CN104736563A

CN104736563A - Cd147作为受体用于脑膜炎球菌至血管内皮的菌毛介导的粘附

Info

Publication number: CN104736563A
Application number: CN201380040023.9A
Authority: CN
Inventors: X·纳西夫; 桑德赖恩·鲍尔图鲁斯; 奥利维尔·乔恩-兰伯特
Original assignee: NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST; Universite Paris Descartes
Current assignee: NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST; Universite Paris Descartes
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2013-07-15
Publication date: 2015-06-24
Also published as: JP2015524418A; US20180340017A1; AU2013295242C1; HK1205138A1; US20190389927A1; WO2014016152A1; CA2875391A1; EP2877492A1; US20150110806A1; US10000545B2; AU2013295242B2; AU2013295242A1; AU2013295242B9

Abstract

本发明涉及IV型菌毛相关蛋白和CD147之间相互作用的抑制剂在预防或治疗脑膜炎球菌菌血症和/或感染中的应用。本发明还涉及这样的抑制剂和抗菌化合物的组合应用，该抗菌化合物诸如为一种用于预防或治疗脑膜炎球菌感染的化合物。本发明还涉及用于预防和/或治疗脑膜炎球菌菌血症和/或感染的方法，及用于筛选IV型菌毛相关蛋白和CD147之间相互作用的抑制剂的方法。

Description

CD147作为受体用于脑膜炎球菌至血管内皮的菌毛介导的粘附

技术领域

背景技术

脑膜炎球菌(N.meningitidis(脑膜炎奈瑟菌),Nm)(引起流行性脑膜炎和脓毒病的原因)是人类鼻咽的共生的革兰氏阴性菌。在血流侵入之后，致命的荚膜细菌粘附至脑内皮细胞并且在宿主细胞的顶面上增殖，以在细菌最初附着的位点处形成微菌落，然后穿过血脑屏障(BBB)移生于脑膜(Nassif等人,2002,Trends Microbiol,10:227-232)。

脑膜炎球菌感染的主要临床症状是脑膜炎。自相矛盾地是，脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)是人类鼻咽的常见的无症状的移生群，并且感染中仅非常小的部分发展成持续的菌血症。在大多数菌血症患者中，N.meningitidis在血流中的存在将一直是无症状的。但是，在血相(blood phase)过程中，细菌将与脑的内皮细胞相互作用并且侵入脑膜，从而引起脑膜炎，这是在70％患者中脑膜炎球菌扩散的最早的临床并发症。在30％的菌血症患者中，血流中脑膜炎球菌的存在将导致败血症的临床症状，在一些情况中伴有爆发性紫癜(purpura fulminans)。在后一种情况中，细菌穿过血脑屏障。但是，脑膜炎症状不处于临床表现的最前部。

Nm的显露和流行潜力与外膜组分(荚膜多糖和脂低聚糖[内毒素])的表达相关，同时，Nm与外周和脑血管细胞牢固相互作用的倾向依赖于IV型菌毛(pili)的表达。这些从细菌细胞表面延伸的长的细丝结构显示出惊人的多功能性，包括致命的包被的脑膜炎球菌与细胞的附接，及引发宿主信号传导事件，这些事件促进细菌菌落在内皮细胞表面的稳定性并且推动随后穿过内皮屏障的转移。IV型菌毛由杂多聚体菌毛蛋白亚基(hetero-multimeric pilin subunit)组成，该杂多聚体菌毛蛋白亚基通过复杂的体系组装成螺旋纤维。它们由毛发生成所需的主要的菌毛蛋白PilE和其它低丰度的菌毛蛋白(诸如PilV、PilX或Comp)组成，该低丰度的菌毛蛋白在结构上与PilE类似并且调节菌毛的粘附和信号传导功能。IV型菌毛的粘附特性还受到菌毛体系(诸如PilC1等位基因)的组分的调节，使得使用遗传途径难以鉴定参与与宿主细胞受体的直接相互作用的分子决定因子。因此，复杂的菌毛结构的精确粘附组分仍然不明确。但是，最近已经鉴定处宿主的G-蛋白偶联的β2-肾上腺素能受体是脑膜炎球菌IV型菌毛的必不可少的内皮受体，以引发信号传导事件(Coureuil等人,2010,Cell,143:1149-1160；Lecuyer等人,2011,Infect Immun,80:175-186)。此外，已经鉴定出，当面对细菌时，人脑内皮细胞系的细胞表面上的Nm菌落促使βarrs转移至质膜的内表面。在菌落下面转移的βarrs起到Nm导致的信号传导事件的脚手架平台的作用。在细胞系中表达的GPCR中，仅β2-肾上腺受体(β2AR)在菌落下面形成皮质斑并且在细胞单层的细菌交叉(bacterial crossing)中发挥了容许复制(permissive)的作用。这些观察结果显示了通过Nm征用β2-肾上腺素能/β-抑制蛋白信号传导途径，以促使稳定粘附至人脑的内皮细胞上以及BBB的随后的相交。更具体地，已经示出β2AR，尤其是β2AR的N-末端与IV型菌毛-相关联的蛋白(诸如PilE或PilV)的相互作用，起始了允许N.meningitidis打开并穿过BBB的过程。

但是，缺失β2-肾上腺素能受体的内皮细胞仍然支持细菌的粘附，表明IV型菌毛蛋白通过与另一仍然未知的受体的相互作用促使脑膜炎球菌的最初附接。

因此，预防脑膜炎球菌至内皮细胞的初级附接将预防血流中的脑膜扩散(即脑膜炎球菌菌血症)，和/或脑膜炎球菌感染，并且从而将预防细菌脑膜炎和/或爆发性紫癜。

发明内容

发明人已经发现了脑膜炎球菌至内皮细胞的最初粘附是通过存在于脑膜炎球菌表面上的IV型菌毛-相关蛋白与存在与宿主内皮细胞表面上的CD147之间的相互作用介导的，并且这样的相互作用可以被阻断，从而抑制脑膜炎球菌菌血症和由此导致的脑膜炎球菌感染。

因此，本发明涉及IV型菌毛-相关蛋白和CD147之间相互作用的抑制剂，用于预防或治疗脑膜炎球菌菌血症和/或感染的应用。所述抑制剂优选是(i)CD147抑制剂和/或(ii)IV型菌毛-相关蛋白抑制剂。优选地，所述相互作用是直接的相互作用。

在一个实施方式中，所述抑制剂包括CD147的抑制剂，该CD147的抑制剂是能够与CD147受体相互作用的多肽，并且从而抑制IV型菌毛-相关蛋白和CD147受体之间的相互作用。

在一个实施方式中，该多肽是抗CD147的抗体或抗体片段，优选针对CD147的胞外部分，并且，通过这样的相互作用，尤其通过结合，所述抗体抑制IV型菌毛-相关蛋白和CD147受体之间的相互作用，或预防或完全破坏IV型菌毛-相关蛋白至CD147的附接。在一个实施方式中，所述抗CD147的抗体是MEM-M6/6抗体。

在另一个实施方式中，多肽可以是IV型菌毛-相关蛋白的片段，该片段能够与CD147受体结合并且与细菌竞争，从而抑制IV型菌毛-相关蛋白和CD147受体之间的相互作用，或预防或完全破坏IV型菌毛-相关蛋白至CD147的附接。

在另一个实施方式中，所述抑制剂包括CD147的抑制剂，该CD147的抑制剂是核酸，优选是使CD147表达沉默的dsRNA。所述CD147的抑制剂可以包括使CD147表达沉默的一种siRNA或几种siRNA，优选序列SEQ ID NO:1、2、3、4或5中的至少一种siRNA。

在另一个实施方式中，所述抑制剂包括IV型菌毛-相关蛋白的抑制剂，该IV型菌毛-相关蛋白的抑制剂是能够与IV型菌毛-相关蛋白相互作用的多肽，并且从而抑制IV型菌毛-相关蛋白和CD147受体之间的相互作用。

在一个实施方式中，该多肽是抗IV型菌毛-相关蛋白的抗体或抗体片段，优选针对与CD147的结合位点，并且，通过这样的相互作用，尤其通过结合，所述抗体抑制IV型菌毛-相关蛋白和CD147受体之间的相互作用，或预防或完全破坏IV型菌毛-相关蛋白至CD147的附接。

在另一个实施方式中，该多肽是CD147多肽，优选包括能够与IV型菌毛-相关蛋白结合的CD147氨基酸序列或其片段的多肽，其中，所述抗体或多肽抑制IV型菌毛-相关蛋白和CD147受体之间的相互作用。

在一个实施方式中，所述CD147多肽包括CD147胞外结构域的可溶形式或其片段，或由CD147胞外结构域的可溶形式或其片段组成，其中，所述可溶形式或片段抑制IV型菌毛-相关蛋白和CD147受体之间的相互作用。所述CD147胞外结构域的可溶形式可以包括序列SEQ ID NO:6或其片段，或者由序列SEQ ID NO:6或其片段组成。

本申请还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括IV型菌毛-相关蛋白和CD147之间的相互作用的抑制剂，及药学上可接受的递送剂(vehicle)、稀释剂或载剂。

本申请还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括IV型菌毛-相关蛋白和CD147之间的相互作用的抑制剂，及额外的至少一种抗菌化合物。所述组合物包括药学上可接受的递送剂、稀释剂或载剂。根据一个特征，所述组合物用于同时、独立或顺序地给予包括人类的哺乳动物。优选地，所述至少一种抗菌化合物是：(i)脑膜炎球菌疫苗抗原，或(ii)包括至少两种脑膜炎球菌疫苗抗原的融合蛋白。所述脑膜炎球菌疫苗抗原可以包括脑膜炎球菌PilE、PilV、PilX、PilC、ComP、fHbp、PorA、NHBA、NadA、MafA、NspA、HmbR、TbpB、AusP或其片段，或由脑膜炎球菌PilE、PilV、PilX、PilC、ComP、fHbp、PorA、NHBA、NadA、MafA、NspA、HmbR、TbpB、AusP或其片段组成。

本申请进一步提供了IV型菌毛-相关蛋白和CD147之间的相互作用的抑制剂，在预防脑膜炎球菌粘附至内皮细胞的方法中的应用。该方法可以在体内或者体外应用。

本申请还提供了一种预防或治疗脑膜炎球菌菌血症和/或脑膜炎球菌感染的方法，该方法包括给予有需要的个体(哺乳动物，优选人类)治疗有效量的，如本文所公开且提供的，IV型菌毛-相关蛋白和CD147之间的相互作用的抑制剂或者组合物。

本发明还提供了IV型菌毛相关蛋白和CD147之间相互作用的抑制剂在制造药剂中的应用，所述药剂用于预防或治疗脑膜炎球菌菌血症和/或感染。

本发明还提供了一种用于筛选IV型菌毛相关蛋白和CD147受体之间相互作用的抑制剂的方法，其中，所述方法包括由以下步骤所组成的步骤：

a)利用含IV型菌毛相关蛋白或其片段，及CD147受体或其片段的介质，其中，所述IV型菌毛相关蛋白或其片段与所述CD147受体或其片段能够特异性相互作用在一起以形成结合对；

b)使所述介质与候选化合物接触；

c)测量所述IV型菌毛相关蛋白或其片段与所述CD147受体或其片段之间的相互作用的抑制。

定义

“脑膜炎球菌菌血症”指能存活的脑膜炎球菌的瞬时进入宿主血液中，且没有任何临床症状。

“脑膜炎球菌感染”指能存活的脑膜炎球菌在宿主中的持续存在，且有临床症状。

“脑膜炎球菌”指Neisseria meningitidis(Nm)细菌，优选血清组A、B、C、Y或W135的Nm。

“IV型菌毛相关蛋白”指存在于细菌菌毛表面的蛋白。例如，所述IV型菌毛相关蛋白可以是PilE、PilV、PilX、PilC或ComP蛋白。优选地，所述IV型菌毛相关蛋白是PilE或PilV蛋白，并且更优选地是源自任何脑膜炎球菌血清组，例如来自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌的PilE或PilV蛋白。

