ES2391833T3

ES2391833T3 - Método y kit de detección de especies bacterianas mediante análisis de ADN

Info

Publication number: ES2391833T3
Application number: ES06764381T
Authority: ES
Inventors: Pedro Anda Fernández; Raquel Escudero Nieto; Isabel Jado García; Isabel Rodríguez Moreno; María Isabel Jiménez Alonso
Original assignee: Instituto de Salud Carlos III
Current assignee: Instituto de Salud Carlos III
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2012-11-30
Anticipated expiration: 2026-06-15
Also published as: EP2267161B1; EP1895015B1; US20080248473A1; EP1895015A1; EP2267162A1; US20110104696A1; PL1895015T3; EP2267161A1; WO2006136639A1; US8318915B2; EP2267162B1; US8445195B2

Abstract

La presente invención se refiere a la detección e identificaciónde diferentes especies bacterianas, todas ellas causantes de zooosis, basada en el análisis de ADN. Más concretamente, la invencón proporciona los cebadores, las sondas, los genes y las regions génicas para llevar a cabo un método para la detección simultáea de bacterias y grupos bacterianos pertenecientes a los género Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsi y Francisella mediante PCR Múltiple y análisis por RLB (ReverseLine Blotting), además de proporcionar el kit para llevarlo a cao

Description

Metodo y kit de deteccion de especies bacterianas mediante analisis de ADN

5 La presente invenciOn se refiere a la detecciOn e identificaciOn de diferentes especies bacterianas, todas ellas causantes de zoonosis, basada en el analisis de ADN. Mas concretamente, la invencion proporciona un metodo y un kit para la deteccion simultanea de bacterias y grupos bacterianos pertenecientes a los generos Anaplasma, Ehrlichia,Borrelia,Bartonella,Coxiella,RickettsiayFrancisellabasados en la amplificaciOn de ADN.

10 ANTECEDENTES

Actualmente hay descritas unas 200 enfermedades zoonoticas (bartonelosis, leptospirosis, borreliosis de Lyme .. .) que el hombre puede padecer. En los 'Daises del tercer mundo, representan una de las principales causas de mortalidad y suponen cuantiosas perdidas economicas. La convivencia con animales, la ausencia de infraestructuras

15 sanitarias y el bajo nivel cultural continUan siendo los principales aliados de estas enfermedades.

Determinados tipos de zoonosis tienden a extenderse por parses desarrollados como consecuencia del aumento de la poblacion en zonas urbanas y periurbanas, asi como del aumento del trafico de animales a nivel internacional, que conlleva el riesgo de introducir enfermedades exOticas en nuestro entorno.

20 Estas circunstancias unidas a los frecuentes hallazgos de artropodos infectados por mas de uno de los patogenos incluidos en la presente invencion, aumenta la posibilidad de transmisiOn de mas de una de las especies bacterianas incluidas en la presente invencion por la misma picadura.

25 Asi pues, cada vez son mas comunes las hospitalizaciones debidas a cuadros clInicos producidos por el contacto del hombre con animales o con diferentes clases de artropodos, tales como mosquitos, garrapatas, pulgas, piojos, acaros, etc., los cuales actuan como vectores o como reservorios de patOgenos. Dichos cuadros clInicos, debido a su gran similitud, no permiten una identificacion rapida y fiable del agente causante de la patologia, por lo que no es posible un tratamiento especifico y rapido, y en ocasiones Ilega demasiado tarde. Esto justifica, sin dejar lugar a

30 dudas, la necesidad de un metodo integrado de detecciOn.

Los metodos diagnosticos disponibles actualmente se limitan a la deteccion de anticuerpos que, por lo general, es retrospectiva y de escasa ayuda en el tratamiento de los pacientes en su fase aguda. El cultivo no es considerado un metodo diagnostic°, tanto por su dificultad tecnologica, que lo excluye de las practicas habituales en un laboratorio

35 de microbiologia de hospital, como por la necesidad de instalaciones P3.

El diagnostic° molecular por amplificacion de genoma mediante PCR supone una opcion diagnostica de gran valor. Sin embargo, no siempre se dispone de suficiente cantidad de muestra clInica como para ensayarla frente a una amplia bateria de patogenos o no se dispone de la metodologia necesaria para realizar diferentes ensayos.

40 Recientemente se ha publicado un trabajo (Blaskovic D. y col. 2005. Oligo-based detection of tick-borne bacteria. FEMS Microbiology Letters 243: 473 — 478), que describe un metodo para la detecciOn de productos de PCR ribosomal 16S de bacterias de picadura por garrapata incluyendo Barrelia spp.,Rickettsiaspp.,Anaplasma spp., Coxiellaspp. yFrancisellaspp.Dicho metodo esta basado en el analisis de ADN ribosomal y emplea cebadores

45 universales, que amplifican el material genetic° tanto de bacterias diana como de otras que no los son por lo que su sensibilidad es bastante reducida.

Otros metodos, tal como el descrito por las patentes Americanas US 6.300.072 y 6.518.020, son capaces de detectar e identificar bacterias del *ler° Bartonella, usando la misma region de ADN (espacio intergenico 16S —

50 23S). Sin embargo, el numero de especies dentro de este genero ha aumentado sensiblemente ya que dichas patentes se registraron y su aproximacion, que consiste en una discriminacion entre especies segun el tamario del amplicon obtenido en una PCR, no es al para determinadas especies del mismo genero que tienen un tamario similar al fragmento amplificado. Tambien se conoce en el estado de la tecnica un ensayo de hibridaciOn por PCR de deteccion sensible y especifica para la detecciOn e identificaciOn simultanea de EhrlichiayBarreliaburgdarferien

55 sentido amplio (SchouIs y col., 1999. Detection and Identification of Ehrlichia, Borrelia burgdorferi Sensu Lato, and Bartonella Species in Dutch Ixodes ricinus Ticks, Journal of Clinical Microbiology, 37: 2215 — 2222).

El metodo aportado por la presente invenciOn propone tambien el empleo de la region intergenica 16S— 238 para la deteccion de especies pertenecientes al genero Bartonella, se han introducido mejoras con respecto a los metodos

que se han descrito previamente, puesto que es capaz de detectar un grupo mucho mas amplio de especies del mismo y otros generos, usando sondas y cebadores completamente novedosos y con niveles de sensibilidad maximos.

5 Para la detecciOn de Coxiella bumetii, la presente invenciOn emplea los mismos cebadores y la misma region de ADN (secuencia de insercion IS1111) que los metodos que se han descrito previamente. Dicha deteccion se ha mejorado combinandola con otra serie de pruebas completamente novedosas para la identificacion de otras especies bacterianas, que pueden ser transmitidas por los mismos vectores, y ademas aporta una nueva sonda de hibridacion para la deteccion de Coxiellaburnetii.

10 DESCRIPCION DE LA INVENCION

Definiciones: PCR multiple o PCR Multiplex: PCR (ReacciOn en cadena de la polimerasa) es un sistema mediante el cual se amplifica o aumenta un numero de copias de una secuencia nucleoticlica especifica usando dos cebadores. 15 El analisis por PCR mOltiple o PCR Mutiplex es una variante del analisis por PCR que permite la amplificacion simultanea de mas de una secuencia diana usando mas de un par de cebadores.

La presente invencion resuelve el problema de lo tedioso y complicado que resulta detectar un elevado numero de bacterias, que causan zoonosis que pueden ser clinica y/o epidemiolOgicamente indistinguibles, mediante el

20 desarrollo de un metodo y un Kit de detecciOn para la identificaciOn simultanea de especies bacterianas causantes de zoonosis pertenecientes a los generos: Anaplasma, Ehrlichia, Barrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia y Francisella.

La solucion encontrada por la presente invencion consiste en analizar diferentes regiones del ADN bacteriano

25 simultaneamente para determinar en cada caso que especies se encuentran presentes. En concreto, se analiza el gen 16S ARNr para detectar la presencia de Anaplasma,EhrilchiayBarrelia;el espacio intergenico 23S — 5S ARNr para detectar la presencia de Rickettsia; el gen que codifica para el precursorde laproteina principaldemembrana TUL4 para detectar la presencia de Francisella; el gen de la transposasa IS1111 para detectar la presencia de Coxiellay el espacio intergenico 16S — 23S para detectar la presencia de Bartonella.

