ES2692162T3 - Tratamiento de obesidad, síndrome metabólico, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal usando al menos una cepa bacteriana de Prevotella - Google Patents

Abstract

Un producto para su uso en el tratamiento de obesidad, síndrome metabólico, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal que comprende al menos una cepa bacteriana aislada a partir de las especies Prevotellaceae, donde la cepa se selecciona de entre el grupo que consiste en Prevotella copri y Prevotella ruminicola.

Description

DESCRIPCION

Tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal usando al menos una cepa bacteriana de Prevotella 5

CAMPO DE LA INVENCION

Un producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal que comprende al 10 menos una cepa bacteriana aislada a partir de las especies Prevotellaceae, donde la cepa se selecciona de entre el grupo que consiste en Prevotella copri y Prevotella ruminicola. El producto puede ser un producto alimentario.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

15 Muchas empresas de alimentos e ingredientes dentro del campo han incrementado sus actividades para identificar ingredientes asf como productos alimentarios cuyo uso proporcionara efectos beneficiosos para la salud en el consumidor ademas de proporcionar nutrientes esenciales, denominados alimentos funcionales. Algunos ejemplos son microorganismos viables, denominados probioticos, que han mostrado beneficios concretos para la salud en la salud del aparato digestivo y que se incluyen entre los productos alimentarios como por ejemplo diferentes 20 productos lacteos como leche fermentada, yogur, asf como diferentes bebidas. Otros ejemplos de productos alimentarios con beneficios para la salud son alimentos que contienen fibra dietetica (FD), hidratos de carbono prebioticos, estanol, acidos grasos omega 3, vitaminas, polifenoles, alimentos con bajo impacto glucemico, etc.

Desde la perspectiva de la salud publica existe actualmente una necesidad especial de desarrollar nuevos productos 25 alimentarios que puedan actuar para mejorar el metabolismo de la glucosa y reducir la obesidad y los trastornos relacionados. El deterioro del metabolismo de la glucosa se asocia tambien con un deterioro del funcionamiento cognitivo. La prevalencia de trastornos del estilo de vida relacionados tales como obesidad y diabetes tipo 2 (DT2) esta creciendo globalmente, y se ha indicado que el numero de personas que sufren DT2 en todo el mundo aumentara desde los actuales 366 millones hasta alcanzar 552 millones en el ano 2030. Asf pues la necesidad de 30 estrategias preventivas es urgente. La prevencion basada en la dieta se reconoce como la estrategia mas eficiente en la lucha contra la enfermedad relacionada con el estilo de vida, y los estudios epidemiologicos respaldan que por ejemplo una ingesta elevada de cereales integrales y legumbres es beneficiosa para la prevencion y abordaje de la diabetes, y para el control del peso.

35 La obesidad es un factor importante que contribuye a los trastornos cardiometabolicos, pero los mecanismos subyacentes no se conocen totalmente. Sin embargo, una caracterfstica clave parece ser la “inflamacion metabolica” y la activacion del sistema innato. Los patrones dieteticos como por ejemplo los alimentos ricos en IG y los alimentos densos en energfa, se consideran cada vez mas de valor predictivo del riesgo futuro de enfermedades cardiovasculares. En la actualidad, existe un cuerpo creciente de conocimientos que respalda la importancia de una 40 microbiota sana del aparato digestivo en la lucha contra los trastornos cardiometabolicos y el ecosistema del aparato digestivo se esta reconociendo como un modulador del metabolismo, el apetito y la regulacion del peso del hospedador. Se ha sugerido que el “dialogo” metabolico entre la microbiota del aparato digestivo y los tejidos perifericos se regula a traves de la fermentacion en el aparato digestivo de los componentes indigeribles de la dieta, tales como hidratos de carbono indigeribles.

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Buena parte de las evidencias relativas al papel de los sustratos fermentables en el aparato digestivo en el metabolismo del hospedador proceden de estudios con inulina que muestran los beneficios en el metabolismo de la glucosa y la regulacion del peso en modelos experimentales animales.

50 Recientemente se ha documentado la importancia de la microbiota del aparato digestivo en estudios basados en trasplante fecal de donantes humanos magros a sujetos que sufren sfndrome metabolico (SMet); representando el SMet una agrupacion de factores de riesgo que identifican a sujetos en alto riesgo de desarrollar DT2 y enfermedades cardiovasculares. El trasplante fecal produjo un aumento en la sensibilidad a la insulina en los sujetos con DT2 6 semanas despues de la infusion fecal. Estos nuevos hallazgos son estimulantes y se suman a los 55 conocimientos sobre la importancia de una microbiota sana. Sin embargo, los trasplantes fecales pueden ser complicados y comportan riesgos.

Asf, se necesitan estrategias para aumentar el numero de bacterias beneficiosas, y promover un equilibrio saludable de la composicion microbiana del aparato digestivo por otros medios. Hasta la fecha la mayorfa de los estudios que 60 muestran aumentos de las bacterias beneficiosas despues de manipulacion de la dieta son transversales y, por

tanto, no revelan causalidad. Esto puede conseguirse suministrando bacterias viables a traves de enemas, o a traves de productos alimentarios, que incluyen los llamados probioticos, o por el suministro en la dieta de cantidades suficientes de sustratos en el colon como, por ejemplo, sustratos prebioticos especfficos en la dieta habitual, o combinando probioticos y prebioticos.

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A pesar de los esfuerzos de la industria alimentaria por desarrollar nuevos productos alimentarios con propiedades saludables mejoradas o productos del tipo de alimentos funcionales la obesidad sigue constituyendo un problema de gran magnitud, al igual que el aumento de la poblacion de sujetos con SMet o DT2. Estas dolencias se tratan normalmente con farmacos. Sin embargo, si a los sujetos sanos o a las personas en riesgo de enfermedad pudieran 10 ofrecerseles productos alimentarios disenados especfficamente para contrarrestar los procesos patologicos tempranos, se prevendrfa el desarrollo de la obesidad y el SMet, incluido el deterioro del funcionamiento cognitivo. Por otra parte, dichos productos alimentarios tambien podrfan facilitar el abordaje de la enfermedad en pacientes con enfermedad manifiesta relacionada con SMet.

15 HAYASHI H. Y COL.: “PREVOTELLA COPRI SP AND PREVOTELLA STERCOREA SP. NOV. ISOLATED FROM HUMAN FAECES”, INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY, vol. 57, n.° 5, 2007, paginas 941-946, describe el aislamiento de una cepa de P. copri a partir de heces humanas.

El documento WO-2011/053653 describe preparaciones de Prevotella histicola para su uso como un medicamento 20 oral o un suplemento dietetico principalmente para tratar dolencias autoinmunitarias tales como artritis y esclerosis multiple.

El documento WO-2013/182038 se refiere a composiciones y procedimientos para mejorar las poblaciones de microbiota del aparato digestivo, incluyendo acidos grasos de cadena corta que producen bacterias.

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El documento WO-2012/142605 describe composiciones que comprenden una combinacion preseleccionada de microorganismos que son utiles en el tratamiento de un trastorno, dolencia o enfermedad intestinal tales como enfermedad inflamatoria intestinal.

30 El documento WO-2013/053836 describe una composicion que comprende microbiota intestinal humana cultivada en condiciones anaerobias, que incluye bacterias de Prevotella para su uso en el tratamiento de enfermedades, que incluyen enfermedad inflamatoria intestinal, Alzheimer, obesidad y diabetes tipo II.

RESUMEN DE LA INVENCION 35

La invencion se refiere al hallazgo singular de que las especies que pertenecen a Prevotellaceae tienen efectos beneficiosos en la salud del hospedador. Las especies pertenecientes a Prevotellaceae pueden usarse en cualquier clase de productos alimentarios, o como ingrediente en un producto alimentario, tal como un probiotico con o sin hidratos de carbono indigeribles anadidos, administrado confinado en una capsula, en forma de enema o como un 40 supositorio para mejorar la salud del consumidor.

En un primer aspecto la invencion se refiere a un producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal que comprende al menos una cepa bacteriana aislada a partir de las especies Prevotellaceae, 45 donde la cepa se selecciona de entre el grupo que consiste en Prevotella copri y Prevotella ruminicola.

Con dicho producto es posible por primera vez proporcionar nuevos ingredientes alimentarios saludables asf como productos alimentarios, capsulas, enemas o supositorios que podrfan ser utiles en el tratamiento de una serie de enfermedades mencionadas anteriormente para mejorar el metabolismo de la glucosa y reducir los factores de 50 riesgo en el sfndrome metabolico. El producto puede proporcionarse conjuntamente con una o mas fibras dieteticas y/o almidon resistente.

Se describiran en mas detalle las ventajas y objetivos adicionales con la presente invencion, entre otros con referencia a los dibujos adjuntos.

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BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Respuestas de glucosa en sangre e insulina serica (cambios incrementales (A)) al desayuno estandarizado despues de 3 dfas de consumo de pan de grano de cebada (PC) y pan de trigo (PT), 60 respectivamente. El consumo de PC produjo menores concentraciones maximas de glucosa e insulina posprandial

(P<0,01, y P<0,001, respectivamente) y menores areas bajo las curvas de glucosa e insulina (0-150 min: P<0,01 y P<0,001, respectivamente) en comparacion con el PT de referencia (n=39).

Figura 2. Respuestas de glucosa en sangre e insulina serica (cambios incrementales (A)) al desayuno 5 estandarizado despues de 3 dfas de consumo de pan de grano de cebada (PC) y pan de trigo (PT), respectivamente. El consumo de PC produjo menores concentraciones maximas de glucosa e insulina posprandial (P<0,05 para las dos), y menores areas bajo las curvas de glucosa e insulina (0-150 min: P<0,05 y P<0,01, respectivamente) en comparacion con el PT de referencia (n=20).

10 Figura 3. Expulsion de H2 exhalado en el desayuno estandarizado, despues de 3 dfas de consumo de pan de grano de cebada (PC) y pan de trigo (PT), respectivamente. El consumo de PC produjo un aumento significativo de H2 exhalado en comparacion con el PT de comida de referencia (concentracion media durante el dfa del experimento, P<0,01 (n=20).

