ES2593360T3

ES2593360T3 - Nuevas composiciones inmunogénicas para la prevención y tratamiento de enfermedad meningocócica

Info

Publication number: ES2593360T3
Application number: ES10182298.9T
Authority: ES
Inventors: Gary W. Zlotnick; Leah D. Fletcher; John Farley; Liesel A. Bernfield; Robert J Zagursky; Benjamin J. Metcalf
Original assignee: Wyeth Holdings LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2022-10-11
Also published as: IL245955A0; US8563007B1; US20120294880A1; CN102755631A; EP2348034A3; EP2371837A1; HK1178800A1; EP2343308A2; EP2348034B1; EP2341062A3; MX349481B; US20150335724A1; US20200138933A1; DK2348036T3; PT2348035E; JP2005515771A; DK2351767T3; EP2351767A2; PT2332961T; FR17C1043I2

Abstract

Una composición que comprende: al menos una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 301; en la que x es cualquier aminoácido; en la que la región de la posición de aminoácido a la posición de aminoácido 8 es cualquiera de 0 a 4 aminoácidos; en la que la región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos; a condición de que dicha proteína no sea SEQ ID NO: 1, 5, 7, 9, 14, 15, 17, 18, 19, 20 o 22 del documento WO03/020756; para uso como un medicamento.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

SEQ ID NO 48: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa Y (ATCC35561).

SEQ ID NO 49: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250732 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 50: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250732 preparada

usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 51: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de M98 250732 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 52: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250732 preparada

usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 53: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de M98 250732. SEQ ID NO 54: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250732. SEQ ID NO 55: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa de M98 250771 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 56: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250771 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 57: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M98 250771 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 58: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250771 preparada usando una secuencia líder P4. SEC Nº 59: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura

de la cepa de M98 250771. SEQ ID NO 60: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250771. SEQ ID NO 61: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa de CDC1135 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 62: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 63: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de CDC1135 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 64: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 65: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa de CDC 1135. SEQ ID NO 66: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1135. SEQ ID NO 67: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa de M97 252153 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 68: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 69: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 252153 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 70: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 71: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252153. SEQ ID NO 72: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153.

7 5

10

15

20

25

30

35

40

45

SEQ ID NO 73: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC1610 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 74: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 75: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de CDC1610 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 76: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 77: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1610.

SEQ ID NO 78: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610. SEQ ID NO 79: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 80: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492 preparada

usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 81: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de CDC1492 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 82: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492 preparada

usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 83: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492.

SEQ ID NO 84: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492.

SEQ ID NO 85: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 86: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando

una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 87: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de L8 M978 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 88: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando

una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 89: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978. SEQ ID NO 90: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978. SEQ ID NO 91: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252988 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 92: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 93: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 252988 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 94: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 95: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252988. SEQ ID NO 96: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988. SEQ ID NO 97: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252697 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

8

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

SEQ ID NO 123: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 251854 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 124: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 251854 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 125: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 251854.

SEC Nº 126: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 251854. SEQ ID NO 127: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1521 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 128: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1521 preparada

usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 129: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de CDC1521 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 130: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1521 preparada

usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 131: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1521.

SEQ ID NO: 132: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1521.

SEQ ID NO 133: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 134: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada

usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 135: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M98 250622 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 136: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada

usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 137: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622. SEQ ID NO 138: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622. SEQ ID NO 139: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 870446 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 140: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 141: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 870446 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 142: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 143: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 870446. SEQ ID NO 144: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446. SEQ ID NO 145: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 253248 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 146: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 147: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 253248 cuando se combina con una secuencia líder P4.

10 5

10

15

20

25

30

35

40

45

SEQ ID NO 148: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada

usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 149: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248.

SEQ ID NO 150: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248.

SEQ ID NO 151: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 152: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809 preparada

usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 153: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M98 250809 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 154: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809 preparada

usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 155: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809. SEQ ID NO 156: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809. SEQ ID NO 157: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa L5 M981 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 158: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 159: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de L5 M981 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 160: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 161: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa L5 M981. SEQ ID NO 162: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981. SEQ ID NO 163: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa NMB cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 164: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 165: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de NMB cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 166: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 167: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa NMB. SEQ ID NO 168: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB. SEQ ID NO 169: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M98 250572 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 170: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 171: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M98 250572 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 172: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572 preparada usando una secuencia líder P4.

