ES2558928T3

ES2558928T3 - Péptidos p53 estabilizados y usos de los mismos

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Publication number: ES2558928T3
Application number: ES08728649.8T
Authority: ES
Inventors: Federico Bernal; Loren D. Walensky; Gregory L. Verdine; Stanley Korsmeyer
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Harvard University
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Harvard University
Priority date: 2007-01-31
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2016-02-09
Anticipated expiration: 2028-01-31
Also published as: US10202431B2; CA2939778A1; US20170081379A1; US8889632B2; US20150119551A1; EP2952522A1; EP2118123A1; JP2010518017A; AU2008210434A1; EP2118123A4; AU2008210434C9; AU2008210434C8; JP6775344B2; US9527896B2; JP2017039701A; CA2939778C; AU2008210434C1; PT2118123E; JP2014224121A; EP2952522B1

Abstract

Un polipéptido helicoidal alfa que se une a la proteína doble minuto humana 2 (HDM2) y/o doble minuto humana 4 (HDMX) de Fórmula (1),**Fórmula** en donde: cada uno de R1 y R2 es independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo, o heterociclilalquilo; cada R3 se extiende a través de dos vueltas helicoidales del polipéptido y es independientemente alquileno, o alquenileno o alquinileno; n es un número entero de 1 a 4; x es 6; y y w son independientemente números enteros de 0 a 100; z es un número entero de 1 a 10; y cada Xaa es independientemente un aminoácido; en donde el polipéptido modificado comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de la secuencia Leu1 Ser2 Gln3 Glu4 Thr5 Phe6 Ser7 Asp8 Leu9 Trp10 Lys11 Leu12 Leu13 Pro14 Glu15 Asn16, excepto que las cadenas laterales de Ser7 y Pro14 se sustituyen por el grupo conector R3, y en donde hasta 6 aminoácidos distintos de los aminoácidos que llevan el grupo conector R3, Phe6, Trp10 y Leu13 se sustituyen independientemente por cualquier otro aminoácido; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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geométricos (p. ej., Z o cis y E o trans) de cualquier olefina presente. Todas estas formas isoméricas de estos compuestos se incluyen expresamente en la presente invención. Los compuestos también pueden estar representados en múltiples formas tautoméricas, en tales casos, la invención incluye expresamente todas las formas tautoméricas de los compuestos descritos en la presente memoria (p. ej., la alquilación de un sistema de anillos

5 puede dar como resultado la alquilación en múltiples sitios, la invención incluye expresamente todos estos productos de reacción). Se incluyen todas estas formas isoméricas de dichos compuestos al igual que todas las formas cristalinas.

Los aminoácidos que contienen tanto un grupo amino como un grupo carboxilo unido a un carbono son referidos como carbono alfa. También se encuentran unidos al carbono alfa un hidrógeno y una cadena lateral. Los 10 aminoácidos adecuados incluyen, sin limitación, tanto los isómeros D-como L-de los 20 aminoácidos de origen natural comunes encontrados en los péptidos (p. ej., A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V (como son conocidos por las abreviaturas de una letra)), así como los aminoácidos de origen natural y no natural producidos por medio de síntesis orgánica u otras rutas metabólicas. La tabla siguiente proporciona las estructuras de las cadenas laterales para cada uno de los 20 aminoácidos de origen natural comunes. En esta tabla el "-" en el

15 lado derecho de cada estructura es el enlace con el carbono alfa.

Aminoácido: Una Letra Tres Letras Estructura de la cadena lateral

Alanina: A Ala CH3-

Arginina: R Arg HN=C(NH2)-NH-(CH2)3-

Asparragina: N Asn H2N-C(O)-CH2-

Ácido aspártico: D Asp HO(O)C-CH2-

Cisteína: C Cys HS-CH2-

Glutamina: Q Gln H2N-C(O)-(CH2)2-

Ácido glutámico: E Glu HO(O)C-(CH2)2-

Glicina: G Gly H-

Histidina: H His imagen6

Isoleucina: I Ile CH3-CH2CH(CH3)-

Leucina: L Leu (CH3)2-CH-CH2-

Lisina: K Lys H2N-(CH2)4-

Metionina: M Met CH3-S-(CH2)2-

Fenilalanina: F Phe Fenil-CH2-

Prolina: P Pro imagen7

Serina: S Ser HO-CH2-

Treonina: T Thr CH3-CH(OH)

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medio de una técnica llamada ligación química nativa (Bang, et al., J. Am Chem Soc. 126: 1377).

