CN111423515A

CN111423515A - 一种cd20/cd47双特异性抗体及应用

Info

Publication number: CN111423515A
Application number: CN202010208405.XA
Authority: CN
Inventors: 王雷; 尹建河; 董丽莎; 张崇骞; 赵永浩; 汤春; 张晓霞; J·彭; D·张
Original assignee: Beierda Pharmacy Suzhou Co ltd
Current assignee: Beierda Pharmacy Suzhou Co ltd; Beta Pharma Inc
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2020-07-17

Abstract

本发明公开了一种CD20/CD47双特异性抗体及应用，该双特异抗体能同时靶向CD20和CD47，包括抗CD20的抗体以及人SIRPa膜胞外段第一个功能区(SIRPaD1)，SIRPaD1和CD20抗体重链的N端通过连接肽进行连接，Fc部分采取部分点突变增强ADCC/CDC。针对CD20部分，所述双特性抗体表现出对肿瘤细胞的ADCC/CDC作用强于CD20单抗激活的ADCC/CDC；针对CD47部分，该双特异抗体能够有效阻断CD47阳性肿瘤细胞与SIRPa的结合，激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性(ADCP)，且强于重组蛋白SIRPaD1‑Fc及CD47单抗激活的ADCP。所述双特异抗体表现出对CD20⁺/CD47⁺双阳性肿瘤细胞更特异的靶向结合及杀伤作用，对单阳性细胞尤其CD47⁺单阳性细胞(如红细胞RBC)表现出不结合或弱结合，对人体外周血单核细胞(PBMC)表现出不结合或弱结合，对RBC及PBMC等正常细胞无ADCC/CDC等免疫杀伤副作用，对红细胞无凝集副作用。

Description

一种CD20/CD47双特异性抗体及应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及包括抗体工程技术领域及免疫性领域，更具体的涉及一种CD20/CD47双特异性抗体及应用。

背景技术

CD20表达于除浆细胞(分泌免疫球蛋白的B细胞)外的发育分化各阶段的B细胞的表面，通过调节跨膜钙离子流动直接对B细胞起作用，在B细胞增殖和分化中起重要的调节作用。CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95％以上的B细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。针对CD20抗原在B细胞性淋巴瘤中表达的相对特异性，多个CD20抗体药物已被批准上市，罗氏旗下开发的Rituxan近年来一直占据着抗体药市场前列，在淋巴瘤方面有着良好的治疗效果。尽管如此，依然有一定比例的患者存在用药复发的状况，其中机制尚不清楚。

CD47也被称为整合素相关蛋白(Integrin Associated Protein，IAP)，广泛的表达于细胞的表面，可与信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα，SIRPα)、血小板反应蛋白(Thrombospondin-1，TSP1)以及整合素(Integrins)相互作用，介导细胞凋亡、增殖、免疫等一系列的反应。CD47在19世纪80年代首次被确认为人类卵巢癌的肿瘤抗原，继而CD47被发现在多种类型的人类肿瘤中表达，包括急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍金性淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌(BC)和其他实体肿瘤。多个研究表明，在细胞水平上，通过阻断SIRPα-CD47之间的相关作用可有效激活巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用，在体内通过CD47抗体阻断SIRPα-CD47之间的相关作用可有效的抑制肿瘤在小鼠体内的生长。针对阻断SIRPα-CD47信号通路已有多种抑制剂的研究报道，包括FortySevern公司的抗CD47单抗Hu5F9-G4、TRILLIUMTHERAPEUTICS，INC.公司的双功能融合蛋白TTI-621等，目前处于临床Phase I/II。单药或联合CD20药物或PD-1等免疫治疗药物，初步临床数据揭示相对单药有着更显著的治疗效果。

CD47/CD20在淋巴瘤细胞皆有着高表达，单药CD47抑制剂或者CD20抑制剂皆有着临床治疗价值，但同时存在一定的副作用，尤其CD47抗体与红细胞的结合引起红细胞凝集。而利用CD47配体SIRPa则能够显著的降低这种红细胞结合，但非特异性结合依然存在，而如果将同时靶向CD20和CD47进行淋巴瘤治疗，不但能够提高癌细胞特异杀伤，通过改善亲和力更能够降低副作用。A bispecific antibody targeting CD47 and CD20 selectivelybinds and eliminates dual antigen expressing lymphoma cells、CD20-selectiveinhibition of CD47-SIRPa“don’t eat me”signaling with a bispecificantibody-derivative enhances the anticancer activity of daratumumab,alemtuzumab andobinutuzumab这两篇皆表明了开发CD20-CD47双靶点多功能蛋白具有现实可行性。

目前市场上尚未有同时针对CD47及CD20双靶点的上市治疗性重组蛋白。CD47靶点抑制可以激起巨噬细胞的免疫作用，在B细胞、T细胞治疗肿瘤之后发现的新治疗机制，具有广阔的应用前景。CD47/CD20在B、T淋巴瘤细胞皆有着高表达情形，因此针对两个靶点联合治疗有着潜在临床应用价值。

专利申请号201710151979.6和WO2018/166507的发明专利公开了一种新型重组双功能融合蛋白，该发明提出的重组双功能融合蛋白(CD20mAb-SD1)由抗人CD20单克隆抗体与人SIRPa膜外端第一个功能区(SIRPaD1)经Fc的C端直接串联而成(无linker)，通过同时靶向CD20/CD47起到激活免疫细胞对肿瘤细胞的ADCC/CDC/ADCP杀伤活性。以及另一种重组双功能融合蛋白(SD1-CD20mAb)，人SIRPa膜外端第一个功能区(SIRPaD1)C端经GGGGSGGGGS与CD20抗体重链N端连接而成。

在申请号201710151979.6和WO2018/166507的专利中，SIRPaD1进行了N80A的突变，CD20mAb-SD1中的SIRPaD1同CD20抗体经Fc的C端直接串联而成，对肿瘤细胞的ADCC作用相对CD20单抗来说并未得到显著增强。对肿瘤细胞的CDC作用相对CD20单抗来看有所下降，可能此种结构对CD20/CD47的同时靶向存在一定的空间位阻，对免疫功能的最大化激活存在一定的阻碍。另外，N80A突变对SIRPa与CD47的阻断没有显著的改变作用，专利CN201811187563.0作了实验论证。

发明内容

本发明的目的是提供一种CD20/CD47双特异性抗体及其制备方法和应用，通过将人SIRPa与CD20抗体以不同的结构方式构建双特异性抗体，发现在其中一种优选结构下的双特异性抗体(9020-1RP)具有显著增强的ADCC/CDC活性及ADCP功能，在此结构下对Fc进行组合突变，获得另一种Fc突变形式的双特异性抗体(9020-T1RP)，9020-T1RP在ADCC或CDC方面具有不同程度的增强作用。本发明中的优选结构是指人SIRPaD1和CD20抗体重链的N端通过连接肽构建成对称型双特异抗体。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明公开了一种CD20/CD47双特异性抗体，包括抗CD20的CD20抗体和人SIRPa胞外段的第一个结构域SIRPaD1，所述SIRPaD1通过连接肽连接在CD20抗体重链的N端。

优选地，所述CD20抗体的类型为IgG1亚型。

优选地，所述CD20抗体重链Fc包含IgG1野生型Fc-WT(SEQ ID NO.9)(SEQ IDNO.10)或IgG1组合突变ADCC增强型Fc-MT(SEQ ID NO.11)(SEQ ID NO.12)，对应的双特异性抗体分别为9020-1RP，和9020-T1RP；更优选ADCC增强型，即9020-T1RP。

优选地，所述人SIRPa为野生型V2(CAA71403.1 30-504aa GeneBank)，人SIRPa胞外段为人SIRPa胞外段的第一个结构域SIRPaD1(SEQ ID NO.1)。

优选地，所述连接肽的序列为(GGGGS)*3。

优选地，所述CD20/CD47双特异性抗体的结构为对称性同源二聚体。

本发明还提供一种氨基酸，其编码上述的CD20/CD47双特异性抗体。

本发明还提供一种多聚核苷酸，其编码上述的氨基酸。

本发明还提供一种表达载体，其包含上述的多聚核苷酸。

本发明还提供一种宿主细胞，其包含上述的表达载体。

本发明还提供一种上述CD20/CD47双特异性抗体在制备治疗肿瘤疾患CD20/CD47过度表达的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤疾患包括血液瘤疾患中的至少一种，所述血液瘤疾患包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T-细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合白血病、非霍奇金淋巴瘤中的至少一种。

