueden generarse otros aspectos usando tecnicas generalmente conocidas en la tecnica.

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Tal como se usa en el presente documento, el termino "monomeros" normalmente indica monomeros enlazados por enlaces fosfodiester o analogos de los mismos para formar oligonucleotidos que varfan en tamano entre unas pocas unidades monomericas, por ejemplo, entre aproximadamente 3-4, y aproximadamente varios cientos de unidades monomericas. Los analogos de enlaces fosfodiester incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonatos, 30 fosforoselenoato, fosforamidato y similares, tal como se describe mas completamente mas adelante.

El termino “nucleotido” cubre nucleotidos de origen natural, asf como nucleotidos no de origen natural. Debe ser evidente para el experto en la materia que diversos nucleotidos que se consideraron anteriormente “no de origen natural” se han descubierto posteriormente en la naturaleza. De este modo, "nucleotidos" incluye no solamente las 35 moleculas que contienen heterociclos de purina y pirimidina conocidas, sino tambien analogos heterocfdiclicos y tautomeros de las mismas. Ejemplos ilustrativos de otros tipos de nucleotidos son moleculas que contienen adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurina, 8-oxo- N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7- deazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6- diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-alquinil(C3-C6)-citosina, 5- fluorouracilo, 5-bromouracilo, seudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y 40 los nucleotidos "no de origen natural" descritos en Benner y col., patente de EE.UU. n° 5.432.272. El termino “nucleotido” pretende cubrir todos y cada uno de estos ejemplos, ademas de analogos y tautomeros de los mismos. Nucleotidos especialmente interesantes son aquellos que contienen adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, que se consideran como los nucleotidos de origen natural en relacion con la aplicacion terapeutica y diagnostica en seres humanos. Los nucleotidos incluyen los azucares naturales 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, por ejemplo, como se describe en 45 Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), ademas de sus analogos.

“Analogos”, en referencia a nucleotidos, incluye nucleotidos sinteticos que tienen restos de bases modificados y/o restos de azucar modificados (vease, por ejemplo, descrito generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429- 4443, Toulme, J.J., (2001) Nature 50 Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3'-C-enlazados [3.2.0] biciclorabinonucleosidos. Dichos analogos incluyen nucleotidos sinteticos disenados para potenciar propiedades de union, por ejemplo, la estabilidad especificidad del duplex o el triplex, o similares.

55

Tal como se usa en el presente documento, "hibridacion" significa el apareamiento de cadenas sustancialmente complementarias de compuestos oligomericos. Un mecanismo de apareamiento implica la formacion de puentes de hidrogeno, que pueden ser puentes de hidrogeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, entre bases de nucleosidos o de nucleotidos (nucleotidos) complementarias de las cadenas de compuestos oligomericos. Por 60 ejemplo, la adenina y la timina son nucleotidos complementarios que se aparean mediante la formacion de puentes

de hidrogeno. La hibridacion puede producirse en circunstancias variables.

Un compuesto antisentido es "especfficamente hibridable" cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para causar una modulacion de la funcion y/o la actividad, y 5 existe un grado de complementariedad suficiente para evitar union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en las que se desea union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.

10 Tal como se usa en el presente documento, la frase "condiciones de hibridacion astringentes" o "condiciones astringentes" se refiere a condiciones en las que un compuesto de la divulgacion hibridara con su secuencia diana, pero con un numero mfnimo de otras secuencias. Las condiciones astringentes son dependientes de secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias y en el contexto de esta divulgacion, "condiciones astringentes" en las que compuestos oligomericos hibridan con una secuencia diana se determinan mediante la naturaleza y la 15 composicion de los compuestos oligomericos y los ensayos en los que estan siendo investigados. En general, las condiciones de hibridacion astringentes comprenden bajas concentraciones (<0,15 M) de sales con cationes inorganicos tales como Na++ o K++ (es decir, baja fuerza ionica), temperatura superior a 20 °C - 25 °C por debajo de la Tm del complejo de compuesto oligomerico: secuencia diana, y la presencia de desnaturalizantes tales como formamida, dimetilformamida, dimetilsulfoxido, o el detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). Por ejemplo, la tasa de 20 hibridacion disminuye un 1,1% por cada 1% de formamida. Un ejemplo de una condicion de hibridacion de alta astringencia es 0,1X tampon cloruro sodico-citrato sodico (SSC)/0,1 % (peso/volumen) de SDS a 60 °C durante 30 minutos.

“Complementario”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de apareamiento preciso 25 entre dos nucleotidos en una o dos cadenas oligomericas. Por ejemplo, si una nucleobase en cierta posicion de un compuesto antisentido es capaz de formar puentes de hidrogeno con una nucleobase en cierta posicion de un acido nucleico diana, siendo dicho acido nucleico diana un ADN, ARN, o molecula de oligonucleotido, entonces la posicion de la formacion de puentes de hidrogeno entre el oligonucleotido y se considera que el acido nucleico diana es una posicion complementaria. El compuesto oligomerico y el ADN, ARN, o molecula de oligonucleotido, adicional son 30 complementarios entre si cuando un numero suficiente de posiciones complementarias en cada molecula estan ocupadas por nucleotidos que pueden formar puentes de hidrogeno entre si. De este modo, "especfficamente hibridable" y "complementariedad" son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o complementariedad sobre un numero suficiente de nucleotidos de modo que se produzca union estable y especffica entre el compuesto oligomerico y un acido nucleico diana.

35

Se entiende en la tecnica que no es necesario que la secuencia de un compuesto oligomerico sea un 100 % complementaria a la de su acido nucleico diana para ser especfficamente hibridable. Ademas, un oligonucleotido puede hibridarse sobre uno o mas segmentos, de modo que segmentos intermedios o adyacentes no esten implicados en el acontecimiento de hibridacion (por ejemplo, una estructura en bucle, desapareamiento o estructura 40 de horquilla). Los compuestos oligomericos de la presente divulgacion comprenden al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 75%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 85%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 99%, de complementariedad de secuencia con una region diana dentro de la secuencia de acidos nucleicos diana a la que se dirigen. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de los 20 nucleotidos del compuesto 45 antisentido son complementarios a una region diana y, por lo tanto, hibridarfan especfficamente, representarfa el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleotidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleotidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre si o a nucleotidos complementarios. Por lo tanto, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleotidos de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleotidos no complementarios que estan flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el 50 acido nucleico diana tendrfa el 77,8% de complementariedad global con el acido nucleico diana y de este modo estarfa dentro del alcance de la presente divulgacion. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una region de un acido nucleico diana puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de busqueda de alineamientos locales basicos) y programas PowerBLAST conocidos en la tecnica El porcentaje de homologfa, identidad de secuencias o complementariedad pueden determinarse por, por ejemplo, el 55 programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando parametros por defecto, que usa el algoritmo de Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "punto de fusion termico (Tm)" se refiere a la temperatura, 60 bajo fuerza ionica, pH y concentracion de acido nucleico definidas, a la que el 50% de los oligonucleotidos

complementarios a la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Normalmente, condiciones astringentes seran aquellas en las que la concentracion de sales es la concentracion de ion Na (u otras sales) de al menos aproximadamente 0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para oligonucleotidos cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleotidos). Tambien pueden lograrse condiciones astringentes 5 con la adicion de agentes desestabilizantes tales como formamida.

Tal como se usa en el presente documento, "modulacion" significa un incremento (estimulacion) o una disminucion (inhibicion) de la expresion de un gen.

10 El termino "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleotidos, puede englobar una secuencia de polinucleotidos relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definicion tambien puede comprender, por ejemplo, variantes "alelicas", de "splicing", de "especie" o "polimorficas". Una variante de splicing puede tener identidad significativa con una molecula de referencia, pero generalmente tendra un mayor o menor numero de polinucleotidos debido al splicing alterno de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipeptido 15 correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias de polinucleotidos que varfan de una especie a otra. Son de particular utilidad en la divulgacion variantes de productos genicos de tipo silvestre (wild type). Las variantes pueden resultar de al menos una mutacion en la secuencia de acidos nucleicos y pueden producir ARNm alterados o polipeptidos cuya estructura o funcion puede o puede no alterarse. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o 20 muchas formas alelicas. Cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleotidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede producirse solo, o en combinacion con los otros, una o mas veces en una secuencia dada.

Los polipeptidos resultantes generalmente tendran identidad significativa de aminoacidos los unos con respecto a los 25 otros. Una variante polimorfica es una variacion en la secuencia de polinucleotidos de un gen particular entre individuos de una especie dada. Las variantes polimorficas tambien pueden englobar "polimorfismos de un solo nucleotido" (SNP), o mutaciones de una sola base en las que la secuencia de polinucleotidos varfa en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una cierta poblacion con una propension por una patologfa, es decir susceptibilidad frente a resistencia.

30

Los polinucleotidos derivados incluyen acidos nucleicos sometidos a modificacion qufmica, por ejemplo, sustitucion de hidrogeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Los derivados, por ejemplo, oligonucleotidos derivados, pueden comprender partes no de origen natural, tales como restos de azucar alterados o enlaces inter-azucar. A modo de ejemplo, entre estos estan fosforotioato y otras especies que contienen azufre que se conocen en la tecnica. Los 35 acidos nucleicos derivados tambien pueden contener etiquetas, que incluyen radionucleotidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogenos, sustratos, cofactores, inhibidores, partfculas magneticas y similares.

Un polipeptido o peptido "derivado" es uno que se modifica, por ejemplo, por glucosilacion, pegilacion, fosforilacion, 40 sulfatacion, reduccion/alquilacion, acilacion, acoplamiento qufmico o tratamiento suave con formalina. Un derivado tambien puede modificarse para contener una etiqueta detectable, tanto directa como indirectamente, que incluye, aunque no se limita a, un radioisotopo, etiqueta fluorescente y enzimatica.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "animal" o "paciente" pretende comprender, por ejemplo, 45 seres humanos, ovejas, alces, venados, ciervos mulos, visones, mamfferos, monos, caballos, ganado vacuno, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, aves, pollo, reptiles, peces, insectos y aracnidos.

"Mamffero" cubre mamfferos de sangre caliente que normalmente estan bajo atencion medica (por ejemplo, seres humanos y animales domesticados). Los ejemplos incluyen felinos, caninos, equinos, bovinos y humanos, ademas 50 de solo humanos.

"Tratar" o "tratamiento" cubre el tratamiento de una patologfa en un mamffero, e incluye: (a) prevenir que se produzca la patologfa en un mamffero, en particular, cuando dicho mamffero tiene predisposicion a la patologfa, pero todavfa no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la patologfa, por ejemplo, detener el desarrollo; y/o (c) aliviar 55 la patologfa, por ejemplo, causando la regresion de la patologfa hasta que se alcance un criterio de valoracion deseado. Tratar tambien incluye la mejora de un sfntoma de una enfermedad (por ejemplo, reducir el dolor o molestia), donde dicha mejora puede o puede no afectar directamente la enfermedad (por ejemplo, causa, transmision, expresion, etc.).

60 Tal como se usa en el presente documento, "cancer" se refiere a todo tipo de cancer o neoplasia o tumores malignos

descubiertos en mamfferos, incluyendo, aunque sin limitarse a: leucemias, linfomas, melanomas, carcinomas y sarcomas. El propio cancer se manifiesta como un "tumor" o tejido que comprende celulas malignas del cancer. Los ejemplos de tumores incluyen sarcomas y carcinomas como tales, pero no limitado a: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, 5 linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomisarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer ovarico, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandula sudorfpara, carcinoma de glandula sebacea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, 10 seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, cancer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimona, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligondendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma. Los canceres adicionales que se pueden tratar para la composicion descrita de acuerdo a la divulgacion incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no 15 Hodgkin, mieloma multiple, neuroblastoma, cancer de mama, cancer ovarico, cancer de pulmon, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primario, tumores de pulmon de celulas pequenas, tumores primarios de cerebro, cancer de estomago, cancer de colon, insulinoma pancreatico maligno, carcinoma maligno, cancer de vejiga urinaria, lesiones premalignas cutaneas, cancer testicular, linfomas, cancer de tiroides, neuroblastoma, cancer esofagico, cancer de tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cancer cervical, cancer endometrial, cancer 20 cortical adrenal, y cancer de prostata.

"Enfermedad o trastorno neurologico" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno del sistema nervioso y/o sistema visual. "Enfermedad o trastorno neurologico" incluye enfermedades o trastornos que implican al sistema nervioso central (cerebro, tronco del encefalo y cerebelo), el sistema nervioso periferico (incluyendo los nervios craneales), y 25 el sistema nervioso autonomo (partes del cual estan ubicadas en el sistema nervioso tanto central como periferico). Los ejemplos de trastornos neurologicos incluyen, aunque sin limitarse a, cefalea, estupor y coma, demencia, convulsiones, trastornos del sueno, traumatismo, infecciones, neoplasias, neurooftalmologfa, trastornos del movimiento, enfermedades desmielinizantes, trastornos de la medula espinal, y trastornos de los nervios perifericos, el musculo y las uniones neuromusculares. La adiccion y la enfermedad mental, incluyen, aunque sin limitarse a, 30 trastorno bipolar y esquizofrenia, se incluyen tambien en la definicion de trastorno neurologico. La siguiente es una lista de varios trastornos, sfntomas, signos y sfndromes neurologicos que pueden ser tratados usando las composiciones y procedimientos de acuerdo con la presente divulgacion: afasia adquirida epileptiforme; encefalomielitis diseminada aguda; adrenoleucodistrofia; degeneracion macular relacionada con la edad; agenesia del cuerpo calloso; agnosia; sfndrome de Aicardi; enfermedad de Alexander; enfermedad de Alpers; hemiplejfa 35 alterna; demencia vascular; esclerosis lateral amiotrofica; anencefalia; sfndrome de Angelman; angiomatosis; anoxemia; afasia; apraxia; quistes aracnoideos; aracnoiditis; malformacion de Chiari Anronl; malformacion arteriovenosa; sfndrome de Asperger; telegiectasia ataxia; trastorno de hiperactividad y deficit de atencion; autismo; disfuncion autonoma; dolor de espalda; enfermedad de Batten; enfermedad de Behcet; paralisis de Bell; blefaroespasmo esencial benigno; focal benigna; amiotrofia; hipertension intracraneal benigna; enfermedad de 40 Binswanger; blefaroespasmo; sfndrome de Bloch Sulzberger; lesion del plexo braquial; absceso cerebral; lesion cerebral; tumores cerebrales (incluyendo glioblastoma multiforme); tumor medular; sfndrome de Brown-Sequard; enfermedad de Canavan; sfndrome del tunel carpiano; causalgia; sfndrome de dolor central; mielinolisis pontina central; trastorno encefalico; aneurisma cerebral; arteriosclerosis cerebral; atrofia cerebral; gigantismo cerebral; paralisis cerebral; enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; neuropatfa inducida por quimioterapia y dolor neuropatico; 45 malformacion de Chiari; corea; polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica; dolor cronico; sfndrome de dolor cronico regional; sfndrome de Coffin Lowry; coma, incluyendo estado vegetativo persistente; diplejfa facial congenita; degeneracion corticobasal; arteritis craneal; craneosinostosis; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; trastornos por traumatismo acumulativo; sfndrome de Cushing; enfermedad de cuerpos de inclusion ciotomegalicos; infeccion por citomegalovirus; sfndrome de ojos danzantes y pies danzantes; sfndrome DandyWalker; enfermedad de Dawson; 50 sfndrome de Morsier; paralisis de Dejerine-Klumke; demencia; dermatomiositis; neuropatfa diabetica; esclerosis difusa; disautonomfa; disgraffa; dislexia; distomas; encefalopatfa epileptica infantil temprana; sfndrome de la silla vacfa; encefalitis; encefaloceles; angiomatosis encefalotrigeminal; epilepsia; paralisis de Erb; temblor esencial; enfermedad de Fabry; sfndrome de Fahr; desmayo; paralisis espastica familiar; convulsiones febriles; sfndrome de Fisher; ataxia de Friedreich; demencia fronto-temporal y otras "tauopatfas"; enfermedad de Gaucher; sfndrome de 55 Gerstmann; arteritis de celulas gigantes; enfermedad de inclusion de celulas gigantes; leucodistrofia de celulas globosas; sfndrome de Guillain-Barre; mielopatfa asociada HTLV-1; enfermedad Hallervorden-Spatz; traumatismo craneoencefalico; cefalea; espasmo hemifacial; paraplejia espastica; heredopatfa atactica polineuritiforme; herpes zoster otico; herpes zoster; sfndrome de Hirayama; demencia y la neuropatfa asociadas a HIV (tambien manifestaciones neurologicas del SIDA); holoprosencefalia; enfermedad de Huntington y otras enfermedades de 60 repeticion de poliglutamina; hidranencefalia; hidrocefalia; hipercortisolismo; hipoxia; encefalomielitis mediada por

