DE3850683T2

DE3850683T2 - Hybrides RNS-Virus.

Info

Publication number: DE3850683T2
Application number: DE3850683T
Authority: DE
Inventors: Paul G Ahlquist; Roy D French; Robert F Sacher
Original assignee: Lubrizol Genetics Inc
Current assignee: Mycogen Plant Science Inc
Priority date: 1987-02-09
Filing date: 1988-02-03
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2008-02-04
Also published as: DE3850683D1; JP3479531B2; US5627060A; EP0278667A2; ES2060646T3; EP0278667B1; AU606382B2; JPS63301787A; ATE108828T1; AU1138388A; JP2004000260A; US5804439A; EP0278667A3; CA1337933C; US5602242A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von RNA-Pflanzenviren für die Gentechnik, um Pflanzenzellen zu transformieren und Pflanzen systemisch zu infizieren, und insbesondere betrifft sie das Verpacken viraler Sequenzen in heterologe Hüllproteine.

Hintergrund der Erfindung

Es wurde erkannt, daß RNA-Viren für die Gentechnik von Pflanzen brauchbar sind, insbesondere +-Strang-Messenger-Sense-RNA-Viren. Siehe z. B. europäische Patentanmeldungen Nrs. 85 300 979.3 und 86 301 586.3, die durch Bezugnahme hier aufgenommen werden.
Ein Problem mit früheren Verfahren, die die Verwendung von RNA-Viren für die Gentechnik von Pflanzen betreffen, war jedoch die Tatsache, daß viele Pflanzenviren, die geeignete Stellen für die Insertion von RNA-Kopien fremder Gene bereitstellen, in ihrem natürlichen infektiven Zustand in kugelförmigen oder ikosahedrischen Capsiden eingekapselt sind, welche der Menge des genetischen Materials geometrische Einschränkungen beschert, welches in diesen Viren enthalten sein kann.
Beispiele solcher brauchbarer Viren sind die dreiteiligen Viren von Tricornaviridae, wie Trespe (Bromus)-Mosaikvirus (BMV) und Langbohne-"chlorotic mottle"-Virus (CCMV), welche in ikosahedrischen Capsiden verpackt sind. Das BMV-RNA3-Segment wurde ausführlich als ein Träger für heterologe RNA untersucht; jedoch zeigte die Beobachtung der Struktur der funktionalen Elemente dieses RNA-Segments an, daß die 3,2-3,3 kb Größe der natürlichen BMV-RNA 1 wahrscheinlich nahe der maximalen Größe ist, die durch die ikosahedrische BMV-Hülle getragen werden kann.
BMV-RNA3 hat eine Größe um 2,1 kb, so daß höchstens nur um 1 kb fremde Sequenz zu dem verpackbaren RNA-Derivat ohne Verlust eines Teils der natürlichen BMV-RNA3-Sequenz hinzugefügt werden können. Obwohl im Fall von BMV-RNA3, welche ausführlich untersucht wurde, die Identifikation von Sequenzen, die nicht in cis für die Replikation und Genexpression erforderlich sind, die Möglichkeit der Konstruktion von Varianten mit solchen Deletionen eröffnet, ist es für die vergrößerte Freiheit und Flexibilität beim Herstellen von höher entwickelten Viren-Derivaten höchst wünschenswert, fähig zu sein, heterologe RNA-Sequenzen hinzuzufügen, ohne daß es erforderlich wird, eine gleiche Menge der ursprünglichen viralen RNA zu deletieren. Die Möglichkeit existiert auch für BMV und einige andere isometrische Viren, deren untere als auch obere RNA-Größengrenzen für das Verpacken viraler RNA existieren (Ahlquist et al. (1984) J. Mol. Biol. 172 : 369-383).
Es wäre somit wünschenswert, rekombinante virale RNA-Sequenzen in ein Hüllprotein einzukapseln, das fähig ist, RNA-Stücke ohne obere oder untere Größenbeschränkungen frei zu verpacken.
Im Gegensatz zu den ikosahedrischen Viren haben eine große Klasse von Pflanzenviren verlängerte Virionen mit der Form starrer oder biegsamer Stäbchen. Der Tabakmosaikvirus ist ein Beispiel, das ausführlich untersucht wurde. (Siehe z. B. M.H.V. Van Regenmortel (1981) "Tobamoviruses", in Handbook of Plant Virus Infections and Comparative Diagnosis, E. Kurstak (ed.), 541-564; P.J.G. Butler (1984) "The Current Picture of the Structure and Assembly of Tobacco Mosaic Virus", J. Gen. Virol. 65 : 253-279; D.L. Beck et al. (1985), "Synthesis of Full-length cDNA Clones of TMV", Phytopathology, 75 : 1334 (Abstrakt); und W.O. Dawson et al. (1986) "cDNA Cloning of the Complete Genome of Tobacco Mosaic Virus and Production of Infectious Transcripts", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 1832-1836.
