ES2691918T3 - Métodos para determinar la calidad de un embrión - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro no invasivo para determinar la calidad de un embrión, que comprende las etapas que consisten en: i) proporcionar una muestra del medio de cultivo donde el embrión se ha cultivado, preparándose dicha muestra cuando el embrión ha alcanzado la fase de blastocisto que corresponde al día 5 o 6 del desarrollo del embrión; ii) extraer ácidos nucleicos sin células de la muestra; iii) determinar la concentración de ácidos nucleicos sin células en la extracción de ácido nucleico; iv) comparar la concentración determinada en la etapa iii) con un valor de referencia, correspondiendo dicho valor de referencia a la concentración de los ácidos nucleicos medida en un medio de cultivo en el día 3 de desarrollo del embrión; y v) concluir que el embrión es competente cuando la concentración determinada en la etapa i) es inferior al valor de referencia.
Description
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DESCRIPCION
Metodos para determinar la calidad de un embrion Sector de la tecnica
La presente invencion se refiere en lmeas generales a los campos de medicina reproductiva. Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a un metodo para determinar la calidad de un embrion.
Estado de la tecnica
Actualmente, no hay un procedimiento genetico o no genetico disponible en el mercado fiable para determinar la calidad de un embrion durante tecnologfa de reproduccion asistida (ART). De forma destacable, sigue habiendo un problema esencial para determinar si un embrion puede producir descendencia viable cuando se transfiere a un entorno uterino apropiado. Otro problema importante es determinar el perfil genetico de un embrion que hara que el desarrollo del feto e incluso despues del nino sea viable.
La seleccion de embriones con un potencial de implante mayor es uno de los retos principales en la tecnologfa de reproduccion asistida (ART). Inicialmente, se usaba transferencia de multiples embriones (MET) para maximizar las tasas de embarazo. Sin embrago, la calidad mejorada del embrion y la elevacion de las tasas de embarazos multiples ha provocado disminuciones en el numero de embriones para el reemplazo. Por lo tanto, la seleccion del "mejor" embrion ha llegado a ser crucial, particularmente siendo enormemente recomendable la transferencia electiva de un unico embrion (SET). Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar nuevas estrategias objetivo para la seleccion de embriones. Los metodos clasicos para seleccionar embriones sanos en condiciones de IVF e ICSI se basan en criterios morfologicos subjetivos tales como el grado de fragmentacion y la presencia de multinucleacion, la cantidad y tamano de blastomeros, la escision embrionaria prematura (Ebner et al., 2003; Fenwick et al., 2002). Sin embargo, la mayona de los estudios sugieren que los embriones con aspecto morfologico apropiado unicamente no son suficientes para predecir un implante satisfactorio. Considerando la limitacion de la evaluacion morfologica y los metodos de cribado citogenetico, ahora hay un movimiento hacia tecnologfas mas sofisticadas de alto rendimiento y la aparicion de la ciencia "omica", tal como transcriptomica y metabolomica. Estas estrategias se centran en una diversidad de celulas corporales, asf como el medio de cultivo embrionario. Una estrategia indirecta y atractiva para predecir los resultados de embriones y embarazos se ha presentado por nuestro equipo usando datos transcriptomicos de expresion genica de celulas del cumulo (CC) (Assou et al., 2011; Assou et al., 2008). Se observo que no hay relacion entre los aspectos morfologicos del embrion y el perfil de expresion genica de CC (Assou et al., 2010). Otros estudios presentaron que el perfil metabolomico del medio de cultivo usado por espectroscopia de Raman o de infrarrojo cercano (NIR) se correlaciona con el potencial reproductor de embriones individuales (Seli et al., 2007; Vergouw et al., 2008). Demostraron tambien que el perfil metabolomico del medio de cultivo de embriones era independiente de la morfologfa.
Otra causa principal de la tasa de implante reducida es una mala calidad genetica del embrion implantado. Por ejemplo, la mayona de los residuos y perdidas embrionarias estan causadas por aneuploidfas (anomalfas en el numero de cromosomas) que con mortales y se producen en aproximadamente un 60 % de todos los abortos espontaneos y muertes fetales. Otras anomalfas geneticas incluyen aneuploidfa cromosomica, amplificacion, translocacion, insercion/eliminacion, inversion, polimorfismos de repeticiones cortas en tandem, polimorfismos de microsatelites, polimorfismos de un unico nucleotido (SNP) y otras anomalfas estructurales. Las anomalfas geneticas pueden causar muchas enfermedades fenotfpicas y algunas son incluso mortales. Si se producen anomalfas geneticas en embriones, muchos tipos de afecciones prenatales y enfermedades congenitas tienen probabilidad de desarrollarse. El cribado de estas anomalfas por diagnostico genetico preimplante (PGD) es muy importante para asegurar una seleccion de embrion estructuralmente normal e implante viable. Sin embargo, los metodos actuales son invasivos y pueden causar perjuicio al embrion.
Se informo de que el ADN sin celulas puede detectarse en lfquidos biologicos tales como sangre, lfquido asdtico, orina, lfquido amniotico, heces, saliva o lfquido cefalorraqrndeo. Diversos acidos nucleicos tales como ADN, ARN, miARN se aislaron, de hecho, y se detectaron en formas sin celulas. Se encontro ADNsc en cantidad detectable en sujetos sanos, asf como, en mayor cantidad, en algunos trastornos patologicos (cancer, infarto de miocardio, enfermedad autoinmunitaria, septicemia, traumatismo, etc.) o estado fisiologico espedfico (esfuerzo intenso, etc.). Los mecanismos de liberacion de ADNsc son muy poco conocidos, pero se ha sugerido que la necrosis, la apoptosis, la fagocitosis o la liberacion activa podnan estar implicadas. El analisis de ADNsc es un area de investigacion activa en el campo de diagnostico especialmente en dos areas que se somete a un alto escrutinio en este momento. El documento EP 1944611 divulga un metodo para determinar la calidad del embrion midiendo el nivel de MICA en el medio de cultivo del embrion o sobrenadante. El documento WO 2013/056002 divulga el uso de miARN para evaluar embriones cultivados in vitro.
