WO2004076483A1

WO2004076483A1 - 癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子

Info

Publication number: WO2004076483A1
Application number: PCT/JP2004/002238
Authority: WO
Inventors: Yoichi Taya; Masato Enari
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Cancer Center Japan
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Cancer Center Japan
Priority date: 2003-02-26
Filing date: 2004-02-25
Publication date: 2004-09-10
Anticipated expiration: 2005-08-26
Also published as: CA2517285A1; US20060159692A1; EP1609802A1; EP1609802A4; JPWO2004076483A1

Abstract

癌細胞にのみアポトーシスを誘導して死滅させる新しい癌治療の手段を提供する。ｐ５３又は１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異ｐ５３、及びクラスリン重鎖から成る、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子である。この転写因子は、ｐ５３ＡＩＰ１プロモーターの転写能を高め、癌細胞のアポトーシスを誘導する。

Description

癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子 . 技術分野

この発明は、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子に関する。従来技術

明

癌抑制遺伝子 p 53は p 21、 p 53R2又は p 53AI P l等の標的遺伝子の DNA配列に特異的に結合して、その転写活性を制御する転写因子であり、近書

年 p 53の関与する細胞癌化のメカニズムは詳しく研究されてきている（細胞ェ学 vol. 22, o.l, 23-28 (2003))。 p 53が制御する標的遺伝子の中で、 P 53AI P 1はミトコンドリアに局在するタンパク質で、ミトコンドリアの膜電位とシトクロム cの放出を制御することで正のアポトーシス作用を有している (Oda K. et al. , Cell, Vol.102, 849-862, 2000； Matsuda K. et al. , Cancer Res. , Vol. 62, 2883-2889, 2002)。この p 53 A I P 1は p 53 によるアポトーシス誘導に重要な役割を持つ S e r 46のリン酸化（特願 200 1-292953) に強い相関を示し、 p 53 A I P 1遺伝子の発現により癌細胞のアポトーシスが誘導される。例えば、 DNAが損傷される等の強いストレスを受けると、転写因子 p 53の S e r 46が p 53D I NP 1等の働きによりリン酸化を受け、 p 53 A I P 1の発現が誘発され、癌細胞のアポトーシスが誘導されると考えられている（細胞工学 vol. 22, No.l, 23-28 (2003))。

—方、癌細胞のアポトーシスを誘導することを目的として、シスブラチンなどの抗癌剤が使用されているが、ほとんどが D N Aに傷をつけることによってアポトーシスを誘導するものである。そのため、正常細胞の DNAにも傷がついて副作用が現れる。癌の放射線療法も同様に正常細胞の DNAに傷がついて副作用が現れる。

この他にも、 p 53の遺伝子や、 p 53によって誘導されてアポトーシスを誘導する B a Xや p 53Al P 1などの遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込んで癌細胞に感染させ、アポトーシスを誘導させて死滅させようという試みもなされてはいるが、よい結果が得られているとはいえない。 ' 発明が解決しょうとする課題

この発明は、癌細胞にのみアポトーシスを誘導して死滅させる新しい癌治療の手段を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、癌細胞から p 5 3の発現に伴ってクラスリン重鎖と見られる約 170 kD aのタンパク質が共沈殿してくることを見出し、クラスリン重鎖の cDNAを発現ベクターに導入して癌細胞の核内へトランスフエクトすると、 p 53A I P 1プロモーターの転写能を高めることを見出した。このような結果から、このクラスリン重鎖と p 53とが結合して転写因子を構成し、 p 53 A I P 1プロモーターの転写能を高め、癌細胞のアポト一シスを誘導すると結論された。

即ち、本発明は、 p 53 (配列番号 1) 又はその 1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異 P 53、及びクラスリン重鎖（配列番号 2) から成る、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子である。これらは、ヒト等の組織や細胞から抽出 '精製して取り出して用いてもよいし、これらをコードする D N Aを含む形質転換体を培養して得て用いてもよい。

