ES2661569T3

ES2661569T3 - Proteínas de unión al factor H (fHbp) con propiedades alteradas y métodos de uso de las mismas

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Publication number: ES2661569T3
Application number: ES11766478.9T
Authority: ES
Inventors: Peter T. Beernink; Dan M. Granoff; Rolando Pajon Feyt
Original assignee: Childrens Hospital Oakland Research Center
Current assignee: Childrens Hospital Oakland Research Center
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-29
Publication date: 2018-04-02
Anticipated expiration: 2031-03-29
Also published as: US10905754B2; CN105315351A; CN102834410A; BR122021020829B1; US9439957B2; AU2015203798B2; BR122021020829B8; US20120288517A1; EP3327028B1; WO2011126863A1; US10342860B2; BR122022015250B1; CA2790167C; EP2552942B1; US20110256180A1; ES2910199T3; EP2552942A1; EP3327028A1; EP4036104A1; AU2011238670A1

Abstract

Una composicion inmunogenica que comprende una proteina de union al factor H (fHbp) no natural derivada de fHbp ID1 (que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1) y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con SEQ ID NO: 1, en la que la fHbp no natural tiene una sustitucion de aminoacido en la posicion R41, y en la que dicha fHbp no natural tiene una afinidad inferior por el factor H humano (fH) que la fHbp ID1, y genera anticuerpos bactericidas contra N. meningitidis; en la que la sustitucion de aminoacido en R41 es R41S o R41A; o en la que la composicion comprende un adyuvante seleccionado de hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, MF59TM, una emulsion de aceite en agua, monofosforil lipido A o una saponina; o en la que la composicion comprende vesiculas de la membrana externa de Neisseria meningitidis modificadas geneticamente para expresar la fHbp; o en la que la composicion comprende microvesiculas de Neisseria meningitidis modificadas geneticamente para expresar la fHbp.

Description

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cepa 8047, fHbp ID 77) y la fHBP de variante 3 (v.3) (de la cepa M1239, fHbp ID 28) difieren en -1 y +7 restos de aminoácidos, respectivamente, de la de MC58 (fHbp ID 1), la numeración usada para referirse a restos para las proteínas fHbp v.2 y v.3 difiere de la numeración basada en las secuencias de aminoácidos reales de estas proteínas. Así pues, por ejemplo, la referencia a un resto de leucina (L) en la posición 166 de la secuencia de fHBP

v.2 o v.3 se refiere al resto de la posición 165 de la proteína v.2 y en la posición 173 en la proteína v.3.

El factor humano H ("fH humano"), como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 9B (SEQ ID NO: 9), y variantes alélicas humanas natural de la misma.

El término "heterólogo" o “quimérico” se refiere a dos componentes que están definidos por estructuras derivadas de diferentes fuentes o secuencias progenitoras. Por ejemplo, cuando se usa "heterólogo" en el contexto de un polipéptido quimérico, el polipéptido quimérico puede incluir secuencias de aminoácidos unidas operativamente que se pueden derivar de diferentes polipéptidos de diferentes grupos filogénicos (por ejemplo, un primer componente de una secuencia de aminoácidos progenitora α y un segundo componente de una secuencia de aminoácidos progenitora β). Un polipéptido quimérico que contiene dos o más segmentos definidos, cada uno de los cuales es de un progenitor diferente, puede ser natural o artificial (de origen no natural). Véase Beernink P. T., Granoff D. M. (2009) Microbiology 155:2873-83 para más detalles sobre quimeras naturales. Las quimeras no naturales se refieren a "quimeras artificiales", y engloban fHbp con componentes heterólogos que no se encuentran en la naturaleza.

Un polipéptido "heterólogo" o "quimérico" también puede contener dos o más componentes diferentes, cada uno derivado de una fHbp diferente (por ejemplo, la variante 1, 2 o 3). El componente puede estar unido operativamente en cualquier posición a lo largo del polipéptido fHbp.

"Heterólogo" en el contexto de un polinucleótido que codifica cualquier polipéptido quimérico descrito anteriormente puede incluir la secuencia de ácido nucleico unida operativamente que puede derivarse de diferentes genes (por ejemplo, un primer componente de un ácido nucleico que codifica un polipéptido fHBP v.1 y un segundo componente de un ácido nucleico que codifica un polipéptido fHBP v.2) o diferentes secuencias de aminoácidos progenitoras (α o β).

