SI20474A

SI20474A - Novi nukleozidi, ki imajo bicikličen sladkorni del

Info

Publication number: SI20474A
Application number: SI9920038A
Authority: SI
Inventors: Guangyi Wang
Original assignee: Icn Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1998-05-26
Filing date: 1999-05-24
Publication date: 2001-08-31
Also published as: HUP0102152A2; SK17432000A3; WO1999060855A1; NO20005938L; PL344303A1; MXPA00011473A; HRP20000751A2; JP2002516256A; CA2333380A1; AU757724B2; NZ507913A; IL139420A0; US6403566B1; BR9911596A; EP1082012A4; EP1082012A1; ZA200006315B; NO20005938D0; AU4010099A; CN1311630A

Abstract

Tu so opisani konformacijsko omejeni 2',4'-premoščeni analogi nukleozidov. Spojine se lahko pripravijo s ciklizacijo pri C2' in C4' nukleozidov s pomočjo linkerja ali povezujoče molekule. Ti novi nukleozidi imajo zaželeno blokirano sladkorno gubo in so potencialno uporabni kot farmacevtske sestavine. Oligonukleotidi, sestavljeni iz teh novih nukleozidov, so uporabni za oligonukleotidne terapevtske in diagnostične spojine.ŕ

Description

NOVI NUKLEOZIDI, KI IMAJO BICIKLIČEN SLADKORNI DEL

Področje izuma

Področje izuma so analogi nukleozidov in oligonukleotidov in postopki za njihovo pripravo.

Ozadje

Analogi nukleozidov in nukleotidov so se dolgo uporabljali kot farmacevtske sestavine proti različnim virusum in rakom. Sedaj so številni analogi nukleozidov in nukleotidov v kliničnih preiskušnjah za različne bolezni.

V celici se nukleozidi innukleotidifosforilirajoalidaljefosforilirajo v ustrezne nukleozid-trifosfate. Nukleozid-trifosfati služijo kot inhibitorji DNA- ali RNA-polimeraz. Nukleozid-trifosfati se tudi lahko vključujejo v DNA ali RNA, kar moti pri raztegovaju DNA ali RNA.

Aktivni analogi nukleozidov se običajno v tarčni celici z lahkoto fosforilirajo. Ustrezni nukleozidtrifosfati imajo visoko afiniteto do katalitskih mest polimeraz in tekmujejo z naravnimi nukleozidtrifosfati kot substrat polimeraz.

Določeni analogi nukleozidov delujejo na nukleozidnem ali monofosfatnem nivoja Ena skupina mnogo obetajočih analogov nukleozidov so nukleozidi s konformacijsko blokiranimi (v angl. orig.: locked) sladkornimi deli. Bilo je opisano, da so določeni konformacijsko blokirani karbociklični analogi nukleozidov kazali močno aktivnost proti HCMV, HSV in EBV (Siddiqui et al. Nucleosides Nucleotides 1996,15, 235-250; Marquez et al. J. Med. Chem. 1996, 39, 37393747). Za konformacijsko blokiran karbociklični AZT 5'-trifosfat so poročali, daje enako močan inhibitor reverzne transkriptaze HlV-a (Marquez et al. J. Am. Chem. Soc. 1998,120, 27802789). Pripravljeni so bili tudi drugi nukleozidi z bicikličnimi sladkornimi deli, čeprav ni bila

-2ugotovljena ali opisana nikakršna aktivnost (Chao et al. Tetrahedron 1997, 53, 1957-1970; Okabe et al. Tetrahedron Lett. 1989,30,2203-2206, Hong, et al. Tetrahedron Lett. 1998,39, 225-228).

Pričakuje se, da imajo koristni konformacijsko blokirani nukleozidi pozitiven vpliv na protismeme (v angl. orig.: antisense) oligonukloetide. Oligonukleotide kot možna protismema zdravila so identificirali in preiskovali v teku dveh desetletij. Oligonukleotidi so sposobni tvogenja dvojne ah trojne vij ačnice s komplementarno DNA ali RNA in imaj o sposobnost cilj anj a specifičnih zaporedij v virusnem ali rakovem genomu. Specifična vezava oligonukleotidov na zanimive DNA- ah RNAtarče bi inaktivizirala funkcijo, povezano z DNA ali RNA, kot na primer replikacija, transkripcija in translacija. Zato se virusni ciklusi ah kancerozni procesi lahko prekinejo, medtem ko normalni celični ciklusi niso prizadeti.

Ker so naravni oligonukleotidi labilni proti celičnim in zunajceličnim nukleazam, je bilo narejenih veliko poskusov za raziskovanje modifikacij nukleotidov, posebno tistih modifikacij, ki so usmegene k izboljšanju rezistence za nukleaze in afinitete za vezavo. Za oligonukleotide, ki vsebujejo določene bicikličnenukleozide,jebilodokazano, da kažejo izboljšano stabilnost zanukleaze(Leumannetal. Bioorg. Med. Chem. Letts. 1995,5,1231-4; Altmann et al. Tetrahedron Lett. 1994,35, 23312334,7625-7628). Nedavno so bili sintetizirani in v oligonukleotide vključeni 2'-O,4'-C-metilen ribonukleozidi, ki imajo blokirano 3'-endo sladkorno gubo (v angl. orig.: pucker). Raziskovanja hibridizacije dokazujejo, da lahko konformacijsko blokirani nukleozidi močno povečajo hibridizacijo modificiranih oligonukleotidov na komplementarno RNA in DNA (Obika et al. Tetrahedron Lett. 1997,38, 8735-8738; Koshkin et al. Tetrahedron 1998,54, 3607-3630).

Obstoji potreba za novimi, konformacijsko blokiranimi nukleozidi z bicikličnimi sladkornimi deli. Ti novi nukleozidi naj bi bili uporabni pri protivirusnih, protirakavih in drugih terapijah Poleg tega naj bi imeli oligonukleotidi, sestavljeni iz teh novih, modificiranih nukleozidov, zaželeno stabilnost proti celičnim nukleazam in močno afiniteto za vezavo na tarče nukleinskih kislin. Zato naj bi bili ti oligonukleotidi potencialno uporabni pri terapevtiki in diagnostiki.

Povzetek izuma

Opisani so konformacijsko blokirani biciklični sladkorni nukleozidi, ki imajo skupno geometrijsko

-3obliko in postopki za izdelavo konformacijsko blokiranih bicikličnih sladkornih nukleozidov. Zagotovljeni so nukleozidi, ki imajo bicildične sladkorne dele in oligonukleotidi, ki obsegajo naslednjo formulo:

v čemer so X, Y in Z neodvisno izbrani iz skupine naslednjih, kot so O, S, CH ₂ NR, OO, OCH ₂ali nič, kjer je R izbran iz skupine naslednjih, kot so vodik, alkil, alkenil, alkinil, acil; R j je izbran iz skupine naslednjih, kot so adenin, citozin, gvanin, hipoksantin, uracil, timin, heterocikli, H, 00¾, OAc, halogen, sulfonat; R?, R₃ sta neodvisno izbrana iz skupine naslednjih, kot so H, OH, DMTO, TBDMSO, BnO, THPO, AcO, BzO, OPtNiPr^CH^N, OPO₃H, PO₃H, difosfat, trifosfat; R₂ in R₃ skupaj sta lahko PhCHO₂, TIPDSO₂ ali DTBSO₂.

Pričakujemo, da so novi nukleozidi, opisani tu notri, uporabni pri antivirusnih, protirakavih in drugih terapijah. Oligonukleotidi, sestavljeni iz teh modificiranih nukleozidov imajo zaželjeno fiziološko stabilnost in afiniteto vezave, ki jim omogoča, da so uporabni pri terapevtiki in diagnostiki.

Podroben opis

Zagotovljeni so konformacijsko blokirani nukleozidi, ki imajo 3'-endo sladkorno gubo in postopki njihove priprave. Postopki za pripravo prej objavljenih bicikličnih analogov nukleozidov se ne morej o uporabiti pri novih analogih nukleozidov, opisanih tu notri. Opisani analogi so bili posledica uspešnega povezovanja med C2' in C4' pozicijama riboze v analogih nukleozidov.

Kot je uporabljeno tu, se okrajšava Ac nanaša na acetil; okrajšava Bn se nanaša na benzil;

okrajšava Bz se nanaša na benzoil; okrajšava DMT se nanaša na dimetoksitritil; okrajšava

THP se nanaša na tetrahidropiranil; okrajšava TBDMS se nanaša na t-butildimetilsilil;

okrajšava TIPDS se nanaša na tetraizopropildisilil; in okrajšava DTBS se nanaša na di(t-butil)silil.

-4Sinteza 2,4-premoščenih derivatov ribofuranoze

1-a-metilarabinozo 1, pripravljeno po objavljenem postopku (Tejima et al. J. Org. Chem. 1963, 28.2999-3003), smo zaščitili z 1,1,3,3-tetraizopropildisiloksanil-om (TIPS) pri 03 in 05, da smo dobili 2, ki smo jo pretvorili v keton 3 z obdelavo z DMSO/DCC/TFA. Naslednja Wittig-ova reakcija in odstranitev TIPS je dala alken 4 z zelo dobrim dobitkom. Spojino 4 smo zaščitili z tbutildimetilsilil-om (TBS) pri 05 in z benzil-om (Bn) pri 03, da smo pridobili 5. Hidroboriranje spojine 5 smo izpeljali z 9-BBN, da smo pridobili izključno 2-deoksi-2-hidroksimetil derivat 6 z odličnim dobitkom. 2-deoksi-2-hidroksimetil derivat 6 smo podvrgli tritiliranju z 4,4'-O-dimetoksitritil (DMT) kloridom in odstranitvi TBS s tetrabutilamonijevim fluoridom (TBAF), da smo naredili 7.

Shema 1.

Spojino 7 smo oksidirali, da smo pridobili aldehid 8, ki smo ga obdelovali s formaldehidom in natrijevim hidroksidom, da smo proizvedli 4-hidroksimetil derivat 9 z odličnim dobitkom, Meziliranje derivata 9 in sledeča odstranitev DMT je dala 10. Ciklizacija, povzročena z NaH v THF in sledeča odstranitevmezilajedalabiciklični sladkor 11. Obdelava spojine 11 z acetanhidridom v prisotnosti DMAP daj e 12, medtem ko obdelava z acetanhidridom/ocetno kislino v prisotnosti žveplove kisline proizvede 13, pri kateri ima acetoksi pri Cl obrnjeno orientacijo (l-β) v primeri z metoksi spojine 11

-5Shema 2.

Sinteza 2',4'-premošČenih biciklonukleozidov

Biciklonukleozide, ki imajo 2',4'-premoščen sladkorni del, smo sintetizirali s kondenzacijami si 1 iliranih baz nukleozidov in bicikličnih sladkorjev, kot je prikazano spodaj. Kondenzacija spojine 13 z bis(trimetilsilil)timinom je dala proizvod 14, α-anomer, z odličnim dobitkom. Z obdelavo proizvoda 14 z BCl₃ smo odstranili acetil in benzil istočasno, da smo proizvedli biciklični a-timidin 15

Kondenzacija spojine 13 s 6-kloro-9-trimetilsililpurinomje dala zmes a- in β-purinskih nukleozidov, in 17 (razmeije α:β, 1:1 do 2:3), ki smo jih lahko ločili s kromatografijo.

