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ES2599986T3 - Tratamiento de enfermedades relacionadas con adiponectina (ADIPOQ) mediante la inhibición de un transcrito antisentido natural de una adiponectina (ADIPOQ) - Google Patents

Tratamiento de enfermedades relacionadas con adiponectina (ADIPOQ) mediante la inhibición de un transcrito antisentido natural de una adiponectina (ADIPOQ) Download PDF

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ES2599986T3
ES2599986T3 ES10808692.7T ES10808692T ES2599986T3 ES 2599986 T3 ES2599986 T3 ES 2599986T3 ES 10808692 T ES10808692 T ES 10808692T ES 2599986 T3 ES2599986 T3 ES 2599986T3
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ES
Spain
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adiponectin
adipoq
antisense
oligonucleotides
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Active
Application number
ES10808692.7T
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English (en)
Inventor
Joseph Collard
Olga Khorkova Sherman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Curna Inc
Original Assignee
Curna Inc
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Publication date
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Abstract

Un oligonucleótido que se orienta a un transcrito antisentido natural de adiponectina (ADIPOQ) para uso como compuesto terapéutico, donde el oligonucleótido modula la expresión de adiponectina (ADIPOQ) y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta en una de las SEQ IDNO: 3-6.

Description

DESCRIPCION
Tratamiento de enfermedades relacionadas con adiponectina (ADIPOQ) mediante la inhibicion de un transcrito antisentido natural de una adiponectina (ADIPOQ)
CAMPO DE LA INVENCION
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. n° 61/232.917 presentada el 11 de agosto de 2009 y de la solicitud de patente provisional de EE.UU. n° 61/253.187 presentada el 10 20 de octubre de 2009.
Aspectos de la divulgacion comprenden oligonucleotidos que modulan la expresion y/o funcion de una adiponectina (ADIPOQ) y moleculas asociadas.
15 ANTECEDENTES
Las hibridaciones de DNA-RNA y RNA-RNA son importantes en muchos aspectos de la funcion del acido nucleico incluyendo la replicacion, transcripcion y traduccion de DNA. La hibridacion es tambien basica para una variedad de tecnologfas que detectan un acido nucleico particular o alteran su expresion. Los nucleotidos antisentido, por 20 ejemplo, desestabilizan la expresion genica al hibridar con RNA diana, interfiriendo asf con el splicing, transcripcion, traduccion y replicacion de RNA. El DNAantisentido tiene el rasgo anadido de que los hfbridos de DNA-RNA sirven como sustrato para la digestion por ribonucleasa H, una actividad que esta presente en la mayorfa de tipos celulares. Las moleculas antisentido pueden suministrarse a celulas, como en el caso de los oligodesoxinucleotidos (ODN), o pueden expresarse a partir de genes endogenos como las moleculas de RNA. La FDA aprobo 25 recientemente un farmaco antisentido, VITRAVENE™ (para tratamiento de retinitis por citomegalovirus), reflejando que el antisentido tiene utilidad terapeutica.
RESUMEN
30 La invencion se define por las reivindicaciones. Aquellos aspectos de la presente divulgacion que constituyen la invencion se definen por las reivindicaciones.
En un aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos para la inhibicion de la accion de un transcrito antisentido natural mediante el uso de un oligonucleotido u oligonucleotidos antisentido orientados a cualquier region del 35 transcrito antisentido natural, dando como resultado la regulacion positiva del correspondiente gen con sentido. Se contempla tambien en la presente memoria que la inhibicion del transcrito antisentido natural pueda conseguirse por siRNA, ribozimas y moleculas pequenas, que se considera que estan dentro del alcance de la presente divulgacion.
Un aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un polinucleotido de 40 adiponectina (ADIPOQ) en celulas o tejidos de paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un complemento inverso de un polinucleotido que comprende de 5 a 30 nucleotidos consecutivos de los nucleotidos 1 a 416 de la SEQ ID NO: 3, o los nucleotidos 1 a 3591 de la SEQ ID NO: 4, o los nucleotidos 1 a 875 de la SEQ ID NO: 5, o los nucleotidos 1 a 194 de la SEQ ID NO: 6, 45 modulando asf la funcion y/o expresion del polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) en celulas o tejidos de paciente in vivo o in vitro.
En otro aspecto, se orienta un oligonucleotido a una secuencia antisentido natural de un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ), por ejemplo los nucleotidos expuestos en las SEQ ID NO: 3 a 6, y cualquier variante, alelo, 50 homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria de los mismos. Se exponen ejemplos de oligonucleotidos antisentido como las SEQ ID NOS: 7 a 31.
Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) en celulas o tejidos de paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas 55 celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un complemento inverso de un compuestoantisentido de polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ), modulando asf la funcion y/o expresion del polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) en celulas o tejidos de paciente in vivo o in vitro.
Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) en celulas o tejidos de paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido no codificante de 5 a 30 nucleotidos de longitud, donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con un oligonucleotido antisentido de un polinucleotido 5 antisentido de adiponectina (ADIPOQ), modulando asf la funcion y/o expresion del polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) en celulas o tejidos de paciente.
En un aspecto, una composicion comprende uno o mas oligonucleotido antisentido que se unen a polinucleotidos de adiponectina (ADIPOQ) con sentido y/o antisentido.
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En otro aspecto, los oligonucleotidos comprenden uno o mas nucleotidos modificados o sustituidos.
En otro aspecto, los oligonucleotidos comprenden uno o mas enlaces modificados.
15 En aun otro aspecto, los nucleotidos modificados comprenden bases modificadas que comprenden moleculas de fosforotioato, metilfosfonato, acidos peptidonucleicos, 2'-O-metilo, fluor o carbono, metileno u otro acido nucleico bloqueado (LNA). Preferiblemente, los nucleotidos modificados son moleculas de acido nucleico bloqueadas, incluyendo a-L-LNA.
20 En otro aspecto, los oligonucleotidos se administran a un paciente por via subcutanea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal.
En otro aspecto, los oligonucleotidos se administran en una composicion farmaceutica. Un regimen de tratamiento comprende administrar los compuestos antisentido al menos una vez al paciente; sin embargo, este tratamiento 25 puede modificarse para incluir multiples dosis durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede combinarse con uno o mas de otros tipos de terapias.
En otro aspecto, los oligonucleotidos se encapsulan en un liposoma o se enlazan con una molecula portadora (p.ej., colesterol, peptido TAT).
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Se describen a continuacion otros aspectos.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
35 La Figura 1 es una grafica de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + desviacion estandar del mRNA de ADIPOQ1 despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de mRNA de ADIPOQ en celulas HepG2 aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con un oligonucleotido disenado para AA515150 antisentido de ADIPOQ y un oligonucleotido disenado 40 para BC036509. Las barras senaladas como CUR-1023 a CUR-1029 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NO: 7 a 13 respectivamente.
La Figura 2 es una grafica de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + desviacion estandar del mRNA de ADIPOQ1 despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de fosforotioato 45 introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de mRNA de ADIPOQ1 en celulas HepG2 aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con dos oligonucleotidos disenados para AA515150 antisentido de ADIPOQ1 (CUR-1107 y 1108) y un oligonucleotido disenado para BC036509 (CUR-1110). Las barras senaladas como CUR-1107, CUR-1108, CUR- 1106, CUR-1110 y CUR-1109 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NO: 14 a 18 respectivamente.
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La Figura 3 es una grafica de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + desviacion estandar del mRNA de ADIPOQ1 despues del tratamiento de celulas Vero con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de mRNA de ADIPOQ1 en celulas Vero aumentan significativamente 48 h despues del 55 tratamiento con dos oligonucleotidos disenados para AA515150 antisentido de ADIPOQ1 (CUR-1107) y un oligonucleotido disenado para BC036509 (CUR-1110). Las barras senaladas como CUR-1107, CUR-1108, CuR- 1106, CUR-1110 y CUR-1109 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NO: 14 a 18 respectivamente.
La Figura 4 es una grafica de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + desviacion
estandar del mRNA de ADIPOQ1 despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de mRNA de ADIPOQ1 en celulas HepG2 aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con dos oligonucleotidos disenados para AA515150 antisentido de ADIPOQ1. Las barras senaladas 5 como CUR-1167 a CUR-1171 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NO: 19 a 23 respectivamente.
La Figura 5 es un grafica de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + desviacion estandar del mRNA de ADIPOQ2 despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con control. Los resultados de PCR en tiempo real 10 muestran que los niveles de mRNA de ADIPOR2 en celulas HepG2 aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con uno de los oligonucleotidos disenados para ADIPOR2 Skerblarbu.aApr antisentido de ADIPOR2. Las barras senaladas como CUR-1068 a CUR-1071 y CUR-1078 a CUR-1081 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NOS: 24 a 31 respectivamente.
15 La Figura 6 muestra la secuencia antisentido natural AA515150 alineada con el genoma de Rhesus, con las posiciones de los oligonucleotidos disenados para AA515150 destacadas.
La Figura 7 muestra el alineamiento de la secuencia antisentido skerblarbu.a.Apr07 con el genoma de Rhesus, con las posiciones de los oligonucleotidos disenados para skerblarbu.a.Apr07.
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Descripcion del listado de secuencias
SEQ ID NO: 1: Adiponectina de Homo sapiens que contiene C1Q y dominio de colageno (ADIPOQ), variante de transcrito 2, mRNA (numero de acceso a NcBI: NM_004797); SEQ ID NO: 2: receptor de adiponectina 2 de Homo 25 sapiens (ADIPOR2), mRNA (numero de acceso a NCBI: NM_024551); SEQ ID NO: 3: secuencia antisentido natural (AA515150); SEQ ID NO: 4: secuencia antisentido natural (BC036509); SEQ ID NO: 5: secuencia antisentido natural (LOC729097.aApr07); SEQ ID NO: 6: secuencia antisentidode ADIPOQ1 natural (skerblarbu.aApr07); SEQ ID NO: 7 a 31: oligonucleotidos antisentido.* indica enlace fosforotioato.
30 DESCRIPCION DETALLADA
Se describen a continuacion varios aspectos de la divulgacion con referencia a aplicaciones ejemplares para ilustracion. Deberfa entenderse que se exponen numerosos detalles especfficos, relaciones y procedimientos para proporcionar una compresion completa de la divulgacion. Un especialista en la tecnica relevante, sin embargo, 35 reconocera facilmente que la divulgacion puede practicarse sin uno o mas de los detalles especfficos o con otros procedimientos. La presente divulgacion no esta limitada por la ordenacion de actos o eventos, ya que algunos actos pueden ocurrir en diferentes ordenes y/o simultaneamente con otros actos o eventos. Ademas, no se requieren todos los actos o eventos ilustrados para poner en marcha una metodologfa de acuerdo con la presente divulgacion.
40 Todos los genes, nombres de genes y productos genicos divulgados en la presente memoria se pretende que correspondan a homologos de cualquier especie para la que sean aplicables las composiciones y procedimientos divulgados en la presente memoria. Por tanto, los terminos incluyen, pero sin limitacion, genes y productos genicos de seres humanos y ratones. Se entiende que, cuando se divulga un gen o producto genico de una especie particular, se pretende que esta divulgacion sea solo ejemplar, y no ha de interpretarse como una limitacion a menos 45 que lo indique claramente el contexto en el que aparece. Por tanto, por ejemplo, para los genes divulgados en la presente memoria, que en algunos aspectos se refieren a secuencias de acido nucleico y aminoacidos de mamffero, se pretende que engloben genes y productos genicos homologos y/u ortologos de otros animales incluyendo, pero sin limitacion, otros mamfferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En aspectos, los genes o secuencias de acido nucleico son humanos.
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Definiciones
La terminologfa usada en la presente memoria es con el fin de describir aspectos particulares solo y no se pretende que sea limitante de la divulgacion. Como se usan en la presente memoria, las formas singulares “uno”, “una” y 55 “el/la” se pretende que incluyan las formas plurales tambien, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Ademas, en la medida en que los terminos “incluir”, “incluye”, “tener”, “tiene”, “con” o variantes de los mismos se usen en cualquiera de la descripcion detallada y/o las reivindicaciones, dichos terminos se pretende que sean inclusivos de manera similar al termino “comprender”.
El termino “aproximadamente” o “alrededor de” significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como se determina por un especialista en la materia, que dependera en parte de como se mida o determine el valor, es decir, de las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, “aproximadamente” puede significar dentro de 1 o mas 1 desviaciones estandares, segun la practica en la tecnica. Como alternativa, 5 “aproximadamente” puede significar un intervalo de hasta un 20 %, preferiblemente hasta un 10 %, mas preferiblemente hasta un 5 % y mas preferiblemente aun hasta un 1 % de un valor dado. Como alternativa, particularmente con respecto a sistemas o procesos biologicos, el termino puede significar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 5 veces y mas preferiblemente dentro de 2 veces de un valor. Cuando se describen valores particulares en la solicitud y reivindicaciones, a menos que se indique otra cosa, deberfa
10 suponerse que el termino “aproximadamente” significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor
particular.
Como se usa en la presente memoria, el termino “mRNA” significa el transcrito o transcritos de mRNA conocidos actualmente de un gen diana, y cualquier transcrito adicional que pueda dilucidarse.
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Se entiende por “oligonucleotidos antisentido” o “compuesto antisentido” una molecula de RNA o DNA que se une a otro RNA o DNA (RNA, DNA diana). Por ejemplo, si es un oligonucleotido de RNA, se une a otra diana de RNA mediante interacciones RNA-RNA y altera la actividad del RNA diana. Un oligonucleotido antisentido puede regular positivamente o negativamente la expresion y/o funcion de un polinucleotido particular. La definicion pretende incluir 20 cualquier molecula de RNA o DNA extrana que sea util desde el punto de vista terapeutico, diagnostico u otro.
Dichas moleculas incluyen, por ejemplo, moleculas de RNA o DNAantisentido, RNA de interferencia (RNAi),
microRNA, moleculas de RNA senuelo, siRNA, RNA enzimatico, RNAde edicion terapeutica y RNA agonista y antagonista, compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), secuencias de splicing, cebadores y sondas alternativos y otros compuestos oligomericos que 25 hibriden con al menos una porcion del acido nucleico diana. Como tales, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios o circulares.
En el contexto de esta divulgacion, el termino “oligonucleotido” hace referencia a un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (RNA) o acido desoxirribonucleico (DNA) o mimeticos de los mismos. El termino “oligonucleotido” 30 incluye tambien oligomeros lineales o circulares de monomeros o ligamientos naturales y/o modificados, incluyendo desoxirribonucleosidos, ribonucleosidos, formas sustituidas y alfa-anomericas de los mismos, acidos peptidonucleicos (PNA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), fosforotioato, metilfosfonato y similares. Los oligonucleotidos son capaces de unirse especfficamente a un polinucleotido diana mediante un patron regular de interacciones de monomero a monomero, tales como apareamiento de bases de tipo Watson-Crick, apareamiento de 35 bases de tipo Hoogsteen o Hoogsteen inverso o similares.
Los oligonucleotidos pueden ser “quimericos”, es decir, compuestos por diferentes regiones. En el contexto de esta divulgacion, los compuestos “quimericos” son oligonucleotidos que contienen dos o mas regiones qufmicas, por ejemplo, una region o regiones de DNA, una region o regiones de RNA, una region o regiones de PNA, etc. Cada 40 region qufmica esta compuesta por al menos una unidad monomerica, es decir, un nucleotido en el caso de un compuesto oligonucleotfdico. Estos oligonucleotidos comprenden tfpicamente al menos una region donde el oligonucleotido esta modificado para exhibir una o mas propiedades deseadas. Las propiedades deseadas del oligonucleotido incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo una resistencia aumentada a la degradacion por nucleasa, una captacion celular aumentada y/o una afinidad de union aumentada por el acido nucleico diana. Por lo tanto, 45 regiones diferentes del oligonucleotido pueden tener propiedades diferentes. Los oligonucleotidos quimericos de la presente divulgacion pueden formarse como estructuras mixtas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o analogos oligonucleotfdicos como se describen anteriormente.
El oligonucleotido puede estar compuesto por regiones que pueden ligarse “alineadas”, es decir, cuando los 50 monomeros se ligan consecutivamente, como en DNA nativo, o ligarse a traves de espaciadores. Los espaciadores se pretende que constituyan un “puente” covalente entre las regiones y tienen en casos una longitud no superior a aproximadamente 100 atomos de carbono. Los espaciadores pueden portar diferentes funcionalidades, por ejemplo tener carga positiva o negativa, portar propiedades de union a acido nucleico especiales (intercalantes, compuestos de union a surco, toxinas, fluoroforos, etc.), ser lipofilos o, inducir estructuras secundarias especiales como, por 55 ejemplo, peptidos que contienen alanina que inducen helices alfa.
Como se usa en la presente memoria, las “adiponectinas (ADIPOQ)” son inclusivas de todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificantes y no codificantes, hebras polinucleotfdicas con sentido y antisentido, etc.
Como se usan en la presente memoria, las palabras adiponectinal, ADIPOQ1, protefna relacionada con complemento de adipocito de 30 kDa, ACDC, ACRP30, protefna de adipocito que contiene C1q y el dominio de colageno, protefna de adipocito de 30 kDa relacionada con el complemento, adiponectina, Adiponectina, AdipoQ 5 protefna del transcrito genico 1 mas abundante en adiposa, ADIPQTL1, ADPN, apM1, APM1, apM-1, APM-1, GBP28 y protefna de union a gelatina se consideran iguales en la bibliograffa y se usan intercambiablemente en la presente solicitud.
Como se usan en la presente memoria, las palabras ACDCR2, protefna 2 receptora de adiponectina, FLJ21432, 10 MGC4640, PAQR2, progestina y miembro II de la familia del receptor adipoQ se usan intercambiablemente en la presente solicitud.
Como se usa en la presente memoria, el termino “oligonucleotido especffico de” u “oligonucleotido orientado a” hace referencia a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una porcion del 15 gen diana o (ii) capaz de formar un duplex estable con una porcion de un transcrito de mRNA del gen diana. La estabilidad de los complejos o duplex puede determinarse por calculos teoricos y/o ensayos in vitro. Se describen en los Ejemplos siguientes ensayos ejemplares para determinar la estabilidad de hibridacion de complejos y duplex.
Como se usa en la presente memoria, el termino “acido nucleico diana” engloba DNA, RNA (comprendiendo pre- 20 mRNA y mRNA) transcrito a partir de dicho DNA y tambien cDNA derivado de dicho RNA, secuencias codificantes y no codificantes, polinucleotidos con sentido o antisentido. La hibridacion especffica de un compuesto oligomerico con su acido nucleico diana interfiere con la funcion normal del acido nucleico. Se hace referencia generalmente a esta modulacion de la funcion de un acido nucleico diana por compuestos que hibridan especfficamente con el mismo como “antisentido”. Las funciones del DNA que se interfieren incluyen, por ejemplo, replicacion y 25 transcripcion. Las funciones del RNA que se interfieren incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocacion de RNA al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna a partir del RNA, splicing del RNA procurando una o mas especies de mRNA y actividad catalftica que puede organizarse o facilitarse por el RNA. El efecto global de dicha interferencia con la funcion del acido nucleico diana es la modulacion de la expresion de un producto codificado u oligonucleotidos.
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La interferencia de RNA “RNAi” esta medida por moleculas de RNA bicatenario (dsRNA) que tienen homologfa especffica de secuencia con sus secuencias de acido nucleico “diana”. En ciertos aspectosde la presente divulgacion, los mediadores son duplex de RNA “interferentes pequenos” de 5-25 nucleotidos (siRNA). Los siRNA derivan del procesamiento de dsRNA por una enzima RNAasa conocida como Dicer. Los productos duplex de siRNA 35 se reclutan en un complejo de siRNA multiproteico denominado RISC (complejo de silenciamiento inducido por RNA). Sin desear ligarse a teorfa particular alguna, se cree entonces que el RISC esta guiado a un acido nucleico diana (adecuadamente mRNA), donde el duplex de siRNA interacciona de modo especffico de secuencia para medir la escision en forma catalftica. Los RNA interferentes pequenos que pueden usarse de acuerdo con la presente divulgacion pueden sintetizarse y usarse de acuerdo con procedimientos que son bien conocidos en la materia y que 40 seran familiares para el especialista en la materia. Los RNA interferentes pequenos para uso en los procedimientos de la presente divulgacion comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleotidos (nt). En ejemplos de aspectos no limitantes, los siRNA pueden comprender de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nt, o aproximadamente 20-25 nucleotidos. 45
La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se facilita usando programas informaticos que alinean automaticamente las secuencias de acido nucleico e indican las regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se usan para comparar las secuencias de acido nucleico obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de las secuencias de acido nucleico 50 de una serie de especies permite la seleccion de secuencias de acido nucleico que exhiben un grado apropiado de identidad entre especies. En el caso de genes que no se hayan secuenciado, se efectuan Southern blots para permitir la determinacion del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Al efectuar Southern blots a diversos grados de astringencia, como es bien conocido en la materia, es posible obtener un grado aproximado de identidad. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que exhiben un alto grado 55 de complementariedad con secuencias de acido nucleico diana en un sujeto para controlar y un menor grado de complementariedad con las correspondientes secuencias de acido nucleico en otras especies. Un especialista en la materia se dara cuenta de que hay una considerable laxitud en la seleccion de las regiones apropiadas de genes para uso en la presente divulgacion.
Se entiende por “RNA enzimatico” una molecula de RNA con actividad enzimatica. Los acidos nucleicos enzimaticos (ribozimas) actuan en primer lugar uniendose a un RNA diana. Dicha union ocurre mediante la porcion de union a diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en estrecha proximidad con una porcion enzimatica de la molecula que actua escindiendo el RNA diana. Por tanto, el acido nucleico enzimatico reconoce en primer lugar y 5 despues se une a un RNA diana mediante apareamiento de bases, y una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente cortando el RNA diana.
