ES2534926T3 - Métodos para tratar la preeclampsia - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de tipo factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o factor de crecimiento placentario (PlGF), o un fragmento de estos, para su uso en un método de tratamiento o prevención de la preeclampsia en un sujeto, donde dicho VEGF, PlGF o fragmento de estos, puede unirse a sFlt-1 y donde dicha preeclampsia se caracteriza por un incremento en los niveles de la expresión del ácido nucleico o del polipéptido sFlt-1 respecto a un nivel o muestra de referencia normal.

Description

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al menos aproximadamente 30ºC, más preferiblemente de al menos aproximadamente 37ºC y aún más preferiblemente de al menos aproximadamente 42ºC. Los parámetros adicionales variables, tales como el tiempo de hibridación, la concentración de detergente, por ejemplo, dodecil sulfato sódico (SDS) y la inclusión o exclusión de ADN transportador, son bien conocidos para los especialistas en la materia. Se consiguen diversos niveles de rigurosidad combinando estas diversas condiciones según sea necesario. En una forma de realización preferida, la hibridación se realizará a 30ºC en NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM y SDS al 1%. En una forma de realización más preferida, la hibridación se realizará a 37ºC en NaCl 500 mM, citrato trisódico 50 mM, SDS al 1%, formamida al 35% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado (ADNes) a 100 µg/ml. En una forma de realización más preferida, la hibridación se realizará a 42ºC en NaCl 250 mM, citrato trisódico 25 mM, SDS al 1%, formamida al 50% y ADNes a 200 µg/ml. Para los especialistas en la materia serán evidentes variaciones útiles de estas condiciones.

Para la mayoría de las aplicaciones, las etapas de lavado que siguen a la hibridación también variarán en rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad de lavado pueden definirse por la concentración de sal y por la temperatura. Como se ha indicado anteriormente, la rigurosidad de lavado puede aumentarse reduciendo la concentración de sal o aumentando la temperatura. Por ejemplo, una concentración de sal rigurosa para las etapas de lavado preferiblemente será menor de aproximadamente NaCl 30 mM y citrato trisódico 3 mM, y aún más preferiblemente menor de aproximadamente NaCl 15 mM y citrato trisódico 1,5 mM. Las condiciones de temperatura rigurosas para las etapas de lavado normalmente incluirán una temperatura de al menos aproximadamente 25ºC, más preferiblemente de al menos aproximadamente 42ºC y aún más preferiblemente de al menos aproximadamente 68ºC. En una forma de realización preferida, las etapas de lavado se realizarán a 25ºC en NaCl 30 mM, citrato trisódico 3 mM y SDS al 0,1%. En una forma de realización más preferida, las etapas de lavado se realizarán a 42ºC en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1%. En una forma de realización más preferida, las etapas de lavado se realizarán a 68ºC en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1%. Para los especialistas en la materia serán evidentes otras variaciones de estas condiciones. Las técnicas de hibridación son bien conocidas para los especialistas en la materia y se describen, por ejemplo, en Benton y Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos 72: 3961, 1975); Ausubel y colaboradores (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nueva York); y Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Por "retraso del crecimiento intrauterino (IUGR)" se entiende un síndrome que tiene como resultado un peso en el nacimiento que es menor que el 10 por ciento del peso fetal previsto para la edad gestacional del feto. El criterio actual de la Organización Mundial de la Salud para un peso bajo en el nacimiento es un peso menor de 2500 g (5 lbs, 8 oz) o por debajo del percentil del 10 por ciento para la edad gestacional de acuerdo con las tablas de Estados Unidos de peso en el nacimiento para la edad gestacional por raza, paridad, y sexo del niño (Zhang y Bowes, Obstet. Gynecol. 86:200-208, 1995). Estos bebés con bajo peso en el nacimiento también se denominan "pequeños para la edad gestacional (SGA)". La preeclampsia es una afección que se sabe que está asociada con IURG o SGA.

Por "sistema de medición" se entiende una medición. Puede usarse un sistema de medición, por ejemplo, para comparar los niveles de una molécula de polipéptido o de ácido nucleico de interés. Los ejemplos de sistemas de medición adecuados incluyen, pero sin limitación, fórmulas matemáticas o algoritmos, tales como relaciones. El sistema de medición a usar es el que discrimine mejor entre los niveles del sFlt-1, VEGF o PlGF en un sujeto que tiene preeclampsia o eclampsia y un sujeto de control normal. Dependiendo del sistema de medición que se use, el indicador de diagnóstico de eclampsia o preeclampsia puede estar significativamente por encima o por debajo de un valor de referencia (por ejemplo, de un sujeto de control que no tenga preeclampsia o eclampsia).

El nivel del sFlt-1 se mide midiendo la cantidad de sFlt-1 libre, unido (es decir, unido al factor de crecimiento) o total (unido + libre). Los niveles del VEGF o PlGF se determinan midiendo la cantidad de PlGF libre o VEGF libre (es decir, no unidos al sFlt-1). Un sistema de medición ilustrativo es [sFlt-1/(VEGF + PlGF)], también denominado índice antiangiogénico de preeclampsia (PAAI).

Por "índice antiangiogénesis de preeclampsia (PAAI)" se entiende la relación de sFlt-1/VEGF + PlGF usada como un indicador de la actividad antiangiogénica. Un PAAI mayor de 20 se considera indicativo de preeclampsia o con riesgo de preeclampsia.

Por "operativamente enlazado" se entiende que un gen y una o más secuencias reguladoras se conectan de tal manera que se permite la expresión del gen cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo proteínas activadoras de la transcripción) se unen a las secuencias reguladoras.

Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende un vehículo que es fisiológicamente aceptable para el animal tratado mientras que mantiene las propiedades terapéuticas del compuesto con el que se administra. Un vehículo farmacéuticamente aceptable ilustrativo es solución fisiológica salina. Otros vehículos fisiológicamente aceptables y sus formulaciones son conocidos para el especialista en la materia y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (20.ª edición), A. Gennaro, editor, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins,

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Filadelfia, Pensilvania, Estados Unidos.

Por "factor de crecimiento placentario (PlGF)" se entiende un factor de crecimiento de mamífero que es homólogo a la proteína definida por el número de acceso del GenBank P49763 y que tiene actividad biológica de PlGF. El PlGF es un homodímero glicosilado que pertenece a la familia del VEGF y puede encontrarse en dos isoformas distintas por medio de mecanismos de ayuste alternativos. El PlGF se expresa por cito-y sincitiotrofoblastos de la placenta y las actividades biológicas del PlGF incluyen inducción de la proliferación, migración y activación de células endoteliales, particularmente células del trofoblasto.

Por "preeclampsia" se entiende el trastorno multisistémico que se caracteriza por hipertensión con proteinuria o edema, o ambos, disfunción glomerular, edema cerebral, edema hepático o anormalidades de la coagulación debidas al embarazo o a la influencia de un embarazo reciente. La preeclampsia generalmente se produce después de la vigésima semana de gestación. La preeclampsia generalmente se define como alguna combinación de los siguientes síntomas: (1) una presión sanguínea sistólica (PS) > 140 mmHg y una PS diastólica > 90 mmHg después de 20 semanas de gestación (medidas generalmente en dos ocasiones, separadas por un periodo de 4-168 horas),

(2) proteinuria de nuevo inicio (1 + por tiras reactivas en urinálisis, > 300 mg de proteína en orina recogida durante 24 horas, o una sola muestra de orina aleatoria que tiene una relación de proteína/creatinina > 0,3), y (3) resolución de hipertensión y proteinuria a las 12 semanas después del parto. La preeclampsia grave generalmente se define como (1) una PS diastólica > 110 mmHg (medida generalmente en dos ocasiones, separadas por un periodo de 4168 horas) o (2) proteinuria caracterizada por una medida de 3,5 g o más de proteína en orina recogida durante 24 horas o dos muestras de orina aleatorias con un nivel de proteína de al menos 3 + medido por tiras reactivas. En la preeclampsia, la hipertensión y la proteinuria generalmente aparecen dentro de un intervalo de siete días. En la preeclampsia grave, la hipertensión grave, la proteinuria grave y el síndrome de HELLP (hemólisis, elevación de las enzimas hepáticas y bajos niveles de plaquetas) o la eclampsia pueden aparecer simultáneamente o solo un síntoma por vez. Ocasionalmente, la preeclampsia grave puede conducir al desarrollo de convulsiones. Esta forma grave del síndrome se denomina "eclampsia". La eclampsia también puede incluir disfunción o lesiones en varios órganos o tejidos tales como el hígado (por ejemplo, lesión hepatocelular, necrosis periportal) y el sistema nervioso central (por ejemplo, edema cerebral y hemorragia cerebral). Se cree que la etiología de las convulsiones es secundaria al desarrollo de edema cerebral y espasmo focal de vasos sanguíneos pequeños del riñón.

