MX2014008988A - Promotores para aumento de expresion de proteinas en meningococo. - Google Patents

Abstract

Se describen nuevos promotores para conducir la transcripción en meningococo, por ejemplo, para la sobre-expresión de antígenos de proteína para retención en vesículas de membrana. Promotores porA modificados carecen de la secuencia poli-G tipo salvaje que puede provocar la variación de fase. Genes de codificación de ARNr meningocócico (por ejemplo, para ARNr de 16S) se pueden usar para conducir la transcripción de un gen de codificación de proteína. Estos enfoques pueden ser usados en combinación.

Description

PROMOTORES PARA AUMENTO DE EXPRESION DE PROTEINAS EN MENINGOCOCO CAMPO DE LA INVENCION Esta invención está en el campo de promotores para controlar la transcripción en bacterias meningocócicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Neisseria meningitidis es una causa de meningitis bacteriana. Un enfoque para la vacunación meningocócica se basa en vesículas de membrana exterior (OMV, por sus siglas en inglés) , tal como se usa en el producto MeNZB ™ de Novartis y el producto MENBVAC™ del Instituto Noruego de Salud Pública, ambos de los cuales son generados por tratamiento con detergente de meningococos .

Es conocido cambiar la composición de proteínas de membranas externas meningocócicas, y por lo tanto para cambiar la composición de las OMV. La supresión de genes indeseables y la sobre-expresión de genes deseables ambas se han descrito. Las referencias 1-3 informan de estudios preclínicos de una vacuna de OMV en la que fHbp (también conocido como GNA1870) es sobre-expresado (y esta sobre-expresión se puede combinar con supresión de LpxLl [4] ) . La referencia 5 informó de un estudio clínico de cinco formulaciones de una vacuna de OMV en la que PorA y FrpB son suprimidos y Hsf y TbpA son sobre-expresados . La referencia REF. : 249768 6 informa de un ensayo clínico en fase I de una vacuna de vesículas de menibrana exterior nativa preparada a partir de bacterias que tienen genes synX y lpxLl inactivados, fHbp sobre-expresado, dos proteínas PorA diferentes y expresión de OPCA estabilizada. La referencia 7 informa de una vacuna de vesículas de membrana exterior nativa trivalente preparada a partir de bacterias que tienen genes synX y lpxLl inactivados (y, en dos casos, IgtA inactivado) , dos proteínas PorA diferentes, y NadA o fHbp sobre-expresado . La inactivación de genes tales como lpxLl es importante si se generarán vesículas por métodos que no eliminan LPS.

Estos cambios en la composición de la proteína pueden efectuarse de diversas maneras. Por ejemplo, las bacterias se pueden cultivar bajo condiciones de limitación de hierro con el fin de estimular la expresión de ciertas proteínas relacionadas con el metabolismo del hierro. Otras técnicas pueden implicar la ingeniería de las bacterias. Por ejemplo, la referencia 8 indica que promotores fuertes (tales como los promotores porA, porB, IGTF, o hpuAB) pueden ser usados para sobre-regular la expresión de proteínas de membrana exterior de protección, o que los mecanismos de control de la transcripción supresores podrían ser eliminados La referencia 9 sugiere que los genes pueden ser manipulados para eliminar su variabilidad de fase. El promotor porA se usa en la referencia 7 para sobre-expresar NadA, mientras que fHbp fue sobre-expresado usando el promotor tac.

Un objeto de la invención es proporcionar más y mejores formas de modificar la expresión de proteínas en los meningococos, y, en particular proporcionar promotores para conducir la expresión de genes de interés. La sobre-regulación se puede usar para aumentar los niveles de proteínas útiles en las OMV.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 ilustra los niveles de expresión de fHbp en la misma cepa de fondo (NZ98/254) usando cinco diferentes promotores y la cepa de punto de referencia que sobre-expresa el mismo alelo fHbp en el mismo fondo [112, 113] . Una alelo variante 2 de fHbp se sobre-expresa en la cepa de punto de referencia o de cualquiera de las 2 variantes de fase tipo salvaje del promotor porA, ya sea con 11 Gs o 13 Gs en el tracto separador o con el promotores de porA ST1, ST2 y ST3 modificados como se indica. Western Blot de cantidades equivalentes de proteína total se cargaron desde 0.5x hasta 2x como se indica para cada cepa, y la flecha muestra fHbp.

Las figuras 2A-2C ilustran el análisis comparativo de la expresión de fHbp de promotores modificados porA y 16S. La cepa NZ98/254 que expresa la variante 2 de fHBP bajo el control de los promotores indicados se cultivó en placas (Figura 2A) y en líquido a fase logarítmica (Figura 2B) y estacionaria (Figura 2C) y los niveles de expresión de fHBP se midieron mediante Western blot a partir de cultivos duplicados (#1, #2) o de la cepa de sobre-expresión de referencia. La flecha ininterrumpida muestra fHbp, mientras que la flecha rota inferior muestra un control de carga.

Las figuras 3A-3B muestran la expresión de fHbp a partir de tres cepas: (a) una supresión de AlpxLl; (b) supresión de AsynX; y (c) una doble supresión de AlpxLlAsynX. En todos los casos, los genes eliminados fueron reemplazados por fHbp bajo el control de un promotor PorA modificado. La expresión de fHbp se evaluó mediante Western blot de extractos celulares en bruto usando suero anti-fHbp, y se comparó con Hfq como control. La figura 3A muestra la inmunotransferencia de tipo Western, y la figura 3B cuantifica la expresión en unidades arbitrarias.

Las figuras 4A-4B muestran los niveles de fHbp en vesículas aisladas de cepas de supresión (i) de AlpxLlAsynX y (ii) de AlpxLlAsynXAmltA. La figura 4A muestra el rendimiento en mg/OD, y la figura 4B es una Western blot de 0.5ug de vesículas.

La figura 5 muestra la expresión de fHbp en dos cepas que sobre-expresan ya sea fHbp variante 1 o variante 2 en locus distintos (líneas c y d) o una cepa que sobre-expresa tanto la variante 1 como la variante 2 en los respectivos locus (línea e) . La línea A es la cepa tipo salvaje, y la línea b es supresión de AfHbp de esa cepa.

La figura 6 muestra SDS-PAGE teñido con plata de vesículas purificadas a partir de la triple supresión.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Un primer aspecto de la invención usa promotores porA modificados para conducir la transcripción. El promotor de porA natural, tal como se usa en los ejemplos 10-16 de la referencia 8, contiene una secuencia poli^-G entre sus regiones -35 y -10, pero esta secuencia puede causar la variación de fase y por lo tanto la expresión a partir del promotor de porA natural puede ser inestable. Los promotores de porA modificados de la invención son mejorados porque carecen de la secuencia poli-G tipo salvaje.

Por lo tanto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende un promotor que incluye (i) una región -10 de un promotor del gen porA meningocócico y/o (ii) una región -35 de un promotor del gen porA meningocócico , en donde la región -10 y la región -35 están separadas por una secuencia de intervención (o separación) de 12-20 nucleótidos, y en donde la secuencia de intervención o bien no contiene ninguna secuencia de poli -guanidina o incluye una secuencia de poli -guanidina que tiene no más de ocho nucleótidos de guanidina consecutivos.

Un segundo aspecto de la invención usa promotores de un gen de codificación de AR r meningocócico (tal como el gen de AR r 16S) para conducir la transcripción de un gen de codificación de proteínas. Por lo tanto, la invención también proporciona un ácido nucleico que comprende un promotor unido operativamente a un gen de codificación de proteínas hacia el extremo 3', en donde el promotor incluye (i) una región -10 del promotor del gen de ARNr meningocócico y/o (ii) una región -35 del promotor del gen de ARNr meningocócico.

La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una región promotora de un promotor del gen de ARNr unido operativamente a un gen de codificación de proteínas que tiene una UTR 5' que contiene elementos reguladores de la traducción para la expresión de la proteína. La región promotora puede incluir (i) una región -10 de un promotor del gen de ARNr meningocócico, (ii) una región -35 de un promotor del gen de ARNr meningocócico, y (iii) una UTR 5' de un gen tal como el gen porA.

La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende un promotor que incluye SEQ ID NO: 18, o una variante de SEQ ID NO: 18 que difiere de SEQ ID NO: 18 por hasta 4 (es decir 1, 2, 3, ó 4) inserciones, supresiones o sustituciones de un solo nucleótido.

Los promotores de porA y ARNr puede ser usados en forma híbrida, por ejemplo, para tener una región -10 de un promotor de porA y una región -35 de un promotor de ARNr (que puede ser una región -35 de consenso) . Por lo tanto, la invención también proporciona un ácido nucleico que comprende un promotor que incluye ya sea (i) una región -10 de un gen de ARNr meningocócico y una región -35 de un gen porA meningocócico, o (ii) una región -10 de un gen porA meningocócico y una región -35 de un gen de ARNr meningocócico.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden estar presentes en una bacteria, y en particular en un meningococo. Los promotores pueden dirigir la expresión de genes de codificación de proteínas hacia el extremo 3' (en particular, genes que codifican para proteínas de membrana exterior) a los que están unidos operativamente, y las bacterias pueden usarse para preparar vacunas (en particular, vacunas a base de vesículas) . La invención también proporciona estas bacterias, estas vesículas y estas vacunas.

Promotores de la invención Las dos secuencias esenciales en promotores bacterianos son la región -10 (también conocida como la caja de Pribnow) y la región -35. Estas están separadas por una secuencia de intervención, y entre la región -10 y el sitio de inicio de la transcripción (+1) está una secuencia hacia el extremo 5' no transcrita corta.

El promotor de PorA se ha estudiado en detalle. La referencia 10 informa de una región -35 de 6 meros, seguida por una secuencia de intervención de 16 meros o 17 meros, luego una caja de Pribnow de 7 meros, luego una secuencia hacia el extremo 5' no transcrita de 7 meros, seguida por un nucleótido transcrito +1. El codón de inicio en el gen porA tipo salvaje está en el nucleótido +59 del transcrito, y esta separación de 59 meros se confirmó en le referencia 8.

