ES2435410T3

ES2435410T3 - Uso de anticuerpos monoclonales antagonistas anti-CD40

Info

Publication number: ES2435410T3
Application number: ES09075395T
Authority: ES
Inventors: Li Long; Mohammed Luqman; Asha Yabannavar; Isabel Zaror; Bao-Lu Chen; Xiaofeng Lu; Sang Hoon Lee; Deborah Hurst
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2013-12-19
Anticipated expiration: 2024-11-04
Also published as: AU2004287879B2; MA28331A1; JP2007510666A; EP2255828A1; PL1682180T3; DK1682178T3; CA2544949C; ATE447412T1; WO2005044306A2; CN1905897B; PL1694360T3; AU2004287482B2; KR20060111555A; HRP20100066T1; EP1682180A2; RS53073B; KR20060132602A; CY1110839T1; CY1110231T1; AU2004287879A1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano para uso en el tratamiento de un cáncer caracterizado por laexpresión de CD40, donde dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano es seleccionado entre el grupoconsistente en: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9,que se puede obtener de la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de PatenteNº PTA-5542, o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12, que se puede obtener de la línea de células dehibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia delCD40 humano mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o en la SEC. Nº ID.: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia delCD40 humano mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o en la SEC. Nº ID.: 12; y d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9, que puede ser obtenido dela línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542, o con elanticuerpo monoclonal CHIR-12.12, que puede ser obtenido de la línea de células de hibridoma depositadaen la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543, en un ensayo de unión competitiva, donde dicho anticuerpo es administrado en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La invención se relaciona con anticuerpos humanos capaces de unirse a CD40, con métodos de utilización de los anticuerpos y con métodos para el tratamiento de enfermedades mediadas por la estimulación de la señalización de CD40 en células que expresan CD40.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Las células B juegan un importante papel durante la respuesta inmune normal in vivo. Un antígeno extraño se unirá a las inmunoglobulinas superficiales sobre células B específicas, para desencadenar una serie de sucesos, incluyendo endocitosis, procesamiento, presentación de péptidos procesados sobre moléculas de la clase II del MHC y regulación a más del antígeno B7 sobre la superficie de las células B. Se une entonces una célula T específica a la célula B por reconocimiento por parte del receptor de las células T (RCT) del antígeno procesado presentado sobre la molécula de la clase II del MHC. La estimulación a través del RCT activa la célula T e inicia la producción de citoquinas por las células T. Una segunda señal que activa además la célula T es una interacción entre el antígeno CD28 sobre las células T y el antígeno B7 sobre las células B. Cuando se reciben las señales antes mencionadas, el ligando CD40 (CD40L o CD154), que no se expresa en células T humanas en reposo, es regulado a más sobre la superficie de las células T. La unión del ligando CD40 al antígeno CD40 sobre la superficie de las células B estimula la célula B, haciendo que la célula B madure hacia una célula plasmática, que segrega elevados niveles de inmunoglobulina soluble.

[0003] CD40 es un antígeno de la superficie celular de 55 kDa que está presente sobre la superficie de las células B humanas tanto normales como neoplásicas, de las células dendríticas, de las células presentadoras de antígeno (CPA), de las células endoteliales y de las células monocíticas y epiteliales. Las células transformadas de pacientes con linfomas de células B de bajo y alto grado, leucemia linfoblástica aguda de células B, mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica y enfermedad de Hodgkin expresan CD40. También se detecta la expresión de CD40 en dos tercios de los casos de leucemia mieloblástica aguda y en un 50% de los linfomas relacionados con el SIDA. Las células B malignas de diversos tumores del linaje de las células B expresan un alto grado de CD40 y parecen depender de la señalización de CD40 para su supervivencia y proliferación.

[0004] Los linfomas inmunoblásticos de células B surgen frecuentemente en individuos inmunocomprometidos, tales como receptores de aloinjertos y otros que reciben terapia inmunosupresora a largo plazo, pacientes de SIDA y pacientes con síndromes de inmunodeficiencia primaria, tales como el síndrome linfoproliferativo ligado a X o el síndrome de Wiscott-Aldrich (Thomas et al. (1991), Adv. Cancer Res. 57: 329; Straus et al. (1993), Ann. Intern. Med.

118: 45).

[0005] El antígeno CD40 está relacionado con el receptor del factor de crecimiento de los nervios (NGF) humano, el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y Fas, lo que sugiere que CD40 es un receptor de un ligando con funciones importantes en la activación de las células B. La expresión de CD40 sobre las CPA tiene un importante papel coestimulante en la activación de los linfocitos tanto T-helper como T citotóxicos. El receptor CD40 se expresa sobre células T activadas, plaquetas activadas y células del músculo liso vascular inflamado. Los receptores CD40 pueden encontrarse también sobre eosinófilos, membranas sinoviales en la artritis reumatoide, fibroblastos dérmicos y otros tipos celulares no linfoides. La unión de CD40L al receptor CD40 estimula la proliferación y diferenciación de las células B, la producción de anticuerpos, el cambio de isotipos y la generación de memoria de las células B.

[0006] WO 01/83755 y WO 02/28904 describen anticuerpos capaces de unirse a CD40, métodos de producción de estos anticuerpos y métodos para su utilización.

[0007] Ellmark et al. (Immunology 2002, 106, 456-463) describen la modulación de la interacción CD40-ligando CD40 usando fragmentos de anticuerpos de una sola cadena anti-CD40 humanos.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0008] Un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano para uso en el tratamiento de un cáncer caracterizado por la expresión de CD40, donde dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano es seleccionado entre el grupo consistente en:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9, que puede ser obtenido de la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Nº de Depósito de Patente PTA-5542, o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12, que puede ser obtenido de la línea de células de

hibridoma depositada en la ATCC como Nº de Depósito de Patente PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia del CD40 humano mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o en la SEC. Nº ID.: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia del CD40 humano mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o en la SEC. Nº ID.: 12; y d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9, que puede ser obtenido de la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Nº de Depósito de Patente PTA-5542, o con el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12, que puede ser obtenido de la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Nº de Depósito de Patente PTA-5543, en un ensayo de unión competitiva,

donde dicho anticuerpo es administrado en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos.

BREVE RESUMEN DE LA DESCRIPCIÓN

[0009] Se describen composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades mediadas por la estimulación de la señalización de CD40 en células que expresan CD40, incluyendo linfomas, enfermedades autoinmunes y rechazos de trasplantes. Las composiciones incluyen anticuerpos monoclonales capaces de unirse a un antígeno CD40 humano localizado sobre la superficie de una célula que expresa el CD40 humano, donde la unión evita el crecimiento o la diferenciación de la célula. Las composiciones también incluyen anticuerpos monoclonales capaces de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa el CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal libre de actividad agonista significativa, donde la administración de dicho anticuerpo monoclonal da lugar a un volumen significativamente menor del tumor en comparación con una concentración similar del anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico IDEC-C2B8 en un modelo tumoral de xenoinjerto en ratón desnudo estadificado utilizando la línea celular de linfoma de células B humana Daudi. Las composiciones también incluyen fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos monoclonales, líneas celulares de hibridoma que producen estos anticuerpos y moléculas de ácido nucleico aisladas codificantes de las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos monoclonales. También se describen aquí composiciones farmacéuticas que incluyen estos anticuerpos anti-CD40 en un soporte farmacéuticamente aceptable.

[0010] Se describen métodos para prevenir o tratar una enfermedad mediada por la estimulación de la señalización de CD40, consistentes en tratar al paciente con un anticuerpo anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo que está libre de actividad agonista significativa cuando se une a un antígeno CD40 sobre una célula que expresa CD40 humano. Como enfermedades mediadas por la estimulación de células que expresan CD40, se incluyen enfermedades autoinmunes, cánceres y rechazos de injertos de órganos y tejidos. Como linfomas que se pueden tratar o prevenir mediante un método como aquí se describe, se incluyen los linfomas no Hodgkin (linfomas de alto grado, linfomas de grado intermedio y linfomas de bajo grado), la enfermedad de Hodgkin, las leucemias linfoblásticas agudas, los mielomas, las leucemias linfocíticas crónicas y las leucemias mieloblásticas.

[0011] Como enfermedades autoinmunes particulares contempladas para el tratamiento empleando los métodos aquí descritos, se incluyen el lupus eritematoso sistémico (LES), la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la psoriasis, la púrpura trombocitopénica autoinmune, la esclerosis múltiple, la espondilitis anquilosante, la miastenia gravis y el pénfigo vulgar. Dichos anticuerpos podrían ser también utilizados para prevenir el rechazo de injertos de órganos y tejidos por supresión de las respuestas autoinmunes, para tratar linfomas privando a los linfocitos B malignos de la señal activadora proporcionada por CD40 y para suministrar toxinas a las células portadoras de CD40 de un modo específico.

[0012] Se describen métodos para inhibir el crecimiento, la diferenciación y/o la proliferación de las células B humanas y para inhibir la producción de anticuerpos por las células B en un paciente humano, al igual que métodos para inhibir el crecimiento de células cancerosas de un linaje de células B. También se describen métodos para identificar anticuerpos que tienen actividad antagonista hacia las células que expresan CD40.

[0013] Los anticuerpos monoclonales aquí descritos tienen una fuerte afinidad por CD40 y se caracterizan por una constante de disociación en equilibrio (KD) de al menos 10-6 M, preferiblemente de al menos aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-8 M, más preferiblemente de al menos aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-12

M. Los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de unión a antígeno adecuados para uso en los métodos aquí expuestos son capaces de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana. Están libres de actividad agonista significativa, pero exhiben actividad antagonista cuando se unen a antígeno CD40 sobre células humanas. En una realización, el anticuerpo anti-CD40 o su fragmento exhibe actividad antagonista cuando se une a antígeno CD40 sobre células B humanas normales. En otra realización, el anticuerpo anti-CD40 o su fragmento exhibe actividad antagonista cuando se une a antígeno CD40 sobre células B humanas malignas. Los anticuerpos monoclonales adecuados tienen regiones constantes humanas; preferiblemente, también tienen regiones de marco total o parcialmente humanizadas, y más preferiblemente son anticuerpos totalmente humanos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Son ejemplos de tales anticuerpos monoclonales los anticuerpos aquí designados como CHIR-5.9 y CHIR-12.12; los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridoma designadas como 131.2F8.5.9 (a la que se hará aquí referencia como la línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hará aquí referencia como la línea celular 12.12); un anticuerpo monoclonal que

comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 6, la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 7, la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 8, las dos secuencias mostradas en la SEC. Nº ID.: 6 y la SEC. Nº ID.: 7 y las dos secuencias mostradas en la SEC. Nº ID.: 6 y la SEC. Nº ID.: 8; un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 2, la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 4, la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 5, las dos secuencias mostradas en la SEC. Nº ID.: 2 y la SEC. Nº ID.: 4 y las dos secuencias mostradas en la SEC. Nº ID.: 2 y la SEC. Nº ID.: 5; un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada entre el grupo consistente en la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 1, la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 3 y las dos secuencias mostradas en la SEC. Nº ID.: 1 y la SEC. ID Nº: 3; y fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos monoclonales que conservan la capacidad de unirse específicamente al CD40 humano y que están libres de actividad agonista significativa, pero exhiben actividad antagonista cuando se unen a antígeno CD40 sobre células humanas. Como ejemplos de dichos anticuerpos monoclonales, se incluyen también un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 12.12; un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o la SEC. Nº ID.: 12; un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 en un ensayo de unión competitiva; y un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o de cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, donde el fragmento conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno CD40 humano. Los expertos en la técnica reconocerán que los anticuerpos antagonistas y los fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos aquí descritos incluyen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos producidos recombinantemente usando métodos bien conocidos en la técnica y que se describirán aquí más adelante, y se incluyen, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales CHIR

5.9 y CHIR-12.12, que han sido producidos recombinantemente.

[0014] En una realización aquí descrita, los métodos de tratamiento incluyen la administración a un paciente de una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene anticuerpos antagonistas anti-CD40 adecuados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Una dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-CD40 o de su fragmento está dentro del rango de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg o de aproximadamente 7 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el método de tratamiento puede consistir en una única administración de una dosis terapéuticamente efectiva o en múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40 o de un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0015] Se pueden modificar los anticuerpos antagonistas anti-CD40 aquí identificados como adecuados para uso en los métodos aquí descritos. Las modificaciones de estos anticuerpos antagonistas anti-CD40 incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos anti-CD40 quiméricos inmunológicamente activos, anticuerpos anti-CD40 humanizados y anticuerpos anti-CD40 murinos inmunológicamente activos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0016] La Figura 1 muestra la unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 a CD40 sobre la superficie de la línea celular de linfoma (Ramos).