Por "proteína" o "polipéptido" o "fragmento polipeptídico" se entiende cualquier cadena de más de dos aminoácidos, independientemente de la modificación postraduccional (por ejemplo, glicosilación o fosforilación), que constituye todo o parte de un polipéptido o péptido natural, o que constituye un polipéptido o péptido no natural.

Por "se reduce o inhibe" se entiende la capacidad de producir una reducción total preferiblemente del 20% o más, más preferiblemente del 50% o más y aún más preferiblemente del 75% o más del nivel de proteína o ácido nucleico, detectado por los ensayos mencionados anteriormente (véase "expresión") en comparación con las muestras no tratadas con oligómeros de nucleobases antisentido o ARNbc usado para interferencia de ARN.

Por "ARN de interferencia pequeños (ARNip)” se entiende una molécula de ARNbc aislada, preferiblemente con una longitud mayor de 10 nucleótidos, más preferiblemente con una longitud mayor de 15 nucleótidos y aún más preferiblemente con una longitud mayor de 19 nucleótidos que se usa para identificar el gen diana o ARNm por degradar. Un intervalo de 19-25 nucleótidos es el tamaño más preferido para los ARNip. Los ARNip también pueden incluir ARN de horquilla cortos en los que se incluyen las dos cadenas de un dúplex de ARNip dentro de una sola molécula de ARN. El ARNip incluye cualquier forma de ARNbc (productos escindidos proteolíticamente de un ARNbc de mayor tamaño, ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético y ARN producido de manera recombinante) así como ARN alterado que difiere del ARN natural por la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de un material no nucleotídico, tal como los extremos del ARN de 21 a 23 nt o internamente (en uno o más nucleótidos del ARN). En una forma de realización preferida, las moléculas de ARN contienen un grupo 3' hidroxilo. Los nucleótidos en las moléculas de ARN de la presente invención también pueden comprender nucleótidos no convencionales, incluyendo nucleótidos o desoxirribonucleótidos no naturales. Colectivamente, todos estos ARN alterados se denominan análogos de ARN. Los ARNip de la presente invención solo necesitan ser suficientemente similares al ARN natural como para que tengan la capacidad de mediar la interferencia del ARN (ARNi). Como se usa en este documento, ARNi se refiere a la escisión dirigida dependiente de ATP y la degradación de una molécula de ARNm específica por medio de la introducción de ARN de interferencia pequeños o ARNbc en una célula o un organismo. Como se usa en este documento “ARNi mediado” se refiere a la capacidad de distinguir o identificar el ARN que se va degradar.

Por “Flt-1 soluble (sFlt-1)” (también conocido como sVEGF-R1) se entiende la forma soluble del receptor Flt-1, que es homólogo a la proteína definida por el número de acceso del GenBank U01134, y que tiene actividad biológica de sFlt-1. La actividad biológica de un polipéptido sFlt-1 puede ensayarse usando cualquier método convencional, por ejemplo, ensayando la unión de sFlt-1 a VEGF. El sFlt-1 carece del dominio transmembrana y del dominio tirosina quinasa citoplásmico del receptor Flt-1. El sFlt-1 puede unirse a VEGF y la unión de PlGF con alta afinidad, pero no puede inducir la proliferación o angiogénesis y por lo tanto es funcionalmente diferente a los receptores Flt-1 y KDR. El sFlt-1 se purificó inicialmente a partir de células endoteliales umbilicales humanas y posteriormente se demostró

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diferentes. La actividad biológica del VEGF nativo incluye la promoción del crecimiento selectivo de células del endotelio vascular o de células del endotelio de la vena umbilical y la inducción de la angiogénesis. Como se usa en este documento, el VEGF incluye cualquier miembro o isoforma de la familia del VEGF (por ejemplo VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF189, VEGF165, o VEGF 121). Preferiblemente, el VEGF es la isoforma VEGF121 o VEGF165 (Tischer y colaboradores, J. Biol. Chem. 266, 11947-11954, 1991; Neufed y colaboradores Cancer Metastasis 15:153-158, 1996), que se describe en las patentes de EE. UU. 6,447,768; 5,219,739; y 5,194,596, incorporadas a la presente por referencia. También se incluyen formas mutantes del VEGF tales como el VEGF con selectividad de KDR y el VEGF con selectividad de Flt descritos en Gille y colaboradores (J. Biol. Chem. 276:3222-3230, 2001). Aunque se prefiere el VEGF humano, la invención no se limita a formas humanas y puede incluir otras formas animales del VEGF (por ejemplo, ratón, perro o pollo).

Por “vector” se entiende una molécula de ADN, normalmente derivada de un plásmido o bacteriófago, en la que pueden insertarse o clonarse fragmentos de ADN. Un vector recombinante contendrá uno o más sitios de restricción únicos, y puede ser capaz de replicarse de manera autónoma en un huesped definido u organismo de vehículo de tal forma que la secuencia clonada sea reproducible. Un vector contiene un promotor operativamente enlazado a un gen o región codificante de tal forma que, tras la transfección en una célula receptora, se exprese un ARN.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes tras la siguiente descripción de las formas de realización preferidas, y de las reivindicaciones.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1 muestra el ARNm y la expresión de proteínas de sFlt-1 en la preeclampsia. La Figura 1A muestra la expresión de ARNm de sFlt-1 placentario de tres pacientes con preeclampsia (P1, P2, P3) y tres embarazos a término con presión normal (N1, N2, N3) según se determina por análisis de transferencia Northern. La banda mayor (7,5 kb) es el ARNm de Flt-1 de longitud completa y la banda menor y más abundante (3,4 kb) es el ARNm de sFlt-1 unido de forma alternativa. GAPDH se incluye como control y la punta de flecha indica ARN 28S. Los pacientes P1 y P2 tenían una preeclampsia grave mientras que el paciente P3 tenía una preeclampsia leve. La Figura 1B es un gráfico que muestra los niveles de sFlt-1 en el suero de pacientes con preeclampsia leve (PE leve), pacientes con preeclampsia grave (PE grave), y mujeres embarazadas normotensas a término (normal). Los niveles de sFlt-1 se midieron por un ELISA realizado para sFlt-1 usando un kit disponible en el mercado (R&D Systems, Mineápolis, Estados Unidos). Como controles adicionales se incluyeron pacientes con partos antes de término por otras razones (antes de llegar a término) para descartar los cambios específicos de la edad gestacional. El número de pacientes ensayados se muestra entre paréntesis en el eje X. Se recogieron muestras antes del parto (t = 0) y 48 horas después del parto (t = 48). La Figura 1C es un gráfico que muestra las relaciones de índices antiangiogénesis (PAAI = sFlt-1/(VEGF + PlGF) en el momento del parto (t = 0), determinadas por ELISA para todos los pacientes descritos en la Figura 1B.