Cuando un promotor de la invención incluye una región -10 de un promotor del gen porA meningocócico, esto es típicamente un TATAAT de 6 merosos, es decir, una región -10 de 6 meros típica.

Cuando un promotor de la invención incluye una región -35 de un promotor del gen porA meningocócico, esto es típicamente un TGGTTT o ATGGTT de 6 meros.

La secuencia de intervención entre una región -35 y una región -10 puede tener entre 12-20 nucleótidos, por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nucleótidos. Una secuencia de intervención de 16, 17 ó 18 nucleótidos es típica .

La corta secuencia hacia el extremo 5' no transcrita tiene típicamente entre 5-10 nucleótidos, por ejemplo 6, 7 ó 8 nucleótidos. Puede ser rica en G:C, por ejemplo, al menos la mitad de los nucleótidos en la secuencia son G o C, por ejemplo, al menos 3 residuos G/C en una secuencia hacia el extremo 5' no transcrita de 6 meros.

Así, un promotor puede incluir una región -35 de 6 meros, una secuencia de intervención de 16 meros o 17 meros, una región -10 de 6 meros, y una secuencia hacia el extremo 5' de 6 meros o 7 meros no transcrita, dando 34, 35 ó 36 nucleótidos del promotor central en total .

Un promotor puede, por supuesto, continuar hacia el extremo 5' de la región -35. Las secuencias hacia el extremo 5' de la región -35 pueden ser importantes para la expresión de alto nivel del promotor, o para la regulación de la expresión de los promotores. Por ejemplo, en promotores de ARNr las secuencias hacia el extremo 5' del promotor central llamadas elementos UP pueden dar cuenta de su excepcional fuerza aumentando la transcripción tanto como 300 veces [11, 12] . Estas pueden ser reconocidas por la subunidad a del núcleo de la ARN polimerasa. Así, un promotor de la invención puede incluir un elemento UP hacia el extremo 5', que por lo general será rico en A:T. Del mismo modo, un promotor de la invención puede incluir un CREN hacia el extremo 5' (elemento regulador de contacto de Neisseria) [13] .

Cuando un promotor de la invención incluye una región -35 y/o una región -10 de un promotor del gen porA, la secuencia corta hacia el extremo 5' no transcrita puede ser TGAAGAC .

Cuando un promotor de la invención incluye una región -35 y/o una región -10 de un promotor del gen porA, la secuencia de intervención puede ser variada, como se muestra en los ejemplos. Por ejemplo, puede ser TTTGCGGGGGGGGGGG (tipo salvaje de 16 meros; SEQ ID NO: 26) o TTTGCGGGGGGGGGGGGG (tipo salvaje de 18 meros; SEQ ID NO: 17), pero estas secuencias de tipo salvaje no se prefieren. Más bien, la secuencia poli-G de 11 meros o 13 meros en este 16 meros o 18 meros puede ser interrumpida por nucleótido (s) no G. Dos secuencias de intervención preferidas son TTTGCGAGGGAGGTGG (16 meros; SEQ ID NO: 27) y TTTTGCGAGGGAGGTGG (17 meros; SEQ ID NO : 28) .

En algunas modalidades, la secuencia de intervención no contiene ninguna secuencia de poli-guanidina, es decir, no hay dinucleótido GG dentro de la secuencia de intervención. En otras modalidades, la secuencia de intervención puede contener una secuencia de poli-guanidina, pero contiene no más de ocho nucleótidos de guanidina consecutivos, es decir, que no incluye una secuencia GGGGGGGG Idealmente, la secuencia de intervención no incluye una secuencia GGGGGGG. Idealmente, la secuencia de intervención no incluye una secuencia GGGGGG. Idealmente, la secuencia de intervención no incluye una secuencia GGGGG. Idealmente, la secuencia de intervención no incluye una secuencia GGGG. La secuencia de intervención puede incluir un trinucleótido GGG o un dinucleótido GG. Así, una secuencia poli-G dentro de la secuencia de intervención se extendería por no más de 8 nucleótidos en total, e idealmente no tiene más de tres residuos de guanidina consecutivos.

Cuando un promotor de la invención incluye una región -10 de un promotor de gen de ARNr meningocócico, esto es típicamente una TATAAT de 6 meros, es decir, una región -10 de 6 meros típica.

Cuando un promotor de la invención incluye una región -35 de un promotor de gen de ARNr meningocócico, esto es típicamente una TTGACA de 6 meros (que es una región -35 de consenso) .

Cuando un promotor de la invención incluye una región -35 y/o una región -10 de un promotor de gen de ARNr meningocócico, la secuencia de intervención puede ser GGCGGAAGGAATACTT (SEQ ID NO: 29) .

Cuando un promotor de la invención incluye una región -35 y/o una región -10 de un promotor de gen de ARNr, la secuencia corta hacia el extremo 5' no transcrita puede ser TCGCAAC.

Los promotores de porA y ARNr se pueden usar en forma híbrida, y un promotor útil incluye una región -35 de un gen de ARNr (por ejemplo, TTGACA) , una secuencia de intervención modificada a partir de un gen porA (por ejemplo, TTTGCGAGGGAGGTGG; SEQ ID NO: 27) , una caja de Pribnow típica (TATAAT) y una secuencia corta hacia el extremo 5' no transcrita de un gen porA (por ejemplo, TGAAGAC) . Así, el promotor puede incluir SEQ ID NO: 30 (TTGACATTTGCGAGGGAGGTGGTATAATTGAAGAC) .

En algunas modalidades, el promotor incluye SEQ ID NO: 18 (un fragmento de 35 meros inmediatamente antes del sitio de inicio de la transcripción del promotor de ARMr 16S meningocócico tipo salvaje) . Esta secuencia se puede modificar por 1, 2, 3 ó 4 inserciones, supresiones o sustituciones de un solo nucleótido dentro de los 35 meros, como se muestra en la presente.

Cuando están presentes en forma de ADN funcional dentro de una bacteria estos promotores se unen operativamente a una secuencia que codifica para una proteína de interés, cuya transcripción está controlada por el promotor. La invención puede usarse para expresar cualquier proteína de interés, pero la proteína es adecuadamente una proteína de membrana exterior que puede ser retenida en las vesículas. Ejemplos adecuados de proteínas de membrana exterior se dan a continuación, pero la invención no se usa preferiblemente para dirigir la expresión de un transcrito que codifica para una proteína de membrana exterior PorA.

En una secuencia de ADN de codificación, hacia el extremo 3' de un promotor de la invención, el ADN incluye un sitio de inicio de transcripción, seguido por una región no traducida 5' (que típicamente incluye una secuencia de Shine-Dalgarno) y luego un codón de inicio para la proteína codificada de interés.

Cuando el promotor es de un gen de AR r, el inicio de la secuencia transcrita idealmente se deriva de un gen que codifica para proteína en lugar de a partir de un gen de ARNr.

Así, el promotor de ARNr (por ejemplo, SEQ ID NO: 18 o variantes) se puede fusionar a la UTR 5' de un gen de codificación de proteína meningocócica . En algunas modalidades, el promotor de ARNr se fusiona a la UTR 5' de un gen porA (un 58 mero), y esta UTR 5' se fusiona entonces con la secuencia de codificación de un gen de interés. La UTR 5' debe incluir elementos reguladores de la traducción que permitan la traducción de la proteína a partir del gen que codifica para la proteína. Por lo tanto esta modalidad usa el promotor de ARNr para producir un transcrito que codifica para proteína que puede ser traducido. Las secuencias hacia el extremo 3' del promotor, dentro de la UTR 5' , pueden ser importantes para la regulación de la transcripción o efectos post-transcripcionales sobre la expresión de los genes hacia el extremo 3' .

La UTR 5' de un gen porA también se puede usar con un promotor de porA modificado de la invención, de tal manera que el promotor de porA modificado sea enlazado a una UTR 5' de un gen porA, que luego sea fusionado a la secuencia de codificación para una proteína de interés.

Una UTR 5 ' de porA útil puede incluir la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39, a saber, GTATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTACAAAAGGAAGCC, o una secuencia que difiera de SEQ ID NO: 39 por hasta 5 (es decir, 1, 2, 3, 4 ó 5) inserciones, supresiones o sustituciones de un solo nucleótido.

Se apreciará que las discusiones de secuencias promotoras en el presente documento se refieren a la hebra en sentido. En el ADN de doble hebra, a partir del cual tiene lugar la transcripción, el promotor tiene una hebra complementaria. Cuando se dice que dos elementos promotores son separados por '?' nucleótidos, esto es de nuevo una referencia al número de nucleótidos en la hebra en sentido; en el ADN de doble hebra el elemento será separado por 'n' pares de bases. Si se dice que un elemento promotor carece de un residuo de guanidina, esto es de nuevo una referencia a la hebra en sentido; en el ADN de doble hebra, por ejemplo, un promotor libre de guanidina podría incluir un residuo de guanidina, pero sólo como una base complementaria en la hebra en antisentido para un residuo de citosina en la hebra en sentido. Aunque la invención se describe por referencia a la hebra en sentido, el alcance de la invención incluye ácidos nucleicos de doble hebra que incluyen tales hebras en sentido, así como ácidos nucleicos de hebra sencilla que incluyen tales hebras en sentido o que incluyen formas en antisentido de estas hebras en sentido (estas hebras en antisentido pueden, por supuesto, ser usadas para preparar las hebras en sentido, mediante técnicas estándares) .

Vesículas La invención es particularmente útil en la preparación de vesículas meningocócicas , es decir, cualquier vesícula proteoliposómica obtenida por la ruptura de o la formación de ampollasa partir de una membrana exterior meningocócica para formar vesículas de la misma que retengan antígenos de la membrana exterior. Así, el término incluye, por ejemplo, las OMV (a veces denominadas 'ampollas'), microvesículas (MVs [14]) y ' OMVs nativas' ('NOMVs1 [15]).