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Objeto de la invencion
La presente invencion se basa en el drastico descubrimiento de la presencia de cantidad de acidos nucleicos sin celulas en el medio de cultivo donde se cultiva el embrion en condiciones de fertilizacion in vitro. Los autores de la invencion demuestran que el nivel de dichos acidos nucleico sin celulas en el medio de cultivo es informativo sobre la capacidad del embrion de dar lugar a un embarazo. Ademas, los autores de la invencion demuestran que el analisis de dichos acidos nucleicos sin celulas, hacen que la deteccion y expresion de una expresion genica de secuencia espedfica sea posible y abre una via para el desarrollo de un metodo no invasivo para el perfil genetico de un embrion.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo in vitro no invasivo para determinar la calidad de un embrion, que comprende las etapas que consisten en i) proporcionar una muestra del medio de cultivo donde se cultiva el embrion, preparandose dicha muestra cuando el embrion ha alcanzado la fase de blastocisto correspondiente al dfa 5 o 6 del desarrollo del embrion; ii) extraer acidos nucleicos sin celulas de la muestra; iii) determinar la concentracion de acidos nucleicos sin celulas en la extraccion de acido nucleico; iv) comparar la concentracion determinada en la etapa iii) con un valor de referencia, correspondiendo dicho valor de referencia a la concentracion de los acidos nucleicos metida en un medio de cultivo en el dfa 3 de desarrollo del embrion; y v) concluir que el embrion es competente cuando la concentracion determinada en la etapa i) es inferior que el valor de referencia. Como se usa en este documento, el termino "embrion" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a un ovocito fertilizado o cigoto. El termino "embrion" tambien se refiere a celulas en todas las fases del desarrollo desde un ovocito fertilizado o cigoto hasta los 5 o 6 dfas (fase de blastocisto). Dicha fertilizacion puede intervenir en las condiciones de fertilizacion in vitro clasicas (cIVF) o en un procedimiento de inyeccion de espermatozoides intracitoplasmatica (ICSI). Los ejemplos de embriones incluyen embriones de 1 celulas (tambien mencionados como cigotos), embriones de 2 celulas, embriones de 3 celulas, embriones de 4 celulas, embriones de 5 celulas, embriones de 6 celulas, embriones de 8 celulas, etc., tipicamente hasta e incluyendo embriones de 16 celulas, cualquiera de los cuales puede obtenerse de cualquier manera conveniente, por ejemplo, de un ovocito que ha madurado in vivo o de un ovocito que ha madurado in vitro. Como se usa en este documento, el termino "blastocisto" se refiere a la estructura formada en la embriogenesis prematura de mairnferos, despues de la formacion de la morula. Posee una masa celular interior (ICM), o embrioblasto, que posteriormente forma el embrion, y una capa exterior de celulas, o trofoblasto, que despues forma la placenta. El trofoblasto rodea la masa de celulas interior y una cavidad de blastocisto rellena de lfquido conocida como blastocele. El blastocisto humano comprende 70-100 celulas. La formacion del blastocisto empieza en el dfa 5/6 despues de la fertilizacion en seres humanos. El ovocito puede resultar de un ciclo natural, un ciclo natural modificado o un ciclo estimulado para cIVF o ICSI. La expresion "ciclo natural" se refiere al ciclo natural por el que la hembra o mujer produce un ovocito. La expresion "ciclo natural modificado" se refiere al proceso por el cual la hembra o mujer produce un ovocito o dos en una estimulacion suave de ovario con antagonistas de GnRH asociados con FSH o hMG recombinante. La expresion "ciclo estimulado" se refiere al proceso por el que una hembra o mujer produce uno o mas ovocitos en estimulacion con agonistas o antagonistas de GnRH asociados con FSH o hMG recombinante.
La expresion "fertilizacion in vitro clasica" o "cIVF" se refiere a un proceso por el que los ovocitos se fertilizan por espermatozoides fuera del organismo, in vitro. IVF es un tratamiento principal en infertilidad cuando no ha logrado la concepcion in vivo. La expresion "inyeccion de espermatozoides intracitoplasmatica" o "ICSI" se refiere a un procedimiento de fertilizacion in vitro en que un unico espermatozoide se inyecta directamente en un ovocito. Este procedimiento se usa mas habitualmente para superar los factores de infertilidad masculina, aunque tambien puede usarse cuando el espermatozoide no puede penetrar facilmente los ovocitos, y ocasionalmente como un metodo de fertilizacion in vitro, especialmente el asociado con donacion de esperma.
Por "determinar la calidad de un embrion" se entiende que el metodo de la invencion tiene como objetivo determinar si un embrion es competente y/o alberga una anomalfa genetica o una secuencia espedfica en el contexto de fertilizacion in vitro. El metodo de la invencion permite la evaluacion de la capacidad de un embrion de realizar satisfactoriamente cualquiera o ambos en terminos de conferir una alta tasa de embarazo y/o producir una persona sana.
La expresion "embrion competente" se refiere a un embrion con una alta tasa de implante que da lugar a embarazo. La expresion "alta tasa de implante" significa el potencial del embrion cuando se transfiere al utero, de implantarse en el entorno uterino y de dar lugar a un feto viable, que a su vez se desarrolla en una descendencia viable sin un procedimiento o evento que termine dicho embarazo.