Las Figura 2A-2F son fotomicrografías que muestran el efecto antiangiogénico del exceso de sFlt-1 en la preeclampsia. Se realizaron ensayos del tubo endotelial usando suero de cuatro mujeres de control embarazadas normales y de cuatro pacientes con preeclampsia. Se muestra un experimento representativo de un control normal y un paciente con preeclampsia. Las Figuras 2A, 2B y 2C muestran ensayos realizados usando suero de un paciente normal, mientras que las Figuras 2D, 2E y 2F muestran ensayos realizados usando suero de un paciente con preeclampsia. En la Figura 2A, t = 0, (10% de suero de una mujer embarazada normal a término); en la Figura 2B, t = 48 (10% de suero de una mujer embarazada normal 48 horas después del parto); en la Figura 2 C, t = 0 + sFlt-1 exógeno (10 ng/ml); en la Figura 2D, t = 0 (10% de suero de una mujer preeclámptica antes del parto); en la Figura 2E, t = 48 (10% de suero de una mujer preeclámptica 48 horas después del parto), y en la Figura 2F, t = 0 + VEGF exógeno (10 ng/ml) + PlGF (10 ng/ml). El ensayo del tubo se cuantificó y la longitud media del tubo +/-SEM se muestra en píxeles en la parte inferior de cada panel.

Las Figuras 3A y 3B son gráficos que demuestran que la inhibición de VEGF y PlGF indujo la vasodilatación de microvasos renales por sFlt-1. La Figura 3A demuestra que el aumento en las respuestas de relajación de arteriolas renales de rata a sFlt-1 (S), VEGF (V), PlGF (P) se midió con tres dosis diferentes. V+ y P+ representan respuestas vasodilatadoras de los reactivos individuales en presencia de sFlt-1 a 100 ng/ml. Todos los experimentos se realizaron en 6 microvasos renales de rata diseccionados diferentes y los datos se muestran como media +/-SEM. El * representa el significado estadístico con p<0,01 en comparación con los reactivos individuales solos. La Figura 3B muestra el aumento en las respuestas de relajación a dosis fisiológicas: VEGF 100 pg/ml (V), PlGF 500 pg/ml (P), sFlt-1 10 ng/ml (S), VEGF (100 pg/ml) + PlGF 500 pg/ml (V + P) o VEGF (100 pg/ml) + PlGF 500 pg/ml + sFlt-1 10 ng/ml (V + P + S). Todos los experimentos se realizaron en 6 microvasos renales de rata diseccionados diferentes y los datos se muestran como media +/-SEM. El * representa el significado estadístico con p<0,05 en comparación con V + P.

Las Figuras 4A y 4B muestran la inducción por parte de sFlt-1 de endoteliosis glomerular. La Figura 4A es una fotomicrografía que muestra tinción con hematoxilina y eosina (H & E) en una oclusión capilar en animales tratados con sFlt-1 con glomérulos agrandados y citoplasma hinchado en comparación con los controles. En los animales

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será evidente para un especialista en la materia que la descripción detallada también puede aplicarse a sFlt-1, VEGF o miembros de la familia PlGF, isoformas y/o variantes, y a factores de crecimiento que se ha demostrado que se unen a sFlt-1. Los siguientes ejemplos son para ilustrar la invención y no deben considerarse limitantes.

Ejemplo 1. Aumento de los Niveles de ARNm de sFlt-1 y Proteína en Mujeres Embarazadas con Preeclampsia

En un intento de identificar nuevos factores secretados que jueguen un papel patológico en la preeclampsia, se ha realizado un perfil de la expresión génica de tejido placentario de mujeres con y sin preeclampsia usando chips de microarreglo Affymetrix U95A. Se ha descubierto que el gen para sFlt-1 estaba regulado positivamente en mujeres con preeclampsia.

Para confirmar la regulación positiva de sFlt-1 en la preeclampsia, se han realizado transferencias Northern para analizar los niveles de ARNm de sFlt-1 placentario (Figura 1A) y ensayos ELISA para medir los niveles de proteína en suero de sFlt-1 (Figura 1B) en mujeres embarazadas preeclámpticas en comparación con mujeres embarazadas normotensas. La preeclampsia se definió como (1) una presión sanguínea sistólica (PS) > 140 mmHg y una PS diastólica > 90 mmHg después de 20 semanas de gestación, (2) proteinuria de nuevo inicio (1 + por tiras reactivas en urinálisis, > 300 mg de proteína en orina recogida durante 24 horas, o una relación de proteína/creatinina en orina aleatoria > 0,3), y (3) resolución de hipertensión y proteinuria a las doce semanas después del parto. Se excluyeron las pacientes con hipertensión, proteinuria o afección renal subyacente. Las pacientes se dividieron en preeclampsia leve y grave basándose en la presencia o ausencia de proteinuria de intervalo nefrítico (> 3 g de proteína en orina recogida durante 24 horas o una relación de proteína/creatinina en orina mayor de 3,0). Las relaciones medias de proteína/creatinina en orina en el grupo de preeclampsia leve fueron de 0,94 +/-0,2 y en el grupo de preeclampsia grave fueron de 7,8 +/-2,1. Las edades gestacionales medias de los diversos grupos fueron las siguientes: normal 38,8 +/-0,2 semanas, preeclampsia leve 34 +/-1,2 semanas, preeclampsia grave 31,3 +/-0,6 semanas, y pretérmino 29,5 +/-2,0 semanas. Se obtuvieron muestras placentarias inmediatamente después del parto. Se tomaron cuatro muestras aleatorias de cada placenta, se pusieron en solución de estabilización de ARN (Ambion, Austin, Texas, Estados Unidos) y se almacenaron a -70ºC. El aislamiento de ARN se realizó usando un kit Qiagen RNAeasy Maxi (Qiagen, Valencia, California, Estados Unidos).

Se detectó un aumento tanto en el ARNm de sFlt-1 placentario como en la proteína sFlt-1 en suero materno en mujeres embarazas preeclámpticas en comparación con mujeres embarazadas normotensas. El nivel medio en suero de sFlt-1 fue casi cuatro veces mayor en los pacientes con preeclampsia grave en comparación con las mujeres embarazadas de control normales. Para excluir la posibilidad de que este efecto se debiera a la anterior edad gestacional de los casos pre-eclámpticos, también se midieron los niveles de sFlt-1 en mujeres normotensas con edad gestacional similar y con un parto prematuro por otras razones (edades gestacionales de 23-36 semanas) y no se encontraron diferencias significativas en este grupo en comparación con los embarazos normotensos a término. Las sondas usadas para las transferencias Northern se obtuvieron por PCR e incluían un fragmento de 500 pb en la región codificante de ADNc de Flt-1 humano de pUC118, y un ADNc de GAPDH que se usó como control de normalización.

En un embarazo normal hay un equilibrio entre los factores pro-y antiangiogénicos secretados por la placenta que es necesario para un desarrollo placentario adecuado. Se hipotetizó que en la preeclampsia, el aumento de la producción de sFlt-1 y la reducción de la producción de VEGF y PlGF desplaza el equilibrio a favor o en contra de la angiogénesis. Para tratar la actividad antiangiogénica neta se midieron los niveles en suero de VEGF y PlGF y se descubrió que los niveles en suero de PlGF y VEGF eran menores en pacientes con preeclampsia en comparación con los pacientes de control normales (PlGF media, 235,3 +/-45,3 pg/ml frente a 464 +/-116,6 pg/ml) como se ha descrito (Tidwell y colaboradores, Am. J. Obstet. Gynecol., 184:1267-1272, 2001). Cuando se incorporó sFlt-1, los niveles de VEGF y PlGF en un índice antiangiogénico, o PAAI, como un indicador de la actividad antiangiogénica neta, se descubrió que se podrían separar claramente los pacientes pre-eclámpticos de los pacientes normales y que el PAAI parecía correlacionarse con la gravedad de la preeclampsia (Figura 1C). Este PAAI puede usarse como herramienta de diagnóstico para la detección de la preeclampsia en mujeres embarazadas.

