ES2891337T3 - Métodos no invasivos para evaluar la integridad genética de células troncales pluripotentes - Google Patents
Métodos no invasivos para evaluar la integridad genética de células troncales pluripotentes Download PDFInfo
- Publication number
- ES2891337T3 ES2891337T3 ES16763789T ES16763789T ES2891337T3 ES 2891337 T3 ES2891337 T3 ES 2891337T3 ES 16763789 T ES16763789 T ES 16763789T ES 16763789 T ES16763789 T ES 16763789T ES 2891337 T3 ES2891337 T3 ES 2891337T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- pluripotent stem
- cells
- cell
- stem cells
- genetic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 80
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 56
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 claims abstract description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 46
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 31
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 claims description 4
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims 1
- -1 acids nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 30
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 19
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 17
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 11
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 5
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 5
- 238000003491 array Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 5
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 5
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 4
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 3
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 208000035719 Maculopathy Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000027073 Stargardt disease Diseases 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 208000011325 dry age related macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 238000013160 medical therapy Methods 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 208000037068 Abnormal Karyotype Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108091061744 Cell-free fetal DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000037051 Chromosomal Instability Diseases 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000012594 Earle’s Balanced Salt Solution Substances 0.000 description 1
- 201000006360 Edwards syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009928 Patau syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 101710205841 Ribonuclease P protein component 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100033795 Ribonuclease P protein subunit p30 Human genes 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091032917 Transfer-messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010063092 Trisomy 12 Diseases 0.000 description 1
- 206010044686 Trisomy 13 Diseases 0.000 description 1
- 208000006284 Trisomy 13 Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000007159 Trisomy 18 Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000004791 biological behavior Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008668 cellular reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002854 epidermolysis bullosa simplex superficialis Diseases 0.000 description 1
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000007672 fourth generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 230000037442 genomic alteration Effects 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 210000000661 isochromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 208000030454 monosomy Diseases 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004457 myocytus nodalis Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003129 oil well Substances 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 206010053884 trisomy 18 Diseases 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Método no invasivo in vitro para determinar la calidad de una célula troncal pluripotente humana o de una célula diferenciada derivada de la misma que comprende las etapas de: i) proporcionar una muestra de cultivo en la que crecen las células troncales, ii) extraer los ácidos nucleicos a partir del sobrenadante de cultivo, e iii) determinar la presencia y/o el nivel de por lo menos una anomalía genética en la extracción de ácidos nucleicos, en el que dicha etapa iii) comprende las etapas de i) determinar la presencia de por lo menos una secuencia hiperrecurrente seleccionada de la tabla 1 en la extracción de ácidos nucleicos, e ii) concluir que las células troncales pluripotentes portan una anomalía genética cuando se detecta por lo menos una secuencia hiperrecurrente.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos no invasivos para evaluar la integridad genética de células troncales pluripotentes
Campo de la invención
La presente invención se refiere de manera general al campo de la medicina regenerativa. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos no invasivos y kits para la determinación de la calidad de las células troncales (“stem”) pluripotentes. Más específicamente, la presente exposición se refiere a métodos no invasivos y kits para la evaluación de la integridad genética de las células troncales pluripotentes en cultivo.
Antecedentes de la invención
La investigación en células troncales pluripotentes humanas (hPSC) ofrece nuevas herramientas para ayudar a comprender y tratar las enfermedades que afectan a diversos tipos celulares en el cuerpo mediante la producción de células humanas para el trasplante o para permitir la identificación de fármacos. Las PSC (aisladas a partir de la masa celular interna de embriones descartados, es decir, células troncales embrionarias humanas (hESC), o derivadas de células diferenciadas, es decir, células troncales pluripotentes inducidas (iPSC)) presentan la notable capacidad de expandirse rápidamente. A nivel práctico, lo anterior implica que pueden generarse suficientes células para preparar miles, e incluso cientos de miles, de dosis celulares terapéuticas a partir de una línea celular. Se han llevado a cabo, o actualmente se están llevando a cabo, varios ensayos clínicos que utilizan derivados diferenciados de hESC. Geron Corporation (NCT01217008) ha sometido a ensayo la seguridad de las células oligodendrocíticas derivadas de hESC en pacientes con lesión de la médula espinal. Advanced Cell Technology (ACT) ha sometido a ensayo la seguridad de la terapia de células epiteliales pigmentarias retinianas (RPE) derivadas de hESC para la distrofia macular de Stargardt (SMD) (ensayo de EE.UU.: NCT01345006; ensayo del Reino Unido: NCT01469832; ensayo de Corea: NCT01625559) y para la degeneración macular asociada a la edad seca (ensayo de EE.UU.: NCT01344993; ensayo de Corea: NCT01674829). Viacyte está sometiendo a ensayo la seguridad y eficacia de las células productoras de insulina en sujetos con diabetes mellitus de tipo 1 (ensayo de EE.UU.: n Ct 02239354). Philippe Ménasché ha empezado a someter a ensayo (NCT02057900) el trasplante de progenitores derivadas de células troncales embrionarias humanas en insuficiencia cardíaca grave. Pfizer (NCT01691261) está investigando la seguridad de utilizar células retinianas trasplantadas derivadas de hESC para tratar pacientes con enfermedad de Stargardt avanzada. Finalmente, un estudio recientemente iniciado en Japón, realizado por Masayo Takahashi, el Instituto RIKEN, está sometiendo a ensayo la seguridad del trasplante de láminas de células de epitelio pigmentario retiniano (RPE) derivadas de células troncales pluripotentes inducidas autólogas (iPSC) en pacientes con degeneración macular asociada a la edad (AMD) exudativa (de tipo húmedo).
La totalidad de dichos ensayos clínicos revelan que el potencial biomédico es enorme, aunque siguen sin resolverse varias cuestiones prácticas. Uno de los mayores problemas son las anomalías genéticas.
Las anomalías genéticas son un grave problema para la utilización de hPSC en medicina regenerativa. En el caso de que los clones de hPSC muestren anomalías genéticas, dichas células y su progenie diferenciada podría no replicar fielmente la fisiología normal de los tejidos adultos e incluso podría constituir un riesgo para la utilización de dichas células en un contexto clínico. De esta manera, resulta obligatorio determinar la causa y extensión de las anomalías genéticas en dichas células. Las aberraciones genéticas pueden clasificarse en dos categorías: las inducidas por el cultivo celular y las inducidas por un proceso de reprogramación celular.
Las ESC humanas son cariotípicamente normales en origen; sin embargo, pueden aparecer clones de hESC aneuploides durante el cultivo celular. Desde 2004, varios estudios han informado de que las condiciones de cultivo utilizadas para amplificar las hPSC no diferenciadas presentan un impacto significativo sobre la estabilidad cromosómica. Dichas anomalías cromosómicas con frecuencia son recurrentes. Se han detectado con frecuencia ganancias de los cromosomas 12 (más frecuentemente 12p), 17 (particularmente 17q), 20 o X mediante la utilización de procedimientos citogenéticos estándares (formación de bandas G) (Draper et al., 2004). Un amplio estudio de 40 líneas de hESC en las que se analizaron 1163 cariotipos concluyó que 12,9% del cultivo de hESC mostraba aberraciones cromosómicas (Taapken et al., 2011). Durante los últimos cinco años, la resolución para la detección de alteraciones genómicas se ha mejorado con tecnologías basadas en matrices (también denominados cariotipos virtuales). La hibridación genómica comparativa basada en matrices (aCGH) o matrices de polimorfismos de nucleótido único (SNP) han permitido la identificación de aberraciones genómicas de tamaño pequeño y han revelado que la frecuencia de alteraciones del ADN en las hPSC podría ser incluso más elevada de lo que se creía anteriormente (Laurent et al., 2011; Narva et al., 2010). Entre dichos cambios cromosómicos de pequeño tamaño, se ha identificado una variante de número de copia recurrente (CNV) situado en el cromosoma 20q11.21 (Lefort et al., 2008; Spits et al., 2008). La región de 20q11.21 también se amplifica en una diversidad de cánceres. Además, se ha mostrado que la adquisición de 20q11.2 se produce en un estadio temprano del cáncer de cuello uterino. Las mutaciones puntuales también contribuyen al proceso de adaptación. Más recientemente, la resecuenciación de exomas completos o genomas completos ha proporcionado una resolución sin precedentes para identificar las mutaciones de un único par de bases en las hPSC (Cheng et al., 2012; Funk et al., 2012; Gore et al., 2011). La generación de iPS mediante reprogramación celular abre un camino a otras potenciales fuentes de mutación.