本发明的有益效果如下：

本发明公开了一组CD20/CD47的双特异性抗体，其中CD47优选人SIRPa膜外端的第一个功能区SIRPaD1，通过连接肽(linker)和CD20抗体重链的N端连接，构成对称性同源二聚体结构的双特异性抗体。CD20抗体重链Fc任选IgG1野生型或突变型，优选IgG1组合突变ADCC增强型，获得双特异性抗体9020-T1RP。

本发明在蛋白水平及细胞水平评估了CD20/CD47双特异性抗体的靶向特异性，证实了9020-T1RP能够同时靶向CD20和CD47，在多种CD20⁺/CD47⁺的肿瘤细胞模型中，有效的激活抗体介导的细胞依赖的细胞毒作用(ADCC)和抗体补体依赖的补体杀伤作用(CDC)以及通过阻断CD47和其配体SIRPa的结合从而激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性(ADCP)。相比CD20单抗或其他形式的双特异性抗体，9020-T1RP有着更强的ADCC/CDC作用，相比CD47融合蛋白抑制剂或者CD47单抗或者其他形式的双特异性抗体，有着增强或相当的ADCP功效。具体地，在本发明所涉及的双抗结构中，9020-T1RP与CD47的结合有着10～50倍的降低，显著降低了CD47脱靶引发的副作用。

本发明同时做了安全性评估，验证其脱靶副作用，研究证实9020-T1RP针对CD20⁺CD47⁺有着更高的特异性，对单阳性细胞尤其CD47⁺单阳性细胞(如红细胞RBC)表现出不结合或弱结合，对人体外周血单核细胞(PBMC)表现出不结合或弱结合，对RBC及PBMC等正常细胞无ADCC/CDC/ADCP等免疫杀伤副作用，对红细胞无凝血。此外将CD20⁺/CD47⁺肿瘤细胞与红细胞(RBC)以不同比例进行混合，检测双抗的靶向特异性，研究发现9020-T1RP相比CD47单抗或SIRPa融合蛋白或CD20单抗或其他结构形式的双抗，不论在结合强度还是结合比例上，表现出更特异的结合CD20⁺/CD47⁺肿瘤细胞。

附图说明

图1是本发明9020-T1RP及其他形式双抗9020-1RP/9020-2RP/9020-6RP的结构示意图。

图2是本发明实施例双特异性抗体表达纯化的SDS-PAGE图。

图3是本发明实施例SEC-HPLC对9020-T1RP纯度分析结果。

图4是本发明实验例1双特异性抗体CD20/CD47结合实验结果，图4A是双抗与CD47靶点结合剂量效应实验(ELISA)结果，图4B是双抗与CD20靶点结合剂量效应实验(FACS)结果。

图5是本发明实验例2多种肿瘤细胞系细胞表面CD20/CD47表达水平检测结果，图5A是SHP-77、CHO-K1-Cyno CD47、Ramous、HL60、Raji、Daudi、CCRF-CEM、CHO-K1-humanCD47、DU145、A431及RBC的CD20/CD47表达水平检测结果，图5B是CHO-K1、PC-3、MDA-MB-231、U87、RBC及JURKAT的CD20/CD47表达水平的检测结果。

图6是本发明实验例3双特异性抗体靶点结合剂量效应实验(FACS)结果，图6A是与表达人CD20/CD47肿瘤细胞株Ramous癌细胞系的结合活性，图6B是与表达人CD20/CD47肿瘤细胞株Raji癌细胞系的结合活性，图6C是与表达人CD20/CD47肿瘤细胞株Daudi癌细胞系的结合活性。

图7是本发明实验例4双特异性抗体靶点结合特异性实验-I结果，图7A是抗体在CHO-K1/hCD47与CHO-K1/hCD20-CD47细胞上的结合，图7B是抗体在CHO-K1/hCD20与CHO-K1/hCD20-CD47细胞上的结合。

图8是本发明实验例5双特异性抗体靶点结合特异性实验-II结果，图8A是抗体分别在Raji与RBC上的结合，图8B是抗体在Raji混合RBC中的Raji上的结合，图8C是抗体在Raji混合RBC中的RBC上的结合。

图9是本发明实验例6双特异抗体与红细胞(RBC)的结合剂量效应评价结果，图9B是对图9A的进一步检测论证抗体同红细胞的结合剂量效应。

图10是本发明实验例7双特异性抗体9020-T1RP Fc端与受体结合实验结果图，图10A是抗体与CD16a结合实验结果，图10B是抗体与CD32b结合实验结果。

图11是本发明实验例8双特异性抗体对红细胞凝集效果图。

图12是本发明实验例9双特异性抗体对肿瘤细胞ADCC活性，图12A是双特异性抗体对肿瘤细胞Daudi的ADCC活性，图12B是双特异性抗体对肿瘤细胞Ramous的ADCC活性，图12C是双特异性抗体对肿瘤细胞Raji的ADCC活性，图12D和图12E是双特异性抗体对肿瘤细胞Ramous和Daudi的ADCC进一步实验论证结果。

图13是本发明实验例10双特异性抗体对红细胞及PBMC的ADCC活性，图13A是双特异性抗体对红细胞的ADCC活性，图13B是双特异性抗体对PBMC的ADCC活性，图13C是双特异性抗体对红细胞的ADCC活性的进一步论证结果。

图14是本发明实验例11双特异性抗体对肿瘤细胞CDC活性，图14A是双特异性抗体对Daudi的CDC活性，图14B是双特异性抗体对Ramous的CDC活性，图14C是双特异性抗体对Raji的CDC活性。

图15是本发明实验例12双特异性抗体对红细胞及PBMC的CDC活性，图15A是双特异性抗体对红细胞的CDC活性，图15B是双特异性抗体对PBMC的CDC活性。

图16是本发明实验例13双特异性抗体对巨噬细胞吞噬活性激活(ADCP)，图16A是双特异性抗体在Daudi细胞中对巨噬细胞的吞噬活性激活结果，图16B是双特异性抗体在Raji中对巨噬细胞吞噬活性激活结果。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

本发明基于CD20抗体和SIRPa膜胞外段第一个结构域(SIRPaD1)构建双特异性抗体，其中SIRPaD1可以通过不同方式和CD20抗体进行连接，比如SIRPaD1可以通过连接肽连接到CD20抗体重链的N端、或连接到CD20抗体轻链的N端、或连接到CD20抗体轻链的C端，对应双特异性抗体9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP。

本发明的研究在蛋白、细胞水平上评估了双特异性抗体9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP同CD20/CD47的结合能力，在细胞水平方面本发明选择了CD20、CD47单因子表达的稳定细胞系及肿瘤细胞系、CD20/CD47共表达的稳定细胞系及肿瘤细胞系、CD47单因子表达的正常人体细胞。

本发明继续评估了双特异性抗体9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP在对肿瘤细胞、PBMC/RBC的ADCC/CDC功能方面同CD20抗体及其他形式的双特异性抗体的差异，评估了在ADCP巨噬细胞免疫激活方面同CD47单抗、SIRPaD1融合蛋白及其他形式的双特异性抗体的差异。

研究证实，9020-1RP同CD47在蛋白、细胞水平方面结合有着10～50倍的降低，同时能够继续保持同CD20的结合能力，提高了其对CD20⁺CD47⁺肿瘤细胞的靶向特异性，降低了同正常细胞结合的脱靶性；且ADCC方面显著优于CD20单抗或其他形式的双特异性抗体、ADCP方面优于CD47单抗或融合蛋白或其他形式的双特异性抗体。

本发明在9020-1RP基础上进行了继续研究，具体地，对SIRPaD1进行了组合突变，参照专利201811187563.0(申请号)，SIRPaD1替换为CD002，对应双特异性抗体9020-1RP-C1；另外，对linker进行研究，将原linker替换为抗体重链铰链区ASTKG，对应双特异性抗体为9020-1RP-C2，研究发现，9020-1RP-C1/C2同CD47结合有着显著的增强，降低了对CD20⁺/CD47⁺肿瘤细胞的特异性，9020-1RP-C2同时还产生了一定的凝血；表明CD47的结合亲和力及linker的选择对双特异性抗体的安全性有着重要的影响。

本发明继续在9020-1RP基础上进行了Fc功能研究，人的CD16蛋白在158位由于存在缬氨酸(V)和苯丙氨酸(F)，即CD16-158V和CD16-158F。CD16-158V与抗体Fc亲和力高于CD16-158F。临床数据统计，带有CD16-158V/V纯合体的患者比带有CD16-158F/F纯合体或V/F杂合体的患者对Rituximab和Transtuzumab的治疗效果更优。因此Fc同Fc受体的相互作用在一定程度上影响着抗体的疗效。本发明将Fc的F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L进行突变，对应双特异性抗体9020-T1RP，研究其结合CD16A/CD32B的亲和力，以及ADCC/CDC方面的功能，结果表明9020-T1RP提高了CD16A的亲和力，降低了CD32B的亲和力，在ADCC/CDC方面有着不同程度的改变。

