ES2839874T3

ES2839874T3 - Método para detectar la presencia de una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta

Info

Publication number: ES2839874T3
Application number: ES15869408T
Authority: ES
Inventors: Juha Kirveskari; Jaakko Kurkela
Original assignee: Mobidiag Oy
Current assignee: Mobidiag Oy
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: US20190345540A1; EP3234608A4; FI20146124A7; CN107110864A; JP2017538434A; AU2024202374A1; CA3241623A1; JP6873903B2; EP3234608A1; CN107110864B; AU2021269432B2; FI126289B; CA3241618A1; CA2971529A1; US11566294B2; AU2015366081A1; EP3234608B1; PL3234608T3; WO2016097491A1; AU2021269432A1

Abstract

Un método para detectar la presencia de una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta en una muestra biológica, comprendiendo el método: realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN extraído de la muestra biológica como molde, un primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos específico para amplificar una secuencia diana en el gen hydR de C. difficile en la reacción, en donde dicho gen hydR comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 1, y un segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos específico para amplificar al menos parte de la secuencia diana correspondiente a la secuencia de C. difficile expuesta en SEQ ID NO: 2 en la reacción, en donde la secuencia diana específica de C. difficile para el primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos es una región de nucleótidos de un gen hydR de C. difficile como se expone en SEQ ID NO: 1 y al menos parte de dicha región de nucleótidos está específicamente amplificada.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para detectar la presencia de una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta

La presente invención se refiere al campo de los ensayos de diagnóstico basados en la amplificación de ácidos nucleicos. Más específicamente, la presente invención proporciona un método basado en PCR para detectar una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta, preferiblemente la cepa 027 de Clostridium difficile productora de toxinas, en una muestra biológica, tal como una muestra de heces. La presente invención se basa en el uso de cebadores y sondas oligonucleotídicos específicas para marcadores negativos y positivos para cepas de Clostridium difficile hipervirulentas.

Antecedentes de la invención

La infección por C. difficile (ICD) es una enfermedad intestinal mediada por toxinas. Los resultados clínicos de la ICD pueden variar desde una colonización asintomática hasta síndromes de enfermedad más graves, que incluyen diarrea intensa, dolor abdominal, fiebre y leucocitosis. C. difficile es reconocido como la principal causa de diarrea infecciosa que se desarrolla en pacientes después de la hospitalización y el tratamiento con antibióticos. Por lo tanto, la ICD ahora se considera una de las infecciones asociadas a la atención médica más importantes. Adicionalmente, también están surgiendo reservorios no hospitalarios de C. difficile, y C. difficile es capaz de propagarse en anfitriones animales (Denéve et al., 2009; Rupnik et al, 2009).

Los métodos de prueba de C. difficile incluyen actualmente métodos de cultivo citotoxigénicos, ensayos de citotoxina (CYT) que detectan las toxinas A y B producidas por C. difficile, ensayos basados en PCR para la detección del gen tcdB de C. difficile, y ensayos para la detección de glutamato deshidrogenasa (GDH) específica de C. difficile (Eastwood et al., 2009).

En la técnica anterior, se ha descubierto que las pruebas basadas en PCR son herramientas de diagnóstico fiables, sensibles y específicas para el escrutinio e identificación rápidos de muestras que contienen C. difficile (Eastwood et al., 2009; Hirvonen et al., 2013; Houser et al., 2010 y documento WO2012087135). Se encuentra en uso comercial un método descrito por el documento WO2010116290 (Philips) relativo a un ensayo de PCR multiplex para la detección de una cepa de C. difficile toxigénica analizando la presencia o ausencia del gen tcdB de la citotoxina y deleciones en el gen tcdC.

Aunque ya se han descrito varios ensayos basados en PCR para detectar la cepa de Clostridium difficile productora de toxinas, todavía existe la necesidad en el campo de un ensayo de PCR que sea capaz de proporcionar una alta especificidad y fiabilidad para la detección de aquellas cepas de C. difficile que son hipervirulentas. Los autores de la presentes invención han localizado ahora regiones de secuencia de ADN en el genoma de Clostridium difficile que son sorprendentemente adecuadas para la amplificación específica y sensible de marcadores negativos y positivos relacionados con cepas de Clostridium difficile hipervirulentas.