Se entiende por “RNA senuelo” una molecula de RNA que imita el dominio de union natural a un ligando. Por lo tanto, el RNA senuelo compite con la diana de union natural por la union de un ligando especffico. Por ejemplo, se 10 ha mostrado que la sobrexpresion de RNA de respuesta de transactivacion de VIH (TAR) puede actuar como “senuelo” y se une eficientemente a la protefna tat de VIH, evitando asf que se una a las secuencias de TAR codificadas en el RNA de VIH. Este pretende ser un ejemplo especffico. Los especialistas en la materia reconoceran que este es solo un ejemplo, y pueden generarse facilmente otros aspectos usando tecnicas conocidas generalmente en la materia.
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Como se usa en la presente memoria, el termino “monomeros” indica tfpicamente monomeros ligados por enlaces fosfodiester o analogos de los mismos que forman oligonucleotidos en el intervalo de tamano de unas pocas unidades monomericas, p.ej. aproximadamente 3-4, a aproximadamente varios cientos de unidades monomericas. Los analogos de ligamientos fosfodiester incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonatos, fosforoseleniato, 20 fosforamidato y similares, como se describe mas detalladamente a continuacion.
El termino “nucleotido” cubre los nucleotidos de origen natural asf como los nucleotidos de origen no natural. Deberfa ser evidente para el especialista en la materia que diversos nucleotidos que se habfan considerado anteriormente “de origen no natural” se han encontrado posteriormente en la naturaleza. Por tanto, “nucleotidos” 25 incluye no solo las moleculas que contienen heterociclos de purina y pirimidina conocidas, sino tambien analogos heterocfclicos y tautomeros de los mismos. Son ejemplos ilustrativos de otros tipos de nucleotidos las moleculas que contienen adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurina, 8-oxo-N6-metiladenina, 7- desazaxantina, 7-desazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-alquinil (C3-C6)citosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, pseudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, 30 isoguanina, inosina y los nucleotidos “de origen no natural” descritos en la patente de EE.Uu. n° 5.432.272.El termino “nucleotido” pretende cubrir todos y cada uno de estos ejemplos, asf como analogos y tautomeros de los mismos. Son nucleotidos especialmente interesantes aquellos que contienen adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, que se consideran como los nucleotido de origen natural en relacion con la aplicacion terapeutica y de diagnostico en seres humanos. Los nucleotidos incluyen los 2'-desoxi- y 2'-hidroxiazucares naturales, p.ej. como se 35 describen en Kornberg y Baker, DNA Replication, 2a Ed. (Freeman, San Francisco, 1992) asf como sus analogos.
“Analogos” con referencia a nucleotidos incluye nucleotidos sinteticos que tienen restos basicos modificados y/o restos de azucar modificados.Dichos analogos incluyen nucleotidos sinteticos disenados para mejorar las propiedades de union, p.ej., la estabilidad de duplex o triplex, la especificidad o similares.
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Como se usa en la presente memoria, “hibridacion” significa el apareamiento de hebras sustancialmente complementarias de compuestos oligomericos. Un mecanismo de apareamiento implica los enlaces de hidrogeno, que pueden ser enlaces de hidrogeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso, entre las bases nucleosfdicas o nucleotfdicas (nucleotidos) de las hebras de compuestos oligomericos. Por ejemplo, adenina y 45 timina son nucleotidos complementarios que se aparean mediante la formacion de enlaces de hidrogeno. La hibridacion puede ocurrir en diversas circunstancias.
Un compuesto antisentido es “especfficamente hibridable” cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere con la funcion normal del acido nucleico diana, causando una modulacion de la funcion y/o actividad, y hay 50 un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no especffica del compuesto antisentido con secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en que se desee una union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en las condiciones en que se efectuen los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
55 Como se usa en la presente memoria, la frase “condiciones de hibridacion astringentes” o “condiciones astringentes” hace referencia a condiciones en las que un compuesto de la divulgacion hibridara con su secuencia diana, pero con un numero mfnimo de otras secuencias. Las condiciones astringentes son dependientes de la secuencia y seran diferentes en circunstancias diferentes y, en el contexto de esta divulgacion, las “condiciones astringentes” en las que los compuestos oligomericos hibridan con una secuencia diana se determinan por la naturaleza y composicion
de los compuestos oligomericos y los ensayos en que se estan investigando. En general, las condiciones de hibridacion astringentes comprenden bajas concentraciones (<0,15 M) de sales con cationes inorganicos tales como Na++ o K++ (es decir, baja fuerza ionica), temperatura mas de 20-25 °C por debajo de la Tm del complejo compuesto oligomerico:secuencia diana y la presencia de desnaturalizantes tales como formamida, 5 dimetilformamida, dimetilsulfoxido o el detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). Por ejemplo, la tasa de hibridacion disminuye un 1,1 % por cada 1 % de formamida. Es un ejemplo de condicion de hibridacion de alta astringencia 0,1x tampon de cloruro de sodio-citrato de sodio (SSC)/0,1 % (p/v) de SDS a 60 °C durante 30 minutos.
“Complementario”, como se usa en la presente memoria, hace referencia a la capacidad de apareamiento preciso 10 entre dos nucleotidos en una o dos hebras oligomericas. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posicion de un compuesto antisentido es capaz de enlace de hidrogeno con una nucleobase en una cierta posicion de un acido nucleico diana, siendo dicho acido nucleico diana una molecula de DNA, RNA u oligonucleotido, entonces la posicion del enlace de hidrogeno entre el oligonucleotido y el acido nucleico diana se considera que es una posicion complementaria. El compuesto oligomerico y la molecula de DNA, RNA u oligonucleotido adicional son 15 complementarios entre si cuando un numero suficiente de posiciones complementarias en cada molecula estan ocupadas por nucleotidos que pueden tener un enlace de hidrogeno entre si. Por tanto, “especfficamente hibridable” y “complementario” son terminos que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o complementariedad en un numero suficiente de nucleotidos de tal modo que ocurra un enlace estable y especffico entre el compuesto oligomerico y un acido nucleico diana.
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Se entiende en la materia que la secuencia de un compuesto oligomerico no tiene que ser un 100 % complementaria de la de su acido nucleico diana para ser especfficamente hibridable. Ademas, un oligonucleotido puede hibridar en uno o mas segmentos de tal modo que los segmentos intermedios o adyacentes no esten implicados en el evento de hibridacion (p.ej., una estructura de bucle, desapareamiento o estructura de horquilla). Los compuestos oligomericos 25 de la presente divulgacion comprenden al menos aproximadamente un 70 %, o al menos aproximadamente un 75 %, o al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, o al menos aproximadamente un 95 %, o al menos aproximadamente un 99 % de complementariedad de secuencia con una region diana en la secuencia de acido nucleico diana a la que estan orientados. Por ejemplo, un compuesto antisentido en que 18 de 20 nucleotidos del compuesto antisentido sean complementarios de una region 30 diana, y por lo tanto hibridarfan especfficamente, representarfa un 90 % de complementariedad. En este ejemplo, los nucleotidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleotidos complementarios y no tienen que estar contiguos entre sf o con nucleotidos complementarios. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleotidos de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleotidos no complementarios que estan flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el acido nucleico diana tendrfa un 77,8 % de complementariedad 35 global con el acido nucleico diana y por lo tanto entrarfa dentro del alcance de la presente divulgacion. La complementariedad porcentual de un compuesto antisentido con una region de un acido nucleico diana puede determinarse rutinariamente usando los programas BLAST (herramientas de busqueda de alineamiento local basico) y programas PowerBLAST conocidos en la materia. La homologfa porcentual, identidad de secuencia o complementariedad pueden determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis 40 Package, version 8 para Unix, Genetics Computer Group,University Research Park, Madison Wis.), usando parametros por defecto, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).
Como se usa en la presente memoria, el termino “punto de fusion termica (Tm)” hace referencia a la temperatura a una fuerza ionica, pH y concentracion de acido nucleico definidos, a la que un 50 % de los oligonucleotidos 45 complementarios de la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Tfpicamente, las condiciones astringentes seran aquellas en que la concentracion salina sea al menos de aproximadamente 0,01 a1,0 M de concentracion de ion Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30 °C para oligonucleotidos cortos (p.ej., 10 a 50 nucleotidos). Las condiciones astringentes pueden conseguirse tambien con la adicion de agentes desestabilizantes tales como formamida.
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Como se usa en la presente memoria, “modulacion” significa tanto un aumento (estimulacion) como una disminucion (inhibicion) de la expresion de un gen.
El termino “variante”, cuando se usa en el contexto de una secuencia polinucleotfdica, pueden englobar una 55 secuencia polinucleotfdica relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definicion puede incluir tambien, por ejemplo, variantes “alelicas”, “de splicing”, “de especie” o “polimorficas”. Una variante de splicing puede tener una identidad significativa con una molecula de referencia, pero tendra generalmente un numero mayor o menor de polinucleotidos debido al splicing alternativo de exones durante el procesamiento de mRNA. El correspondiente polipeptido puede poseer dominios funcionales adicionales o ausencia de dominios. Los variantes de especie son
secuencias polinucleotfdicas que varfan de una especie a otra. Son de particular utilidad en la divulgacion las variantes de productos genicos de tipo silvestre. Las variante pueden ser el resultado de al menos una mutacion en la secuencia de acido nucleico y pueden dar como resultado mRNA alterados o polipeptidos cuya estructura o funcion puede o no alterarse. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas 5 formas alelicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleotidos. Cada uno de estos tipos de cambio puede ocurrir solo, o en combinacion con los demas, una o mas veces en una secuencia dada.
Los polipeptidos resultantes tendran generalmente una identidad aminoacfdica significativa entre si. Una variante 10 polimorfica es una variacion de la secuencia polinucleotfdica de un gen particular entre individuos de una especie dada. Las variantes polimorficas pueden englobar tambien “polimorfismos de nucleotido unico” (SNP) o mutaciones de base unica en que la secuencia polinucleotfdica varfa en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa, por ejemplo, de una cierta poblacion con tendencia a un estado patologico, es decir, sensibilidad frente a resistencia.
15 Los polinucleotidos derivados incluyen acidos nucleicos sometidos a modificacion qufmica, por ejemplo reemplazo de hidrogeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Los derivados, p.ej. oligonucleotidos derivados, pueden comprender porciones de origen no natural, tales como restos de azucar alterados o ligamentos entre azucares. Son ejemplares entre estos fosforotioato y otras especies que contienen azufre que son conocidas en la materia. Los acidos nucleicos derivados pueden contener tambien marcadores, incluyendo radionucleotidos, enzimas, agentes 20 fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogenicos, sustratos, cofactores, inhibidores, partfculas magneticas y similares.
Un polipeptido o peptido “derivado” es aquel que esta modificado, por ejemplo, por glicosilacion, pegilacion, fosforilacion, sulfatacion, reduccion/alquilacion, acilacion, acoplamiento qufmico o tratamiento suave con formalina. 25 Un derivado puede modificarse tambien para contener un marcador detectable, directa o indirectamente, incluyendo pero sin limitacion un marcador radioisotopico, fluorescente y enzimatico.
Como se usa en la presente memoria, el termino “animal” o “paciente” pretende incluir, por ejemplo, seres humanos, ovejas, alces, ciervos, ciervos mulos, visones, mamfferos, monos, caballos, reses, cerdos, cabras, perros, gatos, 30 ratas, ratones, aves, pollos, reptiles, peces, insectos y aracnidos.
“Mamffero” cubre los mamfferos de sangre caliente que estan tfpicamente bajo cuidado medico (p.ej., seres humanos y animales domesticados). Los ejemplos incluyen felinos, caninos, equinos, bovinos y seres humanos, asf como solo seres humanos.
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“Tratar” o “tratamiento” cubre el tratamiento de un estado patologico en un mamffero e incluye: (a) prevenir que ocurra el estado patologico en un mamffero, en particular cuando dicho mamffero esta predispuesto al estado patologico pero no se ha diagnosticado todavfa que lo tiene; (b) inhibir el estado patologico, p.ej. detener su desarrollo y/o (c) aliviar el estado patologico, p.ej., causando la regresion del estado patologico hasta alcanzar un 40 criterio de valoracion deseado. Tratar incluye tambien la mejora de un sfntoma de una enfermedad (p.ej., reducir el dolor o incomodidad), donde dicha mejora puede afectar o no directamente a la enfermedad (p.ej., causa, transmision, expresion, etc.).
Como se usa en la presente memoria, “cancer” hace referencia a todos los tipos de cancer o neoplasias o tumores 45 malignos encontrados en mamfferos incluyendo, pero sin limitacion: leucemias, linfomas, melanomas, carcinomas y sarcomas. El cancer se manifiesta como un “tumor” o tejido que comprende celulas malignas del cancer. Los ejemplos de tumores incluyen sarcomas y carcinomas tales como, pero sin limitacion: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma 50 de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma espinocelular, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandula sudorfpara, carcinoma de glandula sebacea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer cervicouterino, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma microcftico 55 pulmonar, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma. Los canceres adicionales que pueden tratarse con la composicion divulgada de acuerdo con la divulgacion incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma multiple, neuroblastoma, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de pulmon, rabdomiosarcoma,
trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores microcfticos pulmonares, tumores cerebrales primarios, cancer de estomago, cancer de colon, insulinoma pancreatico maligno, carcinoide maligno, cancer de vejiga urinaria, lesiones cutaneas premalignas, cancer testicular, linfomas, cancer tiroideo, neuroblastoma, cancer esofagico, cancer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cancer cervicouterino, cancer endometrico, cancer adrenocortical y 5 cancer de prostata.
“Enfermedad o trastorno neurologico” hace referencia a cualquier enfermedad o trastorno del sistema nervioso y/o del sistema visual. “Enfermedad o trastorno neurologico” incluye enfermedades o trastornos que implican al sistema nervioso central (cerebro, tallo cerebral y cerebelo), sistema nervioso periferico (incluyendo nervios craneales) y 10 sistema nervioso autonomo (partes del cual estan localizadas tanto en el sistema nervioso central como periferico). Los ejemplos de trastornos neurologicos incluyen, pero sin limitacion, cefalea, estupor y coma, demencia, convulsiones, trastornos del sueno, traumatismo, infecciones, neoplasias, neuroftalmologfa, trastornos del movimiento, enfermedades desmielinizantes, trastornos de la medula espinal y trastornos de los nervios perifericos, uniones musculares y neuromusculares. Las adicciones y enfermedades mentales incluyen, pero sin limitacion, 15 trastorno bipolar y esquizofrenia, y estan tambien incluidas en la definicion de trastorno neurologico. La siguiente es una lista de varios trastornos, sfntomas, signos y sfndromes neurologicos que pueden tratarse usando composiciones y procedimientos de acuerdo con la presente divulgacion: afasia epileptiforme adquirida; encefalomielitis diseminada aguda; adrenoleucodistrofia; degeneracion macular relacionada con la edad; agenesia del cuerpo calloso; agnosia; sfndrome de Aicardi; enfermedad de Alexander; enfermedad de Alpers; hemiplejia 20 alternante; demencia vascular; esclerosis lateral amiotrofica; anencefalia; sfndrome de Angelman; angiomatosis; anoxia; afasia; apraxia; quistes aracnoideos; aracnoiditis; malformacion de Arnold-Chiari; malformacion arteriovensa; sfndrome de Asperger; ataxia-telangiectasia; trastorno de deficit de atencion con hiperactividad; autismo; disfuncion autonoma; dolor de espalda; enfermedad de Batten; enfermedad de Behcet; paralisis de Bell; blefaroespasmo esencial benigno; amiotrofia focal benigna; hipertension intracraneal benigna; enfermedad de Binswanger; 25 blefaroespasmo; sfndrome de Bloch-Sulzberger; lesion del plexo braquial; absceso cerebral; lesion cerebral; tumores cerebrales (incluyendo glioblastoma multiforme); tumor espinal; sfndrome de Brown-Sequard; enfermedad de Canavan; sfndrome del tunel carpiano; causalgia; sfndrome de dolor central; mielinolisis central pontina; trastorno cefalico; aneurisma cerebral; arterioesclerosis cerebral; atrofia cerebral; gigantismo cerebral; paralisis cerebral; enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; neuropatfa y dolor neuropatico inducidos por quimioterapia; malformacion de 30 Chiari; corea; polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica; dolor cronico; sfndrome de dolor regional cronico; sfndrome de Coffin-Lowry; coma, incluyendo estado vegetativo persistente; diplejfa facial congenita; degeneracion corticobasal; arteritis craneal; craneosinostosis; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; trastornos traumaticos acumulativos; sfndrome de Cushing; enfermedad de cuerpos de inclusion citomegalicos; infeccion por citomegalovirus; sfndrome de ojos y pies danzantes; sfndrome de Dandy-Walker; enfermedad de Dawson; sfndrome 35 de De Morsier; paralisis de Dejerine-Klumke; demencia; dermatomiositis; neuropatfa diabetica; esclerosis difusa; disautonomfa; disgrafia; dislexia; distomas; encefalopatfa epileptica infantil temprana; sfndrome de la silla turca vacfa; encefalitis; encefaloceles; angiomatosis encefalotrigeminal; epilepsia; paralisis de Erb; temblor esencial; enfermedad de Fabry; sfndrome de Fahr; desmayo; paralisis espastica familiar; convulsiones febriles; sfndrome de Fisher; ataxia de Friedreich; demencia frontotemporal y otras "taupatfas"; enfermedad de Gaucher; sfndrome de 40 Gerstmann; arteritis de celulas gigantes; enfermedad de inclusion de celulas gigantes; leucodistrofia de celulas globoides; sfndrome de Guillain-Barre; mielopatfa asociada a HTLV-1; enfermedad de Hallervorden-Spatz; lesion craneal; cefalea; espasmo hemifacial; paraplejia espastica hereditaria; heredopatfa atactica polineuritiforme; herpes zoster otico; herpes zoster; sfndrome de Hirayama; demencia y neuropatfa asociadas a VIH (tambien manifestaciones neurologicas del SIDA); holoprosencefalia; enfermedad de Huntington y otras enfermedades de 45 repeticion de poliglutamina; hidranencefalia; hidrocefalia; hipercortisolismo; hipoxia; encefalomielitis inmunomediada; miositis de cuerpos de inclusion; incontinencia pigmentaria; enfermedad por almacenamiento de acido fitanico infantil; enfermedad de Refsum infantil; espasmos infantiles; miopatfa inflamatoria; quiste intracraneal; hipertension intracraneal; sfndrome de Joubert; sfndrome de Keams-Sayre; enfermedad de Kennedy; sfndrome de Kinsboume; sfndrome de Klippel-Feil; enfermedad de Krabbe; enfermedad de Kugelberg-Welander; kuru; enfermedad de Lafora; 50 sfndrome miastenico de Lambert-Eaton; sfndrome de Landau-Kleffner; sfndrome medular lateral (de Wallenberg); discapacidades de aprendizaje; enfermedad de Leigh; sfndrome de Lennox-Gustaut; sfndrome de Lesch-Nyhan; leucodistrofia; demencia de cuerpos de Lewis; lisencefalia; sfndrome de enclaustramiento; enfermedad de Lou Gehrig (es decir, enfermedad de las neuronas motoras o esclerosis lateral amiotrofica); enfermedad de los discos lumbares; secuelas neurologicas de la enfermedad de Lyme; enfermedad de Machado-Joseph; macrocefalia; 55 megalencefalia; sfndrome de Melkersson-Rosenthal; enfermedad de Menieres; meningitis; enfermedad de Menkes; leucodistrofia metacromatica; microcefalia; migrana; sfndrome de Miller-Fisher, miniapoplejfas; miopatfas mitocondriales; sfndrome de Mobius; amiotrofia monomelica; enfermedad de las neuronas motoras; enfermedad de Moyamoya; mucopolisacaridosis; demencia multiinfarto; neuropatfa motora multifocal; esclerosis multiple y otros trastornos desmielinizantes; atrofia sistemica multiple con hipotension postural; distrofia muscular p; miastenia grave;
esclerosis difusa mielinoclastica; encefalopatfa mioclonica de la infancia; mioclono; miopatfa; miotonfa congenita; narcolepsia; neurofibromatosis; sfndrome neuroleptico maligno; manifestaciones neurologicas del SIDA; secuelas neurologicas de lupus; neuromiotonfa; lipofuscinosis neuronal ceroidea; trastornos de migracion neuronal; enfermedad de Niemann-Pick; sfndrome de O'Sullivan-McLeod; neuralgia occipital; secuelas de disrafismo espinal 5 oculto; sfndrome de Ohtahara; atrofia olivopontocerebelosa; opsoclono-mioclono; neuritis optica; hipotension ortoestatica; sfndrome por sobreuso; parestesia; enfermedad o trastorno neurodegenerativo (enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica (ELA), demencia, esclerosis multiple y otras enfermedades y trastornos asociados a la muerte de celulas neuronales); paramiotonfa congenita; enfermedades paraneoplasicas; ataques paroxfsmicos; sfndrome de Parry-Romberg; enfermedad de 10 Pelizaeus-Merzbacher; paralisis periodicas; neuropatfa periferica; neuropatfa dolorosa y dolor neuropatico; estado vegetativo persistente; trastornos pervasivos del desarrollo; reflejo de estornudo fotico; enfermedad por almacenamiento de acido fitanico; enfermedad de Pick; nervio comprimido; tumores de pituitaria; polimiositis; porencefalia; sfndrome postpolio; neuralgia postherpetica; encefalomielitis postinfecciosa; hipotension postural; sfndrome de Prader-Willi; esclerosis lateral primaria; enfermedades prionicas; atrofia hemifacial progresiva; 15 leucoencefalopatfa multifocal progresiva; poliodistrofia progresiva esclerosante; paralisis supranuclear progresiva; pseudotumores cerebrales; sfndrome de Ramsay-Hunt (tipos I y II); encefalitis de Rasmussen; sfndrome de distrofia simpatica refleja; enfermedad de Refsum; trastornos de movimientos repetitivos; lesiones por estres repetitivo; sfndrome de las piernas inquietas; mielopatfa asociada a retrovirus; sfndrome de Ren; sfndrome de Reye; baile de San Vito; enfermedad de Sandhoff; enfermedad de Schilder; esquizoencefalia; displasia septo-optica; sfndrome del 20 bebe sacudido; herpes; sfndrome de Shy-Drager; sfndrome de Sjogren; apnea del sueno; sfndrome de Soto; espasticidad; espina bifida; lesion de medula espinal; tumores de medula espinal; atrofia muscular espinal; sfndrome de Stiff-Person; apoplejfa; sfndrome de Sturge-Weber; panencefalitis esclerosante subaguda; encefalopatfa arteriosclerotica subcortical; corea de Sydenham; sfncope; siringomielia; discinesia tardfa; enfermedad de Tay- Sachs; arteritis temporal; sfndrome de la medula espinal anclada; enfermedad de Thomsen; sfndrome de salida 25 toracica; tic doloroso; paralisis de Todd; sfndrome de Tourette; ataque isquemico transitorio; encefalopatfas espongiformes transmisibles; mielitis transversa; lesion cerebral traumatica; temblores; neuralgia de trigemino; paraparesis espastica tropical; esclerosis tuberosa; demencia vascular (demencia multiinfarto); vasculitis incluyendo arteritis temporal; enfermedad de Von Hippel-Lindau; sfndrome de Wallenberg; enfermedad de Werdnig-Hoffman; sfndrome de West; latigazo cervical; sfndrome de Williams; enfermedad de Wildon y sfndrome de Zellweger.
