CN118806799B - 普雷沃氏菌在制备治疗或辅助治疗高血压的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及普雷沃氏菌Prevotella copri在制备治疗或辅助治疗高血压的药物中的应用。本发明首次确认了普雷沃氏菌Prevotella copri在治疗高血压疾病方面的关键作用并在大鼠模型中得到验证，通过增加肠道菌群中普雷沃氏菌Prevotella copri的数量可以有效降低血压，加之其本身就是肠道中正常存在的微生物，不会对人体产生额外副作用，具有同类药物不可比拟的药物安全优势。利用普雷沃氏菌Prevotella copri制备得到的药物和药物组合物，可用于治疗包括原发性高血压和盐敏感性高血压在内的高血压疾病，具有重要的应用价值。

Description

普雷沃氏菌在制备治疗或辅助治疗高血压的药物中的应用

技术领域

本发明的实施例总体涉及生物医药技术领域，并且更具体地涉及普雷沃氏菌在制备治疗或辅助治疗高血压的药物中的应用。

背景技术

近年来高血压的发病率迅速增加，这是一种以体循环动脉压升高为主要表现的临床综合征，可伴有心、脑、血管和肾脏等器官功能性或器质性改变的全身性疾病。由于人体血压水平与心血管疾病发病和死亡风险之间存在密切的因果关系，因此预防和控制高血压成为当下遏制心血管疾病发展的核心策略，所有高血压患者一旦诊断，建议在生活方式干预的同时立即启动药物治疗。

根据药物的作用机制，目前用于针对性治疗高血压的药物分为血管紧张素转化酶抑制剂、利尿剂、受体阻滞剂、钙离子拮抗剂和血管紧张素受体拮抗剂等五大类，然而在临床应用中，抗高血压药物的有效率仅有60% ~ 80%，但毒副作用发生率却高达15% ~ 20%，此外，高血压治疗还面临患者治疗率低、控制率低及依从性差等问题，因此开发更加安全高效的抗高血压药物迫在眉睫。

虽然当下有研究表明人体内的肠道菌群与高血压、糖尿病等疾病的发生发展有密切关系，但由于菌群种类复杂且作用机制不完全明确，肠道菌用于上述疾病治疗的应用并不多，且研究人员目前主要集中在与消化系统有关的糖尿病方面，而高血压疾病则几乎没有涉及。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了普雷沃氏菌Prevotella copri在制备治疗或辅助治疗高血压的药物中的应用，并进一步提供了用于治疗或辅助治疗高血压的药物和药物组合物。

根据本发明的第一方面，提供了普雷沃氏菌Prevotella copri在制备治疗或辅助治疗高血压的药物中的应用。

所述普雷沃氏菌Prevotella copri是一种已知的肠道定植菌，本发明中所提到的普雷沃氏菌Prevotella copri均可通过市面上公开渠道购买获得。

在一个实施例中，所述普雷沃氏菌Prevotella copri为普雷沃氏菌Prevotellacopri活菌体和/或普雷沃氏菌Prevotella copri培养上清液。

在一个实施例中，所述高血压疾病为原发性高血压或盐敏感性高血压。

在一个实施例中，所述药物包括药学有效剂量的普雷沃氏菌Prevotella copri和药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体为脱脂奶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、海藻糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油中的一种或多种。

在一个实施例中，所述药物可以采用药学上可行的任一种或多种剂型，包括但不限于为片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉剂。

具体地，所述药物可采用胶囊、软胶囊、口崩片、咀嚼片、口含片、舌下片、滴丸剂、颗粒剂、冲剂、散剂、混悬剂、缓释片及缓释胶囊、溶液剂、混悬液、丸剂等剂型。这些剂型含有各类赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、乳化剂及稀释剂等。

根据本发明的第二方面，提供了一种用于治疗或辅助治疗高血压的药物，所述药物包括药学有效剂量的普雷沃氏菌Prevotella copri。

在一个实施例中，所述普雷沃氏菌Prevotella copri为普雷沃氏菌Prevotellacopri活菌体和/或普雷沃氏菌Prevotella copri培养上清液。

