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ES2507544T3 - Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN - Google Patents

Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN Download PDF

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ES2507544T3
ES2507544T3 ES10183577.5T ES10183577T ES2507544T3 ES 2507544 T3 ES2507544 T3 ES 2507544T3 ES 10183577 T ES10183577 T ES 10183577T ES 2507544 T3 ES2507544 T3 ES 2507544T3
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mmu
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ES10183577.5T
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Lance Ford
Angie Cheng
Rich Jarvis
Mike Byrom
Dmitriy Ovcharenko
Eric Devroe
Kevin Kelnar
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Asuragen Inc
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico miARN sintético que comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia del miR-34a maduro humano para su uso en la terapia de un cáncer.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular. Más particularmente, concierne a procedimientos y composiciones que implican moléculas de ácidos nucleicos que estimulan microARN (miARN) y 5 que inhiben miARN. Se describen los procedimientos y composiciones que implican moléculas sintéticas de miARN y moléculas inhibidoras de miARN. Además, también se describen procedimientos y composiciones para identificar miARN que contribuyen a los procesos celulares. Además, la identificación de miARN que contribuyen a los procesos celulares proporciona dianas para la intervención terapéutica así como el análisis diagnóstico y/o pronóstico. 10
Descripción de la técnica relacionada
En 2001, varios grupos utilizaron un nuevo procedimiento de clonación para aislar e identificar un gran grupo de “microARN” (miARN) de C. elegans, Drosophila, y seres humanos (Lagos-Quintana y col., 2001; Lau y col., 2001; Lee y Ambros, 2001). Se han identificado cientos de miARN en plantas y animales –incluyendo seres humanos- en los que no parece haber ARNsi endógenos. Por lo tanto, aunque son similares a los ARNsi, no obstante los miARN 15 son distintos.
Los miARN observados tienen una longitud de aproximadamente 21-22 nucleótidos y provienen de precursores más largos, que ese transcriben a partir de genes que no codifican proteínas. Véase la revisión de Carrington y col. (2003). Las formas precursoras forman estructuras que se pliegan unas sobre otras; son procesadas por la nucleasa Dicer en los animales o DCL1 en las plantas. Las moléculas de miARN interrumpen la traducción por medio del 20 emparejamiento de bases preciso o impreciso con sus dianas.
Unos miARN parece que están implicados en la regulación genética. Algunos miARN, que incluyen lin-4 y let-7 inhiben la síntesis proteica uniéndose a regiones 3’ sin traducir (3’ UTR) complementarias de los ARNm diana. Otros, incluyendo el miARN Scarecrow que se encuentra en plantas, funcionan como el ARNsi y se unen a secuencias de ARNm perfectamente complementarias para destruir la transcripción diana (Grishok y col., 2001). 25
La investigación en microARN se incrementa según los científicos están empezando a apreciar el amplio papel que estas moléculas tienen en la regulación de la expresión genética en eucariotas. Los dos miARN mejor conocidos, lin-4 y let-7, regulan el tiempo de desarrollo en C. elegans regulando la traducción de una familia de miARN clave (revisado en Pasquinelli, 2002). Se han identificado varios cientos de miARN en C. elegans, Drosophila, ratón y seres humanos. Como sería de esperar en moléculas que regulan la expresión genética, los niveles de miARN 30 muestran una variación entre tejidos y estadios de desarrollo. Además, un estudio muestra una fuerte correlación entre la expresión reducida de dos miARN y la leucemia linfocítica crónica, proporcionando un posible enlace entre los miARN y el cáncer (Calin, 2002). Aunque el campo aún es joven, hay una especulación sobre que los miARN podrían ser factores de transcripción importantes en la regulación de la expresión genética en eucariotas superiores.
Hay unos pocos ejemplos de que los miARN tienen papeles críticos en la diferenciación celular, el desarrollo 35 temprano, y los procesos celulares tales como apoptosis y metabolismo de las grasas. Tanto lin-4 como let-7 regulan el paso de un estado larvario a otro durante el desarrollo de C. elegans (Ambros, 2003). El mir-15 y bantam son los miARN de Drosophila que regulan la muerte celular, aparentemente regulando la expresión de los genes implicados en la apoptosis (Brennecke y col., 2003, Xu y col., 2003). El miR14 también se ha implicado en el metabolismo graso (Xu y col., 2003). El Lsy-6 y miR-273 son miARN de C. elegans que regulan la asimetría en las neuronas 40 quimiosensoriales (Chang y col., 2004). Otro miARN animal que regula la diferenciación celular es el miR-181, que dirige la diferenciación de células hematopoyéticas (Chen y col., 2004). Estas moléculas representan el intervalo total de miARN animales con funciones conocidas. Además, Kim y col., PNAS (2004) 101:360-365 desvela el miARN miR-34. La mejora del entendimiento de las funciones de los miARN sin duda revelará sistemas reguladores que contribuyen al desarrollo normal, diferenciación, comunicaciones inter e intra celulares, ciclo celular, angiogénesis, 45 apoptosis, y muchos otros procesos celulares. Debido a sus importantes papeles en muchas funciones biológicas, es probable que los miARN ofrezcan puntos importantes para la intervención terapéutica o el análisis diagnóstico.
Caracterizar las funciones de biomoléculas como los miARN a menudo implica la introducción de las moléculas en las células o retirar las moléculas de las células y medir el resultado. Si se introduce un miARN en una célula y se produce apoptosis, entonces el miARN indudablemente participa en una ruta apoptótica. Los procedimientos para 50 introducir y retirar miARN de las células se han descrito. Dos publicaciones recientes describen moléculas antisentido que se pueden utilizar para inhibir la actividad de miARN específicos (Meister y col., 2004; Hutvagner y col., 2004). Otra publicación describe el uso de plásmidos que se transcriben por ARN polimerasas y que producen miARN específicos cuando son transfectados en las células (Zeng y col., 2002). Estos dos grupos de reactivos se han utilizado para evaluar miARN sencillos. 55
Una limitación del sistema de expresión de miARN basado en plásmidos es que la eficacia de transfección de los plásmidos tiende a ser muy baja, con solo aproximadamente un 50% de células que expresan el ARN del plásmido
en las células que son fáciles de transfectar. La eficacia de transfección para los plásmidos en células primarias son mucho más bajas con poco más del 10% de las células típicamente que expresan el ARN deseado. Por lo tanto, existe una necesidad para composiciones alternativas y procedimientos para introducir moléculas de miARN en células de forma que se puedan caracterizar y estudiar.
Sumario de la invención 5
La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico miARN sintético que comprende una secuencia con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia del miR-34 a humano maduro para su uso en una terapia de un cáncer. También se proporciona un ácido nucleico miARN sintético de doble cadena de 17-30 nucleótidos de longitud que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de miR-34 a maduro que comprende los nucleótidos 22-43 de las SEC ID 10 Nº 58, y un segundo polinucleótido separado cuya secuencia de 5’ a 3’ es complementaria entre un 60% y el 100% para su uso como un medicamento.
También se proporciona el uso de un ácido nucleico miARN sintético como se ha mencionado anteriormente para reducir o aumentar la viabilidad celular o la proliferación celular o para inducir o inhibir la apoptosis, con la condición de que se excluyan los procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de terapia. La 15 siguiente descripción detallada se refiere a la presente invención en la medida del alcance de las reivindicaciones.
El término “miARN” se utiliza de acuerdo con su significado habitual y simple y se refiere a una molécula de microARN que se encuentra en las eucariotas que está implicada en la regulación genética basada en ARN. Véase, por ejemplo Carrington y col., 2003, que se incorpora en el presente documento por referencia. Generalmente, el término se utilizará para referirse a la molécula de ARN de cadena sencilla procesada a partir de un precursor. Se 20 han identificado miARN individuales y se han secuenciado en distintos organismos, y se les ha dado nombres. Los nombres de los miARN y sus secuencias se proporcionan en el presente documento.
La presente invención se refiere, en algunas realizaciones de la invención, a moléculas cortas de ácido nucleico que funcionan como miARN o como inhibidores de miARN en una célula. El término “corto” se refiere a una longitud de un nucleótido simple que tenga 150 nucleótidos o poco más. Las moléculas de ácido nucleico son sintéticas. El 25 término “sintético” significa que la molécula de ácido nucleico es aislada y no es idéntica a la secuencia (la secuencia entera) y/o estructura química de una molécula de ácido nucleico de origen natural, tal como una molécula precursora de miARN endógeno. Aunque en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención no tienen una secuencia entera que es idéntica a una secuencia de un ácido nucleico de origen natural, tales moléculas pueden englobar todo o una parte de la secuencia de origen natural. Se contempla, sin embargo, que un ácido 30 nucleico que se administra a una célula puede modificarse o alterarse posteriormente en la célula tal que su estructura o secuencia es la misma que el ácido nucleico no sintético o de origen natural, tal como una secuencia de miARN maduro. Por ejemplo, un ácido nucleico sintético puede tener una secuencia que se diferencia de la secuencia de un precursor de miARN, pero que se puede modificar la secuencia una vez en una célula para que sea la misma que un miARN procesado, endógeno. El término “aislado” significa que las moléculas de ácido nucleico de 35 la invención se separan inicialmente de moléculas de ácido nucleico distintas (en términos de secuencia o estructura) y no deseadas tal que una población de ácidos nucleicos aislados es al menos homogénea en aproximadamente un 90%, y puede ser al menos aproximadamente homogénea en un 95, 96, 97, 98, 99 o el 100% con respecto a otras moléculas de polinucleótido. En muchas realizaciones de la invención, un ácido nucleico se aísla gracias a que se sintetiza in vitro separado de los ácidos nucleicos endógenos de la célula. Se entenderá, sin 40 embargo, que los ácidos nucleicos aislados pueden mezclarse o agruparse juntos posteriormente.
Por supuesto, se entiende que un “ácido nucleico sintético” de la invención quiere decir que el ácido nucleico no tiene la estructura química o la secuencia de un ácido nucleico de origen natural. En consecuencia, se entenderá que la expresión “miARN sintético” se refiere a un “ácido nucleico sintético” que funciona en una célula o bajo condiciones fisiológicas como un miARN de origen natural. 45
Se entenderá que la expresión “de origen natural” se refiere a algo que se encuentra en un organismo sin ninguna intervención de una persona; podría referirse a una molécula de origen natural de tipo silvestre o mutante. En algunas realizaciones, una molécula de miARN sintético no tiene la misma secuencia que la molécula del miARN de origen natural. En otras realizaciones, una molécula de miARN sintético puede tener la misma secuencia que una molécula de miARN de origen natural, pero la estructura química de la molécula, particularmente la parte que no se 50 relaciona específicamente con la secuencia que se precisa (estructura química de la no secuencia) es diferente de la estructura química de la molécula de miARN de origen natural con esa secuencia. En algunos casos, el miARN sintético tiene una estructura química de secuencia y de la no secuencia que no se encuentra en un miARN de origen natural. Además, la secuencia de las moléculas sintéticas identificará cuál miARN se ha proporcionado o inhibido eficazmente; el miARN endógeno se designará como “miARN correspondiente”. Las secuencias del miARN 55 correspondiente incluyen, pero sin limitarse a estas, las secuencias de las SEC ID Nos 1-593. Además, los ácidos nucleicos sintéticos pueden incluir las SEC ID Nos 594-703 así como cualquier otra secuencia de miARN, secuencia de miARN precursor, o cualquier secuencia complementaria de los mismos. En algunas realizaciones, la secuencia es o se deriva de una secuencia de sonda identificada en el apéndice que se dirige contra el miARN particular (o grupo de miARN) que se puede utilizar con esa secuencia de sonda. 60
El miARN sintético de la invención es un ARN o análogo de ARN en algunas realizaciones de la invención. Los inhibidores del miARN pueden ser ADN, ARN, o análogos de los mismos. A los miARN e inhibidores de miARN se les designa colectivamente como “ácidos nucleicos sintéticos”.
En algunas realizaciones, hay un miARN sintético que tiene una longitud de entre 17 y 125 restos. La presente invención afecta a moléculas de miARN sintéticas que son, son al menos, o son como mucho de 15, 16, 17, 18, 19, 5 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 o 125 restos de longitud, o cualquier intervalo que se derive de éste. 10
En ciertas realizaciones, el miARN sintético tiene a) una “región de miARN” cuya secuencia de 5’ a 3’ es idéntica a una secuencia de un miARN maduro, y b) una “región complementaria” cuya secuencia de 5’ a 3’ es entre un 60% y el 100% complementaria a la secuencia del miARN. En ciertas realizaciones, este miARN sintético también está aislado, como se ha definido anteriormente. La expresión “región de miARN” se refiere a una región del miARN sintético que es idéntica al menos en un 80% a la secuencia entera de una secuencia de miARN maduro de origen 15 natural. En ciertas realizaciones, la región de miARN es o al menos es idéntica en un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 o el 100% a la secuencia de miARN de origen natural.
La expresión “región complementaria” se refiere a una región de un miARN sintético que es al menos complementaria en un 60% de la secuencia de miARN maduro de origen natural de la que es idéntica la región activa del miARN. La región complementaria es al menos complementaria en un 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 20 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 o el 100%, o cualquier intervalo derivado de éste. En las secuencias de polinucleótido sencillas, hay una estructura de bucle en horquilla como resultado del enlace químico entre la región miARN y la región complementaria. En otras realizaciones, la región complementaria está en una molécula de ácido nucleico diferente que la de la región miARN, en cuyo caso la región complementaria está en la 25 cadena complementaria y la región miARN está en la cadena activa.
En algunas realizaciones de la invención, un miARN sintético contiene uno o más elementos de diseño. Estos elementos de diseño incluyen, pero no se limitan a estos: i) un grupo de sustitución para el fosfato o hidroxilo del nucleótido en el extremo 5’ de la región complementaria; ii) una o más modificaciones de azúcares en los primeros o los últimos 1 a 6 restos de la región complementaria; o, iii) sin complementariedad entre uno o más nucleótidos en 30 los últimos 1 a 5 restos en el extremo 3’ de la región complementaria y los nucleótidos correspondientes de la región miARN.
En ciertas realizaciones, un miARN tiene un nucleótido en su extremo 5’ de la región complementaria en el que el grupo fosfato y/o hidroxilo se ha sustituido con otro grupo químico (a lo que se denomina como “diseño de sustitución”). En algunos casos, el grupo fosfato se sustituye, mientras que en otros, se sustituye el grupo hidroxilo. 35 En realizaciones particulares, el grupo sustituyente es biotina, un grupo amino, un grupo alquilamino inferior, un grupo acetilo, 2’ O-Me (2’ oxígeno-metilo), DMTO (4,4’-dimetoxitritil con oxígeno), fluoresceína, un tiol, o acridina, aunque son bien conocidos otros grupos sustituyentes por los expertos en la técnica que se pueden utilizar también. Estos elementos de diseño también se pueden utilizar con un inhibidor de miARN.
Realizaciones adicionales se refieren a un miARN sintético que tiene una o más modificaciones del azúcar en los 40 primeros o los últimos 1 a 6 restos de la región complementaria (a las que se denominan “diseños de sustitución de azúcar”). En ciertos casos, hay una o más modificaciones de azúcar en los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más restos de la región complementaria, o cualquier intervalo que se derive de éste. En casos adicionales hay una o más modificaciones de azúcar en los últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más restos de la región complementaria, o cualquier intervalo que se derive de éste, tienen una modificación del azúcar. Se entenderá que los términos “primeros” y 45 “últimos” son con respecto al orden de restos desde el extremo 5’ al extremo 3’ de la región. En realizaciones particulares, la modificación del azúcar es una modificación 2’O-Me. En más realizaciones, hay una o más modificaciones de azúcar en los primeros o últimos 2 a 4 restos de la región complementaria o los primeros o últimos 4 a 6 restos de la región complementaria. El elemento de diseño también se puede utilizar con un inhibidor de miARN. Por tanto, un inhibidor de miARN puede tener este elemento de diseño y/o grupo de sustitución en el 50 nucleótido del extremo 5’, como se ha tratado anteriormente.
En otras realizaciones de la invención, hay un miARN sintético en el que uno o más nucleótidos de los últimos 1 a 5 restos en el extremo 3’ de la región complementaria no son complementarios con los nucleótidos correspondientes de la región miARN (“sin complementariedad”) (a los que se denomina “diseño sin complementariedad”). La no complementariedad puede ser en los últimos 1, 2, 3, 4, y/o 5 restos del miARN complementario. En ciertas 55 realizaciones, no hay complementariedad con al menos 2 nucleótidos en la región complementaria.
Se contempla que el miARN sintético de la invención tiene uno o más diseños de sustitución, modificación de azúcar o sin complementariedad. En ciertos casos, las moléculas de ARN sintético tienen dos de ellos, mientras que en otros estas moléculas tienen a su vez los tres diseños.
La región miARN y la región complementaria pueden estar en el mismo polinucleótido o en polinucleótidos separados. En los casos en los que están contenidos en el mismo polinucleótido, la molécula de miARN se considerará un polinucleótido sencillo. En realizaciones en los que las diferentes regiones están en polinucleótidos separados, el miARN sintético se considerará que está compuesto por dos polinucleótidos.
Cuando la molécula de ARN está en un único polinucleótido, hay una región enlazadora entre la región miARN y la 5 región complementaria. En algunas realizaciones, el único polinucleótido es capaz de formar una estructura de bucle en horquilla como resultado del enlace entre la región miARN y la región complementaria. La enlazadora constituye el bucle en horquilla. Se contempla que en algunas realizaciones, la región enlazadora es, al menos es, o es como mucho de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 restos de longitud, o cualquier intervalo que derive de éste. En ciertas realizaciones, 10 la enlazadora tiene entre 3 y 30 restos (incluidos) de longitud.
Además de tener una región miARN y una región complementaria, puede haber secuencias flanqueantes también en los extremos 5’ o 3’ de la región. En algunas realizaciones, hay o hay al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nucleótidos o más, o cualquier intervalo que derive de éste, flanqueando uno o ambos lados de estar regiones.
Los ácidos nucleicos sintéticos tratados anteriormente y aquí se pueden utilizar en procedimientos de la invención. 15 Así, en ciertas realizaciones, los procedimientos implican ácidos nucleicos sintéticos con diferentes diseños en ellos.
Las características de las células que se pueden evaluar no están limitadas. Incluyen las siguientes características y características asociadas con las siguientes: proliferación celular, índice mitótico, ciclo celular, apoptosis, motilidad, adhesión, transducción de la señal, localización proteica, expresión genética, localización del ARN, división celular, replicación de ADN, modificación post-traduccional, diferenciación, des-diferenciación, activación transcripcional, 20 activación proteica, angiogénesis, metabolismo (producción y/o consumo de energía), degradación proteica, condensación cromatínica, producción de microtúbulos, replicación de ADN, recombinación y funciones de reparación de ADN. Se contempla que estas características pueden ser relevantes globalmente para la célula (por ejemplo, producción proteica total reducida) o en especies individuales en la célula (por ejemplo, inducción de proteína(s) específica(s)). 25
Se contempla que este procedimiento se puede aplicar con respecto a una variedad de diferentes miARN sintéticos y/o no sintéticos en células separadas o en la misma célula. En algunos casos, se pueden introducir el siguiente número de miARN sintéticos en diferentes células: 2, 3, o más. La invención no está limitada por un tipo celular. Se contempla que cualquier célula que exprese miARN o cualquier célula que tiene una característica alterada por un miARN son tratable por los procedimientos y composiciones de la invención. Se puede combinar el uso de dos o 30 más miARN en una composición farmacéutica única como un cóctel o se puede proporcionar para su uso en cualquier procedimiento terapéutico, diagnóstico o pronóstico de la invención. En algunas realizaciones de la invención, los procedimientos incluyen el ensayo de la presencia del miARN en la célula que ha sido presentado eficazmente por una molécula de miARN sintético o inhibido por un inhibidor de miARN. En consecuencia, en algunas realizaciones, los procedimientos incluyen una etapa de generación de un perfil de miARN en una muestra. 35 La expresión “perfil de miARN” se refiere a un grupo de datos con respecto al patrón de expresión para una pluralidad de miARN en la muestra.; se contempla que el perfil de miARN puede obtenerse utilizando una matriz de miARN. En algunas realizaciones de la invención, se genera por etapas un perfil de miARN que incluyen: a) marcar el miARN en la muestra; b) hibridar el miARN con una matriz miARN; y c) determinar la hibridación de miARN a la matriz, en la que se genera un perfil de miARN. Véase la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. 60/575.743 y 40 la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. 60/649.584, y la Solicitud de Patente de EE. UU. Serie Nº 11/141.707.
Adicionalmente, una célula a la que se introduce un miARN sintético o un miARN inhibidor puede evaluarse o ensayarse posteriormente para hallar la cantidad de miARN endógeno o exógeno o inhibidor de miARN. Se contempla cualquier tipo celular para su uso en la invención. La célula puede ser de o estar en un mamífero, tal como un mono, caballo, vaca, cerdo, oveja, perro, gato, conejo, ratón, rata o ser humano. 45
En otros procedimientos de la invención, se incluye una etapa de síntesis u obtención de la molécula de ARN sintético.
En realizaciones adicionales, el ácido nucleico sintético se introduce en las células por transfección de fosfato de calcio, transfección lipídica, electroporación, microinyección, o inyección. Los ácidos nucleicos sintéticos pueden administrarse a un sujeto o pacientes utilizando modos de administración que se conocen bien por los expertos en la 50 técnica, particularmente para aplicaciones terapéuticas. Se contempla particularmente que un paciente es un ser humano o cualquier otro mamífero o animal que tiene miARN.
Los procedimientos incluyen identificar una célula o un paciente que tiene la necesidad de inducir esas características celulares. También se entenderá que un cantidad de ácido nucleico sintético que se proporciona a una célula u organismo es una “cantidad eficaz·, lo que se refiere a una cantidad que se necesita para conseguir un 55 objetivo deseado, tal que induzca característica(s) celular(es) particular(es).
En ciertas realizaciones, los procedimientos incluyen proporcionar o introducir en una célula una molécula de ácido nucleico correspondiente con un miARN maduro en una cantidad eficaz para conseguir un resultado fisiológico
deseado. Tales procedimientos se desvelan en el presente documento.
En otras realizaciones, los procedimientos implican la reducción de la viabilidad celular, la inducción de apoptosis en una células, o la disminución de la proliferación células, con la condición de que se excluyan los procedimientos del tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de terapia, que comprenden introducir o proporcionar a la células una cantidad eficaz de una molécula de miARN sintético que se corresponde con miR-34a. También se contemplan 5 uno o más miARN humanos seleccionados de entre el grupo compuesto por let-7, miR-10a, miR-15a, miR-16, miR-17, miR-21, miR-22, miR-23, miR-24, miR-26a, miR-29b, miR-30a, miR-96, miR-101, miR-105, miR-106, miR-124, miR-125a, miR-126, miR-130, miR130a, miR-133, miR-142, miR-143, miR-144, miR-145, miR-147, miR-181a, miR-182, miR-183, miR-188, miR-189, miR-192, miR-194, miR-195, miR-199a, miR-200b, miR-201, miR-205, miR-219, miR-206, miR-215, miR-219, miR-223, miR-224, miR-321, miR-328, miR-331, miR-342, miR-219, y miR-346. Se 10 contempla que se pueden utilizar 1, 2, 3, o más miARN para estas realizaciones. El cáncer incluye, pero no se limita a estos, cánceres malignos, tumores, cánceres metastáticos, cánceres inoperables, cánceres resistentes a quimioterapia y/o radiación, y cánceres terminales.
Se entenderá que se emplean notaciones abreviadas tal que una descripción genérica de un miARN se refiere a cualquier miembro de su familia de genes (distinguido por un número), a menos de que se indique otra cosa. Se 15 entiende por los expertos en la técnica que una “familia de genes” se refiere a un grupo de genes que tienen la misma secuencia codificante miARN. Típicamente, los miembros de una familia de genes se identifican por un número seguido de la designación inicial. Por ejemplo, miR-16-1 y miR-16-2 son miembros de la familia miR-16 y “miR-7” se refiere a miR-7-1, miR-7-2 y miR-7-3. Además, a menos de que se indique otra cosa, una notación abreviada se refiere a los miARN relacionados (distinguidos por una letra). Así, “let-7”, por ejemplo, se refiere a let7-20 a-2, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, y let-7f-2. Las excepciones a estas notaciones abreviadas se identificarán de otra manera.
También se contempla el uso de ácidos nucleicos miARN sintéticos en la terapia del cáncer de pulmón como parte de la invención. La presente invención se refiere a un ácido nucleico miARN sintético para su uso en el tratamiento del cáncer de cuello uterino o la disminución de la proliferación celular de las células del cáncer de cuello uterino. 25
La presente invención se refiere a un ácido nucleico miARN sintético para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata o la disminución de la proliferación celular de las células del cáncer de próstata. La presente invención se refiere a un ácido nucleico mi ARN sintético para su uso en el tratamiento del cáncer de piel o la disminución de la proliferación celular de las células del cáncer de piel. La presente invención se refiere a un ácido nucleico miARN sintético para su uso en el tratamiento de la leucemia o el descenso de la proliferación celular de los linfocitos T 30 cancerosos (de leucemia).
La presente invención también se refiere a un ácido nucleico miARN sintético para el uso en pacientes a los que se ha diagnosticado que tienen isquemia, lo que están en riesgo de padecer isquemia, lo que son sospechosos de tener isquemia, o los pacientes con signos de isquemia. En ciertos experimentos, se utiliza en los procedimientos y composiciones de la invención un miARN sintético en el que ambas cadenas en sentido y antisentido se derivan de 35 un único miARN precursor. Estos se designan frecuentemente con un sufijo “P” en el que “5P” indica que el miARN maduro deriva del extremo 5’ del precursor y un correspondiente “3P” indica que deriva del extremo 3’ del precursor, como se describe en internet en sanger.ac.uk/cgi-bin/rfam/mirna. Además, en algunas realizaciones, se evaluó un miARN que no se corresponde con un miARN humano conocido. Se contempla que estos miARN no humanos se pueden utilizar en realizaciones de la invención o que puede existir un miARN que es homólogo del miARN no 40 humano.
La expresión “reducción de la viabilidad celular” significa la reducción del número de células vivas.
Los procedimientos que se refieren a la viabilidad celular y la proliferación celular se pueden utilizar generalmente para tratamientos, diagnósticos, creación de líneas celulares con propiedades interesantes de investigación, y la inducción de diferenciación. Los miARN que reducen selectivamente la proliferación de las células cancerosas se 45 pueden emplear como terapia puesto que se pueden suministrar a células cancerosas y no cancerosas de igual manera pero solo afectarán al crecimiento de las cancerosas. Además, los ácidos nucleicos sintéticos pueden detener o prevenir la metástasis o reducir el número de metástasis.
Además, se contempla particularmente que una molécula de ácido nucleico capaz de procesarse en un miARN maduro cuando está dentro de la célula es un miARN sintético en algunas realizaciones de la invención. 50
La presente invención también cubre un ácido nucleico miARN sintético para su uso en procedimientos de inhibición de la activación de ERK. Se contempla que una cantidad eficaz de un modulador de miARN puede ser por administración. En realizaciones particulares, hay un beneficio terapéutico conferido a la materia biológica, donde un “beneficio terapéutico” se refiere a una mejoría en una o más afecciones o síntomas asociados con una enfermedad o afección o una mejoría del pronóstico, duración o estado con respecto a la enfermedad. Se contempla que un 55 beneficio terapéutico incluye, pero no se limita a estos, disminución del dolor, un descenso de la morbilidad, un descenso de un síntoma. Por ejemplo, con respecto al cáncer, se contempla que un beneficio terapéutico en el cáncer puede ser la inhibición del crecimiento tumoral, prevención de metástasis, reducción del número de
metástasis, inhibición de la proliferación celular cancerosa, inducción de muerte celular en células cancerosas, inhibición de angiogénesis cerca de células cancerosas, inducción de apoptosis en las células cancerosas, reducción del dolor, reducción del riesgo de recurrencia, inducción de quimio o radiosensibilidad en las células cancerosas, prolongación de la vida, y/o retraso de la muerte directa o indirectamente relacionada con el cáncer.
Además, se contempla que las composiciones de miARN se pueden proporcionar para su uso como parte de una 5 terapia para un paciente, en conjunción con terapias tradicionales o agentes preventivos. Además, se contempla que cualquier procedimiento tratado en el contexto de la terapia se puede aplicar preventivamente, particularmente en un paciente identificado como que potencialmente necesita la terapia o en riesgo de la afección o la enfermedad para la que necesita terapia.
Las terapias del cáncer también incluyen una variedad de combinación de terapias con tratamientos tanto químicos 10 como basados en radiación. La combinación de quimioterapias incluyen pero no están limitadas a estas, por ejemplo, bevacizumab, cisplatino (CDDP), carboplatino, inhibidores de EGFR (gefitinib y cetuximab), procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) ifosfamida, melfalán, clorambucilo, busulfán, nitrosurea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), bleomicina, plicomicina, mitomicina, etopósido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, receptor estrogénico agentes de unión, taxol, 15 taxotere, gemcitabien, navelbine, inhibidores de farnesil-proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato, o cualquier análogo o variante derivado de los anteriores.
Generalmente, se pueden dar inhibidores de los miARN para conseguir el efecto contrario en comparación con cuando se dan las correspondientes moléculas de ácido nucleico miARN maduro. De manera similar, se pueden dar las moléculas correspondientes de ácido nucleico miARN maduro para conseguir el efecto contrario en comparación 20 con cuando se dan los inhibidores de miARN. Por ejemplo, se pueden proporcionar a las células moléculas de miARN que aumentan la proliferación celular para aumentar la proliferación o se pueden proporcionar inhibidores de tales moléculas para disminuir la proliferación celular. A lo largo de la presente solicitud, el término “aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o procedimiento que se emplea para determinar el valor. 25
El uso de la palabra “un” o “una” cuando se utiliza en conjunción con el término “que comprende” en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar “uno”, pero también es consistente con el significado de “uno o más”, “al menos uno”, y “uno o más de uno”.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar ciertos aspectos de 30 la presente invención. La invención puede entenderse mejor en referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
FIG. 1 Visión en conjunto de la expresión y activación de miARN. Los miARN se transcriben como parte de moléculas de ARN más largas que pueden tener hasta cien nucleótidos (Lee, 2002). Los ARN se procesan en el núcleo en ARN en horquilla de 70-100 nucleótidos por la ribonucleasa Drosha específica de ARNds (Lee, 2003) 35 (FIG. 1). Los ARN en horquilla se transportan al citoplasma y se digieren por una segunda ribonucleasa específica de doble cadena llamada Dicer. Los miARN resultantes de 19-23meros se unen a un complejo que es similar o idéntico al Complejo de Silenciamiento Inducido por ARN (RISC) que participa en la interferencia de ARN (Hutvagner, 2002). En el complejo de unión, el miARN de cadena sencilla se une a ARNm con secuencias que son significativamente, aunque no completamente, complementarias al miARN. Por un mecanismo que no 40 se comprende del todo, pero que no implica degradación del ARNm, el ARNm unido no se traduce, dando como resultado la expresión reducida del gen correspondiente.
