ES2654937T3

ES2654937T3 - Anticuerpos específicos para el complejo BCR y procedimientos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2654937T3
Application number: ES16156951.2T
Authority: ES
Inventors: Leslie S. Johnson; Ling Huang
Original assignee: Macrogenics Inc
Current assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2008-04-02
Filing date: 2009-03-25
Publication date: 2018-02-15
Anticipated expiration: 2029-03-25
Also published as: AU2009258063B2; WO2009151717A2; EP2252631A2; CN106349390A; CA2720365A1; IL248723A0; EP2252631A4; KR20100130631A; US20110117089A1; EP2252631B1; EP3045475A1; JP2015070846A; US8993730B2; CN102046655B; MX2010010387A; US10479831B2; KR101614494B1; IL248723B; CN106349390B; EP3045475B1

Abstract

Un polipéptido que se une al complejo receptor de linfocitos B (BCR) humano, en el que dicho polipéptido comprende: (I) la secuencia aminoacídica de una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (VL) que es una variante humanizada de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo para el complejo BCR natural (VL de BCC), en la que dicha secuencia aminoacídica de dicha región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (VL) está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20; y (II) la secuencia aminoacídica de una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH) que es una variante humanizada de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo para el complejo BCR natural (VH de BCC), en la que dicha secuencia aminoacídica de dicha región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH) está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 34.

Description

imagen1

trasplante. No obstante, puesto que los sistemas inmunitarios humanos atacan a anticuerpos murinos anti-complejo BCR, se desean anticuerpos mejorados cuyo uso suscite una respuesta reducida de anticuerpos humanos antimurinos (“HAMA”). Asimismo, se desean anticuerpos anti-complejo BCR que muestren afinidad de unión mejorada o función efectora alterada.

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Receptores Fc

La interacción de los complejos antígeno-anticuerpo con células del sistema inmunitario da como resultado una amplia gama de respuestas que varían desde funciones efectoras, tales como citotoxicidad dependiente de 10 anticuerpos, desgranulación de mastocitos y fagocitosis a señales inmunomoduladoras, tales como regulación de la proliferación de linfocitos y secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician a través de la unión del dominio Fc de los anticuerpos o inmunocomplejos a los receptores Fc, que son receptores de superficie celular especializados en las células hematopoyéticas. La diversidad de las respuestas celulares desencadenadas por los anticuerpos e inmunocomplejos resulta de la heterogeneidad estructural de los receptores Fc. Los receptores Fc

15 comparten dominios de unión a ligandos relacionados estructuralmente que presuntamente median la señalización intracelular.

Los receptores Fc, miembros de la superfamilia génica de las inmunoglobulinas de proteínas, son glucoproteínas de superficie que se pueden unir la porción Fc de las moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia 20 reconoce inmunoglobulinas de uno o más isotipos a través de un dominio de reconocimiento en la cadena α del receptor Fc. Los receptores Fc se definen por su especificidad frente a los subtipos de inmunoglobulinas. Los receptores Fc para IgG se denominan “FcγR”, para IgE “FεR” y para IgA “FcαR”. Diferentes células accesorias llevan receptores Fc para anticuerpos de diferente isotipo, y el isotipo del anticuerpo determina qué células accesorias intervienen en una respuesta dada (Billadeau et al. (2002) J. Clin. Investigat. 2(109):161-81; Gerber et al. (2001)

25 Microbes Infection 3:131-139; Ravetch et al. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch et al. (2000) Science 290:84-89; Ravetch (1994) Cell 78(4):553-560; Ravetch et al. (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492; véase también, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (4.º ed. 1999), Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, Nueva York). En la tabla 1 se presenta una visión general de los diversos receptores.

TABLA 1 Receptores para las regiones Fc de isotipos de inmunoglobulinas

Receptor: Unión Tipo de células Efecto de fijación

FcγRI (CD64): IgG1 108 M-1 Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos Células dendríticas Captación Estimulación Activación de explosión respiratoria Inducción de muerte

FcγRII-A (CD32): IgG1 2 x 106 M-1 Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos Células dendríticas Plaquetas Células de Langerhans Captación Liberación de gránulos

FcγRII-B1 (CD32): IgG1 2 x 106 M-1 Linfocitos B Mastocitos Sin captación Inhibición de estimulación

FcγRII-B2 (CD32): IgG1 2 x 106 M-1 Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos Captación Inhibición de estimulación

FcγRIII (CD16): IgG1 5 x 105 M-1 Linfocitos NK Eosinófilos Macrófagos Neutrófilos Mastocitos Inducción de muerte

FεRI: IgE 1010 M-1 Mastocitos Eosinófilo Basófilos Secreción de gránulos

FcαRI (CD89): IgA1, IgA2 107 M-1 Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos Captación Inducción de muerte

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(A) una sustitución de isoleucina en el residuo de Kabat 48;

(B): una sustitución de lisina en el residuo de Kabat 62; 5 (C) una sustitución de lisina en el residuo de Kabat 66;

(D): una sustitución de alanina en el residuo de Kabat 67;

(E): una sustitución de leucina en el residuo de Kabat 69;

(F): una sustitución de valina en el residuo de Kabat 71; y

(G): una sustitución de lisina en el residuo de Kabat 73. 15 La divulgación también proporciona los modos de realización de dichos polipéptidos, en la que:

(I): el primer dominio variable de anticuerpo comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, y SEQ ID NO: 20;

(II): el segundo dominio variable de anticuerpo comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, y SEQ ID NO: 36.