Como se usa en este documento, la expresion "anomalfa genetica" se refiere a cualquier evento que pueda existir en el genoma de un individuo (es decir, un embrion) que puede dar lugar a causar enfermedad fenotfpica y mortalidad. Las anomalfas geneticas incluyen, aunque sin limitacion, aneuploidfa, translocacion, amplificacion de un gen/locus, inserciones, eliminaciones, reversiones, polimorfismos de repeticion corta en tandem (STR), polimorfismo de microsatelite, polimorfismos de un unico nucleotido (SNP), mutaciones geneticas individuales responsables de enfermedades hereditarias o una combinacion de las mismas. En particular, cualquier enfermedad geneticamente
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transmisible puede detectarse de acuerdo con el presente metodo. Por ejemplo, una alteracion genetica puede incluir alteraciones conocidas en uno o mas de los genes: CFTR, factor VIII (gen F8), beta-globina, hemacromatosis, G6PD, neurofibromatosis, GAPDH, beta-amiloide y piruvato cinasa. Las secuencias y mutaciones comunes (por ejemplo, polimorfismo de un unico nucleotido o SNP) de los genes son conocidas. Pueden detectarse otras anomalfas geneticas, tales como las que implican una secuencia que se elimina en un cromosoma humano, se mueve en una translocacion o inversion o se duplica en una duplicacion de cromosoma, en la que dicha secuencia se caracteriza en un trastorno genetico conocido en el material genetico fetal. Por ejemplo, la aneuploidfa cromosomica, tal como el smdrome de Down (o trisoirna del 21), el smdrome de Edwards (trisoirna del 18), el smdrome de Patau (trisoirna del 13), el smdrome de Turner (45X0), el smdrome Klinefelter (un sujeto masculino con 2 cromosomas X), el smdrome de Prader-Willi y el smdrome de DiGeorge. Puede encontrarse un listado de las anomalfas geneticas conocidas en la base de datos OMIM (
http://omim.org/). Preferiblemente, se determina la calidad de un embrion humano, pero tambien puede determinarse la calidad de un embrion de otros mairnferos (por ejemplo, primates, perros, gatos, cerdos, vacas, ratones, etc.). Como se usa en este documento, la expresion "acido nucleico" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a una secuencia de acido nucleico codificante o no codificante. Los acidos nucleicos incluyen ADN (acido desoxirribonucleico) y ARN (acido ribonucleico). El ejemplo de acido nucleico, por tanto, incluye, aunque sin limitacion, ADN, ARNm, ARNt, ARNr, ARNmt, miARN, ARNip ARNnop y ARNnp. De acuerdo con la invencion, el acido nucleico puede originarse en el nucleo del embrion o en el compartimento mitocondrial del embrion. Por "acido nucleico sin celulas" se entiende que el acido nucleico esta liberado del embrion y esta presente en el medio de cultivo en el que el embrion se cultiva despues de fertilizacion in vitro o inyeccion de espermatozoides intracitoplasmatica (ICSI).
http://omim.org/). Preferiblemente, se determina la calidad de un embrion humano, pero tambien puede determinarse la calidad de un embrion de otros mairnferos (por ejemplo, primates, perros, gatos, cerdos, vacas, ratones, etc.). Como se usa en este documento, la expresion "acido nucleico" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a una secuencia de acido nucleico codificante o no codificante. Los acidos nucleicos incluyen ADN (acido desoxirribonucleico) y ARN (acido ribonucleico). El ejemplo de acido nucleico, por tanto, incluye, aunque sin limitacion, ADN, ARNm, ARNt, ARNr, ARNmt, miARN, ARNip ARNnop y ARNnp. De acuerdo con la invencion, el acido nucleico puede originarse en el nucleo del embrion o en el compartimento mitocondrial del embrion. Por "acido nucleico sin celulas" se entiende que el acido nucleico esta liberado del embrion y esta presente en el medio de cultivo en el que el embrion se cultiva despues de fertilizacion in vitro o inyeccion de espermatozoides intracitoplasmatica (ICSI).
En el metodo de la invencion, la muestra del medio de cultivo se prepara cuando el embrion ha alcanzado la fase de blastocisto correspondiente al dfa 5 o 6 del desarrollo del embrion. Cualquier metodo bien conocido en la tecnica puede usarse para preparar una muestra del medio de cultivo cuando el embrion se ha cultivado despues de fertilizacion in vitro o inyeccion de espermatozoides intracitoplasmatica (ICSI). Una caractenstica esencial de la invencion es que el embrion permanece viable durante la preparacion de la muestra. No se usa enzima lftica o solucion de lisis basada en reactivos qmmicos para mantener la integridad del embrion. El metodo de la invencion es un metodo no invasivo perfecto y unicamente depende del hecho de que un embrion puede liberar acidos nucleicos en el medio de cultivo por un mecanismo aun no determinado.
Cualquier metodo bien conocido en la tecnica puede usarse por los expertos en la materia para extraer el acido nucleico sin celulas de la muestra preparada. Por ejemplo, puede usarse el metodo descrito en el ejemplo. El metodo de la invencion comprende las etapas que consisten en i) determinar el nivel del acido nucleico en la extraccion de acido nucleico, ii) comparar el nivel determinado en la etapa i) con un valor de referencia y iii) concluir que el embrion es competente cuando el nivel determinado en la etapa i) es inferior que el valor de referencia.
La determinacion del nivel del acido nucleico puede realizarse por una diversidad de tecnicas bien conocidas en la tecnica. En una realizacion particular, puede realizarse PCR cuantitativa para determinar el nivel de ADN tal como se describe en El Messaoudi et al., 2013; Mouliere et al., 2013; Thierry et al., 2013 y el documento WO 2012/028746. En particular, la determinacion del nivel del acido nucleico puede realizarse como se describe en el ejemplo. En el metodo de la invencion, el valor de referencia consiste en el nivel de los acidos nucleicos determinado en un medio de cultivo embrionario en el dfa 3 del desarrollo del embrion. Por consiguiente, la disminucion del nivel entre el dfa 3 del desarrollo del embrion y el dfa 5 o 6 (fase de blastocisto) indica que el embrion es competente.