Otros ejemplos de ácidos nucleicos "heterólogos" incluyen construcciones de expresión en las que un ácido nucleico que comprende una secuencia codificante está unido operativamente a un elemento regulador (por ejemplo, un promotor) que es de un origen genético diferente del de la secuencia codificante (por ejemplo, proporcionar la expresión en una célula hospedadora de interés, que puede ser de diferente origen genético en relación con el promotor, la secuencia codificante o ambos). Por ejemplo, se dice que un promotor T7 unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido fHbp o dominio del mismo es un ácido nucleico heterólogo.

"Heterólogo" en el contexto de las células recombinantes puede referirse a la presencia de un ácido nucleico (o producto génico, tal como un polipéptido) que es de un origen genético diferente al de la célula hospedadora en la que está presente. Por ejemplo, un aminoácido o una secuencia de ácido nucleico de Neisseria de una cepa es heterólogo a un hospedador de Neisseria de otra cepa.

Derivada de", en el contexto de una secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótido (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos "derivada de" fHbp ID 1) pretende indicar que el polipéptido o el ácido nucleico tiene una secuencia que se basa en la de un polipéptido o ácido nucleico de referencia (por ejemplo, una proteína fHBP natural o ácido nucleico codificante), y no pretende limitarse a la fuente ni al método en el que se crea la proteína o el ácido nucleico. Los ejemplos no limitantes de polipéptidos de referencia y polinucleótidos de referencia a partir de los que se puede derivar una secuencia de aminoácidos o una secuencia de polinucleótidos incluyen una fHbp natural, fHbp ID1 y una fHbp no natural. "Derivada de" en el contexto de las cepas bacterianas pretende indicar que una cepa se obtuvo a través del paso in vivo, o en cultivo in vitro, de una cepa parental y/o es una célula recombinante obtenida mediante la modificación de una cepa parental.

"Sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere a una sustitución de un resto de aminoácido con otro que comparte las propiedades químicas y físicas de la cadena lateral de aminoácidos (por ejemplo, carga, tamaño, hidrofobicidad/hidrofilidad). Las "sustituciones conservativas" pretenden incluir la sustitución dentro de los siguientes grupos de restos de aminoácidos: Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Se puede obtener orientación para dichas sustituciones de las alineaciones de secuencias de aminoácidos de polipéptidos que presentan el epítopo de interés.

La expresión "inmunidad protectora" significa que un programa de vacunación o inmunización que se administra a un mamífero induce una respuesta inmune que previene, retrasa el desarrollo de o reduce la gravedad de una enfermedad que está causada por Neisseria meningitidis, o disminuye o elimina por completo los síntomas de la enfermedad. La inmunidad protectora puede estar acompañada por la producción de anticuerpos bactericidas. Cabe señalar que la producción de anticuerpos bactericidas contra Neisseria meningitidis se acepta en el campo como predictiva de un efecto protector de la vacuna en seres humanos (Goldschneider et al. (1969) J. Exp. Med. 129:1307; Borrow et al. (2001) Infect Immun. 69:1568).

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La actividad bactericida se midió con complemento humano contra la cepa H44/76; en los Estudios 3, 5 y 6, los ratones fueron inmunizados con tres dosis de vacuna. En el Estudio 4, se administró una dosis.

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p < 0,05 dp < 0,05 ep = 0,01

EJEMPLO 4: IDENTIFICACIÓN DE UNA VARIANTE DE FHBP NATURAL CON UNIÓN A FH REDUCIDA

En estudios de unión a fH por variantes de fHbp naturales dentro de la subfamilia B descrita anteriormente (Fletcher et al (2004) Infect Immun 72:2088-2100), también denominado grupo de variante 1 (Masignani et al. (2003) supra), las proteínas recombinantes de dos variantes de fHbp, ID 14 y 15, mostraron significativamente menos unión a fH dependiente de la concentración que la de la proteína fHbp ID 1 (Figura 8). Por el contrario, la fHbp ID 14 mostró la unión esperada dependiente de la concentración con anticuerpos monoclonales anti-fHbp JAR 4 y JAR 5, y fHbp ID 15 mostró la unión esperada con anticuerpos monoclonales anti-fHbp JAR 5, pero no con JAR 4 (Nota, no era de esperar que fHbp ID 15 se uniera con JAR 4, porque esta proteína carece del epítopo) (Beernink et al. (2009) Mol Immunol 46:1647-1653; Pajon et al. (2009) Vaccine 28:2122-2129)).