本发明还提供了编码上述双特异性抗体的氨基酸序列、核苷酸序列、表达所述双特异性抗体的表达载体以及制备方法。

本发明对双特异性抗体的结构进行了优化，在不同结构(图1)下对CD47/CD20的靶向特异性进行了评估，表明9020-T1RP能够有效的提高CD20⁺/CD47⁺肿瘤细胞的特异性，降低安全性风险，在ADCC/CDC功能方面有着显著的增强，在ADCP方面有着一定的提高或保持相当大水平。

本发明进一步的优化方案是对SIRPaD1进行选择，比较野生型SIRPaD1及突变型CD002对双特异性抗体在肿瘤靶向特异性的区别。

本发明实施例中所述野生型SIRPaD1氨基酸序列如下(SEQ ID NO.1)：

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS

对应核酸序列如下(SEQ ID NO.2)：

GAAGAGGAGCTGCAGGTCATCCAGCCCGACAAGTCTGTGTCCGTGGCAGCAGGAGAAAGCGCTATCCTGCATTGCACCGTGACCAGCCTGATTCCCGTGGGACCAATCCAGTGGTTCAGAGGAGCCGGACCAGCCAGAGAGCTGATCTACAACCAGAAGGAGGGCCACTTCCCCAGAGTGACAACAGTGTCCGAGAGCACCAAGCGGGAGAACATGGACTTCAGCATCAGCATCAGCAACATCACACCAGCCGACGCCGGCACATACTATTGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCAGCCCAGATACCGAGTTCAAGAGCGGAGCCGGAACAGAGCTGAGCGTGAGAGCCAAGCCTAGC

本发明实施例中所述CD002氨基酸序列如下(SEQ ID NO.3)：

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLFPVGPIQWFRGAGPARELIYNQRQGPFPRVTTVSETTKRENMDFSISISAITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS

对应核酸序列如下(SEQ ID NO.4)：

GAAGAGGAGCTGCAGGTCATCCAGCCCGACAAGTCTGTGTCCGTGGCAGCAGGAGAAAGCGCTATCCTGCATTGCACCGTGACCAGCCTGTTTCCCGTGGGACCAATCCAGTGGTTCAGAGGAGCCGGACCAGCCAGAGAGCTGATCTACAACCAGAGGCAGGGCCCTTTCCCTAGAGTGACAACCGTGTCCGAGACCACCAAGAGGGAGAACATGGACTTCAGCATCAGCATCAGCGCCATCACACCAGCCGACGCCGGCACATACTATTGCGTGAAGTTCCGGAAGGGCAGCCCAGATACCGAGTTCAAGAGCGGAGCCGGAACAGAGCTGAGCGTGAGAGCCAAGCCTAGC

本发明进一步的优化方案是对双特异性抗体的linker进行了研究，比较不同linker是否对双抗的结构产生影响，以及这种影响带来的肿瘤特异性及安全性评价。

所述linker序列为(GGGGS)*3或ASTKG/P。

本发明进一步对双特异性抗体中的CD20抗体进行了优化，在候选抗体利妥昔单抗(Ritxuximab)、阿托珠单抗(Obinutuzumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)中，优选实施例利妥昔单抗(Ritxuximab)。

本发明优选实施例中CD20抗体重链可变区(Rituximab VH)序列如下(SEQ IDNO.5)：

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA

对应核酸序列如下(SEQ ID NO.6)：

CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCAGGAGCAGAACTGGTGAAGCCAGGCGCCAGCGTGAAGATGTCTTGCAAAGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCATTGGGTGAAGCAGACCCCAGGAAGAGGCCTGGAGTGGATCGGTGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACAGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAGGATAGCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGATTGGTACTTCAACGTCTGGGGAGCCGGAACAACAGTGACAGTGTCCGCA

本发明优选实施例中CD20抗体轻链可变区(Rituximab VL)序列如下(SEQ IDNO.7)：

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK

对应核酸序列如下(SEQ ID NO.8)：

CAGATCGTGCTGTCTCAGAGCCCAGCCATTCTGAGCGCTTCTCCAGGCGAGAAGGTCACCATGACTTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGTCCTACATCCATTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGAAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCTAGCGGAGTGCCAGTGAGATTCAGCGGAAGCGGAAGCGGAACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGAGTGGAGGCCGAAGACGCCGCTACATACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCTCCTACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAG

本发明所述的Fc(IgG1-WT)氨基酸序列如下(SEQ ID NO.9)：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

对应核酸序列如下(SEQ ID NO.10)：

GCCAGCACCAAGGGACCTAGCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTCTAGCAAGAGCACAAGCGGAGGAACAGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAAGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGTCTTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACATTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGACTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCTTCTTCTTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGCCGAGCCCAAGTCTTGCGACAAGACCCACACTTGCCCCCCTTGTCCAGCTCCAGAACTCCTGGGAGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCAGAAGTGACTTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAAGACCCCGAGGTCAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCTATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAACCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCTAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAATCTAACGGTCAGCCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAAAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCTTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCAGGAAAG

以下将结合实施例对本发明的方案进行阐述。

实施例双特异性抗体(双抗)表达载体的构建及蛋白表达制备

1、构建表达载体

人的SIRPα拥有两对野生型V1或V2，氨基酸序列27-504位组成成熟的V1(NP_542970.1NCBI)，V2与V1具有13个氨基酸的不同，30-504位氨基酸构成成熟的V2(CAA71403.1GeneBank)，本发明选择野生型2即V2，SIRPαD1的氨基酸序列31-148(SEQ IDNO:1)。

将SIRPαD1同CD20抗体重链的N端或轻链的N端或轻链的C端通过Linker进行连接，构建基因表达载体9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP。SIRPaD1突变体CD002构建成双特异性抗体对应9020-1RP-1C1，9020-1RP替换Linker后对应9020-1RP-1C2，9020-1RP的Fc突变对应9020-T1RP。

所述双特异抗体均有1条重链和1条轻链基因组成。9020-1RP、9020-T1RP、9020-1RP-1C1、9020-1RP-1C2由1条双抗重链和CD20抗体轻链构成，9020-2RP、9020-6RP由1条双抗轻链和CD20抗体重链构成。参见图1。

所述双特异性抗体或重组蛋白的氨基酸的N端加入优化信号肽进行分泌表达，将双特异性抗体或重组蛋白的氨基酸进行密码子优化，并全基因合成，核苷酸的5’端加入Kozak序列GCCGCCACC，核苷酸两端加入pcDNA3.4的酶切位点EcoRI/HindIII，合成基因经酶切后连接到pcDNA3.4。

构建后的表达载体进行目的基因测序。

各融合蛋白的氨基酸及核苷酸构成如下：

9020-1RP重链共有1752个核苷酸(SEQ ID NO:15)，编码584个氨基酸(SEQ ID NO:14)；9020-2RP轻链共有1038个核苷酸(SEQ ID NO:17)，编码346个氨基酸(SEQ ID NO:16)；9020-6RP轻链共有1038个核苷酸(SEQ ID NO:19)，编码346个氨基酸(SEQ ID NO:18)；9020-1RP-1C1重链共有1752个核苷酸(SEQ ID NO:21)，编码584个氨基酸(SEQ ID NO:20)；9020-1RP-1C2重链共有1722个核苷酸(SEQ ID NO:23)，编码574个氨基酸(SEQ ID NO:22)；9020-T1RP重链共有1752个核苷酸(SEQ ID NO:25)，编码584个氨基酸(SEQ ID NO:24)。

2、转染

将9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP、9020-1RP-1C1、9020-1RP-1C2、9020-T1RP、抗体Rituximab(SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7)以及申请号201710151979.6的专利中的CD20mAb-SD1(SEQ ID NO:26)，表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，按照质粒：培养基＝1μg/ml转染Expi-293F细胞。其中9020-1RP、9020-1RP-1C1、9020-1RP-1C2、9020-T1RP双抗重链质粒与CD20抗体轻链质粒共转染，9020-2RP、9020-6RP双抗轻链质粒与CD20抗体重链质粒共转染。Rituximab的Fc选择和9020-T1RP同样的突变定义为Rituximab-TH作为参照，其重链基因编码451个氨基酸(SEQ ID NO:13)。CD20mAb-SD1(重链SEQ ID NO:26)同样采取双质粒共转染表达。