25 La divulgación también proporciona los modos de realización de dichos polipéptidos en la que el primer dominio variable de anticuerpo comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 16 y el segundo dominio variable de anticuerpo comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 34.

La divulgación también proporciona los modos de realización de dichos polipéptidos, en la que el polipéptido es un anticuerpo, y particularmente en la que dicho anticuerpo comprende un dominio Fc de variante que comprende al menos una modificación en el dominio Fc con respecto a un dominio Fc natural.

La divulgación también proporciona los modos de realización de dichos polipéptidos, en la que la modificación comprende: 35

(A): al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V y P396L;

(B): al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en F243L y P396L; F243L y R292P; y R292P y V305I;

(C): al menos tres sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en F243L, R292P y Y300L; F243L, R292P y V305I; F243L, R292P y P396L; y R292P, V305I y P396L;

45 (D) al menos cuatro sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en F243L, R292P, Y300L y P396L; y F243L, R292P, V305I y P396L; o

(E) al menos las sustituciones F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L.

La divulgación también proporciona los modos de realización de dichos polipéptidos, en la que el dominio Fc de variante muestra una función efectora alterada en comparación con un dominio Fc natural, en la que la función efectora alterada está seleccionada del grupo que consiste en:

(A) función de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) potenciada; 55

(B): función de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) potenciada;

(C): unión incrementada a un FcγR de activación en comparación con un dominio Fc natural;

(D): unión disminuida a FcγRIIB en comparación con un dominio Fc natural; o

(E): unión incrementada a FcγRIIB en comparación con un dominio Fc natural.

La divulgación también proporciona los modos de realización de dichos anticuerpos, en la que el anticuerpo es un 65 fragmento F(ab')2, un anticuerpo monoclonal, un fragmento F(ab), un anticuerpo monocatenario o un diacuerpo, y/o en la que el anticuerpo está ligado de manera funcional a un polipéptido heterógeno.

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Secuencia aminoacídica de VH de BCC2 (SEQ ID NO: 8):

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En un modo de realización preferente de la invención, se construyeron y estudiaron siete regiones variables de la cadena ligera de BCC diferentes. Las secuencias aminoacídicas y de ácido nucleico de estas regiones variables de 10 la cadena ligera se presentan a continuación:

Secuencia de ácido nucleico de VL-1 de hBCC (SEQ ID NO: 9):

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Secuencia aminoacídica de VL-1 de hBCC (SEQ ID NO: 10):

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20 Secuencia de ácido nucleico de VL-2 de hBCC (SEQ ID NO: 11):

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Secuencia aminoacídica de VL-2 de hBCC (SEQ ID NO: 12):

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Secuencia de ácido nucleico de VL-3 de hBCC (SEQ ID NO: 13):

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Secuencia aminoacídica de VL-3 de hBCC (SEQ ID NO: 14):

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Secuencia de ácido nucleico de VL-4 de hBCC (SEQ ID NO: 15):

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Secuencia aminoacídica de VL-4 de hBCC (SEQ ID NO: 16):

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Secuencia de ácido nucleico de VL-5 de hBCC (SEQ ID NO: 17):

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15 Secuencia aminoacídica de VL-5 de hBCC (SEQ ID NO: 18):

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Secuencia de ácido nucleico de VL-6 de hBCC (SEQ ID NO: 19):

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Secuencia aminoacídica de VL-6 de hBCC (SEQ ID NO: 20):

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Secuencia aminoacídica de VL de chBCC1 (SEQ ID NO: 37):

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30 En la figura 1 de la presente invención está representada una comparación entre las regiones variables de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo BCC2 natural (SEQ ID NO: 6) y un anticuerpo BCC1 quimérico (SEQ ID NO: 37) y un anticuerpo BCC2 humanizado (SEQ ID NO: 10). Aunque se puede observar que se ha cambiado un número de residuos en estas secuencias quiméricas y humanizadas particulares, no es necesario modificar todos o la mayoría

35 de estos residuos cuando se generen mediante ingeniería los polipéptidos y anticuerpos quiméricos y humanizados

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En diversos modos de realización, los anticuerpos comprenden una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH) que es una VH de BCC quimérico, que comprende preferentemente una o más modificaciones M48I, M62K, R66K, V67A, M69L, T71V o T71V y T73K. En un modo de realización preferente, los anticuerpos comprenden una VH de inmunoglobulina que es una VH de BCC quimérico, que comprende preferentemente la

5 secuencia de SEQ ID NO: 38.