Obdelava 17 in 16 z amoniakom v metanolu, ki ji je sledila hidrogenoliza, je dala adenozinova analoga 18 in 19, poedino. Hidrogenoliza je zahtevala veliko količino materiala katalizatoija, tako kot tudi podaljšan reakcijski čas zaradi povečanega steričnega oviranja na sladkornem delu. Z obdelavo 17 in 16 z merkaptoetanolom v prisotnosti natrijevega metoksida, čemur je sledila hidrogenoliza, smo proizvedli inozinova analoga 20 in 21, poedino.

I8X*=NH₂ 19X-NH₂

20Χ-ΘΗ 21Χ-ΟΗ

Kondenzacija spojine 13 s sililiranim N²-acetilgvaninom proizvede α-gvanozinov derivat 22 kot glavni produkt (30 %), majhno količino β-izomera in N⁷-vezane (v angl. orig.: N⁷-coupled) produkte. Obdelava α-gvanozinovega derivata z amoniakom v metanolu, čemur je sledila hidrogenoliza, je dala biciklični a-gvanozin 23.

-Ί-

Kot je opisano zgoraj, so kondenzacijske reakcije dale bodisi α-nukleozid, izključno, ali zmes ain β-nukleozidov, brez prednosti za β-anomere. Da bi povečali razmeije β-nukleozidov, smo preiskovali različne pogoje kondenzacije. Temperatura je imela majhen učinek na razmeije a- in β-anomerov. Reagent za pripajanje (v angl. orig.: coupling reagent) in funkcionalna skupina pri Cl sladkorja pa sta imela znatne učinke na razmerje a- in β-nukleozidov.

Kondenzacija spojine 12 zbis- ali tri(trimetilsilil) pirimidini v prisotnosti kositerfTV) klorida je dala β-nukleozidekotglavneproduktezdobrimi dobitki. Potemtakemjereakcijaspojinel2ssililiranim timinom dala timidinov derivat 24, z razmajem β: a ~4:1. Kondenzacija spojine 12 s sililiranim uracilom in N⁴-benzoilcitozinom je dala ustrezna nukleozida 25 in 26, poedino, z β: a razmerjem ~9:1 pri obeh reakcijah. Obdelava spojin 24-26 z borovim trikloridom je dala pirimidinove biciklonukleozide27-29, poedino. V primeru citidinovega derivata smo benzoil skupino spojine 29 odstranili z obdelavo z amoniakom, da smo pridobili 30. Alternativna pot (ni prikazano) za pripravo 30, je izhajala iz 28, kije bil acetiliran pri O3'in 05', čemur je sledila reakcija s triazolom in naslednja obdelava z amoniakom. Na ta način smo dobili 30 z zmernim dobitkom.

24X = OHY = Me 27X = OHY = Me

25X = OH,Y = H 28X = OH,Y = H

26X = NHBz,Y = H 29X = NHBz,Y = H

30X = NH₂,Y = H

Raziskovali smotudikondenzacijospojinel2ssililiranimipurini,skupajskositer(IV)kloridomkot reagentom za pripajaiye. Za razliko od reakcij s pirimidini, je kondenzacija sililiranega 6-kloropurina z 12 dala ne samo a- in β-nukleozide 16 in 17, ampak tudi N⁷-vezni produkt (ni prikazano). Podobno je kondenzacija sililiranega N²-acetilgvanina z 12 dala zmes treh produktov, N⁷-vezan β-nukleozid 31 (42 %), zaželeni β-nukleozid 32 (10 %) in a-nukleozid 22 (6 %). Vendar seje N⁷-vezan produkt 31, če smo ga segrevali s sililiranim N²-acetilgvaninom v prisotnosti trimetilsilil triflata, deloma pretvoril v N⁹-vezane, a- in β-biciklonukleozide 22 (~22 %) in 32 (~25 %). Ločeni 32 smo podvrgli enakim obdelavam kot 22, da smo pridobili bicikličen β-gvanozin 33.

-9Stereokemijske določitve 2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktanovega derivata 11 in biciklonukleozidov, nastalih iz kondenzacije bicikličnih sladkorjev s sililiranimi bazami nukleozidov, lahko določimo z NOE protonsko NMR. Kot je naznačeno z modelom palička-kroglica (v angl. orig.: stick-ball), sili togi dioksabiciklo[3,2,l]oktanov obročni sistem protone (ΗΓ in H2') pri Cl' in C2' α-biciklonukleozidov, da postanejo skoraj paralelni, medtem ko soHl' inH2' v β-biciklonukleozidih obrnjeni na nasprotne strani. Na primer, torzijski kot ΗΓ-Ο'-02'-Η2' bicikličnega a-timidina 15 je 37° po optimizaciji geometrije in v skladnosti s tem smo pri protonski NMR ugotovili sklopitveno konstanto (v angl. orig.: coupling constant) 3,9 Hz. Torzijski kot H1'-C1'-C2'-H2' v bicikličnem β-timidinu 27 je po optimizaciji geometrije 96 ⁰ in kot je bilo pričakovano, sklopitve med ΗΓ in H2' nismo opazili. Dejansko je proton pri Cl' v vseh izmegenih β-biciklonukleozidih posamezen vrh. Nasprotno j e v vseh izmeij enih α -biciklonukleozidih proton pri C1' dublet s sklopitveno konstantno ~4,0 Hz.

Stereokemijske določitve biciklonukleozidov so bile nadalje potrjene z rentgenskimi (v angl. orig.: X-ray) kristalnimi strukturami bicikličnih timidinov 15 in 27. Ribozin obroč dioksabiciklo[3,2,l]oktanovega sladkornega dela v obeh spojinah privzema tipično C3'-endo sladkorno gubo, medtem ko šestčlenski obroč v sladkornem delu privzema obliko stola. Timinova baza ima v obeh spojinah anti-orientacijo.

Sinteza fosforamiditov 2,4-premoščenega biciklonukleozida

Bicikličen β-ti mi din 27, bicikličen β-Ν⁴-Τ>βηζοΠοήΐ(ϋη 29 in bicikličen P-N⁴-acetilcitidin29 smo zaščitili z DMT in potem pretvorili v ustrezne fosforamidite, poedino. Zaradi steričnega oviranja je bil potreben daljši reakcijski čas.

DMT<

HO

P-O

CEO

X = OH, Y = Me 35X = NHAc, Y = H 36X = NHBz, Y = H

X = OH, Y = Me 38X-NHAc, Y = H 39 X = NHBz, Y = H

-10Sintezne poti, uporabljene za pripravo opisanih spojin, se lahko tudi uporabljajo za sintezo drugih zahtevanih spojin. Pričujoči izum vključuje, vendar ni omejen na spojine, ki so pripravljene s pomočjo naslednjih primerov. Številke v oklepaju, ki sledijo imenom spojin v primerih, ustrezajo številkam struktur v sekciji podrobnega opisa.

Primeri

Primer 1

Priprava 1-a metil-3,5-0-(1,l,3,3-tetraizopropil-l,3-disiloksandiil)-D-ribofuranoze (2) α-metilarabinozo smo pripravili po objavljenem postopku (Tejima, S.; Fletcher, Jr. H. G. J. Org. Chem. 1963,28,2999-3003) in ločili od njenega β-anomera (stranski produkt) s kromatografijo na siliki. V mešano raztopino a -metilarabinoze (19,27 g, 119,9 mmola) v brezvodnem piridinu (200 mL) pri 0 °C smo dodali l,3-dikloro-l,l,3,3-tetraizopropildisiloksan (38,4 mL, 119,9 mmola). Nastalo raztopino smo mešali pri 0 °C v teku 1 h in potem pri sobni temperaturi v teku 1,5 h. Raztopino smo ohladili na 0 °C in dodali vodo (20 mL). Zmes smo mešali v teku 10 min in razredčili z EtOAc. Vodni sloj smo ekstrahirali z EtOAc. Združeni organski sloj smo sušili (Na2SO₄) in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki s 15 % EtOAc v heksanih je dala 42,7 g (88 %) naslovne spojine kot brezbarven sirup.

Primer 2

Priprava 2-C,2-O-didehidro-a-metiI-3,5-0-(1,l,3,3-tetraizopropil-L3disiloksandiil)-D-ribofuranoze (3)

V mešano raztopino 1-a-metil-3,5-0-(1,1,3,3-tetraizopropil-l,3-disiloksandiil)-D-nbofuranoze (42,6 g, 104,9 mmola) in DCC (43,4 g, 209,8 mmola) v brezvodnem DMSO (250 mL) in etru (100 mL) pri 0 °C pod argonom smo dodali raztopino trifluoroocetne kisline (4,04 mL, 52,5 mmola) in piridin (8,44 mL, 105 mmolov) v DMSO (30 mL). Nastalo reakcijsko zmes smo segreli do sobne temperature, mešali v teku 5 h in potem ohladili na 0 <€. Dodali smo oksalno kislino (21,3 g, 236 mmolov) v metanolu (60 mL), čemur je sledilo dodajanje vode (30 mL). Nastalo zmes smo mešali

-11pri sobni temperaturi v teku 1 h in oborino filtrirali in temeljito izprali s heksani. Filtrat smo dalje razredčili s heksani, petkrat izprali z vodo, sušili (Na₂SO₄) in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z 2 % MeOH v metilen kloridu-heksanih (1:2) je dala 37,6 g (89 %) naslovne spojine kot brezbarven sirup; hi NMRlCDClj) δ 1,00-1,12 (m, 28H,TIPDS), 3,47 (s, 3H, OCH₃), 4,05-4,19 (m, 3H, H4, H5a, H5b), 4,51 (dd, J = 9,3 Hz, 1,5 Hz, IH, H3), 4,89 (t, J = 1,5 Hz, IH, HI).