En un aspecto de la divulgacion, el valor de referencia es un valor umbral o un valor lfmite que puede determinarse de forma experimental, empmca o teorica. Un valor umbral tambien puede seleccionarse arbitrariamente basandose en las condiciones experimentales y/o clmicas existentes, como reconocena un experto en la materia. El valor umbral tiene que determinarse para obtener la sensibilidad optima y la especificidad de acuerdo con la funcion del ensayo y el equilibrio de beneficio/riesgo (consecuencias clmicas de positivos falsos y negativos falsos). Tfpicamente, la sensibilidad optima y la especificidad (y tambien el valor umbral) pueden determinarse usando una curva de eficacia diagnostica (ROC) basada en datos experimentales. Preferiblemente, los expertos en la materia pueden comparar los niveles de acido nucleico con un valor umbral definido. En una realizacion de la presente divulgacion, el valor umbral se obtiene de los niveles de acidos nucleico (o relacion, o puntuacion) determinados en un medio de cultivo embrionario derivado de uno o mas pacientes que experimentan IVF o ISCI. Ademas, la medicion retrospectiva de los niveles de acido nucleico (o relacion, o puntuaciones) en medios de cultivo embrionario historicos apropiadamente almacenados en una coleccion de pacientes que experimentan IVF o ISCI puede usarse a la hora de establecer estos valores umbral. Se divulga ademas en este documento un metodo que comprende las etapas que consisten en i) detectar al menos una mutacion en la extraccion de acido nucleico y ii) concluir que el embrion alberga una anomalfa genetica cuando se detecta la mutacion.
Las tecnicas tfpicas para detectar una mutacion en un acido nucleico en particular ADN o ARNm incluyen, aunque sin limitacion, polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccion, tecnicas de hibridacion, secuenciacion, resistencia a exonucleasa, microsecuenciacion, extension en fase solida usando ddNTP, extension en solucion usando ddNTP, ensayos de oligonucleotidos, metodos para detectar polimorfismos de un unico nucleotido tal como hibridacion dinamica espedfica de alelo, reaccion en cadena de ligamiento, minisecuenciacion, "chips" de ADN, hibridacion de oligonucleotidos espedfica de alelo con sondas con marcaje individual o doble combinadas con PCR
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o con balizas moleculares, y otras.
^picamente, las mutaciones se detectan despues de amplificacion. Por ejemplo, el ARN aislado puede someterse a transcripcion inversa y amplificacion acopladas, tal como transcripcion inversa y amplificacion por reaccion en cadena de la polimerasa (RT-PCR), usando cebadores oligonucleotidicos espedficos que son espedficos para un sitio mutado o que posibilitan la amplificacion de una region que contiene el sitio mutado. De acuerdo con una primera alternativa, las condiciones para la hibridacion de cebador pueden elegirse para asegurar una transcripcion inversa espedfica (cuando sea apropiado) y la amplificacion; de modo que la aparicion de un producto de amplificacion sea un diagnostico de la presencia de una mutacion particular. De lo contrario, el ARN puede transcribirse de forma inversa y amplificarse, o puede amplificarse el ADN, despues de lo cual puede detectarse un sitio mutando en la secuencia amplificado por hibridacion con una sonda adecuada o por secuenciacion directa, o cualquier otro metodo apropiado conocido en la tecnica. Por ejemplo, puede clonarse un ADNc obtenido de ARN y secuenciarse para identificar una mutacion.
En particular, la secuenciacion representa una tecnica ideal que puede usarse en el contexto de la presente invencion. Los expertos en la materia estan familiarizados con varios metodos para secuenciar polinucleotidos. Estos incluyen, aunque sin limitacion, secuenciacion de Sanger (tambien mencionado como secuenciacion con didesoxi) y diversos metodos de secuenciacion por smtesis (SBS) como se revisa por Metzger (Metzger ML 2005, Genome Research 1767), secuenciacion por hibridacion, por ligamiento (por ejemplo, documento WO 2005/021786), por degradacion (por ejemplo, patentes de Estados Unidos n.° 5622824 y 6140053), secuenciacion en nanoporos. Preferiblemente, en un ensayo combinado, se prefiere secuenciacion profunda. La expresion "secuenciacion profunda" se refiere a un metodo de secuenciacion de una pluralidad de acidos nucleicos en paralelo. Vease, por ejemplo, Bentley et al., Nature 2008, 456:53-59. Las plataformas disponibles en el mercado principales producidas por Roche/454 (Margulies et al., 2005a), Illumina/Solexa (Bentley et al., 2008), Life/APG (SOLiD) (McKernan et al., 2009) y Pacific Biosciences (Eid et al., 2009) pueden usarse para secuenciacion profunda. Por ejemplo, en el metodo 454, el ADN a secuenciar se fracciona y se le suministra adaptadores o segmentos de ADN que pueden amplificarse por PCR usando cebadores que contienen los adaptadores. Los adaptadores son oligomeros de 25 nucleotidos requeridos para la union a microesferas de captura de ADN y para hibridar la emulsion de cebadores de amplificacion por PCR y el cebador de secuenciacion. Los fragmentos de ADN se hacen monocatenarios y se adhieren a microesferas de captura de ADN de una manera que permite que unicamente un fragmento de ADN se adhiera a una microesfera. A continuacion, las microesferas que contienen ADN se emulsionan en una mezcla de agua en aceite que provoca microrreactores que contienen solamente una microesfera. Dentro del microrreactor, el fragmento se amplifica por PCR, produciendo un numero de copias de varios millones por microesfera. Despues de la PCR, la emulsion se descompone y las microesferas se cargan en una placa de picovaloracion. Cada pocillo de la placa de picovaloracion puede contener unicamente una microesfera. Se anaden enzimas de secuenciacion a los pocillos y los nucleotidos se hacen fluir a traves de los pocillos en un orden fijo. La incorporacion de un nucleotido produce la liberacion de un pirofosfato, que cataliza una reaccion que da lugar a una senal quimioluminiscente. Esta senal se registra por una camara CCD y se usa un programa informatico para traducir las senales en una secuencia de ADN. En el metodo Illumina (Bentley (2008)), se adhieren fragmentos monocatenarios a los que se ha suministrado adaptador a una superficie opticamente transparente y se someten a "amplificacion de puentes". Este procedimiento produce varios millones de grupos, conteniendo cada uno copias de un unico fragmento de ADN. Se anaden la ADN polimerasa, cebadores y cuatro nucleotidos terminadores reversibles marcados y se toman imagenes de la superficie por fluorescencia laser para determinar la ubicacion y naturaleza de los marcadores. Los grupos de proteccion entonces se retiran y se repite el proceso durante varios ciclos. El proceso SOLiD (Shendure (2005)) es similar a la secuencia 454, los fragmentos de ADN se amplifican en la superficie de las microesferas. La secuenciacion implica ciclos de ligamiento y deteccion de sondas marcadas. Otras varias tecnicas para secuenciacion de alto rendimiento se estan desarrollando actualmente. Los ejemplos de estas son el sistema Helicos (Harris (2008)), Complete Genomics (Drmanac (2010)) y Pacific Biosciences (Lundquist (2008)). Como este es un campo tecnico en desarrollo extremadamente rapido, la aplicabilidad a la presente invencion de metodos de secuenciacion de alto rendimiento sera obvia para un experto en la materia. En este documento se divulga ademas un metodo que comprende las etapas que consisten en i) determinar el nivel de al menos una secuencia de acido nucleico espedfica, ii) comparar el nivel determinado en la etapa i) con un valor de referencia y iii) concluir que el embrion alberga una anomalfa genetica cuando el nivel determinado en la etapa i) es diferente del valor de referencia (es decir, inferior o superior dependiendo del acido nucleico observado).