Es probable que la matriz de la muestra, que en el diagnóstico de la diarrea suele ser una muestra de heces o alimenticia, contenga una gran cantidad de inhibidores de la PCR. Esto reduce la eficacia de amplificación de la reacción de PCR y, por lo tanto, se espera una optimización aún más cuidadosa de la etapa de diseño del amplicón para verificar que todos los moldes y números de copias se amplifiquen por igual pero también de manera suficientemente eficaz. Por lo tanto, se requiere un diseño de oligonucleótidos que permita una alta eficacia de la PCR (de manera óptima, tan cercana a 100% como sea posible). El método de detección utilizado también puede afectar a la eficacia y/o el sesgo de amplificación.

Los autores de la presente invención han localizado ahora regiones de secuencia de ADN que son muy adecuadas para la amplificación y cuantificación específicas y sensibles de las cepas de Clostridium difficile hipervirulentas que causan diarrea. Los amplicones se han diseñado para que sean tan específicos que se puedan combinar en cualquier conjunto multiplex entre sí. Naturalmente, un requisito previo para esto es que todos los amplicones descritos también se hayan diseñado para amplificar en las mismas condiciones de reacción y ciclos. El objetivo de la invención es reemplazar la prueba de antígenos y el cultivo como prueba de escrutinio para Clostridium difficile hipervirulento, y así proporcionar mejoras de procedimiento para beneficios en el laboratorio y clínicos en una mejor gestión del paciente al proporcionar rápidamente un rico conjunto de información. Adicionalmente, el control de infecciones podría beneficiarse si los laboratorios de microbiología clínica pudieran diferenciar fácilmente entre los C. difficile no toxigénico y C. difficile hipervirulento.

Compendio de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para detectar la presencia de una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta en una muestra biológica, comprendiendo el método:

realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN extraído de la muestra biológica como molde, un primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos específico para amplificar una secuencia diana en el gen hydR de C. difficile en la reacción, en donde dicho gen hydR comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 1, y un segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos específico para amplificar al menos parte de la secuencia diana correspondiente a la secuencia C. difficileexpuesta en SEQ ID NO: 2 en la reacción.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un conjunto de cebadores oligonucleotídicos que comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 4, en donde el conjunto de cebadores oligonucleotídicos amplifica una secuencia diana en el gen hydR de C. difficile.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un conjunto de cebadores oligonucleotídicos que comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 6, en donde el conjunto de cebadores oligonucleotídicos amplifica una secuencia diana específica en el genoma de C. difficile.

Otro objeto de la presente descripción es proporcionar un conjunto de cebadores oligonucleotídicos que comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 11 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 12, en donde el conjunto de cebadores oligonucleotídicos amplifica una secuencia diana en el gen tcdB de C. difficile.

Otro objeto de la presente descripción es proporcionar un kit para detectar una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta en una muestra biológica, comprendiendo el kit: un conjunto de cebadores oligonucleotídicos como se definió anteriormente; y un reactivo para realizar la amplificación de un ácido nucleico en una reacción de amplificación de ácido nucleico.

Descripción detallada de la invención

El propósito del método de la presente invención es servir como prueba de detección microbiológica primaria para la identificación cualitativa de C. difficile hipervirulento, y un ribotipo 027 asociado a una enfermedad recurrente. El método se realiza preferiblemente a partir de ADN extraído directamente de una muestra biológica, tal como una muestra de heces, sin el uso de un cultivo de enriquecimiento. Preferiblemente, el método de la invención es un ensayo de C. difficile basado en PCR: tal como un ensayo de qPCR o una prueba de diagnóstico in vitro cualitativa multiplexada basada en ácidos nucleicos destinada a detectar marcadores de ácidos nucleicos correspondientes a la detección e identificación de Clostridium difficile hipervirulento y marcadores selectivos de ribotipo 027 productores de toxina.

Como se emplea en la presente memoria, una "secuencia diana" presente en una muestra de ácido nucleico es una hebra de ADN de C. difficile que debe ser cebada y extendida por un "cebador". Una secuencia diana puede ser de hebra sencilla o dúplex con su secuencia complementaria. La secuencia diana como se define en la presente invención se purifica preferiblemente hasta cierto grado antes de las reacciones de amplificación descritas en la presente memoria.