Das Hüllprotein solcher stäbchenförmiger Virionen wird durch ein RNA-Gen kodiert. Eine Assemblierungs-Origin-Sequenz ist auch notwendig, um das Verpacken zu initiieren. Ein cDNA-Klon, der den Assemblierungs-Origin von TMV- Langbohnen-Stamm (Cc) und das Hüllprotein-Gen enthält, wurde isoliert durch T. Meshi, et al. (1981) "Nucleotide Sequence of a Cloned cDNA Copy of TMV (Cowpea Strain) RNA, Including the Assembly Origin, the Coat Protein Cistron and the 3' Non-Coding Region", Mol. Gen. Genet. 184 : 20-25. In diesem besonderen TMV-Stamm sind die Assemblierungs-Origin-Sequenzen innerhalb des Hüllproteingens, jedoch sind in anderen Stämmen die Assemblierungs-Origin- und Hüllproteingene getrennt.
Die Hüllproteine von stäbchenförmigen Virionen sind in einer helikalen Anordnung zusammengesetzt und kapseln die stäbchenförmigen viralen RNA-Partikel mit RNA ein, die helikal innerhalb des inneren der vergrößerbaren Partikel gewunden ist. Somit ist es, um den Größenbereich der gentechnisch veränderten viralen RNA-Sequenzen zu vergrößern, eine Aufgabe dieser Erfindung, eine rekombinante RNA-Sequenz Bereitzustellen, die in einer stäbchenförmigen Hülle eingekapselt ist.
Im allgemeinen ist es wünschenswert, virale Sequenzen in irgendeinem heterologen Hüllproteincapsid zu verpacken, z. B., wenn der gewünschte Wirt Immunitäten gegen das natürliche Hüllprotein der viralen Sequenz entwickelt hat, mit der die Infektion gewünscht wird. Jedoch wurden vor dieser Erfindung keine Hybridviren konstruiert, die Funktionen (z. B. Wirtspezifizität, Infektivität u.ä.) kombinierten, die von mehr als einem RNA-Virus stammten.
Eine lebensfähige Rekombinante wurde auf der cDNA-Ebene zwischen den Poliovirus-Typen 1 und 3 konstruiert, welche in der RNA-Sequenz 70% homolog sind (G. Stanway et al. (1986), "Construction of poliovirus intertypic recombinants by use of cDNA", J. Virol. 57 : 1187). Diese Rekombinante beinhaltete die 0,74 kb 5'-nichttranslatierte Sequenz und die ersten 11 Polyprotein-Codons von Typ 3, mit dem Rest der Sequenz aus Typ 1. Eine zweite Rekombinante zeigte die komplizierte Insertion eines Teils des VP1-Capsid- Proteingen von Typ 3 in eine Typ 1-Umgebung, aber diese war nicht lebensfähig, was die Probleme beim Kombinieren nicht-homologer funktionaler Regionen anzeigt.
Ein zusätzliches Beispiel von Rekombination zwischen divergierenden Picornavirus-Genomen war die Konstruktion einer Rekombination zwischen Poliovirus-Typ 1 und Coxsackie B3-Virus (B.L. Semler et al. (1986), "A chimeric plasmid from cDNA clones of poliovirus and coxsackie virus that is temperature-sensitive", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 1777). In diesem Fall wurde ein 0,4 kb-Segment der Coxsackie B3-5'-nichtkodierenden Region in eine Poliovirus-Umgebung insertiert, welches ein Segment ersetzte, mit dem es 70% Homologie hatte. Das sich ergebende rekombinante Virus war lebensfähig, aber zeigte einen Temperatur-sensitiven Replikationsphenotyp.
Bei keinem dieser berichteten Versuche, rekombinante Viren herzustellen, wurde ein lebensfähiges Hybrid-Virus hergestellt, bei dem ein Ersatzsegment weniger als 70% Homologie mit dem Segment hatte, das es ersetzte, und in keinem Fall wurden getrennte Funktionen aus zwei oder mehr verschiedenen Viren erfolgreich rekombiniert. Es wurde auch nicht über die künstliche Konstruktion von Hybrid-RNA-Pflanzenviren aus zwei getrennten viralen Typen berichtet.
Nicht eingekapselte Derivate von stäbchenförmigen Viren wurden kürzlich als Vektoren verwendet, um ein fremdes Gen in rekombinanter RNA zu tragen (Takamatsu, N. et al., "TMV-RNA mediated foreign gene expression in tobacco plants", in Druck), und rekombinante RNA-Sequenzen wurden in vitro in eine stäbchenförmige Hülle eingekapselt (Sleat, D.E. et al. ("Packaging of Recombinant RNA Molecules into Pseudovirus Particles Directed by the Origin-of-Assembly Sequence from Tobacco Mosaic Virus RNA", in Druck). Jedoch wurde über das in vivo-Verpacken einer rekombinanten viralen RNA in ein Capsid, das zu den infektiven viralen Sequenzen fremd ist, bisher nicht berichtet.