“CD147”也称为基础免疫球蛋白(Basigin)(BSG)或细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)，是在N-端胞外部分含有两个高度糖基化的C2型免疫球蛋白样结构域的免疫球蛋白超家族的成员。在一些实施方式中，CD147包括以下序列或由以下序列组成:

a)序列SEQ ID NO:7(NCBI参考序列NP_001719.2，于2012年2月26日更新)，

b)序列SEQ ID NO:8(NCBI参考序列NP_940991.1，于2012年2月26日更新)，

c)核酸SEQ ID NO:9编码的序列(NCBI参考序列NM_001728.2，于2012年2月26日更新)，

d)核酸SEQ ID NO:10编码的序列(NCBI参考序列NM_198589.1，于2012年2月26日更新)，

e)与a)至d)的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列。

“IV型菌毛相关蛋白和CD147之间的相互作用”指存在于脑膜炎球菌表面的IV型菌毛相关蛋白与存在于宿主的内皮细胞(诸如外周内皮细胞或脑内皮细胞)表面的CD147之间的直接的相互作用。事实上，发明人已经发现了IV型菌毛相关蛋白与CD147之间的直接的相互作用允许脑膜炎球菌粘附至内皮细胞，从而允许脑膜炎球菌感染血管，诸如脑血管和外周血管。

“抑制剂”指能够降低或完全破坏IV型菌毛相关蛋白与CD147之间的相互作用的试剂。所述抑制剂还可以能够降低或完全破坏CD147的表达。根据本发明，所述抑制剂优选是(i)CD147抑制剂和/或(ii)IV型菌毛-相关蛋白的抑制剂。

优选地，所述抑制剂能够降低或完全破坏至少10％、20％、30％、40％，更优选至少50％、60％、70％，并且最优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的IV型菌毛相关蛋白与CD147之间的相互作用。

本文中引用的多肽和核酸包括本文中公开的氨基酸序列和核酸序列，以及所述序列的变异体。

变异蛋白可以是天然出现的变异体，诸如剪接变异体、等位基因和亚型，或者它们可以是由重组手段产生的。氨基酸序列中的变异可以是通过取代、缺失或在编码蛋白的核酸序列中插入一个或多个密码子从而导致蛋白的氨基酸序列的改变而产生的。任选地，变异是蛋白中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多的氨基酸被任何其它的氨基酸取代。额外或可选地，变异可以是在蛋白内添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多的氨基酸。

变异核酸序列包括能够在中度或高度严格条件下，与SEQ ID No:1-5、9、10的序列特异性杂交的序列。可以通过以下条件鉴定严格条件或高度严格条件：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如在50℃，0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如在42℃，50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH为6.5的50mM磷酸钠缓冲液与750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠。(3)采用42℃，50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x登哈特氏(Denhardt's)溶液，经超声的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，并且在42℃下，在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中在55℃下洗涤，然后在55℃下进行由含EDTA的0.1x SSC组成的高度严格的洗涤。可以鉴定如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验指南),New York(纽约):Cold Spring Harbor Press(冷泉港出版社),1989)所述的中等严格条件，并且中等严格条件包括使用比上述条件严格性低的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中度严格条件的实例是在溶液中，在37℃孵育过夜，包括：20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt's溶液，10％硫酸葡聚糖，和20mg/ml变形的经剪切的鲑鱼精DNA，然后在约37-50℃下在1x SSC中洗涤过滤器。

本文中公开的蛋白和变异蛋白的片段也被包含在本发明中。例如当与全长的蛋白相比时，这样的片段可以是在N-末端或C-末端被截短的，或者可以是缺少内部残基。优选地，所述片段的长度至少是约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、250、300、350、400、450、500个或更多的氨基酸。

本文中公开的核酸序列和变异体的片段也被包含在本发明中。例如当与全长的核酸序列相比时，这样的片段可以是在3’端或5’端被截短的，或者可以是缺少内部碱基。优选地，所述片段的长度至少是约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、250、300、350、400、450、500个或更多的碱基。

变异蛋白可以包括由上述变异的核酸序列编码的蛋白。变异蛋白也可以包括具有与本文公开的多肽序列有至少约80％氨基酸序列一致性的蛋白。优选地，变异蛋白应具有与本文公开的全长多肽序列或多肽序列的片段有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列一致性。氨基酸序列一致性被定义为在对序列进行比对并且进入缺口之后(如必要的话，以实现最大百分比的序列一致性，并且不考虑任何保守取代作为序列一致性的一部分)，变异序列中与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以在变异序列的全长、参考序列的全长或这两种序列的全长上确定序列一致性。

变异核酸序列可以包括具有与本文公开的核酸序列有至少约80％的核苷酸序列一致性的核酸序列。优选地，变异核酸应具有与本文公开的全长核酸序列或核酸序列的片段有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列一致性。核酸序列一致性被定义为在对序列进行比对并且进入缺口之后(如必要的话，以实现最大百分比的序列一致性，并且不考虑任何保守取代作为序列一致性的一部分)，变异序列中与参考序列中的核酸相同的核酸的百分比。可以在变异序列的全长、参考序列的全长或这两种序列的全长上确定序列一致性。

与参考肽“基本同源的”肽可以源自于通过一种或多种保守取代的参考序列。优选地，这些同源肽不包括两个半胱氨酸残基，以便预防环化。当一个或多个氨基酸残基被生物学类似的残基替换或当超过80％的氨基酸是相同的，或超过约90％，优选超过约95％的氨基酸是类似的(功能相同的)时，两条氨基酸序列是“基本同源的”或“基本类似的”。

具有与本发明的查询氨基酸序列至少例如95％“相同的”的氨基酸序列的多肽，指主题多肽的氨基酸序列与查询序列相同，但除了主题多肽序列可以包括在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中多达五个氨基酸变化之外。换句话说，为了获得具有与查询氨基酸序列有至少95％相同的氨基酸序列的多肽，在主题序列中的多达5％(100个氨基酸中的5个)的氨基酸残基可以被插入、缺失或取代为另一氨基酸。

在本申请的上下文中，使用总体比对(即两条序列在它们的全长上进行对比)计算一致性的百分比。对比两条或更多条序列一致性的方法在本领域中是公知的。例如可以使用《针(needle)》程序,该《needle》程序为当考虑它们的全长时，使用Needleman-Wunsch总体比对算法(Needleman和Wunsch,1970J.Mol.Biol.48:443-453)以发现两条序列的最佳比对(包括缺口)。needle程序例如在ebi.ac.uk全球信息网(world wide web site)上是可用的。优选使用EMBOSS::needle(总体)程序计算根据本发明的一致性百分比，该EMBOSS::needle(总体)程序具有等于10.0的“缺口开放(Gap Open)”参数、等于0.5的“Gap Extend”参数和Blosum62矩阵。

与参考序列相比，由与参考序列“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的”氨基酸序列组成的蛋白可以包括诸如缺失、插入和/或取代的突变。在取代的情况中，由与参考序列“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的”氨基酸序列组成的蛋白可以对应于源自除参考序列之外的另一物种的同源序列。

氨基酸取代可以是保守的或非保守的。优选地，取代是保守取代，其中，一个氨基酸被取代为具有类似结构和/或化学性质的另一氨基酸。取代优选对应于如下表所示的保守取代。

术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点的分子，该抗原结合位点与抗原免疫特异性结合。同样地，术语抗体涵盖完整的单克隆抗体，多克隆抗体，嵌合的人源化或人类抗体，抗体，双抗体，由至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体),纳米抗体，骆驼科动物的抗体，以及抗体片段。在天然抗体中，两条重链通过二硫键彼此连接，并且每一条重链都通过二硫键与轻链连接。存在两种类型的轻链，λ型和κ型。存在五种主要的重链类型(或同型)，这五种主要的重链类型(或同型)决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每一条链都含有不同的序列结构域。轻链包括两种结构域：可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四种结构域：可变结构域(VH)和三种恒定结构域(CH1、CH2和CH3，总体称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区域决定对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区域结构域赋予了重要的生物性质，诸如抗体链相连、分泌、经胎盘的流动性、互补结合及与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性存在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基构成。偶尔，来自非高变区或骨架区(FR)的残基影响整体的结构域结构，并且因此影响结合位点。互补决定区(CDR)指一起限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区域的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三种CDR，分别命名为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原结合位点包括六种CDR，包括来自重链和轻链V区的每一区的CDR组。

如Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)(National Institutes of Health(国立卫生研究院),Bethesda(贝塞斯达),Md.,1991)所定义的，骨架区(FR)指插在CDR(即免疫球蛋白的轻链和重链的可变区域的那些部分)之间的在单一物种中，在不同的免疫球蛋白之间是相对保守的氨基酸序列。本文所使用的“人类骨架区”是与天然发现的人类抗体的骨架区基本相同(约85％，或更具体地90％、95％或100％相同)的骨架区。

本文所使用的术语“单克隆抗体”或“mAb”指单一的氨基酸组成的抗体分子，针对特异性抗原并且可以通过B细胞或杂交瘤的单一克隆生成。单克隆抗体还可以是重组的，即是通过蛋白工程产生的。

术语“嵌合抗体”指经基因工程改造的抗体，包括与另一抗体(尤其是人类抗体)的CH结构域和CL结构域相关联的，源自非人类的动物的抗体的VH结构域和VL结构域。作为非人类的动物，可以使用任何动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠、兔等。嵌合抗体还可以指对至少两种不同的抗原具有特异性的多特异性抗体。

术语“人源化抗体”指抗体，该抗体中，与亲本免疫球蛋白的序列相比，骨架区或“互补决定区”(CDR)已经被修改以包括来自具有不同特异性的供体免疫球蛋白。在优选的实施方式中，鼠源CDR被植入人类抗体的骨架区中，以制备“人源化抗体”。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区域。抗体片段的实例包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2、双抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“Fab”指分子量约为50,000并且具有抗原结合活性的抗体片段，其中，在通过蛋白酶处理IgG获得的片段中，H链的约一半的N-端侧和整个L链通过二硫键结合在一起。

术语“F(ab')₂”指分子量约为100,000并且具有抗原结合活性的抗体片段，在通过蛋白酶(胃蛋白酶)处理IgG获得的片段中，F(ab')₂比经由铰链区的二硫键结合的Fab稍大。

术语“Fab'”指分子量约为50,000并且具有抗原结合活性的抗体片段，Fab'是通过剪切F(ab')₂的铰链区的二硫键获得的。

单链Fv("scFv")多肽是共价连接的VH::VL杂二聚体，通常从包括VH和VL编码基因的基因融合表达该共价连接的VH::VL杂二聚体，其通过编码肽的接头连接VH和VL编码基因。优选通过使用基因重组技术，本发明的人类scFv片段包括保持为适当的构象的CDR。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL杂二聚体。二价和多价抗体片段可以自然地来自单价scFv的相连，或者可以通过肽接头连接单价scFv生成，诸如双价sc(Fv)₂。

术语“双抗体”指具有两种抗原结合位点的小的抗体片段，该片段包括在同一多肽链(VH-VL)中，与轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过使用接头，且该接头太短而不能允许在同一链上的两个结构域的配对，从而促使结构域与另一链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。

“反义核酸”指非酶促核酸分子，该非酶促核酸分子通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白核酸；Egholm等人,1993,Nature 365,566)相互作用的方式与靶RNA结合，并且改变靶RNA的活性(参见Stein和Cheng,1993,Science 261,1004,及Woolf等人,美国专利号5,849,902的综述)。典型地，反义分子沿该反义分子的单一连续序列与靶序列互补。但是，在特定实施方式中，反义分子可以与底物结合，以便该底物分子形成环或发夹，和/或反义分子可以结合，以便该反义分子形成环或发夹。因此，反义分子可以与2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多的非连续底物序列互补，或反义分子的2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多的非连续序列部分可以与靶序列或两种序列都互补(例如，参见Crooke,2000,Methods Enzymol.,313,3-45)。此外，反义DNA可以用于通过DNA-RNA相互作用的方式靶定RNA，从而激活RNAse H，RNAse H消化双链中的靶RNA。反义寡核苷酸可以包括一种或多种RNAse H活化区域,该区域能够激活RNAse H以剪切靶RNA。