根据本发明的第三方面，提供了一种用于治疗或辅助治疗高血压的药物组合物，所述药物组合物包括药学有效剂量的普雷沃氏菌Prevotella copri。所述药物组合物还包括其他可用于治疗或辅助治疗高血压的药物或药物成分。

在一个实施例中，所述普雷沃氏菌Prevotella copri为普雷沃氏菌Prevotellacopri活菌体和/或普雷沃氏菌Prevotella copri培养上清液。

基于上述技术方案实现以下有益效果：

1. 本发明首次确认了普雷沃氏菌Prevotella copri在治疗高血压疾病方面的关键作用，并在多种高血压大鼠模型中均得到验证，通过增加肠道菌群中普雷沃氏菌Prevotella copri的数量可以有效降低血压，加之普雷沃氏菌Prevotella copri本身就是肠道内正常存在的微生物，不会对人体产生额外副作用，具有同类药物不可比拟的药物安全优势，患者易于接受且具有临床推广价值，有望解决高血压治疗效果差、患者依从性低、药物副作用大等难题，而且普雷沃氏菌Prevotella copri简单易得，可快速投入生产并获得高效制剂。

2. 本发明利用普雷沃氏菌Prevotella copri在治疗高血压疾病中的关键作用制备得到相应的药物、药物组合物等产品，这些产品可用于治疗包括原发性高血压、盐敏感性高血压等在内的多种高血压疾病，具有重要的应用价值。

应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本发明的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本发明的范围。本发明的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。

附图说明

结合附图并参考以下详细说明，本发明各实施例的上述和其他特征、优点及方面将变得更加明显。在附图中，相同或相似的附图标注表示相同或相似的元素。

图1示出了本发明实施例1的健康人群（Health）和初发高血压患者（HTN）粪便样本中相对丰度排名前15菌株的相对丰度和差异菌株；其中：

A为Health组和HTN组的相对丰度排名前15的菌株示意图，纵坐标表示相对丰度；

B为Prevotella copri菌在Health组和HTN组中的相对丰度对比图，纵坐标表示相对丰度，*p < 0.05；

C为LEfSe分析Health组和HTN组之间的差异菌株图。

图2示出了本发明实施例3的Prevotella copri菌在原发性高血压大鼠模型（SHR）中对大鼠收缩压（SBP）和舒张压（DBP）的影响；其中：

A为加入Prevotella copri菌后SHR大鼠SBP的变化示意图；

B为加入Prevotella copri菌后SHR大鼠DBP的变化示意图；

SHR-control代表对照组，SHR-ABX代表伪无菌模型组，SHR-ABX-PC代表伪无菌+PC组，SHR-PC代表PC组。

图3示出了本发明实施例4的Prevotella copri菌在AngII诱导型高血压小鼠模型中对小鼠收缩压（SBP）和舒张压（DBP）的影响；其中：

A为加入Prevotella copri菌后AngII诱导小鼠SBP的变化示意图；

B为加入Prevotella copri菌后AngII诱导小鼠DBP的变化示意图；

control代表生理盐水对照组，model代表AngII+溶剂处理组，PC代表AngII+PC处理组，** p < 0 .01，*** p < 0 .001。

图4示出了本发明实施例5的Prevotella copri菌在高盐诱导型高血压大鼠模型（HSD）中对大鼠收缩压（SBP）和舒张压（DBP）的影响；其中：

A为加入Prevotella copri菌后HSD大鼠SBP的变化示意图；

B为加入Prevotella copri菌后HSD大鼠DBP的变化示意图；

control代表灌胃溶剂对照组，PC代表灌胃Prevotella copri菌组，*p < 0.05，**p < 0 .01。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的示范性实施例做出说明，其中包括本发明实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本发明的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。

除另有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例中所涉及的健康对照组血压均正常，高血压大鼠和模型大鼠均符合诊断标准。