inmunidad; miositis por cuerpos de inclusion; incontinencia pigmentaria; enfermedad de almacenamiento de acido fitanico infantil; enfermedad de Refsum infantil; espasmos infantiles; miopatfa inflamatoria; quiste intracraneal; hipertension intracraneal; sfndrome de Joubert; sfndrome de Kearns-Sayre; enfermedad de Kennedy, sfndrome de Kinsboume; sfndrome de Klippel Feil; enfermedad de Krabbe; enfermedad Kugelberg-Welander; kuru; enfermedad 5 de Lafora; sfndrome miastenico de Lambert-Eaton; sfndrome de Landau-Kleffner; sfndrome lateral medular (Wallenberg); dificultades de aprendizaje; enfermedad de Leigh; sfndrome de Lennox-Gustaut; sfndrome de Lesch- Nyhan; leucodistrofia; demencia con cuerpos de Lewy; lisencefalia; sfndrome de enclaustramiento; enfermedad de Lou Gehrig (es decir, enfermedad de las neuronas motoras o esclerosis lateral amiotrofica); enfermedad del disco lumbar; La enfermedad de Lyme - secuelas neurologicas; enfermedad de Machado-Joseph; macrocefalia; 10 megalocefalia; sfndrome de Melkelsson-Rosenthal; enfermedad de Meniere; meningitis; enfermedad de Menkes; leucodistrofia metacromatica; microcefalia; migrana; sfndrome de Miller Fisher; miniderrames; miopatfas mitocondriales; sfndrome de Moebius; amiotrofia monomelica; enfermedad de la neuronas motoras; enfermedad de Moyamoya; mucopolisacaridosis; demencia multiinfarto; neuropatfa motora multifocal; esclerosis multiple y otras enfermedades desmielinizantes; atrofia de multiple sistemas con hipotension postural; distrofia muscular; miastenia 15 grave; esclerosis difusa mielinoclastica; encefalopatfa mioclonica de los lactantes; mioclonfa; miopatfa; miotonfa congenita; narcolepsia; neurofibromatosis; sfndrome neuroleptico maligno; manifestaciones neurologicas del SIDA; secuelas neurologicas del lupus; neuromiotonfa; lipofuscinosis ceroidea; trastornos de la migracion neuronal; enfermedad de Niemann-Pick; sfndrome de McLeod- O'Sullivan; neuralgia occipital; secuencia de espina bifida oculta; sfndrome Ohtahara; atrofia olivopontocerebelosa; opsoclono-mioclono; neuritis optica; hipotension ortostatica; 20 sfndrome de sobreuso; parestesia; enfermedad o trastorno neurodegenerativo (enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica (ELA), demencia, esclerosis multiple y otras enfermedades y trastornos asociados con la muerte celular neuronal); paramiotonfa congenita; enfermedades paraneoplasicas; ataques paroxfsticos; Sfndrome de Parry Romberg; enfermedad de Pelizaeus- Merzbacher; paralisis periodicas; neuropatfa periferica; neuropatfa dolorosa y dolor neuropatico; estado vegetativo 25 persistente; trastornos profundos del desarrollo; reflejo de estornudo fotico; enfermedad de almacenamiento de acido fitanico; enfermedad de Pick; nervio pinzado; tumores de la hipofisis; polimiositis; porencefalia; sfndrome post-polio; neuralgia postherpetica; encefalomielitis postinfecciosa; hipotension postural; sfndrome de Prader-Willi; esclerosis lateral primaria; enfermedades prionicas; atrofia hemifacial progresiva; leucoencefalopatfa multifocal progresiva; poliodistrofia esclerosante progresiva; paralisis supranuclear progresiva; seudotumor cerebral; sfndrome de Ramsay- 30 Hunt (tipos I y 11); encefalitis de Rasmussen; sfndrome de distrofia simpatica refleja; enfermedad de Refsum; trastornos por movimientos repetitivos; lesiones por esfuerzo repetitivo; sfndrome de piernas inquietas; mielopatfa asociada a retrovirus; sfndrome de Rett; sfndrome de Reye; baile de San Vito; enfermedad de Sandhoff; enfermedad de Schilder; esquizencefalia; displasia septo-optica; sfndrome del bebe zarandeado; herpes; sfndrome de Shy- Drager; sfndrome de Sjogren; apnea del sueno; sfndrome de Soto; espasticidad; espina bifida; lesion de la medula 35 espinal; tumores de la medula espinal; atrofia muscular en la columna; sfndrome de Stuff-Person; accidente cerebrovascular; sfndrome de Sturge-Weber; panencefalitis esclerosante subaguda; encefalopatfa arteriosclerotica subcortical; corea de Sydenham; sfncope; siringomielia; discinesia tardfa; enfermedad de Tay-Sachs; arteritis temporal; sfndrome de medula espinal anclada; enfermedad de Thomsen; sfndrome del operculo toracico; Tic Douloureux; paralisis de Todd; Sfndrome de Tourette; ataque isquemico transitorio; encefalopatfas espongiformes 40 transmisibles; mielitis transversa; lesion cerebral traumatica; temblor; neuralgia trigeminal; paraparesia espastica tropical; esclerosis tuberosa; demencia vascular (demencia multiinfarto); vasculitis incluyendo arteritis temporal; enfermedad de Von Hippel-Lindau; sfndrome de Wallenberg; enfermedad de Werdnig-Hoffman; sfndrome de West; latigazo cervical; sfndrome de Williams; enfermedad de Wildon; y sfndrome de Zellweger.

45 Una "inflamacion" se refiere a condiciones inflamatorias sistemicas y condiciones asociadas localmente con migracion y atraccion de monocitos, leucocitos y/o neutrofilos. Los ejemplos de inflamacion incluyen, pero no se limitan a, inflamacion que resulta de infeccion con organismos patogenos (incluyendo bacterias gram-positivas, bacterias gram-negativas, virus, hongos, y parasitos protozoarios y helmintos), rechazo de trasplante (incluyendo rechazo de organos solidos como rinon, hfgado, corazon, pulmon o cornea, asf como rechazo de trasplantes de 50 medula osea incluyendo enfermedad del injerto contra (GVHD)), o de reacciones autoinmunitarias o alergicas cronicas o agudas, localizadas. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen glomerulonefritis aguda; artritis reumatoide o reactiva; glomerulonefritis cronica; enfermedades inflamatorias del intestino como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y enterocolitis necrotizante; sfndromes asociados a transfusion de granulocitos; dermatosis inflamatoria como dermatitis por contacto, dermatitis atopica, psoriasis; lupus eritematoso sistemico (LES), tiroiditis 55 autoinmunitaria, esclerosis multiple, y algunas formas de diabetes, u otro estado autoinmunitario donde el ataque del propio sistema inmunitario del sujeto resulte en destruccion patologica del tejido. Las reacciones alergicas incluyen asma alergico, bronquitis cronica, hipersensibilidad aguda y retrasada. Los estados de enfermedad inflamatoria sistemica incluyen inflamacion asociada con traumatismo, quemaduras, reperfusion despues de eventos isquemicos (por ejemplo, eventos tromboticos en corazon, cerebro, intestinos o vasculatura periferica, incluyendo infarto de 60 miocardio y accidente cerebrovascular), sepsis, SDRA o sfndrome de disfuncion en multiples organos. El

reclutamiento de las celulas inflamatorias tambien se presenta en placas ateroscleroticas. La inflamacion incluye, pero no se limita a, linfoma no Hodgkin, granulomatosis de Wegener, tiroiditis de Hashimoto, carcinoma hepatocelular, atrofia del timo, pancreatitis cronica, artritis reumatoide, hiperplasia linfoide reactiva, osteoartritis, colitis ulcerativa, colecistitis aguda, colecistitis cronica, cirrosis, sialadenitis cronica, peritonitis, pancreatitis aguda, 5 pancreatitis cronica, gastritis cronica, adenomiosis, endometriosis, cervicitis aguda, cervicitis cronica, hiperplasia linfoide, esclerosis multiple, hipertrofia secundaria a purpura trombocitopenica idiopatica, neuropatfa de IgA primaria, lupus eritematoso sistemico, psoriasis, enfisema pulmonar, pielonefritis cronica, y cistitis cronica.

Una enfermedad o trastorno cardiovascular incluye aquellos trastornos que pueden causar isquemia o son causados 10 por reperfusion del corazon. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitarse a, aterosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria, miocarditis granulomatosa, miocarditis cronica (no granulomatosa), cardiomiopatfa hipertrofica primaria, enfermedad arterial periferica (EAP), enfermedad vascular periferica, tromboembolismo venoso, embolismo pulmonar, accidente cerebrovascular, angina de pecho, infarto de miocardio, dano tisular cardiovascular provocado por paro cardiaco, dano tisular cardiovascular provocado por bypass cardfaco, choque cardiogeno, y afecciones 15 relacionadas que serfan conocidas por los expertos en la materia o que implican disfuncion de o dano tisular al corazon o la vasculatura, especialmente, aunque sin limitarse a, dano tisular relacionado con la activacion de PON1. Las enfermedades CVS incluyen, aunque sin limitarse a, aterosclerosis, miocarditis granulomatosa, infarto de miocardio, fibrosis miocardica secundaria a enfermedad valvular cardiaca, fibrosis miocardica sin infarto, cardiomiopatfa hipertrofica primaria, y miocarditis cronica (no granulomatosa).

20

Una "enfermedad o trastorno metabolico" se refiere a una gran variedad de enfermedades y trastornos en el sistema endocrino que incluye, por ejemplo, resistencia a la insulina, diabetes, obesidad, alteraciones de la tolerancia a la glucosa, niveles altos de colesterol en sangre, hiperglucemia, hiperinsulinemia, dislipidemia e hiperlipidemia.

25 Ejemplos de enfermedades o trastornos asociados con el estres oxidativo incluyen, pero no se limitan a, ateroesclerosis, enfermedad de Parkinson, fallo cardfaco, infarto de miocardio, enfermedad de Alzheimer, sfndrome de fatiga cronica, Esclerosis Lateral Amiotrofica (ELA), Enfermedad Pulmonar Obstructiva Cronica (EPOC), esclerosis multiple, trastornos o enfermedades hepaticas, trastornos o enfermedades gastrointestinales, diabetes, cancer, autoinmunidad, enfermedades o trastornos relacionados con la inmunidad, enfermedades o trastornos 30 neurologicos, enfermedades o trastornos neurodegenerativos, reparacion de nervios y paralisis, diferenciacion neuroendocrina, enfermedades inflamatorias, enfermedades o trastornos musculares, enfermedades o trastornos asociados con organismos infecciosos, y similares.

Composiciones y moleculas de polinucleotidos y oligonucleotidos

35

Dianas: En un aspecto, las dianas comprenden secuencias de acido nucleico de Paraoxonasa 1 (PON1), incluyendo sin limitacion secuencias no codificantes y/o codificantes, sentido y/o antisentido asociadas con PON1.

La familia paraoxonasa consiste en tres miembros (PON1, PON2 y PON3) que comparten propiedades estructurales 40 y actividades enzimaticas, entre las que se encuentra la capacidad de hidrolizar lfpidos oxidados en el LDL. No esta clara la funcion exacta de los diferentes miembros de la familia, aunque su conservacion, por los diferentes miembros individuales de la familia entre las especies, puede indicar que existe una fuerte presion evolutiva para preservar estas diferencias funcionales.

45 La paraoxonasa (PON) es una protefna secretada por el hfgado que se encuentra principalmente en el suero. Su nombre deriva de su capacidad para hidrolizar el organofosfato paraoxon in vivo. Existen 3 formas alelicas conocidas de paN. La paraoxonasa/arilesterasa del suero (PaN-I) es una residuo 354 4345 kDa A-esterasa asociado con HDL. Es bien conocida su implicacion en la hidrolisis de varios insecticidas de organofosfatos. Las PON2 y PON3 son variantes alelicas conocidas que poseen secuencias similares.

50

Algunos estudios de poblacion humana han revelado vfnculos importantes entre los polimorfismos comunes del gen PONI y la arteriopatfa coronaria (AC). Ademas, el PONI posee la capacidad de destruir ciertos fosfolfpidos oxidados proinflamatorios encontrados en el LDL oxidado. En este caso, tampoco ha habido ningun aislamiento del mecanismo salvo para sugerir que la paraoxonasa puede estar implicada en el.

55

En estudios geneticos con ratones, el ARNm de PONI y los niveles de protefna tienen una relacion inversa al tamano de la lesion aortica. La actividad de PONI pueden tener alguna relacion con los niveles de HDL y AC observados en estudios de poblacion.

60 La hipercolesterolemia familiar es un trastorno genetico que produce niveles cronicos altos de colesterol en suero,

incluso en HDL y LDL. El trastorno tambien se caracteriza por un defecto del receptor de LDL. Es autosomico dominante con una ocurrencia estimada de 1 homozigoto por millon de poblacion. El receptor LDL normalmente participa en la absorcion y subsiguiente eliminacion de LDL mediante hepatocitos. La acumulacion de LDL en estos pacientes es resultado del 5

defecto del receptor de LDL. Hay poblaciones definidas de alta incidencia debido al efecto fundador, los francocanadienses son el ejemplo mas conocido. Los heterozigotos desarrollan xantomas a los 20-30 anos de edad con enfermedad cardfaca aterosclerotica, a los 40-50 anos en hombres y a los 50-60 anos en mujeres. Los homozigotos normalmente no sobreviven mas alla de los cuarenta, debido a infartos cardfacos causados por una 10 acumulacion excesiva de la placa. Tienen un colesterol total entre 500 y 1000 mg/dl, desarrollan xantomas a los 6 anos y enfermedades coronarias arteriales sintomaticas a los 10 anos.

El tratamiento de pacientes con deficiencia de receptor LDL es problematico. Los homocigotos no responden a inhibidores de HMG-CoA reductasa (no tienen receptores LDL funcionales para regular positivamente), y los 15 heterozigotos responden con la mitad de la eficiencia que los normales. La niacina es efectiva para reducir el LDL, pero es poco tolerable. El tratamiento no farmacologico incluye la plasmaferesis semanal, la derivacion (bypass) ileal parcial, derivaciones proto-cava y transplantes de hfgado.

En aspectos preferidos, se usan oligonucleotidos antisentido para prevenir o tratar enfermedades o trastornos 20 asociados con los miembros de la familia de PON1. Las enfermedades y trastornos mediados por la Paraoxonasa 1 ejemplar (PON1) pueden tratarse con celulas/tejidos regenerados a partir de celulas madre obtenidas mediante el uso de compuestos antisentido que comprende: una enfermedad o trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno metabolico (p.ej.: diabetes, obesidad, hipercolesterolemia, etc.), presion arterial alta, aterosclerosis, una enfermedad o trastorno aterogenico, enfermedad cardiaca coronaria, estres oxidativo, una enfermedad o trastorno 25 neurologico, trastorno autista/del espectro autista, epilepsia, cancer, inflamacion, accidente cerebrovascular, traumatismo, una enfermedad renal, artritis reumatoide, enfermedad del ojo de pez, purpura, sfndrome de ovario poliqufstico, hipertiroidismo, enfermedades hepaticas, demencia vascular, una enfermedad infecciosa (p.ej.: durante la respuesta de una fase aguda), estres inducido por exposicion a varios compuestos exogenos como puedan ser productos qufmicos medioambientales (p.ej.: metales como, cobalto, cadmio, niquel, cinc, cobre, bario, lantano, 30 mercurios; acido dicloroacetico, tetraclorido de carbono), farmacos (p.ej.: antagonistas muscarfnicos colinergicos, pravastatina, simastatina, fluvastatina, alcohol); envejecimiento y senescencia.