通过引入，反义核酸进入一般称为RNA干扰(RNAi)途径的细胞途径。术语“RNA干扰”或“RNAi”指RNA的选择性细胞内降解，这也称为基因沉默。RNAi还包括通过小的干扰RNA(siRNA)进行翻译抑制。可以通过引入长的双链RNA(dsRNA)或siRNA或细胞内产生siRNA(例如来自质粒或转基因)起始RNAi，以使一种或多种靶基因的表面沉默。可选择地，RNAi天然存在于细胞中，以去除外源RNA，例如病毒RNA。天然的RNAi经由dicer(内切酶)推进前体dsRNA的定向的片段化，使降解机制针对其它同源的RNA序列。

在一些实施方式中，反义核酸可以是长的双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和/或小干扰RNA(siRNA)。

本文所使用的“长的双链RNA”或“dsRNA”指基因组或合成来源的或源自载体表达的，经修改或未经修改的寡核苷酸或多聚核糖核苷酸及其片段或部分，可以是部分或完整的双链，并且可以是平端的或含有5’和/或3’突出端，并且还可以为发夹形式，该发夹形式包括自身折叠以得到双链区域的单一的寡核糖核苷酸。在一些实施方式中，dsRNA的大小在150bp至3000bp的范围内，优选在250bp至2000bp的范围内，仍然更优选在300bp至1000bp的范围内。在一些实施方式中，所述dsRNA的大小至少为150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500bp。在一些实施方式中，所述dsRNA的大小至多为3000、2500、2000、1500、1000、950、900、850、800、750,700、650、600、550、500、450、400、350、300bp。

“小干扰RNA”或“siRNA”是靶向感兴趣的基因的核苷酸的RNA双链。RNA双链指通过RNA分子的两个区域之间的互补配对形成的结构。siRNA靶向基因，其中，siRNA双链部分的核苷酸序列与靶定基因的核苷酸序列互补。在一些实施方式中，siRNA的双链的长度在15个核苷酸至50个核苷酸的范围内，优选在20个核苷酸至35个核苷酸的范围内，仍然更优选在21个核苷酸至29个核苷酸的范围内。在一些实施方式中，所述双链的长度可至少为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50个核苷酸。在一些实施方式中，所述双链的长度可至多为45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、35、17、16、15个核苷酸。siRNA的RNA双链部分可以是发夹结构的一部分。除了双链部分之外，发夹结构可以含有位于形成双链的两条序列之间的环状部分。环的长度可以变化。在一些实施方式中，环的长度为5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构还可以含有3或5个突出端部分。在一些实施方式中，突出端为3’或5’突出端，并且长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸。

将反义核酸注入和转染进入细胞和有机体中已经是递送的主要方法。但是，还可以使用表达载体，以在瞬时和稳定转染的哺乳动物细胞中持续表达反义核酸。(例如参见Brummelkamp等人,2002,Science,296:550-553；Paddison等人,2002,Genes&Dev,16:948-958)。

使用例如如在Caruthers等人,1992,Methods in Enzymology,211:3-19；International PCT公开号WO 99/54459；Brennan等人,1998,Biotechnol Bioeng,61:33-45；和美国专利号6,001,311中描述的本领域已知的方案，经由使用单链DNA表达载体或其等价体，可以化学合成或表达反义核酸。在非限制性实例中，在394Applied Biosystems,Inc.(应用生物系统公司)合成仪上进行小规模的合成。可选择地，本发明的反义核酸分子可以独立地合成，并且在合成后例如通过连接反应(ligation)(国际PCT公开号WO 93/23569；Bellon等人,1997,Bioconjugate Chem,8:204)接合在一起。

优选地，本发明的反义核酸可以能够降低至少10％、20％、30％、40％，更优选至少50％、60％、70％，并且最优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的CD147的表达。

“脑膜炎球菌疫苗抗原”指脑膜炎球菌抗原，该脑膜炎球菌抗原能够引起针对N.meningitidis的免疫应答，并且适于用作疫苗或用作免疫原性化合物。

“免疫原性化合物”指：当给予个体时，激发或免疫调节(即免疫抑制或刺激免疫)免疫应答的化合物；或者，当给予个体时，诱导抗体产生的化合物。

本文所使用的“疫苗”指给予以免疫调节免疫应答的化合物，诸如本文所述的免疫原性化合物。尤其由于该试剂，将保护或治疗个体的疾病。疫苗可以是：有疗效的(治疗)疫苗，即用于在开始患病之后给予个体，希望降低或阻挡疾病进展；和/或防护性(预防性)疫苗，用于在开始患病之前给予个体，希望预防初始(和/或反复)感染。

术语“受试者”、“个体”或“宿主”可互换使用，并且可以例如是人类或非人类的哺乳动物。优选地，受试者是男人、女人或儿童。

IV型菌毛相关蛋白和CD147之间的相互作用的抑制剂

本发明涉及IV型菌毛相关蛋白和CD147受体之间相互作用的抑制剂，用于预防或治疗脑膜炎球菌菌血症和/或感染，其中所述抑制剂是：

(i)CD147的抑制剂，和/或

(ii)IV型菌毛相关蛋白的抑制剂。

在一些实施方式中，CD147的抑制剂是抗CD147的抗体或反义核酸，其中，所述抗体抑制IV型菌毛相关蛋白和CD147受体之间的相互作用，并且所述反义核酸使CD147受体表达沉默。

在一个实施方式中，所述反义核酸可以包括以下序列或由以下序列组成，所述序列能够抑制或降低序列为SEQ ID NO:7或8的CD147，或者由核酸SEQID NO:9或10编码的序列的CD147的表达。所述反义核酸可以包括以下序列或由以下序列组成，所述序列与编码CD147的核酸，例如序列为SEQ ID NO:9或10的核酸互补。优选地，所述反义核酸包括siRNA或由siRNA组成，尤其是序列为SEQ ID NO:1、2、3、4或5的至少一种siRNA。在一个实施方式中，所述siRNA包括选自由SEQ ID NO:1-5组成的组中的至少2种、3种、4种或5种siRNA，或者由选自由SEQ ID NO:1-5组成的组中的至少2种、3种、4种或5种siRNA组成。在一个实施方式中，所述siRNA包括选自由SEQ ID NO:1-5组成的组中的至多5种、4种、3种或2种siRNA，或者由选自由SEQ ID NO:1-5组成的组中的至多5种、4种、3种或2种siRNA组成。在一个实施方式中，所述siRNA包括序列为SEQ ID NO:2、3、4和5的四种siRNA，或者由序列为SEQ ID NO:2、3、4和5的四种siRNA组成。

优选地，所述抗CD147受体的抗体能够预防或抑制IV型相关蛋白和CD147受体之间的相互作用，从而预防或抑制脑膜炎球菌至内皮细胞的粘附，并且因此预防或抑制脑膜炎球菌菌血症和/或感染。优选地，所述抗CD147的抗体是针对CD147与IV型菌毛相关蛋白的结合位点的抗体。优选地，所述抗CD147的抗体针对CD147的C-端结构域或其片段。仍然更优选地，所述抗CD147的抗体针对CD147的胞外结构域或其片段。相应地，所述抗CD147的抗体针对序列SEQ ID NO:7的氨基酸16至氨基酸321或其片段，或者针对序列SEQ IDNO:8的氨基酸16至氨基酸205或其片段。优选地，所述抗CD147的抗体针对CD147的所述胞外结构域的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个连续氨基酸的片段。仍然优选地，所述抗CD147的抗体针对由序列SEQ ID NO:7的氨基酸221至氨基酸315组成的片段，或者针对序列SEQ ID NO:8的氨基酸105至氨基酸199，即针对CD147的近膜的免疫球蛋白结构域(V型Ig样结构域)。仍有优选地，所述抗CD147的抗体是抗CD147的抗体MEM-M6/6

在又一实施方式中，IV型菌毛相关蛋白的抑制剂是抗IV型菌毛相蛋白的抗体。优选地，所述抗IV型菌毛相蛋白的抗体是针对IV型菌毛相蛋白与CD147受体的结合位点的抗体或其片段。仍然优选地，所述抗IV型菌毛相蛋白的抗体是针对PilE和/或PilV蛋白与CD147受体的结合位点的抗体或其片段。

在又一实施方式中，IV型菌毛相蛋白的抑制剂是：

IV型菌毛相蛋白的免疫原性片段，或

包括IV型菌毛相蛋白的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种免疫原性片段的融合蛋白，或由IV型菌毛相蛋白的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种免疫原性片段组成的融合蛋白，

其中，所述免疫原性片段或所述融合蛋白能够经由抗体引起免疫应答，这些抗体预防所述IV型菌毛相蛋白和CD147受体之间的相互作用。优选地，所述免疫原性片段是PilE或PilV的免疫原性片段。因此，所述融合蛋白例如可以包括以下片段或由以下片段组成：(i)PilE的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种免疫原性片段，(ii)PilV的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种免疫原性片段，(iii)PilE的一种免疫原性片段和PilV的一种免疫原性片段，(iv)PilE的两种免疫原性片段和PilV的两种免疫原性片段，(v)PilE的一种免疫原性片段和PilV的两种免疫原性片段，等等。

在又一实施方式中，IV型菌毛相蛋白的抑制剂是CD147多肽。优选地，所述抗CD147多肽能够预防或抑制IV型相关蛋白和所述CD147受体之间的相互作用，从而预防或抑制脑膜炎球菌至内皮细胞的粘附，并且因此预防或抑制脑膜炎球菌菌血症和/或感染。相应地，所述CD147多肽可以是CD147氨基酸序列或其片段，该CD147氨基酸序列或其片段：(i)与序列为SEQ ID NO:7或8的完整的CD147，或与由核酸SEQ ID NO:9或10编码的序列的完整的CD147有一个或几个氨基酸不同；并且(ii)不能与内皮细胞膜结合。

在一些实施方式中，所述CD147多肽可以包括CD147的细胞外结构域或其片段，或者由CD147的细胞外结构域或其片段组成。

优选地，所述CD147多肽包括以下序列或由以下序列组成：

a)氨基酸序列SEQ ID NO:6，或

b)与SEQ ID NO:6基本同源的氨基酸序列，优选与SEQ ID NO:6至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98或99％相同的氨基酸序列。

例如，所述片段包括以下氨基酸或由以下氨基酸组成：所述CD147多肽的10至180个连续的氨基酸，优选50至150个氨基酸，仍然优选80至120个氨基酸。例如，所述片段可以包括以下氨基酸或由以下氨基酸组成：所述CD147多肽的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160,165、170,175、180个连续的氨基酸，和/或所述CD147多肽的至多180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10个连续的氨基酸。

抗菌化合物

在一些实施方式中，根据本发明的抑制剂用于与至少一种抗菌化合物组合，顺序或同时地给药。

在一些实施方式中，根据本发明的抑制剂用于与至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种抗菌化合物，和/或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2种抗菌化合物组合，顺序或同时地给药。

顺序给药指在不同的时刻或时间点给予各组分，但是该不同的时刻或时间点仍然可以是重叠的。同时给药指同时给予各组分。

抗菌化合物可以是抑制或预防细菌的进展和/或繁殖的生物化合物和/或化学化合物。优选地，所述抗菌化合物是有效对抗Neisseria meningitidis(Nm)，优选血清组A、B、C、Y或W135的Nm的抗菌化合物。

抗菌化合物可以包括(但并不限于)抗生素，诸如β-内酰胺类抗生素。β-内酰胺类抗生素可以例如是(但并不限于)：(a)青霉素类，诸如苄青霉素，苯氧基甲基青霉素(phenoxyméthylpenicilline)，甲氧西林(méticilline)，双氯西林(dicloxacilline)，氟氯西林(flucloxacilline)，阿莫西林，氨苄青霉素，拉维酸，哌拉西林(pipéracilline)，替卡西林(ticarcilline)，阿洛西林(azlocilline)，羧苄西林；(b)头孢菌素，诸如头孢氨苄，头孢噻吩(cephalotin)，头孢唑啉，头孢克罗，头孢呋辛(cefuroxim)，头孢孟多，头孢替坦，头孢西丁，头孢三嗪，头孢克肟，头孢噻肟，头孢他啶，头孢吡肟，头孢匹罗；(c)碳青霉烯类，诸如亚胺培南，美罗培南，厄他培南，多尼培南，氨曲南，克拉维酸(clanulanicacid)，他唑巴坦(tazobactam)，舒巴坦。