Como se emplea en la presente memoria, el término "oligonucleótido" se refiere a cualquier polímero de dos o más de nucleótidos, nucleósidos, nucleobases o compuestos relacionados utilizados como reactivo en los métodos de amplificación de ADN, tales como cebadores y sondas. El oligonucleótido puede ser ADN y/o ARN y/o análogos de los mismos. El término oligonucleótido no denota ninguna función particular del reactivo; más bien, se utiliza genéricamente para cubrir todos los reactivos descritos en la presente memoria. Los oligonucleótidos específicos de la presente invención se describen con más detalle a continuación. Como se emplea en la presente memoria, un oligonucleótido puede tener prácticamente cualquier longitud, limitada solo por su función específica en la reacción de amplificación del ADN. Los oligonucleótidos de una secuencia y estructura química definidas se pueden producir mediante mecanismos conocidos por los expertos en la técnica, tales como mediante síntesis química o bioquímica, y mediante expresión in vitro o in vivo a partir de moléculas de ácido nucleico recombinantes, p. ej., vectores bacterianos o virales. Los oligonucleótidos pueden modificarse de cualquier forma, siempre que una modificación dada sea compatible con la función deseada de un oligonucleótido dado. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente si una modificación dada es adecuada o deseada para cualquier oligonucleótido dado de la presente invención. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de base, modificaciones de azúcar o modificaciones de la cadena principal. Si bien el diseño y la secuencia de oligonucleótidos para la presente invención dependen de su función como se describe a continuación, generalmente se deben tener en cuenta varias variables. Entre los más críticos se encuentran: longitud, contenido de G/C, temperatura de fusión (Tm), energía libre de Gibbs (G), especificidad, autocomplementariedad y complementariedad con otros oligonucleótidos del sistema, tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G) y la secuencia del extremo 3'. El control de estas y otras variables es un aspecto convencional y bien conocido del diseño de oligonucleótidos, y varios programas informáticos están fácilmente disponibles para escrutar un gran número de oligonucleótidos potenciales en busca de los óptimos.

Como se emplea en la presente memoria, el término "reacción de PCR", "amplificar por PCR" o "amplificación por PCR" se refiere generalmente a la amplificación exponencial de ácidos nucleicos mediada por polimerasa cíclica que emplea cebadores que hibridan con hebras complementarias, como describen, por ejemplo, Innis et al, en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990). Se han desarrollado dispositivos que pueden realizar reacciones de ciclos térmicos con composiciones que contienen indicadores fluorescentes que pueden emitir un haz de luz de una longitud de onda específica, leer la intensidad del colorante fluorescente y mostrar la intensidad de la fluorescencia después de cada ciclo. El producto de amplificación contiene una secuencia que tiene identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico diana o su complemento y se puede detectar, por ejemplo, con un colorante intercalante o una sonda de detección que tiene especificidad para una región de la secuencia de ácido nucleico diana o su complemento. La reacción de PCR como se define en la presente invención se realiza preferiblemente como un ensayo de PCR en tiempo real.

Como se emplea en la presente memoria, el término "sonda" se refiere a cualquiera de una variedad de moléculas de señalización indicativas de amplificación. Por ejemplo, SYBR® Green y otros colorantes que se unen al ADN son sondas detectoras. Algunas sondas detectoras pueden estar basadas en secuencias, por ejemplo, sondas de nucleasa 5'. Se conocen en la técnica varias sondas detectoras, por ejemplo, sondas TaqMan® (véase la Patente de Estados Unidos Núm. 5.538.848). La temperatura de fusión, Tm, de las sondas se puede aumentar mediante la adición de nucleótidos modificados. La cantidad de nucleótidos modificados en una sonda es preferiblemente 1, 2, 3, 4 o más. El nucleótido modificado puede ser un nucleótido LNA (Exiqon A/S), un aglutinante de surco menor (MGB™), SuperBase o un ácido peptidonucleico (PNA) o cualquier otra modificación que aumente la Tm de la sonda.

Un experto en la técnica sabe que las secuencias diana amplificadas, es decir, amplicones, varían naturalmente en las cepas relacionadas. Esta pequeña variación se puede tener en cuenta al diseñar cebadores adecuados para amplificar dichos amplicones en el método de la presente invención. Preferiblemente, en el método se amplifica una secuencia de al menos 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos de longitud de cada uno de los amplicones diana seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1,2 y 10.

Preferiblemente, los cebadores y las sondas comprenden las secuencias definidas en las reivindicaciones y tienen menos de 30, 35, 40, 45, 50 o 55 nucleótidos de longitud y, más preferiblemente, menos de 50 nucleótidos de longitud. Cada uno de los presentes cebadores y sondas también se puede definir por constar de al menos 10, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos contiguos presentes en cualquiera de las secuencias de cebadores o sondas seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3-9 y 11-13 o que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3-9 y 11-13.

La presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de un cepa de Clostridium difficile hipervirulenta en una muestra biológica. Preferiblemente, el método es un ensayo de PCR en tiempo real. El método se puede realizar utilizando un chip de ADN, electroforesis en gel, una medición de radiación, una medición de fluorescencia o una medición de fosforescencia. Un experto en la técnica puede utilizar los cebadores y sondas de la invención también en otros métodos y plataformas que utilizan PCR o amplificación de ácidos nucleicos. Dicha muestra biológica puede ser, p. ej., una muestra de heces, una muestra ambiental o una muestra alimenticia.

El método comprende la etapa de:

realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN extraído de la muestra biológica como molde, un primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos específico para amplificar una secuencia diana en el gen hydR de C. difficile en la reacción, en donde dicho gen hydR comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 1, y un segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos específico para amplificar al menos parte de la secuencia diana correspondiente a la secuencia de C. difficile expuesta en SEQ ID NO: 2 en la reacción. Preferiblemente, el método comprende una etapa de detección de la presencia de una cepa Clostridium difficile hipervirulenta en dicha muestra biológica mediante cualquier método capaz de detectar secuencias diana amplificadas en la reacción.

La cepa de Clostridium difficile hipervirulenta se detecta una en la muestra, cuando el primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos no amplifica un producto específico, es decir, la secuencia diana en el gen hydR es un marcador negativo para la cepa de Clostridium difficile hipervirulenta, y el segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos amplifica un producto específico, es decir, la secuencia elegida como diana por el segundo conjunto de cebadores en el genoma de C. difficile es un marcador positivo para las cepas de Clostridium difficile hipervirulentas.

La cepa de Clostridium difficile hipervirulenta más importante detectada por el presente método es la cepa 027 de Clostridium difficile productora de toxinas. Por lo tanto, el presente método está particularmente dirigido a la detección de esta cepa de Clostridium difficile. La presencia de ADN del gen hydR de C. difficile en dicha muestra, sin embargo, indica que la cepa 027 de Clostridium difficile no está presente en la muestra examinada o que además de la presencia de una cepa 027 de Clostridium difficile productora de toxinas, también hay presencia de otra cepa de Clostridium difficile en la muestra. Un experto en la técnica es consciente, sin embargo, de que algunas cepas de C. difficile hipervirulentas no se clasifican como cepas de ribotipo 027, por lo tanto, la presente invención también se refiere a la detección de cepas de Clostridium difficile que se asemejan al ribotipo 027 hipervirulentas.

Preferiblemente, el primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos se dirige al gen hydR de C. difficile y amplifica la secuencia de hydR expuesta en SEQ ID NO: 1 de modo que al menos parte de la secuencia se amplifica específicamente en la reacción de amplificación. Más preferiblemente, el primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 4, amplificando dichos cebadores al menos parte de la secuencia de hydR expuesta en SEQ ID NO: 1. Lo más preferiblemente, el primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 4.

La presencia de la secuencia diana amplificada con el primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos puede detectarse mediante el uso de una sonda que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 7, o preferiblemente, por el uso de una sonda que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 7.

La secuencia diana del segundo cebador oligonucleotídico expuesta en el genoma de C. difficile corresponde a un gen que codifica una supuesta proteína de recombinación de ADN de transposón conjugativo. Preferiblemente, dicho segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 6. Más preferiblemente, el segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 6.

Las sondas para el segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos como se define en SEQ ID NO: 8 y 9 se pueden utilizar como sondas competitivas en una misma reacción para detectar un polimorfismo G/A en el genoma de C. difficile en una posición correspondiente a la posición 12 en SEQ ID NO: 8 o 9. La presencia de la secuencia diana amplificada con el segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos se puede detectar mediante el uso de una sonda que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 7 de manera que se detecta dicho polimorfismo G/A. Preferiblemente, la secuencia diana amplificada con el segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos se detecta mediante el uso de una sonda que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 8 o 9.

La reacción de amplificación como se define en el método puede comprender adicionalmente un tercer conjunto de cebadores oligonucleotídicos específico para amplificar el gen de la toxina B de C. difficile (tcdB). El tercer conjunto de cebadores oligonucleotídicos amplifica al menos parte de la región de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 10.

Preferiblemente, el tercer conjunto de cebadores oligonucleotídicos comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 11 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 12.

Más preferiblemente, el tercer conjunto de cebadores oligonucleotídicos comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 11 y un oligonucleótido que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 12.

La presencia de la secuencia diana amplificada con el tercer conjunto de cebadores oligonucleotídicos se detecta mediante el uso de una sonda que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 13, preferiblemente, mediante el uso de un cebador que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 13.