En un aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido de PON1 se usan terapeuticamente en el transplante de organos (p.ej.: transplante de hfgado, transplante de rinon, transplante de medula osea, transplante de corazon, 35 etc.).

En un ejemplo de prevencion de tratamiento de enfermedades del rinon, un aumento en la expresion o funcion del PON1 en un paciente poseerfa un gran valor terapeutico para el tratamiento o prevencion de enfermedades renales. En un aspecto preferido, al menos un oligonucleotido antisentido es administrado al paciente. Las celulas epiteliales 40 tubulares proximales (PTEC) cumplen un papel central en la respuesta del rinon para atacar mediante su produccion de quimiocinas y citocinas que indican una respuesta inflamatoria. La protefna-7 morfogenica osea (BMP-7/OP-1) reduce la infiltracion de macrofagos y dano tisular en modelos animales de fallos renales cronicos y agudos. El PON1 reprime la expresion basal y estimulada por TNF-a de las citocinas proinflamatorias IL-6 y IL-1p, las quimiocinas MCP-1 y IL-8, y la endotelina-2 (ET-2) vasoconstrictora en las PTEC.

45

En un ejemplo de prevencion o tratamiento de la obesidad, los oligonucleotidos antisentido se administran a un sujeto con necesidad de dicho tratamiento o prevencion. El tejido adiposo es central en la regulacion del equilibrio energetico Hay dos tipos de grasa funcionalmente diferentes en los mamfferos: tejido adiposo blanco, el sitio principal de almacenamiento del triglicerido, y tejido adiposo marron, que esta especializado en el consumo de 50 energfa y puede luchar contra la obesidad. Los factores que especifican la funcion y el destino del desarrollo tanto del tejido adiposo blanco como del marron permanecen vagamente comprensibles. Sin embargo, algunos miembros de la familia de las protefnas morfogenicas oseas (BMP) permiten la diferenciacion adiposa blanca, el PON1 promueve, de forma singular, la diferenciacion de preadipocitos marrones incluso en ausencia del coctel de induccion hormonal normalmente necesario. El PON1 activa un programa completo de adipogenesis marron que 55 incluye induccion de reguladores precoces del destino de la grasa marron, la protefna PRDM16 (dominio PR que contiene 16) y PGC-1 (coactivador del peroxisoma proliferador activado del receptor (PPAR) -1), expresion aumentada de la protefna desacoplante 1 del marcador definidor de grasa marron (UCP1) y los factores de transcripcion adipogenica PPAR y las protefnas de union al potenciador/CCAAT (C/EBPs), e induccion de la biogenesis mitocondrial a traves de la cinasa de la protefna activada por mitogeno (MAP) p38 (tambien conocida por 60 Mapk14) y las vfas dependientes de PGC-1. Ademas, PON1 desencadena la participacion de celulas progenitoras

mesenquimatosas para un linaje adipocito marron.

En aspectos preferidos, las administraciones de uno o mas oligonucleotidos antisentido promueve la diferenciacion de adipocitos y la termogenesis in vivo e in vitro, y previene o trata la obesidad.

5

En otro aspecto preferido, la administracion de uno o mas oligonucleotidos antisentido de PON1, previene, trata y/o mantiene el peso de un sujeto dentro de los parametros normales.

En otro aspecto preferido, el PON1 se administra a las celulas madre. Estas pueden tener cualquier origen y usarse 10 en terapeutica con celulas madre. Por ejemplo, se pueden recolectar las celulas madre de un paciente, cultivadas ex-vivo, y tras ponerlas en contacto con uno o mas nucleotidos antisentido de PON1, se expandiran y se reinfundiran de nuevo en el paciente. Las celulas madre pueden ser embrionicas, derivadas de la medula osea, pluripotentes, etc.

15 En otro aspecto preferido, la administracion de uno o mas oligonucleotidos antisentido de PON1 previene o trata las enfermedades del hfgado, mejorando la regeneracion y funcion del mismo. Tal y como se ha mencionado anteriormente, el PON1 es una citocina multifuncional que media en el crecimiento y la diferenciacion de muchos tipos diferentes de celulas. Entre sus varias funciones durante el desarrollo, el PON1 media en la germinacion de brotes del hfgado a partir del endodermo del intestino anterior central, que finalmente da lugar a hepatocitos. En 20 adultos, el PON1 es principalmente producido por el rinon y el hueso. El PON1 circula por la sangre con un intervalo de concentracion de 100-300 pg/m.

En adultos normales, los hepatocitos poseen un fenotipo quiescente y altamente diferenciado y pocas veces se dividen en los hfgados humanos o animales. Sin embargo, su capacidad innata para replicarse no se pierde y es 25 activada oportunamente despues de la reseccion del hfgado o en lesiones agudas del hfgado debidas a productos qufmicos o virus. Si la perdida del parenquima funcional hepatico no alcanza un nivel crftico, el hfgado puede regenerar completamente su masa funcional. Sin embargo, si el numero de hepatocitos viables decae por debajo de un nivel crftico, el hfgado (fallo hepatico agudo); es decir su capacidad regenerativa, no podra recuperarse de la perdida aguda de masa hepatica. A este respecto, el fallo hepatico agudo, definido por la incidencia de encefalopatfa 30 hepatica (debida a la perdida de las funciones metabolicas y sinteticas del hfgado), provoca una importante mortalidad (40-80%) y los organos donantes son todavfa muy limitados para el transplante ortotopico y curativo de hfgado.

En otro aspecto preferido, la administracion de uno o mas oligonucleotidos antisentido de PON1 trata o previene 35 contra el dano en las celulas hepaticas, asf como en los tejidos y el mismo hfgado.

En otro aspecto preferido, la administracion de uno o mas oligonucleotidos antisentido de PON1 protege, previene o trata las enfermedades del hfgado o los trastornos asociados con ellas. Las enfermedades o trastornos del hfgado pueden identificarse o diagnosticarse mediante cualquier test, como por ejemplo, los tests de funcion hepatica que 40 miden la albumina, la antitripsina alfa-1, los valores ALP, ALT y AST, la gamma-glutamil transpeptidasa (GGT), el tiempo de protrombina, el nivel de bilirrubina serica, las enzimas de bilirrubina en la orina, y similares.

En un aspecto preferido, los oligonucleotidos son especfficos para polinucleotidos de PON1, lo que incluye, sin limitacion regiones no codificantes. Las dianas de PON1 comprenden variantes de PON1; mutantes de PON1, 45 incluyendo SNP; secuencias no codificantes de PON1; alelos, fragmentos y similares. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula de ARN antisentido.

De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no esta limitada a polinucleotidos de PON1 en solitario, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos, regiones no 50 codificantes y similares de PON1.

En otro aspecto preferido, un oligonucleotido esta dirigido a una secuencia antisentido natural (antisentido natural a las regiones codificantes y no codificantes) de dianas de PON1, incluyendo, sin limitacion, variantes, alelos, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a estos. Preferentemente el 55 oligonucleotido es una molecula de ARN o ADN antisentido.

En otro aspecto preferido, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion tambien incluyen variantes en las que una base diferente esta presente en una o mas de las posiciones de nucleotido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina, citidina u otros 60 nucleotidos naturales o no naturales en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones del

compuesto antisentido. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.

En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y 5 la diana, es de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 60%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias 10 o complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100%.

Un compuesto antisentido es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto al acido nucleico diana 15 interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para producir una perdida de actividad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias de acidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea la union especffica. Dichas condiciones incluyen, es decir, condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro..

20

Un compuesto antisentido, ya sea ADN, ARN, quimerico, sustituido, etc., es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto a la molecula de ADN o de ARN diana interfiere en la funcion normal del ADN o ARN diana para producir una perdida de utilidad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la union 25 especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.

En otro aspecto preferido, la eleccion como diana del PON1, incluyendo sin limitacion, secuencias antisentido que se identifican y se expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridacion etc., una o mas de las secuencias expuestas como 30 las SEQ ID NO: 2, y similares, modulan la expresion o funcion de PON1. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada positivamente en comparacion con un control. En otro aspecto preferido, la expresion o funcion esta regulada negativamente en comparacion con un control.

En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 3 a 7 35 incluyendo secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando, por ejemplo PCR, hibridacion, etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto preferido, los nucleotidos comprenden un derivado de fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o de analogo de 40 azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion en nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos, tambien es en sf conocida y no es necesario describirla aquf.

45 La especificidad y sensibilidad de antisentido tambien es empleada por los expertos en la materia para usos terapeuticos. Se han empleado oligonucleotidos antisentido como restos terapeuticos en el tratamiento de patologfas en animales y el ser humano. Los oligonucleotidos antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clfnicos estan actualmente en marcha. De este modo, se establece que los oligonucleotidos pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse para ser utiles en regfmenes 50 de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

En aspectos de la presente divulgacion, los compuestos antisentido oligomericos, particularmente oligonucleotidos, se unen a moleculas de acidos nucleicos diana y modulan la expresion y/o funcion de moleculas codificadas por un gen diana. Las funciones de ADN con las que interferiran comprenden, por ejemplo, replicacion y transcripcion. Las 55 funciones de ARN con las que interferiran comprenden todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocalizacion del ARN al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna desde ARN, splicing del ARN para dar una o mas especies de ARNm, y actividad catalftica que puede acoplarse en o facilitarse por el ARN. Las funciones pueden regularse positivamente o inhibirse dependiendo de las funciones deseadas.

60 Los compuestos antisentido incluyen compuestos antisentido oligomericos, oligonucleotidos antisentido,

oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), agentes de splicing alterno, cebadores, sondas, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. Por lo tanto, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.

5

El direccionamiento de un compuesto antisentido a una molecula de acido nucleico particular, en el contexto de esta divulgacion, puede ser un proceso multietapa. El proceso normalmente empieza con la identificacion de un acido nucleico diana cuya funcion va a modularse. Este acido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresion esta asociada a un trastorno o patologfa particular, o una molecula de 10 acido nucleico de un agente infeccioso. En la presente divulgacion, el acido nucleico diana codifica para la Paraoxonasa 1 (PON1).

El proceso de direccionamiento normalmente tambien incluye la determinacion de al menos una region diana, segmento, o sitio dentro del acido nucleico diana para que la interaccion antisentido se produzca de forma que 15 resulte el efecto deseado, por ejemplo, la modulacion de la expresion. Dentro del contexto de la presente divulgacion, el termino "region" se define como una parte del acido nucleico diana que tiene al menos una estructura, funcion o caracterfstica identificable. Dentro de las regiones de acidos nucleicos diana estan segmentos. Los "segmentos" se definen como partes mas pequenas o sub-partes de regiones dentro de un acido nucleico diana. "Sitios", tal como se usa en la presente divulgacion, se define como posiciones dentro de un acido nucleico diana.

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En un aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a las secuencias antisentido naturales de Paraoxonasa 1 (PON1) y modulan la expresion y/o funcion de la Paraoxonasa 1 (PON1) (SEQ ID NO: 1). Los ejemplos de secuencias antisentido incluyen las sEq ID NO: 2 al 7.

25 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a uno o mas segmentos de los polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1) y modulan la expresion y/o funcion de la Paraoxonasa 1 (PON1). Los segmentos comprenden al menos cinco nucleotidos consecutivos de los polinucleotidos sentido o antisentido de la Paraoxonasa 1 (PON1).

30 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido son especfficos para secuencias antisentido naturales de Paraoxonasa 1 (PON1) donde la union de los oligonucleotidos a las secuencias antisentido naturales de Paraoxonasa 1 (PON1) modulan la expresion y/o la funcion de la Paraoxonasa 1 (PON1).

En otro aspecto preferido, los compuestos de oligonucleotido comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID 35 NO: 3 a 7, secuencias antisentido que se identifican y expanden usando, por ejemplo, PCR, hibridacion etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto preferido, los nucleotidos comprenden un derivado de fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o de analogo de 40 azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion en nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos, tambien es en si conocida y no es necesario describirla aquf.

45 Ya que, tal como se conoce en la tecnica, el codon de iniciacion de la traduccion normalmente es 5'-AUG (en moleculas de ARNm transcrito; 5'-ATG en la molecula de ADN correspondiente), el codon de iniciacion de la traduccion tambien se denomina el "codon AUG", el "codon de iniciacion" o el "codon de iniciacion AUG". Una minorfa de genes tiene un codon de iniciacion de la traduccion que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'- CUG; y se ha demostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. De este modo, las expresiones "codon de 50 iniciacion de la traduccion" y "codon de iniciacion" pueden englobar muchas secuencias de codon, aun cuando el aminoacido iniciador en cada caso normalmente sea metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). Los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o mas codones de iniciacion alternativos, uno cualquiera de los cuales puede utilizarse preferencialmente para la iniciacion de la traduccion en un tipo particular de celula o tejido, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la divulgacion, "codon de iniciacion" y "codon de 55 iniciacion de la traduccion" se refieren al codon o codones que se usan in vivo para iniciar la traduccion de un ARNm transcrito de un gen que codifica para la Paraoxonasa 1 (PON1), a pesar de la(s) secuencia(s) de dichos codones. Un codon de terminacion de la traduccion (o "codon de terminacion") de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente).

Las expresiones "region de codon de iniciacion" y "region de codon de iniciacion de la traduccion" se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de iniciacion de la traduccion. Analogamente, las expresiones "region de codon de terminacion" y "region de codon de terminacion de la traduccion" se refieren a una parte de 5 dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de terminacion de la traduccion. Por consiguiente, la "region de codon de iniciacion" (o "region de codon de iniciacion de la traduccion") y la "region de codon de terminacion" (o "region de codon de terminacion de la traduccion") son todas las regiones que pueden ser eficazmente elegidas como diana con los compuestos antisentido de la presente divulgacion.

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El marco de lectura abierto (ORF) o "region codificante", que se conoce en la tecnica para referirse a la region entre el codon de iniciacion de la traduccion y el codon de terminacion de la traduccion, tambien es una region que puede ser eficazmente elegida como diana. Dentro del contexto de la presente divulgacion, una region elegida como diana es la region intragenica que engloba el codon de iniciacion o de terminacion de la traduccion del marco de lectura 15 abierto (ORF) de un gen.

Otra region diana incluye la region no traducida 5' (5'UTR), conocida en la tecnica para referirse a la parte de un ARNm en la direccion 5' desde el codon de iniciacion de la traduccion, y que incluye, por lo tanto, nucleotidos entre el sitio caperuza 5' (5' cap) y el codon de iniciacion de la traduccion de un ARNm (o nucleotidos correspondientes en 20 el gen). Otra region diana mas incluye la region no traducida 3' (3'UTR), conocida en la tecnica para referirse a la parte de un ARNm en la direccion 3' desde el codon de terminacion de la traduccion, y que incluye, por lo tanto, nucleotidos entre el codon de terminacion de la traduccion y el extremo 3' de un ARNm (o nucleotidos correspondientes en el gen). El sitio caperuza 5' de un ARNm comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo mas 5' del ARNm mediante un enlace trifosfato 5'-5'. La region caperuza 5' de un ARNm se 25 considera que incluye la propia estructura caperuza 5', ademas de los primeros 50 nucleotidos adyacentes al sitio caperuza. Otra region diana para esta divulgacion es la region caperuza 5'.

Aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o mas regiones, conocidas como "intrones", que se escinden de un transcrito antes de que se traduzca. Las regiones restantes (y, 30 por tanto, traducidas) se conocen como "exones" y se someten a splicing juntas para formar una secuencia de ARNm continua. En un aspecto, la eleccion como diana de sitios de splicing, es decir, empalmes intron-exon o empalmes exon-intron, es particularmente util en situaciones en las que el splicing aberrante participa en la enfermedad, o en las que una produccion en exceso de un producto de splicing particular participa en la enfermedad. Un empalme de fusion aberrante debido a la transposicion o delecion es otro aspecto de un sitio diana. 35 Los ARNm transcritos producidos mediante el proceso de splicing de dos (o mas) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como "transcritos de fusion". Los intrones pueden ser eficazmente elegidos como diana usando compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre-ARNm.