30 De acuerdo con lo anterior, un primer aspecto de la invencion se ref iere a un metodo para la deteccion de bacterias a partir de una muestra, que comprende los siguientes pasos:

i) Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reaccion, que contiene cebadores especificos para la 35 realizaciOn de PCR Multiplex.

ii) La amplificacion mediante reaccion en cadena de la polimerasa.

iii) La identificacion de formacion de los productos del paso anterior, siendo dicha formacion indicativa de la 40 presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis.

Los cebadores especificos que se han mencionado en la etapa (i) son SEO ID NO: 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37.

45 En relaciOn con este primer aspecto de la invenciOn, dicha invencion proporciona un metodo para detectar simultaneamente:

•Anaplasmaphagocytophilum,A.bovis,A.equi,A.marginate,A.centraleyA.ovis.

50 • EhrlichiachaffeensisyE.Ewingii.

•Bartonellahenselae,B. quintana,B. clarridgeiae,B. elizabethae,B.grahamii,B. vinsoniisubespecieberkhofii,B. vinsanii subespecievinsonii,B. vnisoniisubespecieaurupensis,B.bacilliformis,B. alsatica,B.bovis,B.dashiae,B.

koehlerae,B.schoenbuchensis,B. tayloriyB. tribocorum. 55

• Todas las especies del genero Barrelia.

•: Caxiellaburnetii.

•: Cualquier subespecie de Francisellatularensis,incluyendo F. tularensissubesp. tularensis,F. tularensissubesp.

holarctica yF. tularensissubesp. navicida,que se detectan conjuntamente, y la variante 3523 de la misma especie y 5 los denominados endosimbiontes de diferentes especies de ixodidos y argasidos, que se detectan diferencialmente.

• El genero Rickettsia, el grupo de las mismas causantes de las fiebres manchadas y el grupo causante del tif us, las especies Rickettsiaakari,R.bellii,R.slovaca,R.canarii,R.aeschlimannii,R. ricketsii,R.sibirica,R.helvetica,R. felis,R.australis,R.prowazekii,yR. typhy(R.maaserii).

10 todas ellas capaces de provocar zoonosis, infectar conjuntamente a un individuo y ser dificiles de identificar mediante la obsen/aciOn de los cuadros clinicos, en base a la amplificaciOn y analisis de genes o regiones genicas concretas (Tablas 1 — 6).

15 Se amplifican fragmentos de ADN incluidos o comprendidos en las secuencias cuyos numeros de acceso se muestran en las tablas 1 —6 que se muestran a continuaciOn.

Las regiones amplificadas pueden tener un tamario de entre 99 y 686 nucleOtidos y contienen regiones variables empleadas para la identificaci6n. Las regiones variables pueden contener o estan incluidas en las SEQ ID NO: 55 a 20 SEQ ID NO: 93 o secuencias complementarias, cuyas posiciones se muestran en las tablas de 1 a 6.

Los productos de amplificacion, que permiten identificar los diferentes especies y grupos bacterianos pueden detectarse simultaneamente mediante el empleo de sondas. Dichas sondas pueden tener una longitud de entre 15 y 25 nucleotidos, mas especificamente, las sondas son sondas que comprenden las secuencias SEQ ID NO: 3 — 6;

25 SEQ ID NO: 9 —24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33— 35; SEQ ID NO: 38 — 51. Las sondas tienen secuencias utiles para detectar una secuencia que comprende o estan incluidas en las secuencias SEQ ID NO: 3 — 6; SEQ ID NO: 9 — 24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33 — 35; SEQ ID NO: 38 — 51; o secuencias complementarias (Tablas 1 — 6).

30 Los cebadores pueden ser diseriados mediante alineamiento multiple usando programas de ordenador, tal como CLUSTAL X, que permite la identificacion de regiones muy conservadas que sirven de molde.

Los cebadores hibridan los genes indicados en las Tablas 1 a 6 que se indican a continuacion, y especialmente aquellos con secuencias cuyo numero de acceso se muestra en las tablas 1 — 6 que se muestran a continuacion.

35 Los cebadores tienen secuencias que comprenden o estan incluidas en las SEQ ID NO: 1 — 2; SEQ ID NO: 7 — 8; SEQ ID NO: 25 — 26; SEQ ID NO: 28 — 29; SEQ ID NO: 31 — 32; SEQ ID NO: 36 — 37; o secuencias complementarias.

Breve explicacion de las tablas: 40

-: Columna 1 (organismo): Indica las especies bacterianas o grupo de especies bacterianas detectadas en cada caso.

-: Columna 2 (gen): Indica el gen o region genomica usada para detectar las especies bacterianas o grupo de

especies de la columna 1. 45

-Columna 3 (cebador): Indica la secuencia del par de cebadores necesarios para realizar la amplificaciOn de la regiOn genica variable o regiones genomicas indicadas en cada tabla (columna 2).

-Columna 4 (sonda): Indica la secuencia de las sondas usadas para detectar las especies bacterianas o grupo de 50 especies a las que se hace referenda en la columna 1 de cada tabla.

-Columna 5 (secuencia 5 — 3'): Indica las referencias de secuencias de las regiones variables que se amplifican para detectar cada especie bacteriana o grupo de especies.

55 -Columna 6 (posiciOn 5'— 3'):

-: La primera fila: Indica un codigo de secuencia relativo a un gen o region genOmica a la que se hace referencia en la columna 2, ademas de la posicion especifica de dicha secuencia en la que el cebador hibrida (columna 3).

-: La segunda a la ultima fila de cada tabla indican un codigo de secuencia relativo a un gen o una regiOn genOmica a la que se hace referenda en la columna 2, ademas de la posicion especifica de dicha secuencia a la que la sonda se une (columna 4).

5 Tabla 1 :AnaplasmayEhrlichia:secuenciadecadaunode loscebadoresysondasusadosenelmetodoysu posicion relativaenelgen 16SARNs

POSICION5'—

ORGANISM° GEN CEBADOR SONDAS SECUENCIA5'—3

3' SEQ IDNO: 1 9-30 Anaplasmaspp (16S/AE—F) (UO2521 )

1 65

Ehrlichiaspp SEQ IDNO:2 109 —86 (16S/AE—R) (UO2521 ) 52 — 73 Anaplasma SEQ IDNO: 1 (UO2521 ) phagocytophilum (16S/AE—F) SEQ IDNO:3 8—29

16S SEQ IDNO:57

A.bovis SEQ IDNO:2 (S—PHA) (AF470698)

A.equi (16S/AE—R) 8-29 (AF1 721 67)

SEQ IDNO: 1 Ehrlichia (16S/AE—F) SEQ IDNO:4 51—71

165 SEQ IDNO:58

chaffeensis SEQ IDNO:2 (S—CHA) (AF147752) ( 1 6S/AE — R) SEQ IDNO: 1 (165/AE—F) SEQ IDNO:5 46 —66

E.ewingii 16S SEQ IDNO:59

SEQ IDNO:2 (5—EWI) (U96436) ( 1 6S/AE — R) 53 — 71 SEQ IDNO: 1 (AJ633048)

A.marginale SEQ IDNO:NO

(16S/AE—F) 72 —90

A.centrale 16S 6 SEQ IDNO:60

SEQ IDNO:2 (AF414869)

A.ovis (S—MCO)

(165/AE—R) 72 —90 (AF41 4870)

Tabla2:Bartonella:Secuenciadecadaunode loscebadoresysondasusadosenelmetodoysuposici6nrelativa

en el especi o i ntergeni co 1 68 — 238 ARNs

ORGANI SMO: GEN CEBADOR SONDAS SECUENCI A 5' — 3 POSI CI ON 5' — 3'

SEQ I D NO: 7: 494 — 51 5

Bartonella spp.: 1 65 — 23S ( BAR/ 1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 (AF369527) 908 — 889

( BAR/ 1 6 — 23R): (AF369527)