30
“Enfermedad metabolica” hace referencia a un amplio intervalo de enfermedades y trastornos del sistema endocrino incluyendo, por ejemplo, resistencia a insulina, diabetes, obesidad, tolerancia alterada a la glucosa, colesterol sangufneo alto, hiperglicemia, dislipidemia e hiperlipidemia.
35 Una “inflamacion” hace referencia a afecciones inflamatorias sistemicas y afecciones asociadas localmente a la migracion y atraccion de monocitos, leucocitos y/o neutrofilos. Los ejemplos de inflamacion incluyen, pero sin limitacion, inflamacion resultante de infeccion con organismos patogenicos (incluyendo bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, virus, hongos y parasitos tales como protozoos y helmintos), rechazo de trasplante (incluyendo rechazo de organos solidos tales como rinon, hfgado, corazon, pulmon o cornea, asf como rechazo de 40 trasplantes de medula osea incluyendo enfermedad del injerto contra el hospedador (GVHD)), o de reacciones autoinmunitarias o alergicas cronicas o agudas localizadas. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen glomerulonefritis aguda; artritis reumatoide o reactiva; glomerulonefritis cronica; enfermedades inflamatorias intestinales tales como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enterocolitis necrosante; sfndromes asociados a la transfusion de granulocitos; dermatosis inflamatorias tales como dermatitis de contacto, dermatitis atopica, psoriasis; 45 lupus sistemico eritematoso (SLE), tiroiditis autoinmunitaria, esclerosis multiple y algunas formas de diabetes, o cualquier otro estado autoinmunitario donde el ataque por el propio sistema inmunitario del sujeto de como resultado la destruccion de tejido patologica. Las reacciones alergicas incluyen asma alergica, bronquitis cronica, hipersensibilidad aguda y retardada. Los estados patologicos inflamatorios sistemicos incluyen inflamacion asociada a traumatismo, quemaduras, reperfusion despues de eventos isquemicos (p.ej., eventos tromboticos en corazon, 50 cerebro, intestinos o vasos perifericos, incluyendo infarto de miocardio y apoplejfa), sepsis, SDRA o sfndrome de disfuncion organica multiple. Puede aparecer tambien reclutamiento inflamatorio en placas ateroscleroticas. La inflamacion incluye, pero sin limitacion, linfoma no de Hodgkin, granulomatosis de Wegener, tiroiditis de Hashimoto, carcinoma hepatocelular, atrofia tfmica, pancreatitis cronica, artritis reumatoide, hiperplasia linfoide reactiva, osteoartritis, colitis ulcerosa, carcinoma papilar, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colecistitis aguda, colecistitis 55 cronica, cirrosis, sialadenitis cronica, peritonitis, pancreatitis aguda, pancreatitis cronica, gastritis cronica, adenomiosis, endometriosis, cervicitis aguda, cervicitis cronica, hiperplasia linfoide, esclerosis multiple, hipertrofia secundaria de purpura trombocitopenica idiopatica, nefropatfa de IgA primaria, lupus sistemico eritematoso, psoriasis, enfisema pulmonar, pielonefritis cronica y cistitis cronica.
Una enfermedad o trastorno cardiovascular incluye aquellos trastornos que pueden causar isquemia o estan causados por reperfusion del corazon. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, ateroesclerosis, enfermedad arterial coronaria, miocarditis granulomatosa, miocarditis cronica (no granulomatosa), cardiomiopatfa hipertrofica primaria, enfermedad arterial periferica (PAD), apop^a, angina de pecho, infarto de miocardio, lesion de tejido 5 cardiovascular causada por paro cardiaco, lesion de tejido cardiovascular causada por derivacion cardiaca, choque cardiogenico y afecciones relacionadas que sedan conocidas por los especialistas en la materia o que implican la disfuncion o la lesion de tejido del corazon o vasos especialmente, pero sin limitacion, lesion de tejido relacionada con la activacion de adiponectina3.Las enfermedades CVS incluyen, pero sin limitacion, ateroesclerosis, miocarditis granulomatosa, infarto de miocardio, fibrosis miocardica secundaria de enfermedad cardiaca valvular, fibrosis de 10 miocardio sin infarto, cardiomiopatfa hipertrofica primaria y miocarditis cronica (no granulomatosa).
Composiciones y moleculas polinucleotfdicas y oligonucleotfdicas
Dianas
15
En un aspecto, las dianas comprenden secuencias de acido nucleico de una adiponectina (ADIPOQ), incluyendo sin limitacion secuencias con sentido y/o antisentido no codificantes y/o codificantes asociadas a una adiponectina (ADIPOQ).
20 En un aspecto, las dianas comprenden las secuencias de acido nucleico de ADIPOQ1, incluyendo sin limitacion las secuencias con sentido y/o antisentido no codificantes y/o codificantes asociadas al gen ADIPOQ1.
En un aspecto, las dianas comprenden las secuencias de acido nucleico de ADIPOQ2, incluyendo sin limitacion las secuencias con sentido y/o antisentido no codificantes y/o codificantes asociadas al gen ADIPOQ2.
25
La adiponectina, tambien denominada GBP-28, apMI, AdipoQ y Acrp30, es una protema espedfica de tejido adiposo novedosa que tiene homologfa estructural con colageno VIII y X y el factor de complemento C1q, y que circula en el plasma humano a altos niveles. Es uno de los polipeptidos fisiologicamente activos secretados por el tejido adiposo, cuyas multiples funciones han empezado a entenderse en los ultimos anos. Una reduccion en la expresion de 30 adiponectina esta asociada a resistencia a insulina en algunos modelos animales. La administracion de adiponectina se ha acompanado por una reduccion de la glucosa plasmatica y un aumento de la sensibilidad a insulina. Ademas, las tiazolidindionas, farmacos que mejoran la sensibilidad a insulina mediante la estimulacion del receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma, aumentan la adiponectina plasmatica y los niveles de mRNA en ratones. Por otro lado, esta protema de adipocitos parece desempenar un papel protector en modelos experimentales de 35 lesion vascular. En seres humanos, los niveles de adiponectina estan inversamente relacionados con el grado de adiposidad y positivamente asociados a la sensibilidad a insulina tanto en sujetos sanos como en pacientes diabeticos. Se ha resenado que los niveles plasmaticos de adiponectina disminuyen en algunos estados resistentes a insulina, tales como obesidad y diabetes sacarina de tipo 2, y tambien en pacientes con enfermedad arterial coronaria. Por el contrario, la insuficiencia renal cronica, diabetes de tipo 1 y anorexia nerviosa estan asociadas a 40 niveles plasmaticos aumentados de adiponectina. Se ha mostrado que las concentraciones plasmaticas de adiponectina se correlacionan negativamente con los niveles de glucosa, insulina, trigliceridos e mdice de masa corporal y positivamente con los niveles de lipoprotema de alta densidad-colesterol y eliminacion de glucosa estimulada por insulina. La perdida de peso y la terapia con tiazolidindionas aumentaba la produccion de adiponectina endogena en seres humanos. La adiponectina aumenta la sensibilidad a insulina al aumentar la 45 oxidacion grasa del tejido, dando como resultado niveles reducidos de acido graso en circulacion y contenidos intracelulares reducidos de trigliceridos en hngado y musculo. Esta protema suprime tambien la expresion de moleculas de adhesion en celulas endoteliales vasculares y la produccion de citocinas de macrofagos, inhibiendo por tanto los procesos inflamatorios que ocurren durante las fases tempranas de la ateroesclerosis.
50 La vision clasica del tejido adiposo como un deposito pasivo de almacenamiento de energfa ya no es valida. En la ultima decada, se ha mostrado que el tejido adiposo tiene funciones endocrinas que regulan la fisiologfa cardiovascular. La secrecion de adiponectina se inhibe por TNF-alfa y por catecolaminas y se estimula por la activacion de PPAR-gamma. La adiponectina actua a traves de dos receptores principales, AdipoR1 y AdipoR2. En el hngado, la adiponectina modula el metabolismo lipfdico y energetico, estimulando el catabolismo de acidos grasos 55 y reduciendo la gluconeogenesis. En musculo esqueletico, promueve la oxidacion de acido graso y la captacion de glucosa. Tomadas en conjunto, las acciones metabolicas de la adiponectina mejoran la sensibilidad a insulina y reducen los niveles de lfpidos en circulacion. La adiponectina tiene tambien un efecto protector contra la aterogenesis, actuando sobre el endotelio y las celulas de musculo liso, no generando secrecion e inhibiendo la produccion de factores de adhesion. En el corazon, la adiponectina inhibe la hipertrofia de cardiomiocitos y la fibrosis
de miocardio mediante mecanismos mal entendidos. Se ha mostrado tambien que la produccion de adiponectina se reduce en pacientes con obesidad y diabetes de tipo 2, y sus niveles en circulacion tienen importancia de pronostico en diversas enfermedades cardiovasculares.
5 El tejido adiposo no es solo un sitio de almacenamiento de trigliceridos, sino tambien un organo endocrino activo que secreta muchos mediadores biologicamente activos a los que se hace referencia como “adipocinas”. En contraposicion con muchas adipocinas, que se sobreproducen en individuos obesos y ejercen efectos nocivos sobre la sensibilidad a insulina, el metabolismo de las lipoprotefnas y el sistema cardiovascular, tales como leptina, factor de necrosis tumoral alfa, inhibidor I de activador de plasminogeno, resistina, etc., la adiponectina parece ser una 10 adipocina unica que se produce en menos cantidades en sujetos obesos que en magros y posee actividades predominantemente beneficiosas, es decir, aumenta la sensibilidad a insulina, estimula la oxidacion de acidos grasos, inhibe la reaccion inflamatoria e induce la vasorrelajacion mediada por oxido nftrico dependiente del endotelio. La adiponectina se une a dos receptores, AdipoRI y AdipoR2. Los ratones con desactivacion genica de adiponectina exhiben diversas manifestaciones del sfndrome metabolico tales como resistencia a insulina, 15 intolerancia a glucosa, hiperlipidemia, vasorrelajacion dependiente de endotelio alterada e hipertension, asf como formacion aumentada de capa neofntima despues de lesion vascular. Estudios clfnicos indican que la concentracion plasmatica de adiponectina es menor en pacientes con hipertension esencial y enfermedad cardiaca isquemica. Elevar el nivel de adiponectina endogena o aumentar la sensibilidad a esta hormona puede ser una estrategia terapeutica prometedora para pacientes con enfermedades metabolicas y cardiovasculares.
20
La adiponectina aumenta la sensibilidad a insulina junto con sus propiedades antiinflamatorias y antiaterogenicas. La orientacion a esta molecula de oligonucleotidos antisentido que aumentan la AIPOQ en pacientes se usa en el tratamiento de diabetes, obesidad, cancer, artroesclerosis y similares. En cancer, la adiponectina puede funcionar como supresor tumoral, por ejemplo, niveles bajos de adiponectina en el colon conducen a cancer colorrectal. En 25 cancer de mama, se cree que la adiponectina es un regulador negativo del cancer y que un aumento de los niveles de adiponectina serfa terapeutico al inhibir el desarrollo o proporcionar tratamiento de cancer de mama.
La modulacion de los niveles de adiponectina en pacientes serfa tambien importante en enfermedades o trastornos inflamatorios, incluyendo enfermedades o trastornos autoinmunitarios. La adiponectina es una adipocina con 30 potentes propiedades antiinflamatorias. Se cree que el desarrollo de enfermedad hepatica alcoholica implica una actividad proinflamatoria aumentada, mediada en parte por la activacion de macrofagos hepaticos (celulas de Kupffer). La alimentacion cronica con etanol sensibiliza a los macrofagos hepaticos ante la activacion por lipopolisacarido (LPS), conduciendo a una produccion aumentada de especies de oxfgeno reactivas y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa). La adiponectina puede normalizar la senalizacion mediada por receptor 4 de tipo 35 Toll (TLR-4) en macrofagos hepaticos despues de alimentacion de etanol, contribuyendo probablemente al efecto hepatoprotector de la adiponectina en la progresion de enfermedad hepatica alcoholica.
La ateroesclerosis esta considerada un proceso inflamatorio cronico que esta presente en la pared arterial pero se caracteriza tambien por una respuesta inflamatoria sistemica en bajo grado. El tejido adiposo puede desempenar un 40 papel importante en la mediacion de este proceso inflamatorio cronico y, posteriormente, el riesgo cardiovascular y por lo tanto no puede considerarse solo como un sitio de almacenamiento para grasa. El adipocito puede tener una funcion endocrina activa; produce varias citocinas [entre ellas interleucina 6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral (TNF)] y adiponectina, una protefna relacionada con el complemento de adipocitos de 30 kDa. Los niveles de adiponectina en suero se determinan principalmente por el tamano y la cantidad de adipocitos. Se encuentran las concentraciones 45 sericas maximas en sujetos con solo poca grasa corporal. La adiponectina tiene efectos sensibilizador de insulina y antiaterogenico y se han resenado menores niveles sericos en pacientes con enfermedad cardiaca coronaria.
En aspectos, un procedimiento de tratamiento de enfermedades o trastornos asociados a bajos niveles de adiponectina comprende administrar a un paciente un oligonucleotido o antisentido que aumenta la expresion y/o 50 funcion de adiponectina. Los ejemplos de oligonucleotidos comprenden las SEQ ID NO: 7 a 31.
De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana esta dirigida a adiponectina (ADIPOQ) y se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, familias y similares de adiponectina (ADIPOQ). Los sinonimos de ADIPOQ incluyen: protefna relacionada con complemento de adipocitos de 30 kDa, ACDC, 55 ACRP30, protefna que contiene Clq y el dominio de colageno de adipocitos, protefna de 30 KDa relacionada con el complemento de adipocito, adiponectina, Adiponectina, AdipoQ, protefna del transcrito 1 del gen mas abundante en adiposa, ADIPQTL1, ADPN, apM1, APM1, apM-1, APM-1, GBP28 y protefna de union a gelatina.
En un aspecto, la divulgacion contempla todos los aspectos asociados a las moleculas descritas en la presente
memoria y engloba todos los peptidos, polipeptidos, derivados, variantes de las secuencias polinucleotfdicas y oligonucleotfdicas de ADIPOQ.
En otro aspecto, la divulgacion comprende anticuerpos y aptameros que pueden generarse por moleculas de 5 ADIPOQ.
En algunos aspectos, se usan oligonucleotidos antisentido para prevenir o tratar enfermedades o trastornos asociados a miembros de la familia de adiponectina (ADIPOQ). Las enfermedades y trastornos mediados por adiponectina (ADIPOQ) ejemplares que pueden tratarse con celulas/tejidos regenerados a partir de celulas madre 10 obtenidas usando los compuestos antisentido comprenden: cancer, inflamacion, ateroesclerosis, una enfermedad o trastorno neurologico, una enfermedad o trastorno cardiaco, una enfermedad o trastorno autoinmunitario, una enfermedad o trastorno infeccioso o una afeccion causada por agentes tales como virus, bacterias, hongos, protozoos, una enfermedad o trastorno inmunodeficiente, una alergia, ateroesclerosis, una enfermedad o trastorno metabolico (diabetes, neuropatfa diabetica, obesidad, hiperglicemia, resistencia a insulina, sfndromes metabolicos 15 asociados a resistencia a insulina, sfndrome metabolico, hipertension, una enfermedad o trastorno asociado a una regulacion alterada de la sensibilidad a insulina, nivel de glucosa sangufnea aberrante, etc.), una enfermedad hepatica, una enfermedad renal, albuminuria y un trastorno proliferativo celular.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido modulan la expresion, funcion y actividad de ADIPOR, 20 incluyendo las moleculas con las que interacciona ADIPOR. La adiponectina inhibe fuertemente la expresion de moleculas de adhesion, incluyendo la molecula de adhesion intracelular I, la molecula de adhesion celular vascular I y E-selectina. La adiponectina inhibe tambien la activacion del factor B nuclear inducida por TNF mediante la inhibicion de la fosforilacion de IE. La supresion del factor B nuclear por adiponectina podrfa ser un mecanismo molecular importante para la inhibicion de la adhesion de monocitos a celulas endoteliales. La adiponectina inhibe 25 tambien la expresion del receptor trampa de clase A-I de macrofagos, dando como resultado una captacion notablemente disminuida de lipoprotefna de baja densidad oxidada por macrofagos y la inhibicion de la formacion de celulas espumosas. Ademas, en celulas de musculo liso cultivadas, la adiponectina atenuaba la sfntesis de DNA inducida por factores de crecimiento que incluyen factor de crecimiento de derivado de plaquetas, factor de crecimiento de tipo factor de crecimiento epidermico (EGF) de union a heparina, factor de crecimiento de fibroblastos 30 basico y EGF, asf como la proliferacion y migracion celular inducidas por el factor de crecimiento de tipo EGF de union a heparina.
En otro aspecto, los oligonucleotidos antisentido modulan la expresion normal y/o funcion normal de una adiponectina (ADIPOQ) en pacientes que padecen o estan en riesgo de desarrollar enfermedades o trastornos 35 asociados a adiponectina (ADIPOQ).
En un aspecto, los oligonucleotidos son especfficos de polinucleotidos de una adiponectina (ADIPOQ) lo que incluye, sin limitacion, regiones no codificantes. Las dianas de adiponectina (ADIPOQ) comprenden variantes de adiponectina (ADIPOQ); mutantes de adiponectina (ADIPOQ) incluyendo SNP; secuencias no codificantes de 40 adiponectina (ADIPOQ); alelos, fragmentos y similares. Preferiblemente, el oligonucleotido es una molecula de RNA antisentido.
De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no esta limitada a un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) solo, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos, 45 regiones no codificantes y similares de una adiponectina (ADIPOQ).
En otro aspecto, un oligonucleotido se orienta a una secuencia antisentido natural (antisentido natural de las regiones codificantes y no codificantes) de una diana de adiponectina (ADIPOQ) incluyendo, sin limitacion, variantes, alelos, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias dela misma. Preferiblemente, el 50 oligonucleotido es una molecula de RNA o DNA antisentido.
En otro aspecto, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion incluyen tambien variantes en que esta presente una base diferente en una o mas de las posiciones nucleotfdicas en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenina, pueden producirse variantes que contengan timidina, guanosina, citidina u otros 55 nucleotidos naturales o no naturales en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones del compuesto antisentido.
En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de
secuencia o complementariedad es de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad es de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad es de aproximadamente 80 a aproximadamente 90 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad es de 5 aproximadamente 90 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 %.
Un compuesto antisentido es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto al acido nucleico diana 10 interfiere con la funcion normal del acido nucleico diana causando una perdida de actividad y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no especffica del compuesto antisentido con las secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en que se desee la union especffica. Dichas condiciones incluyen, concretamente, las condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y las condiciones en que se efectuen los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
15
Un compuesto antisentido, tanto DNA, RNA, quimerico o sustituido, etc. es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto a la molecula de DNA o RNA diana interfiere con la funcion normal del DNA o RNA diana causando una perdida de utilidad y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no especffica del compuesto antisentido con secuencias no diana en condiciones en que se desee union especffica, es decir, en 20 las condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en las condiciones en que se efectuen los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
En otro aspecto, la orientacion a una adiponectina (ADIPOQ) de, incluyendo sin limitacion, secuencias antisentido que se identifican y expanden usando, por ejemplo, PCR, hibridacion, etc., de una o mas de las secuencias 25 expuestas como las SEQ ID NO: 3 a 6 y similares, modula la expresion o funcion de una adiponectina (ADIPOQ). En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada positivamente en comparacion con un control. En otro aspecto, la expresion o funcion esta regulada negativamente en comparacion con un control.
En otro aspecto, los oligonucleotidos comprenden secuencias de acido nucleico expuestas como las SEQ ID NO: 7 a 30 31, incluyendo secuencias antisentido que se identifican y expanden usando, por ejemplo, PCR, hibridacion, etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o ligamientos internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto, los nucleotidos comprenden un derivado de fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede enlazarse con el azucar o resto analogo de 35 azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato anteriormente senalados, y su incorporacion a nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos per se, es tambien conocida y no tiene que describirse aquf.
40 La especificidad y sensibilidad de los compuestos antisentido se aprovechan tambien por los especialistas en la materia para usos terapeuticos. Los oligonucleotidos antisentido se han empleado como restos terapeuticos en el tratamiento de estados patologicos en animales y hombres. Los oligonucleotidos antisentido se han administrado con seguridad y efectividad a seres humanos y estan actualmente en ejecucion actualmente numerosos ensayos clfnicos. Esta por tanto establecido que los oligonucleotidos pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden 45 configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.