En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a regiones codificantes y/o no codificantes de un 40 polinucleotido diana y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.

En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos antisentido naturales y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.

45 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos sentido y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.

Pueden producirse transcritos de ARN alternativos a partir de la misma region genomica de ADN. Estos transcritos alternativos son generalmente conocidos como "variantes". Mas especfficamente, "variantes de pre-ARNm" son 50 transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico que se diferencian de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico en su posicion de inicio o de parada y contienen tanto secuencia intronica como exonica.

Tras la escision de una o mas regiones de exon o intron, o partes de las mismas durante el splicing, las variantes de pre-ARNm producen "variantes de ARNm" mas pequenas. Por consiguiente, las variantes de ARNm son variantes 55 de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm unica siempre debe producir una variante de ARNm unica como resultado del splicing. Estas variantes de ARNm tambien se conocen como "variantes de splicing alternativas". Si no se produce splicing de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es identica a la variante de ARNm.

60 Las variantes pueden producirse mediante el uso de senales alternativas para la transcripcion de inicio o de parada.

Los Pre-ARNm y ARNm pueden poseer mas de un codon de iniciacion o codon de terminacion. Las variantes que se originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de iniciacion alternativos se conocen como "variantes de inicio alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Aquellos transcritos que usan un codon de terminacion alternativo se conocen como "variantes de parada alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo especffico de variante de 5 parada alternativa es la "variante de poliA", en la que los multiples transcritos producidos resultan de la seleccion

alternativa de una de las "senales de parada de poliA" por la maquinaria de transcripcion, produciendo de este modo

transcritos que terminan en sitios de poliA unicos. Dentro del contexto de la divulgacion, los tipos de variantes descritos en el presente documento tambien son aspectos de acidos nucleicos diana.

10 Las ubicaciones en el acido nucleico diana con las que los compuestos antisentido hibridan se definen como al menos una parte de 5 nucleotidos de longitud de una region diana a la que se dirige un compuesto antisentido activo.

Aunque las secuencias especfficas de ciertos segmentos diana a modo de ejemplo se exponen en el presente

15 documento, un experto en la materia reconocera que estas sirven para ilustrar y describir aspectos particulares

dentro del alcance de la presente divulgacion. Segmentos diana adicionales son facilmente identificables por un experto en la materia en vista de esta divulgacion.

Se considera que segmentos diana de 5-100 nucleotidos de longitud que comprenden un tramo de al menos cinco 20 (5) nucleotidos consecutivos seleccionados de dentro de los segmentos diana preferidos ilustrativos tambien son adecuados para el direccionamiento.

Los segmentos diana pueden comprender secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes 25 nucleotidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena arriba del extremo 5' del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). Segmentos diana similarmente preferidos se representan por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 3' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleotidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza 30 inmediatamente cadena abajo del extremo 3' del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). Un experto en la materia armado con los segmentos diana ilustrados en el presente documento sera capaz, sin excesiva experimentacion, de identificar segmentos diana preferidos adicionales.

35 Una vez se han identificado una o mas regiones, segmentos o sitios diana, se eligen compuestos antisentido que son suficientemente complementarios a la diana, es decir, hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado.

En aspectos de la divulgacion, los oligonucleotidos se unen a una cadena antisentido de una diana particular. Los 40 oligonucleotidos tienen al menos 5 nucleotidos de longitud y pueden sintetizarse de manera que cada oligonucleotido se dirija a secuencias solapantes de forma que los oligonucleotidos se sinteticen para cubrir toda la longitud del polinucleotido diana. Las dianas tambien incluyen regiones codificantes, ademas de no codificantes.

En un aspecto, se prefiere dirigirse a acidos nucleicos especfficos por oligonucleotidos antisentido. El 45 direccionamiento de un compuesto antisentido a un acido nucleico particular es un proceso multietapa. El proceso normalmente empieza con la identificacion de una secuencia de acidos nucleicos cuya funcion va a modularse. Esta puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresion esta asociada a un trastorno o patologfa particular, o un polinucleotido no codificante tal como, por ejemplo, ARN no codificante (ARNnc).

50

Los ARN pueden clasificarse en (1) ARN mensajeros (ARNm), que se traducen en protefnas, y (2) ARN no codificantes de protefna (ARNnc). Los ARNnc comprenden microARN, transcritos antisentido y otras unidades transcripcionales (TU) que contienen una alta densidad de codones de terminacion y que carecen de cualquier amplio "marco de lectura abierto". Muchos ARNnc parecen empezar a partir de sitios de iniciacion en regiones no 55 traducidas 3' (3'UTRs) de loci codificantes de protefnas. Los ARNnc son frecuentemente raros y al menos la mitad de los ARNnc que se han secuenciado por el consorcio FANTOM no parecen estar poliadenilados. La mayorfa de los investigadores se han basado, por motivos obvios, en ARNm poliadenilados que se procesan y se exportan al citoplasma. Recientemente, se demostro que el conjunto de ARN nucleares no poliadenilados puede ser muy grande, y que muchos de dichos transcritos surgen de las llamadas regiones intergenicas El mecanismo por el que 60 los ARNnc pueden regular la expresion genica es por apareamiento de bases con transcritos diana. Los ARN que

funcionan por apareamiento de bases pueden agruparse en (1) ARN codificados en cis que estan codificados en la misma ubicacion genetica, pero en la cadena opuesta a los ARN en los que actuan y, por lo tanto, muestran complementariedad perfecta con su diana, y (2) ARN codificados en trans que estan codificados en una ubicacion cromosomica distinta de los ARN en los que actuan y generalmente no presentan potencial de apareamiento de 5 bases perfecto con sus dianas.

Sin desear cenirse a ninguna teorfa, la perturbacion de un polinucleotido antisentido por los oligonucleotidos antisentido descritos en el presente documento puede alterar la expresion de los ARN mensajeros sentido correspondientes. Sin embargo, esta regulacion puede tanto ser discordante (la inactivacion antisentido produce 10 elevacion de ARN mensajero) como concordante (la inactivacion antisentido produce reduccion concomitante de ARN mensajero). En estos casos, los oligonucleotidos antisentido pueden ser dirigidos a partes solapantes o no solapantes del transcrito antisentido que producen su inactivacion o secuestro. El antisentido codificante, ademas de no codificante, puede ser dirigido de una manera identica y que cualquier categorfa es capaz de regular los transcritos sentido correspondientes - tanto de una manera concordante como discordante. Las estrategias que se 15 emplean en identificar nuevos oligonucleotidos para su uso contra una diana pueden basarse en la inactivacion de transcritos de ARN antisentido por oligonucleotidos antisentido o cualquier otro medio de modulacion de la diana deseada.

Estrategia 1: En el caso de regulacion discordante, la inactivacion del transcrito antisentido eleva la expresion del 20 gen convencional (sentido). Si el ultimo gen debe codificar un farmaco diana conocido o supuesto, entonces la inactivacion de su homologo antisentido podrfa imitar posiblemente la accion de un agonista receptor o una enzima estimulante.

Estrategia 2: En el caso de regulacion concordante, podrfan inactivarse de forma concomitante tanto los transcritos 25 antisentido como sentido y asf lograr una reduccion sinergica de la expresion genica (sentido) convencional. Si, por ejemplo, un oligonucleotido antisentido se usa para lograr la inactivacion, entonces esta estrategia puede usarse para aplicar un oligonucleotido antisentido dirigido al transcrito sentido y otro oligonucleotido antisentido al transcrito antisentido correspondiente, o un unico oligonucleotido antisentido energeticamente simetrico que se dirige simultaneamente a transcritos sentido y antisentido solapantes.

30

De acuerdo con la presente divulgacion, los compuestos antisentido incluyen oligonucleotidos antisentido, ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia (iARN) de ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana y modulan su funcion. Por lo tanto, pueden ser ADN, ARN, similares a 35 ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender construcciones tales como, por 40 ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una unica cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleotido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extension del caracter 45 monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleotidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden comprender grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotido seleccionadas, posiciones de azucar o a uno de los enlaces internucleosfdicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de acido nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molecula tipo horquilla auto- 50 complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex. Asf, los dsARN pueden ser completa o parcialmente bicatenarios. Puede lograrse modulacion especffica de la expresion genica por expresion estable de horquillas de dsARN en lfneas celulares transgenicas, sin embargo, en algunos casos, la expresion o funcion genica esta regulada positivamente. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una unica cadena que adopta la forma de una molecula de tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex, las dos 55 cadenas (o regiones formadoras de duplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.

Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden provocar la accion de una o mas enzimas o protefnas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden 60 trabajar mediante mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo

oligonucleotidos) pueden describirse como "similares a ADN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'- desoxiazucares y, generalmente, bases T en vez de U) o "similares a ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-hidroxilazucares o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las helices de acido nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, 5 los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son "similares a ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunos casos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B. En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos deseados o compuestos antisentido comprenden al menos uno de:

10 ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleotidos antisentido quimericos, oligonucleotidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (iARN), ARN interferente pequeno (siRNA); un microARN interferente (miARN); un ARN temporal pequeno (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activacion genica inducida por ARN pequeno (aARN); ARN activantes pequenos (ARNap), o combinaciones de los mismos.

15 Los dsARN tambien pueden activar la expresion genica, un mecanismo que se ha llamado "activacion genica inducida por ARN pequeno" o aARN. Los promotores genicos que se dirigen a dsARN inducen la potente activacion transcripcional de genes asociados. El aARN se demostro en celulas humanas usando dsARN sinteticos, llamados "ARN activantes pequenos" (ARNap). No se sabe actualmente si el aARN esta conservado en otros organismos.

20 Se ha descubierto que el ARN bicatenario pequeno (dsARN), tal como ARN interferente pequeno (siRNA) y microARN (miARN), es el desencadenante de un mecanismo evolutivamente conservado conocido como interferencia de ARN (iARN). La iARN conduce invariablemente al silenciamiento genico mediante la remodelacion de cromatina para suprimir de este modo la transcripcion, degradacion de ARNm complementario, o bloqueo de la traduccion de protefnas. Sin embargo, en los aspectos descritos en detalle en la seccion de ejemplos a continuacion, 25 se muestra que los oligonucleotidos aumentan la expresion y/o funcion de los polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1) y productos codificados por los mismos. Los dsARN tambien pueden actuar como ARN activantes pequenos (ARNap). Sin desear cenirse a ninguna teorfa, direccionando secuencias a promotores genicos, los ARNap induciran la expresion de genes diana en un fenomeno denominado activacion transcripcional inducida por dsARN (aARN).

30 En un aspecto adicional, los "segmentos diana preferidos" identificados en el presente documento pueden emplearse en un cribado para compuestos adicionales que modulan la expresion de polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1). Los "moduladores" son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica para la Paraoxonasa 1 (PON1) y que comprenden al menos una parte de 5 nucleotidos que es complementaria a un segmento diana preferido. El procedimiento de cribado comprende las 35 etapas de poner en contacto un segmento diana preferido de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos sentido o antisentido naturales de la Paraoxonasa 1 (PON1) con uno o mas moduladores candidatos, y seleccionar uno o mas moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1), por ejemplo, las SEQ ID NO: 3 a 7. Una vez que se demuestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, tanto 40 disminuir como aumentar) la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1), el modulador puede entonces emplearse en estudios de investigacion adicionales de la funcion de polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1), o para su uso como un agente de investigacion, diagnostico o terapeutico de acuerdo con la presente divulgacion.

45 El direccionamiento de la secuencia antisentido natural modula p refe rente me nte la funcion del gen diana. Por ejemplo, el gen PON1 (por ejemplo, numero de acceso: NM_000446). En un aspecto preferido, la diana es un polinucleotido antisentido del gen PON1. En un aspecto preferido, un oligonucleotido antisentido se dirige a secuencias sentido y/o antisentido naturales de los polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1) (por ejemplo, numero de acceso: NM_000446), variantes, alelos, isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y 50 secuencias complementarias a los mismos. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido y las dianas incluyen regiones codificantes y no codificantes de polinucleotidos antisentido y/o sentido de PON1.

Los segmentos diana preferidos de la presente divulgacion tambien pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos de la presente divulgacion para formar oligonucleotidos (duplexados) 55 bicatenarios estabilizados.

Se ha demostrado en la materia que dichos restos de oligonucleotido bicatenario modulan la expresion de la diana y regulan la traduccion, ademas del procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Ademas, los restos bicatenarios pueden someterse a modificaciones qufmicas Por ejemplo, se ha demostrado que dichos restos 60 bicatenarios inhiben la diana por la hibridacion clasica de la cadena antisentido del duplex con la diana, produciendo

de este modo la degradacion enzimatica de la diana

En un aspecto preferido, un oligonucleotido antisentido se dirige a polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1) (por ejemplo numero de acceso: NM_000446), variantes, alelos, isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos 5 y secuencias complementarias a los mismos. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.

De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no se limita a la Paraoxonasa 1 (PON1) solo, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos y similares de las moleculas de la Paraoxonasa 1 (PON1).

10

En otro aspecto preferido, un oligonucleotido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleotidos de PON1, por ejemplo, polinucleotidos expuestos como SEQ ID NO: 2, y cualquier variante, alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria a los mismos. Ejemplos de oligonucleotidos antisentido se exponen como las SEQ ID NO: 3 a 7.

15

En un aspecto, los oligonucleotidos son complementarios a, o se unen a, secuencias de acido nucleico de la Paraoxonasa 1 (PON1) antisentido, incluyendo sin limitacion secuencias sentido y/o antisentido no codificantes asociadas con polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1) y modulan la expresion y/o funcion de moleculas de la Paraoxonasa 1 (PON1).

20

En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos son complementarios a, o se unen a, secuencias de acido nucleico del antisentido natural de PON1, expuesto como SEQ ID NO: 2 y modula la expresion y/o la funcion de moleculas de PON1.

25 En un aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden secuencias de al menos 5 nucleotidos consecutivos de las SEQ ID NO: 3 a 7 y modulan la expresion y/o la funcion de moleculas de la Paraoxonasa 1 (PON1).

Las dianas de polinucleotido comprenden PON1, que incluyen miembros de la familia del mismo, variantes del PON1; mutantes del PON1, que incluyen SNP; secuencias no codificantes del PON1; alelos del PON1; variantes de 30 especies, fragmentos y similares. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.

En otro aspecto preferido, el oligonucleotido que se dirige a polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1), comprende: ARN antisentido, ARN de interferencia (iARN), ARN interferente pequeno (siRNA); microARN interferente (miARN); un ARN temporal pequeno (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activacion genica 35 inducida por ARN pequeno (aARN); o, aRn activante pequeno (ARNap).

En otro aspecto preferido, la seleccion como diana de los polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1), por ejemplo, la SEQ ID NO: 2, modula la expresion o funcion de estas dianas. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada positivamente en comparacion con un control. En otro aspecto preferido, la expresion o funcion esta 40 regulada negativamente en comparacion con un control.

En otro aspecto preferido, los compuestos antisentido comprenden secuencias expuestas como SEQ ID NO: 3 a 7. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares.

45

En otro aspecto preferido, las SEQ ID NO: 3 a 7 comprenden uno o mas nucleotidos de LNA.

La modulacion de un acido nucleico diana deseado puede llevarse a cabo de varias formas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, siRNA, etc. Las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos (por ejemplo, 50 ribozimas) son moleculas de acidos nucleicos capaces de catalizar una o mas de diversas reacciones, que incluyen la capacidad para escindir repetidamente otras moleculas de acidos nucleicos separadas en un modo especffico de secuencia de bases de nucleotidos. Dichas moleculas de acidos nucleicos enzimaticos pueden usarse, por ejemplo, para dirigirse practicamente a cualquier transcrito de ARN

55 Debido a su especificidad de secuencia, las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos que se escinden en trans muestran promesa como agentes terapeuticos para enfermedad humana (Usman & McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen y Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037). Las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos pueden disenarse para escindir dianas de ARN especfficas dentro del fondo del ARN celular. Un acontecimiento de escision de este tipo convierte el ARNm en no funcional y anula la expresion de protefnas de 60 ese ARN. De este modo puede inhibirse selectivamente la sfntesis de una protefna asociada a una patologfa.