SEQ I D NO: 7

B. henselae: 1 6S — ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 9 SEQ I D NO: 61 793 — 81 4

23S: SEQ I D NO: 8 (S — HENS) (AF369527)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. quintana: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 1 0 (5 — QUI N) SEQ I D NO: 62 622 — 641 (AF368396)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. clarridgeiae: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 1 1 (5 — CLAR) SEQ I D NO: 63 51 2 — 531 (AF31 2497)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. elizabethae: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 1 2 (S — ELI Z) SEQ I D NO: 64 807 — 827 ( L351 03)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. grahamii: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 1 3 (S — GRAH2) SEQ I D NO: 65 491 — 51 4 (AJ269790)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. vinsonii berkhofil: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 1 4 (5 — VI N — B) SEQ I D NO: 66 2242 — 2261 (AF1 43446)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. vinsonii arupensis: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 1 5 (5 — VI N — Al ) SEQ I D NO: 67 686 — 706 (AF442952)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. vinsonii vinsonii: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 1 6 (5 — VI N — A2) SEQ I D NO: 68 821 — 841 (AF31 2504)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. bacilliformis: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 1 7 (5 — BACI ) SEQ I D NO: 69 474 — 493 (AJ4221 81 )

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. alsatica: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 1 8 (5 — ALS) SEQ I D NO: 70 589 — 608 (AF31 2506)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. bovis: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 1 9 (S — BOV2) SEQ I D NO: 71 455 — 478 (AY1 1 6638)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ I D NO: 7

B. doshiae: 1 6S — 23S ( BAR/1 6 — 23F) SEQ I D NO: 8 SEQ I D NO: 20 (S — DOSH) SEQ I D NO: 72 724 — 743 (AJ269786)

( BAR/ 1 6 — 23R)

SEQ IDNO:7 16S— (BAR/16—23F) SEQ IDNO:21 778 —803

B.koehlerae SEQ IDNO:73

23S SEQ IDNO:8 (5—KOE) (AF312490) (BAR/ 1 6 — 23R) SEQ IDNO:7

B. 165— (BAR/16—23F) SEQ IDNO:22 446—466 SEQ IDNO:74

schoenbuchensis 23S SEQ IDNO:8 (S—SCH02) (AY1 16639) (BAR/ 1 6 — 23R) SEQ IDNO:7 16S— (BAR/16—23F) SEQ IDNO:23 655 —673

B. taylori SEQ IDNO:75

23S SEQ IDNO:8 (S—TAY) (AJ269784) (BAR/ 1 6 — 23R) SEQ IDNO:7 16S— (BAR/16—23F) SEQ IDNO:24 692 —713

B. tribocorum SEQ IDNO:76

23S SEQ IDNO:8 (S—TRIB) (AF312505) (BAR/ 1 6 — 23R)

Tabla3:Borrelia:Secuenciadecadaunode loscebadoresysondasusadosenelmetodoysuposici6nrelativa engen 16SARNs ORGANISM° GEN CEBADOR SONDAS SECUENCIA5'—3 POSICION5'—3' SEQ IDNO:25 336 —356 (AJ224139)

(BOF — 3)

Borrelia spp. 1 6S

SEQ IDNO:26

567 —547 (AJ224139) (BOR) SEQ IDNO:25 (BOF—3) SEQ IDNO:27

Borrelia 16S SEQ IDNO:77 364 —383 (AJ224139)

SEQ IDNO:26 (SG—BOR) (BOR)

Tabla4:Coxiella:Secuenciadecadaunode loscebadoresysondasusadosenelmetodoysuposiciOnrelativa en la secuencia de insercian (transposasa) SECUENCIA POSICION ORGANISM° GEN CEBADOR SONDAS

5'—3

SEQ IDNO:28 200 —221 Coxiella Transposasa (TRANS 1 ) (M80806) bumetii IS1 1 1 1 SEQ IDNO:29 885 —865

(TRANS 2) (M80806) SEQ IDNO:28

SEQ IDNO:

Coxiella Transposasa (TRANS 1 ) SEQ IDNO: 520 —539

30

bumetii IS1 1 1 1 SEQ IDNO:29 78 (M80806)

(S— IS1111 )

(TRANS 2)

Tabla5:Francisella:Genamplificado,secuenciadecadaunode loscebadoresysondasusadosenelmetodoysu

posi ci on rel ati va

SECUENCI A: POSI CI ON

ORGANI SMO: GEN CEBADOR SONDAS

5' — 3: 5' — 3'

1 7: SEQ I D NO: 31 593 — 61 7

Francisella spp.: kDa Tul 4 ( FT594) SEQ I D NO: 32 ( M32059) 825 — 804

( FT827): ( M32059)

1 7: SEQ I D NO: 31

F. tularensis: kDa Tul 4 ( FT594) SEQ I D NO: 32 SEQ I D NO: 33 (5 — TUL) SEQ I D NO: 79 658 — 680 ( M32059)

( FT827)

1 7: SEQ I D NO: 31

Vari ante 3523: kDa Tul 4 ( FT594) SEQ I D NO: 32 SEQ I D NO: 34 (5 — TUL3523) SEQ I D NO: 80 1 69 — 1 88 (AY243029)

( FT827)

Endosi mbi ontes: 1 7 kDa Tu1 4 SEQ I D NO: 31 ( FT594) SEQ I D NO: 32 ( FT827) SEQ I D NO: 35 (S — EN — D052) SEQ I D NO: 81 533 — 553 AY375423)(

Tabla6:Rickettsia:Secuenciadecadaunode loscebadoresysondasusadosenelmetodoysu posici6nrelativa en losgenes238,58ARNryenelespacio intergenico23S—5SARNr

SECUENCIA

ORGANI SM°: GEN CEBADOR SONDAS POSI CI ON 5 — 3'

5' — 3

Rickettsia: 23S SEQ I D NO: 36 ( RCK/23 — 5 — F) 1 — 22 (AY1 2501 2)

spp.: — 5S SEQ I D NO: 37 388 — 367

( RCK/23 — 5 — R): (AY1 2501 2)

SEQ I D NO: 36

Generi co: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 38 SEQ I D NO: 51 — 71

— 5S: SEQ I D NO: 37 (SG — RI CK) 82 (AY1 2501 2)

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

Grupo fi ebres: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 39 SEQ I D NO: 1 23 — 1 41

manchadas: — 5S SEQ I D NO: 37 (SG — SFG) 83 (AY1 2501 2)

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

R. akari: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 40 SEQ I D NO: 291 . 1 05 — 291 . 1 26

— SS: SEQ I D NO: 37 (S — AKA4) 84 (AAFE01 000001 )

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

R. bellii: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 41 SEQ I D NO: 2721 — 2743

— SS: SEQ I D NO: 37 (5 — BELLI I ) 85 ( U1 1 01 5)

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

R. slovaca: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 42 SEQ I D NO: 1 94 — 21 1

— 5S: SEQ I D NO: 37 (5 — SLO) 86 (AY1 25009)

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

. . R. conom: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 43 SEQ I D NO: 1 86 — 204

— 5S: SEQ I D NO: 37 (S — CON) 87 (AY1 2501 2)

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

R.: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 44 SEQ I D NO: 1 83 — 204

aeschlimannii: — 5S SEQ I D NO: 37 (5 — AESCH) 88 (AY1 2501 6)

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

R. rickettsii: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 45 SEQ I D NO: 281 4 — 2833

R. sibirica: — SS SEQ I D NO: 37 (5 — RI /SI ) 89 ( 1 ) 1 1 022)

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

R. heivetica: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 46 SEQ I D NO: 360 — 342

— 5S: SEQ I D NO: 37 (S — HELV) 90 (AY1 2501 7)

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

R. fells: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 47 SEQ I D NO: 1 86 — 207

— SS: SEQ I D NO: 37 (5 — FEL) 55 (SEQ I D NO: 55)

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

R. australis: 23S ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 48 SEQ I D NO: 230 — 249

— SS: SEQ I D NO: 37 (5 — AUS) 56

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

Grupo Tifus: 23S — SS ( RCK/23 — 5 — F) SEQ I D NO: 37 SEQ I D NO: 49 (SG — TG) SEQ I D NO: 91 2804 — 2827 ( U1 1 01 8)

( RCK/23 — 5 — R)