Zusammenfassung der Erfindung

RNA-Viren ergeben brauchbare Vektoren für die gentechnische Veränderung von Pflanzen und anderen höheren Organismen, um nützliche Merkmale zu übertragen, wie z. B. Herbizid-Krankheits- und (Schädlings)plagenresistenz, jedoch sind die existierenden Systeme nicht so flexibel, wie gewünscht. Die Einkapselung einer viralen RNA-Sequenz scheint für seine signifikante und zuverlässige Ausbreitung durch das Wirtsystem erforderlich zu sein. Nichtumhüllte RNA-Viren können z. B. Einzelzellen und Protoplasten infizieren und im Falle von einigen Einzelbestandteil-RNA-Viren können sie sich unregelmäßig an Stellen entfernt von der ursprünglichen Beiimpfungsstelle ausbreiten. Jedoch erfordert die effiziente Transmission über die gesamte Pflanze von einer einzelnen Infektions- oder Transfektionsstelle aus, insbesondere für viele Mehrbestandteil-Pflanzen-RNA-Viren, die Einkapselung in einer viralen Hülle. Diese Erfindung stellt Verfahren zum Herstellen von Hybridviren bereit, in denen infektive virale Sequenzen, die aus nicht-stabförmigen Viren stammen, in heterologe Hüllproteincapside verpackt sind. Eingekapselte Hybridvirionen werden auch bereitgestellt, ebenso wie virale Hybrid-RNA-Sequenzen, die zur Einkapselung in vitro oder in vivo fähig sind.
Wie es hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck "Hybrid-RNA-Virus", auf rekombinante Viren, in denen funktionale Sequenzen aus zwei oder mehreren verschiedenen Viren kombiniert sind, um einen lebensfähigen Organismus zu bilden. Speziell hat das Hybrid-RNA-Virus dieser Erfindung RNA-Sequenzen, die aus einem nicht-stabförmigen Virus stammende infektiöse virale Sequenzen und einen Assemblierungs-Origin und ein aus mindestens einem Virus mit einem stäbchenförmigen Virion stammendes Hüllproteingen umfassen. Der Ausdruck "Hybrid-RNA-Virion" bezieht sich auf die eingekapselte Form solcher Viren.
Viele brauchbare RNA-Viren sind in ikosahedrischen Hüllen eingekapselt, die die Größe der Gene, die hinzugefügt werden sollen, limitieren. Ein Verfahren zum Einkapseln viraler RNA-Sequenzen in stäbchenförmige Hüllproteincapside wird deshalb bereitgestellt. Diese Hüllproteincapside sind expansionsfähig, um RNA-Fragmente großer Größe bis zu mindestens 6,4 kb Größe des Tabakmosaikvirus aufzunehmen. RNA-Fragmente, die so groß wie gewünscht sind, können in stäbchenförmige Partikel eingekapselt werden, solange die Partikel nicht so groß sind, daß sie durch normale physikalische Bearbeitungen wesentlich zerbrochen werden.
Eine rekombinante virale RNA-Sequenz wird bereitgestellt, in die ursprünglichen viralen Sequenzen aus einem Virus, das normalerweise in einem Typ von Hüllprotein eingekapselt ist, in einem verschiedenen Typ eingekapselt sind. Ein infektiöses Virus, das normalerweise in einem ikosahedrischen Capsid eingekapselt ist oder andererseits normalerweise nicht in einem stäbchenförmigen Capsid eingekapselt ist, wird mit Genen und Assemblierungs- Origins für die Herstellung eines stäbchenförmigen Capsids kombiniert, wodurch die Einkapselung der ursprünglichen viralen Sequenzen in einem stäbchenförmigen Capsid ermöglicht wird. Die ursprünglichen viralen Sequenzen sind vorzugsweise so modifiziert, daß sie wünschenswerterweise fremde Gene enthalten.
Eine ursprüngliche virale RNA-Sequenz, die zur Kombination mit heterologen Hüllproteingenen und Assemblierungs-Origins geeignet ist, ist eine Sequenz, die aus einem RNA-Virus stammt oder einer eines RNA-Virus entspricht. Beispiele von solchen Viren sind Plus-Strang-Viren, wie BMV, Tricornaviridae im allgemeinen und viele andere, die der Fachwelt bekannt sind. Weiter sind brauchbare Virussequenzen solche, die aus revers-transkribierter viraler oder Transposon-RNA, Viroiden und Virus-Satelliten stammen oder diesen entsprechen.
Als ein Minimum müssen solche virale Sequenzen die Funktionen der Replikabilität im Wirt und der Fähigkeit den Wirt zu infizieren, haben. Determinanten solcher Funktionen können in cis erforderlich sein oder in anderen Fällen können sie in trans bereitstellbar sein. Ein Beispiel eines Replikations-Erfordernisses, das in trans befriedigt werden kann, ist die Notwendigkeit des Vorhandenseins der Proteine, die durch die BMV-RNA's 1 und 2 kodiert werden, um BMV-RNA3 zu ermöglichen, in einem Wirt zu replizieren. Im Gegensatz müssen bestimmte Replikationssignale in cis vorhanden sein (d. h. direkt verbunden mit RNA3-Derivaten), um die Replikation von RNA3-Derivaten durch die Maschinerie zu ermöglichen, die in der durch die RNA's 1 und 2 infizierten Zelle ausgelöst wird.