En aspectos de la presente divulgacion, los compuestos antisentido oligomericos, particularmente oligonucleotidos, se unen a moleculas de acido nucleico diana y modulan la expresion y/o funcion de moleculas codificadas por un 50 gen diana. Las funciones del DNA para interferir comprenden, por ejemplo, replicacion y transcripcion. Las funciones del RNA para interferir comprenden todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocacion del RNA al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna a partir del RNA, splicing del RNA procurando una o mas especies de mRNA y actividad catalftica que puede organizarse o facilitarse por el RNA. Las funciones pueden regularse positivamente o inhibirse dependiendo de las funciones deseadas.
55
Los compuestos antisentido incluyen compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), secuencias de splicing alternativas, cebadores, sondas y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una porcion del acido nucleico diana. Como tales, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente
monocatenarios o circulares.
Orientar un compuesto antisentido a una molecula de acido nucleico particular, en el contexto de esta divulgacion, puede ser un proceso multietapa. El proceso empieza habitualmente con la identificacion de un acido nucleico diana 5 cuya funcion se va a modular. Este acido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o mRNA transcrito a partir del gen) cuya expresion esta asociada a un trastorno o estado patologico particular, o una molecula de acido nucleico de un agente infeccioso. En la presente divulgacion, el acido nucleico diana codifica una adiponectina (ADIPOQ).
10 El proceso de orientacion incluye habitualmente tambien la determinacion de al menos una region, segmento o sitio diana en el acido nucleico diana para que ocurra la interaccion antisentido de tal modo que de como resultado el efecto deseado, p.ej., modulacion de la expresion. Dentro del contexto de la presente divulgacion, el termino “region” se define como una porcion del acido nucleico diana que tiene al menos una estructura, funcion o caracterfstica identificable. En las regiones de acidos nucleicos diana estan los segmentos. Los “segmentos” se definen como 15 regiones menores o subporciones de regiones dentro de un acido nucleico diana. Los “sitios”, como se usa en la presente divulgacion, se definen como posiciones dentro de un acido nucleico diana.
En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a secuencias antisentido naturales de una adiponectina (ADIPOQ) y modulan la expresion y/o funcion de una adiponectina (ADIPOQ). Los ejemplos de secuencias 20 antisentido incluyen las SEQ ID NO: 7 a 31.
En otro aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a uno o mas segmentos de un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) y modulan la expresion y/o funcion de una adiponectina (ADIPOQ). Los segmentos comprenden al menos cinco nucleotidos consecutivos de polinucleotidos con sentido o antisentido de adiponectina 25 (ADIPOQ).
En otro aspecto, los oligonucleotidos antisentido son especfficos de secuencias antisentido naturales de una adiponectina (ADIPOQ), donde la union de los oligonucleotidos a las secuencias antisentido naturales de una adiponectina (ADIPOQ) modula la expresion y/o funcion de una adiponectina (ADIPOQ).
30
En otro aspecto, los compuestos oligonucleotfdicos comprenden las secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 7 a 31, secuencias antisentido que se identifican y expanden usando, por ejemplo, PCR, hibridacion, etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o ligamientos internucleotfdicos comprenden 35 fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto, los nucleotidos comprenden un derivado de fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede enlazarse con el azucar o resto analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato anteriormente senalados y su incorporacion a nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos per sees tambien conocido y no tiene que 40 describirse aquf.
Puesto que, como es conocido en la materia, el codon de inicio de la traduccion es tfpicamente 5'-AUG (en moleculas de mRNA transcritas; 5'-ATG en la correspondiente molecula de DNA), se hace tambien referencia al codon de inicio de la traduccion como el “codon AUG”, el “codon de inicio” o “el codon de inicio AUG”. Una minorfa 45 de genes tiene un codon de inicio de la traduccion que tiene las secuencias de RNA5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG; y se ha mostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. Por tanto, los terminos “codon de inicio de la traduccion” y “codon de inicio” pueden englobar muchas secuencias de codon, aunque el aminoacido iniciador en cada caso es tfpicamente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). Los genes eucarioticos y procarioticos pueden tener dos o mas codones de inicio alternativos, cualquiera de los cuales puede utilizarse 50 preferiblemente para el inicio de la traduccion en un tipo celular o tejido particular, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la divulgacion, “codon de inicio” y “codon de inicio de la traduccion” hace referencia al codon o codones que se usan in vivo para iniciar la traduccion de un mRNA transcrito a partir de un gen que codifica una adiponectina (ADIPOQ), independientemente de la secuencia o secuencias de dichos codones. Un codon de terminacion de la traduccion (o “codon de terminacion”) de un gen puede tener una de tres secuencias: es decir, 5'55 UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las correspondientes secuencias de DNA son 5'-TAA, 5'- TAG y 5'-TGA, respectivamente).
Los terminos “region de codon de inicio” y “region de codon de inicio de la traduccion” hacen referencia a una porcion de dicho mRNA o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') a partir de un codon de inicio de la traduccion. De forma similar, los terminos
“region de codon de terminacion” y “region de codon de terminacion de la traduccion” hacen referenda a una porcion de dicho mRNA o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') a partir de un codon de terminacion de la traduccion. En consecuencia, la “region de codon de inicio” (o “region de codon de inicio de la traduccion”) y la “region de codon de terminacion” (o 5 “region de codon de terminacion de la traduccion”) son todas regiones a las que pueden orientarse efectivamente los compuestos antisentido de la presente divulgacion.
El marco abierto de lectura (ORF) o “region codificante”, que es conocido en la materia por hacer referencia a la region entre el codon de inicio de la traduccion y el codon de terminacion de la traduccion, es tambien una region a 10 la que pueden orientarse efectivamente. Dentro del contexto de la presente divulgacion, es una region diana la region intragenica que engloba el codon de inicio o terminacion de la traduccion del marco abierto de lectura (ORF) de un gen.
Otra region diana incluye la region 5' no traducida (5'UTR), conocida en la materia por hacer referencia a la porcion 15 de un mRNA en direccion 5' desde el codon de inicio de la traduccion, e incluyendo por tanto los nucleotidos entre el sitio de caperuza 5' y el codon de inicio de la traduccion de un mRNA (o los correspondientes nucleotidos en el gen). Aun otra region diana incluye la region 3' no traducida (3'UTR), conocida en la materia por hacer referencia a la porcion de un mRNA en la direccion 3' desde el codon de terminacion de la traduccion, e incluyendo por tanto los nucleotidos entre el codon de terminacion de la traduccion y el extremo 3' de un mRNA (o los correspondientes 20 nucleotidos en el gen). El sitio de caperuza 5' de un mRNA comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo mas 5' del mRNA a traves de un ligamiento trifosfato 5'-5'. La region de caperuza 5' de un mRNA se considera que incluye la estructura de caperuza 5' misma asf como los 50 primeros nucleotidos adyacentes al sitio de caperuza. Otra region diana para esta divulgacion es la region de caperuza 5'.
25 Aunque algunos transcritos de mRNA eucariotico se traducen directamente, muchos contienen una o mas regiones, conocidas como “intrones”, que se escinden del transcrito antes de traducir. Las regiones restantes (y por lo tanto traducidas) son conocidas como “exones” y se someten a splicing conjuntamente formando una secuencia de mRNA continua. En un aspecto, los sitios de splicing diana, es decir las uniones intron-exon o uniones exon-intron, son particularmente utiles en situaciones en que esta implicado en la enfermedad un splicing aberrante, o cuando esta 30 implicada en la enfermedad una sobreproduccion de un producto de splicing particular. Una union de fusion aberrante debida a transposicion o delecion es otro aspecto de un sitio diana. Los transcritos de mRNA, producidos a traves del proceso de splicing de dos (o mas) mRNA de diferentes fuentes genicas son conocidos como “transcritos de fusion”. En los intrones puede hacerse diana efectivamente usando compuestos antisentido orientados, por ejemplo, a DNA o pre-mRNA.
35
En otro aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a regiones codificantes y/o no codificantes de un polinucleotido diana y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.
En otro aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos antisentido naturales y modulan la 40 expresion y/o funcion de la molecula diana.
En otro aspecto, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos con sentido y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.
45 Pueden producirse transcritos de RNA alternativos a partir de la misma region genomica de DNA. Estos transcritos alternativos son generalmente conocidos como “variantes”. Mas especfficamente, las “variantes de pre-mRNA” son transcritos producidos a partir del mismo DNA genomico que difieren de otros transcritos producidos a partir del mismo DNA genomico en cualquiera de su posicion de inicio o terminacion y contienen tanto secuencias intronicas como exonicas.
50
Tras la escision de una o mas regiones exonicas o intronicas, o porciones de las mismas, durante el splicing, las variantes de pre-mRNAproducen“variantes de pre-mRNA” menores. En consecuencia, las variantes de mRNA son variantes de pre-mRNA procesadas y cada variante de pre-mRNA unica debe producir siempre una unica variante de mRNA como resultado del splicing. Estas variantes de mRNA son tambien conocidas como “variantes de splicing 55 alternativas”. Si no aparece splicing de la variante de pre-mRNA, entonces la variante de pre-mRNA es identica a la variante de mRNA.
Las variantes pueden producirse mediante el uso de senales alternativas para iniciar o terminar la transcripcion. Los pre-mRNA y mRNA pueden poseer mas de un codon de inicio o codon de terminacion. Las variantes que se originan
a partir de un pre-mRNA o mRNA que usan codones de inicio alternatives son conocidas como “variantes de inicio alternative” de ese pre-mRNA o mRNA. Aquellos transcritos que usan un codon de terminacion alternativo son conocidos como “variantes de terminacion alternativa” de ese pre-mRNA o mRNA. Es un tipo especffico de variante de terminacion alternativa la “variante poliA”, en que los multiples transcritos producidos son el resultado de la 5 seleccion alternativa de una de las “senales de terminacion poliA” por la maquinaria de transcripcion, produciendo asf transcritos que terminan en sitios poliA unicos. Dentro del contexto de la divulgacion, los tipos de variantes descritos en la presente memoria son tambien aspectos de acidos nucleicos diana.
Las localizaciones del acido nucleico diana con las que hibridan los compuestos antisentido se definen como al 10 menos una porcion de 5 nucleotidos de largo de una region diana a la que esta orientada un compuesto antisentido activo.
Aunque se exponen en la presente memoria secuencias especfficas de ciertos segmentos diana ejemplares, un especialista en la materia reconocera que estas sirven para ilustrar y describir aspectos particulares dentro del 15 alcance de la presente divulgacion. Son facilmente identificables segmentos diana adicionales por un especialista en la materia a la vista de esta divulgacion.
Los segmentos diana de 5-100 nucleotidos de longitud que comprenden un tramo de al menos cinco (5) nucleotidos consecutivos seleccionados de entre los segmentos diana ilustrativos son considerados adecuados como diana 20 tambien.
Los segmentos diana pueden incluir secuencias de DNA o RNA que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana ilustrativos (siendo los nucleotidos restantes un tramo consecutivo del mismo DNA o RNA que empieza inmediatamente en direccion 5' del extremo 5' del segmento 25 diana y que continua hasta el DNA o RNA contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). Se representan segmentos diana de forma similar por secuencias de DNA o RNA que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 3' de uno de los segmentos diana ilustrativos (siendo los nucleotidos restantes un tramo consecutivo del mismo DNA o RNA que empieza inmediatamente en direccion 3' del extremo 3' del segmento diana y que continua hasta que el DNA o RNA contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 100 nucleotidos). Un especialista en la materia provisto de los segmentos diana ilustrados en la presente memoria sera capaz, sin experimentacion indebida, de identificar segmentos diana adicionales.
Una vez se han identificado una mas regiones, segmentos o sitios diana, se eligen compuestos antisentido que sean suficientemente complementarios con la diana, es decir, que hibriden suficientemente bien y con suficiente 35 especificidad, dando el efecto deseado.
En aspectos de la divulgacion, los oligonucleotidos se unen a una hebra antisentido de una diana particular. Los oligonucleotidos son de al menos 5 nucleotidos de longitud y pueden sintetizarse de modo que cada oligonucleotido se oriente a secuencias superpuestas de tal modo que se sinteticen oligonucleotidos para cubrir toda la longitud del 40 polinucleotido diana. Las dianas incluyen tambien regiones codificantes asf como no codificantes.
En un aspecto, los oligonucleotidos antisentido se orientan a acidos nucleicos especfficos. Orientar un compuesto antisentido a un acido nucleico particular es un proceso multietapa. El proceso empieza habitualmente con la identificacion de una secuencia de acido nucleico cuya funcion se ha de modular. Este puede ser, por ejemplo, un 45 gen celular (o mRNA transcrito a partir del gen) cuya expresion este asociada a un trastorno o estado patologico particular, o un polinucleotido no codificante tal como, por ejemplo, RNA no codificante (ncRNA).
Los RNA pueden clasificarse como (1) RNA mensajeros (mRNA), que se traducen en protefnas, y(2) RNA no codificantes de protefna (ncRNA). Los ncRNA comprenden microRNA, transcritos antisentido y otras unidades 50 transcripcionales (TU) que contienen una alta densidad de codones de terminacion y que carecen de cualquier “marco abierto de lectura” extenso. Muchos ncRNA parecen empezar a partir de los sitios de inicio en las regiones 3' no traducidas (3'UTR) de loci codificantes de protefna. Los ncRNA son a menudo escasos y al menos la mitad de los ncRNA que se han secuenciado por el consorcio FANTOM no parecen estar biotinilados. La mayorfa de investigadores se han centrado por razones obvias en los mRNA poliadenilados, que se procesan y exportan al 55 citoplasma. Recientemente, se ha mostrado que el conjunto de RNA nucleares no poliadenilados puede ser muy grande, y que muchos transcritos surgen de regiones intergenicas. El mecanismo mediante el cual los ncRNA pueden regular la expresion genica es por apareamiento de bases con transcritos diana. Los RNA que funcionan por apareamiento de bases pueden agruparse en (1) RNA codificados en cis, que estan codificados en la misma localizacion genetica, pero en la hebra opuesta de los RNA sobre los que actuan y por lo tanto exhiben una
complementariedad perfecta con su diana, y (2) RNA codificados en trans, que estan codificados en una localizacion cromosomica distinta de los RNA sobre los que actuan, y generalmente no exhiben un potencial de apareamiento de bases perfecto con sus dianas.
5 Sin desear ligarse a teorfa alguna, la perturbacion de un polinucleotido antisentido por los oligonucleotidos antisentido descritos en la presente memoria puede alterar la expresion de los correspondientesRNA mensajero con sentido. Sin embargo, esta regulacion puede ser discordante (resultados de desactivacion genica antisentido con elevacion del RNA mensajero) o concordante (resultados de desactivacion genica antisentido con reduccion concomitante del RNA mensajero). En estos casos, pueden orientarse los oligonucleotidos antisentido a partes 10 superpuestas o no superpuestas del transcrito antisentido, dando como resultado su desactivacion genica o captura. Los compuestos antisentido codificantes asf como no codificantes pueden orientarse de manera identica y cualquier categorfa es capaz de regular los correspondientes transcritos con sentido, de manera concordante o discordante. Las estrategias que se emplean en la identificacion de nuevos oligonucleotidos para uso contra una diana pueden basarse en la desactivacion genica de transcritos de RNA antisentido por oligonucleotidos antisentido o cualquier 15 otro medio de modular la diana deseada.
Estrategia 1:En el caso de regulacion discordante, la desactivacion genica del transcrito antisentido eleva la expresion del gen convencional (con sentido). Si este ultimo gen codifica una diana farmacologica conocida o supuesta, entonces la desactivacion genica de su contrapartida antisentido podrfa imitar convincentemente la accion 20 de un agonista de receptor o estimulante enzimatico.
Estrategia 2: En el caso de regulacion concordante, podrfan desactivarse genicamente a la vez ambos transcritos antisentido y con sentido y conseguirse asf una reduccion sinergica de la expresion genica (con sentido) convencional. Si se usa, por ejemplo, un oligonucleotido antisentido para conseguir la desactivacion genica, 25 entonces puede usarse esta estrategia para aplicar un oligonucleotido antisentido orientado al transcrito con sentido y otro oligonucleotido antisentido al correspondiente transcrito antisentido, o un unico oligonucleotido antisentido energeticamente simetrico que se oriente simultaneamente a los transcritos con sentido y antisentido superpuestos.
De acuerdo con la presente divulgacion, los compuestos antisentido incluyen oligonucleotidos antisentido, ribozimas, 30 oligonucleotidos de gufa externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia de RNA mono- o bicatenarios (iRNA) tales como compuestos de siRNA y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una porcion del acido nucleico diana y modulan su funcion. Como tales, pueden ser DNA, RNA, de tipo DNA, de tipo RNA o mezclas de los mismos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o en horquilla, y pueden contener elementos 35 estructurales tales como protuberancias, desapareamientos o bucles internos o terminales. Los compuestos antisentido se preparan rutinariamente de forma lineal, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden incluir constructos tales como, por ejemplo, dos hebras hibridadas formando un compuesto total o parcialmente bicatenario o una sola hebra con suficiente autocomplementariedad para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto total o parcialmente bicatenario. 40 Las dos hebras pueden ligarse internamente dejando extremos 3' o 5' libres o pueden ligarse formando una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un saliente en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produzca una extension de caracter monocatenario. Los compuestos bicatenarios pueden incluir opcionalmente salientes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados enlazados con uno de los extremos, posiciones nucleotfdicas seleccionadas, posiciones de azucar o con uno de los 45 ligamientos internucleosfdicos. Como alternativa, las dos hebras pueden ligarse a traves de un resto no de acido nucleico o grupo ligador. Cuando se forma a partir de solo una hebra, el dsRNA puede tomar la forma de una molecula de tipo horquilla autocomplementaria que se duplica sobre si misma formando un duplex. Por tanto, los dsRNA pueden ser total o parcialmente bicatenarios. Puede conseguirse la modulacion especffica de la expresion genica mediante expresion estable de horquillas de dsRNA en lfneas celulares transgenicas, sin embargo, en 50 algunos aspectos la expresion o funcion genica esta regulada positivamente. Cuando se forma por dos hebras, o una sola hebra que toma la forma de una molecula de tipo horquilla autocomplementaria duplicada sobre si misma formando un duplex, las dos hebras (o regiones formadoras de duplex de una sola hebra) son hebras de RNA complementario que se aparean por bases de modo Watson-Crick.
55 Una vez introducidos en un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden desencadenar la accion de una o mas enzimas o protefnas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden funcionar a traves de mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo oligonucleotidos) pueden describirse como “de tipo dNa” (es decir, tienen generalmente uno o mas 2'- desoxiazucares y, generalmente, bases T en lugar de U) o “de tipo RNA” (es decir, tienen generalmente uno o mas
2'-hidroxiazucares o azucares 2’-modificados y, generalmente, bases U en lugar de T). Las helices de acido nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, lo mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura de tipo forma B son “de tipo DNA” y aquellos que tienen estructura de tipo forma A son “de tipo RNA”. En algunos casos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener ambas 5 regiones de forma A y B.
En otro aspecto, los oligonucleotidos o compuestos antisentido deseados comprenden al menos uno de:RNA antisentido, DNA antisentido, oligonucleotidos antisentido quimericos, oligonucleotidos antisentido que comprenden ligamientos modificados, RNA de interferencia (RNAi), RNA interferente corto (siRNA), microRNA interferente 10 (miRNA); un RNA temporal pequeno (stRNA) o un RNA de horquilla corto (shRNA); activacion genica inducida por RNA pequeno (RNAa); RNA activadores pequenos (saRNA) o combinaciones de los mismos.
Los dsRNA pueden activar tambien la expresion genica, un mecanismo que se ha denominado “activacion genica inducida por RNA pequeno” o RNAa. Los promotores genicos orientados a dsRNA inducen una potente activacion 15 transcripcional de los genes asociados. La RNAa se ha demostrado en celulas humanas usando dsRNA sinteticos denominados “RNA activadores pequenos” (saRNA).
Se ha encontrado que los RNA bicatenarios (dsRNA) pequenos, tales como RNA interferente pequeno (siRNA) y microRNA (miRNA) son el desencadenante de un mecanismo evolutivamente conservado conocido como 20 interferencia de RNA (RNAi). La RNAi conduce invariablemente al silenciamiento genico. Sin embargo, en aspectos descritos con detalle en la seccion de ejemplos siguiente, se muestran oligonucleotidos que aumentan la expresion y/o funcion de polinucleotidos de adiponectina (ADIPOQ) y productos codificados de los mismos. Los dsRNA pueden actuar tambien como RNA activadores pequenos (saRNA). Sin desear ligarse a teorfa alguna, al orientar secuencias en promotores genicos, los saRNA inducirfan la expresion genica diana en un fenomeno al que se hace referencia 25 como activacion transcripcional inducida por dsRNA (RNAa).
En un aspecto adicional, los “segmentos diana” identificados en la presente memoria pueden emplearse en un cribado de compuestos adicionales que modulen la expresion de un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ). Los “moduladores” son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido 30 nucleico que codifica una adiponectina (ADIPOQ) y que comprenden al menos una porcion de 5 nucleotidos que es complementaria de un segmento diana. El procedimiento de cribado comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidoscon sentido o antisentido naturales de una adiponectina (ADIPOQ) con uno o mas candidatos a moduladores; y seleccionar uno o mas candidatos a modulador que disminuyan o aumenten la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica un 35 polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ), p.ej. las SEQ ID NO: 7 a 31. Una vez se muestra que el candidato o candidatos a modulador es capaz de modular (p.ej., disminuir o aumentar) la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ), puede emplearse entonces el modulador en estudios de investigacion adicionales de la funcion de un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ), o para uso como agente de investigacion, diagnostico o terapeutico de acuerdo con la presente divulgacion.