Todavía en otros modos de realización, los anticuerpos comprenden una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (VL) que es una VL de BCC humanizado o quimérico y también comprenden una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH) que es una VH de BCC humanizado o quimérico. Los anticuerpos pueden 10 comprender cualquier combinación de las regiones VL y VH descritas en el presente documento, por ejemplo, una VL natural con una VH humanizada, una VL natural con una VH quimérica, una VL humanizada con una VH humanizada, una VL humanizada con una VH quimérica, una VL humanizada con una VH natural, una VL quimérica con una VH humanizada, una VL quimérica con una VH quimérica o una VL quimérica con una VH natural. Cada una de estas combinaciones se puede variar adicionalmente por el entendimiento de que en determinados modos de realización,

15 la región VL puede ser una versión (quimérica, humanizada o natural) de un anticuerpo BCC1, y la región VH puede ser una versión (quimérica, humanizada o natural) de un anticuerpo BCC2, o viceversa.

En diversos modos de realización, los anticuerpos comprenden una de las siguientes combinaciones: VL-1 de hBCC / VH de chBCC, VL-2 de hBCC / VH de chBCC, VL-3 de hBCC / VH de chBCC, VL-4 de hBCC / VH de chBCC, VL

20 de chBCC / VH-1 de hBCC, VL de chBCC / VH-2 de hBCC, VL de chBCC / VH-3 de hBCC, VL de chBCC / VH-4 de hBCC, VL de chBCC / VH-5 de hBCC, VL de chBCC / VH-6 de hBCC, VL-4 de hBCC / VH-2 de hBCC, VL-4 de hBCC / VH-7 de hBCC VL-4 de hBCC / VH-8 de hBCC, VL-6 de hBCC / VH-2 de hBCC, VL-6 de hBCC / VH-7 de hBCC o VL-6 de hBCC / VH-8 de hBCC. En un modo de realización preferente, los anticuerpos comprenden una de las combinaciones de las regiones VL y VH expuestas en la tabla 2.

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Tabla 2: combinaciones ejemplares de las regiones VL y VH

Región variable de la cadena ligera(VL): Región variable de la cadena pesada (VH)

Natural: Humanizada Quimérica

Natural: — Una VL seleccionada de VL de BCC1 o VL de BCC2 y una VH seleccionada de VH1 de hBCC, VH-2 de hBCC, VH-3 de hBCC, VH-4 de hBCC, VH-5 de hBCC, VH-6 de hBCC, VH-7 de hBCC, o VH-8 de hBCC Una VL seleccionada de VL DE BCC1 o VL de BCC2 y una VH seleccionada de VH de chBCC1 o VH de chBCC2

Humanizada: Una VL seleccionada de VL-1 de hBCC, VL-2 de hBCC, VL-3 de hBCC, VL-4 de hBCC, VL-5 de hBCC o VL-6 de hBCC, y una VH seleccionada de VH de BCC1o VH de BCC2 Una VL seleccionada de VL1 de hBCC, VL-2 de hBCC, VL-3 de hBCC, VL-4 de hBCC, VL-5 de hBCC o VL-6 de hBCC y una VH seleccionada de VH-1 de hBCC, VH-2 de hBCC, VH-3 de hBCC, VH-4 de hBCC, VH-5 de hBCC, VH-6 de hBCC, VH-7de hBCC o VH-8 de hBCC Una VL seleccionada de VL-1 de hBCC, VL-2 de hBCC, VL3 de hBCC, VL-4 de hBCC, VL-5 de hBCC o VL-6 de hBCC y una VH seleccionada de VH de chBCC1 o VH de chBCC2

Quimérica: Una VL seleccionada de VL de chBCC1 o VL de chBCC2 y una VH seleccionada de VH de BCC1 o VH de BCC2 Una VL seleccionada de VL de chBCC1 o VL de chBCC2 y una VH seleccionada de VH-1 de hBCC, VH-2 de hBCC, VH-3 de hBCC, VH-4 de hBCC, VH-5 de hBCC, VH-6 de hBCC, VH-7 de hBCC o VH-8 de hBCC Una VL seleccionada de VL de chBCC1 o VL de chBCC2 y una VH seleccionada de VH de chBCC1 o VH de chBCC2

Los polipéptidos (especialmente anticuerpos) contemplados por la presente invención se pueden encontrar en un complejo con otro o con otros polipéptidos no inmunoglobulínicos, (por ejemplo, enzimas, hormonas, proteínas