Ejemplo 2. El Suero de Mujeres con Preeclampsia Inhibe la Angiogénesis en un Ensayo de Tubo Endotelial In Vitro

Se hipotetizó que el exceso de sFlt-1 circulante en pacientes con preeclampsia produce una disfunción endotelial y conduce a un estado antiangiogénico. Para solucionar esto, se usó un ensayo de tubo endotelial como un modelo in vitro de angiogénesis. Se puso factor de crecimiento reducido Matrigel (7 mg/ml, Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, Estados Unidos) en pocillos (100 ml/pocillo) de una placa de cultivo de células de 48 pocillos enfriada previamente y se incubó a 37ºC durante 25-30 minutos para permitir la polimerización. Se trataron células endoteliales de vena umbilical humana (30 000 + 300 ml de medio basal endotelial sin suero, Clonetics, Walkersville, Maryland, Estados Unidos) en los pases 3-5 con suero del paciente al 10%, se colocaron en los pocillos recubiertos con Matrigel y se incubaron a 37ºC durante 12-16 horas. Después se evaluó la formación del tubo por medio de un microscopio de contraste de fase invertido a 4 aumentos (Nikon Corporation, Tokio, Japón) y se analizó cuantitativamente (área del tubo y longitud total) usando el software de análisis de imágenes

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preñadas, ya que hay menos moléculas proangiogénicas circulantes para antagonizar sFlt-1. Estos resultados sugerían que los niveles elevados de sFlt-1 pueden ser responsables de la endoteliosis glomerular asociada con la preeclampsia, pero que este efecto era independiente de la placenta, ya que se detectaron cambios glomerulares en ratas no preñadas así como en ratas preñadas. Estos resultados también sugerían que el antagonismo de VEGF y PlGF es importante en la patología de la preeclampsia ya que se producían hipertensión y proteinuria en los ratones no preñados tratados con sFlk-1 pero no en los ratones preñados tratados con sFlk-1 donde los niveles de PlGF son elevados.

El modelo animal creado en este documento pude usarse como modelo experimental para ensayar nuevos compuestos terapéuticos. Usando este modelo animal pueden estudiarse tanto la eficacia de los compuestos terapéuticos potenciales como la farmacología y toxicidad.

Ejemplo 5. Efectos de sFlt-1 en un Modelo Animal de Eclampsia

En ratas preñadas en la primera parte de su segundo trimestre de embarazo se inyecta sFlt-1 exógeno. Después las ratas se controlan y se ensayan durante la primera parte de su tercer trimestre para detectar el desarrollo de eclampsia. Los ensayos usados para la detección de eclampsia puede incluir MRI de los cerebros de las ratas para el desarrollo de edema, EEG del cerebro de la rata para el desarrollo de convulsiones e histología de los cerebros de la rata para determinar si se ha producido lesión endotelial a lo largo de la barrera hematoencefálica y el plexo coroideo usando marcadores endoteliales específicos.

El modelo animal creado en este documento puede usarse como modelo experimental para ensayar nuevos compuestos terapéuticos. Usando este modelo animal pueden estudiarse tanto la eficacia de compuestos terapéuticos potenciales como la farmacología y toxicidad.

Ejemplo 6: La Relación de PlGF/Creatinina en Orina Sirve Como Diagnóstico de la Preeclampsia

Se obtuvieron muestras de orina de 10 mujeres a las 16 semanas de gestación (cinco normales, cuatro con preeclampsia leve y una con preeclampsia grave). A estas muestras las proporcionó el Dr. Ravi Thadhani del Hospital General de Massachusetts. Las relaciones medias de PlGF libre/creatinina en orina (pg de PlGF por mg de creatinina) para las mujeres embarazadas normales fueron de 78 +/-10,7 y para las cuatro mujeres con preeclampsia leve fueron de 33 +/-5,0 y para la paciente con preeclampsia grave fue de 17. De esta manera, una alteración en la relación entre PlGF y creatinina en orina es útil como indicador diagnóstico de preeclampsia en un paciente.

Ejemplo 7: Niveles de Proteína sFlt-1 y PlGF como Indicador de Diagnóstico de Preeclampsia y Eclampsia en mujeres.

Para este estudio se usaron muestras archivadas del ensayo de calcio para la prevención de la preeclampsia para analizar los modelos gestacionales de sFlt-1, PlGF libre y VEGF libre circulantes en embarazos normotensos y preeclámpticos. El ensayo de calcio para la prevención de la preeclampsia, o CPEP, fue un ensayo clínico doble ciego aleatorizado realizado durante 1992-1995 para evaluar los efectos del suplemento diario de 2 g de calcio elemental o placebo sobre la incidencia y gravedad de la preeclampsia (Levine y colaboradores, N. Engl. J. Med. 377:69-76, 1997; Levine y colaboradores, Control Clin. Trials 17:442-469, 1996). Se incluyeron mujeres nulíparas sanas con embarazos simples con entre 13 y 21 semanas de gestación en 5 centros médicos de Estados Unidos participantes y se siguieron hasta 24 horas después del parto usando un protocolo común y formularios de recogida de datos idénticos. En el momento de la inclusión, todas las participantes del CPEP tenían una presión sanguínea < 135/85 mmHg, y ninguna tenía disfunción renal o proteinuria. La edad gestacional se determinó por examen de ultrasonido. Se obtuvieron muestras de suero de las participantes antes de la inclusión en el ensayo (13-21 semanas), a las 2629 semanas, a las 36 semanas si aún estaban embarazadas, y cuando se detectó hipertensión o proteinuria. Las “muestras de criterio de valoración” fueron muestras obtenidas durante o después del inicio de los síntomas y signos de la preeclampsia, pero antes del trabajos de parto y el alumbramiento como se ha descrito en otra parte de este documento (Levine y colaboradores, 1996, supra). Las muestras de sangre conseguidas del ensayo CPEP se obtuvieron gracias a la colaboración del Dr. Richard Levine en el NIH.

Participantes

Se seleccionaron sujetos con una información completa de los resultados, de los que se habían obtenido muestras de suero a < 22 semanas y que tuvieron un varón que nació vivo. De las 4589 participantes del CPEP, se excluyeron 253 que perdieron el seguimiento, 21 cuyo embarazo terminó antes de 20 semanas, 13 ausencias de datos de resultados maternos o perinatales, 4 sin historia de hábito de fumar, 9 con hipertensión no verificada por los grupos de revisión, y otras 32 con niños nacidos muertos, quedando 4257 mujeres con información adecuada y nacimientos vivos. Entre estas, 2156 tuvieron bebés varones. Después de excluir una mujer cuyo bebé tenía una anormalidad cromosómica, 381 con hipertensión gestacional y 43 sin una muestra de suero inicial, quedaron 1731 mujeres. De estas, 175 desarrollaron preeclampsia y 1556 permanecieron normotensas a lo largo de todo el embarazo.

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Como el suplemento de calcio no tuvo ningún efecto sobre el riesgo y gravedad de la preeclampsia y no estuvo relacionado con las concentraciones de moléculas pro-y antiangiogénicas, se eligieron casos y controles sin tener en cuenta el tratamiento en el CPEP. Para cada caso de preeclampsia se seleccionó un control normotenso, equivalente en todos los sitios de inclusión en cuanto a la edad gestacional en la recolección de la primera muestra de suero (antes de una semana) y el tiempo de almacenamiento en congelador a -70ºC (dentro de 12 meses). Se eligieron aleatoriamente 120 parejas equivalentes (“casos” y “controles”) para el análisis de las 657 muestras de suero obtenidas antes del parto (Tabla 2, presentada a continuación). La edad gestacional media en la recogida de la primera muestra de suero fue de 112,8 y 113,6 días en los casos y los controles respectivamente; la duración media del almacenamiento en el congelador fue de 9,35 y 9,39 años.