MVs y NOMVs son vesículas de membrana de origen natural que se forman de manera espontánea durante el crecimiento bacteriano y se liberan en el medio de cultivo. Las MV pueden ser obtenidas cultivando Neisseria en un medio de cultivo de caldo, separando las células enteras a partir de las MV más pequeñas en el medio de cultivo de caldo (por ejemplo, por filtración o por centrifugación a baja velocidad para sedimentar solamente las células y no las vesículas más pequeñas) , y luego recogiendo las MV del medio agotado de células (por ejemplo, por filtración, por precipitación diferencial o agregación de MVs, por centrifugación a alta velocidad para sedimentar las MV) . Las cepas para usarse en la producción de MVs pueden ser generalmente seleccionadas sobre la base de la cantidad de MVs producidas en cultivo; por ejemplo, las referencias 16 y 17 describen Neisseria con una alta producción de MV.

Otra técnica útil para la producción espontánea de vesículas de membrana exterior es inactivar el gen mltA en un meningococo, como se describe en la referencia 18. Estas bacterias mutantes liberan vesículas en su medio de cultivo durante el crecimiento.

Las OMV se preparan artificialmente a partir de bacterias, y se pueden preparar usando tratamiento con detergente (por ejemplo, con desoxicolato) , o por medios no detergentes (por ejemplo, véase la referencia 19) . Las técnicas para formar las OMV incluyen el tratamiento de bacterias con un detergente de sales de ácido biliar (por ejemplo, sales de ácido litocólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., con desoxicolato de sodio [20 y 21], siendo preferido para el tratamiento de Neisseria) a un pH suficientemente alto como para no precipitar el detergente [22] . Otras técnicas pueden llevarse a cabo sustancialmente en ausencia de detergente [19] usando técnicas tales como sonicación, homogeneización, microfluidización, cavitación, choque osmótico, trituración, prensa francesa, combinación, etc. Los métodos que no usan detergente o usan un bajo nivel de detergente pueden retener antígenos útiles, tales como NspA [19]. Así, un método puede usar un amortiguador de extracción de OMV con aproximadamente 0.5% de desoxicolato o menos, por ejemplo, aproximadamente 0.2%, aproximadamente 0.1%, <0.05% o cero. Un proceso útil para la preparación de OMV se describe en la referencia 23 e implica ultrafiltración en las OMV crudas, en lugar de más bien centrifugación a alta velocidad. El proceso puede incluir una etapa de ultracentrifugación después de que tenga lugar la ultrafiltración.

Una manera conveniente de purificar vesículas es el método de filtración doble descrito en la referencia 24.

Las vesículas preferidas son aquellas que se forman espontáneamente durante el cultivo bacteriano, en lugar de las que se liberan sólo después de un tratamiento físico o químico de las bacterias. El crecimiento de meningococos que tienen un MltA inactivado es una manera preferida de producir vesículas de esta forma. La referencia 47 da a conocer otras formas de producción de cepas de hiper-formación de ampolla. Para vesículas liberadas espontáneamente es preferible usar bacterias que no produzcan LOS intacto (las vesículas extraídas con detergentes tienen niveles reducidos de LOS potencialmente reactogénico) .

Si hay lipo-oligosacárido (LOS) presente en una vesícula es posible tratar la vesícula con el fin de enlazar sus LOS y componentes de proteínas (conjugación "intra-ampolla" [48] ) .

Las vesículas pueden carecer de LOS en conjunto, o pueden carecer de LOS hexa-acilado, por ejemplo, LOS en las vesículas puede tener un número reducido de hebras acilo secundarias por molécula de LOS [25] . Por ejemplo, las vesículas pueden partir de una cepa que tenga una supresión o mutación de IpxLl lo que resulte en la producción de un LOS penta-acilado [2, 43] . LOS en una cepa puede carecer de un epítopo de lacto-N-neotetraosa, por ejemplo, puede ser una cepa de supresión de lst y/o lgtB [5] . LOS puede carecer de al menos un ácido graso unido a 0 primario tipo salvaje [26] . El LOS puede no tener una hebra a. El LOS puede comprender GlcNAc-Hep2fosfoetanolamina-KD02-Lípido A [27] .

Las vesículas pueden incluir uno, más de uno, o (preferiblemente) cero serosubtipos de PorA. La modificación de meningococo para proporcionar muíti-PorA OMVs se conoce, por ejemplo, de la referencia 28, que da a conocer la construcción de vesículas a partir de cepas modificadas para expresar seis subtipos diferentes de PorA, y de la referencia 29. Por el contrario, la modificación para eliminar PorA también se conoce, por ejemplo, de la referencia 5.

Las vesículas pueden estar libres de uno o ambos de PorA y FrpB. Las vesículas preferidas están libres de PorA.

Las vesículas pueden carecer de sacárido capsular.

Por ejemplo, pueden ser derivadas de una cepa que tenga uno o más de los genes para la biosíntesis de la cápsula y/o exportación desactivada (por ejemplo, synX) .

La invención puede ser usada con mezclas de vesículas de diferentes cepas. Por ejemplo, la referencia 30 describe una vacuna que comprende composiciones de vesículas meningocócicas multivalentes , que comprende una primera vesícula derivada de una cepa meningocócica con un serosubtipo prevalente en un país de uso, y una segunda vesícula derivada de una cepa que no tiene que tener un serosubtipo prevalente en un país de uso. La referencia 31 también da a conocer combinaciones útiles de diferentes vesículas. Una combinación de vesículas de cepas en cada uno de los inmunotipos L2 y L3 se puede usar en algunas modalidades.

Sobre-expreaion Los promotores de la invención pueden ser usados para sobre-expresar un gen de interés en meningococo. Cuando el gen codifica para un antígeno de proteína de membrana exterior, esta sobre-expresión puede usarse para proporcionar una vesícula que conserve adecuadamente ese antígeno. Tales vesículas se discuten en más detalle a continuación. Como resultado de la sobre-expresión, vesículas preparadas a partir del meningococo modificado contienen niveles más altos del antígeno o antígenos sobre-expresado (s) que los observados en un meningococo tipo salvaje correspondiente. El aumento de la expresión en las vesículas es útil al menos 10%, medido en masa del antígeno relevante por unidad de masa de vesículas, y es más útil al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100% o más.

Las modificaciones recombinantes adecuadas que pueden ser usadas para sobre-expresar un antígeno mediante el uso de promotores de la invención incluyen, pero no se limitan a: (i) sustitución de promotores; (ii) adición de genes y/o (iii) sustitución de genes. Estas tres técnicas pueden, si se desea, ser usadas en conjunto con (iv) supresión de represores.

En sustitución de promotores, el promotor que controla la expresión del gen del antígeno en una bacteria se sustituye con un promotor de la invención con el fin de proporcionar niveles más altos de expresión.

En adición de genes, una bacteria que ya expresa el antígeno recibe una segunda copia del gen relevante. Esta segunda copia puede ser integrada en el cromosoma bacteriano o puede estar en un elemento episómico tal como un plásmido. La segunda copia puede ser expresada usando un promotor de la invención. El efecto de la adición de genes es aumentar la cantidad de antígeno expresado. Cuando se usa un plásmido, es idealmente un plásmido con un alto número de copias, por ejemplo, por encima de 10, o incluso por encima de 100.

En sustitución de genes, se produce adición genes pero está acompañada por la supresión de la copia existente del gen. Por ejemplo, se usó este enfoque en la referencia 3, en donde un gen fHbp cromosómico endógeno de una bacteria fue suprimido y sustituido por una copia codificada por plásmidos (véase también la referencia 32) . La expresión de la copia de sustitución, usando un promotor de la invención, es mayor que la de la copia anterior, lo que conduce a la sobre-expresión.

En algunas modalidades la sustitución de genes se produce cuando la adición de genes está acompañada por la supresión de otro gen. Por ejemplo, cuando se requiere la supresión de un gen endógeno pero no es el gen de interés que se está sobre-expresando por el promotor de la invención.

En algunas modalidades, más de un evento de adición génica o sustitución de genes se puede producir de tal manera que la expresión de múltiples copias del gen de interés por los promotores de la invención o combinaciones de sobre-expresión de diferentes genes de interés por los promotores de la invención pueda tener lugar.

La sobre-expresión de al menos un antígeno usará un promotor de la invención, pero estos promotores pueden ser usados en conjunto con otras técnicas. Por ejemplo, los promotores pueden ser usados en conjunto con supresión de represores, en la que una proteína que reprime la expresión de un antígeno de interés es suprimida. Esta supresión significa que la represión no se produce y el antígeno de interés puede expresarse en un nivel superior.

Por ejemplo, cuando NadA es sobre-expresado, el gen nadA puede usar un promotor de la invención, pero además se puede eliminar el gen que codifique para NadR (NMB1843) . NadR una proteína represora transcripcional [33] que sub-regula o reprime el gen que codifica para NadA en todas las cepas ensayadas. La supresión de NadR resulta en la expresión constitutiva de NadA. Una forma alternativa de sobre-expresar NadA es agregar ácido 4 -hidroxifenilacético al medio de cultivo. Por lo tanto, los promotores de la invención pueden usarse como una estrategia de sobre-expresión por sí sola, o en combinación con otros enfoques.

En algunas modalidades una bacteria sobre-expresa NadA.

En algunas modalidades una bacteria sobre-expresa NHBA.

En algunas modalidades una bacteria sobre-expresa fHbp.

En algunas modalidades, una bacteria sobre-expresa tanto NHBA como NadA.

En algunas modalidades, una bacteria sobre-expresa tanto fHbp como NadA.

En algunas modalidades, una bacteria sobre-expresa tanto fHbp como NHBA.

En algunas modalidades, una bacteria sobre-expresa fHbp, NHBA y NadA.

Además de sobre-expresar NHBA y/o NadA, una bacteria puede sobre-expresar uno o más antígenos adicionales. Por ejemplo, una bacteria puede sobre-expresar uno o más de: (a) -NhhA; (b) TbpA; (c) HmbR; (d) TbpB; (e) NspA; (f) Cu,Zn-superóxido dismutasa; (g) 0mp85; (h) App y/o (i) fHbp. La sobre-exprésion de la NhhA ya se ha reportado en las referencias 5 y 34. La sobre-expresión de TbpA ya se ha reportado en las referencias 5, 34 y 35. Sobreexpresion de HmbR ya se ha reportado en la referencia 36. La sobreexpresion de TbpB ya se ha reportado en la referencia 35. La sobre-expresión de NspA ya se ha reportado en la referencia 37, en combinación con la supresión de porA y cps .