Algunos análisis detallados, mediante la utilización de micromatrices de CGH (Martins-Taylor and Xu, 2010; Pasi et al., 2011), micromatrices de SNP (Hussein et al., 2011; Laurent et al., 2011) o técnicas de secuenciación de nueva generación (Gore et al., 2011; Ji et al., 2012) sugieren que se producen anomalías más sutiles, tales como variantes de número de copia (CNV) y mutaciones, a una frecuencia mucho más elevada de la que se creía anteriormente. Sin embargo, es motivo de mucha polémica cuál es la carga exacta de mutaciones inducida por la reprogramación celular (Bai et al., 2013). Sin embargo, las hiPS también pueden acumular alteraciones genéticas durante el cultivo celular. Kristen Martins-Taylor et al., Nature Biotechnology, vol. 29, n° 6, 1 de junio de 2011, páginas 488 a 491, se refieren a variaciones de número de copia recurrentes en células troncales pluripotentes inducidas humanas.
Estas anomalías genéticas son un grave problema debido a que cualquier mutación del ADN puede ser una etapa en un proceso de transformación maligna. Además, algunas anomalías son altamente recurrentes, lo que sugiere una fuerte presión selectiva mediada por un incremento de la supervivencia celular o de la proliferación celular o por el bloqueo de la diferenciación. Dichas modificaciones funcionales pueden incrementar la susceptibilidad de las PSC a la transformación maligna y alterar sus propiedades terapéuticas esperadas.
La integridad del ADN de las células troncales pluripotentes se evalúa principalmente mediante análisis del cariotipo. Se han sometido a ensayo otros enfoques para superar las evidentes limitaciones de resolución de las técnicas de cariotipado clásicas, por ejemplo las matrices de CGH o las micromatrices de SNP; sin embargo, no hay consenso sobre el método que se debe utilizar para discriminar entre las mutaciones realmente preocupantes, que posiblemente son carcinógenas, y las modificaciones del ADN con prácticamente ningún impacto, o ningún impacto en absoluto, sobre el comportamiento biológico de las PSC, o los simples polimorfismos. Debido a que las tecnologías de secuenciación del ADN y su resolución (mapas genómicos completos a la resolución de bases individuales) han mejorado muy rápidamente y su precio se está reduciendo rápidamente, los presentes inventores pueden prever que un día el análisis rutinario diario de las PSC se basará en la secuenciación de genomas completos. Sin embargo, cada una de dichas técnicas adolece de fuertes limitaciones. Por ejemplo, la técnica de cariotipado clásica es laboriosa, requiere el conocimiento experto de un citogenetista y no puede detectar anomalías de menos de 5 Mb de longitud. Los enfoques basados en micromatrices requieren una instalación básica y bioinformáticos dedicados para el análisis. Finalmente, las técnicas de secuenciación de alto rendimiento tales como NGS todavía no han sido optimizadas para dicho uso y el tiempo necesario para procesar los datos es largo y además requiere de bioinformáticos.
Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de métodos rápidos, económicos y no invasivos (que no destruyan las células), capaces de detectar las anomalías más recurrentes en las hPSC.
Sumario de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones independientes. La presente exposición se refiere a métodos no invasivos y kits para la determinación de la calidad de las células troncales pluripotentes.
La presente exposición se refiere además a métodos no invasivos y kits para la evaluación de la integridad genética de las células troncales pluripotentes en cultivo.
Descripción detallada de la invención
Las células troncales pluripotentes (PSC), que se perpetúan por autorrenovación pero que son capaces de diferenciarse en células maduras de tejidos particulares, son herramientas clave para la medicina regenerativa. La medicina regenerativa es una definición amplia de las innovadoras terapias médicas que permiten al cuerpo repararse, sustituir, restaurar y regenerar células, tejidos y órganos daños o enfermos. Sin embargo, el cultivo celular puede resultar en anomalías epigenéticas y genéticas que podrían alterar las propiedades de las células troncales o predisponerlas a la formación de tumores. Con la rápida expansión del uso de las PSC en la clínica, es el momento de mejorar las herramientas de caracterización de las células troncales pluripotentes (PSC) durante la expansión celular y antes de la liberación de un lote.
Los inventores han determinado que existe un grupo de "secuencias hiperrecurrentes" en las células troncales pluripotentes humanas (hPSC) que son biomarcadores de la inestabilidad de las hPSC en cultivo (tabla 1) y proponen un ensayo rápido y fácil de realizar que puede utilizarse para evaluar rutinariamente las células troncales durante el cultivo y antes del uso clínico.
Tabla 1: lista de las 40 secuencias hiperrecurrentes.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente exposición se refiere a un método no invasivo in vitro para la determinación de la calidad de las células troncales pluripotentes, que comprende las etapas de: i) proporcionar una muestra de cultivo en la que se cultivan las células troncales pluripotentes, ii) extraer ácidos nucleicos de la muestra y iii) determinar la presencia y/o nivel de por lo menos una anomalía genética en los ácidos nucleicos extraídos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula troncal pluripotente" o "PSC" presenta su significado general en la técnica y se refiere a una célula pluripotente tal como una célula troncal embrionaria (ESC) y a una célula troncal pluripotente inducida (iPSC), que es capaz de diferenciarse en cualquier tipo celular en el cuerpo humano. El término "pluripotente" se refiere a una célula que es capaz de diferenciarse en una de entre una pluralidad de diferentes tipos celulares, aunque no necesariamente todos los tipos celulares. Entre las células utilizadas en la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, cardiomiocitos y progenitores de los mismos, células progenitoras neurales, células de los islotes pancreáticos, particularmente células p pancreáticas, células troncales y progenitoras hematopoyéticas, células troncales mesenquimatosas y células satélite musculares. El método de la invención es aplicable a las células troncales pluripotentes, aunque también es aplicable a otras células troncales, células germinales o somáticas (por ejemplo, células troncales mesenquimatosas (MSC), ovocitos, embriones, fibroblastos, etc.).
La expresión "determinar la calidad de la célula troncal pluripotente" se refiere a que el método de la invención presenta el objetivo de determinar si la célula troncal pluripotente porta una anomalía genética o una secuencia específica en el contexto de la medicina regenerativa. El método de la invención permite la evaluación de la integridad genética y la estabilidad genética de la célula troncal pluripotente en cultivo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anomalía genética" se refiere a cualquier suceso que puede producirse en el genoma de una célula troncal individual y pluripotente que puede dar lugar a que cause
una enfermedad fenotípica y letalidad. Entre las anomalías genéticas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, trisomía, traslocación, cuadrisomía, aneuploidía, aneuploidía parcial, monosomía, anomalía cariotípica, cromosoma isodicéntrico, isocromosoma, inversión, inserción, duplicación, variación del número de copia (CNV), traslocación cromosómica, variación de un solo nucleótido (SNV) y pérdida de heterocigosidad (LOH). Típicamente, la expresión "anomalía genética" se refiere a secuencias hiperrecurrentes, tales como las indicadas en la tabla 1.
La expresión "muestra de cultivo" se refiere a sobrenadante de cultivo, medio de cultivo y células en suspensión en el cultivo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ácido nucleico" presenta su significado general en la técnica y se refiere a una secuencia nucleica codificante o no codificante. Entre los ácidos nucleicos se incluyen el ADN (ácido desoxirribonucleico) y el ARN (ácido ribonucleico). Entre los ejemplos de ácidos nucleicos se incluyen, de esta manera, ADN, ARNm, ARNt, ARNtm, ARNmi, ARNpi, ARNsno y ARNsn. La expresión "ácidos nucleicos" se refiere además a ácidos nucleicos libres (fNA) (originados en el núcleo de las células o en el compartimiento mitocondrial de las células), tal como ADN libre celular, moléculas de ARN libres, microARN y ARN no codificante largo. La expresión "ácido nucleico libre" se refiere a que el ácido nucleico resulta liberado por las células troncales pluripotentes y se encuentra presente en el medio de cultivo en el que se cultivan las células troncales pluripotentes.
El experto en la materia puede utilizar cualesquiera métodos bien conocidos de la técnica para extraer el ácido nucleico celular libre a partir de la muestra preparada. Por ejemplo, puede utilizarse el método indicado en el ejemplo.
En una forma de realización particular, el método de la invención comprende las etapas de i) determinar la presencia de por lo menos una secuencia hiperrecurrente en la extracción de ácidos nucleicos, y ii) concluir que las células troncales pluripotentes portan una anomalía genética en el caso de que se detecte por lo menos una secuencia hiperrecurrente.
Típicamente, pueden seleccionarse, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 secuencias hiperrecurrentes de la tabla 1.
La determinación de la presencia y nivel de secuencia hiperrecurrente en la extracción de ácidos nucleicos pueden llevarse a cabo mediante una diversidad de técnicas bien conocidas de la técnica. En una forma de realización particular, puede llevarse a cabo PCR digital en gotas, "ddPCR", para determinar la presencia y el nivel de secuencias hiperrecurrentes en la extracción de ácidos nucleicos. ddPCR se refiere a un método o dispositivo utilizado en el mismo que permite la cuantificación de las secuencias de ADN en un sobrenadante o medio de cultivo.
La determinación de la presencia y el nivel de secuencias hiperrecurrentes en la extracción de ácidos nucleicos también puede llevarse a cabo mediante técnicas tales como Fluidigm, PCR cuantitativa, secuenciación de extremos apareados de alto rendimiento, secuenciación de nueva generación y electroforesis capilar.