TABLA 2: Características de casos y controles en la inclusión en el CPEP y de sus bebés recién nacidos

Características

Casos (n=120) Controles (n=120)

Edad (años)

20,8 ± 4,5 20,2 ± 3,46

Altura (cm)

161,0 ± 6,7 163,0 ± 6,9

Peso (kg)

71,0 ± 19,4 66,8 ± 17,1

Índice de masa corporal

27,3 ± 6,8 25,1 ± 6,1**

Presión sanguínea sistólica (mmHg)

109,5 ± 8,8 105,7 ± 9,0**

Presión sanguínea diastólica (mmHg)

62,0 ± 7,9 59,4 ± 7,4**

Pérdida de embarazo anterior [n(%)]

23 (19,2) 25 (20,8)

Fumador actual [n (%)]

9 (7,5) 13 (10,8)

Seguro social privado [n (%)]

8 (6,7) 13 (10,8)

Casada [n (%)]

25 (20,8) 24 (20,0)

Raza/etnia Blanca, no hispana [n (%)]

24 (20,0) 35 (29,2)

Blanca hispana [n (%)]

21 (17,5) 14 (11,7)

Afroamericana [n (%)]

69 (57,5) 68 (56,7)

Otra, desconocida [n (%)]

6 (5,0) 3 (2,5)

Peso en el nacimiento (g)

3100 ± 796 3255 ± 595

Parto <37 semanas [n (%)]

29 (24,2) 9 (7,5) **

Pequeño para la edad gestacional (< décimo porcentil) [n (%)]

18 (15,0) 4 (3,3) **

Media ± desviación estándar a menos que se indique *p<0,05 **p<0,01

Para este estudio, la hipertensión se definió como una presión sanguínea diastólica de al menos 90 mmHg en dos ocasiones separadas por un periodo de 4-168 horas. La hipertensión grave se definió como una presión sanguínea diastólica de al menos 110 mmHg en dos ocasiones separadas por un periodo de 4-168 horas, o una ocasión si la mujer había recibido una terapia antihipertensiva. La proteinuria se definió como 300 mg o más de proteína en una recogida de orina de 24 horas, dos muestras de orina aleatorias separadas por un periodo de 4-168 horas que contenían al menos 1+ proteína por medio de una tira reactiva, una sola muestra de orina con una relación de proteína/creatinina de al menos 0,35, o una sola muestra de orina aleatoria que contenía al menos 2+ proteína por tira reactiva. La proteinuria grave se diagnosticó por una muestra de recogida de orina de 24 horas que contenía al menos 3,5 g de proteína o por dos muestras de orina aleatorias con al menos 3+ proteína por medio de una tira reactiva. La preeclampsia se definió como hipertensión y proteinuria que se producía con una diferencia menor de 7 días; la preeclampsia grave se definió como una preeclampsia con hipertensión grave, proteinuria grave, síndrome de HELLP (hemólisis, elevación de las enzimas hepáticas y baja concentración de plaquetas) o eclampsia. El inicio de la preeclampsia fue el momento de la detección de la primera elevación de la presión sanguínea o proteinuria en la muestra de orina que conducía al diagnóstico de preeclampsia.

El pequeño tamaño para la edad gestacional (SGA) se definió como un peso en el nacimiento menor del percentil del 10% para la edad gestacional de acuerdo con las tablas de Estados Unidos del peso en el nacimiento para la edad gestacional por raza, paridad y sexo del bebé (Zhang y Bowes 1995, supra).

Procedimientos

Los ensayos se realizaron en el Beth Israel Deaconess Medical Center por el personal de laboratorio que desconocía el diagnóstico de las pacientes y otra información clínica relevante. Las muestras se ordenaron aleatoriamente para el análisis. Se realizaron ensayos inmunoabsorbentes de enzimas ligadas (ELISA) para sFlt-1 humano, PlGF libre y VEGF libre de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando kits adquiridos de R&D Systems (Minneapolis, Mineápolis, Estados Unidos). Se descongelaron a temperatura ambiente alícuotas de muestras de suero que se habían almacenado a -70Cº, se diluyeron con BSA/solución salina tamponada con Tris y

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se incubaron durante 2 horas en una placa de 96 pocillos recubierta previamente con anticuerpo de captura dirigido contra sFlt-1, PlGF o VEGF. Los pocillos después se lavaron tres veces, se incubaron 20 minutos con una solución de sustrato que contenía peróxido de hidrógeno y tetrametilbencidina y la reacción se inactivó con ácido sulfúrico 2N. La densidad óptica se determinó a 450 nm (corrección de longitud de onda a 550 nm). Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Las concentraciones de proteína se calcularon usando una curva patrón derivada de concentraciones conocidas de la proteínas recombinantes respectivas. Si la diferencia entre los duplicados excedía del 25%, el ensayo se repitió y se desecharon los resultados iniciales. Los ensayos tuvieron sensibilidades de 5, 7 y 5 pg/ml para sFlt-1, PlGF y VEGF, respectivamente, con coeficientes de variación inter-e intraensayo del 7,6% y 3,3% para sFlt-1, del 11,2% y 5,4% para PlGF, y del 7,3% y 5,4% para VEGF.

Análisis Estadístico

En los análisis de las características maternas o del niño para comparar las variables categóricas o continuas se usaron respectivamente ensayos Chi cuadrado y ensayos t. Aunque en el texto y en las figuras se proporcionan los valores de media aritmética de las concentraciones, el ensayo estadístico se realizó después de una transformación logarítmica, a menos que se indique otra cosa. El ajuste se realizó usando reversión logística en concentraciones transformadas logarítmicamente.

Resultados

De los 120 casos, 80 desarrollaron preeclampsia y 40 desarrollaron preeclampsia grave, incluyendo 3 con el síndrome HELLP y 3 con eclampsia. Las pacientes del grupo de casos eran más bajas que las pacientes de control, tenían un mayor índice de masa corporal y tenían una mayor presión sanguínea inicial (Tabla 2). Además, mayores proporciones de las pacientes del grupo de casos tenían embarazos complicados, ya sea parto prematuro o niños pequeños para la edad gestacional (SGA). Las pacientes de casos contribuyeron con un promedio de 2,9 muestras de suero al estudio; los controles con 2,6 muestras.

En primer lugar se confirmó que en las pacientes con preeclampsia estaban alterados los niveles de sFlt-1, PlGF y VEGF en el momento de la afección activa en comparación con los controles con una edad gestacional similar de este grupo de estudio de CPEP. Las muestras extraídas en el momento de la preeclampsia clínica establecida (muestra de criterio de valoración) tenían niveles de sFlt-1 aumentados en gran medida, niveles de PlGF reducidos y niveles de VEGF reducidos en comparación con los controles con edades gestacionales (4382 frente a 1643 pg/ml sFlt-1, p<0,0001; 137 frente a 669 pg/ml PlGF, p<0,0001; y 6,41 frente a 13,86 pg/ml VEGF, p=0,06) para los casos y controles, respectivamente, en 23 pares de edad gestacional similar) similares a los informes publicados previamente (Maynard y colaboradores, J. Clin. Invest. 111:649-658, 2003).

Para evaluar el modelo gestacional de los niveles de sFlt-1, PlGF y VEGF, se midieron las concentraciones circulantes de sFlt-1, PlGF y VEGF de muestras de suero obtenidas a partir de pacientes de casos y pacientes de control dentro de diversas ventanas de edad gestacional. El modelo gestacional de la proteína sFlt-1 para 120 mujeres preeclámpticas y 120 mujeres de control se muestra en la Figura 5A. Los niveles de sFlt-1 en los pacientes de control permanecieron constantes hasta las 33-36 semanas, momento en el que se elevaron aproximadamente 145 pg/ml por semana hasta el trabajo de parto y el alumbramiento. Entre los pacientes de los casos antes de los síntomas clínicos, sFlt-1 parecía comenzar a elevarse a las 21-24 semanas, con una elevación por pasos y una diferencia estadísticamente significativa respecto de los controles a las 29-32 semanas (figura 5A). En general, las diferencias entre los pacientes de casos y de controles medidas antes del inicio de los síntomas clínicos eran del 17% (p<0,05) en la mitad de la gestación. Las muestras de criterio de valoración fueron significativamente elevadas en comparación con las muestras extraídas antes de la afección. Para evaluar los mecanismos de la elevación de sFlt-1 antes del inicio de la afección clínica, representamos las concentraciones de sFlt-1 en todas las mujeres preeclámpticas por semanas antes del inicio de la preeclampsia (Figura 5B). Las concentraciones medias de sFlt-1 en muestras de pacientes de casos se representaron por semanas completas antes del inicio de la preeclampsia. Empezando 5 semanas antes de la preeclampsia, las concentraciones de sFlt-1 se elevaron sustancialmente hasta una semana antes del inicio de la afección, momento en el que alcanzaron las concentraciones observadas en las muestras del criterio de valoración. Los aumentos en sFlt-1 4, 3, 2 y 1 semana antes de la preeclampsia se produjeron con pocos cambios en la edad gestacional media y no pueden explicarse por un aumento en la última parte del tercer trimestre al avanzar la edad gestacional. De 8-6 a 5 semanas antes de la preeclampsia, el nivel de sFlt-1 aumentó a 962 pg/ml, mientras que la edad gestacional media se elevó 31 días. Aproximadamente un tercio de este aumento en sFlt-1 no puede atribuirse al avance de la gestación. Cuando se representó el nivel de sFlt-1 por edad gestacional en controles y en casos después de retirar las muestras obtenidas ≤ 5 semanas antes del inicio de la preeclampsia, no se observaron diferencias sustanciales (Figura 5C). Estos datos sugieren que la mayor concentración de sFlt-1 en los pacientes de casos antes del inicio de la preeclampsia se debe a elevaciones agudas en sFlt-1 en las 5 semanas previas al inicio de la afección clínica.