11 5

10

15

20

25

30

35

40

45

SEQ ID NO 173: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572.

SEQ ID NO 174: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572.

SEQ ID NO 175: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 176: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 177: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 178: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 179: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830.

SEQ ID NO 180: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830.

SEQ ID NO 181: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 182: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 183: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de CDC937 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 184: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 185: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937.

SEQ ID NO 186: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937.

SEQ ID NO 187: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 188: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 189: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de M97 252097 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 190: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 191: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097.

SEQ ID NO 192: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097.

SEQ ID NO 193: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 194: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227 preparada usando una secuencia líder nativa.

12 5

10

15

20

25

30

35

40

45

SEQ ID NO 195: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 870227 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 196: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 197: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227.

SEQ ID NO 198: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227. SEQ ID NO 199: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 200: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 preparada usando

una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 201: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de H355 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 202: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 preparada usando

una secuencia líder P4. SEQ ID NO 203: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355.

SEQ ID NO 204: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355.

SEQ ID NO 205: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H44_76 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 206: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H44_76 preparada usando

una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 207: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H44_76 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 208: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa H44_76.

SEQ ID NO 209: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de H44_76 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO: 210: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 de la cepa H44_76. SEQ ID NO 211: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 8529 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 212: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 8529 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 213: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 8529 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 214: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 8529 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 215: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 8529. SEQ ID NO: 216: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 8529. SEQ ID NO 217: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 6940 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 218: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6940 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 219: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 6940 cuando se combina con una secuencia líder P4.

13 5

10

15

20

25

30

35

40

45

SEQ ID NO 220: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6940 preparada usando

una secuencia líder P4. SEQ ID NO 221: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6940.

SEQ ID NO 222: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6940.

SEQ ID NO 223: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M982 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 224: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M982 preparada usando

una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 225: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M982 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 226: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M982 preparada usando

una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 227: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M982. SEQ ID NO 228: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M982. SEQ ID NO 229: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 880049 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 230: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 880049 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 231: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 880049 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 232: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 880049 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 233: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 880049. SEQ ID NO 234: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 880049. SEQ ID NO 235: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 cuando se combina con una secuencia líder

nativa. SEQ ID NO 236: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 237: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 238: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 239: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926. SEQ ID NO 240: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926.

SEQ ID NO 241: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M98 250670 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 242: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250670 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 243: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M98 250670 cuando se combina con una secuencia líder P4.

14

imagen7

imagen8

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Los anticuerpos para la proteína 2086 también protegen de forma pasiva a crías de rata de la exposición a meningococos (véase Tabla VII). La expresión recombinante de la proteína 2086 permite el uso de la proteína 2086 como una composición inmunogénica para la prevención de la enfermedad meningocócica. Todos los candidatos a composición inmunogénica meningocócica recientes en ensayos clínicos han sido mezclas complejas o preparaciones de proteína de membrana externa que contenían muchas proteínas diferentes. La proteína PorA, que proporciona especificidad de serosubtipo, requerirá la inclusión de 6 a 9 variantes en una composición inmunogénica para proporcionar aproximadamente 70-80 % de cobertura de serosubtipos relacionados con enfermedad. Por el contrario, se ha demostrado claramente en el presente documento que los antisueros para una única proteína 2086 sola son capaces de destruir representativos de seis serosubtipos responsables de aproximadamente el 65 % de los aislados de enfermedad en Europa occidental y los Estados Unidos. Por lo tanto, la proteína 2086 purificada tiene el potencial de reducir el número de proteínas requeridas para proporcionar una cobertura de composición inmunogénica adecuada de los serosubtipos responsables de la enfermedad meningocócica.

Proteínas, partes inmunogénicas y equivalentes biológicos

Las proteínas 2086 proporcionadas por la presente invención son proteínas aisladas. El término “aislado” significa alterado por la mando del hombre del estado natural. Si una composición o sustancia “aislada” aparece en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su ambiente original, o ambas. Por ejemplo, un polipéptido o un polinucleótido presente de forma natural en un animal vivo no está “aislado”, pero el mismo polipéptido o polinucleótido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”, como se emplea el término en el presente documento. En consecuencia, como se usa en el presente documento, la expresión “proteína aislada” abarca proteínas aisladas de una fuerte natural y proteínas preparadas usando tecnología recombinante, así como dichas proteínas cuando se combinan con otros antígenos y/o aditivos, tales como vehículos, tampones, adyuvantes, etc. farmacéuticamente aceptables, por ejemplo.