FIG. 2. Procedimientos para introducir los miARN en las células. Hay tres procedimientos básicos para introducir miARN en las células. En el primero, un ADN que tiene un promotor corriente arriba de una secuencia que codifica un miARN se introduce en las células donde se transcribe para producir una molécula de ARN que 45 incluye el miARN maduro. El procesamiento y la captación por el complejo proteico para la regulación genética inducida por miARN dan como resultado la activación del miARN. Este procedimiento padece de introducción ineficaz de la construcción de ADN en las células. En el segundo procedimiento, una molécula de ARNds similar ARNsi, que tiene una de las cadenas idénticas al miARN activo se introduce en las células donde es captada por el complejo proteico para la activación del miARN. Este procedimiento proporciona un suministro eficaz, pero a 50 menudo la captación de molécula de ARN complementaria accidental. El tercer procedimiento, descrito en el presente documento, implica la modificación de la cadena complementaria de forma que favorezca la captación y activación de la cadena activa de la construcción de miARN sintético.
FIG. 3. Captación preferencial de cadenas activas en los miARN sintéticos de la invención. Vectores indicadores con luciferasa bajo el control de sitios diana para miR-33 o let-7 o las cadenas complementarias de 55 los ARNsi mencionados anteriormente. La co-transfección de miARN sintéticos y vectores indicadores seguida por un ensayo de luciferasa 24 horas post-transfección reveló los miARN activados tras la transfección.
FIG. 4. Actividad de miARN sintético para varios miARN. Se prepararon miARN con ARNsi y diseño Pre-miR (5’ amina) y se transfectaron en células HeLa con una concentración final de 3 y 10 nM. Los miARN sintéticos se co-transfectaron con vectores indicadores que llevaban sitios diana para los miARN maduros. La expresión del 60
indicador luciferasa en las células transfectadas se midió veinticuatro horas tras la transfección y se expresó en la figura como la expresión del indicador con respecto a las células co-transfectadas con miARN sintéticos controles negativos.
FIG. 5. Actividad de miARN sintético a través de tipos celulares y contra dianas naturales. Se ensayaron los miARN sintéticos para comprobar la activación apropiada de la cadena y la especificidad del tipo celular para 5 asegurar que el diseño era robusto. Se co-transfectaron cuatro tipos celulares diferentes con el miARN y la cadena complementaria y activa asociada. El panel A muestra que distintos tipos celulares responden igual a los miARN sintéticos. Se transfectaron entonces cuatro miARN diferentes en varios tipos celulares y se midieron los niveles de expresión de dianas naturales de los miARN Panel B).
FIG. 6. Esquema de la selección con bibliotecas de miARN sintéticos o inhibidores de miARN. Los miARN 10 sintéticos o los inhibidores de miARN se distribuyeron en los pocillos de una placa microtiter. Se añadieron el reactivo de transfección y luego las células en cada pocillo. A cierto tiempo post-transfección, se evaluó el fenotipo de las muestras. Los miARN que inducen un cambio que es significativo con respecto a un control negativo se seleccionan para estudios posteriores.
FIG. 7. Selección de miARN que afectan la proliferación celular. En placas de 96 pocillos, se transfectaron 15 inversamente 8.000 células HeLa con inhibidores de miARN (5 pmoles) por triplicado utilizando siPORT Neo-FX Ambion. A las 72 horas post-transfección, se fijaron las células con paraformaldehído al 4 %, se permeabilizaron con TritonX 100 al 0,1 % y se tiñeron con yoduro de propidio para ver el número total de células. Las placas se escanearon, utilizando el Explorer Acumen TTP LabTech, los cambios de morfología en las células inhibidos por miR-31. Se transfectaron las células HeLa con anti-mir31 y se fijaron y se tiñeron las células con anticuerpo anti-20 beta activa y DAPI para visualizar los cambios en la morfología en respuesta a la inhibición de la función del micro-ARN mir-31.
FIG. 8. Selección de miARN que afectan la proliferación en células A549. La selección de miARN implicados en la viabilidad celular en células A549. En placas de 96 pocillos se transfectaron inversamente 8.000 células A549 con inhibidores de miARN (5 pmoles) por triplicado utilizando siPORT Neo-FX. A las 72 horas post-25 transfección se tripsinizaron las células y se contaron utilizando el instrumento de recuento celular Guava. El número de células se representó en el gráfico y se normalizó con un inhibidor de huecos. En esta figura, “mir1d” refiere a mir-1-2.
FIG. 9. Selección de miARN que afectan a la apoptosis en células HeLa. Efectos de los inhibidores de la actividad de la caspasa en HeLa. En placas de 96 pocillos, se transfectaron inversamente 8.000 células con 30 inhibidores de miARN (5 pmoles) por triplicado utilizando Ambion siPORT Neo-FX. A las 72 horas post-transfección se analizaron las células utilizando el ensayo de actividad de la caspasa y se normalizaron basándose en el ensayo de actividad de la esterasa. En esta figura, “mir1d” se refiere a mir-1-2.
FIG. 10. Expresión de miARN en pacientes con cáncer de pulmón y de colon. Se compararon los perfiles de expresión de miARN de los tejidos tumorales frente a normales adyacentes para pacientes con cáncer de pulmón 35 y de colon. Los miARN se proporcionan en filas; los pacientes se presentan en columnas. El verde en el mapa caliente muestra los miARN que están regulados negativamente en la muestra tumoral con respecto a la muestra de tejido normal adyacente, y el rojo muestra los miARN que están regulados positivamente en la muestra tumoral frente a la muestra de tejido normal adyacente.
FIG. 11. Validación de los resultados de expresión de la matriz de miARN en pacientes con cáncer de 40 pulmón. Se analizaron las muestras de ARN total de dos pacientes con cáncer de pulmón para hallar la expresión de miR-16, miR-21, miR-143, miR-145, y let-7 utilizando el análisis de Northern. Los gráficos muestran la relativa abundancia de cada miARN (relación de tumor: TNA) a partir del análisis de la matriz y el análisis de la cámara fosforescente de Northern.
FIG.12. Algunos miARN se expresan diferencialmente en múltiples tipos de cáncer. Se utilizó el análisis de 45 matriz de miARN que compara los tejidos tumorales y normales adyacentes de los pacientes con varios tipos de cáncer para identificar los miARN que se expresaban diferencialmente en el cáncer. Se calculó el porcentaje de pacientes que mostraban regulación positiva o negativa de un determinado miARN para cada tipo de cáncer. Se representan los ocho que se expresaban diferencialmente más a menudo a través de los tipos de muestra.
FIG. 13. Se muestran los miARN que tienen cambios en la expresión mayores de 1,5 veces, entre ambos 50 infectados frente a no infectados y sensibles frente a no sensibles. A la derecha hay un agrupamiento de los resultados de 2 matrices de cada modelo.
FIG. 14. miARN expresados diferencialmente en 3 ratones pre-condicionados respecto a ratones no tratados.
FIG. 15A-C. miARN sintéticos que disminuyen la proliferación celular. A. Se evaluaron las células BT549 y 55 MCF 12 A (mama), HeLa (cuello uterino) y 22 Rv1 (próstata) en cuanto a su proliferación celular. B. Se examinaron las células TE354T y TE353SK (piel), BJ (piel), y A549 (pulmón) en cuanto a su proliferación celular. C. Se evaluaron CRL5826 y HTB-57 (pulmón), Jurkat (linfocitos T), y linfocitos T primarios en cuanto a su proliferación celular.
FIG. 16. miARN sintéticos que aumentan la proliferación celular. Se evaluaron las células HeLa (cuello 60 uterino), 22 Rv1 (próstata), TE354T y TE353SK (piel), BJ (piel), A549 (pulmón), Jurkat (linfocito T), linfocitos T primarios, CRL5826 y HTB-57 (pulmón) en cuanto a su proliferación celular.
FIG. 17. Inhibidores de miARN que reducen la proliferación celular. Se evaluaron las células 22 Rv1 (próstata), TE354T (piel), MCF12a (mama), y A549 (pulmón) en cuanto a su proliferación celular.
FIG. 18. Inhibidores de miARN que aumentan la proliferación celular. Las células 22 Rv1 (próstata), TE354T 65 (piel), MCF12a (mama), y A549 (pulmón) se evaluaron en cuanto a su proliferación celular.
FIG. 19. miARN que afectan la viabilidad celular. Se evaluaron los linfocitos Jurkat (linfocito T), linfocitos T primarios, HeLa (cuello uterino) y A549 (pulmón) en cuanto a su proliferación celular.
FIG. 20. miARN que afectan a la apoptosis. Se evaluaron 22 Rv1 (próstata), TE354T (piel), Jurkat (linfocito T), y HeLa (cuello uterino) en cuanto a su proliferación celular.
FIG. 21. miARN que afectan la viabilidad celular en presencia de un agente terapéutico. Las células A549 5 (pulmón) se evaluaron en cuanto a su aumento y descenso de la viabilidad celular en presencia y ausencia de TRAIL o etopósido. Las células HTB-57 y CRL5826 (pulmón) y HeLa (cuello uterino) se evaluaron en cuanto a su viabilidad celular en ausencia y presencia de etopósido.
FIG. 22. miARN que afectan al ciclo celular. Se evaluaron las células BJ (piel) y HeLa (cuello uterino) en cuanto a aumentos y descensos en el número de células en ciertas fases del ciclo celular (G1, S, G2/M, 10 replicación de ADN).
FIG. 23. Fenotipos de miARN con secuencias similares. Comparación de las secuencias relacionadas y sus efectos sobre la proliferación celular.
FIG. 24. Genes asociados con la regulación de hTert y secuencias de miARN previstas que modulan su expresión. 15
Descripción de las realizaciones ilustrativas
La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos relativos a la preparación y caracterización de miARN, así como al uso de miARN para aplicaciones terapéuticas, pronósticas y diagnósticas. Para superar el problema con los sistemas previos ineficaces basados en plásmidos para introducir el miARN dentro de las células, los inventores desarrollaron ARN pequeños, parcialmente bicatenarios que se pueden suministrar con alta eficacia 20 en células tanto inmortalizadas como primarias. Los ARN pequeños tienen las mismas actividades funcionales que los miARN expresados endógenamente. Debido a que los ARN pequeños se pueden suministrar a las células con una eficacia mucho más alta que con los plásmidos, inducen un fenotipo mucho más fuerte que es más fácil de detectar y cuantificar, haciendo posible identificar muchas de las funciones de los miARN en las células.
Los inventores también han creado una biblioteca de moléculas de ARN pequeñas, bicatenarias que se pueden 25 utilizar para introducir los miARN en las células, así como una biblioteca de moléculas antisentido que inhiben las actividades de miARN conocidos que están presentes en las células. Estas bibliotecas se han utilizado para regular positiva o negativamente secuencialmente uno o más miARN en las células para identificar los miARN que son críticos para los procesos celulares como el ciclo celular, apoptosis, diferenciación, viabilidad, angiogénesis, metabolismo, y otros procesos con potencial terapéutico. Los miARN que regulan la expresión de genes importantes 30 como p53, MYC, y RAS se han identificado y caracterizado también para ubicar más los miARN que pueden proporcionar puntos importantes de intervención para tratar enfermedades. Por ejemplo se ha demostrado que let-7 está implicado con RAS. Véase, Johnson y col, 2005. Estos procesos de modulación seriada de las actividades de miARN y el ensayo de fenotipos celulares se denominan colectivamente como selección funcional de miARN.
I. Moléculas de miARN 35
Las moléculas de microARN (“miARN”) tienen una longitud de 21 a 22 nucleótidos, aunque se han informado longitudes de 17 y hasta 25 nucleótidos. Cada miARN se procesa a partir de una molécula de ARN precursor más largo (“precursor de miARN”). El precursor de miARN se transcribe a partir de genes no codificadores de proteínas. Los precursores de miARN tienen dos regiones de complementariedad que les capacitan para formar una estructura tipo vástago-lazo o plegamiento hacia atrás, que es escindida por una enzima que se denomina Dicer en los 40 animales. Dicer es una nucleasa tipo ribonucleasa III. El miARN procesado típicamente es una parte del vástago.
El miARN procesado (también denominado “miARN maduro”) forma parte de un gran complejo para regular negativamente un gen diana particular. Ejemplos de miARN animales incluyen los que se emparejan imperfectamente con las bases de la diana, lo que detiene la traducción (Olsen y col., 1999; Seggerson y col., 2002). Las moléculas de ARNsi también las procesa la Dicer, pero a partir de una molécula de ARN larga, bicatenaria. Los 45 ARNsi no se encuentran naturalmente en las células animales, pero pueden funcionar en tales células en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) para dirigir la escisión específica de secuencia de un ARNm diana (Denli y col, 2003).
El estudio de moléculas endógenas de miARN se ha descrito, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de EE. UU. 60/575.743. 50
miARN sintéticos
Los miARN aparentemente son activos en la célula cuando el ARN maduro de una cadena se une a un complejo proteico que regula la traducción de ARNm que se hibrida con el miARN. La introducción de moléculas exógenas de ARN que afecten a las células de la misma manera que los miARN expresados endógenamente necesita que una molécula de ARN de una cadena con la misma secuencia que el miARN maduro endógeno pueda captarse por el 55 complejo proteico que facilita el control traduccional. Se han evaluado una variedad de diseños de moléculas de ARN. Se han identificado tres diseños generales que maximizan la captación del miARN de cadena única deseado por la ruta de miARN. Una molécula de ARN con una secuencia de miARN que tiene al menos uno de los tres
diseños se denomina miARN sintético.
Los miARN sintéticos de la invención comprenden, en algunas realizaciones, dos moléculas de ARN en las que un ARN es idéntico a un miARN maduro de origen natural. La molécula de ARN que es idéntica a un miARN maduro se denomina la cadena activa. La segunda molécula de ARN, llamada cadena complementaria, es al menos parcialmente complementaria a la cadena activa. La cadena activa y la complementaria se hibridan para crear un 5 ARN de doble cadena, llamado miARN sintético, que es similar al precursor de miARN de origen natural que se une al complejo proteico inmediatamente antes de la activación de miARN en la célula. Para maximizar la actividad del miARN sintético se necesita maximizar la captación de la cadena activa y minimizar la captación de la cadena complementaria por el complejo proteico de miARN que regula la expresión genética a nivel de la traducción. Los diseños moleculares que proporcionan la actividad de miARN óptima implican modificaciones de la cadena 10 complementaria.
Dos diseños incorporan modificaciones químicas en la cadena complementaria. La primera modificación implica la creación de un ARN complementario con un grupo químico distinto de fosfato o hidroxilo en su extremo 5’. La presencia de la modificación en 5’ aparentemente elimina la captación de la cadena complementaria y en consecuencia, favorece la captación de la cadena activa por el complejo proteico de miARN. La modificación en 5’ 15 puede ser cualquiera de una variedad de moléculas que incluyen NH2, NHCOCH3, biotina y otras.
La segunda estrategia de modificación química que reduce significativamente la captación de la cadena complementaria por la ruta de miARN es incorporando nucleótidos con modificaciones del azúcar en los primeros 2-6 nucleótidos de la cadena complementaria. Se debería señalar que las modificaciones del azúcar que corresponden con la segunda estrategia de diseño se pueden compaginar con las modificaciones en el extremo 5’ que 20 corresponden con la primera estrategia de diseño para mejorar más las actividades del miARN sintético.
El tercer diseño de miARN sintético implica la incorporación de nucleótidos en el extremo 3’ de la cadena complementaria que no es complementaria con la cadena activa. Los híbridos de los ARN activo y complementario resultantes son muy estables en el extremo 3’ de la cadena activa pero relativamente inestables en el extremo 5’ de la cadena activa. Los estudios de los ARNsi indican que la estabilidad del híbrido 5’ es un indicador clave de la 25 captación de ARN por el complejo proteico que soporta la interferencia de ARN, la cual se relaciona al menos con la ruta de miARN en las células. Los inventores han descubierto que el uso cabal de la falta de coincidencia en la cadena de ARN complementaria mejora significativamente la actividad del miARN sintético.
A. Ácidos nucleicos
Se describen moléculas de ácido nucleico que puede introducir o inhibir los miARN en células cultivadas. Los ácidos 30 nucleicos pueden haberse producido en células o in vitro por enzimas purificadas aunque preferencialmente se producen por síntesis química. Pueden estar en bruto o purificadas. El término “miARN”, a menos de que se indique otra cosa, se refiere al ARN procesado después de que se ha escindido de su precursor. La tabla 1 indica qué SEC ID Nº se corresponde con la secuencia de un precursor de miARN particular y qué secuencias con la SEC ID Nº se corresponde con la secuencia madura. El nombre de miARN a menudo está abreviado y se designa sin prefijo y se 35 entenderá como tal dependiendo del contexto. A menos de que se indique otra cosa, los miARN a los que se refiere la solicitud son secuencias humanas identificadas como mir-X o let-X, donde X es un número y/o una letra.
Tabla 1
Secuencias miARN Humano
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
hsa-mir-1-2
SEC ID Nº 1 53-73
hsa-mir-1-1
SEC ID Nº 2 46-66
hsa-let-7a-1
SEC ID Nº 3 6-27
hsa-let-7a-2
SEC ID Nº 4 5-26
hsa-let-7a-3
SEC ID Nº 5 4-25
hsa-let-7b
SEC ID Nº 6 6-27
hsa-let-7c
SEC ID Nº 7 11-32
hsa-let-7d
SEC ID Nº 8 8-28
hsa-let-7e
SEC ID Nº 9 8-28
hsa-let-7f-1
SEC ID Nº 10 7-28
(Continuación)
Secuencias miARN Humano
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
hsa-let-7f-2
SEC ID Nº 11 8-29
hsa-mir-7-1
SEC ID Nº 12 24-44
hsa-mir-7-2
SEC ID Nº 13 32-52
hsa-mir-7-3
SEC ID Nº 14 31-51
hsa-let-7g
SEC ID Nº 15 5-25
hsa-let-7i
SEC ID Nº 16 6-24
hsa-mir-9-1
SEC ID Nº 17 16-38 y/o 56-76
hsa-mir-9-2
SEC ID Nº 18 16-38 y/o 54-74
hsa-mir-9-3
SEC ID Nº 19 16-38 y/o 56-76
hsa-mir-10a
SEC ID Nº 20 22-44
hsa-mir-10b
SEC ID Nº 21 27-48
hsa-mir-15a
SEC ID Nº 22 14-35
hsa-mir-15b
SEC ID Nº 23 20-41
hsa-mir-16-1
SEC ID Nº 24 14-35
hsa-mir-16-2
SEC ID Nº 25 10-31
hsa-mir-17
SEC ID Nº 26 14-37 y/o 51-70
hsa-mir-18
SEC ID Nº 27 6-27
hsa-mir-19a
SEC ID Nº 28 49-71
hsa-mir-19b-1
SEC ID Nº 29 54-76
hsa-mir-19b-2
SEC ID Nº 30 62-84
hsa-mir-20
SEC ID Nº 31 8-29
hsa-mir-21
SEC ID Nº 32 8-29
has-mir-22
SEC ID Nº 33 53-74
hsa-mir-23a
SEC ID Nº 34 45-65
hsa-mir-23b
SEC ID Nº 35 58-80
hsa-mir-24-1
SEC ID Nº 36 6-28 y/o 44-65
hsa-mir-24-2
SEC ID Nº 37 50-71
hsa-mir-25
SEC ID Nº 38 52-73
hsa-mir-26a-1
SEC ID Nº 39 10-31
hsa-mir-26b
SEC ID Nº 40 12-32
hsa-mir-26a-2
SEC ID Nº 41 14-35
hsa-mir-27a
SEC ID Nº 42 51-72
hsa-mir-27b
SEC ID Nº 43 61-80
hsa-mir-28
SEC ID Nº 44 14-35
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
Secuencias miARN Humano
Secuencias miARN Humano
Secuencias miARN Humano
Secuencias miARN Humano
Secuencias miARN Humano
Secuencias miARN Humano
Secuencias miARN Humano
Secuencias miARN Humano
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
hsa-mir-29a
SEC ID Nº 45 41-62
hsa-mir-29b-1
SEC ID Nº 46 51-70
hsa-mir-29b-2
SEC ID Nº 47 52-71
hsa-mir-29c
SEC ID Nº 48 54-75
hsa-mir-30a
SEC ID Nº 49 47-68
hsa-mir-30c-2
SEC ID Nº 50 7-29
hsa-mir-30d
SEC ID Nº 51 6-27
hsa-mir-30b
SEC ID Nº 52 17-37
hsa-mir-30c-1
SEC ID Nº 53 17-39
hsa-mir-30e
SEC ID Nº 54 2-21
hsa-mir-31
SEC ID Nº 55 9-29
hsa-mir-32
SEC ID Nº 56 6-26
hsa-mir-33
SEC ID Nº 57 6-24
hsa-mir-34a
SEC ID Nº 58 22-43
hsa-mir-34b
SEC ID Nº 59 14-35
hsa-mir-34c
SEC ID Nº 60 13-34
hsa-mir-92-1
SEC ID Nº 61 48-69
hsa-mir-92-2
SEC ID Nº 62 48-69
hsa-mir-93
SEC ID Nº 63 12-33
hsa-mir-95
SEC ID Nº 64 49-70
hsa-mir-96
SEC ID Nº 65 9-30
hsa-mir-98
SEC ID Nº 66 2-23
hsa-mir-99a
SEC ID Nº 67 13-34
hsa-mir-99b
SEC ID Nº 68 7-28
hsa-mir-100
SEC ID Nº 69 13-34
hsa-mir-101-1
SEC ID Nº 70 47-68
hsa-mir-101-2
SEC ID Nº 71 49-70
hsa-mir-103-2
SEC ID Nº 72 48-70
hsa-mir-103-1
SEC ID Nº 73 48-70
hsa-mir-105-1
SEC ID Nº 74 13-32
hsa-mir-105-2
SEC ID Nº 75 13-32
hsa-mir-106a
SEC ID Nº 76 13-36
hsa-mir-106b
SEC ID Nº 77 12-32
hsa-mir-107
SEC ID Nº 78 50-72
hsa-mir-122a
SEC ID Nº 79 15-37
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
hsa-mir-124a-1
SEC ID Nº 80 52-73
hsa-mir-124a-2
SEC ID Nº 81 61-82
hsa-mir-124a-3
SEC ID Nº 82 52-73
hsa-mir-125b-1
SEC ID Nº 83 15-36
hsa-mir-125a
SEC ID Nº 84 15-37
hsa-mir-125b-2
SEC ID Nº 85 17-38
hsa-mir-126
SEC ID Nº 86 15-35 y/o 52-72
hsa-mir-127
SEC ID Nº 87 57-78
hsa-mir-128a
SEC ID Nº 88 50-71
hsa-mir-128b
SEC ID Nº 89 52-73
hsa-mir-129-2
SEC ID Nº 90 15-35
hsa-mir-130a
SEC ID Nº 91 55-74
hsa-mir-130b
SEC ID Nº 92 51-72
hsa-mir-132
SEC ID Nº 93 59-80
hsa-mir-133a-1
SEC ID Nº 94 54-75
hsa-mir-133a-2
SEC ID Nº 95 60-81
hsa-mir-133b
SEC ID Nº 96 67-87
hsa-mir-134
SEC ID Nº 97 8-28
hsa-mir-135a-1
SEC ID Nº 98 17-39
hsa-mir-135a-2
SEC ID Nº 99 23-45
hsa-mir-135b
SEC ID Nº 100 16-37
hsa-mir-136
SEC ID Nº 101 15-37
hsa-mir-137
SEC ID Nº 102 60-81
hsa-mir-138-2
SEC ID Nº 103 10-26
hsa-mir-138-1
SEC ID Nº 104 23-39
hsa-mir-139
SEC ID Nº 105 7-24
hsa-mir-140
SEC ID Nº 106 24-44
hsa-mir-141
SEC ID Nº 107 60-80
hsa-mir-142
SEC ID Nº 108 16-35 y/o 52-74
hsa-mir-143
SEC ID Nº 109 61-82
hsa-mir-144
SEC ID Nº 110 52-73
hsa-mir-145
SEC ID Nº 111 16-39
hsa-mir-146
SEC ID Nº 112 21-42
hsa-mir-147
SEC ID Nº 113 47-66
hsa-mir-148a
SEC ID Nº 114 44-65
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
hsa-mir-148b
SEC ID Nº 115 63-84
hsa-mir-149
SEC ID Nº 116 15-36
hsa-mir-150
SEC ID Nº 117 16-37
hsa-mir-151
SEC ID Nº 118 46-67
hsa-mir-152
SEC ID Nº 119 54-74
hsa-mir-153-1
SEC ID Nº 120 54-73
hsa-mir-153-2
SEC ID Nº 121 53-72
hsa-mir-154
SEC ID Nº 122 15-36
hsa-mir-155
SEC ID Nº 123 4-25
hsa-mir-181a
SEC ID Nº 124 39-61
hsa-mir-181b-1
SEC ID Nº 125 36-59
hsa-mir-181c
SEC ID Nº 126 27-48
hsa-mir-181b-2
SEC ID Nº 127 16-39
hsa-mir-182
SEC ID Nº 128 23-44 y/o 67-87
hsa-mir-183
SEC ID Nº 129 27-49