所用转染试剂为ExpiFectamine293TransfectionKit(Theromfisher，Lot#：A14524)，转染时细胞密度为25*10⁵cells/ml，转染后16-18h添加表达增强剂Enhancer1及Enhancer2，转染后5天收集细胞上清。

3、蛋白表达纯化

经ProteinA纯化，在4℃条件下以10000rpm/min，离心30min上清液去除细胞碎片，ProA柱子用平衡液(0.02MPB、0.15MNaCl、pH7.0)平衡10个柱体积后，以2ml/min的速度使上清液流过柱子，上样完成后使用平衡液对结合后的柱子清洗5个柱体积，加入洗脱液(0.02MPB、0.15MNaCl、pH3.0)洗脱，洗脱液滴入到加入中和液(1MTris，pH9.0)收集管中。收集到蛋白洗脱液，使用超滤管(MilliporeUFC903096)4000G超滤浓缩并置换buffer成PBS(HyCloneSH30256.01)，SDS-PAGE检测后放到-20℃保存。去内毒素，过滤除菌，SDS-PAGE纯度检测，如图2所示，总体上实际分子量接近理论分子量。同时本发明所涉及的双特异性抗体并没有因其不同结构影响在宿主细胞中的表达。

4、蛋白纯度分析

将1mg/ml的双特异性抗体进行SEC-HPLC纯度分析，多聚体含量低于2％，目的蛋白纯度>96％。如图3所示。

实验例双特异性性能及功能分析

实验例1双特异性抗体CD47/CD20结合实验

1、双抗与CD47的结合通过ELISA检测：

将hCD47-his(Cat#CD7-H5227，Lot#C56P1-737F1-FA)按照1μg/ml进行包被，包被缓冲液选择PBS(HyCloneLot:AC13298279)，100μl/孔，常温(25℃)包被16-18h，TBST洗板2次，PBS+3％BSA进行封闭，200μl/孔，常温(25℃)封闭16-18h，TBST洗板1次，扣干，37℃干燥2小时。

双特异性抗体系列稀释：按照330μl 10μg/ml配制9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP、9020-1RP-1C1、9020-1RP-1C2、9020-T1RP、CD20mAb-SD1以及抗体Rituximab，重组蛋白SIRPaD1、CD002，100μg/ml为第一个梯度，进行3倍梯度稀释，例如第二个梯度是将第一个梯度80μl加入160μl PBS，依次类推，共8个梯度浓度。

37℃孵育1小时。自动洗板机PBST洗板3次后，每孔加入100μl 1：20000稀释的羊抗人HRP二抗(abcamLot#：ab98624)，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板3次，最后一次洗涤完成后拿酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μl TMB显色液。避光反应3-5分钟，每孔加入50μl 1％H₂SO₄终止反应。设置MD(I3X)酶标仪读取吸光值为450nm和630nm，自动读取完数值后保存数据。结果如图4A所示。9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP相对于SIRPaD1与CD47的亲和力有10～20倍降低；9020-1RP-1C1相对于CD002与CD47的亲和力有5倍降低；9020-1RP-1C2对比9020-1RP与CD47的亲和力有10倍的提高。

结果表明，SIRPaD1不论与CD20抗体的重链的N端还是与CD20抗体轻链的N端或CD20抗体的C端，都能够显著降低与CD47的结合能力，因此通过双抗的设计可以降低CD47的亲和力来降低CD47带来的潜在风险；Linker的改变也会影响双抗中SIRPaD1与CD47的结合。

2、双抗与CD20的结合通过FACS检测：

利用流式细胞仪(BDFACSCelestaCellAnalyzer)测定9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP、9020-1RP-1C1、9020-1RP-1C2、9020-T1RP以及抗体Rituximab、重组蛋白SIRPaD1、CD002与表达人CD20的稳定细胞株CHO-K1/CD20的结合活性。

具体实施如下：

分别将所列细胞进行消化后(悬浮细胞无需消化)，室温进行离心处理，1000rpm，5mins，弃上清，经PBS洗涤后，PBS重悬于细胞流式管中，细胞浓度调整为1*10⁶cells/ml。每管PBS体积为250μL，双特异性抗体的反应浓度为7个梯度，100μg/ml 3倍梯度稀释；室温孵育1h后，PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管样品加入100μL二抗GoatAnti-humanIgG/Alexa647(BiossLot:AE041526)，室温避光孵育30mins后，加入1mLPBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管加入500μL PBS重悬细胞，上机检测。结果如图4B所示，9020-2RP与CD20结合显著降低，其他双抗与CD20的结合相比于Rituximab略有降低，表明双抗的设计不仅会改变同CD47的结合同时也会影响同CD20的结合，本发明的优选结构9020-T1RP在降低CD47结合能力的同时保证了同CD20的靶向结合能力。

实验例2 CD47/CD20在细胞表面表达水平

在靶向特异性检测中，为了能够更好的选择合理细胞株作为试验对象。我们对多个肿瘤细胞株进行细胞表面的CD47及CD20表达水平检测。

利用流式细胞仪(BDFACSCelestaCellAnalyzer)测定Raji、Daudi、Ramous、HL60、MDA-MB231、SHP-77等血液瘤及实体瘤细胞系及RBC的CD20/CD47表达水平。本实验例采用的试剂与仪器见表1。

表1.本发明实验例2采用的试剂与仪器列表

具体实施如下：

1.先在显微镜下观察各细胞，在细胞圆润、透亮，正常状态下收集细胞，计数，1500rpm离心5min。

2.弃上清，用PBS(Hyclone，SH30256.01)重悬各细胞后，96孔板，每孔加入25×10⁴个细胞，每孔50μL。

3.同时每孔加入相应抗体(Rituximab，H5F9-G4，HIgG)10μg/mL，50μL。室温避光孵育30min。

4.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次，加入Alexa Fluor 647AffinipureGoat Anti-Human IgG+IgM(H+L)(Jackson，109605044)。室温避光孵育30min。

5.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次后，弃上清，每孔加入100μL PBS，流式细胞仪(Beckman，cytoflex)分析数据，使用GraphPad Prism作图。

SHP-77、CHO-K1-Cyno CD47、Ramous、HL60、Raji、Daudi、CCRF-CEM、CHO-K1-humanCD47、DU145、A431及RBC的CD20/CD47表达水平检测结果如图5A所示，CHO-K1、PC-3、MDA-MB-231、U87、RBC及JURKAT的CD20/CD47表达水平的9020检测结果如图5B所示。检测结果显示，CD20主要表达于Raji、Daudi、Ramous等血液肿瘤细胞；CD47在多个血液瘤和实体瘤细胞中高表达，尤其PC-3、MDA-MB-231、Jurkat、Daudi等肿瘤细胞中表达水平显著高于RBC中的CD47表达水平；CD20/CD47共表达主要存在于Raji、Daudi、Ramous等血液肿瘤细胞，且CD20表达水平高于CD47表达水平。

上述结果提示CD20/CD47双抗的设计主要以Raji、Daudi、Ramous等血液瘤模型进行实验论证。由于CD20表达相对特异，CD47在RBC中的高表达，双抗的靶向应有意倾向CD20，平衡CD47的药效和安全性。

实验例3双特异性抗体靶点结合实验(FACS)

利用流式细胞仪(BDFACSCelestaCellAnalyzer)测定9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP、9020-1RP-1C1、9020-1RP-1C2、9020-T1RP以及抗体Rituximab、重组蛋白SIRPaD1、CD002与表达人CD20/CD47肿瘤细胞株Raji、Daudi、Ramous等癌细胞系的结合活性。

具体实施如下：

分别将所列细胞进行消化后(悬浮细胞无需消化)，室温进行离心处理，1000rpm，5mins，弃上清，经PBS洗涤后，PBS重悬于细胞流式管中，细胞浓度调整为1*10⁶cells/ml。每管PBS体积为250μL，双特异性抗体的反应浓度为7个梯度，100μg/ml 3倍梯度稀释；室温孵育1h后，PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管样品加入100μL二抗GoatAnti-humanIgG/Alexa647(BiossLot:AE041526)，室温避光孵育30mins后，加入1mLPBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管加入500μLPBS重悬细胞，上机检测。