Los datos previos indicaron que la fHbp representativa de los grupos de variantes 1, 2 o 3 mostró una unión respectiva similar con fH (Shaughnessy J. et al. (2009) Infect Immun 77:2094-103). Como tal, no era de esperar la unión reducida de fH por dos variantes de fHbp naturales (fHbp ID 14 y 15 como se muestra en la Figura 8).

Los datos obtenidos según lo representado en la Figura 8 que muestran baja unión a fH por dos variantes de fHbp naturales indican que los restos amino que contribuyen a dicha unión a fH inferior se pueden identificar mediante análisis de alineaciones de las secuencias de aminoácidos de fHbp de altos y bajos aglutinantes de fH. Esta estrategia sería diferente de una dirigida a restos conservados, tales como los restos E218A y E239A.

Las variantes de fHbp se pueden subclasificar de acuerdo con diferentes combinaciones de cinco segmentos variables, cada uno derivado de uno de dos linajes genéticos, denominados tipos α o β (Pajon et al. (2009) Vaccine 28:2122; Beernink y Granoff (2009) Microbiology 155:2873-83). fHbp ID 1 con alta unión a fH e ID 14 con baja unión a fH están ambos en el grupo modular I (los cinco segmentos son tipos alfa). Por el contrario, el segundo aglutinante bajo de fH, fHbp ID 15, está en el grupo modular IV, que son quimeras naturales (con un segmento A de tipo β y segmentos B, C, D y E de tipo α). Por lo tanto, como control para el segmento A de tipo β del péptido ID 15, se usó la secuencia del péptido variante ID 28 de unión a fH alta de forma natural, que contiene solo segmentos β (grupo modular II). Las respectivas alineaciones de aminoácidos se muestran en las Figuras 19A y 19D. Con fines de comparación de las secuencias de las diferentes variantes, los restos específicos se denominan en el presente documento basándose en la numeración de fHbp ID1. Uno de estos restos de aminoácidos, serina (S), en la posición 41 del segmento A (β) del péptido 15 (baja unión a fH) difería del resto de prolina (P) del segmento A β de control del péptido 28 (alta unión a fH). Un segundo aminoácido, E en la posición 241 en los segmentos E α de ambas variantes de unión a fH baja, difería del de K en la posición 241 del péptido variante 1 de alta unión a fH.

EJEMPLO 5: IDENTIFICACIÓN DE NUEVAS FHBP MUTANTES EN LA POSICIÓN 41 CON UNIÓN A FH REDUCIDA

El resto de arginina de la posición 41 (R41) formó un enlace de hidrógeno cargado con fH (Figura 9, panel A). La arginina fue reemplazada por serina para eliminar este enlace cargado (S41, panel de inserción inferior derecho). Los pocillos de las placas de microtitulación se recubrieron con fHbp ID 1 WT recombinante o R41S mutante ID 1. Mediante ELISA, el mutante R41S no se unió a fH humano (Figura 10, panel A). Los Acm anti-fHbp de control, JAR 4 y JAR 5, se unieron de forma casi idéntica tanto a las fHbp mutantes como a las fHbp de tipo silvestre (Figura 10, paneles B y C). Estos controles indicaron que se adsorbieron cantidades comparables de las respectivas proteínas en los pocillos de la placa de microtitulación. Además, la mutación R41S, que estaba en el mismo dominio y muy cerca del epítopo conformacional de fHbp reconocido por el Acm JAR 4 (Beernink P. T. (2009) Mol Immunol 46:1647-53), no afectó a la unión del Acm. Una mutación adicional en fHbp ID 1 en la que la alanina se sustituyó con arginina, R41A, tampoco se unió a fH (Figura 10A). Por lo tanto, las sustituciones distintas de la serina en la posición 41 también pueden disminuir la unión a fH.