15 Figura 4. Concentraciones de PYY en plasma en el desayuno estandarizado, despues de 3 dfas de consumo de pan de grano de cebada (PC) y pan de trigo (PT), respectivamente. El consumo de PC produjo un aumento significativo de concentraciones plasmaticas de PYY (0-120 min), en comparacion con tres dfas de ingesta de PT (efecto principal durante el dfa del experimento, P<0,05 (n=20).

20 Figura 5. Respuestas de glucosa en sangre en respondedores (n=10) y no respondedores (n=10) despues del desayuno estandarizado, despues de 3 dfas de consumo de pan de grano de cebada (PC) o pan de trigo (PT), respectivamente. En el grupo de respondedores, tres dfas de consumo de PC produjeron respuestas de glucosa significativamente menores, en comparacion con tres dfas de ingesta de PT (area bajo la curva 0-150 min, P<0,0001). No se observaron mejoras en la tolerancia a la glucosa (area bajo la curva) del PC en el grupo de no 25 respondedores.

Figura 6. Respuestas de insulina serica en respondedores (n=10) y no respondedores (n=10) despues del desayuno estandarizado, despues de 3 dfas de consumo de pan de grano de cebada (PC) y pan de trigo (PT), respectivamente. En el grupo de respondedores, tres dfas de consumo de PC produjeron respuestas de insulina 30 significativamente menores, en comparacion con tres dfas de ingesta de PT (area bajo la curva 0-120 min, P<0,01). No se observaron mejoras del PC en el grupo de no respondedores.

Figura 7. Respuestas de glucosa en sangre en respondedores (n=7) y no respondedores (n=7) despues del desayuno estandarizado, despues de 3 dfas de consumo de pan de grano de cebada (PC) y pan de trigo (PT), 35 respectivamente. En el grupo de respondedores, tres dfas de consumo de PC produjeron respuestas de glucosa significativamente menores, en comparacion con tres dfas de ingesta de PT (area bajo la curva 0-150 min, P<0,0001). No se observaron mejoras en la tolerancia a la glucosa (area bajo la curva) del PC en el grupo de no respondedores.

40 La Figura 8 muestra la variacion taxonomica de las principales especies microbianas del aparato digestivo a traves de los diferentes grupos que intervienen en el estudio, los datos se han generado despues de analisis de pirosecuenciacion 454. Las seis barras representan los grupos participates en el estudio: R-control (respondedores de control), R-PT (respondedores de pan de trigo), R-PC (respondedores de pan de grano de cebada). NR=no respondedores. Control significa que las muestras han sido recocidas sin consumo de panes de prueba (PC o PT).

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La Figura 9 muestra que los ratones monocolonizados con Prevotella copri (n=6) durante dos semanas muestran una mejora en la tolerancia a la glucosa oral y menores niveles de insulina serica en comparacion con ratones monocolonizados con Bacteroides thetaiotaomicron (n=6) (P=0,0076). Los ratones bicolonizados con P. copri y B. thetaiotaomicron (n=7) tambien muestran mejor tolerancia a la glucosa oral en comparacion con los ratones 50 monocolonizados con B. thetaiotaomicron (P=0,0426).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

DEFINICIONES

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En el contexto de la presente solicitud y la presente invencion, se aplican las siguientes definiciones:

El termino “sfndrome metabolico” o SMet describe la agrupacion de factores de riesgo tales como obesidad, hiperlipidemia, hipertension e intolerancia a la glucosa, que identifica a sujetos en alto riesgo de desarrollar diabetes 60 tipo 2 (DT2) y enfermedades cardiovasculares. El termino “probiotico” describe un microorganismo viable, tal como

bacterias que tras la colonizacion en el aparato digestivo confieren un beneficio para la salud del hospedador.

El termino “fibra dietetica” o “FD” describe hidratos de carbono que incluyen tres o mas monomeros que resisten la digestion y la absorcion en el intestino delgado, y son fermentados total o parcialmente en el colon por bacterias del 5 aparato digestivo. En la presente solicitud el termino FD se refiere a polisacaridos indigeribles no derivados del almidon tales como beta-glucanos, arabinoxilanos, celulosa, oligosacaridos, fructanos, pectina, goma guar. En la definicion de FD se incluyen tambien sustratos indigeribles que estan asociados estrechamente con polisacaridos indigeribles en la planta (por ejemplo, fracciones de protefnas, compuestos fenolicos, lignina, ceras, fitatos, fitoesteroles indigeribles).

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El termino “almidon resistente” (AR) describe productos de almidon y de degradacion de almidon que escapan a la digestion en el intestino delgado de individuos sanos, es decir, FD derivadas de almidon. El AR puede suministrar algunos de los beneficios de las FD insolubles y algunos de los beneficios de la FD soluble. El AR puede proceder de almidon encapsulado botanicamente, almidon no gelatinizado o almidon retrogradado.

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El termino “almidon retrogradado” describe la recristalizacion de moleculas de almidon despues de cocinar y enfriar, que produce estructuras resistentes a la digestion y la absorcion en el intestino delgado.

El termino “almidon encapsulado botanicamente” describe un almidon que esta atrapado ffsicamente en la matriz del 20 alimento, o en celulas botanicas que lo hacen inaccesible para las enzimas digestivas en el intestino delgado.

El termino “almidon no gelatinizado” describe granulos de almidon no procesado que aparecen en su forma natural, tales como almidon en patatas no cocinadas o cereales no cocinados, o granulos de almidon que han resistido la gelatinizacion tras el procesamiento, para producir una estructura cristalina intacta indigerible retenida.

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El termino “prebiotico” describe componentes alimentarios indigeribles, preferentemente hidratos de carbono indigeribles tales como FD y AR, que estimulan el crecimiento y/o la actividad de bacterias en el sistema digestivo de formas asociadas con beneficios para la salud.

30 El termino “simbioticos” describe una combinacion de probiotico y prebiotico.

El termino SCFA describe acidos grasos de cadena corta producidos a partir de la fermentacion microbiana en el aparato digestivo de hidratos de carbono indigeribles.

35 El termino “encapsulado” describe que la cepa Prevotella puede encapsularse para protegerse del entorno (por ejemplo, oxfgeno y acidez) y asf permanecera intacta y conservara las cualidades y actividades en el producto alimentario y durante el paso a traves del aparato digestivo. Las tecnicas usadas para encapsulacion pueden basarse por ejemplo en pelfculas comestibles basadas en alginato, goma guar, goma de xantano, goma garroffn, goma de carragenano u otras fibras dieteticas, casefna, prebioticos o almidon, emulsiones de Pickering, etc. Pueden 40 aplicarse diferentes tecnologfas de encapsulacion, algunas de las cuales son descritas por R Vidhyalakshmi y col., 2009 [1].

El termino “respondedores” describe a sujetos humanos que despues de consumir el producto prebiotico con grano de cebada recibieron una mejora de la regulacion de la glucosa.

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El termino “no respondedores” se refiere a sujetos humanos que despues de consumir el producto prebiotico con grano de cebada no muestran evidencias de mejora de la regulacion de la glucosa.

El termino “enema” se usa para describir un procedimiento por el cual una solucion que contiene la Prevotella spp se 50 introduce con o sin sustrato de prebiotico en el aparato digestivo a traves del recto para modular de forma beneficiosa la composicion microbiana del aparato digestivo.

El termino inflamacion metabolica se usa para describir: inflamacion cronica de grado bajo orquestada por celulas metabolicas en respuesta a un exceso de nutrientes y energfa asociado con resistencia a la insulina y disfuncion 55 metabolica.

LA INVENCION

Se ha encontrado que la FD y el AR intrfnsecos en productos de grano de cebada poseen efectos beneficiosos con 60 respecto a los marcadores de riesgo cardiometabolico y la regulacion del apetito, lo que probablemente sucede

tambien para otros grupos de fibras. Por ello, la tolerancia a la glucosa y el ahorro de insulina mejoraron en una perspectiva temporal de 11-14 h despues de la ingesta de productos de grano de cebada, que supone una perspectiva de toda la noche desde una cena con grano de cebada hasta el posterior desayuno estandarizado en sujetos sanos.

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Otro hallazgo importante fue un aumento en las concentraciones plasmaticas de GLP-1 y otras hormonas reguladoras del apetito, y una disminucion de la ingesta de energfa voluntaria, mientras simultaneamente se reducfa el hambre percibida. Ademas, los hidratos de carbono indigeribles de cebada redujeron los marcadores de inflamacion metabolica. Un estado de aumento de la inflamacion metabolica es un factor de riesgo cardiometabolico 10 reconocido, lo que convierte a los conceptos alimentarios que reducen la inflamacion metabolica en prometedores para la prevencion del SMet y la DT2. Se observo un aumento en la produccion de hidrogeno exhalado (marcador de fermentacion en el aparato digestivo) y SCFA, indicativo del aumento de la actividad de fermentacion en el aparato digestivo despues de la ingesta de hidratos de carbono indigeribles de cebada. Se encontraron asociaciones significativas entre los marcadores de fermentacion en el aparato digestivo y la mejora de la regulacion de la 15 glucosa, lo que demuestra efectos mediados por prebioticos de los productos a base de grano de cebada en los marcadores de riesgo metabolico, es decir, los efectos beneficiosos observados estan relacionados con mecanismos derivados de fermentacion bacteriana en el aparato digestivo de hidratos de carbono indigeribles. Los SCFA producidos durante la fermentacion de la microbiota en el aparato digestivo proporcionan energfa a los enterocitos en el colon, y ademas los SCFA actuan tambien como moleculas de senalizacion.

