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ES2635546T3 - Polinucleótidos y polipéptidos implicados en el desarrollo de fibra vegetal y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Polinucleótidos y polipéptidos implicados en el desarrollo de fibra vegetal y métodos de uso de los mismos Download PDF

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ES2635546T3
ES2635546T3 ES11154193.4T ES11154193T ES2635546T3 ES 2635546 T3 ES2635546 T3 ES 2635546T3 ES 11154193 T ES11154193 T ES 11154193T ES 2635546 T3 ES2635546 T3 ES 2635546T3
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plant
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plants
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ES11154193.4T
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Rafael Meissner
Hagai Karchi
Evgenia Gold
Rodrigo Yelin
Sharon Ayal
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Original Assignee
Evogene Ltd
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Abstract

Un método para mejorar el alargamiento de la fibra de una planta productora de fibra, método que comprende expresar en la planta productora de fibra un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el polinucleótido de longitud completa expuesto en la SEQ ID NO: 19, mejorando de este modo el alargamiento de la fibra de la planta productora de fibra.

Description

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DESCRIPCION
Polinucleotidos y polipeptidos implicados en el desarrollo de fibra vegetal y metodos de uso de los mismos Campo y antecedentes de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos de uso de polinucleotidos y polipeptidos implicados en el desarrollo de fibra vegetal, como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas.
El algodon y los subproductos de algodon proporcionan materias primas que se usan para producir una riqueza de productos de consumo ademas de textiles que incluyen algodon, alimentos, alimentacion del ganado, fertilizantes y papel. La produccion, la comercializacion, el consumo y el comercio de productos a base de algodon generan un exceso de 100 billones de $ anualmente solo en los E.E.U.U., lo que hace al algodon el cultivo de valor anadido numero uno.
Se estima que el uso de algodon como fibra por los seres humanos se remonta a 7000 anos en America Central y a 5000 anos en India. Incluso con el crecimiento de las fibras sinteticas en los ultimos 50 anos, el algodon sigue siendo responsable de aproximadamente el 50% de la fibra textil del mundo [Agrow Reports, Mercado Mundial de Semillas DS208, Octubre 2000].
A pesar de que el 90% del valor del algodon como un cultivo reside en la fibra (hebra), se ha reducido el rendimiento y calidad de la fibra, especialmente en la ultima decada [Meredith (2000), Proc. World Cotton Research Conference II, Atenas, Grecia pgs. 97-101]. Este descenso se ha atribuido a la erosion general en la diversidad genetica de las variedades de algodon, y una aumentada vulnerabilidad del cultivo a las condiciones ambientales [Bowman et al., Crop Sci. 36: 577-581 (1996); Meredith, supra].
Hay muchas variedades de planta de algodon, de las que se pueden obtener y usar para diversas aplicaciones fibras de algodon con una gama de caractensticas. Las fibras de algodon se pueden caracterizar segun una variedad de propiedades, algunas de las cuales se consideran altamente deseables dentro de la industria textil para la produccion de productos cada vez de mas alta calidad y el optimo aprovechamiento de las tecnologfas modernas de hilado. Propiedades comercialmente deseables incluyen longitud, uniformidad de longitud, finura, relacion de madurez, produccion de fibra fuzz disminuida, micronaire, fuerza del haz, y fuerza de fibra individual. Se ha puesto mucho esfuerzo en la mejora de las caractensticas de las fibras de algodon centrandose principalmente en la longitud de fibra y la finura de fibra. En particular, hay una gran demanda de fibras de algodon de longitudes espedficas.
Se pueden clasificar los metodos para mejorar las caractensticas o rendimiento de fibras de algodon en las tres siguientes categonas:
1. Mejora de la variedad por cruzamiento
Este metodo se ha utilizado ampliamente hasta ahora. En la actualidad, casi todas las variedades cultivadas de planta de algodon se cnan por este metodo. Sin embargo, la mejora del rendimiento de fibra de algodon usando cruzamiento tradicional es relativamente lenta e ineficiente y el grado de variabilidad que se puede alcanzar es limitado.
2. Tratamiento con hormonas vegetales.
Se han usado ampliamente hormonas vegetales como auxina, giberelina, citoquinina y etileno en cultivos de campo y productos hortfcolas. Es conocida la influencia de hormonas vegetales, particularmente giberelina, auxina y brasinolida, sobre las caractensticas de las fibras de plantas de algodon [p. ej. la Patente de E.E.U.U. N° 5880110 produce fibras de algodon con mejoradas caractensticas de fibra mediante tratamiento con brasinosteroides]. Sin embargo, no se ha documentado ningun efecto medible, haciendo el uso practico de estas hormonas a gran escala altamente improbable.
3. Variedad mejorada por ingeniena genetica.
La amplia aceptacion del algodon modificado geneticamente en los principales pafses productores y el hecho de que es un cultivo no alimentario lo convierte en un atractivo candidato para la ingeniena genetica para la mejora del rendimiento y/o calidad de fibra.
En los ultimos anos, se han hecho notables avances en ingeniena genetica de plantas como resultado se han informado varios casos exitosos de mejora de variedad de plantas de cultivo comercialmente importantes (p. ej., algodon, soja, mafz, colza, tomate). Por ejemplo, se han desarrollado y puesto en uso practico metodos de mejora de la resistencia a insectos mediante la introduccion de un gen que codifica la toxina BT (es decir, la protema toxina insecticida producida por Bacillus thuringiensis) en una planta de algodon. Ademas, se han disenado geneticamente plantas de algodon con resistencia mejorada a herbicida (Glifosfato) mediante la introduccion de un gen que codifica el acido 5-enol-piruvil-shiqmmico 3-fosfato sintetasa.
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La disponibilidad y el exito de la ingeniena genetica de plantas combinado con el hecho de que el algodon es un candidato excelente para la manipulacion genetica a traves de tecnicas recombinantes han llevado a los investigadores a postular que si se puede identificar un gen asociado con una propiedad mejorada de fibra de algodon, se puede regular a la alza usando tecnicas recombinantes mejorando asf las caractensticas o rendimiento de las fibras de algodon.
Por el contrario, si se puede identificar un gen asociado con una disminucion en una propiedad de la fibra de algodon, se podna regular a la baja usando metodos de silenciamiento genico. Para este proposito, se deben esclarecer los mecanismos de alargamiento y de formacion de la fibra a nivel genetico y se deben identificar genes estrechamente asociados con estos mecanismos.
Una fibra de algodon se compone de una unica celula que se ha diferenciado a partir de una celula epidermica de la cubierta de la semilla, desarrollandose a traves de cuatro etapas, es decir, iniciacion, alargamiento, engrosamiento de la pared celular secundaria y etapas de maduracion. Mas espedficamente, el alargamiento de una fibra de algodon comienza en la celula epidermica del ovulo inmediatamente despues de la floracion, despues de lo cual la fibra de algodon se alarga rapidamente durante aproximadamente 21 dfas. El alargamiento de la fibra se termina entonces, y se forma una pared celular secundaria y crece a traves de la maduracion para convertirse en una fibra de algodon madura.
Se han aislados varios genes candidatos que estan asociados con el alargamiento y formacion de las fibras de algodon. Por ejemplo, se han identificado cinco genes de plantas de algodon que se expresan espedficamente en la etapa de alargamiento de la fibra de algodon mediante el metodo de cribado diferencial y el metodo de visualizacion diferencial, [Patente de E.E.U.U. N° 5.880.100 y solicitudes de patente de E.E.U.U. N°s de Serie 08/580.545, 08/867.484 y 09/262.653].
WO0245485 describe metodos y medios para modular la calidad de la fibra en plantas productoras de fibra, como algodon, modulando la actividad y/o expresion de la sacarosa sintasa (un azucar importante para la smtesis de la pared celular) en dichas plantas.
La Patente de E.E.U.U. N° 6.472.588 y WO0117333 proporcionan metodos para aumentar la calidad de la fibra de algodon producida a partir de una planta de algodon mediante transformacion con un ADN que codifica sacarosa fosfato sintasa. Las cualidades de fibra incluyen resistencia, longitud, relacion de madurez de fibra, contenido de fibra inmadura, uniformidad de fibra y micronaire.
WO9508914 describe una planta productora de fibra que comprende en su genoma un constructo genetico heterologo. El constructo genetico comprende un promotor espedfico de fibra y una secuencia codificadora que codifica una peroxidasa vegetal, como una peroxidasa de algodon.
WO9626639 proporciona metodos en los que se utiliza una secuencia promotora espedfica de ovario para expresar hormonas que modifican el crecimiento vegetal en el tejido del ovulo de algodon. Los metodos permiten la modificacion de las caractensticas del conjunto de capsula en plantas de algodon y proporcionan un mecanismo para alterar las caractensticas de calidad de la fibra como dimension y resistencia de la fibra.
La Patente de E.E.U.U. N° 5.981.834, la Patente de E.E.U.U. N° 5.597.718, la Patente de E.E.U.U. N° 5.620.882, la Patente de E.E.U.U. N° 5.521.708 y la Patente de E.E.U.U. N° 5.495.070 describen todas un metodo para modificar mediante ingeniena genetica una planta productora de fibra y la identificacion de clones de cDNa utiles para identificar genes de fibra en el algodon. Los clones de cDNA son utiles en el desarrollo de clones genomicos correspondientes de plantas productoras de fibra para llevar a cabo la ingeniena genetica del algodon y otras plantas usando estos genes. Las secuencias codificadoras de estos genes aislados se usan en orientacion sentido o anti-sentido para alterar las caractensticas de fibra de plantas productoras de fibra transgenicas.
Las solicitudes de patente de E.E.U.U. 2002049999 y E.E.U.U. 2003074697 describen ambas plantas de algodon del genero Gossypium con caractensticas de fibra de algodon mejoradas. La planta de algodon tiene un casete de expresion que contiene un gen que codifica una enzima seleccionada del grupo que consiste en endoxiloglucan transferasa, catalasa y peroxidasa de modo que el gen se expresa en celulas de fibra de algodon para mejorar las caractensticas de la fibra de algodon.
WO 01/40250 proporciona metodos para mejorar la calidad de la fibra de algodon modulando la expresion genica del factor de transcripcion.
WO 96/40924 proporciona nuevos constructos de ADN que se pueden usar como sondas moleculares o insertadas alternativamente en una planta huesped para proporcionar la modificacion de la transcripcion de una secuencia de ADN de interes durante varias etapas del desarrollo de la fibra de algodon. Los constructos de ADN comprenden una region reguladora de iniciacion transcripcional de la fibra de algodon asociada con un gen, que se expresa en la fibra de algodon. Tambien se proporciona un algodon nuevo que tiene una fibra de algodon que tiene un color natural. El color se logra mediante la introduccion y expresion en la celula de fibra de algodon de un constructo genico de pigmento.
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EP0834566 proporciona un gen que controla el mecanismo de formacion de fibra en la planta de algodon y que se puede usar para la mejora industrialmente util.
Sin embargo, junto a la Sacrosa Sintasa, no hay evidencia hasta la fecha de que la expresion de cualquier gen particular juegue un papel esencial en la formacion de la fibra de algodon o caractensticas mejoradas de fibra.
Asf, sigue habiendo una necesidad para identificar otros genes asociados con caractensticas de fibra de plantas de algodon y se requiere una busqueda mas exhaustiva para los genes relacionados con la calidad.
Pero reduciendo la presente invencion a la practica, los presentes inventores idearon y emplearon un nuevo enfoque computacional que utiliza la genomica comparativa para identificar genes que juegan un papel fundamental en el desarrollo de la fibra. Como se ha demostrado en esta memoria, la expresion de dichos genes se correlaciona con la longitud de fibra y su sobre-expresion es suficiente para modificar el pelo de la semilla de tomate, un modelo reciente para fibras de algodon. Estos resultados sugieren que se pueden usar polinucleotidos para generar plantas de algodon transgenicas que se caracterizan por fibras de longitud deseada.
Compendio de la invencion
Segun un aspecto de la presente invencion se proporciona un metodo para mejorar el alargamiento de fibra de una planta productora de fibra, metodo que comprende expresar en la planta productora de fibra un polinucleotido exogeno que comprende una secuencia de acido nucleico que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el polinucleotido completo expuesto en SEQ ID NO: 19, mejorando de este modo el alargamiento de la fibra de la planta productora de fibra. Segun otro aspecto de la presente invencion se proporciona un metodo para mejorar el alargamiento de fibra de una planta productora de fibra, metodo que comprende expresar en la planta productora de fibra un polinucleotido exogeno que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 121, mejorando de este modo el alargamiento de la fibra de la planta productora de fibra.
De acuerdo con caractensticas adicionales en realizaciones preferidas, dicho polinucleotido exogeno se liga en un constructo de acido nucleico que comprende un promotor capaz de regular la expresion de dicho polinucleotido en una celula vegetal, en donde dicho promotor es heterologo a dicha celula vegetal.
De acuerdo con todavfa caractensticas adicionales en las realizaciones preferidas descritas el citado polinucleotido exogeno se expone en SEQ ID NO: 19.
De acuerdo con todavfa caractensticas adicionales en las realizaciones preferidas descritas el citado promotor se expone en SEQ ID NO: 74, 75, 85 o 91 o un equivalente funcional de los mismos.
De acuerdo con todavfa caractensticas adicionales en las realizaciones preferidas descritas el citado promotor es un promotor constitutivo.
De acuerdo con todavfa caractensticas adicionales en las realizaciones preferidas descritas el citado promotor es un promotor inducible.
De acuerdo con todavfa caractensticas adicionales en las realizaciones preferidas descritas el citado promotor es un promotor espedfico de etapa de desarrollo o un promotor espedfico de tejido.
De acuerdo con todavfa caractensticas adicionales en las realizaciones preferidas descritas la planta es una planta monocotiledonea.
De acuerdo con todavfa caractensticas adicionales en las realizaciones preferidas descritas la planta es una planta dicotiledonea.
La presente invencion resuelve con exito las deficiencias de las configuraciones conocidas actualmente proporcionando genes implicados en el desarrollo de fibra de algodon y metodos para usarlos.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en esta memoria tienen el mismo significado que comunmente entiende un experto en la tecnica a la que pertenece dicha invencion.
En caso de conflicto, mandara la solicitud de patente, incluyendo las definiciones.
Breve descripcion de los dibujos
En los dibujos:
La FIG. 1 es una ilustracion que representa la metodologfa bioinformatica de la presente invencion llevada a cabo para identificar genes que se pueden usar para mejorar el rendimiento y calidad de la fibra de algodon.
Las FIGs. 2a-d son graficos de barras que muestran los patrones de expresion de los genes espedficos de fibra (CT_11 Figura 2b), genes asociados con el alargamiento (CT_1, Figura 2c) y genes asociados con la iniciacion
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(CT_22, Figura 2d).
La FIG. 3 es un grafico que representa la expresion de CT_76 en variedades de plantas de algodon (G. hirsutum var Tamcot, Coker y Acala, y G. barbadense var Prima S5), como se determina por RT-PCR.
La FIG. 4 es una ilustracion esquematica del plasmido binario pPi.
Las FIGs. 5a-l son fotograffas de plantas de arabidopsis salvajes y transgenicas que sobre-expresan genes de la presente invencion. La Figura 5a muestra roseta de dos semanas de plantas wt; la Figura 5b muestra roseta de dos semanas de plantas de arabidopsis que sobre-expresan CT11; la Figura 5c muestra rafces de dos semanas de CT11; la Figura 5d muestra arabidopsis salvaje de tres semanas; la Figura 5e muestra CT_20 de tres semanas; la Figura 5f muestra CT-22 de tres semanas; la Figura 5g muestra rosetas de 30 dfas de wt y de CT_9; la Figura 5h muestra la influorescencia de 30 dfas de wt y de CT_9; la Figura 5i muestra rafces de dos semanas de CT9; la Figura 5j muestra rosetas de 30 dfas de wt y de CT_40; la Figura 5k muestra roseta de 5 semanas de plantas wt y que sobre-expresan CT81; la Figura 5l muestra una hoja de plantas de arabidopsis wt y que sobre-expresan CT81.
Las FIGs. 6a-e son fotograffas que representan plantas de tomate salvaje y transgenicas que sobre-expresan CT_20. La Figura 6a muestra una hoja de una planta salvaje; la Figura 6b muestra una hoja de un tomate transgenico CT_20; la Figura 6c muestra pelos de semilla de plantas de tomate WT y que sobre-expresan CT_20; la Figura 6d muestra una seccion de una semilla de tomate WT; la Figura 6e muestra una seccion de una semilla de tomate que sobre-expresa CT_20; la Figura 6f pelos de semilla de WT y de CT_82.
Las FIGs. 7a-b son fotograffas que representan plantas de tomate transgenicas que sobre-expresan GUS bajo la expresion del promotor CT_2. La Figura 7a es un corte transversal de fruto de tomate transgenico, que sobre- expresa GUS bajo el promotor CT2 en la etapa verde madura (aumento 5x). La Figura 7b similar a la Figura 7a muestra aumento 25 x;
Las FIGs. 8a-b son fotograffas que representan varios aumentos de frutos de tomate o semillas de tomate salvaje y transgenico. La Figura 8a es una semilla de tomate salvaje unica cubierta con pelos de semilla aumento 10x; la Figura 8b muestra semilla de tomate que sobre-expresa expansina bajo 35S (aumento 10x).
Descripcion detallada
La presente invencion es acerca de un metodo para mejorar el alargamiento de fibra que comprende polipeptidos y polinucleotidos que se expresan que codifican los mismos que estan implicados en el desarrollo de la fibra vegetal, como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas.
Los principios y funcionamiento de la presente invencion pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y descripciones que se acompanan.
El algodon y sub-productos del algodon proporcionan las materias primas que se usan para producir una gran cantidad de productos de consumo; ademas de textiles, el algodon se usa para producir productos alimenticios, alimentacion del ganado, fertilizantes y papel. La produccion, comercializacion, consumo y comercio de los productos a base de algodon generan un exceso de 100 mil millones de $ al ano solo en E.E.U.U., haciendo el algodon el numero uno de cultivo de valor anadido.