Determinar el nivel de expresion de un acido nucleico (en particular un gen, miARN, ARNnp y ARNnop) puede evaluarse por cualquiera de una amplia diversidad de metodos bien conocidos. Tfpicamente, el acido nucleico preparado puede usarse en ensayos de hibridacion o amplificacion que incluyen, aunque sin limitacion, analisis de Southern o Northern, analisis de reaccion en cadena de la polimerasa, tales como PCR cuantitativa (TaqMan) y micromatrices de sondas tales como micromatrices de ADN GeneChip™ (AFF YMETRIX). De forma ventajosa el analisis del nivel de expresion de un acido nucleico implica el proceso de amplificacion de acido nucleico, por ejemplo, por RT-PCR (la realizacion experimental expuesta en la patente de Estados Unidos n.° 4683202), la reaccion en cadena de la ligasa (BARAnY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, pag.: 189-193, 1991), la replicacion de secuencias automantenida (GuATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 57, pag.: 1874-1878, 1990), sistema de amplificacion transcripcional (KWOH et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, pag.: 1173-1177, 1989), Q-Beta Replicasa (LIZARDl et al., Biol. Technology, vol. 6, pag.: 1197, 1988), replicacion por drculo rodante
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(patente de Estados Unidos n.° 5854033) o cualquier otro metodo de amplificacion de acido nucleico, seguido por la deteccion de las moleculas amplificadas usando tecnicas bien conocidas para los expertos en la materia. Se prefiere PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR semicuantitativa. En una realizacion particular, la determinacion comprende hibridar la muestra con reactivos selectivos tales como sondas o cebadores y detectar de ese modo la presencia, o medir la cantidad del acido nucleico. La hibridacion puede realizarse por cualquier dispositivo adecuado, tal como una placa, placa de microvaloracion, tubo de ensayo, pocillo, vidrio, columna y similares. Los acidos nucleicos que muestran complementariedad de secuencia u homologfa con el acido nucleico de interes de este documento encuentran utilidad como sondas de hibridacion o cebadores de amplificacion. Se entiende que dichos acidos nucleicos no tienen que ser identicos, sino que tfpicamente son al menos aproximadamente un 80 % identicos a la region homologa de tamano comparable, mas preferiblemente un 85 % identicos incluso mas preferiblemente un 90-95 % identicos. En determinadas realizaciones, sera ventajoso usar acidos nucleicos en combinacion con medios apropiados, tales como un marcador detectable, para detectar la hibridacion. Una amplia diversidad de indicadores apropiados, son conocidos en la tecnica incluyendo ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimaticos u otros ligandos (por ejemplo, avidina/biotina). Las sondas y cebadores son "espedficos" para el acido nucleico con el que hibridan, es decir, hibridan preferiblemente en condiciones de hibridacion de alta rigurosidad (correspondiente a la temperatura de fusion - Tm - mas elevada, por ejemplo, formamida al 50 %, SCC 5x o 6x. SCC 1x es NaCl 0,15 M, Na-citrato 0,015 M). Muchos ensayos de cuantificacion estan disponibles en el mercado de Qiagen (S.A. Courtaboeuf, Francia) o Applied Biosystems (Foster City, EE. UU.). El nivel de expresion del acido nucleico puede expresarse como perfil de expresion absoluta o perfil de expresion normalizada. Tfpicamente, los perfiles de expresion se normalizan corrigiendo el perfil de expresion absoluta del acido nucleico de interes comparando su expresion con la expresion de un acido nucleico que no es un ARNm relevante, por ejemplo, constitutivo, que se expresa de forma constitutiva. El ARNm adecuado para la normalizacion incluye ARNm constitutivos tales como U6, U24, U48 y S18. Esta normalizacion permite la comparacion del perfil de expresion en una muestra, por ejemplo, una muestra del paciente, con otra muestra, o entre muestras de diferentes fuentes.
La sonda y/o los cebadores se marcan tfpicamente con una molecula o sustancia detectable, tal como una molecula fluorescente, una molecula radiactiva o cualquier otro marcador conocido en la tecnica. Se conocen en la tecnica marcadores que generalmente proporcionan (directa o indirectamente) una senal. El termino "marcado" pretende abarcar marcaje directo de la sonda y cebadores por acoplamiento (es decir, uniendo ffsicamente) una sustancia detectable, asf como marcaje indirecto por reactividad con otro reactivo que esta marcado directamente. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen, aunque sin limitacion, agentes radiactivos o un fluoroforo (por ejemplo, isotiocianato de fluorescema (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5)).
El valor de referencia puede determinarse como se describe anteriormente y dependera del acido nucleico para el que se requiere la determinacion del nivel de expresion para concluir que el embrion alberga una anomalfa genetica o una secuencia espedfica de acido nucleico.