Después se representó el modelo gestacional de la proteína PlGF en el mismo grupo de pacientes que se ha mostrado en la Figura 6A. Las concentraciones de proteína PlGF de control se elevaron durante los dos primeros trimestres, alcanzaron un pico máximo a las 29-32 semanas y se redujeron durante la última parte de la gestación.

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el nivel de PlGF libre de aparición temprana en el segundo trimestre entre las mujeres propensas a desarrollar preeclampsia. Estos resultados demuestran que un aumento en los niveles de PlGF puede ser un agente útil para predecir una preeclampsia de inicio precoz.

En la presente invención se describe por primera vez el modelo gestacional de sFlt-1 en el embarazo normal, observando niveles relativamente estables a lo largo de la gestación seguidos de un aumento constante con inicio a las 33-36 semanas. Esta elevación corresponde a la última reducción gestacional en PlGF observada en el embarazo normal por otros autores (Torry y colaboradores, J. Soc. Gynecol. Invest. 10:178-188, 1998; Taylor y colaboradores, Am. J. Obset. Gynecol. 188:177-182, 2003) y en los resultados descritos en este documento. La asociación temporal, junto con el conocimiento de que sFlt-1 interfiere con la medición ELISA de PlGF (Maynard y colaboradores, supra) sugiere que la reducción de los niveles de PlGF libre durante la última parte de la gestación puede deberse a la elevación de los niveles de sFlt-1. Durante el primer y segundo trimestre, cuando se necesita el crecimiento placentario para poder responder a las crecientes demandas fetales, las concentraciones de PlGF son elevadas y las concentraciones de sFlt-1 son bajas, creando un estado relativamente proangiogénico. Más adelante en la gestación, cuando puede ser necesario templar y detener el crecimiento vascular placentario, se produce una elevación en el sFlt-1 antiangiogénico y una reducción resultante en PlGF. En mujeres con preeclampsia, la elevación de sFlt-1 empieza antes en la gestación, aproximadamente 5 semanas antes del inicio de los síntomas, a aproximadamente 29-32 semanas de gestación en promedio. De esta manera, en la preeclampsia, los “frenos” antiangiogénicos pueden aplicarse demasiado pronto y con demasiada fuerza, dando como resultado una exageración de un proceso fisiológico normal que detiene el crecimiento placentario. Parece claro que los cambios placentarios patológicos que caracterizan a la preeclampsia se producen pronto en la gestación (10-14 semanas), antes de la elevación dramática en sFlt-1. La propia isquemia placentaria resultante puede potenciar la producción de sFlt-1, activando finalmente un aumento de sFlt-1.

Además de las grandes diferencias observadas en las 5 semanas previas al desarrollo de los síntomas clínicos, las mujeres destinadas a desarrollar preeclampsia tenían reducciones pequeñas pero estadísticamente significativas en los niveles de PlGF libre ya a las 13-16 semanas de gestación. Esta reducción en PlGF generalmente no iba acompañada de un aumento recíproco en los niveles de sFlt-1. Sin embargo, hubo una tendencia de niveles de sFlt1 ligeramente mayores en los casos durante el primer trimestre aunque no fue estadísticamente significativa (por ejemplo, en la ventana 17-20 semanas, los niveles medios de sFlt-1 en los casos fueron de 865,77 pg/ml frente a 795,25 en los controles). Esta reducción en los niveles de PlGF pronto en la gestación podrían reflejar una menor producción placentaria de PlGF en embarazos comprometidos por afeciones tales como preeclampsia o SGA. De manera importante, en pacientes con preeclampsia complicada por SGA, se encontró un aumento estadísticamente significativo tanto en la elevación de sFlt-1 como en la reducción de PlGF antes de la presentación de la afección. También es posible que no haya ningún cambio en la producción placentaria de PlGF en pacientes preeclámpticas y que la elevación de los niveles de sFlt-1 locales en la placenta puedan contribuir a la reducción de los niveles de PlGF libre circulantes. Esto se confirma por el hallazgo de que el PlGF placentario, medido por inmuno-histoquímica, no se altera en la preeclampsia (Zhou y colaboradores, Am J. Pathol. 160: 1405-1423. 2002).

En resumen, hemos demostrado que sFlt-1 empieza a elevarse en la preeclampsia al menos 5 semanas antes del inicio de la afección clínica que va acompañado por una reducción en los niveles de PlGF libre y VEGF libre circulantes. La reducción de PlGF durante el primer trimestre puede servir para predecir la preeclampsia y la elevación de sFlt-1 puede servir para predecir la proximidad de la afección clínica. Estos datos junto con el trabajo en animales descrito anteriormente que demuestra que sFlt-1 solo induce síntomas parecidos a los de la preeclampsia en roedores sugieren un papel etiológico probable del sFlt-1 en la patogénesis de la preeclampsia. Nuestros datos limitados sobre niños SGA y parto prematuro en controles, en comparación con las pacientes del grupo de casos, sugiere que las mayores alteraciones en los niveles de proteínas observadas en los embarazos preeclámpticos con un niño SGA son más sustanciales que la diferencia debida únicamente a la restricción del crecimiento uterino o parto prematuro en ausencia de preeclampsia.

Diagnóstico

La presente invención caracteriza ensayos de diagnóstico para la detección de preeclampsia, eclampsia o la propensión a desarrollar tales afecciones. Se miden los niveles de VEGF, PlGF o sFlt-1, libres o totales en una muestra de un sujeto y se usan como indicador de preeclampsia, eclampsia o la propensión a desarrollar tales afecciones.

En una realización se usa un sistema de medición para determinar si una relación entre los niveles de al menos dos de las proteínas es indicativa de preeclampsia o eclampsia. Pueden usarse métodos convencionales para medir los niveles de polipéptido VEGF, PlGF o sFlt-1 en cualquier fluido corporal, incluyendo pero sin limitación orina, suero, plasma, saliva, fluido amniótico o líquido cefalorraquídeo. Tales métodos incluyen inmuno-ensayo, ELISA, transferencia Western usando anticuerpos dirigidos a VEGF, PlGF o sFlt-1 y técnicas de inmuno-ensayo enzimático cuantitativo tales como las descritas en Ong y colaboradores (Obstet. Gynecol. 98:608-611, 2001) y Su y colaboradores (Obstet. Gynecol., 97:898-904, 2001). Los ensayos ELISA son el método preferido para medir los

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niveles de VEGF, PlGF o sFlt-1.

Los niveles en suero de sFlt-1 superiores a 2 ng/ml se consideran un indicador positivo de preeclampsia. Además, cualquier alteración detectable en los niveles de sFlt-1, VEGF o PlGF con respecto a los niveles normales es indicativa de eclampsia, preeclampsia o la propensión a desarrollar tales afecciones. Preferiblemente se mide sFlt-1, más preferiblemente la medición de VEGF y PlGF se combinan con esta medición y aún más preferiblemente se miden las 3 proteínas (o niveles de ARNm indicativos de niveles de proteínas).