Las Figuras 2A y 2B ilustran las propiedades de unión de los anticuerpos monoclonales anti-CD40 CHIR-5.9 y CHIR

12.12 en relación al ligando CD40. La Figura 2A muestra que la unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 a CD40 en la superficie celular evita una posterior unión del ligando CD40. La Figura 2B muestra que los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 pueden competir por el ligando CD40 preunido al CD40 de la superficie celular.

Las Figuras 3A y 3B muestran la actividad CCDA de los anticuerpos monoclonales candidatos CHIR-5.9 y CHIR

12.12 frente a las células cancerosas de los nódulos linfáticos de pacientes con linfoma no Hodgkin (LNH). Se usaron células NK enriquecidas de un donante voluntario normal, bien frescas tras su aislamiento (Figura 3A) o bien después de cultivarlas durante la noche a 37°C (Figura 3B), como células efectoras en este ensayo. Como las células LNH también expresan CD20, el antígeno diana para el rituximab (Rituxán®), se comparó la actividad CCDA de los mAb candidatos con la del rituximab.

La Figura 4 demuestra la actividad antitumoral in vivo de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 en comparación con la del rituximab usando un modelo de linfoma de células B de xenoinjerto en ratón desnudo no estadificado (Namalwa).

La Figura 5 demuestra la actividad antitumoral in vivo de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 en comparación con la del rituximab usando un modelo de linfoma de células B de xenoinjerto en ratón desnudo no

estadificado (Daudi). RD, resistencia al desafío tumoral.

La Figura 6 demuestra la actividad antitumoral in vivo de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 en comparación con la del rituximab usando un modelo de linfoma de células B de xenoinjerto en ratón desnudo estadificado (Daudi). CR, completa regresión.

La Figura 7 muestra el protocolo usado para determinar el número de moléculas CD20 y CD40 en células Namalwa y Daudi.

La Figura 8 muestra la CCDA comparativa del mAb CHIR-12.12 y de rituximab frente a células de linfoma Daudi.

La Figura 9 presenta las secuencias de aminoácidos para las cadenas ligera y pesada del mAb CHIR-12.12. Se muestran las regiones líder (residuos 1-20 de la SEC. Nº ID.: 2), variable (residuos 21-132 de la SEC. Nº ID.: 2) y constante (residuos 133-239 de la SEC. Nº ID.: 2) de la cadena ligera en la Figura 9A. Se muestran las regiones líder (residuos 1-19 de la SEC. Nº ID.: 4), variable (residuos 20-139 de la SEC. Nº ID.: 4) y constante (residuos 140469 de la SEC. Nº ID.: 4) de la cadena pesada en la Figura 9B. La región constante alternativa para la cadena pesada del mAb CHIR-12.12 mostrada en la Figura 9B refleja una substitución con un residuo de serina del residuo de alanina en la posición 153 de la SEC. Nº ID.: 4. Se presenta la secuencia completa para esta variante de la cadena pesada del mAb CHIR-12.12 en la SEC. Nº ID.: 5.

La Figura 10 muestra la secuencia codificante para la cadena ligera (Figura 10A; SEC. Nº ID.: 1) y la cadena pesada (Figura 10B; SEC. Nº ID.: 3) del mAb CHIR-12.12.

La Figura 11 presenta las secuencias de aminoácidos para las cadenas ligera y pesada del mAb CHIR-5.9. Se muestran las regiones líder (residuos 1-20 de la SEC. Nº ID.: 6), variable (residuos 21-132 de la SEC. Nº ID.: 6) y constante (residuos 133-239 de la SEC. Nº ID.: 6) de la cadena ligera en la Figura 11A. Se muestran las regiones líder (residuos 1-19 de la SEC. Nº ID.: 7), variable (residuos 20-144 de la SEC. Nº ID.: 7) y constante (residuos 145474 de la SEC. Nº ID.: 7) de la cadena pesada en la Figura 11B. La región constante alternativa para la cadena pesada del mAb CHIR-5.9 mostrada en la Figura 11B refleja una substitución con un residuo de serina del residuo de alanina en la posición 158 de la SEC. Nº ID.: 7. Se presenta la secuencia completa para esta variante de la cadena pesada del mAb CHIR-5.9 en la SEC. Nº ID.: 8.

La Figura 12 muestra la secuencia codificante (Figura 12A; SEC. Nº ID.: 9) para la isoforma corta del CD40 humano (secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 12B; SEC. Nº ID.: 10) y la secuencia codificante (Figura 12C; SEC. Nº ID.: 11) para la isoforma larga del CD40 humano (secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 12D).

La Figura 13 muestra la temperatura de fusión térmica del CHIR-12.12 en formulaciones a diferentes pH medida por calorimetría de barrido diferencial (DSC).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0017] El alcance de la presente invención queda definido por las reivindicaciones, y cualquier información que no entre dentro de las reivindicaciones es facilitada sólo con fines informativos. "Tumor", tal como se utiliza aquí, se refiere a todos los crecimientos y proliferaciones de células neoplásicas, ya sean malignos o benignos, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

[0018] Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a, o describen, la afección fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Como ejemplos de cáncer, se incluyen, aunque sin limitación, el linfoma y la leucemia.

[0019] Los "anticuerpos" e "inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión a un antígeno, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad antigénica. Polipéptidos de este último tipo son producidos, por ejemplo, a bajos niveles por el sistema linfático y a mayores niveles por los mielomas.

[0020] El término "anticuerpo" es utilizado en su sentido más amplio y cubre anticuerpos totalmente ensamblados, fragmentos de anticuerpo que pueden unirse a antígeno (v.g., Fab’, F’(ab)2, Fv, anticuerpos de una sola cadena, diacuerpos) y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores.

[0021] El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, que los anticuerpos individuales incluidos en la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores.

[0022] Los "anticuerpos nativos" y las "inmunoglobulinas nativas" son normalmente glicoproteínas

heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace covalente disulfuro, mientras que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas.

[0023] El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en cuanto a secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida por los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (RDC) o regiones hipervariables en los dominios variables tanto de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina β, conectadas por tres RDC, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina β. Las RDC de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR, y con las RDC de la otra cadena contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al. (1991), NIH Publ. Nº 91-3242, Vol. I, páginas 647-669).

[0024] Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como unión al receptor de Fc (FcR), participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos, opsonización, iniciación de la citotoxicidad dependiente del complemento y desgranulación de las células cebadas.

[0025] El término "región hipervariable", cuando se utiliza aquí, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "RDC" (es decir, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immological Interest (5ª ed., Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Clothia y Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917). Los residuos de "marco" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable que son distintos de los residuos de la región hipervariable.

[0026] Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Como ejemplos de fragmentos de anticuerpo, se incluyen los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al. (1995), Protein Eng. 8(10):10571062); moléculas de anticuerpos de una sola cadena; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab’)2, que tiene dos sitios de combinación con antígeno y aún es capaz de entrecruzar antígeno.

[0027] "Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo. En una especie Fv de dos cadenas, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. En una especie Fv de una sola cadena, se pueden unir covalentemente un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera mediante un conector peptídico flexible, de tal modo que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres RDC de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. De manera colectiva, las seis RDC confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que incluye sólo tres RDC específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer un antígeno y unirse a él, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.

[0028] El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab’ por la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es como se designa aquí a un Fab’ en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 eran originalmente producidos como pares de fragmentos Fab’ que tienen una bisagra de cisteínas entre ellos. También se conocen otras

copulaciones químicas de fragmentos de anticuerpos.

[0029] Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (κ) y lambda (λ), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

[0030] Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos), v.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son denominados alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Se conocen bien las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas. Diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras. Por ejemplo, los isotipos IgG1 e IgG3 humanos median en la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA).

[0031] La palabra "marcaje", cuando se utiliza aquí, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo para generar un anticuerpo "marcado". El marcaje puede ser detectable por sí mismo (v.g., marcajes radioisotópicos o marcajes fluorescentes) o, en el caso de un marcaje enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición que sirve de substrato y que es detectable. Como radionúclidos que pueden servir como marcajes detectables, se incluyen, por ejemplo, I-131, I123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 y Pd-109. El marcaje podría ser también una entidad no detectable, tal como una toxina.

[0032] El término "antagonista" es utilizado en su sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquee, inhiba o neutralice parcial o totalmente una actividad biológica de un blanco nativo aquí descrito o su transcripción o traducción.

[0033] Los "soportes", tal como se utilizan aquí, incluyen soportes, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a ellos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el soporte fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Como ejemplos de soportes fisiológicamente aceptables, se incluyen tampones, tales como fosfato, citrato, succinato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN, polietilenglicol (PEG) y Pluronics. La administración "en combinación con" uno o más de otros agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

[0034] Una "célula huésped," tal como se utiliza aquí, se refiere a un microorganismo o a una célula o línea de células eucarióticas cultivada como una entidad unicelular que puede ser, o ha sido, usada como receptora para un vector recombinante u otros polinucleótidos de transferencia, e incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Se entiende que la progenie de una sola célula puede no ser necesariamente por completo idéntica en cuanto a morfología o en cuanto a complemento de ADN genómico o total a la célula parental original, debido a mutación natural, accidental o deliberada.

[0035] Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos el FcγRIII y desempeñan una función efectora de citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (CCDA). Como ejemplos de leucocitos humanos que median en la CCDA, se incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células "natural killer" (NK), monocitos, macrófagos, eosinófilos y neutrófilos, siendo preferidos los PBMC y las células NK. Los anticuerpos que tienen actividad CCDA son típicamente del isotipo IgG1 o IgG3. Obsérvese que, además de aislar anticuerpos IgG1 e IgG3, dichos anticuerpos mediadores en la CCDA pueden ser producidos por ingeniería de una región variable de un anticuerpo no CCDA o un fragmento de región variable para obtener una región constante de isotipo IgG1 o IgG3.

[0036] Los términos "receptor de Fc" o "FcR" son utilizados para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Más aún, un FcR preferido es uno que se una a un anticuerpo IgG (un receptor gamma), y se incluyen receptores de las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII, incluyendo las variantes alélicas y formas alternativamente ayustadas de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un "receptor activante") y FcγRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren primariamente en sus dominios citoplásmicos. El receptor activante FcγRIIA contiene una unidad de activación basada en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene una unidad de inhibición basada en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase Daeron (1997), Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234). Existen revisiones de los FcR en Ravetch y Kinet (1991),

Annu. Rev. Immunol. 9: 457-9.92 (1991); Capel et al. (1994), Immunomethods 4: 25-34; y de Haas et al. (1995), J. Lab. Clin. Med. 126: 330-341. Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, quedan aquí abarcados por el término "FcR". El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al. (1976), J. Immunol. 117: 587, y Kim et al. (1994), J. Immunol. 24: 249 (1994)).

[0037] Existe una serie de formas de producción de anticuerpos humanos. Por ejemplo, se pueden inmortalizar células secretoras por infección con el virus de Epstein-Barr (EBV). Sin embargo, las células infectadas con EBV son difíciles de clonar y normalmente producen rendimientos sólo relativamente bajos de inmunoglobulina (James y Bell (1987), J. Immunol. Methods 100: 5-40). En el futuro, se podría conseguir la inmortalización de células B humanas posiblemente introduciendo una combinación definida de genes transformantes. Dicha posibilidad queda resaltada por una reciente demostración de que la expresión de la subunidad catalítica de la telomerasa, junto con la oncoproteína grande del SV40 y un alelo oncogénico de H-ras, daba lugar a la conversión tumorigénica de células epiteliales y fibroblásticas humanas normales (Hahn et al. (1999), Nature 400: 464-468). Es ahora posible producir animales transgénicos (v.g., ratones) capaces, tras inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas (Jakobovits et al. (1993), Nature 362: 255-258; Lonberg y Huszar (1995), Int. Rev. Immunol. 13: 65-93; Fishwild et al. (1996), Nat. Biotechnol. 14: 845-851; Méndez et al. (1997), Nat. Genet. 15: 146-156; Green (1999), J. Immunol. Methods 231: 11-23; Tomizuka et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727; revisado en Little et al. (2000), Immunol. Today 21: 364-370). Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homozigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da lugar a una completa inhibición de la producción de anticuerpos endógenos (Jakobovits et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555). La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulinas de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal da lugar a la producción de anticuerpos humanos tras desafío con antígeno (Jakobovits et al. (1993), Nature 362: 255-258). Méndez et al. (1997) (Nature Genetics 15: 146-156) han generado una línea de ratones transgénicos que, cuando se les desafía con un antígeno, genera anticuerpos totalmente humanos de alta afinidad. Se consiguió esto por integración en la línea germinal de loci megabase de cadena pesada y cadena ligera humanos en ratones con deleción en el segmento JH endógeno como se ha descrito anteriormente. Estos ratones (XenoMouse® II technology (Abgenix; Fremont, California)) albergan 1.020 kb de locus de cadena pesada humana que contienen aproximadamente 66 genes VH, las regiones DH y JH completas y tres regiones constantes diferentes, y también albergan 800 kb de locus K humano que contienen 32 genes Vκ, segmentos Jκ y genes Cκ. Los anticuerpos producidos en estos ratones se asemejan estrechamente a lo observado en humanos en todos los sentidos, incluyendo la redistribución, el montaje y el repertorio de genes. Los anticuerpos humanos se expresan con preferencia sobre los anticuerpos endógenos debido a la deleción en el segmento endógeno, que previene la redistribución de genes en el locus murino. Dichos ratones pueden ser inmunizados con un antígeno de particular interés.