9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP、9020-1RP-1C1、9020-1RP-1C2、9020-T1RP以及抗体Rituximab、重组蛋白SIRPaD1、CD002与表达人CD20/CD47肿瘤细胞株Ramous癌细胞系的结合活性如图6A所示，与表达人CD20/CD47肿瘤细胞株Raji癌细胞系的结合活性如图6B所示，与表达人CD20/CD47肿瘤细胞株Daudi癌细胞系的结合活性如图6C所示。

结果表明：

1、在双抗的三种结构(图1)设计中，9020-1RP、9020-6RP靶向CD20/CD47共表达的Raji、Daudi、Ramous等血液肿瘤细胞能力显著强于9020-2RP，结合双特异性抗体与CD47靶向的结果(实验例1)，可以得出SIRPaD1与CD20抗体轻链的N端进行串联，显著限制了CD20抗体端的生物活性。

2、9020-1RP-1C1靶向CD20/CD47共表达的Raji、Daudi、Ramous等血液肿瘤细胞能力相对于9020-1RP有所下降，而实验例1中9020-1RP-1C1靶向CD47能力显著强于9020-1RP，结果表明双抗靶向CD47端的亲和力增强及9020-2RP的结构可能会影响双抗靶向CD20端的活性，即双抗设计中CD47端亲和力的降低不仅可以降低潜在安全性风险，而且能够提高双抗对于CD20/CD47共表达肿瘤细胞系的特异靶向能力。

3、9020-T1RP、9020-1RP、9020-6RP、Rituximab、CD20mAb-SD1与三种肿瘤细胞的结合能力无显著差异，9020-1RP-1C2略有下降。

实验例4双特异性抗体靶点结合特异性实验-I(FACS)

CD20/CD47共表达稳定细胞株与CD20或CD47单因子表达的稳定细胞株混合，检测双特异性抗体对CD20/CD47共表达细胞株的结合特异性。本实验例采用的试剂和仪器见表2。

表2.实验例4采用的试剂和仪器列表

具体实施如下：

1.先在显微镜下观察CHO-K1/hCD47或CHO-K1/hCD20和CHO-K1/hCD20-CD47细胞，在细胞圆润、透亮，正常状态下收集细胞，计数，1500rpm离心5min。

2.弃上清，用PBS(Hyclone，SH30256.01)重悬CHO-K1/hCD47或CHO-K1/hCD20细胞后，加入CFSE(Abcam，Ab113853)后置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育15min。孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤，重新计数。

3.将CHO-K1/hCD47或CHO-K1/hCD20与CHO-K1/hCD20-CD47细胞1：1混合(每孔2×10⁵cells)，每孔50μL，同时每孔加入相应抗体(9020-1RP，9020-2RP，9020-6RP，Rituximab，B6H12，SIRPa，H5F9-G4，HIgG)10μg/mL，50μL。室温避光孵育30min。

抗体在CHO-K1/hCD47与CHO-K1/hCD20-CD47细胞上的结合如图7A所示，在CD47单因子表达的稳定细胞株(CHO-K1/human CD47)与CD20/CD47共表达细胞株1:1(CHO-K1/human CD47/CD20)混合后，9020-1RP、9020-6RP特异性靶向CHO-K1/human CD47/CD20。9020-2RP与CHO-K1/human CD47/CD20结合能力相对减弱显著，结果与SIRPaD1类似。CD47单抗H5F9-G4/B6H12靶向CHO-K1/human CD47的水平与靶向CHO-K1/human CD47/CD20的水平无显著差异，结论再一次表明提高双抗靶向CD20/CD47的特异性，需要降低CD47端的亲和力。

抗体在CHO-K1/hCD20与CHO-K1/hCD20-CD47细胞上的结合如图7B所示，当CD20单因子表达的稳定细胞株(CHO-K1/human CD20)与CD20/CD47共表达细胞株1:1(CHO-K1/human CD47/CD20)混合后，9020-1RP、9020-6RP、Rituximab特异性靶向CHO-K1/humanCD47/CD20的能力无显著差异，9020-2RP、H5F9-G4与CHO-K1/human CD47/CD20的结合能力相对弱一些。另外，9020-1RP、9020-6RP、Rituximab与CHO-K1/human CD20亲和力强于9020-2RP与CHO-K1/human CD20的亲和力，也再次证实9020-2RP的双抗结构可能限制了靶向CD20的生物活性。

实验例5双特异性抗体靶点结合特异性实验-II(FACS)

CD20/CD47共表达肿瘤细胞株Raji与CD47单因子表达的人体红细胞(RBC)以20:1混合，检测双特异性抗体对CD20/CD47共表达肿瘤细胞株的靶向特异性。

具体实施如下：

1.先在显微镜下观察Raji细胞，在细胞圆润、透亮，正常状态下收集细胞，计数，1500rpm离心5min。

2.弃上清，用PBS(Hyclone，SH30256.01)重悬Raji细胞后，加入CFSE(Abcam，Ab113853)后置于37℃，5％CO2培养箱中孵育15min。

3.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤，重新计数。

4.将RBC与Raji细胞20：1混合(RBC每孔20×10⁵cells，Raji每孔1×10⁵cells)，每孔50μL，同时每孔加入相应抗体(9020-1RP，9020-T1RP，9020-1RP-C1，9020-1RP-C2，CD20mAB-SD1，Rituximab-TH，Rituximab，CD002，SIRPaD1，H5F9-G4，HIgG)10μg/mL，50μL。室温避光孵育30min。

5.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次，加入Alexa Fluor 647AffinipureGoat Anti-Human IgG+IgM(H+L)(Jackson，109605044)。室温避光孵育30min。

6.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次后，弃上清，每孔加入100μL PBS，流式细胞仪(Beckman，cytoflex)分析数据，使用GraphPad Prism作图。

将CD20/CD47共表达细胞株Raji与CD47单因子表达正常人体红细胞RBC按照20:1混合后，9020-1RP、9020-T1RP特异性靶向Raji(图8A)，而9020-1RP-1C1、9020-1RP-1C2与红细胞有较强的结合，表明双抗中CD47端的结合能力增强会影响双抗的靶向特异性；9020-1RP在Raji和RBC混合细胞群中的Raji靶向特异性强于CD20mAb-SD1(图8B)，9020-T1RP、9020-1RP在Raji和RBC混合细胞群中的RBC非特异结合弱于CD20mAb-SD1(图8C)。

实验例6双特异性抗体红细胞结合实验(FACS)

CD47单抗存在与红细胞(RBC)结合的特性，对CD47抗体抑制剂来说，存在药效受RBC干扰及肿瘤脱靶的潜在风险，双特异性抗体的有效设计可以通过降低CD47端的亲和力来降低这种风险。通过体外检测双特异性抗体与RBC的结合来评估双抗的安全性。本实验例采用的试剂和仪器见表3。

表3.实验例6采用的试剂和仪器列表

RBC来源：新鲜血液由肝素钠抗凝管(BD Vacutainer，367880)当天采取，捐献者：公司职员。

新鲜血液经淋巴细胞分离液(Stemcell，07801)分离后，将底部的红细胞吸出，经过2次1000rpm离心5min及1次800rpm离心5min的洗涤后，用于本次实验。

具体实施如下：

1.RBC计数后，96孔板每孔2×10⁵个，每孔50μL。

2.同时每孔加入相应抗体(9020-1RP，9020-2RP，9020-6RP，B6H12，9020-T1RP，9020-1RP-1C1，9020-1RP-1C2，CD20mAB-SD1，Rituximab-TH，Rituximab，CD002，SIRPaD1，H5F9-G4，HIgG)10μg/mL，3倍梯度稀释，共8孔，50μL。室温避光孵育30min。

3.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次，加入Alexa Fluor 647AffinipureGoat Anti-Human IgG+IgM(H+L)(Jackson，109605044)。室温避光孵育30min。

4.孵育完成后，1500rpm离心5min洗涤3次后，弃上清，每孔加入100μL PBS，流式细胞仪(Beckman，cytoflex)分析数据，使用GraphPad Prism作图。

如图9A，9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP与RBC不结合或者若结合，当9020-1RP中的CD47部分结合增强(9020-1RP-1C1)或者Linker改变(9020-1RP-1C2)之后，其结合RBC都显著增强(图9B)。Fc的突变双抗(9020-T1RP)与RBC不结合，弱于9020-1RP与红细胞的结合。

实验例7双特异性抗体9020-T1RP Fc端与受体结合实验(FACS)