Se describen en la presente memoria péptidos de hélice alfa estabilizada (del inglés stabilized alpha-helix) de p53 (SAH-p53) que muestran una alta afinidad por HDM2, y, que en contraste con el péptido p53 no modificado correspondiente, se introducen fácilmente en las células a través de un mecanismo de absorción activo. Como se describe a continuación, el tratamiento con SAH-p53 reactivó la cascada del supresor de tumor p53 mediante la inducción de la transcripción de genes sensible a p53, proporcionando el primer ejemplo de un péptido grapado que elimina las células cancerosas mediante el direccionamiento de una vía transcripcional.

Para diseñar compuestos SAH-p53, los autores de la presente invención colocaron derivados olefínicos sintéticos en las posiciones que evitaban residuos de unión a HDM2 críticos. Las grapas hidrocarbonadas que abarcaban las posiciones i, i + 7 fueron generadas por metátesis de olefinas (FIG. 1A). Se sintetizó un panel inicial de cuatro péptidos SAH-p53, que contenía cada uno un entrecruzamiento claramente localizado (FIG. 1B). Para evaluar el impacto estructural de la instalación de una grapa i, i +7 en todos los hidrocarbonos, los autores de la presente invención realizaron experimentos de dicroísmo circular (CD) para determinar la cualidad de hélice α. Mientras que el péptido p53 de tipo salvaje mostró 11% de contenido de hélice α en agua a pH 7,0, los SAH-1-4 p53 demostraron una cualidad de hélice α de 10-59% (FIG. 1B y 1C). Los análisis de unión por polarización de fluorescencia utilizando HDM217-125 y derivados marcados con FITC de SAH-p53 1-4 identificaron SAH-p53-4 como un interactor subnanomolar, que tenía una afinidad por HDM2 casi tres órdenes de magnitud mayor que la del péptido de tipo salvaje (FIG. 1B y 1D). SAH-p53-4 también demostró una mejor estabilidad proteolítica (FIG. 5).

Los autores de la presente invención encontraron que los compuestos SAH-p53 iniciales generados eran incapaces de penetrar en células T Jurkat intactas (FIG. 1B y FIG. 6). Los autores de la presente invención observaron que los SAH-p53 1-4 se cargaban negativamente (-2) a pH fisiológico. La carga positiva es un rasgo característico de ciertas clases de péptidos que penetran en las células. 11 En el desarrollo de una segunda generación de compuestos, los autores de la presente invención sustituyeron los ácidos aspártico y glutámico por asparraginas y glutaminas para ajustar la carga de los péptidos y mutaron aminoácidos seleccionados que se había referido anteriormente que participaban en la exportación (L14Q) y la ubiquitinación (K24R) nuclear de p53 4,12 (FIG. 1B). Los SAH-p53 5-8 mostraron una mejora de 2 a 8,5 veces en el contenido de hélice α, conservaron una alta afinidad de unión para HDM2, y demostraron una absorción dependiente del tiempo y de la temperatura mediante FACS y microscopía confocal (FIG. 1B, 1E, 1F y 7). Los análisis de viabilidad celular utilizando células cancerosas RKO o SJSA-1 expuestas a los péptidos SAH-p53 indicaron que SAH-p53-8, que contenía mutaciones puntuales en ambos sitios de exportación y ubiquitinación nucleares, era el único ligante de HDM2 estabilizado estructuralmente, que penetra las células, y de alta afinidad que afectaba adversamente a la viabilidad celular (FIGS. 1B y 4A).

Para determinar si el direccionamiento de HDM2 por SAH-p53-8 podría restaurar específicamente los niveles nativos de p53, los autores de la presente invención trataron las células SJSA-1 con péptidos 8, y 8F19A de tipo salvaje durante 8-30 horas y se controlaron los niveles de proteína p53 por medio de análisis Western (FIG. 2). Las células expuestas a SAH-p53-8 demostraron un aumento de los niveles de proteínas p53 que alcanzaron su punto máximo a las 18 horas del tratamiento. La re-supresión de p53 sobre las 24 horas se correspondía con la regulación al alza dependiente del tiempo de HDM2 por p53, coincidiendo con un mecanismo contra-regulador de p53-HDM2 intacto.13 Del mismo modo SAH-p53-8 indujo la regulación al alza del inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p21. 14 La regulación al alza de p21 en células tratadas con 8 se detectó a las 12 horas, alcanzando niveles máximos a las 18 horas. Los niveles en el momento inicial se restauraron en torno a las 30 horas, en consonancia con resupresión de p53 nativo. Los niveles de HDM2 y p21 se mantuvieron sin cambios en las células SJSA-1 tratadas con el tipo salvaje u 8F19A, destacando la especificidad de la modulación de SAH-p53-8 de la vía de señalización de p53.