Primer 3

Priprava 2-deoksi-2-metilen-l-a-metil-3,5-0-(1,1,3,3-tetraizopropil-l, 3disiloksandiil)-D-ribofuranoze

V mešano suspenzijo metiltrifenilfosfonijevega bromida (21,5 g, 60,1 mmola) v brezvodnem etru (1380 mL) pri sobni temperaturi pod argonom smo dodali raztopino natrijevega r-pentoksida (5,97 g, 54,0 mmolov) v brezvodnem benzenu (50 mL). Nastalo svetlo rumeno zmes smo mešali pri sobni temperaturi v teku 6 h in ohladili na -10 TL potem smo dodali raztopino 2-C,2-O-didehidroa-metil-3,5-0-(1,1,3,3-tetraizopropil-l,3-disiloksandiil)-D-ribofuranoze (12,1 g, 30,1 mmola) v etru (35 mL). Reakcijsko zmes smo mešali pri -10 °C v teku 1 h, dvakrat izprali s slanico, sušili (Na₂SO₄) in koncentrirali. Kromatografija na siliki s 5 % EtOAc v heksanih je dala 11,0 g (91 %) naslovne spojine kot brezbarven sirup; hlNMR^DCl}) δ 1,00-1,12 (m, 28H, TIPDS), 3,45 (s, 3H, OCH₃), 3,73 (dt, J = 9,0 Hz, 3,0 Hz, IH, H4), 4,02,4,03 (2s, 2H, H5), 4,62 (dt, J = 9,0 Hz, 2,7 Hz, IH, H3), 5,27 (m, IH, HI), 5,32-5,36 (m, 2H, H2’),

Primer 4

Priprava 2-deoksi-2-metilen-l-a-metil-D-ribofuranoze (4)

V mešano raztopino 2-deoksi-2-metilen-l-a-metil-3,5-(9-(1,1,3,3-tetraizo-propil-l,3-disiloksandiil)D-ribofuranoze (35,0 g, 87,1 mmola) v THF (200 mL) smo dodali 1,0 M TBAF v THF (180 mL).

Nastala raztopina je stala pri sobni temperaturi v teku 1 h. THF smo izparili in ostanek kromatografirali na siliki z 10 % EtOH v metilen kloridu, da smo pridobili 14,6 g (88 %) naslovne spojine kot sirup.

-12Primer 5

Priprava 3-O-benzil-5-O-(i-butildimetilsiIiI)-2-deoksi-2-metiIeii-l-ametil-D-ribofuranoze (5)

Raztopina 2-deoksi-2-metilen-l-a-metil-D-ribofuranoze (13,7 g, 85,5 mmola) in TBDMS-C1 (13,5 g, 89,6 mmola) v brezvodnem piridinu (130 mL) je stala pri sobni temperaturi v teku 15 h. Po ohladitvi na 0 XI in dodajanju vode (2 mL), smo nastalo zmes mešali pri sobni temperaturi v teku 1 h, koncentrirali na polovico volumna, razredčili z EtOAc, izprali s slanico, sušili (Na £0 $ in koncentrirali do suhega. Temeljito sušeno surovo snov smo raztopili v THF (70 mL) in dodali v mešano zmes NaH (60 % v mineralnem olju, 5,6 g, 140 mmolov) v THF (350 mL) pri 0 Tl· Po mešanjupri sobni temperaturi vteku40 min, smo dodali benzil bromid(10,75 mL,90,5 mmola). Reakcijsko zmes smo mešali v teku 4 h in ohladili na 0 93, čemur je sledilo počasno dodajanje vode (2 mL) in potem 10 % AcOH v vodi do pH 7. Zmes smo razredčili z EtOAc, izprali s slanico, potem z razredčenim natrijevim bikarbonatom, sušili (Na₂SO₄) in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z 0-10 % EtOAc v heksanih je dala 23,8 g (76 %) naslovne spojine kot brezbarvno tekočino; Ή NMR (CDC1₃), δ 0,01 (s, 3H, SiCH₃), 0,02 (s, 3H, SiCH₃), 0,85 (s, 9H, t-Bu), 3,41 (s, 3H, OCH₃), 3,60-3,72 (m, 2H, H5a, H5b), 4,20 (dd, J = 8,7 Hz, 4,5 Hz, IH, H3), 4,57,4,66 (AB, J = 12,0 Hz, 2H, Bn), 5,22 (t, J = 1,2 Hz, IH, HI), 5,38 (t, J = 1,5 Hz, IH, H2a'), 5,43 (m, J = 1,2 Hz, IH, H2b’), 7,23-7,37 (m, 5H, Bn); Anal. Izračunano za C₂₀H₃₂O₄Si: C, 65,89; H, 8,85. Ugotovljeno: C, 65,92; H, 9,22.

Primer 6

Priprava 3-č?-benzil-5-O-(/-butildimetiIsilil)-2-dcoksi-2-hidroksimetil-l - a metil-D-ribofuranoze (6)

V mešano raztopino 3-(9-benzil-5-č?-(/-butildimetilsilil)-2-deoksi-2-metilen-1 -a-metilD-ribofuranoze (5,28 g, 14,50 mmola) pod argonom smo dodali 9-BBN (0,5 M v THF, 87 mL). Nastalo raztopino smo mešali pri okoliški temperaturi v teku 1 h, potem pri 40 U preko noči, ohladili na sobno temperaturo in prenesli v stekleničko, kije vsebovala natrijev perborat tetrahidrat (13,39 g, 87 mmolov) v vodi (85 mL) in etanol (85 mL). Nastalo zmes smo močno mešali pri 50 °C v teku 4 h, ohladili na 0 °C, nevtralizirali z AcOH na pH 8 in koncentrirali na majhen volumen. Preostali volumen smo razredčili z vodo (20 ml) in trikrat ekstrahirali z metilen kloridom. Združeni

-13organski sloj smo izprali dvakrat s slanico, sušili (Na₂SO₄) in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z EtOAC-heksani (1:2) je dala 5,17 g (93 %) naslovne spojine kot brezbarvni sirup; ’HNMR (CDC1₃) δ 0,03 (s, 6H, SiCH₃), 0,87 (s, 9H, t-butil), 2,34-2,43 (m, IH, H2), 3,39 (s, 3H, OCH₃), 3,48 (dd, J = 10,5 Hz, 6,0 Hz, IH, H5a), 3,60 (dd, J = 10,5 Hz, 3,6 Hz, IH, H5b), 3,88 (d, J = 7,2 Hz, 2H, H2'), 3,98 (dd, J = 7,2 Hz, 2,7 Hz, IH, H3), 4,17 (m, IH, H4), 4,44,4,66 (AB, J = 12,3 Hz, 2H, Bn), 4,95 (d, J = 5,4 Hz, IH, HI), 7,23-7,36 (m, 5H, Bn); Anal. Izračunano za C₂oH₃₄0₅Si: C, 62,79; H, 8,96. Ugotovljeno: C, 62,92; H, 9,21.

Primer 7

Priprava 3-O-bcnzil-2-deoksi-2-(4,4'-dimetoksitritiIoksimetil)-l-a-metiID-ribofuranoze (7)

Raztopina 3-O-benzil-5-O-(/-butildimetilsilil)-2-deoksi-2-hidroksimetil-1 -a -metil-D-ribofuranoze (6,60 g, 17,28 mmola) in DMT-C1 (7,03 g, 20,74 mmola) v brezvodnem piridinu (50 mL) je stala pri sobni temperaturi preko noči in reakcijo smo pogasili z dodajanjem vode (8 mL). Nastala raztopina je stala v teku 10 min in razredčili smo jo z EtOAc, trikrat izprali s slanico, sušili (Na₂SO₄) in koncentrirali, da smo pridobili surovo snov 9, ki smo jo raztopili v THF (52 mL). Dodali smo TBAF (1,0 M v THF, 26 mL) in nastala raztopina je stala pri sobni temperaturi v teku 30 min. THF smo izparili in ostanek kromatografirali na siliki z EtOAc-heksanom (1:1), da smo pridobili 9,28 g (94 %) naslovne spojine kot belo peno; *H NMR (CDCl^ δ 2,33-2,42 (m, IH, H2), 3,26-3,63 (m, 7H, H5a, H5b, H2a', H2b', OCH3), 3,79 (d, J = 1,2 Hz, 6H, DMT), 3,91 (dd, J - 7,5 Hz, 2,4 Hz, IH, H3), 4,13 (m, IH, H4), 4,41,4,50 (AB, J = 12,9 Hz, 2H, Bn), 5,05 (d, J = 5,1 Hz, IH, HI), 6,78-6,85 (m, 4H, DMT), 7,14-7,47 (m, 14H, Bn, DMT); Anal. Izračunano za C₃₅H₃₈O₇: C, 73,66; H, 6,71. Ugotovljeno: C, 73,57; H, 6,76.

Primer 8

Priprava 3-0-benzil-2-deoksi-2-(4,4'-dimetoksitritiloksimetil)-5-C,5-0didehidro-1- α -metil-D-ribofuranoze (8)

V mešano raztopino 3-D-benzil-2-deoksi-2-{4,4'-dimetoksitritiloksimetil)-l-a-metil-D-ribofuranoze (9,18 g, 16,16 mmola) in DCC (10,0 g, 48,49 mmola) v brezvodnem DMSO (60 mL) pri 10 R3 smo dodali raztopino trifluoroocetne kisline (0,622 mL, 8,08 mmola) in piridina (1,95 mL, 24,24

-14mmola) v DMSO (15 mL), Nastalo reakcijsko zmes smo mešali pri 10 Τ' v teku 1 h, pri sobni temperaturi v teku 6 h in potem ohladili na 0 Tl· Po dodajanju vode (8 mL) smo zmes mešali preko noči in razredčili z EtOAC. Oborino smo filtrirali in temeljito izprali z EtOAc. Združeni filtrat smo petkrat izprali s slanico, sušili (Na2SO4) in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z EtOAc-heksani (L 1) je dala 8,26 g (90 %) naslovne spojine kot belo peno.

Primer 9

Priprava 3-0-benzil-2-deoksi-2-(4,4'-dimetoksitritiIoksim etil)-4-Chidroksimetil-l-a-metil-D-ribofuranoze(9)

V mešano raztopino 3-O-benzil-2-deoksi-2-(4,4’-dimetoksitntiloksimetil)-5-C,5-6L didehidro-l-a-metil-D-ribofuranoze (8,0 g, 14,08 mmola) in formaldehida (37 % v vodi, 85 mL) v dioksanu (420 mL) pri 0 T? smo dodali po kapljicah vodno raztopino NaOH (2,0 M, 210 mL) v teku 15 min. Nastalo motno raztopino smo mešali pri sobni temperaturi v teku 2 dni, daje postala bistra raztopina. Po ohladitvi na 0 T smo raztopino nevtralizirali z 10 % ocetno kislino na pH 8, koncentrirali na majhen volumen, razredčili z vodo (100 mL) in trikrat ekstrahirali z metilen kloridom. Združeni organski sloj smo izprali s slanico, sušili (Na ) in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki s 4-5 % etanola v metilen kloridu je dala 8,11 g (94 %) naslovne spojine kot belo peno; ’Η NMR (CDC1₃) δ 2,46-2,57 (m, IH, H2), 3,23-3,73 (m, 9H, H5, H4', H2', OCH₃), 3,79 (d, J = 1,8 Hz, 6H, DMT), 4,14 (d, J = 6,9 Hz, IH, H3), 4,43,4,47 (AB, J = 12 Hz, 2H, Bn), 4,97 (d, J - 4,8 Hz, IH, HI), 6,77-6,85 (m, 4H, DMT), 7,11-7,46 (m, 14H, Bn, DMT).