将靶蛋白RIIIA/CD16a(Catalog：4325-FC-050)和RIIB/C CD32b/c(Catalog：1875-CD-050)包被ELISA板，1μg/ml，4℃过夜；PBST洗涤后，加入2％BSA的PBST，37℃封闭2h；PBST洗涤后，加入不同浓度的抗体，37℃反应2小时；PBST洗涤后，加入羊抗人IgG-HRP(Catalog：ab98624，abcam)，室温反应1h；PBST洗涤后，TMB双组份(A液：cat#:TMB-S-003、B液：cat#TMB-S-003潮州英创)法显色，每孔加入100μl配好的TMB显色液避光反应3-5分钟，加入50μl终止液1％H₂SO₄(cat#C1058-500ml solarbio)测定OD450。分析待测抗体与CD16a和CD32b蛋白结合能力。

Fc突变双抗或突变前双抗均能特异性识别结合CD16a和CD32b蛋白，9020-T1RP和Rituximab-TH突变体结合CD16a蛋白的能力强于9020-1RP和Rituximab，结果如图10A所示；9020-T1RP和Rituximab-TH突变体结合CD32b/c蛋白比9020-1RP和Rituximab抗体结合力低，结果如图10B所示。

Fc突变后与ADCC激活性受体CD16a结合的增强及与抑制性受体CD32b结合的减弱，将使得带有CD16-158F/F纯合体或V/F杂合体的患者对双抗产生更多的获益。

实验例8双特异性抗体红细胞凝结实验(Hemagglutinationactivity)

利用来自健康人的红细胞测定9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP、9020-1RP-1C1、9020-1RP-1C2、9020-T1RP、SIRPaD1、CD002对红血球的凝集活性，H5F9-G4作为阳性对照，9020-3-991、9020-3-992、9020-3-993是CD20/CD47的另外结构形式的双特异性抗体。

具体实施如下：

使用柠檬酸钠等抗凝血剂收集全血；将全血置于15ml离心管，PBS补足至15ml，室温离心，200×g，10mins，弃上清；用PBS将RBCs补足至15mL，混匀后，室温离心，1500rpm，5mins。洗涤3次；最后一次洗涤后，使用PBS调节RBCs浓度为2％(如在1ml的RBCs中加入49ml的PBS；将重组蛋白及阳性抗体按照200μg/ml进行2倍梯度稀释，共计15个浓度梯度；使用96孔圆底板，每孔加入50μl相应浓度的重组蛋白或单抗与50μl的RBCs，室温孵育2h后观察并记录反应结果。

结果(图11)显示9020-T1RP、9020-1RP、9020-1RP-1C2均没有导致红细胞凝结，H5F9-G4在1.25μg水平以上发生凝血。9020-1RP、9020-T1RP相对H5F9-G4等CD47单抗抑制剂有更高的安全性。

实验例9双特异性抗体对肿瘤细胞的ADCC活性(FACS)

通过Jurkat-FcγRIIIa-NFAT-Luciferase细胞作为效应细胞检测评估双特异性抗体对Raji、Ramous、Daudi的ADCC活性。其中9020-3-991/9020-3-992/9020-3-993是一种同9020-1RP相同结构形式的双抗，CD47部分采用ScFv形式。本实验例采用的试剂和仪器见表4。

表4.实验例9采用的试剂和仪器列表

名称	品牌	货号
			白色平底无菌板	Costar	3917
1640	Gbico	11875-093
			FBS	MRC	CCS30010.02
Bio-glo	promega	G7940
			酶标仪	SpectraMax	i3X

具体实施如下：

1.先在显微镜下观察靶细胞，在细胞圆润、透亮，正常状态下收集细胞，计数，1500rpm离心5min。

2.弃上清，用1640+0.5％FBS重悬靶细胞，混匀后加入白色平底无菌板，1*10⁴cells/孔，每孔25μl。

3.在上述板中加入配置好的4倍终浓度的待测抗体，每孔25μl，37℃，5％CO₂培养箱孵育30min。

4.孵育完成后，加入Jurkat-FcγRIIIa-NFAT-Luciferase细胞，6*10⁴cells/孔，每孔50μl。体积不足100μl(对照孔)，用1640+0.5％FBS培养基补足至100μl，混匀后37℃，5％CO₂培养箱孵育6h。

5.每孔加入40μl Bio-glo，避光孵育5min，酶标仪读取化学发光。

ADCC活性结果显示：

1、9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP三者中9020-6RP ADCC活性最强，9020-2RP ADCC活性最弱，如图12A、12B。即ADCC活性9020-6RP>9020-1RP>9020-2RP。

2、9020-T1RP的ADCC活性显著强于Rituximab、Rituximab-TH(Fc突变)以及CD20mAb-SD1，如图12C、12D、12E。即ADCC活性(9020-T1RP/9020-1RP)>(Rituximab/Rituximab-TH),(9020-T1RP/9020-1RP)>CD20mAb-SD1。

9020-T1RP相对于Rituximab、Rituximab-TH较强的ADCC活性，揭示双抗的CD47部分对ADCC活性的增强有一定的贡献。另外9020-T1RP的ADCC活性亦强于其他结构的双抗，如9020-2RP、CD20mAb-SD1，提示双抗的结构在ADCC活性中有着重大的影响。

实验例10双特异性抗体对正常细胞的ADCC活性(FACS)

通过Jurkat-FcγRIIIa-NFAT-Luciferase细胞作为效应细胞检测双特异性抗体对红细胞(RBC)、外周血单核细胞(PBMC)的ADCC活性，评估其安全性。本实验例采用的试剂和仪器见表5。

表5.实验例9采用的试剂和仪器列表

具体实施如下：

3.在上述板中加入配制好的4倍终浓度的待测抗体，每孔25μl，37℃，5％CO₂培养箱孵育30min。

5.每孔加入40μl Bio-glo，避光孵育5min，酶标仪读取化学发光。

如图13A，结果显示9020-6RP对正常RBC产生ADCC杀伤活性，实验例9结果显示9020-6RP对肿瘤细胞有很强的ADCC活性，但对RBC较强的ADCC作用降低了其安全性。SIRPaD1同样也会对正常RBC产生ADCC杀伤活性，表明CD47融合蛋白抑制剂若采用IgG1形式的Fc将会产生很大的ADCC安全风险。

9020-T1RP对RBC或PBMC的ADCC活性较低，ADCC安全性类似于Rituximab，如图13B、13C。

实验例11双特异性抗体对肿瘤细胞的CDC活性(FACS)

通过血清中的补体体外检测评估双特异性抗体对Raji、Ramous、Daudi的CDC活性。

具体实施如下：

1.显微镜下观察靶细胞，在细胞圆润、透亮，正常状态下收集细胞靶细胞，计数，每个抗体，每个梯度2个重复孔，多铺一列靶细胞作为不加抗体的对照孔，1.5*10⁴cells/孔。根据计算取所需细胞，离心1500rpm 5min，弃上清。

2.用2％FBS+1640培养基(1640：Gbico，REF：61870-036；FBS：MRC REF：CCS30010.02)重悬靶细胞，加入白色平底无菌96孔板中(Costar，REF：3917)，1.5*10⁴cells/孔，每孔25μl。

3.在上述板中加入用2％FBS+1640培养基稀释好的4倍终浓度的待测抗体，每孔25μl，待测抗体第一个点终浓度100μg/ml，10倍梯度稀释，共8个点，对照孔加入25μl 2％FBS+1640培养基。37℃，5％CO₂培养箱孵育30min。

4.孵育完成后，每孔加入用2％FBS+1640培养基配制的20％的Human serum AB血清(Gemini，Cat：100-512)50μl，使Human serum AB血清终浓度为10％，37℃，5％CO₂培养箱孵育4h。整个操作过程保持无菌状态。

5.每孔加入20μl CTG(promega，REF：G7572)，避光孵育5分钟，酶标仪(

i3X)读取化学发光，分析结果。

如图14A、B、C结果显示：

1、9020-2RP对Raji、Daudi、Ramous三种肿瘤细胞系均不产生CDC活性，9020-1RP、9020-6RP对肿瘤细胞的CDC活性强于CD20mAb-SD1，但是弱于Rituximab；

2、9020-1RP的Fc突变后9020-T1RP的CDC活性显著增强，和Rituximab的CDC活性相当。9020-1RP-1C1、9020-1RP-1C2的CDC活性与9020-1RP无明显差异。

上述结果表明CDC活性不仅需要Fc的参与，还需要靶向靶标结合的能力，如9020-2RP靶向能力差，CDC活性亦很差；此外还受到结构的影响，如双抗CD20mAb-SD1的结构是两个靶点位于Fc两端，这也降低了对肿瘤细胞的CDC活性。

实验例12双特异性抗体对正常细胞的CDC活性(FACS)