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Por consiguiente, se ha demostrado que los SCFA producidos por fermentacion bacteriana pueden desencadenar cascadas de senalizacion a traves de su accion en receptores de SCFA en celulas L, lo que produce un aumento de la liberacion en el aparato digestivo de pepticos tales como GLP-1 y PYY (modelo in vitro). Los resultados obtenidos demuestran claramente un potencial prebiotico de FD y AR en productos de cereales tales como los productos de 25 grano de cebada

Sorprendentemente, en sujetos sanos se ha descubierto que los beneficios observados despues de consumir productos de grano de cebada (pan) en relacion con los marcadores de riesgo cardiometabolico y la regulacion del apetito podrfan asociarse con una alteracion especffica de la microbiota del aparato digestivo, y los autores de la 30 invencion han identificado un aumento en las especies Prevotella. Ademas, la transferencia de una cepa de Prevotella especffica (Prevotella copri) a ratones sin germenes mejoro la tolerancia a la glucosa en los animales. Los resultados ponen de relieve un efecto probiotico de la cepa bacteriana identificada con beneficios en el metabolismo de la glucosa. Uno de los criterios para seleccion de cepas de Prevotella fue la aparicion de glucosido hidrolasas, necesarias para la degradacion de azucares complejos. Todas las cepas seleccionadas tienen glucosido hidrolasas, 35 y son capaces de degradar un rango importante de azucares complejos. Un criterio adicional fue que las cepas seleccionadas produjeran succinato como productos principales de la degradacion de los azucares complejos. Los ejemplos de las cepas fueron Prevotella copri, Prevotella stercorea, Prevotella histicola, Prevotella ruminicola, Prevotella Bryantii 25A y Prevotella distasonis. Tambien son posibles mezclas de una o mas de las diferentes cepas, tales como 2, 3, 4, 5 o 6 cepas diferentes. La cepa puede estar presente en una cantidad de 107 o mas tal como 107, 40 1 08, 109 o incluso en cantidades superiores.

Ademas, los resultados revelan por primera vez que los sustratos prebioticos investigados, es decir, FD y AR presentes en productos de grano de cebada, en combinacion con la cepa de Prevotella spp. podrfan ser especialmente valiosos en un enfoque de simbioticos ya que estos sustratos del aparato digestivo favorecfan un 45 aumento de Prevotella. Los resultados se obtuvieron en sujetos sanos de edad mediana/avanzada en ayunas y despues de un desayuno estandarizado despues de 3 dfas ingestion de un producto a base de grano de cebada (basado en 100 g de hidratos de carbono disponibles/dfa). El producto de grano de cebada se comparo con un producto de referencia de pan de trigo usando un diseno cruzado. Al influir en la composicion de la microbiota del aparato digestivo y aumentar la proporcion de Prevotella spp, el producto a base de grano de cebada produjo un 50 aumento de la actividad de fermentacion en el aparato digestivo (hidrogeno (H2) exhalado como marcador de prueba) (P<0,001), un aumento de las concentraciones de SCFA (P<0,05), una mejora de la regulacion de la glucosa (concentraciones de glucosa e insulina reducidas (P<0,05), un aumento de las concentraciones de PYY (una hormona de la saciedad liberada en el aparato digestivo) (P<0,05), un aumento en las concentraciones en ayunas de GLP-1 (una hormona digestiva anti-obesidad y antidiabetica), un aumento en la saciedad percibida en 55 ayunas y una reduccion de las sensaciones de hambre en ayunas. Al alterar la composicion de la microbiota del aparato digestivo y aumentar la Prevotella spp, la ingesta de alimentos a base de grano de cebada ricos en FD y AR de cebada aumento la fermentacion del metabolito succinato en el aparato digestivo en seres humanos y en ratones.

Los resultados revelaron ademas que algunos individuos (aproximadamente el 15 %) entre los sujetos de prueba no 60 consiguieron una mejora de la regulacion de la glucosa despues de la ingesta del producto de prueba a base de

grano de cebada (determinado por la respuesta de glucosa y/o insulina a una comida estandarizada despues de 3 dfas de intervencion con cebada). De forma interesante, ninguno de estos “no respondedores” adquirio un aumento en el aparato digestivo de las concentraciones de Prevotella despues de la ingestion del producto de grano de cebada. Esto resalta la relacion causal entre la mejora de la regulacion glucemica y el aumento de la abundancia de 5 Prevotella spp que es de conocimiento totalmente nuevo en el dominio publico. Ademas, estos resultados indican por primera vez que algunos individuos no modifican tan facilmente la composicion de la microbiota de su aparato digestivo microbiota, y pueden beneficiarse especialmente de la ingestion oral de la combinacion propuesta de prebioticos de cebada (FD+AR) y Prevotella spp; o por ingestion solo de Prevotella spp.

10 Por ejemplo, mediante el uso de un producto alimentario de grano de cebada rico en FD y AR o FD o AR se han establecido beneficios en el control de glucosa en sangre, los marcadores de inflamacion metabolica y la regulacion del apetito. Los beneficios metabolicos se asociaron con marcadores de fermentacion en el aparato digestivo, es decir, hidrogeno exhalado, SCFA en plasma que indica un mecanismo prebiotico.

15 La cartograffa microbiana del aparato digestivo de muestras fecales de seres humanos sanos que infieren el producto de grano de cebada mencionado anteriormente revelaron que los beneficios en los marcadores de riesgo metabolico y la regulacion del apetito estaban relacionados con una alteracion especffica de la composicion de microorganismos presentes en el aparato digestivo. Los sujetos que ingirieron el producto alimentario de grano de cebada mencionado anteriormente mostraron un aumento de especies Prevotella en la microbiota del aparato 20 digestivo y una mejora de los marcadores de riesgo cardiometabolico en comparacion con los sujetos que no ingirieron el producto alimentario de grano de cebada (veanse los Ejemplos mas adelante).

Ademas, se demostro que la monocolonizacion de ratones sin germenes con una cepa de Prevotella spp. mejoro el metabolismo de la glucosa en los animales. Asf, la conclusion a partir de los resultados anteriores es que resulta 25 apropiado usar especies relacionadas con Prevotella como un probiotico por ejemplo con propiedades antidiabeticas y potencial de regulacion del peso. La estrecha relacion entre el deterioro de metabolismo de la glucosa y el deterioro de la funcion cognitiva hace tambien relevante el uso de especies de Prevotella para prevenir el declive cognitivo asociado con SMet. Anteriormente se mencionan otras enfermedades o trastornos.

30 A partir de los experimentos y la conclusion anteriores se identifico que la invencion estaba relacionada con un producto, tal como un producto alimentario o un ingrediente o formulacion alimentarios que se usaran en forma de enema, lo que comprende al menos una cepa bacteriana aislada humana de Prevotellaceae. Las bacterias pueden modificarse geneticamente, por ejemplo modificarse para producir succinato. Los ejemplos son Prevotella copri, Prevotella stercorea, Prevotella histicola, Prevotella ruminicola, Prevotella Bryantii 25A y Prevotella distasonis.

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El producto alimentario probiotico puede usarse en solitario, o en combinacion con otros componentes, tales como al menos un tipo de fibras dieteticas, tales como FD y AR o FD o AR y en algunos ejemplos tambien acido succfnico para regular el metabolismo de la glucosa y reducir los factores de riesgo en el sfndrome metabolico en un mamffero tal como en seres humanos. Los ejemplos de enfermedades o trastornos que se tratarfan incluyen tratamiento de 40 obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal, tales como obesidad, sfndrome metabolico y diabetes tipo 2.

El producto alimentario probiotico puede comprender tambien al menos una FD y/o un AR, naturales o sinteticos, purificados, mezclas o variantes de los mismos. Los ejemplos de FD y AR son FD y AR de cereales o legumbres 45 tales como FD viscosas o no viscosas de cebada, centeno, trigo, avena, semillas de legumbres, beta-glucanos, goma guar, lignina, lignanos y oligosacaridos tales como galactooligosacaridos y fructooligosacaridos, AR encapsulados botanicamente, AR retrogradados, almidon modificado qufmicamente o AR no gelatinizado. El producto puede comprender al menos un tipo de almidon resistente (AR), natural, sintetico, purificado, mezclas o variantes del mismo. Los ejemplos de AR son almidon vegetal tal como almidon retrogradado, almidon encapsulado 50 botanicamente, almidon no gelatinizado y ciclodextrinas, o almidon modificado qufmicamente. La fibra puede proceder por ejemplo de granos de cebada. La proporcion AR/FD podrfa ser por ejemplo de 10,8 (AR)/13,04 (FD). La FD podrfa ser fibra dietetica de cebada, trigo, centeno, avena o beta-glucanos extrafdos, goma guar, lignina, lignanos y oligosacaridos tales como galactooligosacaridos y fructooligosacaridos, AR encapsulados botanicamente, AR retrogradado, almidon modificado qufmicamente o AR no gelatinizado. El producto puede comprender al menos 55 un tipo de almidon resistente (AR), natural, sintetico, purificado, mezclas o variantes del mismo. Los ejemplos de AR son almidon vegetal tal como almidon retrogradado, almidon encapsulado botanicamente, almidon no gelatinizado y ciclodextrinas, o almidon modificado qufmicamente. La fibra puede ser por ejemplo de granos de cebada.

El producto puede contener por ejemplo una o mas cepas bacterianas junto con AR y/o DS para conseguir los 60 resultados esperados.

En otra realizacion, el producto de la invencion comprende una cepa bacteriana adicional, donde dicha cepa puede producir succinato. Los ejemplos de dichas cepas incluyen cualquier cepa bacteriana que sea beneficiosa e incluyen por ejemplo Lactobacillus, tales como Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, 5 Lactobacillus plantarum, Roseburia y Bifidobacteria, tales como Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis y Bifidobacterium bifidum. La cepa bacteriana adicional puede modificarse tambien geneticamente, por ejemplo para producir succinato.

El producto puede contener tambien succinato en forma libre o con adicion de una cepa bacteriana que produce 10 succinato. Una cepa que produce succinato naturalmente o una cepa que ha sido modificada geneticamente para producir succinato.

Por consiguiente, el producto puede estar encapsulado o liofilizado como conocen bien los expertos en la materia.

15 En otra realizacion la cepa bacteriana de Prevotellaceae esta encapsulada en cualquier forma para proteger la cepa del oxfgeno. Los ejemplos de tecnicas de encapsulacion incluyen pelfculas comestibles, emulsiones de Pickering estables que emplean granulos de almidon como material de barrera, encapsulacion basada en polisacaridos como beta-glucanos, goma guar, goma de xantano, goma garroffn, goma de carragenano, prebioticos, alginato, protefna de la leche, etc. Otras tecnicas incluyen formacion de complejos entre polfmeros en dioxido de carbono supercrftico. 20 Pueden aplicarse diferentes tecnicas de encapsulacion, algunas de las cuales han sido descritas por R Vidhyalakshmi y col., 2009.