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estructurales, etc.). Por ejemplo, un modo de realización puede proporcionar un complejo polipeptídico que comprende dos polipéptidos, en el que uno de dichos polipéptidos comprende una cadena pesada y el otro polipéptido comprende una cadena ligera de variante, o en el que ambos polipéptidos comprenden las mismas secuencias. La formación de complejos puede estar mediada por cualquier técnica adecuada, incluyendo mediante

5 dimerización/multimerización en un dominio de dimerización/multimerización, tal como los descritos en el presente documento o interacciones covalentes (tales como a través de un enlace disulfuro) (que en algunos contextos es parte de un dominio de dimerización, por ejemplo, un dominio de dimerización puede contener una secuencia de cremallera de leucinas y una cisteína). En otro modo de realización, una composición puede comprender polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, por ejemplo, una composición puede comprender una pluralidad de cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento. Una composición que comprende un polinucleótido o polipéptido puede estar en forma de un kit o un artículo de fabricación (opcionalmente envasado con instrucciones, tampones, etc.).

También se contempla que se puedan preparar variantes polipeptídicas (y en particular variantes de anticuerpos).

15 Las variantes polipeptídicas pueden poseer modificaciones de secuencia (por ejemplo, sustituciones, deleciones y/o adiciones) en las posiciones deseadas en sus secuencias aminoacídicas con respecto a la secuencia aminoacídica natural. Los expertos en la técnica apreciarán que los cambios aminoacídicos pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo o polipéptido, tales como cambiar el número o posición de los sitios de glucosilación o alterar las características de anclaje a la membrana. En un modo de realización preferente, las variantes polipeptídicas y de anticuerpos son variantes de la región Fc.

Las variantes pueden tener misma actividad o alterada en comparación con un polipéptido o anticuerpo natural. Por ejemplo, puede ser deseable que la variante tenga la misma actividad, pero se modifique de una manera de modo que sea más estable o tenga una semivida más larga in vivo, por ejemplo, conjugando el anticuerpo con

25 seroalbúmina o un epítopo de unión a un receptor de rescate, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.º 5.739.277. O, por ejemplo, puede ser deseable que un anticuerpo tenga una afinidad de unión incrementada a antígeno, pero la misma función efectora como anticuerpo natural, o puede ser deseable que un anticuerpo tenga la misma afinidad de unión a antígeno, pero una función efectora disminuida. La actividad puede se puede someter a prueba, por ejemplo, usando ensayos in vitro, tales como ensayos de ELISA, ensayos de resonancia de plasmón superficial, ensayos de unión de proteína radiomarcada (RIA) o ensayos de inmunoprecipitación.

Se pueden efectuar modificaciones sustanciales en la identidad inmunológica o función seleccionando modificaciones que difieren significativamente en su efecto de conservación de (a) la estructura de la cadena 35 principal del polipéptido en el área de la modificación, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. También se puede emplear análisis de aminoácidos de barrido para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua, por ejemplo, como se describe por Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085. Entre los aminoácidos de barrido preferentes están los aminoácidos neutros relativamente pequeños, tales como alanina, glicina, serina y cisteína. Entre este grupo, la alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferente, porque es el aminoácido más común, con frecuencia se encuentra tanto en posiciones ocultas como expuestas, y porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isotérico. Adicionalmente, se puede sustituir cualquier residuo de cisteína no implicado en conservar la

45 propia conformación del anticuerpo o polipéptido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir el entrecruzamiento atípico. Sin embargo, en determinadas circunstancias, particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv, se pueden añadir enlace(s) de cisteína al anticuerpo o polipéptido para mejorar su estabilidad.

B1. Variantes de dominios Fc

Los polipéptidos de la presente invención pueden tener dominios Fc de variante. La modificación del dominio Fc normalmente da lugar a un fenotipo alterado, por ejemplo, semivida sérica alterada, estabilidad alterada, susceptibilidad alterada a enzimas celulares o función efectora alterada. Puede ser deseable modificar el anticuerpo

55 de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, para incrementar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. La reducción o eliminación de la función efectora es deseable en determinados casos, por ejemplo, en el caso de anticuerpos cuyo mecanismo de acción implica el bloqueo o antagonismo, pero no la muerte de las células que llevan un antígeno diana. Es generalmente deseable una función efectora incrementada al dirigirse a células indeseables, tales como células exógenas o tumorales, donde los FcγR se expresan en niveles bajos, por ejemplo, linfocitos B específicos de tumor con bajos niveles de FcγRIIB (por ejemplo, linfoma no hodgkiniano, LLC y linfoma de Burkitt). En dichos modos de realización, las moléculas de la invención con actividad de función efectora conferida o alterada son útiles para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, trastorno o infección, donde se desea una eficacia potenciada de la actividad de función efectora.