通过血清中的补体体外检测双特异性抗体对红细胞(RBC)、外周血单核细胞(PBMC)的CDC活性，评估其安全性。

具体实施如下：

i3X)读取化学发光，分析结果。

如图15A和15B所示，9020-T1RP不会对PBMC及RBC产生CDC活性，这可能与PBMC、RBC细胞表面的靶点表达丰度低有关，不能形成有效的聚体结构产生CDC活性。

实验例13双特异性抗体ADCP激活实验(FACS)

效应细胞MDM分离诱导：抽取20个人的静脉血液分离PBMC，分离单核细胞，加入GM-CSF/M-CSF诱导分化MDM，1周后通过CD11b、CD14、CD45、CD163、CD206生物标志物进行鉴定分化的巨噬细胞MDM；

ADCP：从培养箱中取出靶细胞HL-60，将细胞收集到15ml离心管，离心，弃去上清，用PBS重悬细胞，计数，用PKH26(SIGMA-ALDRICH)染靶细胞，放置37℃&5％CO₂培养过夜；次日将靶细胞从培养基中取出，离心收集细胞，弃上清，使用完全培养基重悬，计数；取靶细胞，加入完全培养基，将细胞和待测样品加入到对应的96孔板中，50000cells/孔；室温孵育0.5h；从培养基中拿出效应细胞(MDM)，收集上清，加PBS清洗，加Accutase消化MDM，让其脱壁，加入相同体积的完全培养基终止消化，将细胞悬液转移到离心管中，将细胞上清和消化下来的细胞按照300g离心10min；取相应体积的MDM细胞，加入完全培养基，将MDM细胞加入到对应靶细胞的96孔板中。效应细胞：靶细胞＝1:1，37℃孵育4h；

加Accutase，显微镜下观察贴壁的细胞是否消化下来(约15min)，取出细胞，将细胞转移到另一块板中，待消化完全将移出的细胞悬液重新加入对应孔中；离心，加入检测抗体CD11b，4℃孵育15min；加PBS到每孔，离心，弃去上清，加PBS重悬；流式细胞仪检测；

数据分析：％PhagocytosisbyMDMs＝{(PKH26+&CD11b+cells)/AllPKH26+cells}×100％。

如图16A和16B所示，9020-1RP对巨噬细胞的ADCP激活和CD20mAb-SD1类似，但9020-T1RP的ADCP活性显著增强。且9020-T1RP的ADCP活性强于SIRPaD1。在Daudi细胞模型中，9020-T1RP的ADCP活性强于H5F9-G4。

结论分析：

本发明通过将人SIRPa膜外端的第一个功能区SIRPaD1与CD20抗体以不同形式构建双特异抗体，如9020-1RP、9020-2RP、9020-6RP，在这三种结构中，我们发现9020-1RP具有较好的靶向性及安全性。我们在9020-1RP的基础上继续研究，或将9020-1RP中的SIRPaD1进行突变改变CD47的靶向亲和力(9020-1RP-1C1)、或将双特异性抗体9020-1RP的liker进行改变(9020-1RP-1C2)、或将9020-1RP中的Fc进行突变提高CD16a并降低CD32b的亲和力。

研究结果发现：

1、9020-T1RP能够同时靶向CD20/CD47，并具有很高的特异性。在CD20⁺CD47⁺肿瘤细胞和RBC混合模型实验中，相对于单抗或者其他形式的双抗，9020-1RP、9020-T1RP能够更特异的靶向CD20⁺CD47⁺肿瘤细胞。

2、9020-T1RP具有更强的免疫激活肿瘤杀伤作用。在CD20⁺/CD47⁺的肿瘤细胞模型中，相比于CD20单抗或其他结构形式的双抗，能够更加有效的激活抗体介导的细胞依赖的细胞毒作用(ADCC)和抗体补体依赖的补体杀伤作用(CDC)。另外，本发明中双特异性抗体能够通过阻断CD47和其配体SIRPa的结合从而激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性(ADCP)，相比于CD47的抑制剂(CD47单抗或融合蛋白或其他结构形式的双抗)，9020-T1RP激活的ADCP活性有着一定增强。

3、9020-T1RP体外评价具有良好的安全性。在ADCC/CDC方面，相对于CD20或CD47单抗或其他双抗，9020-T1RP对PBMC及RBC无脱靶引发的ADCC/CDC副作用；在凝血方面，9020-T1RP无凝血副作用。

本发明中的双特异性抗体9020-T1RP同时与专利申请号201710151979.6的发明专利重组双功能融合蛋白(CD20mAb-SD1)作了对比。本发明涉及的双特异抗体9020-T1RP具有对肿瘤细胞CD20⁺CD47⁺更特异的靶向作用。9020-T1RP对肿瘤细胞的ADCC作用显著强于CD20mAb-SD1的ADCC作用，且CDC作用同样显著强与CD20mAb-SD1对肿瘤细胞的CDC作用。

CD20mAb-SD1的结构是Fc位于整个结构的中间部分，SIRPaD1和CD20抗体位于Fc两端，可能限制了CD20与CD47同时靶向的特异性，不能够形成有效的多聚体激活CDC作用。

本发明基于所述实施例能够进一步阐述本发明内容，但不限于实施例，且实施例不是限制本发明的保护范围。本领域技术人员可以基于本发明在权利要求范围内进行各种修改、替换及等同都被包括在本发明中。

序列表

<110> 倍而达药业（苏州）有限公司

<120> 一种CD20/CD47双特异性抗体及应用

<130> 2020

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 2

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gaagaggagc tgcaggtcat ccagcccgac aagtctgtgt ccgtggcagc aggagaaagc 60

gctatcctgc attgcaccgt gaccagcctg attcccgtgg gaccaatcca gtggttcaga 120

ggagccggac cagccagaga gctgatctac aaccagaagg agggccactt ccccagagtg 180

acaacagtgt ccgagagcac caagcgggag aacatggact tcagcatcag catcagcaac 240

atcacaccag ccgacgccgg cacatactat tgcgtgaagt tccggaaggg cagcccagat 300

accgagttca agagcggagc cggaacagag ctgagcgtga gagccaagcc tagc 354

<210> 3

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 4

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gaagaggagc tgcaggtcat ccagcccgac aagtctgtgt ccgtggcagc aggagaaagc 60

gctatcctgc attgcaccgt gaccagcctg tttcccgtgg gaccaatcca gtggttcaga 120

ggagccggac cagccagaga gctgatctac aaccagaggc agggcccttt ccctagagtg 180

acaaccgtgt ccgagaccac caagagggag aacatggact tcagcatcag catcagcgcc 240

atcacaccag ccgacgccgg cacatactat tgcgtgaagt tccggaaggg cagcccagat 300

accgagttca agagcggagc cggaacagag ctgagcgtga gagccaagcc tagc 354

<210> 5

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 6

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

caggtgcagc tgcagcagcc aggagcagaa ctggtgaagc caggcgccag cgtgaagatg 60

tcttgcaaag ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tgcattgggt gaagcagacc 120

ccaggaagag gcctggagtg gatcggtgcc atctaccccg gcaacggcga caccagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg acagccgata agagcagcag caccgcctac 240

atgcagctgt ctagcctgac cagcgaggat agcgccgtgt actattgcgc caggagcacc 300

tactacggcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaacaacagt gacagtgtcc 360

gca 363

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 318

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cagatcgtgc tgtctcagag cccagccatt ctgagcgctt ctccaggcga gaaggtcacc 60

atgacttgca gagccagcag cagcgtgtcc tacatccatt ggttccagca gaagccagga 120

agcagcccta agccttggat ctacgccacc agcaacctgg ctagcggagt gccagtgaga 180

ttcagcggaa gcggaagcgg aaccagctac agcctgacca tcagcagagt ggaggccgaa 240

gacgccgcta catactactg ccagcagtgg accagcaacc ctcctacctt tggcggaggc 300

accaagctgg agatcaag 318

<210> 9

<211> 330

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 10

<211> 990

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gccagcacca agggacctag cgtgtttcct ctggcccctt ctagcaagag cacaagcgga 60

ggaacagccg ctctgggctg tctggtgaaa gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtct 120

tggaacagcg gagccctgac cagcggagtg cacacatttc cagccgtgct gcagagcagc 180

ggactgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccttctt cttctctggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggccgagccc 300

aagtcttgcg acaagaccca cacttgcccc ccttgtccag ctccagaact cctgggagga 360

cctagcgtgt tcctgttccc tcccaagcct aaggacaccc tgatgatcag ccggacccca 420

gaagtgactt gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaattgg 480

tacgtggacg gagtggaggt gcacaacgct aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 540

agcacctaca gggtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgccagccc ctatcgagaa gaccatcagc 660

aaggccaagg gccagcctag agaacctcag gtgtacaccc tgcccccttc tagagacgag 720

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacttgc ctcgtgaagg gcttctaccc cagcgatatc 780

gccgtggagt gggaatctaa cggtcagcca gagaacaact acaagaccac ccccccagtg 840

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa aagccgctgg 900

cagcagggca acgtgttctc ttgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960