Los metodos divulgados en este documento son particularmente adecuados para alcanzar una decision clmica. En particular, el metodo como se describe anteriormente, por tanto, ayudara al embriologo a evitar la transferencia al utero de embriones con un bajo potencial de resultado de embarazo. El metodo como se describe anteriormente es tambien particularmente adecuado para evitar embarazos multiples seleccionando el embrion competente que puede dar lugar a un implante y un embarazo y, por lo tanto, podnan transferirse menos embriones en cada ciclo, produciendo una incidencia disminuida de embarazados multiples.
Los metodos divulgados en este documento son particularmente adecuados para potenciar el resultado de embarazo de un bebe con un riesgo mmimo de tener una anomalfa genetica. En este documento se describe ademas un kit para realizar los metodos como se describe anteriormente, en el que dicho kit comprende un medio para determinar el nivel de acido nucleico sin celulas y/o un medo para determinar el nivel de expresion de al menos un acido nucleico espedfico y/o un medio para detectar al menos una mutacion, un SNP o una secuencia espedfica en la extraccion de acido nucleico. Tfpicamente, los kits incluyen sondas, micromatrices de cebadores y micromatrices como se describe anteriormente. Por ejemplo, el kit puede comprender un conjunto de sondas como se define anteriormente, y que pueden estar premarcadas. Como alternativa, las sondas pueden estar sin marcar y los ingredientes para el marcaje pueden incluirse en el kit en recipientes diferentes. El kit puede comprender ademas reactivos de hibridacion u otros reactivos envasados adecuadamente y materiales necesarios para el protocolo de hibridacion particular, incluyendo matrices en fase solida, si fuera aplicable, y patrones. Como alternativa, el kit puede comprender cebadores de amplificacion (por ejemplo, cebadores de tallo-bucle) que pueden estar premarcados o pueden contener un resto de purificacion por afinidad o adhesion. El kit puede comprender ademas reactivos de amplificacion y tambien otros reactivos envasados adecuadamente y materiales necesarios para el protocolo de amplificacion particular.
La invencion se ilustrara ademas por las siguiente figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invencion, que esta limitada unicamente por la reivindicacion adjunta.
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Descripcion de las figuras
Figura 1: Concentraciones de ADNsc en medio de cultivo de varios embriones de dos pacientes en el dia 3.
Figura 2: Concentraciones de ADNsc en medio de cultivo de varios embriones de 9 pacientes en el dia 5/6.
Figura 3: Concentraciones de ADNsc en medio de cultivo de varios embriones de dos pacientes en el
dia 3 y dia 5. Histograma oscuro, concentracion D5/6. Histograma transparente, concentracion D3.
Figura 4A: Diferencia de las concentraciones de ADNsc entre el dia 3 y el dia 5/6 respecto al grado del embrion. Histogramas de la serie 1, concentracion D3-D5/6 (ng/ml de ADNsc); histogramas de la serie 2, clasificacion respecto al grado de crecimiento (1-10). Valores de concentracion de ADNsc obtenidos en la serie del embrion del paciente de HSC.
Figura 4B: Concentraciones de ADNsc respecto al grado del embrion. Histogramas de la serie 1, concentracion dfa 5/6 (ng/ml de ADNsc), histogramas de la serie 2, clasificacion respecto al grado de crecimiento (1 a 10). Valores de concentracion de ADNsc obtenidos en la serie del embrion del paciente de HSC.
Figura 5: Relacion entre el ADNsc en medio de cultivo y resultado de embarazo. Histogramas que comparan la cantidad de ADNsc media en medio de cultivo de embriones en el dfa 5/6 emitido de pacientes con embarazo positivo y pacientes con embarazo negativo.
Figura 6A y 6B: Los histogramas muestran los valores de senal de la micromatriz para genes en ovario, testiculos, ovocitos MII, embriones del dia 3, blastocistos del dia 5/6, muestras de trofectodermo y endometrio. Los datos de la micromatriz de ovocitos MII, embriones del dfa 3, blastocistos del dfa 5/6, muestras de trofectodermo y endometrio se obtuvieron de nuestro equipo y los de muestras de ovario y testiculos se obtuvieron del Gene Expression Omnibus (GEO) mediante los numeros de acceso provisionales (GPL570).
Ejemplo:
Material y metodos Procedimiento IVF
Las mujeres se sometieron a un tratamiento con hormona liberadora de gonadotropina (Gn-RH) largo o protocolos con antagonista, que estuvieron seguidos por estimulacion del ovario por hMG (gonadotropina menopausica humana) u hormona foliculoestimulante (FSH) recombinante. Cuando al menos tres folfculos alcanzaron un diametro medio de 17 mm en examen por ultrasonido transvaginal, se administraron 5000 IU de hCG. Despues, 36 h mas tarde los ovocitos se recuperaron por puncion transvaginal guiada por ultrasonido. Se uso IVF o ICSI convencional como se indica. La fertilizacion se confirmo 16 a 20 h despues de la inseminacion de los ovocitos o microinyeccion por la presencia de dos pronucleos distintos en cuerpos de dos polos + en microscopio invertido. Los cigotos entonces se colocaron individualmente en gotas de 30 pl recientes de medio de cultivo (G1.5, Vitolife, Suecia) cubiertas con aceite mineral y se mantuvieron en incubadora Tri-gas, que proporciona un entorno de oxfgeno al 5 %. Todos los embriones se cultivaron en gotas individuales en todo momento. Los embriones se colocaron en medio de cultivo extendido y se continuo hasta el dfa 5. Se uso medio G2.5 (Vitolife, Suecia) para cultivo extendido.
Cuantificacion del ADNsc en medio de cultivo
Muestreo de medio de cultivo de embriones
Despues de retirar los embriones, el medio de cultivo se coloco individualmente en crioviales marcados y despues se marcaron de nuevo con un numero de acceso asignado aleatoriamente. Las muestras recogidas se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80 °C. Tambien se recogio una muestra de control incubada en las mismas condiciones sin un embrion. Pueden muestrearse hasta 50 pl del medio de cultivo.