La presente invención también se refiere a conjuntos de cebadores oligonucleotídicos, es decir, oligonucleótidos, que comprenden cebadores como se definió anteriormente para el primer, segundo o tercer conjunto de cebadores oligonucleotídicos o una mezcla de los mismos. Los conjuntos de cebadores también pueden comprender sondas como se definió anteriormente para su uso con cada uno de los conjuntos de cebadores. La presente invención también se refiere al uso de estos conjuntos de cebadores oligonucleotídicos para la detección de la presencia de una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta en una muestra biológica, tal como una muestra de heces o una muestra alimenticia. La presente descripción también proporciona kits para detectar una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta en una muestra biológica, un kit puede comprender el conjunto de cebadores oligonucleotídicos como se definió anteriormente; y un reactivo para realizar la amplificación de un ácido nucleico. Preferiblemente, el reactivo se selecciona del grupo que consiste en: ADN polimerasa, dNTP y un tampón.

Otra realización de la invención es un método para detectar la presencia de una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta en una muestra biológica utilizando cebadores y sondas oligonucleotídicos con nucleótidos modificados. Generalmente, el uso de nucleótidos modificados hace posible el acortamiento de un cebador o sonda oligonucleotídicos sin comprometer su especificidad. La cantidad de nucleótidos modificados en un cebador o sonda es preferiblemente 1,2, 3, 4 o más. El nucleótido modificado puede ser un nucleótido LNA (Exiqon A/S), un aglutinante de surco menor (MGB™), una SuperBase o un ácido peptidonucleico (PNA) o cualquier otra modificación de nucleótido que tenga el mismo efecto sobre el oligonucleótido. El método comprende esencialmente las mismas etapas que el método descrito anteriormente y en las reivindicaciones, pero se realiza con al menos un cebador o sonda modificados. Un ejemplo de cebadores y sondas para tal método es:

Par de cebadores 1 (para la detección del gen hydR): SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 con una sonda que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7.

Par de cebadores 2 (para la detección de un supuesto transposón conjugativo, pct): SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 con una sonda que tiene la secuencia CTG TAG ATT TCG GTA CGA (SEQ ID NO: 14), en donde los nucleótidos subrayados son nucleótidos modificados como LNA. Par de cebadores 3 (para la detección del gen tcdB): SEQ ID NO: ^{11 y SEQ ID NO: 12 con una sonda que tiene la secuencia de SEQ ID}n O: ^13.

Por consiguiente, un experto en la técnica comprenderá que la longitud de cualquiera de los cebadores o sondas anteriores se puede acortar de una manera similar utilizando al menos un nucleótido modificado.

Las publicaciones y otros materiales se utilizan en la presente memoria para iluminan los antecedentes de la invención y, en particular, para proporcionar detalles adicionales con respecto a su práctica. La presente invención se describe adicionalmente en el siguiente ejemplo, que no pretende que limite el alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Sección experimental

EJEMPLO 1

En este ejemplo, el ensayo de la invención descrita se utilizó para detectar cepas de C. difficile tanto productoras de toxinas como no productoras de toxinas. Se analizaron un total de 48 muestras caracterizadas que representaban 37 ribotipos diferentes. Esta prueba excluyó 027 o ribotipos genéticamente muy relacionados.

El ensayo contiene una reacción de PCR multiplex que amplifica el panel de dianas (Tabla 1). La identificación de C. difficile productor de toxinas y diferenciación de C.difficile hipervirulento se basan en la detección combinada de estos marcadores. Marcador de toxinas: el gen tcdB codifica la toxina B, marcador negativo para 027: hydR codifica la proteína reguladora de la transcripción de la familia TetR y el marcador positivo para 027: pct codifica la proteína de recombinación de ADN del supuesto transposón conjugativo. Los cebadores y las sondas fueron los definidos en la Tabla 9.

El ensayo de C. difficile debe proporcionar resultados positivos de diferentes cepas de C. difficile productoras de toxinas, y resultados negativos para cepas de C. difficile no productoras de toxinas. La inclusividad (reactividad analítica) se prueba para tener en cuenta la posible variación genética entre las dianas incluidas en el panel. Este ejemplo describe los resultados de la inclusividad del ensayo de qPCR de C. difficile utilizando cepas bien caracterizadas.