Primer 10

Priprava 3-O-benzil-2-deoksi-2-hidroksimetil-5-f?-mezil-4-meziIoksimetil-la-metil-D-ribofuranoze (10)

V mešano raztopino 3-0-benzil-2-deoksi-2-(4,4'-dimetoksitritiloksimetil)-4-Chidroksimetil-1 -a-metil-D-ribofuranoze (7,80 g, 13,0 mmolov) v brezvodnem piridinu (60 mL) pri 0 °C pod argonom smo dodali po kapljicah metansulfonil klorid (3,03 mL, 39 mmolov). Nastalo reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi v teku 45 min, ohladili na 0 T in razredčili z dodajanjem vode (5 mL). Nastalo zmes smo mešali pri sobni temperaturi v teku 15 min, razredčili z EtOAc, trikrat izprali s slanico, sušili (Na in koncentrirali, da smo pridobili surovo snov kot

-15belo peno, ki smo jo raztopili v AcOH-vodi (80:20,400 mL). Nastala raztopina je stala pri sobni temperaturi v teku 2 h in razredčili smo jo z vodo (200 mL) ter koncentrirali na okoli četrtino volumna. Dodali smo vodo (100 mL) in zmes koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z EtOAc-heksani (3:1 to 1:0) je dala 5,32 g (90 %) naslovne spojine kot poltrdno snov; ‘H NMR (CDC1₃) δ 2,43-2,54 (m, IH, H2), 3,01 (s, 3H, OMs), 3,03 (s, 3H, OMs), 3,41 (s, 3H, OCH₃), 3,81 (d, J = 4,8 Hz, 2H, H2’), 4,01,4,04 (AB, J = 10,5 Hz, 2H, H4’), 4,21 (d, J = 7,5 Hz, IH, H3), 4,30, 4,50 (AB, J = 1,8 Hz, 2H, H5), 4,56,4,63 (AB, J = 12,0 Hz, 2H, Bn), 4,99 (d, J = 5,1 Hz, IH, HI), 7,30-7,42 (m, 5H, Bn); Anal. Izračunano za C ^270^2: C, 44,82; H, 5,97. Ugotovljeno: C, 44,68; H, 6,00.

Primer 11

Priprava (/5,35,4R,8_ky)-8-benziloksi-l-hidroksimetil-3-metoksi-2,6dioksabiciklo[3,2,l]oktana (11)

V mešano zmes NaH (60 % v mineralnem olju, 1,83 g, 22,90 mmola) v brezvodnem THF (200 mL) smo dodali raztopino 3-0-benzil-2-deoksi-2-hidroksimetil-5-0-mezil-4-meziloksimetil-la-metil-D-ribofuranoze (5,20 g, 11,45 mmola) v THF (30 mL). Nastalo reakcijsko zmes smo mešali pri 55 9C v teku 42 h in reakcijo pogasili z dodajanjem vode pri 0 9C. THF smo izparili in dodali vodni NaOH (0,5 M, 250 ml). Nastalo zmes smo segrevali pri refluksu v teku 24 h, ohladili na 0 °C, nevtralizirali z razredčeno klorovodikovo kislino na pH 8, štirikrat ekstrahirali z metilen kloridom. Združeni organski sloj smo sušili (Na^SO^) in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z EtOAc-beksani (2:1 do 1:0) je dala 3,16 g (98 %) naslovne spojine kot brezbarven sirup; 'HNMR (CDC1₃) δ 2,32 (m, IH, H2), 3,41 (d, J = 11,4 Hz, IH, H4a’), 3,46-3,60 (m, 2H, 5H, H5, OCH₃), 3,91 (d, J = 11,1 Hz, IH, H4b'), 3,92 (dd, J = 10,8 Hz, 2,4 Hz, IH, H2a’), 4,01 (d, J = 5,4 Hz, IH, H3), 4,04 (d, J = 10,5 Hz, H1, H2b’), 4,58,4,64 (AB, J = 12,0 Hz, Bn), 5,07 (d, J - 3,9 Hz, IH, HI), 7,28-7,40 (m, 5H, Bn).

Primer 12

Priprava (7R,35,4R,SA)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-metoksi-2,6dioksabiciklo[3,2,l]oktana (12)

Raztopino (7S,3S,47?,SS)-8-benziloksi-l-hidroksimetil-3-metoksi-2,6-dioksabiciklo[3,2,l]-16oktana (1,60 g, 5,71 mmola), acetanhidrida (1,08 ml, 11,42 mmola) in DMAP (2,09 g, 17,13 mmola) v brezvodnem metilen kloridu (10 mL) smo mešali pri sobni temperaturi v teku 2 h, ohladili na 0 °C in razredčili z metanolom (4 mL). Zmes smo mešali pri sobni temperaturi v teku 15 min, razredčili z metilen kloridom, izprali s slanico in potem z 10 % NaHCO₃, sušili (Na₂SO₄) in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z etil acetatom-heksani (1:1) je dala 1,82 g (99 %) naslovne spojine kot brezbarven sirup; NMR (CDC1 j) δ 2,02 (s, 3H, OAc), 2,33 (m, IH, H2), 3,50 (d, J = 10,8 Hz, IH, H4a’), 3,57 (s, 3H, OCH₃), 3,86-4,04 (m, 5H, H2a', H2b', H3, H4b', H5a), 4,14 (d, J = 12,0 Hz, IH, H5b), 4,50,4,64 (AB, J = 12,0 Hz, IH, Bn), 5,09 (d, J = 3,9 Hz, IH, HI), 7,29-7,42 (m, 5H, Bn); Anal. Izračunano za C C, 63,34; H, 6,88. Ugotovljeno:

C, 63,41; H, 6,94.

Primer 13

Priprava (7/?,3S,4/f,&y)-3-acetoksi-l-acetoksimelil-8-benziloksi-2,6dioksabiciklo[3,2,l]oktana (13)

V mešano raztopino (J S, 3S,4R, <5S)-8-benziloksi-1 -hidroksimetil-3-metoksi2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktana (600 mg, 2,14 mmola) v zmesi ocetne kisline (6,0 mL) in acetanhidrida (0,6 mL) pri 0 AC smo dodali po kapljicah koncentrirano žveplovo kislino (57 pL, 1,07 mmola). Nastalo reakcijsko zmes smo mešali pri 0 °C v teku 10 min in potem pri sobni temperaturi v teku 2 h. Po ohladitvi na 0 92, smo raztopino razredčili z EtOAc, trikrat izprali s slanico in potem z 10 % natrijevim bikarbonatom, sušili (Na ^O^ in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z EtOAc-heksani (2:3) je dala 696 mg (93 %) naslovne spojine (β-anomer) in 31 mg (3 %) α-anomera, oba kot brezbarven sirup, β-anomer seje strdil po stanju več dni pri sobni temperaturi; tal.: 55-58 AC; ^!H NMR (CDClj) δ 2,03 (s, 3H, OAc), 2,08 (s, 3H, OAc), 2,36-2,39 (m, IH, H2), 3,49 (d, J - 10,8 Hz, H4a’), 3,73 (d, J = 11,1 Hz, 2,7 Hz, IH, H2a'), 3,89 (d, J = 11,1 Hz, IH, H4b'), 4,01 (d, J = 11,1 Hz, IH, H2b'), 4,03 (d, J=9,3 Hz, IH, H5a), 4,14 (d, J = 5,1 Hz, IH, H3),4,55 (d, J = 9,6 Hz, IH,H5b), 4,55,4,64 (AB, J = 11,7Hz, 2H, Bn), 6,39 (s, IH, HI), 7,29-7,42 (m, 5H, Bn); Anal. Izračunano za C₁₈H₂₂O₇: C, 61,70; H, 6,33. Ugotovljeno: C, 61,74; H, 6,46.

-17Primer 14

Priprava 4/^85)-l-acetoksimetiI--8-benziloksi-3-(timin-l-iI)-2,6dioksabiciklo[3,2,ljoktana (14)

Zmes tunina (189 mg, 1,5 mmola) in brezvodnega amonijevega sulfata (15 mg) v HMDS (6 mL) smo segrevali pri refluksu preko noči. Po odstranitvi HMDS smo ostanek soizparili z brezvodnim /n-ksilenom, sušili pod vakuumom v teku 30 min in raztopili v raztopini (1R,3S,4R,8S)3-acetoksi-l-acetoksimetil-8-benziloksi-2,6-dioksabiciklo[3,2, ljoktana (306 mg, 0,87 mmola) v 1,2-dikloroetanu (5 mL). V to mešano raztopino pod argonom smo dodali po kapljicah trimetilsilil triflat (0,38 mL) v 1,2-dikloroetanu (2 mL). Nastalo raztopino smo segrevali pod refluksom v teku 2 h, ohladili na 0 °C, razredčili s kloroformom in nevtralizirali z 10 % NaHCO ₃ (10 mL). Organski sloj smo ločili in vodni sloj dvakrat ekstrahirali s kloroformom. Združeni organski sloj smo sušili (Na₂SO₄) inkoncentrirali do suhega. Kristalizacija izEtOAc-CH₂CI₂ je dala naslovno spojino (303 mg, 83 %) kot brezbarvno trdno snov; tal.: 198-200 AC; NMR (CDCI3) δ 1,94 (d, J = 1,2 Hz, IH, A1CH3), 2,04 (s, 3H, OAc), 2,93 (m, IH, H2'), 3,50 (dd, J = 11,8 Hz, 2,1 Hz, IH, H2a), 3,59 (d, J = 11,4 Hz, IH, H4a), 4,016 (d, J = 11,7 Hz, IH, H4b), 4,022 (d, J = 12,6 Hz, IH, H5a’), 4,09 (d, J = 12,0 Hz, IH, H2b), 4,11 (d, J=4,5 Hz, IH, H3’), 4,27 (d, J = 12,6 Hz, IH, H5b'), 4,53,4,70 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 5,88 (d, J = 3,6 Hz, IH, ΗΓ), 7,30-7,42 (m, 5H, Bn), 7,74 (d, J = 1,5 Hz, IH, H6), 8,79 (s, IH, NH); Anal. Izračunano za C₂₁H₂₄N₂O₇: C, 60,57; H, 5,81; N, 6,73. Ugotovljeno: C, 60,55; H, 5,84; N, 6,69.

Primer 15

Priprava (ISJ S, 4R,&y)-8-hidroksi-l-hidroksimetil-3-(timin-l-il)-2,6dioksabicikloJ3,2, ljoktana (15)

V raztopino (//?,XS',-//?,<5₁S)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(timm-l-il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,ljoktana v brezvodnem metilen kloridu (3 mL) pri 10 AC smo dodali borov triklorid (1,0 M v CH₂C1₂,6 mL). Nastalo reakcijsko zmes smo mešali pri 15 AC do sobne temperature preko noči in ohladili na 0 °C. Po kapljicah smo dodali metanol (1,5 mL) in nastalo zmes mešali pri 0 AC v teku 15 min, čemur je sledilo dodajanje trietilamina (2 mL). Topilo smo izparili in oborino temeljito ekstrahirali s toplim acetonom. Acetonsko raztopino smo sušili (Na₂SO₄) in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z 10 % metanola v kloroformu je dala 99 mg 20 kot belo peno.