实施例中粪便标本、所用试剂材料及其来源：

1. 标本

实施例1中所用粪便来自健康人群和初发高血压患者，实施例2中所用粪便来自原发性高血压大鼠SHR和对照大鼠WKY。

2. 主要试剂材料。

粪便微生物基因组DNA抽提试剂盒（QIAamp® PowerFecal® Pro DNA）；TB green（Takara公司）；Emerald Amp PCR Master Mix（Takara公司）；7周龄雄性SHR大鼠、Wistar-Kyoto（WKY）大鼠和Wistar大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）；7周龄c57小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司）；8%NaCl饲料、0.4%NaCl饲料（书玉生物科技（上海）有限公司）；移液器吸头（规格：10μL、100μL及1mL）、EP管（10mL、100mL及1mL）及八连管（0.2mL）（Axygen公司）；无菌离心管（15mL和50mL）、移液管（5mL和10mL）；大小鼠智能无创血压计（北京软隆生物科技有限公司）；灌胃所用Prevotella copri菌（商城北纳创联生物科技有限公司DSM 18205）。

ABX：200 mg/mL万古霉素，400 mg/mL氨苄西林，400 mg/mL新霉素和400 mg/mL甲硝唑（抗生素购于生工生物）的混悬液，0.5 mL/kg体积灌胃。

mGAM细菌培养基的组成成分如下（每1000mL体系）：月示胨15.0g，胰酪蛋白胨10.0g，大豆胨3.0g，酵母浸粉5.0g，牛肉粉2.0g，消化血清粉13.5g，牛肝浸粉1.2g，葡萄糖3.0g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠3.0g，可溶性淀粉0.3g，L-半胱氨酸0.3g，硫乙醇酸钠0.15g，pH值7.2。

Prevotella copri菌用于灌胃前处理：Prevotella copri菌在冻存液（甘油:mGAM=1:9）中保存在﹣80℃，复苏时，Prevotella copri菌株在厌氧培养箱内使冻存液完全融化后，在超净工作台上将菌液分布至适量的mGAM培养基中，轻轻混匀，并在厌氧培养箱内培养24 h。传代时，将1mL菌液加入至40 mL新鲜空白培基中混匀。灌胃前，将菌液在高速冷冻离心机中离心（4000 rpm，10min），去除上清液并将沉淀重悬于无菌PBS中制成1010CFU/mL的细菌悬液，将该稀释菌液样本分装于灭菌的1.5 mL离心管里，封口条密封置于冰上备用及运输。

ABX：200 mg/mL万古霉素，400 mg/mL氨苄西林，400 mg/mL新霉素和400 mg/mL甲硝唑（抗生素购于生工生物）的混悬液，0.5 mL/kg体积灌胃。

实施例1：健康人群与初发高血压患者肠道菌群的差异

本实施例样本采集于从2022年9月至2023年9月在汕头大学医学院第一附属医院心血管病医院就诊的部分高血压患者与健康人群，所有研究参与者均年满18周岁。高血压认定标准依据《中国高血压防治指南（2018年修订版）》定义为：非同日连续3次测量诊室血压，收缩压（SBP）≥140mm Hg和（或）舒张压（DBP）≥90mm Hg。

上述研究参与者按照指导过夜禁食后，采用无菌粪便收集盒收集粪便样本，并迅速置于冰盒内，尽快运输至﹣80℃环境下保存留待后续实验，通过电子病历与随访收集患者的基本信息（姓名、性别、年龄、身高、体重、联系方式）以及反映肝肾功能与血脂的必要临床信息。

采用QIAamp® PowerFecal® Pro DNA提取试剂盒抽提粪便样本中微生物基因组DNA，按照说明书进行操作。

对健康人群（Health）和初发高血压患者（HTN）的粪便DNA样本分别进行宏基因组检测，结果参见图1，相比于健康人群组，Prevotella copri菌的丰度在初发高血压患者组中减少（图1A），t检验发现Prevotella copri菌在健康人群组显著增加（图1B），Lefse分析显示Prevotella copri菌在健康人群组显著富集（图1C）。

实施例2：原发性高血压大鼠（SHR）和对照大鼠（WKY）肠道内普雷沃氏菌的丰度差异

将7周龄原发性高血压大鼠（SHR）和作为对照的WKY（Wistar Kyoto）大鼠饲养在中南大学实验动物学部。实验动物饲养在SPF环境中，保持12h昼夜循环，温度维持在23-26℃，湿度维持在50±10%，使用实验动物标准饲料进行喂养且动物可以随时饮水。