Para examinar si la estabilización mediada por SAH-p53-8 de p53 nativo podría inhibir las células cancerosas mediante la reactivación de la vía apoptótica, los autores de la presente invención llevaron a cabo análisis de viabilidad y de caspasa-3 utilizando células SJSA-1 expuestas al tipo salvaje, 8, y 8F19A durante 24 horas (FIG. 3). Si bien los péptidos de tipo salvaje y 8F19A no tuvieron efecto sobre la viabilidad celular, SAH-p53-8 mostró una inhibición dependiente de la dosis de la viabilidad de células SJSA-1 (CE50 = 8,8 μM) (FIG. 3A). La activación con caspasa-3 mediante seguimiento de la fluorescencia del sustrato Ac-DEVD-AMC15 escindido con caspasa-3 mostró que ni el péptido de tipo salvaje, ni el BF19A tenían ningún efecto; sin embargo, 8 desencadenó la activación de caspasa-3 dependiente de la dosis (CE50 = 5,8 μM) que fue bloqueado por DEVD-CHO, un inhibidor específico de la caspasa-3, lo que demuestra que SAH-p53-8 inhibía específicamente la viabilidad celular mediante la activación de la apoptosis en células SJSA-1 que expresaban en exceso HDM2 (FIG. 3B). Como se puede observar a partir de la FIG. 3C, la inhibición mediada por SAH-p53-8 de la viabilidad celular observada en las células SJSA-1 también se observó en células HCT 116, una línea celular de cáncer de colon, pero no en una variante de la línea celular HCT 116 que carecía de p53 (HCT 116 p53-/-).

La identificación de múltiples compuestos orgánicos y peptidomiméticos de p53 con actividad anti-HDM2 8,16 es una promesa para el logro de un beneficio clínico de la manipulación de la ruta de p53. Mediante la generación de un inhibidor de HDM2 basado en péptidos grapados, los autores de la presente invención han documentado una interacción in situ entre SAH-p53-8 y HDM2 (FIG. 8), que confirma que su actividad pro-apoptótica deriva de la restauración de la ruta de p53.

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noche en presencia de DIEA.

La reacción de metátesis de cierre del anillo se realizó sobre el péptido protegido terminalmente en el extremo N mientras permanecía sobre el soporte sólido en un recipiente de reacción desechable fritado. La resina se expuso a una solución 10 mM de bis(triciclohexilfosfina)bencilidina -dicloruro de rutenio (IV) (Grubbs First Generation

5 Catalyst) en 1,2-dicloroetano o diclorometano durante 2 horas. La adición de catalizador y la reacción de metátesis de 2 horas se repitieron una vez. El péptido unido a la resina se lavó con CH2Cl2 tres veces y se secó bajo una corriente de nitrógeno.

El péptido se escindió de la resina y se desprotegió mediante exposición a Reactivo K (TFA al 82,5%, tioanisol al 5%, fenol al 5%, agua al 5%, 1,2-etanoditiol al 2,5%) y se precipitó con éter metil-terc-butílico a 4°C y se liofilizó.

10 Los péptidos liofilizados se purificaron mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna C18 (Agilent). Los péptidos se caracterizaron por LC-MS y análisis de aminoácidos. Los espectros de masas se obtuvieron por medio de electropulverización en modo de ion positivo o por medio de MALDI-TOF. Más abajo se muestran un rastro LC representativo y el espectro de masas (FIGS. 4-A y 4-B) y los datos espectrales de masa para todos los compuestos se muestran del mismo modo a continuación en la Tabla 2.