En otra realizacion la cepa/cepas bacterianas de Prevotellaceae pueden proporcionarse a traves de enema en solitario o en una composicion con sustratos prebioticos tales como FD y/o aR.

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El producto puede ser, por ejemplo, cualquier producto alimentario adecuado e incluye cualquier producto alimentario que no este tratado por calor o lo este ligeramente, o donde la Prevotella pueda introducirse despues de tratamiento por calor, tal como bebidas, preparados lfquidos (por ejemplo, a base de frutas o lacteos), batidos de frutas, refrescos, zumos, agua de mesa, sopas frfas/preparados para sopas, productos de aceites, pasta para untar, 30 alinos, salsa frfa/preparados para salsas, salsa, productos lacteos, helados y bebidas a base de cereales, que contienen o estan suplementadas con la Prevotella o con la Prevotella y el prebiotico combinados. La Prevotella puede encapsularse tambien e incluirse en los alimentos descritos anteriormente, aumentando asf la resistencia al entorno y a las condiciones de procesamiento.

35 El producto alimentario tambien puede ser alimentos tratados por calor tales como pan blando, galletas crujientes de centeno, pan sin levadura, tortillas, gachas de avena, cereales de desayuno, barras de cereales u otros aperitivos, patata en polvo u otros productos alimentarios instantaneos, comidas preparadas para comer, que contienen el prebiotico por ejemplo de cebada, para su consumo con o sin suplementos con la Prevotella. Capsulas que contienen la Prevotella spp. que se ingeriran con los productos enumerados anteriormente, o que se consumiran 40 para el suministro de la Prevotella. Las capsulas pueden prepararse adicionalmente a partir de hidratos de carbono prebioticos, por ejemplo de cebada. La Prevotella puede encapsularse tambien por ejemplo mediante tecnicas de emulsion estable e incluirse en los alimentos.

La Prevotella spp. tambien puede proporcionarse en forma de un polvo en seco y empaquetada en recipientes 45 desechables para anadirse a las comidas, por ejemplo a los cereales de desayuno. El producto alimentario tambien puede ser por ejemplo una bebida, sopa, yogur, budfn de cereales frfo o una bebida lfquida proporcionada en un envase con dos camaras, con Prevotella con o sin prebiotico en una de las camaras y el producto alimentario como anteriormente en la otra, que se mezclaran para el consumo. La camara con Prevotella tambien puede consistir en una paja, que se incluye con el paquete, o distribuirse por separado. A continuacion, la Prevotella se consumira 50 bebiendo a traves de la paja.

El producto puede ser una emulsion estable, donde la Prevotella con o sin prebioticos se encapsula en gotas de emulsion. Estos productos pueden administrarse, por ejemplo, en forma de bebida lfquida.

55 En el caso en que la Prevotella se incluya en capsulas, las capsulas deben adoptar preferentemente una forma de capsulas enteras. La Prevotella puede incluirse tambien en comprimidos enteros, comprimidos de tipo depot, capsulas de tipo depot (liberacion prolongada) o granulos de liberacion prolongada.

El producto puede ser tambien un ingrediente alimentario que se anadira a un producto alimentario.

La invencion define tambien un producto que podrfa usarse en el tratamiento de una serie de enfermedades o trastornos que incluyen los mencionados a continuacion. Podrfa usarse para el tratamiento de la obesidad, y trastornos asociados relacionados con deterioro de la regulacion de glucosa en sangre tales como diabetes tipo 2 asf como proteccion frente a inflamacion subclinica y enfermedades asociadas tales como enfermedades 5 cardiovasculares. Ademas, los conceptos protegidos contrarrestan las caracterfsticas de la patogenia de la demencia. Tambien, la desregulacion de la glucosa en sangre se asocia con inflamacion y dano endotelial, y proporciona asf un vinculo entre el concepto protegido por la presente memoria y la prevencion de enfermedades cardiovasculares.

10 Por consiguiente, incluso un deterioro leve de la regulacion de la glucosa en el rango normal esta relacionado con un rendimiento significativamente menor en las pruebas cognitivas y el concepto descrito en la presente memoria mejora la glucorregulacion lo que sugiere beneficios auxiliares en la demencia. Ademas el concepto protegido descrito en la presente memoria estimula las hormonas de incretina tales como GLP-1. GLP-1 ejerce efectos neuroprotectores y antiapoptosicos, reduce la acumulacion de placa beta-amiloide (Ap), modula la potenciacion y la 15 plasticidad sinaptica a largo plazo y promueve la diferenciacion de celulas progenitoras neuronales, con lo que previene la demencia y la enfermedad de Alzheimer. Efectos neuroprotectores de GLP-1: posibles tratamientos para deficits cognitivos en individuos con trastornos del estado de animo. Ademas la estimulacion de GLP-2 observada con el concepto protegido protege frente a la enfermedad inflamatoria intestinal, y se sabe que el GLP-2 exogeno puede proteger la mucosa de mucositis inducida por quimioterapia en ratas.

20

La invencion se refiere tambien al producto identificado, tal como un producto alimentario o ingrediente alimentario y al uso de ese producto para mejorar el metabolismo de la glucosa, reducir la inflamacion metabolica y facilitar la regulacion del apetito asf como reducir los factores de riesgo en el sfndrome metabolico. Esto podrfa ser util en la prevencion y regulacion de trastornos relacionados con el SMet, tales como obesidad, intolerancia a la glucosa, 25 diabetes o enfermedades cardiovasculares asf como en sujetos que sufren deterioro del funcionamiento cognitivo relacionado con SMet. El probiotico de la presente invencion puede usarse tambien en formulaciones de enema o supositorios con o sin sustratos prebioticos.

La invencion se refiere tambien al uso del producto tal como se define anteriormente para reducir los factores de 30 riesgo en el sfndrome metabolico, mejorar el metabolismo de la glucosa, facilitar la regulacion del peso y reducir el riesgo de declive cognitivo relacionado con el SMet.

Finalmente, la invencion se refiere al uso de succinato o una cepa bacteriana que produce succinato para mejorar el metabolismo de la glucosa, facilitar la regulacion del peso y reducir los factores de riesgo en el sfndrome metabolico. 35

El producto puede usarse en seres humanos, caballos, asf como en perros y gatos.

Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar, pero no limitar, la invencion en cualquier modo, manera o forma, ya sea de forma explfcita o implfcita.

40

EJEMPLOS Ejemplo 1

45 LOS HIDRATOS DE CARBONO PREBIOTICOS EN PRODUCTOS A BASE DE GRANO DE CEBADA AFECTAN DE FORMA BENEFICIOSA A LOS MARCADORES DE RIESGO METABOLICO, LAS HORMONAS REGULADORAS DEL APETITO Y LA SACIEDAD PERCIBIDA EN SUJETOS SANOS

INTENCION DEL ESTUDIO Y RESUMEN DEL DISENO DEL ESTUDIO 50

El objetivo del estudio era evaluar los efectos de hidratos de carbono, FD y AR indigeribles intrfnsecos presentes en productos a base de grano de cebada sobre marcadores de riesgo relacionados con el SMet. A 39 sujetos sanos de mediana edad, de 64,5 ± 5,6 anos, con indices de masa corporal normales (media ± DT=23,6 ± 2,3 kg/m2) se les proporciono un pan de grano de cebada o un pan de trigo (PT, producto de referencia) durante tres dfas 55 consecutivos en un diseno cruzado. Al dfa siguiente (dfa cuatro) se sirvio un desayuno estandarizado y se determinaron marcadores de prueba fisiologicos en ayunas y repetidamente en el periodo posprandial (0-180 min). El estudio se dividio en tres sub-estudios (ESTUDIOS A-C). Los marcadores de prueba fisiologicos en el ESTUDIO A incluyeron determinaciones de glucosa en sangre, insulina serica, expulsion de hidrogeno (H2) exhalado (marcador de fermentacion en el colon) y registro de sensaciones subjetivas de apetito. Se recogio sangre venosa 60 repetidamente para evaluaciones posteriores en un subgrupo de la cohorte (vease mas adelante). Ademas, se

recogieron muestras fecales antes de iniciar el estudio y despues de cada periodo de intervencion para caracterizacion de la microbiota del aparato digestivo (ESTUDIO A).

A partir de la cohorte descrita anteriormente, se determinaron marcadores de prueba fisiologicos adicionales de 20 5 sujetos, escogidos aleatoriamente (64,1 ± 5,9 anos, 23,5 ± 2,2 kg/m2) (ESTUDIO B). Ademas de la glucosa en la sangre, insulina serica y el H2 exhalado, se midieron tambien las hormonas reguladoras del apetito (PYY, GLP-1) y los acidos grasos de cadena corta (SCFA) en plasma.

En el ESTUDIO C, se eligio a 20 sujetos de la cohorte del ESTUDIO A basandose en el grado de mejoras en la 10 regulacion de la glucosa en un desayuno estandarizado en una perspectiva de toda la noche despues de la ingestion de un producto a base de grano de cebada (PC) la noche anterior. Se incluyo a los 10 sujetos con efectos mas pronunciados y a los 10 sujetos con efectos menos pronunciados de PC en la regulacion de la glucosa. El ESTUDIO C se comunica mas adelante por separado.

15 MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

SUJETOS DEL ENSAYO

Los criterios de inclusion fueron edad entre 50-70 anos, IMC normal o con ligero sobrepeso (IMC 18-28 kg/m2), valor 20 plasmatico de glucosa en ayunas <6,1 mmol/L, no fumador, buena salud general y ausencia de trastornos metabolicos o alergias alimentarias conocidos. Se aceptaron medicaciones antihipertensivas y analgesicos sin receta sin accion antiinflamatoria. Los estudios fueron aprobados por el Comite Regional de Revision Etica de Lund, Suecia (Referencia 2010/457).

25 ESTUDIO A: En el estudio participaron voluntarios sanos, 6 hombres y 33 mujeres de 64,5 ± 5,6 anos de edad, y con indices de masa corporal normales (media ± DT=23,6 ± 2,3 kg/m2).

ESTUDIO B: Se eligieron aleatoriamente 20 voluntarios sanos, 3 hombres y 17 mujeres, de 64,1 ± 5,9 anos de edad y con indices de masa corporal normales (media ± DT 23,5 ± 2,2 kg/m2), a partir de la cohorte del ESTUDIO A.