65 En determinados modos de realización, las moléculas de la invención comprenden una o más modificaciones en los aminoácidos del dominio Fc, que reducen la afinidad y avidez de la región Fc y, de esta manera, la molécula de la

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Tabla 4: información de unión detallada para las variantes de Fc ejemplares

Secuencia de Fc: CD16A V158 CD16A F158 CD32B Proporción de afinidades

CD16A/CD32B

V158: F158

Proporción de afinidades > 1

Clase I: Unión incrementada a CD16; Unión disminuida a CD32B

F243L: 4,79 3,44 0,84 5,70 4,10

F243L P247L D270E N421K: 2,30 3,45 0,32 7,19 10,78

F243LP247LN421K: 1,89 1,71 0,17 11,12 10,06

F243L R255L D270E P396L: 1,75 1,64 0,38 4,61 4,32

F243L D270E G316D R416G: 1,50 1,34 0,20 7,50 6,70

F243L D270E K392T P396L: 3,16 2,44 0,44 7,18 5,55

F243L D270E P396L Q419H: 1,46 1,15 0,26 5,62 4,42

F243L R292P: 4,73 0,12 39,4

F243L R292P: 4 1,67 0,16 25 10,44

F243L R292P P300L: 6,69 2,3 0,32 20,9 7,19

F243L R292P V305I: 2,56 1,43 ND >25 >25

F243L R292P V305I P396L: 5,37 2,53 0,40 13,43 6,33

P247LD270EN421K: 1,89 2,46 0,58 3,26 4,24

R255L D270E R292G P396L: 1,39 1,30 0,65 2,14 2,00

R255L D270E Y300L P396L: 1,52 1,74 0,87 1,75 2,00

R255L D270E P396L: 1,34 1,65 0,87 1,54 1,90

D270E: 1,25 1,48 0,39 3,21 3,79

D270E G316D R416G: 2,18 2,49 0,78 2,79 3,19

D270E K392T P396L: 1,81 2,28 0,79 2,29 2,89

D270E P396L: 1,38 1,65 0,89 1,55 1,85

D270E P396L G316D R416G: 1,22 1,07 1,14

D270E P396L Q419H: 1,64 2,00 0,68 2,41 2,94

V284M R292P K370N: 1,14 1,37 0,37 3,1 3,7

R292G: 1,54 0,25 6,2

R292P: 2,90 0,25 11,60

R292P V305I: 1,32 1,28 0,37 3,6 3,46

Clase II: Unión disminuida a CD16; Unión ampliamente disminuida a CD32B

R292P: 0,64 0,25 2,56

R292P F243L: 0,6 0,12 5,00

Clase III: Unión incrementada a CD16; Unión invariable a CD32B

F243I R292P Y300L V305I P396L: 10,9 3,12 1,05 10,4 2,97

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Secuencia de Fc: CD16A V158 CD16A F158 CD32B Proporción de afinidades

CD16A/CD32B

V158: F158

F243L R292P Y300L P396L: 10,06 5,62 1,07 9,40 5,25

R292P V305I P396L: 1,85 1,90 0,92 2,01 2,07

Clase IV: Unión ampliamente incrementada a CD16; Unión incrementada a CD32B

F243L R292P Y300L V305I P396L: 10,06 8,25 1,38 7,29 5,98

D270E G316D P396L R416G: 1,22 1,07 1,14

Proporción de afinidades < 1

Clase V: Unión invariable a CD16; Unión incrementada a CD32B

R255L P396L: 1,09 2,22 0,49

Y300L: 1,01 1,18 0,99

Clase VI: Unión incrementada a CD16; Unión ampliamente incrementada a CD32B

F243L P396L: 1,49 1,60 2,22 0,67 0,72

P247L N421K: 1,29 1,73 2,00 0,65 0,87

R255L P396L: 1,39 2,22 0,49 0,63

R292P V305I: 1,59 2,11 2,67 0,60 0,79

K392T P396L: 1,49 1,81 2,35 0,63 0,77

P396L: 1,27 1,73 2,58 0,49 0,67

P396L Q419H: 1,19 1,19 1,33 0,89 0,89

Clase VII: Unión disminuida a CD16; Unión invariable / incrementada a CD32B

D270E G316D P396L R416G: 0,94 1,07 0,88

En otros modos de realización, las moléculas comprenden una región Fc de variante que tiene una o más sustituciones aminoacídicas, alterando las sustituciones (con respecto a una región Fc natural) la unión de la región Fc de variante, por ejemplo, potenciando la unión a un FcγR de activación (tal como FcγRIIA o FcγRIIIA) y/o 5 reduciendo la unión a un FcγR de inhibición (tal como FcγRIIB). Se generaron mediante ingeniería diversas mutaciones de Fc que tenían uno o más cambios aminoacídicos y se analizaron mediante resonancia de plasmón superficial para koff, como se muestra en la tabla 5. Se determinaron las constantes de velocidad de disociación para unir los diversos FcγR mediante análisis BIAcore y se compararon directamente con las del Fc natural, con la proporción (x = koff natural/ koff mutante) indicada en las columnas de la derecha de la tabla 5 con respecto a cada