La sobre-expresión de Cu, Zn-superóxido dismutasa ya se ha reportado en la referencia 35. La sobre-expresión de fHbp ya se ha reportado en las referencias 1-3 y 32, y por un enfoque diferente (que expresa una FNR mutante constitutivamente activa) en las referencias 38 y 39. Cuando se sobre-expresa más de un antígeno, al menos un antígeno será sobre-expresado usando un promotor de la invención, y en algunas modalidades más de un antígeno se sobre-expresa usando un promotor de la invención.

En algunas modalidades, una bacteria sobre-expresa NHBA, NadA y fHbp. Estos tres antígenos son componentes de la "vacuna universal" descrita en la referencia 40 o "4CMenB" [41, 42] . En una modalidad, la expresión de NHBA es controlada por un promotor de la invención, NadR es eliminado, y la cepa expresa un FNR mutante constitutivamente activo. En otra modalidad, la expresión de NHBA es controlada por un promotor de la invención, la expresión de fHbp es controlada por un promotor de la invención, y Nadr es eliminado.

Una cepa modificada de sobre-expresión será generalmente isogénica con su cepa progenitora, a excepción de una modificación genética. Como resultado de la modificación, la expresión del antígeno de interés en la cepa modificada es mayor (en las mismas condiciones) que en la cepa progenitora.

Bacterias Como se mencionó anteriormente, las vesículas de la invención se preparan a partir de meningococos que sobre- expresan el antígeno o antígenos relevantes debido a la modificación genética, que implica al menos el uso de un promotor de la invención. La invención también proporciona estas bacterias. Pueden ser usadas para la preparación de vesículas de la invención.

Además de incluir un promotor de la invención, los meningococos puede incluir una o más modificaciones adicionales. Por ejemplo, pueden tener una supresión de uno o más de IpxLl IgtA, IgtB, porA, frpB, synX, mltA y/o lst. Por ejemplo, la referencia a 43 reporta una vacuna NOMV preparada a partir de bacterias que tienen genes synX, IpxLl y IgtA inactivados. La supresión de al menos IpxLl y Synx es particularmente útil.

La bacteria puede tener bajos niveles de endotoxina, logrados por la supresión de las enzimas implicadas en la biosíntesis de LPS [44, 45] .

La bacteria puede ser de cualquier serogrupo, por ejemplo, A, B, C, W135 o Y. Preferentemente es del serogrupo B o serogrupo W135.

La bacteria puede ser de cualquier serotipo (por ejemplo, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), cualquier serosubtipo, y cualquier inmunotipo (por ejemplo, Ll; L2 ; L3 ; L3 , 3 , 7 ; LIO; etc.). Las vesículas útilmente se pueden preparar a partir de cepas que tengan uno de los siguientes subtipos: P1.2; Pl.2,5; Pl .4 ; Pl .5 ; Pl.5,2; P1.5, C ; P1.5c,10; Pl.7,16; P1.7,16b; P1.7h,4; P1.9; P1.15; Pl.9,15; Pl.12,13; P1.13; P1.14; Pl.21,16; Pl.22,14.

La bacteria puede ser de cualquier linaje adecuado, incluyendo linajes hiperinvasi os e hipervirulentos, por ejemplo, cualquiera de los siguientes siete linajes hipervirulentos: subgrupo I; subgrupo III; subgrupo IV- 1; complejo ET-5; complejo ET-37; grupo A4 ; linaje 3. Estos linajes han sido definidos por electroforesis de enzimas multilocus (MLEE) , pero la tipificación de secuencias multilocus (MLST) también se ha usado para clasificar los meningococos [ref. 46], por ejemplo, el complejo ET-37 es el complejo ST-11 por MLST, el complejo ET-5 es ST-32 (ET-5) , linaje 3 es ST-41/44, etc.

En algunas modalidades una bacteria puede incluir una o más de las mutaciones de supresión y/o expresión descritas en las referencias 8, 37, 47 y 48. Los genes adecuados para la modificación incluyen: (a) Cps, CtrA, CTrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA y/o TbpB [8] ; (b) CtrA, CTrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA y/o TbpB; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CTrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA y/o TbpB; y (d) CtrA, Ctrb, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB y/o SynC.

Como se mencionó anteriormente, el meningococo adecuadamente no expresa un MltA activo (GNA33) , de tal manera que libera espontáneamente vesículas por ejemplo, que contienen antígenos que se expresan usando un promotor de la invención.

Idealmente, la bacteria no expresa un LPS nativo, por ejemplo, tiene un imitante o supresión de LpxLl y/o de LgtB.

Cuando la bacteria tiene una supresión, es conveniente lograr esta supresión mediante la inserción de una secuencia que incluya un promotor de la invención que controle la transcripción de una proteína de interés. Por ejemplo, el gen synX o IpxLl genómico puede ser eliminado mediante la inserción dentro de éste de una secuencia que incluya un promotor de la invención que controle la expresión de una proteína de membrana exterior tal como fHbp. Un único evento de transformación por lo tanto puede ser usado para lograr dos objetivos.

Una bacteria de la invención puede incluir un marcador de selección, por ejemplo, un marcador de resistencia a antibióticos.

Una bacteria puede tener una o más, o todas, de las siguientes características: (i) LgtB y/o GalE sub-regulado o eliminado para truncar el LOS meningocócico; (ii) TbpA sobre-regulado; (iii) NhhA sobre-regulado; (iv) Omp85 sobre- regulado; (v) LbpA sobre-regulado; (vi) NspA sobre-regulado; (vii) PorA eliminado; (viii) FrpB sub-regulado o eliminado; (ix) Opa sub-regulado o eliminado; (x) Opc sub-regulado o eliminado; (xii) complejo de genes cps suprimido. Un LOS truncado puede ser uno que no incluya un epítopo de sialil-lacto-N-neotetraosa, por ejemplo, podría ser un LOS deficiente en galactosa. El LOS puede no tener una hebra a.

Una bacteria puede tener una o más, o todas, de las siguientes características: (i) LgtA sub-regulado o eliminado; (ii) LpxLl sub-regulado o eliminado; (iii) SynX sub-regulado o eliminado; (iv) más de un subtipo de PorA, tales como dos subtipos diferentes de PorA; y/o (v) un antígeno de membrana exterior sobre-regulado, tal como NadA o fHb .

Producción de cepa La invención proporciona un proceso para la preparación de una cepa meningocócica adecuado para la preparación de vesículas, que comprende las etapas de (i) seleccionar una cepa de partida que exprese una primera cantidad de un antígeno cuando se cultive en condiciones de cultivo específicas, después (ii) modificar la cepa de partida para proporcionar una cepa modificada que incluya un promotor de la invención, en donde la cepa modificada expresa una segunda cantidad del antígeno cuando se cultiva en las mismas condiciones de cultivo específicas, la segunda cantidad siendo mayor que la primera cantidad. La segunda cantidad es útilmente al menos 10% más alta que la primera cantidad, medida en masa del antígeno relevante por unidad de masa de bacterias, y es más útilmente al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100% o más.

Este proceso puede ser seguido por una etapa de (iii) cultivar las bacterias modificadas obtenidas en la etapa (ii) para proporcionar un cultivo bacteriano.

El proceso puede también implicar etapas adicionales de manipulación genética, ya sea antes o después de la introducción de un promotor de la invención. Un promotor de la invención se puede introducir en la bacteria más de una vez, y en más de un sitio, por ejemplo con múltiples genes controlados.

La invención también proporciona un proceso para preparar una vesícula meningocócica, que comprende una etapa de tratar un cultivo bacteriano obtenido por un proceso de la invención (como se describe anteriormente) de tal manera que su membrana exterior forme vesículas. Esta etapa de tratamiento puede usar cualquiera de las técnicas descritas anteriormente.

La invención también proporciona un proceso para preparar una vesícula meningocócica, que comprende una etapa de tratar un meningococo de la invención de tal manera que su membrana exterior forme vesículas. Esta etapa de tratamiento puede usar cualquiera de las técnicas descritas anteriormente.

La invención también proporciona un proceso para preparar una vesícula meningocócica, que comprende una etapa de cultivar un meningococo de la invención bajo condiciones en las que su membrana exterior derrame espontáneamente vesículas. Por ejemplo, el meningococo podría no expresar MltA activo.

Las cepas de partida útiles están en el meningococo del serogrupo B. Tres cepas de meningococo de partida útiles para la preparación de bacterias que sobre-expresan un antígeno de interés son C58, NZ98/254 y H44/76. MC58 tiene PorA serosubtipo 1.7,16; NZ98/254 tiene serosubtipo Pl.7-2,4; y H44/76 tiene serosubtipo 1.7,16. Otras cepas con estos serosubtipos también se pueden usar.

Vectores, etc.

La invención proporciona promotores como los descritos anteriormente. Estos pueden estar presentes en un cromosoma bacteriano, o en un ácido nucleico, extra-cromosómico o episómico, por ejemplo, dentro de un plásmido. Una bacteria puede incluir una o más copias del promotor de la invención. Cuando una bacteria incluya dos copias, éstas pueden estar en el cromosoma y/o episoma(s) .

Así, la invención proporciona una bacteria que comprende (i) un cromosoma que incluye al menos un promotor de la invención y/o (ii) un episoma, tal como un plásmido, incluyendo al menos un promotor de la invención.

La invención también proporciona un vector de ácido nucleico que comprende un promotor de la invención, tal como un vector de expresión bacteriana.

Estos promotores dentro de estos vectores o bacterias pueden ser promotores 'huérfanos' sin ninguna secuencia transcribible hacia el extremo 3', pero típicamente serán unidos operativamente a una secuencia que se transcriba, y que luego se traduzca para expresar una proteína de interés.

Antígenos NHBA (antígeno de unión a heparina de Neisseria) NHBA [51] fue incluido en la secuencia genómica publicada para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [78] como gen NMB2132 (número de registro en GenBank GL7227388; SEQ ID NO: 9 en el presente documento) . Secuencias de NHBA de muchas cepas se han publicado desde entonces. Por ejemplo, formas alélicas de NHBA (referidas como proteína '287 ') se pueden ver en las Figuras 5 y 15 de la referencia 49, y en el ejemplo 13 y la figura 21 de la referencia 50 (SEQ IDs 3179 a 3184 en la misma) . También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de NHBA.