优选地，所述至少一种抗菌化合物是：(i)脑膜炎球菌疫苗抗原，或(ii)包括至少两种脑膜炎球菌疫苗抗原的融合蛋白。

根据本发明的脑膜炎球菌疫苗抗原对本领域技术人员是公知的。实际上，几种针对脑膜炎球菌的疫苗已经商品化和/或正在开发中。

脑膜炎球菌疫苗抗原可以包括以下抗原或由以下抗原组成：包含在MCV-4(商品名为或)、MPSV-4或NmVac4-A/C/Y/W-135疫苗内的多糖或糖缀合物抗原中的至少一种。

脑膜炎球菌疫苗抗原还可以包括以下成分或由以下成分组成：组B(MenB)、A、C、Y和/或W135脑膜炎球菌的荚膜，和/或外膜囊泡(OMV)。

在一些实施方式中，脑膜炎球菌疫苗抗原包括一种多肽或多种多肽，或由一种多肽或多种多肽组成。目前，研究了几种这样的多肽或多肽抗原的疫苗效价。脑膜炎球菌疫苗抗原可以是脑膜炎球菌的外表面的任何蛋白。因此，脑膜炎球菌疫苗抗原可以是例如：PilE蛋白(例如在PCT/EP2011/069463中所述的)，PilV蛋白(例如在PCT/EP2011/069463中所述的)，PilX蛋白，PilC蛋白，ComP蛋白，脑膜炎球菌的H因子结合蛋白(fHbp，之前称为GNA1870或Lp2086)，主要免疫显性表面孔蛋白(PorA)，奈瑟氏菌属(Neisserial)发夹结合蛋白(NHBA，之前称为GNA2132),奈瑟氏菌属(Neisseria)粘附素A(NadA)，MafA，奈瑟氏菌属表面蛋白A(NspA)，血红素受体(HmbR)，转铁蛋白-结合蛋白B(TbPB)，自转运蛋白(Autotransporter)丝氨酸蛋白酶(AusP)，或它们的片段。优选地，所述片段是免疫原性片段。

PilE蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述PilE蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的序列，或与序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

PilV蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述PilV蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:13的序列，或与序列SEQ ID NO:13至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

PilX蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述PilX蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:14的序列，或与序列SEQ ID NO:14至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

PilC蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述PilC蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:15的序列，或与序列SEQ ID NO:15至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

ComP蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述ComP蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:16的序列，或与序列SEQ ID NO:16至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

fHBP蛋白可以是亚族B/变体1或亚族A/变体2的fHBP多肽。例如，所述fHBP多肽可以包括以下序列或由以下序列组成：序列SEQ ID NO:17或SEQID NO:18，或与序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

PorA蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述PorA蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：序列SEQ ID NO:19，或与序列SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

NHBA蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述NHBA蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：序列SEQ ID NO:20，或与序列SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

NadA蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述NadA蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：序列SEQ ID NO:21，或与序列SEQ ID NO:21至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

MafA蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述MafA蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的序列，或与序列SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

NspA蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述NspA蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:25的序列，或与序列SEQ ID NO:25至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

HmbR蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述HmbR蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:26的序列，或与序列SEQ ID NO:26至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

TbpB蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述TbpB蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:27的序列，或与序列SEQ ID NO:27至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

AusP蛋白可以源自任何的脑膜炎球菌的血清组，例如源自血清组A、B、C、Y或W135的脑膜炎球菌。例如，所述AusP蛋白可以包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:28的序列，或与序列SEQ ID NO:28至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列，或它们的免疫原性片段。

根据本发明的免疫原性片段可以是具有与所述脑膜炎球菌疫苗抗原相同或基本相同的免疫原性活性，如本文所述的脑膜炎球菌疫苗抗原的连续部分。也就是说，所述片段能够经抗体引起免疫应答，该抗体识别PilE、PilV、PilX、PilC、ComP、fHBP、NadA、PorA、NHBA、MafA、NspA、HmbR、TbPB或AusP。优选地，所述片段能够经抗体引起疫应答，该抗体预防脑膜炎球菌感染。更优选地，所述片段是PilE或PilV的免疫原性片段，该免疫原性片段能够经抗体引起免疫应答，该抗体预防脑膜炎球菌穿过BBB或扩散到脑膜空间。仍然更优选地，所述片段是PilE或PilV的免疫原性片段，该免疫原性片段能够经抗体引起免疫应答，该抗体抑制PilE和/或PilV与β2AR之间的相互作用。

在一些实施方式中，所述PilE或PilV的免疫原性片段各自不携带PilE或PilV的疏水结构域。更具体地，所述PilE的免疫原性片段不携带序列为FTLIELMIVIAIVGILAAVALPAYQDYTARAQVSEAILLAEGQKSAVTEYYL(SEQ ID NO:29)的疏水结构域。更具体地，所述PilV的免疫原性片段不携带序列为FTLLELMIAVAILGILTLITYPSYKTYIRRVRLSEVRTTLLHNAQTMERYYRQ(SEQ ID NO:30)的疏水结构域。

在一些实施方式中，所述PilE的免疫原性片段包括以下序列或由以下序列组成:

a)序列SAVTEYYLNHGEWPGDNSSAGVATSADIKGKYVQSVTVANGVITAQMASSNVNNEIKSKKLSLWAKRQNGSVKWFCGQPVTRTTATATDVAAANGKTDDKINTKHLPSTCRDDSSAS(SEQ ID NO:31)，或

b)序列SEQ ID NO:31的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115个连续不断的氨基酸的片段，或

c)与a)或b)的序列至少80％、85％、90％、95％或99％相同的序列。

在一些实施方式中，所述PilV的免疫原性片段包括以下序列或由以下序列组成:

a)序列TMERYYRQKGTFKTYDKNKLKQNKYFNVTLSKVSPDHFTLQADPNPTTNDGETCVVTLDGGTIAASGTNQSCPGFD(SEQ ID NO:32)，或

b)序列SEQ ID NO:32的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75个连续不断的氨基酸的片段，或

在一些实施方式中，所述PilE或PilV的免疫原性片段携带对负责脑膜炎球菌信号传导的β2AR的识别结构域。

更具体地，所述PilE的免疫原性片段包括以下序列或由以下序列组成:

a)序列CGQPVTRTTATATDVAAANGKTDDKINTKHLPSTC(SEQ ID NO:33)，或

b)序列SEQ ID NO:33的至少10、15、20、25、30个连续不断的氨基酸的片段，或

更具体地，所述PilV的免疫原性片段包括以下序列或由以下序列组成:

a)序列GETCVVTLNDGGTIAASGTNQSCPGFD(SEQ ID NO:34)，或

b)序列SEQ ID NO:34的至少10、15、20、25个连续不断的氨基酸的片段，或

在一些实施方式中，所述融合蛋白包括如本文所述的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2种脑膜炎球菌疫苗抗原。

例如，所述融合蛋白包括以下部分或由以下部分组成：

脑膜炎球菌PilE蛋白或其免疫原性片段，以框架一致的方式与脑膜炎球菌PilV蛋白或其免疫原性片段融合；或

脑膜炎球菌PilE蛋白或其免疫原性片段，以框架一致的方式与PilX、PilC、ComP、fHBP、NadA、PorA、NHBA、MafA、NspA、HmbR、TbpB或AusP蛋白或其免疫原性片段融合；或

脑膜炎球菌PilV蛋白或其免疫原性片段，以框架一致的方式与PilX、PilC、ComP、fHBP、NadA、PorA、NHBA、MafA、NspA、HmbR、TbpB或AusP蛋白或其免疫原性片段融合；或

脑膜炎球菌PilE蛋白或其免疫原性片段，以框架一致的方式与(i)脑膜炎球菌PilV蛋白或其免疫原性片段，及(ii)PilX、PilC、ComP、fHBP、NadA、PorA、NHBA、MafA、NspA、HmbR、TbpB或AusP蛋白或其免疫原性片段融合。

例如，所述融合蛋白包括以下序列或由以下序列组成：与序列为SEQ ID NO:18的fHBP多肽融合的序列为SEQ ID NO:31的PilE的免疫原性片段，或与序列为SEQ ID NO:18的fHBP多肽融合的序列为SEQ ID NO:33的PilE的免疫原性片段。因此，所述融合蛋白包括序列SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36，或由序列SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36组成。

例如，所述融合蛋白包括以下序列或由以下序列组成：与序列为SEQ ID NO:18的fHBP多肽融合的序列为SEQ ID NO:32的PilV的免疫原性片段，或与序列为SEQ ID NO:18的fHBP多肽融合的序列为SEQ ID NO:34的PilV的免疫原性片段。因此，所述融合蛋白包括序列SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38，或由序列SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38组成。

融合蛋白可以进一步包括其它部分，诸如允许连接不同抗原、蛋白或包括在融合蛋白内的片段的肽接头，用于纯化的标签，前导序列，信号肽，一种或多种增强免疫原性的肽片段，等等。

药物组合物

本发明还涉及一种药物组合物，该药物组合物包括根据本发明的抑制剂，及药学上可接受的递送剂、稀释剂或载剂。

优选地，所述抑制剂包括以下序列或由以下序列组成：

(i)选自由如上定义的序列为SEQ ID NO:1、2、3、4和5的siRNA组成的组中的至少1、2、3、4或5种或至多5、4、3、2或1种siRNA，

(ii)如上定义的序列为SEQ ID NO:2、3、4和5的四种siRNA，

(iii)如上定义的抗CD147的抗体MEM-M6/6，或

(iv)如上定义的序列为SEQ ID NO:6的变体CD147。

在一些实施方式中，所述药物组合物进一步包括至少一种抗菌化合物。各活性成分可以混合在同一组合物中，该组合物包括药学上可接受的递送剂、稀释剂或载剂。它们可以被分别处理，用于同时、独立或顺序地给予包括人类的哺乳动物。所述药物组合物还可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种和/或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2种抗菌化合物。

所述至少一种抗菌化合物可以是如上所述的化合物。优选地，所述至少一种抗菌化合物包括以下组分或由以下组分组成：

(a)如上所述的至少PilE、PilV、PilX、PilC、ComP、fHBP、NadA、PorA、NHBA、MafA、NspA、HmbR、TbpB或AusP蛋白或其免疫原性片段，或

(b)如上所述的融合蛋白。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括：

抑制剂(i)和抗菌化合物(a)，

抑制剂(ii)和抗菌化合物(a)，

抑制剂(iii)和抗菌化合物(a)，

抑制剂(iv)和抗菌化合物(a)，

抑制剂(i)和抗菌化合物(b)，

抑制剂(ii)和抗菌化合物(b)，

抑制剂(iii)和抗菌化合物(b)，

抑制剂(iv)和抗菌化合物(b)，

抑制剂(i)和(iii)和抗菌化合物(a)，

抑制剂(i)和(iv)和抗菌化合物(a)，

抑制剂(i)和(iii)和抗菌化合物(b)，

抑制剂(i)和(iv)和抗菌化合物(b)，

抑制剂(ii)和(iii)和抗菌化合物(a)，

抑制剂(ii)和(iv)和抗菌化合物(a)，

抑制剂(ii)和(iii)和抗菌化合物(b)，

抑制剂(ii)和(iv)和抗菌化合物(b)，

抑制剂(i)、(iii)和(iv)和抗菌化合物(a)，

抑制剂(ii)、(iii)和(iv)和抗菌化合物(a)，

抑制剂(i)、(iii)和(iv)和抗菌化合物(b)，或

抑制剂(ii)、(iii)和(iv)和抗菌化合物(b)。

根据本发明的药物组合物可以以适当的药物单位剂型的形式口服给药。根据本发明的药物组合物可以制备成很多形式，包括片剂，硬的或软的胶囊，特别是硬胶或软胶胶囊，水性溶液，悬浮液，和脂质体和其它缓释制剂，诸如成型的聚合凝胶。

给药模式和剂型与有疗效的试剂或组合物的性质紧密相关，该有疗效的试剂或组合物对于给定的治疗应用是期望的和有效的。适当的剂型包括(但并不限于)：口服给药、静脉内给药、直肠给药、舌下给药、黏膜给药，鼻给药，眼给药，皮下给药，肌内给药，透皮给药，脊柱给药，鞘内给药，关节内给药，动脉内给药，蛛网膜下给药，支气管给药和淋巴给药，及用于活性成分的系统递送的其它剂型。