En otra realización, el PAAI (sFlt-1/VEGF + PlGF) se usa como índice antiangiogénico que es diagnóstico de preeclampsia, eclampsia o la propensión a desarrollar tales afecciones. Si el PAAI es mayor de 20 entonces se considera que el sujeto tiene preeclampsia o tiene un riesgo inminente de desarrollarla. La relación de PAAI (sFlt-1/VEGF + PlGF) es simplemente un ejemplo de un sistema de medición útil que puede usarse como indicador de diagnóstico. No pretende limitar la invención. Como indicador de diagnóstico puede usarse prácticamente cualquier sistema de medición que detecte una alteración en el índice antiangiogénico en el sujeto que tiene eclampsia con respecto a un control normal.

Los niveles de expresión de ácidos nucleicos o polipéptidos particulares pueden correlacionarse con un estado de enfermedad particular (por ejemplo, preeclampsia o eclampsia) y de esta manera son útiles en el diagnóstico. Pueden usarse oligonucleótidos o fragmentos mayores procedentes de una secuencia de ácido nucleico de sFlt-1, PlGF o VEGF como una sonda no solo para controlar la expresión, sino también para identificar sujetos que tienen una variación genética, mutación, o polimorfismo en una molécula de ácido nucleico de sFlt-1, PlGF o VEGF que son indicativos de una predisposición a desarrollar las afecciones. Tales polimorfismos se conocen para el especialista en la materia y se describen por Parry y colaboradores (Eur. J Immunogenet. 26:321-3, 1999). Tales alteraciones genéticas pueden estar presentes en la secuencia promotora, un marco de lectura abierto, secuencia intrónica o región 3´ no traducida de un gen de sFlt-1. Puede usarse la información relacionada con alteraciones genéticas para diagnosticar que un sujeto tiene preeclampsia, eclampsia o una propensión a desarrollar tales afecciones. Como se ha indicado a lo largo de este documento, las alteraciones específicas en los niveles de actividad biológica de sFlt-1, VEGF y/o PlGF pueden correlacionarse con la probabilidad de preeclampsia o eclampsia, o la predisposición a estas. Como resultado, un especialista en la materia, habiendo detectado una mutación dada, puede ensayar uno o más sistemas de medición de la actividad biológica de la proteína para determinar si la mutación produce o aumenta la probabilidad de preeclampsia o eclampsia.

En una realización, un sujeto que tiene preeclampsia, eclampsia o una propensión a desarrollar tales afecciones mostrará un aumento en la expresión de un ácido nucleico que codifica sFlt-1 o una alteración de los niveles de PlGF o VEGF. Los métodos para detectar tales alteraciones son convencionales en la materia y se describen en Ausubel y colaboradores, supra. En un ejemplo se usa transferencia Northern o PCR a tiempo real para detectar los niveles de ARNm de sFlt-1, PlGF o VEGF.

En otra realización, puede usarse hibridación con sondas de PCR que son capaces de detectar una molécula de ácido nucleico de sFlt-1, incluyendo secuencias genómicas, o moléculas muy relacionadas, para hibridar con una secuencia de ácido nucleico derivada de un sujeto que tiene preeclampsia o eclampsia o con riesgo de desarrollar tales afecciones. La especificidad de la sonda, si está hecha de una región muy específica, por ejemplo, la región reguladora 5’, o de una región menos específica, por ejemplo como motivo conservado, y la astringencia de la hibridación o amplificación (máxima, alta, intermedia o baja) determinan si la sonda hibrida con una secuencia natural, variantes alélicas u otras secuencias relacionadas. Pueden usarse técnicas de hibridación para identificar mutaciones indicativas de una preeclampsia o eclampsia en una molécula de ácido nucleico de sFlt-1, o pueden usarse para controlar los niveles de expresión de un gen que codifica un polipéptido sFlt-1 (por ejemplo, por análisis Northern, Ausubel y colaboradores, supra).

En otra realización, a los seres humanos se les puede diagnosticar una propensión a desarrollar preeclampsia o eclampsia por análisis directo de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de sFlt-1, VEGF o PlGF.

Un sujeto que tiene preeclampsia, eclampsia o una propensión a desarrollar tales afecciones mostrará un aumento en la expresión de un polipéptido sFlt-1. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido sFlt-1 puede usarse para diagnosticar la preeclampsia o eclampsia o para identificar un sujeto con riesgo de desarrollar tales afecciones. Se conocen diversos protocolos para medir una alteración en la expresión de tales polipéptidos, incluyendo métodos inmunológicos (tales como ELISA y RIA) y proporcionan una base para diagnosticar la preeclampsia o eclampsia o un riesgo de desarrollar tales afecciones. De nuevo, un aumento en el nivel del polipéptido es diagnóstico de un sujeto que tiene preeclampsia, eclampsia o una propensión a desarrollar tales afecciones.

En una realización, el nivel de polipéptido sFlt-1, VEGF o PlGF o ácido nucléico o cualquier combinación de estos se mide al menos en dos tiempos diferentes y una alteración en los niveles en comparación con los niveles de referencia normales a lo largo del tiempo se usa como indicador de preeclampsia, eclampsia o la propensión a desarrollar tales afecciones.

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El nivel de sFlt-1, VEGF o PlGF en los fluidos corporales de un sujeto que tiene preeclampsia, eclampsia o la propensión a desarrollar tales afecciones puede alterarse en una cantidad tan pequeña como del 10%, 20%, 30% 40% o en una cantidad tan grande como del 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con respecto al nivel de sFlt-1, VEGF o PlGF en un control normal. El nivel de sFlt-1 presente en los fluidos corporales de un sujeto que tiene preeclampsia, eclampsia o la propensión a desarrollar tales afecciones puede aumentar 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces o incluso hasta 10 veces o más con respecto a los niveles de un sujeto de control normal.

En una realización, se recoge una muestra de un fluido corporal del sujeto (por ejemplo, orina, plasma, suero, fluido amniótico) en la primera parte del embarazo antes del inicio de los síntomas de preeclampsia. En otro ejemplo, la muestra puede ser un tejido o célula recogida en la primera parte del embarazo antes del inicio de los síntomas de preeclampsia. Los ejemplos no limitantes incluyen tejido placentario, células placentarias, células endoteliales y leucocitos tales como monocitos. En seres humanos, por ejemplo, se recogen muestras de suero de sangre materna de la vena antecubital de mujeres embarazadas durante el primer, segundo o tercer trimestre del embarazo. Preferiblemente, el ensayo se realiza durante el primer trimestre, por ejemplo a las 4, 6, 8, 10, o 12 semanas, o durante el segundo trimestre, por ejemplo a las 14, 16, 18, 20, 22 o 24 semanas. Tales ensayos también pueden realizarse al final del segundo trimestre o al principio del tercer trimestre (aproximadamente a las 28 semanas). Es preferible medir los niveles de sFlt-1, VEGF o PlGF dos veces durante este periodo de tiempo. Para el diagnóstico de la preeclampsia o eclampsia posparto, pueden realizarse los ensayos para sFlt-1, VEGF o PlGF después del parto.

En un ejemplo particular, pueden recogerse muestras de sangre en serie durante el embarazo y pueden determinarse los niveles de sFlt-1 soluble por ELISA. En un estudio usando esta técnica, el ARNm unido de manera alternativa que codifica sFlt-1 tiene una alta expresión por células de trofoblasto y la proteína era fácilmente detectable en el plasma de mujeres embarazadas. Se observó que los niveles de sFlt-1 aumentaban aproximadamente 3 veces entre 20 y 36 semanas de gestación. Se observó que los niveles eran significativamente mayores en mujeres con alto riesgo que posteriormente desarrollaron preeclampsia (Charnock-Jones y colaboradores, J. Soc.Gynecol. Investig. 10 (2): 230, 2003).

En la práctica veterinaria, pueden realizarse ensayos en cualquier momento durante el embarazo, pero preferiblemente pueden realizarse en las primeras fases del embarazo, antes del inicio de los síntomas de preeclampsia. Dado que el término de los embarazos varía ampliamente entre especies, el tiempo del ensayo se determinará por un veterinario, pero generalmente corresponderá a los tiempos de ensayos durante un embarazo humano.

