ES2527287T3 - Método para la detección de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella - Google Patents
Método para la detección de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella Download PDFInfo
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Abstract
Método para la identificación simultánea y específica de bacterias causantes de zoonosis, pertenecientes a los géneros Anaplasma/ Ehrlichia y al género Bartonella, que comprende las siguientes etapas: a. Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción que contenga cebadores que amplifiquen de forma específica las secuencias SEQ ID NO: 1-7 de las especies de Anaplasma/Ehrlichia y las secuencias SEQ ID NO: 8-17 de especies de Bartonella, o sus respectivas secuencias complementarias, b. Amplificar de manera simultánea las secuencias de la etapa (a) mediante reacción en cadena de la polimerasa, c. Identificar las secuencias amplificadas de la etapa (b) usando las sondas que consisten en las SEQ ID NO: 26-42, o sus secuencias complementarias, para hibridar con las secuencias SEQ ID NO 1-17, y d. Detectar la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis asociando las secuencias identificadas de la etapa (c) con una especie bacteriana que pertenece a los géneros Anaplasma/Ehrlichia o al género Bartonella, en el que las especies bacterianas que pertenecen a los géneros Anaplasma/Ehrlichia se seleccionan de la lista que consiste en A. phagocytophilum, E. ruminantium, E, sennetsu, E. risticii, E. muris, A. platys, E. canis y E. Ovina.
Description
E07119610
31-12-2014
La presente invención propone el empleo de los genes 16S y msp2 y el espacio intergénico 16S-23S para la detección e identificación de diferentes especies y grupos de especies bacterianas zoonóticas, aportando mejoras
5 respecto de los procedimientos descritos anteriormente, puesto que éste es capaz de detectar específicamente un número muy elevado especies bacterianas, mediante el empleo de sondas y cebadores con unos niveles de sensibilidad bastante elevados.
Así, la presente invención consigue resolver el problema de lo tedioso y complicado que resulta detectar un elevado
10 número de especies bacterianas zoonóticas, que pueden ser clínica y/o epidemiológicamente indistinguibles, mediante el desarrollo de un método y un Kit de detección basado en la tecnología de la PCR. Concretamente, la invención permite analizar diferentes regiones del ADN bacteriano que pertenece a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella para identificar ambos géneros y especies, según se muestra en la siguiente tabla (Tabla 1).
15 En la mayoría de los casos, las especies identificadas se corresponden a especies cultivadas y en otros se refieren a especies aisladas por primera vez (especies no cultivadas). Dichas especies han sido obtenidas a partir de muestras de las especies Meles meles (tejón), Ixodes ricinus y Apodemus sylvaticus y han sido caracterizadas por las secuencias AJ269792, SEQ ID NO:44-46, según se muestra en la tabla 3.
- ESPECIE BACTERIANA
- GEN
- Anaplasma/Ehrlichia
- A. phagocytophilum msp2
- msp2
- Ehrlichia ruminantium
- 16S
- E. sennetsu
- 16S
- E. risticii
- 16S
- E. muris
- 16S
- A. platys
- 16S
- E. canis/E. ovina
- 16S
- Bartonella
- Genérica
- 16S
- B. talpae
- 16S-23S
- Bartonella sp. *
- 16S-23S
- B. phoceensis
- 16S-23S
- B. rattimasiliensis
- 16S-23S
- Bartonella sp. detectada en Apodemus sylvaticus
- 16S-23S
- B. rochalimae
- 16S-23S
- Bartonella sp. detectada en un tejón.
- 16S-23S
- Bartonella sp* detectada en Ixodes ricinus
- 16S-23S
- Bartonella sp detectada en Ixodes ricinus
- 16S-23S
- * B. chomeli/schoenbuchensis/capreoli/birtlesii
20
Figura 1.- Esta figura muestra dos membranas de hibridación para la validación de los cebadores y sondas empleados en las detecciones del género Bartonella. En la membrana de la izquierda se observa la ausencia de
25 reactividad cruzada entre las diferentes sondas dentro del género. En la membrana de la derecha puede observarse como no existe reactividad cruzada de las sondas con muestras ajenas al propio género Bartonella. La sonda S-CI2 hace referencia a la sonda empleada como CIA. Figura 2.-Esta figura muestra dos membranas de hibridación para la validación de los cebadores y sondas empleados en las detecciones del género Anaplasma/Ehrlichia. En la membrana de la izquierda se observa la
30 ausencia de reactividad cruzada entre las diferentes sondas dentro del género. En la membrana de la derecha puede observarse como no existe reactividad cruzada de las sondas con muestras ajenas al propio género Anaplasma/Ehrlichia. La sonda S-CI2 hace referencia a la sonda empleada como CIA.