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Al orientar la secuencia antisentido natural, se modula la funcion del gen diana. Por ejemplo, la adiponectina (ADIPOQ) (p.ej., los numeros de acceso NM_004797 y NM_024551). En un aspecto, la diana es un polinucleotido antisentido de adiponectina (ADIPOQ). En un aspecto, un oligonucleotido antisentido se orienta a secuencias con sentido y/o antisentido naturales de un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) (p.ej., los numeros de acceso 45 NM_004797 y NM_024551), variantes, alelos, isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias de los mismos. Preferiblemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido y las dianas incluyen regiones codificantes y no codificantes de polinucleotidos de adiponectina (ADIPOQ) antisentido y/o con sentido.
50 Los segmentos diana de la presente divulgacion pueden combinarse tambien con sus respectivos compuestos antisentido complementarios de la presente divulgacion formando oligonucleotidos bicatenarios estabilizados (duplex).
Se ha mostrado en la materia que dichos restos oligonucleotfdicos bicatenarios modulan la expresion de diana y 55 regulan la traduccion asf como el procesamiento de RNA a traves de un mecanismo antisentido. Ademas, los restos bicatenarios pueden someterse a modificaciones qufmicas. Por ejemplo, se ha mostrado que dichos restos bicatenarios inhiben la diana mediante la hibridacion clasica de la hebra antisentido del duplex con la diana, desencadenando asf la degradacion enzimatica de la diana.
En un aspecto, un oligonucleotido antisentido se orienta a polinucleotidos de adiponectina (ADIPOQ) (p.ej. numeros de acceso NM_004797 y NM_024551), variantes, alelos, isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias de los mismos. Preferiblemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.
5 De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no esta limitada a adiponectina (ADIPOQ) sola, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos y similares de una molecula de adiponectina (ADIPOQ).
En otro aspecto, un oligonucleotido se orienta a una secuencia antisentido natural de un polinucleotido de 10 adiponectina (ADIPOQ), por ejemplo los polinucleotidos expuestos como las SEQ ID NO: 3 a 6, y a cualquier variante, alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria de los mismos. Se exponen ejemplos de oligonucleotidos antisentido como las SEQ ID NO: 7 a 31.
En un aspecto, los oligonucleotidos son complementarios de o se unen a secuencias de acido nucleico de un 15 compuesto antisentido de adiponectina (ADIPOQ) incluyendo, sin limitacion, secuencias con sentido y/o antisentido no codificantes asociadas a un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) y modulan la expresion y/o funcion de una molecula de adiponectina (ADIPOQ).
En otro aspecto, los oligonucleotidos son complementarios de o se unen a secuencias de acido nucleico de un 20 compuesto antisentido natural de adiponectina (ADIPOQ) expuesto como las SEQ ID NO: 3 a 6, y modulan la expresion y/o funcion de una molecula de adiponectina (ADIPOQ).
En un aspecto, los oligonucleotidos comprenden secuencias de al menos 5 nucleotidos consecutivos de SEQ ID NO: 7 a 31 y modulan la expresion y/o funcion de una molecula de adiponectina (ADIPOQ).
25
Las dianas polinucleotfdicas comprenden adiponectina (ADIPOQ), incluyendo los miembros de la familia de la misma, variantes de una adiponectina (ADIPOQ); mutantes de una adiponectina (ADIPOQ) incluyendo SNP; secuencias no codificantes de una adiponectina (ADIPOQ); alelos de una adiponectina (ADIPOQ); variantes de especie, fragmentos y similares. Preferiblemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.
30
En otro aspecto, el oligonucleotido orientado a polinucleotidos de adiponectina (ADIPOQ) comprende: RNA antisentido, RNA de interferencia (RNAi), RNA interferente corto (siRNA); microRNA interferente (miRNA); un RNA temporal pequeno (stRNA); o un RNA de horquilla pequeno (shRNA); activacion genica inducida por RNA pequeno (RNAa); o rNa activador pequeno (saRNA).
35
En otro aspecto, la orientacion a un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ), p.ej. las SEQ ID NO: 3 a 6, modula la expresion o funcion de estas dianas. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada positivamente en comparacion con un control. En otro aspecto, la expresion o funcion esta regulada negativamente en comparacion con un control.
40
En otro aspecto, los compuestos antisentido comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 7 a 31. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares.
45 En otro aspecto, las SEQ ID NO: 7 a 31 comprenden uno o mas nucleotidos de LNA.
La modulacion de un acido nucleico diana deseado puede llevarse a cabo de varios modos conocidos en la materia, por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, siRNA, etc. Las moleculas de acido nucleico enzimaticas (p.ej., ribozimas) son moleculas de acido nucleico capaces de catalizar una o mas de una variedad de reacciones, incluyendo la 50 capacidad de escindir repetidamente otras moleculas de acido nucleico separadas de manera especffica de la secuencia de bases nucleotfdicas. Dichas moleculas de acido nucleico enzimaticas pueden usarse, por ejemplo, para orientarse a virtualmente cualquier transcrito de RNA.
Debido a su especificidad de secuencia, las moleculas de acido nucleico enzimaticas de escision en trans se 55 muestran prometedoras como agentes terapeuticos para enfermedad humana. Las moleculas de acido nucleico enzimaticas pueden disenarse para escindir dianas de RNA especfficas en el fondo de RNA celular. Dicho evento de escision vuelve el mRNA no funcional y anula la expresion proteica de ese RNA. De esta manera, puede inhibirse selectivamente la sfntesis de una protefna asociada a un estado patologico.
En general, los acidos nucleicos enzimaticos con actividad de escision de RNA actuan uniendose en primer lugar a un RNA diana. Dicha union ocurre a traves de la porcion de union a diana de un acido nucleico enzimatico, que se mantiene en estrecha proximidad con una porcion enzimatica de la molecula, que actua escindiendo el RNA diana. Por tanto, el acido nucleico enzimatico reconoce en primer lugar y se une entonces a un RNA diana a traves de 5 apareamiento de bases complementarias, y una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente cortando el RNA diana. La escision estrategica de dicho RNA diana destruira su capacidad de dirigir la sfntesis de una protefna codificada. Despues de que un acido nucleico enzimatico se haya unido a y escindido su diana de RNA, se libera de ese RNA para buscar otra diana y puede unirse a y escindir repetidamente nuevas dianas.
10 Se han usado varios enfoques, tales como estrategias de seleccion (evolucion) in vitro para hacer evolucionar nuevos catalizadores de acido nucleico capaces de catalizar una variedad de reacciones, tales como escision y ligacion de ligamientos fosfodiester y ligamientos amida.
El desarrollo de ribozimas que sean optimas para la actividad catalftica contribuirfa significativamente a cualquier 15 estrategia que emplee ribozimas de escision de RNA con el fin de regular la expresion genica. La ribosoma de cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una tasa catalftica (kcat) de aproximadamente 1 min-1 en presencia de concentraciones saturantes (10 mM) de cofactor Mg2+. Se ha mostrado que una ribozima “RNA ligasa” artificial cataliza la correspondiente reaccion de automodificacion con una tasa de aproximadamente 100 min-1. Ademas, es conocido que ciertas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen brazos de union a sustrato compuestos 20 por DNA catalizan la escision de RNA con tasas de recambio multiples que se acercan a 100 min-1. Finalmente, el reemplazo de un residuo especffico en el nucleo catalftico de la cabeza de martillo por ciertos analogos nucleotfdicos da ribozimas modificadas que muestran tanto como 10 veces de mejora de la tasa catalftica. Estos hallazgos demuestran que las ribozimas pueden promover transformaciones qufmicas con tasas catalfticas que son significativamente mayores que las exhibidas in vitro por la mayorfa de ribozimas de autoescision naturales. Es 25 posible entonces que las estructuras de ciertas ribozimas de autoescision puedan optimizarse, dando una actividad catalftica maxima, o que puedan elaborarse motivos de RNA enteramente nuevos que exhiban tasas significativamente mas rapidas de escision de RNA-fosfodiester.
La escision intermolecular de un sustrato de RNA por un catalizador de RNA que se ajusta al modelo de “cabeza de 30 martillo” se mostro por primera vez en 1987. El catalizador de RNA se recupero y se hizo reaccionar con multiples moleculas de RNA, demostrando que era verdaderamente catalftico.
Los RNA catalfticos disenados basandose en el motivo de “cabeza de martillo” se han usado para escindir secuencias diana especfficas haciendo los cambios de base apropiados en el RNA catalftico para mantener el 35 apareamiento de bases necesario con las secuencias diana. Esto ha permitido el uso de RNA catalftico para escindir secuencias diana especfficas e indica que los RNA catalfticos disenados de acuerdo con el modelo de “cabeza de martillo” pueden escindir posiblemente RNA sustrato especfficos in vivo.
La interferencia de RNA (RNAi) se ha convertido en una poderosa herramienta para modular la expresion genica en 40 mamfferos y celulas de mamffero. Este enfoque requiere el suministro de RNA interferente pequeno (siRNA) como RNA mismo o como DNA, usando un plasmido de expresion o virus, y la secuencia de codificacion de RNA de horquilla pequenos que se procesan hasta siRNA. Este sistema posibilita un transporte eficiente de los pre-siRNA al citoplasma, donde son activos y permiten el uso de promotores regulados y especfficos de tejido para expresion genica.
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En un aspecto, un oligonucleotido o compuesto antisentido comprende un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (RNA) y/o acido desoxirribonucleico (DNA) o un mimetico, quimera, analogo u homologo del mismo. Este termino incluye oligonucleotidos compuestos por nucleotidos de origen natural, azucares y ligamientos internucleosfdicos covalentes (esqueleto) asf como oligonucleotidos que tienen porciones de origen no natural que 50 funcionan de modo similar. Dichos oligonucleotidos modificados o sustituidos se desean a menudo frente a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captacion celular mejorada, afinidad mejorada por un acido nucleico diana y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
De acuerdo con la presente divulgacion, los oligonucleotidos o “compuestos antisentido” incluyen oligonucleotidos 55 antisentido (p.ej., RNA, DNA, mimeticos, quimeras, analogos u homologos de los mismos), ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia de RNA (RNAi) mono- o bicatenarios tales como compuestos de siRNA, saRNA, aRNA y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una porcion del acido nucleico diana y modulan su funcion. Como tales, pueden ser dNa, RNA, de tipo DNA, de tipo RNA o mezclas de los mismos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos
compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o en horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias, desapareamientos o bucles internos o terminales. Los compuestos antisentido se preparan rutinariamente de forma lineal, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden incluir constructos tales como, por ejemplo, 5 dos hebras hibridadas formando un compuesto total o parcialmente bicatenario o una sola hebra con suficiente autocomplementariedad para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto total o parcialmente bicatenario. Las dos hebras pueden ligarse internamente dejando extremos 3' o 5' libres o pueden ligarse formando una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un saliente en el extremo 5' o 3' que produce una extension de caracter monocatenario. Los compuestos bicatenarios pueden incluir opcionalmente 10 salientes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados enlazados con uno de los extremos, posiciones nucleotfdicas seleccionadas, posiciones de azucar o uno de los ligamentos internucleosfdicos. Como alternativa, las dos hebras pueden ligarse a traves de un resto no de acido nucleicoo grupo ligador. Cuando se forma a partir de solo una hebra, el dsRNA puede tomar la forma de una molecula de tipo horquilla autocomplementaria que se duplica sobre si misma formando un duplex. Por tanto, los dsRNA pueden ser total o 15 parcialmente bicatenarios. Puede conseguirse la modulacion especffica de la expresion genica mediante la expresion estable de horquillas de dsRNA en lfneas celulares transgenicas. Cuando se forman a partir de dos hebras, o una sola hebra que toma la forma de una molecula de tipo horquilla autocomplementaria duplicada sobre si misma formando un duplex, las dos hebras (o regiones formadoras de duplex de una sola hebra) son hebras de RNA complementarias que se aparean por bases de modo Watson-Crick.
20
Una vez introducidos en un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden desencadenar la accion de una o mas enzimas o protefnas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana, o pueden funcionar mediante mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo oligonucleotidos) pueden describirse como “de tipo dNa” (es decir, que tienen generalmente uno o mas 2'25 desoxiazucares y, generalmente, bases T en lugar de U) o “de tipo RNA” (es decir, que tienen generalmente uno o mas 2'-hidroxiazucares o azucares 2'-modificados y, generalmente, bases U en lugar de T). Las helices de acido nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, lo mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura de tipo B son “de tipo DNA” y aquellos que tienen estructura de tipo A son “de tipo RNA”. En algunos aspectos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto 30 regiones de forma A como B.
Los compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion pueden comprender una porcion antisentido de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleotidos (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleosidos ligados) de longitud. Esto hace referencia a la longitud de la hebra antisentido o porcion del compuesto 35 antisentido. En otras palabras, un compuesto antisentido monocatenario de la divulgacion comprende de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos, y un compuesto antisentido bicatenario de la divulgacion (tal como un dsRNA, por ejemplo) comprende una hebra con sentido y otra antisentido o porcion de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos de longitud. Un especialista en la materia apreciara que esto comprende porciones antisentido de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,
40 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo intermedio.
En un aspecto, los compuestos antisentido de la divulgacion tienen porciones antisentido de 10 a 50 nucleotidos de
longitud. Un especialista en la materia apreciara que esto representa oligonucleotidos que tienen porciones 45 antisentido de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo intermedio. En algunos casos, los oligonucleotidos son de 15 nucleotidos de longitud.
En un aspecto, los compuestos antisentido u oligonucleotfdicos de la divulgacion tienen porciones antisentido de 12 50 o 13 a 30 nucleotidos de longitud. Un especialista en la materia apreciara que esto representa compuestos antisentido que tienen porciones antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo intermedio.
En otro aspecto, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion incluyen tambien variantes en que esta 55 presente una base diferente en una o mas de las posiciones nucleotfdicas en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenosina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina o citidina en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones de los compuestos antisentido o de dsRNA. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en la presente memoria para determinar su capacidad de inhibir la expresion de un acido nucleico diana.
En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente 60 % a 5 aproximadamente 70 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente 90 %, aproximadamente 10 92 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o aproximadamente 100%.
En otro aspecto, los oligonucleotidos antisentido, tales como por ejemplo las moleculas de acido nucleico expuestas en las SEQ ID NO: 7 a 31, comprenden una o mas sustituciones o modificaciones. En un aspecto, los nucleotidos 15 estan sustituidos con acidos nucleicos bloqueados (LNA).
En otro aspecto, los oligonucleotidos se orientan a una o mas regiones de las moleculas de acido nucleico con sentido y/o antisentido de secuencias codificantes y/o no codificantes asociadas a adiponectina (ADIPOQ) y las secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 1 a 6. Los oligonucleotidos se orientan tambien a regiones 20 superpuestas de las SEQ ID NO: 1 a 6.
Ciertos oligonucleotidos de esta divulgacion son oligonucleotidos quimericos. “Oligonucleotidos quimericos” o “quimeras” en el contexto de esta divulgacion son oligonucleotidos que contienen dos o mas regiones qufmicamente distintas, cada una compuesta por al menos un nucleotido. Estos oligonucleotidos contienen tfpicamente al menos 25 una region de nucleotidos modificados que confiere una o mas propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasa aumentada, captacion aumentada en celulas, afinidad de union aumentada por la diana) y una region que es un sustrato para enzimas capaces de escindir hfbridos de RNA:DNA o RNA:RNA. A modo de ejemplo, la RNAasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de RNA de un duplex de RNA:DNA. La activacion de la RNAasa H, por lo tanto, da como resultado la escision de la diana de RNA, mejorando asf en gran 30 medida la eficiencia de la modulacion antisentido de la expresion genica. En consecuencia, pueden obtenerse a menudo resultados comparables con oligonucleotidos mas cortos cuando se usan oligonucleotidos quimericos, en comparacion con desoxioligonucleotidos de fosforotioato que hibridan con la misma region diana. La escision de la diana de RNA puede detectarse rutinariamente por electroforesis en gel y, si es necesario, tecnicas de hibridacion de acido nucleico asociadas conocidas en la materia. En un aspecto, un oligonucleotido quimerico comprende al 35 menos una region modificada para aumentar la afinidad de union de la diana y, habitualmente, una region que actua como sustrato para RNAasa H. La afinidad de un oligonucleotido por su diana (en este caso, un acido nucleico que codifica ras) se determina rutinariamente midiendo la Tm de un par oligonucleotido/diana, que es la temperatura a la que se disocian oligonucleotido y diana; la disociacion se detecta espectrofotometricamente. Cuanto mayor es la Tm, mayor es la afinidad del oligonucleotido por la diana.
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Los compuestos antisentido quimericos de la divulgacion pueden formarse como estructuras compuestas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o mimeticos de oligonucleotidos como se describen anteriormente. Se hace referencia tambien a dichos compuestos en la materia como hfbridos o gapmeros. Las patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de dichos hfbridos comprenden, pero 45 sin limitacion, las patentes de EE.UU. n° 5.013.830, 5.149.797, 5.220.007, 5.256.775, 5.366.878, 5.403.711, 5.491.133, 5.565.350, 5.623.065, 5.652.355, 5.652.356 y 5.700.922.
En otro aspecto, la region del oligonucleotido que esta modificada comprende al menos un nucleotido modificado en la posicion 2' del azucar, lo mas preferiblemente un nucleotido modificado con 2'-Oalquilo, 2'-O-alquil-O-alquilo o 2'50 fluoro. En otros aspectos, las modificaciones de RNA incluyen modificaciones de 2'-fluoro, 2'-amino y 2'O-metilo en la ribosa de pirimidinas, residuos abasicos o una base invertida en el extremo 3' del RNA. Dichas modificaciones se incorporan rutinariamente a oligonucleotidos y se ha mostrado que estos oligonucleotidos tienen una mayor Tm (es decir, mayor afinidad de union por diana) que los 2'-desoxioligonucleotidos contra una diana dada. El efecto de dicha afinidad aumentada es mejorar en gran medida la inhibicion por oligonucleotido de RNAi de la expresion genica. La 55 RNAasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de RNA de duplex de RNA:DNA; la activacion de esta enzima da como resultado por lo tanto la escision del RNA diana, y por tanto puede mejorar en gran medida la eficiencia de la inhibicion de RNAi. La escision de la diana de RNA puede demostrarse rutinariamente por electroforesis en gel. En otro aspecto, el oligonucleotido quimerico se modifica tambien para mejorar la resistencia a nucleasa. Las celulas contienen una variedad de exo- y endonucleasas que pueden degradar acidos nucleicos. Se
ha mostrado que una serie de modificaciones nucleotfdicas y nucleosfdicas hacen mas resistente al oligonucleotido en el que se incorporan ante la digestion con nucleasa que el oligodesoxinucleotido nativo. La resistencia a nucleasa se mide rutinariamente incubando oligonucleotidos con extractos celulares o soluciones de nucleasa aislada y midiendo la extension del oligonucleotido intacto restante con el tiempo, habitualmente por electroforesis en gel. Los 5 oligonucleotidos que se han modificado para potenciar su resistencia a nucleasa sobreviven intactos durante mas tiempo que los oligonucleotidos no modificados. Se ha demostrado que una variedad de modificaciones oligonucleotfdicas mejoran o confieren resistencia a nucleasa. Los oligonucleotidos que contienen al menos una modificacion fosforotioato son actualmente mas preferidos. En algunos casos, las modificaciones oligonucleotfdicas que mejoran la afinidad de union a diana son tambien capaces, independientemente, de mejorar la resistencia a 10 nucleasa. Pueden encontrarse algunas modificaciones deseables en De Mesmaeker et al. (1995) Acc. Chem. Res., 28: 366-374.
Los ejemplos especfficos de algunos oligonucleotidos concebidos por esta divulgacion incluyen aquellos que comprenden esqueletos modificados, por ejemplo fosforotioatos, fosfotriesteres, metilfosfonatos, ligamientos entre 15 azucar de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o ligamientos entre azucar heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. La mayorfa son oligonucleotidos con esqueletos de fosforotioato y aquellos con esqueletos heteroatomicos, particularmente esqueletos de CH2-NH-O-CH2, CH,-N(CH3)-O-CH2 [conocido como metilen(metilimino) o esqueleto de MMI], CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 y O-N(CH3)-CH2-CH2, donde el esqueleto de fosfodiester nativo se representa como O-P-O-CH). Los esqueletos de amida divulgados por 20 De Mesmaeker et al. (1995) Acc. Chem. Res. 28: 366-374 son tambien preferidos. Tambien lo son los oligonucleotidos que tienen estructuras de esqueleto de morfolino (Summerton y Weller, patente de EE.UU. n° 5.034.506). En otros aspectos, tales como el esqueleto de acido peptidonucleico (PNA), el esqueleto de fosfodiester del oligonucleotido se reemplaza por un esqueleto de poliamida, estando unidos los nucleotidos directa o indirectamente a los atomos de nitrogeno azoicos del esqueleto de poliamida. Los oligonucleotidos pueden 25 comprender tambien uno o mas restos de azucar sustituidos, oligonucleotidos que comprenden uno de los siguientes en posicion 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3-O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 u O(CH2)nCH3 donde n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo inferior C1 a C10, alcoxialcoxilo, alquilo, alcarilo o aralquilo inferior sustituido; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido, un grupo de escision de 30 RNA; un grupo reportero; un intercalante; un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificacion incluye 2'-metoxietoxilo [2'-O-CH2CH2OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo)]. Otras modificaciones incluyen 2'-metoxilo (2'-O-CH3), 2'-propoxilo (2'- OCH2CH2CH3) y 2'-fluoro (2'-F). Pueden hacerse tambien modificaciones similares en otras posiciones del 35 oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido 3' terminal y la posicion 5' del nucleotido 5' terminal. Los oligonucleotidos pueden tener tambien mimeticos de azucar tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.