Extraccion de ADNsc
Para muestras del dfa 3 o dfa 5/6, el volumen inicial de 30 pl se completo hasta 200 pl con 170 pl de PBS IX. Para las muestras D5, el volumen inicial de 10 pl se completo hasta 200 pl con 190 pl de PBS IX. Posteriormente, las muestras se manipularon inmediatamente para la extraccion del ADN. Se extrajo ADNsc de 200 pl de la muestra usando el minikit de sangre de ADN QIAmp (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el "protocolo de sangre y lfquido corporal". Las muestras de ADN se mantuvieron a -20 °C hasta su uso.
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Cuantificacion de ADNsc por Q-PCR
La metodologfa y la descripcion de los datos se realizo de acuerdo con las directrices MIQE. Se realizaron amplificaciones por q-PCR al menos por duplicado en un volumen de reaccion de 25 pl en un sistema de deteccion de PCR en tiempo real CFX 96™ usando el programa informatico CFX manager ™ (Bio-Rad, Hercules, CA). Cada mezcla de PCR estaba compuesta de 12,5 pl de mezcla de PCR (Bio-Rad Supermix SYBR Green), 2,5 pl de cada cebador de amplificacion (0,3 pmol/pl), 2,5 pl de agua analizada por PCR y 5 pl de extracto de ADN. El termociclado consistfa en tres etapas repetidas: una etapa de activacion-desnaturalizacion con polimerasa de punto caliente de 3 minutos a 95 °C seguida por 40 ciclos repetidos de 95 °C durante 10 segundos y despues a 60 °C durante 30 segundos. Se obtuvieron curvas de fusion aumentando la temperatura de 55 a 90 °C con un lector de placa cada 0,2 °C. Se usaron diluciones en serie de ADN genomico de celulas de placenta humana (Sigma, Munich, Alemania) como patron para la cuantificacion y su concentracion y calidad se evaluaron usando un fluonmetro Qubit® 2.0 (Life Technologies). Cada ejecucion de Q-PCR comprendfa controles negativos y positivos rutinarios de calidad. Cada muestra se analizo por triplicado y cada ensayo se repitio al menos una vez. Las concentraciones de ADNsc obtenidas se normalizaron a la concentracion precisa usando la curva patron. El coeficiente de variacion del valor de concentracion debido a la extraccion de ADNsc y el analisis de Q-PCR se calculo como un 24 % a partir de dos experimentos (n = 12). La cuantificacion de ADNsc en las muestras y la realizacion de la curva patron se realizaron usando los sistemas de cebador descritos en la tabla 1(KRAS B1 inv k con sentido: SEQ ID NO: 1; y KRAS B2 inv k antisentido: SEQ ID NO: 2). El valor de concentracion determinado por el ensayo muestra un coeficiente de variacion de un 24 %.
Tabla 1: Cebadores Intplex para cuantificacion de ADNsc
_ Nombre del cebador Secuencia de direccion 5-3' Tm (°C) Tamano del amplicon
Especie Gen
v_________________Intplex___________________________________________(pb) 67_____________
Humana Kras KRAS B1 inv k con sentido CCTTGGGTTTCAAGTTATATG 54,0 67
Humana Kras KRAS B2 inv k antisentido CCCTGACATACTCCCAAGGA 59,4
Diseno del cebador
Las secuencias y caractensticas de los cebadores seleccionados se presentan en la tabla 1. Los cebadores se disenaron usando el programa informatico Primer 3 y todas las secuencias se comprobaron para la hibridacion automolecular o intermolecular con el programa informatico de plegamiento de acido nucleico (mfold y oligoAnalyzer 1.2). se realizaron analisis de alineacion local con el programa BLAST para confirmar la especificidad de los cebadores disenados. Los oligonucleotidos se sintetizaron y purificaron en cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento (HPLC) por Eurofins (Ebersberg, Alemania) y se realizo control de calidad de los oligonucleotidos por ionizacion por desorcion con laser asistido por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF).
El sistema de Q-PCR se diseno para que pudiera cuantificar una secuencia presente de dos copias del genoma humano. Posibilita la cuantificacion altamente espedfica y sensible de esta secuencia en un alelo. La mayor especificidad se obtiene usando alelo espedfico con PCR bloqueante usando los mismos cebadores (Mouliere 2011). Este metodo permite distinguir dos secuencias que tienen unicamente una diferencia de un nucleotido con una relacion de mutante/WT de 0,005. Por tanto, detectar y cuantificar una secuencia espedfica puede corresponder a distinguir una secuencia WT frente a secuencias con una diferencia de unos pocos nucleotidos hasta una diferencia de unicamente un nucleotido tal como en ciencias con una mutacion puntual o un SNP. Por lo tanto, la demostracion de la cuantificacion de ADNsc en medio de cultivo de embriones como se muestra en esta ocasion muestra el potencial de este metodo para detectar la presencia de una mutacion de un unico nucleotido, SNP, u otras alteraciones geneticas.
Pueden obtenerse valores de concentracion mayores cuando se abordan secuencias repetidas en el genoma nuclear tal como las secuencia line o secuencias mitocondriales.
Resultados
Deteccion de ADNsc en medio de cultivo de embriones
La secuencia abordada tiene 2 copias por genoma del nucleo de celula diploide. El ADNsc podna detectarse significativamente en medio de cultivo de embriones en D3 o D5/6 (figura 1). El ensayo puede detectar hasta 1,5 ng/ml de medio y, por tanto, se encontro un mmimo de 2 copias GE en el medio de cultivo. Se observo hasta 27 ng/ml de ADNsc o 36 GE en medio de cultivo D5/6 (figura 2). Observese que esos numeros pueden ser relevantes para el desarrollo del embrion. Por tanto, estos datos revelan la posibilidad de la deteccion de la presencia de una secuencia de ADN espedfica (como mucho 2 copias por celulas diploide) y, por lo tanto, la presencia potencial de alteracion genetica o epigenetica homocigotica o heterocigotica. El ADNsc podna detectarse significativamente en todas las muestras y para cada paciente (figura 2).