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<210> 11

<211> 330

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Val Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 12

<211> 990

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gccagcacca agggacctag cgtgtttcct ctggcccctt ctagcaagag cacaagcgga 60

ggaacagccg ctctgggctg tctggtgaaa gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtct 120

tggaacagcg gagccctgac cagcggagtg cacacatttc cagccgtgct gcagagcagc 180

ggactgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccttctt cttctctggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggccgagccc 300

aagtcttgcg acaagaccca cacttgcccc ccttgtccag ctccagaact cgtgggagga 360

cctagcgtgt tcctgctgcc tcccaagcct aaggacaccc tgatgatcag ccggacccca 420

gaagtgactt gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaattgg 480

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agcaccctga gggtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgccagccc ctatcgagaa gaccatcagc 660

aaggccaagg gccagcctag agaacctcag gtgtacaccc tgcccccttc tagagacgag 720

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacttgc ctcgtgaagg gcttctaccc cagcgatatc 780

gccgtggagt gggaatctaa cggtcagcca gagaacaact acaagaccac ccccctggtg 840

ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa aagccgctgg 900

cagcagggca acgtgttctc ttgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960

cagaagagcc tgagcctgag cccaggaaag 990

<210> 13

<211> 451

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Val Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

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Pro Gly Lys

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ggtggaagcg gtggaggcgg atctggcgga ggtggatctc agatcgtgct gtctcagagc 420

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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

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355 360 365

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

370 375 380

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

385 390 395 400

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

405 410 415

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

420 425 430

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

435 440 445

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

450 455 460

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

465 470 475 480

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

485 490 495

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

500 505 510

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

515 520 525

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

530 535 540

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

545 550 555 560

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

565 570

<210> 23

<211> 1722

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gaagaggagc tgcaggtcat ccagcccgac aagtctgtgt ccgtggcagc aggagaaagc 60

gctatcctgc attgcaccgt gaccagcctg attcccgtgg gaccaatcca gtggttcaga 120

ggagccggac cagccagaga gctgatctac aaccagaagg agggccactt ccccagagtg 180

acaacagtgt ccgagagcac caagcgggag aacatggact tcagcatcag catcagcaac 240

atcacaccag ccgacgccgg cacatactat tgcgtgaagt tccggaaggg cagcccagat 300

accgagttca agagcggagc cggaacagag ctgagcgtga gagccaagcc tagcgcctct 360

accaagggcc aggtgcagct gcagcagcca ggagcagaac tggtgaagcc aggcgccagc 420

gtgaagatgt cttgcaaagc cagcggctac accttcacca gctacaacat gcattgggtg 480

aagcagaccc caggaagagg cctggagtgg atcggtgcca tctaccccgg caacggcgac 540

accagctaca accagaagtt caagggcaag gccaccctga cagccgataa gagcagcagc 600

accgcctaca tgcagctgtc tagcctgacc agcgaggata gcgccgtgta ctattgcgcc 660

aggagcacct actacggcgg cgattggtac ttcaacgtct ggggagccgg aacaacagtg 720

acagtgtccg cagccagcac caagggacct agcgtgtttc ctctggcccc ttctagcaag 780

agcacaagcg gaggaacagc cgctctgggc tgtctggtga aagactactt tcccgagccc 840

gtgaccgtgt cttggaacag cggagccctg accagcggag tgcacacatt tccagccgtg 900

ctgcagagca gcggactgta tagcctgagc agcgtggtga ccgtgccttc ttcttctctg 960

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020

aaggccgagc ccaagtcttg cgacaagacc cacacttgcc ccccttgtcc agctccagaa 1080

ctcctgggag gacctagcgt gttcctgttc cctcccaagc ctaaggacac cctgatgatc 1140

agccggaccc cagaagtgac ttgcgtggtg gtggacgtgt cccacgaaga ccccgaggtc 1200

aagttcaatt ggtacgtgga cggagtggag gtgcacaacg ctaagaccaa gcccagggag 1260

gagcagtaca acagcaccta cagggtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 1320

ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgccagc ccctatcgag 1380

aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct agagaacctc aggtgtacac cctgccccct 1440

tctagagacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgactt gcctcgtgaa gggcttctac 1500

cccagcgata tcgccgtgga gtgggaatct aacggtcagc cagagaacaa ctacaagacc 1560

acccccccag tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1620

aaaagccgct ggcagcaggg caacgtgttc tcttgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1680

aaccactaca cccagaagag cctgagcctg agcccaggaa ag 1722

<210> 24

<211> 584

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 24

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

130 135 140

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

145 150 155 160

Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg

165 170 175

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser

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Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser

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Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr

225 230 235 240

Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

245 250 255

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

260 265 270

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

275 280 285

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

290 295 300

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

305 310 315 320

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

325 330 335

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala

340 345 350

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

355 360 365

Pro Glu Leu Val Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro

370 375 380

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

385 390 395 400

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

405 410 415

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln

420 425 430

Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

435 440 445

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

450 455 460

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

465 470 475 480

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

485 490 495

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

500 505 510

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

515 520 525

Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

530 535 540

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

545 550 555 560

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

565 570 575

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

580

<210> 25

<211> 1752

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

gaagaggagc tgcaggtcat ccagcccgac aagtctgtgt ccgtggcagc aggagaaagc 60

gctatcctgc attgcaccgt gaccagcctg attcccgtgg gaccaatcca gtggttcaga 120

ggagccggac cagccagaga gctgatctac aaccagaagg agggccactt ccccagagtg 180

acaacagtgt ccgagagcac caagcgggag aacatggact tcagcatcag catcagcaac 240

atcacaccag ccgacgccgg cacatactat tgcgtgaagt tccggaaggg cagcccagat 300

accgagttca agagcggagc cggaacagag ctgagcgtga gagccaagcc tagcggaggc 360

ggtggaagcg gtggaggcgg atctggcgga ggtggatctc aggtgcagct gcagcagcca 420

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cctcccaagc ctaaggacac cctgatgatc agccggaccc cagaagtgac ttgcgtggtg 1200

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gtgcacaacg ctaagaccaa gccccctgag gagcagtaca acagcaccct gagggtggtg 1320

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agcccaggaa ag 1752

<210> 26

<211> 583

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

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Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

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385 390 395 400

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Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg

485 490 495

Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr

500 505 510

Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile

515 520 525

Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe

530 535 540

Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu

545 550 555 560

Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala

565 570 575

Ala Arg Ala Thr Pro Gln His

580

Claims

1.一种CD20/CD47双特异性抗体，包括抗CD20的CD20抗体和人SIRPa胞外段的第一个结构域SIRPaD1，所述SIRPaD1通过连接肽连接在CD20抗体重链的N端。

2.根据权利要求1所述的一种CD20/CD47双特异性抗体，其特征在于，所述CD20抗体的类型为IgG1亚型。

3.根据权利要求2所述的一种CD20/CD47双特异性抗体，其特征在于，所述CD20抗体重链Fc包含IgG1野生型Fc-WT，序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示，或IgG1组合突变ADCC增强型Fc-MT，序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。

4.根据权利要求1所述的一种CD20/CD47双特异性抗体，其特征在于，所述人SIRPa为野生型V2，所述SIRPaD1的序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求1所述的一种CD20/CD47双特异性抗体，其特征在于，所述连接肽的序列为(GGGGS)*3。

6.根据权利要求1所述的一种CD20/CD47双特异性抗体，其特征在于，所述CD20/CD47双特异性抗体的结构为对称性同源二聚体。

7.一种氨基酸，其特征在于，编码权利要求1-6任意一项所述的CD20/CD47双特异性抗体。

8.一种多聚核苷酸，其特征在于，编码权利要求7所述的氨基酸。

9.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求8所述的多聚核苷酸。

10.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求9所述的表达载体。

11.权利要求1-6任意一项所述的CD20/CD47双特异性抗体在制备治疗肿瘤疾患CD20/CD47过度表达的药物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤疾患包括血液瘤疾患中的至少一种，所述血液瘤疾患包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T-细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合白血病、非霍奇金淋巴瘤中的至少一种。