Durante la pasada decada la produccion de fibra de algodon ha disminuido drasticamente dando lugar a que los productores e investigadores busquen otros enfoques, que se pueden usar para mejorar el rendimiento y calidad de la fibra.
El aumento de la calidad y/o rendimiento de la fibra bajo diversas condiciones ambientales aumentara la rentabilidad de la produccion de cultivos de algodon y proporcionara un nuevo espectro de propiedades del material para la explotacion por las industrias de transformacion.
Pero reduciendo la presente invencion a la practica, los presentes inventores han configurado un nuevo enfoque informatico que utiliza la genomica comparativa para identificar los genes que desempenan un papel en el desarrollo de la fibra. Los genes identificados usando este enfoque se pueden usar con exito para generar plantas transgenicas que se caracterizan por fibras de propiedades deseadas.
De esta manera, se describe en esta memoria un metodo de identificacion de genes que estan implicados en el desarrollo de la fibra de algodon.
Tal como se usa en esta memoria el termino “algodon” se refiere a una variedad cultivada de tipo salvaje (p. ej., tffbrido) o una planta de algodon transgenico (Gossypium).
Tal como se usa en esta memoria la frase “desarrollo de la fibra” se refiere al desarrollo del pelo de la semilla de algodon.
Tal como se usa en esta memoria el termino “desarrollo” cuando se usa en el contexto de fibras de algodon se
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refiere a la iniciacion de la fibra y/o alargamiento de la misma, as^ como al engrosamiento y maduracion de la pared celular secundaria de la fibra.
El metodo se efectua mediante:
(a) proporcionar secuencias de acido nucleico expresadas derivadas de fibras de algodon;
(b) proporcionar secuencias de acido nucleico expresadas derivadas de un tejido de ovulo (es decir, un tejido desarrollado a partir de un ovario de una planta de semilla. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, carpelos, cubierta de semilla, embrion, endosperma);
(c) ensamblar informaticamente las secuencias de acido nucleico expresadas de (a) y (b) para generar agrupamientos; y
(d) identificar agrupamientos de tales agrupamientos que comprenden secuencias de acido nucleico expresadas de (a) y (b), identificando de este modo genes que estan implicados en el desarrollo de la fibra de algodon.
Secuencias de acido nucleico expresadas usadas como una fuente potencial para identificar genes implicados en el desarrollo de la fibra de algodon segun este aspecto de la presente invencion son preferiblemente bibliotecas de ARN mensajero expresados [es decir, etiquetas de secuencias expresadas (EST), clones de cDNA, contigs, pre- mRNA, etc.] obtenidos a partir de preparaciones de tejido o de lmea celular que pueden incluir secuencia genomica o de cDNA.
Se pueden recuperar secuencias de acido nucleico expresadas a partir de bases de datos pre-existentes disponibles publicamente (vease Ejemplo 1 de la seccion de Ejemplos que sigue) o de bases de datos privadas.
Alternativamente, las secuencias de acido nucleico expresadas utilizadas se pueden generar a partir de bibliotecas de secuencias (p. ej., bibliotecas de cDNA, bibliotecas de EST, bibliotecas de mRNA y otras).
Las bibliotecas de cDNA son fuentes adecuadas de informacion de secuencia expresada.
En tal caso generar una base de datos de secuencia se efectua tfpicamente mediante preparacion de la muestra de tejido o celular, aislamiento de ARN, construccion de biblioteca de cDNA y secuenciacion.
Se apreciara que tales bibliotecas de cDNA se puedan construir a partir de ARN aislado de la planta completa, tejidos espedficos, o poblaciones celulares.
Una vez que se obtienen los datos de secuencia expresada tanto de de fibras algodon como de tejido de ovulo, se pueden agrupar las secuencias para formar contigs. Vease el Ejemplo 1 de la seccion de Ejemplos que sigue.
Tales contigs se ensamblan entonces para identificar secuencias homologas (de fibras de algodon y tejido de ovulo) presentes en el mismo agrupamiento, se considera que tales contigs estan implicados en el desrrollo de la fibra de algodon.
Estan disponibles comercialmente un numero de ensambladores de lectura de fragmentos de software informatico comunmente usados capaces de formar agrupamientos de secuencias expresadas. Estos paquetes incluyen pero no se limitan a, El Ensamblador TIGR [Sutton G. et al. (1995) Genome Science and Technology 1: 9-19], GAP [Bonfield JK. et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 4992-4999], CAP2 [Huang X. et al. (1996) Genomics 33: 21-31], The Genome Construction Manager [Lawrence CB. Et al. (1994) Genomics 23: 192-201], Bio Image Sequence Assembly Manager, SeqMan [Swindell SR. y Plasterer JN. (1997) Methods Mol. Biol. 70: 75-89], LEADS y GenCarta (Compugen Ltd. Israel).
Una vez que se identifican los genes que estan implicados en el desarrollo de la fibra de algodon se puede analizar su patron de expresion como se descrbe en el Ejemplo 2 de la seccion de Ejemplos que sigue, para identificar de este modo genes que estan expresados diferencialmente en la fibra de algodon (es decir, expresion espedfica) o durante el desarrollo de la fibra de algodon (es decir, cambio en la expresion durante el desarrollo de la fibra de algodon).
Son bien conocidos en la tecnica metodos para identificar genes expresados diferencialmente.
Usando la metodologfa anterior, los presentes inventores fueron capaces de identificar genes que estan implicados en el desarrollo de la fibra de algodon.
Como se ilustra en la seccion de Ejemplos que sigue se pueden clasificar los genes identificados usando las ensenanzas de la presente invencion en 6 categonas funcionales segun su homologfa de secuencia con protemas y enzimas conocidas (Tabla 3, a continuacion). Dos genes se clasificaron en una categona de compromiso de destino celular: homologo al factor de transcripcion MYB y a GL3 que se sabe que estan implicados en el desarrollo del tricoma en arabidopsis. Los patrones de expresion de ambos genes y el fenotipo del transgen CT20 ambos en
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plantas de arabidopsis y tomate T1 apoyan su implicacion principalmente en la fase de iniciacion. Los otros dos genes (Tabla 3, mas arriba) son factores de transcripcion de las familias MYB y MADS BOX. Muchos estudios demostraron la funcion de estas dos familias de factores de transcripcion como genes homeotios con papel clave en diferentes procesos de desarrollo, entre ellos esta la morfogenesis de tricomas y de la fibra (Suo. J. et. al. 2003, Ferrario S et. al. 2004). Su papel en las primeras etapas de desarrollo de la fibra se apoya tambien por sus patrones de expresion de ARN, que se inducen antes, y durante el dfa de antesis. Un gen pertenece a las rutas del metabolismo del almidon y de la sacarosa. Un trabajo reciente demuestra que otro gen (SUS), que pertenece a esta ruta, es un factor limitante tanto en la iniciacion de la fibra como en el desarrollo. Otro gen (Tabla 3, mas adelante) se clasifica como transporte de lfpidos cuya expresion de ARN se induce altamente durante la etapa temprana de alargamiento de la fibra se ajusta al hecho de que los lfpidos son componentes clave en la formacion de la fibra. Varios genes (Tabla 3, mas adelante) se clasificaron ya sea como genes implicados en desecacion, respuesta a la salinidad estimulada por acido absdsico y genes implicados en la transferencia de electrones. De ellos 3 genes se seleccionaron por patron de expresion de ARN que se indudan en la etapa de alargamiento.
En vista de lo anterior y junto con los resultados experimentales que correlacionan la expresion genica con la longitud de la fibra, se sugiere que los genes de la presente descripcion se pueden usar para generar plantas productoras de fibra con calidad de fibra comercialmente deseada.
Por lo tanto, se describen tambien en esta memoria polininucleotidos identificados usando la anterior metodologfa descrita y sus polipeptidos codificados asf como equivalentes funcionales de los polipeptidos identificados en la presente memoria (es decir, polipeptidos que son capaces de regular el desarrollo de la fibra de algodon, como se puede determinar segun los ensayos descritos en la seccion de Ejemplos que sigue) y sus secuencias codificadoras. Tales equivalentes funcionales pueden ser al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos
aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos
aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos
aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos
aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 75%, al menos
aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 75%, se dice 100% homologos a la SEQ ID NO: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 95 o 96.
Polinucleotidos que codifican equivalentes funcionales pueden ser al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos
aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos
aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos
aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos
aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos
aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 75%, al menos
aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 75%, se dice 100% identicos a la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o 27.
La homologfa (p. ej., porcentaje de homologfa) se puede determinar usando cualquier software de comparacion de homologfa, incluyendo por ejemplo, el software BlastP del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica (NCBI) como usando los parametros por defecto.
La identidad (p. ej., porcentaje de homologfa) se puede determinar usando cualquier software de comparacion de homologfa, incluyendo por ejemplo, el software BlastN del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica (NCBI) como usando los parametros por defecto.
Como se usa en esta memoria la frase “un polinucleotido aislado” se refiere a unas secuencias de acido nucleico de cadena sencilla o doble que se afslan o proporcionan en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleotido complementaria (cDNA), una secuencia de polinucleotido genomica y/o unas secuencias de polinucleotido compuestas (p. ej., una combinacion de las anteriores).
Como se usa en esta memoria la frase “secuencia de polinucleotido complementaria” se refiere a una secuencia, que resulta de la transcripcion inversa de un ARN mensajero usando una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. Tal secuencia se puede amplificar posteriormente in vivo o in vitro usando una ADN polimerasa dependiente de ADN.
Como se usa en esta memoria la frase “secuencia de polinucleotido genomica” se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y por lo tanto representa una porcion contigua de un cromosoma.
Como se usa en esta memoria la frase “secuencia de polinucleotido compuesta” se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genomica. Una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exonicas requeridas para codificar el polipeptido, asf como algunas secuencias intronicas interpuestas entre las mismas. Las secuencias intronicas pueden ser de cualquier fuente, incluyendo de otros genes,
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y tipicamente incluiran secuencias senal de empalme conservadas. Tales secuencias intronicas pueden incluir ademas elementos reguladores de expresion que actuan en cis.
Segun un aspecto preferido de la presente descripcion, la secuencia de acido nucleico es tal como se expone en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 23, 24, 25 o 26.
Segun otro aspecto preferido de la presente descripcion, la secuencia del polinucleotido aislado es tal como se expone en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 27.
Segun con aun otro aspecto preferido de la presente descripcion, el polipeptido es tal como se expone en la SEQ ID NO: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 95 o 96.
Segun con todavfa otro aspecto preferido de la presente descripcion, la secuencia de aminoacidos es tal como se expone en la SEQ ID NO: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 95 o 96.
Los polinucleotidos aislados tambien se pueden calificar usando un ensayo de hibridacion incubando los polinucleotidos aislados descritos anteriormente en presencia de sonda o cebador de oligonucleotido en condiciones de hibridacion de moderadas a astringentes.
Las condiciones de hibridacion de moderadas a astringentes se caracterizan por una solucion de hibridacion como que contiene dextran sulfato al 10%, NaCl 1M, SDS al 1% y sonda marcada con 32P a 5x106 cpm, a 65°C, con una solucion de lavado final de SSC 0,2x y SDS al 0,1% y lavado final a 65°C y sin embargo la hibridacion moderada se efectua usando una solucion de hibridacion que contiene dextran sulfato al 10%, NaCl 1M, SDS al 1% y sonda marcada con 32P a 5x106 cpm, a 65°C, con una solucion de lavado final de SSC 1x y SDS al 0,1% y lavado final a 50°C.
Por lo tanto, la presente descripcion incluye secuencias de acido nucleico descritas anteriormente en esta memoria; fragmentos de las mismas, secuencias hibridables con las mismas, secuencias homolgas a las mismas, secuencias que codifican polipeptidos similares con diferente uso de codones, secuencias alteradas caracterizadas por mutaciones, como supresion, insercion o sustitucion de uno o mas nucleotidos, ya sean de origen natural o inducidos por el hombre, ya sea aleatoriamente o de un modo dirigido.
Dado que las secuencias de polinucleotidos de la presente descripcion codifican peptidos no identificados previamente, la presente descripcion tambien incluye nuevos polipeptidos o porciones de los mismos, que estan codificados por los polinucleotidos aislados y los fragmentos de acido nucleico respectivos de los mismos descritos anteriormente en esta memoria.
Por lo tanto, la presente descripcion tambien incluye polipeptidos codificados por las secuencias de polinucleotidos de la presente descripcion. Las secuencias de aminoacidos de estos nuevos polipeptidos estan expuestas en SEQ ID NO: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 o 96.
La presente descripcion tambien incluye homologos de estos polipeptidos, tales homologos pueden ser al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos
aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos
aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos
aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos
aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos
aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos
aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos
aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o mejor dicho 100% homologos a la SEQ ID NO: 26, 106, 107, 109, 110, 112, 114, 115, 118, 119, 122, 123, 124, 126, 95 o 96.
La presente descripcion tambien incluye fragmentos de los polipeptidos descritos anteriormente y polipeptidos que tienen mutaciones, como supresiones, inserciones o sustituciones de uno o mas aminoacidos, ya sean de origen natural o inducidos por el hombre, ya sea aleatoriamente o de un modo dirigido.
La capacidad de los polinucleotidos de la presente descripcion y sus productos para regular el desarrollo de la fibra de algodon se puede determinar directamente o al menos un parametro estructural de una fibra de algodon como longitud de la fibra o finura de la fibra, o velocidad de crecimiento de la fibra (descrito mas adelante en esta memoria). Sin embargo, el desarrollo de la fibra de algodon se puede tambien determinar indirectamente como mediante sistemas modelo de plantas para el desarrollo de la fibra de algodon. Por ejemplo, esta bien establecido que las celulas de tricoma y pelos radiculares comparten caractensticas comunes con las celulas de fibra de algodon, y como tales se pueden usar como modelo para el desarrollo de la fibra de algodon [Revisado en Wagner G.J. et al. (2004)], como se demuestra en los detalles en el Ejemplo 12 de la seccion de Ejemplos que sigue.
Analizando los perfiles de expresion, los presentes inventores fueron capaces de determinar la implicacion de las
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secuencias biomoleculares (es dedr, polinucleotidos y polipeptidos) de la presente descripcion en la iniciacion y/o alargamiento de la fibra. Estos resultados se fundamentaron ademas estableciendo una correlacion entre la expresion genica y la longitud de fibra (vease Ejemplo 7).
Estos resultados sugieren que las secuencias biomoleculares de la presente descripcion (p. ej., polinucleotidos, polipeptidos, promotores, oligonucleotidos, anticuerpos, referidos tambien en esta memoria como agentes) se pueden usar para mejorar la calidad y/o el rendimiento de fibra de una planta productora de fibra.
Por lo tanto, segun con un aspecto de la presente invencion se proporciona un metodo para mejorar la calidad y/o rendimiento de fibra de una planta productora de fibra, como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas.
El metodo de este aspecto de la presente invencion se efectua regulando un nivel de expresion o actividad de al menos un polinucleotido o polipeptido de la presente descripcion (descrito anteriormente en esta memoria) en la planta productora de fibra como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas, mejorando asf la calidad y/o rendimiento de la planta productora de fibra.
Como se usa aqu la frase “planta productora de fibra” se refiere a plantas que comparten la caractenstica comun de tener una forma alargada y abundante celulosa en paredes celulares gruesas, tipicamente denominadas como paredes secundarias. Tales paredes pueden o no estar lignificadas, y el proptoplasto de tales celulas puede o no ser viable en madurez. Tales fibras tienen muchos usos industriales, por ejemplo, en madera y productos fabricados de madera, papel, textiles, material de embalaje y de empaquetado, cordelena, cepillos y escobas, llenado y relleno, sellado, refuerzo de otros materiales, y fabricacion de derivados de celulosa.
Segun un aspecto preferido de la presente descripcion, la planta productora de fibra es algodon.
El termino “fibra” es que incluye normalmente desde celulas conductoras de pared gruesa como vasos y traqueidas a agregados fibrilares de muchas celulas de fibra individuales. Por lo tanto, el termino “fibra” se refiere a (a) celulas conductoras y no conductoras de pared gruesa del xilema; (b) fibras de origen extraxilar, que incluyen las del floema, corteza, tejido de tierra, y epidermis; y (c) fibras de tallos, hojas, rafces, semillas, y flores o inflorescencias (como las de Sorghum vulgare usadas en la fabricacion de cepillos y escobas).
Ejemplos de plantas productoras de fibra incluyen, pero no se limitan a, cultivos agncolas como algodon, arbol de algodon de seda (Kapok, Ceiba petandra), sauce del desierto, arbusto de creosota, grasa de invierno, arbol de balsa, kenaf, roselle, yute, sisal de abaca, lino, mafz, cana de azucar, canamo, ramio, kapok, fibra de coco, bambu, musgo espanol y Agave spp. (p. ej. sisal).
Como se usa en esta memoria la frase “calidad de la fibra” se refiere a al menos un parametro de fibra que agncolamente se desea, o se requiere en la industria de la fibra (descrito mas adelante en esta memoria). Ejemplos de tales parametros, incluyen pero no se limitan a, longitud de fibra, resistencia de fibra, adecuacion de la fibra, peso de la fibra por unidad de longitud, relacion de madurez y uniformidad (descrito ademas mas adelante en esta memoria).
La calidad de la fibra (hebra) de algodon se mide tipicamente de acuerdo con la longitud de la fibra, resistencia y finura. Por consiguiente, la calidad de hebra se considera mayor cuando la fibra es mas larga, mas fuerte y mas fina.
Como se usa en esta memoria la frase “rendimiento de fibra” se refiere a la cantidad y cantidad de fibras producidas a partir de la planta productora de fibra.
Como se usa en esta memoria el termino “mejora” se refiere a al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, de cambio en la calidad/rendimiento de fibra en comparacion con la planta nativa (es decir, no modificada con las secuencias biomoleculares de la presente descripcion).