Una proteína 2086, de acuerdo con una realización de la invención comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos:

ADIGxGLADA (SEQ ID NO: 254), en la que x es cualquier aminoácido;

IGxGLADALT (SEQ ID NO: 255), en la que x es cualquier aminoácido;

SLNTGKLKND (SEQ ID NO: 256);

SLNTGKLKNDKxSRFDF (SEQ ID NO: 257, en la que x es cualquier aminoácido);

SGEFQxYKQ (SEQ ID NO: 258), en la que x es cualquier aminoácido; o

IEHLKxPE (SEQ ID NO: 259), en la que x es cualquier aminoácido. Una proteína de Subfamilia A de 2086, comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos, de acuerdo con una realización de la presente invención:

GGGVAADIGx (SEQ ID NO: 260), en la que x es cualquier aminoácido;

SGEFQIYKQ (SEQ ID NO: 261);

HSAVVALQIE (SEQ ID NO: 262);

EKINNPDKID (SEQ ID NO: 263);

SLINQRSFLV (SEQ ID NO: 264);

SGLGGEHTAF (SEQ ID NO: 265);

GEHTAFNQLP (SEQ ID NO: 266);

SFLVSGLGGEH (SEQ ID NO: 267);

EKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLP (SEQ ID NO: 268);

GKAEYHGKAF (SEQ ID NO: 269);

YHGKAFSSDD (SEQ ID NO: 270);

GKAEYHGKAFSSDD (SEQ ID NO: 271);

IEHLKTPEQN (SEQ ID NO: 272);

KTPEQNVELA (SEQ ID NO: 273);

18 5

10

15

20

25

30

IEHLKTPEQNVELA (SEQ ID NO: 274);

AELKADEKSH (SEQ ID NO: 275);

AVILGDTRYG (SEQ ID NO: 276);

AELKADEKSHAVILGDTRYG (SEQ ID NO: 277); o

EEKGTYHLAL (SEQ NO: 278). Una proteína de Subfamilia B de 2086 comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos, de acuerdo con una realización de la presente invención:

LITLESGEFQ (SEQ ID NO: 279);

SALTALQTEQ (SEQ ID NO: 280);

FQVYKQSHSA (SEQ ID NO: 281);

LITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQ (SEQ ID NO: 282);

IGDIAGEHTS (SEQ ID NO: 283);

EHTSFDKLPK (SEQ ID NO: 284);

IGDIAGEHTSFDKLPK (SEQ ID NO: 285);

ATYRGTAFGS (SEQ ID NO: 286);

DDAGGKLTYT (SEQ ID NO: 287);

IDFAAKQGHG (SEQ ID NO: 288);

KIEHLKSPEL (SEQ ID NO: 289);

ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNV (SEQ ID NO: 290);

HAVISGSVLY (SEQ ID NO: 291);

KGSYSLGIFG (SEQ ID NO: 292);

VLYNQDEKGS (SEQ ID NO: 293);

HAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFG (SEQ ID NO: 294);

AQEVAGSAEV (SEQ ID NO: 295);

IHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 296);

VETANGIHHI (SEQ ID NO: 297);

AQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 298); o

VAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 299). La proteína 2086 comprende la siguiente secuencia consenso de acuerdo con una realización de la presente invención.

Secuencia Consenso de Proteína 2086 (SEQ ID NO: 300):

imagen10

19 5

10

15

20

25

30

35

En la secuencia consenso anterior, la “x” representa cualquier aminoácido, la región de la posición del aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos, la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos, y la posición del aminoácido 156 es cualquiera de 0 a 1 aminoácidos. La región de la posición del aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 preferentemente comprende 0, 4 o 5 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 preferentemente comprende 0 o 3 aminoácidos. Debería observarse particularmente que esta secuencia consenso ilustra la alta variabilidad de las proteínas 2086. Como teoría, sin pretender quedado ligado a la misma, se cree que esta alta variabilidad proporciona la reactividad cruzada ventajosa e inesperada.