适应性饲养一周后，采用灭菌滤纸收集动物粪便样本于无菌冻存管内，并立即冻存在液氮中，后续保存在﹣80℃环境下等待后续实验。

将原发性高血压大鼠SHR和对照大鼠WKY的粪便样本进行16s rRNA基因测序，结果发现二者在普雷沃氏菌的丰度水平上发生明显变化，例如，相比于WKY组，SHR组中Prevotellaceae_Ga6A1_group的相对丰度降低了3倍，Prevotellaceae_NK3B31_group的相对丰度降低了4倍，Prevotella_9的相对丰度降低了17倍，而通过使用特异性引物进行实时定量PCR，结果发现Prevotella copri在SHR鼠中相比于WKY降低了200倍以上。

实施例3：Prevotella copri菌对原发性高血压大鼠模型（SHR）中大鼠血压的影响

将7周龄原发性高血压大鼠（SHR）饲养在中南大学实验动物学部。实验动物饲养在SPF环境中，保持12h昼夜循环，温度维持在23-26℃，湿度维持在50±10%，使用实验动物标准饲料进行喂养且动物可以随时饮水。

对实验动物编号并称重，随机分组，保证各组内实验动物的体重相当。在本实施例中，SHR大鼠被分为四组，每组10只，分别为对照组（SHR-control）、伪无菌模型组（SHR-ABX）、伪无菌+PC组（SHR-ABX-PC）和PC组（SHR-PC）。

对伪无菌模型组连续灌胃四联抗生素（氨苄西林20 mg/kg、万古霉素10 mg/kg、硫酸新霉素20 mg/kg 和甲硝唑20 mg/kg）5天，尽量敲低大鼠体内肠道菌以模拟无菌环境。停药3天后，对伪无菌+PC组和PC组连续灌胃处理好的PC菌液，每天灌胃一次，每次每只灌胃1mL稀释的Prevotella copri菌液，对对照组及伪无菌模型组均灌胃等体积PBS，持续5周。此过程中，连续每周在给菌前和给菌后记录大鼠血压的变化情况。

采用尾套法测量大鼠血压，大鼠经专用固定器固定后，被放置在仪器内39℃预热15-20 min，使其尾部血管充分扩张以便血压测量，共测量3次血压，间隔10 s，取波形起始处为收缩压，波形最高点为舒张压。测量时需保证较为安静的环境，固定由同一人员完成血压测量，所有大鼠在灌胃处理前均进行了测血压适应性训练，从而减少动物应激导致的血压不准确。

参见图2，结果发现对照组与伪无菌模型组大鼠的SBP变化无区别，而无论是正常菌群状态还是抗生素处理后伪无菌状态，在加入Prevotella copri菌后，伪无菌+PC组和PC组的SBP均降低了约20 mmHg（图2A），下降幅度明显；伪无菌+PC组的DBP相比于伪无菌模型组略有下降，PC组的DBP相比于对照组下降了约20 mmHg（图2B）。

实施例4：Prevotella copri菌对血管紧张素II（AngII）诱导型高血压小鼠模型中小鼠血压的影响

将7周龄c57小鼠饲养在中南大学实验动物学部。实验动物饲养在SPF环境中，保持12h昼夜循环，温度维持在23-26℃，湿度维持在50±10%，使用实验动物标准饲料进行喂养且动物可以随时饮水。

手术前一天将植入式胶囊渗透压微量泵（瑞沃德，1002w）置于生理盐水中在37℃孵箱内激活24小时。称量小鼠体重，计算实验所需AngII总量（每只微量缓释泵容量为100μl），在无菌超净台中进行液体配制及灌泵，对照组灌注等体积生理盐水。

使用气麻机，采用异氟烷的方式对小鼠进行麻醉，75 %乙醇消毒后颈部手术区，在小鼠后颈部行长1 cm左右的竖行切口，使用止血钳钝性分离皮肤和皮下组织，将植入式胶囊渗透压微量泵埋入皮下进行AngII（500 ng/kg/min）或生理盐水灌注，建立AngII诱导型高血压小鼠模型。