Como se usa en esta memoria el termino “regulacion” se refiere a regular a la alza, regular a la baja o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, cuando se desea un aumento en numero de fibra, se puede efectuar la presente invencion sobre-regulando al menos un polinucleotido de la presente descripcion, que esta implicado en la iniciacion de la fibra (p. ej., SEQ ID NOs: 4, 10, 9, 12, 16 y 25). Alternativamente, cuando se desean fibras cortas como por ejemplo, en el mafz, entonces se efectua la presente invencion regulando a la baja al menos un polinucleotido de la presente descripcion que esta implicado en el alargamiento de fibra (p. ej., SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 y 27). Alternativamente, se puede efectuar la presente invencion sobre- regulando la expresion de al menos un polinucleotido (como uno implicado en el alargamiento de fibra) y regulando a la baja al menos un polinucleotido (como uno implicado en la iniciacion de fibra) de los polinucleotidos de la presente descripcion. De esta forma es factible obtener una planta productora de fibra con rendimiento de fibra mejorado de cada una de longitud corta.
Sobre-regular un nivel de expresion de al menos uno de los polinucleotidos de la presente descripcion se puede efectuar a nivel genomico (p. ej., activacion de la transcripcion por medio de promotores, potenciadores, y otros
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elementos reguladores), a nivel de la transcripcion, o a nivel de la protema.
A continuacion se presenta una lista no exhaustiva de agentes capaces de sobre-regular el nivel de expresion y/o actividad de las secuencias biomoleculares (es decir, secuencias de acido nucleico o de protema) de la presente descripcion.
Un agente capaz de sobre-regular la expresion de un polinucleotido de interes puede ser una secuencia de polinucleotido exogena disenada y construida para expresar al menos una porcion funcional del mismo (p. ej., mejora de la calidad/rendimiento de fibra, aumento de la biomasa, etc.). Por consiguiente, la secuencia de polinucleotido exogena puede ser una secuencia de ADN o ARN que codifica una molecula de polipeptido, capaz de mejorar el rendimiento o cantidad de fibra. Alternativamente, el polinucleotido exogeno puede ser una region reguladora que actua en cis (p. ej., SEQ ID NO: 74, 75, 85, 88 o 91) que se puede introducir dentro de la planta para aumentar la expresion de cualquier polinucleotido que esta implicado en el desarrollo de la fibra (p. ej., sacarosa fosfato sintasa, como se describe en la Pat. de E.E.U.U. N° 6.472.588).
Para expresar polinucleotidos exogenos en celulas vegetales, se liga preferiblemente una secuencia de polinucleotido en un constructo de acido nucleico adecuado para expresion en celula vegetal. Tal constructo de acido nucleico incluye una region reguladora que actua en cis como una secuencia promotora para dirigir la transcripcion de la secuencia de polinucleotido en la celula de una manera constitutiva o inducible. El promotor puede ser homologo o heterologo a la planta/celula transformada.
Secuencias promotoras preferidas que se pueden usar de acuerdo con este aspecto de la presente invencion son promotores de celula endotelial.
Por ejemplo, se pueden usar preferiblemente secuencias promotoras de cada una de las secuencias de polinucleotidos descritas en esta memoria en los constructos de acido nucleico descritos en esta memoria.
Segun una realizacion preferida de este aspecto de la presente invencion el promotor es al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos
aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos
aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos
aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos
aproximadamente 99%, o 100% identico a la SEQ ID NO. 85 o 91, que es capaz de regular la expresion de al menos una secuencia de polinucleotido ligada operativamente a la misma en una celula endotelial ovulo (es decir, capaz de ejercer un efecto regulador sobre la secuencia codificadora ligada a la misma).
Como se ilustra claramente en la seccion de Ejemplos que sigue, tales secuencias promotoras son capaces de regular la expresion de una secuencia de acido nucleico codificadora (p. ej., GUS) ligada operativamente a la misma.
Otros ejemplos de promotores de aumento de fibra de algodon incluyen los genes expresados E6 de fibra de algodon (John et al., Plant Mol. Biol., 30: 297-306 (1996) y John et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 12768-12773
(1996) e), H6 (John et al., Plant Physiol., 108: 669-676, (1995)), FbL2A (Rinehart et al., Plant Physiol., 112: 13311341 (1996) y John et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12768-12773 (1996)), rac (Delmer et al., Mol. Gen. Genet., 248: 43-51 (1995)); CelA (Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12637-12642 (1996)); CAP (Kawai et al., Plant Cell Physiol. 39: 1380-1383 (1998)); ACP (Song et al., Biochim. Biophys. Acta 1351: 305-312 (1997); y LTP (Ma et al., Biochim. Biophys. Acta 1344: 111-114 (1997)). Se describen otros promotores espedficos de fibra de algodon en la Pat. de E.E.U.U. N° 5.495.070.
Otros promotores que se pueden usar de acuerdo con este aspecto de la presente invencion son aquellos que aseguran la expresion solo en organos espedficos, como la hoja, rafz, tuberculo, semilla, tallo, flor o tipos de celulas espedficas como celulas de parenquima, epidermicas, de tricoma o vasculares.
Promotores preferidos para potenciar la expresion en celulas de tricoma se describen en WO 2004/111183, a Evogene Ltd.
Los promotores preferidos que potencian la expresion en tejido vascular incluyen el promotor CAD 2 (Samaj et al., Planta, 204: 437-443 (1998)), el promotor Pt4C11 (Hu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5407-5412 (1998)), el promotor C4H (Meyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6619-6623 (1998)), los promotores PtX3H6 y PtX14A9 (Loopstra et al., Plant Mol. Biol., 27: 277-291 (1995)), el promotor RolC (Graham, Plant Mol. Biol., 33: 729-735
(1997) ), el promotor Hvhsp17 (Raho et al., J. Expt. Bot., 47: 1587-1594 (1996)), y el promotor COMT (Capellades et al., Plant Mol. Biol., 31: 307-322 (1996)).
Los promotores preferidos que mejoran la expresion en tejido del tallo incluyen los promotores de medula (Datta, Theor. Appl. Genet., 97: 20-30 (1998) y Ohta et al., Mol. Gen. Genet., 225: 369-378 (1991)), y el promotor de la peroxidasa anionica (Klotz et al., Plant Mol. Biol., 36: 509-520 (1998)). Los promotores preferidos que mejoran la expresion en el floema, corteza y corcho, pero no en el xilema o la medula, incluyen el promotor Psam-1
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(Mijnsbrugge et al., Plant and Cell Physiol., 37: 1108-1115 (1996)).
Los promotores preferidos que mejoran la expresion en semillas incluyen el promotor phas (Geest et al., Plant Mol. Biol. 32: 579-588 (1996)); el promotor GluB-1 (Takaiwa et al., Plant Mol. Biol. 30: 1207-1221 (1996)); el promotor gamma-zema (Torrent et al., Plant Mol. Biol. 34: 139-149 (1997)), y el promotor oleosina (Sarmiento et al., The Plant Journal 11: 783-796 (1997)).
Se describen otras secuencias promotoras que median la expresion constitutiva, inducible, espedfica de tejido o espedfica de etapa de desarrollo en WO 2004/081173 a Evogene Ltd.
Se pueden usar promotores truncados o sinteticos incluyendo regiones de nucleotidos espedficas que confieren una expresion mejorada en tejido, como se ejemplifica por la identificacion de elementos reguladores dentro de los promotores mas grandes que confieren una expresion aumentada en el xilema (Seguin et al., Plant Mol. Biol., 35: 281-291 (1997); Torres-Schumann et al., The Plant Journal, 9: 283-296 (1996); y Leyva et al., The Plant Cell, 4: 263271 (1992)).
El constructo de acido nucleico puede ser, por ejemplo, un plasmido, un bacmido, un fagemido, un cosmido, un fago, un virus o un cromosoma artificial. Preferiblemente, el constructo de acido nucleico de la presente invencion es un vector de plasmido, mas preferiblemente un vector binario.
La frase “vector binario” se refiere a un vector de expresion que lleva una region T modificada de un plasmido Ti, capaz de multiplicarse tanto en celulas E. Coli como en Agrobacterium, y que normalmente comprende el(los) gen(es) marcador(es) para la transformacion en planta entre las dos regiones huesped. Un vector binario adecuado para la presente invencion incluye pBI2113, pBI121, pGA482, pGAH, pBIG, pBI101 (Clonetech), pPI (vease Ejemplo 5 de la seccion de Ejemplos que sigue) o modificaciones de los mismos.
El constructo de acido nucleico se puede utilizar para transformar una celula huesped (p. ej., bacteria, vegetal) o planta.
Como se usa en esta memoria, los terminos “transgenico” o “transformado” se usan indistintamente en referencia a una celula o una planta en la que se ha transferido material genetico clonado.
En la transformacion estable, la molecula de acido nucleico se integra dentro del genoma de la planta, y como tal representa una caractenstica estable y heredado. En la transformacion transitoria, la molecula de acido nucleico es expresada por la celula transformada pero no se integra dentro del genoma, y como tal representa una caractenstica transitoria.
Existen varios metodos de introduccion de genes extranos dentro de plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas (Potrykus, I. (1991). Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42, 205-225; Shimamoto, K. et al. (1989). Plantas fertiles de arroz transgenico regeneradas de protoplastos transformados. Nature (1989) 338, 274-276).
Los principales metodos de integracion estable de ADN exogeno dentro del ADN genomico vegetal incluyen dos abordajes principales:
(i) Transferencia genica mediada por Agobacterium. Vease: Klee, H. J. et al. (1987). Annu Rev Plant Physiol 38, 467486; Klee, H. J. y Rogers, S. G. (1989). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, pg. 2-25, J. Schell y L. K. Vasil, eds., Academic Publishers, San Diego, Cal.; y Gatenby, A. A. (1989). Regulation and Expresion of Plant Genes in Microorganisms, pg. 93-112, Plant Biotechnology, S. Kung y C. J. Arntzen, eds., Butterworth Publishers, Boston, Mass.
(ii) Captacion directa de ADN. Vease, p. ej.: Paszkowski, J. et al. (1989). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, pg. 52-68, J. Schell y L. K. Vasil, eds., Academic Publishers, San Diego, Cal.; y Toriyama, K. et al. (1988). Bio/Technol 6, 1072-1074 (metodos de captacion directa de ADN dentro de protoplastos). Vease tambien: Zhang et al. (1988). Plant Cell Rep 7, 379-384; y Fromm, M. E. et al. (1986). Transformacion estable de mafz despues de transferencia genica por electroporacion. Nature 319, 791-793 (captacion de ADN inducida por choque electrico de celulas vegetales). Vease tambien: Klein et al. (1988). Bio/Technol 6, 559-563; McCabe, D. E. et al. (1988). Transformacion estable de soja (Glycine max) por aceleracion de partfcula. Bio/Technology 6, 923-926; y Sandford, J. C. (1990). Biolistic plant transformation. Physiol Plant 79, 206-209 (Inyeccion de ADN dentro de celulas o tejidos vegetales por bombardeo de partfcula). Vease tambien: Neuhaus, J. M. et al. (1987). Theor Appl Genet 75, 30-36; y Neuhaus, J. M. y Spangenberg, G. C. (1990). Physiol Plant 79, 213-217 (uso de sistemas de micropipetas). Vease Pat. de E.E.U.U. N° 5.464.765 (transformacion en bigotes de fibras de vidrio o de carburo de silicio de cultivos celulares, embriones o tejido calloso). Vease tambien: DeWet, J. M. J. et al. (1985). “Transferencia genica exogena en mafz (Zea mays) usando polen tratado con ADN”, Experimental Manipulation of Ovule Tissue, G. P. Chapman et al., eds., Longman, New York-London, pg. 197-209; y Otha, Y. (1986). Transformacion Genetica de Alto Rendimiento de Mafz por una Mezcla de Polen y ADN Exogeno. Proc Natl Acad Sci USA 83, 715-719 (incubacion directa de ADN con polen en germinacion).
El sistema mediado por Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmfdicos que contienen segmentos de ADN
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definidos que se integran dentro del ADN genomico vegetal. Los metodos de inoculacion del tejido vegetal vanan dependiendo de la especie vegetal y del sistema de suministro del Agrobacterium. Un enfoque ampliamente usado es el procedimiento de hoja-disco, que se puede realizar con cualquier explante de tejido que proporcione una buena fuente para la iniciacion de la diferenciacion de la planta completa (Horsch, R. B. et al. (1988). “Transformacion hoja disco.” Plant Molecular Biology Manual A5, 1-9, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht). Un abordaje complementario emplea el sistema de suministro de Agrobacterium en combinacion con infiltracion a vado. El sistema de Agrobacterium es especialmente util en la creacion de plantas dicotiledoneas transgenicas.
Existen varios metodos de transferencia directa de ADN dentro de celulas vegetales. En la electroporacion, los proptoplastos se exponen brevemente a un fuerte campo magnetico, abriendose mini-poros para permitir que entre el AdN. En la microinyeccion, se inyecta mecanicamente el ADN directamente dentro de las celulas usando micropipetas. En el bombardeo de micropartfculas, el ADN se adsorbe sobre microproyectiles como cristales de sulfato de magnesio o partfculas de tungsteno, y se aceleran ffsicamente los microproyectiles dentro de las celulas o tejidos vegetales.
Despues de la transformacion estable, se produce la propagacion de la planta. El metodo mas comun de propagacion es por semilla. Sin embargo, la desventaja de la regeneracion por propagacion de semilla es la falta de uniformidad en el cultivo debido a la heterozigosidad, ya que las semillas son producidas por plantas segun las varianzas geneticas regidas por las reglas de Mendel. En otras palabras, cada semilla es geneticamente diferente y cada una crecera con sus propias caractensticas espedficas. Por lo tanto, se prefiere que la regeneracion se efectue de tal manera que la planta regenerada tiene rasgos y caractensticas identicos a las de la planta transgenica parental. El metodo preferido de regeneracion de una planta transformada es por micropropagacion, que proporciona una reproduccion rapida, consistente de las plantas transformadas.
La micropropagacion es un proceso de cultivo de plantas de segunda generacion a partir de una unica muestra de tejido extirpada de una planta parental o cultivar seleccionado. Este proceso permite la reproduccion en masa de plantas que tienen el tejido preferido y que expresan una protema de fusion. Las plantas recien generadas son geneticamente identicas a, y tienen todas las caractensticas de la planta original. La micropropagacion permite la produccion en masa del material vegetal de calidad en un corto periodo de tiempo y ofrece una rapida multiplicacion de cultivares seleccionados con la conservacion de las caractensticas de la planta transformada transgenica o transformada original. Las ventajas de este metodo de clonacion de plantas incluyen la velocidad de multiplicacion vegetal y la calidad y uniformidad de las plantas producidas.
La micropropagacion es un proceso de multiples etapas que requiere la alteracion de las condiciones del medio de cultivo o de crecimiento entre las etapas. El proceso de micropropagacion implica cuatro etapas basicas: etapa uno, cultivo inicial del tejido; etapa dos, multiplicacion del cultivo de tejido; etapa tres, diferenciacion y formacion de la planta; y etapa cuatro, cultivo en invernadero y consolidacion. Durante la etapa uno, se establece el cultivo de tejido y se certifica que esta libre de contaminantes. Durante la etapa dos, el cultivo de tejido inicial se multiplica hasta que se produce un numero suficiente de muestras de tejido para alcanzar los objetivos de produccion. Durante la etapa tres, las muestras de tejido recien crecidas se dividen y se crecen en plantulas individuales. En la etapa cuatro, las plantulas transformadas se transfieren a un invernadero para la consolidacion en donde la tolerancia de las plantas a la luz se aumenta gradualmente de manera que puedan seguir creciendo en el entorno natural.
Aunque actualmente se prefiere la transformacion estable, tambien se preve la transformacion transitoria de, por ejemplo, celulas de hojas, celulas meristematicas, o la planta completa.
Se puede efectuar la transformacion transitoria por cualquiera de los metodos de transferencia directa de ADN descritos anteriormente o por infeccion viral usando virus de plantas modificados.
Los virus que se han demostrado utiles para la transformacion de plantas huesped incluyen virus mosaico de la coliflor (CaMV), virus mosaico del tabaco (TMV), y baculovirus (BV). La transformacion de plantas usando virus de plantas se describe en, por ejemplo: Pat. de E.E.U.U. N° 4.855.237 (virus mosaico dorado de judfa, BGMV); EPA 67.553 (TMV); Solicitud Publicada Japonesa N° 63-14693 (TMV); EPA 194.809 (BV); EPA 278.667 (BV); y Gluzman, Y. et al. (1988). Comunicaciones en Biologfa Molecular: Vectores Virales, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pg. 172-189. El uso de partfculas de pseudovirus en la expresion de ADN extrano en muchos huespedes, que incluyen plantas, se describe en WO 87/06261.
La construccion de virus de ARN de plantas para la introduccion y expresion de secuencias de acido nucleico exogenas no virales en plantas se demuestra en las referencias anteriores asf como en: Dawson, W. O. et al. (1989). Un virus hfbrido mosaico del tabaco expresa y pierde un gen anadido. Virology 172, 285-292; French, R. et al. (1986) Science 231, 1294-1297; y Takamatsu, N. et al. (1990). Produccion de encefalina en protoplastos de tabaco usando un vector ARN de virus mosaico del tabaco. FEBS Lett 269, 73-76.
Si el virus transformante es un virus de ADN, un experto en la tecnica puede hacer modificaciones adecuadas al propio virus. Alternativamente, el virus se puede clonar primero dentro de un plasmido bacteriano para facilitar la construccion del vector viral deseado con el ADN extrano. El virus puede ser escindido entonces del plasmido. Si el virus es un virus de ADN, se puede anclar al ADN viral un origen de replicacion bacteriano, que a continuacion se
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replica por la bacteria. La transcripcion y la traduccion del ADN producira la protema de cubierta, que encapsulara el aDn viral. Si el virus es un virus de aRn, normalmente el virus se clona como un cDNA y se inserta dentro de un plasmido. El plasmido se usa entonces para hacer todos los constructos geneticos de plantas. El virus de ARN se transcribe a continuacion a partir de la secuencia viral del plasmido, seguido de traduccion de los genes virales para producir las protemas de cubierta que encapsulan el ARN viral.