SEQ I D NO: 36

-R. prowazeku: 23S -5S ( RCK/23 -5 -F) SEQ I D NO: 37 SEQ I D NO: 50 (S -ROW) SEQ I D NO: 92 2824 -2846 ( U1 1 01 8)

( RCK/23 -5 -R)

SEQ I D NO: 36

R. typhi: 23S ( RCK/23 -5 -F) SEQ I D NO: 51 SEQ I D NO: 1 88 -21 1

(R. mooserii): -5S SEQ I D NO: 37 (5 -TYPHI ) 93 (AY1 2501 9)

( RCK/23 -5 -R)

Dada la gran abundancia de inhibidores de PCR, tales como los acidos humico y fulvico, metales pesados, heparina, etc. que pueden dar lugar a falsos negativos, y aunque existen metodos que reducen la concentracion de este tipo de moleculas, es recomendable (vease, J. Hoorfar y col., 'Making internal Ampllification control mandatory for

5 diagnostic PCR" J. Of Clinical Microbiology, Dec. 2003, pags. 5835) que las pruebas de PCR contengan un Control Inferno de Amplificacion (CIA). Este CIA no es mas que un fragmento de ADN que se amplifica simultaneamente con la muestra diana, de tal modo que su ausencia al final de las pruebas es indicativa de la presencia de factores, que han provocado un indeseado desarrollo de la PCR.

10 El metodo puede describirse en el primer aspecto de dicha invencion, incluyendo al menos un CIA, preferentemente constituido por una secuencia de ADN del gen de la Tetrahidrocannabinol Sintasa de la especie Cannabis sativa y mas preferentemente con la secuencia con numero de acceso AB183705.

Segun una realizaciOn mas preferida, se amplifica una regiOn de la secuencia AB183705, estando dicha secuencia 15 incluida en la SEQ ID NO: 94 o secuencias complementarias (Tabla 7).

Segun otra realizacion preferida, la amplificacion de la regiOn se realiza mediante cebadores especificos cuyas secuencias comprenden o estan incluidas en las SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53 o secuencias complementarias.

20 A lo largo del contexto de esta descripcion, el termino "especifico" implica que los cebadores comprenden una secuencia nucleotidica totalmente complementaria a los genes o fragmentos genicos empleados por la presente invenciOn.

Tabla7:Control interno:Genampl ificado,secuenciadecadaunode loscebadoresysondasusadosenel proceso y su posiciOn relativa. ORGANISMO GEN CEBADOR SONDAS SECUENCIA5'-3' POSICION5'-3'

SEQ ID52 77 -99 (Cl-F) (AB183705) CIA (Cannabissativa) THCSintasa SEQ ID53 447 -427 (CI-R) (AB183705)

SEQ ID 52 (Cl-F) SEQ ID54 281-302

Cannabissativa THCSintasa SEQ ID94

SEQ ID53 (S-C12) (AB183705) (CI-F)

25 La expresion "regiones variables" hace referencia a secuencias de ADN que permiten la identificacion de las especies y grupos bacterianos que se mencionan en este documento.

La amplificacion del CIA puede detectarse mediante hibridacion con sondas. Dichas sondas pueden tener una longitud de 15 a 25 nucleOtidos. Dichas sondas tienen una secuencia comprendida o incluida en la SEQ ID NO: 540 30 secuencias complementarias.

El metodo proporcionado por la presente invencion permite detectar las bacterias y grupos bacterianos que se han mencionado anteriormente, independientemente de la procedencia de las muestras. Dichas muestras pueden haber sido obtenidas a partir de biopsias, raspados, insectos, fluidos biologicos (sangre, orina, saliva, etc.), campo, etc. La

35 muestra una vez tomada es pretratada para realizar un analisis por PCR Multiple y una posterior identificacion de los amplicones.

Como se ha mencionado anteriormente y segun las realizaciones, la invencion proporciona un uso de los cebadores de las SEQ ID NO: 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37, para la amplificaciOn simultanea de ADN procedente de las especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma, Ehrlichia, Bartonella, Borrelia,Coxiella,FrancisellayRickettsia. Preferiblemente, el uso anterior comprende ademas los cebadores de la

5 SEQ ID NO: 52 y la SEQ ID NO: 53 para el control interno de la amplificacion.

La invenciOn tambien proporciona un uso de las sondas de las SEQ ID NO: 3 — 6, 9 — 24, 27, 30, 33 — 35 y 38 — 51, para la deteccion simultanea de especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma,Ehrrichia,Bartonella,Barre[la,Coxiella,Francisella yRickettsia,donde dichas sondas son capaces de

10 hibridar con los fragmentos correspondientes de las SEQ ID NO: 55 — 93. Preferiblemente, el uso anterior comprende ademas la sonda con la SEQ ID NO: 54 capaz de hibridar con el fragmento correspondiente de la SEQ ID NO: 94.

La presente invencion iambi& proporciona un uso de un kit de diagnostico, es decir, un kit para la amplificacion 15 simultanea de ADN procedente de las especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma,Ehrlichia,Bartonella,Borreria,Coxiella,FrancisellayRickettsia,que contiene:

-Cebadores especificos con las secuencias: SEQ ID NO: 1 —2, SEQ ID NO: 7 — 8, SEQ ID NO: 25— 26, SEQ ID NO: 28— 29, SEQ ID NO: 31 —32, SEQ ID NO: 36 — 37 y opcionalmente SEQ ID NO: 52 y 53 como CIA.

20 La presente invencion iambi& proporciona un uso de un kit para la deteccion simultanea de las especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma, Ehrlichia, Bartanella, Borrelia, Coxiella,FrancisellayRickettsia,que contiene:

25 -Sondas con las secuencias: SEQ ID NO: 3— 6, SEQ ID NO: 9— 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 — 35, SEQ ID NO: 38 — 51 y opcionalmente SEQ ID NO: 54 (S — C12) como CIA, donde dichas sondas son capaces de hibridar con los fragmentos correspondientes de ADN de las SEQ ID NO: 55 — 93, y si se usa la SEQ ID NO: 54, capaz de hibridar con el fragmento correspondiente de la SEQ ID NO: 94.

30 Del mismo modo, los kits pueden incluir todos aquellos reactivos necesarios para Ilevar a cabo cualquiera de los metodos descritos. Esto incluye, sin ningun tipo de limitacion, el uso de tampones, polimerasas, cofactores para optimizar su actividad, agentes para prevenir la contaminacion, etc. Por otro lado los kits pueden incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimizacion.

35 Las ventajas del presente metodo y de los kits para aplicarlo son: velocidad (pueden detectarse 39 especies y grupos bacterianos en menos de 8 horas), especificidad (los iniciadores empleados son especificos de cada especie

o grupo de bacterias) y un alto nivel de sensibilidad.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

40 Figura 1: Membrana de hibridacion que muestra la validacion de cebadores, sondas y regiones variables para la deteccion de AnaplasmayEhrlichia (A), Borrelia (B), Francisella (C), Bartonella (D) yCoxiella (E), por medio de sondas especificas (Tablas 1 — 5). La sonda S — C12 se refiere a la sonda de CIA (Tabla 7).

45 Figura 2: A) Membrana de hibridacion que muestra la validacion de cebadores, sondas y regiones variables para la deteccion de Rickettsia; B) Membrana de hibridacion que muestra un ejemplo de detecciOn simultanea de especies pertenecientes a los 7 generos. En este ejemplo: A.phagocytophilum,A.marginate.Echaffeensis,E.ewingi,B.

henselae,B.burgdorferi,F. tularensis tularensis,R.conoriiyR.prowazekii,ensayados a 10 , 10 y 10 equivalentes de genoma/copias. En ambos casos (A y B) se usa la sonda S — C12, que se ref iere a la sonda de CIA (Tabla 7).

50 Figura 3: Membrana de hibridacion que muestra los resultados de un estudio de especificidad realizado en el grupo de sondas indicado (Tablas 1 — 7) en diferentes especies bacterianas, artropodos y marniferos. Los resultados revelan que las sondas son estan unidas a las muestran de los organismos ensayados en ningun caso. La sonda S

— C12 se refiere a la sonda de CIA (Tabla 7).