30

COMIDAS DE PRUEBA

35

40

Las comidas de prueba fueron pan de grano de cebada (PC) y pan de trigo (PT; comida de referencia). Cada producto de prueba se consumio durante tres dfas consecutivos, separados por dos semanas. Se calculo la cantidad de los productos de prueba y de referencia, respectivamente, para proporcionar 100 g de almidon disponible potencialmente al dfa, y se analizo de acuerdo con Holm y col. [2] (Tabla 1). Durante los dos primeros dfas la ingesta diaria se dividio en tres tamanos iguales de raciones para su consumo a aproximadamente 0800, 1400 y 2100. En el tercer dfa, la mitad de la ingesta diaria (50 g de almidon disponible) se dividieron por igual entre las comidas de las 0800 y las 1400, y la otra mitad se consumio a las 2100.

Tabla 1. Composicion del pan de grano de cebada (PC) y la referencia del pan de trigo (PT) en los ESTUDIOS A-C

Productos

Almidon total AR Almidon disponible1 FD insoluble FD soluble FD total2 AR+FD

% de materia seca

PT

77,4 1,92 75,5 3,55 1,38 4,93 6,85

PC

74,3 10,8 63,5 8,83 4,21 13,04 23,84

g/dfa

PT

103 2,54 100 4,71 1,83 6,54 9,08

PC

117 17,0 100 13,97 6,64 20,61 37,61

1 Calculado por diferencia; Almidon total menos AR (3-5).

2 La FD mencionada en la presente solicitud no incluye almidon indigerible o ffsicamente inaccesible, es decir, AR.

45 DESAYUNO ESTANDARIZADO

Se consumio un desayuno estandarizado despues de 3 dfas de intervencion con PC o PT, respectivamente, y consistio en 122,9 g de PT correspondiente a 50 g de hidratos de carbono disponibles, y 2,5 dl de agua del grifo.

50 RECETAS Y PREPARACION DE PRODUCTOS DE PRUEBA.

Pan de trigo (PT, comida de referencia y desayuno estandarizado); Se horneo un PT de acuerdo con un

procedimiento estandarizado en una maquina de horno casera (modelo de pan casero Tefal n° 573102; eleccion del Menu, programa 2 [pan blanco, 1 000 g, rapido (tiempo 2:32)]). El pan se preparo a partir de 540 g de harina de trigo blanca (Kungsornen Ab, Jarna, Suecia), 360 g de agua, 4,8 de levadura seca, 4,8 g NaCl (sin yodo). Despues de enfriar, se corto el pan en rebanadas y se envolvio en papel de aluminio en tamanos de porciones, se introdujo en 5 bolsas de plastico y se guardo en un congelador (-20 °C). El dfa antes del consumo se indico a las personas de la prueba que descongelaran el pan a temperatura ambiente, todavfa envuelto en papel de aluminio y en la bolsa de plastico.

Pan de grano de cebada (PC); Se hirvio un total de 595 g granos de cebada en 520 g de durante para 12 min y, a 10 continuacion, se enfrio durante 30 min a temperatura ambiente. Durante la coccion se absorbio toda el agua en los granos. A los granos se le anadieron 105 g de harina de trigo, 6 de levadura seca, 5 g de sal y 300 g de agua. Se amaso la masa durante 4 min (Electrolux AKM 3000, N23 N25) y se fermento durante 30 min en un cuenco, seguido por otra fermentacion (35 min) en un molde para horno. El molde para horno se cubrio con papel de aluminio y se horneo en un horno casero a 225 °C retirando un recipiente con agua para elevar al maximo el vapor presente, 15 hasta que la temperatura interna del pan alcanzo 96 °C. Despues de hornear se enfrio el pan sin el molde para horno en panos humedos a temperatura ambiente. Despues de enfriar se puso el pan en una bolsa de plastico y se dejo a temperatura ambiente durante la noche. El dfa despues de trocear los panes y envolverlos en papel de aluminio en tamanos de porcion, se introdujeron en bolsas de plastico y se guardaron en un congelador (-20 °C).

20 anAlisis DE ALMIDON TOTAL, AR Y FD EN LOS PRODUCTOS DE PRUEBA

Los productos de prueba se analizaron con respecto a almidon total [3], AR [4] y FD [5]. Antes del analisis de almidon total y FD, se secaron los panes al aire y se trituraron. Se analizo el AR en los productos de prueba en los productos cuando se comieron. Se calculo el almidon disponible restando AR del almidon total (Tabla 1).

25

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

El estudio fue un estudio cruzado aleatorizado (orden de los productos de prueba), lo que significa que cada sujeto participo en dos intervenciones de tres dfas, consumiendo PC o PT, respectivamente, separado por 30 aproximadamente 2 semanas. Se animo a los sujetos a estandarizar su dieta habitual y sus pautas de comidas y a no consumir alcohol, no hacer ejercicio ffsico excesivo ni comer alimentos ricos en FD durante los dfas de consumo de la prueba o los productos de referencia. Ademas, no debfan haber consumido antibioticos ni probioticos durante las 2 semanas anteriores ni durante el estudio. Despues de la ultima cena de la prueba con pan de grano de cebada o PT, respectivamente, se hizo ayunar a los sujetos hasta que se sirvio un desayuno estandarizado a la manana 35 siguiente. Los sujetos llegaron al departamento experimental a las 0730, y se les introdujo una canula intravenosa (BD Venflon, Becton Dickinson) en una vena antecubital para su uso para extraer sangre. Se recogieron las muestras de sangre en ayunas, y se registro la saciedad y el H2 exhalado antes de consumir el desayuno. El desayuno se consumio a las ~0800 y en 13 min. Ademas, se obtuvieron medidas del apetito antes y despues del desayuno usando una escala analogica visual (VAS) de 100 mm. Durante 2,5 h de extracciones de sangre 40 repetidas, se dijo a los sujetos que mantuvieran un grado constante y bajo de actividad ffsica.

MUESTREO Y ANALISIS DE VARIABLES FISIOLOGICAS E HIDROGENO EXHALADO EN EL AIRE EXPULSADO.

Se tomaron muestras de sangre capilar con pinchazo en el dedo para determinar la glucosa en sangre 45 (HemoCue®B-glucose, HemoCue AB, Angelholm, Suecia). Se recogieron muestras de sangre venosa para determinar los marcadores de prueba fisiologicos en suero (s) (s-insulina) y plasma (p) (p-SCFA, p-GLP-1 y p-PYY). Se separaron el suero y el plasma por centrifugado y se guardaron inmediatamente en un congelador (-40 °C) hasta su analisis. Los tubos para recogida de sangre para analisis de GLP-1 en plasma y PYY se prepararon con un coctel de inhibicion que consistfa en DPPIV (10 pl/ml de sangre) (Millipore, St Charles, Ee.UU.) y Trasylol® 10 000 KIE/ml 50 de aprotinina (50 pl/ml de sangre) (Bayer HealthCare AG, Leverkusen, Alemania) antes de la extraccion de sangre. Los tubos que contenfan el coctel de inhibicion se mantuvieron en hielo hasta su uso, aunque con un maximo de 6 dfas. Se usaron kits comerciales basados en ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas para determinar la S- insulina (Mercodia, Uppsala, Suecia), PYY (3-36 y 1-36) y GLP-1 (7-36 activo) (Alpco Diagnostics, Salem, EE.UU.). Se determinaron los SCFA (acetato, propionato, butirato) usando un procedimiento GC [6]. Se midio el hidrogeno 55 (H2) exhalado en el aire expulsado como un indicador de fermentacion en la actividad del colon usando un Gastro+ (Bedfont EC60 Gastrolyzer, Rochester, Inglaterra). Se recogieron muestras fecales antes de la intervencion en la dieta y en el dfa cuatro, es decir, despues de tres dfas de consumo de producto de prueba y de referencia, respectivamente. Se indico a los sujetos que recogieran las heces de la primera defecacion que se produjo en el dfa cuatro e inmediatamente se congelo la muestra y de envfo al departamento experimental en un plazo de 24 h para 60 un almacenamiento continuado a -80 °C hasta su analisis. En la Tabla 2 se presenta un cronograma para la

determinacion de los parametros fisiologicos.

Tabla 2. Cronograma para la determinacion de los marcadores de prueba.

Tiempo (minutos despues del inicio del desayuno)

0 15 30 45 60 90 120 150

P-PYY

x x x

SCFA

x x x

P-GLP2

x x x x x

H2

x x x x x x x x

Glucosa

x x x x x x x x

P-GLP1

x x x x x x

S-insulina

x x x x x x x

Sensaciones de apetito

x x x x x x x x

5 CALCULOS Y PROCEDIMIENTOS ESTADISTICOS.

Se uso GraphPad Prism (version 5, GraphPad Software, San Diego, Calif., EE.UU.) para representacion grafica. Se calcularon las areas bajo la curva incrementales de glucosa en sangre e insulina serica (iAUC, (concentraciones en funcion del tiempo) para cada sujeto y comida de prueba, usando el modelo trapezoidal. Se determinaron las 10 concentraciones pico incrementales (iPico) para glucosa e insulina como el maximo aumento posprandial individual desde el valor basal. Las diferencias significativas en las variables de prueba despues de las diferentes comidas de prueba se evaluaron con ANOVA (modelo lineal general), en MINITAB Statistical Software (version 16; Minitab, Minitab Inc, State College, PA). En los casos de residuos con distribucion no uniforme (probados con Anderson- Darling y considerados distribuidos de manera no uniforme cuando P<0,05), se realizo transformacion de Box Cox 15 en los datos antes de ANOVA. Las correlaciones entre parametros se realizaron usando correlacion de Pearson en MINITAB Statistical Software (version 14; Minitab, Minitab Inc, State College, PA). Los valores de P<0,05 se consideraron significativos. Los datos se expresan como media ± EEM, valores que se consideran significativos a P<0,05. Ejemplo 1: ESTUDIO A: n=39, ESTUDIO B: n=20, ESTUDIO C: n=20.