[0038] Se pueden rastrear los sueros de dichos animales inmunizados en cuanto a reactividad del anticuerpo frente al antígeno inicial. Se pueden aislar linfocitos de los nódulos linfáticos o las células esplénicas y se pueden seleccionar luego en cuanto a células B seleccionando las células negativas a CD138 y positivas a CD19. En un aspecto, se pueden fusionar dichos cultivos de células B (CCB) a células de mieloma para generar hibridomas como se ha detallado anteriormente.

[0039] En otro aspecto, se pueden rastrear además dichos cultivos de células B en cuanto a reactividad frente al antígeno inicial, preferiblemente. Dicho rastreo incluye ELISA con la proteína diana/antigénica, un ensayo competitivo con anticuerpos conocidos que se unen al antígeno de interés y unión in vitro a células CHO u otras transitoriamente transfectadas que expresan el antígeno diana.

[0040] La presente descripción se relaciona con composiciones y métodos para tratar a pacientes humanos con enfermedades mediadas por la estimulación de la señalización CD40 en células que expresan CD40. Los métodos conllevan el tratamiento con un anticuerpo anti-CD40 de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo, donde la administración del anticuerpo o de su fragmento de unión a antígeno promueve una respuesta terapéutica positiva en el paciente que experimenta este método de terapia. Los anticuerpos anti-CD40 adecuados para uso en los métodos de la invención se unen específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana y están libres de actividad agonista significativa, pero exhiben actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 sobre una célula que expresa CD40 humano. Se hace aquí referencia a estos anticuerpos anti-CD40 y a sus fragmentos de unión a antígeno como anticuerpos antagonistas anti-CD40. Dichos anticuerpos incluyen, aunque sin limitación, los anticuerpos monoclonales totalmente humanos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que se describirán a continuación y anticuerpos monoclonales que tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Los expertos en la técnica reconocerán que los anticuerpos antagonistas y los fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos aquí descritos incluyen anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno producidos recombinantemente utilizando métodos bien conocidos en la técnica y que se describirán aquí más adelante, e incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que han sido producidos recombinantemente.

[0041] Como anticuerpos que tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR12.12, se incluyen anticuerpos que interfieren competitivamente con la unión a CD40 y/o que se unen a los mismos

epitopos que CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Un experto podría determinar si un anticuerpo interfiere competitivamente con CHIR-5.9 o CHIR-12.12 utilizando métodos estándar.

[0042] Cuando estos anticuerpos se unen al CD40 exhibido sobre la superficie de células humanas, tales como células B humanas, los anticuerpos están libres de actividad agonista significativa; en algunas realizaciones, su unión al CD40 exhibido sobre la superficie de células humanas da lugar a inhibición de la proliferación y diferenciación de estas células humanas. Así, como anticuerpos antagonistas anti-CD40 adecuados para uso en los métodos de la invención, se incluyen aquellos anticuerpos monoclonales que pueden exhibir actividad antagonista hacia células humanas normales y malignas que expresan el antígeno CD40 de la superficie celular.

[0043] En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 de la invención exhiben una mayor actividad antitumoral en relación al anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico IDEC-C2B8, donde la actividad antitumoral es estudiada con cantidades equivalentes de estos anticuerpos en un modelo tumoral de xenoinjerto en ratón desnudo usando líneas celulares de linfomas humanos. IDEC-C2B8 (IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California; comercializado bajo la denominación comercial Rituxán®, al que también se hace referencia como rituximab) es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico que contiene las regiones constantes IgG1 y kappa humanas con regiones variables murinas aisladas de un anticuerpo monoclonal anti-CD20 murino, IDEC-2B8 (Reff et al. (1994), Blood 83: 435-445). Rituximab® está autorizado para el tratamiento de la recidiva del linfoma no Hodgkin (LNH) de bajo grado o folicular de células B. El descubrimiento de anticuerpos con una superior actividad antitumoral en comparación con Rituximab® podría mejorar drásticamente los métodos de la terapia del cáncer para linfomas de células B, en particular para el linfoma no Hodgkin de células B.

[0044] Como modelos adecuados de tumor de xenoinjerto en ratones desnudos, se incluyen los que utilizan las líneas celulares de linfoma de Burkitt humanas conocidas como Namalwa y Daudi. Las realizaciones preferidas estudian las actividad antitumoral en un modelo tumoral de xenoinjerto en ratones desnudos estadificado utilizando la línea celular de linfoma humana Daudi como se describe aquí más adelante en el Ejemplo 17. Un modelo tumoral de xenoinjerto en ratón desnudo estadificado que utiliza la línea celular de linfoma Daudi es más efectivo para distinguir la eficacia terapéutica de un anticuerpo dado que un modelo no estadificado, ya que, en el modelo estadificado, se inicia la dosificación de anticuerpo sólo después de que el tumor haya alcanzado un tamaño mensurable. En el modelo no estadificado, se inicia la dosificación de anticuerpo generalmente dentro del plazo de aproximadamente 1 día tras la inoculación del tumor y antes de que esté presente un tumor palpable. La capacidad de un anticuerpo para superar a Rituxán® (es decir, para exhibir una mayor actividad antitumoral) en un modelo estadificado es una fuerte indicación de que el anticuerpo será más efectivo terapéuticamente que Rituxán®. Más aún, en el modelo Daudi, anti-CD20, la diana de Rituxán® se expresa sobre la superficie celular a un mayor nivel que CD40.

[0045] Por "cantidad equivalente" del anticuerpo anti-CD40 de la invención y Rituxán®, se entiende que se administra la misma dosis en mg sobre una base de peso. De este modo, cuando se dosifica el anticuerpo anti-CD40 de la invención a 0,01 mg/kg de peso corporal del ratón utilizado en el modelo tumoral, también se dosifica el Rituxán® a 0,01 mg/kg de peso corporal del ratón. De forma similar, cuando se dosifica el anticuerpo anti-CD40 de la invención a 0,1, 1 ó 10 mg/kg de peso corporal del ratón utilizado en el modelo tumoral, también se dosifica el Rituxán® a 0,1, 1 ó 10 mg/kg, respectivamente, del peso corporal del ratón.

[0046] Cuando se administran en el modelo tumoral de xenoinjerto en ratón desnudo, algunos anticuerpos de la invención dan lugar a un volumen tumoral significativamente menor que una cantidad equivalente de Rituxán®. Así, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal totalmente humano CHIR-12.12 exhibe al menos un 20% de aumento en la actividad antitumoral en relación a lo observado con una dosis equivalente de Rituxán cuando se estudia en el modelo tumoral de xenoinjerto en ratón desnudo estadificado utilizando la línea celular de linfoma humana Daudi del modo aquí descrito en los Ejemplos que se darán más adelante, y puede exhibir hasta un 50% a un 60% de aumento en la actividad antitumoral en este ensayo. Esta mayor actividad antitumoral se refleja en la mayor reducción en el volumen del tumor que se observa con el anticuerpo anti-CD40 de la invención cuando se compara con la dosis equivalente de Rituxán®. De este modo, por ejemplo, dependiendo del tiempo transcurrido tras la inoculación del tumor, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 puede exhibir un volumen tumoral de aproximadamente un tercio a aproximadamente la mitad del observado para una dosis equivalente de Rituxán®.

[0047] Otra diferencia en la eficacia del anticuerpo consiste en medir in vitro la concentración de anticuerpo necesaria para obtener la lisis máxima de las células tumorales in vitro en presencia de células NK. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD40 de la invención alcanzan la lisis máxima de las células Daudi a una CE50 de menos de ½ y preferiblemente ¼, y más preferiblemente 1/10, de la concentración de Rituxán®.

[0048] Además del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12, otros anticuerpos anti-CD40 que compartirían las características de tener una eficacia significativamente mayor que cantidades equivalentes de Rituxán® en los ensayos antes descritos incluyen, aunque sin limitación: (1) el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 12.12; (2) un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada dentro del grupo consistente en la secuencia de SEC. Nº ID.: 2, la secuencia de SEC. Nº ID.: 4, la secuencia de SEC. Nº ID.: 5, tanto la secuencia de SEC. Nº ID.: 2 como de SEC. Nº ID.: 4 y tanto la secuencia de SEC. Nº ID.: 2

como de SEC. Nº ID.: 5; (3) un anticuerpo monoclonal que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada entre el grupo consistente en la secuencia nucleotídica de SEC. Nº ID.: 1, la secuencia nucleotídica de SEC. Nº ID.: 3 y tanto la secuencia de SEC. Nº ID.: 1 como de SEC. Nº ID.: 3; (4) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 12.12; (5) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de aminoácidos de SEC. Nº ID.: 10 o SEC. Nº ID.: 12;

(6) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 en un ensayo de unión competitiva; y (7) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o de los anticuerpos monoclonales anteriores de los puntos precedentes (1)-(6), donde el fragmento conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno CD40 humano.

Anticuerpos anti-CD40 antagonistas

[0049] Los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 representan anticuerpos antagonistas anti-CD40 adecuados para uso en los métodos de la presente invención. Los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son anticuerpos monoclonales anti-CD40 totalmente humanos del isotipo IgG1 producidos por las líneas celulares de hibridoma 131.2F8.5.9 (a la que se hará aquí referencia como línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hará aquí referencia como línea celular 12.12). Estas líneas celulares fueron creadas usando esplenocitos de ratones xenotípicos inmunizados que contenían el locus de la cadena pesada de la IgG1 humana y el locus de la cadena κ humana (XenoMouse® technology; Abgenix; Fremont, California). Se fusionaron las células esplénicas con las células SP2/0 de mieloma de ratón (Sierra BioSource). Se subclonaron los hibridomas resultantes varias veces para crear las líneas celulares monoclonales estables 5.9 y 12.12. Se pueden preparar otros anticuerpos de la invención de forma similar usando ratones transgénicos para loci de inmunoglobulinas humanas o por otros métodos conocidos en la técnica y/o aquí descritos.

[0050] Se describen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo CHIR

12.12 y las secuencias de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo CHIR-5.9. Más en particular, se exponen las secuencias de aminoácidos para las regiones líder, variable y constante de la cadena ligera y de la cadena pesada del mAb CHIR-12.12 en las Figuras 9A y 9B, respectivamente. Véanse también la SEC. Nº ID.: 2 (secuencia completa de la cadena ligera del mAb CHIR- 12.12), la SEC. Nº ID.: 4 (secuencia completa de la cadena pesada del mAb CHIR-12.12) y la SEC. Nº ID.: 5 (secuencia completa de una variante de la cadena pesada del mAb CHIR-12.12 expuesta en la SEC. Nº ID.: 4, donde la variante incluye una substitución con serina del residuo de alanina en la posición 153 de la SEC. Nº ID.: 4). Se exponen las secuencias nucleotídicas codificantes de la cadena ligera y de la cadena pesada del mAb CHIR-12.12 en las Figuras 11A y 11B, respectivamente. Véanse también la SEC. Nº ID.: 1 (secuencia codificante de la cadena ligera del mAb CHIR-12.12) y la SEC. Nº ID.: 3 (secuencia codificante de la cadena pesada del mAb CHIR-12.12). Se exponen las secuencias de aminoácidos de las regiones líder, variable y constante de la cadena ligera y de la cadena pesada del mAb CHIR-5.9 en las Figuras 10A y 10B, respectivamente. Véanse también la SEC. Nº ID.: 6 (secuencia completa de la cadena ligera del mAb CHIR-5.9), la SEC. Nº ID.: 7 (secuencia completa de la cadena pesada del mAb CHIR-5.9) y la SEC. Nº ID.: 8 (secuencia completa de una variante de la cadena pesada del mAb CHIR-5.9 expuesta en la SEC. Nº ID.: 7, donde la variante incluye una substitución con serina del residuo de alanina en la posición 158 de la SEC. Nº ID.: 7). Además, se han depositado hibridomas que expresan anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 en la ATCC con una designación de depósito de patente de PTA-5542 y PTA-5543, respectivamente.