La construccion de virus de ARN de plantas para la introduccion y expresion en plantas de secuencias de acido nucleico exogenas no virales, como los incluidos en el constructo de la presente descripcion, se desmuestra tambien en las referencias anteriores asf como en la Pat. de E.E.U.U. N° 5.316.931.
En un aspecto de la descripcion, se proporciona para la insercion un acido nucleico viral vegetal, que comprende una supresion de la secuencia codificadora de la protema de cubierta nativa del acido nucleico viral, una secuencia codificadora de la protema de cubierta viral vegetal no nativa (extrana), y un promotor no nativo, preferiblemente el promotor subgenomico de la secuencia codificadora de la protema de cubierta no nativa, y capaz de la expresion en la planta huesped, empaquetamiento del acido nucleico viral vegetal recombinante, y que asegura una infeccion sistemica del huesped por el acido nucleico viral vegetal recombinante. Alternativamente, la secuencia codificadora de la protema de cubierta nativa se puede hacer no transcribible por insercion de la secuencia de acido nucleico no nativa dentro de ella, de tal manera que se produce una protema no nativa. El constructo de acido nucleico viral de la planta recombinante puede contener uno o mas promotores subgenomicos no nativos adicionales. Cada promotor subgenomico no nativo es capaz de transcribir o expresar genes o secuencias de acido nucleico adyacentes en la planta huesped e incapaz de recombinacion entre sf y con promotores subgenomicos nativos. Ademas, el constructo de acido nucleico viral de la planta recombinante puede contener uno o mas elementos reguladores que actuan en cis, como potenciadores, que se unen a un regulador que actua en trans y que regula la transcripcion de una secuencia codificadora situada corriente debajo de la misma. Las secuencias de acido nucleico no nativas se pueden insertar adyacentes al promotor subgenomico viral de la planta nativo o a los promotores subgenomicos virales de la planta no nativos si se incluye mas de una secuencia de acido nucelico. Las seciencias de acido nucleico no nativas se transcriben o expresan en la planta huesped bajo el control de el(los) promotor(es) subgenomico(s) para producir los productos deseados.
En un segundo aspecto, se proporciona un constructo de acido nucleico viral de planta recombinante como en el primer aspecto excepto que la secuencia codificadora de la protema de cubierta nativa se localiza adyacente a uno de los promotores subgenomicos de la protema de cubierta no nativa en lugar de a la secuencia codificadora de la protema de cubierta no nativa.
En un tercer aspecto, se proporciona un constructo de acido nucleico viral de planta recombinante que comprende un gen de protema de cubierta nativa situado adyacente a su promotor subgenomico y a uno o mas promotores subgenomicos no nativos insertados dentro del constructo de acido nucleico viral. Los promotores subgenomicos no nativos insertados son capaces de transcribir o expresar genes adyacentes en una planta huesped y son incapaces de recombinacion entre sf y con promotores subgenomicos nativos. Se pueden insertar secuencias de acido nucleico no nativas adyacentes a promotores virales vegetales subgenomicos no nativos de tal forma que dichas secuencias se transcriben o expresan en la planta huesped bajo el control de los promotores subgenomicos para producir el producto deseado.
En un cuarto aspecto, se proporciona un constructo de acido nucleico viral de planta recombinante como en el tercer aspecto excepto que la secuencia que codifica la protema de cubierta nativa se reemplaza por una secuencia codificadora de la protema de cubierta no nativa.
Los vectores virales se encapsulan por protemas de cubierta expresadas codificadas por constructos de acido nucleico viral de planta recombinante como se describe anteriormente en esta memoria, para producir un virus de planta recombinante. El constructo de acido nucleico viral de planta recombinante o el virus de planta recombinante se usa para infectar plantas huesped apropiadas. El constructo de acido nucleico viral de planta recombinante es capaz de replicarse en un huesped, propagacion sistemica dentro del huesped, y transcribir o expresar uno o mas genes extranos (acido nucleico aislado) en el huesped para producir la protema deseada.
Ademas de lo anterior, la molecula de acido nucleico se puede tambien introducir dentro del genoma del cloroplasto permitiendo de este modo la expresion en cloroplasto.
Se conoce una tecnica para introducir secuencias de acido nucleico exogeno en el genoma de los cloroplastos. Esta tecnica implica los siguientes procedimientos. Primero, las celulas vegetales se tratan qmmicamente con el fin de reducir el numero de cloroplastos por celula a aproximadamente una. A continuacion, se introduce el acido nucleico exogeno dentro de las celulas preferiblemente a traves del bombardeo de partmulas, con el objetivo de introducir al menos una molecula de acido nucleico exogeno dentro de los cloroplastos. El acido nucleico exogeno se selecciona por alguien experto en la tecnica para que sea capaz de integrarse dentro del genoma del cloroplasto a traves de recombinacion homologa, que se efectua facilmente por enzimas inherentes al cloroplasto. Con este fin, el acido nucleico comprende, ademas del gen de interes, al menos una secuencia de acido nucleico derivada del genoma del cloroplasto. Ademas, el acido nucleico exogeno comprende un marcador seleccionable, que por los procedimientos de seleccion secuencial sirve para permitir a un artesano comprobar que todas o substancialmente todas las copias
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del genoma del cloroplasto que siguen tal seleccion incluyen el acido nucleico exogeno. Mas detalles relativos a esta tecnica se encuentran en la Pat. de E.E.U.U. N°s 4.945.050 y 5.693.507, que se incorporan en esta memoria por referencia. De este modo se puede producir un polipeptido mediante el sistema de expresion de protema del cloroplasto y ser integrado dentro de la membrana interna del cloroplasto.
La regulacion a la baja de un gen de interes se puede efectuar a nivel genomico y/o de transcripcion usando una variedad de moleculas que interfieren con la transcripcion y/o la traduccion (p. ej., antisentido, siRNA), o a nivel de protema usando p. ej., anticuerpos, tecnicas de inmunizacion y similares.
Por ejemplo, un agente capaz de regular a la baja una actividad de un polipeptido de interes es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse espedficamente a un polipeptido de la presente invencion. Preferiblemente, el anticuerpo se une espedficamente al menos a un epftopo del polipeptido de interes. Como se usa en esta memoria, el termino “epttopo” se refiere a cualquier determinante antigenico en un antfgeno al que se une el paratopo de un anticuerpo.
La regulacion a la baja a nivel del ARN se puede efectuar mediante estrategias de silenciamiento basadas en ARN que son eficaces en plantas. Vease por ejemplo, Kusaba (2004) RNA interference in crop plants. Curr. Opin. Biotechnol. 15(2): 139-43; Matzke (2001) RnA based silencing strategies in plants. Curr. Opin. Genet. 11: 221-7.
Por ejemplo, un agente capaz de regular a la baja un polinucleotido de interes es una molecula de ARN pequeno de interferencia (siRNA) en el proceso de interferencia por ARN (RNAi).
Se pueden suministrar dsRNAs en plantas de varias maneras (revisado en Waterhouse P, Helliwell C. 2003. Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing. Nature Genet 4: 29-38): bombardeo por microproyectiles con vectores que expresan dsRNA o ARN en horquilla que contiene intrones (ihpRNA); infiltracion de tejido vegetal con una cepa de Agrobacterium que lleva un T-DNA que expresa un transgen ihpRNA; silenciamiento genico inducido por virus (VIGS); en el que la secuencia diana se integra dentro de secuencias virales que se usan para infectar la planta, o se expresan a partir de transgenes introducidos en Agrobacterium, y mediante transformacion estable con transgenes que expresan ihpRNA. Las diversas tecnicas de iRNA tienen cada una ventajas y desventajas con respecto a como es de persistente su efecto y la gama de plantas a las que se puede aplicar, p. ej. se puede aplicar el bombardeo a cualquier planta, pero solamente produce efectos transitorios. Alternativamente, la transformacion con transgenes que expresan ihpRNA proporciona silenciamiento genico estable y heredable, pero requiere de tecnicas de transformacion de plantas eficientes. Se ha demostrado que los transgenes ihpRNA son muy eficaces para una amplia gama de genes diana en varias especies de plantas (revisado en Waterhouse P, Helliwell C. 2003. Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing. Nature Genet 4: 29-38; Wesley S, Helliwell C, Smith N, et al. 2001. Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J 27: 581-590), indicando que el mecanismo de RNAi esta probablemente conservado en todas las especies de plantas. Esto es apoyado por un informe reciente de RNAi en el musgo no vascular Physcomitrella patens (Bezanilla M, Pan A, Quatrano R. 2003. RNA interference in the moss Physcomitrella patens. Plant Physiol 133: 470-474).
Se pueden usar construcciones geneticas antisentido para promotores espedficos de fibra (p. ej., para SEQ ID NO: 85, 91) para inhibir o disminuir la expresion de uno o mas genes de fibra en celulas de fibra. El uso de constructos antisentido se describe en la Pat. de E.E.U.U. N° 5.495.070 y en Smith, et al. Nature 334: 724-726, 1988; Bird, et al. Bio/Technology 9: 635-639, 1991; Van der Krol, et al. Gene 72: 45-50, 1988.
Se apreciara que la generacion de la planta productora de fibra de caractensticas deseadas se pueda efectuar mediante el cruce de cada una de las plantas geneticamente modificadas anteriores con las plantas de tipo salvaje, dbridas o transgenicas, usando metodos que son bien conocidos en la tecnica.
Una vez que se generan las plantas transgenicas, se recogen las fibras (por ejemplo por recoleccion mecanica y/o arrancado a mano) y se determina el rendimiento y calidad de fibra.
A continuacion se describen metodos de calificacion de fibras de algodon.
Longitud de fibra- Se usan instrumentos como un fibrografo y sistemas HVI (instrumentacion de de alto volumen) para medir la longitud de la fibra. Los instrumentos HVI calculan la longitud en terminos de longitud “media” y “media de la mitad superior” (UHM). La media es la longitud media de todas las fibras mientras que UHM es la longitud media de la mitad mas larga de la distribucion de fibra.
Resistencia de fibra- Como se ha mencionado, la resistencia de fibra se define generalmente como la fuerza requerida para romper un haz de fibras o una unica fibra. En la prueba HVI la fuerza de ruptura se convierte a “gramos de fuerza por unidad text”. Esta es la fuerza requerida para romper un haz de fibras que es una unidad tex en tamano. En la prueba HVI la resistencia se da en gramos por unidades tex (gramos/tex). Las fibras se pueden clasificar como resistencia baja (p. ej., 19-22 grs/tex), resistencia media (p. ej., 23-25 grs/tex), resistencia alta (p. ej., 26-28 grs/tex), y resistencia muy alta (p. ej., 29-36 grs/tex).
Micronaire- La lectura micronaire de una fibra se obtiene a partir de un ensayo de porosidad de flujo de aire. La prueba se llevo a cabo como sigue. Una muestra pesada de algodon se comprime hasta un volumen dado y se pasa
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un flujo de aire controlado a traves de la muestra. Se hace la lectura de la resistencia al flujo de aire como unidades micronaire. Las lecturas micronaire reflejan una combinacion de madurez y finura. Dado que el diametro de fibras dentro de una variedad de algodon es bastante consistente, el mdice micronaire indicara muy probablemente variacion de madurez mas que variaciones en finura. Una lectura micronaire de 2,6-2,9 es baja mientras que 3,0-3,4 es inferior a la media, 3,5-4,9 es normal y 5,0 y mas son altas. Para la mayona de las aplicaciones textiles se usa un micronaire de 3,5-4,9. Cualquiera mas alto que esto normalmente no es deseable. Se apreciara sin embargo, que diferentes aplicaciones requieren diferentes propiedades de fibra. Por lo tanto, se entiende que una propiedad de fibra que es desventajosa en una aplicacion podna ser ventajosa en otra.
Como se ilustra en la seccion de Ejemplos, que sigue, las secuencias biomoleculares son capaces de aumentar numero y longitud de tricomas/pelo de hoja, asf como el pelo de semilla. Como tales secuencias biomoleculares de la presente invencion se pueden usar para generar plantas transgenicas con numero/longitud de tricomas aumentado que diasuaden mejor a herbfvoros, guian la trayectoria de polinizadores, o afectan a la fotosmtesis, temperatura de la hoja, o perdida de agua a traves de una mayor reflexion de la luz. Ademas tales plantas transgenicas se pueden usar para la produccion compartimentalizada de protemas recombinantes y sustancias qmmicas en tricomas, como se describe en detalle en WO 2004/111183 a Evogene Ltd.
Interesante e inesperadamente, los presentes inventores encontraron que las secuencias de polinucleotidos de la presente descripcion son capaces de aumentar una biomasa de una planta. Se apreciara que la capacidad de los polipeptidos de la presente descripcion de aumentar rendimiento/biomasa/vigor de la planta es inherente a su habilidad de promover el aumento en el tamano o volumen de la celula vegetal (como se describe en esta memoria).
Por lo tanto, tambien se describe en esta memoria un metodo para aumentar una biomasa/vigor/rendimiento de una planta (plantas comferas, musgo, algas, monocotiledonea o dicotiledonea, asf como otras plantas que figuran en
www.nationmaster.com/encyclopedia/Plantae). Esto se efectua regulando la expresion y/o actividad de al menos uno de los polinucleotidos de la presente descripcion, como se describe anteriormente.
Como se usa en esta memoria la frase “biomasa de planta” se refiere al montante o cantidad de tejido producido a partir de la planta en una temporada de crecimiento, lo que tambien podna determinar o afectar al rendimiento de la planta o al rendimiento por area de cultivo.
Como se usa en esta memoria la frase “vigor de planta” se refiere al montante o cantidad de tejido producido a partir de la planta en un momento dado. Por lo tanto aumentar el vigor podna determinar o afectar al rendimiento de la planta o al rendimiento por tiempo de crecimiento o area de cultivo.
Como se usa en esta memoria la frase “rendimiento de planta” se refiere al montante o cantidad de tejido producido y recolectado como el producto vegetal producido. Por lo tanto aumentar el rendimiento podna afectar al beneficio economico que uno puede obtener de la planta en una cierta area de crecimiento y/o tiempo de crecimiento.
Por lo tanto, la presente descripcion es de alto valor agncola para promover el rendimiento de cultivos comercialmente deseados (p. ej., biomasa de organos vegetativos como madera de alamo, u organo reproductivo como numero de semillas o biomasa de la semilla).
Como se usa en esta memoria el termino “aproximadamente” se refiere a ± 10%.
Ejemplos
Generalmente, la nomenclatura usada en esta memoria y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invencion incluyen tecnicas moleculares, bioqmmicas, microbiologicas y recombinantes de ADN. Tales tecnicas se explican a fondo en la literatura. Vease, por ejemplo, “Molecular cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologfas como se exponen en las Pat. de E.E.U.U. N°s 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a Edicion), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la literatura de patentes y cientifica, vease, por ejemplo, Pat. de E.E.U.U. N°s 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization -A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). Se proporcionan otras referencias generales a lo largo de este documento. Los procedimientos en el mismo
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se cree que son bien conocidos en la tecnica y se proporcionan para la conveniencia del lector.
Ejemplo 1
Identificacion in silico de genes de algodon implicados en la formacion de fibra Procedimientos experimentales
Comparacion entre especies de secuencias expresadas.- Se usaron dos herramientas principales durante la etapa de extraccion de datos. Se consulatron un gran numero de perfiles de genes a partir de una base de datos ORACLE que alberga la plataforma GeneCarta de Compugen (Compugen Ltd. Israel). Estos datos se cargaron en hojas de calculo de Microsoft Excel para su posterior refinamiento manual. Usando estos datos se llevo a cabo una comparacion genomica a traves de especies, con el objetivo de definir organos de otras especies de plantas para las que se pueden usar bibliotecas EST publicamente disponibles como modelos y como nuevas fuentes de informacion para definir nuevos genes con papel clave en la formacion de fibra (Figura 1). Este analisis de comaparacion uso principalmente las bases de datos de algodon, arabidopsis y tomate.
Agrupamiento y agrupamiento entre especies de secuencias EST.- La base de datos genomica del algodon incluia menos de 50.000 ESTs (publicacion de Genebank # 135) que se originan principalmente de dos especies Gossypium arboreum (~35.000 ESTs) y Gossypium hirsutum L. (~9.000 ESTs, Tabla 1, mas abajo). Estas ESTs estan agrupadas y ensambladas usando la plataforma de software LEADS™ (Compugen Ltd, Israel) en dos enfoques alternativos.
En el primer enfoque, las ESTs de dos especies se agruparon y ensamblaron juntas (imitando asf el proceso evolutivo ya que G. arboreum es un ascendiente de G. hirsutum). Este proceso revelo 6.478 agrupamientos entre ellos 3.243 nuevos agrupamientos (sin mRNA en la base de datos publica) que se definieron como agrupamientos de alta calidad (Tabla 1, mas abajo).
En el segundo enfoque, se agruparon y ensamblaron ESTs de cada especie por separado. La comparacion entre los dos enfoques mostro que usar el primer enfoque anade informacion a los agrupamientos de algodon sin un un sesgo significativo en el analisis. La base de datos del tomate contiene 126.156 ESTs que se originan de aproximadamente 30 bibliotecas bien definidas que a traves del proceso de agrupamiento y ensamblaje revelaron 14.034 agrupamientos de los cuales un gran grupo de 12.787 agrupamientos eran agrupamientos de alta calidad (Tabla 1). La base de datos genomica de arabidopsis incluye 99.417 ESTs (
ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/). 8.573 cDNA de longitud completa (Rikken y genbank mRNAs
ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbamk/) y toda la secuencia de ADN. Usando el software LEADS se revelaron 23.148 agrupamientos y 6.777 singletones (ESTs unicos que no tiene otro EST agrupado dentro del mismo), todos los cuales se apoyaron por secuencias ESTs, en contra del consorcio publico (TAlR,
www.arabidopsis.org/).