En general, los acidos nucleicos enzimaticos con actividad de escision de ARN actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union se produce mediante la parte de union de diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. De este modo, 5 el acido nucleico enzimatico se reconoce primero y a continuacion se une a ARN diana mediante apareamiento de bases complementario, y una vez se une al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana. La escision estrategica de dicho ARN diana destruira su capacidad para dirigir la sfntesis de una protefna codificada. Despues de unirse un acido nucleico enzimatico y escindir su aRn diana, se libera de ese ARN para buscar otra diana y puede unirse repetidamente y escindir nuevas dianas.

10

Se han usado varias estrategias como la seleccion in vitro (evolucion) (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 435) para desarrollar nuevos catalizadores de acido nucleico capaces de catalizar diversas reacciones, tales como escision y ligamiento de enlaces fosfodiester y enlaces amida.

15 El desarrollo de ribozimas que son optimas para la actividad catalftica contribuirfa significativamente a cualquier estrategia que empleara ribozimas que escinden ARN con el fin de regular la expresion genica. La ribozima de cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una velocidad catalftica (kcat) de aproximadamente 1 min-1 en presencia de concentraciones saturantes (10 mM) de cofactor de Mg2+. Se ha demostrado que una ribozima de "ligasa de ARN" artificial cataliza la reaccion de auto-modificacion correspondiente con una velocidad de 20 aproximadamente 100 min-1. Ademas, se sabe que ciertas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen brazos de union al sustrato hechos de ADN catalizan la escision de ARN con multiples velocidades de recuperacion que se aproximan a 100 min-1. Finalmente, la sustitucion de un residuo especffico dentro del nucleo catalftico de la cabeza de martillo con ciertos analogos de nucleotido da ribozimas modificadas que muestran una mejora de hasta 10 veces en la velocidad catalftica. Estos descubrimientos demuestran que las ribozimas pueden promover 25 transformaciones qufmicas con velocidades catalfticas que son significativamente superiores a aquellas mostradas in vitro por la mayorfa de las ribozimas que se auto-escinden naturales. Entonces es posible que las estructuras de ciertas ribozimas que se auto-escinden puedan optimizarse para dar la maxima actividad catalftica, o que puedan prepararse motivos de ARN completamente nuevos que muestran velocidades significativamente mas rapidas para la escision de fosfodiester de ARN.

30

La escision intermolecular de un sustrato de ARN por un catalizador de ARN que se ajusta al modelo de "cabeza de martillo" se demostro por primera vez en 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). Se recupero el catalizador de ARN y se hizo reaccionar con multiples moleculas de ARN, demostrando que era verdaderamente catalftico.

35

Se han usado ARN catalfticos disenados basandose en el motivo de "cabeza de martillo" para escindir secuencias diana especfficas haciendo cambios de base apropiados en el ARN catalftico para mantener apareamiento de bases necesarios con las secuencias diana Esto ha permitido el uso del ARN catalftico para escindir secuencias diana especfficas e indica que los ARN catalfticos disenados segun el modelo de "cabeza de martillo" pueden escindir 40 posiblemente ARN de sustrato especffico in vivo.

La interferencia de ARN (iARN) se ha convertido en una poderosa herramienta para modular la expresion genica en mamfferos y celulas de mamffero. Este enfoque requiere la administracion de ARN interferente pequeno (siRNA) bien como el propio ARN o bien como ADN, usando un plasmido de expresion o virus y la secuencia codificante para 45 ARN de horquilla pequeno que se procesa a siRNA. Este sistema permite el eficaz transporte de los pre-siRNA al citoplasma en el que son activos y permiten el uso de promotores regulados y especfficos de tejido para la expresion genica.

En un aspecto preferido, un oligonucleotido o compuesto antisentido comprende un oligomero o polfmero de acido 50 ribonucleico (ARN) y/o acido desoxirribonucleico (ADN), o un mimetico, quimera, analogo u homologo de los mismos. Este termino incluye oligonucleotidos compuestos de nucleotidos de origen natural, azucares y enlaces internucleosfdicos covalentes (esqueleto), ademas de oligonucleotidos que tienen partes no de origen natural que funcionan similarmente. Dichos oligonucleotidos modificados o sustituidos son frecuentemente deseados con respecto a formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captacion celular potenciada, 55 afinidad potenciada por un acido nucleico diana y elevada estabilidad en presencia de nucleasas.

De acuerdo con la presente divulgacion, los oligonucleotidos o "compuestos antisentido" incluyen oligonucleotidos antisentido (por ejemplo, ARN, ADN, mimetico, quimera, analogo u homologo de los mismos), ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia (iARN) de 60 ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, ARNap, ARNa, y otros compuestos oligomericos que

hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana y modulan su funcion. Por lo tanto, pueden ser ADN, ARN, similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los 5 compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender construcciones tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una unica cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o 10 pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleotido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extension del caracter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleotidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden comprender grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotido seleccionadas, posiciones de azucar o a uno de los enlaces internucleosfdicos. Como 15 alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de acido nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molecula tipo horquilla auto- complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulacion especffica de la expresion genica por expresion estable de horquillas de dsARN en lfneas celulares transgenicas Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una unica cadena 20 que adopta la forma de una molecula de tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de duplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.

Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden provocar la accion de una o mas 25 enzimas o protefnas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden trabajar mediante mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo oligonucleotidos) pueden describirse como "similares a ADN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'- desoxiazucares y, generalmente, bases T en vez de U) o "similares a ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-hidroxilazucares o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las helices de acido 30 nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son "similares a ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunos casos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B. En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos deseados o compuestos antisentido comprenden al menos uno de:

35

Los compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion pueden comprender una parte antisentido de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleotidos (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleosidos enlazados) de longitud. Esto se refiere a la longitud de la cadena antisentido o parte del compuesto antisentido. En otras palabras, un compuesto antisentido monocatenario de la divulgacion comprende de 5 a 40 aproximadamente 80 nucleotidos, y un compuesto antisentido bicatenario de la divulgacion (tal como un dsARN, por ejemplo) comprende una cadena sentido y antisentido o parte de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciara que este comprenda partes antisentido de 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,

46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,

45 77, 78, 79 u 80 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias.

En un aspecto, los compuestos antisentido de la divulgacion tienen partes antisentido de 10 a 50 nucleotidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciara que estos integran oligonucleotidos que tienen partes antisentido de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,

50 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias. En

algunos aspectos, los oligonucleotidos tienen 15 nucleotidos de longitud.

En un aspecto, los compuestos antisentido o de oligonucleotido de la divulgacion tienen partes antisentido de 12 o 13 a 30 nucleotidos de longitud. Un experto en la materia apreciara que estos integran compuestos antisentido que 55 tienen partes antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias.

En otro aspecto preferido, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion tambien incluyen variantes en las que una base diferente esta presente en una o mas de las posiciones de nucleotido en el compuesto. Por ejemplo, si 60 el primer nucleotido es una adenosina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina o citidina en

esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones de los compuestos antisentido o de dsARN. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.

5 En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y la diana, es de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de 10 aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100%.

15 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido, como, por ejemplo, las moleculas de acidos nucleicos expuestas en las SEQ ID NO: 2 a 7 comprenden una o mas sustituciones o modificaciones. En un aspecto, los nucleotidos estan sustituidos con acidos nucleicos bloqueados (LNA).

En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos se dirigen a una o mas regiones de las moleculas de acidos nucleicos 20 sentido y/o antisentido de secuencias codificantes y/o no codificantes asociadas a PON1 y las secuencias expuestas como sEq ID NO: 1 y 2. Los oligonucleotidos tambien se dirigen a regiones solapantes de las SEQ ID NO: 1 y 2.

Ciertos oligonucleotidos preferidos de esta divulgacion son oligonucleotidos quimericos. "Oligonucleotidos quimericos" o "quimeras", en el contexto de esta divulgacion, son oligonucleotidos que contienen dos o mas regiones 25 qufmicamente distintas, cada una constituida por al menos un nucleotido. Estos oligonucleotidos normalmente contienen al menos una region de nucleotidos modificados que confiere una o mas propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasas incrementada, captacion en celulas incrementada, afinidad de union por la diana incrementada) y una region que es un sustrato para enzimas capaces de escindir hfbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un 30 duplex de ARN:ADN. La activacion de ARNasa H, por lo tanto, produce la escision del ARN diana, potenciando asf enormemente la eficiencia de la modulacion antisentido de la expresion genica. Por consiguiente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleotidos mas cortos cuando se usan oligonucleotidos quimericos, en comparacion con desoxioligonucleotidos de fosforotioato que hibridan con la misma region diana. La escision del ARN diana puede detectarse rutinariamente por electroforesis en gel y, si fuera necesario, tecnicas de 35 hibridacion de acidos nucleicos asociadas conocidas en la tecnica. En un aspecto preferido, un oligonucleotido quimerico comprende al menos una region modificada para aumentar la afinidad de union de la diana, y, normalmente, una region que actua de sustrato para ARNasa H. La afinidad de un oligonucleotido por su diana (en este caso, un acido nucleico que codifica ras) se determina rutinariamente midiendo la Tm de un par de oligonucleotido/diana, que es la temperatura a la que se disocian el oligonucleotido y la diana; la disociacion se 40 detecta espectrofotometricamente. Cuanto mayor sea la Tm, mayor sera la afinidad del oligonucleotido por la diana.

Se pueden formar compuestos antisentido quimericos de la divulgacion como estructuras compuestas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o mimeticos de oligonucleotidos, tal como se ha descrito anteriormente. Como tales, estos compuestos tambien se han referido en la tecnica como hfbridos o 45 gapmeros. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estas estructuras hfbridas comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU con nos. 5,013,830; 5,149,797; 5, 220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; and 5,700,922 .

En otro aspecto preferido, la region del oligonucleotido que se modifica comprende al menos un nucleotido 50 modificado en la posicion 2' del azucar, de la forma mas preferente un nucleotido modificado con 2'-O-alquilo, 2'-O- alquil-O-alquilo o 2'-fluor. En otros aspectos preferidos, las modificaciones de ARN incluyen modificaciones de 2'- fluor, 2'-amino y 2'-O-metilo en la ribosa de pirimidinas, residuos abasicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Dichas modificaciones se incorporan rutinariamente en oligonucleotidos y se ha demostrado que estos oligonucleotidos tienen una mayor Tm (es decir, mayor afinidad de union a diana) que los 2'-desoxioligonucleotidos 55 contra una diana dada. El efecto de dicha afinidad incrementada es potenciar enormemente la inhibicion por oligonucleotidos de iARN de la expresion genica. La ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de los duplex de ARN:ADN; por lo tanto, la activacion de esta enzima produce la escision del ARN diana, y de este modo puede potenciar enormemente la eficiencia de inhibicion de iARN. La escision del ARN diana puede demostrarse rutinariamente por electroforesis en gel. En otro aspecto preferido, el oligonucleotido quimerico tambien 60 se modifica para potenciar la resistencia a nucleasas. Las celulas contienen diversas exo- y endo-nucleasas que

pueden degradar acidos nucleicos. Se ha demostrado que varias modificaciones de nucleotidos y nucleosidos hacen que el oligonucleotido en el que se incorporan sea mas resistente a la digestion por nucleasa que el oligodesoxinucleotido nativo. La resistencia a nucleasas se mide rutinariamente incubando oligonucleotidos con extractos celulares o soluciones de nucleasa aisladas y midiendo el grado de oligonucleotido intacto que queda con 5 el tiempo, normalmente por electroforesis en gel. Los oligonucleotidos que se han modificado para potenciar su resistencia a nucleasas sobreviven intactos durante mas tiempo que los oligonucleotidos sin modificar. Se ha demostrado que diversas modificaciones de oligonucleotidos potencian o confieren resistencia a nucleasas. Los oligonucleotidos que contienen al menos una modificacion de fosforotioato son actualmente mas preferidos. En algunos casos, las modificaciones de oligonucleotidos que potencian la afinidad de union a diana son, tambien, 10 independientemente, capaces de potenciar la resistencia a nucleasas. Algunas modificaciones deseables pueden encontrarse en De Mesmaeker et al. (1995) Acc. Chem. Res., 28:366-374.

Ejemplos especfficos de algunos oligonucleotidos preferidos concebidos por esta divulgacion incluyen aquellos que comprenden esqueletos modificados, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriesteres, metilfosfonatos, enlaces entre 15 azucares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azucares heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Los mas preferidos son oligonucleotidos con esqueletos de fosforotioato y aquellos con esqueletos de heteroatomo, particularmente esqueletos de CH2 --NH--O-CH2, CH,--N(CH3)--O--CH2 [conocido como un esqueleto de metilen(metilimino) o MMI], CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2-N(CH3)--N (CH3)--CH2 y O-- N(CH3)--CH2--, donde el esqueleto de fosfodiester nativo se representa como O--P--O--CH,). Los esqueletos de amida divulgados por De 20 Mesmaeker et al. (1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374 tambien se prefieren. Tambien se prefieren oligonucleotidos que tienen esqueletos de morfolino (Summerton and Weller, Patente de EE.UU. N°. 5.034.506. En otros aspectos preferidos, tal como el esqueleto de acido nucleico peptfdico (PNA), el esqueleto de fosfodiester del oligonucleotido se sustituye por un esqueleto de poliamida, estando los nucleotidos unidos directamente o indirectamente a los atomos de nitrogeno azo del esqueleto de poliamida (Nielsen y col. Los oligonucleotidos tambien pueden 25 comprender uno o mas restos de azucar sustituidos. Oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)nNH2 o O(CH2)nCH3 en los que n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo C1 a C10 inferior, alcoxialcoxi, alquilo, alcarilo o aralquilo inferior sustituido; CI; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S--, o N-alquilo; O--, S--, o N-alquenilo; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escision 30 de ARN; un grupo reportero; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificacion preferida incluye 2'-metoxietoxi [2'-O-CH2 CH2 OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo)]. Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O--CH3), 2'-propoxi(2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-fluor (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones 35 sobre el oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' y la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucar tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.

Los oligonucleotidos tambien pueden comprender, adicionalmente o como alternativa, modificaciones o sustituciones 40 de nucleobases (frecuentemente denominadas en la tecnica simplemente "base"). Tal como se usa en el presente documento, nucleotidos "no modificados" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados incluyen nucleotidos encontrados solo poco frecuentemente o transitoriamente en acidos nucleicos naturales, por ejemplo, hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me-pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (tambien denominada 5-metil-2'-desoxicitosina y frecuentemente denominada en la 45 tecnica 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, ademas de nucleotidos sinteticos, por ejemplo, 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-deazaguanina, N6(6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina Puede incluirse una base "universal" conocida en la tecnica, por ejemplo, inosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-Me-C incrementan la estabilidad duplex del 50 acido nucleico alrededor de 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y actualmente son las sustituciones base preferidas.

Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad o captacion celular del oligonucleotido. Dichos restos incluyen, 55 pero no se limitan a, restos de lfpido, tales como un resto colesterol, un resto colesterilo, una cadena alifatica, p. ej.: residuos de undecilo o dodecanodiol, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantano acetico. Los oligonucleotidos que comprenden restos lipofilos, y procedimientos para preparar dichos oligonucleotidos, son conocidos en la tecnica, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5,138,045,5,218,105 y 5,459,255.

60 No es necesario que todas las posiciones en un oligonucleotido dado esten uniformemente modificadas, y de hecho

mas de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un unico oligonucleotido o incluso dentro de un unico nucleosido dentro de un oligonucleotido. La presente divulgacion tambien incluye oligonucleotidos que son oligonucleotidos quimericos, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento.

5

En otro aspecto, la molecula de acido nucleico de la presente divulgacion esta conjugada con otro resto que incluye, aunque no se limita a, nucleotidos abasicos, polieter, poliamina, poliamidas, peptidos, hidratos de carbono, lfpido, o compuestos de polihidrocarburo. Los expertos en la materia reconoceran que estas moleculas pueden enlazarse a uno o mas de cualquiera de los nucleotidos que comprenden la molecula de acido nucleico en varias posiciones en 10 el azucar, base o grupo fosfato.