Tabla 1. Panel de dianas de ensayo de C.difficile

Marcador Región del gen Descripción

diana

Toxina B tcdB Detecta C.difficile productor de citotoxina (toxina B)

Marcador hipervirulento pct El marcador hipervirulento positivo se detecta solo a partir de cepas positivo hipervirulentas (ribotipo 027)

Marcador hipervirulento hydR El marcador negativo no se detecta en las cepas de ribotipo 027, pero negativo es positivo para otras cepas de C.difficile

Materiales y métodos

1.1 La lista de dianas bacterianas

El ensayo de C. difficile abarca los patógenos que causan infecciones gastrointestinales. En este estudio de inclusividad se analizaron un total de 48 muestras caracterizadas que representan 37 ribotipos diferentes que abarcan C. difficile no toxinogénico y C.difficile productor de Toxina B. La lista de cepas se describe en la Tabla 2. Esta prueba excluyó 027 o ribotipos muy estrechamente relacionados genéticamente.

Las cepas se recolectaron de biobancos comerciales disponibles (ATCC, DSMZ y Microbiologics). Las muestras de ADN se probaron a concentraciones inferiores a 100 ng/gl.

Tabla 2. Panel de prueba de inclusividad de ensayos GE C.difficile Amplidiag

1.2 Reactivos y aparatos

reactivos qPCR:

qPCR Mastermix, Mobidiag

Mezcla de ensayo formada por cebadores y sondas de qPCR de C. difficile

Dispositivos:

Stratagene MxPro 3000

Configuración de PCR

En reacción:

10 pl 2 x mezcla maestra

5 pl 4 x mezcla de cebadores

5 pl muestra / mezcla de ADN control pos^/ control de extracción de ADN/H2O

20 pl TOTAL

Programa de PCR:

RESULTADOS

Tabla 3. identificación de marcadores toxB, pct e hydR en cepas de C. difficile.

Funcionalidad de controles

• Los controles positivos se detectaron como positivos

• El control negativo se detectó como negativo

• El Control de Amplificación Interno se detectó en todas las muestras

CONCLUSIONES

Las 39 cepas productoras de toxinas se identificaron correctamente como ToxB+. Las 9 cepas no productoras de toxinas se identificaron correctamente como negativas. Ninguna cepa proporcionó una identificación falsa positiva del ribotipo 027 (toxB+, pct+, hydR-).

Los controles se detectaron como se esperaba, lo que confirmó la fiabilidad de los resultados.

EJEMPLO 2

En este ejemplo, se sometió a prueba la funcionalidad de la invención descrita para diferenciar la detección del ribotipo 027. En las muestras se incluyeron dos ribotipos muy relacionados, a saber, 016 y 176.

Materiales y métodos

Extracción de ADN

Los ADN de los productos aislados de C. difficile se extrajeron como se describe a continuación:

Se suspendió una colonia de cultivos bacterianos en el tampón 1xPBS a la concentración final aprox. 1,5 x 10A8 UFC/ml (ref. patrón 0,5 de McFarlan). Se transfirieron 100 pl de suspensión bacteriana a la etapa de lisis externa después de la extracción automatizada con el dispositivo NucliSENS EasyMAG (bioMérieux) según el protocolo del fabricante para el programa Generic 2.0.1. Los ADN se eluyeron en 100 pl de tampón de elución. La serie de extracción contenía el control de extracción, es decir, C. difficile (cepa no productora de toxinas).

PCR en tiempo real y análisis

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo como se define en el Ejemplo 1. El control de amplificación interno, el control de PCR positivo y el control de PCR negativo se incluyen en la serie de pruebas.

Se analizaron un total de 18 cepas de ribotipo 027 diferentes, una cepa de ribotipo 016 y una cepa de ribotipo 176.

Tabla 4. identificación de marcadores toxB, pct e hydR en cepas 027 de C. difficile.

El ensayo proporcionó una identificación de identificación positiva correcta de las 18 cepas 027 diferentes y proporcionó una identificación positiva de los ribotipos 016 y 176. Por tanto, el ensayo detecta los ribotipos 016 y 176 estrechamente relacionados genéticamente además del ribotipo 027 como 027+.

EJEMPLO 3

En este ejemplo, la invención descrita se comparó con un método de la técnica anterior para detectar un C. difficile presuntamente positivo para 027. El ensayo de la invención se comparó con la prueba Xpert C. difficile/Epi (Cepheid). La prueba Xpert C. difficile/Epi utiliza la detección de una deleción en el gen tcdC para informar sobre un hallazgo presuntamente positivo para 027.

Se probaron un total de 11 cepas diferentes, que representan 11 ribotipos diferentes, con ambos métodos y se compararon los resultados.