55 EJEMPLO DE REALIZACION

Alineamientos, diserios de cebadores y sondas

Por comparacion y alineamientos multiples de secuencias obtenidas a partir de bases de datos publicas como Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), se identificaron regiones conservadas, a partir de las cuales se disenaron cebadores especificos (Tablas 1 — 6) para su empleo en PCR multiple. La compatibilidad entre los cebadores, asi como su concentracion Optima, se comproba empiricamente de la misma manera que las sales de magnesio y la

5 albumina bovina serica.

A partir de los alineamientos de las secuencias seleccionadas se identificaron regiones variables, que permitieron el diseno de sondas para la diferenciacion entre las diferentes especies bacterianas y grupos genicos (Tablas 1 — 6), mediante RLB (Transferencia inversa en linea, Reverse Line Blotting) (Kauf hold A, Podbielski A, Baumgarten G,

10 Blokpoel M, Top J, Schouls L. Rapad Typing of group-a streptococci by the use of DNA amplification and nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes. FEMS Microbiology Letters 119: 19 — 25 (1994)).

Se realiz6 un primer analisis de especificidad de cada una de las sondas comparando su secuencia a partir de bases de datos publicas (Genbank) usando programas informaticos, tales como BLAST (http://www.ncbi.hlm.nih.gov/blast/). 15 La especificidad se demostro posteriormente realizando pruebas sobre una diversidad de muestras de ADN de diferentes especies bacterianas y eucariaticas (Figura 3).

Medlos de cultivo y aislamiento de ADN

20 Las especies y grupos genicos seleccionados para su identificaciOn se obtuvieron de colecciones privadas, de la Coleco& Espanola de Cultivos Tipo (CECT) y/o el banco de muestras disponible en el Centro Nacional de Microbiologia (CNM). Todas las especies analizadas se muestran en la Tabla 8.

El aislamiento del material genetico se realiza usando metodos bien conocidos en la tecnica y disponibles en el 25 mercado (DNA Mini Kit, Qiagen, Nr de Referencia: 51304).

Tabla8.Origen delADNusadoen la invencion ORGANISMO ADN NATIVO(or igen) ADN SINTETICO* Anaplasmaphagocytophilum X ( 1 )

A.marginate: X ( 1 ) Ehrlichia chaffeensis X

E.: ewingii X Borreliaburgdorferi X (2)

B.garinii X (2)

B.afzelii: X (2)

B.: lusitaniae X (2)

B.japonica X (2)

B.hermsii X (2)

B.parker': X (2) Francisella tularensis tularensis X (3)

F.: tularensissubespecieholarctica X (3)

F.: tularensissubesp.Novicida X (3) Francisella variante 3523 X FrancisellaEndosimbiontes X Bartonellaalsatica X (4)

B.bacilliformis X (4)

B.bovis: X (4)

B.: clarridgeiae X (4)

B.doshiae: X (4)

B.: elizabethae X (4)

B.grahamii X (4)

B.henselae X (4)

B.koehlerae X (4)

B.quintana: X (4)

B.: schoenbuchensis X (4)

B.: taylorii X (4)

B.: tribocorum X (4)

B.vinsonlisubesp.Arupensis X (4)

B.vinsonlisubesp.Berkhofii X (4)

B.vinsonlisubesp.Vinsonil X (4) Coxiellabumetii X (5) Rickettsiaaeschlimannii X

R.akari X (5)

R.australis X (5)

R.bellii: X (5)

R.: conori X (5)

R.: fells X (5)

R.Helvetica: X (5)

R.: rickettsli X (5)

R.: sibirica X

R.: slovaca X (5)

R.: prowazekii X

R.: typhi X (5)

Brucellamelitensis X (6) Chlamydiapneumoniae X (7)

C.psittaci X (7) Escherichiacon X (6) Legionellapneumophila X (8) Leptospira interrogans X (4) Micoplasmapneumonlae X (7) Ochrobactrumantropi X (4) Orientia tsutsugamushi X (5) Pseudomonasaeruginosa X (4) SalmonellaentericaTyphi X (4)

Streptococcuspneumoniae X (6) Treponemapallidum X (7) lxodesricinus X (9) Dermacentormarginatus X (9) Ripicephalussanguineus X (9) Apodemussylvaticus X (9) ADN humano X (10) Control lnterno X

Origen del ADN natural:

1: Muestra positiva.

2: Medio de cultivo axenico, segun se describe en:

Benach JL, Coleman JL, and Golightly MG. 1988. A murine monoclonal antibody binds an antigenic determinant in outer surface protein A, an immunodominant basic protein of the Lyme disease spirochete. J. Immunol. 140: 265 — 10 72.

3: Medio de cultivo axenico, segun se describe en:

Anda P, Segura del Pozo J, Diaz Garcia JM, Escudero R, Garcia Perla FJ, Lopez Velasco MC, Sellek RE, Jimenez 15 Chillaron MR, Sanchez Serrano LP, Martinez Navarro JF. 2001. Waterborne outbreak of tularemia associated with crayfish fishing. Emerg. Infect. Dis. 7 (Suppl): 575 — 82.

4: Composicion de los medios de cultivo axenicos especificos para cada especie disponible en:

20 http://cip.pasteurir/index.html.en

5: Propagacion en cultivos celulares mediante la tecnica de "shell vial", segun se describe en:

Marrero M, Raoult D. 1989. Centrifugation-shell vial technique for rapid detection of Mediterranean spotted fever rickettsia in blood culture. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40: 197 -9.

5 6: Cultivo de agar "Mueller Hinton" suplementado con el 5 % de sangre de carnero.

7: ADN extraido de portaobjetos para inmunofluorescencia indirecta de origen comercial.

8: Medio de cultivo axenico segun se describe en:

10 Edelstein PH. 1981. Improved semiselective medium for isolation of LegianeIla pneumaphila from contaminated clinical and environmental samples. J. Clin. Microbiol. 14: 298 -303.

9: ADN extraido de ejemplares libres de patogenos. 15

10: ADN extraido de muestras clinicas de pacientes con enfermedades no relacionadas.

ADN sintetico

20 El ADN sintetico se prepar6 segun las secuencias correspondientes que se han enumerado en las tablas 1 a 7 (columna 6), mediante elongacion consecutiva de la ADN por PCR usando cebadores de aproximadamente 70 nucleOtidos, solapados entre Si en, aproximadamente, 20 nucleotidos.

Amplificacion, hibridacion y validacion

25 Esta etapa incluya el analisis experimental de las regiones variables detectadas tempranamente usando PCR para su validacion. El ADN aislado se amplifico por PCP (Saiki y col., (1985) Science 230, 1350; 1354), aplicando la siguiente tabla de ciclos de temperatura y la composiciOn de la mezcla de reacciOn, junto con los cebadores especificos que se han usado previamente para tal proposito.

30 CiclosdeTemperatura

Temperatura ( 'C) Tiempo Ciclos

94 91 94 15" 60 1'40 65 4'

65 7'1

Composicion de la mezcla de reaccion para un volumen final de 50

-H20: En fund& del volumen final de ADN 35

-Buffer Taq Gold LD: 9 tl

-Cl2Mg [3 mM]: 6 pi

40 -dNTPs [200 mM]: 1 p1 x 4

-BSA [0,8 ug/ul]: 4 tl

-14 Cebadores especificos (SEQ ID NO: 1 -2, SEQ ID NO: 7 -8, SEQ ID NO: 25-26, SEQ ID NO: 28 -29, SEQ ID NO: 31 45 32, SEQ ID NO: 36-37, SEQ ID NO: 52-53) [50 pm41.1]: 0,5 tl de cada uno (7 p.1)

-Taq Gold LD: 0,5 tl [2,5 unidades]

-ADN problema: maxim° de 800 ng

Los amplicones se secuenciaron para su validacion, comprobando que la secuencia amplificada coincidiera con las

5 secuencias variables inferidas de estudios bioinformaticos. Posteriormente, los amplicones se hibridaron con las sondas especificas siguiendo el protocolo de RBL descrito por Sjoerd G. T. Rijpkema y col., Journal of Clinical Microbiology, Dec. 1995, pag. 3091 — 3095, aunque aplicando las siguientes modificaciones (Figura 1 y 2A):

-Sustrato: Super Signal West Dura (Pierce, Ref.: 34075) 10

-Sondas: Se usaron a una concentracion de entre 0,2 y 3,2 picomoles / microlitro

-Incubacion: a 55 QC

15 - Lavados: a 52 QC

Los resultados de la hibridaciOn se muestran en las figuras 1 y 2A, en las que se puede observar que cada una de las sondas se une especificamente a los amplicones de cada una de las especies bacterianas detectadas usando el metodo de la invenciOn.