En experimentos de resonancia de plasmón de superficie, se inmovilizó fH humano (2.400 unidades de respuesta) en un chip CM5 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) mediante acoplamiento de aminas, y se midió la unión de fHbp soluble. La proteína mutante R41S (0,5 μΜ) no mostró unión con fH (-0,6 unidades de respuesta) en comparación con +22,5 unidades de respuesta con 0,5 μΜ del respectivo antígeno fHbp de tipo silvestre, lo que confirmó de forma independiente los resultados de ELISA. La proteína mutante R41S también tuvo estabilidad térmica en comparación con la de la fHbp de tipo silvestre (Figura 7, panel B).

La mutación R41S también eliminó la unión a fH cuando la mutación se introdujo en otras variantes de secuencia de fHbp del grupo de variante 1, grupo modular I. Estas incluyeron fHbp ID 4, 9 y 74 (Figura 11, paneles A, C y E,

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a,bUsando modelos de regresión lineal general, el efecto del tipo de vacuna de fHbp R41S mutante o de tipo silvestre difirió en la concentración en suero de fH humano sobre el título bactericida, p = 0,018; c,dp > 0,5; e,fp = 0,05.

En ratones transgénicos para fH humano inmunizados, no hubo una correlación significativa entre las respuestas de

5 anticuerpos bactericidas en suero a la vacuna de fHbp mutante que no se unió a fH humano y las concentraciones de fH humano en suero (Figura 3, panel B; r = +0,17; p = 0,58), mientras que, como se ha descrito anteriormente (Figura 3, panel A), en los ratones transgénicos, hubo una correlación inversa con los títulos bactericidas generados por la vacuna de tipo silvestre que se unió a fH (r = -0,65; p = 0,02). Los respectivos coeficientes de correlación para las dos vacunas fueron significativamente diferentes entre sí (p = 0,03).

10 Se usaron modelos de regresión lineal general para confirmar si el tipo de vacuna de fHbp (fHbp de tipo silvestre o mutante R41S) o la concentración en suero de fH humano afectaba a las respuestas de anticuerpos bactericidas en suero de los ratones transgénicos. Hubo una interacción significativa entre el tipo de vacuna de fHbp y la concentración de fH humano en la respuesta bactericida (ensayo de razón de verosimilitud, p = 0,018). Basándose

15 en el modelo de regresión, se estimaron las proporciones de GMT bactericidas en suero recíprocas para los ratones transgénicos inmunizados con la vacuna de mutante R41S frente a los de los ratones transgénicos inmunizados con la vacuna de fHbp que unió a fH humano a diversas concentraciones de fH humano en suero (Figura 3, panel C). Si bien no hubo diferencias significativas en las respuestas bactericidas cuando las concentraciones de fH humano en suero fueron bajas (<250 μg/ml), las respuestas bactericidas a la vacuna de mutante R41S fueron significativamente

20 mayores cuando las concentraciones de fH en suero eran superiores (fH > 250 μg/ml, p < 0,05; fH > 316 μg/ml, p < 0,01). Dado que muchos seres humanos tienen concentraciones de fH en este intervalo (Figura 1, panel B), los resultados en los ratones transgénicos sugieren que las moléculas de fHbp mutante que no se unen a fH pueden ser vacunas superiores en seres humanos.

25 Los protocolos experimentales de diversos estudios de inmunización presentados anteriormente, así como los resultados se resumen en la siguiente tabla.

Tabla 5. Sumario de estudios de inmunización en ratones transgénicos para fH humano

Estudio: Cepa de ratones BALB/c Vacuna/s meningocócicas Unión de fH a la vacuna Resultados

1: fH humano Tg Proteína de unión al Factor H (fHbp) Sí1 Respuesta de IgG y anticuerpos bactericidas en suero inferior de los ratones Tg cuyo fH humano se unió al antígeno vacunal

Control de tipo silvestre: fHbp No2

2A: fH humano Tg fHbp Sí1 Respuestas de IgG y anticuerpos bactericidas en suero inferiores confirmadas de los ratones Tg

Control de tipo silvestre: fHbp No2

2B: fH humano Tg Conjugado de PS-CRM del Grupo C No3 Los ratones de tipo silvestre y Tg mostraron respuestas de IgG y bactericidas en suero respectivas casi idénticas hacia una vacuna meningocócica de control que no se unió a fH

Control de tipo silvestre: Conjugado de PS-CRM del Grupo C No4

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Como se muestra en la Figura 29, panel A, las sustituciones sencillas Q126A, D201A y E202A en fHbp ID 22 no redujeron significativamente la unión a fH humano. Como se muestra en la Figura 29, panel B, las mutantes Q126A, D201A y E202A conservaron la unión al Acm JAR35, lo que indica que el epítopo JAR35 se conservó en cada una de estas mutantes.