Los oligonucleotidos usados de acuerdo con esta divulgacion pueden prepararse comoda y rutinariamente mediante la tecnica muy conocida de sfntesis en fase solida. Equipo para dichas sfntesis es comercializado por varios proveedores que incluyen Applied Biosystems. Tambien puede emplearse cualquier otro medio para dicha sfntesis; 15 la sfntesis real de los oligonucleotidos esta perfectamente dentro de las aptitudes de un experto en la materia. Tambien es muy conocido usar tecnicas similares para preparar otros oligonucleotidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados. Tambien es muy conocido usar tecnicas similares y amiditos modificados disponibles en el mercado y productos de vidrio de poro controlado (CPG) tales como biotina, fluorescefna, acridina o amiditos modificados con psoraleno y/o CPG (disponible de Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleotidos 20 marcados de forma fluorescente, biotinilados u otros oligonucleotidos modificados tales como oligonucleotidos modificados con colesterol.

De acuerdo con la divulgacion, el uso de modificaciones tales como el uso de monomeros de LNA para potenciar la potencia, especificidad y duracion de la accion y ampliar las vfas de administracion de oligonucleotidos comprende 25 qufmicas actuales tales como MOE, ANA, FANA, PS, etc. Esto puede lograrse al sustituir alguno de los monomeros en los olgonucleotidos actuales por monomeros de LNA. El oligonucleotido modificado con LNA puede tener un tamano similar al compuesto parental o puede ser mas grande o preferentemente mas pequeno. Se prefiere que dichas oligonucleotidos modificados con LNA contengan menos de aproximadamente el 70%, mas preferentemente menos de aproximadamente el 60%, de la manera mas preferente menos de aproximadamente el 50% de 30 monomeros de LNA y que sus tamanos esten entre aproximadamente 5 y 25 nucleotidos, mas preferentemente entre aproximadamente 12 y 20 nucleotidos.

Esqueletos de oligonucleotidos modificados preferidos comprenden, aunque no se limitan a, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, metil y otros alquil fosfonatos que 35 comprenden 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, analogos enlazados en 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida, donde los pares adyacentes de unidades de nucleosidos estan enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'2'. Un acontecimiento de escision tal convierte el ARNm en no funcional y anula la expresion de protefnas de ese 40 ARN.

Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los enlaces anteriores que contienen fosforo comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5, 177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 45 5,405,939; 5,453,496; 5,455, 233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563, 253; 5,571,799; 5,587,361; y 5,625,050.

Esqueletos de oligonucleotido modificados preferidos que no incluyen un atomo de fosforo en ellos tienen esqueletos que se forman por enlaces internucleosfdicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosfdicos de 50 heteroatomo y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o mas enlaces internucleosfdicos heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azucar de un nucleosido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfoxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; 55 esqueletos de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos.

Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los oligoncleosidos comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264, 562; 5, 264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 60 5,596, 086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623, 070; 5,663,312; 5,633,360;

5,677,437; y 5,677,439.

En otros mimeticos de oligonucleotidos preferidos, tanto el azucar como el enlace internucleosfdico, es decir, el esqueleto, de las unidades de nucleotido se sustituyen por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen 5 para la hibridacion con un compuesto de acido nucleico diana apropiado. Dicho compuesto oligomerico, un oligonucleotido mimetico que se ha demostrado que tiene excelente propiedades de hibridacion, se denomina acido nucleico peptfdico (PNA). En compuestos de PNA, el esqueleto de azucar de un oligonucleotido se sustituye por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se unen directamente o indirectamente a atomos de nitrogeno azo de la parte de amida del esqueleto. Las patentes 10 representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de compuestos PNA comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con nos. 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262. Ensenanzas adicionales de compuestos de PNA pueden encontrarse en Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500.

En otro aspecto preferido de la divulgacion, los oligonucleotidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleosidos 15 con esqueletos de heteroatomo, y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-, conocidos como un esqueleto de metileno (metilimino) o MMI, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- y -O-N(CH3)-CH2- CH2- donde el esqueleto de fosfodiester nativo se representa como -O-P-O-CH2- de la patente de EE.UU. n° 5.489.677, citada anteriormente, y los esqueletos de amida de la patente de EE.UU. n° 5.602.240, citada anteriormente. Tambien se prefieren oligonucleotidos que tienen esqueletos de morfolino de la patente de EE.UU. n° 20 5.034.506, citada anteriormente.

Los oligonucleotidos modificados tambien pueden contener uno o mas restos de azucar sustituidos. Oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, So N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C a CO sustituido o sin 25 sustituir o alquenilo y alquinilo C2 a CO. Se prefieren particularmente O(CH2)n OmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2nON(CH2)nCH3)2 en las que n y m pueden ser de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': C a CO, (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3, OCF3, SOcH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, 30 polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escision de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificacion preferida comprende 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE), es decir un grupo alcoxialcoxi. Otra modificacion preferida comprende 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo 35 O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como 2'-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos en el presente documento mas adelante, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (tambien conocido en la tecnica como 2'-O- dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2..

Otras modificaciones preferidas comprenden 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluor 40 (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' o en oligonucleotidos enlazados 2'-5' y la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucar tales como restos ciclobutilo en lugar del azucar pentofuranosilo. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de dichas estructuras de azucar modificadas comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los 45 EE.UU. con nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514, 785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646, 265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920.

Los oligonucleotidos tambien pueden comprender modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente 50 denominadas en la tecnica simplemente "base"). Tal como se usa en el presente documento, nucleotidos "no modificados" o "naturales" comprenden las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados comprenden otros nucleotidos sinteticos y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6- metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados de alquilo de 55 adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6- azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halogeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8- hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halogeno, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilquanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.

Ademas, los nucleotidos comprenden los divulgados en la patente de Estados Unidos n° 3.687.808, aquellos divulgados en 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', paginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellos divulgados por Englisch et al., 'Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, pagina 613, y aquellos divulgados por Sanghvi, Y.S., Capftulo 15, 'Antisense Research and Applications', 5 paginas 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Algunos de estos nucleotidos son particularmente utiles para incrementar la afinidad de union de los compuestos oligomericos de la divulgacion. Estos comprenden pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, que comprenden 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcistosina incrementan la estabilidad del duplex de acido nucleico alrededor de 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. y 10 Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y actualmente son las sustituciones base preferidas, de manera aun mas particular cuando se combinan con modificaciones de azucar de 2'-Ometoxietilo

Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los nucleotidos modificados 15 citados anteriormente, asf como otros nucleotidos modificados, comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con nos. 3,687,808, asf como 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175, 273; 5, 367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,596,091; 5,614,617; 5,750,692, y 5,681,941.

20 Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados, que potencian la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido

Dichos restos comprenden, aunque no se limitan a, restos de lfpido tales como un resto colesterol, acido colico, un tioeter, por ejemplo, hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o 25 undecilo, un fosfolfpido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantano acetico, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estos conjugados de

30 oligonucleotidos comprenden, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU con nos. 4,828,979; 4,948,882;

5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552, 538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124;

5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486, 603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025;

4,762, 779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082, 830; 5,112,963; 5,214,136;

5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5, 245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098;

35 5,371,241, 5,391, 723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5, 565,552; 5,567,810; 5,574,142;

5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599, 928 y 5,688,941.

Descubrimiento de farmacos: Los compuestos de la presente divulgacion tambien pueden aplicarse en las areas del descubrimiento de farmacos y validacion de dianas. La presente divulgacion comprende el uso de los compuestos y 40 segmentos diana preferidos e identificados en el presente documento en un esfuerzo por descubrir farmacos para esclarecer las relaciones que existen entre polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1) y una patologfa, fenotipo o afeccion. Estos procedimientos incluyen detectar o modular los polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1) que comprenden: poner en contacto una muestra, tejido, celula u organismo con los compuestos de la presente divulgacion, medir el nivel de acido nucleico o de protefna de los polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1) y/o un 45 criterio de valoracion fenotfpico o qufmico relacionado en algun momento despues del tratamiento, y opcionalmente: comparar el valor medido con una muestra no tratada o muestra tratada con otro compuesto de la divulgacion. Estos procedimientos tambien pueden realizarse en paralelo o en combinacion con otros experimentos para determinar la funcion de genes desconocidos para el proceso de validacion de dianas o para determinar la validez de un producto genico particular como diana para el tratamiento o prevencion de una enfermedad, afeccion o fenotipo particular.

50

Evaluation de la regulation positiva o inhibition de la expresion genica:

La transferencia de un acido nucleico exogeno a una celula u organismo huesped puede evaluarse detectando directamente la presencia del acido nucleico en la celula u organismo. Dicha deteccion puede lograrse mediante 55 varios procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la presencia del acido nucleico exogeno puede detectarse por Southern blot o por una tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que amplifican especfficamente secuencias de nucleotidos asociadas al acido nucleico. La expresion de los acidos nucleicos exogenos tambien puede medirse usando procedimientos convencionales que incluyen analisis de expresion genica. Por ejemplo, el ARNm producido a partir de un acido nucleico exogeno puede detectarse y 60 cuantificarse usando una Northern blot y PCR con transcripcion inversa (RT-PCR).

La expresion de ARN del acido nucleico exogeno tambien puede detectarse midiendo una actividad enzimatica o una actividad de protema reportera. Por ejemplo, puede medirse la actividad moduladora antisentido indirectamente como una disminucion o aumento en la expresion de acido nucleico diana como una indicacion de que el acido 5 nucleico exogeno esta produciendo el ARN efector. Basandose en conservacion de secuencias, pueden disenarse cebadores y usarse para amplificar regiones codificantes de los genes diana. Inicialmente, la region codificante mas altamente expresada de cada gen puede usarse para construir un gen de control modelo, aunque puede usarse cualquier region codificante o no codificante. Cada gen de control se ensambla insertando cada region codificante entre una region codificante reportera y su senal de poli(A). Estos plasmidos producinan un ARNm con un gen 10 reportero en la parte cadena arriba del gen y una posible diana de iARN en la region no codificante 3'. La eficacia de oligonucleotidos antisentido individuales se ensayana por modulacion del gen reportero. Genes reporteros utiles en los procedimientos de la presente divulgacion incluyen acetohidroxiacido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucuronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), protema verde fluorescente (GFP), protema roja fluorescente (RFP), protema amarilla fluorescente (YFP), protema cian fluorescente 15 (CFP), peroxidasa de rabano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS), y derivados de los mismos. Estan disponibles multiples marcadores de seleccion que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Los procedimientos de determinacion de la modulacion de un gen reportero son muy conocidos en la tecnica, e incluyen, aunque no se limitan a, procedimientos fluorimetricos (por ejemplo, 20 espectroscopfa de fluorescencia, clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), microscopfa de fluorescencia), determinacion de la resistencia a antibioticos.

La expresion de la protema PON1 y del ARNm se pueden valorar usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia y descritos en otra parte en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse inmunoensayos tales 25 como ELISA para medir los niveles de protemas. Estan comercialmente disponibles kits de ensayo ELISA para PON1, por ejemplo de R&D Systems (Minneapolis, MN).

En aspectos, la expresion de PON1 (por ejemplo, ARNm o protema) en una muestra (por ejemplo, celulas o tejidos in vivo o in vitro) tratada usando un oligonucleotido antisentido de la divulgacion se evalua comparando con la 30 expresion de PON1 en una muestra de control. Por ejemplo, la expresion de la protema o acido nucleico puede compararse usando procedimientos conocidos para los expertos en la materia con aquella en una muestra tratada con vector simulado o sin tratar. Como alternativa, la comparacion con una muestra tratada con un oligonucleotido antisentido de control (por ejemplo, una que tiene una secuencia alterada o diferente) puede hacerse dependiendo de la informacion deseada. En otro aspecto, una diferencia en la expresion de la protema o acido nucleico de PON1 35 en una muestra tratada frente a sin tratar puede compararse con la diferencia en la expresion de un acido nucleico diferente (incluyendo cualquier estandar considerado apropiado por el investigador, por ejemplo, un gen de mantenimiento) en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar.

Las diferencias observadas pueden expresarse segun se desee, por ejemplo, en forma de una relacion o fraccion, 40 para su uso en una comparacion con control. En aspectos, el nivel de ARNm o protema de PON1, en una muestra tratada con un oligonucleotido antisentido de la presente divulgacion, disminuye o aumenta de aproximadamente 1,25 veces a aproximadamente 10 veces o mas con respecto a una muestra sin tratar o una muestra tratada con un acido nucleico de control. En aspectos, el nivel de ARNm o protema de PON1 aumenta o disminuye al menos aproximadamente 1,25 veces, al menos aproximadamente 1,3 veces, al menos aproximadamente 1,4 veces, al 45 menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 1,6 veces, al menos aproximadamente 1,7 veces, al menos aproximadamente 1,8 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 5,5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 6,5 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al 50 menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 8,5 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 9,5 veces, o al menos aproximadamente 10 veces o mas.

Kits, reactivos de investigacion, diagnosticos y terapeuti cos

55

Los compuestos de la presente divulgacion pueden utilizarse para diagnostico, agentes terapeuticos y profilaxis, y como reactivos de investigacion y componentes de kits. Ademas, los oligonucleotidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresion genica con exquisita especificidad, son usados frecuentemente por los expertos en la materia para aclarar la funcion de genes particulares o para distinguir entre funciones de diversos miembros de una via 60 biologica.

Para su uso en kits y diagnosticos y en diversos sistemas biologicos, los compuestos de la presente divulgacion, tanto solos como en combinacion con otros compuestos o terapeuticos, son utiles como herramientas en analisis diferenciales y/o combinatorios para aclarar patrones de expresion de una parte o de todo el complemento de genes 5 expresados dentro de celulas y tejidos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "sistema biologico" o "sistema" se define como cualquier organismo, celula, cultivo celular o tejido que expresa, o se ha hecho competente para expresar productos de genes de la Paraoxonasa 1 (PON1). Estos incluyen, aunque no se limitan a, seres humanos, animales transgenicos, 10 celulas, cultivos celulares, tejidos, xenoinjertos, trasplantes y combinaciones de los mismos.

Como un ejemplo no limitante, patrones de expresion dentro de celulas o tejidos tratados con uno o mas compuestos antisentido se comparan con celulas o tejidos de control no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan para niveles diferenciales de expresion genica, ya que estan relacionados, por ejemplo, con 15 asociacion de enfermedad, via de senalizacion, localizacion celular, nivel de expresion, tamano, estructura o funcion de los genes examinados. Estos analisis pueden realizarse en celulas estimuladas o sin estimular y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan los patrones de expresion.

Ejemplos de procedimientos de analisis de la expresion genica conocidos en la tecnica incluyen micromatrices o 20 matrices de ADN, SAGE (analisis en serie de expresion genica), READS (amplificacion por enzimas de restriccion de los ADNc digeridos), TOGA (analisis de expresion genica total), matrices de protefnas y proteomicos, secuenciacion de marca de secuencia expresada (EST), huella de ADN sustractiva (SuRF), clonacion sustractiva, presentacion diferencial (DD), hibridacion genomica comparativa, tecnicas de FISH (hibridacion in situ fluorescente) y procedimientos de espectrometrfa de masas.

25

Los compuestos de la divulgacion son utiles para investigacion y diagnostico, debido a que estos compuestos hibridan con acidos nucleicos que codifican para la Paraoxonasa 1 (PON1). Por ejemplo, los oligonucleotidos que hibridan con dicha eficiencia y en dichas condiciones que se han descrito en el presente documento como moduladores eficaces de la Paraoxonasa 1 (PON1) son cebadores o sondas eficaces en condiciones que favorecen 30 la amplificacion genica o deteccion, respectivamente. Estos cebadores y sondas son utiles en procedimientos que requieren la deteccion especffica de moleculas de acidos nucleicos que codifican para la Paraoxonasa 1 (PON1) y en la amplificacion de dichas moleculas de acidos nucleicos para la deteccion o para su uso en estudios adicionales de la Paraoxonasa 1 (PON1). La hibridacion de los oligonucleotidos antisentido, particularmente los cebadores y sondas, de la divulgacion con un acido nucleico que codifica para la Paraoxonasa 1 (PON1) puede detectarse por 35 medios conocidos en la tecnica. Dichos medios pueden comprender conjugacion de una enzima con el oligonucleotido, radiomarcado del oligonucleotido, o cualquier otro medio de deteccion adecuado. Tambien pueden prepararse kits que usan dichos medios de deteccion para detectar el nivel de la Paraoxonasa 1 (PON2) en una muestra.