Los antígenos NHBA preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con SEQ ID NO: 9; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 9, en donde '?' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 9.

Los antígenos NHBA más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se puedan unir a un polipéptido meningocócico que consista en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9. Antígenos NHBA adecuados para su uso con la invención pueden provocar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.

La sobre-expresión de NHBA previamente se ha logrado de diversas maneras por ejemplo, introducción de un gen NHBA bajo el control de un promotor inducible por IPTG [51] .

NadA (adhesina A de Neisseria) El antígeno NadA se incluyó en la secuencia genómica publicada para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [78] como gen NMB1994 (número de registro en GenBank GL7227256; SEQ ID NO: 10 en el presente documento). Las secuencias del antígeno NadA de muchas cepas se han publicado desde entonces, y la actividad de la proteína como una adhesina de Neisseria ha sido bien documentada. También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de NadA.

Los antígenos NadA preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con SEQ ID NO: 10; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos '?' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 10, en donde 'n1 es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 10.

Los antígenos NadA más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10. Antígenos NadA adecuados para su uso con la invención pueden provocar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto. SEQ ID NO: 6 es uno de tales fragmentos.

HmbR La secuencia HmbR de longitud completa se incluye en la secuencia genómica publicada de la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [78] como gen NMB1668 (SEQ ID NO: 7 en el presente documento) . La referencia 52 reporta una secuencia HmbR de una cepa diferente (SEQ ID NO: 8 en el presente documento) , y la referencia 36 reporta una secuencia adicional (SEQ ID NO: 19 en el presente documento) . SEQ ID NOs : 7 y 8 difieren en longitud por 1 aminoácido y tienen 94.2% de identidad. SEQ ID NO: 19 es un aminoácido más corta que SEQ ID NO: 7 y tiene 99% de identidad (una inserción, siete diferencias) por CLUSTAL . La invención puede usar cualquiera de estos polipéptido HmbR.

La invención puede usar un polipéptido que comprenda una secuencia HmbR de longitud completa, pero a menudo usará un polipéptido que comprenda una secuencia HmbR parcial. Asi, en algunas modalidades, una secuencia HmbR usada de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos i% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7, en donde el valor de i es 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o más. En otras modalidades una secuencia HmbR usada de acuerdo con la invención puede comprender un fragmento de al menos j aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 7, en donde el valor de j es 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 , 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más. En otras modalidades una secuencia HmbR usada de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos (i) que tenga al menos i% de identidad de secuencia con SEQ ID NO : 7 y/o (ii) que comprenda un fragmento de al menos j aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 7.

Los fragmentos preferidos de j aminoácidos comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 7. Tales epítopos generalmente comprenderán aminoácidos que se encuentren en la superficie de HmbR. Los epítopos útiles incluyen aquellos con aminoácidos implicados en la unión de HmbR a hemoglobina, ya que los anticuerpos que se unen a estos epítopos pueden bloquear la capacidad de una bacteria para unirse a la hemoglobina hospedera. La topología de HmbR, y sus residuos funcionales críticos, se investigaron en la referencia 53. Fragmentos que conservan una secuencia de transmembrana son útiles, porque se pueden visualizar en la superficie bacteriana, por ejemplo, en vesículas. Ejemplos de largos fragmentos de HmbR corresponden a SEQ ID NO: 21 y 22. Si se usa HmbR soluble, sin embargo, se pueden usar secuencias que omitan la secuencia de transmembrana, pero que típicamente retengan epítopo(s) de la porción extracelular .

Los antígenos HmbR más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se puedan unir a un polipéptido meningocócico que consista en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7. Los antígenos HmbR adecuados para su uso con la invención pueden provocar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto. fHbp (proteína de unión a factor H) El antígeno fHbp se ha caracterizado en detalle. También se ha conocido como proteína '741' [SEQ IDs 2535 y 2536 en la ref. 50], 'NMB18701, 'GNA1870' [54-56], 'P2086', 'LP2086' u ORF2086 '[57-59]. Es naturalmente una lipoproteína y se expresa a través de todos los serogrupos de meningococos . La estructura del dominio inmunodominante del extremo C-terminal de fHbp ('fHbpC') ha sido determinada por MN [60] . Esta parte de la proteína forma un barril ß de ocho cadenas, cuyas cadenas están conectadas por lazos de longitudes variables. El barril está precedido por una corta hélice a y por una cola N-terminal flexible.

El antígeno fHbp cae en tres variantes distintas [61] y se ha encontrado que producido en suero contra una familia dada es bactericida dentro de la misma familia, pero no es activo contra cepas que expresan una de las otras dos familias, es decir, hay protección cruzada intrafamiliar, pero no protección cruzada interfamiliar. La invención puede usar una única variante de fHbp, pero útilmente incluirá una fHbp de dos o tres de las variantes. Por lo tanto se puede usar una combinación de dos o tres fHbps diferentes, seleccionadas de: (a) una primera proteína, que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos a% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1; (b) una segunda proteína, que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos b% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2; y/o. (c) una tercera proteína, que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos c% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 3.

El valor de a es al menos 85, por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, o más. El valor de b es al menos 85, por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, o más. El valor de c es al menos 85, por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, o más. Los valores de a, b y c no están intrínsecamente relacionados entre sí.

El valor de x es al menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40 , 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . El valor de y es al menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . El valor de z es al menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . Los valores de x, y y z no están intrínsecamente relacionados entre sí.

Cuando la invención usa una sola variante fHbp, una composición puede incluir un polipéptido que comprenda (a) una secuencia de aminoácidos que tenga al menos a% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1; o (b) una secuencia de aminoácidos que tenga al menos £>% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de SEQ ID NO : 2; o (c) una secuencia de aminoácidos que tenga al menos c% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de SEQ ID NO : 3.

Cuando la invención usa un fHbp de dos o tres de las variantes, una composición puede incluir una combinación de dos o tres fHbps diferentes seleccionados de: (a) un primer polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos a% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1; (b) un segundo polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos £>% de identidad de secuencia con SEQ ID NO : 2 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2; y/o (c) un tercer polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos c% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 3. El primero, segundo y tercer polipéptidos tienen diferentes secuencias de aminoácidos.

Cuando la invención usa un fHbp de dos de las variantes, una composición puede incluir tanto: (a) un primer polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos a% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1; y (b) un segundo polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos £>% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2. El primero y segundo polipéptidos tienen diferentes secuencias de aminoácidos.

Cuando la invención usa un fHbp de dos de las variantes, una composición puede incluir tanto: (a) un primer polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos a% de identidad de secuencia con SEQ ID NO : 1 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1; (b) un segundo polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos c% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 y/o que comprenda una secuencia de aminoácidos que consista en un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 3. Los primero y segundo polipéptidos tienen diferentes secuencias de aminoácidos.

Otro fHbp útil que se puede usar de acuerdo con la invención es una de las formas modificadas descritas, por ejemplo, en la referencia 62, por ejemplo, que comprende SEQ ID NO: 20 ó 23 de la misma. Estas formas modificadas pueden provocar respuestas de anticuerpos que sean ampliamente bactericidas contra meningococos . SEQ ID NO: 77 en la referencia 62 es otra secuencia de fHbp útil que se puede usar.

Una modificación útil de fHbp, incluyendo una de las secuencias mencionadas anteriormente, es una mutación que reduce o elimina la afinidad de la proteína por el factor H. Por ejemplo, las referencias 63 y 64 dan a conocer tales mutaciones en los residuos Glu-283 y/o Glu-304 por su numeración (restar 72 de este esquema de numeración para que coincida con SEQ ID NO: 1 en el presente documento) . Asimismo, las referencias 65 y 66 dan a conocer la mutación (por ejemplo, a Ser) en la posición Arg-41 por su numeración (restar 7 para que coincida con SEQ ID NO: 1) para la variante 1 y en las posiciones 80, 211, 218, 220, 222, y/o 236 por su numeración (restar 7 para que coincida con SEQ ID NO: 2) para la variante 2. Los alineamientos revelarán rápidamente los residuos correspondientes para cualquier secuencia fHbp de interés. La mutación Arg-41-Ser en las secuencias de la variante 1 es particularmente preferida.

Las proteínas fHbp en una OMV por lo general serán lipidadas, por ejemplo, en una cisteína N-terminal. En otras modalidades no serán lipidadas.

NspA (proteína A de superficie de Neisseria) El antígeno NspA se incluyó en la secuencia genómica publicada de la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [78] como gen NMB0663 (número de registro en GenBank GL7225888; SEQ ID NO: 11 en el presente documento) . El antígeno se conocía antes de las referencias 67 y 68. Las secuencias del antígeno NspA de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de NspA.

Los antígenos NspA preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con SEQ ID NO: 11; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos '?' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 11, en donde 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 11.

Los antígenos NspA más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11. Los antígenos NspA adecuados para su uso con la invención pueden provocar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.

NhhA (homólogo hia de Neisseria) El antígeno NhhA se incluyó en la secuencia genómica publicada para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [78] como gen NMB0992 (número de registro en GenBank GL7226232; SEQ ID NO: 12 en el presente documento). Las secuencias de antígeno NhhA de muchas cepas se han publicado desde, por ejemplo, las referencias 49 y 69, y varios fragmentos inmunogénicos de NhhA han sido reportados. También se conoce como Hsf .

Los antígenos NhhA preferidos para usarse con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con SEQ ID NO: 12; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos '?' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 12, en donde '?' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 12.

Los antígenos NhhA más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócica que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12. los antígenos NhhA adecuados para su uso con la invención pueden provocar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.

App (proteína de adhesión y penetración) El antígeno App se incluyó en la secuencia genómica publicada de la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [78] como gen NMB1985 (número de registro en GenBank GL7227246; SEQ ID NO: 13 en el presente documento) . Las secuencias del antigeno App de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se ha conocido como ' 0RF1' 'y 'Hap' . También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de App.

Antígenos App preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con SEQ ID NO: 13; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 13, en donde '?' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 13.