また、前記変異 p 53は、少なくとも 46位の S e rが置換された p 53であつてもよく、特にその 46位の S e rが Ph eに置換されていることが好ましレ、。また本発明は、この転写因子を有効成分とする癌の治療薬である。図面の簡単な説明

第 1図は、クラスリン重鎖による p 53 A I P 1の転写活性の制御の概念図を示す。

第 2図は、 p c— p 53— fベクターの構造を示す。

第 3図は、 p 53AI P l. p r o. r e p o r t e rベクターの構造を示す。第 4図は、 p c— C H Cベクターの構造を示す。

第 5図は、発現ベクター（pcDNA- p53- f) をヒト骨肉腫由来細胞にトランスフエタトし、その P 5 3 A 1 P 1プロモーターからの転写能を示す。

第 6図は、発現ベクター（pcDNA3 . 1、 pcDNA-p53-f) をヒト非小肺がん由来細胞にトランスフヱタトした細胞抽出物の S D S— P AG E (銀染色）を示す。第 7図は、発現ベクター（pcDNA- p53- f) をヒト非小肺がん由来細胞にトランスフエクトした細胞抽出物の抗クラスリン重鎖抗体及び抗 p 5 3抗体によるゥエスタンブロットを示す。図中、 WT は WT- p53、 46A は p53、 46D は S46D— p53、 46Fは S46F— p53、厶 44— 63は 44— 63-p53を用レヽたものを示す。第 8図は、発現ベクター（pcDNA3 . 1、 pcDNA-p53-f) をヒト非小肺がん由来細胞にトランスフヱク卜した細胞の細胞質及び核抽出物に対し、抗クラスリン重鎖抗体を用いたウェスタンブロットを示す。図中、 pcDNAは pcDNA3 . 1、 WTは WT - p53、 46Fは S46F - ρ53、 Δ 44 - 63は 44 - 63- p53を用レヽたものを示す。第 9図は、クラスリン重鎖の c D N Aを入れた発現ベクター（pc-CHC) と p 5 3発現ベクター（pcDNA- p53- f) を共にヒト骨肉腫由来細胞にトランスフエタトし、その細胞抽出物を調べた結果を示す。図中、 Clathrin HCは pc- CHC、 WT iま WT— p53、 S46F ま S46F— ρ53、 Δ 44— 63 fま 44— 63— p53を用!/、たものを示す。発明の実施の形態

クラスリンには重鎖と軽鎖とがあり、普通は細胞表面から内部への物質の取り込みであるエンドサイト一シスに働く。し力し、本研究の結果、発明者らは、このクラスリン重鎖が、第 1図に示すように、癌細胞の中で軽鎖とは結合せずに p 5 3と結合して p 5 3の転写活性ィ匕能を高め、アポトーシスを強く誘導することを見出した。特に、 p 5 3のセリン 4 6をフエ二ルァラニンに置換した p 5 3とは特に強く結合してアポトーシスも強く誘導する。

本発明の転写因子を何らかの方法で癌細胞に注入する力、又はクラスリン重鎖のみを何らかの方法で癌細胞に注入し癌細胞中に存在する P 5 3と結合させることにより、癌細胞にアポトーシスを誘導して死滅させることができる。このような転写因子を利用すれば、正常細胞には傷をつけないで、癌細胞にのみ特異的に、従来の方法よりも効果的にアポトーシスを誘導させて死滅させることが可能になり、従来の方法よりも効率のよい癌治療法になる。以下、実施例により本発明を例証するが、これらは本発明を制限することを意図したものではない。試験例 1

この試験例では、以後の試験で用いる下記 5種のベクター（これらを総称して「pcDNA— p53— f」とレヽう。）を作成した。

(i) 野生型ヒト p 53遺伝子を p cDNA3プラスミド（Invitrogen 社、第 2図参照）に挿入した野生型ヒト p 53発現ベクター（以下「WT - p53」という。）

(ii) 46位の S e rを A 1 aに置き換えた変異型ヒト p 53遺伝子を p c D NA3プラスミドに挿入した変異ヒト p 53発現ベクター（以下「S46A- p53」という。)