Es ist auch wünschenswert, daß solche ursprünglichen viralen Sequenzen geeignete Stellen für den Zusatz fremder oder heterologer Gene haben. Der Ausdruck "fremd", und "heterolog", in bezug auf Gene und Sequenzen meint Gene oder Sequenzen, die nicht in der Natur in dem ursprünglichen Virus kodiert sind. Solche fremden Gene oder Sequenzen können an irgendeiner Stelle insertiert werden, die keinen Anlaß zu Störung mit den notwendigen Funktionen der ursprünglichen viralen Sequenzen, d. h. der Fähigkeit, zu replizieren und einen Wirt zu infizieren, gibt. In bezug auf die Expression in einem Wirt ist ein "heterologes" Gen eines, das nicht normalerweise an der Stelle in dem Wirt vorhanden ist, an der es plaziert worden ist.
Ähnliches ist wünschenswert, daß das Plazieren der heterologen Hüllproteingene und der Assemblierungs-Origins nicht solche notwendigen Funktionen der ursprünglichen viralen Sequenzen stört.
Hüllproteinsequenzen aus flexiblen oder starren stäbchenförmigen RNA-Viren sind besonders in dieser Erfindung brauchbar, in Kombination mit einem Assemblierungs-Origin, der fähig ist, die Hüllproteinsequenzen zu regulieren. Allgemein ist es in der Technik anerkannt, daß Assemblierungs-Origins zu ihren Hüllproteingenen spezifisch sind, so daß es bevorzugt ist, daß die Hüllproteingene und Assemblierungs-Origins aus dem selben Organismus stammen. Hüllproteingene, die ihren Assemblierungs-Origin innerhalb des Gens enthalten, z. B. BMV-Langbohne(Cc)-Stammgene, sind besonders bevorzugt.
Die fremden RNA-Sequenzen, die zu der ursprünglichen viralen RNA hinzugefügt werden, können sein oder kodieren für funktionale RNA's, und der Wirtorganismus kann genotypisch oder phenotypisch transfektiert und transformiert sein. Eine funktionale RNA ist eine, die irgendeine Funktion bereitstellt, welche geeignet ist, und von der bekannt ist, daß sie von einem RNA- Segment bereitgestellt wird. Solche Funktionen beinhalten, aber sind nicht darauf beschränkt, kodierende Funktionen, in denen die RNA als Messenger- RNA wirkt, wobei die RNA eine Sequenz kodiert, welche, translatiert durch die Wirtzelle, zur Synthese eines Peptids oder Proteins mit nützlichen oder gewünschten Eigenschaften führt. Solche Proteine werden hier "funktionale Proteine" genannt. Das RNA-Segment kann auch strukturell sein, wie z. B. in ribosomaler RNA; es kann regulatorisch sein, wie z. B. bei kleinen Kern-RNA's oder Anti-Sense RNA, oder es kann katalytisch sein. Anti-Sense-RNA ist nützlich, die Funktion komplementärer RNA in der Zielzelle zu inhibieren.
Wie es von Fachleuten geschätzt wird, falls die insertierte RNA-Sequenz in der Form von Messenger-Sense-RNA ist, die direkt durch die transformierte Zelle zu translatierende Gene umfaßt, müssen die Gene frei von unterbrechenden, nicht-translatierten Sequenzen, wie Introns, sein. Andererseits müssen die insertierten Gene nicht natürlich vorkommende Gene sein, aber sie sollten modifiziert werden können, Zusammenstellungen aus mehr als einem kodierenden Segment sein oder mehr als ein Protein kodieren. Die RNA kann auch modifiziert sein durch Kombinieren von Insertionen und Deletionen, um die Gesamtlänge oder andere Eigenschaften des modifizierten RNA-Moleküls zu steuern.
Die insertierten fremden RNA-Sequenzen können nicht-viralen oder viralen Ursprungs sein und können entweder RNA oder DNA in der Natur entsprechen. Sie können prokaryotischen oder eukaryotischen Ursprungs sein, solange sie in einer Form sind, die direkt durch die Translations-Maschinerie der Empfängerzelle translatiert werden kann oder auf andere Weise erkannt werden kann und für ihre funktionalen, strukturellen oder regulatorischen Funktionen verwendet werden können.