20 RESULTADOS

ESTUDIO A (N=39)

GLUCOSA EN SANGRE E INSULINA SERICA 25

Tres dfas de consumo de PC mejoraron significativamente la respuesta de glucosa en sangre al desayuno estandarizado en terminos de concentraciones pico posprandiales (iPico, P<0,01) e iAUC 0-150 min (P<0,01) en comparacion con el PT de referencia (Tabla 3). Ademas, el PC produjo una iAUC de insulina significativamente reducida (0-150 min, P<0,001) y iPico de insulina (P<0,001, Figura 1, Tabla 3).

30

Tabla 3. Respuestas de glucosa en sangre e insulina serica al desayuno estandarizado despues de 3 dfas de ________consumo de pan de grano de cebada (PC) o pan de trigo (PT), respectivamente.________

Glucosa (n = 39) Insulina (n = 39)

iPico iAUC 0-150 min iPico iAUC 0-150 min

mmol/L mmol min/L nmol/L nmol • min/L

PT

3,45 ± 0,14 215 ± 13,6 0,266 ± 0,019 16,2 ± 1,28

PC

2,99 ± 0,14** 181 ± 11,7** 0,230 ± 0,020*** 13,7 ± 1,13***

% cambio

-13,4 -15,8 -13,6 -15,5

*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (diferencias entre PT y PC). 35 EXPULSION DE H2 EXHALADO

El consumo del PC redujo significativamente el H2 exhalado en comparacion con el PT de referencia, un indicio de aumento de la actividad de fermentacion en el aparato digestivo despues del PC (P<0,001, Tabla 4).

40 Tabla 4. Expulsion de H2 exhalado y sensaciones de apetito en ayunas y despues del desayuno estandarizado,

H2 Saciedad Hambre

Valor en ayunas Media 0-150 min Valor en ayunas Valor en ayunas

N = 38 N = 39 N = 39 N = 39

Ppm mm

PT

11,39 ± 2,23 7,54 ± 1,04 31,44 ± 4,33 53,77 ± 3,51

PC

26,32 ± 3,42*** 33,17 ± 4,26*** 39,74 ± 4,26* 43,67 ± 4,52*

% cambio

131 339,92 26,4 -18,78

*P < 0,05, ***P < 0,001 (diferencias entre PT y PC)

SENSACIONES DE APETITO

5 Tres dfas de consumo de PC produjeron un aumento de la saciedad y una reduccion hambre en ayunas al dfa siguiente, en comparacion con tres dfas de consumo de PT (P<0,05, Tabla 4).

ESTUDIO A: RESUMEN Y CONCLUSIONES: La ingesta de un producto a base de grano de cebada produjo una mejora en la regulacion de la glucosa posprandial 11-14 horas despues de la ingestion de la ultima porcion. Ademas, 10 el producto a base de grano de cebada aumento la saciedad y redujo la sensacion de hambre en la misma perspectiva de tiempo. En paralelo, la expulsion de hidrogeno exhalado aumento, como un indicio de un aumento en la fermentacion en la actividad del colon. Los resultados sugieren que los efectos beneficiosos obtenidos despues del producto a base de grano de cebada estan mediados por el aumento de la fermentacion en el aparato digestivo, y la activacion de la microbiota especffica, de la FD y el AR intrfnsecos, presentes en productos a base de grano de 15 cebada.

ESTUDIO B (marcadores de prueba adicionales en n=20, elegidos aleatoriamente a partir de la cohorte del ESTUDIO A)

20 RESPUESTA DE GLUCOSA EN SANGRE E INSULINA SERICA

Tres dfas de consumo de PC influyeron beneficiosamente en la respuesta de glucosa en sangre en el siguiente desayuno estandarizado en terminos de menores iPico (P<0,05) y iAUC 0-150 min (P<0,05), en comparacion con tres dfas de consumo de PT. Ademas, la iAUC de s-insulina (0-150 min) y el iPico de insulina se redujeron 25 significativamente (P<0,01 y P<0,05, respectivamente) (Figura 2).

MARCADORES DE FERMENTACION EN EL APARATO DIGESTIVO: H2 EXHALADO Y SCFA

Tres dfas de consumo de PC produjeron un aumento significativo de H2 exhalado en comparacion con el PT de la 30 comida de referencia (P<0,01, Figura 3, Tabla 5). Ademas, la ingesta de PC incremento significativamente las concentraciones de s-acetato y la concentracion de total SCFA (P<0,05, Tabla 5). Se observo un aumento no significativo del s-butirato circulante despues de PC en comparacion con despues de PT (PC 16,1 ± 0,7; PT 14,2 ± 0,9; P=0,11). Los resultados indican un aumento de la actividad de fermentacion en el aparato digestivo despues del PC.

35

Tabla 5. Concentraciones de SCFA en plasma en ayunas, despues de 3 dfas de consumo de pan de grano de ________________________cebada (PC) o pan de trigo (PT), respectivamente._______________________

Acetato Propionato Butirato SCFA total

Valor en ayunas Valor en ayunas Valor en ayunas Valor en ayunas

N = 19 N = 19 N = 18 N = 19

pmoi/L pmoi/L pmoi/L pmoi/L

PT

145,3 ± 11,5 9,84 ± 0,902 14,23 ± 0,864 170,2 ± 12,6

PC

171,5 ± 10,2* 10,45 ± 0,793 16,01 ± 0,7061 197,8 ± 10,3*

% cambio

18 6 13 16

*P < 0,05, 1P = 0,11

40 HORMONAS RELACIONADAS CON EL APARATO DIGESTIVO GLP-1

GLP-1: es una hormona que es producida por las celulas L en el aparato digestivo y que aumenta la secrecion de 45 insulina desde el pancreas y aumenta la sensibilidad a la insulina en las celulas alfa y las celulas beta de una forma dependiente de la glucosa. GLP-1 tambien aumenta la masa de celulas beta, inhibe la secrecion de acido y el vaciado gastrico en el estomago y disminuye la ingesta de alimento al aumentar la saciedad en el encefalo.

El consumo de comidas de prueba de PC produjo un aumento significativo de las concentraciones de p-GLP-1 en ayunas en el dfa cuatro despues de PC (1,6 ± 0,5 pmol/L) en comparacion con despues de PT (1,0 ± 0,4 pmol/L) (P<0,01).

5 GLP-2

Las concentraciones de p-GLP-2 aumentaron significativamente durante el dfa del experimento despues de tres d^as de consumo de PC (media 0-150 min: 3,5 ± 0,5 ng/ml) en comparacion con despues de PT (media 0-150 min: 3,1 ± 0,4 ng/ml, P<0,05).

10

PYY

PYY: tambien es producida por celulas L e inhibe la motilidad gastrica y se ha demostrado que reduce el apetito.

15 Se observo un efecto principal significativo de las comidas de prueba que revelo un aumento en las concentraciones plasmaticas de PYY (0-120 min) despues de tres dfas de consumo de PC, en comparacion con tres dfas de ingesta de PT (P<0,05, Figura 4).

RELACIONES ENTRE HORMONAS RELACIONADAS CON EL APARATO DIGESTIVO Y SCFA

20

Despues de tres dfas de consumo de PT o PC, las concentraciones plasmaticas de PYY mantuvieron una correlacion con las concentraciones plasmaticas de SCFA total (r=0,51, P<0,05 y r=0,57, P=0,01) respectivamente.

ESTUDIO B: RESUMEN Y CONCLUSIONES: Las investigaciones extendidas muestran que, ademas de los 25 resultados presentados en el ESTUDIO A, el producto a base de grano de cebada aumento las concentraciones plasmaticas de las hormonas digestivas importantes para la regulacion del apetito de la glucosa en una perspectiva temporal de 11-14 horas despues del consumo. Se determino un aumento de la actividad de fermentacion en el aparato digestivo con aumento de la expulsion de hidrogeno exhalado y aumento de las concentraciones plasmaticas de SCFA. Ademas, el producto de grano de cebada aumento las concentraciones plasmaticas de GLP- 30 2, una hormona digestiva importante para las funciones de barrera del aparato digestivo al reducir la permeabilidad de la pared intestinal, por ejemplo, a las endotoxinas.

El estudio indica que la fermentacion en el aparato digestivo de hidratos de carbono indigeribles intrmsecos presentes en productos a base de grano de cebada puede constituir un mecanismo para un enfoque prometedor 35 dirigido a prevenir y/o tratar la obesidad y los trastornos metabolicos asociados

ESTUDIO C (n=20, elegido entre la cohorte del estudio A basandose en el grado de mejoras en la regulacion de la glucosa individual en el desayuno estandarizado.

40 A partir de la cohorte del ESTUDIO A (n=39, Ejemplo 1), se incluyo a 20 sujetos (18 mujeres y 2 hombres), de edad (media ± DT) 64,9 ± 5,1 anos y con indices de masa corporal (media ± DT) de 23,2 ± 2,4 kg/m2, en investigaciones adicionales. Se eligio a los sujetos en relacion con la eficiencia del producto de grano de cebada para mejorar la regulacion de la glucosa individual, en comparacion con el PT. Se incluyo a los 10 sujetos (8 mujeres y 2 hombres, 64,0 ± 4,6 anos, IMC 23,9 ± 2,7 kg/m2) del ESTUDIO A con efectos mas pronunciados de PC con respecto a los 45 beneficios en la regulacion de la glucosa y se denotaron como “respondedores”, y se incluyo a los 10 sujetos (10 mujeres, 65,7 ± 5,3 anos, IMC 22,5 ± 1,7 kg/m2) con mejoras mmimas en la regulacion de la glucosa de PC y se denotaron como “no respondedores”. A continuacion, se describen los criterios usados para definir a los respondedores y los no respondedores. En el grupo de respondedores, tres dfas de consumo de PC produjeron una tolerancia a la glucosa significativamente mejorada (iAUC 0-150 min: 156 ± 20 y 251 ± 26 mmol*min/L despues de 50 PC y PT, respectivamente, P<0,0001, Figura 5) y una respuesta a la insulina reducida despues del desayuno estandarizado (iAUC 0-120 min: 10,3 ± 1,5 y 15,3 ± 2,1 nmol*min/L despues de PC y PT, respectivamente P<0,01, Figura 6). En cambio, no se observaron mejoras significativas en la tolerancia a la glucosa (iAUC 0-150 min: 173 ± 23 y 191 ± 24 mmol*min/L despues de PC y PT, respectivamente, P=0,11) o en las respuestas de insulina (iAUC 0120 min: 15,8 ± 1,8 y 16,3 ± 1,5 nmol*min/L despues de PC y PT, respectivamente, P=0,51) en el grupo de no 55 respondedores.