Los antígenos App más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13. Antígenos App adecuados para su uso con la invención pueden provocar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto. 0mp85 (proteína de membrana exterior de 85 kPa) El antígeno Omp85 estaba incluido en la secuencia genómica publicada para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [78] como gen NMB0182 (número de registro en GenBank GL7225401; SEQ ID NO: 14 en el presente documento) . Las secuencias de antígeno Omp85 de muchas cepas se han publicado desde entonces. Más información sobre Omp85 se puede encontrar en las referencias 70 y 71. Varios fragmentos inmunogénicos de 0mp85 también se han reportado.

Los antígenos Omp85 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con SEQ ID NO: 14; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n1 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 14, en donde 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 , 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 14.

Los antígenos OMP85 más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14. Antígenos OMP85 adecuados para su uso con la invención pueden provocar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.

TbpA El antígeno TbpA se incluyó en la secuencia genómica publicada para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [78] como gen N B0461 (número de registro en GenBank GL7225687; SEQ ID NO: 23 en el presente documento) . Las secuencias de TbpA de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de TbpA.

Los antígenos TbpA preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con SEQ ID NO: 23; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 23, en donde '?' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 , 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 23.

Los antígenos TbpA más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23. Los antígenos TbpA adecuados para su uso con la invención pueden provocar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.

TbpB El antígeno TbpB se incluyó en la secuencia genómica publicada de la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [78] como gen NMB1398 (número de registro en GenBank GL7225686; SEQ ID NO: 24 en el presente documento). Las secuencias de TbpB de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de TbpB.

Los antígenos TbpB preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con SEQ ID NO: 24; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 24, en donde '?' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 , 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 24.

Los antígenos TbpB más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24. Los antígenos TbpB adecuados para su uso con la invención pueden provocar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.

Cu, Zn-superóxido dismutasa El antígeno CU, Zn-superóxido dismutasa se incluyó en la secuencia genómica publicada de la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 [78] como gen NMB1398 (número de registro en GenBank GL7226637; SEQ ID NO: 25 en el presente documento) . Las secuencias de Cu, Zn-superóxido dismutasa de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de Cu, Zn-superóxido dismutasa.

Los antígenos de Cu, n-superóxido dismutasa preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con SEQ ID NO: 25; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos '?' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 25, en donde '?' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 25.

Los antígenos de Cu, Zn-superóxido dismutasa más útiles pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, se pueden unir a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25. Los antígenos de Cu, Zn-superóxido dismutasa adecuados para su uso con la invención pueden provocar anticuerpos anti-meningocócicos bactericidas después de su administración a un sujeto.

Composiciones farmacéuticas Las vesículas de la invención son útiles como ingredientes activos en composiciones farmacéuticas inmunogénicas para su administración a un paciente. Estas incluirán típicamente un portador farmacéuticamente aceptable, y una minuciosa discusión de tales portadores está disponible en la referencia 72.

Los volúmenes de dosificación eficaces pueden establecerse de forma rutinaria, pero una dosis humana típica de la composición tiene un volumen de aproximadamente 0.5 mi por ejemplo, para inyección intramuscular. La vacuna a base de OMV RIV se administró en un volumen de 0.5 mi [73] por inyección intramuscular en el muslo o parte superior del brazo. MeNZB™ se administra en una dosis de 0.5 mi por inyección intramuscular a la cara anterolateral del muslo o la región deltoidea del brazo. Dosis similares pueden ser usadas para otras rutas de suministro, por ejemplo, una vacuna a base de OMV intranasal para atomización puede tener un volumen de aproximadamente ???µ? o alrededor de 130µ1 por aspersión, con cuatro aspersiones administradas para dar una dosis total de aproximadamente 0.5 mi.

El pH de una composición de la invención es por lo general de entre 6 y 8, y más preferiblemente entre 6.5 y 7.5 (por ejemplo, alrededor de 7) . El pH de la vacuna a base de OMV RIVM es 7.4 [74], y se prefiere un pH <7.5 para las composiciones de la invención. La vacuna a base de OMV RIVM mantiene el pH mediante el uso de un amortiguador Tris/HCl a lOmM, y un pH estable en las composiciones de la invención se puede mantener mediante el uso de un amortiguador, por ejemplo, un amortiguador Tris, un amortiguador de citrato, amortiguador de fosfato o un amortiguador de histidina. Por lo tanto, las composiciones de la invención incluirán generalmente un amortiguador.

La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los seres humanos.

Las composiciones de la invención para su administración a pacientes son inmunogénicas , y son más preferiblemente composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ya sea ser profilácticas (es decir para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir para tratar la infección) , pero típicamente serán profilácticas. Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno(s), así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por 'cantidad inmunológicamente eficaz1, se quiere decir que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la condición de salud y física del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico tratante de la situación médica, y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos de rutina. El contenido de antígeno de las composiciones de la invención generalmente se expresará en términos de la cantidad de proteína por dosis. Una dosis de aproximadamente 0.9 mg de proteína por mi es típica para las vacunas intranasales a base en OMV.

Las composiciones de la invención pueden incluir un adyuvante inmunológico. Así, por ejemplo, pueden incluir un adyuvante de sal de aluminio o una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, una emulsión de escualeno en agua) . Sales de aluminio adecuadas incluyen hidróxidos de (por ejemplo, oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos) , (por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la referencia 75), o mezclas de los mismos. Las sales pueden adoptar cualquier forma adecuada (por ejemplo, de gel, cristalina, amorfa, etc.), con la adsorción del antígeno a la sal siendo preferida. La concentración de Al+++ en una composición para administración a un paciente es preferiblemente menos de 5mg/ml por ejemplo, =4 mg/ml, =3 mg/ml, =2 mg/ml, =1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido es entre 0.3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0.85mg/dosis . Adyuvantes de hidróxido de aluminio son particularmente adecuados para su uso con las vacunas meningocócicas .

Los meningococos afectan diversas áreas del cuerpo y por lo tanto las composiciones de la invención se pueden preparar en varias formas líquidas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones. La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo por un inhalador, usando una aspersión fina. La composición puede prepararse para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como spray o gotas. Los inyectables para administración intramuscular son típicos.

Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se envasen en formato de múltiples dosis. Los antimicrobianos como tiomersal y 2-fenoxietanol se encuentran comúnmente en las vacunas, pero se prefiere usar ya sea un conservador libre de mercurio o ningún conservador en absoluto.

Las composiciones de la invención pueden comprender un detergente por ejemplo, un Tween (polisorbato) , tal como Tween 80. Detergentes están generalmente presentes en niveles bajos por ejemplo, <0.01%.

Las composiciones de la invención pueden incluir detergente residual (por ejemplo, desoxicolato) de la preparación de OMV. La cantidad de detergente residual es preferiblemente menor que 0.4 g (más preferiblemente menos de 0.2 g) por cada µg de proteína MenB.

Si una composición de la invención incluye LOS, la cantidad de LOS es preferiblemente menor que 0.12µg (más preferiblemente menos de 0.05 g) por cada µg de proteína.

Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10+2 mg/ml de NaCl es típica, por ejemplo, aproximadamente 9 mg/ml.

Además de las vesículas de la invención, las composiciones inmunogénicas pueden incluir antígenos de proteínas solubles. Por ejemplo, una composición útil puede incluir vesículas de la invención en combinación con uno o más de (i) un antígeno NHBA (ii) un antígeno NadA y (iii) un antígeno fHbp. Por ejemplo, las vesículas se pueden mezclar con la vacuna "4C enB" (véase más arriba) . En una modalidad útil, la composición incluye fHbp tanto en forma soluble como también en forma vesicular sobre-expresada, con las dos formas siendo variantes fHbp diferentes, por ejemplo, variante 1 en forma soluble (como en 4CMenB) y variante 2 y/o 3 presente en la superficie de una vesícula, preparada a partir de bacterias que expresen la secuencia de la variante 2 ó 3 de un promotor de la invención.

Así, una composición de la invención incluye: (i) las vesículas de la invención, tales como vesículas liberadas espontáneamente que muestran una secuencia fHbp; (ii) un antígeno NHBA soluble, tal como SEQ ID NO: 4; (iii) un antígeno fHbp soluble, tal como SEQ ID NO: 5 y (iv) un antígeno NadA soluble, tal como SEQ ID NO: 6.

Métodos de tratamiento La invención también proporciona un método para desarrollar una respuesta inmune en un mamífero, que comprende administrar una composición de la invención al mamífero. La respuesta inmune es preferentemente protectora y preferiblemente implica anticuerpos. El método puede desarrollar una respuesta de refuerzo en un paciente que ya haya sido cebado contra N. meningitidis .

El mamífero es preferiblemente un ser humano. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o bebé) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferiblemente un adulto. Una vacuna destinada a los niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.

La invención también proporciona vesículas de la invención para uso como un medicamento. El medicamento se usa preferentemente para aumentar una respuesta inmune en un mamífero (es decir, es una composición inmunogénica) y es más preferentemente una vacuna.

La invención también proporciona el uso de vesículas de la invención en la fabricación de un medicamento para desarrollar una respuesta inmune en un mamífero.

Estos usos y métodos son preferentemente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por N. meningitidis, por ejemplo, meningitis bacteriana (o, más específicamente, meningocócica) , o septicemia.

Un modo de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico incluye monitorear la infección por Neisseria después de la administración de la composición de la invención. Un modo de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico incluye monitorear las respuestas inmunes contra antígenos después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención se puede determinar al administrarlas a sujetos de prueba (por ejemplo, niños 12 a 16 meses de edad o modelos de animales [76] ) y luego determinar los parámetros estándares, incluyendo anticuerpos bactericidas en suero (SBA) y títulos de ELISA (G T) . Estas respuestas inmunes serán determinadas generalmente alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y comparadas con los valores determinados antes de la administración de la composición. Se prefiere un incremento de SBA de al menos 4 veces u 8 veces. Cuando se administra más de una dosis de la composición, se puede hacer más de una determinación de la administración.