Wie oben diskutiert, kann "Expression", der fremden RNA-Sequenzen die Produktion funktionaler RNA's oder funktionaler Proteine beinhalten. Diese Expression kann auf irgendeinem nützlichen Level sein und wie es von Fachleuten geschätzt wird, können geeignete regulatorische Elemente abhängig vom gewünschten Produkt und verwendeten Wirt notwendig sein. Das Bereitstellen solcher regulatorischer Elemente ist eine dem Fachmann bekannte Angelegenheit.
Die natürliche TMV-RNA hat eine Länge von etwa 6,4 kb. Die stäbchenförmigen Capside dieser Erfindung können jedoch so lang oder so kurz sein, wie es erforderlich ist. Als maximale Größe nimmt man an, daß das ikosahedrische Capsid von BMV fähig ist, etwa 3,2 kb einzukapseln, und es kann ersehen werden, daß die Verwendung einer stäbchenförmigen Hülle den Größenbereich der gentechnischen viralen Sequenzen beträchtlich vergrößert, welche durch die Einkapselung zur systemischen Ausbreitung in Wirten, kompetent gemacht werden können, welche vorher nur ikosahedrisch eingekapselten Viren zugänglich waren.
Wie nachfolgend diskutiert wird die Insertion fremder RNA-Sequenzen vorzugsweise durch reverse Transkription aller Sequenzen, die an der entsprechenden cDNA beteiligt sind, durchgeführt oder im Fall fremder Sequenzen, die ursprünglich aus DNA stammen, können ursprüngliche DNA-Sequenzen verwendet werden. Irgendein geeigneter Vektor kann verwendet werden, um eine Grundlage zum Ausführen solcher Gentechnik bereitzustellen, alles, wie es dem Fachmann einleuchtend ist. Bevorzugte Plasmide werden in den Beispielen hier diskutiert. Techniken zum Konstruieren gewünschter DNA-Sequenzen oder Kombinationen von DNA-Fragmenten sind der Technik wohlbekannt, und zwar unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme, Ligationstechniken und Oligonucleotid-gerichteten Veränderungen, die zur Konstruktion von Fragrnent-Kombinationen, die die gewünschten Funktionen enthalten, erhältlich sind. Techniken zum Testen solcher Konstruktionen, um ihre Wirksamkeit bzw. ihren Betrieb sicherzustellen, sind auch wohlbekannt und werden nicht hier im Detail diskutiert.
Ähnlich kann jeder in der Technik bekannte bakterielle Wirt für Vektoren, die die DNA-Sequenzen dieser Erfindung enthalten, beim Durchführen der genetischen Experimente und/oder beim Erhalten der RNA-Transkripte von DNA- Sequenzen in vivo verwendet werden. RNA-Transkripte können auch in vitro produziert werden, z. B. durch die Verfahren der europäischen Patentanmeldung Nr. 85 300 979.3.
Jegliche Pflanze kann mit einer RNA-Sequenz dieser Erfindung infiziert werden, wie es dem Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich ist, durch Bereitstellen geeigneter Wirt-Spezifizität und Replikationsfunktionen. Mit geeigneten Konstruktionen können auch andere eukaryotische Organismen infiziert werden, wie Einzelzellen und Gewebekulturen. Diese Erfindung ist' nicht auf irgendeine Klasse von Wirten oder Typen des RNA-Virus beschränkt. Die allgemeine Anwendbarkeit beim Schaffen einer heterologen schützenden Hülle oder Einkapselung insbesondere einer, die Größen-Expansion für eine virale Sequenz ermöglicht, wird vom Fachmann als eine Verbesserung in einem Verfahren erkannt werden, welches die Verwendung von Viren, die durch hinzugefügte RNA-Sequenzen verbessert werden können, beinhaltet.
Der Ausdruck "systemische Infektion" meint Infektionen, die sich im System des Wirt-Organismus ausbreiten, um mehr als die Zellen an der Stelle der ursprünglichen Beimpfung zu betreffen. Der gesamte Wirtorganismus muß nicht infiziert werden; einzelne Organe oder sogar Teile der Organe sind ausreichend, abhängig vom Zweck der Infektion.
Der Ausdruck "transfiziert", wie er auf den Wirtorganismus angewendet wird, meint den Einbau viraler Sequenzen dieser Erfindung in die Zellen des Organismus, und zwar derart, daß darin repliziert wird. Um transfiziert zu werden, braucht der Organismus nicht systemisch infiziert zu werden, aber wird vorzugsweise systemisch infiziert.
Verfahren zum Initiieren der Infektion des Wirtorganismus sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, und andere geeignete Verfahren können verwendet werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Infizieren von Pflanzen ist, die "verwundete" Pflanze mit einer Lösung zu kontaktieren, die das Virus oder die virale RNA enthält, um zu bewirken, daß das Virus in der Pflanze repliziert oder diese infiziert.