Se buscaron bibliotecas EST de otras plantas y organos que comparten procesos biologicos similares a los de la fibra de algodon. Se espera que tales ESTs sirvan como modelos y como nuevas fuentes de informacion para la identificacion de genes que estan implicados en el desarrollo de la fibra. Con este fin, se genero una lista de genes conocidos que se sospecha que estan implicados en el desarrollo de la fibra. Estos genes originados a partir de arabidopsis y se muestran en varios estudios que tienen un papel clave en la formacion de tricoma (es decir, GL2, CPC, bHLH, TTG1, GL1, revisado en Larkin J. C. et al. 2003, Schellmann S. et al. 2002). El amplio analisis genomico comparativo revelo que los genes de tomate, con alta homologfa con los genes de fibra de algodon y con los genes de tricoma de arabidopsis tienen un contenido significativo de EST en cualquiera de las bibliotecas de hoja de tricoma y de desarrollo espedfico de la flor. Un analisis adicional comparo la base de datos genomica de estas tres especies - algodon, Arabidopsis y tomate (centrandose en las bibliotecas del tomate mencionadas anteriormente) como parametros clave en la presente busqueda de base de datos (Figura 1).
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Tabla 1
Bases de datos genomicas de Algodon, Tomate y Arabidopsis
Especie
Descripcion Bibl de EST Recuento de EST mRNA Despues de LEADS (agrupamientos)
G. arboreum
Fibra 6DPA 37.276 12 16.294 agrupamientos en produccion mixta*
G. hirsutum
Fibra 7-10 DPA 7.944 236
G. hirsutum
Ovulo de flor 1 DPA 1.272 870
L. esculentum
Todas las bibliotecas 115.859 7 25.678 agrupamientos en produccion mixta
L. hirsutum
Bibliotecas de Tricoma 2.409 7
L. pennellii
Bibliotecas de Tricoma 2.723 24.450
A. thaliana
Todas las bibliotecas 160.698 mRNA 25.678 agrupamientos
*agrupamientos derivados de especies diferentes, algodon G. arboreum y G. hirsutum, tomate L. esculentum, L. hirsutum y L. pennellii
Identificacion in silico de genes de algodon con un papel en el desarrollo de la fibra - Para buscar si los datos genomicos del tomate se pueden usar como una fuente relevante de datos genomicos para estudiar el desarrollo de la fibra de algodon se efectuo una comparacion genomica extensiva para identificar tanto genes de tomate como de algodon que tienen alta homologfa con genes clave que determinan el desarrollo del tricoma en arabidopsis (p. ej., GL2, CPC, bHLH, TTG1, GL1).
Se identificaron genes homologos en algodon y tomate. Debido a que casi todas las ESTs de algodon se producen de fibras de algodon, fue imposible realizar la prediccion in-silico del perfil de expresion de esos genes. Sin embargo, muchas fuentes de tejido usadas para la produccion de la base de datos EST del tomate permitieron la identificacion de tejidos en los que se expresaban genes espedficos de tricoma.
En tomate se revelo que tanto las ESTs de tricoma como de ovulo estan enriquecidas en agrupamientos que representan genes espedficos de tricoma. De modo interesante, se encontro que las fibras de algodon se producen a partir de celulas de recubrimiento del ovulo. Como las semillas de tomate se cubren con tejido tipo velloso, de forma similar a las semillas de algodon, se postulo que esos pelos estan ligados en terminos de desarrollo a la formacion del tricoma y de la fibra de algodon.
Se encontraron ~1.100 agrupamientos en tomate que incluyen al menos un EST de bibliotecas de tricoma. Entre ellas aproximadamente 1.000 secuencias inclrnan secuencias que tambien se originan de bibliotecas de la flor de tomate (en la que esta presente el tejido de ovulo). La compararacion de este grupo de genes con los datos de algodon revelo ~2.300 genes de algodon con alta homologfa con los genes de tricoma de tomate. La extraccion de la base de datos usando estos dos grupos de genes junto con otra informacion bioinformatica [homologfa a traves especies, Ontologfa Genica (OG)] revelaron 80 agrupamientos de algodon que se predice que tienen un papel clave en la formacion de fibra. Se seleccionaron esos genes en base a los siguientes criterios:
Agrupamientos de algodon con al menos 2 ESTs;
Homologfa con agrupamiento de tomate con e-puntuacion mayor que 1e-5;
Homologfa con agrupamiento de tomate con al menos un EST que proviene de bibliotecas de tricoma o un EST que proviene de tejidos que contiene el ovulo;
Se consideraron los siguientes criterios como ventajosos aunque no necesarios:
Gran numero de ESTs en un agrupamiento;
Factor de transcripcion/protemas de transduccion de senal;
Anotacion de genes relacionados con la expansion celular, presion de turgencia, smtesis de pared celular.
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Se analizaron adicionalmente los nuevos genes junto con los genes de control de algodon conocidos por estar implicados en la formacion de fibra mediante su perfil de expresion de ARN en plantas de algodon.
Ejemplo 2
Analisis de expresion de mRNA de genes identificados segun las ensenanzas de la presente invencion
Para estudiar el perfil de expresion de ARN de genes candidatos identificados como se describe en el Ejemplo 1 anterior, se efectuo una transcripcion inversa seguida de PCR en tiempo real (RT-qPCR).
Procedimientos experimentales
Analisis cuantitativo por PCR en Tiempo Real (qRT PCR).- Para verificar los niveles de expresion espedfica y asociada a la caractenstica se efectuo una Transcripcion Inversa seguida de PCR cuantitativa (en Tiempo Real) (RTqPCR). Se extrajo el ARN total en diferentes etapas de desarrollo de la fibra (desde el dfa de antesis hasta el dfa 20 post-antesis). Para estudiar la especificidad de expresion, se recogio ARN de otros tejidos de plantas de algodon y se analizaron para expresion control (es decir, hojas jovenes, tallos jovenes, tallos maduros, rafces jovenes, sepalos, petalos, y estambre). Para este proposito, se extrajo ARN de tejido de algodon usando el protocolo de Extraccion de Borato Caliente segun
www.eeob.iastate.edu/faculty/WendelJ/ultramicrorna.html. Se efectuo la transcripcion inversa usando 1,5 |ig de ARN total, usando 300 U de enzima Transcriptasa Reversa Super Script II (Invitrogen), 225 ng de hexameros aleatorios de deoxinucleotidos (Invitrogen), mezcla de dNTPs (Takara, Japon) 500 |iM, 0,2 volumenes de tampon RT 5x (Invitrogen), DTT 0,01 M, 60 U de RNAsin (Promega), se anadio DEPC tratado con agua doblemente destilada hasta 37,5 |il. Las reacciones de RT se incubaron durante 50 min a 42°C, seguido de 70°C durante 15 min. Se diluyo el cDNA a 1:20 en Tris EDTA, pH=8. Se usaron 5 ml de cDNA diluido para la qRT-PCR.
Se realizo la RT-PCR cuantitativa sobre el cDNA (5 |il), usando mezcla patron SYBR GREEN PCR 1x (Applied Biosystems), cebadores directo e inverso 0,3 |iM de cada uno. Se uso la maquina de PCR ABI7000real-time con las siguientes condiciones 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 veces de 95°C durante 15 seg y 1 min a 60°C, seguido de 95°C durante 15 seg, 60°C durante 60 seg, y 70 veces de 60°C durante 10 seg + 0,5°C de incremento en cada ciclo. Para cada gen, se preparo una curva estandar a partir de un grupo de RTs de todas las muestras, en 5 diluciones (diluciones - 1:60, 1:200, 1:600, 1:2000. 1:10000). El grafico de curva estandar [ct (ciclo umbral) vs. log (concentracion)] debe tener R>=0,98 con una eficiencia en el intervalo de 100% +/- 5%. Se calcularon los niveles de expresion (Qty) medidos en la qPCR usando la eficiencia (E) de la reaccion de amplificacion y el correspondiente C.T. (el ciclo al que las muestras cruzan el umbral) Qty=E-C.T.. Se examinaron las curvas de disociacion obtenidas para la ausencia de productos de PCR adicionales o dfmeros de cebador no deseados. Las reacciones se repitieron al menos dos veces. El metodo se basa en el hecho de que las eficiencias de las reacciones del GOI (gen de interes) y de los genes constitutivos son similares.
Para normalizar el nivel de expresion entre los diferentes tejidos, se disenaron cebadores espedficos para hibridar espedficamente con los siguientes genes constitutivos: Actina (N° Acceso GenBank D88414 SEQ ID NO: 28, cebadores directo e inverso se exponen en SEQ ID NO: 68 y 69, respectivamente), GAPDH (N° Acceso GenBank COTCWPPR, secuencia parcial, SEQ ID NO: 29, cebadores directo e inverso se exponen en SeQ ID NO: 97 y 98, respectivamente), y RPL19 (N° Acceso GenBank AI729179, SEQ ID NO: 30, cebadores directo e inverso se exponen en SEQ ID NO: 99 y 100, respectivamente).
Usando esta metodologfa fue posible identificar genes que presentaban una expresion elevada durante el alargamiento de la fibra, asf como genes que presentaban especificidad unica de fibra de algodon. Los genes que presentaban expresion elevada durante la antesis que disminman durante el alargamiento de la fibra se consideraron buenos candidatos de estar implicados en la diferenciacion e iniciacion de la fibra. La metodologfa de cuantificacion descrita anteriormente no proporciono de modo notable niveles de expresion absolutos, pero proporciono buenos parametros para evaluar la expresion genica relativa a lo largo del desarrollo de la fibra a pesar de que se detectaron diferencias tan altas como mas de 1000 veces en los maximos niveles de expresion alcanzados por diferentes genes (Tabla 2, a continuacion).
Resultados
Se evaluaron 88 genes de algodon por perfil de expresion en diferentes tejidos de algodon (Gossypium hirsutum, var Acala). Segun los resultados de la expresion de genes, se predijeron 23 genes que mejoraban el rendimiento y calidad de fibra. Se presentan los perfiles de expresion de todos los genes candidatos en la Tabla 2.
Tabla 2
Gen ID/SEQ ID NO.
-DPA* 0-1 dpa 12-14 dpa 15-17 dpa 18-20 dpa 2-3 dpa 4-5 dpa 6-8 dpa 9-11 dpa hojas maduras tallos maduros petalos sepalos estambre hojas jovenes raices jovenes tallos jovenes
CT1/1
0,053* 0,049 2,034 2,138 2,477 2,295 0,976 1,347 1,118 0,53 0,029 9,368 0,336 0,277 0,347 0,002 0,202
CT2/2
0,025 0,040 0,870 0,735 0,819 0,060 0,183 0,238 0,267 0,014 0,000 0,001 0,008 0,01 0,021 0,068 0,025
CT3/3
0,082 0,070 0,511 0,632 0,819 0,057 0,084 0,116 0,092 0,109 0,032 0,038 0,086 0,020 0,142 0,037 0,063
CT4/4
1,313 0,719 0,389 0,561 0,419 0,622 0,666 0,757 0,774 0,001 0,001 0,004 0,000 0,044 0,001 0,003 0,003
CT6/5
0,093 0,075 0,580 0,732 0,916 0,066 0,095 0,104 0,110 0,113 0,028 0,037 0,085 0,026 0,148 0,037 0,044
CT7/6
0,074 0,055 0,362 0,297 0,197 0,112 0,219 0,228 0,263 0,066 0,001 0,125 0,007 0,001 0,055 0,000 0,049
CT9/7
0,276 0,980 1,166 0,715 0,960 0,980 1,265 1,103 2,095 0,012 0,000 0,019 0,032 0,004 0,008 0,000 0,012
CT11/8
0,148 0,163 0,132 0,163 0,121 0,142 0,131 0,163 0,097 0,000 0,000 0,000 0,000 0,068 0,000 0,000 0,000
CT20/9
0,074 0,035 0,021 0,013 0,016 0,045 0,042 0,032 0,033 0,051 0,051 0,459 0,076 0,572 0,037 0,069 0,067
CT22/10
2,989 1,631 0,870 0,838 0,749 1,693 1,268 1,017 1,589 0,541 0,636 0,168 0,408 0,521 0,463 1,308 0,762
CT26/11
0,022 0,001 0,017 0,001 0,018 0,017 0,028 0,039 0,017 " " 0,006 " 0,001 " " 0,000
CT27/12
0,010 0,009 0,009 0,009 0,010 0,008 0,005 0,005 0,003 " 0,007 0,008 0,005 0,001 0,001 0,001 0,007
CT40/16
0,016 0,016 0,014 0,023 0,024 0,012 0,013 0,016 0,017 0,007 0,000 0,002 0,022 0,005 0,005 0,001 0,004
CT49/17
0,056 0,114 0,156 0,131 0,111 0,161 0,283 0,315 0,332 0,031 0,002 0,011 0,007 0,007 0,060 0,005 0,047
CT70/18
1,406 2,247 8,460 7,782 10,709 2,152 5,313 7,361 4,796 1,065 0,492 9,976 0,671 1,207 1,904 1,177 1,294
CT71/19
0,095 0,403 1,736 2,079 2,670 0,338 0,685 1,139 0,809 0,627 1,708 1,258 1,268 6,599 1,301 0,004 0,480
CT74/20
2,971 2,555 3,474 4,398 5,859 3,135 4,301 4,272 6,983 0,017 0,002 0,203 0,015 0,136 0,030 0,003 0,464
CT75/21
1,727 0,282 16,012 15,856 20,171 3,812 8,935 " 20,295 4,473 3,644 83,72 6,317 28,659 8,534 0,872 2,759
CT76/22
0,000 0,002 0,041 0,039 0,080 0,007 0,020 0,015 0,036 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 " 0,000 0,000
CT77/23
0,005 0,011 0,555 0,892 1,434 0,057 0,161 0,166 0,123 0,016 0,026 0,020 0,009 " 0,023 0,001 0,003
CT81/24
0,161 0,196 3,455 4,880 14,028 0,210 0,354 0,515 1,153 9,477 26,444 1,165 0,913 0,021 6,614 0,004 1,089
CT82/25
0,024 0,022 0,005 0,004 0,006 0,018 0,016 0,014 0,011 0,053 0,034 0,017 0,045 0,036 0,004 " 0,000
CT84/27
0,007 0,005 0,136 0,167 0,371 0,004 0,014 0,027 0,031 0,036 0,346 0,034 0,196 0,101 0,061 0,071 0,035
CT88/13
0,002 0,371 0,841 2,978 3,045 4,947 14,725 17,514 28,290 0,001 0,034 0,005 0,000 0,005 0,004 0,007
Se realizo transcripcion inversa seguida de PCR cuantitativa usando PCR en tiempo real, en tejidos ya sea de plantas de algodon joven o de maduro (G. hirsutum var Acala). Se presentan las cantidades relativas de mRNA de cada gen en todos los tejidos examinados. dpa- dias post antesis, de tejidos de ovulo y fibras (hasta 10 dpa) o solo de tejido de fibra (despues de 10 dpa).
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Se usaron dos criterios principales para seleccionar genes de algodon como candidatos que pueden estar implicados en el desarrollo de la fibra segun su perfil de ARN. Los genes que presentan un alto grado de especificidad de expresion de fibra y los genes que muestran niveles de expresion que cambian de forma concomitante con el desarrollo de la fibra (Tabla 3, a continuacion).
Veintitres genes cumplen estos criterios de seleccion:
CT-1 (SEQ ID NOs. 1 y 106), CT_2 (SEQ ID NOs. 2 y 107), CT_3 (SEQ ID NOs. 3 y 108), CT_4 (SEQ ID NOs. 4 y 109) CT_6 (SEQ ID NOs. 5 y 110), CT_7 (SEQ ID NOs. 6 y 111), CT_9 (SEQ ID NOs. 7 y 112), CT_11 (SEQ ID NOs. 8 y 113), CT_20 (SEQ ID NOs. 9 y 114), CT_22 (10 y 115), CT_26 (SEQ ID NOs. 11 y 116), CT_27 (SEQ ID NOs. 12 y 117), CT_40 (SEQ ID NOs. 16 y 118), CT_49 (SEQ ID NOs. 17 y 119), CT_70 (SEQ ID NOs. 18 y 120), CT_71 (SEQ ID NOs. 19 y 121), CT_74 (SEQ ID NOs. 20 y 122), CT_75 (SEQ ID NOs. 21 y 123), CT_76 (SEQ ID NOs. 22 y 124), CT_77 (SEQ ID NOs. 23 y 125), CT_81 (SEQ ID NOs. 24 y 126), CT_82 (SEQ ID NOs. 25 y 95), CT_84 (SEQ ID NOs. 27 y 96) and CT_88 (SEQ ID NOs. 13 y 26).
Se eligieron CT-4, 22, 20, 27, 40, 82 (SEQ ID Nos: 4, 10, 9, 12, 16 y 25, respectivamente) principalmente como genes candidatos que pueden tener un papel en la iniciacion de la fibra (Tabla 3) mientras CT 27 (SEQ ID NO: 12), que es un gen homologo de GL3, se uso tambien como un control (en la Figura 2d se muestra CT 22, SEQ ID NO: 10).
Se predijo que CT-1, 2, 3, 6, 7, 9, 49, 70, 71, 74, 75, 76, 77, 81, 84 (SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 5, 6, 7, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 y 27, respectivamente, vease Figuras 2a, c) estanan implicados en el alargamiento y calidad de fibra (resistencia y finura) segun sus patrones de expresion (Tabla 3, se muestra CT en la Figura 2C).
CT11, 40, 74 y CT 26 (SEQ ID NOs. 8, 16, 20 y 11, respectivamente, vease Figuras 2a, b) que son homologos a Glabrous1 de Arabidopsis (N° de acceso a GeneBank AB006078) son genes espedficos de fibra que mostraron expresion uniforme y espedfica de fibra durante todas las etapas del desarrollo de la fibra (Tabla 3, se muestra CT 11 como un ejemplo en la Figura 2B). Se muestran los perfiles de expresion de todos los genes elegidos en la Tabla 2, mas arriba.