本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何方法给药，包括(但并不限于)：经皮给药(经由贴剂，凝胶，乳膏，软膏或电离子导入的被动给药)；静脉注射给药(推注，输液)；皮下给药(输液，积存处(depot))；经粘膜给药(颊和舌下，例如，口腔分散片剂，薄片(wafer)，薄膜和泡腾制剂)；结膜给药(眼药水)；直肠给药(栓剂，灌肠剂))；或皮内给药(推注，输液，积存处)。

固态的单位剂型可以是传统形式。固态形式可以是胶囊，诸如含有本发明的抑制剂，并且可选地本发明的抗菌化合物，及载剂(例如润滑剂)和惰性填充剂(诸如乳糖、蔗糖或玉米淀粉)的普通明胶形式。在另一实施方式中，这些化合物被制成片剂，采用与粘合剂(如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶)、崩解剂(诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉或藻酸)和润滑剂(如硬脂酸或硬脂酸镁)组合的传统片剂基料(诸如乳糖、蔗糖或玉米淀粉)。

口服的液态药物组合物可以为例如水性或油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式，或者可以呈现为干燥产品，并且在使用之前与水或其它适当的递送剂混合在一起。这样的液态药物组合物可以含有传统的添加剂，诸如悬浮剂、乳化剂、非水性递送剂(可包括食用油)或防腐剂。

本发明的药物组合物还可配制用于胃肠外给药(例如通过注射，例如弹丸式注射或连续输注)，并且可以在安瓿、预填充注射器、小体积输注容器或者多剂量容器中与添加的防腐剂一起呈现为单位剂型的形式。药物组合物可以采用如在油性或水性递送剂中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可以含有配制试剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，本发明的药物组合物可以为粉末形式。该粉末形式通过经消毒的固体的无菌分离或通过自溶液进行冷冻法获得，用于在使用之前与适当的递送剂(例如经消毒的无热源的水)混合在一起。

适于直肠给药的药物组合物(其中载剂是固体)最优选地呈现为单位剂量的栓剂。适当的载剂包括可可油和本领域中经常使用的其它材料。并且可以通过使药物组合物与软化或融化的载剂混合，然后在模子中冷却和成形常规形成栓剂。

为了通过吸入给药，根据本发明的药物组合物常规来源于吹入器、喷雾器或加压包或递送气溶胶喷雾的其它方便的装置。加压包可以包括适当的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体。在加压气溶胶的情况中，剂量单位可以通过提供递送计量的量的阀门来确定。可选择地，为了通过吸入或喷注给药，本发明的药物组合物可以采用干燥粉末组合物形式，例如药物组合物和适当的粉末基料(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以呈现为以例如胶囊或药筒(cartridge)或例如为明胶或泡罩包装形式的单位剂型，从中可以在吸入器或喷注器的帮助下给予粉末。

对于鼻内给药，本发明的药物组合物可以经由液体喷雾，诸如经由塑料瓶雾化器给药。典型的是密斯托仪表(Mistometerg)(异丙肾上腺素吸入器-文涛博(Wintrop))和(异丙肾上腺素吸入器-瑞克(Riker))。

对于反义核酸的给药，本发明的药物组合物可以制备成包括封装在脂质体、微粒、微胶囊、脂质基载剂系统中的形式。适于在本发明中使用的可选的脂质基载剂系统的非限制性实例包括：聚阳离子聚合物核酸复合物(参见例如US专利公开号20050222064)，环糊精聚合物核酸复合物(参见例如US专利公开号20040087024)，可生物降解的聚3-氨基酯聚合物核酸复合物(参见例如US专利公开号20040071654),pH敏感的脂质体(参见例如US专利公开号20020192274)、阴离子脂质体(参见例如US专利公开号20030026831)、阳离子脂质体(参见例如US专利公开号20030229040)、经可逆遮蔽的脂质体(参见例如US专利公开号20030180950)、细胞类型特异性脂质体(参见例如US专利公开号20030198664)、含聚合物基质的微粒(参见例如US专利公开号20040142475)、pH敏感的脂质体(参见例如US专利公开号20020192275)、含有经可释放的亲水性聚合物衍生的脂质的脂质体(参见例如US专利公开号20030031704)、其中捕获由核酸的脂质(参见例如PCT专利公开号WO 03/057190)、脂质封装的核酸(参见例如US专利公开号20030129221)、聚阳离子固醇衍生物核酸复合物(参见例如US专利号6,756,054)、其它脂质体组合物(参见例如US专利公开号20030035829)、其它微粒组合物(参见例如US专利公开号20030157030)、复合物(poly-plexes)(参见例如PCT专利公开号WO 03/066069)、乳液组合物(参见例如US专利号6,747,014)、浓缩的核酸复合物(参见例如US专利公开号20050123600)、其它聚阳离子核酸复合物(参见例如US专利公开号20030125281)、聚乙烯醚核酸复合物(参见例如US专利公开号20040156909)、多环脒核酸复合物(参见例如US专利公开号20030220289)、纳米胶囊和微胶囊组合物(参见例如PCT专利公开号WO 02/096551)、脂质体和乳液的稳定的混合物(参见例如EP1304160)、卟啉核酸配合物(参见例如US专利号6,620,805)、脂质核酸复合物(参见例如US专利公开号20030203865)、核酸微乳液(参见例如US专利公开号20050037086)和阳离子脂质基组合物(参见例如US专利公开号20050234232)。本领域技术人员应理解本发明的经修改的siRNA还可以作为裸露的siRNA分子递送。

本发明的药物组合物还可以含有其它辅助剂，诸如调味剂、着色剂或防腐剂。

应进一步理解，在治疗中需要使用的药物组合物的量不仅将随着选择的有疗效的试剂而改变，而且还随着给药途径、正在治疗的症状的性质和患者的年龄和症状而改变，并且将最终由护理医师或临床医师来判断。

用于预防脑膜炎球菌与内皮细胞的粘附的方法

根据本发明的抑制剂可以用于预防或抑制脑膜炎球菌与内皮细胞的粘附的方法中。

所述方法可以是体外或离体的方法。

因此，本发明提供了如本文定义的抑制剂在体外或体内的方法中的应用，该体外或体内的方法用于预防脑膜炎球菌与内皮细胞的粘附。在一些实施方式中，所述抑制剂与如上定义的至少一种抗菌化合物组合使用。在一些实施方式中，抑制剂与至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种抗菌化合物，和/或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2种如上定义的抗菌化合物组合使用。

所述方法可以包括例如使所述细胞和/或所述脑膜炎球菌暴露至所述抑制剂。当方法是体内方法时，该方法可以包括将所述抑制剂给予受试者，优选有需要的患者。

在一些实施方式中，所述内皮细胞可以是脑内皮细胞、毛细血管内皮细胞、人类皮肤内皮细胞和/或脐静脉内皮细胞。

给药和治疗方法

本发明还涉及用于预防或治疗有需要的个体中的脑膜炎球菌菌血症或感染的方法，该方法包括给予治疗有效量的根据本发明的抑制剂或本发明的药物组合物。

“治疗”指治疗用途(即对患给定疾病的患者)，并且“预防”指预防性应用(即对易于发生给定疾病的个体)。术语“治疗”不仅包括导致疾病完全治愈的治疗，而且还包括减缓疾病进程和/或延长患者存活的治疗。

“有效量”指在剂量和必要的时段中，有效实现期望的治疗结果或预防性结果的量。

本发明的抑制剂的治疗有效量可以根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体的重量，及蛋白的能力等因素而改变，以诱发期望的治疗结果。治疗有效量涵盖其中治疗有益效果超过抑制剂的任何毒性或有害效果的量。治疗有效量还涵盖足以赋予益处(例如临床益处)的量。

在本发明的上下文中，“预防脑膜炎球菌菌血症或感染”可以指预防脑膜炎球菌粘附至宿主的内皮细胞。

在本发明的上下文中，“治疗脑膜炎球菌菌血症或感染”可以指逆转、减轻或抑制脑膜炎球菌粘附至宿主的内皮细胞。

在本发明的上下文中，脑膜炎球菌感染可以被降低至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％。

在一些实施方式中，本发明的方法包括与如上定义的至少一种抗菌化合物组合地，顺序或同时地给予如上定义的抑制剂。例如，如上定义的，所述至少其它抗菌化合物是：(i)脑膜炎球菌疫苗抗原，或(ii)包括至少两种脑膜炎球菌疫苗抗原的融合蛋白。

在另一实施方式中，所述方法包括给予根据本发明的药物组合物。

给药方案可以是系统方案。给药模式和剂型与有疗效的试剂或组合物的性质紧密相关，该有疗效的试剂或组合物对于给定的治疗应用是期望的和有效的。适当的剂型和给药途径包括(但并不限于)：口服给药、静脉内给药、直肠给药、舌下给药、黏膜给药，鼻给药，眼给药，皮下给药，肌内给药，透皮给药，脊柱给药，鞘内给药，关节内给药，动脉内给药，蛛网膜下给药，支气管给药和淋巴给药，和/或用于活性成分的系统递送的其它剂型和给药途径。在优选的实施方式中，剂型用于胃肠外给药。

给药方案可以例如为至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天的时间。

剂量范围可以在0.1mg/kg/天至100mg/kg/天之间。更优选地，剂量范围在0.5mg/kg/天至100mg/kg/天之间。最优选地，剂量范围在1mg/kg/天至80mg/kg/天之间。最优选地，剂量范围在5mg/kg/天至50mg/kg/天之间，或者在10mg/kg/天至40mg/kg/天之间。

在一些实施方式中，所述剂量可以为至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg/kg/天。在一些实施方式中，所述剂量可以为至多50、45、40、35、30、25、20、25、15、10、5、1、0.5、0.1mg/kg/天。

剂量范围还可以在10至10000UI/kg/天之间。更优选地，剂量范围在50至5000UI/kg/天之间，或者在100至1000UI/kg/天之间。

在一些实施方式中，所述剂量可以为至少10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000UI/kg/天。在一些实施方式中，所述剂量可以为至多10000、9500、9000、8500、8000、7500、7000、6500、6000、5500、5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、900、800、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100UI/kg/天。

筛选方法

本发明还涉及一种用于筛选IV型菌毛相关蛋白和CD147受体之间相互作用的抑制剂的方法，其中，所述方法包括由以下步骤所组成的步骤：

a)利用含IV型菌毛相关蛋白或其片段，及CD147受体或其片段的介质，其中，所述IV型菌毛相关蛋白或其片段与所述CD147受体或其片段能够一起特异性相互作用形成结合对；

b)使所述介质与候选化合物接触；

优选地，步骤b)通过向步骤a)的介质中添加候选化合物来进行。

选择抑制相互作用的化合物。如果步骤c)中的测量证明显著抑制了所述相互作用，则可以进行该选择。

在一些实施方式中，所述IV型菌毛相关蛋白包括能够与CD147受体相互作用的PilE或PilV蛋白或其片段，或者由能够与CD147受体相互作用的PilE或PilV蛋白或其片段组成。

在一些实施方式中，所述CD147受体的片段包括CD147的胞外结构域，或CD147的近膜免疫球蛋白结构域，或序列为SEQ ID NO:6的CD147的细胞外结构域；或由CD147的胞外结构域，或CD147的近膜免疫球蛋白结构域，或序列为SEQ ID NO:6的CD147的细胞外结构域组成。

在一些实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，在步骤c)时，通过免疫测定法(特别是通过ELISA或通过免疫放射测定法(IRMA))，通过闪烁迫近分析法(SPA)或通过荧光共振能量转移(FRET)进行相互作用的抑制的测量。

优选地，根据本发明的方法基于技术。基于供体(D，光敏剂)和受体(A，化学发光剂(chemiluminescer))微珠，该微珠包被有易于彼此结合的感兴趣的两种分子。D珠子的激光激发导致环境中的氧通过光敏剂被转化成单重态。单重态氧类反过来活化A珠子上的化学发光试剂。通过活化，化学发光试剂发出被酶标仪(microplate reader)中的光检测器检测到的光。当A珠子和D珠子接近(<200nm)时产生信号，从而报告被捕获在两种珠子上的搭档(partner)之间的相互作用(Taouji等人,2009,Curr Genomics,10(2):93)。