(iii) 46位の S e rを A s pに置き換えた変異型ヒト p 53遺伝子を p c DNA3プラスミドに挿入した変異ヒト p 53発現ベクター（以下「S46D- p53」という。）

(iv) 46位の S e rを Ph eに置き換えた変異型ヒト p 53遺伝子を p cD NA3プラスミドに挿入した変異ヒト p 53発現ベクター（以下「S46F-p5³」という。）

(V) 44〜63位を欠失させた変異型ヒト p 53遺伝子を p cDNA3プラスミドに揷入した変異ヒト p 53発現ベクター（以下「44-63 - p53」という。）以上のベクターを以下の手順で作成した。

各種 pcDNA - p53 - f は、まず pcDNA3プラスミド（Invitrogen社）を制限酵素 Xhol 部位及び Xbal 部位で切断し、 9 アミノ酸残基からなる Flag 配列

(GDYKDDDDK)をコードする二本鎖 D N A (配列番号 8 )を揷入した（pcDNA-f )。作製した PCDNA3- fプラスミドの制限酵素 BamHI部位及ぴ Xhol部位を切断し、 BamHI部位及び Xhol部位切断末端を持つ野生型ヒト p53遺伝子（配列番号 9 ) 又は変異型ヒト p53遺伝子を挿入した（pcDNA- p53- f)。これらベクターの地図を第 2図に示す。試験例 2

この試験例では、 p53AIPl遺伝子ィントロン 1内にある p53結合配列を含む糸勺 500bpを pGL3— promoterぺクター (promega ¾：; の lucif erase遺 1s子の上流へ挿入したレポータープラスミドを作成した。

pGL3-promoterべクター (Promega社）を制限酵素 Sacl部位及ぴ Bglll 部位で切断し、制限酵素 Sacl部位及び Bglll部位切断末端を持つ p53結合配列を含む P53AIP1イントロン 1 (約 500bp、配列番号 1 0 ) を挿入した。このベクターの地図を第 3 図に示す。以下このレポーターを「D53AIPlpiro . reporterj といつ。試験例 3

試験例 1と同様の操作で、クラスリン重鎖遺伝子（かずさ D N A研究所から分与、配列番号 1 1 ) を pcDNA3プラスミド（ェ nvitrogen社、第 2図参照）に揷入して、クラスリン重鎖発現ベクター（以下「pc- CHCJ という。）を作成した。このベクターの地図を第 4図に示す。試験例 4

この試験例では、試験例 1で用意した 5種の発現ベクターをヒト骨肉腫由来細胞にトランスフヱクトし、その細胞抽出物を調べた。

試験は以下の手順で行った。

1 ) 7 X 10⁴個の Saos- ²細胞（骨肉腫由来）を²⁴穴プレートに蒔き、一晩培養した。

2 ) トランスフエクションするための DNAを、試験例 1と試験例 2で用意した pc DNA— p53— fと p53AIPlpro . reporterを用レヽて、表 1のように調製した。カロえた各 pcDNA-p53-fは 0〜3 0 n g用レ、、 pcDNA3 . 1と併せて総量 30 ngとした。なお、 phRG - TKは、ゥミシィタケ lucif eraseを発現するプラスミド（Promega 社、内部コント口ール）を示す。トランスフエクションの方法は Invitrogen社のキットに添付されているプロトコールに従った，

表 1

3 ) DNA溶液と Lipo溶液を混和し、室温で 30分間ィンキュベーションした。

4 ) その DNA- lipo some複合体を 1 ) で調製した細胞に滴下した。

5 ) 4時間後、 DNA- liposome複合体を除去し、細胞を 1 X PBS-で洗浄した。

6 ) トランスフエクシヨンしてから 24時間後、細胞を 1 X PBS-で洗浄し、 Dua 1 lucif erase assay kit (Promega社) を用レヽて、細胞中のホタノレ lucif erase活性及びゥミシィタケ lucif erase活性（内部コントロール）をそれぞれルミノメーターで測定した。その測定方法は、 Promega社のキットに添付されているプロトコールに従って行った。