De acuerdo con una implementación de la presente invención, las proteínas 2086 se caracterizan como inmunogénicas, no patógenas y no específicas de cepa. Estas proteínas muestran inesperadamente inmunogenicidad mientras que son de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 40 % no conservadas.

Como se usa en el presente documento, la expresión “no conservada” se refiere al número de aminoácidos que pueden experimentar inserciones, sustituciones y/o deleciones como un porcentaje del número total de aminoácidos en una proteína. Por ejemplo, si una proteína es 40 % no conservada y tiene, por ejemplo, 263 aminoácidos, entonces hay 105 posiciones de aminoácidos en la proteína en las que los aminoácidos pueden experimentar sustitución. De forma similar, si la proteína es 10 % no conservada y tiene, por ejemplo, aproximadamente 280 aminoácidos, entonces hay 28 posiciones de aminoácidos en las que los aminoácidos pueden experimentar sustitución. Las proteínas 2086 también pueden experimentar deleción de restos de aminoácidos sin comprometer la inmunogenicidad de las proteínas.

Además, las proteínas 2086 pueden dividirse en subfamilias basándose en la homología en diversas regiones. Por ejemplo, sin pretender quedar ligada a lo mismo, las secuencias consenso para dichas dos subfamilias, Subfamilia A y Subfamilia B, se proporcionan a continuación:

Secuencia de Subfamilia A de 2086 (SEC ID 301)

imagen11

La referencia “x” es cualquier aminoácido. La región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 8 es cualquiera de 0 a 4 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 8 preferentemente comprende 0 o 4

aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 preferentemente comprende 0 o 3 aminoácidos. Subfamilia B de 2086 (SEC ID 302)

imagen12

La referencia “x” es cualquier aminoácido. La región de la posición de aminoácido 8 a la posición de aminoácido 12 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 8 a la posición de aminoácido 12 preferentemente comprende 0 o 5

aminoácidos.

20

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

(Continuación)

Condición de rigurosidad: Híbrido polinucleotídico Longitud del híbrido (pb)I Temperatura de hibridación y tampónH Temperatura de lavado y tampónH