El efecto de diversas sustituciones de aminoácidos simples y dobles sobre la capacidad de fHbp ID 1, ID 22 e ID 77 para unirse al fH humano y para unirse a diversos anticuerpos monoclonales se resume en las Tablas 6 y 7.

Tabla 6 – Mutaciones que reducen la unión a fH

Acm de reactividad anti-Reducción en la fHbp Antecedentes de variante de unión a fH secuencia de fHbp (grupo Mutación de aminoácido (Número de

modular*) JAR 5 JAR 4 JAR 31 JAR 35

Figura)

ID1(I) Ninguna(WT) 0 2 2 0 0 R41S >50 (F10) 2 2 NA NA No

R41A >50 (F10) 2 NA NA

hecho R130A >50 (F15) 2 1 NA NA H119A >10(F15) 2 1 NA NA E218A >50† (F4) 2 2 NA NA E239A >10† (F4) 2 2 NA NA

E218A/E239A >50† (F4) 2 2 NA NA

ID4(I)ID9(I)ID74(I) R41S >50(F11) 2 2 NA NA R41S >50 (F11) 2 2 NA NA R41S >50 (F11) 2 2 NA NA

ID15(IV) Ninguna(WT) 0 2 0 0 0 S41P >50 (F17) 2 NA 0 NA ID 22 (III) Ninguna (WT) 0 0 2† 2 2 R80A >50 (F23) NA 0 2 2 D211A >50 (F23) NA 2 2 2 E218A >50 (F23) NA 2 2 2 E248A >50 (F23) NA 1 2 2

G236I >50 (F27) NA 0 1 2 T221A/H223A >50 (F27) NA 2 2 2 ID 77 (VI) Ninguna (WT) 0 0 2† 2 0

R41S/K113A >10 (F21) NA 1 2 NA R41S/K119A >5 (F21) NA 1 2 NA R41S/D121A >10 (F21) NA 1 2 NA

R41S/K113A/D121A >50 (F22) NA 0 2 NA

*Grupo modular basado en los linajes de cinco segmentos variables, véase la Figura 16. Los grupos modulares I y

IV son del grupo de variante 1 antigénico; los grupos modulares III y VI son del grupo de variante 2 antigénico.

En comparación con la unión del Acm con la respectiva variante de secuencia; 0, sin unión significativa por el Acm;

1, unión reducida (reducción > 30 %); 2, unión similar o superior (reducción < 30 %).

†: JAR 4 se une aproximadamente un 30% menos a la variante 2 de fHbp (es decir, ID 22 o 77) que a la variante 1 (es decir, ID 1)

†: Figura 5 de la publicación de patente de EE.UU. n.º 2006/0029621 **NA, no aplicable; para la reactividad de los Acm, el anticuerpo no se une a la respectiva variante de secuencia de tipo silvestre.

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Tabla 7. Mutaciones que no reducen significativamente la unión a fH

Acm anti-fHbp Reducción en Antecedentes de la unión a fH

Mutación de

variante de secuencia de (Número de JAR5 JAR4 JAR31 JAR35 aminoácido

fHbp (grupo modular*) Figura)

ID1(I) Ninguna 0 2 2 0

0 (tipo silvestre) K241E 0 (F14) 2 2 NA NA Q87A 0 22NA NA Q113A 0 22NA NA I114A/S117A 0 2 2 NA NA

G121R 0 22NA NA

Ninguna (tipo 0 2 0 0 0 ID 15 (IV) silvestre)_ E241K 0 (F14) 2 NA NA NA

ID 19 (VI) Ninguna 0 0 2 (tipo silvestre)