20 Preparacion de muestras y PCR

Una de las ventajas de los sistemas de identificacion basados en analisis por PCR y RBL consiste en que no es necesario partir de cultivos bacterianos puros. De este modo, y una vez realizada la validacion de los cebadores y 25 las sondas con muestras de ADN de las diferentes especies y subespecies enumeradas en las tablas 1 — 6, preparadas siguiendo los metodos enumerados en la labia 8 y analizandolas por duplicado, se realiza un analisis basado en PCR Multiple de una mezcla de control de ADN preparada en condiciones de laboratorio, seguido de la prueba RLB, empleando los cebadores y sondas especificas diseriados, los ciclos de temperatura y la composiciOn de la mezcla de reaccion, indicados anteriormente, cuyos resultados se muestran en la Figura 2B. En dicha figura se

30 puede observar que fue posible realizar la detecciOn simultanea de especies bacterianas presentes en la muestra.

Deteccion de inhibidores de PCR

Para la deteccion de inhibidores de PCR, se crea un control interno de amplificacion (CIA) que se amplifica junto los

35 ADN diana, utilizando cebadores especificos (Tabla 7), que fueron diseriados a partir de regiones conservadas de la secuencia AB183705 (Tabla 7) perteneciente al gen de la THC sintasa de Cannabis sativa. Concretamente el amplicon que actua como CIA se corresponde a una secuencia de 371 pares de bases para la cual lamb& se disert una sonda (Tabla 7) para su deteccion durante el analisis RBL.

40 Especificidad del metodo

La alta especificidad de este metodo se basa en la especificidad de los cebadores y sus sondas, los cuales se ensayaron con otra serie de organismos (Tabla 9), siguiendo el metodo descrito por la presente invencion, comprobandose que en ningun caso se detectaba la formacion de amplicones detectables mediante hibridacion

45 (Figura 3).

Tabla9:Especificidad:especies no relacionadas debacterlas,artropodosymamfferosusadasenel desarrol lodelmetodo

ESPECI E: RESULTADO DEL RLB

1: BruceIla melitensis Negati vo

2: Chlamydia pneumoniae Negati vo

3: C. psittaci Negati vo

4: Escherichia coil Negati vo

5: Legionella pneumophila Negati vo

6: Leptaspira interragans Negati vo

7: Mycoplasma pneumoniae Negati vo

8: Ochrobactrum antropi Negati vo

9: Orientia tsutsugamushi Negati vo

1 0: Pseudamonas aeruginosa Negati vo

1 1: Salmonella enter/ca Typhi Negati vo

1 2: Streptococcus pneumoniae Negati vo

1 3: Treponema pallidum Negati vo

Art rapodos: Negat ivo

1 4: lxodes ricinus Negati vo

1 5: Dermacentor marginatus Negati vo

1 6: Ripicephalus sanguineus Negati vo

Mamfferos: Negat ivo

1 7: Apodemus sylvaticus Negati vo

1 8: Seres humanos Negat ivo

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Instituto de Salud Carlos III 5

<120> Metodo y kit de detecci6n de especies bacterianas mediante analisis de ADN

<130> 1580

10 <160>94

<170> Patentln version 3.1

<210>1 15 <211>22

<212> ADN

<213> Cebador 16S/AE — F

<400> 1 20

cagaacgaac gca ag 22

<210>2 <211>24 25 <212> ADN

<213> Cebador 16S/AE — R

<400> 2

gcattactca cccgtctqce actc 29

30

<210>3 <211>22

<212> ADN 35 <213> Sonda 16S. 5— PHA.

<400> 3

ggmttattct tta ag t g ct 22 40

<210>4

<211>21

<212> ADN

<213> Sonda 16S. S — CHA.

5

<400> 4

attgcttata acctttLggt t

21

10 <210>5

<211>21

<212> ADN

<213> Sonda 16S. 5— EWI.

15 <400>5

gaacaattcc taaatagtct

21

<210>6

20 <211> 19

<212> ADN

<213> Sonda 16S. 5— MCO.

<400> 6

25

cagcttgctg cgtgtatgg

19

<210>7

<211>22

30 <212> ADN

<213> Cebador BAR/16S: — 23 — F

<400> 7

ttgataagcg tgagg cgga gg

22

35

<210>8

<211>20

<212> ADN

40 <213> Cebador BAR/16 —: 23— R

<400> 8

caaagcaggt gctetcrcag

20

45

<210>9

<211>22

<212> ADN

<213> Sonda 16S — 23S. S — HEN.

<400> 9 5

atcggttcaa t a atcgct tt 22

<210> 10

<21 1 >20 10 <212> ADN

<213> Sonda 16S—23S.S—QUIN.

<400> 1 0

cgcttatcca tttggtttaa 20

15

<210> 1 1

<21 1 >20

<21 2> ADN 20 <213> Sonda 16S—23S.S—CLAR.

<400> 1 1

acgatgctaa a gttgctat

20

25

<210> 12

<21: 1 >21

<21: 2> ADN

<213> Sonda 16S—23S.S—ELIZ. 30

<400> 1 2

taagttccct tcaagaggat a

21

35 <210> 13

<21: 1 >24

<21: 2> ADN

<213> Sonda 16S—23S.S—GRAH2.

40 <400> 13

attcaagttg atgaatttgg ttat 24

<210> 14 45 <21 1 >20

<21 2> ADN

<213> Sonda 16S—23S.S—VIN—B

<400>14

tttcggacac tattgataaa 20

5 <210>15 <211>21

<212> ADN

<213> Sonda 16S —235. S —VIN — Al

10 <400>15

acttgttgqa attqctt.aac c 21

15 <210> 16 <211>21

<212> ADN

<213> Sonda 16S — 23S. S — VIN — A2

20 <400>16

atgaaaatat t a agattt g 21

<210>17 25 <211>20

<212> ADN

<213> Sonda 16S — 23S. S — BACI

<400>17 30 cctatgattg atttct 20

<210>18 <211>20 35 <212> ADN

<213> Sonda 165— 23S. S — ALS.

<400>18

gctggtgaaa cttgcttata 20

40

<210>19 <211>24

<212> ADN 45 <213> Sonda 168 — 23S. S — BOV2

<400>19

cgttttgata gtcttttgtg ttgc

24

<21 0> 20 5 <21 1 >20

<21 2> ADN

<213> Sonda 16S-23S.S-DOSH.

<400> 20 10

tttgaacctt ctrtctt at 20

<21 0> 21

<21 1 >27 15 <212> ADN

<213> Sonda 16S-23S.S-KOE

<400> 21

ttaaatta a tca:ctttggg tc.atacg 27

20

<21: 0> 22

<21: 1 >21

<21 2> ADN 25 <213> Sonda 16S-23S.S-SCH02.

<400> 22

gctgataagt tt.gctgataa g 21

30

<21: 0> 23

<21: 1 > 19

<21: 2> ADN

<213> Sonda 16S-23S.S-TAY. 35

<400> 23

tatccatttc tLaggca

19

40 <210>24

<21: 1 >22

<21: 2> ADN

<213> Sonda 16S-23S.S-TRIB.