Hay intra e intervariacion significativa (1 Log) entre muestras, que refuerza que la nocion de la dinamica de medicion posibilita la comparacion entre muestras (figura 3).
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Relacion entre ADNsc y resultado de embrion in vitro
La relacion entre el contenido ADNsc del medio de cultivo de embriones y el desarrollo del embrion in vitro tambien se investigo:
La concentracion de ADNsc determinada en D3 y D5/6 podna compararse en medio de cultivo de 11 embriones. Como se muestra en la figura 4A, los valores de la diferencia de la concentracion de ADNsc entre D3 y D5/6 son crecientes respectivamente con el buen desarrollo del embrion evaluado por criterios morfologicos. Como se presenta en la figura 4B, los valores de concentracion de ADNsc son inversamente proporcionales al buen desarrollo del embrion. Por tanto, tanto la disminucion de la concentracion de ADNsc D5/6 como la concentracion D3-D5/6 aparecen como un marcador del desarrollo embrionario in vitro.
El ADNsc aislado de medio de cultivo de embriones que se desarrollo en embrion de 8 celulas de buena calidad en el dfa 3 y que da lugar a la fase de blastocisto en el dfa 5/6 se selecciono y dividio en 3 grupos: i) ADNsc de embrion en el dfa 3 que se desarrollo en blastocisto de buena calidad en el dfa 5/6 (grado 4AA, 4AB o 4BA, 5AA, 5AB o 5BA) y que da lugar a embarazo, ii) ADNsc de embrion en el dfa 3 desarrollado en blastocisto de calidad intermedia en el dfa 5/6 (grado 4BB o 5 BB), iii) ADNsc de embrion en el dfa 3 desarrollado en blastocisto de mala calidad en el dfa 5/6 (grado 4CC o 5CC) (vease la tabla 2 para el paciente de HSC). La cantidad de ADNsc en medio de cultivo del embrion en el dfa 3 que se desarrollo en blastocisto de buena calidad en dfa 5/6 (grado 4AA, 4AB, 4BA) y que da lugar a embarazo fue 22,16 ng/ml y 2,75 ng/ml en el dfa 3 y en el dfa 5/6, respectivamente (88 % de disminucion). La variacion del valor de ADNsc entre el dfa 3 y el dfa 5/6 disminuyo hasta 7,55 ng/ml y 1,80 ng/ml (76 % de disminucion) en el grado intermedio y hasta 6,46 ng/ml (dfa 3) y 3,78 (dfa 5/6) (41 % de disminucion) en el blastocisto que no es de buena calidad (tabla 3). De forma interesante, esta variacion es muy baja en el embrion lisado de 8,36 ng/ml (dfa 3) y 5,57 (dfa 5/6) (33 % de disminucion). Adicionalmente, las cantidades de ADNsc en el medio de cultivo de embriones en el dfa 5/6 se evaluaron de acuerdo con el resultado del paciente. Se muestra que el ADNsc era mayor en medio de cultivo de embriones en el dfa 5/6 de pacientes sin embarazo que de pacientes con embarazo (figura 5).
El ADNsc en medio de cultivo de embriones podria usarse para detectar embriones masculinos
Podnan usarse genes tales como TSPY1 (protema espedfica de testfculo, 1 ligada a Y) y RPS4Y1 (protema ribosomica S4, 1 ligada a Y) para revelar el genero del embrion. Esto abre una estrategia apropiada para cribar embriones de parejas que se sabe que estan en riesgo de una enfermedad ligada al X. Los chips de micromatriz Affymetrix HG-U133P de oligonucleotidos de alta densidad se usaron para investigar la expresion de TSPY1 y RPS4Y1 en muestras XX y XY. Nuestros resultados revelan que TSPY1 y RPS4Y1 pueden demostrar ser biomarcadores valiosos de la determinacion del genero del embrion por amplificacion de las multiples copias de estos genes (ADNsc) en el medio de cultivo de embriones (figura 6A y 6B). Los metodos pueden aplicables a otros genes ubicados en el cromosoma Y: DDX3Y (polipeptido 3 de secuencia DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp), ligado a Y), EIF1AY (traduccion eucariota) y gen del cromosoma Y (SRY).
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1. Un metodo in vitro no invasivo para determinar la calidad de un embrion, que comprende las etapas que consisten en:i) proporcionar una muestra del medio de cultivo donde el embrion se ha cultivado, preparandose dicha muestra cuando el embrion ha alcanzado la fase de blastocisto que corresponde al dfa 5 o 6 del desarrollo del embrion;ii) extraer acidos nucleicos sin celulas de la muestra;iii) determinar la concentracion de acidos nucleicos sin celulas en la extraccion de acido nucleico;10 iv) comparar la concentracion determinada en la etapa iii) con un valor de referencia, correspondiendo dichovalor de referencia a la concentracion de los acidos nucleicos medida en un medio de cultivo en el dfa 3 de desarrollo del embrion; yv) concluir que el embrion es competente cuando la concentracion determinada en la etapa i) es inferior al valor de referencia.15I c.inSij
imagen1 8U03-0U-8U*29l.eZH3ZBJnSi jimagen2 8U03-0U-8UVZQIZLV13Figura 3Concentracion de ADNsc en e! dfa 3 y 5 de HSCimagen3 □ Serie 1 ■ Serie 226imagen4 Figura 5- Dia 5
- Paciente
- ADNsc (ng/ml) Embarazo
- HSC
- ?,75 Si
- BT
- 0,993 Si
- AGG
- 11,4 Si
- GS
- IS, 5 7 No
- MMB
- 13,16 No
- LA
- IS,98 No
Cantidad media de ADNscimagen5 Embarazoimagen6 Sin embarazoFigura 6ANJOTSPY1imagen7 Expresion por Affymetrix80006000400020000imagen8
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