hsa-mir-184
SEC ID Nº 130 53-74
hsa-mir-185
SEC ID Nº 131 15-32
hsa-mir-186
SEC ID Nº 132 15-37
hsa-mir-187
SEC ID Nº 133 71-91
hsa-mir-188
SEC ID Nº 134 15-36
hsa-mir-190
SEC ID Nº 135 15-36
hsa-mir-191
SEC ID Nº 136 16-37
hsa-mir-192
SEC ID Nº 137 24-44
hsa-mir-193
SEC ID Nº 138 55-75
hsa-mir-194-1
SEC ID Nº 139 15-36
hsa-mir-194-2
SEC ID Nº 140 15-36
hsa-mir-195
SEC ID Nº 141 15-35
hsa-mir-196-1
SEC ID Nº 142 7-27
hsa-mir-196-2
SEC ID Nº 143 25-45
hsa-mir-197
SEC ID Nº 144 48-69
hsa-mir-198
SEC ID Nº 145 6-24
hsa-mir-199a-1
SEC ID Nº 146 6-28 y/o 46-67
hsa-mir-199a-2
SEC ID Nº 147 31-53 y/o 69-90
hsa-mir-199b
SEC ID Nº 148 26-48
hsa-mir-200b
SEC ID Nº 149 54-77
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
hsa-mir-200c
SEC ID Nº 150 45-66
hsa-mir-200a
SEC ID Nº 151 54-75
hsa-mir-203
SEC ID Nº 152 65-86
hsa-mir-204
SEC ID Nº 153 33-54
hsa-mir-205
SEC ID Nº 154 34-55
hsa-mir-206
SEC ID Nº 155 53-74
hsa-mir-208
SEC ID Nº 156 44-65
hsa-mir-210
SEC ID Nº 157 66-86
hsa-mir-211
SEC ID Nº 158 26-47
hsa-mir-212
SEC ID Nº 159 71-91
hsa-mir-213
SEC ID Nº 160 24-46 y/o 64-85
hsa-mir-214
SEC ID Nº 161 71-91
hsa-mir-215
SEC ID Nº 162 27-47
hsa-mir-216
SEC ID Nº 163 19-39
hsa-mir-217
SEC ID Nº 164 35-58
hsa-mir-218-1
SEC ID Nº 165 25-45
hsa-mir-218-2
SEC ID Nº 166 25-45
hsa-mir-219-1
SEC ID Nº 167 21-41
hsa-mir-219-2
SEC ID Nº 168 19-39
hsa-mir-220
SEC ID Nº 169 23-43
hsa-mir-221
SEC ID Nº 170 65-87
hsa-mir-222
SEC ID Nº 171 69-92
hsa-mir-223
SEC ID Nº 172 68-88
hsa-mir-224
SEC ID Nº 173 8-30
hsa-mir-296
SEC ID Nº 174 14-34
hsa-mir-299
SEC ID Nº 175 7-28
hsa-mir-301
SEC ID Nº 176 51-73
hsa-mir-302
SEC ID Nº 177 44-66
hsa-mir-320
SEC ID Nº 178 48-70
hsa-mir-321
SEC ID Nº 179 10-30
hsa-mir-323
SEC ID Nº 180 50-71
hsa-mir-324
SEC ID Nº 181 16-38 y/o 51-72
hsa-mir-326
SEC ID Nº 182 60-79
hsa-mir-328
SEC ID Nº 183 48-69
hsa-mir-330
SEC ID Nº 184 57-79
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
hsa-mir-331
SEC ID Nº 185 61-81
hsa-mir-335
SEC ID Nº 186 16-38
hsa-mir-337
SEC ID Nº 187 56-78
hsa-mir-338
SEC ID Nº 188 42-64
hsa-mir-339
SEC ID Nº 189 15-35
hsa-mir-340
SEC ID Nº 190 58-80
hsa-mir-342
SEC ID Nº 191 61-84
hsa-mir-345
SEC ID Nº 573 17-37
hsa-mir-346
SEC ID Nº 574 4-26
hsa-mir-367
SEC ID Nº 575 44-65
hsa-mir-368
SEC ID Nº 576 44-65
hsa-mir-369
SEC ID Nº 577 44-64
hsa-mir-370
SEC ID Nº 578 48-68
hsa-mir-371
SEC ID Nº 579 44-64
hsa-mir-372
SEC ID Nº 580 42-64
hsa-mir-373
SEC ID Nº 581 44-66
hsa-mir-374
SEC ID Nº 582 12-33
hsa-mir-375
SEC ID Nº 677 40-61
hsa-mir-376a
SEC ID Nº 678 44-64
hsa-mir-377
SEC ID Nº 679 45-66
hsa-mir-378
SEC ID Nº 680 5-26 y 44-65
hsa-mir-379
SEC ID Nº 681 6-24
hsa-mir-380
SEC ID Nº 682 5-26 y 40-61
hsa-mir-381
SEC ID Nº 683 49-70
hsa-mir-382
SEC ID Nº 684 11-32
hsa-mir-383
SEC ID Nº 685 7-28
hsa-mir-384
SEC ID Nº 686 57-76
hsa-mir-422a
SEC ID Nº 687 11-32
hsa-mir-423
SEC ID Nº 688 53-74
hsa-mir-424
SEC ID Nº 689 11-32
hsa-mir-425
SEC ID Nº 690 55-75
hsa-mir-448
SEC ID Nº 691 71-92
hsa-mir-429
SEC ID Nº 692 51-72
hsa-mir-449
SEC ID Nº 693 16-37
hsa-mir-450-1
SEC ID Nº 694 17-38
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
hsa-mir-450-2
SEC ID Nº 704 22-43
hsa-mir-451
SEC ID Nº 705 17-39
hsa-mir-452
SEC ID Nº 706 17-38
hsa-mir-453
SEC ID Nº 707 43-64
hsa-mir-455
SEC ID Nº 708 16-37
hsa-mir-483
SEC ID Nº 709 48-70
hsa-mir-484
SEC ID Nº 710 2-23
hsa-mir-485
SEC ID Nº 711 9-30
hsa-mir-486
SEC ID Nº 712 4-25
hsa-mir-487
SEC ID Nº 713 49-70
hsa-mir-488
SEC ID Nº 714 14-34
hsa-mir-489
SEC ID Nº 715 51-73
hsa-mir-490
SEC ID Nº 716 76-97
hsa-mir-491
SEC ID Nº 717 16-38
hsa-mir-492
SEC ID Nº 718 30-52
hsa-mir-493
SEC ID Nº 719 16-37
hsa-mir-494
SEC ID Nº 720 48-71
hsa-mir-495
SEC ID Nº 721 50-72
hsa-mir-496
SEC ID Nº 722 61-77
hsa-mir-497
SEC ID Nº 723 24-44
hsa-mir-498
SEC ID Nº 724 34-56
hsa-mir-499
SEC ID Nº 725 33-55
hsa-mir-500
SEC ID Nº 726 52-73
hsa-mir-501
SEC ID Nº 727 14-35
hsa-mir-502
SEC ID Nº 728 1-21
hsa-mir-503
SEC ID Nº 729 6-28
hsa-mir-504
SEC ID Nº 730 13-33
hsa-mir-505
SEC ID Nº 731 52-73
hsa-mir-506
SEC ID Nº 732 71-91
hsa-mir-507
SEC ID Nº 733 56-76
hsa-mir-508
SEC ID Nº 734 61-83
hsa-mir-509
SEC ID Nº 735 55-77
hsa-mir-510
SEC ID Nº 736 10-32
hsa-mir-511-1
SEC ID Nº 737 16-36
hsa-mir-511-2
SEC ID Nº 738 16-36
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
hsa-mir-512-1
SEC ID Nº 739 14-36
hsa-mir-512-2
SEC ID Nº 740 20-42
hsa-mir-513-1
SEC ID Nº 741 37-58
hsa-mir-513-2
SEC ID Nº 742 36-57
hsa-mir-514-1
SEC ID Nº 743 39-58
hsa-mir-514-2
SEC ID Nº 744 39-58
hsa-mir-514-3
SEC ID Nº 745 39-58
hsa-mir-515-1
SEC ID Nº 746 14-37
hsa-mir-515-2
SEC ID Nº 747 14-37
hsa-mir-516-1
SEC ID Nº 748 61-78
hsa-mir-516-2
SEC ID Nº 749 61-78
hsa-mir-516-3
SEC ID Nº 750 15-37
hsa-mir-516-4
SEC ID Nº 751 15-37
hsa-mir-517a
SEC ID Nº 752 15-36
hsa-mir-517b
SEC ID Nº 753 6-27
hsa-mir-517c
SEC ID Nº 754 20-41
hsa-mir-518a-1
SEC ID Nº 755 14-34
hsa-mir-518a-2
SEC ID Nº 756 15-34
hsa-mir-518b
SEC ID Nº 757 51-72
hsa-mir-518c
SEC ID Nº 758 24-46
hsa-mir-518d
SEC ID Nº 759 16-36
hsa-mir-518e
SEC ID Nº 760 54-75
hsa-mir-518f
SEC ID Nº 761 16-38
hsa-mir-519a-1
SEC ID Nº 762 15-38
hsa-mir-519a-2
SEC ID Nº 763 54-78
hsa-mir-519b
SEC ID Nº 764 13-36
hsa-mir-519c
SEC ID Nº 765 16-39
hsa-mir-519d
SEC ID Nº 766 54-76
hsa-mir-519e
SEC ID Nº 767 14-35
hsa-mir-520a
SEC ID Nº 768 15-35
hsa-mir-520b
SEC ID Nº 769 41-61
hsa-mir-520c
SEC ID Nº 770 16-36
hsa-mir-520d
SEC ID Nº 771 15-37
hsa-mir-520e
SEC ID Nº 772 54-74
hsa-mir-520f
SEC ID Nº 773 55-76
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
hsa-mir-520g
SEC ID Nº 774 55-78
hsa-mir-520h
SEC ID Nº 775 55-76
hsa-mir-521-1
SEC ID Nº 776 54-75
hsa-mir-521-2
SEC ID Nº 777 54-75
hsa-mir-522
SEC ID Nº 778 16-39
hsa-mir-523
SEC ID Nº 779 16-39
hsa-mir-524
SEC ID Nº 780 16-37
hsa-mir-525
SEC ID Nº 781 15-35
hsa-mir-526a-1
SEC ID Nº 782 15-35
hsa-mir-526a-2
SEC ID Nº 783 7-27
hsa-mir-526b
SEC ID Nº 784 14-37
hsa-mir-527
SEC ID Nº 785 14-34
ambi-mir-7100
SEC ID Nº 803
mir-526b*
SEC ID Nº 804
mir-520a*
SEC ID Nº 805
Tabla 2
Secuencias de miARN de ratón
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
mmu-mir-1-1
SEC ID Nº 192 49-69
mmu-mir-1-2
SEC ID Nº 193 47-67
mmu-let-7g
SEC ID Nº 194 7-27
mmu-let-7i
SEC ID Nº 195 6-24
mmu-let-7d
SEC ID Nº 196 16-36 + 70-91
mmu-let-7a-1
SEC ID Nº 197 13-34
mmu-let-7a-2
SEC ID Nº 198 17-38
mmu-let-7b
SEC ID Nº 199 7-28
mmu-let-7c-1
SEC ID Nº 200 16-37
mmu-let-7c-2
SEC ID Nº 201 14-35
mmu-let-7e
SEC ID Nº 202 15-35
mmu-let-7f-1
SEC ID Nº 203 8-29
mmu-let-7f-2
SEC ID Nº 204 8-29
mmu-mir-7-1
SEC ID Nº 205 24-44
mmu-mir-7-2
SEC ID Nº 206 19-39
mmu-mir-7b
SEC ID Nº 207 30-50
(Continuación)
Secuencias de miARN de ratón
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
mmu-mir-9-2
SEC ID Nº 208 8-30 y/o 46-66
mmu-mir-9-1
SEC ID Nº 209 16-38 y/o 56-76
mmu-mir-9-3
SEC ID Nº 210 16-38 y/o 56-76
mmu-mir-10b
SEC ID Nº 211 7-28
mmu-mir-10a-1
SEC ID Nº 212 22-44
mmu-mir-10a-2
SEC ID Nº 213 22-44
mmu-mir-15b
SEC ID Nº 214 4-25
mmu-mir-15a
SEC ID Nº 215 15-36
mmu-mir-16-1
SEC ID Nº 216 16-37
mmu-mir-16-2
SEC ID Nº 217 17-38
mmu-mir-17
SEC ID Nº 218 14-37 y/o 51-70
mmu-mir-18
SEC ID Nº 219 17-38
mmu-mir-19b-2
SEC ID Nº 220 54-76
mmu-mir-19a
SEC ID Nº 221 49-71
mmu-mir-19b-1
SEC ID Nº 222 54-76
mmu-mir-20
SEC ID Nº 223 27-49
mmu-mir-21
SEC ID Nº 224 18-39
mmu-mir-22
SEC ID Nº 225 57-78
mmu-mir-23b
SEC ID Nº 226 46-68
mmu-mir-23a
SEC ID Nº 227 46-66
mmu-mir-24-1
SEC ID Nº 228 6-28 y/o 44-65
mmu-mir-24-2
SEC ID Nº 229 61-82
mmu-mir-25
SEC ID Nº 230 52-73
mmu-mir-26a-1
SEC ID Nº 231 16-37
mmu-mir-26b
SEC ID Nº 232 15-36
mmu-mir-26a-2
SEC ID Nº 233 14-35
mmu-mir-27b
SEC ID Nº 234 49-68
mmu-mir-27a
SEC ID Nº 235 56-76
mmu-mir-28
SEC ID Nº 236 14-35
mmu-mir-29b-1
SEC ID Nº 237 47-68
mmu-mir-29a
SEC ID Nº 238 53-74
mmu-mir-29c
SEC ID Nº 239 54-75
mmu-mir-29b-2
SEC ID Nº 240 52-73
mmu-mir-30a
SEC ID Nº 241 47-68
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
Secuencias de miARN de ratón
Secuencias de miARN de ratón
Secuencias de miARN de ratón
Secuencias de miARN de ratón
Secuencias de miARN de ratón
Secuencias de miARN de ratón
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
mmu-mir-30b
SEC ID Nº 242 2-22
mmu-mir-30e
SEC ID Nº 243 2-21
mmu-mir-30c-1
SEC ID Nº 244 17-39
mmu-mir-30c-2
SEC ID Nº 245 14-36
mmu-mir-30d
SEC ID Nº 246 12-33
mmu-mir-31
SEC ID Nº 247 28-49
mmu-mir-32
SEC ID Nº 248 6-26
mmu-mir-33
SEC ID Nº 249 6-24
mmu-mir-34c
SEC ID Nº 250 13-35
mmu-mir-34b
SEC ID Nº 251 13-35
mmu-mir-34a
SEC ID Nº 252 20-42
mmu-mir-92-2
SEC ID Nº 253 55-75
mmu-mir-92-1
SEC ID Nº 254 50-70
mmu-mir-93
SEC ID Nº 255 15-37
mmu-mir-96
SEC ID Nº 256 24-46
mmu-mir-98
SEC ID Nº 257 2-23
mmu-mir-99a
SEC ID Nº 258 6-25
mmu-mir-99b
SEC ID Nº 259 7-28
mmu-mir-100
SEC ID Nº 260 13-34
mmu-mir-101
SEC ID Nº 261 38-57
mmu-mir-101b
SEC ID Nº 262 61-82
mmu-mir-103-1
SEC ID Nº 263 52-74
mmu-mir-103-2
SEC ID Nº 264 52-74
mmu-mir-106a
SEC ID Nº 265 5-26
mmu-mir-106b
SEC ID Nº 266 12-32
mmu-mir-107
SEC ID Nº 267 52-74
mmu-mir-122a
SEC ID Nº 268 6-28
mmu-mir-124a-3
SEC ID Nº 269 43-64
mmu-mir-124a-1
SEC ID Nº 270 52-73
mmu-mir-124a-2
SEC ID Nº 271 61-82
mmu-mir-125a
SEC ID Nº 272 6-28
mmu-mir-125b-2
SEC ID Nº 273 7-28
mmu-mir-125b-1
SEC ID Nº 274 15-36
mmu-mir-126
SEC ID Nº 275 9-29 y/o 46-66
mmu-mir-127
SEC ID Nº 276 43-64
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
mmu-mir-128a
SEC ID Nº 277 44-65
mmu-mir-128b
SEC ID Nº 278 48-69
mmu-mir-129-1
SEC ID Nº 279 6-27
mmu-mir-129-2
SEC ID Nº 280 15-36
mmu-mir-130a
SEC ID Nº 281 42-61
mmu-mir-130b
SEC ID Nº 282 51-72
mmu-mir-132
SEC ID Nº 283 42-63
mmu-mir-133a-1
SEC ID Nº 284 44-65
mmu-mir-133a-2
SEC ID Nº 285 60-81
mmu-mir-133b
SEC ID Nº 286 67-87
mmu-mir-134
SEC ID Nº 287 7-27
mmu-mir-135a-1
SEC ID Nº 288 17-39
mmu-mir-135b
SEC ID Nº 289 16-37
mmu-mir-135a-2
SEC ID Nº 290 23-45
mmu-mir-136
SEC ID Nº 291 5-27
mmu-mir-137
SEC ID Nº 292 46-67
mmu-mir-138-2
SEC ID Nº 293 2-18
mmu-mir-138-1
SEC ID Nº 294 23-39
mmu-mir-139
SEC ID Nº 295 7-24
mmu-mir-140
SEC ID Nº 296 7-27
mmu-mir-141
SEC ID Nº 297 49-69
mmu-mir-142
SEC ID Nº 298 4-23 y/o 40-61
mmu-mir-143
SEC ID Nº 299 40-61
mmu-mir-144
SEC ID Nº 300 43-64
mmu-mir-145
SEC ID Nº 301 7-30
mmu-mir-146
SEC ID Nº 302 6-27
mmu-mir-148a
SEC ID Nº 303 61-82
mmu-mir-149
SEC ID Nº 304 4-25
mmu-mir-150
SEC ID Nº 305 6-27
mmu-mir-151
SEC ID Nº 306 43-63
mmu-mir-152
SEC ID Nº 307 47-67
mmu-mir-153
SEC ID Nº 308 44-63
mmu-mir-154
SEC ID Nº 309 6-27
mmu-mir-155
SEC ID Nº 310 4-25
mmu-mir-181a
SEC ID Nº 311 7-29
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
mmu-mir-181b-1
SEC ID Nº 312 12-35
mmu-mir-181c
SEC ID Nº 313 17-38
mmu-mir-181b-2
SEC ID Nº 314 16-39
mmu-mir-182
SEC ID Nº 315 7-28
mmu-mir-183
SEC ID Nº 316 6-28
mmu-mir-184
SEC ID Nº 317 45-66
mmu-mir-185
SEC ID Nº 318 7-24
mmu-mir-186
SEC ID Nº 319 7-29
mmu-mir-187
SEC ID Nº 320 40-61
mmu-mir-188
SEC ID Nº 321 6-27
mmu-mir-190
SEC ID Nº 322 6-27
mmu-mir-191
SEC ID Nº 323 7-28
mmu-mir-192
SEC ID Nº 324 14-31
mmu-mir-193
SEC ID Nº 325 41-61
mmu-mir-194-1
SEC ID Nº 326 7-28
mmu-mir-194-2
SEC ID Nº 327 16-37
mmu-mir-195
SEC ID Nº 328 1-21
mmu-mir-196-1
SEC ID Nº 329 24-44
mmu-mir-196-2
SEC ID Nº 330 16-36
mmu-mir-199a-1
SEC ID Nº 331 6-28 y/o 45-66
mmu-mir-199a-2
SEC ID Nº 332 31-53 y/o 69-90
mmu-mir-199b
SEC ID Nº 333 26-48
mmu-mir-200b
SEC ID Nº 334 45-67
mmu-mir-200a
SEC ID Nº 335 54-75
mmu-mir-200c
SEC ID Nº 336 46-67
mmu-mir-201
SEC ID Nº 337 6-26
mmu-mir-202
SEC ID Nº 33 45-66
mmu-mir-203
SEC ID Nº 339 49-69
mmu-mir-204
SEC ID Nº 340 6-28
mmu-mir-205
SEC ID Nº 341 7-28
mmu-mir-206
SEC ID Nº 342 46-67
mmu-mir-207
SEC ID Nº 343 52-74
mmu-mir-208
SEC ID Nº 344 50-71
mmu-mir-210
SEC ID Nº 345 66-86
mmu-mir-211
SEC ID Nº 346 26-47
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
mmu-mir-212
SEC ID Nº 347 56-76
mmu-mir-213
SEC ID Nº 348 14-36 y/o 54-75
mmu-mir-214
SEC ID Nº 349 71-91
mmu-mir-215
SEC ID Nº 350 30-50
mmu-mir-216
SEC ID Nº 351 7-27
mmu-mir-217
SEC ID Nº 352 34-57
mmu-mir-218-2
SEC ID Nº 353 25-45
mmu-mir-219-1
SEC ID Nº 354 21-41
mmu-mir-219-2
SEC ID Nº 355 19-39
mmu-mir-221
SEC ID Nº 356 60-81
mmu-mir-222
SEC ID Nº 357 49-71
mmu-mir-223
SEC ID Nº 358 68-88
mmu-mir-224
SEC ID Nº 359 8-30
mu-miR-290
SEC ID Nº 360 15-37
mmu-mir-291
SEC ID Nº 361 14-35 y/o 50-72
mmu-mir-292
SEC ID Nº 362 12-33 y/o 51-73
mmu-mir-293
SEC ID Nº 363 48-69
mmu-mir-294
SEC ID Nº 364 51-72
mmu-mir-295
SEC ID Nº 365 43-65
mmu-mir-296
SEC ID Nº 366 13-33
mmu-mir-297-1
SEC ID Nº 367 15-35
mmu-mir-297-2
SEC ID Nº 368 36-56
mmu-mir-298
SEC ID Nº 369 11-32
mmu-mir-299
SEC ID Nº 370 7-28
mmu-mir-300
SEC ID Nº 371 51-72
mmu-mir-301
SEC ID Nº 372 51-73
mmu-mir-302
SEC ID Nº 373 44-66
mmu-mir-320
SEC ID Nº 374 48-70
mmu-mir-321
SEC ID Nº 375 10-30
mmu-mir-323
SEC ID Nº 376 50-71
mmu-mir-324
SEC ID Nº 377 18-40 y/o 53-74
mmu-mir-325
SEC ID Nº 378 16-38
mmu-mir-326
SEC ID Nº 379 60-80
mmu-mir-328
SEC ID Nº 380 61-82
mmu-mir-329
SEC ID Nº 381 61-82
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
mmu-mir-330
SEC ID Nº 382 61-83
mmu-mir-331
SEC ID Nº 383 61-81
mmu-mir-337
SEC ID Nº 384 61-83
mmu-mir-338
SEC ID Nº 385 61-83
mmu-mir-339
SEC ID Nº 386 16-36
mmu-mir-340
SEC ID Nº 387 61-83
mmu-mir-341
SEC ID Nº 388 61-81
mmu-mir-342
SEC ID Nº 389 61-84
mmu-mir-344
SEC ID Nº 390 61-83
mmu-mir-345
SEC ID Nº 391 16-36
mmu-mir-346
SEC ID Nº 392 16-38
mmu-mir-350
SEC ID Nº 393 61-84
mmu-mir-351
SEC ID Nº 583 16-39
mmu-mir-370
SEC ID Nº 584 48-70
mmu-mir-376a
SEC ID Nº 585 44-64
mmu-mir-376b
SEC ID Nº 586 51-72
mmu-mir-380
SEC ID Nº 587 40-61
mmu-mir-409
SEC ID Nº 588 47-69
mmu-mir-410
SEC ID Nº 589 50-71
mmu-mir-411
SEC ID Nº 590 56-78
mmu-mir-412
SEC ID Nº 591 50-72
mmu-mir-425
SEC ID Nº 695 54-74
mmu-mir-429
SEC ID Nº 696 51-72
mmu-mir-448
SEC ID Nº 697 72-93
mmu-mir-449
SEC ID Nº 698 16-37
mmu-mir-450
SEC ID Nº 699 17-38
mmu-mir-451
SEC ID Nº 786 17-38
mmu-mir-452
SEC ID Nº 787 17-38
mmu-mir-463
SEC ID Nº 788 4-24
mmu-mir-464
SEC ID Nº 789 47-69
mmu-mir-465
SEC ID Nº 790 5-27
mmu-mir-466
SEC ID Nº 791 51-73
mmu-mir-467
SEC ID Nº 792 50-71
mmu-mir-468
SEC ID Nº 793 53-75
mmu-mir-469
SEC ID Nº 794 6-31
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
mmu-mir-470
SEC ID Nº 795 9-29
mmu-mir-471
SEC ID Nº 796 7-29
mmu-mir-483
SEC ID Nº 797 45-67
mmu-mir-484
SEC ID Nº 798 2-23
mmu-mir-485
SEC ID Nº 799 9-30
mmu-mir-486
SEC ID Nº 800 4-25
Tabla 3
Secuencias de miARN de rata
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
rno-let-7d
SEC ID Nº 394 14-34 y/o 68-89
rno-mir-7-1
SEC ID Nº 395 19-39 y/o 61-82
rno-let-7a-1
SEC ID Nº 396 13-34
rno-let-7a-2
SEC ID Nº 397 17-38
rno-let-7b
SEC ID Nº 398 7-28
rno-let-7c-1
SEC ID Nº 399 16-37
rno-let-7c-2
SEC ID Nº 400 14-35
rno-let-7e
SEC ID Nº 401 15-35
rno-let-7f-1
SEC ID Nº 402 8-29
rno-let-7f-2
SEC ID Nº 403 8-29
rno-let-7i
SEC ID Nº 404 6-24
rno-mir-7-2
SEC ID Nº 405 19-39
rno-mir-7b
SEC ID Nº 406 29-49
rno-mir-9-1
SEC ID Nº 407 16-38
rno-mir-9-3
SEC ID Nº 408 16-38
rno-mir-9-2
SEC ID Nº 409 16-38
rno-mir-10a
SEC ID Nº 410 22-44
rno-mir-10b
SEC ID Nº 411 26-47
rno-mir-15b
SEC ID Nº 412 20-41
rno-mir-16
SEC ID Nº 413 17-38
rno-mir-17
SEC ID Nº 414 14-37
rno-mir-18
SEC ID Nº 415 17-38
rno-mir-19b-1
SEC ID Nº 416 54-76
rno-mir-19b-2
SEC ID Nº 417 62-84
rno-mir-19a
SEC ID Nº 418 49-71
(Continuación)
Secuencias de miARN de rata
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
rno-mir-20
SEC ID Nº 419 16-38 y/o 52-72
rno-mir-21
SEC ID Nº 420 18-39
rno-mir-22
SEC ID Nº 421 57-78
rno-mir-23a
SEC ID Nº 422 46-66
rno-mir-23b
SEC ID Nº 423 58-80
rno-mir-24-1
SEC ID Nº 424 44-65
rno-mir-24-2
SEC ID Nº 425 61-82
rno-mir-25
SEC ID Nº 426 52-73
mo-mir-26a
SEC ID Nº 427 16-37
rno-mir-26b
SEC ID Nº 428 15-36
rno-mir-27b
SEC ID Nº 429 61-80
rno-mir-27a
SEC ID Nº 430 56-76
rno-mir-28
SEC ID Nº 431 14-35
rno-mir-29b-2
SEC ID Nº 432 52-73
rno-mir-29a
SEC ID Nº 433 53-74
rno-mir-29b-1
SEC ID Nº 434 51-72
rno-mir-29c
SEC ID Nº 435 54-75
rno-mir-30c-1
SEC ID Nº 436 17-39
rno-mir-30e
SEC ID Nº 437 2-21
rno-mir-30b
SEC ID Nº 438 16-36
rno-mir-30d
SEC ID Nº 439 12-33
rno-mir-30a
SEC ID Nº 440 47-68
rno-mir-30c-2
SEC ID Nº 441 14-36
rno-mir-31
SEC ID Nº 442 28-49
rno-mir-32
SEC ID Nº 443 6-26
rno-mir-33
SEC ID Nº 444 6-24
rno-mir-34b
SEC ID Nº 445 13-35
rno-mir-34c
SEC ID Nº 446 13-35
rno-mir-34a
SEC ID Nº 447 20-42
rno-mir-92-1
SEC ID Nº 448 48-68
rno-mir-92-2
SEC ID Nº 449 55-75
rno-mir-93
SEC ID Nº 450 15-37
rno-mir-96
SEC ID Nº 451 24-46
rno-mir-98
SEC ID Nº 452 2-23
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
(Continuación)
Secuencias de miARN de rata
Secuencias de miARN de rata
Secuencias de miARN de rata
Secuencias de miARN de rata
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
rno-mir-99a
SEC ID Nº 453 13-34
rno-mir-99b
SEC ID Nº 454 7-28
rno-mir-100
SEC ID Nº 455 13-34
rno-mir-101b
SEC ID Nº 456 61-82
rno-mir-101
SEC ID Nº 457 47-68
rno-mir-103-2
SEC ID Nº 458 52-74
rno-mir-103-1
SEC ID Nº 459 52-74
rno-mir-106b
SEC ID Nº 460 12-32
rno-mir-107
SEC ID Nº 461 52-74
rno-mir-122a
SEC ID Nº 462 15-37
rno-mir-124a-3
SEC ID Nº 463 52-73
rno-mir-124a-1
SEC ID Nº 464 52-73
rno-mir-124a-2
SEC ID Nº 465 61-82
rno-mir-125a
SEC ID Nº 466 15-37
rno-mir-125b-1
SEC ID Nº 467 15-36
rno-mir-125b-2
SEC ID Nº 468 17-38
rno-mir-126
SEC ID Nº 469 9-29 y/o 46-66
rno-mir-127
SEC ID Nº 470 57-78
mo-mir-128a
SEC ID Nº 471 50-71
mo-mir-128b
SEC ID Nº 472 52-73
rno-mir-129-2
SEC ID Nº 473 19-40 y/o 61-82
rno-mir-129-1
SEC ID Nº 474 6-27
rno-mir-130a
SEC ID Nº 475 55-74
rno-mir-130b
SEC ID Nº 476 51-72
rno-mir-132
SEC ID Nº 477 59-80
rno-mir-133a
SEC ID Nº 478 53-74
rno-mir-134
SEC ID Nº 479 8-28
rno-mir-135b
SEC ID Nº 480 16-37
rno-mir-135a
SEC ID Nº 481 23-45
rno-mir-136
SEC ID Nº 482 15-37
rno-mir-137
SEC ID Nº 483 60-81
rno-mir-138-2
SEC ID Nº 484 9-25
mo-mir-138-1
SEC ID Nº 485 23-39
rno-mir-139
SEC ID Nº 486 7-24
rno-mir-140
SEC ID Nº 487 23-43 y/o 61-84
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
rno-mir-141
SEC ID Nº 488 59-79
rno-mir-142
SEC ID Nº 489 16-35 y/o 52-74
rno-mir-143
SEC ID Nº 490 60-81
rno-mir-144
SEC ID Nº 491 50-71
rno-mir-145
SEC ID Nº 492 16-39
rno-mir-146
SEC ID Nº 493 17-38
rno-mir-148b
SEC ID Nº 494 61-82
rno-mir-150
SEC ID Nº 495 16-37
rno-mir-151
SEC ID Nº 496 16-37 y/o 50-71
rno-mir-152
SEC ID Nº 497 53-73
rno-mir-153
SEC ID Nº 498 53-72
rno-mir-154
SEC ID Nº 499 15-36
rno-mir-181c
SEC ID Nº 500 24-45
rno-mir-181a
SEC ID Nº 501 39-61
rno-mir-181b-1
SEC ID Nº 502 36-59
rno-mir-181b-2
SEC ID Nº 503 15-38
rno-mir-183
SEC ID Nº 504 27-49
rno-mir-184
SEC ID Nº 505 47-68
rno-mir-185
SEC ID Nº 506 14-31
rno-mir-186
SEC ID Nº 507 15-37
rno-mir-187
SEC ID Nº 508 66-86
rno-mir-190
SEC ID Nº 509 15-36
rno-mir-191
SEC ID Nº 510 15-36
rno-mir-192
SEC ID Nº 511 24-44
rno-mir-193
SEC ID Nº 512 54-74
rno-mir-194-1
SEC ID Nº 513 15-36
rno-mir-194-2
SEC ID Nº 514 15-36
rno-mir-195
SEC ID Nº 515 15-35
rno-mir-196
SEC ID Nº 516 25-45
rno-mir-199a
SEC ID Nº 517 31-53
rno-mir-200c
SEC ID Nº 518 46-67
rno-mir-200a
SEC ID Nº 519 54-75
rno-mir-200b
SEC ID Nº 520 54-77
rno-mir-203
SEC ID Nº 521 52-73
rno-mir-204
SEC ID Nº 522 33-54
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
rno-mir-205
SEC ID Nº 523 33-54
rno-mir-206
SEC ID Nº 524 51-72
rno-mir-208
SEC ID Nº 525 50-71
rno-mir-210
SEC ID Nº 526 66-86
rno-mir-211
SEC ID Nº 527 26-47
rno-mir-212
SEC ID Nº 528 72-92
rno-mir-213
SEC ID Nº 529 55-76
rno-mir-214
SEC ID Nº 530 71-91
rno-mir-216
SEC ID Nº 531 19-39
rno-mir-217
SEC ID Nº 532 32-55
rno-mir-218-2
SEC ID Nº 533 25-45
rno-mir-218-1
SEC ID Nº 534 25-45
rno-mir-219-1
SEC ID Nº 535 21-41
rno-mir-219-2
SEC ID Nº 536 19-39
rno-mir-221
SEC ID Nº 537 65-87
rno-mir-222
SEC ID Nº 538 62-85
rno-mir-223
SEC ID Nº 539 68-88
rno-mir-290
SEC ID Nº 540 14-36
rno-mir-291
SEC ID Nº 541 14-35 y/o 50-72
rno-mir-292
SEC ID Nº 542 12-33 y/o 51-73
rno-mir-296
SEC ID Nº 543 13-33
rno-mir-297
SEC ID Nº 544 26-48
rno-mir-298
SEC ID Nº 545 11-32
rno-mir-299
SEC ID Nº 546 7-28
rno-mir-300
SEC ID Nº 547 51-72
rno-mir-301
SEC ID Nº 548 61-85
rno-mir-320
SEC ID Nº 549 48-70
rno-mir-321
SEC ID Nº 550 10-30
rno-mir-322
SEC ID Nº 551 61-80
rno-mir-323
SEC ID Nº 552 50-71
rno-mir-324
SEC ID Nº 553 16-38 y/o 51-72
rno-mir-325
SEC ID Nº 554 16-38
rno-mir-326
SEC ID Nº 555 60-80
rno-mir-328
SEC ID Nº 556 48-69
rno-mir-329
SEC ID Nº 557 61-82
Nombre de miARN
Precursor Secuencia Procesada Respecto al Precursor
rno-mir-330
SEC ID Nº 558 60-82
rno-mir-3 31
SEC ID Nº 559 61-81
rno-mir-333
SEC ID Nº 560 16-35
rno-mir-336
SEC ID Nº 561 16-36
rno-mir-337
SEC ID Nº 562 60-82
rno-mir-338
SEC ID Nº 563 41-63
rno-mir-339
SEC ID Nº 564 16-36
rno-mir-341
SEC ID Nº 565 61-81
rno-mir-342
SEC ID Nº 566 61-84
rno-mir-344
SEC ID Nº 567 61-83
rno-mir-345
SEC ID Nº 568 16-36
rno-mir-346
SEC ID Nº 569 16-38
rno-mir-349
SEC ID Nº 570 61-82
rno-mir-350
SEC ID Nº 571 61-84
rno-mir-351
SEC ID Nº 572 16-39
rno-mir-352
SEC ID Nº 592 61-81
rno-mir-421
SEC ID Nº 593 10-30
rno-mir-429
SEC ID Nº 700 53-74
rno-mir-448
SEC ID Nº 701 72-93
rno-mir-449
SEC ID Nº 702 16-37
rno-mir-450
SEC ID Nº 703 17-38
rno-mir-451
SEC ID Nº 801 17-38
rno-mir-483
SEC ID Nº 802 45-67
Se entiende que un miARN se deriva de secuencias genómicas de un gen. A este respecto, el término “gen” se utiliza por simplicidad para referirse a la secuencia genómica que codifica el precursor de miARN de un determinado miARN. Sin embargo, las realizaciones de la invención puede implicar secuencias genómicas de un miARN que está implicado en su expresión, tal como un promotor u otras secuencias reguladoras. 5
El término “recombinante” se puede utilizar y generalmente se refiere a una molécula que se ha modificado in vitro o que es el producto replicado o expresado de tal molécula.
La expresión “ácido nucleico” se conoce bien en la técnica. Un “ácido nucleico” como se utiliza en el presente documento generalmente se refiere a una molécula (de una o más cadenas) de ADN, ARN o un derivado o análogo del mismo, que comprende una base nitrogenada. Una base nitrogenada incluye, por ejemplo, una base purínica o 10 pirimidínica de origen natural en el ADN (por ejemplo, una adenina “A”, una guanina “G”, una timina “T” o una citosina “C”) o de ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo “U” o una C). La expresión “ácido nucleico” engloba los términos “oligonucleótido” y “polinucleótido”, cada uno como un subgénero de la expresión “ácido nucleico”.