La prueba Xpert C. difficile/Epi informó de que 5 cepas eran C. difficile toxigénicas positivas, presuntamente positivas para 027, si bien ninguna de las cepas sometidas a prueba era realmente ribotipo 027. De estas 5 cepas, el método de la presente invención identificó solo 2 cepas como positivas para 027, lo que demuestra un efecto mejorado en la diferenciación entre ribotipo 027 y distinto de 027 en comparación con la técnica anterior. Es notable que estas dos cepas de C. difficile (016 y 176) hayan demostrado estar altamente relacionadas con cepas de C. difficile hipervirulentas (Knetsch et al., 2011).

La identificación de los marcadores descritos informó correctamente sobre 9 cepas como ToxB+, pero no 027+, como se esperaba. En resumen, el ensayo de la invención identificó correctamente 9/11 cepas como 027-, mientras que la prueba Xpert C. difficile/Epi informó correctamente de 6/11 cepas con respecto a la supuesta negatividad de 027. EJEMPLO 4

El flujo de trabajo de la presente invención consiste en la extracción de ácidos nucleicos de muestras de heces (NucliSens easyMAG), amplificación por PCR en tiempo real y detección de regiones de genes diana y análisis de resultados.

En este ejemplo, se sometieron a prueba diferentes cepas de C. difficile productoras de toxinas como muestras enriquecidas en fondo de heces. Se utilizaron un total de 35 cepas diferentes. Cada cepa se incorporó a una muestra de heces negativa para C. difficile. Se extrajo ADN de muestras de heces y se prepararon reacciones de qPCR de modo que la cepa estuviera presente a concentraciones de 7,5 UFC/reacción o 75 UFC/reacción como se ilustra en la Tabla 6. Todas las muestras se sometieron a prueba en reacciones por duplicado.

Los resultados demuestran que las cepas se identificaron correctamente como positivas en todos los casos.

Tabla 6. Detección de diferentes cepas de C. difficile productoras de toxinas en muestras de heces enriquecidas.

Valores Cq de detección de marcadores

CI = control interno, controla la inhibición de la PCR

UFC/rxn = unidades formadoras de colonias/reacción

Dos réplicas por muestra

EJEMPLO 5

Este ejemplo describe los resultados de un estudio de posibles resultados falsos positivos en el ensayo de qPCR de C. difficiledebido a una reacción cruzada. El material de muestra para este ensayo diseñado es una muestra de heces. Por lo tanto, los patógenos (bacterias, virus y parásitos) asociados con infecciones gastrointestinales, y que no están cubiertos por el panel de ensayo, pueden causar una posible reacción cruzada. También las bacterias incluidas en la flora comensal pueden tener reacciones cruzadas. Además, los patógenos incluidos en el panel de dianas de ensayo se añaden al estudio de reacción cruzada, ya que solo se debe detectar el patógeno diana y no se debe producir ninguna reacción cruzada entre otras dianas.

Materiales y métodos

Reactivos, dispositivos y muestras

Reactivos de qPCR:

Mezcla maestra de qPCR de Mobidiag (MM)

Mezcla de ensayo que consiste en cebadores y sondas de qPCR para C. difficile (véase la Tabla 9)

Dispositivos:

Stratagene Mxp3000

Configuración de PCR

En reacción:

10 gl 2 x MM

5 gl 4 x Cebador

mezcla

5 gl muestra/mezcla de ADN control pos./H2O

20 gl

Control Pos. = mezcla de moldes

Muestras:

ADN (o ARN) extraído de 127 patógenos. Las cepas se han recolectado principalmente de biobancos disponibles comercialmente (ATCC, DSMZ, Microbiologics Qnostics y Vircell). Algunas cepas se añaden del biobanco Mobidiag y esas cepas se han purificado originalmente a partir de muestras de pacientes y se han caracterizado por HUSLAB (laboratorio del hospital central de la Universidad de Helsinki).

La cantidad de ADN se determinó mediante un ensayo de ARNr 16S o mediante NanoDrop.

Tabla 7. Resultados de reacciones cruzadas.

Funcionalidad de controles

• Los controles positivos se detectaron como positivos

• Los controles negativos se detectaron como negativos

Resultados

La prueba de reactividad cruzada no mostró falsos positivos.

Tabla 9. Cebadores y sondas oligonucleotídicos

Tabla 10. Amplicones amplificados por los conjuntos de oligonucleótidos.