-18Kristalizacija iz acetona je dala 95 mg (93 %) naslovne spojine kot brezbarvno trdno snov; tal.: 225-226 °C; 'f lNMR (DMSO-d₆) δ 1,76 (d, J - 0,9 Hz, IH, ArCH₃), 2,45 (m, IH, H2'), 3,25 (dd, J = 11,4 Hz, 2,1 Hz, IH, H2a), 3,32-3,52 (m, 2H, H5'), 3,53 (d, J = 11,4 Hz, IH, H4a), 3,72 (d, J = 11,1 Hz, IH, H4b), 3,93 (d, J = 11,1 Hz, IH, H2b), 4,16 (m, IH, H3’), 4,84 (t, J = 6,0 Hz,

IH, OH), 5,74 (d, J = 4,2 Hz, IH, HI’), 5,84 (d, J = 3,9 Hz, IH, OH), 7,76 (d, J - 1,2 Hz, 1 H, H6),

II, 32 (s, IH, NH); MS m/z 285 (MH⁴); Anal. Izračunano za C₁₂H_l6N₂O₆: C, 50,70; H, 5,67; N, 9,85. Ugotovljeno: C, 50,85; H, 5,68; N, 9,75.

Primer 16

Priprava (77?,3/?,47?,85)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(6-kloropurin-9-il)2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktana (17) in (7/?,35,47?,S0’)-l-acetoksimetiI-8-benziloksi-3(6-kloropurin-9-il)-2,6-dioksabicikloI3,2,l]-oktana (16)

Zmes 6-kloropurina (246 mg, 1,6 mmola) in HMDS (8,0 mL) smo refluksirali pod argonom v teku 2 h. HMDS smo izparili in ostanek sušili pod vakuumom v teku 30 min in potem raztopili v raztopini (IR, 3S, 4R, &S)-3-acetoksi-1 -acetoksimetil-8-benzi]oksi-2,6- dioksabiciklo[3,2,1 joktana (302 mg, 0,83 mmola) v brezvodnem 1,2-dikloroetanu (5,0 mL), čemur je sledilo dodajanje trimetilsilil triflata (0,38 mL, 2,25 mmola) v 1,2-dikloroetanu (2,0 mL). Nastalo raztopino smo segrevali pri refluksu pod argonom v teku 45 min. Dodelava je bila enaka, kot je tista, kije bila opisana prej. Kromatografija na siliki z EtOAc-beksani (1:1) je dala (/R,3S,4R,8S)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(6-kloropurin-9-il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,l]-oktan (122 mg, α-anomer) in (77?,3/?,77?,55)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(6-kloropurin-9-il)·

2,6-dioksabiciklo-[3,2,l]oktan(157 mg, β-anomer), oba kot brezbarvno trdno snov. Celoten dobitek je bil 75 %. α-izomer: ^JHNMR (CDClj) δ 2,05 (s, 3H, OAc), 2,89 (m, IH, H2'), 3,23 (dd, J 12,0 Hz, 2,4 Hz, IH, H2a), 3,72 (d, J = 11,7 Hz, H4a), 4,09 (d, J = 12,3 Hz, 2H, H4, H5a’), 4,13 (d, J = 13,2 Hz, IH, H2b), 4,24 (d, J = 4,8 Hz, H3’), 4,29 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5b’), 4,60,4,74 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,50 (d, J = 4,2 Hz, IH, HI'), 7,32-7,44 (m, 5H, Bn), 8,69 (s, IH, H8), 8,78 (s, IH, H2). β-izomer: tal.: 124-125 T (EtOAc-heksani);¹H NMR (CDC1)₃ δ 2,05 (s, 3H, OAc), 2,90 (m, IH, H2’), 3,55 (d, J = 11,1 Hz, H4a”), 3,95-4,03 (m, 2H, H2a”, H4b), 4,18-4,24 (m, 3H, H5’, H2b), 4,32 (d, J - 4,8 Hz, H3'), 4,47,4,63 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,52 (s, IH, ΗΓ), 7,24-7,35 (m, 5H, Bn), 8,40 (s, IH, H8), 8,72 (s, IH, H2); Anal. Izračunano za C₂₁H₂₁N₄O₅C1: C, 56,70; H, 4,76; N, 12,59. Ugotovljeno: C, 56,36; H, 4,56; N, 12,37.

-19Primer 17

Priprava (7/?,35,4R,S5)-l-acetoksimetil-3-(N²-acetilgvanin-9-iI)-8-benziloksi2,6-dioksabiciklo(3,2,l]oktana (22)

Zmes N²-acetil gvanina (193 mg, 1,0 mmol) in amonijevega sulfata (20 mg) v piridinu (1,0 mL) in HMDS (5,0 mL) smo refluksirali pod argonom v teku 3 h. Nastalo bistro raztopino smo koncentrirali in soizparili s ksilenom (10 mL, sušen z natrijem). Ostanek smo sušili pod vakuumom pri 50 °C v teku 1 h in raztopili v raztopini (//?,35,4/?,SS)-3-acetoksi-l-acetoksimetil-8benziloksi-2,6-djoksabiciklo[3,2,l]oktana (175 mg, 0,5 mmola) v brezvodnem 1,2-dikloroetanu (5,0 mL), čemur je sledilo dodajanje trimetilsilil triflata (0,27 mL, 1,5 mmola) v 1,2-dikloroetanu (1,0 mL). Nastalo raztopino smo mešali pri sobni temperaturi pod argonom v teku 30 min, potem segrevali pri 70-75 9C v teku 2 h, ohladili na 0 9C in nevtralizirali z 10 % natrijevim bikarbonatom (10 mL). Nastalo zmes smo mešali v teku 15 min in organski sloj ločili. Vodni sloj smo dvakrat ekstrahirali s kloroformom. Združeni organski sloj smo sušili (Na £>O $ in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z 10 % etanola in CHC1 j-EtOAc (1:1) je dala naslovno spojino (72 mg, 30 %) kot brezbarvno trdno snov; tal.: 249 9C (razkroj, EtOAc); ^]HNMR (CDClj) δ 2,01 (s, 3H, OAc), 2,29 (s, 3H, NAc), 2,75 (m, IH, H2'), 3,29 (dd, J = 11,7 Hz, 1,8 Hz, IH, H2a), 3,66 (d, J -11,4 Hz, IH, H4a), 4,03 (d, J = 11,4 Hz, IH, H4b), 4,05 (d, J = 11,7 Hz, IH, H2b), 4,70 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5a'), 4,13 (d, J = 4,8 Hz, H3'), 4,23 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5b’), 4,53,4,67 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,17 (d, J = 4,2 Hz, IH, HI'), 7,28-7,40 (m, 5H, Bn), 8,32 (s, IH, H8), 9,80 (s, ΙΗ,ΝΗ), 12,12 (s, ΙΗ,ΝΗ).

Primer 18

Priprava (75,3/f,4/?,85^T)-3-(adenin-9-iI)-8-hidroksi-l-hidroksimetil-2,6dioksabiciklo[3,2,l Joklana (18)

Raztopino (/7?,37?,47?,55)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(6-kloropurin-9-il)-2,6dioksabiciklo[3,2,l]-oktana (100 mg, 0,225 mmola) v zmesi dioksana (20 mL) in 30 % vodnega amonijevega hidroksida (20 mL) smo segrevali v jeklenem avtoklavu (v angl. orig.: Steel bomb) pri 100 °C v teku 16 h. Topila smo izparili in ostanek raztopili v metanolu, čemur je sledilo dodajanje 20 % paladijevega hidroksida na oglju (~50 % vode, 3 x 250 mg, dodano vsak dan). Hidrogenolizo smo izvajali pri sobni temperaturi pod 55 psi (= 3,79 χ 10 ⁵Pa, opomba prev.) vodika

-20v teku 4 dni. Katalizator smo filtrirali in izprali z metanolom. Združeno metanolno raztopino smo koncentrirali in ostanek kromatografirali na siliki z 20 % metanola v metilen kloridu, da smo pridobili naslovno spojino (39 mg, 59 %) kot brezbarvno trdno snov, ki smo jo kristalizirali iz metanola; tal.: 250 <€ (razkroj); h i NMR (DMSO-d₆+ D/)): δ 2,53 (m, IH, H2'), 3,33 (d, J = 11,1 Hz, IH, H2a), 3,40 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5a'), 3,50 (d, J = 12,6 Hz, IH, H5b'), 3,69-3,76 (m, 2H, H2b, H4a), 4,05 (d, J = 10,2 Hz, H4b), 4,45 (d, J = 5,1 Hz, IH, H3'), 6,26 (s, IH, HI'), 7,28 (m, 2H, NH₂), 8,12 (s, IH, H8), 8,33 (s, IH, H2); MS: 294 (MH⁴); Anal. Izračunano za C₁₂H₁₅N₅O₄: C, 49,14; H, 5,16; N, 23,88. Ugotovljeno: C, 49,01; H, 4,97; N, 23,92.

Primer 19

Priprava (75)35,4//,&y)-3-(adenin-9-iI)-8-hidroksi-l-hidroksimetil-2,6dioksabiciklo[3,2,l]oktana (19)

Podoben postopek, kot je opisan v Primeru 18, je dal naslovno spojino (43 mg, 65 %) kot brezbarvno trdno snov iz (7//,35,-///,(S5)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(6-kloropurm-9-il)2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktana (100 mg), h i NMR (CDpD): δ 2,71 (m, IH, H2'), 3,13 (dd, J = 11,7 Hz, 2,4 Hz, IH, H2a), 3,57 (d, J = 12,6 Hz, IH, H5a'), 3,64 (d, J = 11,1 Hz, H4a), 3,68 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5b'), 3,96 (d, J = 11,1 Hz, IH, H4b), 4,14 (d, J = 11,7 Hz, IH, H2b), 6,39 (d, J = 4,2 Hz, IH, HI'), 8,04 (s, IH, H8), 8,44 (s, IH, H2); MS m/z 294 (MH+).