El término “miARN” generalmente se refiere a una molécula de una cadena, pero en realizaciones específicas, las moléculas implementadas en la invención también englobarán una región o una cadena adicional que es 15 parcialmente (entre el 10 y el 50% complementaria a lo largo de la longitud de la cadena), sustancialmente (más del 50% pero menos del 100% complementaria a lo largo de la longitud de la cadena) o totalmente complementaria con
otra región de la misma molécula de la cadena única o con otro ácido nucleico. Por lo tanto, los ácidos nucleicos pueden englobar una molécula que comprende una o más cadenas complementarias o autocomplementarias o “complementos” de una secuencia particular que comprende una molécula. Por ejemplo, el precursor de miARN puede tener una región autocomplementaria que es complementaria hasta en el 100%.
Como se utiliza en el presente documento, “hibridación”, “se hibrida” o “capaz de hibridarse” se entiende que 5 significa la formación de una molécula de doble o triple cadena o una molécula con naturaleza parcial de doble o triple cadena. El término “templarse” como se utiliza en el presente documento es sinónimo de “hibridarse”. El término “hibridación, “se hibrida(n)” o “capaz de hibridarse” engloba los términos “condiciones rigurosas” o “alta rigurosidad” y los términos “baja rigurosidad” o “condiciones de baja rigurosidad”.
Los ácidos nucleicos sintéticos de la invención comprenderán, en algunas realizaciones la secuencia de miARN de 10 cualquier miARN descrito en las SEC ID Nos 1-805, y/o cualquier secuencia con el complemento de la misma. Se contempla que las secuencias de los ácidos nucleicos de la invención pueden tener, tener al menos, o tener como mucho 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 15 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nos 1-805 (o cualquier intervalo derivado de las mismas), o es un complemento de las mismas. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos son, son al menos, o son como mucho el 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% idénticos o 20 complementarios a la secuencia de miARN de las SEC ID Nos 1-805, o cualquier combinación o intervalo derivable de las mismas.
1. Bases nitrogenadas
Como se utiliza en el presente documento una “base nitrogenada” se refiere a una base heterocíclica, tal como por ejemplo una base nitrogenada de origen natural (es decir, una A, T, G, C o U) que se encuentra en al menos un 25 ácido nucleico de origen natural (es decir, un ADN y ARN), y derivados y análogos de tal base nitrogenada que se encuentran natural o no naturalmente. Una base nitrogenada puede generalmente formar uno o más enlaces de hidrógeno (“templarse” o “hibridarse”) con al menos una base nitrogenada de origen natural de manera que puede sustituir el emparejamiento con la base nitrogenada de origen natural (por ejemplo, el enlace de hidrógeno entre A y T, G y C, y A y U). 30
La(s) base(s) nitrogenada(s) “de purina” y/o “pirimidina” engloban las bases nitrogenadas purínicas y pirimidínicas de origen natural y también los derivados y análogos de las mismas, incluyendo pero sin limitarse a estas, las purinas o pirimidinas sustituidas por uno o más restos de entre un alquilo, carboxialquilo, amino, hidroxilo, halógeno (es decir, fluoro, cloro, bromo, o yodo), tiol o alquiltiol. Los restos alquilo preferidos (por ejemplo, alquilo, carboxialquilo, etc.) comprenden de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, 35 aproximadamente 5, a aproximadamente 6 átomos de carbono. Otros ejemplos de una purina o pirimidina incluye una deazapurina, una 2,6-diaminopurina, un 5-fluorouracilo, una xantina, una hipoxantina, una 8-bromoguanina, una 8-cloroguanina, una bromotimina, una 8- aminoguanina, una 8-hidroxiguanina, una 8-metilguanina, una 8-tioguanina, una azaguanina, una 2-aminopurina, una 5-etilcitosina, una 5-metilcitosina, un 5-bromouracilo, un 5-etiluracilo,un 5-yodouracilo, un 5-clorouracilo, un 5-propiluracilo, un tiouracilo, una 2-metiladenina, una metiltioadenina, una N,N-40 diemetiladenina, una azadenina, una 8-bromoadenina, una 8-hidroxiadenina, una 6-hidroxiaminopurina,una 6-tiopurina, una 4-(6-aminohexil/citosina), y similares. Otros ejemplos son conocidos por un experto en la técnica.
Una base nitrogenada puede estar comprendida en un nucleósido o nucleótido, que utiliza cualquier procedimiento de síntesis química o natural descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. Tal base nitrogenada se puede marcar o puede ser parte de una molécula que está marcada y contiene la base nitrogenada. 45
2. Nucleósidos
Como se utiliza en el presente documento, un “nucleósido” se refiere a una unidad química individual que comprende una base nitrogenada unida covalentemente a un resto de base nitrogenada engarce. Un ejemplo no limitante de un “resto de base nitrogenada engarce” es un azúcar que comprende 5 átomos de carbono (es decir, un “azúcar de 5 carbonos”), incluyendo pero sin limitarse a una desoxirribosa, una ribosa, una arabinosa, o un derivado 50 o un análogo de un azúcar de 5 carbonos. Ejemplos no limitantes de un derivado o análogo de un azúcar de 5 carbonos incluyen una 2’-fluoro-2’-desoxirribosa o un azúcar carbocíclico en la que se sustituye un carbono por un átomo de oxígeno en el anillo de azúcar.
Se conocen en la técnica diferentes tipos de uniones covalentes de una base nitrogenada a un resto de base nitrogenada engarce. A manera de ejemplo no limitante, un nucleósido que comprende una purina (es decir, A o G) 55 o una base nitrogenada 7-deaza purina se une covalentemente típicamente en la posición 9 de una purina o una 7-deazapurina en la posición 1’ de un azúcar en la posición 5. En otro ejemplo no limitante, un nucleósido comprende una base nitrogenada pirimidínica (es decir, C, T, o U) se une covalentemente típicamente con una posición 1 de
una pirimidina o una posición 1’ de un azúcar de 5 carbonos (Komberg y Baker, 1992).
3. Nucleótidos
Como se utiliza en el presente documento, un “nucleótido” se refiere a un nucleósido que comprende además un “resto de estructura”. Un resto de estructura generalmente se une covalentemente a otra molécula que comprende un nucleótido, o a otro nucleótido que forma un ácido nucleico. El “resto de estructura” en los nucleótidos de origen 5 natural comprende típicamente un resto de fósforo que está unido covalentemente a un azúcar de 5 carbonos. Sin embargo, se conocen otros tipos de unión en la técnica, particularmente cuando un nucleótido comprende derivados o análogos de un azúcar de 5 carbonos de origen natural o un resto de fósforo.
4. Análogos de ácido nucleico
Un ácido nucleico puede comprender o estar compuesto enteramente de, un derivado o análogo de una base 10 nitrogenada, un resto de base nitrogenada engarce y/o un resto de estructura que puede estar presente en un ácido nucleico de origen natural. El ARN con análogos de ácidos nucleicos también se pueden marcar de acuerdo con los procedimientos de la invención. Como se utiliza en el presente documento un “derivado” se refiere a una forma modificada o alterada químicamente de una molécula de origen natural, mientras que los términos “mimético” o “análogo” se refiere a una molécula que puede o no parecerse estructuralmente a una molécula o resto de origen 15 natural, pero posee funciones similares. Como se utiliza en el presente documento, un “resto” generalmente se refiere a un componente químico más pequeño o molecular o una estructura química más grande o molecular. Se conocen bien en la técnica los análogos de bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos, y han sido descritos (véase por ejemplo, Scheit, 1980, incorporado en el presente documento por referencia).
Ejemplos no limitantes adicionales de nucleósidos, nucleótidos o ácidos nucleicos y/o derivados o análogos que 20 comprenden un azúcar de 5 carbonos y/o un resto de estructura, incluyen los de: la Patente de EE. UU. Nº 5.681.947, que describe oligonucleótidos que comprenden derivados de purina que forman hélices triples y/o evitan la expresión de ADNds; las Patentes de EE. UU. 5.652.099 y 5.763.167, que describen ácidos nucleicos que incorporan análogos de nucleósidos fluorescentes que se encuentran en ADN o ARN, particularmente para su uso como sondas de ácidos nucleicos fluorescentes; la Patente de EE. UU. 5.614.617, que describe análogos de 25 oligonucleótidos con sustituciones en los anillos de pirimidina que poseen una estabilidad mejorada frente a nucleasas; las Patentes de EE. UU. 5.670.663. 5.872.232 y 5.859.221, que describen análogos de oligonucleótidos con azúcares de 5 carbonos modificados (es decir, restos de 2’-desoxifuranosilo) que se utilizan en la detección de ácidos nucleicos; la Patente de EE. UU. 5.446.137, que describe oligonucleótidos que comprenden al menos un resto de azúcar de 5 carbonos sustituidos en la posición 4’ con un sustituyente distinto de hidrógeno que se puede 30 utilizar en ensayos de hibridación; la Patente de EE. UU. 5.886.165, que describe oligonucleótidos tanto desoxirribonucleótidos con uniones internucleótido 3’-5’ como ribonucleótidos con uniones internucleótido 2’-5’; la Patente de EE. UU. 5.714.606, que describe una unión internucleótido modificada en la que un oxígeno en la posición 3’ de la unión internucleótido se sustituye con un carbono para mejorar la resistencia a nucleasas de los ácidos nucleicos; la Patente de EE. UU. 5.672.697, que describe oligonucleótidos que contienen una o más uniones 35 internucleótidos 5’ metilen fosfonato que aumentan las resistencia a nucleasas; las Patentes de EE. UU. 5.466.786 y 5.792.847, que describen la unión de un resto sustituyente que puede comprender un fármaco o una marca en el carbono 2’ de un oligonucleótido para proporcionar una mayor estabilidad frente a nucleasas y la capacidad de suministrar fármacos y restos de detección; la Patente de EE. UU. 5.223.618, que describe análogos de oligonucleótidos con 2 o 3 uniones de carbono estructurales unidas en la posición 4’ y posición 3’ adyacentes al 40 resto de azúcar de 5 carbonos para mejorar la captación celular, la resistencia a las nucleasas y la hibridación con un ARN diana; la Patente de EE. UU. 5.470.967, que describe oligonucleótidos que comprenden al menos una unión internucleótido sulfamato o sulfamida que son útiles como sondas de hibridación de ácidos nucleicos: las Patentes de EE. UU. 5.378.825. 5.777.092. 5.623.070. 5.610.289 y 5.602.240, que describen oligonucleótidos con restos de engarce de tres o cuatro átomos que sustituyen el medio estructural de fosfodiéster utilizado para mejorar la 45 resistencia a nucleasas, captación celular y regulación de la expresión de ARN; la Patente de EE. UU. 5.858.988, que describe un agente portador hidrofóbico unido en la posición 2’-O de los oligonucleótidos para mejorar su permeabilidad de membrana y la estabilidad; la Patente de EE. UU. 5.214.136, que describe oligonucleótidos conjugados con antraquinona en el extremo 5’ que posee una hibridación al ADN, o ARN mejorada, estabilidad frente a nucleasas mejorada; la Patente de EE. UU. 5.700.922, que describe quimeras PAN-ADN-PAN en las que el 50 ADN comprende 2’-desoxi-eritro-pentofuranosil nucleótidos para mejorar la resistencia a las nucleasas, afinidad de unión, y capacidad para activar la RNasa H; y la Patente de EE. UU. 5.708.154, que describe la unión de ARN a un ADN para formar un híbrido ADN-ARN; la Patente de EE. UU. 5.728.525, que describe el marcaje de análogos de nucleósidos con una marca fluorescente universal.
Enseñanzas adicionales de análogos de nucleósidos y análogos de ácidos nucleicos están en la Patente de EE. UU. 55 5.728.525, que describe análogos de nucleósidos que están marcados en un extremo; la Patente de EE. UU. 5.637.683, 6.251.666 (sustituciones L-nucleótido) y 5.480.980 (nucleótidos 7-deaza-2’ desoxiguanosina y análogos de ácido nucleicos de los mismos).
El uso de otros análogos se contempla específicamente para su uso en el contexto de la presente invención. Tales análogos se pueden utilizar en moléculas de ácido nucleico sintético de la invención, en toda la molécula o en los 60
nucleótidos seleccionados. Incluyen, pero no se limitan a estos, 1) modificaciones en la ribosa (tal como 2’ F, 2’ NH2, 2’ N3, 4’ tio, o 2’ O-CH3) y 2) modificaciones fosfato (tales como los que se encuentran en los fosforotioatos, metil fosfonatos, y fosforoboratos). Tales análogos se han creado para conferir una estabilidad a los ARN reduciendo o eliminando su capacidad para ser escindido por ribonucleasas. Cuando estos análogos de nucleótidos están presentes en los ARN, puede tener efectos profundamente positivos en la estabilidad de ARN de animales. Se 5 contempla que el uso de análogos de nucleótidos se pueden utilizar solos o en conjunción con cualquiera de las modificaciones de diseño de un miARN sintético para cualquier ácido nucleico de la invención.
5. Nucleótidos modificados
Tanto los miARN como los inhibidores de miARN de la invención contemplan específicamente el uso de nucleótidos que se han modificado para aumentar sus actividades. Tales nucleótidos incluyen los que están en los extremos 5’ o 10 3’ del ARN así como los que están internamente en la molécula. Los nucleótidos modificados que se utilizan en las cadenas complementarias de los miARN sintéticos o bien bloquean el OH o fosfato 5’ del ARN o introducen modificaciones del azúcar internas que aumenta la captación de la cadena activa del miARN sintético. Las modificaciones por los inhibidores de miARN incluyen las modificaciones del azúcar interno que aumenta la hibridación así como la estabilidad de las moléculas en las células y las modificaciones de los extremos que 15 estabilizan más los ácidos nucleicos en las células. Se contemplan además las modificaciones que se pueden detectar por microscopía y otros procedimientos para identificar células que contienen miARN sintéticos o inhibidores de miARN.
B. Preparación de los ácidos nucleicos
Un ácido nucleico se puede preparar por cualquier técnica conocida por un experto en la técnica, tal como por 20 ejemplo, síntesis química, producción enzimática o producción biológica. Aunque los miARN sintéticos de acuerdo con la invención se podrían producir utilizando procedimientos recombinantes, se prefiere producir los miARN sintéticos por síntesis químicas o producción enzimática. Por otro lado, los inhibidores de miARN se producen preferentemente por síntesis química o producción enzimática. Los miARN no sintéticos se pueden producir por varios procedimientos, incluyendo los procedimientos que implican tecnologías de ADN recombinante. 25
La síntesis de ácido nucleico se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos de referencia. Véase, por ejemplo, Itakura y Riggs (1980). Adicionalmente, la Patente de EE. UU. 4.704.362, Patente de EE. UU. 5.221.619, y Patente de EE. UU. 5.583.013 describe cada una varios procedimientos para preparar ácidos nucleicos sintéticos. Ejemplos no limitantes de ácidos nucleicos sintéticos (por ejemplo, un oligonucleótido sintético), incluyen un ácido nucleico hecho por síntesis química in vitro utilizando química fosfotriéster, fosfita o fosforamidita y técnicas en fase sólida 30 tales como las descritas en el documento EP 266.032, incorporado en el presente documento por referencia, o por medio de desoxinucleósidos H-fosfonato intermedios como se describe en Froehler y col., 1986 y Patente de EE. UU. Serie Nº 5.705.629. En los procedimientos de la presente invención, se pueden utilizar uno o más oligonucleótidos. Se han desvelado varios mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótidos en por ejemplo, Patentes de EE. UU. 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 35 5.602.244.
Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico producido enzimáticamente incluye el producido por enzimas en reacciones de amplificación tales como PCR™ (véase por ejemplo, Patente de EE. UU. 4.683.202 y Patente de EE. UU. 4.682.195, incorporada cada una en el presente documento como referencia), o la síntesis de un oligonucleótido descrito en la Patente de EE. UU. Nº 5.645.897, incorporada en el presente documento por referencia. 40
La síntesis de oligonucleótidos se conoce bien por los expertos en la técnica. Se han desvelado varios mecanismos de síntesis de oligonucleótidos en por ejemplo las Patentes de EE. UU. 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244.
Básicamente, la síntesis química se puede conseguir por el procedimiento diéster, el procedimiento triéster, el procedimiento de polinucleótido fosforilasa y por química en fase sólida. Estos procedimientos se tratan 45 posteriormente.
Procedimiento diéster. El procedimiento diéster fue el primero que se desarrolló en estado utilizable, primariamente por Khorana y colaboradores. (Khorana, 1979). La etapa básica es la unión de dos desoxinucleótidos protegidos adecuadamente para formar un didesoxinucleótido que contiene un enlace fosfodiéster. El procedimiento diéster está bien establecido y se ha utilizado para sintetizar moléculas de ADN (Khorana, 1979). 50
Procedimiento triéster. La diferencia principal entre los procedimientos diéster y triéster es la presencia en el último de un grupo extra protector de los átomos de fosfato de los reactivos y productos (Itakura y col., 1975). El grupo protector del fosfato normalmente es un grupo clorofenilo, que hace solubles a los nucleótidos y polinucleótidos intermedios en disolventes orgánicos. Por lo que la purificación se hace en soluciones de cloroformo. Otras mejoras en el procedimientos incluyen (i) el bloqueo del emparejamiento de trímeros y oligómeros más grandes, (ii) el uso 55 extensivo de cromatografía líquida de altas prestaciones para la purificación de productos tanto intermedios como finales, y (iii) síntesis en fase sólida.
Procedimiento de polinucleótido fosforilasa. Este es un procedimiento enzimático de síntesis de ADN que se puede utilizar para sintetizar muchos oligonucleótidos útiles (Gillam y col., 1978; Gillam y col., 1979). Bajo condiciones controladas, la polinucleótido fosforilasa añade predominantemente un único nucleótido a un oligonucleótido corto. La purificación cromatográfica permite la purificación del añadido a obtener. Al menos se necesita un trímero para empezar el procedimiento, y este cebador se debe obtener por algún otro procedimiento. El 5 procedimiento de polinucleótido fosforilasa funciona y tiene la ventaja de que los procedimientos implicados son familiares para la mayoría de los bioquímicos.
Procedimientos en fase sólida. El avance en la tecnología de la síntesis en fase sólida de polipéptidos, ha sido posible al fijar el nucleótido inicial en un material de soporte sólido y se procede con la adición de nucleótidos por etapas. Todas las etapas de mezclado y lavado se simplifican, y el procedimiento se puede automatizar. Estas 10 síntesis se llevan a cabo actualmente de manera rutinaria utilizando sintetizadores automáticos de ácidos nucleicos.
La síntesis química con fosforamidita (Beaucage y Lyer, 1992) ha llegado a ser con mucho la técnica química de acoplamiento que se utiliza más ampliamente para la síntesis de oligonucleótidos. Como es bien conocido por los expertos en la técnica, la síntesis con fosforamidita de oligonucleótidos implica la activación de precursores de monómeros de nucleósido fosforamidita por la reacción con agente activador para formar intermedios activados, y 15 después por adición secuencial de intermedios activantes a la cadena de oligonucleótidos en crecimiento (generalmente anclada por un extremo a un soporte sólido adecuado) para formar el producto oligonucleótido.
Procedimientos recombinantes. Los procedimientos recombinantes para producir ácidos nucleicos en una célula son bien conocidos por los expertos en la técnica. Incluyen el uso de vectores, plásmidos, cósmidos, y otros vehículos para suministrar un ácido nucleico a una célula, que puede ser una célula diana o simplemente una célula 20 huésped (para producir grandes cantidades de la molécula de ARN deseada). De manera alternativa, tales vehículos pueden utilizarse en el contexto de un sistema libre de células siempre y cuando estén presentes los reactivos que generan la molécula de ARN. Tales procedimientos incluyen los que se describen en Sambrook, 2003, Sambrook, 2001 y Sambrook, 1989, que se incorpora en el presente documento por referencia.
En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que no son sintéticas. En 25 algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico tiene una estructura química de un ácido nucleico de origen natural, tal como la secuencia exacta y entera de un miARN primario de cadena sencilla (véase Lee, 2002), un precursor de miARN de cadena sencilla, o un miARN maduro de cadena sencilla. Además del uso de tecnología recombinante, tales ácidos nucleicos no sintéticos se pueden generar químicamente, tal como empleando la tecnología que se utiliza para crear oligonucleótidos. 30
C. Diseño de miARN sintéticos
Los miARN sintéticos comprenden típicamente dos cadenas, una cadena activa que es idéntica respecto a la secuencia del miARN maduro que se está estudiando y una cadena complementaria que es al menos parcialmente complementaria a la cadena activa. La cadena activa es la molécula biológicamente relevante y debería ser captada preferentemente por el complejo celular que modula la traducción, sea a través de degradación de ARNm o por 35 control traduccional. La captación preferente de la cadena activa tienen dos profundos resultados: (1) la actividad observada del miARN sintético aumenta drásticamente y (2) se eliminan esencialmente los efectos no deseados inducidos por la captación y activación de la cadena complementaria. De acuerdo con la invención, se pueden utilizar varios diseños de miARN sintéticos para asegurar la captación preferente de la cadena activa.
Agente bloqueante 5’. La introducción de un resto estable distinto de fosfato o hidroxilo en el extremo 5’ de la 40 cadena complementaria incapacita su actividad en la ruta del miARN. Esto asegura que solo se utilizará la cadena activa del miARN sintético para regular la traducción en la célula. Las modificaciones en 5’ incluyen, pero no se limitan a estas, NH2, biotina, un grupo amino, un grupo alquilamina inferior, un grupo acetilo, 2’O-Me, DMTO, fluoresceína, un tiol, o acridina o cualquier otro grupo de este tipo de funcionalidad.
Otras modificaciones de cadena en sentido. La introducción de modificaciones en nucleótidos tales como 2’-OMe, 45 NH2, biotina, un grupo amino, un grupo alquilamina inferior, un grupo acetilo, DMTO, fluoresceína, un tiol, o acridina o cualquier otro grupo con este tipo de funcionalidad en la cadena complementaria del miARN sintético puede eliminar la actividad de la cadena complementaria y aumenta la captación de la cadena activa del miARN.
Falta de coincidencia de bases en la cadena en sentido. Como con los ARNsi (Schwarz, 2003), la estabilidad relativa de los extremos 5’ y 3’ de la cadena activa del miARN sintético determina aparentemente la captación y 50 activación de la activa por la ruta del miARN. La desestabilización del extremo 5’ de la cadena activa del miARN sintético por la colocación estratégica de falta de coincidencias en el extremo 3’ de la cadena complementaria del miARN aumenta la actividad de la cadena activa y elimina esencialmente la actividad de la cadena complementaria.
E. Marcadores y marcas
Los miARN sintéticos se pueden marcar con un marcador o marca radioactiva, enzimática, colorimétrica, u otro 55 marcador o marca con fines de detección o aislamiento. Los ácidos nucleicos pueden marcarse con fluorescencia en algunas realizaciones de la invención. Los marcadores fluorescentes que se contemplan para el uso como
conjugados incluyen ,pero no se limitan a estos, Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, azul cascada, Cy3, Cy5, 6-FAM, Isotiocianato de fluoresceína, HEX, 6-JOE, Verde Oregón 488, verde Oregón 500, verde Oregón 514, Azul pacífico, REG, verde rodamina, Renografina, ROX, SYPRO, TAMRA, TET, Tetrametilrodamina, y/o Rojo Tejas.
Se contempla que los miARN sintéticos se pueden marcar con dos marcadores diferentes. Además se puede 5 emplear transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) en los procedimientos de la invención (por ejemplo, Klostermeier y col., 2002; Emptage, 2001; Didenko, 2001).
Hay disponibles varias técnicas para visualizar o detectar fácilmente los ácidos nucleicos marcados. La referencia de Stanley T. Crooke, 2000 trata tales técnicas (Capítulo 6) que se incorpora en el presente documento por referencia. Tales técnicas incluyen, microscopía, matrices, fluorometría, cicladores de luz u otras máquinas de PCR™ en tiempo 10 real, análisis FACS, contadores de centelleo, fosfocámaras, contadores Geiger, MRI, CAT, procedimientos de detección basados en anticuerpos (Westerns, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica), técnicas histoquímicas, HPLC (Griffey y col., 1997, espectroscopia, electroforesis en gel de capilaridad (Cummins y col., 1996), espectroscopia, espectroscopia de masas; técnicas radiológicas; y técnicas de equilibrio de masas. De manera alternativa, los ácidos nucleicos se pueden marcar para permitir su aislamiento eficaz. En otras realizaciones de la 15 invención, los ácidos nucleicos están biotinilados.
F. Procedimientos de suministro
La presente invención implica en algunas realizaciones el suministro de un ácido nucleico a una célula.
Las moléculas de ARN se pueden codificar por una molécula de ácido nucleico que está comprendido en un vector. El término “vector” se utiliza para referirse a una molécula portadora de ácido nucleico en la que se puede insertar 20 una molécula de ácido nucleico para su introducción en una célula donde pueda replicarse. Una secuencia de ácido nucleico puede ser “exógena”, que significa que es ajena a la célula en la que el vector se introduce o que la secuencia es homóloga a una secuencia de la célula pero en una posición en la que el ácido nucleico de la célula huésped no se encuentra normalmente. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales, y virus vegetales), y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un experto en la técnica estaría bien 25 equipado para construir un vector por medio de técnicas recombinantes de referencia, que se describen en Sambrook y col., 1989 y Ausubel y col., 1996. Además para codificar un polipéptido modificado tal como una gelonina modificada, un vector puede codificar secuencias de polipéptido no modificadas tales como un marcador o una molécula dirigida. Una molécula dirigida es la que dirige una molécula de ácido nucleico deseada a un órgano, tejido, célula, u otra localización en particular del cuerpo de un sujeto. 30
La expresión “vector de expresión” se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una parte de un producto génico capaz de ser transcrito. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de “secuencias de control”, que se refiere a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posible traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped en particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de 35 expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que sirven también para otras funciones y que se han descrito.
Hay varias formas en las que los vectores de expresión se pueden introducir en las células. En ciertas realizaciones de la invención, el vector de expresión comprende un virus o un vector modificado derivado de un genoma vírico. La capacidad de ciertos virus para entrar en las células por medio de endocitosis mediada por receptor, para integrarse 40 en el genoma de la célula huésped y expresar los genes víricos estable y eficazmente los ha hecho candidatos atractivos para la transferencia de genes ajenos en células de mamífero (Ridgeway, 1988; Nicolas y Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986). Los primeros virus utilizados como vectores víricos eran ADN virus incluyendo papovavirus (virus 40 de simio, virus del papiloma bovino, y polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986). Estos tienen una capacidad relativamente 45 baja para secuencias de ADN ajeno y tienen un espectro de huéspedes restringido. Además, su potencial oncogénico y sus efectos citopáticos en las células permisivas planteaban problemas de seguridad. Se pueden albergar en ellos solamente hasta 9 kb de material genético ajeno pero se pueden introducir fácilmente en una variedad de líneas celulares y animales de laboratorio (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986).
Los retrovirus son un grupo de ARN virus de cadena sencilla que se caracterizan por una capacidad para convertir 50 su ARN en ADN de doble cadena en las células infectadas; también se pueden utilizar como vectores. Se pueden emplear otros vectores víricos como construcciones de expresión en la presente invención. Se pueden emplear vectores derivados de virus tales como los virus vacunales (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar y col., 1988), virus adenoasociados (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Hermonat y Muzycska, 1984) y herpesvirus. Ofrecen varias características atractivas para varias células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 55 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar y col., 1988; Horwich y col., 1990).
Otros procedimientos adecuados para el suministro de ácidos nucleicos para efectuar la expresión de composiciones de la presente invención se cree que incluyen virtualmente cualquier procedimiento por los que un
ácido nucleico (por ejemplo, ADN, incluyendo vectores víricos y no víricos) se pueden introducir en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como podría conocer un experto en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero sin limitarse a estos, suministro directo de ADN tal como por inyección (Patentes de EE. UU. Nos 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), que incluye la microinyección (Harlan y Weintraub, 1985; Patente de EE. UU. Nº 5.789.215); 5 por electroporación (Patente de EE. UU. Nº 5.384.253); por precipitación en fosfato cálcico (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe y col., 1990); utilizando DEAE-dextrano y después polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer y col., 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene. 1982; Fraley y col., 1979; Nicolau y col., 1987; Wong y col., 1980; Kaneda y col., 1989; Kato y col., 1991); por bombardeo con microproyectiles (Solicitud PCT Nos WO 94/09699 y 95/06128; Patentes de EE. UU. Nos 5.610.042, 10 5.322.783, 5.563.055. 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y col., 1990; Patentes de EE. UU. Nos 5.302.523 y 5.464.765); por transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de EE. UU. Nos 5.591.616 y 5.563.055); o por transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh y col., 1993; Patentes de EE. UU. Nos. 4.684.611 y 4.952.500); por captación de ADN mediado por inhibición/ desecación (Potrykus y col., 1985). A través de la aplicación de técnicas tales como estas, se pueden transformar 15 estable o transitoriamente orgánulos, células, tejidos u organismos.
B. Suministro de miARN sintéticos
Se cree que los procedimientos adecuados para el suministro de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención incluyen virtualmente cualquiera de los procedimientos por los que un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, incluyendo vectores víricos y no víricos) se puede introducir en un orgánulo, una célula, un tejido o un 20 organismo, como se describe en el presente documento o como sería conocido por un experto en la técnica. Tales procedimientos incluyen, aunque no se limita a estos, el suministro directo de ácidos nucleicos tales como por inyección (Patente de EE. UU. Nos 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), que incluye la microinyección (Harlan y Weintraub, 1985; Patente de EE. UU. Nº 5.789.215); por electroporación (Patente de EE. UU. Nº 5.384.253); por precipitación en fosfato cálcico (Graham y Van Der Eb, 25 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe y col., 1990); utilizando DEAE-dextrano y después polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer y col., 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene. 1982; Fraley y col., 1979; Nicolau y col., 1987; Wong y col., 1980; Kaneda y col., 1989; Kato y col., 1991); por bombardeo con microproyectiles (Solicitud PCT Nos WO 94/09699 y 95/06128; Patentes de EE. UU. Nos 5.610.042, 5.322.783, 5.563.055. 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y 30 col., 1990; Patentes de EE. UU. Nos 5.302.523 y 5.464.765); por transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de EE. UU. Nos 5.591.616 y 5.563.055); o por transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh y col., 1993; Patentes de EE. UU. Nos 4.684.611 y 4.952.500); por captación de ADN mediado por inhibición/desecación (Potrykus y col., 1985). A través de la aplicación de técnicas tales como estas, se pueden transformar estable o transitoriamente orgánulos, células, tejidos u organismos. 35
Se han fijado a los extremos de los oligonucleótidos una variedad de compuestos para facilitar su transporte a través de las membranas celulares. Se ha descubierto que los péptidos cortos de señal encontrados en el VIH, TAT, HSV VP22, Drosophila antennapedia, y otras proteínas son capaces de la rápida transferencia de biomoléculas a través de membranas (revisado por Schwarze 2000). Estos péptidos de señal, a los que se designan como Dominios de Transducción Proteica (DTP), se han fijado a los oligonucleótidos para facilitar su suministro en células cultivadas. 40 Los colesteroles se han conjugado a oligonucleótidos para mejorar su captación por las células animales (MacKellar 1992). Los grupos de colesterol en los extremos aparentemente interactúan con los receptores o lípidos de las superficies de las células y facilitan la internalización de oligonucleótidos modificados. Asimismo, la poli-1-lisina se ha conjugado con oligonucleótidos para disminuir la carga negativa neta y mejorar la captación por las células (Leonetti 1990). 45
Se han desarrollado una variedad de compuestos que forman complejos con ácidos nucleicos, suministrarlos a las superficies de las células y facilitar su captación y la liberación a partir de los endosomas. Entre estos están: (1) una variedad de lípidos tales como DOTAP (u otro lípido catiónico), DDAB, DHDEAB, y DOPE y (2) polímeros basados en sustancias no lipídicas como la polietilenimina, poliamidoamina, y dendrímeros de estos y otros polímeros. En ciertas de estas realizaciones se emplea una combinación de lípidos tales como DOTAP y colesterol o una derivado 50 del colesterol (Patente de EE. UU. 6.770.291). Varios de estos reactivos han demostrado facilitar la captación de ácido nucleico en los animales.