35 De acuerdo con un primer aspecto de la invención, ésta se refiere a un método (en adelante, método de la invención) para la detección e identificación simultanea de bacterias que causan zoonosis que pertenecen a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y al género Bartonella que comprende las siguientes etapas:
3
E07119610
31-12-2014
- TABLA 2. Detección e identificación de especies del género Anaplasma/Ehrlichia
- ORGANISMO
- GEN CEBADOR SONDAS SECUENCIAS POSICIÓN
- Anaplasma (Ehrlichia)
- A. phagocytophilum
- msp2 SEQ ID NO:18 (EF143812 (1-22)) MSP2 (SEQ ID NO:26) SEQ ID NO:1 EF143812 (223-243)
- SEQ ID NO:19 (EF143812 (313-334)
- Genérica
- 16S SEQ ID NO:20. (U02521 (9-30) AEGEN (SEQ ID NO:48) SEQ ID NO:47 U02521 (38-57)
- SEQ ID NO:21 (U02521 (109-86)
- Ehrlichia ruminantium
- 16S SEQ ID NO:21 S-RUM (SEQ ID NO:27) SEQ ID NO:2 DQ640401 (23-45)
- SEQ ID NO:21
- E. sennetsu
- 16S SEQ ID NO:20. S-SEN (SEQ ID NO:28) SEQ ID NO:3 M73225 (46-63)
- SEQ ID NO:21
- E. risticii
- 16S SEQ ID NO:20. S-RIS (SEQ ID NO:29) SEQ ID NO:4 AY005439 (46-65)
- SEQ ID NO:21
- E. muris
- 16S SEQ ID NO:20. S-MUR (SEQ ID NO:30) SEQ ID NO:5 AY587608 (16-37)
- SEQ ID NO:21
- A. platys
- 16S SEQ ID NO:20. S-PLA (SEQ ID NO:31) SEQ ID NO:6 EF139459 (53-75)
- SEQ ID NO:21
- E. canis/E. ovina
- 16S SEQ ID NO:20. S-CANOVIN (SEQ ID NO:32) SEQ ID NO:7 EF011111 (14-37)
- SEQ ID NO:21
- TABLA 3. Detección e identificación de especies del género Bartonella
- ORGANISMO
- GEN CEBADOR SONDAS SECUENCIAS POSICIÓN
- Bartonella
- Genérica
- 16S SEQ ID NO:22 (AJ223780 (961-979)) BARTGEN2 (SEQ ID NO:33) SEQ ID NO:8 AJ223780 (1054-1075)
- SEQ ID NO:23 (AJ223780 (13761398))
- B. talpae
- 16S-23S SEQ ID NO:24 (AY116638 (455-478)) S-TOPO (SEQ ID NO:34) SEQ ID NO:9 SEQ ID NO: 43 (90-113)
- SEQ ID NO:25 (724-743 (AJ269786))
- B. phoceensis
- 16S-23S SEQ ID NO:24 S-PHO (SEQ ID NO:35) SEQ ID NO:10 AY515123 (659-679)
- SEQ ID NO:25
- B. rattimasiliensis
- 16S-23S SEQ ID NO:24 S-RAT (SEQ ID NO:36) SEQ ID NO:11 AY515122 (807-827)
- SEQ ID NO:25
- B. rochalimae
- 16S-23S SEQ ID NO:24 S-ROC (SEQ ID NO:37) SEQ ID NO:12 AF415211 (414-434)
- SEQ ID NO:25
- Bartonella sp. *
- 16S-23S SEQ ID NO:24 CHOSCA (SEQ ID NO:38) SEQ ID NO:13 AY116639 (438-461)
- SEQ ID NO:25
- Bartonella sp. de Apodemus sylvaticus
- 16S-23S SEQ ID NO:24 S-APO38 (SEQ ID NO:39) SEQ ID NO:14 AJ269792 (425-445)
- SEQ ID NO:25
- Bartobella sp de Meles meles
- 16S-23S SEQ ID NO:24 S-TEJ (SEQ ID NO:40) SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:44 (329350)
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