Primer 20

Priprava (75,37/,4R,85)-8-hidroksi-l-hidroksimetil-3-(hipoksantin-9-il)-2,6dioksabiciklo[3,2,l]oktana (20)

Raztopini (/7/,3//,4/7,&S)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(6-kloropurin-9-il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,1 ]-oktana (150 mg, 0,34 mmola) in merkaptoetanola (0,19 mL, 2,7 mmola) v metanolu (20 mL) smo dodali natrijev metoksid (0,37 mL 5,4 M v metanolu, 2,0 mmola). Nastalo raztopino smo segrevali pod refluksom v teku 6 h, ohladili na sobno temperaturo, nevtralizirali z 10 % AcOH na pH 7. Metanol smo izparili in ostanek razredčili z 1,0 M NaHCOj (15 mL), čemur je sledila ekstrakcija z 10 % metanola v kloroformu, dokler vodna faza ni več vsebovala produkta. Združeni organski sloj smo sušili (Na^O^ in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z 10-15 % metanola v kloroformu je dala 109 mg (84 %) inozinovega derivata (ni pokazano) kot brezbarvno

-21trdno snov, od katerega smo 100 mg (0,26 mmola) raztopili v metanolu, čemur je sledilo dodajanje 20 % paladijevega hidroksida na oglju (50 % vode, 600 mg). Hidrogenolizo smo izvajali pri sobni temperaturi pod 50 psi (= 3,45 χ 10⁵ Pa, opomba prev.) vodika v teku 3 dni. Katalizator smo filtrirali in izprali z metanolom. Združeno metanolno raztopino smo koncentrirali in ostanek kromatografirali na siliki z 20-25 % metanola v metilen kloridu, da smo pridobili 61 mg (61 %) naslovne spoj ine kot brezbarvno trdno snov, ki smo j o kristalizirali iz metanola-etil acetata; tal.: 22 8 °C (razkroj); ^]H NMR (DMSO-d^: δ 2,52 (m, IH, ffi'), 3,30-3,55 (m, 3H, H5', ffia), 3,69 (dd, J = 11,1 Hz, 2,7 Hz, IH,H2a”), 3,73 (d, J = 10,8Hz, ffib), 4,05 (d, J = 10,8 Hz, IH, ffib), 4,40 (m, IH, ffib), 5,03 (t, J = 6,0 Hz, IH, OH), 5,74 (d, J = 4,2 Hz, IH, OH), 6,24 (s, IH, ΗΓ), 8,06 (s, IH, H8), 8,30 (s, IH, ffi), 12,40 (s, IH, NH); MS m/z 295 (MII⁴).

Primer 21

Priprava (75,35',4R,85’)-8-hidroksi-l-hidroksimetil-3-(hipoksantin-9-il)-2,6dioksabiciklo[3,2,l]oktana (21)

Raztopini (IR, 3S,4/<&S)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(6-kloropurin-9-il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktana(120mg,0,27mmola),merkaptoetanola(0,15mL,2,lmmola)vmetanolu(16 mL) smo dodali natrijev metoksid (1,62 mmola, 0,30 mL 5,4 M v metanolu). Podoben postopek, kot je opisan za Primer 20, je dal 37 mg (47 %) naslovne spojine kot higroskopsko trdno snov; ti NMR (DMSO-d₆) δ 2,52 (m, IH, H2’), 3,06 (dd, J = 11,7 Hz, 2,4 Hz, IH, ffia), 3,34-3,53 (m, 2H, H5'), 3,56 (d, J = t1,1 Hz, IH, ffia), 3,79 (d, J = 11,4 Hz, IH, ffib), 3,98 (d, J - 11,4 Hz, IH, ffib), 4,31 (d, J = 4,5 Hz, IH, H3’), 4,89 (br, IH, OH), 5,99 (br, IH, OH), 6,28 (d, J = 4,2 Hz, IH, HV), 8,03 (s, IH, H8), 8,27 (s, IH, ffi), 12,30 (br, IH, NH).

Primer 22

Priprava (/5,35,4R,8A)-3-(gvanin-9-il)-8-hidroksi-l-hidroksimetil-2,6dioksabiciklo[3,2,l Joktana (23)

Podoben postopek, kot je opisan za Primer 18, je dal naslovno spojino (41 mg, 66 %) kot sivo belo trdno snov iz /7/č35,7A,55)-l-acetoksimetil-3-(N²-acetilgvanin-9-il)-8-benziloksi-2,6dioksabiciklo[3,2,l joktana (100 mg). ¹HNMR(DMSO-d₆+ Dp)<5 2,42 (m, IH,H2’),3,15 (dd,

-22J = 11,4 Hz, 2,1 Hz, IH, H2a), 3,34 (d, J = 11,4 Hz, IH, H5a’), 3,47 (d, J = 12,6 Hz, IH, H5b’),

3.51 (d, J = 12,0 Hz, IH, H4a), 3,77 (d, J = 10,8 Hz, IH, H4b”), 3,98 (d, J = 11,7 Hz, IH, H2b), 4,23 (d, J = 4,8 Hz, IH, H3'), 4,80 (br, IH, OH), 5,90 (br, IH, OH), 6,05 (d, J = 4,2 Hz, IH, ΗΓ),

6.52 (br, 2H, NH₂), 7,93 (s, IH, H8), 12,30 (br, IH, NH); MS m/z 310 (MH+)·

Primer 23

Priprava (7U,3/?,4J?,85)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(timin-l-il)-2,6dioksabiciklo[3,2,l]oktana (24)

Reakcijo smo izvajali po istem postopku, kot je opisan za Primer 14, razen da je bil reagent za pripajanje kositer(IV) klorid (0,45 mL) in sladkorni substrat je bil (1R,3S,4R,8S)-1acetoksimetil-8-benziloksi-3-metoksi-2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktan (202 mg, 0,63 mmola). Kromatografija na siliki s 5 % EtOH v CH₂C1₂ je dala zmes (233 mg, 89 %) naslovne spojine (β-anomer) in njenega a-anomera (razmeije β:α, ~4:1) kot brezbarvno trdno snov. ^!HNMR (CDC1₃) β-anomera (iz spektra zmesi a- in β-anomerov) δ 1,93 (d, J = 0,9 Hz, IH, AiCH₃), 2,05 (s, 3H, OAc), 2,66 (m, IH, H2*), 3,48 (d, J = 11,1 Hz, H4a), 3,86-4,12 (m, 5H, H2a, H2b, H3', H4b, H5a’), 4,26 (d, J = 12,6Hz, H5b'), 4,44,4,64 (AB, J = 11,4 Hz, 2H,Bn), 6,06 (s, IH, HI'), 7,26-7,42 (m, 5H, Bn), 7,59 (d, J = 1,2 Hz, IH, H6), 8,94 (s, IH, NH).

Primer 24

Priprava (/Z?,3Z?,4/?,&y)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(uracil-l-il)-2,6dioksabiciklo|3,2,lloktana (25)

Podoben postopek, kot je opisan za Primer 23, je dal, po kromatografiji na siliki s 5 % EtOH v metilen kloridu, zmes (267 mg, 87 %) naslovne spojine in njenega a-anomera (razmeije β: a, ~9:1) kot brezbarvno trdno snov iz (//?,35',-//?,YS’)-l-acetoksimetil-8-benziloksi3-metoksi-2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktana(230mg,0,71mmola)insililiranegauracila(2,0mmola). Naslovno spojino (β-anomer) smo delno ločili s kromatografijo na siliki; tal.: 145-147 °C (EtOAc-heksani); ^JHNMR (CDC1₃) δ 2,02 (s, 3H, OAc), 2,67 (m, IH, H2'), 3,49 (d, J = 11,4 Hz, IH, H4a), 3,86-3,97 (m, 3H, H2a, H3’, H4b), 4,08 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5a'), 4,09 (d, J = 10,5 Hz, IH, H2b),4,25 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5b’), 4,44,4,64 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,05 (s, IH, HV), 7,26-7,40 (m, 5H, Bn), 5,69 (d, J = 8,1 Hz, IH, H5), 7,79 (d, J - 8,4 Hz, IH, H6), 8,92 (s,

-23ΙΗ,ΝΗ); Anal. Izračunano za C₂₀H₂2^P7^: č, 59,69; H, 5,51; N, 6,96. Ugotovljeno: C, 59,45; H, 5,56; N, 6,91.

Primer 25

Priprava (7/?,3/i,4/i,S5)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(N⁴-benzoilcitozin-l-il)2,6-dioksabiciklol3,2,lJoktana (26)

Podoben postopek, kot je opisan za Primer 23, je dal, po kromatografiji na siliki s 5 % EtOH v metilen kloridu, 910 mg (90%) naslovne spojine (β -anomer) kot brezbarvno trdno snov iz reakcije (/R3S,7/?,8S)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-metoksi-2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktana (645 mg, 2,0 mmola) s sililiranimN⁴-benzoilcitozinom (4,0 mmoli); tal.: 173-174 ‘U (EtOAc); ^]HNMR (CDC1₃) δ 2,07 (s, 3H, OAc), 2,83 (m, IH, H2’), 3,51 (d, J = 11,1 Hz, H4a), 3,86 (d, J = 5,4 Hz, IH, H3'), 3,97 (d, J = 11,1 Hz, IH, H4b), 3,99-4,13 (m, 3H, H2a, H2b, H5a'), 4,27 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5b'), 4,38,4,61 (AB, J = 11,4 Hz, 2H, Bn), 6,15 (s, IH, HI’), 7,24-7,38 (m, 5H, Bn), 7,50-7,66 (m, 4H, H5, Bz), 7,90 (m, 2H, Bz), 8,28 (d, J = 7,5 Hz, IH, H6), 8,84 (br, IH, NH); Anal. Izračunano za C₂₇H₂₇N₃O₇: C, 64,15; H, 5,38; N, 8,31. Ugotovljeno: C, 64,10; H, 5,20; N, 8,43.

Primer 26

Priprava (1S,3R,4R, &S)-8-hidroksi-l-hidroksimetiI-3-(timin-l-il)2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktana (27)

Raztopini zmesi (//<3//,7/?,&S’)-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(timin-l-il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,ljoktana in njegovega a-anomera(~4:1,200 mg, 0,48 mmola) v brezvodnem metilen kloridu (4 mL) pri 0 °C smo dodali borov triklorid (1,0 M v CH jCl^ 8 mL). Nastalo reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi v teku 8 h, pri 15 9C preko noči in potem ohladili na 0 Tl Po kapljicah smo dodali metanol (5,0 mL), čemur je sledilo dodajanje 1,0 M NaOMe v MeOH do pH 8. Raztopino smo ločili in oborino temeljito ekstrahirali z 20 % metanola v metilen kloridu. Združeni filtrat smo sušili (Na^O^) in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z 10-15 % metanola v etil acetatu je dala naslovno spojino (78 mg), zmes naslovne spojine in njenega a-anomera (24 mg) in a-anomer(23 mg), vse kot brezbarvno trdno snov. Celotni dobitekjebil 91 %. Kristalizacija naslovne spojine iz metanola-etil acetata je dala kristalinično trdno snov; tal.: 217-218 T3; *H

-24NMR (DMSO-d₆): 6 l,75(d,J= 1,2 Hz, lH,ArCH₃),2,24(m, IH,H2'),3,20(d, J= 10,8 Hz, IH, H4a), 3,33-3,58 (m, 3H, H2a, H5’), 3,66 (d, J = 10,8 Hz, H4b), 3,97 (d, J = 10,5 Hz, IH, H2b), 4,14 (m, IH, H3'), 5,24 (ζ J = 5,1 Hz, IH, OH), 5,67 (d, J = 2,4 Hz, IH, OH), 5,82 (s, IH, HI’), 7,95 (d, J = 0,9 Hz, IH, H6), 11,32 (s, IH, NH); MS m/z 285 (MH⁺), Anal. Izračunano za ^C12^H16^N2°6^{: c}> 50,70; H, 5,67; N, 9,85. Ugotovljeno: C, 50,65; H, 5,57; N, 9,73.