Entre las técnicas típicas para detectar una secuencia hiperrecurrente en un ácido nucleico, en particular ADN o ARNm, se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, polimorfismo de longitudes de fragmentos de restricción, técnicas de hibridación, secuenciación, resistencia a exonucleasas, microsecuenciación, extensión en fase sólida utilizando ddNTP, extensión en solución utilizando ddNTP, ensayos de oligonucleótidos, métodos para detectar polimorfismos de nucleótidos únicos, tales como la hibridación específica de alelos dinámica, la reacción en cadena de ligación, la minisecuenciación, los "chips" de ADN, la hibridación de oligonucleótidos específicos de alelos con sondas de marcaje único o doble combinada con PCR o con balizas moleculares, y otras.
Típicamente, se detectan secuencias hiperrecurrentes después de la amplificación. Por ejemplo, el ARN aislado puede someterse a transcripción inversa y amplificación acopladas, tal como transcripción inversa y amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), utilizando cebadores oligonucleótidos específicos que son específicos de una secuencia hiperrecurrente o que permiten la amplificación de una región que contiene la secuencia hiperrecurrente. Según una primera alternativa, pueden seleccionarse condiciones para la hibridación de cebadores a fin de garantizar la transcripción inversa específica (en caso apropiado) y la amplificación, de manera que la aparición de un producto de amplificación sea diagnóstica de la presencia de una secuencia hiperrecurrente particular. Por el contrario, el ARN puede transcribirse inversamente y amplificarse, o el ADN puede amplificarse, seguido de la detección de una secuencia hiperrecurrente en la secuencia amplificada mediante hibridación con una sonda adecuada o mediante secuenciación directa, o cualquier otro método apropiado conocido de la técnica. Por ejemplo, puede clonarse un ADNc obtenido a partir de ARN y secuenciarse para identificar una secuencia hiperrecurrente.
En particular, la secuenciación representa una técnica ideal que puede utilizarse en el contexto de la presente invención. Al experto en la materia le resultarán familiares varios métodos para la secuenciación de polinucleótidos.
Entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, la secuenciación de Sanger (también denominada secuenciación dideoxi) y diversos métodos de secuenciación mediante síntesis (SBS), según la revisión de Metzger (Metzger ML., Genome Research, 1767, 2005), la secuenciación mediante hibridación, mediante ligación (por ejemplo, el documento n° WO 2005/021786), mediante degradación (por ejemplo, las patentes US n° 5.622.824 y n° 6.140.053) y la secuenciación por nanoporos. Preferentemente, resulta preferida la secuenciación profunda en un ensayo multiplex. La expresión "secuenciación profunda" se refiere a un método de secuenciación de una pluralidad de ácidos nucleicos en paralelo. Ver, por ejemplo, Bentley et al., Nature 456:53-59, 2008. Las plataformas disponibles comercialmente principales, producidas por Roche/454 (Margulies et al., 2005a), Illumina/Solexa (Bentley et al., 2008), Life/APG (SoLiD) (McKernan et aL., 2009) y Pacific Biosciences (Eid et al., 2009) pueden utilizarse para la secuenciación profunda. Por ejemplo, en el método 454, el ADN que debe secuenciarse se fracciona y se suministra con adaptadores o segmentos de ADN que pueden amplificarse por PCR mediante la utilización de cebadores que contienen los adaptadores. Los adaptadores son nucleótidos 25-meros requeridos para la unión a las perlas de captura de a Dn y para la hibridación de los cebadores de amplificación en la PCR en emulsión y el cebador de secuenciación. Los fragmentos de ADN se convierten en monocatenarios y se unen a perlas de captura de ADN de una manera que permite la unión de solo un fragmento de ADN a una perla. A continuación, las perlas que contienen el ADN se emulsionan en una mezcla de agua-en aceite, resultando en microrreactores que contienen únicamente una perla. Dentro del microrreactor, el fragmento se amplifica por PCR, resultando en un número de copia de varios millones en cada perla. Después de la PCR, se rompe la emulsión y las perlas se cargan en una placa de picotitulación. Cada pocillo de la placa de picotitulación puede contener únicamente una perla. Se añaden enzimas de secuenciación a los pocillos y los nucleótidos se hacen fluir por los pocillos en un orden fijo. La incorporación de un nucleótido resulta en la liberación de un pirofosfato, que cataliza una reacción que conduce a una señal quimioluminiscente. Dicha señal es registrada por una cámara CCD y se utiliza un software para traducir las señales en una secuencia de ADN. En el método de Illumina (Bentley, 2008), se unen fragmentos de cadena sencilla provistos de adaptador a una superficie ópticamente transparente y se someten a "amplificación puente". Dicho procedimiento resulta en agregados de varios millones, cada uno de los cuales contiene copias de un único fragmento de ADN. Se añaden la ADN polimerasa, cebadores y cuatro nucleótidos terminadores reversibles marcados y se obtienen imágenes de la superficie mediante fluorescencia láser a fin de determinar la localización y naturaleza de los marcajes. A continuación, se eliminan los grupos protectores y se repite el procedimiento en varios ciclos. El procedimiento SOLiD (Shendure, 2005) es similar a la secuenciación de 454: se amplifican fragmentos de ADN sobre la superficie de perlas. La secuenciación implica ciclos de ligación y detección de sondas marcadas. Actualmente se están desarrollando varias otras técnicas de secuenciación de alto rendimiento. Son ejemplos de ellas, The Helicos system (Harris (2008)), Complete Genomics (Drmanac (2010)) y Pacific Biosciences (Lundquist (2008)). Debido a que éste es un campo técnico en desarrollo extremadamente rápido, la aplicabilidad de la presente invención de métodos de secuenciación de alto rendimiento resultará evidente para el experto en la materia.
La determinación del nivel de expresión de un ácido nucleico (en particular, un gen, ARNmi, ARNsn y ARNsno) puede evaluarse mediante cualquiera de entre una amplia diversidad de métodos bien conocidos. Típicamente, el ácido nucleico preparado puede utilizarse en ensayos de hibridación o amplificación entre los que se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa, tales como PCR cuantitativa (TaqMan) y matrices de sondas, tales como matrices de ADN GeneChip(TM) (Affymetrix). Ventajosamente, el análisis del nivel de expresión de un ácido nucleico implica el procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante RT-PCR (forma de realización experimental explicada en la patente US n° 4.683. 202), reacción en cadena de la ligasa (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991), replicación de secuencias autosostenida (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.57, p: 1874-1878, 1990), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989), replicasa Q-Beta (Lizardi et al., Biol. Technology, vol. 6, p: 1197, 1988), replicación de círculo rodante (patente US n° 5.854.033) o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido de la detección de las moléculas amplificadas mediante la utilización de técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Resulta preferida la RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real. En una forma de realización particular, la determinación comprende hibridar la muestra con reactivos selectivos, tales como sondas o cebadores, y detectar de esta manera la presencia, o medir la cantidad, del ácido nucleico. La hibridación puede llevarse a cabo mediante cualquier dispositivo adecuado, tal como una placa, placa de microtitulación, probeta, pocillo, vaso, columna, etc. Los ácidos nucleicos que muestran complementariedad de secuencias u homología respecto al ácido nucleico de interés en la presente memoria encuentran utilidad como sondas de hibridación o cebadores de amplificación. Se entiende que dichos ácidos nucleicos no necesitan ser idénticos, aunque típicamente son por lo menos aproximadamente 80% idénticos a la región homóloga de tamaño comparable, más preferentemente 85% idénticos y todavía más preferentemente 90% a 95% idénticos. En determinadas formas de realización, resultará ventajoso utilizar ácidos nucleicos en combinación con medios apropiados, tales como un marcaje detectable, para la detección de la hibridación. Es conocida en la técnica una amplia diversidad de indicadores apropiados, entre ellos ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos y otros ligandos (por ejemplo, avidina/biotina). Las sondas y cebadores son "específicos" del ácido nucleico con el que se hibridan, es decir, se hibridan preferentemente bajo condiciones de hibridación de alta astringencia (correspondientes a la temperatura de fusión más alta, Tf, por ejemplo, formamida al 50%, 5x o 6x SSC; 1x SCC es NaCl 0,15 M, Na-citrato 0,015 M). Muchos ensayos de cuantificación se encuentran disponibles comercialmente de Qiagen (S.A. Courtaboeuf, Francia) o de Applied Biosystems (Foster City, EE.UU.). El nivel de expresión del ácido nucleico puede expresarse como perfil de
expresión absoluta o como perfil de expresión normalizada. Típicamente, los perfiles de expresión se normalizan mediante corrección del perfil de expresión absoluta del ácido nucleico de interés mediante comparación de su expresión con la expresión de un ácido nucleico que no es relevante, por ejemplo, un ARNm de mantenimiento que se expresa constitutivamente. El ARNm adecuado para la normalización incluye ARNm de mantenimiento tales como U6, U24, U48 y S18. Dicha normalización permite la comparación del perfil de expresión en una muestra, por ejemplo, una muestra del paciente, con otra muestra, o entre muestras de diferentes orígenes.