15 Tabla 2: Datos espectrales de masa para diversos polipéptidos

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extractos se centrifugaron, y los sobrenadantes se incubaron con proteína A/G Sepharose (50 µl de suspensión de cuentas al 50% por cada 0,5 ml de producto lisado; Santa Cruz Biotechnology). Los sobrenadantes previamente aclarados (500 µl) se recogieron después de la centrifugación, se incubaron con 10 µl de anticuerpo anti-FITC de cabra (AbCam) durante 1,5 h seguido de proteína A/G Sepharose durante 1,5 horas más. Las reacciones de inmunoprecipitación se sedimentaron y se lavaron tres veces con tampón de lisis. Las proteínas precipitadas se suspendieron en tampón de carga que contenía SDS, se hirvieron, y los sobrenadantes se procesaron mediante SDS-PAGE sobre geles Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore). Después del bloqueo, las transferencias se incubaron con una dilución 1:100 de anticuerpo anti-HDM2 humano de ratón (clon IF2; EMD Biosciences) o con una dilución 1:200 de anticuerpo anti-FITC de conejo (Zymed) en BSA al 3% en PBS seguido de anti-IgG de ratón o de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Pharmingen). La proteína HDM2 y los péptidos FITC se visualizaron utilizando el reactivo de quimioluminiscencia Western Lightning™ (Perkin Elmer) y exponiéndolos a la película. Los geles se tiñeron utilizando un kit de tinción de plata (Bio-Rad) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Polipéptidos

En algunos casos, las trabas hidrocarbonadas (es decir, los entrecruzamientos) descritos en la presente memoria pueden ser manipulados adicionalmente. En un caso, se puede oxidar un doble enlace de una traba de alquenilo hidrocarbonada, (p. ej., sintetizada utilizando una metátesis de cierre del anillo catalizada por rutenio (RCM)) (p. ej., a través de epoxidación o dihidroxilación) para proporcionar uno de los compuestos de más abajo.

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O bien se puede funcionalizar aún más el radical epóxido o uno de los radicales hidroxilo libres. Por ejemplo, el epóxido se puede tratar con un nucleófilo, que proporciona funcionalidad adicional que se puede utilizar, por ejemplo, para anclar una etiqueta (p. ej., un radioisótopo o etiqueta fluorescente). La etiqueta se puede utilizar para ayudar a dirigir el compuesto a una ubicación deseada en el organismo o para rastrear la ubicación del compuesto en el organismo. Alternativamente, se puede anclar químicamente un agente terapéutico adicional a la traba funcionalizada (p. ej., un agente anti-canceroso, tal como rapamicina, vinblastina, taxol, etc.). Semejante derivatización, alternativamente, se puede lograr mediante la manipulación sintética del extremo amino o carboxi del polipéptido o a través de la cadena lateral de aminoácido. Otros agentes se pueden anclar a la traba funcionalizada,

p. ej., un agente que facilita la entrada del polipéptido en las células.

Aunque se han descrito trabas hidrocarbonadas, también se contemplan otras trabas. Por ejemplo, la traba puede incluir uno o más de un radical éter, tioéter, éster, amina, o amida. En algunos casos, se puede incorporar a la traba una cadena lateral de un aminoácido de origen natural. Por ejemplo, se puede acoplar una traba con un grupo funcional tal como el hidroxilo de la serina, el tiol de la cisteína, la amina primaria de la lisina, el ácido del aspartato o el glutamato, o la amida de la asparragina o la glutamina. Por consiguiente, es posible crear una traba utilizando aminoácidos naturales en lugar de utilizar una traba que se haya elaborado mediante el acoplamiento de dos aminoácidos de origen no natural. También es posible utilizar un aminoácido de origen no natural único junto con un aminoácido de origen natural.

Se prevé además que la longitud de la traba pueda variar. Por ejemplo, se puede utilizar una longitud más corta de la traba cuando sea deseable proporcionar un grado relativamente alto de restricción sobre la estructura alfahelicoidal secundaria, mientras que, en algunos casos, es deseable proporcionar menos restricción en la estructura secundaria alfa-helicoidal, y por lo tanto se puede desear una traba más larga.

Además, si bien se han descrito ejemplos de trabas que abarcan desde los aminoácidos i a i+3, i a i+4; e i a i+7 con el fin de proporcionar una traba que se encuentre principalmente en una sola cara de la hélice alfa, se pueden sintetizar trabas para abarcar cualquier combinación de números de aminoácidos.

En algunos casos, se utilizan aminoácidos alfa disustituidos en el polipéptido para mejorar la estabilidad de la estructura secundaria helicoidal alfa. Sin embargo, no se requieren aminoácidos alfa disustituido, y también se prevén casos en los que se utilizan sustituyentes mono-alfa (p. ej., en los aminoácidos trabados).