[0051] Además de una actividad antagonista, es preferible que los anticuerpos anti-CD40 de esta invención tengan otro mecanismo de acción frente a una célula tumoral. Por ejemplo, los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 nativos tienen actividad CCDA. Alternativamente, las regiones variables de los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 pueden expresarse en otro isotipo de anticuerpo que tenga actividad CCDA. Es también posible conjugar formas nativas, formas recombinantes o fragmentos de unión a antígeno de CHIR-5.9 o CHIR-12.12 a una citotoxina, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo o radioisótopo, como se indica aquí más adelante.

[0052] Los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen al CD40 soluble en ensayos de tipo ELISA, evitan la unión de CD40-ligando al CD40 de la superficie celular y desplazan el CD40-ligando preunido, según se determina mediante ensayos de citometría de flujo. Los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 compiten entre sí por la unión al CD40, pero no con 15B8, el anticuerpo monoclonal anti-CD40 descrito en WO 02/28904. Cuando se estudian in vitro en cuanto a los efectos sobre la proliferación de células B de sujetos humanos normales, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 actúan como anticuerpos antagonistas anti-CD40. Más aún, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 no inducen una potente proliferación de los linfocitos humanos de sujetos normales. Estos anticuerpos son capaces de matar las células diana que expresan CD40 por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). La afinidad de unión de CHIR-5.9 por el CD40 humano es de 1,2x10-8 M y la afinidad de unión de CHIR-12.12 es de 5x10-10 M, según se determina mediante el ensayo Biacore™.

[0053] Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 adecuados para uso en los métodos de la presente invención exhiben una fuerte afinidad de unión de un solo sitio por el antígeno de la superficie celular CD40. Los anticuerpos monoclonales de la invención exhiben una constante de disociación en equilibrio (KD) para el CD40 de al menos 10-5 M, al menos 3X10-5 M, preferiblemente al menos 10-6 M a 10-7 M, más preferiblemente al menos 10-8 M a

aproximadamente 10-12 M, medida usando un ensayo estándar, tal como Biacore™. El ensayo Biacore es conocido en la técnica y se facilitan detalles de él en el "BIAapplications handbook". Se pueden usar los métodos descritos en WO 01/27160 para modular la afinidad de unión.

[0054] Por "antígeno CD40", "antígeno de la superficie celular CD40", "receptor CD40" o "CD40", se entiende una glicoproteína de transmembrana que pertenece a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (véanse, por ejemplo, las Patentes EE.UU. Nº 5.674.492 y Nº 4.708.871; Stamenkovic et al. (1989), EMBO 8: 1403; Clark (1990), Tissue Antigens 36: 33; y Barclay et al. (1997), The Leucocyte Antigen Facts Book (2ª ed., Academic Press, San Diego)). Se han identificado dos isoformas del CD40 humano, codificadas por variantes de transcriptos alternativamente ayustadas de este gen. La primera isoforma (también conocida como la "isoforma larga" o "isoforma 1") se expresa como un polipéptido precursor de 277 aminoácidos (SEC. Nº ID.: 12 (primeramente referida como Nº Acceso del GenBank CAA43045 e identificada como isoforma 1 en el Nº de Acceso del GenBank NP_001241), codificada por la SEC. Nº ID.: 11 (véanse los Números de Acceso del GenBank X60592 y NM_001250)), que tiene una secuencia de señal representada por los primeros 19 residuos. La segunda isoforma (también conocida como la "isoforma corta" o "isoforma 2") se expresa como un polipéptido precursor de 203 aminoácidos (SEC. Nº ID.: 10 (Nº de Acceso del GenBank NP_690593), codificada por la SEC. Nº ID.: 9 (Nº de Acceso del GenBank NM_152854)), que también tiene una secuencia de señal representada por los primeros 19 residuos. Los polipéptidos precursores de estas dos isoformas del CD40 humano comparten en común sus primeros 165 residuos (es decir, los residuos 1-165 de la SEC. Nº ID.: 10 y de la SEC. Nº ID.: 12). El polipéptido precursor de la isoforma corta (mostrado en la SEC. Nº ID.: 10) está codificado por una variante de transcripto (SEC. Nº ID.: 9) que carece de un segmento codificante, lo que da lugar a un cambio de marco de traducción; la isoforma de CD40 resultante contiene un extremo C más corto y distinto (residuos 166-203 de la SEC. Nº ID.: 10) con respecto al contenido en la isoforma larga del CD40 (extremo C mostrado en los residuos 166-277 de la SEC. Nº ID.: 12). Para los fines de la presente invención, el término "antígeno CD40", "antígeno de la superficie celular CD40", "receptor CD40" o "CD40" abarca las isoformas tanto corta como larga del CD40. Los anticuerpos anti-CD40 de la presente invención se unen a un epitopo del CD40 humano que reside en la misma localización en la isoforma corta o en la isoforma larga de este antígeno de la superficie celular, como se indica aquí más adelante.

[0055] El antígeno CD40 se exhibe sobre la superficie de una variedad de tipos celulares, según se describe aquí en algún otro lugar. Por "se exhibe sobre la superficie" y "se expresa sobre la superficie", se entiende que todo o parte del antígeno CD40 está expuesto al exterior de la célula. El antígeno CD40 exhibido o expresado puede estar total o parcialmente glicosilado.

[0056] Por "actividad agonista", se entiende que la substancia funciona como un agonista. Un agonista se combina con un receptor sobre una célula e inicia una reacción o actividad similar o idéntica a la iniciada por el ligando natural del receptor. Un agonista de CD40 induce cualquiera o todas de, aunque sin limitación, las siguientes respuestas: proliferación y diferenciación de las células B, producción de anticuerpos, adhesión intercelular, generación de memoria de las células B, cambio de isotipos, regulación a más de la expresión en la superficie celular del MHC Clase II y del CD80/86 y secreción de citoquinas proinflamatorias, tales como IL-8, IL-12 y TNF. Por "actividad antagonista", se entiende que la substancia funciona como un antagonista. Un antagonista de CD40 previene o reduce la inducción de cualquiera de las respuestas inducidas por la unión del receptor CD40 a un ligando agonista, en particular CD40L. El antagonista puede reducir la inducción de cualquiera o más de las respuestas a la unión del agonista en un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o 35%, preferiblemente un 40%, 45%, 50%, 55% o 60%, más preferiblemente un 70%, 80% o 85% y más preferiblemente un 90%, 95%, 99% o 100%. Los métodos para medir la especificidad de unión del anticuerpo anti-CD40 y el ligando de CD40 y la actividad antagonista son conocidos para un experto en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, ensayos de unión competitiva estándar, ensayos para monitorizar la secreción de inmunoglobulinas por las células B, ensayos de proliferación de las células B, ensayos de proliferación de las células B de tipo Banchereau, ensayos de células T helper para producción de anticuerpos, ensayos de coestimulación de la proliferación de células B y ensayos para la regulación a más de marcadores de activación de las células B. Véanse, por ejemplo, tales ensayos descritos en WO 00/75348 y en la Patente EE.UU. Nº 6.087.329.

[0057] Por actividad agonista "significativa", se entiende una actividad agonista al menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% mayor que la actividad agonista inducida por una substancia neutra o un control negativo, según se mide en un ensayo de una respuesta de las células B. Preferiblemente, actividad agonista "significativa" es una actividad agonista al menos dos veces mayor o al menos tres veces mayor que la actividad agonista inducida por una substancia neutra o un control negativo, según se mide en un ensayo de una respuesta de las células B. Así, por ejemplo, cuando la respuesta de las células B de interés es la proliferación de las células B, actividad agonista "significativa" sería la inducción de un nivel de proliferación de las células B al menos dos veces mayor o al menos tres veces mayor que el nivel de proliferación de las células B inducido por una substancia neutra o un control negativo. En una realización, una inmunoglobulina no específica, por ejemplo IgG1, que no se une a CD40 sirve como control negativo. Una substancia "libre de actividad agonista significativa" exhibiría una actividad agonista no más de aproximadamente un 25% mayor que la actividad agonista inducida por una substancia neutra o un control negativo, preferiblemente no más de aproximadamente un 20% mayor, un 15% mayor, un 10% mayor, un 5% mayor, un 1% mayor o un 0,5% mayor, o incluso no más de aproximadamente un 0,1% mayor, que la actividad agonista inducida por una substancia neutra o un control negativo, según se mide en

un ensayo de una respuesta de las células B. Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 útiles en los métodos de la presente invención están libres de actividad agonista significativa, según se ha indicado anteriormente, cuando se unen a un antígeno CD40 sobre una célula humana. En una realización de la invención, el anticuerpo antagonista anti-CD40 está libre de actividad agonista significativa en una respuesta de las células B. En otra realización de la invención, el anticuerpo antagonista anti-CD40 está libre de actividad agonista significativa en ensayos de más de una respuesta de las células B (v.g., proliferación y diferenciación, o proliferación, diferenciación y producción de anticuerpos).

[0058] Tal como se utiliza aquí "anticuerpo anti-CD40" abarca cualquier anticuerpo que reconozca específicamente el antígeno de la superficie de las células B CD40, incluyendo anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena y sus fragmentos, tales como Fab, F(ab’)2, Fv y otros fragmentos que conservan la función de unión a antígeno del anticuerpo anti-CD40 parental. Son de particular interés para la presente invención los anticuerpos antagonistas anti-CD40 aquí expuestos que comparten las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 antes descritos. Dichos anticuerpos incluyen, aunque sin limitación, los siguientes: (1) los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridoma designadas como 131.2F8.5.9 (a la que se hace aquí referencia como la línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace aquí referencia como la línea celular 12.12), depositadas en la ATCC como Nº de Depósito de Patente PTA-5542 y Nº de Depósito de Patente PTA-5543, respectivamente; (2) un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 2, la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 4, la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 5, las dos secuencias mostradas en la SEC. Nº ID.: 2 y la SEC. Nº ID.: 4 y las dos secuencias mostradas en la SEC. Nº ID.: 2 y la SEC. Nº ID.: 5; (3) un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 6, la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 7, la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 8, las dos secuencias mostradas en la SEC. Nº ID.: 6 y la SEC. Nº ID.: 7 y las dos secuencias mostradas en la SEC. Nº ID.: 6 y la SEC. Nº ID.: 8; (4) un anticuerpo monoclonal que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada entre el grupo consistente en la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. Nº ID.: 1, la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. Nº ID.: 3 y las dos secuencias mostradas en la SEC. Nº ID.: 1 y la SEC. Nº ID.: 3; (5) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 5.9 o la línea celular de hibridoma 12.12; (6) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o la SEC. Nº ID.: 12; (7) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 en un ensayo de unión competitiva; y (8) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 o de los anticuerpos monoclonales anteriores de los puntos precedentes (1)-(7), donde el fragmento conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno CD40 humano.

Producción de anticuerpos antagonistas anti-CD40

[0059] Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 aquí expuestos y para uso en los métodos de la presente invención pueden ser producidos usando cualquier método de producción de anticuerpos conocido para los expertos en la técnica. Así, se pueden preparar sueros policlonales por métodos convencionales. En general, se usa primeramente una solución que contiene el antígeno CD40 para inmunizar a un animal adecuado, preferiblemente un ratón, una rata, un conejo o una cabra. Se prefieren los conejos o las cabras para la preparación de sueros policlonales por el volumen de suero que se puede obtener y la disponibilidad de anticuerpos anti-conejo y anti-cabra marcados.

