ES2667558T3 - Polipéptidos de fusión que comprenden una proteína activa unida a un polipéptido con dominio mucina - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende un polipéptido con dominio mucina unido a al menos una proteína activa mediante un enlazador opcional en la que el polipéptido con dominio mucina está glicosilado y comprende la SEQ ID NO: 20 o cualquier secuencia de aminoácidos homóloga a la misma con al menos un 90 % de identidad de la secuencia de aminoácidos, en la que la proteína activa es IL-1Ra o exendina-4 o cualquier secuencia de aminoácidos idéntica a la misma con al menos 90 % de identidad de secuencia; y en la que la semivida de la proteína de fusión es dos veces mayor en comparación con la semivida de la proteína activa correspondiente que no está fusionada con el polipéptido con dominio mucina.

Description

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DESCRIPCION

Polipéptidos de fusión que comprenden una proteína activa unida a un polipéptido con dominio mucina Antecedentes de la invención

La farmacocinética, la farmacodistribución, la solubilidad, la estabilidad, la potenciación de la función efectora y la unión al receptor de los productos terapéuticos de tipo proteína pueden verse influidos significativamente por el resto carbohidrato de las proteínas glicosiladas. Además, muchos péptidos y proteínas biológicamente activos tienen una solubilidad limitada, o se agregan durante las producciones recombinantes, lo que requiere procedimientos complejos de solubilización y replegamiento. Además, los compuestos terapéuticos de tipo proteína y péptido con pesos moleculares inferiores a 60 kilodaltons (kD) a menudo tienen semividas cortas debido a la depuración renal.

Las estrategias actuales empleadas para prolongar la semivida sérica de los compuestos terapéuticos de tipo proteína se engloban principalmente en dos categorías generales: 1) utilización de reciclado mediado por FcRn y 2) aumento del volumen hidrodinámico. Los enfoques específicos que se han descrito incluyen conjugación, unión o fusión a proteínas o dominios de unión a FcRn (Fc, albúmina) para la primera estrategia, y multimerización, acoplamiento químico a polímeros o hidratos de carbono (como PEG, ácido colomínico o hidroxietil almidón), incorporación de sitios de N-glicosilación para la última. Sin embargo, la producción de proteínas de fusión Fc es un proceso lento, ineficiente y costoso que requiere etapas de fabricación adicionales y, a menudo, procedimientos de purificación complejos. Además, las estrategias de acoplamiento químico, siendo la PEGilación la más ampliamente utilizada, dan como resultado un aumento significativo en los costes de producción debido a la adición de etapas de conjugación y purificación y rendimientos globales reducidos. Recientemente, se han descrito también otros imitadores de PEG recombinantes producidos por fusión de una secuencia polipeptídica larga y flexible, como los descritos en el documento U.S. 2010/0239554 A1. Aunque esta tecnología evita la etapa de conjugación adicional, la secuencia peptídica añadida, que no es endógena, tiene el potencial de inmunogenicidad. El documento WO 2010/091122 divulga proteínas de fusión que comprenden una proteína biológicamente activa, tal como IL-1Ra y exendina-4, y un polipéptido XTEN; donde el polipéptido XTEN mejora las propiedades farmacocinéticas, tales como la semivida, de la proteína activa. Las proteínas mucina y los dominios de mucina de proteínas contienen un alto grado de glicosilación, lo que estructuralmente permite que las proteínas de mucina y otros polipéptidos que comprenden dominios de mucina se comporten como espirales aleatorias rígidas. Esta estructura en espiral aleatoria rígida en combinación con los hidratos de carbono hidrófilos ramificados hidrófilos que constituyen los dominios de mucina fuertemente glucosilados es particularmente útil para aumentar el radio hidrodinámico de la proteína activa más allá de lo que se esperaría basado en el peso molecular de la proteína expresada. También debido al alto nivel de glicosilación, la adición de un dominio mucina tiene el potencial de modificar las propiedades fisicoquímicas de una proteína tales como la carga, la solubilidad y las propiedades viscoelásticas de las soluciones concentradas de la proteína activa.

Las composiciones de la proteína de fusión y los métodos de la presente invención mejoran las propiedades biológicas, farmacológicas, de seguridad y/o farmacéuticas de una proteína activa.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden un polipéptido con dominio mucina unido covalentemente a una proteína activa que tiene propiedades mejoradas (por ejemplo, propiedades farmacocinéticas y/o fisicoquímicas) en comparación con la misma proteína activa no unida al polipéptido con dominio mucina, así como a métodos para producir y usar las proteínas de fusión de la invención.

En una realización, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende un polipéptido con dominio mucina unido a una proteína activa mediante un enlazador opcional en el que el polipéptido con dominio mucina está glicosilado y comprende la SEQ ID NO: 20 o cualquier secuencia de aminoácidos homóloga a la misma con al menos 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, en el que la proteína activa es IL-1Ra o exendina-4 o cualquier secuencia de aminoácidos idéntica a la misma con al menos 90 % de identidad de secuencia; y en el que la semivida de la proteína de fusión aumenta dos veces en comparación con la semivida de la proteína activa correspondiente que no está fusionada con el polipéptido con dominio mucina.

En una realización, la invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión de la invención, así como vectores y células hospedadoras para expresar los ácidos nucleicos de la invención.

En una realización, la invención proporciona métodos para prolongar la semivida sérica de una proteína activa terapéutica que comprende:

a) proporcionar una proteína activa terapéutica, en la que la proteína activa es IL-1Ra o exendina-4 o cualquier secuencia de aminoácidos idéntica a la misma con al menos 90 % de identidad de secuencia;

b) unir la proteína activa terapéutica a un polipéptido con dominio mucina que comprende la SEQ ID NO: 20 para formar una proteína de fusión; y

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c) medir la semivida sérica de la proteína de fusión después de la administración de una dosis terapéuticamente eficaz a un sujeto y determinar que la semivida se ha incrementado en comparación con la proteína terapéutica correspondiente sola cuando también se administra a una dosis terapéutica comparable. En una realización, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión de la invención.

En una realización, la invención proporciona las composiciones farmacéuticas de la invención para su uso en medicina

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1. Gel de SDS/poliacrilamida teñido con azul de Coomassie (A) y gel de IEF (B) de construcciones de

mucina IL1Ra. Las flechas indican las proteínas de interés. La multiplicidad de bandas de gel IEF indica especies

cargadas de forma diferente, muy probablemente debido a diferencias en la N-glicosilación

FIG. 2. Cromatograma de filtración en gel de RDB1813 (gris) y patrones de tamaño molecular (negro). Los pesos

moleculares de los patrones y el peso molecular aparente de RDB1813 se indican encima de cada pico de

elución.

FIG. 3. Cromatograma de filtración en gel de RDB1814 (gris) y patrones de tamaño molecular (negro). Los pesos moleculares de los patrones y el peso molecular aparente de RDB1814 se indican encima de cada pico de elución.

FIG. 4. Cromatograma de filtración en gel de RDB1826 (gris) y patrones de tamaño molecular (negro). Los pesos moleculares de los patrones y el peso molecular aparente de RDB1826 se indican encima de cada pico de elución.

FIG. 5. Cromatograma de filtración en gel de RDB1815 (gris) y patrones de tamaño molecular (negro). Los pesos moleculares de los patrones y el peso molecular aparente de RDB1815 se indican encima de cada pico de elución.

FIG. 6. Cromatograma de filtración en gel de RDB1816 (gris) y patrones de tamaño molecular (negro). Los pesos moleculares de los patrones y el peso molecular aparente de RDB1816 se indican encima de cada pico de elución.

FIG. 7. Inhibición de la señalización de IL1(3 por RDB1813 (2TR) y RDB1814 (4TR) en el ensayo HEK-blue.

Actividad de IL1(3 (—■—) como una función de su concentración en ausencia de inhibición. La inhibición por

RDB1813 (‘"X"), RDB1814 (—>«■*■■■■) y IL1Ra (Anakinra se midieron en la presencia de 15pM de IL1(3.

Todas las mediciones se realizaron por duplicado. Los valores estimados de IC50 se indican en la esquina superior derecha de la figura.

FIG. 8. Inhibición de la señalización de IL1(3 por RDB1826 (6TR) en el ensayo HEK-blue. Actividad de IL1(3 (...■....) como una función de su concentración en ausencia de inhibición. La inhibición por RDB1826 ( ...) y

IL1Ra (Anakinra ^ ) se midieron en la presencia de 15pM de IL1(3. Todas las mediciones se realizaron por duplicado. Los valores estimados de IC50 se indican en la esquina superior derecha de la figura.

FIG. 9. Inhibición de la señalización de IL1(3 por RDB1815 (8TR) y RDB1816 (12TR) en el ensayo HEK-blue. Actividad de IL1(3 (............■...........) como una función de su concentración en ausencia de inhibición. La inhibición por

RDB1815 RDB1816 (—.&>•■■■) y IL1Ra (Anakinra se midieron en la presencia de 15pM of IL1(3.

Todas las mediciones se realizaron por duplicado. Los valores estimados de IC50 se indican en la esquina superior derecha de la figura.

FIG. 10. Mediciones de la Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) de la unión de RDB1813 al receptor IL1RI de ratón inmovilizado. Los sensogramas y las curvas ajustadas se muestran en gris y negro, respectivamente. Los parámetros cinéticos de RDB1813 y anakinra (datos no mostrados) se muestran en el recuadro.

FIG. 11. Mediciones de la Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) de la unión de RDB1814 al receptor IL1RI de ratón inmovilizado. Los sensogramas y las curvas ajustadas se muestran en gris y negro, respectivamente. Los parámetros cinéticos de RDB1814 y anakinra (datos no mostrados) se muestran en el recuadro.

FIG. 12. Mediciones de la Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) de la unión de RDB1826 al receptor IL1RI de ratón inmovilizado. Los sensogramas y las curvas ajustadas se muestran en gris y negro, respectivamente. Los parámetros cinéticos de RDB1826 y anakinra (datos no mostrados) se muestran en el recuadro.

FIG. 13. Mediciones de la Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) de la unión de RDB1815 al receptor IL1RI de ratón inmovilizado. Los sensogramas y las curvas ajustadas se muestran en gris y negro, respectivamente. Los parámetros cinéticos de RDB1815 y anakinra (datos no mostrados) se muestran en el recuadro.

FIG. 14. Mediciones de la Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) de la unión de RDB1816 al receptor IL1RI de ratón inmovilizado. Los sensogramas y las curvas ajustadas se muestran en gris y negro, respectivamente. Los parámetros cinéticos de RDB1816 y anakinra (datos no mostrados) se muestran en el recuadro.

FIG. 15. Diseño experimental para la evaluación de RDB1816 en el modelo de inflamación CAIA de ratón.

Fig. 16. Los efectos inhibidores de una sola inyección de 20 mg/kg de RDB1816 ( -*■), IL1Ra (Anakinra *♦•), y control de solución salina ( *') en el modelo de inflamación CAIA de ratón. Las flechas negras indican los días de inyección con el cóctel de anticuerpos monoclonales (mAb) y con LPS y molécula de tratamiento. Se utilizó un grupo de ocho ratones para cada tratamiento y cada punto de tiempo representa la media de cada grupo.

FIG. 17. Perfil farmacocinético de RDB1815 y RDB186 en rata. Los perfiles de concentración plasmática-tiempo se registran para RDB1815 i.v. ( ■ , inyección única de 2,1 mg/Kg [mpk]), inyección SC ( - »■, inyección única

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de 5,6 mpk) y para RDB1816 i.v. (•*», inyección única 2,4 mpk), inyección SC ( inyección única 6,4 mpk). Los símbolos representan la media de tres ratas diferentes por condición. Los parámetros farmacocinéticos para los grupos SC se resumen en la tabla.

FIG. 18. Gel de SDS/poliacrilamida teñido con azul de Coomassie de la construcción de mucina exendina-4 RDB2203.

FIG. 19. Cromatograma de filtración en gel de RDB2203 (gris) y patrones de tamaño molecular (gris). Los pesos moleculares de los patrones se indican encima de cada pico de elución.

FIG. 20. Ensayo de actividad GLP-1R para RDB2203 y exendina-4.

FIG. 21. Perfil farmacocinético de RDB2203.

Descripción detallada de la invención

A continuación se incluye una descripción de las realizaciones preferidas de la invención.

Definiciones

Como se usa en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique lo contrario.

Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las formas singulares “un(o)”, “una” y “el” incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión “una célula” incluye una pluralidad de células, que incluyen mezclas de las mismas.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar no interrumpido por aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que se ha modificado, por ejemplo, mediante formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, tal como la conjugación con un componente de marcado.

Como se usa en la presente memoria, el término “aminoácido” se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, que incluyen, pero no se limitan a, glicina y ambos isómeros ópticos D o L, y análogos de aminoácidos y peptidomiméticos. Para designar los aminoácidos se usan los códigos estándar de una o tres letras.

La expresión “no natural”, tal como se aplica a las secuencias y tal como se usa en la presente memoria, significa secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas que no tienen homólogas a, no son complementarias a, o no tienen un alto grado de homología con una secuencia de tipo silvestre o natural encontrada en un mamífero. Por ejemplo, un polipéptido no natural puede compartir no más del 99 %, 98 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 % o incluso menos identidad de secuencia de aminoácidos en comparación con una secuencia natural cuando esté adecuadamente alineado.

Los términos “glicosilación” y “glicosilada” se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a la porción de carbohidrato de una proteína o al proceso mediante el cual los azúcares se unen postraduccionalmente a las proteínas durante su producción en las células para formar glicoproteínas. La glicosilación de proteínas es un evento postraduccional y se refiere a la unión de glucanos a serina y treonina y, en menor medida a hidroxiprolina e hidroxilisina en el caso de la glucosilación ligada a O, o asparagina, en el caso de la glicosilación ligada a N.

Un “fragmento” es una forma truncada de una proteína activa nativa que retiene al menos una porción de la actividad terapéutica y/o biológica. Una “variante” es una proteína con homología de secuencia con la proteína activa nativa que retiene al menos una porción de la actividad terapéutica y/o biológica de la proteína activa. Por ejemplo, una proteína variante puede compartir al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína activa de referencia. Como se usa en la presente memoria, la expresión “resto de proteína activa” incluye proteínas modificadas deliberadamente, como por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, inserciones, o accidentalmente a través de mutaciones.

Una “célula hospedadora” incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor para los vectores sujeto. Las células hospedadoras incluyen la progenie de una única célula hospedadora. La progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en genómica del complemento de ADN total) a la célula parental original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una célula hospedadora incluye células transfectadas in vivo con un vector de esta invención.

“Aislado” cuando se usa para describir los diversos polipéptidos divulgados en la presente memoria, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que generalmente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Como será evidente para los expertos en la materia, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína,

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anticuerpo o fragmentos del mismo de origen no natural no requiere “aislamiento” para distinguirlo de su homólogo natural. Además, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo, o fragmentos del mismo, “concentrado”, “separado” o “diluido”, se distingue de su homólogo natural en que la concentración o el número de moléculas por volumen es generalmente mayor que la de su homólogo natural. En general, un polipéptido producido por medios recombinantes y expresado en una célula hospedadora se considera “aislado”.

Un polinucleótido o un ácido nucleico que codifica un polipéptido u otro ácido nucleico que codifica polipéptidos “aislado” es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido aislada es distinta de la forma o entorno en el que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido específico tal como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido aislada incluye moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos contenidas en células que ordinariamente expresan el polipéptido donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica o extracromosómica diferente a la de las células naturales.

“Conjugado”, “unido”, “fusionado” y “fusión” se usan indistintamente en la presente memoria. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes químicos más, por cualquier medio que incluya conjugación química o medios recombinantes. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia. Generalmente, “operativamente unido” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y están en fase o en marco de lectura. Una “fusión en marco” se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos (ORF) para formar un ORF continuo más largo, de una manera que mantiene el marco de lectura correcto de los ORF originales. Por lo tanto, la proteína de fusión recombinante resultante es una única proteína que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos normalmente no están unidos en la naturaleza).

En el contexto de polipéptidos, una “secuencia lineal” o una “secuencia” es un orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección del extremo amino al carboxilo en el que los restos que se encuentran próximos en la secuencia están contiguos en la estructura primaria del polipéptido. Una “secuencia parcial” es una secuencia lineal de parte de un polipéptido que se sabe que comprende restos adicionales en una o ambas direcciones.

“Heterólogo” significa derivado de una entidad genotípicamente distinta del resto de la entidad con la que se compara. Por ejemplo, una secuencia rica en glicina eliminada de su secuencia codificante nativa y unida operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es una secuencia heteróloga rica en glicina. El término “heterólogo” tal como se aplica a un polinucleótido, un polipéptido, significa que el polinucleótido o polipéptido se deriva de una entidad genotípicamente distinta de la del resto de la entidad con la que se compara.

Los términos “polinucleótidos”, “ácidos nucleicos”, “nucleótidos” y “oligonucleótidos” se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definidos a partir del análisis de ligamiento, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si está presente, pueden impartirse modificaciones a la estructura de nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleotídicos.

“Recombinante” como se aplica a un polinucleótido significa que el polinucleótido es el producto de varias combinaciones de etapas de clonación, restricción y/o ligamiento in vitro, y otros procedimientos que dan como resultado una construcción que puede expresarse potencialmente en una célula hospedadora.

El término “gen” o la expresión “fragmento de gen” se usan indistintamente en la presente memoria. Se refieren a un polinucleótido que contiene al menos un marco de lectura abierto que es capaz de codificar una proteína particular después de transcribirse y traducirse. Un gen o fragmento de gen puede ser genómico o de ADNc, siempre que el polinucleótido contenga al menos un marco de lectura abierto, que puede cubrir toda la región de codificación o un segmento de la misma. Un “gen de fusión” es un gen compuesto por al menos dos polinucleótidos heterólogos que están unidos entre sí.

“Homología” u “homólogo” se refiere a la similitud de secuencia o intercambiabilidad entre dos o más secuencias de polinucleótidos o dos o más secuencias de polipéptidos. Cuando se usa un programa como BestFit para determinar la identidad de secuencia, similitud u homología entre dos secuencias de aminoácidos diferentes, se pueden usar las configuraciones predeterminadas, o se puede seleccionar una matriz de puntuación apropiada, como blosum45 o blosum80, para optimizar la identidad, la similitud o puntuaciones de homología. Preferiblemente, los polinucleótidos

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que son homólogos son aquellos que se hibridan en condiciones rigurosas como se define en la presente memoria y tienen al menos 70 %, preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 90 %, más preferiblemente 95 %, más preferiblemente 97 %, más preferiblemente 98 % e incluso más preferiblemente el 99 % de identidad de secuencia con esas secuencias.

Las expresiones “condiciones rigurosas” o “condiciones de hibridación rigurosas” incluyen referencias a condiciones en las cuales un polinucleótido se hibridará con su secuencia diana, en un grado detectablemente mayor que otras secuencias (p.ej., al menos 2 respecto al fondo). Generalmente, la rigurosidad de la hibridación se expresa, en parte, con referencia a la temperatura y la concentración de sal bajo la cual se lleva a cabo la etapa de lavado. Generalmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es menor que aproximadamente 1,5 M de iones Na, generalmente aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de concentración de iones Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para polinucleótidos cortos (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para polinucleótidos largos (p.ej., más de 50 nucleótidos), por ejemplo, las “condiciones rigurosas” pueden incluir hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y tres lavados durante 15 min cada uno en 0,1 * SSC/1 % de SDS a 60 a 65 °C. Como alternativa, se pueden usar temperaturas de aproximadamente 65 °C, 60 °C, 55 °C o 42 °C. La concentración de SSC puede variar de aproximadamente 0,1 a 2xSSC, estando presente SDS a aproximadamente 0,1 %. Dichas temperaturas de lavado generalmente se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C a 20 °C por debajo del punto de fusión térmico para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (con una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente adaptada. Una ecuación para calcular la Tm y las condiciones para la hibridación de ácido nucleico es bien conocida y se puede encontrar en Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview N.Y.; específicamente, véase el Volumen 2 y el Capítulo 9. Generalmente, los reactivos de bloqueo se usan para bloquear la hibridación no específica. Dichos reactivos de bloqueo incluyen, por ejemplo, ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado a aproximadamente 100-200 |jg/ml. El disolvente orgánico, tal como formamida a una concentración de aproximadamente 35-50 % v/v, también se puede usar en circunstancias particulares, tal como para hibridaciones de ARN:ADN. Las variaciones útiles en estas condiciones de lavado serán evidentes para los expertos en la materia.

Las expresiones “porcentaje de identidad” y “% de identidad”, tal como se aplican a las secuencias de polinucleótidos, se refieren al porcentaje de coincidencias de restos entre al menos dos secuencias de polinucleótidos alineadas usando un algoritmo estandarizado. Dicho algoritmo puede insertar, de forma estandarizada y reproducible, espacios en las secuencias que se están comparando para optimizar la alineación entre dos secuencias, y por lo tanto lograr una comparación más significativa de las dos secuencias. El porcentaje de identidad puede medirse a lo largo de una secuencia de polinucleótidos definida completa, por ejemplo, tal como se define mediante un número de SEQ ID particular, o puede medirse en una longitud más corta, por ejemplo, a lo largo de la longitud de un fragmento tomado de un fragmento más grande, secuencia de polinucleótidos definida, por ejemplo, un fragmento de al menos 45, al menos 60, al menos 90, al menos 120, al menos 150, al menos 210 o al menos 450 restos contiguos. Dichas longitudes son solamente a modo de ejemplo, y se entiende que cualquier longitud de fragmento soportada por las secuencias mostradas aquí, en las Tablas, Figuras o Listado de Secuencias, se puede usar para describir una longitud sobre la que se puede medir el porcentaje de identidad.

“Porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos” con respecto a las secuencias polipeptídicas identificadas en la presente memoria, se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia de consulta que son idénticos a los restos de aminoácidos de una segunda secuencia polipeptídica de referencia o porción de la misma, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando un software informático disponible públicamente tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAr). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr una alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. El porcentaje de identidad puede medirse a lo largo de una secuencia polipeptídica definida completa, por ejemplo, como se define mediante un número de SEQ ID particular, o puede medirse en una longitud más corta, por ejemplo, a lo largo de un fragmento tomado de un fragmento más grande, secuencia polipeptídica definida, por ejemplo, por un fragmento de al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 70 o al menos 150 restos contiguos. Dichas longitudes son solamente a modo de ejemplo, y se entiende que cualquier longitud de fragmento soportada por las secuencias mostradas en la presente memoria, en las Tablas, Figuras o Listado de Secuencias, se puede usar para describir una longitud sobre la que se puede medir el porcentaje de identidad.

Un “vector” es una molécula de ácido nucleico, preferiblemente autorreplicante en un hospedador apropiado, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada en y/o entre células hospedadoras. El término incluye vectores que funcionan principalmente para la inserción de aDn o ARN en una célula, la replicación de vectores que funcionan principalmente para la replicación de ADN o ARN, y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. También se incluyen los vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriores. Un “vector de expresión” es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula

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hospedadora apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido(s). Un “sistema de expresión” normalmente connota una célula hospedadora adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar para producir un producto de expresión deseado.

“Resistencia a la degradación”, tal como se aplica a un polipéptido, se refiere a la capacidad de los polipéptidos para resistir la degradación en sangre o componentes de los mismos, que generalmente implica proteasas en el suero o plasma, o dentro de una formulación destinada a almacenamiento o administración de un vehículo para una proteína. La resistencia a la degradación puede medirse combinando la proteína con sangre, suero, plasma humanos (o de ratón, rata, mono, según corresponda), o una formulación, generalmente durante un intervalo de días (p.ej., 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 días), a temperaturas específicas tales como -80 °C, -20 °C, 0 °C, 4 °C, 25 °C y 37 °C. La proteína intacta en las muestras se mide utilizando técnicas convencionales de cuantificación de proteínas. El punto temporal en el que se degrada el 50 % de la proteína es la “semivida de degradación” de la proteína.

El término “semivida” generalmente se refiere al tiempo requerido para que la concentración plasmática de un fármaco se reduzca a la mitad. Los términos y expresiones “semivida”, “W, “semivida de eliminación “y” semivida circulante “se usan indistintamente en este documento.

El “radio hidrodinámico” es el radio aparente (Rh en nm) de una molécula en una solución calculada a partir de propiedades difusionales. El “radio hidrodinámico” de una proteína afecta a su velocidad de difusión en solución acuosa, así como a su capacidad para migrar en geles de macromoléculas. El radio hidrodinámico de una proteína está influenciado por su peso molecular, así como por su estructura, incluyendo la forma y la compacidad, y su estado de hidratación. Los métodos para determinar el radio hidrodinámico son bien conocidos en la técnica, tal como mediante el uso de DLS y cromatografía de exclusión por tamaño. La mayoría de las proteínas tienen estructura globular, que es la estructura tridimensional más compacta que una proteína puede tener con el radio hidrodinámico más pequeño. Algunas proteínas adoptan una conformación aleatoria y abierta, no estructurada o “lineal” y como resultado tienen un radio hidrodinámico mucho mayor en comparación con las proteínas globulares típicas de peso molecular similar.

Las “condiciones fisiológicas” se refieren a un conjunto de condiciones en un hospedador vivo, así como a las condiciones in vitro, incluyendo temperatura, concentración de sal, pH, que imitan esas condiciones de un sujeto vivo. Se han establecido una serie de condiciones fisiológicamente relevantes para su uso en ensayos in vitro. Generalmente, un tampón fisiológico contiene una concentración fisiológica de sal y se ajusta a un pH neutro que varía de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,8, y preferiblemente de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5. Una variedad de tampones fisiológicos se enumeran en Sambrook et al. (1989). La temperatura fisiológicamente relevante varía de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 38 °C, y preferiblemente de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 37 °C.

“Agente de liberación controlada”, “agente de liberación lenta”, “formulación de depósito” o “agente de liberación sostenida” se usan indistintamente para referirse a un agente capaz de prolongar la duración de la liberación de un polipéptido de la invención en relación con la duración de la liberación cuando el polipéptido se administra en ausencia de agente. Diferentes realizaciones de la presente invención pueden tener diferentes velocidades de liberación, dando como resultado diferentes cantidades terapéuticas.

El término “antagonista”, como se usa en la presente memoria, incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido nativo divulgado en la presente memoria. Los métodos para identificar antagonistas de un polipéptido pueden comprender poner en contacto un polipéptido nativo con una molécula antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido nativo. En el contexto de la presente invención, los antagonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, anticuerpos o cualquier otra molécula que disminuya el efecto de una proteína activa.

El término “agonista” se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido nativo divulgado en la presente memoria. Las moléculas agonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos agonistas, fragmentos o variantes de secuencias nativas de aminoácidos de polipéptidos, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los métodos para identificar agonistas de un polipéptido nativo pueden comprender poner en contacto un polipéptido nativo con una molécula agonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido nativo.

“Actividad” para los fines de la presente invención se refiere a una acción o efecto de un componente de una proteína de fusión consistente con la de la proteína activa nativa correspondiente, en la que “actividad biológica” o “bioactividad” se refiere a una función o efecto biológico in vitro o in vivo, que incluye, pero no se limita a, unión a un receptor, actividad antagonista, actividad agonista o una respuesta celular o fisiológica.

Como se usa en la presente memoria, “tratamiento” o “tratar” o “aliviar” o “mejorar” se usan de forma indistinta en la presente memoria. Estos términos se refieren a un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados que

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incluyen, pero no se limitan a, un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se entiende la erradicación o la mejora del trastorno subyacente que se está tratando. Además, se logra un beneficio terapéutico con la erradicación o mejora de uno o más de los síntomas fisiológicos asociados con el trastorno subyacente de modo que se observa una mejora en el sujeto, a pesar de que el sujeto todavía puede estar afectado por el trastorno subyacente. Para beneficio profiláctico, las composiciones se pueden administrar a un sujeto con riesgo de desarrollar una enfermedad particular, o a un sujeto que refiere uno o más de los síntomas fisiológicos de una enfermedad, incluso aunque no se haya realizado un diagnóstico de esta enfermedad.

Un “efecto terapéutico”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un efecto fisiológico, que incluye pero no se limita a la cura, mitigación, mejora o prevención de enfermedades en humanos u otros animales, o para mejorar el bienestar físico o mental de los seres humanos o animales, provocados por una proteína de fusión de la invención distinta de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por la proteína activa. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en este documento.

Las expresiones “cantidad terapéuticamente efectiva” y “dosis terapéuticamente efectiva”, como se usan en la presente memoria, se refieren a una cantidad de una proteína activa, sola o como parte de una composición de proteína de fusión, que es capaz de tener cualquier efecto beneficioso detectable en cualquier síntoma, aspecto, parámetro medido o características de un estado patológico o afección cuando se administra en una o en dosis repetidas a un sujeto. Tal efecto no necesita ser en absoluto beneficioso.

La expresión “régimen posológico terapéuticamente eficaz”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un esquema para la administración de dosis consecutivamente de una proteína activa, sola o como parte de una composición de proteína de fusión, en la que las dosis se administran en cantidades terapéuticamente efectivas para dar como resultado un efecto beneficioso sostenido sobre cualquier síntoma, aspecto, parámetro medido o características de un estado patológico o afección.

Proteínas de fusión

La invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden un polipéptido con dominio mucina unido a una proteína activa. Dichas proteínas también se denominan en la presente memoria proteínas “mucinadas”. Como se usa en la presente memoria, una “proteína de fusión” de la invención comprende un polipéptido con dominio mucina unido a una proteína activa. En un aspecto, el polipéptido con dominio mucina y la proteína activa normalmente existen en proteínas separadas y se unen en la proteína de fusión; o pueden existir normalmente en la misma proteína pero se colocan en una nueva disposición en la proteína de fusión. Las composiciones y métodos de la invención son particularmente útiles para potenciar las propiedades farmacocinéticas, en particular la semivida de una proteína activa cuando se fusiona con un polipéptido con dominio mucina. En un aspecto, las proteínas de fusión divulgadas en la presente memoria retienen la totalidad o una parte de la actividad biológica y/o terapéutica de la proteína activa correspondiente no unida a un polipéptido con dominio mucina. En un aspecto, la actividad terapéutica/biológica de la proteína activa se mejora cuando se fusiona con un polipéptido con dominio mucina para formar una proteína de fusión. En un aspecto, la proteína de fusión de acuerdo con la invención excluye específicamente moléculas de inmunoglobulina o cualquier molécula que contenga un dominio Fc, o cualquier fragmento del mismo. En un aspecto, la proteína de fusión o cualquier porción de la misma no está glicosilada por a- 1,3-galactosiltransferasa o p-1,6-acetilglucosaminiltransferasa. En un aspecto, la proteína de fusión no se une a un anticuerpo específico para aGal. En un aspecto, la proteína de fusión de la invención no se une a un anticuerpo específico Gal a1, 3Gal.

Las proteínas mucina y los dominios mucina de proteínas contienen un alto grado de glicosilación que estructuralmente permite que las proteínas mucina y otros polipéptidos que comprenden dominios mucina se comporten como espirales aleatorias rígidas. Esta estructura en espiral aleatoria rígida en combinación con los hidratos de carbono hidrófilos ramificados que constituyen los dominios de mucina fuertemente glicosilados es particularmente útil para aumentar el radio hidrodinámico de la proteína activa más allá de lo que se esperaría basado en el peso molecular de la proteína expresada. También debido al alto nivel de glicosilación, la adición de un dominio mucina también tiene el potencial de modificar las propiedades fisicoquímicas de una proteína, tales como la carga, la solubilidad y las propiedades viscoelásticas de soluciones concentradas de la proteína activa. Las proteínas de fusión muciladas de la invención tienen varias ventajas respecto a las estrategias de la técnica anterior para prolongar la semivida de las proteínas. Las proteínas de fusión de la invención se pueden producir a través de medios de expresión convencionales sin la necesidad de otras etapas de conjugación y purificación. Los polipéptidos con dominio mucina pueden estar unidos a la proteína activa a través del extremo N o C de la proteína activa. Los polipéptidos con dominio mucina son estructuralmente menos restrictivos que otras parejas de fusión porque son proteínas monoméricas no globulares que tienen un volumen reducido y un menor riesgo de impacto sobre la bioactividad. El uso de dominios mucina disminuye el riesgo de bioactividades endógenas tales como las funciones efectoras Fc. Cuando se usan para preparar agentes terapéuticos humanos, las proteínas de fusión de la invención pueden comprender secuencias completamente humanas con alta glucosilación para reducir el riesgo de inmunogenicidad.

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La actividad de las composiciones de proteína de fusión de la invención, que incluyen las características funcionales o la actividad biológica y farmacológica y los parámetros que resultan, se pueden determinar mediante cualquier ensayo de selección adecuado conocido en la técnica para medir la característica deseada. La actividad y la estructura de las proteínas de fusión pueden medirse mediante ensayos descritos en la presente memoria, ensayos de los Ejemplos o mediante métodos conocidos en la técnica para determinar la semivida, el grado de solubilidad, la estructura y la retención de la actividad biológica de las composiciones de la invención, así como comparaciones con proteínas activas que no son proteínas de fusión de la invención.

Cuando se hace referencia a la proteína de fusión, el término “unido” o “fusionado” o “fusión” pretende indicar que el polipéptido con dominio mucina y las proteínas activas se expresan como un único polipéptido en las células de una manera que permite la glicosilación unida al O del polipéptido con dominio mucina y mantiene la actividad de la proteína activa. En una realización, el polipéptido con dominio mucina se puede unir opcionalmente a la proteína activa a través de un enlazador de aminoácido. El enlazador de aminoácido puede comprender adicionalmente una secuencia de escisión que puede diseñarse para liberar la proteína activa tras la administración de la proteína de fusión a un sujeto.

Opcionalmente, la proteína de fusión que comprende la proteína activa fusionada al polipéptido del dominio mucina se puede fusionar adicionalmente con uno o más restos adicionales destinados a potenciar la actividad o impartir actividades adicionales a la proteína de fusión. En un aspecto, la proteína de fusión comprende la estructura: A-M-B, en la que A es un compañero de fusión N-terminal, M es un dominio mucina y B es un compañero de fusión C- terminal. A y B pueden comprender identidades similares y diferentes. En un aspecto de esta realización, A y B son restos bioactivos que pueden actuar de forma independiente o sinérgica de una manera que incluye, pero no se limita a, agonismo, antagonismo, actividad enzimática, dirigirse a proteínas o células específicas, reactividad química u oligomerización. En otro aspecto, cuando A y B son lo mismo, la mejora de la actividad se lleva a cabo a través de la avidez.

Una proteína de fusión de la invención se puede producir mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan juntos en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos terminados romos o escalonados para la ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar los extremos apropiados, rellenando de extremos cohesivos según corresponda, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable y ligación enzimática. En otro aspecto, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automáticos. Como alternativa, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo utilizando cebadores de anclaje que dan lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que pueden ser posteriormente hibridados y reamplificados para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992). Hay comercializados muchos vectores de expresión para utilizar en las fracciones de fusión y se analizarán con más detalle a continuación.

Polipéptido con dominio mucina

Un “polipéptido con dominio mucina” se define en la presente memoria como cualquier proteína que comprende un “dominio mucina”. Un dominio mucina es rico en sitios de glicosilación potenciales, y tiene un alto contenido de serina y/o treonina y prolina, que puede representar más del 40 % de los aminoácidos dentro del dominio mucina. Un dominio mucina está muy glicosilado con glicanos predominantemente enlazados a O. Un polipéptido con dominio mucina tiene al menos aproximadamente un 60 %, al menos un 70 %, al menos 80 %, o al menos 90 % de su masa debido a los glucanos. Los dominios de mucina pueden comprender unidades de repetición de aminoácidos en tándem (también denominadas aquí TR) que pueden variar en longitud desde aproximadamente 8 aminoácidos hasta 150 aminoácidos por cada unidad de repetición en tándem. El número de unidades de repetición en tándem puede variar entre 1 y 25 en un polipéptido con dominio mucina de la invención.

Los polipéptidos con dominio mucina divulgados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, proteínas mucina. Una “porción del mismo” significa que el enlazador polipéptido de mucina comprende al menos un dominio mucina de una proteína mucina. Las proteínas mucina incluyen cualquier proteína codificada por un gen MUC (es decir, MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9, MUC11, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, MUC20, MUC21). El dominio mucina de una proteína mucina está generalmente flanqueado en ambos lados por regiones de aminoácidos no repetitivas. Un polipéptido con dominio mucina puede comprender la totalidad o una porción de una proteína mucina (por ejemplo, mUc20) que incluye la porción extracelular de la proteína mucina, la porción de secuencia señal de la proteína mucina, el dominio transmembrana de la proteína mucina y/o el dominio citoplasmático de la proteína mucina. Un polipéptido con dominio mucina puede comprender la totalidad o una porción de una proteína mucina de una proteína mucina soluble. Preferiblemente, el polipéptido con dominio mucina comprende la porción extracelular de una proteína mucina.

Un polipéptido con dominio mucina también puede comprender la totalidad o una porción de una proteína que comprende un dominio mucina pero que no está codificada por un gen de MUC. Dichas proteínas naturales que no

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están codificadas por un gen MUC pero que comprenden dominios mucina incluyen, pero no se limitan a, proteínas ancladas a la membrana tales como inmunoglobulina transmembrana y proteínas de la familia del dominio mucina (TIM), fractalquina (neurotactina), ligando de glucoproteína de P-selectina 1 (PSGL-1, CD162), E-selectina, L- selectina, P-selectina, CD34, CD43 (leucosialina, sialoforina), CD45, CD68, CD96, CD164, GlyCAM-1, MAdCAM, glicoforinas de eritrocitos, glicocalicina, glicoforina, LDL-R, ZP3, endosialina, factor de aceleración de decaimiento (daf, CD55), podocalixina, endoglicano, alfa-distroglicano, neurofascina, EMR1, EMR2, EMR3, EMR4, ETL y epiglicanina.

Un polipéptido con dominio mucina también puede comprender un polipéptido no natural que tiene un dominio mucina como se define dicho término en la presente memoria. En un aspecto, el polipéptido con dominio mucina está diseñado de novo para comprender un dominio mucina. En un aspecto, un polipéptido con dominio mucina comprende dominios de repeticiones de aminoácidos en tándem que son ricas en Pro, Ser y Thr. En un aspecto, el número de unidades de repetición en tándem en un polipéptido con dominio mucina está entre 1 y 25. Preferiblemente, el número de unidades de repetición en tándem en un polipéptido con dominio mucina está entre 2 y 20. Más preferiblemente, el número de unidades de repetición en tándem en un polipéptido con dominio mucina es al menos aproximadamente 4. En un aspecto adicional, el porcentaje de restos de serina y/o treonina y prolina en un polipéptido con dominio mucina es al menos 10 %. Preferiblemente, el porcentaje de restos de serina y/o treonina y prolina en un polipéptido con dominio mucina es al menos 20 %. Más preferiblemente, el porcentaje de restos de serina y/o treonina y prolina en un polipéptido con dominio mucina es mayor que 30 %. En un aspecto final, cada unidad de repetición de aminoácidos en tándem dentro del dominio mucina está compuesta por al menos 8 aminoácidos. Preferiblemente, cada unidad está compuesta por al menos 16 aminoácidos. Más preferiblemente, cada unidad está compuesta por al menos 19 aminoácidos, y cada unidad puede variar en longitud desde aproximadamente 19 aminoácidos hasta 150 aminoácidos.

En un aspecto, el polipéptido con dominio mucina comprende al menos 32 aminoácidos, que comprende al menos un 40 % de serina, treonina y prolina. En un aspecto, un polipéptido con dominio mucina comprende al menos 2, 4, 8, 10 o 12 unidades repetitivas de aminoácidos en tándem de al menos 8 aminoácidos de longitud por unidad repetitiva en tándem. Las secuencias de aminoácidos preferidas de una unidad repetitiva en tándem incluyen, pero no se limitan a, las de la Tabla I. El polipéptido con dominio mucina y/o ácidos nucleicos que codifican el polipéptido con dominio mucina se pueden construir usando secuencias codificadoras del dominio mucina de proteínas que son conocidas en la técnica y están disponibles públicamente a través de fuentes como GenBank.

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   REIVINDICACIONES

   1. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido con dominio mucina unido a al menos una proteína activa mediante un enlazador opcional en la que el polipéptido con dominio mucina está glicosilado y comprende la SEQ ID NO: 20 o cualquier secuencia de aminoácidos homóloga a la misma con al menos un 90 % de identidad de la secuencia de aminoácidos, en la que la proteína activa es IL-1Ra o exendina-4 o cualquier secuencia de aminoácidos idéntica a la misma con al menos 90 % de identidad de secuencia; y en la que la semivida de la proteína de fusión es dos veces mayor en comparación con la semivida de la proteína activa correspondiente que no está fusionada con el polipéptido con dominio mucina.
2. 2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el polipéptido con dominio mucina comprende al menos dos repeticiones en tándem de SEQ ID NO: 20.
3. 3. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el peso molecular aparente de la proteína de fusión es mayor que el peso molecular calculado de la proteína de fusión.
4. 4. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende los aminoácidos 4-200 de SEQ ID NO: 1.
5. 5. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende los aminoácidos 4-245 de SEQ ID NO: 3.
6. 6. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende los aminoácidos 4-283 de SEQ ID NO: 5.
7. 7. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende los aminoácidos 4-335 de SEQ ID NO: 7.
8. 8. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende los aminoácidos 4-425 de SEQ ID NO: 9.
9. 9. Una proteína de fusión de la reivindicación 1 que comprende los aminoácidos 1-224 de secuencia de la SEQ ID NO: 24.
10. 10. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. 11. Un vector de expresión que comprende la secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 10, que comprende además preferiblemente una secuencia reguladora recombinante operativamente unida a la secuencia de polinucleótidos.
12. 12. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 11.
13. 13. Un método para aumentar la semivida sérica de una proteína activa terapéutica que comprende:

    a) proporcionar una proteína activa terapéutica, en el que la proteína activa es IL-1Ra o exendina-4 o cualquier secuencia de aminoácidos idéntica a la misma con al menos 90 % de identidad de secuencia;

    b) unir la proteína activa terapéutica a un polipéptido con dominio mucina, que comprende la SEQ ID NO: 20 para formar una proteína de fusión; y

    c) medir la semivida sérica de la proteína de fusión después de la administración de una dosis terapéuticamente efectiva a un sujeto y determinar que la semivida ha aumentado en dos veces en comparación con la proteína terapéutica correspondiente sola cuando también se administra a una dosis terapéutica comparable.
14. 14. El método de la reivindicación 13, en el que el polipéptido con dominio mucina comprende al menos dos repeticiones en tándem de SEQ ID NO: 20.
15. 15. El método de la reivindicación 13, en el que la etapa de unión incluye unir la proteína activa a un polipéptido con dominio mucina a través de un enlazador aminoácido.
16. 16. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 19 y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. 17. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16 para su uso en medicina.
18. 18. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 17 para uso en un método para tratar una enfermedad o trastorno seleccionado de: diabetes tipo 2, hemofilia, neutropenia, anemia, trombocitopenia, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artrosis.

    imagen1

    pl gel IEF

    PM gel SDS

    FIG. 1

    IL1Ra 6TR

    Absorbancia

    Patrones de peso molecular
19. 15.0

    to.o :
20. 5.0

    0,0

    imagen2

    FIG.2

    Absorbancia

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    FIG.3

    imagen4

    imagen5

    Absorbancia

    imagen6

    FIG.6

    Absorbancia

    imagen7

    Concentración (nM)

    FIG. 7

    Absorbancia

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    Absorbancia

    imagen9

    FIG.9

    Respuesta

    NU

    140

    120

    100

    60

    60

    <0

    20

    0

    imagen10

    Datos brutos Ajuste

    imagen11

    Respuesta

    imagen12

    Tiempo (s)

    FIG. 1 í

    Respuesta

    imagen13

    Tiempo (s)

    F1G. 12

    Respuesta

    imagen14

    FIG. 13

    imagen15

    *.*. ' '

    2,8 x 104 1.5

    Anakinra

    '

    Molécula ff.

    Datos brutos

    Ajuste

    sos

    sa

    uno

    • *.»

    m

    r>o:

    Tiempo (s)

    FIG. 14

    Día O

    imagen16

    400 pl (4 mg)

    cóctel de mAb

    Día 3

    imagen17

    • Inyección IP (100 pg) 200 pL LPS

    • Inyección SC del tratamiento

    Día 1,2, 3, 7,14

    imagen18

    Puntuación

    Día 21

    imagen19

    Necropsia

    de anticuerpos (IV)

    Proteína IL-1Ra

    Dosis Conc Vol. dosis Conc Dosis Conc Vol.dosis

    Grupo

    (m9) (mg/ml) (no (mg/ml) (Mi) (mg/kg) (mg/ml) (ml/kg)

    Solución salina

    4 10 mg/ml 400 0,1 0,5 200 0 0 i

    Anakinra

    4 10 mg/ml 400 0,1 0,5 200 20 150 0,13

    12TB (RDB18J6)

    4 10 mg/ml 400 0,1 0,5 200 20 0,5 40

    FIG. 15

    Desplazamiento de volumen (mi)

    Efecto de una inyección SC única del compuesto biológico sobre el edema de la pata en el modelo de ratón CAIA

    imagen20

    ■j -z -i u

    í t

    mAb LPS y Días

    Tratamiento

    FIG. 16

    imagen21

    100000

    1GOOOO

    10000

    1815 - 2.1mpk IV

    10000

    1815 - 5,6mpk SC

    1816 -IV 2,4 mpk

    1000

    1816-SC 6,4 mpk

    100

    Tiempo (h)

    rv SC

    ■00 C1 (ml/min/kg) AUClNF(h*ng/m]) Cmax (ng/mí) Tm (h) AUCÍNF(h*ng/ml) . . ■: :ííí::í! ::: : :: %F

    Anakinra

    125 9 5890 4400 0,8 16300 94 ■

    RDB-1815

    17,9 0,7 50300 2277 11,0 35633 i: ■ 27 j

    RDB-1816

    13,9 0.25 166000 4275 8.0 755S0 . . m

    FIG. 17

    PM

    imagen22

    F1G. 18

    imagen23

    440 kO

    Patrones de peso

    molecular

    ROB2203

    Vacio

    10,0

    12,5 15,0

    20 mi

    Volumen de retención (mi)

    F G. 19

    imagen24

    Concentración sérica (ng/ml)

    FC de LSC 12-261 (exendina-4-mucina) en rata: Media

    imagen25

    
    0 20 40 60 80

    Tiempo (h)

    Exendma-4-mucma AUC(h'r>tf"ll Cm»(f»W| AIXJD {hV«/niA») On»/0|r^W«| Ftbt Tm«(h) 31/2(61 O/F (frt/hAs)

    
    IV(065fr*/k() 04738 1S33715 961] 36 S74S46 1.00 NA ]0> 74.40

    
    $C{0,66m^kjü Í464B 664 ® 99)4 81 10360 1.03 37S 2 59 10.38

    
    SC(7WV«I 83757 3 712S0) 11966® 101796 124 43? 3CB 95 05

    FIG. 21