Kurze Beschreibung der Figur

Fig. 1 zeigt eine schematische Zeichnung der viralen cDNA-Regionen der Plasmide pB3TP7 enthaltend BMV-RNA3, pB3RS2 mit dem Hüllproteinstartkodon modifiziert von ATG bis AAG, pB3/TMV mit dem TMV-Hüllprotein und dem Assemblierungs-Origin als Ersatz für das BMV-RNA3-Hüllprotein und pCc8C5 enthaltend das TMV-Hüllprotein und den Assemblierungs-Origin, wobei das Plasmid Konstruktionen von pB31TMV zeigt.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist ein RNA-Segment eines ikosahedrischen Virus, vorzugsweise eines dreiteiligen Virus und weiter bevorzugt BMV, in einem zylindrischen Capsid verpackt, vorzugsweise von TMV und weiter bevorzugt von TMV-Langbohnen-Stamm (Cc)-Hüllprotein. Vorzugsweise ist die verpackte Sequenz auch modifiziert, um ein heterologes Gen zu enthalten.
Das Genom von BMV ist in die Messenger-Sense-RNA's 1, 2 und 3 von 3,2, 2,9 bzw. 2,1 kb unterteilt. cDNA-Kopien dieser RNA's wurden in den universellen Transkriptionsvektor pPM1 kloniert, weicher bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 07. März 1984 als Nr. 40172 hinterlegt worden war. Die Klone, die die RNA's 1, 2 bzw. 3 enthielten, wurden pB1PM18, pB2PM25 und pB3PM1 bezeichnet und wurden bei der ATCC am gleichen Tag als die Nrs. 40171, 40170 bzw. 40169 hinterlegt. Um Zellen mit BMV-RNA3 zu infizieren, mußten die durch BMV-RNA's 1 und 2 kodierten Proteine vorhanden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese drei BMV-RNA's in dem stäbchenförmigen Virushüllprotein getrennt eingekapselt.
In der bevorzugten Ausführungsform enthalten die BMV-RNA's 1, 2 und 3 jeweils einen geeigneten Assemblierungs-Origin, aber nur die BMV-RNA3- Sequenz enthält ein hinzugefügtes Hüllprotein, obwohl irgendeine der Sequenzen modifiziert sein kann, um zusätzliche RNA-Sequenzen zu enthalten, wie Sequenzen, die für funktionale Proteine kodieren oder funktionale RNA's. Verfahren zum Modifizieren von DNA-Sequenzen, um heterologe oder fremde Sequenzen zu insertieren, sind dem Fachmann gut bekannt. Im allgemeinen wird die virale RNA-Sequenz in ein cDNA-Transkript voller Länge umgewandelt und in einen Vektor kloniert, dann durch Insertieren eines fremden DNA- Segments in eine Region modifiziert, die fähig ist, solch eine Insertion ohne Unterbrechung der RNA-Replikation oder Zerstörung der Infektivität zu dulden.
Es ist notwendig, daß in der verpackten viralen RNA, das Gen für sein eigenes Hüllprotein zerstört oder inaktiviert worden ist, um Wechselwirkungen mit dem hinzugefügten Hüllproteingen zu vermeiden. Mittel zur Inaktivierung viraler Hüllproteingene sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe z. B. Ahlquist et al. (1981) "Complete Nucleotide Sequence of Brome Mosaic Virus RNA3", J. Mol. Biol. 153 : 23-38. Ein bevorzugtes Verfahren zum Inaktivieren des Gens ist einfach die Deletion des Gens oder wesentlicher Teile davon. Andere Verfahren beinhalten Punktmutation oder Inaktivierung durch Insertion.
Um die translationale Genauigkeit des heterologen Hüllproteingens sicherzustellen, kann es auch notwendig sein, das Translationsinitiations-ATG-Kodon für das ursprüngliche Hüllprotein zu modifizieren, falls dieses nicht deletiert worden ist, und dies kann mittels bekannter Maßnahmen erreicht werden, wie Oligonucleotid-gerichtete Substitution. Falls die hinzuzufügende Hüllproteinsequenz sein eigenes translationales Startkodon hat, ist die Deletion oder Inaktivierung des Startkodons für das ursprüngliche Protein notwendig; alternativ jedoch kann es beibehalten werden und verwendet werden, um die Translation der hinzugefügten Hüllproteinsequenz zu initiieren, vorausgesetzt, daß jeglicher dadurch eingeführter Aminosäuresequenzaustausch nicht die RNA-Verpackung und Capsidbildung stört.
Viele RNA-Viren, die stäbchenförmige Virionpartikel produzieren, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe, z. B. Plant Virolo (2. Ausgabe), R.E.F. Matthews (1981) Academic Press, New York, und "4th Report of the International Committee on Taxomony of Viruses", (1982) Intervirology 11 : 1-199). Brauchbares Hüllprotein und Origins von Assemblierungs-Sequenzen können isoliert werden und aus solchen Viren mittels bekannter Maßnahmen ohne aufwendiges Experimentieren revers transkribiert werden. Bevorzugte Sequenzen sind TMV-Sequenzen und am meisten bevorzugt sind Hüllproteingene, die ihren eigenen Assemblierungs-Origin einbauen, wie z. B. das Hüllproteingen von TMV-Langbohne (Cc)-Stamm. Plasmid pCc8C5 von Meshi et al., supra enthält cDNA, die solchen Sequenzen entspricht, und wurde von Meshi et al. für die hier diskutierte Arbeit erhalten. Die weitreichende Verfügbarkeit dieses Stamms und die Tatsache, daß die Sequenzen des Hüllproteingens und der Assemblierungs-Origin publiziert wurden (Meshi et al. supra), macht die Rekonstruktion dieses Plasmids und/oder der Sequenzen zu einem Gegenstand üblichen Könnens.
Durch Standard-Klonierungstechniken werden das Hüllproteingen und die Assemblierungs-Origin-Sequenzen von stäbchenförmigen Virionen in die zu verpackende virale Sequenz ligiert, vorzugsweise an der Stelle, wo das ursprüngliche Hüllprotein für das Virus entfernt wurde, aber in jedem Fall an einer Stelle, die nicht die Fähigkeit des Virus zu replizieren und seinen Wirt zu infizieren, stört.