R41S 0(F12) NA 1 2 NA

0(F28) NA 1 2 2Q38A R41S

ID22(III) 0(F28) NA 1 2 2

A235G 0(F28) NA 1 2 2

Q126A 0(F29) NA 2 2 2 D201A 0(F29) NA 1 1 2 E202A 0(F29) NA 1 2 2

R41S 0 (F12) NA ND*** 2 NA K113A 0 (F20) NA ND 2 NA ID 77 (VI) K119A 0 (F20) NA ND 2 NA D121A 0 (F20) NA ND 2 NA

*Grupo modular basado en los linajes de cinco segmentos variables, véase la Figura 16. Los grupos modulares I y IV son del grupo de variante 1 antigénico; los grupos modulares III y VI son del grupo de variante 2 antigénico. *En comparación con la unión a fH por la respectiva variante de fHbp de tipo silvestre. ¶En comparación con la unión a la respectiva variante de secuencia de tipo silvestre; 0, sin unión significativa por el Acm; 1, unión reducida (reducción > 30 %); 2, unión similar o superior (reducción < 30 %). **NA, no aplicable; el Acm no se une a la respectiva variante de secuencia de tipo silvestre. ***ND, no ensayado

Como se muestra en la Figura 30, panel A, las sustituciones sencillas E218A en fHbp ID 28 redujeron la unión a fH humano en comparación con la unión de fH por fHbp ID 28 de tipo silvestre. También como se muestra en la Figura 30, panel A, las sustituciones sencillas E197A, K245A y D201A en fHbp ID 28 no redujeron significativamente la

5 unión a fH. La Figura 30, panel B, muestra la unión del antisuero ID28 anti-fHbp policlonal de ratón a las diversas proteínas (fHbp WT; sustituciones sencillas E197A, K245A y D201A en fHbp ID 28). Los datos presentados en la Figura 30, panel B indican que las diversas fHbp están presentes en la placa de ELISA en cantidades similares. Como se muestra en la Figura 30, paneles C y D, la mutante E218A se unió a los Acm JAR 31 y JAR 33, lo que indica que se conservan las configuraciones globales de los epítopos reconocidos por estos Acm.

10 La inmunogenicidad global de las fHbp mutantes puede determinarse mediante la administración de los mutantes como vacunas a los ratones de tipo silvestre cuyo fH nativo no se une a las vacunas mutantes o de tipo silvestre. Los datos generados en este modelo proporcionan una evaluación global de si los epítopos importantes para generar anticuerpos bactericidas en suero se retienen o no en la vacuna de mutante. Por ejemplo, la mutante

15 E218A/E239A en fHbp ID1 eliminó la unión con fH humano, pero en múltiples estudios tuvo una capacidad alterada para generar respuestas de anticuerpos bactericidas en ratones WT (Tabla 2, anterior). Los experimentos de inmunogenicidad se llevan a cabo como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Los títulos de anticuerpos IgG y bactericidas se miden y se comparan con los niveles correspondientes encontrados en ratones que han recibido los correspondientes controles de tipo silvestre y/o negativos. Si los epítopos críticos necesarios para generar la

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Otros datos adicionales sobre la inhibición de fH por los anticuerpos anti-fHbp son importantes para la actividad bactericida. Ocho de nueve aislamientos meningocócicos africanos ensayados eran susceptibles a la actividad bactericida de un antisuero de ratones inmunizados con una vacuna de vesículas de membrana externa nativa prototipo (NOMV) preparada a partir de un mutante de la cepa H44/76 del grupo B con fHbp ID 1 sobreexpresada (Tabla 11). Por el contrario, los nueve aislados fueron resistentes al antisuero de ratones inmunizados con la vacuna recombinante de fHbp ID 1 (títulos bactericidas < 1:10) y solo uno de los nueve aislamientos fue destruido por el antisuero de control de ratones inmunizados con la vacuna de NOMV del mutante fHbp KO (X5, título 1:36). La mezcla del antisuero de fHbp KO de NOMV con el antisuero con la vacuna recombinante de fHbp ID 1 no aumentó la actividad bactericida contra ninguna de las cepas de ensayo (Tabla 11). Por lo tanto, los anticuerpos anti-fHbp generados por la vacuna NOMV con fHbp sobreexpresada parecían ser responsables de la actividad bactericida contra los aislados con variantes de secuencia de fHbp que no coincidían con la fHbp ID 1 en la vacuna de NOMV. Tampoco hubo evidencia de actividad bactericida cooperativa éntrelos anticuerpos contra fHbp y anticuerpos contra otros antígenos en la vacuna de NOMV.