Primer 27

Priprava (/5,3R,4R,85)-8-hidroksi-l-hidroksimetil-3-(uracil-l-il)-2,6dioksabiciklo|3,2,l]oktana (28)

Podoben postopek, kot je opisan za Primer 26, je dal, po kromatografiji na siliki z 10 % metanola v metilen kloridu, 110 mg (76 %) naslovne spojine kot belo trdno snov iz (JR, 3R, 4R, 8S)-\-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(uracil-1 -il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,1 ]-oktana (215 mg, 0,53 mmola). Naslovna spojinajebilakontaminiranazmajhno količino njenega α-anomera. Čisto naslovno spojino smo dobili s prekristalizacijo iz acetona-etil acetata; tal. : 218-219 *C; tl NMR (aceton-dg) δ 2,42 (m, IH, H2’), 3,27 (d, J = 10,8 Hz, IH, H4a), 3,58-3,72 (m, 3H, H2a, H5’), 3,83 (d, J = 10,8 Hz, IH, H4b), 4,13 (d, J = 10,5 Hz, IH, HH2b), 4,37 (t, J = 5,1 Hz, IH, OH), 4,42 (m, IH, H3'), 4,88 (d, J = 3,9 Hz, IH, OH), 5,52 (d, J = 7,8 Hz, IH, H5), 5,95 (s, IH, HI’), 8,17 (d, J = 7,8 Hz, IH, H6), 10,02 (s, IH, NH); MS m/z 271 (MH⁴); Anal. Izračunano za C, ,Hi₄N₂O₆: C, 48,89; H, 5,22; N, 10,37. Ugotovljeno: C, 48,60; H, 5,64; N, 10,21.

Primer 28

Priprava (/5,3R,4R,85)-3-(citoziii-l-il)-8-hidroksi-l-hidroksimetil2,6-dioksabiciklo[3,2,l|oktana (30)

Podoben postopek, kot je opisan za Primer 26, je dal, po kromatografiji na siliki z 10 % MeOH v metilen kloridu iz (//<3/<-//?_I&S')-l-acetoksimetil-8-benziloksi-3-(N⁴-benzoilcitozinl-il)-2,6-dioksabiciklo-[3,2,l]oktana, 364 mg(65 %) (/.S',3//,7/?,(7.S)-3-(N⁴-benzoilcitozin-l-il)8-hidroksi-l-hidroksimetil-2,6-dioksabiciklo-[3,2,l joktana (760 mg), od česar smo 120 mg (0,32 mmola) raztopili v nasičeni raztopini amoniaka v metanolu in raztopino mešali pri sobni temperaturi v teku 24 h. Amoniak in metanol smo izparili in ostanek raztopili v vodi, čemur je sledila temeljita ekstrakcija s kloroformom (5 krat) in potem s toluenom (2 krat). Vodo smo izparili in kristalizacija

-25iz metanola je dala 62 mg naslovne spojine (45 mg kristalinične trdne snovi in 17 mg nekristalinične trdne snovi); tal.: 250 <€ (razkroj); bi NMR (CDpD) δ 2,33 (m, IH, H2'), 3,31 (d, J = 11,1 Hz, IH, H4a), 3,57 (d, J -12,3 Hz, IH, H5a'), 3,65 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5b’), 3,78 (dd, J = 10,5 Hz, 2,7 Hz, H2a), 3,84 (d, J = 11,1 Hz, IH, H4b), 4,14 (d, J = 10,5 Hz, IH, H2b), 4,20 (d, J = 5,1 Hz, IH, H3'), 5,86 (d, J = 7,5 Hz, IH, H5), 5,96 (s, IH, HI’), 8,22 (d, J = 7,8 Hz, IH, H6); MS: m/z 270 (MH^4-); Anal. Izračunano za C₁₁H₁5N₃O₅: C, 49,07; H, 5,62; N, 15,61. Ugotovljeno: C, 48,93; H, 5,55; N, 15,64.

Podobno smo pripravili (/S,5/?,7//&S)-3-(N⁴-acetilcitozin-l-il)-8~hidroksi-l-hidroksirnetil2.6- dioksabiciklo-[3,2,ljoktan.

Alternativen postopek Zmes (/_lS^,,3/<7/?,NS)-8-hidroksi-l-hidroksimetil-3-(uracil-l-il)2.6- dioksabiciklo[3,2,l]oktana (170 mg, 0,63 mmola), acetanhidrida (2,16 mL, 20,1 mmola) in piridina (0,29 mL, 3,5 mmola) v brezvodnem DMF (2,5 mL) smo mešali pri sobni temperaturi preko noči, razredčili z metilen kloridom, izprali s slanico in 10 % NaHCOg sušili (Na^SO^, koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki z etil acetatom-heksani (2:1) je dala 117 mg (77 %) 3',5’-diacetil derivata (IS, 3R, 4R, &S)-8-acetoksi-l-caetoksimetil-3-(uracil-l -il)-2,6dioksabiciklo[3,2,1 ]-oktana.

(/S,3R4/<8S)-8-acetoksi-l-caetoksimetil-3-(uracil-l-il)-2,6-dioksabiciklo-[3,2,l]oktan (175 mg, 0,58 mmola) smo raztopili v brezvodnem piridinu (1,5 mL) in nastalo raztopino ohladili na 0 °C pod argonom, čemur je sledilo dodajanje 4-klorofenil diklorofosfata (0,29 mL, 1,75 mmola). Nastalo raztopino smo segreli do sobne temperature in prenesli v vialo, zaprto s septumom, ki je vsebovala 1,2,4-triazol (120 mg, 1,75 mmola). Reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi v teku 3 dni, razredčili s CH^l^ izprali s slanico in 5 % NaHCOg sušili (Na2SO₄) in koncentrirali do suhega. Ostanek smo raztopili v dioksanu (7 mL) in 30 % amonijevem hidroksidu (10 mL). Raztopina je stala pri sobni temperaturi v teku 16 h in topila smo izparili. Ostanek smo kromatografirali na siliki z. Ht₃N-MeOH-CHCl₃(5:30:65), da smo pridobili 74 mg (55 %) naslovne spojine kot rahlo rumeno trdno snov.

-26Primer 29

Priprava (77Ϊ,377,47?,85)-l-acetoksimetil-3-(N²-acetilgvanin-7-il)-8-benziloksi2,6-dioksabiciklo|3,2,l]-oktana (31)

Sililirano bazo izN²-acetilgvanina (386 mg, 2,0 mmola) smo pripravili po postopku, opisanem za Primer 17 in raztopili v raztopini (IR,3S,4R,8S)~ 1 -acetoksimetil-8-benziloksi-3-metoksi2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktana (477 mg, 1,48 mmola) v brezvodnem 1,2-dikloroetanu (10 mL), čemur je sledilo dodajanje kositer(IV) klorida (0,75 mL) v 1,2-dikloroetanu (2,0 mL). Nastalo zmes smo segrevali pri refluksu v teku 3 h, potem pri 70 93 preko noči in ohladili na 0 93. Zmes smo nevtralizirali z 2,0 M natrijevim karbonatom, filtrirali skozi celit in temeljito ekstrahirali s kloroformom. Združeni filtrat smo sušili (Na^SO^ in koncentrirali do suhega. Kromatografija na siliki s 5 % EtOH v kloroformu je dala 297 mg (42 %) naslovne spojine, 73 mg (10 %) N9-vezanega β-anomera naslovne spojine in 46 mg (6 %) N9-vezanega α-anomera, vse kot belo trdno snov. Naslovna spojina: tal.: 176-178 9C (CHjCl-EtOAc); 'HNMR (CDCl3) δ 2,09 (s, 3H, OAc), 2,40 (s, 3H, NAc), 2,78 (m, IH, H2'), 3,53 (d, J = 11,4 Hz, IH, H4a), 3,99 (d, J = 11,1 Hz, H4b), 4,03-4,18 (m, 4H, H2a, H2b, H3’, H5a'), 4,26 (d, J = 12,6 Hz, IH, H5b'), 4,39,4,58 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,62 (s, IH, HI'), 7,22-7,40 (m, 5H, Bn), 8,21 (s, IH, H8), 10,60 (s, IH, NH), 12,34 (s, IH, NH); Anal. Izračunano za C23H₂5iN₅O₈: C, 55,31; H, 5,05; N, 14,02. Ugotovljeno: C, 55,35; H, 4,83; N, 13,80,

Primer 30

Priprava (77?,37i,4/i,S5)-l-acetoksimetil-3-(N²-acetilgvanin-9-il)-8-benziloksi2,6-dioksabiciklol3,2,l J-oktana (32)

Enako količino sililiranega N²-acetilgvanina, kot je opisano za Primer 29, smo raztopili v raztopini (77?,37?,47?,^S)-l-acetoksimetil-3-(N²-acetilgvanin-7-il)-8-benziloksi-2,6-dioksabiciklo [3,2,l]-oktana (370 mg, 0,76 mmola) v brezvodnem 1,2-dikloroetanu (10 mL) in dodali trimetilsilil triflat (0,54 mL, 3,0 mmole) v 1,2-dikloroetanu (3 mL). Nastalo raztopino smo segrevali pod refluksom preko noči. Dodali smo dodaten TMSOTf (0,54 mL) in zmes refluksirali v teku dodatnih dveh dni. Enaka dodelava, kot je opisana za Primer 29, je dala, po kromatografiji na siliki s 5 % etanola v kloroformu, 104 mg (28 %) intaktnega začetnega materiala, 91 mg (25 %) naslovne spojine in 80 mg (22 %) α-anomera naslovne spojine, vse kot belo trdno snov. Naslovna

-27spojina: tal.: 128-131 T?(CH₃Cl-EtOAc); 'HNMR (CDC1₃) δ 2,02 (s, 3H, OAc), 2,30 (s, 3H, NAc), 2,67 (m, IH, H2'), 3,50 (d, J = 10,8 Hz, IH, H4a), 3,78 (dd, J = 10,8 Hz, 2,7 Hz, IH, H2a), 3,99 (d, J = 10,8 Hz, H4b”), 4,12 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5a’), 4,14 (d, J = 10,8 Hz, IH, H2b), 4,27 (d, J = 12,3 Hz, IH, H5bj, 4,33 (d, J = 5,1 Hz, IH, H3'), 4,49,4,62 (AB, J = 11,7 Hz, 2H, Bn), 6,25 (s, IH, HI'), 7,26-7,38 (m, 5H, Bn), 7,83 (s, IH, H8), 9,0 (s, IH, NH), 11,95 (s, IH, NH); MS: m/z 310 (MH⁺); Anal. Izračunano za υ₂₃Η₂₅Ν₅Ο₈: C, 55,31; H, 5,05; N, 14,02. Ugotovljeno: C, 55,70; H, 5,00; N, 13,95.