[0060] Se pueden preparar sueros policlonales en un animal transgénico, preferiblemente un ratón, portador de loci de inmunoglobulinas humanas. En una realización preferida, se usan células Sf9 que expresan CD40 como inmunógeno. También se puede llevar a cabo la inmunización mezclando o emulsionando la solución que contiene antígeno en solución salina, preferiblemente en un adyuvante, tal como adyuvante completo de Freund, e inyectando la mezcla o emulsión parenteralmente (en general subcutánea o intramuscularmente). Una dosis de 50-200 μg/inyección es típicamente suficiente. La inmunización es generalmente reforzada 2-6 semanas después con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, preferiblemente utilizando adyuvante incompleto de Freund. Alternativamente, se pueden generar anticuerpos por inmunización in vitro usando métodos conocidos en la técnica, lo que, para los fines de esta invención, se considera equivalente a la inmunización in vivo. Se obtienen antisueros policlonales sangrando al animal inmunizado en un recipiente de vidrio o de plástico e incubando la sangre a 25°C durante una hora, seguido de incubación a 4°C durante 2-18 horas. Se recupera el suero por centrifugación (v.g.,

1.000 x g durante 10 minutos). Se pueden obtener aproximadamente 20-50 ml por sangría de conejos.

[0061] Se describe la producción de las células Sf 9 (Spodoptera frugiperda) en la Patente EE.UU. Nº 6.004.552, aquí incorporada a modo de referencia. Resumiendo, se recombinaron secuencias codificantes del CD40 humano en un baculovirus usando vectores de transferencia. Se cotransfectaron los plásmidos con ADN de baculovirus de tipo salvaje en células Sf 9. Se identificaron las células Sf9 infectadas con baculovirus recombinantes y se purificaron clonalmente.

[0062] Preferiblemente, el anticuerpo es de naturaleza monoclonal. Por "anticuerpo monoclonal", se entiende un

anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, que los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores. El término no está limitado en cuanto a la especie o fuente del anticuerpo. El término abarca inmunoglobulinas completas, así como fragmentos, tales como Fab, F(ab’)2, Fv y otros que conservan la función de unión a antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un solo sitio antigénico, es decir, el antígeno de la superficie celular CD40 en la presente invención. Más aún, contrariamente a las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante sobre el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población substancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de considerar que se requiera la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para uso según la presente invención pueden ser producidos por el método de hibridomas primeramente descrito por Kohler et al. (1975), Nature 256: 495, o pueden ser producidos por métodos de ADN recombinante (véase, v.g., la Patente EE.UU. Nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden ser también aislados de librerías de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clackson et al. (1991), Nature 352: 624-628; Marks et al. (1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597; y la

[0063] Patente EE.UU. Nº 5.514.548.

[0064] Por "epitopo", se entiende la parte de una molécula antigénica para la que se produce un anticuerpo y a la que se unirá el anticuerpo. Los epitopos pueden incluir residuos de aminoácidos lineales (es decir, que los residuos en el epitopo se distribuyen secuencialmente uno después del otro de una forma lineal), residuos de aminoácidos no lineales (a los que se hace aquí referencia como "epitopos no lineales"; estos epitopos no se distribuyen secuencialmente) o residuos de aminoácidos tanto lineales como no lineales.

[0065] Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando el método de Kohler et al. (1975), Nature 256: 495496 o una modificación del mismo. Típicamente, se inmuniza a un ratón con una solución que contiene un antígeno. Se puede realizar la inmunización mezclando o emulsionando la solución que contiene el antígeno en solución salina, preferiblemente en un adyuvante, tal como adyuvante completo de Freund, e inyectando la mezcla o emulsión parenteralmente. Se puede emplear cualquier método de inmunización conocido en la técnica para obtener los anticuerpos monoclonales de la invención. Tras la inmunización del animal, se extirpa el bazo (y eventualmente varios grandes nódulos linfáticos) y se disocia en células simples. Se puede hacer un rastreo de las células esplénicas aplicando una suspensión celular a una placa o pocillo revestido con el antígeno de interés. Las células B que expresan inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno se unen a la placa y no se eliminan por lavado. Se induce entonces a las células B resultantes, o a todas las células esplénicas disociadas, a fusionarse con células de mieloma para formar hibridomas y se cultivan en un medio selectivo. Se plaquean las células resultantes por dilución seriada y se estudian en cuanto a la producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno de interés (y que no se unen a antígenos no relacionados). Se cultivan entonces los hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales (mAb) seleccionados in vitro (v.g., en botellas de cultivo de tejidos o reactores de fibra hueca) o in vivo (como ascitis en ratones).

[0066] Cuando se han de preparar los anticuerpos antagonistas anti-CD40 de la invención usando métodos de ADN recombinante, el ADN codificante de los anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (v.g., usando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma aquí descritas sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, se puede poner el ADN en vectores de expresión, que son entonces transfectados en células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) o células de mieloma, que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Como artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias de ADN codificante del anticuerpo, se incluyen Skerra et al. (1993), Curr. Opinion in Immunol. 5: 256, y Phickthun (1992), Immunol. Revs. 130: 151. Alternativamente, se puede producir anticuerpo en una línea celular, tal como una línea de células CHO, como se describe en las Patentes EE.UU. Nº 5.545.403, Nº 5.545.405 y Nº 5.998.144. Para explicarlo brevemente, se transfecta la línea celular con vectores capaces de expresar una cadena ligera y una cadena pesada, respectivamente. Transfectando las dos proteínas en vectores independientes, se pueden producir anticuerpos quiméricos. Otra ventaja es la correcta glicosilación del anticuerpo.

[0067] En algunas realizaciones, se produce el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo el anticuerpo CHIR

12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en células CHO usando el sistema de expresión génica GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire), que emplea glutamina sintetasa como marcador. Véanse también las Patentes EE.UU. Nº 5.122.464, Nº 5.591.639, Nº 5.658.759, Nº 5.770.359, Nº 5.827.739, Nº 5.879.936, Nº 5.891.693 y Nº 5.981.216.

[0068] Se conocen en la técnica anticuerpos monoclonales para CD40. Véanse, por ejemplo, las secciones dedicadas a antígeno de células B en McMichael, ed. (1987; 1989), Leukocyte Typing III and IV (Oxford University Press, New York); Patentes EE.UU. Nº 5.674.492, Nº 5.874.082, Nº 5.677.165 y Nº 6.056.959; WO 00/63395;

Publicaciones Internacionales Nº WO 02/28905 y Nº WO 02/28904; Gordon et al. (1988), J. Immunol. 140: 1425; Valle et al. (1989), Eur. J. Immunol. 19: 1463; Clark et al. (1986), PNAS 83: 4494; Paulie et al. (1989), J. Immunol.

142: 590; Gordon et al. (1987), Eur. J. Immunol. 17: 1535; Jabara et al. (1990), J. Exp. Med. 172: 1861; Zhang et al. (1991), J. Immunol. 146: 1836; Gascan et al. (1991), J. Immunol. 147: 8; Banchereau et al. (1991), Clin. Immunol. Spectrum 3: 8; y Banchereau et al. (1991), Science 251: 70. De particular interés para la presente invención son los anticuerpos antagonistas anti-CD40 aquí expuestos que comparten las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 antes descritos.

[0069] El término "epitopo del antígeno CD40", tal como se usa aquí, se refiere a una molécula capaz de inmunorreaccionar con los anticuerpos monoclonales anti-CD40 de esta invención, excluyendo el propio antígeno CD40. Los epitopos del antígeno CD40 pueden incluir proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos y otras moléculas, pero para los fines de la presente invención son más comúnmente proteínas, oligopéptidos cortos, imitadores de oligopéptidos (es decir, compuestos orgánicos que imitan las propiedades de unión al anticuerpo del antígeno CD40) o sus combinaciones. Se describen imitadores de oligopéptidos adecuados, entre otros, en la solicitud PCT EE.UU. 91/04282.

[0070] Adicionalmente, el término "anticuerpo anti-CD40", tal como se utiliza aquí, abarca anticuerpos anti-CD40 quiméricos; dichos anticuerpos anti-CD40 quiméricos para uso en los métodos de la invención tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 aquí descritos. Por anticuerpos "quiméricos", se entienden anticuerpos más preferiblemente derivados usando técnicas de ácido desoxirribonucleico recombinante y que comprenden componentes tanto humanos (incluyendo especies inmunológicamente "relacionadas", v.g., chimpancé) como no humanos. Así, la región constante del anticuerpo quimérico es más preferiblemente substancialmente idéntica a la región constante de un anticuerpo humano natural; la región variable del anticuerpo quimérico deriva más preferiblemente de una fuente no humana y tiene la especificidad antigénica deseada para el antígeno de la superficie celular CD40. La fuente no humana puede ser cualquier fuente de vertebrados que pueda utilizarse para generar anticuerpos para un antígeno de la superficie celular CD40 humano o un material que contenga un antígeno de la superficie celular CD40 humano. Dichas fuentes no humanas incluyen, aunque sin limitación, roedores (v.g., conejo, rata, ratón, etc.; véase, por ejemplo, la Patente EE.UU. Nº 4.816.567) y primates no humanos (v.g., Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.; véanse, por ejemplo, las Patentes EE.UU. Nº

5.750.105 y Nº 5.756.096). Tal como se utiliza aquí, la expresión "inmunológicamente activo", cuando se usa en relación a anticuerpos anti-CD40 quiméricos, significa un anticuerpo quimérico que se une al CD40 humano.

[0071] El término anticuerpo anti-CD40, tal como se utiliza aquí, también abarca anticuerpos anti-CD40 quiméricos y humanizados. Los anticuerpos quiméricos incluyen segmentos de anticuerpos derivados de diferentes especies. Rituxán® es un ejemplo de anticuerpo quimérico con una región variable murina y una región constante humana.

[0072] Por "humanizados", se entienden formas de anticuerpos anti-CD40 que contienen una secuencia mínima derivada de secuencias de inmunoglobulinas no humanas. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en donde los residuos de una región hipervariable (también conocida como región determinante de complementariedad o RDC) del receptor están substituidos por los residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o un primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. La expresión "región determinante de complementariedad" se refiere a secuencias de aminoácidos que juntas definen la afinidad y especificidad de unión de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulinas nativo. Véanse, v.g., Chothia et al (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917; Kabat et al. (1991), U. S. Dept. of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). La expresión "región constante" se refiere a la porción de la molécula del anticuerpo que confiere funciones efectoras. En el trabajo previo dirigido a la producción de anticuerpos no inmunogénicos para uso en la terapia de la enfermedad humana, se substituyeron regiones constantes murinas por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los anticuerpos humanizados en cuestión derivaban de inmunoglobulinas humanas. Sin embargo, estos anticuerpos humanizados aún provocaban una respuesta inmune no deseada y potencialmente peligrosa en humanos y había una pérdida de afinidad. Los anticuerpos anti-CD40 humanizados para uso en los métodos de la presente invención tienen características de unión similares a las exhibidas por los anticuerpos monoclonales CHIR

5.9 y CHIR-12.12 aquí descritos.

[0073] La humanización puede ser esencialmente llevada a cabo siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986), Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988), Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988), Science 239: 1534-1536), substituyendo con RDC o secuencias RDC de roedores o de roedores mutantes las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Véanse también las Patentes EE.UU. Nº 5.225.539, Nº 5.585.089, Nº 5.693.761, Nº 5.693.762 y Nº 5.859.205. En algunos casos, se substituyen residuos dentro de las regiones de marco de una o más regiones variables de la inmunoglobulina humana por los correspondientes residuos no humanos (véanse, por ejemplo, las Patentes EE.UU. Nº 5.585.089, Nº 5.693.761, Nº 5.693.762 y Nº 6.180.370). Más aún, los anticuerpos humanizados pueden incluir residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Se realizan estas modificaciones para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo (v.g., para obtener la afinidad deseada). En general, el anticuerpo humanizado incluirá substancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en donde todas o substancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas las regiones

de marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también incluirá eventualmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones et al. (1986), Nature 331: 522-525; Riechmann et al. (1988), Nature 332: 323-329; y Presta (1992), Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" pueden incluir anticuerpos donde se ha substituido substancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de RDC y posiblemente algunos residuos de marco están substituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Véanse, por ejemplo, las Patentes EE.UU. Nº 5.225.539, Nº 5.585.089, Nº 5.693.761, Nº 5.693.762 y Nº

5.859.205. Véanse también la Patente EE.UU. Nº 6.180.370 y la Publicación Internacional Nº WO 01/27160, donde se exponen anticuerpos humanizados y técnicas para producir anticuerpos humanizados con mayor afinidad por un antígeno predeterminado.