Los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento pueden usarse individualmente o en combinación con cualquier otro método de diagnóstico descrito en este documento para un diagnóstico más preciso de la presencia, gravedad o tiempo estimado del inicio de preeclampsia o eclampsia. Además, los métodos de diagnóstico descritos en este documento pueden usarse en combinación con cualquier otro método de diagnóstico útil para el diagnóstico preciso de la presencia, gravedad o tiempo estimado del inicio de preeclampsia o eclampsia.

Los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento también pueden usarse para controlar y tratar la preeclampsia o eclampsia en un sujeto. En un ejemplo, si se determina que un sujeto tiene un nivel de proteína sFlt1 en suero de 10 ng/ml y un nivel de PlGF libre en suero de 100 pg/ml, entonces pueden administrarse VEGF hasta que el nivel de PlGF en suero alcance aproximadamente 400 pg/ml. En esta forma de realización, los niveles de sFlt1, PlGF y VEGF o todos y cada uno de estos se miden repetidamente como un método no solo para diagnosticar la afección, sino también para controlar el tratamiento y el manejo de la preeclampsia y la eclampsia.

Kits de Diagnóstico

La invención también proporciona un kit de ensayo de diagnóstico. Por ejemplo, un kit de ensayo de diagnóstico puede incluir anticuerpos contra sFlt-1, VEGF o PlGF, y medios para detectar y más preferiblemente evaluar la unión entre los anticuerpos y el polipéptido sFlt-1, VEGF o PlGF. Para la detección, el anticuerpo o el polipéptido sFlt-1, VEGF o PlGF se marca, y el anticuerpo o el polipéptido sFlt-1, VEGF o PlGF se une al sustrato, de tal manera que la interacción de polipéptido sFlt-1, VEGF o PlGF-anticuerpo pueda establecerse determinando la cantidad de marcador unido al sustrato después de la unión entre el anticuerpo y el polipéptido sFlt-1, VEGF o PlGF. Una ELISA convencional es un método común conocido en la materia para detectar la interacción de anticuerpo-sustrato y puede proporcionarse con el kit de la invención. Los polipéptidos sFlt-1, VEGF o PlGF pueden detectarse prácticamente en cualquier fluido corporal incluyendo, pero sin limitación orina, suero, plasma, saliva, líquido amniótico o líquido cefalorraquídeo. Un kit que determina una alteración en el nivel de polipéptido sFlt-1, VEGF o PlGF con respecto a una referencia, tal como el nivel presente en un control normal, es útil como kit de diagnóstico en los métodos de la invención.

Ensayos de Selección

Como se ha descrito anteriormente, la expresión de un ácido nucleico o polipéptido sFlt-1 aumenta en un sujeto que tiene preeclampsia, eclampsia o una propensión a desarrollar tales afecciones. Basándose en estos

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una propensión a desarrollar preeclampsia o eclampsia.

(56)

El método de (34), (35), (44) o (45), donde dicho sujeto es una mujer embarazada.

(57)

El método de (34), (35), (44) o (45), donde dicho sujeto es una mujer después del parto.

(58)

El método de (34), (35), (44) o (45), donde dicho sujeto no es humano.

(59)

El método de (34), (35), (44) o (45), donde dicho sujeto no es humano y se selecciona entre el grupo compuesto por una vaca, un caballo, una oveja, un cerdo, una cabra, un perro o un gato.

(60)

El método de (34), (35), (44) o (45), donde al menos uno de dichos niveles medidos es el nivel de sFlt-1.

(61)

El método de (34), (35), (44) o (45), donde cuando se mide el nivel de VEGF entonces también se mide el nivel de sFlt-1 o PlGF.

(62)

El método de (34), (35), (44) o (45), donde un aumento en el nivel de ácido nucleico o polipéptido sFlt-1 con respecto a una referencia es un indicador de diagnóstico de preeclampsia o eclampsia.

(63)

El método de (34), (35), (44) o (45), donde una reducción en el nivel de ácido nucleico o polipéptido VEGF libre con respecto a una referencia es un indicador de diagnóstico de preeclampsia o eclampsia.

(64)

El método de (34), (35), (44) o (45), donde una reducción en el nivel de ácido nucleico o polipéptido PlGF libre con respecto a una referencia es un indicador de diagnóstico de preeclampsia o eclampsia.

(65)

El método de (34), (35) o (44), donde dicha medición de los niveles se realiza en dos o más ocasiones y un cambio en dichos niveles entre las mediciones es un indicador de diagnóstico de preeclampsia o eclampsia.

(66)

Un kit para el diagnóstico de preeclampsia o eclampsia en un sujeto que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo compuesto por una molécula de ácido nucleico de sFlt-1, VEGF y PlGF o una secuencia complementaria a esta, o cualquier combinación de estas.

(67)

El kit de (66), donde dicha secuencia de ácido nucleico comprende al menos dos sondas de ácido nucleico para la detección de dicha molécula de ácido nucleico.

(68)

Un kit para el diagnóstico de preeclampsia o eclampsia en un sujeto que comprende un medio para detectar un polipéptido sFlt-1, VEGF o PlGF, o cualquier combinación de estos.

(69)

El kit de (68), donde dicho medio de detección se selecciona entre el grupo compuesto por un ensayo inmunológico, un ensayo enzimático y un ensayo colorimétrico.

(70)

El kit de (66) o (68), donde dicho kit diagnostica una propensión a desarrollar preeclampsia o eclampsia en una mujer embarazada o no embarazada.

(71)

El kit de (66) o (68), donde dicho kit detecta sFlt-1.

(72)

El kit de (66) o (68), donde dicho kit detecta PlGF.

(73)

El kit de (66) o (68), donde cuando dicho kit detecta VEGF, entonces también se detecta sFlt-1 o PlGF.

(74)

Un método para identificar un compuesto que mejora la preeclampsia o eclampsia, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula que expresa una molécula de ácido nucleico de sFlt-1, VEGF o PlGF con un compuesto candidato, y comparar el nivel de expresión de dicha molécula de ácido nucleico en dicha célula que ha entrado en contacto con dicho compuesto candidato con el nivel de expresión en una célula de control que no ha entrado en contacto con dicho compuesto candidato, donde una alteración en la expresión de dicha molécula de ácido nucleico de sFlt-1, VEGF o PlGF identifica que dicho compuesto candidato es un compuesto que mejora la preeclampsia o eclampsia.

(75)

El método de (74), donde dicha alternación es una reducción en el nivel de sFlt-1.

(76)

El método de (74), donde dicha alternación es un aumento en el nivel de VEGF o PlGF.

(77)

El método de (74), donde dicha alteración en la expresión es una alternación en la transcripción.

(78)

El método de (74), donde dicha alteración en la expresión es una alternación en la traducción.

(79)

Una composición farmacéutica que incluye un polipéptido VEGF o PlGF o una porción de este, y un compuesto que reduce la hipertensión formulados en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

(80)

Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de PlGF o una porción de esta, formulada en un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración a un mamífero embarazado.

(81)

La composición de (79), que comprende además una molécula de ácido nucleico de VEGF o una porción de esta.

(82)

Una composición que comprende un anticuerpo purificado o un fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a sFlt-1.

(83)

La composición de (82), donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno previene la unión de un factor de crecimiento sFlt-l.

(84)

La composición de (82), donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

(85)

La composición de (82), donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este es un anticuerpo humano o humanizado.

(86)

La composición de (82), donde dicho anticuerpo carece de una porción Fc.

(87)

La composición de (82), donde dicho anticuerpo es un F (ab') 2, un Fab o una estructura Fv.

(88)

La composición de (82), donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este está presente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

(89)

Un método para identificar un compuesto que mejora la preeclampsia o eclampsia, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula que expresa un polipéptido sFlt-1, VEGF o PlGF con un compuesto candidato, y comparar el nivel de expresión de dicho polipéptido en dicha célula que ha entrado en contacto con dicho compuesto candidato con el nivel de expresión del polipéptido en una célula de control que no ha entrado en

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