40 La especificidad y sensibilidad del antisentido tambien son empleadas por los expertos en la materia para usos terapeuticos. Se han empleado oligonucleotidos antisentido como restos terapeuticos en el tratamiento de patologfas en animales, que incluyen seres humanos. Los farmacos de oligonucleotido antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clfnicos estan actualmente en marcha. De este modo, se establece que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden 45 configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

Para productos terapeuticos, un animal, preferentemente un ser humano, que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresion de polinucleotidos de la Paraoxonasa 1 (PON1), 50 se trata administrando compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion. Por ejemplo, en un aspecto no limitante, los procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal que necesita tratamiento, una cantidad terapeuticamente eficaz del modulador de la Paraoxonasa 1 (PON1). Los moduladores de la Paraoxonasa 1 (PON1) de la presente divulgacion modulan de manera efectiva la actividad de la Paraoxonasa 1 (PON1) o modulan la expresion de la protefna de la Paraoxonasa 1 (PON1). En un aspecto, la actividad o expresion de la Paraoxonasa 1 55 (PON1) en un animal se inhibe aproximadamente el 10% en comparacion con un control. Preferentemente, la actividad o expresion de la Paraoxanasa 1 (PON1) en un animal se inhibe aproximadamente el 30%. Mas preferentemente, la actividad o expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1) en un animal se inhibe el 50% o mas. De este modo, los compuestos oligomericos modulan la expresion del ARNm de la Paraoxanasa 1 (PON1) al menos el 10%, al menos el 50%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al 60 menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el

98%, al menos el 99%, o el 100% en comparacion con un control.

En un aspecto, la actividad o expresion de la Paraoxanasa 1 (PON1) y/o en un animal aumenta aproximadamente el 10% en comparacion con un control. Preferentemente, la actividad o expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1) en un 5 animal aumenta aproximadamente el 30%. Mas preferentemente, la actividad o expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1) en un animal aumenta el 50% o mas. De este modo, los compuestos oligomericos modulan la expresion del ARNm de la Paraoxonasa 1 (PON1) al menos el 10%, al menos el 50%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100% en comparacion con un 10 control.

Por ejemplo, se puede medir la reduccion de la expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1) en suero, sangre, tejido adiposo, hfgado o cualquier otro lfquido corporal, tejido u organo del animal. Preferentemente, las celulas contenidas dentro de dichos lfquidos, tejidos u organos que se analizan contienen una molecula de acido nucleico que codifica 15 peptidos de la Paraoxonasa 1 (PON1) y/o la propia protefna de la Paraoxonasa 1 (PON1).

Los compuestos de la divulgacion pueden utilizarse en composiciones farmaceuticas anadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o vehfculo farmaceuticamente aceptable adecuado. El uso de los compuestos y procedimientos de la divulgacion tambien pueden ser utiles profilacticamente.

20

Conjugados

Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados, que potencian la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido 25 Estos restos o conjugados pueden comprender grupos conjugados covalentemente unidos a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Grupos conjugados de la divulgacion incluyen intercaladores, moleculas reporteras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, polieteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinamicas de oligomeros, y grupos que potencian las propiedades farmacocineticas de oligomeros. Grupos conjugados tfpicos incluyen colesteroles, lfpidos, fosfolfpidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, 30 acridina, fluorescefnas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Grupos que potencian las propiedades farmacodinamicas, en el contexto de esta divulgacion, incluyen grupos que mejoran la captacion, potencian la resistencia a la degradacion y/o fortalecen la hibridacion especffica de secuencia con el acido nucleico diana. Grupos que potencian las propiedades farmacocineticas, en el contexto de esta divulgacion, incluyen grupos que mejoran la captacion, distribucion, metabolismo o eliminacion de los compuestos de la presente divulgacion. Grupos conjugados 35 representativos se describen en la solicitud de patente internacional n°. PCT/US92/09196, depositada el 23 de 1992, y la patente de EE.UU. con No. 6,287,860. Restos conjugados incluyen, aunque no se limitan a, restos de lfpido tales como un resto colesterol, acido colico, un tioeter, por ejemplo, hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolfpido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O- hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido 40 adamantano acetico, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Los oligonucleotidos de la divulgacion tambien pueden conjugarse con principios activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, acido 2,3,5-triyodobenzoico, acido flufenamico, acido folfnico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbiturico, una cefalosporina, un farmaco sulfa, un antidiabetico, un antibacteriano o un 45 antibiotico.

Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estos conjuados de oligonucleotidos incluyen, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con Nos. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124;

50 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025;

4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136;

5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098;

5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142;

5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941.

55

Formulaciones

Los compuestos de la divulgacion tambien pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moleculas, estructuras de molecula o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moleculas 60 dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, topica u otras, para ayudar en la captacion, distribucion y/o

absorcion. Las patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de estas formulaciones de ayuda en la captacion, distribucion y/o absorcion incluyen, pero no se limitan a, las patentes de los EE.UU. con Nos. 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,165; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5,595,756.

Aunque los oligonucleotidos antisentido no necesitan administrate en el contexto de un vector con el fin de modular la expresion y/o funcion de una diana, aspectos de la divulgacion se refieren a construcciones de vector de expresion para la expresion de oligonucleotidos antisentido, que comprende promotores, secuencias de genes 10 promotores hfbridos y poseen una fuerte actividad promotora constitutiva, o una actividad promotora que puede inducirse en el caso deseado.

En un aspecto, la practica de la divulgacion implica administrar al menos uno de los oligonucleotidos antisentido anteriores con un sistema de administracion de acidos nucleicos adecuado. En un aspecto, ese sistema incluye un 15 vector no viral enlazado operativamente al polinucleotido. Ejemplos de dichos vectores no virales incluyen el oligonucleotido solo (por ejemplo, una cualquiera o mas de las SEQ ID NO: 3 a 7) o en combinacion con una formulacion de protefna, polisacarido o lfpido adecuada.

Sistemas de administracion de acidos nucleicos adecuados adicionales incluyen vector viral, normalmente secuencia 20 de al menos uno de un adenovirus, virus asociado a adenovirus (AAV), adenovirus dependiente de cooperador, retrovirus, o complejo de virus hemaglutinante de Japon-liposoma (HVJ). Preferentemente, el vector viral comprende un promotor de eucariota fuerte operativamente enlazado al polinucleotido, por ejemplo, un promotor del citomegalovirus (CMV).

25 Vectores preferidos adicionales incluyen vectores virales, protefnas de fusion y conjugados qufmicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney y virus basados en el HIV. Un vector viral basado en el HIV preferido comprende al menos dos vectores en los que los genes gag y pol son de un genoma del HIV y el gen env es de otro virus. Se prefieren vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de pox tales como vectores de ortopox o avipox, vectores del virus del herpes tales como un vector del virus del herpes simple I (HSV), 30 vectores de adenovirus y vectores de virus adeno-asociados.

Los compuestos antisentido de la divulgacion engloban cualquier sal, ester o sal de dichos esteres farmaceuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administracion a un animal, que incluye un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biologicamente activo o residuo del 35 mismo.

La expresion "sales farmaceuticamente aceptables" se refiere a sales fisiologicamente y farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la divulgacion: es decir, sales que retienen la actividad biologica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicologicos no deseados al mismo. Para oligonucleotidos, ejemplos 40 preferidos de sales farmaceuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860.

La presente divulgacion tambien incluye composiciones y formulaciones farmaceuticas que incluyen los compuestos antisentido de la divulgacion. Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden administrarse en 45 varias formas que dependen de si se desea tratamiento local o sistemico y del area que va a tratarse. La administracion puede ser topica (incluyendo oftalmica y a membranas mucosas que incluyen administracion vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, por inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, que incluye por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o administracion intracraneal, por 50 ejemplo, intratecal o intraventricular.

Para tratar tejidos en el sistema nervioso central, la administracion puede realizarse por, por ejemplo, inyeccion o infusion en el lfquido cefalorraqufdeo. La administracion del ARN antisentido en el lfquido cefalorraqufdeo se describe, por ejemplo, en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. App. Pub. No. 2007/0117772, "Metodos 55 para desacelerar el progreso de la enfermedad en la ELA familiar".

Cuando se pretende que el oligonucleotido antisentido de la presente divulgacion se administre a celulas en el sistema nervioso central, la administracion puede ser con uno o mas agentes capaces de promover la penetracion del oligonucleotido antisentido objeto a traves de la barrera hematoencefalica. La inyeccion puede realizarse, por 60 ejemplo, en la corteza entorrinal o hipocampo. La administracion de factores neurotroficos mediante la

administracion de un vector de adenovirus a neuronas motoras en tejido muscular se describe, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. n°. 6.632.427, "Transferencia genica mediada por vector adenoviral en neuronas motoras medulares". La distribucion de vectores directamente al cerebro, por ejemplo, el cuerpo estriado, el talamo, el hipocampo, o la sustancia negra, se conoce en la tecnica y se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n°.

5 6.756.523, "Vectores de adenovirus para la transferencia de genes extranos en celulas del sistema nervioso central particularmente en el cerebro". La administracion puede ser rapida como mediante inyeccion o realizarse durante un periodo de tiempo como por infusion o administracion lenta de formulaciones de liberacion lenta.

Los oligonucleotidos antisentido objeto tambien puede enlazarse o conjugarse con agentes que proporcionan 10 propiedades farmaceuticas o farmacodinamicas deseables. Por ejemplo, el oligonucleotido antisentido puede acoplarse a cualquier sustancia, conocida en la tecnica para promover la penetracion o transporte a traves de la barrera hematoencefalica, tal como un anticuerpo para el receptor de transferrina, y administrarse mediante inyeccion intravenosa. El compuesto antisentido puede enlazarse con un vector viral, por ejemplo, que hace al compuesto antisentido mas eficaz y/o aumenta el transporte del compuesto antisentido a traves de la barrera 15 hematoencefalica. La rotura osmotica de la barrera hematoencefalica tambien puede llevarse a cabo por, por ejemplo, infusion de azucares que incluyen, aunque no se limitan a, mesoeritritol, xilitol, D(+) galactosa, D(+) lactosa, D(+) xilosa, dulcitol, mioinositol, L(-) fructosa, D(-) manitol, D(+) glucosa, D(+) arabinosa, D(-) arabinosa, celobiosa, D(+) maltosa, D+) rafinosa, L(+) ramnosa, D(+) melibiosa, D(-)ribosa, adonitol, D(+) arabitol, L(-) arabitol, D(+) fucosa, L(-) fucosa, D(-) lixosa, L(+) lixosa y L(-) lixosa, o aminoacidos que incluyen, aunque no se limitan a, 20 glutamina, lisina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, acido glutamico, glicina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina, valina y taurina. Los procedimientos y materiales para potenciar la penetracion de la barrera hematoencefalica se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n° 4.866.042, "Metodo para la distribucion de material genetico a traves de la barrera sangufnea del cerebro," 6.294.520,"Material para el paso a traves de la barrera sangufnea del cerebro" y 6.936.589, "Sistemas de 25 administracion parenteral".

Los compuestos antisentido objeto pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moleculas, estructuras de molecula o mezclas de compuestos, por ejemplo, liposomas, moleculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, topica u otras, para ayudar en la captacion, distribucion y/o absorcion. Por 30 ejemplo, pueden incluirse lfpidos cationicos en la formulacion para facilitar la captacion de oligonucleotidos. Se mostro que una composicion tal que facilitaba la captacion es LIPOFECTIN (disponible de GIBCO-BRL, Bethesda, MD).

Se cree que los oligonucleotidos con al menos una modificacion de 2'-O-metoxietilo son particularmente utiles para 35 administracion por via oral. Composiciones y formulaciones farmaceuticas para administracion topica pueden comprender parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, esprais, lfquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehfculos farmaceuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares. Tambien pueden ser utiles preservativos recubiertos, guantes y similares.

40 Las formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificacion unitaria, pueden prepararse de acuerdo con tecnicas convencionales muy conocidas en la industria farmaceutica. Dichas tecnicas incluyen la etapa de poner en asociacion los principios activos con el (los) vehfculo(s) farmaceutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociacion uniforme e fntimamente los principios activos con vehfculos lfquidos o vehfculos solidos finamente divididos, o ambos, y luego, 45 si fuera necesario, moldeando el producto.

Las composiciones de la presente divulgacion pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificacion posibles tales como, aunque no se limitan a, comprimidos, capsulas, capsulas de gel, jarabes lfquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgacion tambien pueden formularse como 50 suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizantes.

Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion incluyen, aunque no se limitan a, soluciones, 55 emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden comprender uno o mas potenciadores de la penetracion, vehfculos, excipientes u otros principios activos o inactivos.

Las emulsiones normalmente son sistemas heterogeneos de un lfquido dispersado en otro en forma de gotitas que 60 normalmente superan 0,1 pm de diametro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales, ademas de

las fases dispersas, y el farmaco activo que puede estar presente como una solucion en o bien la fase acuosa, fase oleosa o bien el mismo como una fase independiente. Las microemulsiones estan incluidas como un aspecto de la presente divulgacion. Las emulsiones y sus usos son muy conocidos en la tecnica y se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860.

5

Formulaciones de la presente divulgacion incluyen formulaciones liposomales. Tal como se usa en la presente divulgacion, el termino "liposoma" significa una vesfcula compuesta por lfpidos anfifflicos dispuestos en una bicapa o bicapas esfericas. Los liposomas son vesfculas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada por un material lipofilo y un interior acuoso que contiene la composicion que va a administrarse. Los liposomas 10 cationicos son liposomas positivamente cargados que se cree que interaction con moleculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o estan cargados negativamente atrapan el ADN en vez de complejarse con el. Se han usado tanto liposomas cationicos como no cationicos para administrar ADN a celulas.

15 Los liposomas tambien incluyen liposomas "estericamente estabilizados", una expresion que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o mas lfpidos especializados. Cuando se incorporan en liposomas, estos lfpidos especializados producen liposomas con vidas en circulacion mejoradas con respecto a los liposomas que carecen de dichos lfpidos especializados. Ejemplos de liposomas estericamente estabilizados son aquellos en los que parte de la parte de lfpido formado de vesfcula del liposoma comprende uno o 20 mas glucolfpidos o se derivatiza con uno o mas polfmeros hidrofilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860.

Las formulaciones y composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion tambien pueden comprender tensioactivos. El uso de tensioactivos en medicamentos, formulaciones y en emulsiones es muy conocido en la 25 tecnica. Los agentes tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. No. 6,287,860.

En un aspecto, la presente divulgacion emplea diversos potenciadores de la penetracion para efectuar la administracion eficiente de acidos nucleicos, particularmente oligonucleotidos. Ademas de ayudar en la difusion de farmacos no lipofilos a traves de membranas celulares, los potenciadores de la penetracion tambien potencian la 30 permeabilidad de farmacos lipofilos. Los potenciadores de la penetracion pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorfas, es decir, tensioactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los mejoradores de penetracion y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. No. 6,287,860.

35 Un experto en la materia reconocera que las formulaciones se disenan rutinariamente segun su uso previsto, es decir, su via de administracion.

Formulaciones preferidas para administracion topica incluyen aquellas en las que los oligonucleotidos de la divulgacion estan en mezcla con un agente de administracion topica tal como lfpidos, liposomas, acidos grasos, 40 esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Lfpidos y liposomas preferidos incluyen neutros (por ejemplo, dioleoil-fosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DmPc, diestearoilfosfatidilcolina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y cationicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoil-fosfatidiletanolamina DOTMA).

45 Para administracion topica u otra, los oligonucleotidos de la divulgacion pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas cationicos. Como alternativa, los oligonucleotidos pueden estar complejados con lfpidos, en particular con lfpidos cationicos. Acidos grasos y esteres preferidos, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860.