Translationale Expression des insertierten neuen Hüllproteingens kann durch bekannte Maßnahmen bereitgestellt werden. In dem Beispiel wurde das TMV- Hüllproteingen direkt downstream der Initiationsstelle für subgenomische BMV-RNA4 insertiert, was zu BMV-gerichteter Synthese einer subgenomischen mRNA für TMV-Hüllprotein führte. Von dem TMV-Gen wird somit gesagt, daß es downstream eines "subgenomischen Promotors", plaziert worden ist.
Die fremden Gene, für die die Expression in der Wirtspflanze gewünscht ist, können an jeder geeigneten Stelle im Genom des ursprünglichen Virus insertiert werden, welche nicht die Fähigkeit des Virus zu replizieren und den Wirt zu infizieren, stört. Vorzugsweise werden die fremden Gene direkt upstream des Hüllproteins und seines subgenomischen Promotors insertiert. Eine Kopie des subgenomischen Promotors, der normalerweise das Hüllprotein im ursprünglichen Virus reguliert, kann auch upstream solcher fremden Gene plaziert sein, um ihre translationale Expression zu ermöglichen.
RNA-Transkripte werden in vivo hergestellt, wie z. B. in bakteriellen Wirten oder in vitro, ganz wie es auf diesem Fachgebiet bekannt ist, und werden verwendet, um einen geeigneten Pflanzenwirt oder ein geeignetes Pflanzengewebe zu beimpfen. Die RNA kann in eingekapselter Form oder in Lösung verwendet werden, weil die Einkapselung innerhalb des Wirtorganismus stattfinden wird.
Wie es vom Fachmann verstanden wird, kann ein gegebenes Virus spezielle Bedingungen für optimale Infektivität und Replikation erfordern, einschließlich des Vorhandenseins von Genen, die in cis oder in trans wirken, wobei all dieses vorhanden sein sollte, wenn die Pflanze oder das Pflanzengewebe infiziert wird. Zum Beispiel ist für die Infektivität von BMV-RNA3 das Vorhandensein von BMV-RNA 1 und 2 notwendig. Darüber hinaus kann die Infektion durch ein Virus mit den notwendigen Wirt-Spezifizität-Genen für einen bestimmten Wirt unter einigen Umständen die Infektion des Wirts durch ein zweites Virus ermöglichen, das normalerweise diesen Wirt nicht angreifen würde, z. B. gemischte TMV- und BMV-Viren werden sowohl Gerste als auch Tabak infizieren, obwohl BMV allein Tabak nicht infizieren würde und TMV allein nicht Gerste infizieren würde (Hamilton und Nichols (1977) Phytopathology, 67 : 484-489). Es ist nicht notwendig, daß alle erforderlichen Gene identifiziert und kartiert werden, wenn das gesamte ursprüngliche Virus, das die notwendigen Gene bereitstellt, verwendet wird.
Geeignete Gene, die in das ursprüngliche virale Segment für die Expression in der Wirtspflanze insertiert werden können, beinhalten, d. h. CAT (chloramphenicol transferase)-Gen, Schädlingsresistenzgene, z. B. Bacillus thuringiensis, insektizidale Proteingene, Krankheitsresistenz, Herbizidtoleranz oder -resistenz, modifizierte Wachstumsverhaltens- und neue metabolische Stoffwechselgene und Gene zur Herstellung kommerziell brauchbarer Peptide oder Pharmazeutika in Pflanzen oder anderen Wirtsorganismen. Im allgemeinen kann jegliches heterologes Gen, dessen Expressionsprodukt in der Pflanze funktionell ist, in das hier beschriebene virale Expressionssystem insertiert werden.
Pflanzen können sowohl unter Feld- als auch Gewächshausbedingungen transfiziert werden. Die Modifikationen können zu jeder Zeit während des Wachstumszyklus, abhängig von der Notwendigkeit für das Merkmal, angewendet werden. Zum Beispiel kann die Schädlingsresistenz nur übertragen werden, wenn für das Getreide das Risiko von Schädlingen besteht und zu der Zeit, wenn das Getreide am wahrscheinlichsten durch Schädlinge angegriffen wird. Andere Merkmale können verwendet werden, um sekundäre Eigenschaften zu verbessern, z. B., um den Proteingehalt von Futter nach der Ernte zu vergrößern. Jegliche Pflanzensorte, die für eine Infektion durch einen RNA-Virus empfänglich ist, kann phenotypisch transformiert werden. Die Auswahl des Virus und die Details der Modifikation werden abhängig von den bekannten Parametern zu Wahlgegenständen und werden durch Fachleute so verstanden.
Andere Verwendungen für Zellen und Organismen, die phenotypisch oder genotypisch mittels einer aus einem RNA-Virus stammenden modifizierten RNA modifiziert worden sind, sind dem Fachmann leicht ersichtlich, in Anbetracht eines breiten Bereichs von zu modifizierenden RNA-Viren und einem breiten Bereich empfänglicher Wirtzelltypen. Andere Verwendungen für transfizierte Tierzellen, Bakterienzellen u.ä. kann man sich leicht vorstellen. Zum Beispiel können Tierzellen, die für eine Infektion durch alpha-Viren empfänglich sind, welche homologe nicht-strukturelle Proteine und viele Merkmale der viralen Replikation mit BMV teilen, in einer Zellkultur mit einem modifizierten alpha- Virus, das ein gewünschtes Gen enthält, infiziert werden, und sie können dazu veranlaßt werden, große Mengen eines gewünschten Proteins innerhalb einer kurzen Zeit zu exprimieren. Die eingekapselten RNA-Viren dieser Erfindung sind besonders nützlich, wenn es notwendig ist, den Virus harten Bedingung zu unterwerfen, auf Grund entweder von Umweftbedingungen oder einer Abwehr durch den Wirt, welche das nicht-umhüllte Virus inaktivieren würden.
Das Verfahren zum Herstellen und Verwenden gentechnisch veränderter Viren ist hier mit besonderem Bezug auf BMV-RNA's beschrieben, aber der gewöhnlich gut ausgebildete Fachmann wird fähig sein, unter Verwendung bekannter Techniken die beschriebenen Prinzipien auf andere virale RNA's anzuwenden.