Tabla 3
CT#
Anotacion de gen Iniciacion Calidad & Alargamiento de Fibra Expresion Estable y Especifica de Fibra Especifico de Fibra Proceso Biologico
CT_2
Sacarosa-6-fosfato hidrolasa acida V Si Metabolismo carbohidratos
CT_7
Supuesta aciltransferasa V Desconocido
CT_9
Proteina hipotetica V Si Procesamiento de tRNA
CT_49
Proteina hipotetica V Desconocido
CT_1
Proteina tipo lipasa/hidrolasa con motivo GDSL V Desconocido
CT_3
Supuesta proteina mitocondrial V Desconocido
CT_6
Aspartil proteasa V Proteolisis y peptidolisis
CT_70
Cisteina proteasa V Privacion de agua
CT_71
Proteina de respuesta a la deshidratacion V Desecacion
CT_75
Supuesta proteina de transferencia de lipidos V
CT_76
Supuesto receptor de quinasa V Si Fosforilacion de aminoacidos de proteina
CT_77
Proteina hipotetica V Si
CT_81
Proteina tipo APETAL2 V organizacion y biogenesis de la pared celular
CT_84
Proteina hipotetica V biosintesis de la familia de aminoacidos aromaticos
CT_4
Proteina tipo citocromo P450 V Si transporte de electrones
CT_20
Proteina homologa relacionada con MYB V regulacion de la transcription
CT_22
Proteina hipotetica V desconocido
CT_27
Proteina tipo factor de transcripcion bHLH V regulacion de la transcripcion
CT_82
Caja MADS tipo priteina V regulacion de la transcripcion
CT_11
Factor de transcripcion de caja MADS tipo agamous V Si regulacion de la transcripcion
CT_26
Proteina homologa relacionada con MYB V Si compromiso de destino celular
CT_40
Proteina precursora 3 de transferencia de lipidos (LTP 3) V Si transporte de lipidos
CT_74
Proteina del transposon tipo EN/SPM V Si organization y biogenesis de la pared celular
K)
CO
Los genes seleccionados se sobre-expresaron en arabidopsis y tomate transgenicos, usando el promotor constitutivo CaMV de 35S (SEQ ID NO. 31). Se evaluaron adicionalmente las plantas transgenicas para modificaciones epidermicas, densidad y longitud de tricoma y rendimiento del pelo de semilla (como se describe adicionalmente en esta memoria mas adelante).
5 Ejemplo 3
Analisis de la expresion genica usando microchips publicamente disponibles
Se recopilo informacion adicional sobre la expresion de los genes seleccionados (Ejemplo 2, mas arriba) por analisis estadfstico de datos de microchips de arabidopsis. Esencialmente, se compararon los mejores homologos de los nuevos genes candidatos en arabidopsis con un conjunto de 77 microchips experimentales de diferentes 10 tejidos de Arabidopsis (bases de datos AtGenExpress, el investigador principal para aFgN: Prof. Dr. Lutz Nover, Botanisches Institut, Molekulare Zellbiologie, FB Biologie und Informatik der J. W. Goethe Universitat Frankfurt; Biozentrum N200 3OG, Marie-Curie-Strasse 9, 60439 Frankfurt am Main,

www.arabidopsis.org/info/expression/ATGenExpress.isp).
Se seleccionaron secuencias de polinucleotidos que se expresaban altamente en celulas alargadas o meristemos 15 de inflorescencia para analisis posterior.
La Tabla 4 a continuacion enumera los tejidos que exhiben los niveles mas altos de expresion.
Tabla 4
Tejidos con alta expresion < cambio en veces/especificidad Relacionado con la fibra
CT_1
Semilla, silicuas 10-20 Celulas alargadas
CT_11
carpelos, flor, semilla, silicuas Espedfico de tejido Espedfico de flor
CT_2
rafz, plantula y sepalos Espedfico de tejido Celulas alargadas
CT_22
carpelos, flor, inflorescencia, brote 4-10 inflorescencia
CT_4
Petalos, estambre >10 Celulas alargadas
CT49
silicuas >2 Celulas alargadas
CT_7
carpelos, flor, inflorescencia, petalos, brote, silicuas 10-30 inflorescencia
CT_70
flor, rafz, estambre Casi espedfico de tejido
CT_76
carpelos, flor, inflorescencia, brote, silicuas >2 Celulas alargadas & inflorescencia
CT_77
semillas, polen, estambre, petalos, sepalos, silicuas 10-50 Celulas alargadas
CT_82
inflorescencia, brote tallo 3-6 inflorescencia
CT_88
petalos, estambre Celulas alargadas
Ejemplo 4
20 Establecer una correlacion entre la expresion de genes candidatos y longitud de fibra
Con el fin de definir las correlaciones entre los niveles de expresion de ARN de los genes seleccionados y la longitud de fibra, se analizaron fibras de 4 lmeas de algodon diferentes. Se seleccionaron estas fibras que mostraban una muy buena calidad de fibra y un alto mdice de pelusa (tipos Pima, procedentes de otras especies de algodon, esto es G. barbadense) y diferentes niveles de calidad e indices de pelusa de varias lmeas de G. hirsutum: buena calidad
y alto mdice de pelusa (tipo Acala), mdice medio de pelusa (tipo Coker) y pobre calidad y bajo mdice de pelusa (tipo Tamcot).
Procedimientos experimentales
Extraccion de ARN.- Se tomaron muestras de etapas de desarrollo de la fibra, que representan diferente 5 caractenstica de fibra, a 5, 10, 15 y 20 DPA y se extrajo el ARN como se describe en el Ejemplo 2.
Evaluacion de la fibra.- Se midio la longitud de fibra de las lmeas anteriores usando el fibrografo. El sistema de fibrografo se uso para calcular la longitud en terminos de longitud “Media de la Mitad Superior” (UHM). La media de la mitad superior (UHM) es la longitud media de la mitad mas larga de la distribucion de fibra. El fibrografo mide longitud en longitudes de tramo en un punto porcentual dado 10 (
www.cottoninc.com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length.)
Resultados
Se crecieron cuatro lmeas diferentes de algodon en Rehovot, Israel durante el verano de 2004, y se midieron sus longitudes de fibra. Los valores UHM de las fibras se resumen en la Tabla 5, a continuacion:
Tabla 5
Longitud (UHM)
Prima S5
1,40 ± 0 a
Acala
1,23 ± 0,01 b
Coker 310
1,18 ± 0,01 c
Tamcot
1,15 ± 0,02 c
15
Se probaron cinco genes para la correlacion entre la expresion genica y la longitud de fibra (presentada para CT_76 en la Figura 3). Los resultados se resumen en la Tabla 6 a continuacion:
Tabla 6
Dfa de Muestreo del Tejido (DPA)
0
5 10 15
Cantidade s relativas de mRNA
Cantidades relativas de mRNA Expresion relativa en relacion a T0 Cantidades relativas de mRNA Expresion relativa en relacion a T0 Cantidades relativas de mRNA Expresion relativa en relacion a T0
CT_1
Tamcot 0,75 2,99 4,0 4,71
Coker 310
0,51 4,80 9,3 7,56
Acala
0,64 5,08 7,9 8,01
CT 2
Tamcot 0,03 0,19 7,6 8,17
Coker 310
0,03 0,35 11,4 15,04
Acala
0,02 0,36 17,7 15,28
Pima S5
0,02 0,41 23,6 17,58
CT 40
Tamcot 0,28 0,47 1,67
Coker 310
0,37 0,46 1,24
Acala
0,30 0,67 2,25
Pima S5
0,37 1,03 2,75
CT 76
Tamcot 0,01 0,03 5,4 0,01 2,3 0,00 0,10
Coker 310
0,01 0,08 8,9 0,04 5,1 0,00 0,10
Acala
0,01 0,12 16,6 0,06 9,1 0,00 0,12
Pima S5
0,01 0,13 122,4 0,18 177,9 0,12 99,51
CT_81
Tamcot 0,50 1,33 2,68 5,03 10,15 1,11 2,24
Coker 310
0,31 2,64 8,65 4,51 14,76 0,84 2,75
Acala
0,49 4,38 8,98 6,36 13,05 3,65 7,49
Se llevo a cabo transcripcion inversa seguida de PCR cuantitativa usando PCR en tiempo real, en tejidos de 0, 5, 10 y 15 DPA de plantas de algodon (G. hirsutum var Tamcot, Coker y Acala, y G. barbadense var Pima S5). Se presentan las cantidades relativas de mRNA y la expresion relativa relacionada con T0 de cada gen en todos los tejidos examinados.
5 Ejemplo 5
Clonacion de los genes seleccionados en un vector binario bajo regulacion constitutiva y expresion recombinante del mismo
Analisis ORF.- Se analizaron las secuencias genicas de la presente invencion por ORFs usando software Gene Runner version 3.05 (Hasting Software, Inc:
www.generunner.com/). Se compararon las ORFs de cada gen con la 10 base de datos del Genbank, usando Blast (
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Se determino la posicion del codon de iniciacion ATG, comparando con ORFs de mas alta homologfa. Todas las secuencias descritas en esta memoria mostraron tener una ORF de longitud completa predicha e incluir el codon de iniciacion ATG predicho.
Clonacion dentro del vector de expresion pPI.- Para clonar genes de la presente invencion, se extrajeron los ARNs totales de las varias etapas de desarrollo de celulas productoras de fibra usando Extraccion de ARN con Borato 15 Caliente de tejido de algodon segun
www.eeob.iastate.edu/faculty/WendelJ/rnaextraction.html. Se produjeron moleculas de ADN complementario (cDNA) de mRNA usando la enzima de transcripcion inversa (RT) M-MuLV (Roche) y el cebador de ADN T16NN, siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Se realizo la amplificacion de cDNA de 19 genes, de las secuencias anteriores, es decir los clones CT numeros 1, 2, 3, 6, 7, 9, 11, 20, 22, 27, 40, 71, 74, 75, 76, 81, 82, 84 y 88, por PCR usando la enzima ADN polimerasa correctora PFU 20 (Promega
www.promega.com/pnotes/68/7381 07/7381 07.html) siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Se disenaron cebadores para cada gen para abarcar la ORF completa. Se anadieron sitios de restriccion de endonucleasa adicionales al extremo 5' de cada cebador para facilitar la clonacion adicional de los CTs al vector binario (pPI). La Tabla 7 a continuacion enumera los cebadores usados para la clonacion de cada uno de los genes:
Tabla 7
N°de CT
Cebador directo / SEQ ID NO: Cebador inverso / SEQ ID NO: Sitio de restriccion corriente arriba Sitio de restriccion corriente abajo
CT 1
ACCCGGGATGGATGGTTATTGTAGCAGAAGG/32 GCCGAGCTCGAATCAAATGAGGGCAATGCC/3 3 Sma T Sad
CZ_2
AATCTAGACAAGTACAGAAGCTCAATTCCC/34 TGATAATCATGTGGAAGCAACC/3 5 Xbal
CT_3
CAGCCCGGGTGATGGAACTGAGCATTCAG/3 6 CGTGAGCTCTGATTAGAGTTTCAAGTGCATG/ 3 7 Sma I Saci
CT_S
T T TCCCGGGTTGTTGTCATGGCTTCTCTGC/3 8 ATGGAGCTCATATTCATGGCCAAAACAC/39 Sma I Sac:
CT_7
G CACCCGGGAAAGGAAATGGC AGGCGTC/4 0 TTTCGATATCCACAGTACCCTACTTCCATGC/41 Sma I EcoRV
CT_9
TACCCGGGTACCAT TACTCTACTACAGCTGC/4 2 GAGAGCTCAACAGACAAAGACCAGACTGG/4 3 Sma 7 Saar
CT_11
ACCCCCGGGCAAGTGATCAAAGAGAATGG/4 4 CATGAGCTCTTTCTCCAACTCCTCTACCC/4 5 Sma I Sad
C7 2D
CCCCCGGGTCCCTATTGCATGCCTTTC/4 6 TTGAGCTCACTCGATCTTACTCATCC/4 7 Sr:.a I Sad
CT_2 2
AGCCCGGGAGATAGAGAGATGGGAGGTCC/48 TCGAGCTCTGGGGCAACAATCATTTACC/4 9 Srr.al Sad
CT_2 7
tccccgggcatctgatctaattgttggtgg/50 TTGGATATCGCACCTTATGACATGGGATC/51 Sma I EcoF.V
CT_4 0
TTCCCGGGTACAAACATGGCTAGTTCCG/52 TCGAGCTCATCAACCTCACTGCACCTTG/53 Sma I Sad
CTJ 1
tagtcactcctgttctagatgaag/5 4 CTGAGCTCCAGGATTTTTACTTAGGGACCC/55 Xbal Sad
CT 74
TACCCGGGCATACAGAGATGGAGAGGC/5 6 ACGAGCTCAAAGGTGTTTGCTTAGGTCC/57 SmaT Sac:
CT 7 5
AGCCCGGGAGAAAGATGAT GAAAAGGGG/5 8 AAGATATCAAATCCCATGCAAAACCCC/59 Sma T EcoRV
CT_7fi
AACCCGGGCGGCAACTTAAAAGAAAACC/60 AAGAGCTCCTTTGTTGGCTTCTCAAG/61 Smal Sad
CT 61
GACCCGGGACTGTAAAAAAGCATAGG/62 GCGAGCTCAGCTTAAGGAT GATGGGGAG/6 3 Sma ] SacI
CT_62
ATCC CGGGGATGGTGAGAGGCAAAATTC/6 4 ACGAGCTC TAGCAATGGCGATAACGTAC/6 5 Sraal SacI
CT_B4
ATCCCGGGTTCCATGAAAAGGGTCTCG/66 GTGAGCTCTATCGTCGTTGTCCTTCAGC/67 Smal Sad
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los productos romos resultantes de la PCR se purificaron usando el Kit de Purificacion de PCR (Qiagen, Alemania), digeridos con las endonucleasas de restriccion apropiadas (Roche) y se clonaron dentro del vector binario pPI (Figura 4), mientras que se reemplaza el gen marcador GUS existente. pPI es una version modificada de pBI101.3 (Clontech, N° de Acceso U12640). pPI se construyo insertando una secuencia senal de poli-(A) sintetica, que provema del vector plasirndico pGL3 Basic (Promega, N° Acc U47295, donde se localiza la secuencia senal de poli- (A) sintetica entre las pares de bases 4658-4811), dentro del sitio de restriccion HindIII de pBI101.3 (mientras se reconstruye el sitio HindIII, corriente abajo del inserto de poli-(A)), para evitar la posibilidad de efecto de revision del promotor Nos corriente arriba. Para reemplazar el gen GUS con cada uno de los genes CT en el vector binario pPI se digirio pPI con las enzimas de restriccion apropiadas [la enzima de restriccion 5' es o SmaI o XbaI y la enzima de restriccion 3' es o SacI o EcoRV (Roche- usando el protocolo proporcionado por el fabricante)]. Se purifico el vector binario abierto usando el Kit de Purificacion de PCR (Qiagen, Alemania). Se ligaron 5-75 ng de producto de PCR de cada uno de los genes CT y 100 ng del vector plasirndico pPI abierto en 10 |il de volumen de reaccion de ligacion usando la enzima ADN ligasa T4 (Roche), siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Los productos de ligacion se introdujeron en celulas de E. coli.
Expresion recombinante en bacteria.- Se transformaron 60 |il de celulas competentes de E. coli, cepa DH5-a (aproximadamente 109 celulas/ml), usando 1 |il de mezcla de reaccion de ligacion por electroporacion, usando un electroporador MicroPulser (Biorad), cubetas de 0,2 cm (Biorad) y el programa de electroporacion EC-2 (Biorad). Se crecieron celulas de E. coli en 0,8 ml de medio lfquido LB a 37°C durante 1 h y se plaquearon 0,2 ml de suspension celular sobre placas de LB-agar suplementadas con el antibiotico kanamicina a 50 mg/l (Sigma). Las placas se incubaron despues a 37°C durante 16 h. Crecieron las colonias bacterianas y se confirmo la expresion por amplificacion por PCR usando cebadores que se disenaron para abarcar la secuencia insertada en el vactor binario. Los cebadores usados para la amplificacion de ADN de los insertos en el vector binario pPI fueron:
5'-GGTGGCTCCTACAAATGCCATC-3' (directo, SEQ ID NO. 70) y 5'-AAGTTGGGTAACGCCAGGGT-3' (inverso, SEQ ID NO. 71).
Se separaron los productos de PCR en geles de agarosa al 1,5% y se estimaron los tamanos de los productos comparando con una escalera de ADN (MBI Fermentas). Los productos de PCR con los tamanos predichos se secuenciaron usando los mismos cebadores previamente usados para la amplificacion por PCR (Vease Tabla 7, mas arriba).
Se usaron cebadores adicionales, que fueron disenados en base a la secuencia de cada gen inserto, para completar la secuenciacion del inserto de ORF de longitud completa.
Se realizo la secuenciacion de la secuencia insertada para verificar que los clones se introdujeron en la orientacion correcta, y para eliminar la posibilidad de que se incluyeran errores de secuencia durante la amplificacion por PCR. Se determinaron las secuencias de ADN usando el secuenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc.).
Se clono en cada uno de los 19 constructos binarios pPI que albergaban los genes CT el promotor constitutivo 35S del Virus Mosaico de la Coliflor.
Se clono la secuencia promotora de 35S del Virus Mosaico de la Coliflor, originada a partir del vector pBI121 (Clontech, N° de Acceso AF485783) digiriendo el vector pBI121 con las endonucleasas de restriccion HindIII y BamHI (Roche) y se ligo en los constructos binarios, digeridos con las mismas enzimas (SEQ ID NO. 31).
Ejemplo 6
Transformacion en Agrobacterium de plasmidos binarios que albergan los genes de interes y expresion en plantas de Arabidopsis y de tomate.
Cada uno de los diecinueve constructos binarios, que comprenden el promotor 35S corriente arriba de cada uno de los genes CTs se transformaron en plantas de Arabidopsis o de tomate a traves de transformacion de Agrobacterium tumefaciens.
Se transformaron 60 |il de celulas competentes GV301 o LB4404 de Agrobacterium tumefaciens (aproximadamente 109 celulas/ml) con 20 ng de plasmido binario a traves de electroporacion, usando un electroporador MicroPulser (Biorad), cubetas de 0,2 cm (Biorad) y programa de electroporacion EC-2 (Biorad).