50

Las composiciones y formulaciones para administracion por via oral incluyen polvos o granulos, micropartfculas, nanopartfculas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, capsulas, capsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersion o aglutinantes. Formulaciones orales preferidas son aquellas en las que los 55 oligonucleotidos de la divulgacion se administran conjuntamente con uno o mas potenciadores de la penetracion, tensioactivos y quelantes. Tensioactivos preferidos incluyen acidos grasos y/o esteres o sales de los mismos, acidos biliares y/o sales de los mismos. Acidos biliares/sales y acidos grasos preferidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860. Tambien se prefieren combinaciones de potenciadores de la penetracion, por ejemplo, acidos grasos/sales en combinacion con acidos biliares/sales. Una 60 combinacion particularmente preferida es la sal de sodio de acido laurico, acido caprico y UDCA. Potenciadores de

la penetracion adicionales incluyen eter polioxietilen-9-laurflico, eter polioxietilen-20-cetflico. Los oligonucleotidos de la divulgacion pueden administrate por via oral, en forma granulada que incluye partfculas secadas por pulverizacion, o complejados para formar micro o nanopartfculas. Los agentes complejantes de oligonucleotidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 6,287,860.

5

Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden comprender soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, aunque no se limitan a, potenciadores de la penetracion, compuestos portadores y otros vehfculos o excipientes farmaceuticamente aceptables

10

Ciertos aspectos de la divulgacion proporcionan composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas compuestos oligomericos y uno o mas de otros agentes quimioterapeuticos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Ejemplos de dichos agentes quimioterapeuticos incluyen, aunque no se limitan a, farmacos quimioterapeuticos para el cancer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, 15 esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosido, biscloroetil-nitrosurea, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrogeno, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclo-fosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 520 fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, teniposido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la divulgacion, dichos agentes quimioterapeuticos pueden usarse individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotido), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotido durante un periodo de tiempo seguido de MTX y oligonucleotido), o en combinacion con uno o mas de otros de dichos agentes quimioterapeuticos (por 25 ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleotido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleotido). Farmacos antiinflamatorios, que incluyen, aunque no se limitan a, farmacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y farmacos antivirales, que incluyen, aunque no se limitan a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, tambien pueden combinarse en composiciones de la divulgacion. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros farmacos no antisentido tambien estan dentro del alcance de la presente divulgacion. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados 30 juntos o secuencialmente.

En otro aspecto relacionado, las composiciones de la divulgacion pueden contener uno o mas compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, dirigidos a un primer acido nucleico y uno o mas compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo acido nucleico diana. Por ejemplo, la primera diana puede ser una 35 secuencia antisentido particular de la Paraoxonasa 1 (PON1), y la segunda diana puede ser una region de otra secuencia de nucleotidos. Como alternativa, las composiciones de la divulgacion pueden contener dos o mas compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo acido nucleico diana de la Paraoxonasa 1 (PON1). Se ilustran numerosos ejemplos de compuestos antisentido en el presente documento y otros pueden seleccionarse de entre compuestos adecuados conocidos en la tecnica. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos 40 o secuencialmente.

Dosificacion:

Se cree que la formulacion de composiciones terapeuticas y su posterior administracion (dosificacion) estan dentro 45 de la experiencia de los expertos en la materia. La dosificacion depende de la gravedad y sensibilidad de la patologfa que va a tratarse, durando el ciclo de tratamiento de varios dfas a varios meses, o hasta que se efectue una cura o se logre una disminucion de la patologfa. Pueden calcularse programas de dosificacion optimos a partir de mediciones de acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente. Los expertos pueden determinar facilmente dosificaciones optimas, metodologfas de dosificacion y tasas de repeticion. Las dosificaciones optimas pueden variar 50 dependiendo de la potencia relativa de oligonucleotidos individuales, y generalmente pueden estimarse basandose en las CE50 que se ha descubierto que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificacion es de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una vez o mas diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 anos. Los expertos en la materia pueden estimar facilmente tasas de repeticion para la dosificacion basandose en tiempos de residencia medidos y 55 concentraciones del farmaco en fluidos corporales o tejidos. Tras el tratamiento satisfactorio, puede desearse que el paciente reciba terapia de mantenimiento para prevenir la reaparicion de la patologfa, en el que el oligonucleotido se administra en dosis de mantenimiento, que oscilan de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal, una vez o mas diariamente, a una vez cada 20 anos.

60 En aspectos, un paciente se trata con una dosificacion de farmaco que es al menos aproximadamente 1, al menos

aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos 5 aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Se describen ciertas dosis inyectadas de oligonucleotidos antisentido, por ejemplo, en la patente de EE.Uu. n°. 7.563.884, "Modulacion antisentido de expresion PTP1B".

10 Aunque diversos aspectos de la presente divulgacion se han descrito anteriormente, debe entenderse que se han presentado a modo de ejemplo solamente, y no de limitacion. Pueden realizarse numerosos cambios a los aspectos descritos de acuerdo con la divulgacion en el presente documento sin alejarse del espfritu o alcance de la divulgacion. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente divulgacion no deben estar limitados por ninguno de los aspectos descritos anteriormente.

15

Por su citacion de diversos referencias en este documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia particular sea "tecnica anterior" a su invencion. Realizaciones de composiciones y procedimientos inventivos se ilustran en los siguientes ejemplos.

20 EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la invencion. Se apreciara que variaciones en proporciones y alternativas en elementos de los componentes mostrados seran evidentes para los expertos en la materia y estan dentro del alcance de aspectos de la presente divulgacion.

25

Ejemplo 1: Diseno de oligonucleotidos antisentido especificos para una molecula de acido nucleico antisentido a la Paraoxonasa 1 (PON1) y/o una cadena sentido de polinucleotido de la Paraoxonasa 1 (PON1)

Tal como se ha indicado anteriormente, la expresion “oligonucleotido especffico para” o “dianas de oligonucleotido” 30 se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana.

La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se facilita usando programas informaticos que alinean 35 automaticamente secuencias de acido nucleico e indican regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se usan para comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acidos nucleicos de un intervalo de especies permite la seleccion de secuencias de acidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para 40 permitir una determinacion del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando Southern blots a grados de astringencia variables, tal como es muy conocido en la tecnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de acido nucleico correspondientes en otras especies. Un experto en la 45 materia se dara cuenta de que hay libertad considerable en la seleccion de regiones apropiadas de genes para su uso en la presente invencion.

Un compuesto antisentido es "especfficamente hibridable" cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para causar una modulacion de la funcion y/o la actividad, y 50 existe un grado de complementariedad suficiente para evitar union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en las que se desea union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.

55 Las propiedades de hibridacion de los oligonucleotidos descritos en el presente documento pueden determinarse por uno o mas ensayos in vitro, tal como se conoce en la tecnica. Por ejemplo, las propiedades de los oligonucleotidos descritos en el presente documento pueden obtenerse por determinacion de la intensidad de union entre el antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco usando el ensayo de la curva de fusion.

60 La intensidad de union entre el antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco (Molecula) puede

estimarse usando cualquiera de los procedimientos establecidos de medicion de la intensidad de interacciones intermoleculares, por ejemplo, un ensayo de la curva de fusion.

El ensayo de la curva de fusion determina la temperatura a la que se produce una rapida transicion de conformacion 5 bicatenaria a monocatenaria para el complejo de antisentido natural/molecula. Esta temperatura es ampliamente aceptada como una medida fiable de la intensidad de interaccion entre las dos moleculas.

Puede realizarse un ensayo de la curva de fusion usando una copia de ADNc de la molecula de ARN antisentido natural real o un nucleotido de ADN o ARN sintetico correspondiente al sitio de union de la molecula. Estan 10 disponibles multiples kits que contienen todos los reactivos necesarios para realizar este ensayo (por ejemplo, kit MeltDoctor de Applied Biosystems lnc.). Estos kits incluyen una solucion tampon adecuada que contiene uno de los colorantes de union a ADN bicatenario (dsADN) (tales como los colorantes aBi HRM, SYBR Green, SYTO, etc.). Las propiedades de los colorantes de dsADN son tales que casi no emiten fluorescencia en forma libre, pero son altamente fluorescentes cuando se unen a dsADN.

15

Para realizar el ensayo, el ADNc o un oligonucleotido correspondiente se mezclan con la molecula en concentraciones definidas por los protocolos del fabricante particulares. La mezcla se calienta a 95°C para disociar todos los complejos de dsADN previamente formados, luego se enfrfa lentamente a temperatura ambiente u otra temperatura menor definida por el fabricante del kit para permitir que se hibriden las moleculas de ADN. Entonces, 20 los complejos recientemente formados se calientan lentamente a 95°C con recopilacion de datos continua simultanea sobre la cantidad de fluorescencia que se produce por la reaccion. La intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a las cantidades de dsADN presentes en la reaccion. Los datos pueden recogerse usando un instrumento de PCR en tiempo real compatible con el kit (por ejemplo, sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus de ABI o el instrumento LightTyper, Roche Diagnostics, Lewes, Reino Unido).

25

Los picos de fusion se construyen representando la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-d(Fluorescencia)/dT) sobre el eje y) contra la temperatura (eje x) usando software apropiado (por ejemplo, LightTyper (Roche) o SDS Dissociation Curve, ABI). Los datos se analizan para identificar la temperatura de la rapida transicion del complejo de dsADN a moleculas monocatenarias. Esta temperatura se llama Tm y es 30 directamente proporcional a la intensidad de la interaccion entre las dos moleculas. Normalmente, la Tm superara los 40°C.

Ejemplo 2: Modulacion de polinucleotidos de PON1

35 Tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos antisentido

Se cultivaron celulas HepG2 de ATCC (n° de cat HB-8065) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone n° de cat SH30024, o Mediatech n° de cat MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech n° de cat MT35- 011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech n° de cat MT30-002-CI)) a 37°C y el 5% de CO2. Un dfa antes del experimento, 40 las celulas volvieron a sembrarse a la densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37°C y con el 5% de CO2. El dfa del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambio a medio de cultivo fresco. Todos los oligonucleotidos antisentido se diluyeron a la concentracion de 20 pM. Se incubaron dos pI de esta solucion con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, n° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con 45 celulas HepG2. Se uso una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la solucion de oligonucleotido para los controles transfectados con vector simulado. Despues de 3-18 horas de incubacion a 37°C y con el 5% de CO2 , el medio se cambio a medio fresco de crecimiento. 48 h despues de la adicion de oligonucleotidos antisentido, el medio se elimino y se extrajo ARN de las celulas usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (n° de cat 74181) siguiendo las instrucciones 50 del fabricante. Se anadieron 600 ng de ARN a la reaccion de transcripcion inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n° de cat AB1453B) o el kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (n° de cat 4368813) tal como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reaccion de transcripcion inversa se uso para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresion genica Taqman de ABI (n° de cat 4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI (ensayo de expresion genica Taqman de Applied 55 Biosystems: Hs00166557_m1 by Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se uso el siguiente ciclo de PCR: 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 ciclos de (95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 min) usando el termociclador Mx4000 (Stratagene).

El cambio de veces en la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido se calculo 60 basandose en la diferente de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural de la Paraoxonasa 1 (PON1) para uso como un compuesto terapeutico, donde el oligonucleotido modula la expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1) y

   5 donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 2.
2. 2. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural de la Paraoxonasa 1 (PON1) para uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a la Paraoxonasa 1 (PON1), donde el oligonucleotido modula la expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1) y donde el transcrito antisentido natural tiene la

   10 secuencia de acido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 2.
3. 3. Uso de un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural de la Paraoxonasa 1 (PON1) para la fabricacion de un medicamento para uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada a la Paraoxonasa 1 (PON1), donde dicho oligonucleotido modula la expresion de la Paraoxonasa

   15 1 (PON1) y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 2.
4. 4. Un uso de acuerdo con la reivindicacion 3, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 2, donde la enfermedad o trastorno se selecciona de un grupo que consiste en una enfermedad o

   20 trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno metabolico (p.ej.: diabetes, obesidad, hipercolesterolemia, etc.), presion arterial alta, aterosclerosis, una enfermedad o trastorno aterogenico, enfermedad cardiaca coronaria, estres oxidativo, una enfermedad o trastorno neurologico, trastorno autista/del espectro autista, epilepsia, cancer, inflamacion, accidente cerebrovascular, traumatismo, una enfermedad renal, artritis reumatoide, enfermedad del ojo de pez, purpura, sfndrome de ovario poliqufstico, hipertiroidismo, enfermedades hepaticas, demencia vascular, una 25 enfermedad infecciosa (p.ej.: durante la respuesta de una fase aguda), estres inducido por exposicion a varios compuestos exogenos como puedan ser productos qufmicos medioambientales (p.ej.: metales como, cobalto, cadmio, niquel, cinc, cobre, bario, lantano, mercurios; acido dicloroacetico, tetraclorido de carbono), farmacos (p.ej.: antagonistas muscarfnicos colinergicos, pravastatina, simastatina, fluvastatina, alcohol).

   30 5. Un procedimiento in vitro de modulacion de la expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1) en celulas o

   tejidos de un paciente que comprende: poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural de la Paraoxonasa 1 (PON1); modulando de este modo la expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1), donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 2.

   35
5. 6. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural de la Paraxonasa 1 (PON1), donde

   el oligonucleotido modula la expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1), donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en la SEQ ID NO: 2 y donde el oligonucleotido comprende ademas una o mas modificaciones que comprenden:

   40

   a. al menos un enlace internucleosfdico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, 2'- O-metoxietilo (MOE), 2'-fluoro, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidata, ester carboximetflico, y combinaciones de los mismos;

   b. al menos un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico (PNA), un acido nucleico 45 bloqueado (LNA), un acido arabino-nucleico, un analogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o

   c. al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado con 2'-O- metoxietilo, un resto de azucar modificado con 2'-metoxi, un resto de azucar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, y combinaciones de los mismos.

   50 7. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, o el oligonucleotido para uso de

   acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4, o el procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicacion 5, o el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 6, donde el oligonucleotido tiene entre 10 y 30 nucleotidos de longitud.

   55 8. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7, o el oligonucleotido para uso

   de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 o el procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicacion 5 o la reivindicacion 7, o el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, donde el oligonucleotido tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con un complemento de un transcrito antisentido natural de la Paraoxonasa 1 (PON1).
6. 9. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 u 8, o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el oligonucleotido es monocatenario.

   5
7. 10. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 u 8, o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el oligonucleotido es un compuesto de siRNA.

   10
8. 11. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 10, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, o 7 a 10 o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 10, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el oligonucleotido comprende al menos una de las SEQ ID NO: 3 a 7.

   15
9. 12. Un uso de acuerdo con la reivindicacion 11, o el oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 11, o el procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicacion 11, o el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 11, donde el oligonucleotido comprende la SEQ ID NO: 3.

   20 13. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 12, o el oligonucleotido para

   uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, o 7 a 12, o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 12, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, donde el oligonucleotido aumenta la expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1).

   25 14. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 13, o el oligonucleotido para

   uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, o 7 a 13 o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 13, o el oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, donde la expresion de la Paraoxonasa 1 (PON1) aumenta, al menos, un 10%.

   30 15. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, o 7 a 14, o el oligonucleotido para

   uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 14, o el procedimiento in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 14, donde el oligonucleotido comprende, ademas, una o mas modificaciones que comprenden

   35 (a) al menos un enlace internucleosfdico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, 2'- O-metoxietilo (MOE), 2'-fluoro, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidata, ester carboximetflico, y combinaciones de los mismos;

   (b) al menos un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico (PNA), un acido nucleico bloqueado (LNA), un acido arabino-nucleico, un analogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o 40 (c) al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado con 2'-O- metoxietilo, un resto de azucar modificado con 2'-metoxi, un resto de azucar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, y combinaciones de los mismos.
10. 16. Una composicion farmaceutica que comprende un oligonucleotido de acuerdo con las reivindicaciones 45 6 a 15, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
11. 17. Un uso de un oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15 en un procedimiento estetico para tratar el envejecimiento y la senescencia.