En general, las composiciones de la invención son capaces de inducir respuestas de anticuerpos bactericidas en suero después de ser administradas a un sujeto. Estas respuestas se miden convenientemente en ratones y son un indicador estándar de eficacia de la vacuna. La actividad bactericida en suero (SBA) mide la destrucción bacteriana mediada por el complemento, y se puede ensayar usando complemento de humano o conejo bebé. Las normas de la OMS requieren una vacuna induzca al menos un aumento de 4 veces en SBA en más de 90% de los receptores. MeNZB™ provoca un aumento de 4 veces en SBA 4-6 semanas después de la administración de la tercera dosis.

Las composiciones preferidas pueden conferir un título de anticuerpos en un paciente sujeto humano que sea superior al criterio para seroprotección para un porcentaje aceptable de los sujetos. Los antígenos con un título de anticuerpos asociado arriba del cual un anfitrión se considere seroconvertido contra el antígeno son bien conocidos, y tales títulos son publicados por organizaciones como la O S . Preferiblemente más del 80% de una muestra estadísticamente significativa de sujetos es seroconvertida, muy preferiblemente más de 90%, aún más preferiblemente más de 93% y lo más preferiblemente 96-100%.

Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un paciente. La administración directa puede llevarse a cabo mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal , por vía intravenosa, por vía intramuscular, o al espacio intersticial de un tejido), o por cualquier otra vía adecuada La invención puede ser usada para provocar inmunidad sistémica y/o mucosa. Se prefiere la administración intramuscular en el muslo o el brazo superior. La inyección puede ser a través de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica) , pero la inyección sin aguja puede usarse alternativamente. Una dosis por vía intramuscular típica es de 0.5 mi .

El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Dosis múltiples pueden ser usadas en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Un programa de dosis primaria puede ser seguido por un programa de dosis de refuerzo. La sincronización adecuada entre las dosis de cebado o iniciales (por ejemplo, entre 4-16 semanas) , y entre el cebado y refuerzo, se puede determinar de forma rutinaria. La vacuna RIVM a base de OMV fue probada usando un programa primario de 3 ó 4 dosis, con la vacunación a O, 2 y 8 ó 0, 1, 2 y 8 meses. MeNZB™ se administra como tres dosis a intervalos de seis semanas.

Las composiciones de la invención pueden usarse para inducir respuestas de anticuerpos bactericidas contra más de un linaje hipervirulento de meningococo. En particular, preferentemente pueden inducir respuestas bactericidas contra dos o tres de los siguientes tres linajes hipervirulentos : (i) grupo A4; (ii) complejo ET5 y (iii) linaje 3. Pueden inducir además respuestas de anticuerpos bactericidas contra uno o más de los linajes hipervirulentos del subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1 o complejo ET-37, y contra otros linajes, por ejemplo, linajes hyperinvasive . Esto no significa necesariamente que la composición puede inducir anticuerpos bactericidas contra todas y cada una de las cepas del meningococo dentro de estos linajes hipervirulento, por ejemplo, más bien, para cualquier grupo dado de cuatro de más cepas de meningococo dentro de un linaje hipervirulento en particular, los anticuerpos inducidos por la composición son bactericidas contra al menos 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90% o más) del grupo. Los grupos preferidos de cepas incluirán cepas aisladas en al menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, y CU. El suero tiene preferiblemente un título bactericida de al menos 1024 (por ejemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o más alto, preferiblemente al menos 214) , por ejemplo, el suero es capaz de matar al menos 50% de bacterias de prueba de una cepa particular cuando se diluye 1/1024.

Composiciones útiles pueden inducir respuestas bactericidas contra las siguientes cepas de meningococo del serogrupo B: (i) del grupo A4, cepa 961-5945 (B : 2b : Pl .21 , 16) y/o cepa G2136 (B:-); (ii) de complejo ET-5, cepa C58 (B:15:P1.7,16b) y/o cepa 44/76 (B : 15 : Pl .7, 16) ; (iii) de linaje 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) y/o cepa BZ198 (B :NT : - ) . Las composiciones más preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra cepas 961-5945, 44/76 y 394/98.

Las cepas 961-5945 y G2136 son ambas cepas de referencia MLST de Neisseria (ids 638 y 1002 en la ref. 77). La cepa MC58 está ampliamente disponible (por ejemplo, ATCC BAA-335) y fue la cepa secuenciada en la referencia 78. La cepa 44/76 ha sido ampliamente usada y caracterizada (por ejemplo, ref. 79) y es una de las cepas de referencia MLST de Neisseria [id 237 en ref. 77; fila 32 de la Tabla 2 en la ref. 46] . La cepa 394/98 fue aislada originalmente en Nueva Zelanda en 1998, y ha habido varios estudios publicados usando esta cepa (por ejemplo, refs. 80 y 81) . La cepa BZ198 es otra cepa de referencia MLST (id 409 en la referencia 77; fila 41 de la Tabla 2 en la referencia 46.).

Otros componentes antigénicos Además de las vesículas de la invención, una composición inmunogénica puede incluir otros antígenos que no sean vesículas.

En algunas modalidades, una composición incluye uno o más sacáridos capsulares de meningococos por ejemplo, de los serogrupos A, C, 135 y/o Y. Estos sacáridos por lo general se pueden conjugar a un portador de proteína. Una composición de la invención puede incluir uno o más conjugados de sacáridos capsulares de 1, 2, 3 ó 4 de los serogrupos meningocócicos A, C, 135 y Y, por ejemplo, A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, A+ 135+Y, A+C+W135+Y, etc. Componentes que incluyan sacáridos de todos los cuatro serogrupos A, C, W135 y Y son ideales.

Así como contienen antígenos de N. meningitidis, las composiciones pueden incluir antígenos de otros patógenos. Por ejemplo, la composición puede comprender uno o más de los siguientes antígenos adicionales: - un antígeno de Streptococcus pneumoniae, tal como un sacárido (típicamente conjugado) - un antígeno de virus de la hepatitis B, tal como el antígeno de superficie HBsAg. - un antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3. - un antígeno de difteria, tal como un toxoide de la difteria. - un antígeno del tétanos, tal como un toxoide del tétanos. - un antígeno sacárido de Haewophilus influenzae B (Hib) , típicamente conjugado. - antígenos de poliovirus inactivados.

Cuando un antígeno de difteria está incluido en la composición se prefiere incluir también el antígeno del tétanos y antígenos de pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antígeno del tétanos se prefiere incluir también antígenos de difteria y de pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de pertussis se prefiere incluir también antígenos de difteria y tétanos. Combinaciones de DTP son entonces preferidas.

Si un sacárido Hib es incluido (típicamente como un conjugado) , la porción de sacárido puede ser un polisacárido (por ejemplo, fosfato de polirribosilribitol de longitud completa (PRP) como el purificado a partir de bacterias) , pero también es posible fragmentar el sacárido purificado para hacer oligosacáridos (por ejemplo, PM de ~1 a ~5 kDa) por ejemplo, por hidrólisis. La concentración de conjugado de Hib en una composición por lo general estará en el rango de 0.5µg a 5C^g, por ejemplo, de l-20ug, de 10-15pg, de 12-16µ , etc. La cantidad puede ser de aproximadamente 15g, o aproximadamente 12µ9 en algunas modalidades. Una masa de menos de 5µ9 puede ser adecuada [82] , por ejemplo, en el rango de 1-5µgl 2-4µg, o alrededor de 2.5ug. Como se describió anteriormente, en combinaciones que incluyan sacárido Hib y sacáridos meningocócicos, la dosis del primero pueden ser seleccionadas sobre la base de la dosis del último (en particular, con múltiples serogrupos de meningococos , su masa media) . Otras características de los conjugados de Hib son como se describió anteriormente para conjugados meningocócicos, incluyendo la elección de la proteína portadora (por ejemplo, CRM197 o toxoide del tétanos), enlaces, relaciones, etc.

Si un antígeno de S. pneumoniae es incluido, este puede ser un polipéptido o un sacárido. Sacáridos capsulares conjugados son particularmente útiles para la inmunización contra el neumococo. El sacárido puede ser un polisacárido que tenga el tamaño que surja durante la purificación del sacárido a partir de bacterias, o puede ser un oligosacárido obtenido por fragmentación de un polisacárido tal. En el producto 7-valente PREVENAR™, por ejemplo, 6 de los sacáridos se presentan como polisacáridos intactos mientras que uno (el serotipo 18C) se presenta como un oligosacárido. Una composición puede incluir un sacárido capsular de uno o más de los siguientes serotipos de neumococo: 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y/o 33F. Una composición puede incluir múltiples serotipos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o más serotipos. Combinaciones de conjugados 7-valentes, 9-valentes, 10-valentes, 11-valentes y 13-valentes son ya conocidas en la técnica, como es una combinación no conjugada 23 -valente. Por ejemplo, una combinación 10 -valente puede incluir sacárido de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. Una combinación 11-valente puede incluir además sacáridos del serotipo 3. Una combinación 12-valente puede añadir a la mezcla 10-valente: los serotipos 6A y 19A; 6A y 22F; 19A y 22F; 6A y 15B; 19A y 15B; r 22F y 15B; Una combinación 13-valente puede añadir a la mezcla 11-valente: serotipos 19A y 22F; 8 y 12F; 8 y 15B; 8 y 19A; 8 y 22F; 12F y 15B; 12F y 19A; 12F y 22F; 15B y 19A; 15B y 22F etc. Otras características de conjugados neumocócicos son como se describen anteriormente para conjugados meningocócicos , incluyendo la elección de la proteína portadora (por ejemplo, CRM197 o toxoide tetánico) , enlaces, relaciones, etc. Cuando una composición incluya más de un conjugado, cada conjugado puede usar la misma proteína portadora o una proteína portadora diferente. La referencia 83 describe las ventajas potenciales cuando se usan diferentes proteínas portadoras en las vacunas conjugadas neumocócicas mult ivalentes .

General La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, referencias 84-90, etc.

El término "que comprende" abarca "que incluye", así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x+10%.