相应地，在一个实施方式中，在步骤a)时，所述IV型菌毛相关蛋白或其片段与受体珠子结合，并且所述CD147受体或其片段与供体珠子结合。在另一实施方式中，在步骤a)时，所述IV型菌毛相关蛋白或其片段与供体珠子结合，并且所述CD147受体或其片段与受体珠子结合。所述IV型菌毛相关蛋白或其片段和CD147受体或其片段可以直接或间接地与所述珠子结合。

在允许所述IV型菌毛相关蛋白和所述CD147受体之间的相互作用的条件中，进行步骤a)。相应地，所述IV型菌毛相关蛋白和所述CD147受体的结合将供体颗粒和受体颗粒带到彼此相距小于200nm处，从而提供供体分子和受体分子之间的能量转移。

在一些实施方式中，供体珠子含有酞菁，并且受体珠子含有红荧烯(rubren)。供体珠子受到680nm处的激光激发，诱发环境氧转化为单重态氧。单重态氧与在受体珠子上的化学发光试剂(即红荧烯)反应。通过能量转移，被活化的红荧烯发出520-620的光，该520-620的光被酶标仪中的光检测器检测到。冷光可以例如使用在微孔酶标仪(诸如来自Perkin-Elmer的多标记酶标仪)中的光检测器测量。

在一些实施方式中，供体珠子和受体珠子与荧光团结合，并且激发时，由第一供体荧光团朝第二受体荧光团发出至荧光团的能量转移量。受体荧光团因此被活化，并且发出第二荧光。第二受体荧光团的荧光可以例如通过分光荧光计测量。

如果在步骤a)时检测到能量转移，则考虑存在在所述IV型菌毛相关蛋白或其片段与所述CD147受体或其片段之间的相互作用。

候选化合物包括(但并不限于)肽、小分子、抗体、适体(aptamer)和诸如反义核酸等的核酸。

在步骤c)，可以通过测量冷光或荧光，测量所述IV型菌毛相关蛋白或其片段与所述CD147受体或其片段之间的相互作用的抑制。如果步骤c)时的冷光或荧光水平低于步骤a)时的冷光或荧光水平，则表明候选化合物是所述IV型菌毛相关蛋白或其片段与所述CD147受体或其片段之间的相互作用的抑制剂。

现在，将参考下面的附图和实施例更详细地描述本发明。本文引用的所有文献和专利文件通过引用并入本文中。

附图说明

图1：CD147作为N.meningitidis受体候选物的鉴定。TPA处理诱导Nm粘附至BB19细胞：细胞是在没有放线菌素D(1μg/ml)(-)或存在放线菌素D(1μg/ml)的情况下，未经处理(白)或经TPA(10ng/ml)处理的(黑)。在处理之后48h，测量野生型脑膜炎球菌(WT)的粘附。平均值±s.e.m,n>_3；***P<0.0001；双因素方差分析。

图2：CD147作为N.meningitidis受体候选物的鉴定。TPA处理诱导Nm粘附至BB19细胞：细胞是未经处理(白)或经TPA(10ng/ml)处理的(黑)。在处理之后48h，测量野生型脑膜炎球菌(WT)或细菌突变体dpilE、dpilC1或dpilC2的粘附。平均值±s.e.m,n>_3；***P<0.0001；双因素方差分析。

图3：CD147聚集在细菌粘附的位点处，这独立于02肾上腺素能受体偶联的信号传导事件。异丙肾上腺素诱导的β2肾上腺素能受体内吞作用抑制IV型菌毛诱导的信号传导事件，但是不影响CD147聚集在细菌粘附的位点处。量化在使用10IaM异丙肾上腺素的细胞预处理期间Nm粘附位点处的埃兹蛋白(Ezrin)、肌动蛋白、CD44或CD147的募集。平均值±s.e.m,n＝3；***P<0.001；**P<0.01；NS P>0.05；双因素方差分析。

图4：相对于对照siRNA(CTL)，CD147敲低(knockdown)降低了Nm对hCMEC/D3s的粘附。平均值±s.e.m,n＝4；**P<0.05；双尾t检验。

图5：外源CD147的表达恢复了细菌与CD147敲低的hBMEC细胞的粘附。平均值±s.e.m,n＝3；**P＝0.00255；单因素方差分析。

图6：在剪切应力下，CD147敲低降低了Nm与hBMEC细胞的初始的附接。平均值±s.e.m,n＝3；**P<0.01。单因素方差分析。

图7：CD147-Fc(5μg/ml)降低了Nm与hBMEC细胞的粘附，但ICAM-1-Fc(5μg/ml)没有降低Nm与hBMEC细胞的粘附。平均值±s.e.m,n＝3；**P<0.01；单因素方差分析。

图8：抗CD147的MEM-M6/6[10μg/ml]强有力地抑制了Nm与hBMEC细胞的粘附，其它抗体[10μg/ml]几乎(MEM-M6/1)或不(抗ICAM-1、11C81)影响粘附。平均值±s.e.m,n＝3；***P<0.001；**P<0.001；单因素方差分析。

图9：Nm直接粘附在固定的CD147-Fc上，但是不粘附在ICAM-1-Fc上。阴性：无固定的蛋白。棒：每一范围的平均值。平均值±s.e.m,n＝3；***P<0.001；单因素方差分析。

图10：粘附至固定的CD147-Fc的野生型(WT)、dpilE、dpilC1或dpilC2脑膜炎球菌。棒：每一范围的平均值。平均值±s.e.m,n＝4；***P<0.001；单因素方差分析。

图11：经纯化的MBP-PilE和MBP-PilV嵌合体直接与CD147-Fc发生相互作用，但是MBP-PilX、MBP-ComP和MBP不直接与CD147-Fc发生相互作用。顶部：示出CD147-Fc与携带MBP-菌毛蛋白的葡萄状球菌的共沉淀。底部：结合的CD147-Fc的量化。平均值±s.e.m,n＝4；***P<0.001；**P<0.01；单因素方差分析。

图12：可溶的MBP-PilE和MBP-PilV强有力地抑制了细菌与hCMEC/D3细胞的粘附，但是MBP-PilX、MBP-ComP和MBP是无效的。平均值±s.e.m,n＝4；***P<0.001；**P<0.01；单因素方差分析。

图13：细菌突变体ΔpilE和ΔpilV无法与hCMEC/D3细胞粘附。平均值±s.e.m,n＝4；***P<0.001；单因素方差分析。

图14：粘附的荧光脑膜炎球菌/100μm2切片的量化，表示为粘附的WT％。平均值±s.e.m n＝3，来自3位不同供体的脑切片；***P<0.001；单因素方差分析。

图15：新鲜的人类脑切片原位感染N.meningitidis需要菌毛与CD147的相互作用。相对于不存在抗体情况下的荧光，总荧光/100μm2的平均值±s.e.m，n＝4，来自3位不同供体的脑切片，*P<0.05；单因素方差分析。

图16：如果SCID小鼠(腹膜内途径，106CFU，每组3只小鼠)，Neisseriameningitidis的菌毛对于靶定人类皮肤的异种移植物是必需的。

图17：在SCID小鼠(腹膜内途径，10⁵CFU，每组3只小鼠)中，人类皮肤的异种移植物对于菌血症的影响。

图18：感染了Neisseria meningitidis的SCID小鼠(腹膜内途径，10⁵CFU，每组3只小鼠)的存活率。

具体实施方式

序列表的说明

SEQ ID NO:1-5示出针对CD147的siRNA的序列。

SEQ ID NO:6示出CD147的细胞外结构域的序列。

SEQ ID NO:7示出参考NCBI参考序列号NP_001719.2的CD147的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8示出参考NCBI参考序列号NP_940991.1的CD147的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9示出参考NCBI参考序列号NM_001728.2的CD147的核苷酸序列。

SEQ ID NO:10示出参考NCBI参考序列号NM_198589.1的CD147的核苷酸序列。

SEQ ID NO:11和12示出PilE的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13示出PilV的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14示出PilX的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15示出PilC的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16示出ComP的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17和18示出fHBP的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19示出PorA的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20示出NHBA的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21示出NadA的氨基酸序列。

SEQ ID NO:22-24示出MafA的氨基酸序列。

SEQ ID NO:25示出NspA的氨基酸序列。

SEQ ID NO:26示出HmbR的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27示出TbpB的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28示出AusP的氨基酸序列。

SEQ ID NO:29示出PilE的疏水结构域的序列。

SEQ ID NO:30示出PilV的疏水结构域的序列。

SEQ ID NO:31和33示出PilE的免疫原性片段的序列。

SEQ ID NO:32和34示出PilV的免疫原性片段的序列。

SEQ ID NO:35和36示出PilE多肽和fHBP多肽之间的融合蛋白的序列。

SEQ ID NO:37和38示出PilV多肽和fHBP多肽之间的融合蛋白的序列。

SEQ ID NO:39示出对照siRNA的序列。

实施例

材料和方法

适于小型提取物的基因表达的系列分析(SADE)。

使用经TPA处理之后16小时，从2x 107未经处理或经TPA处理的BB19细胞中提取的200μg RNA作为SADE底物。如在Virlon等人,1999,Proc NatlAcad Sci USA,96:15286-15291中所述，进行SADE筛选。简单来讲，从细胞中提取总RNA，在寡聚-dT柱子上选择聚腺苷酸化的RNA，并且从聚-A RNA合成带标签的cDNA。对DNA标签的串联体进行测序，并且使用蒙特卡洛统计分析确定和分析有区别地存在于两个文库中的测序标签(sequenced tag)的数量。

抗体和试剂

抗hCD147的抗体购自AbD Serotec，抗hCD44的mAb购自免疫技术(Immunotech)，抗hICAM-1的抗体购自R&D系统(R&D Systems)，抗GFAP和抗波形蛋白的抗体购自西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)。针对埃兹蛋白的多克隆抗血清获自P.Mangeat(CNRS UMR 5539,Montpelier(蒙彼利埃),法国)。针对PilE的mAb(20D9)和针对脑膜炎球菌2C4.3菌株的多克隆抗血清如之前所述(Coureuil等人,2010,Cell,143:1149-1160)。用于免疫荧光标记、显色免疫组化和免疫印迹的二抗来自Jackson ImmunoResearch实验室。可溶的嵌合CD147-Fc和ICAM-1-Fc分子购自R&D Systems。DAPI、罗丹明-毒伞素、TPA、放线菌素D、异丙肾上腺素、DAB过氧化物酶底物和NBT/BCIP碱性磷酸酶底物购自Sigma Aldrich。

细胞培养、转染和感染

经乳头状瘤病毒转化的BB19(一种人类脑内皮细胞系)由JA.Nelson博士(Oregon Health and Science University(俄勒冈健康与科学大学),Beaverton(比佛顿),USA)友情提供(Prudhomme等人,1996,Int J Parasitol,26:647-655)。为了诱导细菌粘附，使用TPA(10ng/ml,10’)处理BB19，洗涤，并且在处理之后48h，测量脑膜炎球菌粘附。当在TPA处理之后2h进行指示时，添加转录抑制剂放线菌素D(1μg/ml,4h)，洗涤细胞，并且42h之后测量粘附。如之前所述(Coureuil等人,2010,Cell,143:1149-1160；Doulet等人,2006,J Cell Biol,173-627-637)，转染和感染hCMEC/D3和hBMEC细胞系。编码人类CD147的质粒由Bukrinsky博士友情提供，并且编码融合有YFP的β2肾上腺素能受体(p2AR-YFP)的质粒如之前所述(Angers等人,2000,Proc Natl Acad Sci USA,97:3684-3689)。为了使CD147、CD44和ICAM-1的表达沉默，使用四种siRNA双链的池(来自Dharmacon的ON-TARGET加SMARTpool siRNA)。使用siCONTROL siRNA(Dharmacon)作为对照。转染之后两天，通过FACS分析测定敲低的效率，并且同时感染细胞。当使用靶定CD147的3’非翻译区的siRNA3’-GCUGUCUGGUUGCGCCAUUUU-5’(SEQ ID NO:1)或对照siRNA3’-AUGUAUUGGCCUGUAUAG-5’(SEQ ID NO:39)(Eurogentech)转染指示出的hBMEC时，并且在40h之后，再次使用模拟转染(-)或经CD147编码区的cDNA转染细胞。8小时之后，通过FACS分析量化CD147的表面表达，并且同时使用Nm 8013克隆12,胶囊化的Opa-、Opc-血清组C临床分离物表达I类SB菌毛感染细胞。如之前所述(Nassif等人,1994,Proc Natl Acad Sci USA,91:3769-3773；Mikaty等人,2009,PloS Pathog,5:e1000314；Helaine等人,2005,Mol Microbiol,55:65-77；Mairey等人,2006,J Exp Med,203:1939-1950)，获得并且培养该菌株的突变体ApilC1、ApilC2、ApilE、ApilV、ApilX、AcomP和表达GFP的野生型Nm。