Las sondas y/o cebadores típicamente se marcan con una molécula o sustancia detectable, tal como una molécula fluorescente, una molécula radioactiva o cualesquiera otros marcajes conocidos de la técnica. Se conocen marcajes en la técnica que proporcionar generalmente (directa o indirectamente) una señal. El término "marcado" pretende comprender el marcaje directo de la sonda y cebadores mediante acoplamiento (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable, así como el marcaje indirecto mediante reactividad con otro reactivo que se marca directamente. Entre los ejemplos de sustancias detectables se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agentes radioactivos o un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5)).
El método de la exposición resulta particularmente adecuado para determinar la calidad del cultivo de células troncales pluripotentes y después aislar las células troncales pluripotentes libres de anomalías genéticas. El método tal como se ha descrito anteriormente resulta particularmente adecuado para evitar la destrucción del cultivo de células troncales pluripotentes que contiene células troncales pluripotentes libres de anomalías genéticas que pueden aislarse y cultivarse.
De acuerdo con lo anterior, la presente exposición se refiere a un método para aislar una célula troncal pluripotente libre de anomalías genéticas, que comprende las etapas de:
i) determinar el nivel de secuencias hiperrecurrentes en un cultivo de células troncales pluripotentes mediante la realización del método según la invención,
ii) comparar el nivel determinado en la etapa i) con un valor de referencia,
iii) concluir que el cultivo de células troncales pluripotentes contiene células troncales pluripotentes libres de anomalías genéticas en el caso de que el nivel determinado en la etapa i) sea diferente del valor de referencia,
iv) y aislar dichas células troncales pluripotentes libres de anomalías genéticas.
La etapa de aislamiento de células troncales pluripotentes puede llevarse a cabo mediante una diversidad de técnicas bien conocidas, tales como la técnica Fluidigm.
En una forma de realización particular, el valor de referencia es un valor umbral o un valor de corte que pude determinarse experimental, empírica o teóricamente. También puede seleccionarse arbitrariamente un valor umbral basándose en condiciones experimentales existentes, tal como reconocerá el experto ordinario en la materia. Debe determinarse el valor umbral a fin de obtener la sensibilidad y especificidad óptimas según la función del ensayo y el equilibrio de beneficio/riesgo (consecuencias clínicas de un falso positivo y de un falso negativo). Típicamente, la sensibilidad y especificidad óptimas (y, por lo tanto, el valor umbral) pueden determinarse mediante la utilización de una curva característica de receptor-operador (ROC) basada en datos experimentales. Preferentemente, el experto en la materia puede comparar los niveles de ácidos nucleicos (obtenidos según el método de la invención) con un valor umbral definido. En una forma de realización de la presente invención, el valor umbral se define a partir de niveles de ácidos nucleicos (o una proporción o una puntuación) determinados en un cultivo de células troncales pluripotentes portadoras de anomalías genéticas. Además, puede utilizarse una medición retrospectiva de los niveles (o proporciones o puntuaciones) de ácidos nucleicos en cultivos de células troncales pluripotentes históricas apropiadamente depositadas, en el establecimiento de dichos valores umbral.
El método de la invención resulta particularmente adecuado para alcanzar una decisión clínica. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "decisión clínica" se refiere a cualquier decisión de realizar o no una acción que presenta un resultado que afecta a la salud o supervivencia del sujeto. En particular, en el contexto de la invención, una decisión clínica se refiere a una decisión de transferir, injertar, trasplantar o no las células troncales pluripotentes en el sujeto. Una decisión clínica también puede referirse a una decisión de realizar ensayos adicionales, para llevar a cabo acciones para mitigar un fenotipo no deseable. En particular, el método tal como se ha descrito anteriormente ayudará de esta manera al clínico a evitar la transferencia al sujeto de células troncales pluripotentes portadoras de anomalías genéticas. El método tal como se ha descrito anteriormente también resulta particularmente adecuado para evitar la contaminación del sujeto con células troncales pluripotentes portadoras de anomalías genéticas, a evitar el desarrollo de enfermedades, tales como tumores malignos causados por la transferencia de células troncales pluripotentes portadoras de anomalías genéticas en el sujeto. El método tal como se ha descrito anteriormente resulta particularmente adecuado además para el tratamiento de un sujeto que necesita del mismo mediante la administración de células troncales pluripotentes sin efectos secundarios.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a un mamífero. Típicamente, el sujeto según la invención se refiere a cualquier sujeto (preferentemente, ser humano) que necesita del tratamiento regenerativo mediante la utilización del trasplante de células troncales pluripotentes. El término "sujeto" se refiere además a otros mamíferos, tales como primates, perros, gatos, cerdos, vacas o ratones. En una forma de realización particular, el término "sujeto" se refiere a un sujeto que sufre o es susceptible de sufrir enfermedades que requieren de tratamiento regenerativo mediante la utilización de trasplante de células troncales pluripotentes, tal como lesión de la médula espinal, distrofia macular de Stargardt (SMD), degeneración macular asociada a la edad seca, diabetes mellitus de tipo I, trastornos cardiovasculares, tales como insuficiencia cardíaca, enfermedad de Stargardt avanzada, degeneración macular asociada a la edad exudativa (de tipo húmedo), distrofias musculares, enfermedades neurológicas y retinianas, enfermedad hepática y diabetes.
De acuerdo con lo anterior, el método de la invención permite la evaluación de la capacidad de las células troncales pluripotentes de llevar a cabo una transferencia, injerto o trasplante sano en un sujeto. El método de la invención permite el ensayo y selección genéticos de células troncales pluripotentes que pueden transferirse, injertarse o trasplantarse en un sujeto.
Las células troncales pluripotentes seleccionadas mediante la realización de la invención y las células diferenciadas derivadas a partir de las mismas encuentran utilidad en la medicina regenerativa. La expresión "medicina regenerativa" presenta su significado general de la técnica y se refiere al tratamiento generativo relacionado con el procedimiento de crear células y tejidos funcionales vivos para reparar o sustituir células, tejidos o función orgánica perdida debido a la edad, enfermedad, daños o defectos congénitos.
De acuerdo con lo anterior, la presente exposición se refiere además a un método para el trasplante de células troncales pluripotentes o células diferenciadas derivadas a partir de las mismas en un sujeto que requiere del tratamiento regenerativo, que comprende las etapas de: i) llevar a cabo el método según la invención, ii) seleccionar las células troncales pluripotentes libres de anomalías genéticas, y iii) administrar las células troncales pluripotentes seleccionadas en la etapa ii) o células diferenciadas derivadas de las mismas en dicho sujeto.
En un aspecto adicional, los métodos de la exposición resultan particularmente adecuados para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que requiere del tratamiento regenerativo mediante la utilización de trasplante de células troncales pluripotentes con un riego mínimo de transferencia de anomalías genéticas. Los métodos de la invención también resultan adecuados para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que requiere del tratamiento regenerativo mediante la utilización de trasplante de células troncales pluripotentes con un riesgo mínimo de desarrollar enfermedades tales como tumores malignos causados por la transferencia de células troncales pluripotentes portadoras de anomalías genéticas.
De acuerdo con lo anterior, la exposición se refiere además a un método para tratar una enfermedad en un sujeto que requiere del tratamiento regenerativo, que comprende las etapas de: i) llevar a cabo el método según la invención, ii) seleccionar las células troncales pluripotentes libres de anomalías genéticas, y iii) administrar las células troncales pluripotentes seleccionadas en la etapa ii) o células diferenciadas derivadas de las mismas, en dicho sujeto.
En un aspecto adicional, la presente exposición se refiere a un método para potenciar la respuesta al tratamiento regenerativo en un sujeto que requiere del mismo, que comprende las etapas de: i) llevar a cabo el método según la invención, ii) seleccionar las células troncales pluripotentes libres de anomalías genéticas, y iii) administrar las células troncales pluripotentes seleccionadas en la etapa ii) o células diferenciadas derivadas de las mismas en dicho sujeto.
La exposición se refiere además a un kit para llevar a cabo los métodos tal como se han descrito anteriormente, en el que dicho kit comprende unos medios para determinar la presencia y/o nivel de por lo menos una anomalía genética en la extracción de ácidos nucleicos. Típicamente, entre los kits se incluyen sondas, cebadores, macromatrices o micromatrices tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, el kit puede comprender un juego de sondas tal como se ha definido anteriormente, y que pueden estar premarcadas. Alternativamente, las sondas pueden estar no marcadas y pueden incluirse los ingredientes para el marcaje en el kit, en recipientes separados. El kit puede comprender además reactivos de hibridación u otros reactivos y materiales convenientemente empaquetados necesarios para el protocolo de hibridación particular, incluyendo matrices de fase sólida, en caso aplicable, y patrones. Alternativamente, el kit de la invención puede comprender cebadores de amplificación (por ejemplo, cebadores de tallo-bucle) que pueden estar premarcados o pueden contener una fracción de purificación por afinidad o de unión. El kit puede comprender además reactivos de amplificación y además otros reactivos y materiales convenientemente empaquetados necesarios para el protocolo de amplificación particular. El kit puede comprender además unos medios necesarios para determinar si se ha producido la amplificación. El kit puede incluir, además, por ejemplo, tampones y enzimas de PCR; secuencias de control positivo, cebadores de control de la reacción, e instrucciones para amplificar y detectar las secuencias específicas.