Cuando la invención se refiere a un "epítopo", este epítopo puede ser un epítopo de células B y/o un epítopo de células T, pero por lo general será un epítopo de células B. Tales epítopos se pueden identificar empíricamente (por ejemplo, usando PEPSCAN [91, 92] o métodos similares) , o se pueden predecir (por ejemplo, usando el índice antigénico de Jameson-Wolf [93] , los enfoques a base de matriz [94] , MAPITOPE [95], TEPITOPE [96, 97], redes neuronales [98], Opti er y EpiMer [99, 100], ADEPT [101], Tsites [102], hidrofilicidad [103] , índice antigénico [104] o los métodos descritos en las referencias 105-109, etc.) . Los epítopos son las partes de un antígeno que son reconocidas por y se unen a los sitios de unión a antígeno de anticuerpos o receptores de células T, y también pueden ser denominados "determinantes antigénicos " .

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y % de homología o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 110. Una alineación preferida es determinada por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con una penalización de hueco abierto de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se describe en la referencia 111.

La palabra " sustancialmente " no excluye "completamente" por ejemplo, una composición que esté "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

Promotores PorA modificados Las secuencias hacia el extremo 5' del sitio de inicio de transcripción de dos variantes de fase del promotor de porA meningocócico tipo salvaje, que contienen 11 y 13 Gs consecutivos en la región separadora, son las siguientes, con las regiones -35 y -10 subrayadas: AAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGAC (SEQ ID NO: 31) AAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGAC (SEQ ID NO: 40) La secuencia de intervención entre las regiones -35 y -10 incluye una secuencia poli-G Gn que está conectada a variación de fase de la expresión de PorA. Para estabilizar la expresión de este promotor, se ensayaron tres modificaciones (modificaciones en minúsculas) : AAAAATGGTTTTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC PST1"; SEQ ID NO: 32) AAAAATtGacaTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC ("ST2"; SEQ ID NO: 33) AAAAtTGacaTTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC ("ST3"; SEQ ID NO: 34) Así, en "ST1" la secuencia Gn fue interrumpida en tres lugares, dejando no más de 3 residuos G consecutivos. En "ST2" se usó la misma secuencia de intervención, pero la región -35 fue sustituida por una región -35 de consenso TTGACA. En "ST3 " un residuo T extra se insertó inmediatamente hacia el extremo 3' de la región -35.

Estos tres promotores fueron usados para conducir la expresión de una secuencia de fHbp (fHbp variante 2) en la cepa NZ98/258. Todos los tres promotores modificados dieron como resultado la sobre-expresión de alto nivel de fHBP en la cepa en comparación con una cepa que sobre-expresa equivalente que se ha reportado en la literatura [112, 113]. La mejor expresión fue vista con ST2 (Figuras 1-2C) .

Promotores de ARNr modificados En experimentos adicionales el promotor 16S de ARNr se fusionó a la 5 ' UTR del gen porA: ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATAATTCGCAAC ... (SEQ ID NO: 35) Este promotor se sometió a mutación y tres variantes hacia el extremo 3' de la región -35 se secuenciaron como sigue: ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTAT ATTCGCAAC ("wt"; SEQ ID NO: 35) ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATATTCGCAAC ... ("#5"; SEQ ID NO: 36) ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTTAATTCGCAC ... ("#6"; SEQ ID NO: 37) ATATCTTGACAGGCGGAAGGAAACTTTATAATTCGCAAC ... ("#8"; SEQ ID NO: 38) Así, en las variantes #5 y #6 la secuencia -10 es un 5 -mero, y la variante #6 también perdió un nucleótido entre la región -10 y el sitio de inicio de transcripción. En la variante #8 la región -10 y su secuencia de hacia el extremo 3' son las mismas que wt, pero la secuencia de intervención entre las regiones -35 y -10 es un nucleótido más corta que wt .

Expresión de fHbp a partir de promotores modificados Estos promotores se fusionaron a la región 5 'UTR del gen porA y se usaron para conducir la expresión de la secuencia de codificación de fHbp. Como se ve en la figura 2, variantes #5 y #6, las variantes #5 y #6 mostraron la expresión más fuerte, acercándose a los niveles observados con ST2.

La región completa que abarca el promotor tipo salvaje (SEQ ID NO: 35), que se extiende hacia el extremo 3' en la región transcrita y también hacia el extremo 5', es la siguiente (SEQ ID NO: 41; 358 meros) , con las regiones -35 y -10 subrayadas, y el nucleótido +1 (siguiendo la referencia 10) en doble subrayado: ... CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAGAGGAAAG GATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATTTCCC CAAAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCTGCAG AAGTGGCGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCGGAAG GAATACTTTATAATTCGCAACGTATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTACAAAAG GAAGCC... (SEQ ID NO: 41) Del mismo modo, las secuencias circundantes para las variantes #5 y #6 fueron como sigue: #5: ...CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAGAGG AAAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATT TCCCCAAAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCT GCAGAAGTGGCGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCG GAAGGAATACTTTATATTCGCAACGTATCGGGTGTTTGCCHNANGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTCAAA AGGAAGCC... (SEQ ID NO: 42) #6: ... CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAGAGG AAAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATT TCCCCAAAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCT GCAGAAGTGGCGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCG GAAGGAATACTTTTAATTCGCACGTATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATTAAATTTACAAA AGGAAGCCCATANGAATCGAACTGC ... (SEQ ID NO: 43) Cualquiera de estas secuencias más largas se puede usar con la invención, aunque las modificaciones como las explicadas en este documento pueden, por supuesto, ser hechas.

Un gen fHbp bajo el control de un promotor variante se insertó de manera estable en el cromosoma de un meningococo (cepa NZ98/254) en lugar de los genes IpxLl y/o synX endógenos. Niveles de expresión ligeramente más altos se observaron en el locus synX, y la expresión para la cepa con ambas inserciones (doble supresión de AlpxLlAsynX) fue la suma de la expresión de los locus individuales (Figuras 3A-3B) .

También se hicieron cepas en las que dos variantes fHbp diferentes (1 y 2) se expresaron bajo el control de un promotor PorA modificado. La co-expresión de ambas variantes no tiene ningún efecto negativo significativo en la expresión de cada locus distinto, y en su lugar se tradujo en un efecto aditivo (Figura 5) .

La supresión del gen endógeno mltA (GNA33) en la doble supresión de AlpxLlAsynX aumentó aún más los niveles de expresión, y no tuvo ningún impacto negativo en la localización de la proteína fHbp a las vesículas de la cepa. La figura 4 muestra los niveles de fHbp en vesículas aisladas a partir de estas cepas, que muestra (Figura 4A) el rendimiento de la proteína (mg) en relación con la densidad óptica (OD) del cultivo, y (Figura 4B) un Western blot de anti-fHbp contra 0.5 ]ig de la vesículas. SDS-PAGE muestra que la banda de fHbp en la cepa de triple supresión fue una de las proteínas más abundantes en las vesículas, junto con PorA y PorB (Figura 6) .

Se entenderá que la invención se describe anteriormente a modo de ejemplo solamente y se pueden realizar modificaciones mientras permanezcan dentro del alcance y espíritu de la invención.

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Se hace constar que, con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende un promotor que incluye (i) una región -10 de un promotor del gen porA meningocócico y (ii) una región -35 de un promotor del gen porA meningocócico, en donde la región -10 y la región -35 están separadas por una secuencia de intervención de 12-20 nucleótidos, y en donde la secuencia de intervención o bien no contiene ninguna secuencia poli-G o incluye una secuencia poli-G que tiene no más de ocho nucleótidos de G consecu ivos.

2. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende un promotor unido operativamente a un gen de codificación de proteínas hacia el extremo 3', en donde el promotor incluye (i) una región -10 del promotor del gen de ARNr meningocócico y/o (ii) una región -35 del promotor del gen de ARNr meningocócico.

3. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende una región promotora de un promotor del gen de ARNr unido operativamente a un gen de codificación de proteínas que tiene una UTR 5' que contiene elementos reguladores de la traducción para la expresión de la proteína.

4. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende un promotor que incluye una región -10 de un promotor del gen porA meningocócico y una región -35 de un promotor del gen de ARNr meningocócico.

5. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende un promotor que incluye SEQ ID NO: 18 que difiere de SEQ ID NO: 18 por hasta 4 inserciones, supresiones o sustituciones de un solo nucleótido.

6. El ácido nucleico de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque: la región -10 es TATAAT la región -35 de un promotor del gen porA meningocócico es TGGTTT; y/o la región -35 de un promotor del gen de ARNr meningocócico es TTGACA.

7. El ácido nucleico de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque la secuencia de intervención entre una región -35 y una región -10 tiene entre 12-20 nucleótidos, por ejemplo, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28 O SEQ ID NO: 29.

8. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia de intervención no incluye una secuencia GGGGG.

9. El ácido nucleico de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el no transcrito hacia el extremo 3' de la secuencia de -10 sino hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción tiene entre 5-10 nucleótidos, por ejemplo, TGAAGAC o TCGCAAC .

10. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 30.

11. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 18 o una variante de la misma, por ejemplo, los nucleótidos 6-39 de SEQ ID NO: 36, nucleótidos 6-38 de SEQ ID NO: 37, o los nucleótidos 6-39 de SEQ ID NO: 38.

12. Un vector de expresión bacteriana caracterizado porque comprende una secuencia de ADN que incluye el promotor de conformidad con cualquier reivindicación anterior.

13. Un meningococo caracterizado porque comprende una secuencia de ADN que incluye el promotor de conformidad con cualquier reivindicación anterior.

14. El meningococo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el promotor conduce la expresión de una proteína de la membrana exterior.

15. El meningococo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la proteína de membrana exterior es una fHbp .

16. El meningococo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque la bacteria no expresa un MltA activo.

17. El meningococo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque la bacteria tiene una supresión de SynX y/o LpxLl .

18. El meningococo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque tiene el serogrupo B.

19. El meningococo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque tiene el serogrupo W135.

20. El meningococo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, caracterizado porque tiene el inmunotipo L3.

21. Vesículas de membrana exterior caracterizadas porque se preparan a partir del meningococo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20.

22. Una composición farmacéutica inmunógena, caracterizada porque comprende las vesículas de conformidad con la reivindicación 21.

23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque incluye uno o más sacáridos capsulares conjugados de meningococo.

24. Un método para provocar una respuesta inmune en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero la composición de conformidad con la reivindicación 22 o la reivindicación 23.