Las muestras fecales recogidas antes del estudio, y despues de consumir PC y PT, respectivamente, se caracterizaron con respecto a la microbiota del aparato digestivo (veanse los Ejemplos 2).

60 DEFINICION DE “RESPONDEDORES” Y “NO RESPONDEDORES”

Los respondedores se definieron como los 10 sujetos de la cohorte del ESTUDIO A (n=39) que consiguieron el efecto beneficioso mas pronunciado del producto de grano de cebada en la regulacion de la glucosa. En los respondedores el producto de grano de cebada produjo una disminucion del area incremental de la glucosa en 5 sangre (iAUC, 0-90 min) despues del desayuno estandarizado en el 25 % como mfnimo (entre -25-(-67)%, media=-39 %), una reduccion en la AUC total en el mismo periodo de tiempo y una disminucion de la iAUC de la insulina despues del desayuno estandarizado en al menos el 15 % (-15-(-69)%, media=-33 %). Varios de los 29 sujetos restantes tenfan una menor respuesta a la glucosa o una menor respuesta a la insulina. Sin embargo, los 10 sujetos con las menores mejoras en las respuestas a la glucosa y/o la insulina se denotaron como “no respondedor”. 10 En el grupo de no respondedores (n=10), cuatro sujetos consiguieron no reducir las respuestas a la glucosa y la insulina despues de cebada, tres sujetos tuvieron respuestas a la glucosa ligeramente reducidas, pero sin mejoras en las respuestas a la insulina, y tres sujetos consiguieron una respuesta a la insulina ligeramente reducida despues de PC, pero sin mejoras en las respuestas a la glucosa.

15 ESTUDIO C: RESUMEN Y CONCLUSIONES: Los resultados muestran diferencias individuales relativas a la eficiencia beneficiosa de los granos de cebada en la regulacion de la glucosa en una perspectiva de 11-14 horas. Se ha sugerido que la razon de las discrepancias individuales esta relacionada con diferencias en la composicion de la microflora del aparato digestivo.

20 Se llevo a cabo UN SEGUIMIENTO AL ESTUDIO C. El objetivo era confirmar los resultados obtenidos previamente en la regulacion de la glucosa y de la microflora del aparato digestivo despues del consumo del PC con respecto al PT. El diseno del estudio fue similar al diseno descrito anteriormente. Se pregunto a todos los sujetos del estudio C (10 respondedores y 10 no respondedores) si estaban dispuestos a repetir el estudio. Siete respondedores (6 mujeres y 1 hombre, 65,6 ± 4,3 anos, imc 23,5 ± 3,2 kg/m2) y siete no respondedores (7 mujeres, 64,7 ± 6,1 anos, 25 imc 21,7 ± 1,2 kg/m2) aceptaron los resultados.

Los resultados del estudio de seguimiento fueron coherentes con los resultados obtenidos previamente. Por tanto, en el grupo de respondedores (n=7), el PC mejoro significativamente la tolerancia a la glucosa para el desayuno estandarizado (iAUC 0-150 min: 239 ± 32 y 295 ± 28 mmol*min/L despues de PC y PT, respectivamente, P<0,0001, 30 Figura 7), mientras que no se observaron mejoras del PC en la tolerancia a la glucosa en el grupo de no respondedores (iAUC 0-150 min: 277 ± 20 y 287 ± 36 mmol*min/L despues de PC y PT, respectivamente, P=0,81).

RESUMEN Y CONCLUSIONES, ESTUDIO DE SEGUIMIENTO: Los resultados obtenidos en el estudio de seguimiento verifican asf los resultados obtenidos en los estudios previos descritos anteriormente (estudios A-C) en 35 relacion con los efectos beneficiosos en la regulacion de la glucosa de FD y AR en PC, e indican un componente individual de la respuesta metabolica.

Ejemplo 2

40 CARACTERIZACION DE LA MICROBIOTA DEL APARATO DIGESTIVO HUMANO DESPUES DE INGESTION DE PRODUCTOS DE PT O PC EN SERES HUMANOS; Y EXPERIMENTOS DE INOCULACION EN RATONES PARA VALIDACION DE RELACIONES CAUSALES

EXTRACCION DE ADN FECAL, AMPLIFICACION, PIROSECUENCIACION Y ANALISIS DE DATOS.

45

Se aislo ADN genomico a partir de 100-150 mg de heces por individuo usando el procedimiento de batido de microesferas repetido (RBB) descrito anteriormente por Salonen y col. [7]. El ADN fecal se cuantifico usando un espectrofotometro NanoDrop ND-1000 (Nano-Drop Technologies) y la calidad del ADN genomico se valoro mediante electroforesis en gel usando gel de agarosa-GelRed al 1 %. Se diluyo una parte alfcuota del ADN genomico a 10 ng 50 en 1 pl antes de su uso para PCR.

La amplificacion de la region variable V1-V2 del gen 16 ARNr se realizo usando los cebadores 27F y 338R fusionados con adaptadores de secuenciacion 454 Titanium para valorar la diversidad de la microbiota fecal. Los cebadores 338R contenfan codigos de barras de 12 bases de correccion de errores unicos que permiten analizar 55 multiples muestras en una sola tanda de secuenciacion. Cada muestra se amplifico por triplicado en un volumen de reaccion de 25 pL que contenfa 1,5 U de FastStart Taq ADN Polimerasa (Roche), 0,2 pM de cada cebador y 1 pl (~10 ng) del aDn genomico extrafdo. La PCR se realizo en las siguientes condiciones: desnaturalizacion inicial durante 3 min a 95 °C, seguido por 25 ciclos de desnaturalizacion durante 20 s a 95 °C, hibridacion durante 30 s a 52 °C y elongacion durante 60 s a 72 °C, y una etapa de elongacion final durante 10 min a 72 °C. Despues de la 60 PCR se combinaron los triplicados y se verifico el producto resultante en cuanto a tamano y pureza en gel de

agarosa-GelRed al 0,8 %. A continuacion se purificaron las muestras con el kit NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel, Alemania) y se cuantifico usando el kit Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se diluyeron los productos de PCR purificados a una concentracion de 20 ng en 1 pl y se guardaron en reserva en cantidades iguales. A continuacion se purificaron las muestras en reserva con las microesferas de purificacion 5 magnetica Ampure (Agencourt, Danvers, MA) para eliminar los fragmentos de amplificacion mas cortos. Los productos en reserva se secuenciaron usando la qufmica de titanio 454 GS FLX en la National Genomics Infrastructure (Estocolmo).

Se procedio a filtrado de calidad de los datos en bruto para eliminar las secuencias que tuvieran menos de 200 10 nucleotidos, mas de 1000 nucleotidos, que contuvieran errores de correspondencia, bases ambiguas, codigos de barra incorregibles o tandas de homopolfmeros de mas de seis bases. Las lecturas con filtro de calidad se recortaron a partir de sus adaptadores 454 y secuencias de codigos de barras y se analizaron con el paquete de software Quantitative Insights In Microbial Ecology (QIIME) (version 1.5.0). El numero de lecturas que valoraron el filtro de calidad sumaron 755.963 (media 125.99 secuencias/muestra). Se elimino el ruido de los datos de 15 secuenciacion con una envoltura denoise_wrapper.py disponible en QIIME.

Se asignaron las secuencias a unidades taxonomicas operativas (OTU) usando UCLUST con un umbral del 97 % de identidad de pares. Se tomo la secuencia mas abundante como representativa para cada OTU y se asigno taxonomicamente usando el clasificador Ribosomal Database Project (RDP). Las OTU representativas se alinearon 20 usando Pynast y se usaron para construir un arbol filogenetico con FastTree, que se uso para estimar la diversidad de muestras p (UniFrac ponderado).

EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE ACIDOS GRASOS DE CADENA CORTA.

25 Se transfirieron 120-190 mg de heces congeladas a un tubo de vidrio (16*125 mm) provisto de una tapa roscada y se anadieron 100 pl de solucion de reserva de patron interno ([1-13C]acetato y [2H6]propionato en concentracion 1 M, [13C4]butirato en concentracion 0,5 M, [1-13C1]isobutirato y [1-13C]isovalerato en concentracion 0,1 M, [1,2- 13C2]hexanoato, [13C]lactato y [13C4]acido succfnico cada uno en concentracion 40 mM). Antes de la extraccion se liofilizaron las muestras a -50 °C durante 3 h (rendimiento 28-78 mg/peso en seco). Despues de la acidificacion con 30 50 pl de HCl al 37 %, se extrajeron los acidos organicos (2 ml de eter dietflico/extraccion; 2 ciclos). Se mezclo una parte alfcuota de 500 pl de la muestra extrafda junto con 50 pl de N-terc-butildimetilsilil-N-metiltrifluoracetamida (MTBSTFA; Sigma) a temperatura ambiente. Se inyecto una parte alfcuota (1 pl) del material derivatizado resultante en un cromatografo de gases (Agilent Technologies 7890 A) acoplado a un detector de espectrometro de masas (Agilent Technologies 5975 C). Se uso un gradiente de temperatura lineal. La temperatura inicial de 65 °C se 35 mantuvo durante 6 min, se aumento a 260 °C (15 °C/min) y despues a 280 °C durante 5 min. Las temperaturas del inyector y de la via de transferencia fueron de 250 °C. La cuantificacion se completo en modo de adquisicion de monitorizacion ionica seleccionada por comparacion con patrones internos etiquetados (se comparo valerato con [1- 13C]isovalerato, heptanoato y octanoato se compararon con [1,2-13C2]hexanoato y fumarato se comparo con [13C4]acido succfnico). Las proporciones m/z de iones monitorizados fueron las siguientes: 117 (acido acetico), 131 40 (acido propionico), 145 (acido butfrico), 146 (acido isovalerico), 159 (acido isovalerico y acido valerico, 173 (acido hexanoico), 187 (acido heptanoico), 201 (acido octanoico)), 261 (acido lactico), 287 (acido fumarico), 289 (acido succfnico), 121 ([2H2]- y [1-13C]acetato), 136 ([2Hs]propionato), 146 ([1-13C1]isobutirato), 149 ([13C4]butirato), 160 ([1- 13C]isovalerato), 175 ([1,2-13C2]hexanoato), 264 ([13C]lactato) y 293 ([13C4]acido succfnico).