C: ADN:ARN > 50 67EC; SSC1x -o45EC; SSC1x, formamida al 50 % 67EC; SSC0,3x

D: ADN:ARN < 50 TD; SSC1x TD; SSC1x

E: ARN: ARN > 50 70EC; SSC1x -o50EC; SSC1x, formamida al 50 % 70EC; SSC0,3x

F: ARN: ARN < 50 TF; SSC1x Tf; SSC1x

G: ADN:ADN > 50 65EC; SSC4x -o42EC; SSC4x, formamida al 50 % 65EC; SSC1x

H: ADN:ADN < 50 TH; 4xSSC TH; SSC4x

I: ADN:ARN > 50 67EC; SSC4x -o45EC; SSC4x, formamida al 50 % 67EC; SSC1x

J: ADN:ARN < 50 TJ; SSC4x TJ; SSC4x

K: ARN: ARN > 50 70EC; SSC4x -o50EC; SSC4x, formamida al 50 % 67EC; SSC1x

L: ARN: ARN < 50 TL; 2xSSC TL; SSC2x

M: ADN:ADN > 50 50EC; SSC4x -o40EC; SSC6x, formamida al 50 % 50EC; SSC2x

N: ADN:ADN <50 TN; SSC6x TN; SSC6x

O: ADN:ARN > 50 55EC; SSC4x -o42EC; SSC6x, formamida al 50 % 55EC; SSC2x

P: ADN:ARN < 50 TP; SSC6x TP; SSC6x

Q: ARN: ARN > 50 60EC; SSC4x -o-45EC; SSC6x, formamida al 50 % 60EC; SSC2x

R: ARN: ARN < 50 TR; SSC4x TR; SSC4x

pbI: La longitud del híbrido es la anticipada para la región o regiones hibridadas de los polinucléotidos que hibridan. Cuando se hibrida un polinucleótido con un polinucleótido diana de secuencia desconocida, se supone que la longitud del híbrido es la del polinucleótido que hibrida. Cuando se hibridan polinucleótidos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o las regiones de complementariedades de secuencia óptimas. tampónH: SSPE (SSPE1x es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituir a SSC (SSC1x es NaCl 15 M y citrato sódico 15 M) en los tampones de hibridación y lavado; se realizan lavados durante 15 minutos después de completarse la hibridación. TB hasta TR: La temperatura de hibridación para híbridos que se anticipa que son de menos de 50 pares de bases de longitud debería ser de 5-10EC menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, cuando Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm(EC) = 2(nº de bases A + T) + 4(nº de bases G +C). Para híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm(EC) = 81,5 + 16,6 (log10[Na+]) + 0,41(% G+C) – (600/N), en la que N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación ([Na+]) para SSC1x = 0,165 M).

Se proporcionan ejemplos adicionales de condiciones de rigurosidad para la hibridación de polinucleótidos en Sambrook, J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 5 Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capítulos 9 y 11, y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4.

También se desvelan en el presente documento polinucleótidos que son completamente complementarios de estos polinucleótidos que también proporcionan secuencias antisentido.

Los polinucleótidos desvelados en el presente documento se preparan de muchas maneras (por ejemplo, por

10 síntesis química, de bibliotecas de ADN, del organismo en sí mismo) y pueden tomar diversas formas (por ejemplo, monocatenarias, bicatenarias, vectores, sondas, cebadores). El término “polinucleótido” incluye ADN y ARN y también sus análogos, tales como los que contienen cadenas principales modificadas.

Proteínas de fusión

También se desvelan en el presente documento proteínas de fusión. Una “proteína de fusión” se refiere a una

15 proteína codificada por dos genes fusionados, con frecuencia no relacionados, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden diversas partes de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína inmunogénica o parte de la misma. En muchos casos, el empleo de una región Fc de inmunoglobulina como parte de una proteína de fusión es ventajoso para su uso en terapia y diagnóstico dando como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (véase, por ejemplo, documento EP 0 232

27

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

TABLA III

CB50 de la cepa diana

Procedimiento: Fracción H44/76 880049 H355 539* M982

sOMP sin LOS: 1.000 215 450 NC 50

Detergente Extracciones: Extracto citoplasmático 200 NT NT NT NT

TX-100: >800 >800 >800 >800 <25

Zwittergent 3-12: 400 >25 100 400 <25

Zwittergent 3-14: <25 NT NT NT NT

Zw.3-14 + NaCl: <25 NT NT NT NT

Sarcosilo: <25 NT NT NT NT

Zw.3-14 + calor: <25 NT NT NT NT

IEF Preparatorio: Fracciones 1-3 (pH 2,3-3,9) 50 NT NT NT NT

Fracción 4 (pH 4,1): >800 <25 100 <25 NT

Fracción 5 (pH 4,3): >800 <25 100 200 NT

Fracción 6 (pH 4,5): 400 NT NT NT NT

Fracción 7 (pH 4,8): <25 NT NT NT NT

Fracciones 8-9 (pH 5,0-5,3): <25 NT NT NT NT

Fracciones 10-17 (pH 5,5-7,8): >800 200 <800 <800 NT

Intercambio aniónico: Adsorbida 400 NT 100 100 NT

No adsorbida: >6.400 NT <800 <800 NT

NT: no ensayado *El aislado clínico 539 es una cepa homóloga de 8529, aislada del mismo brote

Como se muestra en la FIG. 1A, estaban presentes dos proteínas principales en la fracción no adsorbida como se determinó por SDS-PAGE. Para identificar estas proteínas, se realizaron dos tipos de análisis. Un análisis fue

5 realizar degradación proteolítica limitada (Véase FIG. 1A y FIG. 1B) seguido de aislamiento de péptidos y secuenciación de proteínas directa. El otro análisis fue realizar SDS-PAGE seguido de escisión en gel, digestión proteolítica y EM-CL/EM (Espectrometría de Masas en Tándem con Cromatografía Líquida), (véase FIG. 3) para obtener información espectral de masas sobre los componentes de las preparaciones de interés. (Véase procedimientos de mapeo y secuenciación de péptidos descritos posteriormente en esta sección).