Tabla 11. Actividad bactericida de sueros de ratones inmunizados con una vacuna de vesículas de membrana externa nativas de la cepa del grupo B H44/76 con fHbp ID 1 sobreexpresada

Cepa de ensayo (fHbp. ID)*: 1/título en suero de vacuna de fHbp recombinante 1/título en suero de vacuna de NOMV fHbp KO fHbp ID 1 sobreexpresada

fHbp homóloga*: fHbp ID 1

A3 (ID 5): <10 <10 <10 818 12.204 4066 7680 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 132

A14 (ID 5): <10 114

W1 (ID 9): <10 <10

W3 (ID 9): <10 43

X3 (ID 74): <10 574

X5 (ID 74): 36 640

X7 (ID 74): <10 324

Las cepas A3 y A14 son grupo capsular A, W1 y W3 son grupo capsular W-135, y X3, X5 y X7 son grupo capsular X; todas las cepas eran aislados clínicos de pacientes con enfermedad meningocócica de África subsahariana.

Actividad bactericida (complemento humano) de sueros almacenados de ratones inmunizados en un estudio publicado previamente (Koeberling, Vaccine 2007, supra) con vacunas de fHbp recombinante o NOMV preparadas de mutantes de la cepa H44/76 del grupo B con sobreexpresión de fHbp ID 1. Los títulos son las medias de la dilución del suero para una reducción del 50 % en UFC/ml tras una h de incubación con complemento humano medida en al menos dos ensayos independientes. **Título con la respectiva vacuna de fHbp recombinante ID 5, 9 o 74 del de la cepa de ensayo.

La amplia actividad bactericida anti-fHbp de reacción cruzada en suero inducida por la vacuna de NOMV mutante está asociada con respuestas de anticuerpos anti-fHbp más elevadas y un mayor bloqueo de la unión de fH a fHbp que la vacuna de fHbp recombinante. Mediante ELISA, los ratones inmunizados con la vacuna de NOMV del mutante con fHbp ID 1 sobreexpresada tuvieron concentraciones de anticuerpo anti-fHbp ID 1 en suero mayores que los ratones inmunizados con la vacuna de fHbp ID 1 recombinante (medias geométricas respectivas de 2.203 y 746 U/ml, p < 0,02, Figura 43, Panel A). Mediante ELISA, los sueros de los ratones inmunizados con la vacuna de NOMV mutante también mostraron una mayor inhibición de la unión de fH a fHbp ID 4, que era la variante de secuencia expresada por las cepas del grupo A (Figura 43, Panel B, p < 0,05 en cada dilución ensayada). El aumento de la inhibición de fH no fue solo resultado de las concentraciones en suero de anti-fHbp más altas en el grupo de vacuna de NOMV mutante, porque, como media, la concentración de anticuerpos anti-fHbp requerida para la inhibición de fH en este grupo fue casi 4 veces menor que en el grupo de vacuna fHbp ID 1 recombinante (respectivas medias geométricas de 1,17 frente a 4,04 U/ml, p < 0,05, Figura 43, Panel C).

Figura 43, Panel A Respuestas del anticuerpo anti-fHbp a la vacunación según lo medido por ELISA (Panel A), y la capacidad de los anticuerpos anti-fHbp en suero para inhibir la unión de fH a fHbp (Paneles B y C, también mediante ELISA). Los ratones se inmunizaron con vacuna de fHbp ID1 recombinante (triángulos rellenos) o vacunas de NOMV preparadas a partir de mutantes de la cepa H44/76 del grupo B con sobreexpresión de fHbp ID 1 (círculos vacíos) o una fHbp desactivada (círculos rellenos). Para la vacuna de fHbp recombinante y la vacuna de NOMV con fHbp ID 1 sobreexpresada, cada símbolo (Panel A y C) representa el resultado de un ratón individual (10 ratones por grupo de vacuna). Para la vacuna NOMV fHbp KO, cada símbolo representa los resultados del ensayo de los sueros combinados de 3 a 4 animales individuales. A) Concentraciones de anticuerpo anti-fHbp ID 1 en unidades arbitrarias por ml. El grupo de vacuna de NOMV OE tuvo una mayor media geométrica de la concentración (línea horizontal) que los ratones inmunizados con la vacuna de fHbp recombinante (p = 0,02). B) Inhibición de la unión de fH a fHbp

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Claims

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