45 <400>24

ttctattaag tttgtcaaag gg 22

<210>25 <211>21 5 <212> ADN

<213> Cebador 16S/B0 -F -3

<400> 25

taagaatctt ccgC atggg c 21

10

<210>26 <211>21

<212> ADN 15 <213> Cebador 16S/B0 -R

<400> 26

atc g c ac tcacccttta c 21

20 <210>27 <211>20

<212> ADN

<213> Sonda 16S. SG -BOR3 25

<400> 27

tgacggagcg acactg 20

30 <210> 28 <211>22

<212> ADN

<213> Cebador transposa 181111 directo. TRANS 1

35 <400> 28

tatgtat ca ccctaqccaq tc 22

<210>29 40 <211>21

<212> ADN

<213> Cebador transposasa IS1111 indirecto. TRANS 2

<400> 29 45

21

cccaacaaca rctccttatt c 21

<210>30 <211>20 5 <212> ADN

<213> Sonda Transposasa 151111. S —151111

<400> 30

gcaagaatac ggactcacga 20

10 <210>31 <211>23

<212> ADN

<213> Cebador 17 KDa — Tu14 directo. FT594. 15

<400> 31

gyaggtttag cka c gttc tac 23

20 <210> 32 <211>23

<212> ADN

<213> Cebador 17 KDa — Tu14 indirecto. FT827.

25 <400> 32

ggagcytgcc attgtaatct tac 23

<210>33 30 <211>23

<212> ADN

<213> Sonda 17 kDa — Tu14. S — TUL

<400> 33 35

agatactgct gctgctcaga cq 23

<210>34 <211>20 40 <212> ADN

<213> Sonda 17 kDa — Tu14. S — TUL3523.

<400> 34

gcatcagata ..gq.qca 20

45

<210>35 <211>21

<212> ADN 5 <213> Sonda 17 kDa — Tu14. S — ENDOS2.

<400> 35

cagctacacc aacrgc gta g 21

10 <210>36 <211>22

<212> ADN

<213> Cebador 23S — 5S. RIK/23 —5— F 15

<400> 36

gataggtcrg gtggaagc ac 22

20 <210> 37 <211>22

<212> ADN

<213> Cebador 23S — 5S. RIK123 —5— R

25 <400> 37

tcgggayggg atcgtgtg t tc 22

<210>38 30 <211>21

<212> ADN

<213> Sonda 23S — 5S. SG — RICK.

<400> 38 35

tagctcgatt grtttacttt g 21

<210>39 <211>19 40 <212> ADN

<213> Sonda 238 — 5S. SG — SFG

<400> 39

actcacaarg ttatcaggt 19

45

<210>40 <211>22

<212> ADN

<213> Sonda 23S — 5S. S — AKA4. 5

<400> 40

gatcatgcag caatacatta gc 22

10 <210> 41 <211>23

<212> ADN

<213> Sonda 23S — 5S. S — BELLI!

15 <400> 41

gtgtttattc tataatatgt cag 23

<210>42 20 <211> 18

<212> ADN

<213> Sonda 23S — 5S. S — SLO

<400> 42 25

gtagc cctg cca• 18

<210>43 <211>19 30 <212> ADN

<213> Sonda 238 — 5S. S — CON

<400> 43

gttatatact gtagccctg 19

35

<210>44 <211>22

<212> ADN 40 <213> Sonda 23S — 5S. S — AESCH.

<400> 44

atattatact çtatgtagcc cc

22

45 <210>45 <211>20

<212> ADN

<213> Sonda 23S — 5S. S — RI/SI.

<400> 45

gttatactgt agtcctgcaa 20 5

<21: 0> 46

<21: 1 > 19

<21 2> ADN 10 <213> Sonda23S—5S.S—HELV.

<400> 46

catggcttga c acggta 19

15

<21: 0> 47

<21: 1 >22

<21: 2> ADN

<213> Sonda23S—5S.S—EEL. 20

<400> 47

taatgttata r. :c :1 gLcrC gc 22

25 <210>48

<21: 1 >20

<21: 2> ADN

<213> Sonda23S—5S.S—AUS.

30 <400>48

gacaagttta gttat c at

20

<21 0> 49 35 <21 1 >24

<21 2> ADN

<213> Sonda23S—5S.SG—TG.

<400> 49 40

gttattctat c tt , tatgt yacg 24

<21 0> 50

<21 1 >23 45 <212> ADN

<213> Sonda23S—5S.S—PROW.

<400> 50

25

tacgatttga tagtaaagtt ttg 23

<210>51 5 <211>24

<212> ADN

<213> Sonda 23S — 5S. S — TYPHI.

<400> 51 10

atgtcacgat ttgac gtaa gatc 24

<210>52 <211>23 15 <212> ADN

<213> Cebador THC sintasa. CI — F

<400> 52

atgatgctga "tee tac 23

20

<210>53 <211>21

<212> ADN 25 <213> Cebador THC sintasa. CI — R

<400> 53

gt ttctcct ccaccaccac g

21

30 <210>54 <211>22

<212> ADN

<213> Sonda THC sintasa. S — C12. 35

<400> 54

gtggaca tt tagtggagga gg 22

40 <210> 55 <211>377

<212> ADN

<213> R. fells

45 <220>

<221> lugar_union_Sonda

<222> (186) .. (207)

<223>

<400> 55

gataggtcgq gtgtggaagc ac tagctcgatt 60

gatttacttt gctgtgaga:_ aatgtagtat 120

caactcacaa agtLatcagg 1 taaat4— ttgttgcaca 180

gctaataatg ttataccgtg gtc atatttagat 240

tcttgcttcc gcaggaatga 300: tart Co

aCaaatCtat c.tttttaaaa g tgagtgaaac 360

acacgatccc atcccga 377

5 10 15: <210>56 <211>343 <212> ADN <213> R. australis <220> <221> lugar union Sonda <222> (230) .. (249) <223> <400> 56

tatggtgtta 60

t.

ctttatcaat 120

gaataaagat gttgttgcac ag•t, cagtatctag 180

ca.gtatctag aaaaatttat aata.:A' acaagtttag 240

ttatgcaata acattaacag aaet tAr: agtttgtatt 300

gctagcttgg tggttatagc a 343

<210>57 <211>22 5 <212> ADN

<213> Anaplasma phagocytophilum, A. bovis y E. equi

<400> 57

agcaagctat aaagaataak cc 22

10

<210>58

<211>21

<212> ADN 15 <213> Ehrlichia chaffeensis

<400> 58

aaccaaaagg ttataagcaa t

21

20 <210>59 <211>21

<212> ADN

<213> Erlichia ewingii 25

<400> 59

gagactattt aggaattgtt 21

<210>60 <211>19

<212> ADN

<213> Anaplasma marginale, A. centrale y A. ovis

<400> 60

10 <210> 61 <211>22

<212> ADN

<213> Bartolella henselae

15 <400> 61

<210>62 20 <211>20

<212> ADN

<213> Bartonella guintana

<400> 62

<210>63 <211>20

30 <212> ADN

<213> B. clarridgeiae

<400> 63

35

<210>64 <211>21

<212> ADN 40 <213> B. elizabethae

<400> 64

45 <210>65

ccatacacgc açcaaqctq 19

aaagc atat gattgaaccg at 22

ttaaaccaaa aa 20

atagcaactt tta 20

tatcctcttg aagg a ct a 21

<211>24

<212> ADN

<213> B. grahamii

5 <400> 65

<210>66 10 <211>20

<212> ADN

<213> B. vinsonii berkhofii

<400> 66 15

<210>67 <211>21 20 <212> ADN

<213> B. vinsonii arupensis

<400> 67

25

<210>68 <211>21

<212> ADN 30 <213> B. vinsonii vinsonii

<400> 68

35 <210>69 <211>20

<212> ADN

<213> B. bacilliformis 40

<400> 69

45 <210> 70 <211>20

<212> ADN

<213> B. alsatica

ataact,:aaat tcatcaactt. gnat 24

tttatcaata g g cegaaa

20

aagcaa ttccaacaag

g 2J.

caaatctctc aatattttca t 2].

gcctagaaat caatcatagg 20

<400> 70

tataagcaag tttcaccagc 20

5 <210> 71 <211>24

<212> ADN

<213> B. bovis

10 <400> 71

gcaacacaaa agactatcaa aacg 24

<210>72 15 <211>20

<212> ADN

<213> B. doshiae

<400> 72 20

ataaagagag aaggttcaaa 20

<210>73 <211>27 25 <212> ADN

<213> B. koehlerae

<400> 73

-gtatgaccc aagtgatat ti 27 30

<210>74 <211>21

<212> ADN 35 <213> B. schoenbuchensis

<400> 74

cttatcagca elactt.at.c 21

40 <210>75 <211>19

<212> ADN

<213> B. taylori 45

<400> 75

tgcctaag aaatqgata

19

5 <210> 76 <211>22

<212> ADN

<213> B. tribocorum

10 <400> 76

ccctttgaca aactt a ag aa 22

<210>77 15 <211>20

<212> ADN

<213> Borrelia burgdorferi sensu lata

<400> 77 20

cacgcagtgt :cgCtccgtc.a 20

<210>78 <211>20

25 <212> ADN

<213> Coxiella burnetii

<400> 78

tcgtgagtcc gt:attct..