La invención se ilustra adicionalmente mediante la figura y ejemplos siguientes. Sin embargo, dichos ejemplos y figuras no deberían interpretarse en modo alguno como limitativos del alcance de la presente invención.
Figuras:
Figura 1: ilustración esquemática del flujo de trabajo. Uso contemplado de un análisis genómico de sobrenadante para cualificar las hPSC en cultivo. Se recogió el sobrenadante de las hPSC y se extrajo el cfDNA total. A continuación, se llevó a cabo una PCR. A continuación, los resultados fueron analizados por bioinformáticos para detectar los biomarcadores en el cfDNA.
Figura 2: recurrencia de las anomalías genéticas de las hPSC en SEAdb. Gradiente de color: n° de estudios; tamaño de burbuja: longitud de la región genómica; Y: puntuación de recurrencia; X: cromosoma.
Figura 3: para los cromosomas 21 que alojan la mayor parte de las alteraciones genéticas >1 Mb, los 40 grupos de secuencias de la tabla 1 (sondas: S1 a S40) cubren 93,5% de las anomalías cromosómicas.
Figura 4: detección y cuantificación de los CfNA en muestras de sobrenadante de hPSC. Se evaluó la amplificación de secuencias de repetición ALU humanas en dos sobrenadantes de hPSC y utilizando ADN de fibroblastos de prepucio humano a cinco concentraciones a modo de control (330 pg, 110 pg, 13 pg, 3,3 pg y 0,33 pg). Se llevaron a cabo experimentos de QPCR en un Roche LC480. Se captó la fluorescencia en cada ciclo y se representó gráficamente frente al número de ciclos. El nivel creciente de fluorescencia medida era proporcional a la cantidad de producto de PCR generado durante la reacción. La concentración de CfNA medida en las hPSC era de entre 330 pg y 110 pg.
Figura 5: detección basada en el sobrenadante de la trisomía 20. A. Cariotipos anormales representativos en dos líneas de hPSC. HD291 (47,XY,+12) (panel izquierdo) y HD129 (47,XY,+20) (panel derecho). B. Cuantificación mediante ddPCR de la trisomía 20 en dos líneas de hPSC y sobrenadantes utilizando una secuencia hiperrecurrente específica para únicamente la trisomía 20. El gráfico de número de copia, con pocillos por triplicado exactos, reveló la presencia de trisomía 20 únicamente en células hPSC anormales HD129 y su sobrenadante, pero no en HD291. Todas las barras de error generadas por el software QuantaSoft™ representan el intervalo de confianza al 95%.
Figura 6: la elevada sensibilidad del sistema QX200 permite la cuantificación de la trisomía 20 en el sobrenadante de hPSC utilizando una secuencia hiperrecurrente específica. Las concentraciones de las muestras se representan gráficamente como n° de copias/pl.
Ejemplos
Ejemplo 1:
Métodos:
cultivo de hPSC y recolección de sobrenadantes.
Las PSC humanas (hESC o iPSC) se cultivaron en pocillos de 35 mm sobre Geltrex™ en presencia de medio libre "Xeno-free" y medio completamente definido (medio Essential 8™). Las células se disociaron mecánicamente y se cultivaron en cultivo en masa o se disociaron enzimáticamente y se adaptaron al pase de células individuales. Se renovó el medio cada día. Se incubaron medios libres de hPSC a modo de controles. Se recogió un ml de sobrenadante (medio acondicionado con hPSC) de cada pocillo inmediatamente antes del pase de rutina de PSC y se congeló inmediatamente en tubos libres de ADN, ADNasa, ARNasa e inhibidores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y se almacenaron a -80°C hasta la purificación de los ácidos nucleicos. Se tomaron precauciones apropiadas para evitar la contaminación de las muestras por ADN foráneo.
Purificación de ácidos nucleicos
Se extrajeron los ácidos nucleicos de 200 pl de sobrenadante mediante la utilización del kit sanguíneo QIAmp DNA Mini (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 20 pl de proteinasa K y 200 pl de tampón AL a cada sobrenadante. Tras la agitación pulsada con vórtex durante 15 s, la mezcla de lisis se incubó a 56°C durante 10 min en un tubo Eppendorf (1,5 ml). Las condiciones altamente desnaturalizantes a temperaturas elevadas favorecieron la liberación completa de los ácidos nucleicos de cualesquiera proteínas unidas. Tras la adición de 200 pl de etanol frío (al 100%) al lisado, la muestra se transfirió a una columna QlAamp Mini. Se adsorbieron los ácidos nucleicos libres de células sobre la membrana a medida que se hacía pasar el lisado por centrifugación a 6000g durante 1 min. Los contaminantes se eliminaron eficientemente por lavado en dos etapas de lavado (en tampón AW1 y tampón AW2). Finalmente, los ácidos nucleicos libres de células se eluyeron en 30 pl de tampón AE y se almacenaron a -20°C.
Cuantificación de los ácidos nucleicos libres de células (CfNA)
Se evaluó la concentración de CfNA en cada sobrenadante respecto a la concentración correspondiente de producto de PCR ALU-115, que se determinó mediante un enfoque de PCR cuantitativa (LC480, Roche). Con este fin, se añadió un pl de cada muestra de eluido de CfNA a una mezcla de reacción que contenía 2X mezcla maestra LightCycler480 SYBR Green I (Roche Applied Science, Alemania) y 0,25 pM de cebadores ALU directos e inversos, tal como se indica en Umetani et al., (2006) en un volumen total de 10 pl. Las reacciones se configuraron en placas blancas de 96 pocillos (Eppendorf) mediante la estación de trabajo de manipulación de líquidos EpMotion 5070 (Eppendorf). Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado. Se incluyó un control negativo (agua sin ARNasa/ADNasa) en cada tanda. Se determinó la concentración de CfNA en el sobrenadante mediante la utilización de una curva patrón obtenida mediante diluciones sucesivas de ácidos nucleicos genómicos extraídos directamente de las hPSC.
La detección de CNV en los CfNA mediante la utilización del sistema de PCR digital en gotas (ddPCR).
El ensayo de ddPCR se llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente (Abyzov et al., 2002). Brevemente, el flujo de trabajo de la ddPCR consiste en configurar las reacciones, preparar las gotas, el ciclado térmico y la operación del lector de gotas siguiendo las instrucciones de Bio-Rad (sistema Bio-Rad QX200). La ddPCR utiliza sondas de hibridación internas marcadas fluorescentemente (sondas TaqMan) para la detección de CNV en los CfNA. La reacción normalmente se configura mediante la utilización de un par de cebadores con diana en la región de interés (por ejemplo: CNV-ID1, dHsaCP2506319) y un segundo par de cebadores con diana en cualquier gen de referencia patrón (por ejemplo: RPP30, dHsaCP2500350). Los dos cebadores (diana y de referencia) se marcan con fluoróforos diferentes (FAM y HEX). Se añadió una entrada de CfNA de cada sobrenadante a la mezcla de reacción de PCR TaqMan. Dicha mezcla de reacción incluía la supermezcla de ddPCR sin dUTP (Bio-Rad, ref.
1863023) y cebadores en un volumen final de 20 pl. A continuación, se cargó cada mezcla de reacción de ddPCR ensamblada en el pocillo para muestras de un cartucho generador de gotas desechable de ocho canales (Bio-Rad, ref. 1864008). Se cargó un volumen de 60 pl de aceite de generación de gotas (Bio-Rad, ref. 1863005) en el pocillo para aceite de cada canal. Se introdujo el cartucho en el generador de gotas (Bio-Rad). Se extrajo el cartucho del generador de gotas, en el que las gotas que se recogieron en el pocillo de gotas seguidamente se transfirieron manualmente con una pipeta multicanal a una placa de PCR de 96 pocillos. La placa se termoselló con lámina de aluminio y después se introdujo en un ciclador térmico convencional y se amplificó hasta el punto final (40 a 50 ciclos). Mediante la utilización de tecnología de microfluidos, la mezcla de reacción se dividió en gotas esféricas compuestas de una superficie de aceite y un núcleo acuoso que contenía la mezcla de reacción de PCR. Las gotas se sometieron a ciclado térmico. Tras la amplificación, se leyó la fluorescencia de cada gota en sucesión con un lector de gotas. Las gotas que contenían la región diana de interés o referencia emitirán fluorescencia en el canal correspondiente (gotas positivas), mientras que aquellas sin diana no emitirán (gotas negativas). Los recuentos de gotas positivas y negativas para cada diana están relacionados con la concentración de la diana en la muestra según la distribución de Poisson.