10 La secuencia genómica de N. meningitidis A Sanger usando los procedimientos y algoritmos descritos en Zagursky y Russell, 2001, BioTechniques, 31:636-659. Este análisis de extracción produjo más de 12.000 posibles Marcos Abiertos de Lectura (ORF). Tanto los datos de secuenciación directa como los datos espectrales de masas descritos anteriormente indicaron que los componentes principales de la fracción no adsorbida fueron los productos de varias ORF presentes en un análisis de la base de datos de Sanger. Las tres proteínas predominantes identificadas por

15 esta metodología corresponden a las ORF 4431, 5163 y 2086 (véase FIGS. 1B y 3).

Aunque la ORF 4431 fue la proteína más predominante identificada en las fracciones, los anticuerpos de ratón para 4431 lipidado recombinante no fueron bactericidas y no proporcionaron una respuesta protectora en un modelo animal. El análisis adicional de ORF 5136 está en progreso.

El segundo componente más predominante de las preparaciones descritas en el presente documento corresponde al 20 producto de ORF 2086.

34

imagen25

imagen26

TABLA IV: CEBADORES

SEQ ID NO. (CompuestoNº): Cebado r Secuencia Sitios de restricción

303 (4623): Inverso BamHI

304 (4624): Directo CTATTCTGCATATGACTAGGAGC NdeI

305 (4625): Directo AGCAGCGGAGGCGGCGGTGTC

306 (5005): Directo TGCCGATGCACTAACCGCACC

307 (5007): Inverso CGTTTCGCAACCATCTTCCCG

308 (5135): Inverso BglII

309 (5658): Directo GCGGATCCAGCGGAGGGGGTGGTGTCGCC BamHI

310 (5660): Inverso SphI

311 (6385): Directo GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGAAGC BamHI

312 (6406): Directo BglII y NdeI

313 (6470): Directo CTATTCTGCGTATGACTAG

314 (6472): Inverso GTCCGAACGGTAAATTATCGTG

315 (6473): Directo GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGTGTCGCC BamHI

316 (6474): Directo BglII y NdeI

317 (6495): Directo GACAGCCTGATAAACC

318 (6496): Inverso GATGCCGATTTCGTGAACC

319 (6543): Inverso GCGCATGCCTACTGTTTGCCGGCGATG SphI

320 (6605): Inverso BglII

321 (6721): Directo BglII y NdeI

Expresión de lipoproteínas de rLP2086 utilizando secuencia líder nativa:

En referencia a la FIG. 5, se transformó/transfectó o infectó con el plásmido pPX7340 células huésped BLR(DE3) pLysS (Life Sciences). Se seleccionó un transformante y se inoculó en 50 ml de Caldo de Cultivo Terrific que 5 contenía glucosa al 2 %, kanamicina (30 g/ml), cloranfenicol (30 g/ml) y tetraciclina (12 g/ml). La DO600 para el cultivo de una noche fue de 6,0. El cultivo de una noche se diluyó en 1 litro de Caldo de Cultivo Terrific con glicerol 1 % y los mismos antibióticos. La DO600 de partida fue de 0,4. Después de 2 horas la DO600 fue de 1,6 y se tomó una muestra pre-inducida. Se centrifugaron células equivalentes a una DO600 = 1 y se retiró el sobrenadante. El sedimento de células completas se resuspendió en 150 g de tampón Tris-EDTA y 150 l de tampón de muestras 10 SDS-PAGE 2x. Se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de 3,5 horas se tomó una muestra

37

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

TABLA VI-A

Cepa: Serosubtipo Fuente

M97 251854: B:4z, PI:4 MPHL

M98 250622: B:2b, PI:10 MPHL

M98 250572: B:2b, PI:10 MPHL

M98 250771: B:4z, PI.22,14 MPHL

M98 250732: B:4z, PI.22,14a MPHL

M98 250809: B:15, PI:7,16 MPHL

M97 252697: B:1, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 252988: B:4, PI:6, P1.18,25,6 MPHL

M97 252976: B:4, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 252153: B:4, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 253248: B:15,PI:7, NT, 16 MPHL