Se han llegado a conocer los componentes celulares implicados en la ruta de miARN. Las proteínas que estabilizan y transportan miARN en las células pueden potenciar la estabilidad y actividad de los miARN porque deberían proteger y guiar el miARN al que se unen una vez que está en las células. Las mezclas de proteínas transportadoras 55 de miARN y los miARN podrían aumentar la eficacia de las terapias basadas en miARN.
Los ARN son moléculas hidrófilas gracias a su estructura de fosfato aniónico y azúcar. Aunque las bases nitrogenadas son hidrofóbicas, domina la hidrofilia debido a la unión extensa de hidrógeno que resulta de los restos de fosfato y azúcar. El carácter hidrófilo y la estructura aniónica reduce la penetración celular. La conjugación con grupos lipófilos como el colesterol (Manoharan, 2002) y los derivados del ácido láurico y litocólico con funcionalidad 60 C32 ha demostrado que (Lorenz y col., 2004), mejoran la captación celular. Además la unión de oligonucleótidos
conjugados con esteroides a diferentes lipoproteínas en la corriente sanguínea, tales como el LDL, protegen su integridad y gobiernan su biodistribución (Rump y col., 2000). También se ha demostrado que el colesterol unido a moléculas antisentido (Bijsterbosch y col., 2001) y aptámeros (Rusconi y col., 2004) estabilizan oligonucleótidos permitiendo la unión con lipoproteínas. Se ha demostrado que el colesterol aumenta la captación y la estabilidad en el suero de los ARNsi in vitro (Lorenz y col., 2004) e in vivo (Soutschek y col., 2004). Adicionalmente, varias 5 moléculas pequeñas como SB-435495 (Blackie y col., (2002), Isradipina (Oravcova y col., 1994), amlodipina (Oravcova y col., 1994) y 2,2’, 4,4’, 5,5’-hexaclorobifenilo (Borlakoglu y col., 1990) podrían aumentar la captación celular, y mejorar la resistencia a las nucleasas favoreciendo la asociación con lipoproteínas.
1. Nucleótidos para marcado
Los nucleótidos para marcado no son nucleótidos de origen natural, sino al contrario, se refiere a nucleótidos 10 preparados que tienen un resto reactivo en ellos. Los reactivos de interés con funcionalidades específicas incluyen: amino, sulfhidrilo, sulfoxilo, amino-sulfhidrilo, azido, epóxido, isotiocianato, anhídrido, monoclortriazina, pirimidina mono o dihalógeno sustituida, diazina mono o disustituida, maleimida, epóxido, aziridina, sulfonil halido, ácido hálido, alquil hálido, aril hálido alquilsulfonato, éster de N-hidroxisuccinimida, éster imido, hidrazina, azidonitrofenil, azida, 3-(2-piridil ditio)- propionamida, glioxal, aldehído, yodoacetilo, éster de cianometilo, éster de p-nitrofenilo, éster de o-15 nitrofenilo, éster de hidroxipiridina, imidazol de carbonilo, y otros de tales grupos químicos. En algunas realizaciones la funcionalidad reactiva se puede unir directamente a un nucleótido, o se puede unir al nucleótido por medio de un grupo de unión. El resto funcional y cualquier engarce no pueden sustancialmente alterar la capacidad del nucleótido que se va a añadir al miARN o que se va a marcar. Los grupos de unión representativos incluyen grupos de unión que contienen carbono, típicamente variando desde aproximadamente 2 a 18, normalmente desde 20 aproximadamente 2 a 8 átomos de carbono, donde los grupos de unión que contienen carbono pueden o no incluir uno o más heteroátomos, por ejemplo, S, O, N, etc., y pueden o no incluir uno o más sitios de insaturación. De particular interés en muchas realizaciones son los grupos de unión alquilo, típicamente grupos de unión alquilo de menos de 1 a 16, normalmente 1 a 4 átomos de carbono, en donde los grupos de unión puede incluir uno o más sitios no saturados. Los nucleótidos funcionalizados (o cebadores) que se usan en los procedimientos anteriores de 25 generación de diana funcionalizada se pueden fabricar utilizando protocolos conocidos o se pueden adquirir en los vendedores comerciales, por ejemplo, Sigma, Rocho, Ambion, y NEN. Los grupos funcionales se pueden preparar de acuerdo con las formas conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo la información representativa encontrada en las Pat. de EE. UU. Nos 4.404.289; 4.405.711; 4.337.063 y 5.268.486, y la Pat. Br. Nº 1.529.202.
Los nucleótidos amino modificados se utilizan en varias realizaciones de la invención. El nucleótido amino 30 modificado es un nucleótido que tiene un grupo amino reactivo para la unión del marcador. Se contempla que cualquier ribonucleótido (G, A, U, o C) o desoxirribonucleótido (G, A, T, o C) se pueden modificar para marcado. Ejemplos, incluyen, pero no se limitan a estos, los ribo y desoxirribonucleótidos modificados siguientes: 5-(3-aminoalil)-UTP; 8-[(4-amino) butil]-amino-ATP y 8-[(6-amino) butil]-amino-ATP; N6-(4-amino) butil-ATP, N6-(6-amino) butil-ATP, N4-[2,2-oxi-bis-(etilamina)]-CTP; N6-(6-Amino) hexil-ATP; 8-[(6-Amino) hexil]-amino-ATP; 5-propargilamino 35 -CTP, 5-propargilamino-UTP; 5-(3-aminoalil)-dUTP; 8-[(4-amino)butil]-amino-dATP y 8-[(6-amino) butil]-amino-dATP; N6-(4-amino) butil-dATP, N6-(6-amino) butil-dATP, N4-[2,2-oxi-bis-(etilamina)]-dCTP; N6-(6-Amino) hexil-dATP; 8-[(6-Amino) hexil]-amino-dATP; 5-propargilamino-dCTP, y 5-propargilamino-dUTP. Tales nucleótidos se pueden preparar según los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Además, un experto en la técnica podría preparar otras entidades de nucleótidos con la misma modificación amina, tales como un 5-(3-aminoalil)-CTP, GTP, 40 ATP, dCTP, dGTP, dTTP, o dUTP en lugar de un 5-(3-aminoalil)-UTP.
2. Técnicas de marcado
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se marcan por adición catalítica de un nucleótido o nucleótidos ya marcados al ácido nucleico. Se pueden añadir uno o más nucleótidos marcados a moléculas de miARN. Véase la Patente de EE. UU. 6.723.509. 45
En otras realizaciones, un nucleótido o nucleótido sin marcar se añade catalíticamente a un miARN, y el nucleótido sin marcar se modifica con un resto químico que le capacita para ser marcado posteriormente. En realizaciones de la invención, el resto químico es un reactivo amino tal que el nucleótido es un nucleótido amino modificado.
Ejemplos de nucleótidos amino modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica, muchos están disponibles comercialmente tal como en Ambion, Sigma, Jena Bioscience, y TriLink. 50
Al contrario que el marcado de ADNc durante su síntesis, el problema para marcar miARN es cómo marcar una molécula que ya existe. La presente invención se refiere al uso de una enzima capaz de utilizar un ribonucleótido o desoxirribonucleótido di o trifosfato como sustrato para su adición a un miARN, una molécula de ARN pequeña. Además en realizaciones específicas, implica el uso de un ribonucleótido di o trifosfato modificado, que se añade al extremo 3’ de un miARN. La fuente de la enzima no es limitante. Ejemplos de fuentes de enzimas incluyen 55 levaduras, bacterias gram-negativas tales como E. coli, Lactococcus lactis, y virus de la viruela ovina.
Las enzimas capaces de añadir tales nucleótidos incluyen, pero sin limitarse a estas, polimerasa poli (A), transferasa terminal, y polinucleótido fosforilasa. En realizaciones específicas de la invención, se contempla que la ligasa NO
sea la enzima utilizada para añadir un marcador, y en vez de ello, se utiliza una enzima no ligasa.
La polimerasa poli(A) se ha clonado a partir de varios organismos desde vegetales hasta humanos. Se ha demostrado que cataliza la adición de tractos de homopolímero al ARN (Martin y col., RNA, 4(2):226-30, 1998).
La transferasa terminal cataliza la adición de nucleótidos al extremo 3’ de un ácido nucleico.
La polinucleótido fosforilasa puede polimerizar difosfatos de nucleótidos sin necesidad de un cebador. 5
3. Marcadores
Los marcadores de los miARN o las sondas de miARN pueden ser colorimétricos (que incluyen el espectro visible y el UV, incluyendo los fluorescentes), luminiscentes, enzimáticos, o emisión de positrones (incluyendo los radioactivos). El marcador se puede detectar directa o indirectamente. Los marcadores radioactivos incluyen 125I, 32P, 33P, y 35S. Ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen fosfatasa alcalina, luciferasa, peroxidasa de rábano 10 rusticano, y -galactosidasa. Los marcadores pueden ser también proteínas con propiedades luminiscentes, por ejemplo, proteína fluorescente verde y ficoeritrina.
Los marcadores colorimétricos y fluorescentes contemplados para su uso como conjugados incluyen, pero no se limitan a estos, colorantes Alexa Flúor, colorantes BODIPY, tal como BODIPY FL; Cascada azul, Cascada amarillo; cumarina y sus derivados, tales como 7-amino-4-metilcumarina, aminocumarina e hidroxicumarina; colorantes de 15 cianina, tales como Cy3 y Cy5; eosinas y eritrosinas; fluoresceína y sus derivados, tales como isotiocianato de fluoresceína; quelados macrocíclicos e iones de lantánidos, tales como Quantum Dye™; Azul Marina; verde Oregón; colorantes de rodamina, tales como el rojo rodamina, tetrametilrodamina y rodamina 6G; Rojo Texas; colorantes de transferencia de energía fluorescente, tales como el heterodímero de etidio-tiazol naranja, y , TOTAB.
Ejemplos específicos de colorantes incluyen, pero sin limitarse a estos, los que se han identificado anteriormente y 20 los siguientes: Alexa Flúor 350, Alexa Flúor 405, Alexa Flúor 430, Alexa Flúor 488, Alexa Flúor 500. Alexa Flúor 514, Alexa Flúor 532, Alexa Flúor 546, Alexa Flúor 555, Alexa Flúor 568, Alexa Flúor 594, Alexa Flúor 610, Alexa Flúor 633, Alexa Flúor 647, Alexa Flúor 660, Alexa Flúor 680, Alexa Flúor 700, y, Alexa Flúor 750; colorantes amino-reactivos BODIPY, tales como BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/655, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, y, 25 BODIPY-TR; Cy3, Cy5, 6-FAM, Isotiocianato de Fluoresceína, HEX, 6-JOE, Verde Oregón 488, Verde Oregón 500, Verde Oregón 514, Azul pacífico, REG, Verde Rodamina, Rojo Rodamina, Renografina, ROX, SYPRO, TAMRA, 2’,4’,5’,7’-Tetrabromosulfona Fluoresceína, y TET.
Ejemplos específicos de ribonucleótidos marcados por fluorescencia están disponibles en Molecular Probes, y estos incluyen Alexa Flúor 488-5-UTP, Fluoresceína-12-UTP, BODIPY FL-14-UTP, BODIPY TMR-14-UTP, 30 TetrametilRodamina-6-UTP, Alexa Flúor 546-14-UTP, Rojo Texas-5-UTP, y BODIPY TR-14-UTP. Otros ribonucleótidos fluorescentes están disponibles en Amersham Biosciences, tales como Cy3-UTP y Cy5-UTP.
Ejemplos de desoxirribonucleótidos marcados por fluorescencia incluyen Dinitrofenil (DNP)-11-dUTP, Azul Cascada-7-dUTP, Alexa Flúor 488-5-dUTP, Fluoresceína-12-dUTP, Verde Oregón 488-5-dUTP, BODIPY FL-14-dUTP, Rodamina Verde-5-dUTP, Alexa Flúor 532-5-dUTP, BODIPY TMR-14-dUTP, TetrametilRodamina-6-dUTP, Alexa 35 Flúor 546-14-dUTP, Alexa Flúor 568-5-dUTP, Rojo Texas-12-dUTP, Rojo Texas-5-dUTP, BODIPY TR-14-dUTP, Alexa Flúor 594-5-dUTP, BODIPY 630/650-14-dUTP, BODIPY 650/665-14-dUTP; Alexa Flúor 488-7-OBEA-dCTP, Alexa Flúor 546-16-OBEA-dCTP, Alexa Flúor 594-7-OBEA-dCTP, Alexa Flúor 647-12-OBEA-dCTP.
Se contempla que los ácidos nucleicos se pueden marcar con dos marcadores diferentes. Además, se puede emplear la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) en procedimientos de la invención (por 40 ejemplo, Klostermeier y col., 2002; Emptage, 2001; Didenko, 2001, incorporados cada uno en el presente documento por referencia).
De manera alternativa, el marcador puede no ser detectable per se, sino indirectamente detectable o que es posible por el aislamiento o separación del ácido nucleico seleccionado. Por ejemplo, el marcador podría ser biotina, digoxigenina, cationes polivalentes, grupos quelantes y otros ligandos, incluidos ligandos para un anticuerpo. 45
4. Técnicas de visualización
Varias técnicas están disponibles fácilmente para visualizar o detectar los ácidos nucleicos marcados. La referencia de Stanley T. Crooke, 2000 trata tales técnicas (Capítulo 6), que se incorpora en el presente documento por referencia. Tales técnicas incluyen, microscopía, matrices, fluorometría, cicladores de luz y otras máquinas de PCR en tiempo real, análisis FACS, contadores de centelleo, fosfoimágenes, contadores Geiger, MRI, CAT, 50 procedimientos de detección basado en anticuerpos (Westerns, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica), técnicas histoquímicas, HPLC (Griffey y col., 1997), espectroscopia, electroforesis en gel de capilaridad (Cummins y col., 1996), espectroscopia; espectroscopia de masas; técnicas radiológicas; y técnicas de equilibrio de masas.
Cuando se emplean dos o más marcadores coloreados diferencialmente, se pueden emplear técnicas de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para caracterizar el ARNds. Además, un experto en la técnica está bien informado de formas de visualización, identificación, y caracterización de ácidos nucleicos marcados, y en consecuencia, tales protocolos se pueden utilizar como parte de la invención. Ejemplos de herramientas que también se pueden utilizar incluyen la microscopía fluorescente, un BioAnalyzer, un lector de 5 placas, Storm (Molecular Dynamics), escáner de matriz, FACS (clasificador celular activada fluorescente), o cualquier instrumento que tiene la capacidad de excitar y detectar una molécula fluorescente.
III. Aplicaciones terapéuticas
Los miARN sintéticos o inhibidores de miARN que afectan los rasgos fenotípicos proporcionan puntos de intervención para aplicaciones terapéuticas así como aplicaciones diagnósticas (por exploración de la presencia o 10 ausencia de un miARN particular). Se contempla específicamente que las moléculas de ARN de la presente invención se pueden utilizar para tratar el cáncer como se trató en la sección previa. Además, cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente también se puede emplear con respecto a los aspectos terapéuticos de la invención.
En las aplicaciones terapéuticas, una cantidad eficaz de los miARN sintéticos de la presente invención se 15 administran a una célula, la cual puede estar o no en un animal. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de los miARN sintéticos o inhibidores de miARN de la presente invención se administra a un individuo para el tratamiento del cáncer. La expresión “cantidad eficaz” como se utiliza en el presente documento se define como la cantidad de moléculas de la presente invención que es necesaria para dar como resultado el cambio fisiológico deseado en la célula o tejido al que se administra. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” como 20 se utiliza en el presente documento se define como la cantidad de moléculas de la presente invención que consiguen el efecto deseado con respecto al cáncer. Un experto reconoce fácilmente que en muchos casos las moléculas pueden no proporcionar una cura pero pueden proporcionar un beneficio parcial, tal como el alivio o la mejoría de al menos un síntoma. En algunas realizaciones, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio se considera terapéuticamente beneficioso. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una cantidad de moléculas que 25 proporcionan un cambio fisiológico se considera una “cantidad eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz”.
En algunas realizaciones la molécula tiene una secuencia que se corresponde con la secuencia de un miARN de ese animal en particular, en oposición al de otro animal. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se utiliza una secuencia humana en las moléculas de ARN de la presente invención.
A. Modos de administración y formulaciones 30
Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden administrarse a un sujeto solas o en forma de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de una manera convencional utilizando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables, diluyentes, excipientes o auxiliares que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la ruta de administración que se elija. 35
Para la administración tópica, las proteínas de la invención se pueden formular como soluciones, geles, ungüentos, cremas, suspensiones, etc. como se conocen bien en la técnica. Las formulaciones sistémicas incluyen las designadas para la administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, así como aquellas designadas para la administración vía transdérmica, transmucosa, inhalatoria, oral o pulmonar. Para inyección, los ácidos nucleicos de la invención se pueden formular en soluciones 40 acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hank, solución de Ringer, o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De manera alternativa, las moléculas de ácido nucleico pueden estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Para la administración transmucosa, en la formulación se utilizan penetrantes de barrera apropiados para que 45 se absorban. Tales penetrantes generalmente se conocen en la técnica. Para la administración oral, los ácidos nucleicos se pueden formular fácilmente combinando las moléculas con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos capacitan a los ácidos nucleicos de la invención para formularse como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares. Para las formulaciones sólidas vía oral tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos, los excipientes adecuados 50 incluyen cargas tales como azúcares, por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetil celulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP); agentes granulantes; y agentes aglutinantes. Si se desea se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona reticular, agar, o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato sódico. Si se desea, las 55 formas de dosificación sólida pueden estar revestidas con azúcar o revestimiento entérico utilizando técnicas de referencia. Para las preparaciones líquidas por vía oral tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, se pueden añadir, vehículos adecuados, excipientes o diluyentes incluyendo el agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Adicionalmente se pueden añadir, agentes saborizantes, conservantes, agentes colorantes y similares. Para la administración bucal, las moléculas pueden tomar la forma de comprimidos, comprimidos para chupar, etc. 60
formulados de una manera convencional. Para la administración por inhalación, las moléculas para su uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de un pulverizador en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad 5 medida. Las cápsulas y cartuchos de gelatina para su uso en un inhalador o insuflador se pueden formular de forma que contenga una mezcla en polvo de ácidos nucleicos y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Las moléculas de ARN también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contengan las bases para supositorios tales como la manteca de coco u otros glicéridos. 10
Además de las formulaciones descritas anteriormente, las moléculas pueden formularse también como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, las moléculas se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite adecuado) o resinas de intercambio de iones, o en derivados moderadamente solubles, por 15 ejemplo una sal moderadamente soluble.
De manera alternativa, se pueden utilizar otros sistemas farmacéuticos de suministro. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro que se pueden utilizar para suministrar los ácidos nucleicos de la invención.
Un ácido nucleico de la invención se puede administrar en combinación con un vehículo o lípido para aumentar la 20 captación celular. Por ejemplo, el oligonucleótido se puede administrar en combinación con un lípido catiónico. Ejemplos de lípidos catiónicos incluyen, pero sin limitarse a estos, lipofectina, DOTMA, DOPE, y DOTAP. La publicación WO0071096, por ejemplo, describe diferentes formulaciones, tales como DOTAP: formulación de colesterol o derivada de colesterol que se puede utilizar eficazmente para terapia genética. Otras divulgaciones también tratan diferentes formulaciones lipídicas o liposómicas incluyendo nanopartículas y procedimientos de 25 administración; estas incluyen, pero no se limitan a, Publicaciones de Patentes de EE. UU. 20030203865, 20020150626, 20030032615, y 20040048787. Los procedimientos para formar partículas se desvelan también en las Pat. de EE. UU. Nos 5.844.107, 5.877.302, 6.008.336, 6.077.835, 5.972.901, 6.200.801, y 5.972.900.
Los ácidos nucleicos se pueden administrar también en combinación con aminas catiónicas tales como la poli (L-lisina). Los ácidos nucleicos se pueden también conjugar con resto químico, tal como transferrina y colesterilos. 30 Además, los oligonucleótidos se pueden dirigir a ciertos orgánulos por unión específica de grupos químicos específicos al oligonucleótido. Por ejemplo, uniendo el oligonucleótido a una matriz adecuada de restos de manosa dirigirá el oligonucleótido al hígado.
Adicionalmente, las moléculas se pueden suministrar utilizando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido varios 35 materiales de liberación sostenida y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar las moléculas durante unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica de moléculas quiméricas, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de las moléculas.
Los ácidos nucleicos se pueden incluir en cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente como ácidos 40 libres o bases o como sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables son las sales que mantienen sustancialmente la actividad biológica de las bases libres y que se preparan por reacción con ácidos inorgánicos. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de bases libres.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de una o más 45 moléculas de miARN sintéticos o inhibidores de miARN disueltos o dispersos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las frases “farmacéutica o farmacológicamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o inadecuada cuando se administra a un animal, por ejemplo, un ser humano, como es apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un polipéptido quimérico o un principio activo adicional será conocida por un experto en la técnica a la luz de 50 la presente divulgación, como se ejemplifica en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para la administración a animales (por ejemplo, seres humanos), se entenderá que las preparaciones puede que necesiten cumplir con las referencias de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza que requiere la oficina de Referencias Biológicas de la FDA.
Como se utiliza en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los 55 disolventes, medios de dispersión, revestimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes de retraso de absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizadores de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, colorantes, tales como materiales y combinaciones de las mismas,
como sería conocido por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto si no es cualquiera de los vehículos compatibles con el principio activo, su uso se contempla en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
Las moléculas quiméricas pueden comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se van a administrar en forma sólida, líquida o en aerosol, y si se necesita, que estén estériles para tales vías de administración como las 5 inyecciones. La presente invención se puede administrar por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de un aerosol), por inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada, baño de células diana 10 directamente, por medio de un catéter, por medio de un lavado, en crema, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro procedimiento o cualquier combinación de los anteriores como conocería un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. Mack Printing Company, 1990).
La cantidad de dosificación actual de una composición de la presente invención que se administra a un paciente animal se puede determinar por factores físicos y fisiológicos tales como peso corporal, gravedad de la afección, el 15 tipo de enfermedad que se va a tratar, intervenciones terapéuticas concurrentes o previas, idiopatía del paciente y la ruta de administración. El médico responsable de la administración, determinará, en cada caso, la concentración de principio(s) activo(s) en una composición y la dosis adecuada(s) para un sujeto particular.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente el 0,1% de un principio activo. En otras realizaciones, el principio activo puede estar comprendido 20 entre aproximadamente un 2% a aproximadamente un 75% del peso de la unidad, o entre aproximadamente un 25% a aproximadamente un 60%, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable del mismo. En otros ejemplos no limitantes, una dosis puede también comprender desde aproximadamente un microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 25 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 30 miligramos/kg de peso corporal, a aproximadamente 10000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable del mismo. En ejemplo no limitantes de un intervalo derivable de los números listados aquí, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, etc., basándose en los números descritos anteriormente. 35
En cualquier caso, la composición puede comprender varios antioxidantes para retrasar la oxidación de uno o más componentes. Adicionalmente, se puede conseguir la prevención de la acción de microorganismos con conservantes tales como varios agentes antibacterianos y antifúngicos, incluyendo pero sin limitación, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.
Las moléculas se pueden formular en una composición en forma de bases libres, neutras o sales. Las sales 40 farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales por adición de ácidos, por ejemplo, las que se forman con los grupos amino libres de una composición proteinácea, o las que se forman con ácidos inorgánicos tales como por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como el acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas tales como por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos; o bases orgánicas tales como isopropilamina, 45 trimetilamina, histidina o procaína.
En realizaciones en las que la composición está en forma líquida, un vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que comprende pero no se limita a agua, etanol, poliol, (por ejemplo, glicerol, propilenglicol polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo, triglicéridos, aceites vegetales, liposomas) y combinaciones de los mismos. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de un revestimiento, tal como lecitina; por 50 el mantenimiento del tamaño de partícula que se necesita por dispersión en vehículos tales como, por ejemplo poliol líquido o lípidos; por el uso de tensioactivos tales como, por ejemplo hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de tales procedimientos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, tales como por ejemplo, azúcares, cloruro sódico o combinaciones de los mismos.
En otras realizaciones, se pueden utilizar gotas oftálmicas, soluciones nasales o pulverizadores, aerosoles o 55 inhalantes en la presente invención. Tales composiciones se diseñan generalmente para ser compatibles con el tipo de tejido diana. En un ejemplo no limitante, las soluciones nasales habitualmente son soluciones acuosas diseñadas para administrarse en los conductos nasales en gotas o pulverizadores. Las soluciones nasales se preparan de forma que son similares en muchos aspectos a las secreciones nasales, de forma que se mantenga la acción ciliar normal. Por lo tanto, en realizaciones preferidas las soluciones nasales acuosas son habitualmente isotónicas o 60
ligeramente tamponadas para mantener un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5. Además, se pueden incluir en la formulación conservantes antimicrobianos, similares a los que se utilizan en preparaciones oftálmicas, fármacos, o estabilizantes de fármacos apropiados, si es necesario. Por ejemplo, se conocen varias preparaciones nasales comerciales e incluyen fármacos tales como antibióticos o antihistamínicos.
En ciertas realizaciones, las moléculas se preparan para administración por vías tales como la ingestión oral. En 5 estas realizaciones, la composición sólida puede comprender, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas (por ejemplo, cápsulas con cubierta dura o blanda), formulaciones de liberación sostenida, composiciones bucales, trociscos, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, o combinaciones de los mismos. Las composiciones orales se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Vehículos preferidos para administración oral comprenden diluyentes inertes, vehículos comestibles asimilables o 10 combinaciones de los mismos. En otros aspectos de la invención, la composición oral se puede preparar como un jarabe o un elixir. Un jarabe o elixir que puede comprender, por ejemplo, al menos un principio activo, un agente edulcorante, un conservante, un agente saborizante, un colorante, un conservante, o combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones preferidas una composición oral puede comprender uno o más aglutinantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes saborizantes y combinaciones de los mismos. En ciertas 15 realizaciones, una composición puede comprender uno o más de los siguientes: un aglutinante, tal como, por ejemplo, goma de tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz, gelatina, o combinaciones de los mismos, un excipiente, tal como, por ejemplo, fosfato dicálcico, manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, celulosa, carbonato magnésico o combinaciones de los mismos; un agente disgregante, tal como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico o combinaciones de los mismos; un lubricante, tal como, por 20 ejemplo, estearato magnésico; un agente edulcorante, tal como, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina o combinaciones de las mismas; un agente saborizante, tal como, por ejemplo menta, aceite de gaulteria, saborizante de cereza, saborizante de naranja, etc.; o combinaciones de los anteriores. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, vehículos tales como un vehículo líquido. Otros varios materiales pueden estar presentes como revestimientos o de otra manera que modifiquen la 25 forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras, o cápsulas se pueden cubrir con goma laca, azúcar o ambas.
La composición debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe conservar contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se debe apreciar que la contaminación con endotoxinas se debería mantener mínimamente a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 30 ng/mg de proteína.
En realizaciones particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede llevar a cabo por el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
Cualquiera de las realizaciones tratadas anteriormente con respecto al suministro o transporte a las células también 35 se puede emplear con respecto a implementar el suministro de compuestos medicinales tratados en esta sección.
B. Dosificaciones eficaces
Las moléculas de la invención se utilizarán generalmente en una cantidad eficaz para alcanzar el fin que se pretende. Para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, las moléculas de la invención, o las composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad 40 terapéuticamente eficaz es una cantidad eficaz para mejorar o prevenir los síntomas, o prolongar la supervivencia de los pacientes que se tratan. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Para la administración sistémica, una dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de 45 ensayos in vitro. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración circulante que incluye la CI50 que se determina en un cultivo celular. Tal información se puede utilizar para determinar con más precisión las dosis útiles en seres humanos.
Las dosis iniciales también se pueden estimar a partir de datos in vivo, por ejemplo, con modelos animales, utilizando técnicas que se conocen bien en la técnica. Un experto habituado en la técnica podría fácilmente optimizar 50 la administración en seres humanos basándose en los datos de animales.
La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en el plasma de las moléculas que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones habituales en los pacientes para su administración por inyección varían desde aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg/día, preferentemente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Los niveles en suero terapéuticamente eficaces se pueden alcanzar 55 administrando múltiples dosis cada día.
En los casos de administración local o de captación selectiva, la concentración eficaz local de las proteínas puede no relacionarse con la concentración en el plasma. Un experto en la técnica será capaz de optimizar las dosificaciones terapéuticamente locales sin una experimentación innecesaria.
La cantidad de moléculas administradas dependerá, por supuesto, del sujeto que se vaya a tratar, del peso del sujeto, la gravedad de la afección, la manera de administración y el juicio el médico que las prescribe. 5
La terapia se puede repetir intermitentemente mientras son detectables los síntomas o incluso cuando no son detectables. La terapia puede proporcionarse sola o en combinación con otros fármacos o tratamientos (incluyendo la cirugía).
C. Toxicidad
Preferentemente, una dosis terapéuticamente eficaz de las moléculas descritas en el presente documento 10 proporcionará un beneficio terapéutico sin producir una toxicidad sustancial.
La toxicidad de las moléculas descritas en el presente documento se puede determinar por procedimientos farmacéuticos de referencia en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo determinando la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) o la DL100 (la dosis letal para el 100% de la población). La dosis de la relación entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Se prefieren las proteínas que muestran altos 15 índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios con animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosificación que no sea tóxico para su uso en seres humanos. La dosificación de las proteínas descrita en el presente documento se basa preferentemente en un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen dosis eficaces con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar en este intervalo de concentraciones circulantes dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de 20 administración utilizada. La formulación, vía de administración y dosificación exactas la puede elegir el médico individual en vista de la afección del paciente, (Véase, por ejemplo, Fingl y col., 1975, En: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Cáp.1, p.1).