[0074] También quedan abarcados por el término anticuerpos anti-CD40 los anticuerpos anti-CD40 xenogénicos o modificados producidos por un huésped mamífero no humano, más particularmente un ratón transgénico, caracterizados por loci de inmunoglobulinas (Ig) endógenos inactivados. En dichos animales transgénicos, los genes endógenos competentes para la expresión de subunidades ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas del huésped se vuelven no funcionales y se substituyen con loci de inmunoglobulinas humanas análogos. Estos animales transgénicos producen anticuerpos humanos en la substancial ausencia de subunidades de inmunoglobulinas ligeras

o pesadas del huésped. Véanse, por ejemplo, las Patentes EE.UU. Nº 5.877.397 y Nº 5.939.598.

[0075] Preferiblemente, se obtienen anticuerpos totalmente humanos para el CD40 inmunizando a ratones transgénicos. Se obtiene dicho ratón usando tecnología XenoMouse® (Abgenix; Fremont, California), y se describe en las Patentes EE.UU. Nº 6.075.181, Nº 6.091.001 y Nº 6.114.598. Para producir los anticuerpos aquí expuestos, se inmunizaron ratones transgénicos para el locus de la cadena pesada de la IgG1 humana y el locus de la cadena ligera κ humana con células Sf 9 que expresan el CD40 humano. Los ratones pueden ser también transgénicos para otros isotipos. Los anticuerpos totalmente humanos útiles en los métodos de la presente invención se caracterizan por propiedades de unión similares a las exhibidas por los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 aquí expuestos.

[0076] Los fragmentos de los anticuerpos anti-CD40 son adecuados para uso en los métodos de la invención en la medida en que conserven la afinidad deseada del anticuerpo de longitud total. Así, un fragmento de un anticuerpo anti-CD40 conservará la capacidad de unirse al antígeno de la superficie de las células B CD40. Dichos fragmentos se caracterizan por propiedades similares al correspondiente anticuerpo antagonista anti-CD40 de longitud total, es decir, que los fragmentos se unirán específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una célula humana y están libres de actividad agonista significativa, pero exhiben actividad antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 sobre una célula que expresa el CD40 humano. Se hace referencia aquí a dichos fragmentos como fragmentos "de unión a antígeno".

[0077] Los fragmentos de unión a antígeno adecuados de un anticuerpo tienen una porción de un anticuerpo de longitud total, generalmente su región de unión a antígeno o variable. Como ejemplos de fragmentos de anticuerpo, se incluyen, aunque sin limitación, fragmentos Fab, F(ab’)2 y Fv y moléculas de anticuerpo de una sola cadena. Por "Fab", se entiende un fragmento de unión a antígeno monovalente de una inmunoglobulina que está compuesto por la cadena ligera y parte de la cadena pesada. Por F(ab’)2, se entiende un fragmento de unión a antígeno bivalente de una inmunoglobulina que contiene ambas cadenas ligeras y parte de ambas cadenas pesadas. Por fragmentos de anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "sFv", se entienden fragmentos que comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Véanse, por ejemplo, las Patentes EE.UU. Nº 4.946.778, Nº 5.260.203, Nº 5.455.030 y Nº 5.856.456. En general, el polipéptido Fv incluye además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión del sFv, véase Pluckthun (1994), en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315. Los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos antagonistas anti-CD40 aquí expuestos pueden también ser conjugados a una citotoxina para matar a las células cancerosas diana, según se describirá aquí más adelante.

[0078] Se pueden aislar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de librerías de fagos de antibióticos generadas usando las técnicas descritas en, por ejemplo, McCafferty et al. (1990), Nature 348: 552-554 (1990), y la Patente EE.UU. Nº 5.514.548. Clackson et al. (1991), Nature 352: 624-628, y Marks et al. (1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597, describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando librerías de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por mezcla de cadenas (Marks et al. (1992), Bio/Technology 10: 779-783), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para la construcción de librerías muy grandes de fagos (Waterhouse et al. (1993), Nucleic. Acids Res. 21: 2265-2266). Así, estas técnicas constituyen alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

[0079] Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos derivaban por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, v.g., Morimoto et al. (1992),

Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992), y Brennan et al. (1985), Science 229: 81). Sin embargo, estos fragmentos pueden ser ahora producidos directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, se pueden aislar los fragmentos de anticuerpos de las librerías de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, se pueden recuperar fragmentos Fab’-SH directamente de E. coli y copularlos químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al. (1992), Bio/Technology 10: 163-167). Según otro enfoque, se pueden aislar fragmentos F(ab’)2 directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos resultarán obvias para el experto en la materia.

[0080] Como anticuerpos antagonistas anti-CD40 útiles en los métodos de la presente invención, se incluyen los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR- 12-12 aquí expuestos, así como anticuerpos que difieren de estos anticuerpos, pero que conservan las RDC, y anticuerpos con una o más adiciones, deleciones o substituciones de aminoácidos, donde se mide la actividad antagonista por inhibición de la proliferación y/o diferenciación de las células B. La invención también incluye anticuerpos antagonistas anti-CD40 desinmunizados, que pueden ser producidos como se describe en, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nº WO 98/52976 y Nº WO 0034317. De este modo, se modifican residuos que se encuentran dentro de los anticuerpos antagonistas anti-CD40 de la invención para hacer que los anticuerpos sean menos o nada inmunogénicos para humanos, pero conservando su actividad antagonista hacia las células que expresan el CD40 humano, donde se mide dicha actividad mediante ensayos indicados aquí en algún otro lugar. También se incluyen en el alcance de las reivindicaciones proteínas de fusión que incluyen un anticuerpo antagonista anti-CD40 de la invención, o un fragmento del mismo, cuyas proteínas de fusión pueden ser sintetizadas o expresadas a partir de correspondientes vectores polinucleotídicos, como es sabido en la técnica. Se describen dichas proteínas de fusión en relación a la conjugación de anticuerpos, como se indica más adelante.

[0081] Los anticuerpos de la presente invención pueden tener variaciones de secuencia producidas usando métodos descritos en, por ejemplo, las Publicaciones de Patentes Nº EP 0.983.303 A1, WO 00/34317 y WO 98/52976. Por ejemplo, se ha visto que secuencias dentro de la RDC pueden hacer que un anticuerpo se una al MHC de Clase II y desencadene una respuesta no deseada de las células T helper. Una substitución conservadora puede permitir a un anticuerpo conservar la actividad de unión y aun así perder su capacidad para desencadenar una respuesta no deseada de las células T. Se puede producir cualquier substitución conservadora o no conservadora de este tipo usando métodos reconocidos en la técnica, tales como los indicados aquí en algún otro lugar, y los anticuerpos resultantes entrarán dentro del alcance de la invención. Los anticuerpos variantes pueden ser estudiados rutinariamente en cuanto a actividad antagonista, afinidad y especificidad usando los métodos aquí descritos.

[0082] Un anticuerpo producido por cualquiera de los métodos antes descritos o cualquier otro método no expuesto aquí quedará dentro del alcance de esta exposición si posee al menos una de las siguientes actividades biológicas: inhibición de la secreción de inmunoglobulinas por las células B periféricas humanas normales estimuladas por las células T; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales estimuladas por células T Jurkat; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales estimuladas por células que expresan CD40L o ligando CD40 soluble (sCD40L); inhibición de las señales intracelulares antiapoptóticas de "supervivencia" en cualquier célula estimulada por sCD40L o CD40L en fase sólida; inhibición de la transducción de señal CD40 en cualquier célula al ligar con sCD40L o CD40L en fase sólida; e inhibición de la proliferación de las células B malignas humanas como se indica más adelante. Estos ensayos pueden ser realizados como se describe en los Ejemplos que aquí se dan. Véanse también los ensayos descritos en Schultze et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8200-8204; Denton et al. (1998), Pediatr. Transplant. 2: 6-15; Evans et al. (2000), J. Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998), Agents Actions Supl. 49: 17-22; Lederman et al. (1996), Curr. Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan et al. (1991), Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom et al. (1993), Immunology 79: 439-444; y Patentes EE.UU. Nº 5.674.492 y Nº 5.847.082.

[0083] Un ensayo representativo para detectar anticuerpos antagonistas anti-CD40 específicos para los epitopos del antígeno CD40 aquí identificados es un "ensayo de unión competitiva". Los ensayos de unión competitiva son ensayos serológicos en los que se detectan y cuantifican elementos desconocidos por su capacidad para inhibir la unión de un ligando conocido marcado a su anticuerpo específico. También se hace referencia a esto como un ensayo de inhibición competitiva. En un ensayo de unión competitiva representativo, se precipita el polipéptido CD40 marcado mediante anticuerpos candidatos en una muestra, por ejemplo en combinación con anticuerpos monoclonales producidos contra uno o más epitopos de los anticuerpos monoclonales de la invención. Se pueden identificar anticuerpos anti-CD40 que reaccionan específicamente con un epitopo de interés rastreando una serie de anticuerpos preparados contra una proteína CD40 o un fragmento de la proteína que incluye el epitopo particular de la proteína CD40 de interés. Por ejemplo, para el CD40 humano, los epitopos de interés incluyen epitopos que tienen residuos de aminoácidos lineales y/o no lineales de la isoforma corta del CD40 humano (véase el Nº de Acceso del GenBank NP_690593) expuesta en la Figura 12B (SEC. Nº ID.: 10), codificada por la secuencia expuesta en la Figura 12A (SEC. Nº ID.: 9; véase también el Nº de Acceso del GenBank NM_152854), o de la isoforma larga del CD40 humano (véanse los Números de Acceso del GenBank CAA43045 y NP_001241) expuesta en la Figura 12D (SEC. Nº ID.: 12), codificada por la secuencia expuesta en la Figura 12C (SEC. Nº ID.: 11; véanse los Números de Acceso del GenBank X60592 y NM_001250). Alternativamente, se podrían usar ensayos de unión competitiva con anticuerpos antagonistas anti-CD40 adecuados previamente identificados para seleccionar anticuerpos monoclonales comparables a los anticuerpos previamente identificados.

[0084] Los anticuerpos empleados en dichos inmunoensayos pueden estar marcados o sin marcar. Se pueden emplear anticuerpos no marcados en aglutinación; se pueden emplear anticuerpos marcados en una amplia variedad de ensayos, utilizando una amplia variedad de marcajes. Se puede facilitar la detección de la formación de un complejo anticuerpo-antígeno entre un anticuerpo anti-CD40 y un epitopo de interés uniendo una substancia detectable al anticuerpo. Como medios de detección adecuados, se incluye el uso de marcajes, tales como radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescedores, quimioluminiscedores, cromógenos, substratos o cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, complejos de grupos prostéticos, radicales libres, partículas, colorantes y similares. Como ejemplos de enzimas adecuadas, se incluyen la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la β-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; como ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados, se incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; como ejemplos de materiales fluorescentes adecuados, se incluyen la umbeliferona, la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la diclorotriazinilaminofluoresceína, el cloruro de dansilo o la ficoeritrina; un ejemplo de un material luminescente es el luminol; como ejemplos de materiales bioluminescentes, se incluyen la luciferasa, la luciferina y la aequorina; y como ejemplos de materiales radiactivos adecuados, se incluyen 115I, 131I, 35S o 3H. Dichos reactivos marcados pueden ser usados en una variedad de ensayos bien conocidos, tales como radioinmunoensayos, enzimoinmunoensayos, v.g., ELISA, inmunoensayos fluorescentes y similares. Véanse, por ejemplo, las Patentes EE.UU. Nº 3.766.162, Nº 3.791.932, Nº

3.817.837 y Nº 4.233.402.

[0085] Se puede conjugar cualquiera de los anticuerpos antagonistas anti-CD40 o fragmentos de anticuerpos de los mismos previamente descritos antes de su uso en los métodos de la presente invención. Los métodos de producción de anticuerpos conjugados son conocidos en la técnica. Así, se puede marcar el anticuerpo anti-CD40 utilizando un marcaje indirecto o un enfoque de marcaje indirecto. Por "marcaje indirecto" o "enfoque de marcaje indirecto", se entiende que se une un agente quelante covalentemente a un anticuerpo y se inserta al menos un radionúclido en el agente quelante. Véanse, por ejemplo, los agentes quelantes y radionúclidos descritos en Srivagtava y Mease (1991), Nucl. Med. Bio. 18: 589-603. Como marcajes adecuados, se incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos (particularmente 32P y 125I), reactivos densos en electrones, enzimas y ligandos que tienen compañeros de unión específica. Las enzimas son típicamente detectadas por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante es normalmente detectada por su capacidad para convertir la 3,3’, 5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. "Compañero de unión específica" se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula de ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para el mismo. Otros compañeros de unión específica incluyen biotina y avidina o estreptavidina, Ig G y proteína A y las numerosas parejas receptor-ligando conocidas en la técnica. Habría que entender que la anterior descripción no pretende categorizar los diversos marcajes en clases distintas, ya que el mismo marcaje puede servir de varios modos diferentes. Por ejemplo, el 125I puede servir como marcaje radiactivo o como reactivo denso en electrones. La HRP puede servir como enzima o como antígeno para un mAb. Además, se pueden combinar varios marcajes para el efecto deseado. Por ejemplo, los mAb y la avidina también requieren marcajes en la práctica de esta invención: así, se podría marcar un mAb con biotina y detectar su presencia con avidina marcada con 125I, o con un mAb antibiotina marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades resultarán fácilmente obvias para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención.