CDC1610: P1:NT 4(15), P1.18-7,16-14 CDC

CDC1521: P1.6,3 2b(4) CDC

CDC1034: P1.7 4(15) CDC

L8: P1.7,1 15(4) Walter Reed

CDC1492: P1.7,1 4(15) CDC

870446: P1.12a,13 RIVM

CDC2369: P1.(9),14 CDC

6557: P1.(9),14, P1.22a,14a RIVM

2996: P1.5,2, P1.5a,2c RIVM

NmB: P1.5,2, P1.5a,2c UIOWA

L3: P1.5,2 Walter Reed

B16B6: P1.5,2 RIVM

CDC1135: CDC

L5: P1.NT, P1.21-6,1 Walter Reed

L4: P1.21,16 Walter Reed

W135: Walter Reed

C11: C:16, P1.7,1 CDC

Y: Walter Reed

TABLA VI-B

Cepa: Serosubtipo Fuente

M98 250670: B:1, PI:4 MPHL

M98 250024: B:1, PI:4 MPHL

M97 253524: B:1, PI:4 MPHL

M97 252060: B:1, PI:4 MPHL

M97 251870: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251836: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251830: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251905: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251898: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251885: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251876: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251994: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251985: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251957: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251926: B:4z, PI:4 MPHL

43

(continuación)

M97 252045: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252038: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252026: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252010: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252098: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252083: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252078: B:4z, PI:4 MPHL

M98 250735: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250797: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250768: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250716: B:2b, PI:10 MPHL

M98 250699: B:4z,PI:10 MPHL

M98 250393: B:4z,PI:10 MPHL

M98 250173: B:4z,PI:10 MPHL

M97 253462: B:4z, PI:14 MPHL

M98 250762: B:15, PI:7,16 MPHL

M98 250610: B:15, PI:7,16 MPHL

M98 250626: B:15, PI:7,16 MPHL

M97 250571: B:15, PI:16 MPHL

M97 252097: B:15, PI:16, PI.7b,16 MPHL

M97 253092: B:1, PI:6 MPHL

M97 252029: B:15,PI:7, NT MPHL

M97 251875: B:15,PI:7, NT MPHL

CDC1127: PI.7,16 4(15) CDC

CDC982: PI.7,16 4(15) CDC

CDC1359: PI.7,16 4(15) CDC

CDC798: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1078: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1614: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1658: PI.7,16 15(4) CDC

H44/76: PI.7,16 15(4) RIVM

CDC1985: P1.7,13 4(15) CDC

L6: P1.7,1 ?(4) Walter Reed

CDC1573: P1.7,1 4(15) CDC

L7: P1.7,(9),1 Walter Reed

CDC937: P1.7,3, P1.7b,3 CDC

8529: P1.7,3, P1.7b,3 RIVM

880049: P1.7b,4 RIVM

CDC2367: P1.15 4(15) CDC

H355: P1.19,15 RIVM

CDC1343: P1.14 4(15) CDC

M982: P1.22,9 RIVM

870227: P1.5c,10 RIVM

B40: P1.5c,10 RIVM

5315: P1.5c,10 RIVM

CDC983: P1.5,2 CDC

CDC852: P1.5,2 CDC

6940: P1.18,25 (6) RIVM

A4

44

imagen32

imagen33

imagen34

(continuación)

Variante de rLP2086: Homología de A.A. (%)1 pI teórico Pureza (%)2

M98250771: 62 6,1 83

Purificación de rLP2086 de Subfamilia B

TABLA XI

Variante de rLP2086: Homología de A.A. (%)1 pI teórico Pureza (%)2

8529: 100 7,5 96

M982: 94 6,3 96

88049: 92 6,2 90

CDC1573: 87 5,6 93

5

Procedimiento de Purificación: Todas las variantes se solubilizaron de membranas de E. coli con TX-100 (excepción rLP2086-8529 que se solubilizó con Sarcosilo o Urea). Se consiguió purificación adicional con una combinación de intercambio aniónico (TMAE), exclusión por tamaño y/o cromatografía de intercambio catiónico (Fractogel S) en un tampón Tris-HCl o NaPO4.

10 1 Homología de aminoácidos en comparación con P2086 de la cepa 8529.

2 Pureza como se determinada por SDS-PAGE y densitometría por láser de banda teñida por Coomassie coloidal (tinción Simply Blue).