D. Grupos laterales
Se puede fijar o conjugar un “grupo lateral” con un ácido nucleico. Los grupos laterales pueden aumentar la 25 captación celular del ácido nucleico. Los grupos laterales se pueden unir a cualquier parte del ácido nucleico pero comúnmente se unen a los extremos de la cadena de oligonucleótido. Ejemplos de grupos laterales incluyen, pero sin limitarse a estos: derivados de acridina (es decir, 2-metoxi-6-cloro-9-aminoacridina); reticulares tales como derivados del psoraleno, azidofenacilo, proflavina, y azidoproflavina; endonucleasas artificiales; complejos de metal tales como el EDTA-Fe (II), o-fenantrolina-Cu(I), y porfirina-Fe (II): restos alquilantes; nucleasas tales como nucleasa 30 amino-1-hexanolstafilocócica y fosfatasa alcalina; transferasas terminales; abzimas; restos de colesterilo; portadores lipofílicos; conjugados peptídicos; alcoholes de cadena larga; ésteres de fosfato; amino; grupos mercapto; marcadores radioactivos; marcadores no radioactivas tales como colorantes; y polilisina u otras poliaminas. En un ejemplo, el ácido nucleico se conjuga con un carbohidrato, carbohidrato sulfatado, o glucano.
Ejemplos 35
A menos de que se designe otra cosa, los números de catálogo se refieren a los productos disponibles en Ambion, Inc. con ese número.
Ejemplo 1:
Ensayo para medir la actividad de miARN precursores (indicadores)
Se crearon una serie de vectores indicadores de luciferasa para medir las actividades de los miARN sintéticos en las 40 células. Los vectores indicadores se basaron en plásmidos que se había utilizado para controlar la actividad de miARN endógenos (trabajo de Tuschl). En resumen, se creó un vector de expresión de mamífero con el gen de la luciferasa bajo el control del promotor precoz de CMV. Corriente abajo de la secuencia codificante de luciferasa, en la UTR 3’ del gen, se añadieron secuencias complementarias a miR-1-2, miR-10, miR-124, miR-19a, y miR-130 maduros. Los vectores indicadores se co-transfectaron en células HeLa junto con miARN sintéticos diseñados para 45 introducir uno de los cinco miARN enumerados anteriormente. Las transfecciones implicaban la mezcla de 200 ng de vector indicador con 0,3, 1, y 3 pmoles de cada uno de los miARN sintéticos correspondientes. La mezcla indicador/miARN se mezcló con 0,3 l de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y se incubó durante 5-15 minutos. Se añadieron aproximadamente 8.000 células a cada complejo miARN/indicador/reactivo de transfección en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Se cultivaron las células HeLa en D-MEM (GIBCO) suplementado con un 50 10% de suero fetal bovino (GIBCO) a 37 ºC y un 5% de CO2. A las 24-48 horas tras la transfección, las células se recolectaron y se ensayaron utilizando el ensayo de Luciferasa como describe el fabricante (Promega). El nivel de expresión de Luciferasa en las poblaciones celulares se comparó con las células transfectadas con el mismo indicador pero con un miARN sintético con una secuencia que no corresponde al vector. A este miARN no dirigido se le designó como el miARN control negativo. 55
El análisis final de los diseños de miARN implicaba la medición de la actividad tanto de la cadena activa como de la complementaria de los miARN de la invención. Para estos estudios, se crearon vectores indicadores con secuencias 3’ UTR de luciferasa que incluían regiones complementarias tanto a la cadena activa como a la complementaria de los diseños de miARN sintéticos miR-33 y let-7b de la invención. Cuando los indicadores se co-transfectan con miARN sintéticos que no funcionan, los indicadores con una secuencia seleccionada por la cadena complementaria 5 muestran una expresión de luciferasa reducida debido a que la cadena complementaria de los miARN sintéticos entran en la ruta de miARN además o incluso en vez de la cadena activa que es la que se desea. Para estos experimentos, los protocolos de co-transfección y análisis del indicador son idénticos a los descritos anteriormente.
Ejemplo 2
Ensayo para medir la actividad de miARN precursores (gen endógeno) 10
Como las construcciones de indicador de luciferasa eran extremadamente valiosas para evaluar los diseños de miARN sintético, era importante verificar los hallazgos de las construcciones indicadoras midiendo los efectos de los miARN sintéticos sobre los genes diana. Para estos estudios, se eligió como control la expresión de RAS y MYC en células transfectadas con miARN let-7. Tanto RAS como MYC están regulados negativamente por varios miembros de la familia let-7 en seres humanos y C. elegans. Utilizando un sistema de micromatrices específico para miARN, 15 los inventores encontraron que las células HepG2 expresaban niveles no detectables de let-7. Para ensayar las actividades de los varios diseños de miARN de la invención, se crearon miARN let-7 y se utilizaron para transfectar HepG2 en placas de 24 pocillos utilizando siPORT NeoFx (Ambion) según las sugerencias del fabricante. La reducción relativa en la expresión de la proteína diana en las células transfectadas con let-7 sintético se determinó comparando la intensidad de tinción de MYC y RAS con las células transfectadas con un miARN control negativo 20 utilizando el software MetaMorph.
Para asegurarse de que los resultados de los ensayos del let-7 de la invención se podría verificar por interacciones adicionales de miARN que se observan en las células naturalmente, los inventores han creado ensayos para dos miARN adicionales con dianas verificadas. En el primero, se ha desarrollado un ensayo PCR™ en tiempo real para medir el nivel de ARNm HOXB8 en células transfectadas con el miR-196 sintético. Se ha demostrado que el miR-25 196 induce la degradación de ARNm HOXB8 en las células. Cuando se transfectaba en células cultivadas utilizando siPORT NeoFx según las instrucciones del fabricante, los diseños eficaces de miARN sintéticos miR-196 reducen los niveles de ARNm HOXB8.
Para controlar la eficacia de los miARN sintéticos miR-1-2, se creó un vector indicador en el que la UTR 3’ del gen G6PD se situara inmediatamente corriente abajo de la región codificante de la luciferasa. Se ha publicado una 30 interacción entre miR-1-2 y UTR 3’ G6PD (Lewis, 2003). Los diseños de miR-1-2 sintético se co-transfectaron con el vector indicador y se ensayaron como se describe en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Efectividad de miARN parcialmente complementarios
Se compararon tres secuencias generales de diseños en cuanto a la actividad de miARN. La primera, a la que se 35 designa como “diseño miARN”, presentaba una cadena activa idéntica al miARN maduro que se encuentra en animales y una cadena complementaria que era idéntica a una secuencia en horquilla que se predecía que existía en las células durante el procesamiento del miARN antes de la activación del miARN (véase posteriormente). El segundo diseño, al que se designa como “diseño sin coincidencia”, era un híbrido de la misma cadena activa anterior con una cadena complementaria con un dinucleótido, protuberante en 3’ y dos faltas de coincidencia en los cinco 40 nucleótidos finales que precedían a la protuberancia en 3’ (véase posteriormente). El tercer diseño, designado como “diseño ARNsi”, comprende la misma cadena activa anterior hibridada con un segundo ARN que era totalmente complementario excepto por que dejaba protuberancias de dinucleótido 3’ o bien en el final de la molécula de doble cadena (dos polinucleótidos) (véase posteriormente). Los ejemplos posteriores implican o se corresponden con miARN humanos. 45
miR-1-2
secuencia de miR-1-2 maduro - UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (53-73 of SEC ID Nº 1)
diseño miARN = CAUACUUCUUUAUAUGCCCAUA (SEC ID Nº 594) + UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (SEC ID Nº 595)
diseño sin coincidencia = CAUACUUCUUUACAUUCUGTT (SEC ID Nº 596) + UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA 50 (SEC ID Nº 597)
diseño ARNsi = CAUACUUCUUUACAUUCCATT (SEC ID Nº 598) + UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (SEC ID Nº 599)
mir-124a-1
secuencia miR-124 maduro - UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (52-73 of SEC ID Nº 80)
diseño miARN = GUGUUCACAGCGGACCUUGAUU (SEC ID Nº 600) + UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEC ID Nº 601)
diseño sin coincidencia = GCAUUCACCGCGUGCCUUGGTT (SEC ID Nº 602) + UUAAGGCACGCGGUGAAU 5 GCCA (SEC ID Nº 603)
diseño ARNsi = GCAUUCACCGCGUGCCUUAATT (SEC ID Nº 604) + UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEC ID Nº 605)
miR-130a
secuencia miR-130 maduro - CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (55-74 of SEC ID Nº 91) 10
diseño miARN = UCUUUUCACAUUGUGCUAC (SEC ID Nº 606) + CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (SEC ID Nº 607)
diseño sin coincidencia = UAUUUUAACAUUGCACUGTT (SEC ID Nº 608) + CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (SEC ID Nº 609)
diseño ARNsi = CCUUUUAACAUUGCACUGTT (SEC ID Nº 610) + CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (SEC ID Nº 15 611)
miR-19a
secuencia miR-19a maduro - UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA (49-71 of SEC ID Nº 28)
diseño miARN = AGUUUUGCAUAGUUGCACUA (SEC ID Nº 612) + UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA (SEC ID Nº 613) 20
diseño sin coincidencia = ACAUUUGCAUAGAUUUGCACATT (SEC ID Nº 614) + UGUGCAAAUCUAUGCAAAA CUGA (SEC ID Nº 615)
diseño ARNsi = AGUUUUGCAUAGAUUUGCACATT (SEC ID Nº 616)+ UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA (SEC ID Nº 617)
mmu-miR-10a-1 (ratón) 25
secuencia miR-10 maduro - UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (22-44 of SEC ID Nº 212)
diseño miARN = CAAAUUCGUAUCUAGGGGAAUA (SEC ID Nº 618) + UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (SEC ID Nº 619)
diseño sin coincidencia = AGAAUUCGGAUCUACAGGGUATT (SEC ID Nº 620) + UACCCUGUAGAUCCGAAU UUGUG (SEC ID Nº 621) 30
diseño ARNsi = CAAAUUCGGAUCUACAGGGUATT (SEC ID Nº 622) + UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (SEC ID Nº 623)
miR-33
secuencia miR-33 maduro - GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (6-24 of SEC ID Nº 57)
miARN = AUGUUUCCACAGUGCAUCA (SEC ID Nº 624) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº 625) 35
diseño sin coincidencia = GUCCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº 626) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº 627)
diseño ARNsi = AUGCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº 628) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº 629)
let-7b 40
secuencia let-7b maduro - UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (6-27 of SEC ID Nº 6)
diseño miARN = CUAUACAACCUACUGCCUUCC (SEC ID Nº 630) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEC ID Nº 631)
diseño sin coincidencia = CCACACAACCUACUAUCUUATT (SEC ID Nº 632) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUG GUU (SEC ID Nº 633) 45
diseño ARNsi = CCACACAACCUACUACCUCATT (SEC ID Nº 634) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEC ID Nº 635)
miR-196-2
secuencia miR-196 maduro - UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGG (7-27 of SEC ID Nº 143)
diseño ARNsi = AACAACAUGAAACUACCUATT (SEC ID Nº 636) + UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGG (SEC ID 50 Nº 637)
diseño miARN = CAAAUUCGUAUCUAGGGGAAUA (SEC ID Nº 638) + UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGG (SEC ID Nº 639)
diseño sin coincidencia = AAUAACAUGAAACUACCUATT (SEC ID Nº 640) + UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGG (SEC ID Nº 641) 55
Se ensayó la capacidad de varios miARN sintéticos miR-1-2, mmu-miR-10a-1, miR-19a, miR-124a-1, y miR-130a para reducir la expresión del gen indicador en vectores con sitios diana apropiados para miARN utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 1. Los tres diseños fueron capaces similarmente de regular negativamente los vectores indicadores adecuados.
Para evaluar si había diferencias entre los distintos diseños de miARN en su capacidad para afectar la expresión de 5 los genes endógenos, se transfectaron las siguientes células: células HepG2 con tres diseños de los miARN sintéticos let-7, A549 con tres diseños de miARN sintéticos miR-196, y HeLa con el vector indicador G6PD y tres diseños del miARN sintético miR-1-2. Como con los vectores indicadores, los tres diseños miARN sintéticos eran capaces de reducir la expresión de los genes diana, aunque hay que destacar que el diseño ARNsi lo llevaba a cabo más pobremente. 10
Como comparación final de los tres diseños de miARN sintéticos, los miARN sintéticos se co-transfectaron con los vectores indicadores que incluyen sitios diana para las cadenas complementarias de los miARN sintéticos según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. En este ensayo, era aparente que el diseño ARNsi afectaba significativamente los vectores indicadores, indicando que la cadena errónea del miARN entraba en la ruta del miARN (FIG. 3). Debido a que la cadena complementaria puede impactar en la expresión de genes que no son 15 dianas naturales del miARN que se están estudiando, el diseño ARNsi es inapropiado para los miARN sintéticos eficaces.
Ejemplo 4
Eficacia de miARN sintéticos modificados quimicamente en el extremo 5’
Aunque el diseño ARNsi se mostró problemático porque mostraba una alta tasa de captación de la cadena 20 complementaria por la ruta miARN, tenía la ventaja de que era fácil de hibridar y fácil de suministrar a las células. Por estas razones, se exploraron las maneras de superar los problemas con la captación de las cadenas complementarias. El diseño ARNsi se utilizó para ensayar los efectos de las modificaciones químicas en los extremos 5’ de los miARN sintéticos. Para estos estudios, se sintetizaron varias cadenas complementarias diferentes con extremos 5’ únicos. Una de ellas mostraba cuatro nucleótidos desoxirribosa en el extremo 5’; otro era una 25 combinación de cuatro nucleótidos desoxirribosa en el extremo 5’ y un NH2 5’; otro tenía un NH2 5’; otro tenía un 5’ NHCOCH3 (véase posteriormente).
miR-33
secuencia miR-33 maduro - GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (6-24 de SEC ID Nº 57) 30
diseño ARNsi = AUGCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº 642) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº 643)
diseño 5’ amino = (NH2) AUGCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº 644) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº 645)
diseño 5’ acetilo = (CH3OCNH) AUGCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº 646) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG 35 (SEC ID Nº 647)
diseño 5’ DNA = dAdUdGdCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº 648) + GUGCAUUGUAGUUGCAUUG (SEC ID Nº 649)
diseño 5’ amino DNA = (NH2) dAdUdGdCAACUACAAUGCACTT (SEC ID Nº 650) + GUGCAUUGUAGUUGCAU UG (SEC ID Nº 651) 40
let-7b
secuencia let-7b maduro - UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (6-27 de SEC ID Nº 6)
diseño ARNsi = CCACACAACCUACUACCUCATT (SEC ID Nº 652) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEC ID Nº 653)
diseño 5’ amino = NH2 CCACACAACCUACUACCUCATT (SEC ID Nº 654) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGU 45 U (SEC ID Nº 655)
diseño 5’ DNA = dCdCdAdCACAACCUACUACCUCATT (SEC ID Nº 656) + UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU
(SEC ID Nº 657)
diseño 5’ amino DNA = NH2 dCdCdAdCACAACCUACUACCUCATT (SEC ID Nº 658) + UGAGGUAGUAGGUUG UGUGGUU (SEC ID Nº 659) 50
miR-1-2
secuencia miR-1-2 maduro - UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (53-73 of SEC ID Nº 1)
diseño ARNsi = CAUACUUCUUUACAUUCCATT (SEC ID Nº 660) + UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA (SEC ID Nº 661)
diseño 5’ amino = NH2 CAUACUUCUUUACAUUCCATT (SEC ID Nº 662) + UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA 55 (SEC ID Nº 663)
miR-124a-1
secuencia miR-124 maduro - UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (52-73 of SEC ID Nº 80)
diseño ARNsi = GCAUUCACCGCGUGCCUUAATT (SEC ID Nº 664) + UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEC ID Nº 665)
diseño 5’ amino = NH2 GCAUUCACCGCGUGCCUUAATT (SEC ID Nº 666) + UUAAGGCACGCGGUGAAUGCC 5 A (SEC ID Nº 667)
miR-130a
secuencia miR-130 maduro - CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (55-74 of SEC ID Nº 91)
diseño ARNsi = CCUUUUAACAUUGCACUGTT (SEC ID Nº 668) + CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (SEC ID Nº 669) 10
diseño 5’ amino = NH2 CCUUUUAACAUUGCACUGTT (SEC ID Nº 670) + CAGUGCAAUGUUAAAAGGGC (SEC ID Nº 671)
miR-10a-1
secuencia miR-10 maduro - UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG (22-44 of SEC ID Nº 212)
diseño ARNsi = CAAAUUCGGAUCUACAGGGUATT (SEC ID Nº 672) + UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG 15
(SEC ID Nº 673)
diseño 5’amino = NH2 CAAAUUCGGAUCUACAGGGUATT (SEC ID Nº 674) + UACCCUGUAGAUCCGAAUUUG UG (SEC ID Nº 675)
Los miARN sintéticos miR-33 y let-7b se co-transfectaron en células HeLa y HepG2, respectivamente, con vectores indicadores que tenían sitios diana para las cadenas activa y complementaria de miR-33 y let-7b como se describe 20 en el Ejemplo 1. La expresión de luciferasa de los vectores indicadores específicos de cadena complementaria y activa se midieron según el protocolo del fabricante (Promega). Como se muestra en la FIG.3, los diseños miARN sintéticos con el 5’ NH2 y 5’ NHCOCH3 proporcionaban una actividad mayor de la cadena activa y reducía significativamente la actividad de la cadena complementaria con respecto a los miARN sintéticos sin modificar. Esto es ideal para los miARN sintéticos puesto que los efectos que se ven después de la transfección serán específicos 25 de la actividad de la cadena activa del miARN sintético. Además, la alta eficacia de los diseños modificados en 5’ permitirá que se utilicen menores concentraciones en las transfecciones y se reduce la toxicidad que se observa a menudo cuando se transfectan las células con cantidades mayores de ácido nucleico.
Para confirmar que la modificación 5’ amino es superior a los diseños ARNsi de referencia en un amplio grupo de miARN, se midió la eficacia de ambos diseños de miARN sintético en células co-transfectadas con vectores 30 indicadores con sitios diana de miARN. Como se aprecia en la FIG. 4, el 5’ NH2 es superior de manera reproducible al diseño sin modificar de ARNsi.
Ejemplo 5
Selección de miARN en la biblioteca de miARN sintéticos que tiene influencia en la proliferación celular
Una característica distintiva del cáncer es la proliferación celular incontrolada; habitualmente los investigadores 35 utilizan ensayos de proliferación celular para estudiar la influencia de los genes en la oncogénesis. Se utilizó un ensayo de proliferación celular en conjunción con la biblioteca de inhibidores de miARN para identificar los miARN que tenían influencia sobre la proliferación celular.
Los inventores transfectaron por triplicado células HeLa con quince miARN sintéticos diferentes utilizando siPORT NeoFx (Ambion) según las instrucciones del fabricante (FIG. 6). Se analizaron las células HeLa utilizando Azul 40 Alamar (BioSource International, Inc., CA) a intervalos de 24 h. El Azul Alamar es un compuesto, que cuando se reduce en el metabolismo celular, cambia de un color azul no fluorescente a una forma roja fluorescente que es fácilmente cuantificable. La cantidad de Azul Alamar reducido es directamente proporcional al número de células, proporcionando un procedimiento rápido para evaluar la proliferación celular. Para llevar a cabo el ensayo, se añadió el reactivo Azul Alamar en el medio de cultivo tisular con una concentración final del 10%. Se incubó la mezcla 45 durante 3-6 h en condiciones de crecimiento tras lo cual se cuantificó la fluorescencia utilizando un Spectra Max™ GeminisXS™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las células transfectadas con miR-124 y miR-106 sintéticos mostraban una proliferación menor que las muestras transfectadas con el control negativo, así como las muestras transfectadas con los otros miARN sintéticos.
Ejemplo 6 50
Selección de miARN en la biblioteca de inhibidores de miARN que tienen influencia en la proliferación celular
Una característica distintiva del cáncer es la proliferación celular incontrolada. Los investigadores utilizan habitualmente ensayos de proliferación para estudiar la influencia de los genes en la oncogénesis. Se utilizó un
ensayo de proliferación en conjunción con la biblioteca de miARN inhibidor para identificar los miARN que tenían influencia en la proliferación celular.
Se transfectaron las células con una biblioteca de unos 90 inhibidores de miARN para identificar los miARN que están implicados en el crecimiento celular. Las células HeLa (8.000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos) se transfectaron por triplicado con 5 pmoles de inhibidores de miARN utilizando siPORT™ NeoFx™ (Ambion). Los 5 medios se cambiaron a las 24 h tras la transfección. A las 72 h tras la transfección, los inventores fijaron las células con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con 0,1% de TritonX 100, y se tiñeron con yoduro de propidio para ver el número total de células. Las placas se exploraron utilizando el TTP LabTech Acumen Explorer. El número de células se representó en relación a las células transfectadas con un inhibidor de miARN control negativo (FIG. 7). Las barras rojas horizontales agrupan la variación normal en la proliferación celular (variación del 20%). Inserciones: 10 Los inhibidores de miARN específicos que o bien aumentan la proliferación celular (flecha izquierda) o que no afectan la proliferación celular (flecha derecha) se utilizaron en una segunda ronda de selección. Las células HeLa se transfectaron con estos inhibidores de miARN y se fijaron y tiñeron las células con un anticuerpo anti b-actina y DAPI para visualizar los cambios en la morfología celular en respuesta a la función del miARN específico. Las células se transfectaron con el inhibidor de miARN que aumentaba la proliferación celular mostraba una marcada 15 alteración de la morfología celular (inserción izquierda) frente a la morfología normal (inserción derecha).
Se identificó un grupo de nueve inhibidores de miARN (miR 31, 150, 187, 125a, 190, 191, 193, 204 y 218) que producían descensos significativos del crecimiento celular y dos inhibidores de miARN que producían un aumento significativo (miR 24 y miR 21) del crecimiento celular después de la transfección en las células HeLa (Tabla 4). La inhibición de miARN-31 también producía una morfología celular distintiva. Se eligió un punto de corte del 20% por 20 encima y del 100% por debajo como genes que se consideraban cambiados significativamente. Estos resultados demuestran la capacidad de los miARN individuales humanos para regular procesos celulares importantes, Además, la diversidad de los efectos demuestra la complejidad potencial del os resultados celulares de la regulación de la expresión genética mediada por miARN.
Tabla 4. miARN que afectan la proliferación celular 25
miARN
Impacto relativo sobre la proliferación celular
miR-31
Regulación positiva
miR-150
Regulación positiva
miR-187
Regulación positiva
miR-125a
Regulación positiva
miR-190
Regulación positiva
miR-191
Regulación positiva
miR-193
Regulación positiva
miR-204
Regulación positiva
miR-218
Regulación positiva
miR-21
Regulación negativa
miR-24
Regulación negativa
Ejemplo 7
Selección de miARN en la biblioteca de miARN sintéticos que tienen influencia sobre la apoptosis
Muchas enfermedades, incluyendo el cáncer, se caracterizan por una incapacidad para instaurar la muerte celular programada, o apoptosis. Se utilizó un ensayo de actividad de caspasa 3/7 en conjunción con una biblioteca de 30 miARN sintético para identificar miARN que están implicados en la regulación de la apoptosis celular.
Se utilizó una biblioteca de dieciocho miARN sintéticos para transfectar por triplicado células A549 (8.000 células por pocillo de una placa de 96 pocillos) utilizando siPORT™ NeoFx™ (Ambion). El medio se cambió tras 24 h y se inspeccionaron visualmente las células bajo un microscopio para inspeccionar cualitativamente la muerte celular 72 h tras la transfección. Las células se midieron para valorar la apoptosis calculando actividad de la caspasa 3 de la 35 siguiente manera: 1) Se lavaron las células una vez con PBS y se congelaron a -80 ºC. 2). Se lisaron las células añadiendo 40 l de tampón de lisado frío (HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 40 mM, NP40 0,5%, EDTA 0,5 mM) en los pocillos y se incubó durante 20 min a 4 ºC. 3) Se añadió 160 µl de tampón ICE (HEPES 50 mM pH 7,4, CHAPS al 0,1%, EDTA 0,1 mM, un 10% de sacarosa) + DTT 5 mM que contiene sustrato DEVDafc 20 m. 4) Se midió el aumento de fluorescencia en una hora a 400 ex, 505 em. 40
Las células transfectadas con los miARN sintéticos miR-1-2 y miR-33 mostraban una actividad de la caspasa 3/7 reducida y las células transfectadas con miR-20 mostraban niveles de apoptosis mucho más altos. Estos tres miARN probablemente regulan genes que están implicados en el control de la apoptosis.
Ejemplo 8
Selección de miARN que tienen influencia en la viabilidad celular 45
Los inhibidores de miARN también se utilizaron para identificar los miARN que tenían influencia en la viabilidad celular. Una biblioteca de unos 90 inhibidores de miARN se utilizó para transfectar por triplicado células A549 (8.000 células/pocillo de placas de 96 pocillos) utilizando siPORT™ NeoFx™ (Ambion). El medio se cambió tras 24 h y las células se inspeccionaron visualmente bajo un microscopio para inspeccionar cualitativamente la muerte celular 72 horas después de la transfección. Las células se tripsinizaron y se tiñeron con el Reactivo ViaCount Flex, que 5 distingue entre células viables y no viables basándose en la permeabilidad de ADN que se une a los colorantes del reactivo. Las células se analizaron utilizando PCA-96 Guava (Análisis Celular Personal).
Veintiún inhibidores de miARN inducían una relación de células vivas con respecto a las muertas significativamente diferente de lo que lo hacía el inhibidor de miARN control negativo (FIG, 8). Doce reducían la viabilidad celular y nueve aumentaban la viabilidad celular (Tabla 5). Resulta interesante que había un pequeño solapamiento entre los 10 miARN que afectaban la viabilidad celular en células A549 y los que afectaban la proliferación celular en células HeLa, sugiriendo que las diferentes células responden de manera diferente al hecho de tener actividades reducidas de miARN o que la viabilidad celular y la proliferación celular no están afectadas por las mismas rutas celulares.
Tabla 5. miARN que afectan la viabilidad celular
miARN
Impacto relativo sobre la viabilidad celular
miR-7
Bajo
miR-19a
Bajo
miR-23
Bajo
miR-24
Bajo
miR-27a
Bajo
miR-31
Bajo
miR-32
Bajo
miR-134
Bajo
miR-140
Bajo
miR-150
Bajo
miR-192
Bajo
miR-193
Bajo
miR-107
Alto
miR-133
Alto
miR-137
Alto
miR-152
Alto
miR-155
Alto
miR-181a
Alto
miR-191
Alto
miR-203
Alto
miR-215
Alto
Ejemplo 9 15
Selección de miARN que tienen influencia sobre la apoptosis
La apoptosis es un proceso celular natural que ayuda al control del cáncer induciendo la muerte en las células con potencial oncogénico. Muchos oncogenes funcionan alterando la inducción de la apoptosis. Para identificar la participación en la apoptosis, se usó un ensayo de apoptosis con la biblioteca de inhibidores de miARN.
Utilizando una biblioteca de unos 90 inhibidores de miARN, los inventores seleccionaron los miARN que afectaban a 20 la apoptosis. Se transfectaron por triplicado células HeLa (8.000 células/pocillo de placas de 96 pocillos) con inhibidores de miARN (5 pmoles) utilizando siPORT™ NeoFx™. El medio se cambió 24 h después de la transfección y las células se procesaron 72 horas después de la transfección. Se calculó la apoptosis de las células midiendo la actividad de la caspasa 3 de la siguiente manera: 1) Se lavaron las células una vez con PBS y se congelaron a -80 ºC. 2) Se lisaron las células añadiendo 40 l de tampón de lisado frío (HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 40 mM, NP40 25 0,5%, EDTA 0,5 mM) en los pocillos y se incubó durante 20 min a 4 ºC. 3) Se añadió 160 µl de tampón ICE (HEPES 50 mM pH 7,4, CHAPS al 0,1%, EDTA 0,1 mM, un 10% de sacarosa) + DTT 5 mM que contiene sustrato DEVDafc 20 m. 4) Se midió el aumento de fluorescencia en una hora a 400 ex, 505 em.
Se analizó también el número de células de las muestras utilizando un ensayo general de esterasa para normalizar los resultados de la caspasa 3. Se diluyó sustrato FDA (0,4 mg/ml de diacetato de fluoresceína (FDA) en acetonitrilo) 30 1:19 en tampón de dilución (TrisCl 40 mM pH 7,5, NaCl 20 mM, 0,5% NP-40, con una concentración final de 0,02 mg/ml). Se añadieron 40 l de tampón (TrisCl 40 mM pH 7,5, 0,5% NP-40) a cada pocillo de muestra. Las muestras se incubaron 20 minutos en hielo. Se añadieron 160 l de sustrato FDA diluido a cada pocillo. Se midió la
fluorescencia durante 30 min a 37 ºC (ex = 488, em = 529). La pendiente de fluorescencia aumenta en el tiempo en función del número de células en la placa.
Los datos de selección normalizados se presentan en la FIG. 9. Los miARN que afectan a la apoptosis se enumeran en la Tabla 6.
Tabla 6. miARN que afectan a la apoptosis 5
miARN
Impacto relativo sobre la proliferación celular
miR-31
Bajo
miR-214
Bajo
miR-7
Alto
miR-1-2
Alto
miR-148
Alto
miR-195
Alto
miR-196
Alto
miR-199a
Alto
miR-204
Alto
miR-210
Alto
miR-211
Alto
miR-212
Alto
miR-215
Alto
miR-216
Alto
miR-218
Alto
miR-296
Alto
miR-321
Alto
Ejemplo 10
Análisis de expresión utilizando ARN sintéticos
Además del uso de los ensayos fenotípicos para identificar los miARN que tienen influencia sobre los procesos celulares importantes o rutas celulares, se pueden utilizar colecciones de miARN sintéticos y/o inhibidores de miARN para identificar los miARN que regulan directamente la expresión de un gen. Se creó un plásmido que tenía un gen 10 de luciferasa inmediatamente corriente arriba del UTR 3’ del gen G6PD. Se co-transfectaron células A549 con el vector reportador y 18 miARN sintéticas diferentes. Veinticuatro horas después de la transfección se midió la actividad luciferasa. En las diversas poblaciones de luciferasa resultó interesante que mir-1-2 redujo de forma significativa la expresión del gen de luciferasa, indicando que esta familia de miARN regula la expresión del gen G6PD. Se utilizaron experimentos similares para identificar los miARN que regulan la expresión de genes 15 importantes tales como p53, BRCA1 y BRCA2, RAS, MYC, BCL-2, y otros.
Ejemplo 11
Expresión diferencial de miARN oncogénicos y regulación en el cáncer
Como se ha señalado en los ejemplos previos, se han identificado varios miARN que se expresan diferencialmente entre las muestras tumorales y de tejido normal adyacente de los mismos pacientes de cáncer. Resulta interesante 20 que haya un solapamiento significativo en los miARN que se expresan diferencialmente en los distintos cánceres, sugiriendo que hay un grupo central de miARN que tienen influencia en los procesos celulares que cuando se alteran, dan lugar a cáncer. A continuación se describen experimentos con el fin de desarrollar un vínculo entre la mala regulación del miARN y el cáncer.