Beispiel

Die folgende Diskussion beschreibt die Insertion eines TMV-Hüllproteingens und Assemblierungs-Origins in BMV-RNA3, Expression des insertierten Gens und in vivo-Verpackung der Hybrid-RNA in stäbchenförmige Partikel.
Wie es in Fig. 1 gezeigt ist, enthält Plasmid pB3TP7 die cDNA-Kopie voller Länge von BMV-RNA3 aus Plasmid pB3PM1, das an einen Promotor für Bakteriophage T7-RNA-Polymerase fusioniert worden ist, was in vitro zu produzierende biologisch aktive RNA3-Transkripte ermöglicht. Das Initiations- ATG-Kodon des BMV-Hüllproteins in diesem Plasmid wurde durch Oligonukleotid-gerichtete Substitution (Zoller und Smith (1982) Nucl. Acids Res. 10 : 6487-6500; Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82 : 488-492) an ein AAG-Kodon zur Erzeugung von Plasmid pB3RS2 modifiziert.
Plasmid pCc8C5 enthält eine Teil-cDNA-Kopie der RNA von Langbohne (Cc)- Stamm von Tabak-Mosaik-Virus (Meshi et al., suora). Unter Verwendung von Standardverfahren (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, CSH Laboratory), wurde das etwa 0,5 kb Sall-Xbal-Fragment von pB3RS2 innen von dem BMV-Hüllgen dann durch ein etwa 0,6 kb Mboll-Xbal-Fragment von pCc8C5 ersetzt, welches das gesamte Hüllproteingen von TMV-Cc enthält, einschließlich Sequenzen von denen man annimmt, daß sie den Einkapselungs-Origin der RNA darstellen (Meshi et al., supra). Die Sall und Mboll-Restriktionsfragmentenden wurden beide zu Bluntenden mit T4DNA-Polymerase vor der Ligation aufgefüllt. Das sich ergebende Plasmid wird als pB3/TMV bezeichnet.
Transkripte von EcoRI-linearisiertem pB3/TMV, einschließlich der kompletten BMV-RNA3- und TMV-Sequenzen, die in diesem Plasmid enthalten sind, wurden auf Gerste-Protoplasten zusammen mit infektiösen Transkripten und BMV-RNAI und -RNA2-cDNA-Klonen geimpft (French et al., (1986) Science 231 : 1294-1297). Die pB3/TMV-RNA's wurden in solchen Infektionen repliziert und verursachten eine subgenomische RNA einer Größe, die für eine mRNA initiiert an der normalen BMV-RNA3-subgenomischen Initiationsstelle erwartet worden war und enthielt alle ,Sequenzen zwischen diesem Punkt und dem 3'-Ende der BMV-RNA-Sequenz, einschließlich der TMV-Cc-Sequenz- Insertion.
RNA-Proben stammten aus Protoplasten, die mit Transkripten von WildtypcDNA-Kopien der BMV-RNA's 1 ,und 2 und entweder keinen zusätzlichen Transkripten (-) oder Transkripten von entweder Wildtyp BMV-RNA3-cDNA oder pB3/TMV beimpft worden waren. Fluorogramme von ³H-Uridin-markierten RNA's, die auf einem 1% (w/v) Agarosegel aufgetrennt worden waren, und zwar nach Extraktion von verschieden beimpften Protoplastenproben, die für 20 Stunden in Licht bei 24ºC inkubiert worden waren, zeigten die Anwesenheit von all diesen RNA's.
Wenn Gefrier/Auftau-Lysate von Gerste-Protoplasten, die mit Transkripten von BMV-RNA 1, RNA2 und pB3/TMV infiziert worden waren, durch serologisch-spezifische Elektronenmikroskopie (K.S. Derrick und R.H. Brlansky (1976) Phythopathology 66 : 815-820) unter Verwendung von Anti-BMV- Virion-Antikörper erprobt worden waren, wurden stäbchenförmige Partikel in wiederholten Experimenten gleichmäßig sichtbar gemacht. Diese Partikel hatten verschiedene Merkmale, die höchst charakteristisch für normale TMV- Virion-Partikel sind, einschließlich einem etwa 20 nm Durchmesser und einem zentralen Uranylacetat-Anfärbkanal. Die Partikel hatten überwiegend eine Länge um 110 nm, während die längsten Partikel, die in der gleichen Weise aus mit TMV-Cc-Virion-RNA infizierten Protoplasten sichtbar gemacht worden waren und 310 nm lang waren. Nimmt man eine Länge von 6,4 kb für TMV- RNA (Goelet et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 82 : 488-492) und ein konstantes Verhältnis von RNA zur Partikellänge (Butler, supra), an, bedeuten diese Ergebnisse, daß die Hauptpartikelform von pB3/TMV infizierten Protoplasten eine etwa 2,3 kb RNA enthält und daß die Länge der pB3/TMV-RNA etwa 2,2 kb ist. Ein kleiner Anteil kleinerer Partikel wurde auch in von pB3/- TMV-stammenden Präparationen gesehen und ein größerer Anteil und eine breitere Längenverteilung von Partikeln kleiner als 310 nm wurde auch aus TMV-Cc-infizierten Präparationen gesehen. Solche kleineren Partikel können aus dem Bruch größerer Partikel entstehen oder aus der Einkapselung subgenomischer RNA's.
Das vorhergehende Beispiel dient zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung der Erfindung.

Claims

1. Hybrid-RNA-Virus-Sequenz, umfassend eine infektiöse Virus-Sequenz, die von einem nicht-stabförmigen Virus stammt und einen heterologen Ursprung für den Zusammenbau und ein Hüllprotein-Gen, die von mindestens einem Virus mit einem stabförmigen Virion stammen.

2. Sequenz nach Anspruch 1, umfassend zusätzlich zu dem Hüllprotein-Gen eine heterologe für ein funktionelles Protein codierende Sequenz.

3. Sequenz nach Anspruch 1, umfassend eine heterologe Sequenz einer funktionellen RNA.

4. Sequenz nach Anspruch 1, worin der Ursprung für den Zusammenbau und das Hüllprotein-Gen von TMV stammen.

5. Plasmid, enthaltend eine zu der RNA-Sequenz von Anspruch 1 komplementäre cDNA.

6. Hybrid-RNA-Virion, umfassend eine Hybrid-RNA-Virus-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

7. Stabförmiges Hybrid-RNA-Virion nach Anspruch 6.

8. Verfahren zur Transfektion einer Pflanze mit einer funktionellen heterologen RNA, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:

(a) Modifizierung einer zur Infektion der Pflanze fähigen RNA-Virus-Sequenz, die von einem nicht-stabförmigen Virus stammt, um die funktionelle heterologe RNA und den Ursprung für den Zusammenbau und das Hüllprotein-Gen zu enthalten, die von mindestens einem Virus mit einem stabförmigen Virion stammen,

(b) Bereitstellung von ein oder mehreren Replikationsgenen in cis oder in trans, um die Replikation der modifizierten RNA-Virus-Sequenz zu sichern,

(c) Inkontaktbringen der Pflanze mit den Elementen von (a) und (b), um die Infektion zu initiieren, und

(d) Erlauben der Infektion, sich systemisch über die Pflanze auszubreiten.