Resultados:
Las células troncales pluripotentes (PSC), que se perpetúan por autorrenovación pero que son capaces de diferenciarse en células maduras de tejidos particulares, son herramientas clave para la medicina regenerativa. La medicina regenerativa es una definición amplia de las innovadoras terapias médicas que permiten al cuerpo repararse, sustituir, restaurar y regenerar células, tejidos y órganos daños o enfermos. Sin embargo, el cultivo celular puede resultar en anomalías epigenéticas y genéticas que podrían alterar las propiedades de las células troncales o predisponerlas a la formación de tumores. Con la rápida expansión del uso de las PSC en la clínica, es el momento de mejorar las herramientas de caracterización de las células troncales pluripotentes (PSC) durante la expansión celular y antes de la liberación de un lote.
Actualmente no existe ningún procedimiento genético y no invasivo disponible comercialmente que sea fiable para la evaluación de la integridad genética de células troncales pluripotentes en cultivo. La presente invención se refiere a un método para evaluar la integridad genómica de las hPSC en cultivo, que comprende una etapa de detección de anomalías genéticas en el ADN presente en el sobrenadante recogido durante la propagación de las PSC en cultivo.
Los inventores han determinado que existe un grupo de "secuencias hiperrecurrentes" en las hPSC que son biomarcadores de la inestabilidad de las hPSC en cultivo (tabla 1) y proponen un ensayo rápido y fácil de realizar que puede utilizarse para evaluar rutinariamente las células troncales durante el cultivo y antes del uso clínico (figura 1).
Alteraciones genéticas recurrentes producidas durante el cultivo de hPSC
Los inventores han desarrollado una base de datos "SEAdb" dedicada a la visualización de todos los tipos de anomalía genética, obtenidas mediante cariotipo, FISH, análisis de micromatrices (SNP, aCGH) o NGS. Puede accederse a SEAdb mediante el enlace siguiente: seadb.org (usuario: seadb y contraseña: SEAdb). Los inventores
han compilado anomalías para más de 400.000 anomalías y variantes.
Los inventores muestran que las alteraciones genéticas más recurrentes que se producen durante el cultivo de hPSC son anomalías del cariotipo y variaciones del número de copia (CNV) >1 Mb (figura 2).
En contraste, las anomalías genéticas más pequeñas, tales como mutaciones e indels, prácticamente no son recurrentes. En SEAdb se encuentran 1117 alteraciones genéticas > 1 Mb. Los inventores han diseñado una puntuación de recurrencia que nos ayuda a identificar las posiciones en el genoma que presentan mayor tendencia a la modificación genómica inducida por el cultivo de PSC. Por ejemplo, para los cromosomas 21 que alojan la mayor parte de las alteraciones genéticas >1 Mb, los inventores muestran que los 40 grupos de secuencias de la tabla 1 (sondas: S1 a S40) cubren 93,5% de las anomalías cromosómicas (figura 3).
El sobrenadante de cultivo celular como fuente de ADN para la detección de secuencias patogénicas
Una restricción importante en la evaluación de la integridad del genoma de las células troncales en cultivo es la necesidad de destruir una muestra del cultivo para llevar a cabo el ensayo. Por lo tanto, el inventor propone que la integridad del genoma puede evaluarse en el sobrenadante del cultivo celular.
En efecto, el sobrenadante del cultivo celular contiene ADN libre de células (CfDNA) que son moléculas de doble cadena con peso molecular más bajo que el ADN genómico, en forma de fragmentos cortos (de entre 70 y 200 pares de bases de longitud) o fragmentos largos de hasta 21 kb. Los mecanismos de liberación de CfDNA son poco conocidos, aunque se ha propuesto que la necrosis, apoptosis, fagocitosis o liberación activa podrían tener un papel (Choi et al., 2005; Gahan et al., 2008; Stroun et al., 2001).
El CfDNA está presente en el suero o en el plasma y se utiliza para ensayos no invasivos para detectar anomalías cromosómicas (Hui y Bianchi, 2013). Se ha demostrado que aneuploidías fetales específicas, tales como la trisomía 13, 18 o 21, pueden detectarse en ADN fetal libre de células de muestras de suero materno (Dan et al., 2012; Fairbrother et al., 2013; Nicolaides et al., 2014). Además, el CfDNA fetal en el plasma materno también se utiliza para detectar variaciones patogénicas del número de copia (CNV) mediante la utilización de secuenciación de captura de región diana (Ge et al., 2013).
Basándose en el resultado de que el CfDNA resulta liberado en líquidos diferentes (suero y plasma) y que puede utilizarse para detectar CNV patógenos, los inventores han propuesto la utilización de ADN presente en el sobrenadante como fuente para detectar CNV patógenos y para llevar a cabo un análisis no invasivo de las hPSC, evitando la destrucción celular.
Con el fin de evaluar una posible fuente exógena de ADN en el sobrenadante de las células troncales, el inventor ha utilizado PCR en tiempo real cuantitativa de repeticiones ALU (Umetani et al., 2006). La cuantificación mediante ALU-qPCR de CfDNA total (por triplicado) en dos sobrenadantes de dos hESC ha mostrado inequívocamente que el CfDNA se detecta en todas las muestras sometidas a ensayo y que la concentración medida de CfDNA es de entre 330 pg y 110 pg (figura 4).
Estos resultados demuestran que el sobrenadante de hPSC contiene ADN libre de células (CfDNA), resultando presumiblemente de la liberación de material genético a partir de células muertas y células vivas flotantes. La detección del CfDNA liberado en el sobrenadante de las hPSC representa una herramienta todavía inexplorada para facilitar la evaluación de las anomalías genéticas mediante la utilización biomarcadores de secuencia.
La expresión "medio de cultivo" se refiere a una solución nutritiva para el cultivo, crecimiento o proliferación de células. La expresión "cultivo celular" se refiere a células que se mantienen, cultivan o hacen crecer en un medio in vitro artificial.
El término "CNV" se refiere a alteraciones del ADN de un genoma que resultan en que la célula presenta una variación anormal o, para determinados genes, normal, del número de copias de una o más secciones del ADN. Las CNV corresponden a regiones relativamente grandes del genoma que han sido eliminadas (menos del número normal) o duplicadas (más del número normal) en determinados cromosomas.
Ejemplo de referencia 2:
Métodos:
Cariotipado
Se disociaron células troncales pluripotentes humanas con TryPLE Select (Life Technologies) y se cultivaron durante 3 días hasta alcanzar plenamente la etapa exponencial. A continuación, se incubaron las células individuales con 1/10,000 KaryoMAX® Colcemid™ (Life Technologies) durante 90 min para detener el ciclo en metafase antes del hinchado hipotónico con solución de KCl 0,075 M a 37°C durante 20 min y tres fijaciones
sucesivas en metanol/ácido acético glacial helado (3:1, vol/vol). Se depositaron veinte microlitros de suspensión de núcleos sobre portaobjetos de vidrio, se secaron al aire a 18,4°C y 60% de humedad y se rehidrataron en agua durante 5 min antes de la desnaturalización en EARLE naranja o 10x EBSS a 87°C durante 55 min. Después, los portaobjetos se enjuagaron en agua fría y se tiñeron con GIEMSA al 3% durante 3 min, se enjuagaron cinco veces y se secaron al aire. Se llevó a cabo la microscopía y análisis espectrales mediante la utilización de la plataforma de escaneo de portaobjetos Metafer (MetaSystem).
Análisis de datos de ddPCR y estadísticas
Se comparó el número de gotas de registro de la fluorescencia para el ensayo específico de diana (dHsaCP2506319) con el recuento obtenido para el ensayo específico de la referencia (dHsaCP2500350). Se calcularon los números finales de copias mediante la utilización del software del fabricante QuantaSoft (Bio-Rad, CA, EE.UU.) mediante la aplicación de estadísticos de Poisson:
X=-ln(l-p )
en el que "A" es el número medio de copias por cada gota y "p" es la proporción de gotas positivas a número total de gotas.