10 FcγR sometido a prueba.

Tabla 4: comparación de koff de mutantes de Fc con respecto a Fc natural

M: Cambio(s) aminoacídico(s) CD16AV CD16AF CD32AH CD32B

Un aminoácido

1: F243L 4,8 3,4 0,6 0,8

2: D270 E 1,3 1,5 2,2 0,4

3: R292 P 2,4 1,6 0,7 0,3

4: S298N nd nd nt 0,2

25

M: Cambio(s) aminoacídico(s) CD16AV CD16AF CD32AH CD32B

5: Y300L 1,0 1,2 2,9 1,2

6: V305 I 0,9 0,6 1,3 1,2

7: A330V 0,6 1 2 0,4 0,3

8: P396L 1,3 1,7 1,6 2,6

Dos aminoácidos

9: F243L P396L 2,2 2,0 1,5 1,6

10: F243L R292 P 4,0 1,7 0,5 0,2

11: R292 P V305 I 1,3 1,3 0,8 0,4

Tres aminoácidos

12: F243L R292 P Y300L 7,4 4,6 1,0 0,6

13: F243L R292 P V305 I 2,6 1,4 0,2 0,1

14: F243L R292 P P396L 6,3 3,4 1,4 0,4

15: R292 P V305 I P396L 1,9 1,9 1,5 0,9

Cuatro aminoácidos

16: F243L R292 P Y300L P396L 10,1 5,6 1,7 1,1

17: F243L R292 P V305 I P396L 4,0 2,3 0,8 0,4

Cinco aminoácidos

18: F243L R292 P Y300L V305 I P396L 10,1 8,3 3,2 1,4

Abreviaturas: M, número de mutante; nd, unión no detectable; nt, no sometido a prueba. Los valores con una diferencia ≥ 80 % (≥ 0,8 veces) del natural en cualquier dirección figuran en negrita. El sombreado denota mutantes de Fc identificados directamente mediante expresión en la superficie de levaduras; todos los demás mutantes se construyeron mediante mutagénesis de sitio dirigido.

También hay extensa orientación en la técnica de tecnologías para la ingeniería de anticuerpos relativa a las modificaciones deseables. Las modificaciones ejemplares que pueden ser deseables en determinadas circunstancias se enumeran a continuación:

5 En un modo de realización específico, en regiones Fc de variante, cualquier modificación aminoacídica (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 o 330 y preferentemente uno o más de los siguientes residuos: A240, 1240, L241, L243, H244, N298, 1328 o V330. En un modo de realización específico diferente, en regiones Fc de variante, cualquier modificación aminoacídica (por

10 ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439 y preferentemente uno o más de los siguientes residuos: H280, Q280, Y280, G290, S290, T290, Y290, N294, K295, P296, D298, N298, P298, V298,1300 o L300.

15 En un modo de realización preferente, en regiones Fc de variante que se unen a un FcγR con una afinidad alterada, cualquier modificación aminoacídica (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Preferentemente, la región Fc de variante tiene cualquiera de los siguientes residuos:

26

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12: F241L / V262I 65 S239D / N297D / I332E / A330Y / F241S / F243H / V262T / V264T