Se crecieron celulas de Agrobacterium en 0,8ml de medio lfquido LB a 28°C durante 3 h y se plaquearon 0,2 ml de la suspension celular sobre placas de LB-agar suplementadas con los antibioticos gentamicina a 50 mg/l (para cepas de Agrobacterium GV301) o estreptomicina a 300 mg/l (para cepa de Agrobacterium LB4404) y kanamicina a 50 mg/l (Sigma). Las placas se incubaron despues a 28°C durante 48 h. Crecieron las colonias de Agrobacterium y se realizo la amplificacion por PCR en celulas de Agrobacterium, usando cebadores que se disenaron para abarcar la secuencia inserta en el vector binario.
Los cebadores usados para la amplificacion por PCR fueron: 5'-GGTGGCTCCTACAAATGCCATC-3' (directo, SEQ ID NO. 70) y 5'-AAGTTGGGTAACGCCAGGGT-3' (inverso, SEQ ID NO. 71).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se separaron los productos de PCR en geles de agarosa al 1,5% y se determinaron los tamanos de los productos comparando con una escalera de ADN (MBI Fermentas). Los productos de PCR con los tamanos predichos se secuenciaron usando los cebadores que se usaron para la amplificacion por PCR. Se realizo la secuenciacion de la secuencia insertada para verificar que se introdujeron los clones correctos en las celulas de Agrobacterium.
La secuenciacion de ADN se efectuo usando el secuenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc.).
Transformacion de plantas y cultivo:
Transformacion de plantas de Arabidopsis thaliana con presuntos genes de algodon.- Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana Columbia (plantas T0) usando el procedimiento Floral Dip descrito por Clough y Bent y por Desfeux et al., con mmimas modificaciones. Brevemente, se sembraron Plantas T0 en macetas de 250 ml llenas con la mezcla de crecimiento basado en turba humeda. Las macetas se cubrieron con papel de aluminio y una cupula de plastico, se mantuvieron a 4°C durante 3-4 dfas, despues se descubrieron y se incubaron en una camara de crecimiento a 18-24°C bajo ciclos de luz/oscuridad de 16/8 h. Las plantas T0 estaban listas para la transformacion seis dfas antes de la antesis. Se cultivaron colonias individuales de Agrobacterium que llevan los constructos binarios en medio LB suplementado con kanamicina (50 mg/l) y gentamicina (50 mg/l). Los cultivos se incubaron a 28°C durante 48 h bajo agitacion vigorosa y despues se centrifugaron a 4.000 rpm durante 5 min. Los precipitados que comprenden celulas de Agrobacterium se resuspendieron en un medio de transformacion que contiene Murashig-Skoog (Duchefa) de fuerza media (2,15 g/l); bencilamino purina (sigma) 0,044 |iM; 112 |ig/l de vitaminas Gambourg B5 (Sigma); sacarosa al 5%; y 0,2 ml/l de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) en agua doblemente destilada, a pH de 5,7. La transformacion de plantas T0 se efectuo invirtiendo cada planta en una suspension de Agrobacterium, tal que el tejido de la planta por encima de la tierra se sumergio durante 3-5 seg. Cada planta T0 inoculada se coloco inmediatamente en una bandeja de plastico, luego se cubrio con una cupula de plastico claro para mantener la humedad y se mantuvo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 18 h, para facilitar la infeccion y transformacion. Se descubrieron entonces las plantas transformadas (es decir, transgenicas) y se transfirieron a un invernadero para su recuperacion y maduracion.
Se cultivaron las plantas T0 transgenicas en el invernadero durante 3-5 semanas hasta que las silicuas eran marrones y secas. Las semillas se recogieron de las plantas y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta la siembra. Para generar plantas transgenicas T1 que albergan los genes, se esterilizaron en superficie las semillas recogidas de plantas transgenicas T0 sumergiendolas en etanol al 70% durante 1 minuto, seguido de inmersion en hipoclorito sodico al 5% y triton al 0,05% durante 5 minutos. Las semillas esterilizadas en superficie se lavaron a fondo en agua destilada esteril despues se colocaron en placas de cultivo que contienen Murashig-Skoog (Duchefa) de fuerza media; sacarosa al 2%; agar de planta al 0,8%; kanamicina 50 mM; y cerbenicilina (Duchefa) 200 mM. Las placas de cultivo se incubaron a 4°C durante 48 h se transfirieron despues a una sala de crecimiento a 25°C durante una semana adicional de incubacion. Se transfirieron plantas de Arabidopsis T1 vitales a unas placas de cultivo fresco durante otra semana de incubacion. Despues de la incubacion se retiraron las plantas T1 de las placas de cultivo y se plantaron en mezcla de crecimiento contenida en macetas de 250 ml. Las plantas transgenicas se dejaron crecer en un invernadero hasta la madurez.
Transformacion de plantas de tomate Micro-Tom con presuntos genes de algodon.- La transformacion y cultivo de tomate (Lycopersicon esculentum, var MicroTom) de plantas transgenicas se efectuo de acuerdo a Curtis et al. 1995, y Meissner et al. 2000.
Ejemplo 7
Crecimiento de plantas de Arabidopsis transformadas y caracterizaciones de fenotipo
Se crecieron plantas T1 de Arabidopsis como se describe anteriormente y se caracterizaron los fenotipos.
Analisis por PCR de plantas transgenicas.- Se sembraron semillas T2 de Arabidopsis directamente en mezcla de crecimiento contenida en macetas de 250 ml. Se monitorizaron por PCR las plantas transgenicas positivas para resistencia a kanamicina en hojas viejas de dos semanas. Los cebadores usados para la amplificacion por PCR de la kanamicina fueron: 5'-CTaTtCGGCTATGACTGGGC-3' (directo, SEQ ID NO. 72) y 5'- ATGTCCTGATAGCGGGTCCGC-3' (inverso, SEQ ID NO. 73).
Funcionamiento de la rafz.- Con el fin de visualizar el funcionamiento de la rafz, se esterilizaron en superficie semillas T2 sumergiendolas en metanol al 70% durante 1 minuto, seguido de inmersion en hipoclorito sodico al 5% y triton al 0,05% durante 5 minutos. Las semillas esterilizadas en superficie se lavaron a fondo en agua destilada esteril y despues se colocaron en placas de cultivo que contienen Murashig-Skoog (Duchefa) de fuerza media; sacarosa al 2%; agar de planta al 0,8%; kanamicina 50 mM; y cerbenicilina (Duchefa) 200 mM. Las placas de cultivo se incubaron a 4°C durante 48 h despues se transfirieron a una sala de crecimiento a 25°C hasta que alcanzan el tamano correcto para la caracterizacion fenotfpica.
Tabla 8- Analisis de plantas T2 de Arabidopsis que cuidan de los supuestos genes de algodon
CT
Funcion del gen supuesto Generacion de T N° de plantas independientes Fenotipo T2
CT_11
Factor de transcripcion de caja MADS tipo agamous 2 5 Hojas curvadas y estrechas, con peciolos largos, raices mas largas y densas (Figuras 5a-c)
CT_9
Proteina hipotetica 2 5 Las hojas de roseta y las inflorescencias son mas largas y mas grandes en comparacion con el control. Las raices son mas largas y densas. El fenotipo se asemeja al fenotipo de plantas de Arabidopsis que sobre-expresen expansina como se caracterizo por Hyung-Taeg Cho y Daniel J. Cosgrove en PNAS u Agosto 15, 2000. (Figuras 5g-i)
CT_20
Proteina relacionada con MYB 1 1 Hojas pequehas irritantes y peludas (Figuras 5d y e)
CT_40
Proteina de transferencia de lipidos 3 2 5 Hojas mas largas y curvadas (Figura 5j)
CT_22
Proteina hipotetica Hojas mas estrechas, con largos peciolos (Figuras 5d y f)
CT_81
Proteina tipo APETAL2 1 1 Las hojas de roseta son casi dobles que las del tipo salvaje (Figuras 5k y I)
CT_1
Proteina tipo hidrolasa 1 6 Hojas estrechas, con largos peciolos (lo mismo que CT_22, no mostrado)
Ejemplo 8
Crecimiento de plantas transformadas de MicroTom y caracterizaciones de fenotipo Procedimientos experimental
Plantas transgenicas de tomate.- Se transformaron las plantas como se describe en el Ejemplo 6, anteriormente. 5 Despues de la transformacion, las plantas de tomate MicroTom T1 se crecieron en mezcla contenida en macetas de 1000 ml.
Tabla 9 - Analizando plantas de tomate Micro-Tom T1 y T2 y semillas que cuidan de los supuestos genes de algodon
CT
Funcion del gen supuesto Generacion deT N° de plantas independientes Longitud de pelo de semilla T1 (wt 0,3 mm) Fenotipo T2
CT20
Proteina homologa relacionada con MYB I 10 0,366±0,006 mm (Figuras 6c-e) Hojas pequenas y arrugadas, los tricomas en las hojas son mas largos y densos (Figuras 6a-b)
CT75
Supuesta proteina de transferencia de Ifpidos I 2 0,347±0,019 mm Inflorescencia grande
CT_6
Aspartil proteasa 1 1 0,343±0,019
CT_82
Caja MADS tipo proteina 1 3 0,423±0,013 mm (Figura 5f) Plantas normales
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Discusion
(Ejemplos 1-8)
Identificacion in silico de genes implicados en el desarrollo de la fibra de algodon.- Poco se conoce sobre el control genetico de la iniciacion y alargamiento de la fibra de algodon. Desde que tanto la fibra de algodon y los tricomas de Arabidopsis se desarrollan a partir de celulas epidermicas unicas se asume que comparten una regulacion genetica similar (revisado en Wagner G. J. et al. 2004). En Arabidopsis, un gran numero de estudios han puesto de manifiesto una amplia informacion sobre los mecanismos geneticos que regulan la iniciacion y alargamiento del tricoma. Varios estudios demostraron las similitudes entre el tricoma y la fibra mostrando que promotores espedficos de la fibra de algodon en plantas de arabidopsis y tabaco confieren expresion espedfica de tricoma (Kim y Triplett, 2001; Hsu et al. 1999; Liu et. al. 2000, Wang et al. 2004). La mayor parte de la investigacion que estudia el desarrollo de la fibra usa el tricoma de arabidopsis como un sistema modelo para identificar genes de algodon de un modo a pequena escala (Kim y Triplett, 2001; Wang et al. 2004).
En este estudio los presentes inventores han usado bibliotecas EST de tricoma y de flor de tomate como sistemas modelo para estudiar el desarrollo de la fibra de algodon. El analisis del perfil de las bibliotecas EST de los agrupamientos homologos del tomate con genes conocidos de tricoma de arabidopsis mostraron que las bibliotecas EST de tricoma y de flor de tomate contribuyeron significativamente a este conjunto de agrupamientos.
Este resultado se confirmo mientras se analizaba el perfil de las bibliotecas EST de los nuevos agrupamientos de algodon que se seleccionaron por su patron de expresion de ARN como genes de fibra de algodon. 9 y 10 agrupamientos conteman ESTs que proveman de bibliotecas de flor y de tricoma, respectivamente. Ademas, el grupo de agrupamientos de tricoma de tomate (ESTs de tricoma /ESTs totales > 0,1) comprende gran parte de los genes de tomate que presentan alto grado de homologfa con algodon (~50%) a pesar de que su prcentaje en la poblacion total es solamente ~5%. Esto puede indicar que ambos oganos comparten procesos de desarrollo comunes. A pesar de que hay un gran grupo de estudios sobre el control genetico del desarrollo del fruto y tricoma del tomate no se encuentran publicaciones que usen estos organos como una fuente de datos genomicos para estudiar el desarrollo de la fibra de algodon. Se compararon todos los 23 genes de algodon con datos unicos EST producidos por separado a partir de embrion y suspensores de semillas en desarrollo de la judfa Scarlet Runner (
www.mcdb.ucla.edu/Research/Goldberg/ests/intro-index.htm). Todas las secuencias, excepto una, comparten altas homologfas con secuencias procedentes del suspensor, que es un tejido maternal. Este resultado apoya los resultados in silico e identifica el papel de estos agrupamientos de algodon en el desarrollo de la fibra, que se origino tambien a partir de celulas maternas.
Identificar genes de algodon con un papel en el desarrollo de la fibra a traves del analisis del perfil de expresion de ARN.- La fase de diferenciacion/iniciacion se representa mediante expresion genica en o antes de la antesis. La fase de alargamiento principalmente en cultivares de hirsutum se representa por un crecimiento muy rapido durante 5 a 20 DPA. Un patron se representa por genes como CT 1, 2, 3 expresados a sus mas altos niveles, ligeramente antes y durante el periodo de pico de expansion de fibra aproximadamente a 20 DPA. Otro patron de expresion genica se muestra por el CT40, 11 o 70 que tienen el mismo nivel de expresion a traves de todo el desarrollo de la fibra. Del mismo modo, genes conocidos que codifican actina, endoxiloglucan transferasa o Suc sintasa tambien muestran niveles de ARN invariables a lo largo del desarrollo de la fibra (Shimizu et al., 1997).
Ya que la iniciacion se produce principalmente antes de la antesis hasta 1 DPA, sugiere que genes con un pico de expresion durante este tiempo pueden tener un papel en la iniciacion de la fibra. CT 4, 20, 22 y 11 tienen patrones de expresion que indican su implicacion en esta etapa.
Una limitacion de la base de datos EST actual del algodon es la ausencia de ESTs que se extrajeron a partir de la flor en la etapa de iniciacion (hay una biblioteca que se saco de ovario 1DPA pero de pobre calidad) la mayona de ESTs se tomaron solo mas tarde, entre 6 y 20 DPA. Esta composicion EST puede explicar porque la mayona de los genes elegidos tienen un patron de expresion que indica su asociacion con la etapa de alargamiento.
Papel de los genes seleccionados en el desarrollo de la fibra, posibles mecanismos.- Los 23 agrupamientos asociados a fibra se pueden clasificar en 6 categonas funcionales de acuerdo a sus homologfas de secuencia con protemas y enzimas conocidas (Tabla 3, mas arriba). La clasificacion se hizo segun el consorcio GO (
www.geneontology.org/). El grupo mas grande comprende secuencias unicas sin homologfa con cualquier protema conocida. El resto de los agrupamientos se clasificaron de acuerdo a categonas conocidas por estar asociadas con el desarrollo de la fibra. Dos genes (Tabla 3, mas arriba) se clasificaron dentro de una categona compromiso de destino celular: un nuevo gen que pertenece al factor de transcripcion MYB y un gen de algodon homologo a GL3 que se sabe que estan implicados en el desarrollo de tricoma en arabidopsis. El patron de expresion de ambos genes y el fenotipo del transgen CT20 tanto en plantas T1 de arabidopsis como en tomate apoyan su implicacion principalmente en la fase de iniciacion.
Pruebas acumulativas ligan los genes MYB de algodon con el desarrollo de la fibra (Suo. J. et. al. 2003, Cerdoni. M. L. et. al. 2003, Loguerico L.L. et al 1999). La sobre-expresion de un numero de genes que funcionan en la misma ruta relacionada con la fase de iniciacion, puede ademas inducir la iniciacion. Kirik et al. (2004) mostro que sobre-
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expresando dos o tres genes de la fase de iniciacion aumentan el numero de tricomas y pelos de ra^z. Los genes que se relacionan con la fase de iniciacion se pueden usar para uniformidad de la iniciacion de la fibra en la semilla de algodon, iniciar mas de las celulas epidermicas de semillas en fibras. Se puede usar la sobre-expresion de esos genes en meristemos vegetativos como tallos y hojas como proteccion frente a insectos (como se ha mostrado en la colza,
www.westerngrains.com/news/nr 050413.html) y estreses a-bioticos. Sin embargo, no hay evidencia sustancial que pruebe la implicacion directa de cualquier gen MYB en el desarrollo de la fibra.
Otros dos genes (Tabla 3, mas arriba) son factores de transcripcion de las familias MYB y MADS BOX. Muchos estudios demostraron la funcion de estas dos familias de factores de transcripcion como genes homeoticos con papel clave en diferentes procesos de desarrollo, entre ellos estan la morfogenesis del tricoma y de la fibra (Suo. J. et. al. 2003, Ferrario. S. et. al. 2004). Su papel en etapas tempranas del desarrollo de la fibra se apoya tambien por su patron de expresion de ARN, que, se induce antes, y durante el dfa de antesis. Un gen (CT 2, Tabla 3, mas arriba) se clasifico en las rutas del metabolismo del almidon y la sacarosa. Un trabajo reciente demuestra que otro gen (SUS), que, pertenece a esta ruta, es un factor limitante tanto en la iniciacion de la fibra como en el desarrollo. CT_40, 75 se clasificaron como de transporte de lfpidos cuya expresion de ARN esta altamente inducida durante la etapa temprana de alargamiento de la fibra ligado al hecho de que los lfpidos son componentes clave en la formacion de la fibra. Varios genes (Tabla 3, mas arriba, CT_4, 70, 71) se clasificaron o como genes implicados en la a desecacion, respuesta a salinidad estimulada por acido absdsico o como genes implicados en la transferencia de electrones. De ellos, se seleccionaron 3 genes (CT 7, 9 y 49) por patron de expresion de ARN por ser inducidos en la etapa de alargamiento. Varios estudios consideran cambios en los mecanismos de bomba de proton y potasio como factor clave en la rapida velocidad de crecimiento de la fibra (Smart L. B. et. al. 1998). Combinar la sobre- expresion de varios genes que se relacionan con el alargamiento de la fibra como genes relacionados con el metabolismo de almidon y sacarosa que aumentaran la formacion de la pared celular, con genes de transporte de lfpidos o genes relacionados con la desecacion que puedan influir en la presion de la celula, podna dar como resultado fibras mas largas que sobre-expresar un solo gen.