Inmunogenicidad de un miembro de Subfamilia B, rLP2086-8529, ensayado frente a cepas homólogas y heterólogas.

15 La Tabla XII a continuación muestra la inmunogenicidad de un miembro de Subfamilia B, rLP2086-8529, ensayado frente a cepas homólogas y heterólogas.

TABLA XII

Cepa diana: Subfamilia de P2086 Serosubtipo de la cepa diana Homología de A.A.a Título de ELISA de células completasb Título de CB50 c

539: B P1.7-2,3 100 >1.458.000 3.200

H44/76: B P1.7,16 100 >1.458.000 3.200

H355: B P1.19,15 100 >1.458.000 3.200

CDC937: B P1.7-2,3-4 100 >1.458.000 >800

M97252097: B P1.7-2,16 100 >1.458.000 >800

870227: B P1.5-2,10 100 >1.458.000 <25

6940: B P1.18,25,6 97 900.162 >800

M982: B P1.22,9 94 435.909 200

880049: B P1.7-2,4 92 349.912 400

CDC1573: B P1.7-1,1 87 102.508 25

870446: A P1.12-1,13 71 389.829 800

M98250771: A P1.22,14 62 139.397 <25

NmB: A P1.5-1,2-2 71 <2.000 <25

48

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

TABLA XIX

Variantes de rLP2086 de Subfamilia -Caracterización

rLP2086-8529: rLP2086-M982 rLP2086-80049 rLP2086-CDC1573

Medio de cultivo: Apollon (Sanford) Apollon HySoy HySoy

Solubilidad: Urea 4 M ⇒Z3-12 rTX-100 ⇒Z3-12 rTX-100 ⇒Z3-12 rTX-100

Etapas de purificación: TMAE S Fractogel TMAE S Fractogel TMAE S Fractogel TMAE SEC

Pureza (%): 96 96 90 93

Rendimiento (mg/g de sedimento celular): 0,2 (fermentador) 1,6 (fermentador) 0,4 1,0

Tamaño: SEC (Z3-12) 95.000 110.000 150.000 100.000 120.000

EM: 27.785 (822 lípido) 27.719 (711 lipid) 28.044 (819 lípido) 28.385 (823 lípido)

Punto medio de transición de desnaturalización térmica (TM) ºC: 70 °C 75 °C 62 °C NT

Proteína disponible (mg): Urea – 34 mg Sarc – 36 mg Grupo 1 – 47 mg Grupo 2 – 17 mg 3,6 mg 4,9 mg

Homología de secuencia de 8529 (%): 100 94 92 87

La Tabla XX a continuación proporciona los resultados de ensayos bactericidas en suero fluorescentes para la Subfamilia A de 2086.

TABLA XX

Descripción: 250771 870446 6557 NMB M98 250732 M97 252697

rLP2086-252988, 10 g: >800 (99 %)* >800 (99 %)* <25 - >800 (99 %)* >800 (93 %)*

rLP2086-C11, 10 g: 200 >880 (91 %)* <25 - 200 400

rLP2086-250771, 10 g: >800 (92 %)* >800 (99 %)* <25 - >800 (96 %)* >800 (84 %)*

rLP2086-870446, 10 g: 400 >800 (99 %)* <25 - 400 400

rLP2086-2996, 10 g: 800 >800 (99 %)* <25 - >800 (93 %)* >800 (72 %)*

rLP2086-8529 + rLP2086-2996, 10 g: 800 >800 (99 %)* <25 - >800 (80 %)* >800 (72 %)*

rLP2086-8529 + rP1,22a,14a + rP1,5a,2c, 10 g: - 800 200 >800 (98 %)* - -

rLP2086-8529 +rLP2086-2996 + rP1,22a,14a +rP1,5a,2c, 10 g: 400 >800 (99 %)* 200 >800 (99 %)* 400 >800 (88 %)*

Vesículas de NMB/rLP2086-8529, 20 g: - 100 - 400 - -

56

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

imagen46

imagen47

imagen48

imagen49

imagen50

imagen51

imagen52

imagen53

imagen54

imagen55

imagen56

imagen57

imagen58

imagen59

imagen60

imagen61

imagen62

imagen63

imagen64

imagen65

Claims

imagen1

imagen2