对模型小鼠编号并随机分组，保证各组内实验动物的体重相当。在本实施例中，SHR大鼠被分为三组，每组10只，分别为生理盐水对照组（control）、AngII+溶剂处理组（model）和AngII+PC处理组（PC）。

通过微量泵对三组小鼠定时灌注等体积的生理盐水或AngII，对AngII+PC处理组灌胃处理好的PC菌液，每天灌胃一次，每次每只灌胃1mL稀释的Prevotella copri菌液，对AngII+溶剂处理组灌胃等体积PBS，持续两周。此过程中，在第5、9、13天对小鼠血压进行检测。

参见图3，结果发现加入Prevotella copri菌后，AngII+PC处理组的小鼠血压相比于AngII+溶剂处理组有明显降低，其中SBP下降了约30 mmHg（图3A），DBP下降了约20 mmHg（图3B）。

实施例5：Prevotella copri菌对高盐诱导型高血压大鼠模型中大鼠血压的影响

将7周龄Wisar小鼠饲养在中南大学实验动物学部。实验动物饲养在SPF环境中，保持12h昼夜循环，温度维持在23-26℃，湿度维持在50±10%，使用实验动物标准饲料进行喂养且动物可以随时饮水。

给予Wisar大鼠8%的高盐使其发展为高血压模型，然后将高盐诱导的高血压模型鼠随机均分为两组，分别为对照组（control）和PC组（PC），对PC组连续灌胃处理好的PC菌液，每天灌胃一次，每次每只灌胃1mL稀释的Prevotella copri菌液，对照组灌胃等体积PBS，持续四周。此过程中，连续每周在给菌前和给菌后记录大鼠血压的变化情况。

参见图4，结果发现加入Prevotella copri菌能够显著降低高盐诱导高血压大鼠的血压，其中SBP下降约15 mmHg（图4A），DBP下降约15 mmHg（图4B）。

以上结果表明，普雷沃氏菌Prevotella copri在高血压疾病的预防和质量中起到关键作用，经验证普雷沃氏菌Prevotella copri在高血压患者及在原发性高血压大鼠模型（SHR）、AngII诱导型高血压小鼠模型和高盐诱导型高血压大鼠模型中均表现出相对丰度显著下降，而在进一步使用普雷沃氏菌Prevotella copri对原发性高血压大鼠模型（SHR）、AngII诱导型高血压小鼠模型和高盐诱导型高血压大鼠模型进行干预后，发现各模型中实验对象的血压均显著降低。综上，普雷沃氏菌Prevotella copri能够降低收缩压和舒张压，具有较好的治疗效果，加之其本身就是肠道中正常存在的微生物，不会对人体产生额外副作用，具有同类药物不可比拟的药物安全优势。

此外，普雷沃氏菌家族的物种多样性很高，难以将某个具体普雷沃氏菌菌种的特性直接推定到其余普雷沃氏菌上，而目前也没有关于普雷沃氏菌Prevotella copri与高血压疾病的研究报道。本发明第一次在种水平上明确了Prevotella copri菌本身对于高血压的治疗效果。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (5)

1.普雷沃氏菌Prevotella copri在制备治疗高血压的药物中的应用，所述普雷沃氏菌Prevotella copri的菌株编号为DSM 18205。

2.根据权利要求1所述的普雷沃氏菌Prevotella copri在制备治疗高血压的药物中的应用，其特征在于，所述普雷沃氏菌Prevotella copri为普雷沃氏菌Prevotella copri活菌体。

3.根据权利要求1所述的普雷沃氏菌Prevotella copri在制备治疗高血压的药物中的应用，其特征在于，所述高血压为原发性高血压或盐敏感性高血压。

4.根据权利要求1所述的普雷沃氏菌Prevotella copri在制备治疗高血压的药物中的应用，其特征在于，所述药物包括药学有效剂量的普雷沃氏菌Prevotella copri和药学上可接受的载体。

5.根据权利要求1所述的普雷沃氏菌Prevotella copri在制备治疗高血压的药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉剂。