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ES2665463T3 - Polinucleótidos y polipéptidos implicados en el desarrollo de fibra vegetal y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Polinucleótidos y polipéptidos implicados en el desarrollo de fibra vegetal y métodos de uso de los mismos Download PDF

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ES2665463T3
ES2665463T3 ES11154213.0T ES11154213T ES2665463T3 ES 2665463 T3 ES2665463 T3 ES 2665463T3 ES 11154213 T ES11154213 T ES 11154213T ES 2665463 T3 ES2665463 T3 ES 2665463T3
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ES11154213.0T
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Rafael Meissner
Hagai Karchi
Evgenia Gold
Rodrigo Yelin
Sharon Ayal
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Evogene Ltd
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Abstract

Un método para mejorar el alargamiento de la fibra de una planta, método que comprende expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polinucleótido de longitud completa expuesto en SEQ ID NO: 7, en donde dicho polinucleótido es capaz de regular el desarrollo de la fibra de algodón, mejorando de este modo el alargamiento de la fibra de la planta, en donde dicha mejora de dicho alargamiento de la fibra es en una planta productora de fibra.

Description

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DESCRIPCION
Polinucleótidos y polipéptidos implicados en el desarrollo de fibra vegetal y métodos de uso de los mismos
La presente invención se refiere polinucleótidos y polipéptidos implicados en el desarrollo de fibra vegetal y métodos de uso de los mismos.
La presente invención se refiere a un nuevo enfoque computacional que utiliza la genómica comparativa para identificar los genes que juegan un papel en el desarrollo de la fibra.
El algodón y los subproductos de algodón proporcionan materias primas que se usan para producir una riqueza de productos de consumo además de textiles que incluyen algodón, alimentos, alimentación del ganado, fertilizantes y papel. La producción, la comercialización, el consumo y el comercio de productos a base de algodón generan un exceso de 100 billones de $ anualmente solo en los Ee.UU., lo que hace al algodón el cultivo de valor añadido número uno.
Se estima que el uso de algodón como fibra por los seres humanos se remonta a 7000 años en América Central y a 5000 años en India. Incluso con el crecimiento de las fibras sintéticas en los últimos 50 años, el algodón sigue siendo responsable de aproximadamente el 50% de la fibra textil del mundo [Agrow Reports, Mercado Mundial de Semillas DS208, Octubre 2000].
A pesar de que el 90% del valor del algodón como un cultivo reside en la fibra (hebra), se ha reducido el rendimiento y calidad de la fibra, especialmente en la última década [Meredith (2000), Proc. World Cotton Research Conference II, Atenas, Grecia pgs. 97-101]. Este descenso se ha atribuido a la erosión general en la diversidad genética de las variedades de algodón, y una aumentada vulnerabilidad del cultivo a las condiciones ambientales [Bowman et al., Crop Sci. 36: 577-581 (1996); Meredith, supra].
Hay muchas variedades de planta de algodón, de las que se pueden obtener y usar para diversas aplicaciones fibras de algodón con una gama de características. Las fibras de algodón se pueden caracterizar según una variedad de propiedades, algunas de las cuales se consideran altamente deseables dentro de la industria textil para la producción de productos cada vez de más alta calidad y el óptimo aprovechamiento de las tecnologías modernas de hilado. Propiedades comercialmente deseables incluyen longitud, uniformidad de longitud, finura, relación de madurez, producción de fibra fuzz disminuida, micronaire, fuerza del haz, y fuerza de fibra individual. Se ha puesto mucho esfuerzo en la mejora de las características de las fibras de algodón centrándose principalmente en la longitud de fibra y la finura de fibra. En particular, hay una gran demanda de fibras de algodón de longitudes específicas.
Se pueden clasificar los métodos para mejorar las características o rendimiento de fibras de algodón en las tres siguientes categorías:
1. Mejora de la variedad por cruzamiento
Este método se ha utilizado ampliamente hasta ahora. En la actualidad, casi todas las variedades cultivadas de planta de algodón se crían por este método. Sin embargo, la mejora del rendimiento de fibra de algodón usando cruzamiento tradicional es relativamente lenta e ineficiente y el grado de variabilidad que se puede alcanzar es limitado.
2. Tratamiento con hormonas vegetales.
Se han usado ampliamente hormonas vegetales como auxina, giberelina, citoquinina y etileno en cultivos de campo y productos hortícolas. Es conocida la influencia de hormonas vegetales, particularmente giberelina, auxina y brasinolida, sobre las características de las fibras de plantas de algodón [p. ej. la Patente de EE.UU. N° 5880110 produce fibras de algodón con mejoradas características de fibra mediante tratamiento con brasinosteroides]. Sin embargo, no se ha documentado ningún efecto medible, haciendo el uso práctico de estas hormonas a gran escala altamente improbable.
3. Variedad mejorada por ingeniería genética.
La amplia aceptación del algodón modificado genéticamente en los principales países productores y el hecho de que es un cultivo no alimentario lo convierte en un atractivo candidato para la ingeniería genética para la mejora del rendimiento y/o calidad de fibra.
En los últimos años, se han hecho notables avances en ingeniería genética de plantas como resultado se han informado varios casos exitosos de mejora de variedad de plantas de cultivo comercialmente importantes (p. ej., algodón, soja, maíz, colza, tomate). Por ejemplo, se han desarrollado y puesto en uso práctico métodos de mejora de la resistencia a insectos mediante la introducción de un gen que codifica la toxina BT (es decir, la proteína toxina insecticida producida por Bacillus thuringiensis) en una planta de algodón. Además, se han diseñado genéticamente plantas de algodón con resistencia mejorada a herbicida (Glifosfato) mediante la introducción de un gen que codifica
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el ácido 5-enol-piruvil-shiquímico 3-fosfato sintetasa.
La disponibilidad y el éxito de la ingeniería genética de plantas combinado con el hecho de que el algodón es un candidato excelente para la manipulación genética a través de técnicas recombinantes han llevado a los investigadores a postular que si se puede identificar un gen asociado con una propiedad mejorada de fibra de algodón, se puede regular a la alza usando técnicas recombinantes mejorando así las características o rendimiento de las fibras de algodón. Por el contrario, si se puede identificar un gen asociado con una disminución en una propiedad de la fibra de algodón, se podría regular a la baja usando métodos de silenciamiento génico. Para este propósito, se deben esclarecer los mecanismos de alargamiento y de formación de la fibra a nivel genético y se deben identificar genes estrechamente asociados con estos mecanismos.
Una fibra de algodón se compone de una única célula que se ha diferenciado a partir de una célula epidérmica de la cubierta de la semilla, desarrollándose a través de cuatro etapas, es decir, iniciación, alargamiento, engrosamiento de la pared celular secundaria y etapas de maduración. Más específicamente, el alargamiento de una fibra de algodón comienza en la célula epidérmica del óvulo inmediatamente después de la floración, después de lo cual la fibra de algodón se alarga rápidamente durante aproximadamente 21 días. El alargamiento de la fibra se termina entonces, y se forma una pared celular secundaria y crece a través de la maduración para convertirse en una fibra de algodón madura.
Se han aislados varios genes candidatos que están asociados con el alargamiento y formación de las fibras de algodón. Por ejemplo, se han identificado cinco genes de plantas de algodón que se expresan específicamente en la etapa de alargamiento de la fibra de algodón mediante el método de cribado diferencial y el método de visualización diferencial, [Patente de EE.UU. N° 5.880.100 y solicitudes de patente de EE.UU. N°s de Serie 08/580.545, 08/867.484 y 09/262.653].
WO0245485 describe métodos y medios para modular la calidad de la fibra en plantas productoras de fibra, como algodón, modulando la actividad y/o expresión de la sacarosa sintasa (un azúcar importante para la síntesis de la pared celular) en dichas plantas.
La Patente de EE.UU. N° 6.472.588 y WO0117333 proporcionan métodos para aumentar la calidad de la fibra de algodón producida a partir de una planta de algodón mediante transformación con un ADN que codifica sacarosa fosfato sintasa. Las cualidades de fibra incluyen resistencia, longitud, relación de madurez de fibra, contenido de fibra inmadura, uniformidad de fibra y micronaire.
WO9508914 describe una planta productora de fibra que comprende en su genoma un constructo genético heterólogo. El constructo genético comprende un promotor específico de fibra y una secuencia codificadora que codifica una peroxidasa vegetal, como una peroxidasa de algodón.
WO9626639 proporciona métodos en los que se utiliza una secuencia promotora específica de ovario para expresar hormonas que modifican el crecimiento vegetal en el tejido del óvulo de algodón. Los métodos permiten la modificación de las características del conjunto de cápsula en plantas de algodón y proporcionan un mecanismo para alterar las características de calidad de la fibra como dimensión y resistencia de la fibra.
La Patente de EE.UU. N° 5.981.834, la Patente de EE.UU. N° 5.597.718, la Patente de EE.UU. N° 5.620.882, la Patente de EE.UU. N° 5.521.708 y la Patente de EE.UU. N° 5.495.070 describen todas un método para modificar mediante ingeniería genética una planta productora de fibra y la identificación de clones de cDNA útiles para identificar genes de fibra en el algodón. Los clones de cDNA son útiles en el desarrollo de clones genómicos correspondientes de plantas productoras de fibra para llevar a cabo la ingeniería genética del algodón y otras plantas usando estos genes. Las secuencias codificadoras de estos genes aislados se usan en orientación sentido o anti-sentido para alterar las características de fibra de plantas productoras de fibra transgénicas.
Las solicitudes de patente de EE.UU. 2002049999 y EE.UU. 2003074697 describen ambas plantas de algodón del género Gossypium con características de fibra de algodón mejoradas. La planta de algodón tiene un casete de expresión que contiene un gen que codifica una enzima seleccionada del grupo que consiste en endoxiloglucan transferasa, catalasa y peroxidasa de modo que el gen se expresa en células de fibra de algodón para mejorar las características de la fibra de algodón.
WO 01/40250 proporciona métodos para mejorar la calidad de la fibra de algodón modulando la expresión génica del factor de transcripción.
WO 96/40924 proporciona nuevos constructos de ADN que se pueden usar como sondas moleculares o insertadas alternativamente en una planta huésped para proporcionar la modificación de la transcripción de una secuencia de ADN de interés durante varias etapas del desarrollo de la fibra de algodón. Los constructos de ADN comprenden una región reguladora de iniciación transcripcional de la fibra de algodón asociada con un gen, que se expresa en la fibra de algodón. También se proporciona un algodón nuevo que tiene una fibra de algodón que tiene un color natural. El color se logra mediante la introducción y expresión en la célula de fibra de algodón de un constructo génico de pigmento.
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EP0834566 proporciona un gen que controla el mecanismo de formación de fibra en la planta de algodón y que se puede usar para la mejora industrialmente útil.
Sin embargo, junto a la Sacrosa Sintasa, no hay evidencia hasta la fecha de que la expresión de cualquier gen particular juegue un papel esencial en la formación de la fibra de algodón o características mejoradas de fibra.
Así, sigue habiendo una necesidad para identificar otros genes asociados con características de fibra de plantas de algodón y se requiere una búsqueda más exhaustiva para los genes relacionados con la calidad.
La US 2004031072 se refiere a polinucleótidos útiles para la mejora de plantas. En particular, se proporcionan secuencias de polinucleótidos de fuentes vegetales. También se proporcionan los polipéptidos codificados por las secuencias de polinucleótidos. Los polinucleótidos y polipéptidos descritos encuentran uso en la producción de plantas transgénicas para producir plantas que tienen propiedades mejoradas.
La WO 03098186 proporciona genes de expansión (FE) de la fibra vegetal que codifican polipéptidos FE, como fosfoenol piruvato carboxilasa (PEPcase), expansina, endoglucanasa, xiloglucan endoglicosiltransferasa (XET), y pectin metil esterasa (PME). Proporciona además promotores específicos de fibra. Aún más, la invención proporciona estrategias moleculares para modular la calidad y el rendimiento de la fibra en plantas productoras de fibra modulando la expresión de genes FE o formas mutantes de genes FE.
La US5495070 describe un método para modificar genéticamente una planta productora de fibra. Este método comprende primero la etapa de construir un vector de expresión en plantas que comprende una secuencia que codifica una proteína y una secuencia de ADN capaz de promover la expresión génica en células de fibra, en donde la secuencia de ADN es homóloga a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en 12 secuencias genómicas diferentes. Después el método implica introducir el vector de expresión dentro de una planta productora de fibra en donde la secuencia que codifica la proteína se expresa en las células de fibra de la planta productora de fibra. También se describe un método de obtención de una secuencia de ADN capaz de promover la expresión génica en células de fibra.
La WO 9508914 se refiere a una planta productora de fibra que comprende en su genoma un constructo genético heterólogo. Este constructo genético comprende un promotor específico de fibra y una secuencia codificadora que codifica una peroxidasa vegetal. Preferiblemente, la secuencia codificadora es de peroxidasa de algodón. También se describen las semillas de la planta que contiene este constructo genético y células vegetales que contienen este constructo.
La WO 0117333 se refiere a un método para controlar la síntesis de celulosa en plantas para optimizar el nivel de producción y calidad de los productos derivados de la planta. En particular, proporciona una planta de algodón transgénica que tiene altos rendimientos de fibra y semilla de algodón. También proporciona métodos para aumentar la calidad de la fibra de algodón producida a partir de una planta de algodón. También proporciona métodos generales para cambiar la relación de celulosa con otros componentes de la planta en peso seco, para cambiar el grososr de las paredes celulares, para aumentar el rendimiento y cambiar la calidad de otras fibras vegetales, para aumentar el rendimiento de semilla, y para aumentar la tolerancia de eficacia fotosintética a temperaturas nocturnas frías.
La WO 9626639 se refiere a métodos Novedosos a través de los cuales las secuencias codificadoras que dirigen preferencialmente la expresión génica en tejido de ovario, particularmente en el desarrollo temprano de la fruta, se utilizan para expresar hormonas que modifican el crecimiento vegetal en tejido de óvulo de algodón. Estos métodos permiten la modificación de las características del conjunto de vainas y en plantas de algodón y proporcionan un mecanismo para alterar las características de calidad de fibra como dimensión y fuerza de fibra.
La US 2002049999 tiene que ver con plantas de Algodón del género Gossypium con características de fibra de algodón mejoradas. La planta de algodón tiene un casete de expresión que contiene un gen que codifica una enzima seleccionada del grupo que consiste en endoxiloglucan transferasa, catalasa y peroxidasa para que el gen se exprese en células de fibra de algodón para mejorar las características de la fibra de algodón. También se describe un método para producir fibras de algodón con características de fibra mejoradas a partir de estas plantas de algodón.
La WO 9640924 se refiere a constructos de ADN novedosos que se pueden usar como sondas moleculares o insertarse en un huésped vegetal para proporcionar modificación de la transcripción de una secuencia de ADN de interés durante varias etapas del desarrollo de la fibra de algodón. Los constructos de ADN comprenden una región reguladora de iniciación transcripcional de la fibra de algodón asociada con un gen que se expresa en fibra de algodón. También se proporciona un algodón novedoso que tiene una fibra de algodón que tiene un color natural introducido mediante la expresión en la célula de fibra de algodón, que usa tal constructo, de genes de síntesis de pigmento. Se incluyen células de fibra de algodón que tienen un color generado mediante ingeniería genética y células de algodón que comprenden melanina y pigmentos añil.
“mRNA de proteína desconocida de Arabidopsis thaliana (At3g52610), cds completa”, DATABASE EMBL, (20010613), N° de acceso a la base de datos AY034915.
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“ADN del cromosoma 3 de Arabidopsis thaliana, BAC clon F3C22”, DATABASE EMBL, (20000427), N° de acceso a la base de datos AL353912.
“GA_Eb0026P18f de Gossypium arboreum 7-10 dpa librería de cDNA de fibra de Gossypium arboreum clon GA_ Eb0026P18f, secuencia de mRNA”, DATABASE eMbL, (20001120), N° de acceso a la base de datos BF277249.
“mRNA de expansina de Gossypium hirsutum, cds completa”, DATABASE EMBL, (20030520), N° de acceso a la base de datos AY189969.
Ji Sheng-Jian et al., se refiere a “Aislamiento y análisis de genes expresados preferencialmente durante el desarrollo temprano de la fibra de algodón mediante PCR sustractiva y arrays de cDNA.”, Nucleic Acids Research 15 May 2003, vol. 31, n° 10, ISSN 1362-4962, pags. 2534-2543.
Pero reduciendo la presente invención a la práctica, los presentes inventores idearon y emplearon un nuevo enfoque computacional que utiliza la genómica comparativa para identificar genes que juegan un papel fundamental en el desarrollo de la fibra. Como se ha demostrado en esta memoria, la expresión de dichos genes se correlaciona con la longitud de fibra y su sobre-expresión es suficiente para modificar el pelo de la semilla de tomate, un modelo reciente para fibras de algodón. Estos resultados sugieren que los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden usar para generar plantas de algodón transgénicas que se caracterizan por fibras de longitud deseada.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a un método de mejora del alargamiento de fibra de una planta, método que comprende expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polinucleótido de longitud completa expuesto en SEQ ID NO: 7, en donde dicho polinucleótido es capaz de regular el desarrollo de la fibra de algodón, mejorando de este modo el alargamiento de la fibra de la planta, en donde dicha mejora de dicho alargamiento de la fibra se realiza en una planta productora de fibra.
La presente invención también se refiere a un método de mejora del alargamiento de fibra de una planta, método que comprende expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 112, mejorando de este modo el alargamiento de la fibra de la planta, en donde dicha mejora de dicho alargamiento de la fibra se realiza en una planta productora de fibra.
La presente invención aún se refiere a una célula vegetal transgénica que comprende un constructo de ácido
nucleico que comprende un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polinucleótido
de longitud completa expuesto en SEQ ID NO: 7, y un promotor capaz de regular la expresión de dicho
polinucleótido en la célula vegetal transgénica, en donde dicho promotor es heterólogo a la célula vegetal
transgénica, en donde dicho polinucleótido y célula vegetal transgénica mejora el alargamiento de la fibra de una planta productora de fibra de una planta.
Preferiblemente, dicho polinucleótido es al menos 90% idéntico al polinucleótido de longitud completa expuesto en SEQ ID NO: 7.
Preferiblemente, dicho polinucleótido tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el polinucleótido de longitud completa expuesto en SEQ ID NO: 7.
Preferiblemente, dicho promotor se expone en SEQ ID NO: 74, 75, 85 o 91 de un equivalente funcional del mismo. Preferiblemente, dicho promotor es un promotor constitutivo.
Preferiblemente, dicho promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor inducible, un promotor de desarrollo específico de etapa y un promotor específico de tejido.
La presente invención se refiere a una planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica.
La presente invención se refiere a un método de generar una planta transgénica, que comprende expresar dentro de la planta un constructo de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polinucleótido de longitud completa expuesto en SEQ ID NO: 7, y un promotor capaz de regular la expresión de dicho polinucleótido en una célula vegetal, en donde dicho promotor es heterólogo a la célula vegetal transgénica, en donde dicho polinucleótido mejora el alargamiento de la fibra de una planta productora de fibra, generando de este modo la planta transgénica.
Preferiblemente, dicha planta es algodón.
La presente invención se refiere a un método para producir fibras de algodón, método que comprende:
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(a) generar una planta de algodón transgénica de acuerdo con el método de la reivindicación 11, y
(b) recoger las fibras de la planta de algodón transgénica, produciendo de este modo las fibras de algodón.
Preferiblemente, la planta es una planta monocotiledónea.
Preferiblemente, la planta es una planta dicotiledónea.
Preferiblemente, dicho polinucleótido se expone en SEQ ID NO: 7.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos:
La FIG. 1 es una ilustración que representa la metodología bioinformática de la presente descripción llevada a cabo para identificar genes que se pueden usar para mejorar el rendimiento y calidad de la fibra de algodón.
Las FIGs. 2a-d son gráficos de barras que muestran los patrones de expresión de los genes específicos de fibra (CT_11 Figura 2b), genes asociados con el alargamiento (CT_1, Figura 2c) y genes asociados con la iniciación (CT_22, Figura 2d).
La FIG. 3 es un gráfico que representa la expresión de CT_76 en variedades de plantas de algodón (G. hirsutum var Tamcot, Coker y Acala, y G. barbadense var Prima S5), como se determina por RT-PCR.
La FIG. 4 es una ilustración esquemática del plásmido binario pPi.
Las FIGs. 5a-1 son fotografías de plantas de arabidopsis salvajes y transgénicas que sobre-expresan genes de la presente descripción. La Figura 5a muestra roseta de dos semanas de plantas wt; la Figura 5b muestra roseta de dos semanas de plantas de arabidopsis que sobre-expresan CT11; la Figura 5c muestra raíces de dos semanas de CT11; la Figura 5d muestra arabidopsis salvaje de tres semanas; la Figura 5e muestra CT_20 de tres semanas; la Figura 5f muestra CT_22 de tres semanas; la Figura 5g muestra rosetas de 30 días de wt y de CT_9; la Figura 5h muestra la influorescencia de 30 días de wt y de CT_9; la Figura 5i muestra raíces de dos semanas de CT9; la Figura 5j muestra rosetas de 30 días de wt y de CT_40; la Figura 5k muestra roseta de 5 semanas de plantas wt y que sobre-expresan CT81; la Figura 5l muestra una hoja de plantas de arabidopsis wt y que sobre-expresan CT81.
Las FIGs. 6a-e son fotografías que representan plantas de tomate salvaje y transgénicas que sobre-expresan CT_20. La Figura 6a muestra una hoja de una planta salvaje; la Figura 6b muestra una hoja de un tomate transgénico CT_20; la Figura 6c muestra pelos de semilla de plantas de tomate WT y que sobre-expresan CT_20; la Figura 6d muestra una sección de una semilla de tomate WT; la Figura 6e muestra una sección de una semilla de tomate que sobre-expresa CT_20; la Figura 6f pelos de semilla de WT y de CT_82.
Las FIGs. 7a-b son fotografías que representan plantas de tomate transgénicas que sobre-expresan GUS bajo la expresión del promotor CT_2. La Figura 7a es un corte transversal de fruto de tomate transgénico, que sobreexpresa GUS bajo el promotor CT2 en la etapa verde madura (aumento 5x). La Figura 7b similar a la Figura 7a muestra aumento 25 x;
Las FIGs. 8a-b son fotografías que representan varios aumentos de frutos de tomate o semillas de tomate salvaje y transgénico. La Figura 8a es una semilla de tomate salvaje única cubierta con pelos de semilla aumento 10x; la Figura 8b muestra semilla de tomate que sobre-expresa expansina bajo 35S (aumento 10x).
Descripción de los aspectos preferidos
La presente descripción es de polipéptidos y polinucleótidos que codifican lo mismo que están implicados en el desarrollo de la fibra vegetal y los cuales se pueden usar para mejorar la calidad y/o rendimiento/biomasa de la fibra de una planta productora de fibra.
Los principios y funcionamiento de la presente descripción se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y las descripciones correspondientes.
Antes de explicar al menos un aspecto de la descripción en detalle, se debe entender que la descripción no está limitada en su aplicación a los detalles establecidos en la siguiente descripción o ejemplificados por los Ejemplos. La descripción es capaz de otros aspectos o de paracticarse o de llevarse a cabo de varias maneras. También, se debe entender que la fraseología y terminología empleada en esta memoria es para propósito de la descripción. El algodón y los subproductos de algodón proporcionan materias primas que se usan para producir una gran cantidad de productos de consumo; además de textiles, el algodón se usa para producir productos alimenticios, alimentos para el ganado, fertilizantes y papel. La producción, la comercialización, el consumo y el comercio de productos a base de algodón generan un exceso de 100 billones de $ anualmente solo en los EE.Uu., lo que hace al algodón el
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cultivo de valor añadido número uno.
Durante la pasada década la producción de fibra de algodón ha disminuido drásticamente dando lugar a que los productores e investigadores busquen otros enfoques, que se pueden usar para mejorar el rendimiento y calidad de la fibra.
El aumento de la calidad y/o rendimiento de la fibra bajo diversas condiciones ambientales aumentará la rentabilidad de la producción de cultivos de algodón y proporcionará un nuevo espectro de propiedades del material para la explotación por las industrias de transformación.
Pero reduciendo la presente invención a la práctica, los presentes inventores han configurado un nuevo enfoque informático que utiliza la genómica comparativa para identificar los genes que desempeñan un papel en el desarrollo de la fibra. Los genes identificados usando este enfoque se pueden usar con éxito para generar plantas transgénicas que se caracterizan por fibras de propiedades deseadas.
De esta manera, según un aspecto de la presente descripción se proporciona un método de identificación de genes que están implicados en el desarrollo de la fibra de algodón.
Tal como se usa en esta memoria el término “algodón” se refiere a una variedad cultivada de tipo salvaje (p. ej., híbrido) o una planta de algodón transgénico (Gossypium).
Tal como se usa en esta memoria la frase “desarrollo de la fibra” se refiere al desarrollo del pelo de la semilla de algodón.
Tal como se usa en esta memoria el término “desarrollo” cuando se usa en el contexto de fibras de algodón se refiere a la iniciación de la fibra y/o alargamiento de la misma, así como al engrosamiento y maduración de la pared celular secundaria de la fibra.
El método según este aspecto de la presente descripción se efectúa mediante:
(a) proporcionar secuencias de ácido nucleico expresadas derivadas de fibras de algodón;
(b) proporcionar secuencias de ácido nucleico expresadas derivadas de un tejido de óvulo (es decir, un tejido desarrollado a partir de un ovario de una planta de semilla. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, carpelos, cubierta de semilla, embrión, endosperma);
(c) ensamblar informáticamente las secuencias de ácido nucleico expresadas de (a) y (b) para generar agrupamientos; y
(d) identificar agrupamientos de tales agrupamientos que comprenden secuencias de ácido nucleico expresadas de (a) y (b), identificando de este modo genes que están implicados en el desarrollo de la fibra de algodón.
Secuencias de ácido nucleico expresadas usadas como una fuente potencial para identificar genes implicados en el desarrollo de la fibra de algodón según este aspecto de la presente descripción son preferiblemente bibliotecas de ARN mensajero expresados [es decir, etiquetas de secuencias expresadas (EST), clones de cDNA, contigs, pre- mRNA, etc.] obtenidos a partir de preparaciones de tejido o de línea celular que pueden incluir secuencia genómica o de cDNA.
Las secuencias de ácido nucleico expresadas, según este aspecto de la presente descripción, se pueden recuperar a partir de bases de datos pre-existentes disponibles públicamente (véase Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos que sigue o bases de datos privadas).
Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico expresadas utilizadas por la presente descripción se pueden generar a partir de bibliotecas de secuencias (p. ej., bibliotecas de cDNA, bibliotecas de EST, bibliotecas de mRNA y otras).
Las bibliotecas de cDNA son fuentes adecuadas de información de secuencia expresada.
En tal caso generar una base de datos de secuencia se efectúa típicamente mediante preparación de la muestra de tejido o celular, aislamiento de ARN, construcción de biblioteca de cDNA y secuenciación.
Se apreciará que tales bibliotecas de cDNA se puedan construir a partir de ARN aislado de la planta completa, tejidos específicos, o poblaciones celulares.
Una vez que se obtienen los datos de secuencia expresada tanto de de fibras algodón como de tejido de óvulo, se pueden agrupar las secuencias para formar contigs. Véase el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos que sigue.
Tales contigs se ensamblan entonces para identificar secuencias homólogas (de fibras de algodón y tejido de óvulo) presentes en el mismo agrupamiento, se considera que tales contigs están implicados en el desrrollo de la fibra de
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algodón.
Están disponibles comercialmente un número de ensambladores de lectura de fragmentos de software informático comúnmente usados capaces de formar agolpamientos de secuencias expresadas. Estos paquetes incluyen pero no se limitan a, El Ensamblador TIGR [Sutton G. et al. (1995) Genome Science and Technology 1: 9-19], GAP [Bonfield JK. et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 4992-4999], CAP2 [Huang X. et al. (1996) Genomics 33: 21-31], The Genome Construction Manager [Lawrence CB. Et al. (1994) Genomics 23: 192-201], Bio Image Sequence Assembly Manager, SeqMan [Swindell SR. y Plasterer JN. (1997) Methods Mol. Biol. 70: 75-89], LEADS y GenCarta (Compugen Ltd. Israel).
Una vez que se identifican los genes que están implicados en el desarrollo de la fibra de algodón se puede analizar su patrón de expresión como se descrbe en el Ejemplo 2 de la sección de Ejemplos que sigue, para identificar de este modo genes que están expresados diferencialmente en la fibra de algodón (es decir, expresión específica) o durante el desarrollo de la fibra de algodón (es decir, cambio en la expresión durante el desarrollo de la fibra de algodón).
Son bien conocidos en la técnica métodos para identificar genes expresados diferencialmente.
Usando la metodología anterior, los presentes inventores fueron capaces de identificar genes que están implicados en el desarrollo de la fibra de algodón.
Como se ilustra en la sección de Ejemplos que sigue se pueden clasificar los genes identificados usando las enseñanzas de la presente invención en 6 categorías funcionales según su homología de secuencia con proteínas y enzimas conocidas (Tabla 3, a continuación). Los dos genes se clasificaron en una categoría de compromiso de destino celular: homólogo al factor de transcripción MYB y a GL3 que se sabe que están implicados en el desarrollo del tricoma en arabidopsis. Los patrones de expresión de ambos genes y el fenotipo del transgen CT20 ambos en plantas de arabidopsis y tomate T1 apoyan su implicación principalmente en la fase de iniciación. Los otros dos genes (Tabla 3, más arriba) son factores de transcripción de las familias MYB y MADS BOX. Muchos estudios demostraron la función de estas dos familias de factores de transcripción como genes homeótios con papel clave en diferentes procesos de desarrollo, entre ellos está la morfogénesis de tricomas y de la fibra (Suo. J. et. al. 2003, Ferrario S et. al. 2004). Su papel en las primeras etapas de desarrollo de la fibra se apoya también por sus patrones de expresión de ARN, que se inducen antes, y durante el día de antesis. Un gen pertenece a las rutas del metabolismo del almidón y de la sacarosa. Un trabajo reciente demuestra que otro gen (SUS), que pertenece a esta ruta, es un factor limitante tanto en la iniciación de la fibra como en el desarrollo. Otro gen (Tabla 3, más adelante) se clasifica como transporte de lípidos cuya expresión de ARN se induce altamente durante la etapa temprana de alargamiento de la fibra se ajusta al hecho de que los lípidos son componentes clave en la formación de la fibra. Varios genes (Tabla 3, más adelante) se clasificaron ya sea como genes implicados en desecación, respuesta a la salinidad estimulada por ácido abscísico y genes implicados en la transferencia de electrones. De ellos 3 genes se seleccionaron por patrón de expresión de ARN que se inducían en la etapa de alargamiento.
En vista de lo anterior y junto con los resultados experimentales que correlacionan la expresión génica con la longitud de la fibra, se sugiere que los genes de la presente descripción se pueden usar para generar plantas productoras de fibra con calidad de fibra comercialmente deseada.
Por lo tanto, la presente descripción incluye polininucleótidos identificados usando la presente metodología y sus polipéptidos codificados así como equivalentes funcionales de los polipéptidos identificados en la presente memoria (es decir, polipéptidos que son capaces de regular el desarrollo de la fibra de algodón, como se puede determinar según los ensayos descritos en la sección de Ejemplos que sigue) y sus secuencias codificadoras. Tales equivalentes funcionales pueden ser al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos
aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos
aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos
aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos
aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos
aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 75%, al menos
aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 75%, se dice 100% homólogos a la SEQ ID NO: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 95 o 96.
Polinucleótidos que codifican equivalentes funcionales pueden ser al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos
aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos
aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos
aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos
aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos
aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 75%, al menos
aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 75%, se dice 100% idénticos a la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 27.
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La homología (p. ej., porcentaje de homología) se puede determinar usando cualquier software de comparación de homología, incluyendo por ejemplo, el software BlastP del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) como usando los parámetros por defecto.
La identidad (p. ej., porcentaje de homología) se puede determinar usando cualquier software de comparación de homología, incluyendo por ejemplo, el software BlastN del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) como usando los parámetros por defecto.
Como se usa en esta memoria la frase “un polinucleótido aislado” se refiere a unas secuencias de ácido nucleico de cadena sencilla o doble que se aíslan o proporcionan en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótido complementaria (cDNA), una secuencia de polinucleótido genómica y/o unas secuencias de polinucleótido compuestas (p. ej., una combinación de las anteriores).
Como se usa en esta memoria la frase “secuencia de polinucleótido complementaria” se refiere a una secuencia, que resulta de la transcripción inversa de un ARN mensajero usando una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. Tal secuencia se puede amplificar posteriormente in vivo o in vitro usando una ADN polimerasa dependiente de ADN.
Como se usa en esta memoria la frase “secuencia de polinucleótido genómica” se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y por lo tanto representa una porción contigua de un cromosoma.
Como se usa en esta memoria la frase “secuencia de polinucleótido compuesta” se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. Una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exónicas requeridas para codificar el polipéptido de la presente descripción, así como algunas secuencias intrónicas interpuestas entre las mismas. Las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, incluyendo de otros genes, y típicamente incluirán secuencias señal de empalme conservadas. Tales secuencias intrónicas pueden incluir además elementos reguladores de expresión que actúan en cis.
Según un aspecto preferido de este aspecto de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico es tal como se expone en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 23, 24, 25 o 26.
Según otro aspecto preferido de este aspecto de la presente descripción, la secuencia del polinucleótido aislado es tal como se expone en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o 27.
Según aún otro aspecto preferido de este aspecto de la presente descripción, el polipéptido es tal como se expone en la SEQ ID NO: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 95 o 96.
Según todavía otro aspecto preferido de este aspecto de la presente descripción, la secuencia de aminoácidos es tal como se expone en la SEQ ID NO: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 95 o 96.
Los polinucleótidos aislados de este aspecto de la presente descripción también se pueden calificar usando un ensayo de hibridación incubando los polinucleótidos aislados descritos anteriormente en presencia de sonda o cebador de oligonucleótido en condiciones de hibridación de moderadas a astringentes.
Las condiciones de hibridación de moderadas a astringentes se caracterizan por una solución de hibridación como que contiene dextran sulfato al 10%, NaCl 1M, SDS al 1% y sonda marcada con 32P a 5x106 cpm, a 65°C, con una solución de lavado final de SSC 0,2x y SDS al 0,1% y lavado final a 65°C y sin embargo la hibridación moderada se efectúa usando una solución de hibridación que contiene dextran sulfato al 10%, NaCl 1M, SDS al 1% y sonda marcada con 32P a 5x106 cpm, a 65°C, con una solución de lavado final de SSC 1x y SDS al 0,1% y lavado final a 50°C.
Por lo tanto, la presente descripción incluye secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente en esta memoria; fragmentos de las mismas, secuencias hibridables con las mismas, secuencias homólgas a las mismas, secuencias que codifican polipéptidos similares con diferente uso de codones, secuencias alteradas caracterizadas por mutaciones, como supresión, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, ya sean de origen natural o inducidos por el hombre, ya sea aleatoriamente o de un modo dirigido.
Dado que las secuencias de polinucleótidos de la presente descripción codifican péptidos no identificados previamente, la presente descripción también incluye nuevos polipéptidos o porciones de los mismos, que están codificados por los polinucleótidos aislados y los fragmentos de ácido nucleico respectivos de los mismos descritos anteriormente en esta memoria.
Por lo tanto, la presente descripción también incluye polipéptidos codificados por las secuencias de polinucleótidos de la presente descripción. Las secuencias de aminoácidos de estos nuevos polipéptidos están expuestas en SEQ ID NO: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 o 96.
La presente descripción también incluye homólogos de estos polipéptidos, tales homólogos pueden ser al menos
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aproximadamente
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aproximadamente
84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos
aproximadamente
87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos
aproximadamente
90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos
aproximadamente
93%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos
aproximadamente
95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos
aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o mejor dicho 100% homólogos a la SEQ ID NO: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 o 96.
La presente descripción también incluye fragmentos de los polipéptidos descritos anteriormente y polipéptidos que tienen mutaciones, como supresiones, inserciones o sustituciones de uno o más aminoácidos, ya sean de origen natural o inducidos por el hombre, ya sea aleatoriamente o de un modo dirigido.
La capacidad de los polinucleótidos de la presente descripción y sus productos para regular el desarrollo de la fibra de algodón se puede determinar directamente o al menos un parámetro estructural de una fibra de algodón como longitud de la fibra o finura de la fibra, o velocidad de crecimiento de la fibra (descrito más adelante en esta memoria). Sin embargo, el desarrollo de la fibra de algodón se puede también determinar indirectamente como mediante sistemas modelo de plantas para el desarrollo de la fibra de algodón. Por ejemplo, está bien establecido que las células de tricoma y pelos radiculares comparten características comunes con las células de fibra de algodón, y como tales se pueden usar como modelo para el desarrollo de la fibra de algodón [Revisado en Wagner G.J. et al. (2004)], como se demuestra en los detalles en el Ejemplo 12 de la sección de Ejemplos que sigue.
Analizando los perfiles de expresión, los presentes inventores fueron capaces de determinar la implicación de las secuencias biomoleculares (es decir, polinucleótidos y polipéptidos) de la presente descripción en la iniciación y/o alargamiento de la fibra. Estos resultados se fundamentaron además estableciendo una correlación entre la expresión génica y la longitud de fibra (véase Ejemplo 7).
Estos resultados sugieren que las secuencias biomoleculares de la presente descripción (p. ej., polinucleótidos, polipéptidos, promotores, oligonucleótidos, anticuerpos, referidos también en esta memoria como agentes) se pueden usar para mejorar la calidad y/o el rendimiento de fibra de una planta productora de fibra.
Por lo tanto, según aún otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para mejorar la calidad y/o rendimiento de fibra de una planta productora de fibra.
El método de este aspecto de la presente descripción se efectúa regulando un nivel de expresión o actividad de al menos un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción (descrito anteriormente en esta memoria) en la planta productora de fibra, mejorando así la calidad y/o rendimiento de la planta productora de fibra.
Como se usa aquí la frase “planta productora de fibra” se refiere a plantas que comparten la característica común de tener una forma alargada y abundante celulosa en paredes celulares gruesas, típicamente denominadas como paredes secundarias. Tales paredes pueden o no estar lignificadas, y el proptoplasto de tales células puede o no ser viable en madurez. Tales fibras tienen muchos usos industriales, por ejemplo, en madera y productos fabricados de madera, papel, textiles, material de embalaje y de empaquetado, cordelería, cepillos y escobas, llenado y relleno, sellado, refuerzo de otros materiales, y fabricación de derivados de celulosa.
Según un aspecto preferido de este aspecto de la presente descripción, la planta productora de fibra es algodón.
El término “fibra” es que incluye normalmente desde células conductoras de pared gruesa como vasos y traqueidas a agregados fibrilares de muchas células de fibra individuales. Por lo tanto, el término “fibra” se refiere a (a) células conductoras y no conductoras de pared gruesa del xilema; (b) fibras de origen extraxilar, que incluyen las del floema, corteza, tejido de tierra, y epidermis; y (c) fibras de tallos, hojas, raíces, semillas, y flores o inflorescencias (como las de Sorghum vulgare usadas en la fabricación de cepillos y escobas).
Ejemplos de plantas productoras de fibra incluyen, pero no se limitan a, cultivos agrícolas como algodón, árbol de algodón de seda (Kapok, Ceiba petandra), sauce del desierto, arbusto de creosota, grasa de invierno, árbol de balsa, kenaf, roselle, yute, sisal de abaca, lino, maíz, caña de azúcar, cáñamo, ramio, kapok, fibra de coco, bambú, musgo español y Agave spp. (p. ej. sisal).
Como se usa en esta memoria la frase “calidad de la fibra” se refiere a al menos un parámetro de fibra que agrícolamente se desea, o se requiere en la industria de la fibra (descrito más adelante en esta memoria). Ejemplos de tales parámetros, incluyen pero no se limitan a, longitud de fibra, resistencia de fibra, adecuación de la fibra, peso de la fibra por unidad de longitud, relación de madurez y uniformidad (descrito además más adelante en esta memoria).
La calidad de la fibra (hebra) de algodón se mide típicamente de acuerdo con la longitud de la fibra, resistencia y finura. Por consiguiente, la calidad de hebra se considera mayor cuando la fibra es más larga, más fuerte y más fina.
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Como se usa en esta memoria la frase “rendimiento de fibra” se refiere a la cantidad y cantidad de fibras producidas a partir de la planta productora de fibra.
Como se usa en esta memoria el término “mejora” se refiere a al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, de cambio en la calidad/rendimiento de fibra en comparación con la planta nativa (es decir, no modificada con las secuencias biomoleculares de la presente descripción).
Como se usa en esta memoria el término “regulación” se refiere a regular a la alza, regular a la baja o una combinación de los mismos. Por ejemplo, cuando se desea un aumento en número de fibra, se puede efectuar la presente descripción sobre-regulando al menos un polinucleótido de la presente descripción, que está implicado en la iniciación de la fibra (p. ej., SEQ ID NOs: 4, 10, 9, 12, 16 y 25). Alternativamente, cuando se desean fibras cortas como por ejemplo, en el maíz, entonces se efectúa la presente descripción regulando a la baja al menos un polinucleótido de la presente descripción que está implicado en el alargamiento de fibra (p. ej., SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 y 27). Alternativamente, se puede efectuar la presente descripción sobreregulando la expresión de al menos un polinucleótido (como uno implicado en el alargamiento de fibra) y regulando a la baja al menos un polinucleótido (como uno implicado en la iniciación de fibra) de los polinucleótidos de la presente descripción. De esta forma es factible obtener una planta productora de fibra con rendimiento de fibra mejorado de cada una de longitud corta.
Sobre-regular un nivel de expresión de al menos uno de los polinucleótidos de la presente descripción se puede efectuar a nivel genómico (p. ej., activación de la transcripción por medio de promotores, potenciadores, y otros elementos reguladores), a nivel de la transcripción, o a nivel de la proteína.
A continuación se presenta una lista no exhaustiva de agentes capaces de sobre-regular el nivel de expresión y/o actividad de las secuencias biomoleculares (es decir, secuencias de ácido nucleico o de proteína) de la presente descripción.
Un agente capaz de sobre-regular la expresión de un polinucleótido de interés puede ser una secuencia de polinucleótido exógena diseñada y construida para expresar al menos una porción funcional del mismo (p. ej., mejora de la calidad/rendimiento de fibra, aumento de la biomasa, etc.). Por consiguiente, la secuencia de polinucleótido exógena puede ser una secuencia de ADN o ARN que codifica una molécula de polipéptido, capaz de mejorar el rendimiento o cantidad de fibra. Alternativamente, el polinucleótido exógeno puede ser una región reguladora que actúa en cis (p. ej., SEQ ID NO: 74, 75, 85, 88 o 91) que se puede introducir dentro de la planta para aumentar la expresión de cualquier polinucleótido que está implicado en el desarrollo de la fibra (p. ej., sacarosa fosfato sintasa, como se describe en la Pat. de EE.UU. N° 6.472.588).
Para expresar polinucleótidos exógenos en células vegetales, se liga preferiblemente una secuencia de polinucleótido de la presente descripción en un constructo de ácido nucleico adecuado para expresión en célula vegetal. Tal constructo de ácido nucleico incluye una región reguladora que actúa en cis como una secuencia promotora para dirigir la transcripción de la secuencia de polinucleótido en la célula de una manera constitutiva o inducible. El promotor puede ser homólogo o heterólogo a la planta/célula transformada.
Secuencias promotoras preferidas que se pueden usar de acuerdo con este aspecto de la presente descripción son promotores de célula endotelial.
Por ejemplo, se pueden usar preferiblemente secuencias promotoras de cada una de las secuencias de polinucleótidos de la presente descripción en los constructos de ácido nucleico de la presente descripción.
Según un aspecto preferido de este aspecto de la presente descripción, el promotor es al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos
aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos
aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos
aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos
aproximadamente 99%, o 100% idéntico a la SEQ ID NO. 85 o 91, que es capaz de regular la expresión de al menos una secuencia de polinucleótido ligada operativamente a la misma en una célula endotelial óvulo (es decir, capaz de ejercer un efecto regulador sobre la secuencia codificadora ligada a la misma).
Como se ilustra claramente en la sección de Ejemplos que sigue, tales secuencias promotoras son capaces de regular la expresión de una secuencia de ácido nucleico codificadora (p. ej., GUS) ligada operativamente a la misma.
Otros ejemplos de promotores de aumento de fibra de algodón incluyen los genes expresados E6 de fibra de algodón (John et al., Plant Mol. Biol., 30: 297-306 (1996) y John et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 12768-12773 (1996) e), H6 (John et al., Plant Physiol., 108: 669-676, (1995)), FbL2A (Rinehart et al., Plant Physiol., 112: 13311341 (1996) y John et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12768-12773 (1996)), rac (Delmer et al., Mol. Gen. Genet.,
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248: 43-51 (1995)); CelA (Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12637-12642 (1996)); CAP (Kawai et al., Plant Cell Physiol. 39: 1380-1383 (1998)); ACP (Song et al., Biochim. Biophys. Acta 1351: 305-312 (1997); y LTP (Ma et al., Biochim. Biophys. Acta 1344: 111-114 (1997)). Se describen otros promotores específicos de fibra de algodón en la Pat. de EE.UU. N° 5.495.070.
Otros promotores que se pueden usar de acuerdo con este aspecto de la presente descripción son aquellos que aseguran la expresión sólo en órganos específicos, como la hoja, raíz, tubérculo, semilla, tallo, flor o tipos de células específicas como células de parénquima, epidérmicas, de tricoma o vasculares.
Promotores preferidos para potenciar la expresión en células de tricoma se describen en WO 2004/111183, a Evogene Ltd.
Los promotores preferidos que potencian la expresión en tejido vascular incluyen el promotor CAD 2 (Samaj et al., Planta, 204: 437-443 (1998)), el promotor Pt4C11 (Hu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5407-5412 (1998)), el promotor C4H (Meyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6619-6623 (1998)), los promotores PtX3H6 y PtX14A9 (Loopstra et al., Plant Mol. Biol., 27: 277-291 (1995)), el promotor RolC (Graham, Plant Mol. Biol., 33: 729-735 (1997)), el promotor Hvhsp17 (Raho et al., J. Expt. Bot., 47: 1587-1594 (1996)), y el promotor COMT (Capellades et al., Plant Mol. Biol., 31: 307-322 (1996)).
Los promotores preferidos que mejoran la expresión en tejido del tallo incluyen los promotores de médula (Datta, Theor. Appl. Genet., 97: 20-30 (1998) y Ohta et al., Mol. Gen. Genet., 225: 369-378 (1991)), y el promotor de la peroxidasa aniónica (Klotz et al., Plant Mol. Biol., 36: 509-520 (1998)). Los promotores preferidos que mejoran la expresión en el floema, corteza y corcho, pero no en el xilema o la médula, incluyen el promotor Psam-1 (Mijnsbrugge et al., Plant and Cell Physiol., 37: 1108-1115 (1996)).
Los promotores preferidos que mejoran la expresión en semillas incluyen el promotor phas (Geest et al., Plant Mol. Biol. 32: 579-588 (1996)); el promotor GluB-1 (Takaiwa et al., Plant Mol. Biol. 30: 1207-1221 (1996)); el promotor gamma-zeína (Torrent et al., Plant Mol. Biol. 34: 139-149 (1997)), y el promotor oleosina (Sarmiento et al., The Plant Journal 11: 783-796 (1997)).
Se describen otras secuencias promotoras que median la expresión constitutiva, inducible, específica de tejido o específica de etapa de desarrollo en WO 2004/081173 a Evogene Ltd.
Se pueden usar promotores truncados o sintéticos incluyendo regiones de nucleótidos específicas que confieren una expresión mejorada en tejido, como se ejemplifica por la identificación de elementos reguladores dentro de los promotores más grandes que confieren una expresión aumentada en el xilema (Seguin et al., Plant Mol. Biol., 35: 281-291 (1997); Torres-Schumann et al., The Plant Journal, 9: 283-296 (1996); y Leyva et al., The Plant Cell, 4: 263271 (1992)).
El constructo de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un plásmido, un bácmido, un fagémido, un cósmido, un fago, un virus o un cromosoma artificial. Preferiblemente, el constructo de ácido nucleico de la presente descripción es un vector de plásmido, más preferiblemente un vector binario.
La frase “vector binario” se refiere a un vector de expresión que lleva una región T modificada de un plásmido Ti, capaz de multiplicarse tanto en células E. Coli como en Agrobacterium, y que normalmente comprende el(los) gen(es) marcador(es) para la transformación en planta entre las dos regiones huésped. Un vector binario adecuado para la presente descripción incluye pBI2113, pBI121, pGA482, pGAH, pBIG, pBI101 (Clonetech), pPI (véase Ejemplo 5 de la sección de Ejemplos que sigue) o modificaciones de los mismos.
El constructo de ácido nucleico de la presente descripción se puede utilizar para transformar una célula huésped (p. ej., bacteria, vegetal) o planta.
Como se usa en esta memoria, los términos “transgénico” o “transformado” se usan indistintamente en referencia a una célula o una planta en la que se ha transferido material genético clonado.
En la transformación estable, la molécula de ácido nucleico de la presente descripción se integra dentro del genoma de la planta, y como tal representa una característica estable y heredado. En la transformación transitoria, la molécula de ácido nucleico es expresada por la célula transformada pero no se integra dentro del genoma, y como tal representa una característica transitoria.
Existen varios métodos de introducción de genes extraños dentro de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas (Potrykus, I. (1991). Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42, 205-225; Shimamoto, K. et al. (1989). Plantas fértiles de arroz transgénico regeneradas de protoplastos transformados. Nature (1989) 338, 274-276).
Los principales métodos de integración estable de ADN exógeno dentro del ADN genómico vegetal incluyen dos abordajes principales:
(i) Transferencia génica mediada por Agobacterium. Véase: Klee, H. J. et al. (1987). Annu Rev Plant Physiol 38, 467486; Klee, H. J. y Rogers, S. G. (1989). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of
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Plant Nuclear Genes, pg. 2-25, J. Schell y L. K. Vasil, eds., Academic Publishers, San Diego, Cal.; y Gatenby, A. A. (1989). Regulation and Expresion of Plant Genes in Microorganisms, pg. 93-112, Plant Biotechnology, S. Kung y C. J. Arntzen, eds., Butterworth Publishers, Boston, Mass.
(ii) Captación directa de ADN. Véase, p. ej.: Paszkowski, J. et al. (1989). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, pg. 52-68, J. Schell y L. K. Vasil, eds., Academic Publishers, San Diego, Cal.; y Toriyama, K. et al. (1988). Bio/Technol 6, 1072-1074 (métodos de captación directa de ADN dentro de protoplastos). Véase también: Zhang et al. (1988). Plant Cell Rep 7, 379-384; y Fromm, M. E. et al. (1986). Transformación estable de maíz después de transferencia génica por electroporación. Nature 319, 791-793 (captación de ADN inducida por choque eléctrico de células vegetales). Véase también: Klein et al. (1988). Bio/Technol 6, 559-563; McCabe, D. E. et al. (1988). Transformación estable de soja (Glycine max) por aceleración de partícula. Bio/Technology 6, 923-926; y Sandford, J. C. (1990). Biolistic plant transformation. Physiol Plant 79, 206-209 (Inyección de ADN dentro de células o tejidos vegetales por bombardeo de partícula). Véase también: Neuhaus, J. M. et al. (1987). Theor Appl Genet 75, 30-36; y Neuhaus, J. M. y Spangenberg, G. C. (1990). Physiol Plant 79, 213-217 (uso de sistemas de micropipetas). Véase Pat. de EE.Uu. N° 5.464.765 (transformación en bigotes de fibras de vidrio o de carburo de silicio de cultivos celulares, embriones o tejido calloso). Véase también: DeWet, J. M. J. et al. (1985). “Transferencia génica exógena en maíz (Zea mays) usando polen tratado con ADN”, Experimental Manipulation of Ovule Tissue, G. P. Chapman et al., eds., Longman, New York-London, pg. 197-209; y Otha, Y. (1986). Transformación Genética de Alto Rendimiento de Maíz por una Mezcla de Polen y ADN Exógeno. Proc Natl Acad Sci USA 83, 715-719 (incubación directa de ADN con polen en germinación).
El sistema mediado por Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos de ADN definidos que se integran dentro del ADN genómico vegetal. Los métodos de inoculación del tejido vegetal varían dependiendo de la especie vegetal y del sistema de suministro del Agrobacterium. Un enfoque ampliamente usado es el procedimiento de hoja-disco, que se puede realizar con cualquier explante de tejido que proporcione una buena fuente para la iniciación de la diferenciación de la planta completa (Horsch, R. B. et al. (1988). “Transformación hoja disco.” Plant Molecular Biology Manual A5, 1-9, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht). Un abordaje complementario emplea el sistema de suministro de Agrobacterium en combinación con infiltración a vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente útil en la creación de plantas dicotiledóneas transgénicas.
Existen varios métodos de transferencia directa de ADN dentro de células vegetales. En la electroporación, los proptoplastos se exponen brevemente a un fuerte campo magnético, abriéndose mini-poros para permitir que entre el AdN. En la microinyección, se inyecta mecánicamente el ADN directamente dentro de las células usando micropipetas. En el bombardeo de micropartículas, el ADN se adsorbe sobre microproyectiles como cristales de sulfato de magnesio o partículas de tungsteno, y se aceleran físicamente los microproyectiles dentro de las células o tejidos vegetales.
Después de la transformación estable, se produce la propagación de la planta. El método más común de propagación es por semilla. Sin embargo, la desventaja de la regeneración por propagación de semilla es la falta de uniformidad en el cultivo debido a la heterozigosidad, ya que las semillas son producidas por plantas según las varianzas genéticas regidas por las reglas de Mendel. En otras palabras, cada semilla es genéticamente diferente y cada una crecerá con sus propias características específicas. Por lo tanto, se prefiere que la regeneración se efectúe de tal manera que la planta regenerada tiene rasgos y características idénticos a las de la planta transgénica parental. El método preferido de regeneración de una planta transformada es por micropropagación, que proporciona una reproducción rápida, consistente de las plantas transformadas.
La micropropagación es un proceso de cultivo de plantas de segunda generación a partir de una única muestra de tejido extirpada de una planta parental o cultivar seleccionado. Este proceso permite la reproducción en masa de plantas que tienen el tejido preferido y que expresan una proteína de fusión. Las plantas recién generadas son genéticamente idénticas a, y tienen todas las características de la planta original. La micropropagación permite la producción en masa del material vegetal de calidad en un corto periodo de tiempo y ofrece una rápida multiplicación de cultivares seleccionados con la conservación de las características de la planta transformada transgénica o transformada original. Las ventajas de este método de clonación de plantas incluyen la velocidad de multiplicación vegetal y la calidad y uniformidad de las plantas producidas.
La micropropagación es un proceso de múltiples etapas que requiere la alteración de las condiciones del medio de cultivo o de crecimiento entre las etapas. El proceso de micropropagación implica cuatro etapas básicas: etapa uno, cultivo inicial del tejido; etapa dos, multiplicación del cultivo de tejido; etapa tres, diferenciación y formación de la planta; y etapa cuatro, cultivo en invernadero y consolidación. Durante la etapa uno, se establece el cultivo de tejido y se certifica que está libre de contaminantes. Durante la etapa dos, el cultivo de tejido inicial se multiplica hasta que se produce un número suficiente de muestras de tejido para alcanzar los objetivos de producción. Durante la etapa tres, las muestras de tejido recién crecidas se dividen y se crecen en plántulas individuales. En la etapa cuatro, las plántulas transformadas se transfieren a un invernadero para la consolidación en donde la tolerancia de las plantas a la luz se aumenta gradualmente de manera que puedan seguir creciendo en el entorno natural.
Aunque actualmente se prefiere la transformación estable, también se prevé por la presente descripción la transformación transitoria de, por ejemplo, células de hojas, células meristemáticas, o la planta completa.
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Se puede efectuar la transformación transitoria por cualquiera de los métodos de transferencia directa de ADN descritos anteriormente o por infección viral usando virus de plantas modificados.
Los virus que se han demostrado útiles para la transformación de plantas huésped incluyen virus mosaico de la coliflor (CaMV), virus mosaico del tabaco (TMV), y baculovirus (BV). La transformación de plantas usando virus de plantas se describe en, por ejemplo: Pat. de EE.UU. N° 4.855.237 (virus mosaico dorado de judía, BGMV); EPA 67.553 (TMV); Solicitud Publicada Japonesa N° 63-14693 (TMV); EPA 194.809 (BV); EPA 278.667 (BV); y Gluzman, Y. et al. (1988). Comunicaciones en Biología Molecular: Vectores Virales, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pg. 172-189. El uso de partículas de pseudovirus en la expresión de ADN extraño en muchos huéspedes, que incluyen plantas, se describe en WO 87/06261.
La construcción de virus de ARN de plantas para la introducción y expresión de secuencias de ácido nucleico exógenas no virales en plantas se demuestra en las referencias anteriores así como en: Dawson, W. O. et al. (1989). Un virus híbrido mosaico del tabaco expresa y pierde un gen añadido. Virology 172, 285-292; French, R. et al. (1986) Science 231, 1294-1297; y Takamatsu, N. et al. (1990). Producción de encefalina en protoplastos de tabaco usando un vector ARN de virus mosaico del tabaco. FEBS Lett 269, 73-76.
Si el virus transformante es un virus de ADN, un experto en la técnica puede hacer modificaciones adecuadas al propio virus. Alternativamente, el virus se puede clonar primero dentro de un plásmido bacteriano para facilitar la construcción del vector viral deseado con el ADN extraño. El virus puede ser escindido entonces del plásmido. Si el virus es un virus de ADN, se puede anclar al ADN viral un origen de replicación bacteriano, que a continuación se replica por la bacteria. La transcripción y la traducción del ADN producirá la proteína de cubierta, que encapsulará el aDn viral. Si el virus es un virus de aRn, normalmente el virus se clona como un cDNA y se inserta dentro de un plásmido. El plásmido se usa entonces para hacer todos los constructos genéticos de plantas. El virus de ARN se transcribe a continuación a partir de la secuencia viral del plásmido, seguido de traducción de los genes virales para producir las proteínas de cubierta que encapsulan el ARN viral.
La construcción de virus de ARN de plantas para la introducción y expresión en plantas de secuencias de ácido nucleico exógenas no virales, como los incluidos en el constructo de la presente descripción, se desmuestra también en las referencias anteriores así como en la Pat. de EE.UU. N° 5.316.931.
En un aspecto se proporciona para la inserción un ácido nucleico viral vegetal, que comprende una supresión de la secuencia codificadora de la proteína de cubierta nativa del ácido nucleico viral, una secuencia codificadora de la proteína de cubierta viral vegetal no nativa (extraña), y un promotor no nativo, preferiblemente el promotor subgenómico de la secuencia codificadora de la proteína de cubierta no nativa, y capaz de la expresión en la planta huésped, empaquetamiento del ácido nucleico viral vegetal recombinante, y que asegura una infección sistémica del huésped por el ácido nucleico viral vegetal recombinante. Alternativamente, la secuencia codificadora de la proteína de cubierta nativa se puede hacer no transcribible por inserción de la secuencia de ácido nucleico no nativa dentro de ella, de tal manera que se produce una proteína no nativa. El constructo de ácido nucleico viral de la planta recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no nativos adicionales. Cada promotor subgenómico no nativo es capaz de transcribir o expresar genes o secuencias de ácido nucleico adyacentes en la planta huésped e incapaz de recombinación entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Además, el constructo de ácido nucleico viral de la planta recombinante puede contener uno o más elementos reguladores que actúan en cis, como potenciadores, que se unen a un regulador que actúa en trans y que regula la transcripción de una secuencia codificadora situada corriente debajo de la misma. Las secuencias de ácido nucleico no nativas se pueden insertar adyacentes al promotor subgenómico viral de la planta nativo o a los promotores subgenómicos virales de la planta no nativos si se incluye más de una secuencia de ácido nucelico. Las seciencias de ácido nucleico no nativas se transcriben o expresan en la planta huésped bajo el control de el(los) promotor(es) subgenómico(s) para producir los productos deseados.
En un segundo aspecto, se proporciona un constructo de ácido nucleico viral de planta recombinante como en el primer aspecto excepto que la secuencia codificadora de la proteína de cubierta nativa se localiza adyacente a uno de los promotores subgenómicos de la proteína de cubierta no nativa en lugar de a la secuencia codificadora de la proteína de cubierta no nativa.
En un tercer aspecto, se proporciona un constructo de ácido nucleico viral de planta recombinante que comprende un gen de proteína de cubierta nativa situado adyacente a su promotor subgenómico y a uno o más promotores subgenómicos no nativos insertados dentro del constructo de ácido nucleico viral. Los promotores subgenómicos no nativos insertados son capaces de transcribir o expresar genes adyacentes en una planta huésped y son incapaces de recombinación entre sí y con promotores subgenómicos nativos. Se pueden insertar secuencias de ácido nucleico no nativas adyacentes a promotores virales vegetales subgenómicos no nativos de tal forma que dichas secuencias se transcriben o expresan en la planta huésped bajo el control de los promotores subgenómicos para producir el producto deseado.
En un cuarto aspecto, se proporciona un constructo de ácido nucleico viral de planta recombinante como en el tercer aspecto excepto que la secuencia que codifica la proteína de cubierta nativa se reemplaza por una secuencia codificadora de la proteína de cubierta no nativa.
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Los vectores virales se encapsulan por proteínas de cubierta expresadas codificadas por constructos de ácido nucleico viral de planta recombinante como se describe anteriormente en esta memoria, para producir un virus de planta recombinante. El constructo de ácido nucleico viral de planta recombinante o el virus de planta recombinante se usa para infectar plantas huésped apropiadas. El constructo de ácido nucleico viral de planta recombinante es capaz de replicarse en un huésped, propagación sistémica dentro del huésped, y transcribir o expresar uno o más genes extraños (ácido nucleico aislado) en el huésped para producir la proteína deseada.
Además de lo anterior, la molécula de ácido nucleico de la presente descripción se puede también introducir dentro del genoma del cloroplasto permitiendo de este modo la expresión en cloroplasto.
Se conoce una técnica para introducir secuencias de ácido nucleico exógeno en el genoma de los cloroplastos. Esta técnica implica los siguientes procedimientos. Primero, las células vegetales se tratan químicamente con el fin de reducir el número de cloroplastos por célula a aproximadamente una. A continuación, se introduce el ácido nucleico exógeno dentro de las células preferiblemente a través del bombardeo de partículas, con el objetivo de introducir al menos una molécula de ácido nucleico exógeno dentro de los cloroplastos. El ácido nucleico exógeno se selecciona por alguien experto en la técnica para que sea capaz de integrarse dentro del genoma del cloroplasto a través de recombinación homóloga, que se efectúa fácilmente por enzimas inherentes al cloroplasto. Con este fin, el ácido nucleico comprende, además del gen de interés, al menos una secuencia de ácido nucleico derivada del genoma del cloroplasto. Además, el ácido nucleico exógeno comprende un marcador seleccionable, que por los procedimientos de selección secuencial sirve para permitir a un artesano comprobar que todas o substancialmente todas las copias del genoma del cloroplasto que siguen tal selección incluyen el ácido nucleico exógeno. Más detalles relativos a esta técnica se encuentran en la Pat. de EE.UU. N°s 4.945.050 y 5.693.507. De este modo se puede producir un polipéptido mediante el sistema de expresión de proteína del cloroplasto y ser integrado dentro de la membrana interna del cloroplasto.
La regulación a la baja de un gen de interés se puede efectuar a nivel genómico y/o de transcripción usando una variedad de moléculas que interfieren con la transcripción y/o la traducción (p. ej., antisentido, siRNA), o a nivel de proteína usando p. ej., anticuerpos, técnicas de inmunización y similares.
Por ejemplo, un agente capaz de regular a la baja una actividad de un polipéptido de interés es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse específicamente a un polipéptido de la presente descripción. Preferiblemente, el anticuerpo se une específicamente al menos a un epítopo del polipéptido de interés. Como se usa en esta memoria, el término “epítopo” se refiere a cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une el paratopo de un anticuerpo.
La regulación a la baja a nivel del ARN se puede efectuar mediante estrategias de silenciamiento basadas en ARN que son eficaces en plantas. Véase por ejemplo, Kusaba (2004) RNA interference in crop plants. Curr. Opin. Biotechnol. 15(2): 139-43; Matzke (2001) RnA based silencing strategies in plants. Curr. Opin. Genet. 11: 221-7.
Por ejemplo, un agente capaz de regular a la baja un polinucleótido de interés es una molécula de ARN pequeño de interferencia (siRNA) en el proceso de interferencia por ARN (RNAi).
Se pueden suministrar dsRNAs en plantas de varias maneras (revisado en Waterhouse P, Helliwell C. 2003. Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing. Nature Genet 4: 29-38): bombardeo por microproyectiles con vectores que expresan dsRNA o ARN en horquilla que contiene intrones (ihpRNA); infiltración de tejido vegetal con una cepa de Agrobacterium que lleva un T-DNA que expresa un transgen ihpRNA; silenciamiento génico inducido por virus (VIGS); en el que la secuencia diana se integra dentro de secuencias virales que se usan para infectar la planta, o se expresan a partir de transgenes introducidos en Agrobacterium, y mediante transformación estable con transgenes que expresan ihpRNA. Las diversas técnicas de iRNA tienen cada una ventajas y desventajas con respecto a cómo es de persistente su efecto y la gama de plantas a las que se puede aplicar, p. ej. se puede aplicar el bombardeo a cualquier planta, pero solamente produce efectos transitorios. Alternativamente, la transformación con transgenes que expresan ihpRNA proporciona silenciamiento génico estable y heredable, pero requiere de técnicas de transformación de plantas eficientes. Se ha demostrado que los transgenes ihpRNA son muy eficaces para una amplia gama de genes diana en varias especies de plantas (revisado en Waterhouse P, Helliwell C. 2003. Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing. Nature Genet 4: 29-38; Wesley S, Helliwell C, Smith N, et al. 2001. Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J 27: 581-590), indicando que el mecanismo de RNAi está probablemente conservado en todas las especies de plantas. Esto es apoyado por un informe reciente de RNAi en el musgo no vascular Physcomitrella patens (Bezanilla M, Pan A, Quatrano R. 2003. RNA interference in the moss Physcomitrella patens. Plant Physiol 133: 470-474).
Se pueden usar construcciones genéticas antisentido para promotores específicos de fibra (p. ej., para SEQ ID NO: 85, 91) para inhibir o disminuir la expresión de uno o más genes de fibra en células de fibra. El uso de constructos antisentido se describe en la Pat. de EE.UU. N° 5.495.070 y en Smith, et al. Nature 334: 724-726, 1988; Bird, et al. Bio/Technology 9: 635-639, 1991; Van der Krol, et al. Gene 72: 45-50, 1988.
Se apreciará que la generación de la planta productora de fibra de características deseadas según la presente descripción se pueda efectuar también mediante el cruce de cada una de las plantas genéticamente modificadas
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anteriores con las plantas de tipo salvaje, híbridas o transgénicas, usando métodos que son bien conocidos en la técnica.
Una vez que se generan las plantas transgénicas de la presente descripción, se recogen las fibras (por ejemplo por recolección mecánica y/o arrancado a mano) y se determina el rendimiento y calidad de fibra.
A continuación se describen métodos de calificación de fibras de algodón.
Longitud de fibra- Se usan instrumentos como un fibrógrafo y sistemas HVI (instrumentación de de alto volumen) para medir la longitud de la fibra. Los instrumentos HVI calculan la longitud en términos de longitud “media” y “media de la mitad superior” (UHM). La media es la longitud media de todas las fibras mientras que UHM es la longitud media de la mitad más larga de la distribución de fibra.
Resistencia de fibra- Como se ha mencionado, la resistencia de fibra se define generalmente como la fuerza requerida para romper un haz de fibras o una única fibra. En la prueba HVI la fuerza de ruptura se convierte a “gramos de fuerza por unidad text”. Esta es la fuerza requerida para romper un haz de fibras que es una unidad tex en tamaño. En la prueba HVI la resistencia se da en gramos por unidades tex (gramos/tex). Las fibras se pueden clasificar como resistencia baja (p. ej., 19-22 grs/tex), resistencia media (p. ej., 23-25 grs/tex), resistencia alta (p. ej., 26-28 grs/tex), y resistencia muy alta (p. ej., 29-36 grs/tex).
Micronaire- La lectura micronaire de una fibra se obtiene a partir de un ensayo de porosidad de flujo de aire. La prueba se llevó a cabo como sigue. Una muestra pesada de algodón se comprime hasta un volumen dado y se pasa un flujo de aire controlado a través de la muestra. Se hace la lectura de la resistencia al flujo de aire como unidades micronaire. Las lecturas micronaire reflejan una combinación de madurez y finura. Dado que el diámetro de fibras dentro de una variedad de algodón es bastante consistente, el índice micronaire indicará muy probablemente variación de madurez más que variaciones en finura. Una lectura micronaire de 2,6-2,9 es baja mientras que 3,0-3,4 es inferior a la media, 3,5-4,9 es normal y 5,0 y más son altas. Para la mayoría de las aplicaciones textiles se usa un micronaire de 3,5-4,9. Cualquiera más alto que esto normalmente no es deseable. Se apreciará sin embargo, que diferentes aplicaciones requieren diferentes propiedades de fibra. Por lo tanto, se entiende que una propiedad de fibra que es desventajosa en una aplicación podría ser ventajosa en otra.
Como se ilustra en la sección de Ejemplos, que sigue, las secuencias biomoleculares de la presente descripción son capaces de aumentar número y longitud de tricomas/pelo de hoja, así como el pelo de semilla. Como tales secuencias biomoleculares de la presente descripción se pueden usar para generar plantas transgénicas con número/longitud de tricomas aumentado que diasuaden mejor a herbívoros, guian la trayectoria de polinizadores, o afectan a la fotosíntesis, temperatura de la hoja, o pérdida de agua a través de una mayor reflexión de la luz. Además tales plantas transgénicas se pueden usar para la producción compartimentalizada de proteínas recombinantes y sustancias químicas en tricomas, como se describe en detalle en WO 2004/111183 a Evogene Ltd.
Interesante e inesperadamente, los presentes inventores encontraron que las secuencias de polinucleótidos de la presente descripción son capaces de aumentar una biomasa de una planta. Se apreciará que la capacidad de los polipéptidos de la presente descripción de aumentar rendimiento/biomasa/vigor de la planta es inherente a su habilidad de promover el aumento en el tamaño o volumen de la célula vegetal (como se describe en esta memoria).
Por lo tanto, la presente descripción también prevé un método para aumentar una biomasa/vigor/rendimiento de una planta (plantas coníferas, musgo, algas, monocotiledónea o dicotiledónea, así como otras plantas que figuran en
www.nationmaster.com/encyclopedia/Plantae). Esto se efectúa regulando la expresión y/o actividad de al menos uno de los polinucleótidos de la presente descripción, como se describe anteriormente.
Como se usa en esta memoria la frase “biomasa de planta” se refiere al montante o cantidad de tejido producido a partir de la planta en una temporada de crecimiento, lo que también podría determinar o afectar al rendimiento de la planta o al rendimiento por área de cultivo.
Como se usa en esta memoria la frase “vigor de planta” se refiere al montante o cantidad de tejido producido a partir de la planta en un momento dado. Por lo tanto aumentar el vigor podría determinar o afectar al rendimiento de la planta o al rendimiento por tiempo de crecimiento o área de cultivo.
Como se usa en esta memoria la frase “rendimiento de planta” se refiere al montante o cantidad de tejido producido y recolectado como el producto vegetal producido. Por lo tanto aumentar el rendimiento podría afectar al beneficio económico que uno puede obtener de la planta en una cierta área de crecimiento y/o tiempo de crecimiento.
Por lo tanto, la presente descripción es de alto valor agrícola para promover el rendimiento de cultivos comercialmente deseados (p. ej., biomasa de órganos vegetativos como madera de álamo, u órgano reproductivo como número de semillas o biomasa de la semilla).
Como se usa en esta memoria el término “aproximadamente” se refiere a ± 10%.
Objetivos adicionales, ventajas, y características novedosas de la presente descripción se harán evidentes para un
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experto en la materia después del análisis de los siguientes ejemplos. Adicionalmente, cada uno de los diversos aspectos de la presente descripción como se delinearon anteriormente en esta memoria y como se reivindica en la sección de reivindicaciones a continuación encuentran soporte experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, que junto con las anteriores descripciones ilustran la descripción. Generalmente, la nomenclatura usada en esta memoria y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y recombinantes de ADN. Tales técnicas se explican a fondo en la literatura. Véase, por ejemplo, “Molecular cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías como se exponen en las Pat. de EE.UU. N°s 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la literatura de patentes y científica, véase, por ejemplo, Pat. de EE.UU. N°s 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization -A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). Se proporcionan otras referencias generales a lo largo de este documento. Los procedimientos en el mismo se cree que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector.
Ejemplo 1
Identificación in silico de genes de algodón implicados en la formación de fibra Procedimientos experimentales
Comparación entre especies de secuencias expresadas.- Se usaron dos herramientas principales durante la etapa de extracción de datos. Se consulatron un gran número de perfiles de genes a partir de una base de datos ORACLE que alberga la plataforma GeneCarta de Compugen (Compugen Ltd. Israel). Estos datos se cargaron en hojas de cálculo de MicroSoft Excel para su posterior refinamiento manual. Usando estos datos se llevó a cabo una comparación genómica a través de especies, con el objetivo de definir órganos de otras especies de plantas para las que se pueden usar bibliotecas EST públicamente disponibles como modelos y como nuevas fuentes de información para definir nuevos genes con papel clave en la formación de fibra (Figura 1). Este análisis de comaparación usó principalmente las bases de datos de algodón, arabidopsis y tomate.
Agrupamiento y agrupamiento entre especies de secuencias EST.- La base de datos genómica del algodón incluía menos de 50.000 ESTs (publicación de Genebank # 135) que se originan principalmente de dos especies Gossypium arboreum (~35.000 ESTs) y Gossypium hirsutum L. (~9.000 ESTs, Tabla 1, más abajo). Estas ESTs están agrupadas y ensambladas usando la plataforma de software LEADS™ (Compugen Ltd, Israel) en dos enfoques alternativos.
En el primer enfoque, las ESTs de dos especies se agruparon y ensamblaron juntas (imitando así el proceso evolutivo ya que G. arboreum es un ascendiente de G. hirsutum). Este proceso reveló 6.478 agrupamientos entre ellos 3.243 nuevos agrupamientos (sin mRNA en la base de datos pública) que se definieron como agrupamientos de alta calidad (Tabla 1, más abajo).
En el segundo enfoque, se agruparon y ensamblaron ESTs de cada especie por separado. La comparación entre los dos enfoques mostró que usar el primer enfoque añade información a los agrupamientos de algodón sin un un sesgo significativo en el análisis. La base de datos del tomate contiene 126.156 ESTs que se originan de aproximadamente 30 bibliotecas bien definidas que a través del proceso de agrupamiento y ensamblaje revelaron 14.034 agrupamientos de los cuales un gran grupo de 12.787 agrupamientos eran agrupamientos de alta calidad (Tabla 1). La base de datos genómica de arabidopsis incluye 99.417 ESTs (
ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/), 8.573 cDNA de longitud completa (Rikken y genbank mRNAs
ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbamk/) y toda la secuencia de ADN. Usando el software LEADS se revelaron 23.148 agrupamientos y 6.777 singletones (ESTs únicos que no tiene otro EST agrupado dentro del mismo), todos los cuales se apoyaron por secuencias ESTs, en contra del consorcio público (TAIR,
www.arabidopsis.org/).
Se buscaron bibliotecas EST de otras plantas y órganos que comparten procesos biológicos similares a los de la
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fibra de algodón. Se espera que tales ESTs sirvan como modelos y como nuevas fuentes de información para la identificación de genes que están implicados en el desarrollo de la fibra. Con este fin, se generó una lista de genes conocidos que se sospecha que están implicados en el desarrollo de la fibra. Estos genes originados a partir de arabidopsis y se muestran en varios estudios que tienen un papel clave en la formación de tricoma (es decir, GL2, CPC, bHLH, TTG1, GL1, revisado en Larkin J. C. et al. 2003, Schellmann S. et al. 2002). El amplio análisis genómico comparativo reveló que los genes de tomate, con alta homología con los genes de fibra de algodón y con los genes de tricoma de arabidopsis tienen un contenido significativo de EST en cualquiera de las bibliotecas de hoja de tricoma y de desarrollo específico de la flor. Un análisis adicional comparó la base de datos genómica de estas tres especies - algodón, Arabidopsis y tomate (centrándose en las bibliotecas del tomate mencionadas anteriormente) como parámetros clave en la presente búsqueda de base de datos (Figura 1).
Tabla 1
Bases de datos genómicas de Algodón, Tomate y Arabidopsis
Especie
Descripción Bibl de EST Recuento de EST mRNA Después de LEADS (agrupamientos)
G. arboreum
Fibra 6DPA 37.276 12 16.294 agrupamientos en producción mixta*
G. hirsutum
Fibra 7-10 DPA 7.944 236
G. hirsutum
Óvulo de flor 1 DPA 1.272 870
L. esculentum
Todas las bibliotecas 115.859 7 25.678 agrupamientos en producción mixta
L. hirsutum
Bibliotecas de Tricoma 2.409 7
L. pennellii
Bibliotecas de Tricoma 2.723 24.450
A. thaliana
Todas las bibliotecas 160.698 mRNA 25.678 agrupamientos
*agrupamientos derivados de especies diferentes, algodón G. arboreum y G. hirsutum, tomate L. esculentum, L. hirsutum y L. pennellii
Identificación in silico de genes de algodón con un papel en el desarrollo de la fibra.- Para buscar si los datos genómicos del tomate se pueden usar como una fuente relevante de datos genómicos para estudiar el desarrollo de la fibra de algodón se efectuó una comparación genómica extensiva para identificar tanto genes de tomate como de algodón que tienen alta homología con genes clave que determinan el desarrollo del tricoma en arabidopsis (p. ej., GL2, CPC, bHLH, TTG1, GL1).
Se identificaron genes homólogos en algodón y tomate. Debido a que casi todas las ESTs de algodón se producen de fibras de algodón, fue imposible realizar la predicción in-silico del perfil de expresión de esos genes. Sin embargo, muchas fuentes de tejido usadas para la producción de la base de datos EST del tomate permitieron la identificación de tejidos en los que se expresaban genes específicos de tricoma.
En tomate se reveló que tanto las ESTs de tricoma como de óvulo están enriquecidas en agrupamientos que representan genes específicos de tricoma. De modo interesante, se encontró que las fibras de algodón se producen a partir de células de recubrimiento del óvulo. Como las semillas de tomate se cubren con tejido tipo velloso, de forma similar a las semillas de algodón, se postuló que esos pelos están ligados en términos de desarrollo a la formación del tricoma y de la fibra de algodón.
Se encontraron ~1.100 agrupamientos en tomate que incluyen al menos un EST de bibliotecas de tricoma. Entre ellas aproximadamente 1.000 secuencias incluían secuencias que también se originan de bibliotecas de la flor de tomate (en la que está presente el tejido de óvulo). La compararación de este grupo de genes con los datos de algodón reveló ~2.300 genes de algodón con alta homología con los genes de tricoma de tomate. La extracción de la base de datos usando estos dos grupos de genes junto con otra información bioinformática [homología a través especies, Ontología Génica (OG)] revelaron 80 agrupamientos de algodón que se predice que tienen un papel clave en la formación de fibra. Se seleccionaron esos genes en base a los siguientes criterios:
Agrupamientos de algodón con al menos 2 ESTs;
Homología con agrupamiento de tomate con e-puntuación mayor que 1e-5;
Homología con agrupamiento de tomate con al menos un EST que proviene de bibliotecas de tricoma o un EST que
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proviene de tejidos que contiene el óvulo;
Se consideraron los siguientes criterios como ventajosos aunque no necesarios:
Gran número de ESTs en un agolpamiento;
Factor de transcripción/proteínas de transducción de señal;
Anotación de genes relacionados con la expansión celular, presión de turgencia, síntesis de pared celular.
Se analizaron adicionalmente los nuevos genes junto con los genes de control de algodón conocidos por estar implicados en la formación de fibra mediante su perfil de expresión de ARN en plantas de algodón.
Ejemplo 2
Análisis de expresión de mRNA de genes identificados según las enseñanzas de la presente invención
Para estudiar el perfil de expresión de ARN de genes candidatos identificados como se describe en el Ejemplo 1 anterior, se efectuó una transcripción inversa seguida de PCR en tiempo real (RT-qPCR).
Procedimientos experimentales
Análisis cuantitativo por PCR en Tiempo Real (qRT PCR).- Para verificar los niveles de expresión específica y asociada a la característica se efectuó una Transcripción Inversa seguida de PCR cuantitativa (en Tiempo Real) (RTqPCR). Se extrajo el ARN total en diferentes etapas de desarrollo de la fibra (desde el día de antesis hasta el día 20 post-antesis). Para estudiar la especificidad de expresión, se recogió ARN de otros tejidos de plantas de algodón y se analizaron para expresión control (es decir, hojas jóvenes, tallos jóvenes, tallos maduros, raíces jóvenes, sépalos, pétalos, y estambre). Para este propósito, se extrajo ARN de tejido de algodón usando el protocolo de Extracción de Borato Caliente según
www.eeob.iastate.edu/faculty/WendelJ/ultramicrorna.html. Se efectuó la transcripción inversa usando 1,5 |ig de ARN total, usando 300 U de enzima Transcriptasa Reversa Super Script II (Invitrogen), 225 ng de hexámeros aleatorios de deoxinucleótidos (Invitrogen), mezcla de dNTPs (Takara, Japón) 500 |iM, 0,2 volúmenes de tampón RT 5x (Invitrogen), DTT 0,01 M, 60 U de RNAsin (Promega), se añadió DEPC tratado con agua doblemente destilada hasta 37,5 |il. Las reacciones de RT se incubaron durante 50 min a 42°C, seguido de 70°C durante 15 min. Se diluyó el cDNA a 1:20 en Tris EDTA, pH=8. Se usaron 5 ml de cDNA diluido para la qRT-PCR.
Se realizó la RT-PCR cuantitativa sobre el cDNA (5 |il), usando mezcla patrón SYBR GREEN PCR 1x (Applied Biosystems), cebadores directo e inverso 0,3 |iM de cada uno. Se usó la máquina de PCR ABI7000real-time con las siguientes condiciones 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 veces de 95°C durante 15 seg y 1 min a 60°C, seguido de 95°C durante 15 seg, 60°C durante 60 seg, y 70 veces de 60°C durante 10 seg + 0,5°C de incremento en cada ciclo. Para cada gen, se preparó una curva estándar a partir de un grupo de RTs de todas las muestras, en 5 diluciones (diluciones - 1:60, 1:200, 1:600, 1:2000. 1:10000). El gráfico de curva estándar [ct (ciclo umbral) vs. log (concentración)] debe tener R>=0,98 con una eficiencia en el intervalo de 100% +/- 5%. Se calcularon los niveles de expresión (Qty) medidos en la qPCR usando la eficiencia (E) de la reacción de amplificación y el correspondiente C.T. (el ciclo al que las muestras cruzan el umbral) Qty=E-C.T.. Se examinaron las curvas de disociación obtenidas para la ausencia de productos de PCR adicionales o dímeros de cebador no deseados. Las reacciones se repitieron al menos dos veces. El método se basa en el hecho de que las eficiencias de las reacciones del GOI (gen de interés) y de los genes constitutivos son similares.
Para normalizar el nivel de expresión entre los diferentes tejidos, se diseñaron cebadores específicos para hibridar específicamente con los siguientes genes constitutivos: Actina (N° Acceso GenBank D88414 SEQ ID NO: 28, cebadores directo e inverso se exponen en SEQ ID NO: 68 y 69, respectivamente), GAPDH (N° Acceso GenBank COTCWPPR, secuencia parcial, SEQ ID NO: 29, cebadores directo e inverso se exponen en SeQ ID NO: 97 y 98, respectivamente), y RPL19 (N° Acceso GenBank AI729179, SEQ ID NO: 30, cebadores directo e inverso se exponen en SEQ ID NO: 99 y 100, respectivamente).
Usando esta metodología fue posible identificar genes que presentaban una expresión elevada durante el alargamiento de la fibra, así como genes que presentaban especificidad única de fibra de algodón. Los genes que presentaban expresión elevada durante la antesis que disminuían durante el alargamiento de la fibra se consideraron buenos candidatos de estar implicados en la diferenciación e iniciación de la fibra. La metodología de cuantificación descrita anteriormente no proporcionó de modo notable niveles de expresión absolutos, pero proporcionó buenos parámetros para evaluar la expresión génica relativa a lo largo del desarrollo de la fibra a pesar de que se detectaron diferencias tan altas como más de 1000 veces en los máximos niveles de expresión alcanzados por diferentes genes (Tabla 2, a continuación).
Resultados
Se evaluaron 88 genes de algodón por perfil de expresión en diferentes tejidos de algodón (Gossypium hirsutum, var
Acala). Según los resultados de la expresión de genes, se predijeron 23 genes que mejoraban el rendimiento y calidad de fibra. Se presentan los perfiles de expresión de todos los genes candidatos en la Tabla 2.

Claims (15)

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    1. Un método para mejorar el alargamiento de la fibra de una planta, método que comprende expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polinucleótido de longitud completa expuesto en SEQ ID NO: 7, en donde dicho polinucleótido es capaz de regular el desarrollo de la fibra de algodón, mejorando de este modo el alargamiento de la fibra de la planta, en donde dicha mejora de dicho alargamiento de la fibra es en una planta productora de fibra.
  2. 2. Un método para mejorar el alargamiento de la fibra de una planta, método que comprende expresar en la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 112, mejorando de este modo el alargamiento de la fibra de la planta, en donde dicha mejora de dicho alargamiento de fibra es en una planta productora de fibra.
  3. 3. Una célula vegetal transgénica que comprende un constructo de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polinucleótido de longitud completa expuesto en SEQ ID NO: 7, y un promotor capaz de regular la expresión de dicho polinucleótido en la célula vegetal transgénica, en donde dicho promotor es heterólogo a la célula vegetal transgénica, en donde dicho polinucleótido y célula vegetal transgénica mejora el alargamiento de la fibra de una planta productora de fibra de una planta.
  4. 4. La célula vegetal transgénica de la reivindicación 3, en donde dicho polinucleótido es al menos 90% idéntico al polinucleótido de longitud completa expuesto en SEQ ID NO: 7.
  5. 5. El método de la reivindicación 1, o la célula vegetal transgénica de la reivindicación 3, en donde dicho polinucleótido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el polinucleótido de longitud completa se expone en SEQ ID NO: 7.
  6. 6. La célula vegetal transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde dicho promotor se expone en SEQ ID NO: 74, 75, 85 o 91 de un equivalente funcional del mismo.
  7. 7. La célula vegetal transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde dicho promotor es un promotor constitutivo.
  8. 8. La célula vegetal transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor inducible, un promotor de desarrollo específico de etapa y un promotor específico de tejido.
  9. 9. Una planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 3-8.
  10. 10. Un método para generar una planta transgénica, que comprende expresar dentro de la planta un constructo de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polinucleótido de longitud completa expuesto en SEQ ID NO: 7, y un promotor capaz de regular la expresión de dicho polinucleótido en una célula vegetal, en donde dicho promotor es heterólogo a la célula vegetal transgénica, en donde dicho polinucleótido mejora el alargamiento de la fibra de una planta productora de fibra, generando de este modo la planta transgénica.
  11. 11. El método de la reivindicación 10, en donde dicha planta es algodón.
  12. 12. Un método de producción de fibras de algodón, método que comprende:
    (a) generar una planta de algodón transgénica de acuerdo con el método de la reivindicación 11, y
    (b) recoger las fibras de la planta de algodón transgénica, produciendo de este modo las fibras de algodón.
  13. 13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 10, la célula transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 3-8, o la planta transgénica de la reivindicación 9, en donde la planta es una planta monocoltiledónea.
  14. 14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 10, la célula transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 3-8, o la planta transgénica de la reivindicación 9, en donde la planta es una planta dicoltiledónea.
  15. 15. El método de la reivindicación 1, 10, 11o 12, la célula vegetal transgénica de la reivindicación 3, o la planta transgénica de la reivindicación 9, en donde dicho polinucleótido se expone en SEQ ID NO: 7.
    imagen1
    Tomate
    Algodón
    Arabidopsis DB
    Revisión de literatura,
    Si
    JA R. GenBank
    Homología
    Homoloqia
    Algodón DB
    Tomate DB
    Genes control
    Perfil de
    biblioteca de
    Conjunto de nuevos genes
    genes control
    relacionados con la característica
    >1.100 genes
    Detectar genes con
    similar perfil de
    bib hoteca
    Filtrar lista por: Anotación Ontología, calidad del agrupamlento, grado de homología
    Lista refinada de nuevos genes implicados en el desarrollo de la fibra de algodón
    Fig. 1
    Curva de Desarrollo de Fibra de Algodón
    imagen2
    pétalos sépalos tallos maduros hojas maduras raíces jóvenes tallos jóvenes hojas jóvenes 18-20 dpa 15-17 dpa 12-14 dpa 9-11 dpa 6-8 dpa 4-5 dpa 2-3 dpa 0-1 dpa -DPA
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    Aumento de expresión (relativa a DPA)
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    Longitud de fibra
    Cantidades relativas de mRNA
    CT_76
    imagen6
    imagen7
    imagen8
    123
    KS.X.B.Sm
    imagen9
    Leyendas:
    RB- Borde derecho T-ADN
    LB- Borde izquierdo T-ADN
    H- Enzima de restricción Hind-llll
    X- Enzima de restricción Xba-I
    B- Enzima de restricción BamHI
    S- Enzima de restricción Sal-I
    Sm- Enzima de restricción Sma-I
    R-l- Enzima de restricción Hind-lll
    H- Enzima de restricción Eco-RI
    Sc-Sacl/Sstl/Ecl 13611
    (números)- Longitud en pares de bases
    Fig.4
    GUS
    imagen10
    124
    imagen11
    Fig. 5a Fig. 5b Fig. 5c
    Fig. 5d Fig. 5e
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    Fig. 5f
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    Fig. 5i
    Fig. 5h
    ©üSÍJiSt
    Fig. 5g
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    Fig. 5j
    Fig. 5k Fig. 5i
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    Fig. 6e
    imagen17
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