45 RESULTADOS RELATIVOS AL PATRON MICROBIANO FECAL EN LOS SERES HUMANOS

La pirosecuenciacion de los amplicones de codigo de barras de genes de ARN 16S produjo 755 963 secuencias de alta calidad, con una media de 12 599 secuencias (intervalo 7018-21116) por muestra con una cantidad similar de secuencias generadas en respondedores (R) y no respondedores (NR) despues de cada tratamiento. Firmicutes 50 (~70 %) fue el filo mas abundante en cada grupo de estudio seguido por Bacteroidetes (~20 %). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la abundancia relativa de Firmicutes y Bacteroidetes entre respondedores o no respondedores o por cualquier tratamiento. Sin embargo, se observo un aumento no significativo en la abundancia de Bacteroidtetes en el grupo de respondedores con dieta con suplemento de pan de grano de cebada (Figura 8A).

55

El filo Bacteroidetes esta compuesto por Prevotella y Bacteroides y de forma interesante los autores de la invencion encontraron una abundancia relativa significativamente mayor en los grupos de respondedores de Prevotella (Figura 8B, ANOVA de dos vfas, P<0,01). Ademas, los niveles de Prevotella aumentaron despues del consumo del pan de grano de cebada en el grupo de respondedores, que no se observo en el de no respondedores.

Por otra parte, se midio un aumento significativo en los niveles fecales de succinato en el grupo de respondedores en dieta con suplemento de pan de grano de cebada (Tabla 6). Se sabe que el succinato es el principal metabolito de las actividades de fermentacion de las especies Prevotella.

5 __________________________Tabla 6. Concentracion fecal de acidos organicos.__________________________

Metabolito pmol/g de peso en seco

Respondedores de control Respondedores PT Respondedores PC No respondedores de control No respondedores PT No respondedores PC

Acetato

92,82 93,47 77,58 90,95 100,92 79,51

Propionato

40,08 36,88 35,12 29,02 37,47 27,57

Butirato

38,02 32,41 30,07 28,27 33,49 23,81

Lactato

3,54 12,86 5,37 4,73 4,89 8,30

Succinato

4,32 2,86 9,32 1,66 1,33 2,43

EXPERIMENTOS DE INOCULACION EN RATONES

A ratones macho Swiss Webster sin germenes de 10 a 12 semanas se les inoculo con alimentacion forzada unica de 10 108 CFU de Bacteroidetes thetaiotaomicron cepa VPI-5482 (cultivo durante toda la noche en medio YCFA) o Prevotella copri cepa DSM18205 (cultivo durante toda la noche en medio PYG) en aislamiento o juntos. Las dos cepas se habfan aislado de heces humanas. Las dos se cultivaron y se transportaron a las instalaciones con ratones en tubos Hungate de 15 ml. Se alojaron ratones monocolonizados y bicolonizados en sistema iso-cage durante 14 dfas. Antes de sacrificar a los ratones se realizo una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT). Todos los 15 ratones se mantuvieron en ayunas 4 h antes de OGTT. La densidad de colonizacion se verifico usando ensayos qPCR que usaron cebadores especfficos de la especie. A un grupo de control de ratones Swiss Webster machos gnotobioticos de edad comparable tambien se les suministro la misma dieta de pienso en autoclave a voluntad.

Se dejo en ayunas a los ratones durante horas y a continuacion se les suministro alimentacion forzada por via oral 20 de D-glucosa al 60 % (3 g/kg de peso corporal). Se extrajo sangre de la vena caudal a 0, 30, 60, 90 y 120 minutos y se midieron los niveles de glucosa en sangre usando un glucometro HemoCue®. Se recogio sangre adicional de la vena caudal a 0, 15 y 30 minutos para analisis de los niveles de insulina serica usando ensayo ELISA de insulina (Crystal Chem, Inc.).

25 RESULTADOS

Para investigar si Prevotella tiene un impacto en las mejoras en la tolerancia a la glucosa los autores de la invencion monocolonizaron ratones gnotobioticos con cepa de Prevotella derivada de heces humanas, Prevotella copri, y compararon la tolerancia a la glucosa de esos ratones con ratones monocolonizados con B. thetaiotaomicron y 30 bicolonizados con las dos cepas. La colonizacion con B. thetaiotamicron provoco un deterioro de la tolerancia a la glucosa en comparacion con los ratones colonizados P. copri (Figura 9A-B). Ademas, los niveles de insulina serica en los ratones monocolonizados con P. copri fueron menores a 15 y 30 min despues de la alimentacion forzada por via oral de glucosa, en comparacion con los ratones monocolonizados B. thetaiotaomicron (Figura 9C). De forma importante, los ratones colonizados con B. thetaiotaomicron mostraron mejora en la tolerancia a la glucosa cuando 35 fueron cocolonizados con P. copri. Estos datos sugieren que mientras que B. thetaiotaomicron deteriora la tolerancia a la glucosa P. copri puede prevenir este deterioro.

Ejemplo 3

40 EJEMPLOS DE PRODUCTOS

A) Un vaso de precipitados que incluye una racion de yogur, con FD de cebada y/o AR y Prevotella (107 CFU o mas), cerrado hermeticamente en la tapa y separado por una membrana.

45 B) Un frasco que incluye una racion de yogur bebible, con FD de cebada, AR y Prevotella (109 CFU) cerrado hermeticamente en una paja para beber de acompanamiento.

C) Una racion de FD de cebada, AR y Prevotella cerrada hermeticamente en envases monodosis.

50 D) Un frasco que incluye una racion de bebida de frutas, con FD de cebada y/o AR y Prevotella (109 CFU) cerrado hermeticamente en una paja para beber de acompanamiento.

E) Un frasco que incluye una racion de bebida de frutas, con FD de cebada y AR y Prevotella (109 CFU) cerrado hermeticamente en una tapa y separado por una membrana.

F) Un producto alimentario emulsionado que contiene la Prevotella encapsulada en una matriz con o sin el 5 componente de hidratos de carbono de prebiotico.

A-F) Una porcion de FD de cebada y AR y Prevotella (7 g de FD de cebada insoluble, 3,3 g de FD de cebada soluble, 8,5 g de AR y 109 CFU de Prevotella).

10 REFERENCIAS

1. Vidhyalakshmi, R., R. Bhakyaraj, and R. S. Subhasree, Encapsulation “The Future of Probiotics”—A Review. Advances in Biological Research 2009. 3(3-4): p. 96-103.

2. Holm, J., et al., A rapid method for the analysis of starch. Starch/Starke, 1986. 38: p. 224-226.

15 3. Bjorck, I. M. E. and M. A. Siljestrom, In-vivo and in-vitro digestability of starch in autoclaved pea and potatoe products. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1992. 58: p. 541-553.

4. Akerberg, A. K., et al., An in vitro method, based on chewing, to predict resistant starch content in foods allows parallel determination of potentially available starch and dietary fiber. The Journal of Nutrition, 1998. 128(3): p. 65160.

20 5. Asp, N.-G., et al., Rapid enzymatic assay of insoluble and soluble dietary fiber. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1983. 31: p. 476-482.

6. Brighenti, F., Summary of the conclusion of the working group on Profibre interlaboratory study on determination of short chain fatty acids in blood, in Functional properties of non-digestible carbohydrates, F. Gullion, et al., Editors. 1998, European Commission, DG XII, Science, Research and Development: Brussels, Belgium. p. 150-153.

25 7. Salonen, A., et al., Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. J Microbiol Methods, 2010. 81(2): p. 127-34.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal que

   5 comprende al menos una cepa bacteriana aislada a partir de las especies Prevotellaceae, donde la cepa se selecciona de entre el grupo que consiste en Prevotella copri y Prevotella ruminicola.
2. 2. El producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal de

   10 acuerdo con la reivindicacion 1, donde el producto comprende Prevotella copri.
3. 3. El producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, donde el producto comprende al menos un tipo de fibra dietetica.

   15
4. 4. El producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal de acuerdo con la reivindicacion 3, donde el producto comprende al menos un almidon resistente.

   20 5. El producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2,

   enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha cepa bacteriana esta modificada geneticamente.

   25 6. El producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2,

   enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dichas fibras dieteticas y dicho almidon resistente estan relacionados con cereales en cualquier forma tales como fibra de cebada, trigo, centeno, avena, beta-glucano.

   30 7. El producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2,

   enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal de acuerdo con la reivindicacion 6, donde dicha fibra dietetica es de cebada.
5. 8. El producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2,

   35 enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho almidon resistente esta en cualquier forma como la intrfnseca de granos de cebada, almidon retrogradado, almidon encapsulado botanicamente, almidon no gelatinizado natural, ciclo-dextrinas o almidon modificado qufmicamente.

   40 9. El producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2,

   enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una cepa bacteriana adicional, donde dicha cepa es una cepa que produce succinato.

   45 10. El producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2,

   enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende succinato.
6. 11. El producto para su uso en el tratamiento de obesidad, sfndrome metabolico, diabetes tipo 2, 50 enfermedades cardiovasculares, demencia, enfermedad de Alzheimer y enfermedad inflamatoria intestinal de

   acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la cepa bacteriana de la especie Prevotellaceae esta encapsulada o liofilizada.
7. 12. Un producto que comprende al menos una cepa bacteriana aislada a partir de las especies 55 Prevotellaceae, donde la cepa se selecciona de entre el grupo que consiste en Prevotella copri y Prevotella

   ruminicola, y donde el producto comprende ademas al menos un tipo de fibra dietetica.
8. 13. El producto de acuerdo con la reivindicacion 12, donde el producto comprende como unica cepa bacteriana una cepa bacteriana aislada a partir de las especies Prevotellaceae, donde la cepa es Prevotella copri.
9. 14. El producto de acuerdo con la reivindicacion 12, donde el producto comprende ademas una cepa bacteriana adicional, donde dicha cepa es una cepa que produce succinato.
10. 15. El producto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde el producto comprende 5 ademas succinato.