Como pueden apreciar los expertos en la técnica, los métodos de síntesis de los compuestos descritos en la presente memoria serán evidentes para los expertos normales en la técnica. Adicionalmente, las diversas etapas sintéticas se pueden realizar en una secuencia u orden alternativos para proporcionar los compuestos deseados.

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de bases apropiadas incluyen las sales de metales alcalinos (p. ej., sodio), de metales alcalinotérreos (p. ej., magnesio), de amonio y de N-(alquilo)4+. Esta invención también prevé la cuaternarización de cualquier grupo que contenga nitrógeno alcalino de los compuestos descritos en la presente memoria. Se pueden obtener productos solubles o dispersables en agua o aceite por medio de semejante cuaternarización.

Los compuestos de las fórmulas descritas en la presente memoria pueden, por ejemplo, ser administrados por medio de inyección, por vía intravenosa, intraarterial, subdérmica, intraperitoneal, intramuscular o subcutánea; o por vía oral, bucal, nasal, transmucosa, tópica, en una preparación oftálmica, o por inhalación, con una dosificación que varía de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o de acuerdo con los requisitos del fármaco particular. Los métodos de la presente memoria contemplan la administración de una cantidad eficaz del compuesto o la composición del compuesto para lograr el efecto deseado o indicado. Típicamente, las composiciones farmacéuticas de esta invención se administrarán de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 veces por día o alternativamente, en forma de una infusión continua. Semejante administración se puede utilizar como una terapia crónica o aguda. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del anfitrión tratado y del modo concreto de administración. Una preparación típica contendrá de aproximadamente 5% a aproximadamente 95% de compuesto activo (p/p). Alternativamente, tales preparaciones contienen de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% de compuesto activo.

Pueden ser necesarias dosis menores o mayores que las citadas anteriormente. Los regímenes de dosificación y tratamiento específicos para cualquier paciente concreto dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, estado de salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad y el curso de la enfermedad, la afección o los síntomas, la disposición del paciente a la enfermedad, la afección o los síntomas, y el criterio del médico a cargo.

Tras la mejora de la afección de un paciente, se puede administrar una dosis de mantenimiento de un compuesto, composición o combinación de esta invención, si es necesario. Con posterioridad, se pueden reducir la dosis o la frecuencia de administración, o ambas, en función de los síntomas, a un nivel en el que se conserva el estado mejorado. Los pacientes pueden, sin embargo, requerir un tratamiento intermitente a largo plazo tras cualquier recurrencia de los síntomas de la enfermedad.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria comprenden un compuesto de las fórmulas descritas en la presente memoria o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; un agente adicional que incluye, por ejemplo, morfina o codeína; y cualquier portador, coadyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Otras composiciones descritas en la presente memoria comprenden un compuesto de las fórmulas descritas en la presente memoria o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un portador, coadyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones definidas en la presente memoria incluyen los compuestos de las fórmulas definidas en la presente memoria, así como agentes terapéuticos adicionales si están presentes, en cantidades eficaces para lograr una modulación de la enfermedad o de los síntomas de la enfermedad. El término "portador o coadyuvante farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador o un coadyuvante que puede administrarse a un paciente, junto con un compuesto de esta invención, y que no destruye la actividad farmacológica del mismo y no es tóxico cuando se administra en dosis suficientes para liberar una cantidad terapéutica del compuesto.

Los portadores, coadyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden utilizar en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas de liberación de fármacos auto-emulsionantes (SEDDS) tales como succinato de d-α-tocoferol polietilenglicol 1000, tensioactivos utilizados en formas de dosificación farmacéuticas tales como Tween u otras matrices de liberación poliméricas similares, proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas con glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógenofosfato disódico, hidrógenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana. Las ciclodextrinas tales como ciclodextrina α, β, y γ, también se pueden utilizar ventajosamente para mejorar la liberación de los compuestos de las fórmulas descritas en la presente memoria.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se pueden administrar por vía oral, parenteral, por pulverización para inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un reservorio implantado, preferiblemente mediante administración oral o administración por inyección. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden contener cualquier portador, coadyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable no tóxico convencional. En algunos casos, el pH de la formulación se puede ajustar con ácidos, álcalis o tampones farmacéuticamente aceptables para mejorar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de liberación. El término parenteral, según se utiliza en la presente memoria incluye inyección o técnicas de infusión subcutáneas, intracutáneas, intravenosas, intramusculares, intraarticulares, intraarteriales, intrasinoviales, intraesternales, intratecales, intralesionales e intracraneales.