Resultados:
Evaluación de la integridad genética en sobrenadante de hPSC mediante la utilización del enfoque de ddPCR: aplicación en el cribado rutinario
La evaluación del cribado de la integridad genética resulta posible mediante el ensayo para CfDNA en sobrenadante de hPSC. Los presentes inventores utilizaron dos líneas de células troncales pluripotentes humanas aneuploides: HD129 y HD291 con el fin de validar la viabilidad del ensayo. HD129 mostró una trisomía 20 (47, XY+20), mientras que HD291 mostró una trisomía 12 (47,XY, 12), según se determinó mediante cariotipado de bandas R convencional. Se recolectaron las células y sobrenadante correspondientes, respectivamente, para el análisis de la trisomía 20 mediante la utilización del enfoque específico de secuencias hiperrecurrentes y ddPCR de los presentes inventores. Tal como se muestra en la figura 5, (i) se detecta la aberración genómica (en este caso, la trisomía 20) en el sobrenadante de las hPSC mediante la utilización de un enfoque de ddPCR para la línea hPSC HD129, aunque no en la línea HD291, confirmando los resultados del cariotipo, (ii) se encuentra una correlación entre el resultado de cribado de anomalías genéticas del sobrenadante y el cariotipo correspondiente, demostrando la prueba de concepto de que los CfNA presentes en el sobrenadante pueden utilizarse para evaluar la integridad genética de las células troncales pluripotentes. La ventaja del cribado de células troncales mediante la utilización del sobrenadante sería la capacidad de evaluar la integridad genética de las células troncales sin destrucción. Además, la utilización de esta simple metodología, basada en la reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas (ddPCR), permite el cribado rápido, eficiente y fácil de líneas de hPSC a partir de cantidades pequeñas de material, incluyendo el sobrenadante del cultivo. Dichos beneficios podrían hacer que dicho enfoque resultase atractivo, conduciendo a la potencial utilización de manera rutinaria. Finalmente, el método de los presentes inventores puede aplicarse cualesquiera otros experimentos que requieran el análisis preciso del genoma para el ensayo de la integridad genética (por ejemplo): células troncales multipotentes, tales como las células troncales mesenquimatosas (MSC), células germinales, linfocitos, embriones o células somáticas).
Concentración mínima de ácidos nucleicos para un ensayo robusto
La sensibilidad de la detección de la secuencia de la trisomía 20 mediante la utilización de ddPCR se evaluó mediante el ensayo de diferentes concentraciones (1,1 ng/plL, 0,4 ng/pl, 0,1 ng/plL, 3,7 pg/pl, 1,1 pg/pl y 0,4 pg/pl) de ácidos nucleicos extraídos del sobrenadante recogido de la línea de hPSC HD129. Tal como se muestra en la figura 6, se detectó una señal de trisomía 20 entre las señales obtenidas de una concentración muy baja (de hasta 0,1 ng/pl), pero todavía suficiente para proporcionar un resultado de cribado fiable.
Referencias:
Abyzov, A., Mariani, J., Palejev, D., Zhang, Y., Haney, M. S., Tomasini, L., Ferrandino, A. F., Rosenberg Belmaker, L. A., Szekely, A., Wilson, M. et al. (2012). Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature 492, 438-42.
Cheng, L., Hansen, N. F., Zhao, L., Du, Y., Zou, C., Donovan, F. X., Chou, B. K., Zhou, G., Li, S., Dowey, S. N., Ye, Z., Chandrasekharappa, S. C., Yang, H., Mullikin, J. C., Liu, P. P., 2012. Low incidence of DNA sequence variation in human induced pluripotent stem cells generated by nonintegrating plasmid expression. Cell Stem Cell. 10, 337-44.
Choi, J. J., Reich, C. F., 3rd, Pisetsky, D. S., 2005. The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells. Immunology. 115, 55-62.
Dan, S., Wang, W., Ren, J., Li, Y., Hu, H., Xu, Z., Lau, T. K., Xie, J., Zhao, W., Huang, H., Sun, L., Zhang, X., Liao, S., Qiang, R., Cao, J., Zhang, Q., Zhou, Y., Zhu, H., Zhong, M., Guo, Y., Lin, L., Gao, Z., Yao, H., Zhang, H., Zhao, L., Jiang, F., Chen, F., Jiang, H., Li, S., Wang, J., Duan, T., Su, Y., 2012. Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors. Prenat Diagn. 32, 1225-32.
Draper, J. S., Moore, H. D., Ruban, L. N., Gokhale, P. J., Andrews, P. W., 2004. Culture and characterization of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 13, 325-36.
Fairbrother, G., Johnson, S., Musci, T. J., Song, K., 2013. Clinical experience of noninvasive prenatal testing with cell-free DNA for fetal trisomies 21, 18, and 13, in a general screening population. Prenat Diagn. 33, 580 3.
Funk, W. D., Labat, I., Sampathkumar, J., Gourraud, P. A., Oksenberg, J. R., Rosler, E., Steiger, D., Sheibani, N., Caillier, S., Stache-Crain, B., Johnson, J. A., Meisner, L., Lacher, M. D., Chapman, K. B., Park, M. J., Shin, K. J., Drmanac, R., West, M. D., 2012. Evaluating the genomic and sequence integrity of human ES cell lines; comparison to normal genomes. Stem Cell Res. 8, 154-64.
Gahan, P. B., Anker, P., Stroun, M., 2008. Metabolic DNA as the origin of spontaneously released DNA? Ann N Y Acad Sci. 1137, 7-17.
Ge, H., Huang, X., Li, X., Chen, S., Zheng, J., Jiang, H., Zhang, C., Pan, X., Guo, J., Chen, F., Chen, N., Fang, Q., Wang, W., 2013. Noninvasive prenatal detection for pathogenic VNCs: the application in alphathalassemia. PLoS One. 8, e67464.
Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E., Lee, J. H., Loh, Y. H., Manos, P. D., Montserrat, N., Panopoulos, A. D., Ruiz, S., Wilbert, M. L., Yu, J., Kirkness, E. F., Izpisua Belmonte, J. C., Rossi, D. J., Thomson, J. A., Eggan, K., Daley, G. Q., Goldstein, L. S., Zhang, K., 2011. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature.
471, 63-7.
Hui, L., Bianchi, D. W., 2013. Recent advances in the prenatal interrogation of the human fetal genome. Trends Genet. 29, 84-91.
Hussein, S. M., Batada, N. N., Vuoristo, S., Ching, R. W., Autio, R., Narva, E., Ng, S., Sourour, M., Hamalainen, R., Olsson, C., Lundin, K., Mikkola, M., Trokovic, R., Peitz, M., Brustle, O., Bazett-Jones, D. P., Alitalo, K., Lahesmaa, R., Nagy, A., Otonkoski, T., 2011. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471, 58-62.
Ji, J., Ng, S. H., Sharma, V., Neculai, D., Hussein, S., Sam, M., Trinh, Q., Church, G. M., McPherson, J. D., Nagy, A., Batada, N. N., 2012. Elevated coding mutation rate during the reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 435-40.
Laurent, L. C., Ulitsky, I., Slavin, I., Tran, H., Schork, A., Morey, R., Lynch, C., Harness, J. V., Lee, S., Barrero, M. J., Ku, S., Martynova, M., Semechkin, R., Galat, V., Gottesfeld, J., Izpisua Belmonte, J. C., Murry, C., Keirstead, H. S., Park, H. S., Schmidt, U., Laslett, A. L., Muller, F. J., Nievergelt, C. M., Shamir, R., Loring, J. F., 2011. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8, 106-18.
Lefort, N., Feyeux, M., Bas, C., Feraud, O., Bennaceur-Griscelli, A., Tachdjian, G., Peschanski, M., Perrier, A. L., 2008. Human embryonic stem cells reveal recurrent genomic instability at 20q11.21. Nat Biotechnol. 26, 1364-6.
Martins-Taylor, K., Xu, R. H., 2010. Determinants of pluripotency: from avian, rodents, to primates. J Cell Biochem. 109, 16-25.
Narva, E., Autio, R., Rahkonen, N., Kong, L., Harrison, N., Kitsberg, D., Borghese, L., Itskovitz-Eldor, J., Rasool, O., Dvorak, P., Hovatta, O., Otonkoski, T., Tuuri, T., Cui, W., Brustle, O., Baker, D., Maltby, E., Moore, H. D., Benvenisty, N., Andrews, P. W., Yli-Harja, O., Lahesmaa, R., 2010. High-resolution DNA analysis of human embryonic stem cell lines reveals culture-induced copy number changes and loss of heterozygosity. Nat Biotechnol. 28, 371-7.
Nicolaides, K. H., Syngelaki, A., Poon, L. C., Gil, M. M., Wright, D., 2014. Firsttrimester contingent screening for trisomies 21, 18 and 13 by biomarkers and maternal blood cell-free DNA testing. Fetal Diagn Ther. 35, 185-92.
Pasi, C. E., Dereli-Oz, A., Negrini, S., Friedli, M., Fragola, G., Lombardo, A., Van Houwe, G., Naldini, L., Casóla, S., Testa, G., Trono, D., Pelicci, P. G., Halazonetis, T. D., 2011. Genomic instability in induced stem cells. Cell Death Differ. 18, 745-53.
Spits, C., Mateizel, I., Geens, M., Mertzanidou, A., Staessen, C., Vandeskelde, Y., Van der Elst, J., Liebaers, I., Sermon, K., 2008. Recurrent chromosomal abnormalities in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol.
26, 1361-3.
Stroun, M., Lyautey, J., Lederrey, C., Olson-Sand, A., Anker, P., 2001. About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release. Clin Chim Acta. 313, 139-42.