7 ) pcDNA3 . 1を導入した細胞抽出液中のホタル lucif erase活性をゥミシィタケ lucif erase活性で割った値を 1とした時の相対的な活性（Fold Activatio n) を算出した。

その結果を第 5図に示す。 p 5 3の S e r 4 6 P h e置換体は p 5 3 A 1 P 1 プロモーターからの転写を野生型よりもかなり強く誘導することがわかつた。実施例 1

この実施例では、試験例 1で用意した 5種の発現ベクターをヒト非小肺がん由来細胞にトランスフエクトし、その細胞抽出物を調べた。

試験は以下の手順で行つた。

1 ) 9 X 1 0 ⁶の H1299細胞（非小肺がん由来）を 15 cm ディッシュに蒔き、ー晚培養した（10枚)。 2 ) トランスフエクシヨンするための DNAを表 2のように調製した。トランスフェクシヨンの方法 ίま Roche Applied Scienceのキッ卜 ίこ添付されてレヽるプロトコールに従った。

表 2 pcDNA3.1あるいは pcDNA-p53-f 8 μg

FuGENE 6 48 μΐ

D-MEM 752 μΐ ディッシュ 1枚当たり

DNA-liposome溶液

3 ) その DNA- liposomeを室温で 30分間ィンキュベーシヨンし、 1 ) で調製した細胞に滴下した。

4 ) トランスフエクシヨンしてから 21時間後、細胞をスクレイパーで剥がし、 600 X g、 5分間低速遠心して細胞を回収した。

5 ) 細胞を 1度 X PBS-で洗浄した後、 10 ml の表 3の下記細胞溶解緩衝液で細胞を溶解した。

表 3

細胞溶解緩街液 *

50 mi Tris-HCl (pH7. 2) 10 g/ml antipain

150 m NaCl 10 g/ml pepstatin

2 mM gCl₂ 10 g/ral chymostatin

0. 1 mM EDTA 10 g/ml leupeptin

10 mM NaF

6 ) 細胞を超音波破砕後、不溶性画分を 15krpm、 15分間、 4°Cで除去した。

7 ) その上清を 0 . 2 mlの抗 FLAG抗体ァガロースビーズ（Sigma) とー晚インキュベーシヨンした。

8 ) インキュベーション後、ビーズを上記細胞溶解緩衝液で 4回洗浄した。 • 9) その後、 1.5 mg/ml FLAG ペプチドを含む上記細胞溶解緩衝液で競合的にビーズから p53タンパク質溶出した。

10) その溶出画分を SDS- PAGE次いで銀染色した。

その結果を第 6図に示す。その結果、 S 46 F置換体では p 53と一緒に分子量 170 kD aのタンパク質が強く共沈澱してくる。これをマススぺクトロメトリーにかけてみたところ、 LH I I EVGTPPTGNQPFPK、 IVLDN SVFSEHR、 VANVELYYR、 QLP LVKPYLR, 及び VDKLD AS E SLR (配列番号 3〜 7) のアミノ酸配列が得られた。これらは、それぞれクラスリン重鎖（配列番号 2) の 228— 245、 1011— 1022、 13 98— 1406、 1444一 1453、及ぴ 1610_ 1620位に相当する。これは、この 170 kD aのタンパク質がクラスリンの重鎖であることを示す。

11) 170 kDのタンパク質の同定には銀染色で使われた量の約 20倍のタンパク質を濃縮し、 SDS-PAGE次いで CBB染色、目的バンドの切り出し、トリプシン消化後、質量分析を用いて行った。

12) 10) の実験手順で得られた溶出液の 100分の 1容を SDS-PAGE次いで PVDF 膜に転写後、抗クラスリン重鎖 f几体 (Transduction Laboratories) あるいは抗 p53抗体（Santa Cruz) を用いたウェスタンブロッテイング法を行つた。ここ、 3~ Amersham个土の horseradish peroxidase— マウス IgG一次抗体と ECLキットを用いてバンドを視覚化した。