Primer 31

Priprava (1SJR,4R, &V)-3-(gvaniii-9-il)-8-hidroksi-l-hidroksimetil-2,6dioksabiciklo [3,2,1 Joktana (33)

Podoben postopek, kot je opisan za Primer 22, je dal, po kromatografiji, 52 mg (45 %) naslovne spojine kot brezbarvno trdno snov iz (7/?,5/?,-//?,&Sj-l-acetoksimetil-3-(N²- acetilgvanin-9-il)8-benziloksi-2,6-dioksabiciklo[3,2,1 ]-oktana (180 mg). Kristalizacija iz vode-etanola (9:1) je dala kristalinično trdno snov; tal.: 258 9C (razkroj); 'HNMR(DMSO): δ 2,45 (m, IH, H2'), 3,31 (d, J = 10,8 Hz, IH, H4a”), 3,36-3,50 (m, 2H, H5a’,H5b'), 3,60 (dd, J = 10,2 Hz, 2,7 Hz, IH, H2a), 3,1 (d, J = 11,1 Hz, H4b), 4,03 (d, J = 10,5 Hz, IH, H2b’j, 4,36 (m, IH, H3'), 4,95 (t, J = 5,7 Hz, IH, OH), 5,70 (d, J = 3,9 Hz, IH, OH), 6,06 (s, IH, HV), 6,55 (br, 2H, NH^, 7,90 (s, IH, H8), 10,68 (s, IH, NH); MS m/z 310 (MH⁺).

Primer 32

Priprava (1SJR,4R, &S)-8-hidroksi-l-(4,4’-dimetoksitritiloksimetil)-3-(N⁴acetilcitozin-il)-2,6-dioksabiciklo|3,2,l]oktana (35)

Raztopina (/S,3R4RS5)-8-hidroksi-l-hidroksimetil-3-(N⁴-acetilcitozin-il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,1]oktana (200 mg, 0,64 mmola) in 4,4'-dimetoksitritil klorida (548 mg, 0,61 mmola) v brezvodnem piridinu (7 mL) je stala pri sobni temperaturi preko noči, razredčili smo jo z etil acetatom, izprali s slanico in 10 %NaHCO₃, sušili nad natrijevim sulfatom in koncentrirali. Kromatografija na siliki z 10 % etanola v kloroformu je dala 342 mg (87 %) naslovne spojine kot brezbarvno peno.

Podobno smo pripravili (1S,3R, 4R, &S)-8-hidroksi-1 -(4,4'-dimetoksitritiloksimetil)-3-(N ⁴ benzoil-28citozin-1 -il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,1 ]oktan (36) in (7S,3^,4/?,&S)-8-hidroksi-l -(4,4'-dimetoksi tritiloksimetil)-3-(timin-il)-2,6-dioksabiciklo[3,2, l]oktan (34).

Primer 33

Priprava (Z53fi,4fi,8S)-8-hidroksi-l-(4,4’-dimetoksitritiloksimetil)-3(N⁴-acetilcitozin-il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,l]<)ktaii 8-č?-(2-cianoetil-N,Ndiizopropilfosforamidit)-a (38)

V mešano raztopino (75,37^^^-8-hidroksi-l-(4,4'-dimetoksitritiloksi-metil)-3-(N-acetilcitozin-il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,l]oktana (320 mg, 0,52 mmola) in diizopropiletil-amina (0,36 mL, 2,08 mmola) v brezvodnem dikiorometanu (6 mL) pri 0 AC pod argonom smo dodali po kapljicah 2-cianoetil-N,N-diizopropilklorofosforamidit (0,23 mL, 1,04 mmola). Nastalo raztopino smo mešali pri okoliški temperaturi v teku 4 h, hladili z ledom, razredčili z etil acetatom, izprali s hladnim 10 % NaHCO₃, sušili nad natrijevim sulfatom in koncentrirali pri sobni temperaturi. Kromatografija na siliki s 5 % trietilamina in 5 % acetona v metilen kloridu je dala 376 mg (89 %) naslovne spojine kot brezbarvno peno.

Podobnosmopripravili(/S,3/č4/<&S)-8-hidroksi-l-(4,4'-dimetoksitritiloksimetil)-3-(N-benzoilcitozin-l-il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,l joktan 8-O-(2-cianoetil-N,N-diizopropil-fosforamidit (39) in (IS,3R,4R, &S)-8-hidroksi-1 -(4,4'-dimetoksitritiloksimetil)-3-(timin-1 -il)-2,6-dioksabiciklo[3,2,1 ]oktan 8-<9-(2-cianoetil-N,N-diizopropil-fosforamidit) (37).

Primer 34

Priprava oligonukleotidov, ki vsebujejo 2,4-biciklonukleotide

Ta primer illustrira uporabo biciklonukleozid fosforamiditov (v angl. orig.: bicyclonucleoside phosphoramidites) 37-39 za sintezo oligonukleotida, ki vsebuje 2'-C,4'-C-premoščene biciklonukleozide. Oligonukleotide v tem primeru smo sintetizirali z uporabo fosforamiditne poti. Modificirane oligonukleotide smo sintetizirali po standardnem postopku (protokol za ABI 394 Synthesizer iz Perkin-Elmer-ja, 1994) razen, da smo uporabili bolj koncentrirano raztopino in podaljšan čas pripajanja. Raztopina za modificirane fosforamidite je bila 0,13 M, kar je 30 % bolj

-29koncentrirana kot tiste za nemodificirane fosforamidite (0,1 M). Čas za pripajanje deset minut smo uporabili za modificirane fosforamidite in pet minut za nemodificirane fosforamidite poleg modificiranih fosforamiditov. Dobitki pripajanja za modificirane fosforamidite so primerljivi nemodificiranim (98-99 %). Modificirane ODNs smo čistili z reverzno-fazno HPLC in karakterizirali z masno spektrometrijo.

Naslednja sintetizirana zaporedja so navedena kot primeri.

5'-d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3’

5'-d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3'

5'-d(ATCTCrCCGCTTCCTTTC)-3'

5'-d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'

5’-d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'

5'-d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'

A, C, G in T = nemodificiran deoksiribonukleozid

T = 2',4'-C-premoščen timidin

C = 2',4'-C-premoščen deoksicitidin

Primer 35

Lastnosti hibridizacije oligonukleotidov, ki vsebujejo 2’-C,4’-C-premoščene hiciklonukleotide

Hibridizacijo modificiranih oligonukleotidov na komplementarno DNA in RNA smo raziskovali preko termodinamičnih meritev taljenja (Wang et al. Nucleosides Nucleotides 1997,16,445).

Kot lahko vidimo v Tabeli 1, modifikacije pomembno povečajo hibridizacijo na RNA Za zaporedja, ki vsebujejo bicikličen T timidin, so povečanja v vrednostih Tm v območju 2,2-3,3 stopinje na

-30modifikacijo. Zaporedja, ki vsebujejo bicikličen C citidin, imajo tudi višje vrednosti Tm kot nemodificirani oligonukleotidi, 2,4 ⁰ višjo na modifikacijo za Zaporedje 4 in 1,9 ° višjo na modifikacijo za Zaporedje 5. Zaporedje 12 vsebuje neujemajoč se nukleozid (G v sredini zaporedja je zamenjan s T) in ima vrednost Tm enajst stopinj nižjo kot Zaporedje 10, kar razkriva specifičnost zaporedja. Za zaporedja, v katerih so vsi T in C zamenjani s T in C, so bile vrednosti Tm (>90 °) dodatno povečane, tako da v merilnem sistemu ni bilo mogoče dobiti točnih vrednosti.

Tabela 1. Podatki za hibridizacijo oligonukleotidov, ki vsebujejo 2'-C,4'-C-premoščene biciklonukleozide

Zaporedje

Tm °C ATm

RNA °C/mod.

1.	5'-d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3'	64.4
2.	5’-d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3'	78.1	+2.8
3.	5AJ(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3'	~82	+2.2
4.	5'-d(ATCTCTCCGCnCCTTTC)-3'	71.7	+2.4
5.	5Al(ATCTCTCCGCTTCC'rrrC)-3'	77.5	+1.9
6.	5^,-d(ATCTCTCCGCTTCCTTTC)-3’	>90
7.	5'-d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'	63.0
8.	5'-d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'	69.5	+3.3
9.	5'-d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'	76.2	+3.3
10.	5'-d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3’	81.4	+2.3
11.	5’-d(CTTCCTGTCTGATGGCTTC)-3'	>90
12.	5'-d(CTTCCTGTCTTATGGCTTC)-3'	70.3

T=2',4'-C-premoščen timidin, C=2',4'-C-premoščen citidin. Vzorci za meritve Tm vsebujejo 2,0 μΜ modificiranih oligonukleotidov in 2,0 μΜ bodisi komplementarne DNA ali RNA v pufru (10 mM natrijev fosfat, 0,1 mM EDTA in 0,1 M natrijev klorid, pH 7,0).

-31Opisane šobile torej specifične izvedbe in uporabe predstavitev in postopkov za pridobivanje novih nukleozidov in oligonukleotidov zbicikličnimi sladkornimi deli. Vendar naj bi bilo strokovnjakom jasno, daje možnih mnogo več modifikacij poleg tistih, ki so že bile opisane, ne da bi se oddaljili od izumiteljskih konceptov tu notri. Vsebina izumiteljskega predmeta naj zato ne bi bila omejena, razen v duhu dodanih patentnih zahtevkov. Razen tega naj bi se pri interpretiranju tako opisa kot zahtevkov vsi izrazi interpretirali na najširši možen način, kije skladen s kontekstom. Posebno izrazi obsega in obsegajoč naj bi se interpretirali kot nanašajoči se na elemente, sestavne dele ali korake na neizklj učevalen način, naznačuj oč, da so navedeni elementi, sestavni deli ali koraki lahko prisotni ali se uporabljajo ali kombinirajo z drugimi elementi, sestavnimi deli ali koraki, ki niso bili izrecno navedeni.

Claims

1. Spojina, ki ima naslednjo formulo:

v čemer so X, Y in Z neodvisno izbrani iz skupine, ki obsega O, S, CH ₂, NR, C=O, C=CH ₂ ali nič, kjer je R izbran iz skupine, ki obsega vodik, alkil, alkenil, alkinil, acil;

Rj je izbran iz skupine, ki obsega adenin, citozin, gvanin, hipoksantin, uracil, timin, heterocikle; in

R₂, R₃ sta neodvisno izbrana iz skupine, ki obsega H, OH, DMTO, TBDMSO, BnO, THPO, AcO, BzO, OP(NiPr₂)O(CH₂)₂CN, OPO₃H, difosfat, trifosfat; R₂ in R₃ skupaj sta lahko PhCHO₂, TIPDSO₂ ali DTBSO₂.

2. Spojina po zahtevku 1, kjer je X kisik; Y je O, S, NH ali metilen; Z je metilen.

3. Oligonukleotid, ki obsega vsaj en monomer po zahtevku 1.

4. Oligonukleotid, ki obsega vsaj en monomer po zahtevku 2.