[0086] Alternativamente, el anticuerpo anti-CD40 puede ser marcado usando "marcaje directo" o un "enfoque de marcaje directo", donde se une covalentemente un radionúclido directamente a un anticuerpo (típicamente a través de un residuo de aminoácido). Se facilitan radionúclidos preferidos en Srivagtava y Mease (1991), supra. Se prefiere, en particular, el enfoque de marcaje indirecto. Véanse también, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nº WO 00/52031 y Nº WO 00/52473, donde se usa un conector para unir un marcaje radiactivo a anticuerpos, y las formas marcadas de anticuerpos anti-CD40 descritas en la Patente EE.UU. Nº 6.015.542.

[0087] Además, se puede conjugar un anticuerpo (o fragmento del mismo) con un resto terapéutico, tal como una citotoxina, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo o radioisótopo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea nocivo para las células. Como ejemplos, se incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y sus análogos u homólogos. Como agentes terapéuticos, se incluyen, aunque sin limitación, antimetabolitos (v.g., metotrexato, 6mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina y 5-fluorouracildacarbazina), agentes alquilantes (v.g., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiaminoplatino (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (v.g., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (v.g., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (v.g., vincristina y vinblastina). Como radioisótopos se incluyen, aunque sin limitación, I-131, I-123,1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi213, Pd-109, Tc-99, In-111 y similares. Los conjugados de la invención pueden ser usados para modificar una respuesta biológica dada; el resto del fármaco no ha de ser considerado como limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto del fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina, tal como abrina, ricina A,

exotoxina de Pseudomonas o toxina de la difteria; una proteína, tal como el factor de necrosis tumoral, el interferónalfa, el interferón-beta, el factor de crecimiento de los nervios, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas y el activador del plasminógeno de los tejidos; o modificadores de la respuesta biológica, tales como, por ejemplo, las linfoquinas, la interleuquina-1 ("IL-1"), la interleuquina-2 ("IL-2"), la interleuquina-6 ("IL-6"), el factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos ("GM-CSF"), el factor estimulante de las colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.

[0088] Las técnicas para conjugar dicho resto terapéutico con anticuerpos son bien conocidas. Véanse, por ejemplo, Arnon et al. (1985), "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987), "Antibodies for Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2ª ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623653; Thorpe (1985), "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies ’84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italia, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; y Thorpe et al. (1982), Immunol. Rev. 62: 119-158.

[0089] Alternativamente, se puede conjugar un anticuerpo con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo, como se describe en la Patente EE.UU. Nº 4.676.980. Además, se pueden usar conectores entre los marcajes y los anticuerpos de la invención (véase la Patente EE.UU. Nº 4.831.175). Los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno pueden estar directamente marcados con yodo, indio o itrio radiactivo u otra partícula radiactiva conocida en la técnica (Patente EE.UU. Nº 5.595.721). El tratamiento puede consistir en una combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no conjugados administrados simultáneamente o a continuación (WO 00/52031 y WO 00/52473).

Variantes de anticuerpos antagonistas anti-CD40

[0090] Se pueden usar variantes biológicamente activas adecuadas de los anticuerpos antagonistas anti-CD40 en los métodos de la presente invención. Dichas variantes conservarán las propiedades de unión deseadas del anticuerpo antagonista anti-CD40 parental. Los métodos para producir variantes de anticuerpos están generalmente disponibles en la técnica.

[0091] Por ejemplo, se pueden preparar variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 aquí descrito, por mutaciones en la secuencia de ADN clonado codificante del anticuerpo de interés. Los métodos para la mutagénesis y las alteraciones en la secuencia nucleotídica son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Walker y Gaastra, eds. (1983), Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985), Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et al. (1987), Methods Enzymol. 154: 367-382; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); Patente EE.UU. Nº 4.873.192; y las referencias allí citadas. Se puede encontrar una guía en cuanto a substituciones apropiadas de aminoácidos que no afectan a la actividad biológica del polipéptido de interés en el modelo de Dayhoff et al. (1978), en Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Se pueden preferir substituciones conservadoras, tales como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares. Como ejemplos de las substituciones conservadoras, se incluyen, aunque sin limitación, Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln y Phe⇔Trp⇔Tyr.

[0092] Al construir variantes del polipéptido del anticuerpo antagonista anti-CD40 de interés, se hacen modificaciones de tal forma que las variantes continúen poseyendo la actividad deseada, es decir, una afinidad de unión similar y que sean capaces de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado sobre la superficie de una célula humana, y que estén libres de actividad agonista significativa, pero que exhiban actividad antagonista cuando se unan a un antígeno CD40 sobre una célula que expresa el CD40 humano. Obviamente, cualquier mutación que se haga en el ADN codificante del polipéptido variante no debe poner la secuencia fuera del marco de lectura y preferiblemente no creará regiones complementarias que podrían producir una estructura de ARNm secundaria. Véase la Publicación de la Solicitud de Patente EP Nº 75.444.

[0093] Además, se puede mutar la región constante de un anticuerpo antagonista anti-CD40 para alterar la función efectora de una serie de formas. Por ejemplo, véanse la Patente EE.UU. Nº 6.737.056B1 y la Publicación de la Solicitud de Patente EE.UU. 2004/0132101A1, que describen mutaciones de Fc que optimizan la unión de anticuerpos a receptores de Fc.

[0094] Preferiblemente, las variantes de un anticuerpo antagonista anti-CD40 de referencia tienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 70% o 75% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 80% o 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94% o 95% de identidad de secuencia, con respecto a la secuencia de aminoácidos para la molécula del anticuerpo antagonista anti-CD40 de referencia, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 aquí descrito, o con respecto a una porción más corta de la molécula del anticuerpo de referencia. Más preferiblemente, las moléculas comparten al menos un

96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia. Para los fines de la presente invención, se determina el porcentaje de identidad de secuencia usando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman, utilizando una búsqueda de huecos afines con una penalización abierta para cada hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. Se enseña el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman en Smith y Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2: 482-489. Una variante puede, por ejemplo, diferir del anticuerpo antagonista anti-CD40 de referencia en tan sólo 1 a 15 residuos de aminoácidos, tan sólo 1 a 10 residuos de aminoácidos, tal como 6-10, tan sólo 5, o tan sólo 4, 3, 2 o incluso 1 residuo de aminoácido.

[0095] Con respecto a la alineación óptima de dos secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de aminoácidos variante puede tener residuos de aminoácidos adicionales o residuos de aminoácidos suprimidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo usado para la comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia incluirá al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, y pueden ser 30, 40, 50 o más residuos de aminoácidos. Se pueden hacer correcciones para la identidad de secuencia asociada con substituciones o huecos conservadores de residuos (véase el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman).

[0096] La estructura química precisa de un polipéptido capaz de unirse específicamente a CD40 y de conservar actividad antagonista, en particular cuando se une al antígeno CD40 sobre células B malignas, depende de una serie de factores. Dado que están presentes en la molécula grupos amino y carboxilo ionizables, se puede obtener un polipéptido particular como una sal ácida o básica o en forma neutra. Todas aquellas preparaciones que conserven su actividad biológica cuando se les ponga en condiciones ambientales adecuadas quedan incluidas en la definición de anticuerpos antagonistas anti-CD40 tal como se usa aquí. Además, se puede aumentar la secuencia primaria de aminoácidos del polipéptido por derivatización usando restos de azúcares (glicosilación) o mediante otras moléculas adicionales, tales como lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. También se puede aumentar por conjugación con sacáridos. Se consiguen ciertos aspectos de dicho aumento a través de sistemas de procesamiento posterior a la traducción del huésped productor; se pueden introducir otras modificaciones de este tipo in vitro. En cualquier caso, dichas modificaciones quedan incluidas en la definición de un anticuerpo anti-CD40 aquí utilizado, en la medida en que no se destruyan las propiedades antagonistas del anticuerpo anti-CD40. Se espera que dichas modificaciones puedan afectar cuantitativa o cualitativamente a la actividad, ya sea aumentando o disminuyendo la actividad del polipéptido, en los diversos ensayos. Además, se pueden modificar residuos de aminoácidos individuales en la cadena por oxidación, reducción u otra derivatización, y se puede escindir el polipéptido para obtener fragmentos que conserven la actividad. Aquellas alteraciones que no destruyan la actividad antagonista no apartan a la secuencia polipeptídica de la definición de anticuerpos anti-CD40 de interés como aquí se utiliza.

[0097] La técnica proporciona una orientación substancial en cuanto a la preparación y el uso de variantes polipeptídicas. Al preparar las variantes del anticuerpo anti-CD40, un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué modificaciones de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la proteína nativa darán como resultado una variante adecuada para uso como componente terapéuticamente activo de una composición farmacéutica utilizada en los métodos aquí descritos.

Métodos de terapia utilizando los anticuerpos antagonistas anti-CD40

[0098] Los métodos aquí descritos se dirigen al uso de anticuerpos antagonistas anti-CD40 para tratar a pacientes que tienen una enfermedad mediada por la estimulación de la señalización de CD40 en células que expresan CD40. Por "célula que expresa CD40", se entienden células B normales y malignas que expresan el antígeno CD40. Los métodos para detectar la expresión de CD40 en células son bien conocidos en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, técnicas de PCR, inmunohistoquímica, citometría de flujo, Western blot, ELISA y similares. Por célula B "maligna", se entiende cualquier célula B neoplásica, incluyendo, aunque sin limitación, células B derivadas de linfomas, incluyendo linfomas de células B de grado bajo, intermedio y alto, linfomas inmunoblásticos, linfomas no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, linfomas inducidos por el Virus Epstein-Barr (EBV) y linfomas relacionados con el SIDA, así como leucemias linfoblásticas agudas de células B, mielomas, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias mieloblásticas agudas y similares.

[0099] Se define aquí "tratamiento" como la aplicación o administración de un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo a un paciente, o la aplicación o administración de un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento del mismo a un tejido o línea celular aislada de un paciente, donde el paciente tiene una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición a una enfermedad, donde el objetivo es curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar a la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad. Por "tratamiento", también se entiende la aplicación o administración de una composición farmacéutica que contiene los anticuerpos antagonistas anti-CD40 o sus fragmentos a un paciente, o la aplicación o administración de una composición farmacéutica que contiene los anticuerpos anti-CD40 o sus fragmentos a un tejido o línea celular aislada de un paciente que tiene una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición a una enfermedad, donde el objetivo es curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar a la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad.

[0100] Por "actividad antitumoral", se entiende una reducción en el ritmo de proliferación o acumulación de células malignas que expresan CD40, y por ello una disminución en el ritmo de crecimiento de un tumor existente o en un tumor que surge durante la terapia, y/o la destrucción de células neoplásicas (tumorales) existentes o de células neoplásicas de nueva formación, y por ello una reducción en el tamaño global de un tumor durante la terapia. La terapia con al menos un anticuerpo anti-CD40 (o fragmento de unión a antígeno del mismo) causa una respuesta fisiológica que es beneficiosa con respecto al tratamiento de estados morbosos asociados a la estimulación de la señalización de CD40 en células que expresan CD40 en un humano.