Referencias

Denéve, C., Janoira, C., Poilaneb, I., Fantinatob, C., y Collignon, A., New trends in Clostridium difficile virulence and pathogenesis, International Journal of Antimicrobial Agents, 200933:24-28.

Eastwood, K., Else P., Charlett, A., y Wilcox, MH., Comparison of Nine Commercially Available Clostridium difficile Toxin Detection Assays, a Real-Time PCR Assay for C. difficile tcdB, and a Glutamate Dehydrogenase Detection Assay to Cytotoxin Testing and Cytotoxigenic Culture Methods, J. Clin. Microbiol., Oct. 2009, p. 3211-3217.

Hirvonen, JJ., Mentula, S., Kaukoranta, S-S., Evaluation of a New Automated Homogeneous PCR Assay, GenomEra C. difficile, for Rapid Detection of Toxigenic Clostridium difficile in Fecal Specimens, J. Clin. Microbiol. 2013, 51 (9):2908. DOI: 10.1128/JCM.01083-13.

Houser, BA., Hattel, AL., y Jayarao, BM., Real-Time Multiplex Polymerase Chain Reaction Assay for Rapid Detection of Clostridium difficile Toxin-Encoding Strains, Foodborne Pathogens And Disease, 2010, 7(6):719-726.

Knetsch, CW., Hensgens, MPM., Harmanus, C., van der Bijl, MW., Savelkoul, PHM., Kuijper, EJ., Corver J., y van Leeuwen, HC., Genetic markers for Clostridium difficile lineages linked to hypervirulence, Microbiology (2011), 157, 3113-3123.

Rupnik, M., Wilcox, MH. y Gerding, DN, Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis, Nature Reviews Microbiology 7, 526-536 (July 2009) p526, doi:10.1038/nrmicro2164

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar la presencia de una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta en una muestra biológica, comprendiendo el método:

realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN extraído de la muestra biológica como molde, un primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos específico para amplificar una secuencia diana en el gen hydR de C. difficile en la reacción, en donde dicho gen hydR comprende una secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 1, y un segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos específico para amplificar al menos parte de la secuencia diana correspondiente a la secuencia de C. difficile expuesta en SEQ ID NO: 2 en la reacción, en donde la secuencia diana específica de C. difficile para el primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos es una región de nucleótidos de un gen hydR de C. difficile como se expone en SEQ ID NO: 1 y al menos parte de dicha región de nucleótidos está específicamente amplificada.

2. El método según la reivindicación 1, que comprende una etapa de detección de la presencia de una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta en dicha muestra biológica, en done la cepa de Clostridium difficile hipervirulenta se detecta en la muestra, cuando el primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos no amplifica un producto específico y el segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos amplifica un producto específico.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde la cepa de Clostridium difficile hipervirulenta es la cepa 027 de Clostridium difficile o una cepa de Clostridium difficile que se asemeja al ribotipo 027.

4. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde la presencia de ADN del gen hydR de C. difficile en dicha muestra indica que la cepa 027 de Clostridium difficile no está presente en la muestra.

5. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde el primer conjunto de cebadores oligonucleotídicos comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 4.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo conjunto de cebadores oligonucleotídicos comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 6.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la reacción de amplificación comprende adicionalmente un tercer conjunto de cebadores oligonucleotídicos específico para amplificar el gen de la toxina B de C. difficile (tcdB) en la reacción y al menos parte de la región de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 10 se amplifica específicamente en la reacción.

8. El método según la reivindicación 7, en donde el tercer conjunto de cebadores oligonucleotídicos comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 11 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 12.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra biológica es una muestra de heces o una muestra alimenticia.

10. El método según la reivindicación 2, en donde la detección de la cepa de Clostridium difficile hipervirulenta se realiza utilizando un chip de ADN, electroforesis en gel, una medición de radiación, una medición de fluorescencia, o una medición de fosforescencia.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método se realiza como ensayo de PCR en tiempo real.

12. Un conjunto de cebadores oligonucleotídicos que comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 4, en donde el conjunto de cebadores oligonucleotídicos amplifica una secuencia diana en el gen hydR de C. difficile

y que comprende adicionalmente un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que comprende o consiste en al menos 10 nucleótidos contiguos presentes en una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 6, en donde el conjunto de cebadores oligonucleotídicos amplifica adicionalmente una secuencia diana en el genoma de C. difficile.

13. Uso del conjunto de cebadores oligonucleotídicos según la reivindicación 12 para la detección de la presencia de una cepa de Clostridium difficile hipervirulenta en una muestra biológica, preferiblemente una muestra de heces o una muestra alimenticia.