Los oligonucleotidos pueden incluir tambien, adicionalmente o como alternativa, modificaciones o sustituciones de 40 nucleobase (a la que se hace referencia a menudo en la materia simplemente como “base”). Como se usa en la presente memoria, los nucleotidos “no modificados” o “naturales” incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados incluyen nucleotidos encontrados solo infrecuente o transitoriamente en acidos nucleicos naturales, p.ej., hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me-pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (a la que se hace referencia tambien como 5-metil-2'-desoxicitosina y a la que se hace referencia a 45 menudo en la tecnica como 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosil-HMC y gentobiosil-HMC, asf como nucleotidos sinteticos, p.ej. 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2- (aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5- hidroximetiluracilo, 8-azaguanina,7-desazaguanina, N6,(6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. Puede incluirse una base "universal" conocida en la materia, p.ej., inosina. Las sustituciones de 5-Me-C se ha mostrado que 50 aumentan la estabilidad del duplex de acido nucleico en 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pag. 276-278) y son actualmente sustituciones basicas.
Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica el ligamiento qufmico con el oligonucleotido de 55 uno o mas restos o conjugados que mejoren la actividad o captacion celular del oligonucleotido. Dichos restos incluyen, pero sin limitacion, restos lipfdicos tales como un resto de colesterol, un resto de colesterilo, un tioeter, p.ej. hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, p.ej. residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolfpido, p.ej. dihexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantanoacetico. Los oligonucleotidos que comprenden restos lipofilos, y
procedimientos para preparar dichos oligonucleotidos, son conocidos en la materia, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 5.138.045, 5.218.105 y 5.459.255.
No es necesario que todas las posiciones de un oligonucleotido dado esten modificadas uniformemente, y de hecho 5 pueden incorporarse mas de una de las modificaciones anteriormente mencionadas a un solo oligonucleotido o incluso en un solo nucleosido en un oligonucleotido. La presente divulgacion incluye tambien oligonucleotidos que son oligonucleotidos quimericos como se definen anteriormente en la presente memoria.
En otro aspecto, la molecula de acido nucleico de la presente divulgacion esta conjugada con otro resto incluyendo, 10 pero sin limitacion, nucleotidos abasicos, compuestos de polieter, poliamina, poliamidas, peptidos, carbohidratos, lfpidos o polihidrocarburos.Los especialistas en la materia reconoceran que estas moleculas pueden ligarse con uno mas de cualquier nucleotido que comprenda la molecula de acido nucleico en varias posiciones en el azucar, base o grupo fosfato.
15 Los oligonucleotidos usados de acuerdo con esta divulgacion pueden elaborarse conveniente y rutinariamente mediante la tecnica bien conocida de sfntesis en fase solida. El equipo de dicha sfntesis se vende por varios vendedores, incluyendo Applied Biosystems. Puede emplearse tambien cualquier otro medio para dicha sfntesis; la sfntesis real de los oligonucleotidos esta dentro de las capacidades de un especialista en la materia. Es tambien bien conocido usar tecnicas similares para preparar otros oligonucleotidos tales como los fosforotioatos y derivados 20 alquilados. Es tambien bien conocido usar tecnicas similares y amiditas modificadas comercialmente disponibles y productos de vidrio de poro controlado (CPG) tales como amiditas modificadas con biotina, fluorescefna, acridina o psoraleno y/o CPG (disponible en Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleotidos marcados fluorescentemente, biotinilados u otros modificados tales como oligonucleotidos modificados con colesterol.
25 De acuerdo con la divulgacion, el uso de modificaciones tales como el uso de monomeros de LNA para mejorar la potencia, especificidad y duracion de la accion y ampliar las vfas de administracion de oligonucleotidos comprendfa qufmicas actuales tales como de MOE, ANA, FANA, PS, etc. Esto puede conseguirse sustituyendo algunos de los monomeros en los oligonucleotidos actuales por monomeros de LNA. El oligonucleotido modificado de LNA puede tener un tamano similar al compuesto original o puede ser mayor o preferiblemente menor. Es que dichos 30 oligonucleotidos modificados con LNA contienen menos de aproximadamente un 70 %, mas preferiblemente menos de aproximadamente un 60 %, lo mas preferiblemente menos de aproximadamente un 50 % de monomeros de LNA y que sus tamanos estan entre aproximadamente 5 y 25 nucleotidos, mas preferiblemente entre aproximadamente 12 y 20 nucleotidos.
35 Los esqueletos oligonucleotfdicos modificados comprenden, pero sin limitacion, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, metilfosfonatos y otros alquilfosfonatos comprendiendo 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos comprendiendo 3'- aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres y boranofosfatos que tienen ligamientos 3'-5' normales, analogos ligados 2'-5' de estos y aquellos que tienen una 40 polaridad invertida donde los pares adyacentes de unidades nucleosfdicas estan ligadas de 3'-5' a 5'-3' o de 2'-5' a 5'-2'. Se incluyen tambien diversas sales, sales mixtas y formas de acido libre.
Las patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de los ligamientos que contienen fosforo anteriores comprenden, pero sin limitacion, las patentes de EE.UU. n° 3.687.808, 4.469.863, 4.476.301, 45 5.023.243, 5.177.196, 5.188.897, 5.264.423, 5.276.019, 5.278.302, 5.286.717, 5.321.131, 5.399.676, 5.405.939, 5.453.496, 5.455.233, 5.466.677, 5.476.925, 5.519.126, 5.536.821, 5.541.306, 5.550.111, 5.563.253, 5.571.799, 5.587.361 y 5.625.050.
Los esqueletos oligonucletfdicos modificados que no incluyen un atomo de fosforo en los mismos tienen esqueletos 50 que estan formados por ligamientos internucleosfdicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, ligamientos internucleosfdicos heteroatomicos mixtos y de alquilo o cicloalquilo o uno o mas ligamientos internucleosfdicos heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen ligamientos morfolino (formados en parte a partir de la porcion de azucar de un nucleosido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfoxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; 55 esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfona y sulfonamida; esqueletos de amida y otros que tienen partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas.
Las patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de los oligonucleotidos anteriores
comprenden, pero sin limitacion, las patentes de EE.UU. n° 5.034.506, 5.166.315, 5.185.444, 5.214.134, 5.216.141, 5.235.033, 5.264.562, 5.264.564, 5.405.938, 5.434.257, 5.466.677, 5.470.967, 5.489.677, 5.541.307, 5.561.225, 5.596.086, 5.602.240, 5.610.289, 5.602.240, 5.608.046, 5.610.289, 5.618.704, 5.623.070, 5.663.312, 5.633.360, 5.677.437 y 5.677.439.
5
En otros mimeticos de oligonucleotidos, tanto el azucar como el ligamiento internucleosfdico, es decir el esqueleto, de las unidades nucleotfdicas se reemplaza por grupos novedosos. Las unidades basicas se mantienen para hibridacion con un compuesto diana de acido nucleico apropiado. Se hace referencia a uno de dichos compuestos oligomericos, un mimetico de oligonucleotido que se ha mostrado que tiene excelentes propiedades de hibridacion, 10 como un acido peptidonucleico (PNA). En los compuestos de PNA, el esqueleto de azucar de un oligonucleotido se reemplaza por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a los atomos de nitrogeno azoicos de la porcion amida del esqueleto. Las patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de compuestos de PNA comprenden, pero sin limitacion, las patentes de EE.UU. n°5.539.082, 5.714.331 y 5.719.262. Pueden encontrarse ensenanzas 15 adicionales de compuestos de PNA en Nielsen, et al. (1991) Science 254,1497-1500.
En otro aspecto de la divulgacion, los oligonucleotidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleosidos con esqueletos heteroatomicos y, en particular, -CH2-NH-O-CH2-,-CH2-N(CH3)-O-CH2-, conocido como metilen(metilimino) o esqueleto de MMI, -CH2-O-N(CH3)-CH2-,-CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- y -ON(CH3)-CH2-CH2- 20 donde el esqueleto de fosfodiester nativo se representa como -O-P-O-CH2- de la patente de EE.UU. anteriormente referenciada n° 5.489.677 y los esqueletos de amida de la patente de EE.uU. anteriormente referenciada n° 5.602.240. Tambien son oligonucleotidos que tienen estructuras de esqueleto de morfolino de la patente de EE.UU. anteriormente referenciada n° 5.034.506.
25 Los oligonucleotidos modificados pueden contener tambien uno o mas restos de azucar sustituidos. Los oligonucleotidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo u O-alquil-O-alquilo, donde alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C a CO o alquenilo y alquinilo C2 a CO no sustituidos o sustituidos. Particularmente, son O(CH2)nOmCH3, O(CH2)n,OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON(CH2)nCH3)2 donde n y m pueden ser de 1 a 30 aproximadamente 10. Otros oligonucleotidos comprenden uno de los siguientes en posicion 2': (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo) C a CO, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escision de RNA, un grupo reportero, un intercalante, un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido o un grupo para mejorar las propiedades 35 farmacodinamicas de un oligonucleotido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificacion comprende 2'-metoxietoxilo (2'-O-CH2CH2OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE),es decir, un grupo alcoxialcoxilo. Una modificacion adicional comprende 2'-dimetilaminoxietoxilo, es decir un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos siguientes de la presente memoria, y 2'-dimetilaminoetoxietoxilo (tambien conocido en la materia como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'40 DMAEOE), es decir 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.
Otras modificaciones comprenden 2'-metoxilo (2'-OCH3), 2'-aminopropoxilo (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). Pueden hacerse tambien modificaciones similares en otras posiciones del oligonucleotido, particularmente la posicion 3' en el azucar del nucleotido 3' terminal o en oligonucleotidos ligados 2'-5' y en la posicion 5' del nucleotido 45 5' terminal. Los oligonucleotidos pueden tener tambien mimeticos de azucar tales como restos de ciclobutilo en lugar de azucar de pentofuranosilo. Las patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de dichas estructuras de azucar modificadas comprenden, pero sin limitacion, las patentes de EE.UU. n° 4.981.957, 5.118.800, 5.319.080, 5.359.044, 5.393.878, 5.446.137, 5.466.786, 5.514.785, 5.519.134, 5.567.811, 5.576.427,
5.591.722, 5.597.909, 5.610.300, 5.627.053,5.639.873, 5.646.265, 5.658.873, 5.670.633 y 5.700.920.
50
Los oligonucleotidos pueden comprender tambien modificaciones o sustituciones de nucleobase (a la que se hace referencia a menudo en la materia simplemente como “base”). Como se usa en la presente memoria, los nucleotidos “no modificados” o “naturales” comprenden las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados comprenden otros nucleotidos sinteticos y naturales 55 tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6- metilo y otros alquilos de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros alquilos de adenina y guanina, 2- tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halogenouracilo y 5-halogenocitosina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina, 6- azouracilo, 6-azocitosina y 6-azotimina, 5-uracilo (seudouracilo), 4-tiouracilo, adeninas y guaninas sustituidas con 8- halogeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras 8-sustituidas, uracilos y citosinas sustituidos con 5-
halogeno, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8- azaguanina y 8-azadenina, 7-desazaguanina y 7-desazadenina y 3-desazaguanina y 3-desazadenina.
Ademas, los nucleotidos comprenden aquellos divulgados en la patente de Estados Unidos n° 3.687.808, aquellos 5 divulgados en “The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering”, paginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellos divulgados por Englisch et al., “Angewandle Chemie, International Edition”, 1991, 30, pagina 613, y aquellos divulgados por Sanghvi, Y.S., capftulo 15, “Antisense Research and Applications”, paginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Ciertos de estos nucleotidos son particularmente utiles para aumentar la afinidad de union de los compuestos oligomericos de la divulgacion. Estos comprenden 10 pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y 0-6, que comprenden 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Las sustituciones de 5-metilcitosina se ha mostrado que aumentan la estabilidad de duplex de acido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds, “Antisense Research and Applications”, CRC Press, Boca Raton, 1993, pag. 276-278) y son actualmente sustituciones basicas, aun mas particularmente cuando se combinan con modificaciones de azucar 2'-Ometoxietilo. 15
Las patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de los nucleotidos modificados anteriormente senalados, asf como otros nucleotidos modificados, comprenden, pero sin limitacion: las patentes de EE.UU. n° 3.687.808 asf como 4.845.205, 5.130.302, 5.134.066, 5.175.273, 5.367.066, 5.432.272, 5.457.187, 5.459.255, 5.484.908, 5.502.177, 5.525.711, 5.552.540, 5.587.469, 5.596.091, 5.614.617, 5,750,692 y 5.681.941.
20
Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica ligar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que mejoren la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido.
Dichos restos comprenden, pero sin limitacion, restos lipfdicos tales como un resto de colesterol, acido colico, un 25 tioeter, p.ej. hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, p.ej., residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolfpido, p.ej., dihexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido adamantanoacetico, un resto palmitilo o un resto octadecilamina o hexilaminocarboniltoxicolesterol.
30 Las patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de dichos conjugados oligonucleotfdicos comprenden, pero sin limitacion, las patentes de EE.UU. n° 4.828.979, 4.948.882, 5.218.105, 5.525.465, 5.541.313, 5.545.730, 5.552.538, 5.578.717, 5.580.731, 5.580.731, 5.591.584, 5.109.124, 5.118.802,
5.138.045, 5.414.077, 5.486.603, 5.512.439, 5.578.718, 5.608.046, 4.587.044, 4.605.735, 4.667.025, 4.762.779,
4.789.737, 4.824.941, 4.835.263, 4.876.335, 4.904.582, 4.958.013, 5.082.830, 5.112.963, 5.214.136, 5.082.830,
35 5.112.963, 5.214.136, 5.245.022, 5.254.469, 5.258.506, 5.262.536, 5.272.250, 5.292.873, 5.317,098, 5.371.241,
5.391.723, 5.416.203, 5.451.463, 5.510.475, 5.512.667, 5.514.785, 5.565.552, 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481.
5.587.371, 5.595.726, 5.597.696,5.599.923, 5.599.928 y 5.688.941.
Descubrimiento de farmacos: Los compuestos de la presente divulgacion pueden aplicarse tambien a las areas del 40 descubrimiento de farmacos y validacion de dianas. La presente divulgacion comprende el uso de los compuestos y segmentos diana identificados en la presente memoria en esfuerzos de descubrimiento de farmacos para dilucidar las relaciones que existen entre un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) y un estado, fenotipo o afeccion patologico. Estos procedimientos incluyen detectar o modular un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ), que comprende poner en contacto una muestra, tejido, celula u organismo con los compuestos de la presente 45 divulgacion, medir el nivel de acido nucleico o protefna de un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) y/o un criterio de valoracion fenotfpico o qufmico relacionado en algun momento despues del tratamiento y, opcionalmente, comparar el valor medido con una muestra no tratada o muestra tratada con un compuesto adicional de la divulgacion. Estos procedimientos pueden efectuarse tambien en paralelo o en combinacion con otros experimentos para determinar la funcion de genes desconocidos para el proceso de validacion de farmacos o para determinar la 50 validez de un producto genico particular como diana para el tratamiento o la prevencion de una enfermedad, afeccion o fenotipo particular.
Valoracion de la regulacion positiva o inhibicion de la expresion genica:
55 Puede valorarse la transferencia de un acido nucleico exogeno a una celula u organismo hospedador detectando directamente la presencia de un acido nucleico en la celula u organismo. Dicha deteccion puede conseguirse mediante varios procedimientos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, la presencia de un acido nucleico exogeno puede detectarse por Southern blot o por una tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) que usa cebadores que amplifican especfficamente secuencias nucleotfdicas asociadas al acido nucleico. La expresion
de los acidos nucleicos exogenos puede medirse tambien usando procedimientos convencionales, incluyendo analisis de expresion genica. Por ejemplo, el mRNA producido por un acido nucleico exogeno puede detectarse y cuantificarse usando una Northern blot y PCR de transcripcion inversa (RT-PCR).
5 La expresion de RNA del acido nucleico exogeno puede detectarse tambien midiendo una actividad enzimatica o una actividad de enzima reportera. Por ejemplo, la actividad moduladora antisentido puede medirse indirectamente como una disminucion o aumento de la expresion de acido nucleico diana como una indicacion de que el acido nucleico exogeno produce el RNA efector. Basandose en la conservacion de secuencia, pueden disenarse cebadores y usarse para amplificar regiones codificantes de los genes diana. Inicialmente, la region codificante mas 10 expresada de cada gen puede usarse para construir un gen de control modelo, aunque puede usarse cualquier region codificante o no codificante. Cada gen de control se ensambla insertando cada region codificante entre una region codificante reportera y su senal de poli(A). Estos plasmidos producirfan un mRNA con un gen reportero en la porcion en direccion 5' del gen y una diana de RNAi potencial en la region 3'no codificante'. La efectividad de los oligonucleotidos antisentido individuales se ensayarfa mediante la modulacion del gen reportero. Los genes 15 reporteros utiles en los procedimientos de la presente divulgacion incluyen acetohidroxiacido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucoronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), protefna fluorescente verde (GFP), protefna fluorescente roja (RFP), protefna fluorescente amarilla (YFP), protefna fluorescente cian (CFP), peroxidasa de rabano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS) y derivados de los mismos. Estan disponibles marcadores seleccionables multiples que confieren 20 resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Los procedimientos para determinar la modulacion de un gen reportero son bien conocidos en la materia e incluyen, pero sin limitacion, procedimientos fluorometricos (p.ej., espectroscopia de fluorescencia, clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), microscopia de fluorescencia) y determinacion de la resistencia a antibioticos.
25
Las protefnas ADIPOQIy ADIPOQ2 y la expresion de mRNA pueden ensayarse usando procedimientos conocidos por los especialistas en la materia y descritos en otro lugar de la presente memoria. Por ejemplo, pueden usarse inmunoensayos tales como ELISA para medir niveles de protefna. Los anticuerpos de adiponectina (ADIPOQ) para ELISA estan disponibles comercialmente, p.ej. en R&D Systems (Mineapolis, mN) y Abeam, Cambridge, MA.
30
En aspectos, se evalua para comparacion la expresion de ADIPOQ1 y ADIPOQ2 (p.ej., mRNA o protefna) en una muestra (p.ej., celulas o tejidos in vivo o in vitro) tratada usando un oligonucleotido antisentido de la divulgacion con la expresion de adiponectina (ADIPOQ) en una muestra de control. Por ejemplo, puede compararse la expresion de la protefna o acido nucleico, usando procedimientos conocidos por los especialistas en la materia, con la de una 35 muestra tratada ficticiamente o no tratada. Como alternativa, puede hacerse la comparacion con una muestra tratada con un oligonucleotido antisentido de control (p.ej., uno que tiene una secuencia alterada o diferente) dependiendo de la informacion deseada. En otro aspecto, puede compararse una diferencia en la expresion de la protefna o acido nucleico de adiponectina (ADIPOQ) en una muestra tratada frente a no tratada con la diferencia en expresion de un acido nucleico diferente (incluyendo cualquier patron considerado apropiado por el investigador, p.ej. un gen 40 domestico) en una muestra tratada frente a una muestra no tratada
Las diferencias observadas pueden expresarse como se desee, p.ej., en forma de una relacion o fraccion, para uso en una comparacion con control. En aspectos, el nivel de un mRNA o protefna de adiponectina (ADIPOQ) en una muestra tratada con un oligonucleotido antisentido de la presente divulgacion aumenta o disminuye de 45 aproximadamente 1,25 veces a aproximadamente 10 veces o mas respecto a una muestra no tratada o muestra tratada con un acido nucleico de control. En aspectos, el nivel de un mRNA o protefna de adiponectina (ADIPOQ) aumenta o disminuye al menos aproximadamente 1,25 veces, al menos aproximadamente 1,3 veces, al menos aproximadamente 1,4 veces, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 1,6 veces, al menos aproximadamente 1,7 veces, al menos aproximadamente 1,8 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al 50 menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 5,5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 6,5 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 8,5 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 9,5 veces o al 55 menos aproximadamente 10 veces o mas.
Kits, reactivos de investigacion, diagnostico y terapia
Los compuestos de la presente divulgacion pueden utilizarse para diagnostico, terapia y profilaxis y como agentes
de investigacion y componentes de kits. Ademas, los oligonucleotidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresion genica con exquisita especificidad, se usan a menudo por los especialistas en la materia para dilucidar la funcion de genes particulares o para distinguir entre las funciones de varios miembros de una ruta biologica.
5 Para uso en kits y diagnostico y en diversos sistemas biologicos, los compuestos de la presente divulgacion, solos o en combinacion con otros compuestos o terapias, son utiles como herramientas en analisis diferenciales y/o combinatorios para dilucidar los patrones de expresion de una porcion o del complemento completo de genes expresados en celulas y tejidos.
10 Como se usa en la presente memoria, el termino “sistema biologico” o “sistema” se define como cualquier organismo, celula cultivo celular o tejido que expresa, o se hace competente para expresar, productos de adiponectina (ADIPOQ). Estos incluyen, pero sin limitacion, seres humanos, animales transgenicos, celulas, cultivos celulares, tejidos, xenoinjertos, trasplantes y combinaciones de los mismos.
15 Como ejemplo no limitante, se comparan patrones de expresion en celulas o tejidos tratados con uno o mas compuestos antisentido con celulas o tejidos de control no tratados con compuestos antisentido y se analizan en los patrones producidos los niveles diferenciales de expresion genica segun atanan, por ejemplo, a asociacion patologica, ruta de senalizacion, localizacion celular, nivel de expresion, tamano, estructura o funcion de los genes examinados. Estos analisis pueden efectuarse en celulas estimuladas o no estimuladas y en presencia o ausencia 20 de otros compuestos que afecten a los patrones de expresion.