その結果を第 7図に示す。 S 46 F置換体にクラスリン重鎖が特に強く結合することがわかった。試験例 5

この試験例では、実施例 1で用いたヒト非小肺がん由来細胞の核抽出物を調べ ' た。試験は以下の手順で行った。

1 ) 15 cmディッシュ一枚分を実施例 1と同様の手順でトランスフエクシヨンした。

2) 細胞を回収後、 1 ml の表 4の低張緩衝液 *1 で細胞を懸濁し、ホモジナイザ一で細胞膜を破壊した。表 4

低碰衝液 * 1

10 mM HEPES - KOH (pH7. 9) 10 pg/ml antipain

10 mM KC1 10 g/ml pepstatin

1. 5 mM MgCl₂ 10 μ_ε/ηι1 chymostatin

0. 5 mM DTT 10 μ_β/ιη1 leupeptin

高醒衝液 * 2

25 mM HEPES- KOH (pH7. 9) 10 μg/ml antipain

420 mM KC1 10 μg/ml pepstatin

10 % glycerol 10 μ8/ιπ1 chymostatin

0. 1 mM DTT 10 g/ml leupeptin

1 mM Na₃V0₄ 10 g/ml E64

50 mM NaF 10 pg/ml PMSF

3 ) それを 600 x g、 5分間、 4°Cで低速遠心し、細胞質画分と核画分に分離した。

4 )核画分に関しては 2 )、 3 ) の操作を 2回繰り返し、核画分に細胞質由来のタンパク質の持ち込みをできる限り除去した。

5 ) 核画分を 0 . 2 mlの表 4の高張緩衝液 * 2 で懸濁し 30分間氷上に置き、核力らタンパク質を溶出した。

6 ) 10 k X g、 5分間、 4 °Cで核画分から不溶性画分を除去した。

7 )細胞質画分と核画分由来のタンパク質を SDS- PAGE次いで PVDF膜に転写後、抗クラスリン重鎖抗体を用いた実施例 1と同様にウェスタンプロッティング法を行った。核画分は細胞質に比べ 5倍量の細胞由来のタンパク質を用いた。

その結果を第 8図に示す。この結果、クラスリンは細胞質でのみ働くと思われていたが、クラスリン重鎖の一部分は核内にも存在することを確認した。実施例 2 この実施例では、試験例 4の手順のうち 2 ) のトランスフエクシヨンするための DNAを、試験例 3で用意した pc-CHCを用いて、表 5のように調製.した以外は、試験例 4と同様の試験を行つた。，

表 5

pcDNA3.1あるいは pcDNA-p53-f 30 ng OPTI-MEM 25 μΐ

p53AIPlpro.reporter 100 ng Lipofectamine 2000 0.28 μΐ pcDNA3.1あるいは pc-CHC 400 ng

phRG-TK 10 ng Lipo^液

Total 540 ng

OPTI-MEM 25 μΐ

DNA溶液その結果を第 9図に示す。上記 D NA溶液において、 pc- CHC ( 400ng)を用いたものを Clathrin +、 pcDNA3 . 1 ( 400ng)を用レ、たものを Clathrin —と表記する。 .

クラスリン重鎖の c D NAを発現ベクターに入れて p 5 3と共にトランスフエクトすると、 p 5 3 A l P 1プロモーターからの転写能を高めたことが認められた。特に、 S 4 6 F置換体では強く高められた。

Claims

請求の範囲

1 . p 5 3又はその 1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異 P 5 3、及びクラスリン重鎖から成る、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子。

2 . 前記変異 p 5 3力少なくとも 4 6位の S e rが置換された p 5 3である請求項 1又に記載の転写因子。

3 . 前記変異 p 5 3が、その 4 6位の S e rが P h eに置換されている請求項 2に記載の転写因子。

4 . 請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の転写因子を有効成分とする癌の治療薬。

5 . 請求項：！〜 3のいずれか一項に記載の転写因子又はクラスリン重鎖を癌細胞に注入することから成る癌治療法。