13: F241R / F243Q / V262T / V264R 66 S239D / N297D / I332E / K326E

14: F241R / F243Q / V262T / V264R / I332E 67 S239D / N297D / I332E / L235D

15: F241W / F243W / V262A / V264A 68 S239D / S298A / I332E

16: F241Y / F243Y / V262T / V264T 69 S239D / V264I / A330L / I332E

17: F241Y / F243Y / V262T / V264T / N297D / I332E 70 S239D / V264I / I332E

18: F243L / V262I / V264W 71 S239D / V264I / S298A / I332E

19: P243L / V264I 72 S239E / D265N

20: L328D / I332E 73 S239E / D265Q

21: L328E / I332E 74 S239E / I332D

22: L328H / I332E 75 S239E / I332E

23: L328I / I332E 76 S239E / I332N

24: L328M / I332E 77 S239E / I332Q

25: L328N / I332E 78 S239E / N297D / I332E

26: L328Q / I332E 79 S239E / V264I / A330Y /1332 E

27: L328T / I332E 80 S239E / V264I / I332E

28: L328V / I332E 81 S239E / V264I / S298A / A330Y / I332E

29: N297D / A330Y / I332E 82 S239N / A330L / I332E

30: N297D / I332E 83 S239N / A330Y / I332E

31: N297D / I332E / S239D / A330L 84 S239N / I332D

32: N297D / S298A / A330Y /1 332E 85 S239N / I332E

33: N297D / T299L / I332E 86 S239N / I332N

34: N297D / T299F / I332E / N297D / T299H / 87 S239N / I332Q

35: N297D / T299I / I332E 88 S239N1S298A / I332E

36: N297D / T299L / I332E 89 S239Q / I332D

37: N297D / T299V / I332E 90 S239Q / I332E

38: N297E / I332E 91 S239Q / I332N

39: N297S / I332E 92 S239Q / I332Q

40: P230A / E233D / I332E 93 S239Q / V264I / I332E

41: P244H / P245A / P247V 94 S298A / I332E

42: S239D / A330L / I332E 95 V264E / N297D / I332E

43: S239D / A330Y / I332E 96 V264I / A330L / I332E

44: S239D / A330Y / I332E / K326E 97 V264I / A330Y / I332E

45: S239D / A330Y / I332E / K326T 98 V264I / I332E

46: S239D / A330Y / I332E / L234I 99 V264I / S298A / I332E

47: S239D / A330Y / I332E / L235D 100 Y296D / N297D / I332E

48: S239D / A330Y / I332E / V240I 101 Y296E / N297D / I332E

49: S239D / A330Y / I332E / V264T 102 Y296H / N297D / I332E

50: S239D / A330Y / I332E / V266I 103 Y296N / N297D / I332E

51: S239D / D265F /N297D / I332E 104 Y296Q / N297I / I332E

52: S239D / D265H / N297D / I332E 105 Y296T / N297D / I332E.

53: S239D / D265I / N297D / I332E

La función efectora se puede modificar mediante técnicas, tales como las descritas en la técnica de tecnologías para la ingeniería de anticuerpos, o mediante otros medios. Por ejemplo, se puede introducir un residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región, dando como resultado 5 la generación de un anticuerpo homodimérico que puede tener capacidad de internalización mejorada y/o muerte celular mediada por el complemento y ADCC incrementadas. Véase Caron et al. (1992) J. Exp Med. 176:1191-1195; y B. Shopes (1992) J. Immunol. 148:2918-2922. Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral mejorada también se pueden preparar usando reticuladores heterobifuncionales, como se describe en Wolff et al. (1993) Cancer Research 53:2560-2565. Alternativamente, se puede generar mediante ingeniería un anticuerpo que tenga 10 regiones Fc duales y así tenga lisis por el complemento potenciada y capacidades de ADCC. Stevenson et al. (1989) Anti-Cancer Drug Design 3:219-230.

B2. Modificaciones de secuencia

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allá de la proporcionada por la unión extracelular, que es susceptible a aclaramiento por el entorno enzimático extracelular acoplado con un aclaramiento circulatorio.

También se pueden detectar proteínas de BCR usando procedimientos de inmunoanálisis y los anticuerpos de la

5 invención. Por ejemplo, los procedimientos estándar incluyen radioinmunoanálisis, procedimientos inmunocromatográficos, inmunoanálisis de tipo sándwich (incluyendo ELISA), ensayos de inmunofluorescencia, inmunoelectrotransferencia, cromatografía de afinidad (ligando de afinidad unido a una fase sólida) y detección in situ con anticuerpos marcados.

10 Una vez descrita generalmente la invención, se entenderá más fácilmente la misma a través de la referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes de la presente invención, a menos que se especifique.

Ejemplo

15

ELISA de unión directa

Se realizaron ELISA como sigue: Se recubrió 50 µl/pocillo de 0,5 µg/ml de sBCRC-Fc (“BCRC” se refiere al complejo BCR) en una placa Maxisorp de 96 pocillos en tampón carbonato a 4 °C durante la noche. La placa se lavó tres 20 veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,1 %) y entonces se bloqueó con BSA al 0,5 % en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de someter a prueba los anticuerpos. Las variantes de anticuerpos se diluyeron en una serie de diluciones de dos veces partiendo de 0,15 µg/ml, y se añadieron a 50 µl/pocillo a la placa que contenía el sBCRC-Fc. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar tres veces con PBS-T, se añadió a la placa 50 µl/pocillo de F(ab')2 de anti-IgG humana de cabra F(ab')2 conjugada con peroxidasa de rábano

25 picante (HRP) diluida 1:10.000 (Jackson ImmunoResearch). La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó tres veces con PBS-T y se reveló con 80 µl/pocillo de sustrato de TMB. Tras 5 minutos de incubación, se detuvo la reacción mediante 40 µl/pocillo de H2SO4 al 1 %. Se leyó la OD450 nm usando un lector de placas de 96 pocillos y el software SOFTmax. La lectura se representó usando el software GraphPadPrism 3.03.