Los ejemplos de procedimientos de analisis de expresion genica conocidos en la materia incluyen matrices o micromatrices de DNA (Brazma y Vilo, (2000) FEBS Lett., 480, 17-24; Celis, et al., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16), SAGE (analisis en serie de la expresion genica) (Madden, et al., (2000) Drug Discov. Today, 5, 415-425), READS 25 (amplificacion por enzimas de restriccion de cDNA digeridos) (Prashar y Weissman, (1999) Methods Enzymol., 303, 258-72), TOgA (analisis de expresion genica total) (Sutcliffe, et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 1976-81), matrices proteicas y proteomica (Celis, et al., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16; Jungblut, et aI., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciacion de marcador de secuencia expresada (EST) (Celis, et aI., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et aI., J. BiotechnoI., 2000, 80, 143-57), identificacion de RnA sustractiva (SuRF) (Fuchs, et al., (2000) 30 Anal. Biochem. 286, 91-98; Larson, et al., (2000) Cytometry 41, 203-208), clonacion sustractiva con exposicion diferencial (DD) (Jurecic y Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3, 316-21), hibridacion genomica comparativa (Carulli, et al., (1998) J. Cell. Biochem. Suppl., 31, 286-96), tecnicas de FISH (hibridacion fluorescente in situ) (Going y Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35, 1895-904) y procedimientos de espectrometrfa de masas (To, Comb. (2000) Chem. High ThroughputScreen, 3, 235-41).
35
Los compuestos de la divulgacion son utiles para investigacion y diagnostico porque estos compuestos hibridan con acidos nucleicos que codifican una adiponectina (ADIPOQ). Por ejemplo, los oligonucleotidos que hibridan con dicha eficiencia y en dichas condiciones como se divulgan en la presente memoria por ser moduladores efectivos de adiponectina (ADIPOQ), son cebadores o sondas efectivos en condiciones que favorezcan la amplificacion o 40 deteccion genica, respectivamente. Estos cebadores y sondas son utiles en procedimientos que requieren la deteccion especffica de moleculas de acido nucleico que codifican una adiponectina (ADIPOQ) y en la amplificacion de dichas moleculas de acido nucleico para la deteccion o para el uso en estudios adicionales de una adiponectina (ADIPOQ). La hibridacion de los oligonucleotidos antisentido, particularmente cebadores y sondas, de la divulgacion con un acido nucleico que codifica una adiponectina (ADIPOQ) puede detectarse mediante medios conocidos en la 45 materia. Dichos medios pueden incluir conjugacion de una enzima con el oligonucleotido, radiomarcaje del oligonucleotido o cualquier otro medio de deteccion adecuado. Pueden prepararse tambien kits que usan dichos medios de deteccion para detectar el nivel de una adiponectina (ADIPOQ) en una muestra.
La especificidad y sensibilidad de los compuestos antisentido son tambien aprovechados por los especialistas en la 50 materia para usos terapeuticos. Los compuestos antisentido se han empleado como restos terapeuticos en el tratamiento de estados patologicos en animales, incluyendo seres humanos. Los farmacos oligonucleotfdicos antisentido se han administrado segura y efectivamente a seres humanos y estan actualmente en ejecucion numerosos ensayos clfnicos. Esta por tanto establecido que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de 55 celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.
Para terapia, se trata un animal, preferiblemente un ser humano, sospechoso de tener una enfermedad o trastorno que pueda tratarse modulando la expresion de un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ) mediante la administracion de compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion. Por ejemplo, en un aspecto no limitante,
los procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal necesitado de tratamiento una cantidad terapeuticamente efectiva de un modulador de adiponectina (ADIPOQ). Los moduladores de adiponectina (ADIPOQ) de la presente divulgacion modulan efectivamente la actividad de una adiponectina (ADlPOQ) o modulan la expresion de una protefna de adiponectina (ADIPOQ). En un aspecto, se inhibe la actividad o expresion de una 5 adiponectina (ADIPOQ) en un animal en aproximadamente un 10 % en comparacion con un control. Preferiblemente, se inhibe la actividad o expresion de una adiponectina (ADIPOQ) en un animal en aproximadamente un 30 %. Mas preferiblemente, se inhibe la actividad o expresion de una adiponectina (ADIPOQ) en un animal en un 50 % o mas. Por tanto, los compuestos oligomericos modulan la expresion de un mRNA de adiponectina (ADIPOQ) en al menos un 10 %, en al menos un 50 %, en al menos un 25 %, en al menos un 30 %, en 10 al menos un 40 %, en al menos un 50 %, en al menos un 60 %, en el menos un 70 %, en al menos un 75 %, en al menos un 80 %, en al menos un 85 %, en al menos un 90 %, en al menos un 95 %, en al menos un 98 %, en al menos un 99 % o en al menos un 100 % en comparacion con un control.
En un aspecto, la actividad o expresion de una adiponectina (ADIPOQ) y/o en un animal aumenta en 15 aproximadamente un 10 % en comparacion con un control. Preferiblemente, la actividad o expresion de una adiponectina (ADIPOQ) en un animal aumenta en aproximadamente un 30 %. Mas preferiblemente, la actividad o expresion de una adiponectina (ADIPOQ) en un animal aumenta en un 50 % o mas. Por tanto, los compuestos oligomericos modulan la expresion de un mRNA de adiponectina (ADIPOQ) en al menos un 10 %, en al menos un 50 %, en al menos un 25 %, en al menos un 30 %, en al menos un 40 %, en al menos un 50 %, en al menos un 60 20 %, en al menos un 70 %, en al menos un 75 %, en al menos un 80 %, en al menos un 85 % en al menos un 90 %, en al menos un 95 %, en al menos un 98 %, en al menos un 99 % o en al menos un 100 % en comparacion con un control.
Por ejemplo, la reduccion de la expresion de una adiponectina (ADIPOQ) puede medirse en suero, sangre, tejido 25 adiposo, hfgado o cualquier otro fluido corporal, tejido u organo del animal. Preferiblemente, las celulas contenidas en dichos fluidos, tejidos u organos que se estan analizando contienen una molecula de acido nucleico que codifica peptidos de adiponectina (ADIPOQ) y/o la protefna adiponectina (ADIPOQ) misma.
Los compuestos de la divulgacion pueden utilizarse en composiciones farmaceuticas anadiendo una cantidad 30 efectiva de un compuesto a un diluyente o vehfculo farmaceuticamente aceptable. El uso de los compuestos y procedimientos de la divulgacion puede ser tambien util profilacticamente.
Conjugados: Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica ligar qufmicamente con el oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que mejoren la actividad, distribucion celular o captacion celular del 35 oligonucleotido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente con grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primario o secundario. Los grupos conjugados de la divulgacion incluyen intercalantes, moleculas reporteras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, polieteres, grupos que mejoran las
propiedades farmacodinamicas de oligomeros y grupos que mejoran las propiedades farmacocineticas de
oligomeros. Los grupos conjugados tfpicos incluyen colesteroles, lfpidos, fosfolfpidos, biotina, fenazina, folato, 40 fenantridina, antraquinona, acridina, fluorescefnas, rodaminas, cumarinas y tintes. Los grupos que mejoran las propiedades farmacodinamicas, en el contexto de esta divulgacion, incluyen grupos que mejoran la captacion, mejoran la resistencia a la degradacion y/o refuerzan la hibridacion especifica de secuencia con el acido nucleico diana. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocineticas, en el contexto de esta divulgacion, incluyen grupos que mejoran la captacion, distribucion, metabolismo o excrecion de los compuestos de la presente
45 divulgacion. Se divulgan grupos conjugados representativos en la solicitud de patente internacional n°
PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992 y la patente de EE.UU. n° 6.287.860. Los restos conjugados incluyen, pero sin limitacion, restos lipfdicos tales como un resto de colesterol, acido colico, un tioeter, p.ej. hexil-5- tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, p.ej. residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolfpido, p.ej. dihexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena 50 de polietilenglicol, o acido adamantanoacetico, un resto palmitilo o un resto octadecilamino o hexilaminocarboniloxicolesterol. Los oligonucleotidos de la divulgacion pueden conjugarse tambien con sustancias farmacologicas activas, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, acido 2,3,5-triyodobenzoico, acido flufenamico, acido folfnico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, un farmaco 55 de sulfonamida, un antidiabetico, un antibacteriano o un antibiotico.
Las patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de dichos conjugados oligonucleotfdicos incluyen, pero sin limitacion, las patentes de EE.UU. n° 4.828.979, 4.948.882, 5.218.105, 5.525.465, 5.541.313, 5.545.730, 5.552.538, 5.578.717, 5.580.731, 5.580.731, 5.591.584, 5.109.124, 5.118.802,
5.138.045, 5.414.077, 5.486.603, 5.512.439, 5.578.718, 5.608.046, 4.587.044, 4.605.735, 4.667.025, 4.762.779,
4.789.737, 4.824.941, 4.835.263, 4.876.335, 4.904.582, 4.958.013, 5.082.830, 5.112.963, 5.214.136, 5.082.830,
5.112.963, 5.214.136, 5.245.022, 5.254.469, 5.258.506, 5.262.536, 5.272.250, 5.292.873, 5.317.098, 5.371.241,
5.391.723, 5.416.203, 5.451.463, 5.510.475, 5.512.667, 5.514.785, 5.565.552, 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481,
5 5.587.371, 5.595.726, 5.597.696, 5.599.923, 5.599.928 y 5.688.941.
Formulaciones: Los compuestos de la divulgacion pueden tambien mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo con otras moleculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos como, por ejemplo, liposomas, moleculas orientadas a receptor, formulaciones orales, rectales, topicas u otras, para ayudar a la captacion, 10 distribucion y/o absorcion. Las patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de dichas formulaciones de ayuda a la captacion, distribucion y/o absorcion incluyen, pero sin limitacion, las patentes de EE.UU. n° 5.108.921, 5.354.844, 5.416.016, 5.459.127, 5.521.291, 5.543.165, 5.547.932, 5.583.020, 5.591.721,
4.426.330, 4.534.899, 5.013.556, 5.108.921, 5.213.804, 5.227.170, 5.264.221, 5.356.633, 5.395.619, 5.416.016,
5.417.978, 5.462.854, 5.469.854, 5.512.295, 5.527.528, 5.534.259, 5.543.152, 5.556.948, 5.580.575 y 5.595.756.
15
Aunque los oligonucleotidos antisentido no tienen que administrarse en el contexto de un vector para modular una expresion y/o funcion diana, aspectos de la divulgacion se refieren a constructos de vector de expresion para la expresion de oligonucleotidos antisentido que comprenden promotores, secuencias genicas promotoras hfbridas y poseen una fuerte actividad promotora constitutiva, o una actividad promotora que puede inducirse en el caso 20 deseado.
En un aspecto, la practica de la divulgacion implica administrar al menos uno de los oligonucleotidos antisentido anteriores con un sistema de suministro de acido nucleico adecuado. En un aspecto, ese sistema incluye un vector no vfrico ligado operativamente con el polinucleotido. Los ejemplos de dichos vectores no vfricos incluyen el 25 oligonucleotido solo (p.ej., cualquiera o mas de las SEQ ID NO: 7 a 31) o en combinacion con una formulacion proteica, polisacarfdica o lipfdica adecuada.
Adicionalmente, los sistemas de suministro de acido nucleico adecuados incluyen vectores vfricos, tfpicamente una secuencia de al menos uno de un adenovirus, virus adenoasociado (AAV), adenovirus dependiente de auxiliar, 30 retrovirus o complejo de virus hemaglutinante de Japon (HVJ)-liposoma. Preferiblemente, el vector vfrico comprende un promotor eucariotico fuerte ligado operativamente con el polinucleotido, p.ej. un promotor de citomegalovirus (CMV).
Adicionalmente, los vectores incluyen vectores vfricos, protefnas de fusion y conjugados qufmicos. Los vectores 35 retrovfricos incluyen virus de leucemia de murino de Moloney y virus basados en VIH. Un vector vfrico basado en VIH comprende al menos dos vectores donde los genes gag y pol son de un genoma de VIH y el gen env es de otro virus. Se prefieren vectores vfricos de DNA. Estos vectores incluyen vectores de poxvirus tales como vectores de ortopoxvirus o avipoxvirus, vectores de herpesvirus tales como vector de herpesvirus simple I (HSV), vectores de adenovirus y vectores de virus adenoasociados.
40
Los compuestos antisentido de la divulgacion engloban cualquier sal, ester o sales de dichos esteres o cualquier otro compuesto farmaceuticamente aceptables que, tras administracion a un animal, incluyendo un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biologicamente activo o un residuo del mismo.
45 El termino “sales farmaceuticamente aceptables” hace referencia a sales fisiologica y farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la divulgacion: es decir, sales que retienen la actividad biologica deseada del compuesto original y no confieren efectos toxicologicos indeseados al mismo. Para oligonucleotidos, los ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. n° 6.287.860.
50 La presente divulgacion incluye tambien composiciones y formulaciones farmaceuticas que incluyen los compuestos antisentido de la divulgacion. Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden administrarse de una serie de modos, dependiendo de si se desea tratamiento local o sistemico y del area para tratar. La administracion puede ser topica (incluyendo oftalmica y a membranas mucosas, incluyendo suministro vaginal y rectal), pulmonar, p.ej. por inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal, 55 intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o administracion intracraneal, p.ej. intratecal o intraventricular.
Para tratar tejidos en el sistema nervioso central, puede hacerse la administracion, p.ej., por inyeccion o infusion en
el liquido cefalorraqufdeo. La administracion de RNA antisentido al liquido cefalorraqufdeo se describe, p.ej., en la solicitud de patente de EE.UU. n° de pub. 2007/0117772, "Methods for slowing familial ALS disease progression".
Cuando se pretende administrar el oligonucleotido antisentido de la presente divulgacion a celulas en el sistema 5 nervioso central, la administracion puede ser con uno o mas agentes capaces de promover la penetracion de los oligonucleotidos antisentido en cuestion a traves de la barrera hematoencefalica. La inyeccion puede hacerse, p.ej., en la corteza entorrinal o hipocampo. El suministro de factores neurotroficos por administracion de un vector adenovfrico a neuronas motoras en tejido muscular se describe, p.ej., en la patente de EE.UU. n° 6.632.427, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons". El suministro de vectores directamente al 10 cerebro, p.ej., el cuerpo estriado, talamo, hipocampo o sustancia negra, es conocido en la materia y se describe, p.ej., en la patente de EE.UU. n° 6.756.523, "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain". La administracion puede ser rapida como por inyeccion o hacerse durante un periodo de tiempo como por infusion lenta o administracion de formulaciones de liberacion lenta.
15 Los oligonucleotidos antisentido en cuestion pueden tambien ligarse o conjugarse con agentes que proporcionen propiedades farmaceuticas o farmacodinamicas deseables. Por ejemplo, el oligonucleotido antisentido puede acoplarse con cualquier sustancia conocida en la materia por promover la penetracion o el transporte a traves de la barrera hematoencefalica, tal como un anticuerpo del receptor de transferrina, y administrarse por inyeccion intravenosa. El compuesto antisentido puede ligarse con un vector vfrico, por ejemplo, que haga al compuesto 20 antisentido mas efectivo y/o aumente el transporte del compuesto antisentido a traves de la barrera hematoencefalica. La rotura osmotica de la barrera hematoencefalica puede lograrse tambien, p.ej., por infusion de azucares incluyendo, pero sin limitacion, mesoeritritol, xilitol, D(+) galactosa, D(+) lactosa, D(+) xilosa, dulcitol, mioinositol, L(-) fructosa, D(-) manitol, D(+) glucosa, D(+) arabinosa, D(-)arabinosa, celobiosa, D(+) maltosa, D(+) rafinosa, L(+) ramnosa, D(+) melibiosa, D(-) ribosa, adonitol, D(+)arabitol, L(-) arabitol, D(+) fucosa, L(-) fucosa, D(-) 25 lixosa, L(+) lixosa y L(-) lixosa, o aminoacidos, incluyendo pero sin limitacion, glutamina, lisina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, acido glutamico, glicina,histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina, valina y taurina. Los procedimientos y materiales para mejorar la penetracion de la barrera hematoencefalica se describen, p.ej. en las patentes de EE.uU. n° 4.866.042, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier", 6.294.520, "Material for passage through the blood-brain barrier" y 6.936.589, "Parenteral 30 delivery systems".
Los compuestos antisentido en cuestion pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo con otras moleculas, estructuras moleculares o compuestos, por ejemplo, liposomas, moleculas orientadas a receptor, formulaciones orales, rectales, topicas u otras, para ayudar a la captacion, distribucion y/o absorcion. Por ejemplo, 35 pueden incluirse lfpidos cationicos en la formulacion para facilitar la captacion de oligonucleotidos. Una de dichas composiciones que se ha mostrado que facilita la captacion es LIPOFECTIN (disponible en GIBCO-BRL, Bethesda, MD).
Los oligonucleotidos con al menos una modificacion de 2'-O-metoxietilo se cree que son particularmente utiles para 40 administracion oral. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas para administracion topica pueden incluir parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles gotas, supositorios, pulverizadores, lfquidos y polvos. Los vehfculos farmaceuticos convencionales, bases acuosas en polvo u oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Pueden ser tambien utiles condones y guantes recubiertos y similares.
45 Las formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificacion unitaria, pueden prepararse de acuerdo con tecnicas convencionales bien conocidas en la industria farmaceutica. Dichas tecnicas incluyen la etapa de poner en asociacion los ingredientes activos con un vehfculo o vehfculos o un excipiente o excipientes farmaceuticos. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociacion uniforme e fntima los ingredientes activos con vehfculos lfquidos o vehfculos solidos finamente divididos o 50 ambos y entonces, si es necesario, conformando el producto.
Las composiciones de la presente divulgacion pueden formularse en cualquiera de muchas posibles formas de dosificacion tales como, pero sin limitacion, comprimidos, capsulas, capsulas de gel, jarabes lfquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgacion pueden formularse tambien como 55 suspensiones en medio acuoso, no acuoso o mixto. Las suspensiones acuosas pueden contener ademas sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspension puede contener tambien estabilizantes.
Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion incluyen, pero sin limitacion, soluciones, emulsiones,
espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden comprender uno o mas mejoradores de la penetracion, vehfculos, excipientes u otros ingredientes activos o inactivos.
5 Las emulsiones son tfpicamente sistemas heterogeneos de un lfquido dispersado en otro en forma de gotitas que habitualmente superan 0,1 pm de diametro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales ademas de las fases dispersadas y el farmaco activo que puede estar presente como solucion en cualquiera de la fase acuosa, fase oleosa o por si mismo como fase separada. Las microemulsiones se incluyen como un aspecto de la presente divulgacion. Las emulsiones y sus usos son bien conocidos en la materia y se describen ademas en la patente de 10 EE.UU. n° 6.287.860.
Las formulaciones de la presente divulgacion incluyen formulaciones liposomicas. Como se usa en la presente divulgacion, el termino “liposoma” significa una vesfcula compuesta por lfpidos anfffilos dispuestos en una bicapa o bicapas esfericas. Los liposomas son vesfculas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada 15 por un material lipofilo y un interior acuoso que contiene la composicion para suministrar. Los liposomas cationicos son liposomas cargados positivamente que se cree que interaccionan con moleculas de DNA cargadas negativamente formando un complejo estable. Los liposomas que son sensibles al pH o cargados negativamente se cree que atrapan el DNA en lugar de complejarse con el. Se han usado tanto liposomas cationicos como no cationicos para suministrar DNA a celulas.
20
Los liposomas incluyen tambien liposomas “estericamente estabilizados”, un termino que, como se usa en la presente memoria, hace referencia a liposomas que comprenden uno o mas lfpidos especializados. Cuando se incorporan a liposomas, estos lfpidos especializados dan como resultado liposomas con tiempos de circulacion mejorados respecto a liposomas que carecen de dichos lfpidos especializados. Los ejemplos de liposomas 25 estericamente estabilizados son aquellos en que parte de la porcion lipfdica formadora de vesfcula del liposoma comprende uno o mas glicolfpidos o se derivatiza con uno o mas polfmeros hidrofilos, tales como un resto polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen ademas en la patente de EE.UU. n°6.287.860.
Las formulaciones y composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden incluir tambien tensioactivos. 30 El uso de tensioactivos en productos farmacologicos, formulaciones y en emulsiones es bien conocido en la materia. Los tensioactivos y sus usos se describen ademas en la patente de Ee.UU. n°6.287.860.
En un aspecto, la presente divulgacion emplea diversos mejoradores de la penetracion para efectuar el suministro efectivo de acidos nucleicos, particularmente oligonucleotidos. Ademas de ayudar a la difusion de farmacos no 35 lipofflicos a traves de membranas celulares, los mejoradores de la penetracion mejoran tambien la permeabilidad de farmacos lipofflicos. Los mejoradores de la penetracion pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco categorfas amplias, es decir, tensioactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y tensioactivos no quelantes. Los mejoradores de la penetracion y sus usos se describen ademas en la patente de EE.UU. n° 6.287.860.
40
Un especialista en la materia reconocera que las formulaciones se disenan rutinariamente de acuerdo con su uso pretendido, es decir la via de administracion.
Las formulaciones para administracion topica incluyen aquellas en que los oligonucleotidos de la divulgacion estan 45 en mezcla con un agente de suministro topico tal como lfpidos, liposomas, acidos grasos, esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lfpidos y liposomas incluyen neutros (p.ej.,
dioleoilfosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearoilfosfatidilcolina), negativos (p.ej. dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y cationicos (p.ej.,dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoilfosfatidiletanolamina DOTMA).
50
Para administracion topica u otras, los oligonucleotidos de la divulgacion pueden encapsularse en liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas cationicos. Como alternativa, los oligonucleotidos pueden complejarse con lfpidos, en particular con lfpidos cationicos, acidos y esteres grasos, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y sus usos se describen ademas en la patente de EE.UU. n° 55 6.287.860.