Expresión de miARN en cáncer de pulmón 25
Se analizaron veintidós muestras tumorales y de tejido normal adyacente (TNA) de pacientes con cáncer de pulmón utilizando el sistema de matrices de miARN descrito anteriormente. Se analizaron las matrices y se comparó la expresión relativa de cada miARN entre el tumor y los tejidos normales adyacentes de cada paciente. Se agruparon los distintos miARN basándose en su expresión relativa en tumores a través de los diferentes pacientes (FIG. 14). Se expresaban seis miARN (miR-126, 30a, 143, 145, 188, y 331) a niveles significativamente bajos en los tumores 30 en más del 70% de los pacientes. Se expresaban dos miARN (miR-21 y 200b) a niveles significativamente más altos en los tumores de más del 70% de los pacientes. La expresión diferencial de varios de estos miARN se verificó por análisis de Northern (FIG. 15).
Expresión de miARN en cáncer de colon
Se analizaron veinticinco muestras de tumores y TNA de pacientes de cáncer de colon utilizando el proceso de 35 matrices de miARN de la invención. Como en las comparaciones en el cáncer de pulmón, se agruparon distintos miARN basándose en su expresión relativa en los tumores en los diferentes pacientes de cáncer de colon (FIG. 14).
Se expresaban cinco miARN (miR-143, 145, 195, 130a, y miR-331) a niveles significativamente más bajos en los tumores de más del 70% de los pacientes. Se expresaban cinco miARN (miR-223, 21, 31, 17, y 106) a niveles significativamente más altos en los tumores de más del 70% de los pacientes.
miARN como marcadores de cáncer
Es interesante que ocho miARN diferentes se expresaran diferencialmente entre las muestras del tumor y del tejido 5 adyacente normal en la mayoría de las muestras de pacientes de tumor de pulmón y colon que analizaron los inventores (FIG. 16). Se encontró también que estos mismos miARN se expresaban diferencialmente en los pacientes de cáncer de mama, timo, vejiga, páncreas, y próstata que analizaron los inventores, sugiriendo que estos miARN podían controlar procesos celulares que cuando se alteran dan lugar al cáncer.
miARN como reguladores de la expresión de oncogenes 10
Para abordar si miARN específicos pueden ser partícipes en el cáncer por medio de la mala regulación de los oncogenes, se exploraron regiones 3’ sin traducir (UTR) de 150 oncogenes bien conocidos para hallar secuencias con una homología significativa con los miARN identificados en el análisis de micromatrices de la invención. Se seleccionaron los sitios diana potenciales basándose en dos criterios:
(1) Complementariedad perfecta entre las posiciones 2-9 del miARN y el oncogén. Esta secuencia central de 15 miARN se ha identificado como crítica para las actividades de los miARN y los sitios diana de miARN tienen esencialmente un 100% de complementariedad en este sitio (Doench y col., 2004).
(2) Interacción total de Tm del miARN/ARNm. Además de la secuencia central, la estabilidad total de unión entre los miARN y los ARNm ha demostrado ser un indicador importante de la actividad del miARN (Doench y col., 2004). 20
Como se aprecia en la Tabla 8, se identificaron los sitios diana potenciales en las UTR 3’ de los oncogenes conocidos para todos los miARN en los que se observó rutinariamente su expresión diferencial en las muestras tumorales. Resulta interesante que KRAS2, MYCL1, y CBL tienen múltiples sitios de unión de miARN previstos que podrían proporcionar uniones cooperativas de miARN lo que se ha implicado como un factor importante en la regulación de miARN (Doench y col., 2003; Zeng y col., 2003). Muchos de los genes enumerados en la Tabla 8 se 25 convierten en oncogénicos cuando se sobre-expresan, por lo tanto se concibe que la expresión reducida de un miARN podría dar lugar a la regulación positiva de uno o más de los oncogenes y en consecuencia dan lugar a oncogénesis.
Tabla 8: miARN relacionados con el cáncer y sus supuestas dianas oncogénicas
miARN
Diana genética prevista
let-7
RAS
let-7
C-MYC
miR-21
Homólogo 2 mutS (MSH2)
miR-21
Homólogo del oncogén vírico v-ski sarcoma (aviar) (SKI)
miR-143
Región de punto de rotura del grupo (BCR)
miR-143
Secuencia transformante derivada de la línea celular MCF.2 (MCF2)
miR-143
Supresor tumoral de von Hippel-Lindau (VHL)
miR-143
homólogo del oncogén vírico del sarcoma 2 de la rata Kirsten v-Ki-ras2 (KRAS2)
miR-143
homólogo del oncogén vírico del sarcoma 2 de la rata Kirsten v-Ki-ras2 (KRAS2)
miR-143
Secuencia transformante retrovírica ecotrópica (murina) Cas-Br-M (CBL)
miR-143
Secuencia transformante retrovírica ecotrópica (murina) Cas-Br-M (CBL)
miR-145
Oncogén vírico relacionado con la mielocitomatosis v-myc (MYCN)
miR-145
Receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR2)
miR-145
Secuencia transformante retrovírica ecotrópica Cas-Br-M (murina) (CBL)
miR-188
Homólogo 1 del oncogén vírico de la mielocitomatosis (MYCL1)
miR-200b
Cadherina 13 (CDH13)
miR-200b
Homólogo del oncogén vírico Hardy-Zuckerman 4 del sarcoma felino v-kit (KIT)
miR-219
Homólogo 1 del oncogén vírico de la mielocitomatosis (MYCL1)
miR-219
CLL de linfocitos B /linfoma 2 (BCL2)
miR-219
Cadherina 1, tipo 1, E-cadherina (epitelial) (CDH1)
miR-331
Oncogén vav 1 (VAV1)
miR-331
Receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR1)
miR-331
Antagonista BCL2/citolítico 1 (BAK1)
miR-331
Receptor del ácido retinoico, alfa (RARA)
miR-331
Homólogo del oncogén vírico del sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) v-src (SRC)
Ejemplo 12
Medición del efecto de los miARN sobre la expresión oncogénica
La confirmación de las predicciones de sitios diana de miARN se pueden hacer de varias maneras. En Drosophila y C. elegans, se han aplicado estrategias genéticas en las que se hicieron mutaciones en el miARN y los supuestos 5 sitios diana de miARN y mostraron un resultado de fenotipos similares (Ha y col., 1996; Vella y col., 2004). En las células de mamíferos, en las que las estrategias genéticas son mucho más difíciles, se han utilizado construcciones indicadoras para mostrar que las UTR 3’ de los supuestos genes diana están regulados en las células a niveles que están desproporcionadas con respecto a los vectores indicadores de control que contienen mutaciones en los supuestos sitios de unión de miARN (Lewis y col., 2003). Además, se han utilizado vectores y oligonucleótidos para 10 introducir o inhibir miARN en las células para determinar efectos sobre los niveles endógenos de los supuestos genes diana (Lewis y col., 2003; Kiriakidou y col. 2004). La última estrategia se ha emprendido para validar las predicciones de los sitios diana de miARN.
Se han desarrollado miARN e inhibidores de miARN que pueden transfectarse en células de mamíferos para introducir miARN en las células o para inhibir la actividad de miARN en las células, respectivamente. Véase USSN 15 60/627.171. Un miARN sintético y un inhibidor de miARN que corresponden al let-7b se utilizaron para determinar si la predicciones del sitio diana eran correctas. En estos experimentos, las células cultivadas que expresan niveles indetectables del miARN se transfectaron con el miARN sintético utilizando el agente de transfección siPORT™ NeoFx™ (Ambion). Se utilizaron ensayos de inmunofluorescencia para RAS y C-MYC en las células transfectadas. Las proteínas de ambos oncogenes se expresaban a niveles casi tres veces más bajos en las células transfectadas 20 con el miARN sintético que en las células transfectadas con el miARN negativo de control (Ambion). En un experimento recíproco, las células que expresan naturalmente altos niveles del miARN se transfectaron con el inhibidor del miARN let-7. Como se esperaba, las proteínas de ambos oncogenes eran mayores en las células transfectadas con el inhibidor del miARN que en las células transfectadas con el inhibidor negativo de control (Ambion). Estos resultados son coherentes con el modelo de que el miARN regula la expresión de los dos 25 oncogenes. Estos datos sugieren que la mala regulación de un miARN clave podría participar en la progresión del cáncer por el fallo en la regulación de la expresión de uno o más oncogenes.
Ejemplo 13
Selección de miARN en la biblioteca de miARN sintéticos que tienen influencia en la proliferación celular y la viabilidad celular en varios tipos celulares 30
Una característica distintiva del cáncer es la proliferación celular incontrolada; habitualmente los investigadores utilizan ensayos de proliferación celular para estudiar la influencia de los genes en la oncogénesis. Se utilizó un ensayo de proliferación celular en conjunción con la biblioteca de inhibidores de miARN para identificar los miARN que tenían influencia sobre la proliferación celular.
Las células HeLa (cáncer ovárico humano) y A549 (cáncer de pulmón humano) se transfectaron por triplicado con 35 150 miARN sintéticos utilizando siPORT NeoFx (Ambion) según las instrucciones del fabricante. Los 150 son los siguientes: let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7g, miR-1, miR-7, miR-9, miR-10a, miR-10b, miR-15a, miR-16, miR-18, miR-19a, miR-17-3p, miR-20, miR-21, miR-22, miR-23a, miR-23b, miR-24, miR-25, miR-26a, miR-27a, miR-28, miR-29a, miR-31, miR-32, miR-30a-3p, miR-34a, miR-92, miR-95, miR-96, miR-98, miR-99a, miR-100, miR-101, miR-103, miR-105, miR-107, miR-108, miR-122, miR-124, miR-125a, miR-125b, miR-126, miR-128, miR-129, miR-132, 40 miR-133A, miR-133B, miR-134, miR-135, miR-136, miR-137, miR-139, miR-140, miR-141, miR-142, miR-143, miR-144, miR-145, miR- 146, miR-147, miR-148, miR-149, miR-150, miR-151, miR-152, miR-153, miR-155, miR-181a, miR-182, miR-183, miR-184, miR-186, miR-187, miR-188, miR-190, miR-191, miR-192, miR-193, miR-194, miR-195, miR-196, miR-197, miR-198, miR-199, miR-201, miR-203, miR-204, miR-205, miR-206, miR-207, miR-208, miR-210, miR-211, miR-212, miR-214, miR-215, miR-216, miR-217, miR-218, miR-219, miR-220, miR-221, miR-223, miR-224, 45 miR-299, miR-301, miR-302, miR-320, miR-322, miR-323, miR-325, miR-324-3p, miR-328, miR-330, miR-331, miR-335, miR-337, miR-338, miR-339, miR-340, miR-345, miR-346, miR-367, miR-368, miR-369, miR-370, miR-371, miR-372, miR-373, miR-374, mumiR-290, mu-miR-291, mu-miR-92-3p, mu-miR-293, mu-miR-294, mu-miR-295, mu-miR-297, mu-miR-298, mu-miR-329, mu-miR-341, mu-miR-344, mu-miR-351, mu-miR-376b, mu-miR-380-3p, mu-miR-409, mu-miR-411, mu-miR-412. 50
Los miARN sintéticos eran moléculas de ácido nucleico de cadena doble, compuestos por una cadena activa y una cadena complementaria. La cadena activa contenía una secuencia que era idéntica al correspondiente miARN maduro. La cadena complementaria contenía una secuencia que era un 100% complementaria con la región relevante de la secuencia de miARN maduro, pero 1) carecía de dos nucleótidos en su extremo 3’ que fueran complementarios con la secuencia de miARN maduro (en el extremo 5’ de la cadena activa) y 2) tenía un 55 dinucleótido protuberante en su extremo 5’ con respecto a la cadena activa. En otras palabras, las dos cadenas eran
completamente complementarias entre sus secuencias excepto en que cada cadena tenía un dinucleótido 5’ protuberante con respecto a la otra cadena. Se utilizó el mismo tipo de miARN para los siguientes Ejemplo(s) también. Se describen posteriormente algunas excepciones. Los miARN indicados en las tablas identifican el miARN que se corresponde con la secuencia sintética proporcionada.
Se electroporaron linfocitos Jurkat (células de leucemia humana) y linfocitos T primarios humanos por triplicado con 5 el mismo grupo de miARN sintéticos utilizando siPorter-96 (Ambion) según las instrucciones del fabricante. Se analizaron todas las células para hallar las células viables y no viables 72 horas después de la transfección utilizando PCA-96 (Guava) con el Ensayo Viacount. El número de células viables es el número de células vivas en un pocillo en el momento del ensayo. Los números proporcionados en las tablas posteriores son iguales al número medio de células viables en los pocillos transfectados con un miARN en particular dividido por el número de células 10 viables en los pocillos transfectados con miARN sintéticos negativos de control multiplicado por 100 para dar lugar al % de Viabilidad Celular de las células transfectadas con miARN con respecto a las células transfectadas con el control negativo.
La significación se asignó basándose en los valores medios de las muestras transfectadas con el control negativo. Los miARN que eran significativamente diferentes a los controles negativos se calificaron como “significativos” 15 basándose en que fueran al menos dos desviaciones estándar por encima o por debajo de los datos del control negativo.
La secuencia de miARN-325 es 5’- ccuaguagguguccaguaagugu-3’.
TABLA 9
miARN que reducen significativamente la viabilidad celular de células HeLa
% de Viabilidad desv. estánd.
miR-345
75 5,9
miR-346
77,8 8,2
miR-193
79,6 14,7
miR-206
79,6 6,5
miR-337
80,8 3,1
mmu-miR-293
82,6 1,7
miR-299
84,0 4,0
mmu-miR-329
84,5 4,5
mmu-miR-409
86 2,8
mmu-miR-292-3p
86,2 2,8
miR-210
86,4 5,1
mmu-miR-344
86,4 5,3
mmu-miR-298
86,7 4,2
miR-208
87,4 4,5
miR-197
87,6 7,5
miR-217
87,9 3,5
miR-1
88,2 9,0
miR-124
88,8 4,2
20
TABLA 10
miARN que reducen el número de células viables de células HeLa
Células Totales desv. estánd.
Let-7b
16,2 8,1
Let-7g
22,7 8,2
Let-7c
24,1 7,2
miR-124
24,5 3,4
Let-7a
25,4 1,2
Let-7d
37,3 2,3
miR-337
37,5 16,9
miR-1
38,7 2,2
miR-299
38,9 4,2
miARN que reducen el número de células viables de células HeLa
Células Totales desv. estánd.
miR-34a
40,5 13,3
mmu-miR-292
41,2 8,3
miR-122
41,2 6,5
miR-346
41,9 4,3
(Continuación)
miARN que reducen el número de células viables de células HeLa
Células Totales desv. estánd.
miR-101
43,4 6,4
miR-210
47,1 8,4
miR-147
47,7 8,2
miR-98
50,6 2,6
miR-345
51,8 6,8
miR-92
52,4 6,8
miR-96
53,2 0,9
miR-7
54,0 5,3
miR-133b
55,9 3,1
miR-206
56,0 12,4
mmu-miR-297
56,0 5,7
miR-19a
57,2 20,6
mmu-miR-344
57,5 14,1
miR-205
58,9 18,7
miR-208
60,5 11,1
TABLA 11
miARN que aumentan significativamente el número de células de células HeLa
Células Totales desv. Estánd.
miR-32
142,9 25,4
mu-miR-290
143,5 17,6
miR-212
143,5 10,4
miR-92
144,7 16,8
miR-323
147,3 25,9
miR-145
148,1 22,2
miR-324
148,2 9,0
miR-198
152,1 67,8
miR-27a
156,2 13,4
miR-369
158,4 27,3
miR-31
159,3 16,1
miR-335
161,7 20,8
mmu-miR-351
162,3 6,9
miR-370
164,3 4,5
miR-325
169,6 19,8
miR-331
172,5 24,0
miR-139
181,3 11,2
TABLA 12 5
miARN que reducen significativamente la viabilidad celular de células A549
% de Viabilidad desv. Estánd.
miR-193
92,4 2,5
miR-224
92,5 1,4
miR-96
92,6 0,1
miR-346
93,9 1,6
mmu-miR-293
94,9 0,7
miR-34a
95 0,2
(Continuación)
miARN que reducen significativamente la viabilidad celular de células A549
% de Viabilidad desv. Estánd.
miR-216
95,1 1,0
mmu-miR-380
95,2 0,8
miR-182
95,6 0,8
miR-301
95,6 1,0
mmu-miR-344
95,8 0,2
mmu-miR-409
95,8 0,6
miR-369
95,9 0,7
TABLA 13
miARN que reducen significativamente el número de células viables en células A549
Número de células desv. Estánd.
miR-124
44,3 2,2
miR-16
52,9 1,3
miR-337
54,7 7,0
miR-195
59,3 6,7
miR-34a
60,8 2,1
miR-15a
60,9 3,7
miR-28
61,3 0,8
Let-7g
61,9 0,8
mmu-miR-292
62,2 2,3
mmu-miR-344
62,6 9,1
miR-7
62,9 4,6
miR-193
63,7 3,3
miR-137
63,9 1,3
miR-147
64,8 0,5
miR-29a
67,0 3,8
miR-129
67,2 3,3
miR-22
67,5 3,4
miR-126
68,0 2,6
miR-345
69,2 7,4
miR-192
69,5 5,9
Let-7b
70,2 2,2
Let-7d
70,5 2,7
miR-346
70,9 7,1
TABLA 14 5
miARN que aumentan significativamente el número de células viables en A549
Células Totales desv. estánd.
miR-373
110,4 7,9
miR-25
111,8 6,0
mmu-miR-294
112,1 5,9
miR-32
120,8 4,3
miR-92
122,4 4,0
TABLA 15
miARN que reducen significativamente la viabilidad celular de los linfocitos Jurkat
% de Viabilidad desv. estánd.
let-7a
20,54 0,70
miR-10b
35,98 2,92
let-7b
48,79 5,08
miR-17-3p
61,55 15,63
miR-30a-3p
64,36 26,60
miR-34a
65,45 20,44
miR-122
65,63 17,80
miR-29a
66,44 7,14
miR-101
67,44 29,56
miR-133a
71,51 17,82
miR-19a
71,77 23,79
miR-32
75,59 11,69
miR-1
75,74 12,92
miR-132
76,32 16,22
miR-28
77,07 16,58
miR-20
77,60 15,23
miR-134
78,96 1,75
TABLA 16
miARN que aumentan significativamente la viabilidad celular de linfocitos Jurkat
Células totales desv. estánd.
miR-181-a
122,77 22,40
miR-9
124,63 9,98
miR-141
126,08 24,03
miR-98
126,24 11,90
miR-10a
126,86 8,93
miR-125b
128,71 3,50
miR-126
130,69 18,20
miR-100
130,77 14,60
miR-23b
132,18 3,50
miR-140
135,73 4,08
miR-155
142,57 22,40
miR-15a
143,01 11,29
miR-129
146,94 9,92
miR-25
150,25 17,85
miR-143
158,74 1,86
miR-26a
166,09 13,65
TABLA 17 5
miARN que reducen significativamente la viabilidad celular en linfocitos T primarios
% de Viabilidad desv. estánd.
miR-184
61,04 12,16
miR-145
68,98 11,23
miR-186
69,64 6,99
miR-139
69,85 0,29
miR-134
71,90 22,42
miR-190
75,59 2,43
miR-144
77,13 4,18
(Continuación)
miARN que reducen significativamente la viabilidad celular en linfocitos T primarios
% de Viabilidad desv. estánd.
miR-183
77,71 2,86
miR-147
78,09 0,33
miR-140
78,70 5,81
miR-155
79,26 10,68
TABLA 18
miARN que aumentan significativamente la viabilidad celular de linfocitos T primarios
% de Viabilidad desv. estánd.
miR-126
120,81 40,08
miR-10b
121,28 18,86
miR-17
122,46 3,71
miR-10a
124,11 9,46
miR-20
124,75 13,60
let-7c
124,81 4,00
miR-125a
125,66 5,13
miR-15a
129,07 10,96
let-7b
130,11 13,48
let-7a
130,88 16,16
miR-18
131,73 1,75
Resulta interesante señalar que los miARN que afectan un tipo celular a menudo no afectan otros tipos celulares. 5 Esto se debe probablemente al hecho de que los procesos celulares que están activos varían entre los distintos tipos celulares. Esto puede ser vitalmente importante cuando se considera el potencial de las terapias basadas en miARN. Las células anormales (enfermas) son diferentes de las células normales debido al hecho de que están activos procesos celulares diferentes en los dos tipos de células. Sería ideal identificar los miARN que tienen efectos diferenciales sobre las células normales y anormales ya que podrían suministrarse globalmente y se esperaría que 10 solamente tengan un efecto sobre células enfermas. Cuando se compararon los datos de viabilidad celular de las células de leucemia (linfocitos T cancerosos) y los linfocitos T primarios, se notó que let-7a, let-7b, y miR-10b, reducían significativamente el porcentaje de células viables en las células de leucemia, mientras que no tenían esencialmente ningún efecto en los correspondientes linfocitos T normales. Estos miARN eran candidatos a fármacos para la leucemia. 15
Ejemplo 14
Selección de miARN que tienen influencia en la apoptosis
La apoptosis es un proceso celular natural que ayuda al control del cáncer induciendo la muerte de las células con un potencial oncogénico. Muchos oncogenes funcionan alterando la inducción de la apoptosis. Para identificar los miARN que participan en la apoptosis, se utilizó un ensayo de apoptosis con la biblioteca de inhibidores de miARN. 20
Se transfectaron por triplicado células HeLa (8000 células/pocillo de placas de 96 pocillos) con más de 150 miARN sintéticos (descritos anteriormente) (3 pmoles) utilizando el Ambion siPORT™ NeoFx™. Se cambió el medio a las 24 h después de la transfección y se procesaron las células 72 h tras la transfección. Se midió la apoptosis de las células midiendo la actividad de la caspasa 3 de la manera siguiente: 1) Las células se lavaron una vez con PBS y se congelaron a – 80 ºC. 2) Las células se lisaron añadiendo 40 l de tampón de lisado frío (50 mM HEPES pH 7,2, 25 40 mM de NaCl, 0,5% de NP40, 0,5 mM EDTA) en los pocillos y se incubaron durante 20 min a 4 ºC. 3) Se añadieron 160 l de tampón ICE (50 mM HEPES pH 7,4, 0,1% de CHAPS, 0,1 mM de EDTA, 10% de sacarosa) + 5 mM de DTT que contiene 20 uM de sustrato DEVDafc. 4) Medición del aumento de fluorescencia en una hora a 400 ex., 505 em.
Se analizó también el número de células de las muestras utilizando un ensayo general de esterasa para normalizar 30 los resultados de caspasa 3. Se diluyó el sustrato FDA (0,4 mg/ml de diacetato de fluoresceína (FDA) en acetonitrilo) 1:19 en un tampón de dilución (40 mM TrisCl pH 7,5, 20 mM de NaCl, 0,5% de NP-40, con una concentración final de 0,02 mg/ml). Se añadieron 40 l de tampón (40 mM TrisCl, pH 7,5, 0,05% de NP-40) a cada pocillo de muestra. Las muestras se incubaron durante 10 min en hielo. Se añadieron 160 ul de sustrato FDA diluido a cada pocillo. La fluorescencia se midió durante 30 min a 37 grados (ex = 488, em = 529). El aumento de la pendiente de 35 fluorescencia con el tiempo es una función del número de células en la placa.
Los miARN que afectan a la apoptosis se enumeran en la tabla siguiente. Estos miARN regulan aparentemente las rutas que dan lugar a la apoptosis. La mala regulación de estos miARN podría inducir apoptosis en las células o pueden evitar que las células sufran apoptosis. La introducción o inhibición de estos miARN en células cancerosas (u otras enfermedades) que han superado la señalización de las rutas de apoptóticas o en células del Parkinson (u otras enfermedades) que se han inducido prematuramente a la apoptosis, podrían utilizarse para tratar las 5 enfermedades.
TABLA 20
miARN que aumentan significativamente el porcentaje de células apoptóticas
Cambio relativo en células apoptóticas desv. estánd.
miR-338
773,46 69,82
miR-27a
607,24 150,08
miR-128
594,42 260,06
miR-23a
473,44 208,82
miR-324
442,99 101,03
miR-22
439,13 62,59
miR-181a
409,97 65,14
mmu-miR-293
403,86 53,41
mmu-miR-412
402,27 42,04
miR-196
378,13 28,15
miR-31
373,90 61,39
Let-7d
369,10 88,94
miR-23b
360,68 81,97
mu-miR-290
354,90 46,63
miR-217
347,38 56,49
miR-199
345,75 67,55
miR-24
317,43 62,85
miR-214 miR-198
312,25 303,24 7,38 44,25
TABLA 21
miARN que disminuyen significativamente el porcentaje de células apoptóticas
Cambio relativo en células apoptóticas desv. estánd.
miR-105
39,97 8,91
miR-34a
37,75 8,41
miR-96
31,89 13,40
mmu-miR-292
30,72 4,27
miR-126
28,71 4,24
miR-137
12,69 11,80
miR-101
7,50 6,91
10
Ejemplo 15
Selección de miARN de la biblioteca de miARN sintéticos que tienen influencia en el ciclo celular
El cuerpo de un ser humano adulto está compuesto por aproximadamente 50-100 trillones de células. Cada día, varios billones de estas células se dividen en dos para remplazar los billones de células que mueren y se eliminan. En el curso de una vida media, esto supone un número astronómico de divisiones celulares, la mayoría de las cuales 15 van perfectamente bien. Sin embargo, ocurren errores, y si no se corrigen pueden dar lugar al cáncer. El crecimiento y división de las células se controlan normalmente por un intrincado sistema de controles y equilibrios. Pero ocasionalmente una células que empieza a proliferar salvajemente, dividiéndose una y otra vez y desafiando todas las restricciones sobre su crecimiento. Este es el principio de las formas más comunes de cáncer.
Se transfectaron por triplicado 4.000 células BJ/pocillo con 46 miARN sintéticos utilizando Lipofectamina 2000 20 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
Let-7a
Let-7a
miR-1
miR-1
miR-105
miR-125a
miR-128
miR-142
miR-145
miR-146
miR-147
miR-150
miR-15a
miR-16
miR-186
miR-187
miR-188
miR-191
miR-195
miR-20
miR-206
miR-21
miR-211
miR-223
miR-224
miR-26a
miR-320
miR-324-3p
miR-325
miR-335
miR-337
miR-338
miR-345
miR-371
miR-373
miR-92
mmu-miR-201
mmu-miR-207
mmu-miR-290
mmu-miR-291-3p
mmu-miR-294
mmu-miR-295
mmu-miR-297
mmu-miR-322
mmu-miR-376b
mmu-miR-409
A las 24 horas post-transfección, la mitad de las células BJ de cada pocillo se trasladaron a un medio reciente. A las 72 horas post-transfección, las células se fijaron con de paraformaldehído al 4% con una concentración final del 2%. Las células fijadas se tiñeron con yoduro de propidio (protocolo de TTP LabTech) y se evaluaron utilizando el escáner celular TTP LabTech. El yoduro de propidio tiñe el ADN y el contenido relacionado con ADN en una célula 5 corresponde con su posición en el ciclo celular. El escáner celular medía la tinción de yoduro de propidio en cada
célula y asignaba su posición en el ciclo celular. El porcentaje de células en cada estado del ciclo celular se calculó y se comparó con las células transfectadas con los miARN sintéticos de control negativo. El cambio relativo en las células en cada estado se calculó para cada miARN que se utilizó. Los miARN sintéticos que inducían un cambio significativo hacia o en contra de un estado específico del ciclo celular se enumeran a continuación. Estos representan los miARN que regulan puntos clave en el ciclo celular y ofrecen puntos clave de intervención para el 5 desarrollo de terapias relacionadas con el cáncer.
TABLA 23
miARN que reducen significativamente el porcentaje de células BJ en fase G1 del ciclo celular
miARN
% Dif de Células en G1 desv. estánd.
miR-miR-21
54,4 4,2
miR-miR-20
63,6 9,3
miR-miR-1
65,3 9,5
miR-miR-206
66,8 9,0
miR-miR-373
72,6 5,7
miR-miR-26a
78,0 4,0
TABLA 24
miARN que aumentan significativamente el porcentaje de células BJ en fase G1 del ciclo celular
miARN
% Dif de Células en G1 desv. estánd.
rno-miR-miR-325
121,7 5,3
mmu-409
123,2 13,7
miR-miR-324
123,7 4,9
miR-miR-195
125,1 2,5
mmu-376b
126,5 3,1
miR-miR-142
127,0 13,0
miR-miR-371
128,9 2,8
let-7a
131,5 4,5
miR-miR-146
141,5 7,7
miR-miR-128
143,0 2,4
10
TABLA 25
miARN que reducen significativamente el porcentaje de células BJ en fase S del ciclo celular
miARN
% Dif de Células en S desv. estánd.
miR-miR-128
55,5 3,8
let-7a
57,6 8,7
miR-miR-142
59,5 24,7
miR-miR-146
63,5 16,8
mmu-297
65,0 14,1
miR-miR-337
65,3 11,3
miR-miR-195
65,6 0,1
mmu-376b
69,1 11,6
miR-miR-324
72,2 9,4
miR-miR-187
72,3 10,9
miR-miR-186
72,8 6,1
TABLA 26
miARN que aumentan significativamente el porcentaje de células BJ en fase S del ciclo celular
miARN
% Dif de Células en G1 desv. estánd.
miR-miR-92
132,0 14,7
miR-miR-15a
134,8 13,9
miR-miR-191
135,9 29,1
miR-miR-26a
136,0 7,6
miR-miR-20
139,7 17,6
mmu-290
141,0 11,7
let-7a
141,1 19,9
miR-miR-345
143,3 45,8
miR-miR-16
150,1 24,8
miR-miR-224
150,6 9,8
TABLA 26
miARN que reducen significativamente el porcentaje de células BJ en fase G2/M del ciclo celular
miARN
% Dif de Células en G2/M desv. estánd.
miR-miR-147
51,2 6,1
miR-miR-371
52,8 2,7
miR-miR-146
57,2 5,3
miR-miR-195
58,9 4,4
miR-miR-128
65,4 2,7
miR-miR-15a
67,4 13,7
let-7a
69,1 2,8
TABLA 27 5
miARN que aumentan significativamente el porcentaje de células BJ en fase G2/M del ciclo celular
miARN
% Dif de Células en G2/M desv. estánd.
miR-miR-26a
130,2 5,8
miR-miR-187
132,0 4,3
miR-miR-145
136,8 13,7
miR-miR-373
137,9 5,2
miR-miR-20
143,0 10,6
miR-miR-21
160,3 7,1
TABLA 28
miARN que aumentan significativamente el porcentaje de células BJ con una cantidad mayor de 2x de ADN
miARN
% Dif células c/>2x DNA desv. estánd.
miR-miR-20
157,9 23,4
miR-miR-1
161,9 13,6
miR-miR- 345
176,1 17,4
miR-miR-373
177,9 32,7
miR-miR-337
195,0 52,1
miR-miR-21
209,4 45,7
Ejemplo 16
Selección de miARN en la biblioteca de miARN sintéticos que tienen influencia en la proliferación celular
Se utilizaron ensayos de proliferación celular en conjunción con la biblioteca de miARN sintéticos de los inventores para identificar miARN que tienen influencia en la proliferación celular en un amplio intervalo de células, incluyendo las de pulmón, mama, próstata, piel, cuello uterino, linfocitos T, y tejidos prepuciales. 5
Se transfectaron por triplicado células del cuello uterino (HeLa), de pulmón (A549, CRL-5826 y HTB-57), mama (MCF12A y BT549), próstata (22rev1), linfocitos T (Jurkat y normales primarios), y piel (TE354T, TE353SK, y BJ) con cada uno de los más de 150 miARN sintéticos de la biblioteca de los inventores. Con las excepciones de linfocitos Jurkat y linfocitos T primarios, cada tipo celular se transfectó con 5 picomoles de cada uno de los miARN de la biblioteca de miARN sintéticos utilizando siPORT™ NeoFx™ (Ambion) con una densidad en las placas de 10 aproximadamente 8.000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos. Los linfocitos Jurkat y los linfocitos T primarios se mezclaron a una tasa de aproximadamente 50.000 células por pocillo con 500 picomoles de cada uno de los miARN sintéticos. El medio se cambió 24 h tras la transfección. Se estimó el número de células a las 72 h post-transfección por uno de tres métodos:
(1) Se añadió Azul Alamar a cada pocillo y las placas de 96 pocillos se analizaron utilizando un lector de placas. 15 El azul Alamar es un sustrato para una enzima metabólica de las células y el producto de la reacción es fluorescente. La fluorescencia en cada pocillo se correlaciona con el número total de células en cada pocillo.