20

30

<210>79 <211>23

<212> ADN 35 <213> Fracisiella tularensis

<400> 79

ctgtctgagc agcaqcagta tct 23

40 <210>80 <211>20

<212> ADN

<213> Fraciliella turalensis variante 3523 45

<400> 80

<210>81 <211>21 5 <212> ADN

<213> Francisiella endosimbionte

<400> 81

<210>82

<211>21

<212> ADN

gcggtgccct tatctgat c 20

ctacggcygt tggtqtagct g 21

15 <213> Rickettsia conorii variante 1450

<400> 82

20

<210>83

<211>19

<212> ADN

<213> Rickettsia conorii cepa 1450 25

<400> 83

30 <210> 84 <211>22

<212> ADN

<213> Rickettsia akari

35 <400> 84

<210>85 40 <211>23

<212> ADN

<213> Rickettsia bellii

<400> 85 45

caaagtaaay c.aatcgagct a 21

acctgataaC yt tgagt 19

gctaatgtat tgctg a ga tc 22

ctgacatatt atagaataaa cac 23

5: <21 0> 86 <21 1 > 1 8 <21 2> ADN <21 3> Ri ckettsi a sl ovaca

<400> 86

tatcgtggca 1 8: ggggc tac

1 0 1 5: <21 0> 87 <21 1 > 1 9 <21 2> ADN <21 3> Ri ckettsi a conori i <400> 87

cagggctaca 1 9: gtata aac

20: <21 0> 88 <21 1 > 22 <21 2> ADN <21 3> R. aeschl i manni i

25: <400> 88

gg 22: c a at acagta aat at

30: <21 0> 89 <21 1 > 20 <21 2> ADN <21 3> Ri ckettsi a ri ckettsi i

35: <400> 89 2 q: ga. c aqtataaC

40: <21 0> 90 <21 1 > 1 9 <21 2> ADN <21 3> Ri ckettsi a hel vet i ca

<400> 90

45: taccgtggat 1 9 ca gccatg

<21 0> 91

34

<211>24

<212> ADN

<213> Rickettsia prowazekii

5 <400> 91

<210>92 10 <211>23

<212> ADN

<213> Rickettsia prowazekii

<400> 92 15

<210>93 <211>24 20 <212> ADN

<213> Rickettsia typhi

<400> 93

25

<210>94 <211>22

<212> ADN 30 <213> Cannabis saliva

<400> 94

35

cgtracataa aacgata-aa t ac 24

caaaacttta ctatcaatc 23

gatcttacgg t acat 24

cctcctccac ta ,u cc ac 22

Claims

REIVINDICACIONES

1. Metodode analisis para la deteccion simultanea de especies bacterianas, que pertenecen a los

generos Anaplasma,Ehrrichia,BegoneIla,Barrelia,Coxiella,FrancisellayRickettsia,que comprende: 5

a. Poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reaccion, que contiene cebadores especificos de SEQ ID NO: 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37, para realizar PCR

b. Amplificar mediante reaccion en cadena de la polimerasa. 10

c. Identificar la formacion de productos del paso anterior, siendo dicha formacion indicativa de la presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis.
2. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que las especies bacterianas detectadas son: 15

a.

Anaplasmaphagocytophilum,A.bovis,A.equi,A.marginale,A.centrateyA.ovis.

b.

EhrlichiachaffeensisyE.Ewingii.

20 c. Barton&lahenselae,B.quintana,B. clarridgeiae,B. elizabethae,B.grahamii,B. vinsonii subespecieberkhafii,B. vinsonii subespecievinsonii,B. vnisoniisubespecieaurupensis,B.bacilliformis,B. alsatica,B.bovis,B.dash/ac,B. koehlerae,B.schaenbuchensis,B. taylariyB. tribocarum.

d. Todas las especies del genero Barrelia. 25

e.

Coxiellaburnetii.

f.

Cualquier subespecie de Francisellatularensis,incluyendo F. tularensissubesp. tularensis,F. tularensissubesp.

holarctica yF. tularensissubesp. novicida,que se detectan conjuntamente, y la variante 3523 de la misma especie y 30 los denominados endosimbiontes de diferentes especies de ixOdidos y argasidos, que se detectan diferencialmente.

g. El genero Rickettsia, el grupo de las mismas causantes de las fiebres manchadas y el grupo causante del tif us, las especies Rickettsiaakari,R.belifi,R.slovaca,R.conarii,R.aeschfimannii,R. ricketsii,R.sibirica,R.helvetica,R. fe s,R.australis,R.prowazekii,yR. typhy(R.mooserh).

35
3. Elmetodo, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detecciOn simultanea de los productos de amplificacion se realiza usando sondas que comprenden las secuencias SEQ ID NO: 3 — 6, 9 — 24, 27, 30, 33 — 35 y 38 — 51.

40 4. Metodo, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos un control interno de amplificacion.
5. Metodo, segun la reivindicacion 4, en el que el control interno de amplificacion consiste en:

45 a. La amplificaciOn de la SEQ ID NO: 94 con cebadores especificos.

b. La detecciOn de la formaciOn del producto de amplificacion resultante de la etapa anterior.
6. Metodo, segun la reivindicacion 5, en el que los cebadores especificos tienen las secuencias SEQ ID 50 NO: 52 y SEQ ID NO: 53.
7. Metodo, segun cualquiera de las reivindicaciones 4 — 6, en el que la deteccion del producto de amplificacion se realiza usando la sonda con la SEQ ID NO: 54.

55 8. Usoin vitro de los cebadores de las SEQ ID NO: 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37, para la amplificacion simultanea de ADN de especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma,Ehrlichia,BegoneIta,Barrel/a, Coxiella,Francisella yRickettsia.
9.

Eluso de los cebadores, segun la reivindicacian 8, que comprende adicionalmente los cebadores de la SEQ ID NO: 52 y la SEQ ID NO: 53 para el control interno de amplificaciOn.
10.

Uso invitrode las sondas de las SEQ ID NO: 3 — 6, 9 — 24, 27, 30, 33 — 35 y 38 — 51, para la

5 detecci6n simultanea de las especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma, Ehrlichia,Bartonella,Barrelia,Coxiella,FrancisellayRickettsia,en el que dichas sondas son capaces de hibridar con los fragmentos correspondientes de las SEQ ID NO: 55— 93.
11. Usode las sondas, segun la reivindicacion 10, que comprende adicionalmente la sonda con la SEQ ID 10 NO: 54 capaz de hibridar con el fragmento correspondiente de la SEQ ID NO: 94.
12.

Usoin vitro de un kit, en el que dicho kit comprende los cebadores de las SEQ ID NO: 1, 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 36 y 37, para la amplificacion simultanea de ADN de las especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma,Ehrlichia,Bartonella,Borrelia,Coxiella,FrancisellayRickettsia.
13.

El uso de un kit, segun la reivindicacion 12, que comprende adicionalmente los cebadores de las SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53 para el control interno de amplificaci6n.
14.

Usoin vitro de un kit, en el que dicho kit comprende las sondas de las SEQ ID NO: 3— 6, 9 —24, 27,

20 30, 33 — 35 y 38 — 51, para la detecciOn simultanea de las especies bacterianas causantes de zoonosis, que pertenecen a los generos Anaplasma, Ehrlichia, Bartonella, Borrelia, Coxiella, Francisella y Rickettsia, en el que dichas sondas son capaces de hibridar con los fragmentos correspondientes de ADN de las SEQ ID NO: 55 — 93.
15. Usodel kit, segun la reivindicacian 14, que comprende adicionalmente la sonda con la SEQ ID NO: 54 25 capaz de hibridar con el fragmento correspondiente de la SEQ ID NO: 94.