Taapken, S. M., Nisler, B. S., Newton, M. A., Sampsell-Barron, T. L., Leonhard, K. A., Mclntire, E. M., Montgomery, K. D., 2011. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29, 313-4.
Umetani, N., Kim, J., Hiramatsu, S., Reber, H. A., Hines, O. J., Bilchik, A. J., Hoon, D. S., 2006. Increased integrity of free circulating DNA in sera of patients with colorectal or periampullary cancer: direct quantitative PCR for ALU repeats. Clin Chem. 52, 1062-9.
Claims (9)
1. Método no invasivo in vitro para determinar la calidad de una célula troncal pluripotente humana o de una célula diferenciada derivada de la misma que comprende las etapas de: i) proporcionar una muestra de cultivo en la que crecen las células troncales, ii) extraer los ácidos nucleicos a partir del sobrenadante de cultivo, e iii) determinar la presencia y/o el nivel de por lo menos una anomalía genética en la extracción de ácidos nucleicos, en el que dicha etapa iii) comprende las etapas de
i) determinar la presencia de por lo menos una secuencia hiperrecurrente seleccionada de la tabla 1 en la extracción de ácidos nucleicos, e ii) concluir que las células troncales pluripotentes portan una anomalía genética cuando se detecta por lo menos una secuencia hiperrecurrente.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula diferenciada derivada de célula troncal pluripotente humana se selecciona de entre el grupo que consiste en cardiomiocitos y progenitores de los mismos; células progenitoras neurales; células de los islotes pancreáticos, particularmente células p pancreáticas; células progenitoras y madre hematopoyéticas; células troncales mesenquimatosas; y células satélite musculares.
3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula diferenciada derivada de célula troncal pluripotente humana es un linfocito.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la anomalía genética se detecta mediante PCR.
5. Método según la reivindicación 4, en el que dicha PCR es una PCR en gotas digital.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la anomalía genética se detecta mediante secuenciación de nueva generación.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la anomalía genética se detecta mediante análisis de matrices de sondas.
8. Célula troncal pluripotente humana o célula diferenciada derivada de la misma libre de anomalías genéticas, para la utilización en un método de trasplante, en la que dicho método comprende las etapas de: i) llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, ii) seleccionar la célula troncal pluripotente humana libre de anomalías genéticas, e iii) administrar la célula troncal pluripotente seleccionada en la etapa ii) o las células diferenciadas derivadas de la misma a un sujeto que necesita un tratamiento regenerativo.
9. Célula troncal pluripotente humana o célula diferenciada derivada de la misma libre de anomalías genéticas, para la utilización en un método para tratar una enfermedad en un sujeto que necesita un tratamiento regenerativo, en la que dicho método comprende las etapas de: i) llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, ii) seleccionar la célula troncal pluripotente libre de anomalías genéticas, e iii) administrar la célula troncal pluripotente humana seleccionada en la etapa ii) o células diferenciadas derivadas de la misma a dicho sujeto.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15306389 | 2015-09-11 | ||
| PCT/EP2016/071256 WO2017042309A1 (en) | 2015-09-11 | 2016-09-09 | Non-invasive methods for assessing genetic integrity of pluripotent stem cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2891337T3 true ES2891337T3 (es) | 2022-01-27 |
Family
ID=54199137
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16763789T Active ES2891337T3 (es) | 2015-09-11 | 2016-09-09 | Métodos no invasivos para evaluar la integridad genética de células troncales pluripotentes |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20180245037A1 (es) |
| EP (1) | EP3347487B1 (es) |
| JP (1) | JP6873978B2 (es) |
| CN (1) | CN108138240A (es) |
| AU (1) | AU2016319189B2 (es) |
| CA (1) | CA2998530A1 (es) |
| DK (1) | DK3347487T3 (es) |
| ES (1) | ES2891337T3 (es) |
| WO (1) | WO2017042309A1 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019244853A1 (ja) * | 2018-06-18 | 2019-12-26 | 株式会社 島津製作所 | 細胞のゲノム異常の評価方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| DE69430909T2 (de) | 1993-03-19 | 2003-02-27 | Sequenom, Inc. | Dns-sequenzbestimmung durch massenspektrometrie auf dem weg des abbaus mit exonuklease |
| US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US6140053A (en) | 1996-11-06 | 2000-10-31 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
| ES2354238T3 (es) * | 2003-07-03 | 2011-03-11 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Genes como herramienta de diagnóstico para autismo. |
| GB0320059D0 (en) | 2003-08-27 | 2003-10-01 | Solexa Ltd | A method of sequencing |
| BRPI1015018B8 (pt) * | 2009-04-17 | 2021-06-15 | Inst Nat Sante Rech Med | métodos para selecionar oócitos e embriões competentes com alto potencial de êxito de gravidez |
| CN103987855B (zh) * | 2011-11-01 | 2017-04-26 | 独立行政法人产业技术综合研究所 | 未分化细胞检测方法及复合糖检测方法 |
| AT512417A1 (de) * | 2012-02-10 | 2013-08-15 | Ivf Zentren Prof Zech Bregenz Gmbh | Verfahren zur analyse fetaler nukleinsäuren |
| US9892230B2 (en) * | 2012-03-08 | 2018-02-13 | The Chinese University Of Hong Kong | Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma |
| EP3399054B1 (en) * | 2013-06-18 | 2022-03-09 | INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods for determining the quality of an embryo |
-
2016
- 2016-09-09 CA CA2998530A patent/CA2998530A1/en active Pending
- 2016-09-09 ES ES16763789T patent/ES2891337T3/es active Active
- 2016-09-09 EP EP16763789.1A patent/EP3347487B1/en active Active
- 2016-09-09 JP JP2018512901A patent/JP6873978B2/ja active Active
- 2016-09-09 DK DK16763789.1T patent/DK3347487T3/da active
- 2016-09-09 AU AU2016319189A patent/AU2016319189B2/en active Active
- 2016-09-09 WO PCT/EP2016/071256 patent/WO2017042309A1/en not_active Ceased
- 2016-09-09 CN CN201680060356.1A patent/CN108138240A/zh active Pending
- 2016-09-09 US US15/758,526 patent/US20180245037A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2998530A1 (en) | 2017-03-16 |
| WO2017042309A1 (en) | 2017-03-16 |
| CN108138240A (zh) | 2018-06-08 |
| EP3347487B1 (en) | 2021-07-14 |
| US20180245037A1 (en) | 2018-08-30 |
| DK3347487T3 (da) | 2021-08-09 |
| EP3347487A1 (en) | 2018-07-18 |
| JP2018526018A (ja) | 2018-09-13 |
| JP6873978B2 (ja) | 2021-05-19 |
| AU2016319189A1 (en) | 2018-04-12 |
| AU2016319189B2 (en) | 2022-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2898250T3 (es) | Bibliotecas de genoma completo de células individuales para secuenciación de la metilación | |
| KR102475710B1 (ko) | 단일 세포 전체 게놈 라이브러리 및 이의 제조를 위한 조합 인덱싱 방법 | |
| ES2691918T3 (es) | Métodos para determinar la calidad de un embrión | |
| EP3283657B1 (en) | Quality assessment of circulating cell-free dna using multiplexed droplet digital pcr | |
| ES2796224T3 (es) | Evaluación de embriones previa a la implantación a través de la detección de ADN embrionario libre | |
| CN114008199A (zh) | 高通量单细胞文库及其制备和使用方法 | |
| US20060188986A1 (en) | Restoration of methylation states in cells | |
| ES2891337T3 (es) | Métodos no invasivos para evaluar la integridad genética de células troncales pluripotentes | |
| JP2018525356A (ja) | 子宮内膜処置のための方法およびシステム | |
| CN105950766B (zh) | 一种用于检测hla-b*5801等位基因的引物组及试剂盒 | |
| ES2616836T3 (es) | Diagnósticos del virus Torque teno | |
| US10770183B2 (en) | Methods of assessing a risk of developing necrotizing meningoencephalitis | |
| RU2838946C2 (ru) | Высокопроизводительные библиотеки одиночных клеток и способы получения и использования | |
| HK40068328A (en) | High-throughput single-cell libraries and methods of making and of using | |
| CN105803067B (zh) | miR-1304在转移性肺鳞癌诊治中的应用 | |
| CN104561346B (zh) | 用于检测scz相关基因多态性的引物及试剂盒 | |
| AU2003302429B2 (en) | Restoration of methylation states in cells | |
| US20220127671A1 (en) | METHODS FOR IMPROVING HUMAN EGG QUALITY USING MICRORNAs | |
| Crawford | Microarray analysis of chromosome 14 congenic strains in the SHRSP | |
| Glossop et al. | DNA methylation profiling of synovial fluid-derived FLS in rheumatoid arthritis reveals common changes relative to tissue-derived FLS | |
| CN112004944A (zh) | 用于急性移植物抗宿主病的供体选择和预后的组合物和方法 | |
| CN106011294A (zh) | miRNA在软骨母细胞型骨肉瘤诊断中的用途 |