粘附测定

如之前所述(Coureuil等人,2010,Cell,143:1149-1160；Mairey等人,2006,JExp Med,203:1939-1950；Lambotin等人,2005,J Cell Sci,118:3805-3816)，在静态条件和剪切应力的条件下，测定hCMEC/D3、hBMEC和BB19上的脑膜炎球菌的粘附。在hBMEC与额外的2μg/ml的可溶蛋白的相互作用之前，当指示出的脑膜炎球菌与5μg/ml可溶的重组重组人类CD147-Fc和ICAM-1-Fc嵌合体(包括与人类IgG1的Fc结构域融合的CD147或ICAM-1的Ig结构域，并且产生为二硫键连接的同型二聚体)预孵育。在静态条件中经30min感染，之后量化脑膜炎球菌的粘附。为了讨论抗体的抑制效果，使hBMEC生长在IBIDI室上，使用10μg/ml靶定ICAM-1(11C81)或CD147(MEM-M6/1和MEM-M6/6)的抗体预处理1h，并且在倒置显微镜下经受层流(0.04dyes/cm²)。在层流下，将表达GFP的细菌引入室中。20min之后，确定粘附细菌的数量。对于经固定的蛋白的粘附测定，使用在Steffen等人,2008,Curr Biol,18:926-931中描述的技术的修改形式，将重组的人类CD147-Fc和ICAM1-Fc嵌合体固定在载玻片上。简单来讲，载玻片经0.1％多聚L赖氨酸涂覆，经PBS洗涤，与戊二醛(0.5％)交联，洗涤，与在测定缓冲液(具有3％BSA的PBS)中的抗Fc孵育2h，在测定缓冲液中洗涤，并且与2μg/ml嵌合蛋白在4℃孵育过夜。在使用OD₆₀₀0.05脑膜炎球菌悬浮液感染之前，洗涤载玻片。在与细菌孵育之后，洗涤载玻片三次并且固定。标记细菌，并且经使用63x油浸物镜的Leica(莱卡)DMI6000显微镜使细菌可视化。使用ImageJ软件，量化30个视野的每一个视野中的粘附细菌的数量。

MBP-菌毛蛋白的重组蛋白的表达、纯化和固定

在E.Coli(大肠杆菌)中产生与麦芽糖-结合蛋白(MBP)融合的、缺乏编码全长蛋白的氨基酸残基1至28的区域的PilE、PilV、PilX和Comp的片段，在直链淀粉树脂(New England Biolabs)上纯化，并且固定在Staphylococcusaureus(金黄色葡萄球菌)(ATCC 25923)上，该Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)(ATCC 25923)表达如之前所述的IgG的Fc结构域的特异性受体。包被的细菌在冰上与1μg重组的人类CD147-Fc嵌合体孵育30min。洗涤3次之后，使用Laemmli缓冲液裂解细菌，并且通过免疫印迹分析测定共沉淀的CD147-Fc蛋白的量。使用Image J软件量化结合的CD147-Fc。当表示时，在使用OD₆₀₀0.05的脑膜炎球菌悬浮液感染30min之前，使用10μg/ml的MBP-菌毛蛋白预处理hCMEC/D3细胞15min。在与细菌孵育之后，细胞洗涤三次，并且如上所述确定粘附的细菌的数量。

共聚焦免疫荧光显微镜

hCMEC/D3、BB19或hBMEC在permanox盖玻片上或在transwell(穿孔)过滤器上，生长至覆盖一层。在所示处理和/或感染之后，如之前所述(Lambotin等人,2005,J Cell Sci,118:3805-3816；Hoffmann等人,2001,J Cell Biol,155:133-143)地固定和标记细胞。使用DMI6000显微镜(Leica(莱卡),63x)，进行图像获取和分析。使用共聚焦旋转盘显微镜(Leica(莱卡),63x)，获得系列光学切片。采用Imaris软件和量化直方图与ImageJ软件(NIH)获得三维重建。将蛋白在细菌菌落下募集的定量分析确定为对于所示感兴趣的蛋白为阳性的菌落的比例。每一盖玻片观察至少50个菌落。每一实验一式两份或一式三份地重复至少3次。

人脑组织的感染

新鲜的人脑切片获自个体的肉眼可见且组织学上的正常脑(经神经病例学家确认过)的大脑额叶样本，该个体被法医学研究室称为不明原因的医院外猝死(来自庞加莱医院的机构审查委员会(The Institutional Review Boards of thePoincaréHospital)、凡尔赛圣康坦大学(Versailles-Saint Quentin University)和法国“生物医药局(Agence de la Biomédecine)”的同意表格ML1094，PFS10-008，ClinicalTrials.gov NCT00320099)。

使用在液氮中冷却的异戊烷冷冻脑组织之后，将7μm厚、含软脑膜(leptomeninge)、皮质带和下层白质的切片固定在superfrost^TM加显微镜载玻片，并且储存在-80℃。在使用细菌(在150μl含0.1％BSA的介质中有2.10⁷个细菌)悬浮液在37℃感染1h之前，将除霜的切片在PBS中再水化5分钟，并且与含0.1％BSA的介质孵育1h。然后，轻柔地水平洗涤切片5次，并且在RT将切片在PAF 4％中固定10min。当指示时，在被细菌感染之前，使用靶定CD147或ICAM-1的10μg/ml的抗体处理切片1h，然后洗涤3次。通过显色免疫组化和免疫荧光分析，检测粘附的脑膜炎球菌。为了进行显色免疫组化，在组织再水化之后，将切片与所指示的初级抗体孵育过夜，并且使用偶联辣根过氧化物酶的驴抗小鼠的二抗和碱性磷酸酶的驴抗兔的二抗进行显色。DAB(棕色)和NBT/BCIP(蓝色)用作发色团。对于免疫荧光分析，脑切片与在PBS/BSA0.1％中的所指示的初级抗体孵育2h。将Alexa-缀合的毒伞素和DAPI(0.5mg/ml)添加到Alexa-缀合的二抗中1h。在额外洗涤之后，将盖玻片放置在甘油(Dako)中。所有样本都使用Nanozoomer 2.0(Hamamatsu)扫描，并且使用光学显微镜、荧光显微镜(Zeiss Axiovert,40x)和共聚焦(旋转盘Leica(莱卡),63x)显微镜进行进一步分析。通过其中初级抗体被替换为相同浓度的同型对照Ig以检验切片，并且通过来自同一供体的未经感染的组织的免疫染色，系统性证实标记物的特异性。使用mageJ软件(NIH)，进行在1mm²表面积上粘附的有荧光标记的细菌的定量分析。结果被表示为来自两次独立实验的荧光/100μ²的平均值。使用Imaris软件，在解卷共聚焦栈(deconvoluted confocal stacks)上进行三维创建。

测定

技术用于测定MBP-菌毛蛋白的重组融合蛋白之间的相互作用，并且CD147-Fc-His或ALCAM-1-Fc-His作为对照。使用白的384孔Optiplate(PerkinElmer,Whalham,MA,USA)，在20μl(总反应体积)中进行结合反应。试剂(抗MBP-包被的受体珠子和镍螯合物-包被的供体珠子)获自PerkinElmer。在20mM Tris、pH 7.4、20mM NaCl中制备CD147-Fc-His(或ALCAM-1-Fc-His)和菌毛蛋白-MBP。在室温，供体珠子(20μg/ml)与CD147-His(0、100或500nM)孵育45min。在平行实验中，在室温，受体珠子(20μg/ml)与菌毛蛋白-MBP(0、50或500nM)在反应缓冲液(25mM Tris、在20℃为pH 7.4、20mM NaCl、0.1％BSA和0.05％吐温(Tween)20)中孵育1h。然后，将10μl每一相互作用的搭档添加到板中，允许在室温，在黑暗中进行2h孵育或孵育过夜。为了进行抗体竞争测定，在与菌毛蛋白-MBP受体珠子孵育之前，在室温，将5μl的MEM-M-6/6抗体(各种浓度)添加至CD147-Fc-His-供体珠子30min。通过使用多标记酶标仪(PerkinElmer)检测光信号。在暗光下，进行涉及珠子的所有操作。

结果和讨论

为了鉴定负责由内皮细胞表达的Nm IV型菌毛蛋白的初始附接的候选受体，已经利用了BB19上的功能受体的诱导表达，BB19是不容易出现Nm粘附的经转化的人脑内皮细胞系。使用佛波酯巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(TPA)对BB19细胞的处理强有力地增强了Nm 8013克隆12(血清组C的被包裹的有菌毛的临床分离物)的粘附(图1)。转录抑制剂放线菌素D的处理抑制了这一效果(图1)。进一步地，仅带有粘附菌毛的野生型菌株和细菌pilC2缺失突变体粘附至经TPA处理的细胞，与不能粘附经TPA处理的细胞的无菌毛的pilE和非粘附的pilC1突变体形成鲜明对比(图2)。这些数据突出了脑膜炎球菌IV型菌毛的假定粘附受体的转录调节。通过对10478种基因表达的差异和定量的大规模分析(参见方法)，在经TPA处理的BB19细胞中鉴定出与未经处理的细胞相比，211种上调基因和194种下调基因。在上调基因中，六种被编码的膜相关的蛋白(包括血脑屏障(BBB)的公知的标记物CD147)在Nm优先粘附的脑内皮细胞上高度富集。CD147是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，含有两种糖基化Ig样结构域，参与各种生理和病理过程。已经证实了BB19细胞的TPA处理上调CD147的表达。进一步地，Nm与经TPA处理的细胞的粘附诱导CD147被大量募集至细菌粘附的位点。因此，CD147似乎是IV型菌毛介导的Nm粘附的有吸引力的受体候选物。

为了研究CD147在Nm与内皮细胞粘附中的作用，将两种细胞系用作模型。hCMEC/D3是源自脑毛细血管的完全分化的人脑内皮细胞系，其再现了BBB的主要表型特征；并且hBMEC是从骨髓毛细血管中分离的人内皮细胞系。如预期的，CD147主要富集在极化单层hCMEC/D3细胞的细胞-细胞连接处，并且CD147的显著部分存在于腔面处。在被Nm感染的细胞中，CD147聚集在脑膜炎球菌粘附的位点处，并且与β2肾上腺素能受体共定位。重要的是，如假定的受体介导初始的细菌粘附预期的，CD147的募集独立于β2肾上腺素能受体的表达和相关的偶联信号传导事件(图3)。

为了确定CD147是否是脑膜炎球菌的粘附所必需的，使用CD147特异性小干扰RNA(siRNA)转染hCMEC/D3和hBMEC细胞，该CD147特异性siRNA相对于对照siRNA敲低了60％至70％的CD147的表面表达。在CD147被敲低的细胞中，细菌与这些细胞的粘附显著下降(图4和图5)。外源的CD147的再表达修复了这一效果。重要的是，在初始粘附事件的定量测定中，CD147缺失也影响在流动条件下的细菌粘附(图6)，这表明CD147对于促进脑膜炎球菌与人内皮细胞的初始附接是必需的。相比之下，CD44或ICAM-1表达(在IV型介导的信号传导事件下，被募集在细菌粘附位点处的两种粘附分子)的类似缺失，不影响脑膜炎球菌与hCMEC/D3细胞或hBMEC细胞的粘附，因此支持CD147缺失对脑膜炎球菌与人内皮细胞粘附的特异性效果。