Las composiciones y formulaciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, micropartfculas, nanopartfculas, suspensiones o soluciones enagua o medio no acuoso, capsulas, capsulas de gel, saquitos, comprimidos o minicomprimidos. Los espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, auxiliares de
dispersion o aglutinantes pueden ser deseables. Son formulaciones orales aquellas en que los oligonucleotidos de la divulgacion se administran junto con uno o mas mejoradores de la penetracion, tensioactivos y quelantes. Los tensioactivos incluyen acidos grasos y/o esteres o sales de los mismos, acidos biliares y/o sales de los mismos. Los acidos/sales biliares y acidos grasos y sus usos se describen ademas en la patente de EE.UU. n° 6.287.860. Son 5 tambien combinaciones de mejoradores de la penetracion, por ejemplo, acidos/sales grasas en combinacion con acidos/sales biliares. Es una combinacion particular la sal de sodio de acido laurico, acido caprico y UDCA. Mejoradores de la penetracion adicionales incluyen polioxietileno-9-laurileter y polioxietilen-20-cetileter. Los oligonucleotidos de la divulgacion pueden suministrarse por via oral, en forma granular incluyendo partfculas secadas por pulverizacion o complejarse formando micropartfculas o nanopartfculas. Los agentes complejantes de 10 oligonucleotidos y sus usos se describen ademas en la patente de EE.UU. n° 6.287.860.
Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas esteriles que pueden contener tambien tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitacion, mejoradores de la penetracion, compuestos portadores y otros vehfculos o excipientes 15 farmaceuticamente aceptables.
Ciertos aspectos de la divulgacion proporcionan composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas compuestos oligomericos y uno o mas de otros agentes quimioterapeuticos que funcionan mediante un mecanismo no antisentido. Los ejemplos de dichos agentes quimioterapeuticos incluyen, pero sin limitacion, farmacos 20 quimioterapeuticos de cancer tales como daunorubicina, daunomicina, dactinomacina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, esorubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosido, biscloroetilnitrosourea, busulfan, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, cloranbucilo, metilciclohexilnitrosourea, mostazas nitrogenadas, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, 25 citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5- fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, teniposido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la divulgacion, dichos agentes quimioterapeuticos pueden usarse individualmente (p.ej., 5-FU y oligonucleotido), secuencialmente (p.ej., 5-FU y oligonucleotido durante un periodo de tiempo seguido por MTX y 30 oligonucleotido) o en combinacion con uno o mas de otros de dichos agentes quimioterapeuticos (p.ej., 5-FU, MTX y oligonucleotido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleotido). Los farmacos antiinflamatorios, incluyendo pero sin limitacion farmacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y los farmacos antivfricos, incluyendo pero sin limitacion ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, pueden combinarse tambien en composiciones de la divulgacion. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros farmacos no antisentido estan tambien dentro del alcance de esta 35 divulgacion. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados conjunta o secuencialmente.
En otro caso aspecto, las composiciones de la divulgacion pueden contener uno o mas compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, orientados a un primer acido nucleico y uno o mas compuestos antisentido adicionales orientados a una segunda diana de acido nucleico. Por ejemplo, la primera diana puede ser una 40 secuencia antisentido particular de una adiponectina (ADIPOQ) y la segunda diana puede ser una region de otra secuencia nucleotfdica. Como alternativa, las composiciones de la divulgacion pueden contener dos o mas compuestos antisentido orientados a diferentes regiones de la misma diana de acido nucleico de adiponectina (ADIPOQ). Se ilustran en la presente memoria numerosos ejemplos de compuestos antisentido y pueden seleccionarse otros de entre los compuestos adecuados conocidos en la materia. Pueden usarse dos o mas 45 compuestos combinados conjunta o secuencialmente.
Dosificacion:
La formulacion de composiciones terapeuticas y su posterior administracion (dosificacion) se cree que estan dentro 50 de las habilidades de los especialistas en la materia. La dosificacion depende de la gravedad y sensibilidad del estado patologico que se trate, durando el curso de tratamiento de varios dfas a varios meses, o hasta efectuar una cura o conseguir una disminucion del estado patologico. Los programas de dosificacion optimos pueden calcularse a partir de las medidas de acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente. Los especialistas en la materia pueden determinar facilmente las dosificaciones optimas, las metodologfas de dosificacion y las tasas de repeticion. Las 55 dosificaciones optimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleotidos individuales, y pueden estimarse generalmente basandose en las CE50 que se ha encontrado que son efectivas en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificacion es de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal, y puede procurarse una vez o mas al dfa, a la semana, al mes o al ano, o incluso una vez cada 2 a 20 anos. Los especialistas en la materia pueden estimar facilmente las tasas de repeticion para dosificacion basandose en los
tiempos de residencia y concentraciones del farmaco medidos en fluidos o tejidos corporales. Despues de un tratamiento exitoso, puede ser deseable someter al paciente a terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado patologico, donde el oligonucleotido se administra en dosis de mantenimiento en el intervalo de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal, una o mas veces al dfa hasta una vez cada 20 anos.
5
En aspectos, se trata un paciente con una dosificacion de farmaco que es de al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos 10 aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90 o al menosaproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Ciertas dosificaciones inyectadas de oligonucleotidos antisentido se describen, p.ej. en la patente de EE.UU. n° 7.563.884, "Antisense modulation of PTP1B expression".
15
Aunque se han descrito anteriormente diversos aspectos de la presente divulgacion, deberfa entenderse que se han presentado solo a modo de ejemplo y no de limitacion. Pueden hacerse numerosos cambios a los aspectos divulgados de acuerdo con la divulgacion de la presente memoria sin apartarse del espfritu o alcance de la divulgacion. Por tanto, la amplitud y alcance de la presente divulgacion no deberfa limitarse por ninguno de los casos 20 anteriormente descritos.
Al citar diversas referencias en este documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia particular sea “tecnica anterior” de su invencion. Se ilustran en los siguientes ejemplos realizaciones de composiciones y procedimientos de la invencion.
25
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la invencion. Se apreciara que las variaciones en proporciones y las alternativas a elementos de los componentes mostrados resultaran 30 evidentes para los especialistas en la materia y estan dentro del alcance de aspectos de la presente divulgacion.
Ejemplo 1: Diseno de oligonucleotidos antisentido especfficos de una molecula antisentido de acido nucleico de una adiponectina (ADIPOQ) y/o una hebra con sentido de un polinucleotido de adiponectina (ADIPOQ)
35 Como se indica anteriormente, el termino “oligonucleotido especffico de” o “oligonucleotido orientado a” hace referencia a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una porcion del gen diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una porcion de un transcrito de mRNA del gen diana.
La seleccion de los oligonucleotidos apropiados se facilita usando programas informaticos que alinean 40 automaticamente las secuencias de acido nucleico e indican las regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se usan para comparar secuencias de acido nucleico obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acido nucleico de una serie de especies permite la seleccion de secuencias de acido nucleico que exhiben un grado apropiado de identidad entre especies. En el caso de genes que no se hayan secuenciado, se efectuan Southern blots para 45 permitir la determinacion del grado de identidad entre genes en la especie diana y otras especies. Al efectuar las Southern blots a grados variables de astringencia, como es bien conocido en la materia, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que exhiben un alto grado de complementariedad con las secuencias de acido nucleico diana en un sujeto para controlar y un menor grado de complementariedad con las correspondientes secuencias de acido nucleico de otras especies. Un 50 especialista en la materia se dara cuenta de que hay una considerable laxitud en la seleccion de las regiones apropiadas de genes para uso en la presente invencion.
Un compuesto antisentido es “especfficamente hibridable” cuando la union del compuesto con el acido nucleico diana interfiere la funcion normal del acido nucleico diana causando una modulacion de la funcion y/o actividad, y 55 hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no especffica del compuesto antisentido con secuencias de acido nucleico no diana en condiciones en que se desee una union especffica, es decir en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en las condiciones en que se efectuan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
Las propiedades de hibridacion de los oligonucleotidos descritos en la presente memoria pueden determinarse mediante uno o mas ensayos in vitro conocidos en la materia. Por ejemplo, las propiedades de los oligonucleotidos descritos en la presente memoria pueden obtenerse mediante la determinacion de la fuerza de union entre el compuesto antisentido natural diana y moleculas farmacologicas potenciales usando el ensayo de curva de fusion.
5
La fuerza de union entre el compuesto antisentido natural diana y una molecula farmacologica potencial (molecula) puede estimarse usando cualquiera de los procedimientos establecidos de medida de la fuerza de interacciones intermoleculares, por ejemplo, un ensayo de curva de fusion.
10 El ensayo de curva de fusion determina la temperatura a la que ocurre una transicion rapida de conformacion bicatenaria a monocatenaria para el complejo de compuesto antisentido natural/molecula. Esta temperatura es ampliamente aceptada como una medida fiable de la fuerza de interaccion entre las dos moleculas.
Puede efectuarse un ensayo de curva de fusion usando una copia de cDNA de la molecula de RNA antisentido 15 natural real o un nucleotido de DNA o RNA sintetico correspondiente al sitio de union de la molecula. Estan disponibles multiples kits que contienen todos los reactivos necesarios para efectuar este ensayo (p.ej., Applied Biosystems Inc., kit MeltDoctor). Estos kits incluyen una solucion tampon adecuada que contiene uno de los tintes de union a DNA bicatenario (dsDNA) (tal como tintes ABI HRM, SYbR Green, SYTO, etc.). Las propiedades de los tintes de dsDNA son tales que casi no emiten fluorescencia en forma libre pero son altamente fluorescentes cuando 20 se unen a dsDNA.
Para efectuar el ensayo, se mezclan el cDNA o el correspondiente oligonucleotido con la molecula a concentraciones definidas por los protocolos del fabricante particular. Se calienta la mezcla a 95 °C para disociar todos los complejos de dsDNA preformados y se enfrfa entonces lentamente a temperatura ambiente u otra 25 temperatura menor definida por el fabricante del kit para permitir que se reasocien las moleculas de DNA. Se calientan lentamente entonces a 95 °C los complejos recien formados con recogida continua simultanea de datos sobre la cantidad de fluorescencia que se produce por la reaccion. La intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a las cantidades de dsDNA presente en la reaccion. Los datos pueden recogerse usando un instrumento de PCR en tiempo real compatible con el kit (p.ej. StepOne Plus Real Time PCRSystem de ABI o el 30 instrumento LightTyper, Roche Diagnostics, Lewes, RU).
Se construyen los picos de fusion representando la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-d(fluorescencia)/dT) en el eje y) frente a la temperatura (eje x) usando el software apropiado (por ejemplo, LightTyper (Roche) o SDS Dissociation Curve, ABI). Se analizan los datos para identificar la temperatura de 35 transicion rapida del complejo de dsDNA a moleculas monocatenarias. Esta temperatura se denomina Tm y es directamente proporcional a la fuerza de interaccion entre las dos moleculas. Tfpicamente, la Tm superara los 40 °C.
Ejemplo 2: Modulacion de polinucleotidos de ADIPOQ
40 Tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos antisentido
Se hicieron crecer celulas HepG2 de ATCC (n° cat., HB-8065) en medio de crecimiento (MEM/EBSS (Hyclone n° cat SH30024, o Mediatech n° cat MT-10-010-CV) +10 % de FBS (Mediatech n° cat. MT35-011-CV) + penicilina/estreptomicina (Mediatech n° cat. MT30-002-CI) a 37 °C y 5 % de CO2. Un dfa antes del experimento, se 45 resembraron las celulas a una densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5% de CO2. El dfa del experimento, se cambio el medio en las placas de 6 pocillos por medio de crecimiento reciente. Se diluyeron todos los oligonucleotidos antisentido a una concentracion de 20 pM. Se incubaron 2 pl de esta solucion con 400 pl de medio Opti-MEM (Gibco n° cat. 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (Invitrogen n° cat. 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de la placa de 6 pocillos con celulas HepG2. Se 50 uso una mezcla similar que incluye 2 pl de agua en lugar de la solucion de oligonucleotido para los controles transfectados ficticiamente. Despues de 3-18 h de incubacion a 37 °C y 5 % de CO2, se cambio el medio a medio de crecimiento reciente. 48 h despues de la adicion de los oligonucleotidos antisentido, se retiro el medio y se extrajo el RNA de las celulas usando el sistema de aislamiento de RNA total SV de Promega (n° cat. Z3105) o el kit de aislamiento de RNA total RNeasy de Qiagen (n° cat. 74181) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se 55 anadieron 600 ng de RNA a la reaccion de transcripcion inversa efectuada usando el kit de cDNA Verso de Thermo Scientific (n° cat.AB1453B) o el kit de transcripcion inversa de cDNA de alta capacidad (n° cat. 4368813) como se describe en el protocolo del fabricante. Se uso el cDNA de esta reaccion de transcripcion inversa para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresion genica ABI Taqman (n° cat.4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI (ensayo de expresion genica Applied Biosystems Taqman: Hs02564413_s1 y
Hs01047563_m1 de Applied Biosysterns Inc., Foster City CA). Se uso el siguiente ciclo de PCR: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 minuto) usando la maquina de PCR StepOne Plus Real Time (Applied Biosystems). Se calculo el cambio en veces de la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido basandose en la diferencia en los valores de dCt normalizados a 5 18S entre las muestras tratadas y transfectadas ficticiamente.
Resultados:
Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de mRNA de ADIPOQ en celulas HepG2 aumentan 10 significativamente 48 h despues del tratamiento con un oligonucleotido disenado para AA515150 antisentido de ADIPOQ y un oligonucleotido disenado para BC036509 (Fig. 1).
Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de mRNA de ADIPOQ en celulas Hepg2 aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con dos oligonucleotidos disenados para AA515150 antisentido de 15 ADIPOQ (CUR-1107 y 1108) y un oligonucleotido disenado para BC036509 (CUR-1110) (Fig. 2).
Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de mRNA de ADIPOQ en celulas HepG2 aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con dos oligonucleotidos disenados para AA515150 antisentido de ADIPOQ (Fig. 4).
20
Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de mRNA de ADIPOR2 en celulas HepG2 aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con uno de los oligonucleotidos disenados para ADIPOR2 Skerblarbu.aApr antisentido de ADIPOR2. Los oligonucleotidos disenados para LOC729097 (CUR-1078-CUR-1081) no aumentaban la expresion de ADIPOR2 (Fig. 5).
25
Tratamiento de celulas Vero76 con oligonucleotidos antisentido:
Se hicieron crecer celulas Vero76 de ATCC (n° cat. CRL-1587) en medio de crecimiento (MEM/EBSS (Hyclone n° cat. SH30024, o Mediatech (n° cat. MT-10-010-CV) +10 % de FBS (Mediatech n° cat.MT35-011-CV) + 30 penicilina/estreptomicina (Mediatech n° cat. MT30-002-CI)) a 37 °C y 5 % de Co2. El dfa antes del experimento, se resembraron las celulas a una densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2. El dfa del experimento, se cambio el medio en las placas de 6 pocillos por medio de crecimiento reciente. Se diluyeron todos los oligonucleotidos antisentido en agua a una concentracion de 20 pM. Se incubaron 2 pl de esta solucion con 400 pl de medio Opti-MEM (Gibco n° cat.31985-070) y 4 pl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen n° cat. 35 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con celulas Vero76. Se uso una mezcla similar que inclufa 2 pl de agua en lugar de la solucion de oligonucleotido para los controles transfectados ficticiamente. Despues de 3-18 h de incubacion a 37 °C y 5 % de CO2, se cambio el medio a medio de crecimiento reciente. 48 h despues de la adicion de oligonucleotidos antisentido, se retiro el medio y se extrajo el RNA de las celulas usando el sistema de aislamiento de RNA total SV de Promega (n° cat. Z3105) o 40 el kit de aislamiento de RNA total RNeasy (n° cat. 74181), siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se anadieron 600 ng de RNA a la reaccion de transcripcion inversa efectuada usando el kit de cDNA Verso de Thermo Scientific (n° cat.AB1453B) como se describe en el protocolo del fabricante. Se uso el cDNA de esta reaccion de transcripcion inversa para monitorizar la expresion genica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresion genica ABI Taqman(n° cat.4369510) y cebadores/sondas disenados por ABI (ensayo de expresion genica Taqman 45 de Applied Biosystems: Hs02564413_s1 y Hs01047563_m1 de Applied Biosystems Inc., Foster .City CA). Se uso el siguiente ciclo de PCR: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la maquina de PCR StepOne Plus Real Time (Applied Biosystems). Se calculo el cambio en veces de la expresion genica despues del tratamiento con oligonucleotidos antisentido basandose en la diferencia en los valores de dCt normalizados a 18S entre las muestras tratadas y transfectadas ficticiamente.
Resultados: Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de mRNA de ADIPOQ en celulas Vero aumentan significativamente 48 h despues del tratamiento con un oligonucleotido disenado para AA515150 antisentido de ADIPOQ (CUR-1107) y un oligonucleotido disenado para BC036509 (CUR-1110) (Fig. 3).

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un oligonucleotido que se orienta a un transcrito antisentido natural de adiponectina (ADIPOQ) para uso como compuesto terapeutico, donde el oligonucleotido modula la expresion de adiponectina (ADIPOQ) y donde
    5 el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico expuesta en una de las SEQ IDNO: 3-6.
  2. 2. Un oligonucleotido que se orienta a un transcrito antisentido natural de adiponectina (ADIPOQ) para uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a adiponectina (ADIPOQ), donde el oligonucleotido modula la expresion de adiponectina (ADIPOQ) y donde el transcrito antisentido natural tiene la
    10 secuencia de acido nucleico expuesta en una de las SEQ IDNO: 3-6.
  3. 3. Uso de un oligonucleotido que se orienta a un transcrito antisentido natural de adiponectina (ADIPOQ) para la fabricacion de un medicamento para uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada a adiponectina (ADIPOQ), donde el oligonucleotido modula la expresion de adiponectina (ADIPOQ) y
    15 donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico expuesta en una de las SEQ IDNO: 3-6.
  4. 4. El oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 2 o el uso del oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 3, donde la enfermedad o trastorno asociado a adiponectina (ADIPOQ) se selecciona de entre el grupo consistente en cancer, inflamacion, ateroesclerosis, una enfermedad o trastorno neurologico, una
    20 enfermedad o trastorno cardiaco, una enfermedad o trastorno autoinmunitario, una enfermedad o trastorno infeccioso o una afeccion causada por agentes tales como virus, bacterias, hongos o protozoos, una enfermedad o trastorno de inmunodeficiencia, una alergia, ateroesclerosis, una enfermedad o trastorno metabolico (diabetes, neuropatfa diabetica, obesidad, hiperglicemia, resistencia a insulina, sfndromes metabolicos asociados a resistencia a insulina, sfndrome metabolico, hipertension, una enfermedad o trastorno asociado a una regulacion alterada de la 25 sensibilidad a insulina, nivel de glucosa sangufnea aberrante, etc.), una enfermedad hepatica, una enfermedad renal, albuminuria y un trastorno proliferativo celular.
  5. 5. Un procedimiento in vitro de modulacion de la expresion de adiponectina (ADIPOQ) en celulas o tejidos de pacientes que comprende: poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido que se
    30 orienta a un transcrito antisentido natural de adiponectina (ADIPOQ); modulando asf la expresion de adiponectina (ADIPOQ), donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico expuesta en una de las SEQ IDNO: 3-6.
  6. 6. Un oligonucleotido que se orienta a un transcrito antisentido natural de adiponectina (ADIPOQ), donde 35 el oligonucleotido modula la expresion de adiponectina (ADIPOQ) y donde el transcrito antisentido natural tiene la
    secuencia de acido nucleico expuesta en una de las SEQ IDNO: 3-6.
  7. 7. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, o el uso del oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4, o un procedimiento in vitro de acuerdo con la
    40 reivindicacion 5, o un oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 6, donde el oligonucleotido es de entre 10 y 30 nucleotidos de longitud.
  8. 8. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7, o el uso del oligonucleotido de acuerdo cualquiera de la reivindicacion 3, 4 o 7, o un procedimiento in vitro de acuerdo con la
    45 reivindicacion 5 o la reivindicacion 7, o un oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, donde el oligonucleotido tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con un complemento de un transcrito antisentido natural de adiponectina (ADIPOQ).
  9. 9. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 u 8, o el uso

    50 del oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8, o un procedimiento in vitro de

    acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, o un oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las
    reivindicaciones6 a 8, donde el oligonucleotido es monocatenario.
  10. 10. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 u 8, o el uso

    55 del oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8, o un procedimiento in vitro de

    acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, o un oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las
    reivindicaciones 6 a 8, donde el oligonucleotido es un compuesto de siRNA
  11. 11. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 10, o el uso
    del oligonucleotido de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 o 10, o un procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 10, o un oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el oligonucleotido comprende al menos una de las SEQ IDNO: 7-31.
    5 12. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 11, o el uso
    del oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 11, o un procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 11, o un oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, donde el oligonucleotido aumenta la expresion de adiponectina (ADIPOQ).
    10 13. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 11, o el uso
    del oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 11, o un procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 11, o un oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, donde el oligonucleotido disminuye la expresion de adiponectina (ADIPOQ).
    15 14. El oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 12, o el uso del oligonucleotido de
    acuerdo con la reivindicacion 12, o un procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicacion 12, o un
    oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 12, donde la expresion de adiponectina (ADIPOQ) aumenta en al menos un 10 %.
    20 15. El oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 13, o el uso del oligonucleotido de
    acuerdo con la reivindicacion 13, o un procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicacion 13, o un
    oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 13, donde la expresion de adiponectina (ADIPOQ) disminuye en al menos un 10 %.
    25 16. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 15, o el uso
    del oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 15, o un procedimiento invitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 15, o un oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, donde el oligonucleotido comprende ademas una o mas modificaciones que comprenden
    30 a. al menos un ligamiento internucleosfdico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, 2'-Ometoxietilo (MOE), 2'-fluoro, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester fosfato, acetamitado, ester de carboximetilo y combinaciones de los mismos;
    b. al menos un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido peptidonucleico (PNA), un acido nucleico bloqueado (LNA), un acido arabinonucleico (FANA), un analogo, un derivado y combinaciones de los mismos; o
    35 c. al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado con 2'-O- metoxietilo, un resto de azucar modificado con 2'-metoxilo, un resto de azucar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico y combinaciones de los mismos.
  12. 17. Una composicion farmaceutica que comprende al menos un oligonucleotido que tiene los rasgos de un
    40 oligonucleotido definido en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 16 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
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