Ejemplo 9
Clonacion y analisis de secuencias promotoras corriente arriba de los genes de la presente invencion
La expresion genica diferencial en tejidos de fibra frente a otros tejidos en algodon es el resultado de una regulacion genica complicada. Las regiones genomicas corriente arriba de los 23 genes seleccionados se predijo que posefan actividades promotoras que dirigen la expresion genica en celulas de fibra de forma cuantitativa y cualitativa unicas. Una expresion genica precisa, dirigida a celulas de fibra, es crucial para el desarrollo de plantas de algodon con un rendimiento mejorado de fibra, sin afectar negativamente a otros tejidos de la planta.
Procedimientos experimentales
Clonacion de secuencias promotoras.- La secuencia genomica corriente arriba de CT2 y CT6 se clonaron a partir de ADN genomico de algodon (Gossypium hirsutum L. var Acala), como sigue. Se extrajo el ADN genomico total de tejidos de las hojas de la plante de 4 semanas de edad de plantas de algodon cultivadas (Gossypium hirsutum L. var Acala), usando el Kit de extraccion de ADN (Dneasy plant mini kit, Qiagen, Alemania). Se realizaron PCR inversa (IPCR), digestion de ADN, auto-ligacion, y reaccion de PCR sobre ADN genomico, siguiendo el protocolo comun (
www.pmci.unimelb.edu.au/core facilities/manual/mb390.asp) con las siguientes modificaciones. Para evitar errores en la IPCR, se identifico primero la secuencia genomica de la secuencia 5' de un cDNA relevante (es decir, incluyendo intrones) para producir Genomic Island (GI). La region deseada del ADN genomico se amplifico por PCR usando cebadores de oligonucleotidos directos disenados en base a la secuencia del agrupamiento de cDNa (para CT_2 y CT_6, las secuencias GI son, respectivamente, como se establece en SEQ ID NOs. 74 y 75 para CT_2 y CT_6. Los cebadores son como se establecen en SEQ ID NOs. 14-15 (CT_2) y 101-102 CT_6). La reaccion de PcR se realizo en un termociclador de ADN, usando protocolos comunes de PCR. Por ejemplo:
92°C/3 min ^ 31 x [94°C/30 seg ^ 56°C/30 seg ^ 72°C/3 min] ^ 72°C/10 min).
Los productos de PCR se purificaron usando el kit de purificacion de PCR (Qiagen) y se realizo la secuenciacion de los productos de PCR, usando el secuenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc.).
En algunos casos, se uso una tecnica diferente [UP-PCR (Dominguez y Lopez-Larrea 1994)] cuando la IPCR da como resultado una pobre amplificacion. Se uso la tecnica de UP-PCR con el fin de amplificar una region corriente arriba desconocida de secuencias de agrupamientos conocidas. Normalmente, el procedimiento implica cuatro cebadores de oligonucleotidos: dos cebadores espedficos de secuencia (SPs, externo e interno) (enumerados a continuacion), ambos con la misma orientacion del extremo 3' hacia la desconocida, pero deseada, region 5' del gen, y dos cebadores universales caminantes (WP28 5'-TTTTTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGGTGT (SEQ ID NO. 76 y sWP 5'-TTTTTGTTTGTTGTGGG, SEQ ID NO. 77). Las reacciones se llevaron a cabo usando las siguientes mezclas de reaccion: mezcla de la muestra (SM)- Se anadio ADN genomico de especies de algodon (30-40 ng), cebadores WP28 (20 pmol), y agua doblemente destilada hasta un volumen final de 10 g.l. Mezcla de la polimerasa (PM)- Se anadieron dNTPs (Roche, Suiza, 10 nmol cada uno), mezcla Expand Long Template Enzyme (Roche, Suiza, 1 U), tampon 10 x suplementado con la enzima y agua doblemente destilada hasta un volumen final de 8 g.l.
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Las SMs se colocaron en un termociclador (Biometra, E.E.U.U.), donde se sometieron a un programa de amplificacion de 1 minuto a 90°C, se mantuvieron (pausa) a 80°C hasta que se anadio PM, 30 seg a 15°C, 10 minutos a 25°C, 3 minutos a 68°C, se mantuvieron a 90°C hasta que se anadio SP externo (2 |il de concentracion 10 |iM). El proceso se siguio por reaccion de PCR externa de 30 segundos a 92°C, 10 segundos a 94°C, 30 segundos a 65,5°C, 3 minutos a 68°C, durante 30 ciclos seguido de extension final de 10 minutos a 68°C.
El producto de la PCR externa diluido 5.000-25.000 veces se uso como un molde, y se efectuo la amplificacion por PCR usando cebadores espedficos internos sWP y SP (30 pmol de cada uno), 1 U de Ex Taq (Takara), en un volumen de reaccion de 50 |il. La reaccion de PCR interna se sometio a un programa de amplificacion de 2 minutos a 92°C, seguido de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 58°C, y 3 minutos a 72°C durante 30 ciclos y una extension final de 10 minutos a 72°C. Los productos de IPCR/Up-PCR se purificaron (PCR Purification Kit, Qiagen, Alemania) y se secuenciaron (secuenciador ABI 377, Amersham Biosciences Inc.).
Los cebadores para CT_2 fueron como sigue (UP-PCR):
Cebadores externos:
sWP28- 5-TTTTTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGGTGT-3' (SEQ ID NO. 78)
SP (Externo)- 5'-CTGGGGTTACTTGCTAATGG-3' (SEQ ID NO: 79)
Cebadores internos (anidados):
sWP- 5'-TTTTTGTTTGTTGTGGG-3' (SEQ ID NO: 80)
SP (Interno)- 5'-GCTCCGGGCTTTGGTTAACG-3' (SEQ ID NO: 81)
La secuencia genomica interna de CT_2 resultante del procedimiento anterior se proporciona en la SEQ ID NO: 14. Los cebadores para CT_6 fueron como sigue (UP-PCR):
Cebadores externos:
sWP28- 5'-TTTTTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGGTGT-3' (SEQ ID NO. 78)
SP (Externo)- 5'-GGCTTTGGGATGTTTGAGGTGG-3' (SEQ ID NO. 82)
Cebadores internos (anidados):
sWP- 5'-TTTTTGTTTGTTGTGGG-3' (SEQ ID NO: 83)
SP (Interno)- 5'-GGTGGTGGGCTCTTGCAACAG-3' (SEQ ID NO: 84)
La secuencia genomica interna de CT_2 resultante del procedimiento anterior se proporciona en la SEQ ID NO: 85.
Para clonar los promotores y los 5' UTRs supuestos, se llevo a cabo una amplificacion por PCR usando un nuevo conjunto de cebadores (debajo) en los que habfa una extension de 8-12 pb que inclrna un sitio de restriccion (HindIII, SalI, XbaI, BamHI, o SmaI) en el extremo 5'. Para cada promotor, se seleccionaron sitios de restriccion que no existfan en la secuencia promotora. Ademas, los sitios de restriccion en las secuencias cebadoras se disenaron de manera que los productos de PCR resultantes fueran clonados en el vector binario pPI en la orientacion correcta, corriente arriba del gen marcador GUS.
El plasmido pPI se construyo insertando una secuencia senal de poli-(A) sintetica, procedente del vector plasmfdico basico pGL3 (Promega, N° Acc. U47295; 4658-4811 pb) en el sitio de restriccion HindIII del vector binario pBI101.3 (Clontech, N° Acceso U12640).
A continuacion se presentan los cebadores usados para la amplificacion y clonacion del promotor y del 5' UTR (P+U) dentro de pPI, y la secuencia amplificada y clonada. Los sitios de restriccion dentro de cada cebador se muestran en letras en negrita:
CT_2:
P+U directo (HindIII): 5'-ATTCAAGCTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGG-3' (SEQ ID NO: 86)
P+U inverso (BamHI): 5'- TTGGATCCTTGGGCATTGAGCTTCTGTAC-3' (SEQ ID NO: 87)
La secuencia P+U de CT_2 es como se expone en SEQ ID NO: 88.
CT6:
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P+U directo (Hindlll): 5'- TTAAAGCTTTGGGCTCTTGCAACAGAGGC-3' (SEQ ID NO: 89)
P+U inverso (BamHI): 5'-AAGGATCCGACGACGACAACAACAACAAC-3' (SEQ ID NO: 90)
La secuencia P+U de CT_6 es como se expone en SEQ ID NO: 91.
Se uso ADN genomico o el producto IPCR/UP-PCR como ADN molde para la amplificacion por PCR, usando los cebadores de oligonucleotidos nuevamente disenados. Los productos de PCR se purificaron (PCR Purification Kit, Qiagen, Alemania) y se digirieron con los sitios de restriccion existentes en los cebadores (Roche, Suiza). Los productos de PCR digeridos se re-purificaron y se clonaron en el vector binario pPI, que se digirio con las mismas enzimas de restriccion. El producto de PCR y el vector plasmfdico abierto se ligaron usando la enzima ADN ligasa de T4 (Roche, Suiza).
Ejemplo 10
Transformar celulas de Agobacterium tumefaciens con vectores binarios que albergan promotores de fibra de algodon
Se uso el vector binario pPI, que incluye o el promotor de CT2 o el de CT6, corriente arriba del gen marcador GUS para transformar celulas de Agrobacterium.
Los vectores binarios se introdujeron en celulas competentes GV301 o LB4404 de Agrobacterium tumefaciens (aproximadamente 109 celulas/ml) mediante electroporacion. La electroporacion se realizo usando un electroporador MicroPulser (Biorad), cubetas de 0,2 cm (Biorad) y el programa de electroporacion EC-2 (Biorad). Las celulas tratadas se cultivaron en medio lfquido LB a 28°C durante 3 h, despues se plaquearon sobre LB agar suplementado con gentamicina (50 mg/l; para cepas de Agrobacterium GV301) o estreptomicina (300 mg/l; para la cepa de Agrobacterium LB4404) y kanamicina (50 mg/l) a 28°C durante 48 h. Se analizaron las colonias de Agrobacterium que se desarrollaron en el medio selectivo por PCR usando los cebadores expuestos en las SEQ ID NOs: 70-71, que se disenaron para abarcar la secuencia insertada en el plasmido pPI. Los productos de PCR resultantes se aislaron y secuenciaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 4, para verificar que se introdujeron apropiadamente las secuencias correctas en las celulas de Agrobacterium.
Ejemplo 11
Los promotores espedficos de fibra de algodon se expresan en hojas de tomate y frutos de tomate Se efectuo la tincion de GUS para ilustrar la expresion espedfica en tricomas y frutos de tomate.
Procedimientos expeimentales
Transformacion de plantas de tomate Micro-Tom con el supuesto promotor de algodon.- Como se describe anteriormente.
Transformacion de plantas de Arabidopsis thaliana con el supuesto promotor de algodon.- Como se describe anteriormente.
Tincion de GUS de Arabidopsis.- La tincion de GUS de plantas de Arabidopsis se efectuo como se describio previamente (Jefferson RA. et. al. 1987, Meissner et. al. 2000).
Tincion de GUS de hojas de tomate. La tincion de GUS de plantas de tomate se efectuo como se describio previamente (Jefferson Ra. et. al. 1987, Meissnet et. al. 2000).
La fijacion del tejido se efctuo de la siguiente manera. Las hojas de tomate se sumergieron en acetona al 90%, helada, despues se incubaron en hielo durante 15-20 minutos seguido de la eliminacion de la acetona. A partir de entonces el tejido se enjuago dos veces con la Solucion de Trabajo [tampon Fosfato Sodico (Sigma. E.E.U.U.) 100 mM pH=7, Ferricianida (Sigma. E.E.U.U.) 5 mM, Ferrocianida (Sigma. E.E.U.U.) 5 mM, EDTA (BioLab) pH=8 1 mM, Triton X-100 (Sigma. E.E.U.U.) al 1%] durante 15-20 minutos en la oscuridad. A continuacion se retiro la solucion de lavado y se reemplazo con solucion de tincion de X-gluc [Solucion de Trabajo + acido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D- glucuronico (X-GlcA, Duchefa) solubilizado en N,N-dimetilformamida (BioLab) 0,75 mg/ml, Ditiotreitol (BioLab) 100 mM] y se incubo durante toda la noche a 37°C en la oscuridad (tubos envueltos con papel de aluminio). La destincion se efectuo hundiendo el tejido vegetal en etanol al 70% y calentando a 50°C ~120 minutos. La etapa de destincion se repitio hasta que el tejido vegetal se volvio transparente excluyendo las regiones tenidas de azul. Las plantas destenidas se almacenaron en etanol (BioLab) al 70% a temperatura ambiente.
Tincion de GAS de frutos de tomate.- La tincion de Gus de frutos de tomate se efectuo como se describio previamente (Jefferson RA. et. al. 1987, Meissner et. al. 2000). Brevemente: se sumergieron laminas finas de fruto de tomate en solucion de tincion [tampon Fosfato Sodico (Sigma. E.E.U.U.) 100 mM pH=8, Ferricianida (Sigma. E.E.U.U.) 5 mM, Ferrocianida (Sigma. E.E.U.U.) 5 mM, EDtA (BioLab) pH=8 15 mM, Metanol (BioLab) al 20%, acido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucuronico (X-GlcA, Duchefa) solubilizado en N,N-dimetilformamida (BioLab) 0,75
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mg/ml] en la oscuridad (tubos envueltos con papel de aluminio) e incubados durante toda la noche a 37°C. La destincion se efectuo hundiendo el tejido vegetal en etanol al 70% y calentando a 50°C ~20 minutos. La etapa de destincion se repitio hasta que la lamina de fruto se volvio transparente excepto por las regiones tenidas de azul. Los frutos destenidos se almacenaron en etanol (BioLab) al 70% a temperature ambiente.
Resultados
Se realizo la tincion de GUS en semillas de plantas de tomate T1.
GUS se expreso bajo la regulacion de CT2 y CT6, promotores en las plantas de tomate transformadas geneticamente (Figuras 7a-b).
Los resultados para la generacion de tomate T1 se resumen en la Tabla 10, a continuacion. Tabla 10
Promotor
N° de plantas T1 independientes Hoja Tricoma de hoja Cubierta de semilla de fruto joven Cubierta de semilla de verde maduro Cubierta de semilla de fruto maduro
CT2
cuatro 0 2 3 5 3
CT6
uno 0 1 1 2,5 1
Los numeros representan el grado promedio, 0- no expresado, 5-alta expresion
Ejemplo 12
Pelo de semilla de tomate como un sistema modelo para fibras de algodon
La modificacion genetica del algodon es larga y consume tiempo. Por lo tanto para encontrar genes que son capaces de mejorar el rendimiento y calidad de la fibra de algodon, existe una necesidad de un sistema modelo para el desarrollo de fibra de algodon en otras plantas.
Las celulas de tricoma y el pelo de rafz comparten caractensticas comunes con las celulas de fibra de algodon, y son ampliamente aceptados como sistemas modelo para el desarrollo de la fibra de algodon [Revisado en Wagner. G. J. et. al. (2004) y Wang et al. 2004].
Sin embargo medir cambios en velocidad de crecimiento, longitud y grosor asf como otros parametros estructurales no es una tarea facil debido al pequeno tamano, remota accesibilidad y falta de uniformidad en tamanos de las celulas de tricoma.
Para superar estas limitaciones, se analizaron pelos de semilla de tomate para su posible uso como un tejido modelo para el desarrollo de la fibra de algodon. Para este fin, se sobre-expreso el gen marcador GUS bajo la regulacion del elemento promotor espedfico de fibra de algodon derivado de CT2, como se describe anteriormente.
Se efectuo la transformacion en el tomate del constructo primario, la regeneracion de la planta y la tincion de GUS como se describe anteriormente.
Los pelos de la semilla de tomate (Figura 8a) son celulas epidermicas maternales, que cubren la superficie del ovulo de las semillas. En aspectos anatomicos, el pelo de la semilla de tomate esta mas cerca de las fibras de algodon que cualquiera de las celulas de tricoma o del pelo de la rafz.
Se produjeron 4 frutos de tomate transgenicos independientes que sobre-expresan el gen GUS bajo el promotor espedfico de algodon CT_2. Se observo tincion de GUS de frutos en la etapa de maduro-verde (fruto en su tamano justo antes del proceso de maduracion) unicamente en la envoltura de la semilla, donde se esta desarrollando el pelo de la semilla (Figuras 7a y b).
Se produjeron cinco frutos de tomate transgenico independientes que sobre-expresan 35S-expansina (AF043284), y se midio la longitud del pelo de semilla y se comparo con el wt. El pelo de semilla de plantas transgenicas era significativamente mas largo que el del wt (Figuras 8a y b).
Tabla 11
Planta
Numero de plantas independientes Longitud de pelo de semilla (mm)
WT
3 0,300±0,019
35S:expansina
5 0,357±0,017 (Figura 8b)
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Referencias citadas por nombre del autor en la solicitud
(se citan otras referencias en el documento)
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Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    10
    15
    20
    1. Un metodo para mejorar el alargamiento de la fibra de una planta productora de fibra, metodo que comprende expresar en la planta productora de fibra un polinucleotido exogeno que comprende una secuencia de acido nucleico que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el polinucleotido de longitud completa expuesto en la SEQ ID NO: 19, mejorando de este modo el alargamiento de la fibra de la planta productora de fibra.
  2. 2. Un metodo para mejorar el alargamiento de la fibra de una planta productora de fibra, metodo que comprende expresar en la planta productora de fibra un polinucleotido exogeno que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 121, mejorando de este modo el alargamiento de la fibra de la planta productora de fibra.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en donde dicho polinucleotido exogeno se liga dentro de un constructo de acido nucleico que comprende un promotor capaz de regular la expresion de dicho polinucleotido en una celula vegetal, en donde dicho promotor es heterologo a dicha celula vegetal.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1 o 3, en donde dicho polinucleotido se expone en la SEQ ID NO: 19.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 3, en donde dicho promotor se expone en la SEQ ID NO: 74, 75, 85 o 91 o un equivalente funcional del mismo.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 3, en donde dicho promotor es un promotor constitutivo.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 3, en donde dicho promotor es un promotor inducible.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 3, en donde dicho promotor es un promotor espedfico de etapa de desarrollo o un promotor espedfico de tejido.
  9. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la planta es una planta monocotiledonea.
  10. 10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la planta es una planta dicotiledonea.
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