为了进一步证实CD147在Nm与内皮细胞粘附中的作用，使用CD147的胞外结构域的重组可溶形式(CD147-Fc)，以特异性竞争膜结合受体。与未经处理的细胞或经对照的可溶ICAM-1-Fc处理的细胞相比，CD147-Fc的添加降低了50％细菌与hBMEC细胞的粘附(图7)。独立的途径依赖于两种CD147特异性的抗体MEM-M6/1和MEMM6/6在分别与CD147的N-端和C-端Ig结构域的结合的应用。有趣的是，当在感染之前添加至hBMEC时，与经抗ICAM-1的对照抗体(11C81)预处理的细胞相比，MEM-M6/6在流动条件下抑制了75％的Nm的初始附接，然而MEM-M6/1仅降低了20％的初始附接(图8)。重要的是，MEM-M6/1和MEM-M6/6都类似地标记在hCMEC/D3细胞上表达的CD147。但是，仅MEM-M6/1有效地标记聚集在细菌粘附位点处的CD147分子，表明MEM-M6/6和脑膜炎球菌竞争CD147上的相同的结合基序。总的来说，我们的数据表明CD147是Nm与人内皮细胞初始附接的关键的内皮受体。

接下来，我们检验了Nm是否能够直接粘附至纯化的CD147-Fc分子上，该纯化的CD147-Fc分子固定在玻璃支撑体上。引人注目的是，粘附至CD147-Fc的脑膜炎球菌的数量为粘附至ICAM-Fc，或没有固定的蛋白的对照条件(阴性)的细菌数量的4至5倍(图9)。与脑膜炎球菌IV型菌毛在该直接相互作用中的作用一致，与pilE和pilC1突变体相对比，野生型和pilC2突变体菌株粘附至固定的CD147-Fc(图10)。为了鉴定在菌毛组分中的CD147的“配体”，我们测定了在可溶的CD147-Fc分子和纯化的重组菌毛之间的相互作用，其中重组菌毛产生为与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白，并且固定在葡萄球菌上(如在Coureuil等人,2010,Cell,143:1149-1160中所述)(图11)。有趣的是，纯化的PilE与CD147-Fc分子相互作用。较少的菌毛蛋白PilV也观察到类似的相互作用，而较少的菌毛蛋白PilX或ComP没有检测到显著的相互作用。为了进一步分析每一种菌毛蛋白对脑膜炎球菌与内皮细胞的粘附的相对贡献，在纯化的菌毛蛋白的存在下，进行野生型Nm对hCMEC/D3细胞的感染，以测定它们竞争与膜受体结合的能力(图12)。引人注目的是，PilE或PilV的添加分别降低了60％和50％的细菌粘附，而PilX或ComP蛋白的添加没有影响(图12)。相一致地，pilV缺失突变体(与pilE突变体不一样，仍然是有菌毛的)完全破坏了细菌与hCMEC/D3细胞的粘附(图13)。总之，这些结果指出PilE和PilV与CD147之间的选择性相互作用在脑膜炎球菌与内皮细胞的初始粘附中的关键作用。

为了测定该发现在人类的Nm感染中的相关性，探讨了活的致病性脑膜炎球菌粘附在新鲜的脑切片上的能力，该新鲜的脑切片来自正常人脑的额叶样本。引人注目的是，细菌主要与软脑膜(在菲-罗隙内)和皮层区的脑血管建立了紧密的联系。重要的是，该定位很容易使人想起在细菌性脑膜炎中的神经病例观察，并且依赖于菌毛蛋白PilE和PilV的表达。实际上，与野生型Nm相比，pilE或pilV缺失的突变体不容易粘附至来自相同供体的脑切片(图14)。野生型细菌在脑膜和皮层脑血管的腔侧上形成菌落，脑膜和皮层脑血管的腔侧与表达CD147的内皮细胞一致。此外，发现细菌菌落与CD147+软脑膜细胞相关联，但是不与不表达CD147的神经胶质或神经元细胞相关联，证实细菌与新鲜的人脑组织的粘附与CD147表达紧密相关。最后，在经Nm感染之前，脑切片经MEM-M6/6的预处理显著降低了脑的菌落化，而MEM-M6/1和11C81抗体没有效果(图15)。与我们使用培养的内皮细胞得到的结果一致，这些结果证实CD147的C-端结构域对于脑血管的原位感染是必需的。

总的来讲，该研究证实CD147通过直接与菌毛蛋白组分PilE和PilV的相互作用，是Nm对脑和外周人内皮细胞的初始粘附必需的受体。重要的是，首次证实了，致病性脑膜炎球菌对脑血管原位选择性靶定，依赖于微生物配体和脑受体直接的特异性相互作用。因为它在组织被Nm菌落化的病理生理学级联中的关键位置，CD147变成抑制脑和外周毛细血管的脑膜炎球菌血源性感染的主要药理学靶点。缺少脑膜炎球菌感染的动物模型已经妨碍了对脑膜炎球菌发病机理的了解。N.meningitidis仅与人类来源的细胞相互作用并且仅与人类细胞粘附，因此预防了使用动物模型研究脑膜炎球菌细胞的相互作用在脑膜炎球菌发病机理中的作用。

已经建立了使用移植有人类皮肤的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的模型。之前的报道已经示出，在移植之后4至6周，人类皮肤移植保留正常人类皮肤的特征，包括它的微脉管系统(Yan等人,1993,J Clin Invest,91:986；Gilet等人,2009,J Invest Dermatol,129:879)。简单来讲，在整形手术过程中被移除的正常成人皮肤移植到SCID小鼠的背上。一个月之后，小鼠受到腹膜内或静脉内注射包裹的有菌毛的脑膜炎球菌的感染。组织病理学检验显示N.meningitidis特异性靶定异种移植物的引流脉管(但不靶定正常小鼠皮肤的引流脉管)，与内皮粘附，并且在脉管腔内形成模糊的菌落。图16清楚地示出在移植有人类皮肤的SCID小鼠中，能够与细胞相互作用的有菌毛的包裹的细菌在人类皮肤中的数量远远高于不能与人类皮肤相互作用的无菌毛的包裹的细菌。这通过组织检验得到证实。实际上，无菌毛的细菌不能在体内与移植物的人内皮细胞粘附。这些数据证明，菌毛生成是细菌在体内与人类细胞相互作用所必需的。

相信高水平的菌血症对脑膜炎球菌病理学是最重要的。已知允许建立该菌血症的毒性因素是荚膜、脂低聚糖、因子H结合蛋白和铁螯合系统。这些毒性因素允许细菌在细胞外的流体中存活。使用SCID小鼠模型，我们测试了如下假设：细菌在血管中相互作用和繁殖的能力也参与了菌血症的建立。如图17所示，当将有菌毛的细菌注射到移植的人皮肤小鼠中时，菌血症仍然远远高于当将类似的细菌注射到未经移植的小鼠中时的菌血症，因此暗示细菌与人皮肤的相互作用允许菌血症的建立。IV型菌毛的作用通过如下事实证实：无菌毛的脑膜炎球菌(不能与内皮细胞粘附)的注射从血流中清除了细菌，与有菌毛的细菌观察到结果不同。为了证实该相互作用在脑膜炎球菌病理中的作用，已经对比了经注射的移植小鼠或经注射的未经移植小鼠之间的有菌毛的脑膜炎球菌的毒性。如在图18中所示，3只移植小鼠中有2只死亡，而所有未经移植的小鼠都存活了。

总的来讲，这些数据证明脑膜炎球菌菌血症的建立不仅需要荚膜、脂低聚糖、因子H结合蛋白和铁螯合系统，而且还需要促进细菌与内皮细胞相互作用的菌毛蛋白。此外，与内皮细胞的该相互作用对于脑膜炎球菌病理是必需的(图18)。这些数据暗示，抑制该相互作用将预防脑膜炎球菌的感染，并且靶向减少脑膜炎球菌细胞相互作用的疫苗将有效预防脑膜炎球菌的感染。

最后，已经开发了允许测量菌毛蛋白和CD147胞外结构域之间的相互作用的Alphascreen测试。使用技术检测CD147-Fc与PilE和PilV之间的剂量依赖性相互作用，并且CD147-Fc不与其它较少的菌毛蛋白PilX和Comp相互作用，而在PilE或PilV与对照蛋白之间没有检测到相互作用。如预期的，纯化的MBP-PilE-SA和MBP-PilE-SB嵌合体与CD147-Fc进行类似的相互作用。进一步地，CD147和PilE之间的相互作用可以被添加的针对CD147的Ig近端结构域的MEM-M6/6抗体成功抑制。这些结果暗示，Alphascreen测试可以用于高通量地筛选IV型菌毛相关蛋白和CD147之间相互作用的抑制剂。

Claims

1.一种IV型菌毛相关蛋白和CD147受体之间相互作用的抑制剂，用于预防或治疗脑膜炎球菌菌血症和/或感染的应用，其中所述抑制剂是：

(i)CD147的抑制剂，和/或

(ii)IV型菌毛相关蛋白结合的抑制剂。

2.根据权利要求1所述的用于应用的抑制剂，其中，所述CD147的抑制剂是抗CD147的抗体或反义核酸，其中，所述抗体抑制IV型菌毛相关蛋白和CD147受体之间的相互作用，并且所述反义核酸使CD147受体表达沉默。

3.根据权利要求1所述的用于应用的抑制剂，其中，所述IV菌毛相关蛋白的抑制剂是抗IV型菌毛相关蛋白的抗体或CD147多肽，或其片段，其中，所述抗体，或所述CD147多肽或其片段抑制IV型菌毛相关蛋白和CD147受体之间的相互作用。

4.根据权利要求2所述的用于应用的抑制剂，其中，所述CD147的抑制剂包括siRNA，优选序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5的至少一种siRNA。

5.根据权利要求3所述的用于应用的抑制剂，其中，所述CD147多肽包括CD147的细胞外结构域的可溶形式或其片段，或者所述CD147多肽由CD147的细胞外结构域的可溶形式或其片段组成。

6.根据权利要求5所述的用于应用的抑制剂，其中，所述CD147的细胞外结构域的可溶形式包括序列SEQ ID NO:6或由序列SEQ ID NO:6组成。

7.根据权利要求2所述的用于应用的抑制剂，其中，所述抗CD147的抗体是MEM-M6/6抗体。

8.根据权利要求1至7任一项所述的用于应用的抑制剂，其中，所述抑制剂用于顺序地或同时地与至少一种抗菌化合物组合地给药。

9.根据权利要求8所述的用于应用的抑制剂，其中，所述至少一种抗菌化合物是：

(i)脑膜炎球菌疫苗抗原，或

(ii)包括至少两种脑膜炎球菌疫苗抗原的融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的用于应用的抑制剂，其中，所述脑膜炎球菌疫苗抗原包括脑膜炎球菌PilE、PilV、PilX、PilC、ComP、fHbp、PorA、NHBA、NadA、MafA、NspA、HmbR、TbpB、AusP，或其片段，或由脑膜炎球菌PilE、PilV、PilX、PilC、ComP、fHbp、PorA、NHBA、NadA、MafA、NspA、HmbR、TbpB、AusP，或其片段组成。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的用于应用的抑制剂，其中，所述抑制剂被配制在药学上可接受的组合物中。

12.一种药物组合物，包括如在权利要求1至7中任一项限定的抑制剂，及药学上可接受的递送剂、稀释剂或载剂。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包括至少一种抗菌化合物，优选：

(i)脑膜炎球菌疫苗抗原，或

(ii)包括至少两种脑膜炎球菌疫苗抗原的融合蛋白，

用于同时、独立地或顺序地给予受试者，优选人类。

14.如在权利要求1至7中任一项限定的抑制剂在预防脑膜炎球菌与内皮细胞粘附的体外方法中的应用。

15.一种用于筛选IV型菌毛相关蛋白和CD147受体之间相互作用的抑制剂的方法，其中，所述方法包括由以下步骤所组成的步骤：

a)利用含IV型菌毛相关蛋白或其片段，及CD147受体或其片段的介质，其中，所述IV型菌毛相关蛋白或其片段与所述CD147受体或其片段能够特异性地一起相互作用以形成结合对；

b)添加候选化合物至所述介质；

c)测量所述IV型菌毛相关蛋白或其片段与所述CD147受体或其片段之间相互作用的抑制。