(2) Se añadió a cada pocillo Reactivo Flex ViaCount (Guava), un colorante que es fluorescente cuando interactúa con ADN, y se cuantificó la fluorescencia utilizando el Guava PCA-96 según las instrucciones del fabricante.
(3) Se añadió a cada pocillo yoduro de propidio, un colorante que es fluorescente cuando interactúa con ADN, y 20 el número total de células en el pocillo se estimó por recuento de los sitios únicos de ADN teñido utilizando el Escáner Celular TTP LabTech según las instrucciones del fabricante.
El impacto de cada miARN sobre la proliferación celular se evaluó dividiendo el número de células leídas en cada pocillo por el número medio de células leído en los pocillos transfectados con un miARN control negativo (CN).
En la FIG. 15 A-C se presentan miARN sintéticos que reducían significativamente la proliferación de varios tipos de 25 células que se analizaron. Estos miARN representan moléculas que se podrían utilizar para terapias, diagnósticos, creación de líneas celulares con propiedades de investigación interesantes, e inducción de diferenciación.
Aproximadamente el 10% de los miARN reducían significativamente la proliferación celular en al menos cuatro tipos celulares diferentes. Estos miARN (presentados en orden de prioridad en la tabla siguiente) se proporcionan a continuación y se pueden utilizar en procedimientos y composiciones de la invención. 30
TABLA 29
miARN Anti-Proliferación Comunes
miARN
nº de Positivos
miR-124
7
miR-16
6
miR-101
6
miR-126
6
miR-147
6
miR-15a
5
miR-96
5
miR-105
5
miR-142
5
miR-215
5
miR-346
4
miR-206
4
miR-192
4
miR-194
4
Entre las células que se utilizaron para la selección en la biblioteca de miARN sintéticos se hicieron parejas de células cancerosas y no cancerosas de mama, piel y linfocitos T. Era interesante, que muchos miARN sintéticos afectaban de manera distinta la proliferación de las parejas de células (véase la tabla a continuación). 35
Tabla 30
Mama
Cancerosas No Cancerosas
miARN
%CN % desv. estánd. %CN % desv. estánd.
miR-201
79 14 103 17
miR-192
81 3 95 17
miR-92
85 11 104 24
Piel
Cancerosas Normales
pre-MIR
% CN % desv. estánd. % CN % desv. estánd.
miR-154
51 5 93 10
miR-195
58 3 87 5
mu-miR-376b
65 3 99 8
miR-201
67 8 106 4
miR-26a
69 12 97 17
miR-193
69 4 105 10
Linfocitos T
Leucemia Normales
%CN % desv. estánd. %CN % desv. estánd.
let-7a
21 1 137 15
let-7b
50 5 136 13
miR-101
69 30 95 5
miR-10b
37 3 115 18
miR-122
67 18 104 18
miR-17-3p
63 16 116 4
miR-29a
68 7 111 8
miR-30a-3p
66 27 97 18
miR-34a
67 21 100 1
En la FIG. 16 se presentan miARN sintéticos que aumentan significativamente la proliferación de varios tipos celulares que se habían analizado.
Ejemplo 17 5
Selección para identificar miARN en la biblioteca de inhibidores de miARN que tienen influencia en la proliferación celular
Se utilizó un ensayo de proliferación celular en conjunción con la biblioteca de miARN sintéticos de los inventores para identificar miARN que tenían influencia sobre la proliferación celular en un amplio intervalo de células, incluyendo las de pulmón, mama, próstata, piel, cuello uterino, linfocitos T, y tejidos prepuciales. 10
Se transfectaron por triplicado las células de mama (MCF12A), próstata (22Rv1), pulmón (A549), y piel (TE354T) con cada uno de los más de 150 inhibidores de miARN de la biblioteca de los inventores. Cada tipo celular se transfectó con 10 picomoles de cada uno de los inhibidores de miARN de la biblioteca utilizando siPORT™ NeoFx™ (Ambion) con una densidad en la placa de aproximadamente 8.000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos. Se estimó el número de células a las 72 h post-transfección por uno de tres métodos: 15
(1) Se añadió Azul Alamar a cada pocillo y las placas de 96 pocillos se analizaron utilizando un lector de placas. El azul Alamar es un sustrato para una enzima metabólica de las células y el producto de la reacción es fluorescente. La fluorescencia en cada pocillo se correlaciona con el número total de células en cada pocillo.
(2) Se añadió a cada pocillo Reactivo Flex ViaCount (Guava), un colorante que es fluorescente cuando interactúa con DNA, y se cuantificó la fluorescencia utilizando el Guava PCA-96 según las instrucciones del fabricante. 20
(3) Se añadió a cada pocillo yoduro de propidio, un colorante que es fluorescente cuando interactúa con ADN, y se estimó el número total de células en el pocillo por recuento de los sitios únicos de ADN teñido utilizando el
Escáner Celular TTP LabTech según las instrucciones del fabricante.
El impacto de cada inhibidor de miARN sobre la proliferación celular se evaluó dividiendo el número leído de células de cada pocillo por el número medio de células leído en los pocillos transfectados con un miARN control negativo (CN).
En la FIG. 17 se presentan miARN cuya inhibición reducían significativamente la proliferación de varios tipos 5 celulares que se analizaron. Estos miARN representan moléculas que se podrían utilizar para terapias, diagnóstico, creación de líneas celulares con propiedades de investigación interesantes, e inducción de diferenciación.
En la FIG. 18 se presentan inhibidores de miARN que aumentan significativamente la proliferación de varios tipos celulares que se analizaron. Estos miARN representan moléculas que se podrían utilizar para terapias, diagnóstico, creación de líneas celulares con propiedades de investigación interesantes, e inducción de diferenciación. 10
Ejemplo 18
Selección de miARN en la biblioteca de miARN sintéticos que tienen influencia sobre la viabilidad celular
La base de la mayoría de las enfermedades humanas es la subversión de una o más células que funcionan de forma que se salen de lo que hacen normalmente. Por ejemplo, el cáncer se inicia con la inmortalización y transformación de una sola célula que se divide repetidamente para formar un tumor. Los compuestos que reducen la viabilidad de 15 las células enfermas se utilizan de manera rutinaria para tratar pacientes con cáncer y otras enfermedades.
Se transfectaron por triplicado células del cuello uterino ((HeLa), de pulmón (A549), y linfocitos T (Jurkat y normales primarios) con cada uno de los más de 150 miARN de la biblioteca de los inventores. Con las excepciones de los linfocitos Jurkat y linfocitos T primarios, cada tipo celular se transfectó con 5 picomoles de cada uno de los miARN de la biblioteca de miARN sintéticos utilizando siPORT™ NeoFx™ (Ambion) con una densidad en las placas de 20 aproximadamente 8.000 células/pocillo de placas de 96 pocillos. Los linfocitos Jurkat y los linfocitos T primarios se mezclaron a una tasa de aproximadamente 50.000 células/pocillo con 500 picomoles de cada uno de los miARN sintéticos. Para las células HeLa y A549, se cambió el medio a las 24 h tras la transfección. Se estimó la viabilidad celular 72 horas post-transfección por uno de dos procedimientos:
(1) Se añadió a cada pocillo Reactivo ViaCount Flex (Guava), que incluye un colorante que solamente penetra en 25 células muertas y que es fluorescente cuando interactúa con ADN, y se cuantificó la fluorescencia utilizando el Guava PCA-96 según las instrucciones del fabricante. El porcentaje de células viables se halló dividiendo el número de células no muertas y no apoptóticas en la muestra por el número total de células en el pocillo y multiplicándolo por 100.
(2) Se añadió a cada pocillo yoduro de propidio, un colorante que es fluorescente cuando interactúa con ADN. 30 Cada célula se analizó utilizando el Escáner Celular TTP LabTech según las instrucciones del fabricante para detectar células con patrones de tinción que concuerdan con muerte celular o apoptosis. El porcentaje de células viables se midió dividiendo el número de células no muertas y no apoptóticas en la muestra por el número total de células en el pocillo y multiplicando por 100.
En la FIG. 19 se presentan miARN sintéticos que disminuyen o aumentan significativamente la viabilidad en los 35 varios tipos celulares que se analizaron. En una comparación de la viabilidad entre linfocitos Jurkat y linfocitos T primarios, que representan las formas leucemia y normal de los linfocitos T, let-7, miR-10, miR-101, miR-17-3p, miR-19, y miR-34a reducían mucho la viabilidad de las células de leucemia sin afectar a los linfocitos T normales.
Ejemplo 19
Selección de miARN en la biblioteca de miARN sintéticos que tienen influencia en la apoptosis 40
Para identificar los miARN que participan en la apoptosis, se utilizó un ensayo de apoptosis con la biblioteca de inhibidores de miARN.
Se transfectaron por triplicado aproximadamente 8.000 células por pocillo del cuello uterino (HeLa), de próstata (22Rv1), linfocitos T (Jurkat), y de piel (TE354T) con cada uno de los más de 150 miARN sintéticos de la biblioteca de los inventores utilizando siPORT™ NeoFx™ (Ambion). El medio se cambió después de 24 h y se visualizaron las 45 células inspeccionándolas bajo un microscopio para inspeccionar cualitativamente la muerte celular a las 72 horas después de la transfección. Se midió la apoptosis en las células midiendo la actividad de la caspasa 3 de la siguiente manera: 1) Se lavaron las células una vez con PBS y se congelaron a -80 ºC. 2) Las células se destruyen añadiendo 40 l de tampón de lisado frío (50 mM de HEPES pH 7,2, 40 mM de NaCl, 0,5% de NP40, 0,5 mM EDTA) en los pocillos y se incubaron durante 20 min a 4 ºC. 3) Se añadieron 160 l de tampón ICE (50 mM HEPES pH 7,4, 0,1% 50 CHAPS, 0,1 mM EDTA, 10% sacarosa) + 5 mM DTT que contenía 20 M de sustrato DEVDafc. 4) Se mide el aumento de fluorescencia en una hora con 400 ex, 505 em. Las muestras se analizaron también para hallar el número de células utilizando un ensayo general de esterasa para normalizar los resultados de caspasa 3. El sustrato FDA (0,4 mg/ml de diacetato de fluoresceína (FDA) en acetonitrilo) se diluyó 1:19 en un tampón de dilución (40 mM
TrisCl pH 7.5, 20 mM NaCl, 0,5% NP-40, concentración final 0,02 mg/ml). Se añadieron 40 l de tampón (40 mM TrisCl pH 7,5, 0,5% NP-40) a cada pocillo de muestra. Las muestras se incubaron 10 min en hielo. Se añadieron 160 l de sustrato FDA diluido a cada pocillo. Se midió la fluorescencia durante 30 minutos a 37 grados (ex = 488, em = 529). La pendiente del aumento de fluorescencia en el tiempo es una función del número de células en la placa.
El impacto de cada miARN sobre la apoptosis se evaluó dividiendo la lectura de caspasa 3 de cada pocillo por la 5 media de la lectura de caspasa 3 de los pocillos transfectados con un miARN control negativo (CN).
Como se aprecia en la FIG. 20, muchos miARN diferentes eran capaces de aumentar o disminuir la apoptosis en los cuatro tipos celulares que se ensayaron. Unos cuantos miARN (miR-126, miR-26a, miR-1, miR-149, y let-7g) afectaban a la apoptosis en múltiples tipos celulares sugiriendo que regulan la apoptosis por medio de genes que son comunes en múltiples tipos celulares. 10
Ejemplo 20
Selección de miARN en la biblioteca de miARN sintéticos que inducen transformación
La transformación es necesaria para la formación del tumor ya que sobrepasa la respuesta natural de la célula de parar de dividirse cuando se sitúa en un entorno abarrotado. Para identificar los miARN que participan en la transformación, se utilizó un ensayo de transformación con la actuación de células NIH3T3 con la biblioteca de 15 miARN sintéticos. Las células NIH3T3 se utilizan en los ensayos de transformación porque carecen de la capacidad para formar colonias cuando se colocan en placas de agar blando. La modulación de los procesos que inhiben la transformación se pueden detectar fácilmente debido a que inducen a las células NIH3T3 a que empiecen a formar colonias cuando se colocan en placas de agar blando.
Se transfectaron por duplicado aproximadamente 8.000 células NIH3T3 con cada uno de los más de 150 miARN 20 sintéticos de la biblioteca de los inventores utilizando siPORT™ NeoFx™ (Ambion). El medio se cambió a las 24 h y las células se transfirieron a placas de 24 pocillos que contenían agar blando. El agar blando limita la movilidad y asegura que las células hermanas permanezcan en contacto a continuación de la división celular. El contacto íntimo con otras células induce típicamente a las células NIH3T3 que paren de dividirse. El número total de las células de cada pocillo se midió tomando una lectura de la absorbancia a 495 nm. La lectura de la absorbancia para cada 25 pocillo se dividía por la lectura media de absorbancia de las células transfectadas con el miARN control negativo y se multiplicó por 100 para obtener el porcentaje de cambio en la transformación. Una selección inicial revelaba que miR-10, miR-23, miR-24, miR-198, miR-192, y miR-199 eran miARN que aumentaban la transformación con respecto a las células transfectadas con el control negativo. Una repetición del experimento con los candidatos iniciales arrojó el siguiente resultado que se muestra a continuación: 30
Tabla 31
miARN
%CN %DE
198
103 2,07
192
108 5,7
199
113 5,59
Ejemplo 21
miARN que afectan la eficacia de compuestos terapéuticos
Se han ensayado muchos compuestos en ensayos clínicos para hallar su capacidad de que afecten positivamente al 35 resultado de los pacientes. En algunos casos estos compuestos se encuentran en el grupo de referencias de la FDA y se convierten en agentes terapéuticos. Desafortunadamente, muy pocos agentes terapéuticos son eficaces al 100%. El aumento de las actividades de los compuestos terapéuticos proporciona una oportunidad significativa a la industria médica. Los dos procedimientos más comunes que se utilizan para mejorar los terapéuticos son la modificación química de la estructura de los compuestos o el uso simultáneo de compuestos terapéuticos múltiples. 40 Se evaluó si sería beneficioso introducir miARN con antelación a la adición de compuestos de los que se sabe que reducen significativamente la viabilidad de las células cancerosas. Uno de los compuestos anticáncer que se introdujeron era TRAIL, un compuesto que se une al menos a dos receptores diferentes y activa la ruta de apoptosis para inducir la muerte celular primariamente en células cancerosas. El segundo compuesto que se ensayó en combinación con los miARN sintéticos era etopósido, un inhibidor de la topoisomerasa II que activa la ruta de 45 apoptosis en células cancerosas al igual que en las normales reduciendo la reparación del ADN dañado en las células.
Se transfectaron por triplicado aproximadamente 8.000 células del cuello uterino (HeLa) y de pulmón (A549, HTB-57, y CRL-5826) por pocillo con miARN sintéticos de la biblioteca de los inventores utilizando siPORT™ NeoFx™ (Ambion). Se cambió el medio a las 24 h y se introdujeron el etopósido y el TRIAL a una concentración final de 50 aproximadamente 25 M después de 48 horas. Las células se inspeccionaron visualmente bajo el microscopio para inspeccionar cualitativamente la muerte celular 64 horas tras la transfección.
Se midió la apoptosis de las células tratadas con etopósido midiendo la actividad de la caspasa 3 de la manera siguiente: 1) Se lavaron las células una vez con PBS y se congelaron a -80 ºC. 2) Las células se lisaron añadiendo 40 l de tampón de lisado frío (50 mM HEPES pH 7.2, 40 mM NaCl, 0.5% NP40, 0.5 mM EDTA) a los pocillos y se incubaron durante 20 min a 4 ºC. 3) Se añadieron 160 l de tampón ICE (50 mM HEPES pH 7,4, 0,1% CHAPS, 0,1 mM EDTA, 10% sacarosa) + 5 mM DTT que contenía 20 M de sustrato DEVDafc. 4) Se midió el aumento de 5 fluorescencia en una hora a 400 ex., 505 em. También se analizaron las muestras para hallar el número de células utilizando un ensayo general de esterasa para normalizar los resultados de caspasa 3. El sustrato FDA (0,4 mg/ml de diacetato de fluoresceína (FDA) en acetonitrilo) se diluyó 1:19 en un tampón de dilución (40 mM TrisCl pH 7,5, 20 mM NaCl, 0,5% NP-40, concentración final 0,02 mg/ml). Se añadieron 40 l de tampón (40 mM TrisCl pH 7,5, 0,5% NP-40) a cada pocillo de muestra. Las muestras se incubaron 10 min en hielo. Se añadieron 160 l de sustrato FDA 10 diluido a cada pocillo. Se midió la fluorescencia durante 30 minutos a 37 grados (ex = 488, em = 529). La pendiente del aumento de fluorescencia en el tiempo es una función del número de células en la placa.
Se evaluó la viabilidad celular de las células tratadas con TRAIL añadiendo azul alamar a cada pocillo y se analizó la fluorescencia utilizando un lector de placas. El azul alamar es un sustrato para una enzima metabólica de las células y el producto de la reacción es fluorescente. La fluorescencia de cada pocillo se correlaciona con el número total de 15 células en cada pocillo.
El efecto de cada miARN sobre los tratamientos se midió dividiendo la lectura de caspasa 3 o el azul alamar de las células transfectadas con los miARN y tratadas con TRAIL o etopósido con las mismas lecturas de células que solo se transfectaron con los miARN. El cambio de la actividad de la caspasa 3 o la tinción por azul alamar para cada miARN se dividió entonces por las diferencias observadas en los dos miARN controles negativos y se multiplicaron 20 por 100 para calcular el efecto relativo inducido por la combinación de cada uno de los miARN y el compuesto terapéutico. Estos valores se enumeran como el % CN en la Figura G.
Como se muestra en la FIG. 21, varios de los miARN aumentaban significativamente la capacidad de los dos compuestos terapéuticos para inducir la muerte celular en las células cancerosas que se habían tratado. Resulta interesante que miR-292-3p, miR-132, miR-124, y miR-28, trabajaran todos extremadamente bien en combinación 25 tanto con TRAIL como con etopósido.
Ejemplo 22
Selección de miARN en la biblioteca de miARN que afectan al ciclo celular
El cuerpo de un ser humano adulto está compuesto por aproximadamente 50-100 trillones de células. Cada día, varios billones de estas células se dividen en dos para remplazar los billones de células que mueren y se eliminan. 30 En el curso de una vida media, esto supone un número astronómico de divisiones celulares, la mayoría de las cuales van perfectamente bien. Sin embargo, ocurren errores, y si no se corrigen pueden dar lugar al cáncer. El crecimiento y división de las células se controlan normalmente por un intrincado sistema de controles y equilibrios. Pero ocasionalmente una células que empieza a proliferar salvajemente, dividiéndose una y otra vez y desafiando todas las restricciones sobre su crecimiento. Este es el principio de las formas más comunes de cáncer. 35
Se transfectaron por triplicado aproximadamente 8.000 células del cuello uterino (HeLa) y 4.000 células de piel (BJ) por pocillo con cada uno de los más de 150 miARN sintéticos de la biblioteca de los inventores. Las células HeLa se transfectaron utilizando siPORT™ NeoFx™ (Ambion) y las células BJ se transfectaron utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. A las 24 h de la transfección, la mitad de las células de cada pocillo se retiraron a un medio reciente. A las 72 h post-transfección, las células se fijaron con paraformaldehído al 40 4% con una concentración final del 2%. Las células fijadas se tiñeron con yoduro de propidio (protocolo de TTP LabTech) y se evaluaron utilizando el escáner celular TTP LabTech. El yoduro de propidio tiñe el ADN y el contenido relativo de ADN en una célula se corresponde con su posición en el ciclo celular. El escáner celular medía la tinción de yoduro de propidio en cada célula y asignaba su posición en el ciclo celular. Se calculó el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular y se comparó con las células transfectadas por los controles negativos de miARN 45 sintéticos. Se calculó el cambio en las células relativo a cada fase para cada miARN que se había utilizado. Estos miARN sintéticos que inducen un cambio significativo del ciclo celular hacia o en contra de una fase específica del ciclo celular se enumeran posteriormente. Estos representan unos miARN que regulan puntos clave en el ciclo celular y ofrecen puntos clave de intervención para el desarrollo terapéutico relacionado con el cáncer.
Como se aprecia en la FIG. 22, muchos miARN diferentes alteraban significativamente el porcentaje de células en 50 los distintos estadios del ciclo celular en los dos tipos celulares que se analizaron.
Ejemplo 23
Selección de miARN en la biblioteca de miARN sintéticos que tienen influencia en la expresión de hTert
La telomerasa es un complejo de proteínas y ARN que mantiene los extremos de los cromosomas agregando telómeros. Con raras excepciones, las células diferenciadas terminalmente carecen de telomerasa activa. Una de las 55 excepciones son las células cancerosas. Más del 90% de las muestras humanas de cáncer tienen telomerasa activa (revisado en Dong y col., 2005). El gen hTert codifica el dominio catalítico de telomerasa. La expresión de hTert se
correlaciona con la actividad de la telomerasa en las células lo que le hace un buen sustituto de la actividad telomerasa. Los inventores han desarrollado y utilizado un ensayo basado en RT-PCR para controlar la expresión de ARNm hTert en células negativas a telomerasa para identificar los miARN que participan en la regulación de la telomerasa. Los miARN que regulan la actividad telomerasa representan puntos de intervención para terapias contra el cáncer. 5
Las células BJ son fibroblastos normales del prepucio que carecen de actividad de ARNm hTert y telomerasa. Las células BJ se tripsinizaron y se diluyeron hasta 13.000 células/ml en medio de cultivo normal. Se diluyeron 0,3 l de agente lipofectamina 2000 en 40 l de OPTIMEM y se incubaron durante cinco minutos. Se añadió reactivo de transfección diluido a los pocillos de placas de 96 pocillos que contenían 151 miARN sintéticos así como dos controles negativos de miARN diferentes. Cada pocillo albergaba un miARN sintético diferente. Los miARN sintéticos 10 y el agente de transfección se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se añadieron 200 l (2.600 células) sobre el complejo lípido/miARN. Las células se colocaron en una incubadora y se aisló el ARN 72 horas más tarde. El ARN se aisló de las células de cada pocillo utilizando el protocolo de referencia del kit de Aislamiento de ARN Total RNAqueous™-MagMAX96 (nº de catálogo 1830) (lisis de las células en los pocillos). Se hizo la transcripción inversa utilizando una reacción RETROscript añadiendo 11 ul de ARN total (20-100 ng/l) a 1 l 15 de decámeros aleatorios e incubándolos en baño de agua a 70 ºC durante 3 minutos y luego colocándolos en hielo. Después, se le añadieron 8 l del cóctel que contenía 3,8 l de agua libre de Nucleasa, 2,0 l de 10x de tampón de transcripción inversa, 2,0 l de dNTPs 2,5 mM, Proteína inhibidora de RNasa (40 U/l), 0,1 l de MMLV-RT (100 U/l), y se incubaron a 42 ºC durante 1 hora, y después a 92 ºC durante 10 minutos.
Se ensamblaron reacciones PCR en tiempo real para cuantificar el ARNm hTert y el ARNr 18S en cada una de las 20 muestras. Se colocaron en un tubo de PCR: Agua libre de nucleasa, 10x tampón completo de PCR/SYBR, MgCl2 25 mM, 2,5 mM de dNTPs, 50x de ROX, cebadores específicos de 18S o hTert (mezcla de directos e inversos 3 M), el ADNc de la distintas muestras, y polimerasa Súper taq. Se calentó la reacción a 95 ºC durante 5 minutos y luego se sometió a 40 ciclos a 95 ºC durante 15 segundos, 60 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 30 segundos. Los productos de amplificación se controlaron utilizando ABI 7600 (Applied Biosystems). Las células BJ normalmente no 25 producen productos de amplificación con los cebadores de hTert. También se analizaron las muestras transfectadas con miARN que daban lugar a productos de PCR hTert para hallar niveles de ARNr 18S para asegurar de que no hubiera significativamente más células en las muestras que pudieran haber contribuido a la cantidad de hTert en las muestras.
Se detectó el ARNm hTert en transfecciones duplicadas de cada uno de los miARN enumerados posteriormente. 30 Estos miARN presumiblemente afectan las rutas que regulan la expresión del gen hTert. La sobre-expresión de cualquiera de estos miARN podría contribuir al cáncer por activación de la telomerasa. La regulación de las actividades de estos miARN en las células cancerosas podría limitar su trasformación y superar la oncogénesis.
Tabla 33
miARN activadores de hTert
miARN
Expresión Log(2) de hTert
miR-147
3,14
miR-195
4,25
miR-21
1,55
miR-24
4,68
miR-26a
4,35
miR-301
4,14
miR-368
5,30
miR-371
2,43
35
La exploración de la actividad de telomerasa se repitió utilizando una serie de ARNsi dirigidos a quinasas, fosfatasas, GPCR, factores de transcripción y otros genes variados. La dirección de ARNsi contra los genes siguientes da como resultado un aumento de la expresión de hTert. Resulta interesante que se predijo que muchos de estos genes eran dianas de los miARN que los inventores encontraron reguladores de hTert (véase la tabla siguiente). 40
Tabla 34
Activadores del Gen hTert
Gen
Expresión Log(2) de hTert
ACOX1
3,44
AKT1
1,80
APAF1
3,40
COX-5B
2,78
COX6
2,28
COX7B
3,95
CPOX
4,66
DUOX2
3,80
GPX1
1,85
GPX2
2,56
GPX4
3,17
LPO
3,37
MAPK1
3,07
MAPK4
3,61
MTCO1
1,58
NOX3
2,30
NOX5
2,54
PAOX
1,72
PPOX
2,09
PRKCA
2,24
PRKCD
4,39
TNFRSF6
2,25
Ejemplo 24
Efecto de la secuencia primaria de miARN sobre la función
Parece que muchos miARN están estrechamente relacionados unos con otros basándose en sus secuencias 5 primarias. Por ejemplo, let-7a es un miembro de la familia genética let-7, que incluye 7 genes únicos en el genoma humano. Los genes let-7 codifican miARN que varían por tan poco como un único nucleótido y como mucho en cuatro nucleótidos. En las bibliotecas de miARN sintéticos e inhibidores de miARN, los inventores tienen cinco miARN let-7 humanos diferentes. Estos miARN se han utilizado en muchos tipos celulares diferentes en selecciones diseñadas para identificar los miARN implicados en una variedad de distintos procesos celulares. En muchas de las 10 selecciones, los distintos miARN let-7 generan fenotipos similares. La FIG. 23 proporciona dos ejemplos en los que todos los miembros de la familia let-7 dan lugar a respuestas similares. Por el contrario, hay algunas selecciones en las que los distintos miARN de la familia let-7 dan lugar a resultados significativamente diferentes (FIG. 23).
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una molécula de ácido nucleico miARN sintético que comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia del miR-34a maduro humano para su uso en la terapia de un cáncer.
  2. 2. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 definido además como una molécula de ácido nucleico de entre 17 y 125 restos de longitud, que comprende 5
     una región de miARN cuya secuencia de 5’ a 3’ es al menos idéntica en un 80% a un miARN maduro miR-34a, y
     una región complementaria cuya secuencia de 5’ a 3’ es complementaria entre un 60% y el 100% a la región de miARN.
  3. 3. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 o 10 2, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5’ a 3’ es idéntica en al menos un 85% a una secuencia de miR-34a maduro.
  4. 4. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5’ a 3’ es idéntica en al menos un 90% a una secuencia de miR-34a maduro. 15
  5. 5. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5’ a 3’ es idéntica a una secuencia de miR-34a, miR-34b o miR-34c maduro.
  6. 6. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico está comprendido por dos polinucleótidos separados. 20
  7. 7. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico es una molécula en horquilla.
  8. 8. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su administración a una célula o a un paciente que tiene la célula identificada como que necesita una terapia de un cáncer. 25
  9. 9. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en una terapia de tratamiento de un cáncer de pulmón, cáncer de cuello de útero, cáncer de próstata, cáncer de piel, o leucemia.
  10. 10. Un ácido nucleico miARN sintético de cadena doble de 17-30 nucleótidos de longitud que comprende un primer polinucleótido que tiene una secuencia con una identidad de secuencia de al menos un 80% con una secuencia de 30 miR-34a maduro que comprende los nucleótidos 22-43 de la SEC ID Nº 58, y un segundo polinucleótido separado cuya secuencia de 5’ a 3’ es complementaria entre un 60% y el 100% con el primer polinucleótido, para su uso como un medicamento.
  11. 11. Un miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 10, que se caracteriza porque el ácido nucleico está definido además como en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7. 35
  12. 12. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 que comprende además uno o más de los siguientes:
    i) un grupo de sustitución del fosfato o el hidroxilo del nucleótido en el extremo 5’ de la cadena complementaria de la molécula de ARN;
    ii) una o más modificaciones en los azúcares de los primeros o últimos 1 a 6 restos de la región complementaria; 40 o
    iii) una no complementariedad entre uno o más nucleótidos de los últimos 1 a 5 restos del extremo 3’ de la región complementaria y los correspondientes nucleótidos de la región miARN.
  13. 13. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, que comprende i) al menos un nucleótido modificado que bloquea el OH 5’ o fosfato en el extremo 5’, en el que la 45 modificación del al menos un nucleótido es un NH2, biotina, un grupo amino, un grupo alquilamino inferior, un grupo acetilo o una modificación 2’ oxígeno-metilo (2’ O-Me), o ii) al menos una modificación de la ribosa seleccionada de entre 2’F, 2’NH2, 2’N3, 4’tio, o 2’ O-CH3.
  14. 14. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 13 que es un polinucleótido de cadena sencilla, o un polinucleótido de cadena doble. 50
  15. 15. El uso de un ácido nucleico miARN sintético como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la reducción de la viabilidad celular o la disminución de la proliferación celular o la inducción o inhibición de la
    apoptosis, con la condición de que se excluyan los procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de cirugía o terapia.
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