30 Se realizaron tres ELISA diferentes de acuerdo con el protocolo expuesto anteriormente. El primer ELISA examinó la unión de anticuerpos que tenían diversas cadenas ligeras, incluyendo los anticuerpos chBCC2, hBCC, hLc-2/chHc, hLc-3/chHc, hLc-4/chHc y hLc-1/chHc. Los resultados se muestran en la figura 4. El segundo ELISA examinó la unión de anticuerpos que tenían diversas cadenas pesadas, incluyendo los anticuerpos chLc/hHc-1, chLc/hHc-2, chLc/hHc-3, chLc/hHc-4, chLc/hHc-5, chLc/hHc-6, chBCC2 y hBCC. Para el anticuerpo chLc/hHc-6, se usó solo

35 medio como control negativo en lugar de una dilución de 0,019 µg/ml. Los resultados se muestran en la figura 5. El tercer ELISA examinó la unión de anticuerpos que tenían varias cadenas ligeras y pesadas, incluyendo hLc-4/hHc-2, hLc-4/hHc-7, hLc-4/hHc-8, hLc6/hHc-2, hLc-6/hHc-7, hLc-6/hHc-8, chBCC1 y chBCC2. Se proporciona una descripción de anticuerpos sometidos a prueba en la tabla 6.

40 TABLA 6

Designación del anticuerpo: Región variable de la cadena ligera Región variable de la cadena pesada

Nombre: SEQ ID NO Nombre SEQ ID NO

chBCC1: VL de chBCC1 37 VH de chBCC1 38

chLc/hHc-1: VL de chBCC1 37 VH-1 de hBCC 22

chLc/hHc-2: VL de chBCC1 37 VH-2 de hBCC 24

chLc/hHc-3: VL de chBCC1 37 VH-3 de hBCC 26

chLc/hHc-4: VL de chBCC1 37 VH-4 de hBCC 28

chLc/hHc-5: VL de chBCC1 37 VH-5 de hBCC 30

chLc/hHc-6: VL de chBCC1 37 VH-6 de hBCC 32

hLc-1/chHc: VL-1 de hBCC 10 VH de chBCC1 38

hLc-2/chHc: VL-2 de hBCC 12 VH de chBCC1 38

hLc-3/chHc: VL-3 de hBCC 14 VH de chBCC1 38

hLc-4/chHc: VL-4 de hBCC 16 VH de chBCC1 38

hLc-4/hHc-2: VL-4 de hBCC 16 VH-2 de hBCC 24

hLc-4/hHc-7: VL-4 de hBCC 16 VH-7 de hBCC 34

hLc-4/hHc-8: VL-4 de hBCC 16 VH-8 de hBCC 36

hLc6/hHc-2: VL-6 de hBCC 20 VH-2 de hBCC 24

hLc-6/hHc-7: VL-6 de hBCC 20 VH-7 de hBCC 34

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Declaraciones (únicamente con fines de divulgación).

Declaración 1. Un polipéptido que se une al complejo BCR humano, en el que dicho polipéptido comprende la 5 secuencia aminoacídica de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) que es una variante humanizada de VL de BCC que comprende:

(A) una modificación en el residuo de Kabat 37; 10 (B) una modificación en el residuo de Kabat 45; o

(C) ambas (A) y (B).

Declaración 2. El polipéptido de la declaración 1, en el que dicha variante humanizada de VL de BCC tiene: 15

(A): una sustitución de leucina en el residuo de Kabat 37;

(B): una sustitución de lisina o asparagina en el residuo de Kabat 45; o

20 (C) ambas (A) y (B).

Declaración 3. El polipéptido de la declaración 1, en el que dicha VL tiene una leucina en el residuo de Kabat 37 y una lisina en el residuo de Kabat 45.

25 Declaración 4. El polipéptido de la declaración 1, en el que dicha VL tiene una leucina en el residuo de Kabat 37 y una asparagina en el residuo de Kabat 45.

Declaración 5. El polipéptido de la declaración 1, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 30 16, SEQ ID NO: 18, y SEQ ID NO: 20.

Declaración 6. Un polipéptido que se une al complejo BCR humano, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia aminoacídica de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) que es una variante humanizada de VH de BCC que comprende una modificación de uno o más de los residuos de Kabat 48, 62, 66, 67,

35 68, 69, 70, 71 y 73.

Declaración 7. El polipéptido de la declaración 6, en el que dicha variante humanizada de VH de BCC comprende una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en:

40 (A) una sustitución de isoleucina en el residuo de Kabat 48;

(B) una sustitución de lisina en el residuo de Kabat 62;

(C): una sustitución de lisina en el residuo de Kabat 66; 45

(D) una sustitución de alanina en el residuo de Kabat 67;

(E): una sustitución de leucina en el residuo de Kabat 69; 50 (F) una sustitución de valina en el residuo de Kabat 71; y

(G) una sustitución de lisina en el residuo de Kabat 73.

Declaración 8. El polipéptido de la declaración 7, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia 55 aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, y SEQ ID NO: 36.

Declaración 9. El polipéptido de cualquiera de las declaraciones 1-8, en el que dicho polipéptido es un anticuerpo monocatenario o un diacuerpo. 60 Declaración 10. Un polipéptido que comprende al menos dos dominios variables de anticuerpos:

(I) en el que el primero de dichos dominios variables de anticuerpos es un dominio variable de cadena ligera (VL) que es una variante humanizada de VL de BCC que comprende:

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Claims

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