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Se pueden utilizar PEG que tienen enlaces degradables en la cadena principal. Por ejemplo, se puede preparar PEG con enlaces éster que se someten a hidrólisis. Los productos conjugados que tienen enlaces de PEG degradables se describen en los documentos WO 99/34833; WO 99/14259, y en la Patente de los Estados Unidos 6.348.558.

En ciertos casos, el polímero macromolecular (p. ej., PEG) se ancla a un agente descrito en la presente memoria a través de un conector intermedio. En ciertas realizaciones, el conector se compone de 1 a 20 aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, en donde los aminoácidos se seleccionan entre los 20 aminoácidos de origen natural. Algunos de estos aminoácidos pueden estar glicosilados, como es bien sabido por los expertos en la técnica. En otras realizaciones, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan entre glicina, alanina, prolina, asparragina, glutamina, y lisina. En otras realizaciones, el conector está constituido por una mayoría de aminoácidos que no tienen impedimento estérico, tales como glicina y alanina. También son posibles conectores no peptídicos. Por ejemplo, se pueden utilizar conectores alquilo tales como -NH(CH2)nC(O)-, en donde n = 2-20. Estos conectores alquilo pueden además estar sustituidos con cualquier grupo sin impedimento estérico tal como alquilo inferior (p. ej., C1-C6) acilo inferior, halógeno (p. ej., Cl, Br), CN, NH2, fenilo, etc. La Patente de los Estados Unidos Núm. 5.446.090 describe un conector PEG bifuncional y su uso en la formación de productos conjugados que tienen un péptido en cada uno de los extremos del conector de PEG.

Análisis de escrutinio

También se describen métodos (también denominados en la presente memoria "análisis de escrutinio") para la identificación de polipéptidos, moléculas pequeñas, o derivados bifuncionales que se unen a HDM2 y/o a HDMX.

La afinidad de unión de los polipéptidos que se unen a HDM2 y/o a HDMX se puede medir utilizando los métodos descritos en la presente memoria, por ejemplo, mediante el uso de un análisis de unión de titulación. HDM2 y/o HDMX se pueden exponer a concentraciones variables de un compuesto candidato (es decir, polipéptidos) (p. ej., 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM, 100 µM, 1 mM, y 10 mM) y se puede medir la unión utilizando la resonancia de plasmón superficial para determinar la Kd para la unión. Además, las interacciones de unión de los péptidos SAHp53 marcados con fluorescencia a HDM2 y/o HDMX se pueden utilizar en un análisis de unión competitiva para el escrutinio y la identificación de péptidos, pequeñas moléculas, o derivados bifuncionales de los mismos que compiten con los péptidos FITC-SAH-p53 y calcular adicionalmente los valores de Ki para la competición por la unión. Los compuestos candidatos también pueden ser escrutados para determinar la actividad biológica in vivo. También se puede utilizar análisis de escrutinio de la permeabilidad celular en los que los compuestos candidato marcados con fluorescencia se aplican a las células intactas, que luego se analizan para determinar la fluorescencia celular por microscopía o detección de fluorescencia celular de alto rendimiento.

Los análisis descritos en la presente memoria se pueden realizar con compuestos candidato individuales o se pueden realizar con una pluralidad de compuestos candidato. Cuando los análisis se realizan con una pluralidad de compuestos candidato, los análisis se pueden realizar utilizando mezclas de compuestos candidato o se pueden ejecutar en reacciones paralelas con cada reacción que tiene un único compuesto candidato. Los compuestos de ensayo o los agentes se pueden obtener utilizando cualquiera de los numerosos enfoques en los métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica.

Así, se pueden exponer HDM2 (p. ej., MDM2 purificada) o HDMX (p. ej., MDMX purificada) purificadas a un compuesto de ensayo en presencia de un péptido p53 grapado y determinar si el compuesto de ensayo reduce (inhibe) la unión del péptido p53 grapado a MDM2 o MDMX. Un compuesto de ensayo que inhibe la unión es un inhibidor candidato de la interacción entre p53 y MDM2 o MDMX (o ambas). Los compuestos de ensayo se pueden someter a ensayo para determinar su capacidad para inhibir la unión de MDM2 y MDMX con el fin de identificar los compuestos que son relativamente selectivos para inhibir la unión de p53. En algunos casos, se puede utilizar nutlin3 (CAS 548472-68-0) como control puesto que nutlin-3 es un inhibidor selectivo de la unión de p53 a HDM2.

Referencias

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Claims

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