[0101] Los métodos aquí expuestos encuentran una utilización en el tratamiento de linfomas no Hodgkin relacionados con la proliferación o acumulación anormal e incontrolable de células B. Para los fines de la presente exposición, se hará referencia a tales linfomas según el esquema de clasificación de Working Formulation, donde dichos linfomas de células B se clasifican como de grado bajo, de grado intermedio y de grado alto (véase "The NonHodgkin’s Lymphoma Pathologic Classification Project", Cancer 49 (1982): 2112-2135). Así, los linfomas de células B de grado bajo incluyen los linfomas linfocítico pequeño, folicular de células pequeñas segmentadas y folicular mixto de células pequeñas segmentadas y de células grandes; los linfomas de grado intermedio incluyen los linfomas folicular de células grandes, difuso de células pequeñas segmentadas, difuso mixto de células pequeñas y de células grandes y difuso de células grandes; y los linfomas de grado alto incluyen los linfomas inmunoblástico de células grandes, linfoblástico y de células pequeñas no segmentadas del tipo Burkitt y no Burkitt.

[0102] Se reconoce que los métodos aquí expuestos son útiles en el tratamiento terapéutico de linfomas de células B clasificados según el sistema de la Revised European and American Lymphoma Classification (REAL). Dichos linfomas de células B incluyen, aunque sin limitación, linfomas clasificados como neoplasias de células B precursoras, tales como la leucemia/el linfoma linfoblástico(a) B; neoplasias de células B periféricas, incluyendo la leucemia linfocítica/el linfoma linfocítico pequeño crónica(o) de células B, el linfoma linfoplasmacitoide/inmunocitoma, el linfoma de células de manto (LCM), el linfoma del centro folicular (folicular) (incluyendo los linfomas difuso de células pequeñas, difuso mixto de células pequeñas y grandes y difuso de células grandes), el linfoma de células B de la zona marginal (incluyendo los tipos extranodal, nodal y esplénico), la leucemia de células vellosas, el plasmacitoma/mieloma, el linfoma difuso de células B de células grandes del subtipo primariamente mediastínico (tímico), el linfoma de Burkitt y el linfoma de células B de grado alto de tipo Burkitt; leucemias agudas; leucemias linfocíticas agudas; leucemias mieloblásticas; leucemias mielocíticas agudas; leucemia promielocítica; leucemia mielomonocítica; leucemia monocítica; eritroleucemia; leucemia granulocítica (leucemia mielocítica crónica); leucemia linfocítica crónica; policitemia vera; mieloma múltiple; macroglobulinemia de Waldenstrom; enfermedad de las cadenas pesadas; y linfomas de células B de grado bajo o de grado alto inclasificables.

[0103] Se reconoce que los métodos aquí expuestos pueden ser útiles en la prevención de otras proliferaciones tumorales que puedan surgir durante la terapia. Los métodos aquí expuestos son de particular utilidad en el tratamiento de sujetos que tienen linfomas de células B de grado bajo, en particular de aquellos sujetos que sufren recaídas después de una quimioterapia estándar. Los linfomas de células B de grado bajo son más indolentes que los linfomas de células B de grado intermedio y de grado alto y se caracterizan por un curso de recidiva/remisión. Por lo tanto, el tratamiento de estos linfomas mejora utilizando los métodos aquí expuestos, ya que se reducen los episodios de recidivas en cuanto a número y a gravedad.

[0104] Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 aquí descritos pueden también encontrar una utilización en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y de deficiencias o trastornos del sistema inmune, incluyendo, aunque sin limitación, el lupus eritematoso sistémico, la psoriasis, la escleroderma, el síndrome de CREST, la miositis inflamatoria, el síndrome de Sjogren, la enfermedad mixta del tejido conjuntivo, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la enfermedad inflamatoria del intestino, el síndrome del distrés respiratorio agudo, la inflamación pulmonar, la fibrosis pulmonar idiopática, la osteoporosis, la hipersensibilidad de tipo retardado, el asma, la cirrosis biliar primaria y la púrpura trombocitopénica idiopática.

[0105] Según los métodos aquí expuestos, se usa al menos un anticuerpo antagonista anti-CD40 (o fragmento de unión a antígeno del mismo) como se define aquí en algún otro lugar para promover una respuesta terapéutica positiva con respecto a una célula B humana maligna. Por "respuesta terapéutica positiva" con respecto al tratamiento del cáncer, se entiende una mejoría en la enfermedad en asociación con la actividad antitumoral de estos anticuerpos o de sus fragmentos, y/o una mejoría en los síntomas asociados a la enfermedad. Es decir, que se pueden observar un efecto antiproliferativo, la prevención de otras proliferaciones tumorales, una reducción en el tamaño del tumor, una reducción en el número de células cancerosas y/o una reducción en uno o más síntomas mediados por la estimulación de las células que expresan CD40. Así, por ejemplo, una mejoría en la enfermedad se puede caracterizar como una respuesta completa. Por "respuesta completa", se entiende una ausencia de enfermedad clínicamente detectable con normalización de cualquier estudio radiográfico, médula ósea y líquido cefalorraquídeo (CSF) previamente anormales. Dicha respuesta debe persistir durante al menos un mes después del tratamiento según los métodos aquí expuestos. Alternativamente, se puede clasificar una mejoría en la enfermedad como una respuesta parcial. Por "respuesta parcial", se entiende una reducción de al menos aproximadamente un 50% en toda la carga tumoral mensurable (es decir, el número de células tumorales presentes en el sujeto) en ausencia de nuevas lesiones y que persiste durante al menos un mes. Dicha respuesta es aplicable sólo a tumores mensurables.

[0106] Se puede valorar la respuesta tumoral en cuanto a cambios en la morfología del tumor (es decir, carga tumoral global, tamaño del tumor y similares) usando técnicas de rastreo, tales como la imagen por resonancia magnética (IRM), la imagen radiográfica x, la tomografía computerizada (TC), la imagen bioluminescente, por ejemplo la imagen por luciferasa, la gammagrafía ósea y las muestras para biopsia de tumores, incluyendo la aspiración de médula ósea (AMO). Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto que pasa por terapia con el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede experimentar el efecto beneficioso de una mejoría en los síntomas asociados a la enfermedad. De este modo, para tumores de células B, el sujeto puede experimentar una reducción en los así llamados síntomas B, es decir, sudores nocturnos, fiebre, pérdida de peso y/o urticaria.

[0107] Por "dosis o cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva", se entiende una cantidad de anticuerpo antagonista anti-CD40 o de fragmento de unión a antígeno del mismo que, cuando se administra, produce una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente con una enfermedad que comprende la estimulación de células que expresan CD40. En algunas realizaciones de la invención, una dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-CD40 o su fragmento es de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg o de aproximadamente 7 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el método de tratamiento puede consistir en una sola administración de una dosis terapéuticamente efectiva o en múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40 o del fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0108] Otra realización de la exposición consiste en el uso de anticuerpos antagonistas anti-CD40 para la monitorización diagnóstica de los niveles de proteína en un tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, v.g., para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Se puede facilitar la detección copulando el anticuerpo a una substancia detectable. Como ejemplos de substancias detectables, se incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Como ejemplos de enzimas adecuadas, se incluyen la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la β-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; como ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados, se incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; como ejemplos de materiales fluorescentes adecuados, se incluyen la umbeliferona, la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la diclorotriazinilaminofluoresceína, el cloruro de dansilo o la ficoeritrina; como ejemplo de un material luminescente, se incluye el luminol; como ejemplos de materiales bioluminescentes, se incluyen la luciferasa, la luciferina y la aequorina; y como ejemplos de material radiactivo adecuado, se incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.

[0109] Los anticuerpos anti-CD40 aquí descritos pueden ser además utilizados para obtener reactivos, v.g., anticuerpos marcados, que pueden ser usados, por ejemplo, para identificar células que expresan CD40. Esto puede ser muy útil en la determinación del tipo celular de una muestra desconocida. Se pueden usar paneles de anticuerpos monoclonales para identificar tejido por especie y/o por tipo de órgano. De un modo similar, se pueden usar estos anticuerpos anti-CD40 para rastrear células de cultivos de tejidos en cuanto a contaminación (es decir, para rastrear en cuanto a la presencia de una mezcla de células que expresan CD40 y de células que no expresan CD40 en un cultivo).

[0110] Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 pueden ser usados en combinación con agentes quimioterapéuticos y citoquinas conocidos para el tratamiento de estados morbosos en los que intervienen células que expresan CD40 estimuladas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD40 de la invención pueden ser utilizados en combinación con citoquinas, tales como la interleuquina-2. En otra realización, los anticuerpos anti-CD40 de la invención pueden ser usados en combinación con rituximab (IDEC-C2B8; Rituxán®; IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California).

[0111] De este modo, los anticuerpos antagonistas anti-CD40 aquí descritos, o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, son administrados en combinación con al menos otra terapia contra el cáncer, incluyendo, aunque sin limitación, cirugía o procedimientos quirúrgicos (v.g., esplenectomía, hepatectomía, linfadenectomía, leucoforesis, trasplante de médula ósea y similares); terapia de radiación; quimioterapia, eventualmente en combinación con trasplante autólogo de médula ósea, donde, como agentes quimioterapéuticos adecuados, se incluyen, aunque sin limitación, fludarabina o fosfato de fludarabina, clorambucilo, vincristina, pentostatina, 2clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorrubicina, prednisona y sus combinaciones, por ejemplo regímenes que contienen antraciclina, tales como CAP (ciclofosfamida y doxorrubicina más prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona más doxorrubicina), VAD (vincristina y doxorrubicina más dexametasona) y MP (melfalán más prednisona), y otros agentes citotóxicos y/o terapéuticos usados en quimioterapia, tales como mitoxantrona, daunorrubicina, idarrubicina, asparraginasa y antimetabolitos, incluyendo, aunque sin limitación, citarabina, metotrexato, 5-fluorouracildacarbazina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina y nelarabina; terapia con otros anticuerpos monoclonales anticancerosos (por ejemplo, alemtuzumab (Campath®) u otro anticuerpo anti-CD52 que se dirige a la glicoproteína de la superficie celular CD52 sobre células B malignas; rituximab (Rituxán®), el anticuerpo

totalmente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuxetán (Zevalin®) o cualquier otro anticuerpo anti-CD20 terapéutico que se dirija al antígeno CD20 sobre células B malignas; anticuerpo anti-CD19 (por ejemplo, MT103, un anticuerpo biespecífico); anticuerpo anti-CD22 (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) u otro anticuerpo anticanceroso que se dirija al factor de crecimiento endotelial vascular humano; anticuerpo anti-CD22, que se dirige al antígeno CD22 sobre células B malignas (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal BL-22, una toxina alfaCD22); anticuerpo α-M-CSF, que se dirige al factor estimulante de las colonias de macrófagos; anticuerpos que se dirigen al activador del receptor de kappaB del factor nuclear (RANK) y su ligando (RANKIL), que se sobreexpresan en el mieloma múltiple; anticuerpo anti-CD23, que se dirige al antígeno CD23 sobre células B malignas (por ejemplo, IDEC-152); anticuerpo anti-CD80, que se dirige al antígeno CD80 (por ejemplo, IDEC-114); anticuerpo anti-CD38, que se dirige al antígeno CD38 sobre células B malignas; anticuerpos que se dirigen a los receptores del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (anticuerpos anti-MHC) expresados sobre células B malignas; otros anticuerpos anti-CD40 (por ejemplo, SGN-40) que se dirigen al antígeno CD40 sobre células B malignas; y anticuerpos que se dirigen al receptor 1 del ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL-R1) (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humano agonista HGS-ETR1) y al TRAIL-R2 expresados sobre una serie de tumores sólidos y de tumores de origen hematopoyético); terapia del cáncer basada en moléculas pequeñas, incluyendo, aunque sin limitación, inhibidores de los microtúbulos y/o de la topoisomerasa (por ejemplo, el inhibidor mitótico dolastatina y análogos de la dolastatina; el agente de unión a tubulina T900607; XL119; y el inhibidor de la topoisomerasa aminocamptotecina), SDX-105 (clorhidrato de bendamustina), ixabepilona (un análogo de epotilona, al que también se hace referencia como BMS-247550), inhibidores de la proteína kinasa C, por ejemplo midoestaurina ((PKC-412, CGP 41251, N-benzoilestauroesporina), pixantrona, eloxatina (un agente antineoplásico), ganita (nitrato de galio), Thalomid® (talidomida), derivados inmunomoduladores de la talidomida (por ejemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak™ (inhibidor antisentido de la proteína kinasa C-alfa), SDX-101 (R-etodolac, que induce la apoptosis de los linfocitos malignos), análogos de nucleósidos de purina de segunda generación, tales como clofarabina, inhibidores de la producción de la proteína Bcl-2 por las células cancerosas (por ejemplo, los agentes antisentido oblimersen y Genasense®), inhibidores de proteasomas (por ejemplo, Velcade™ (bortezomib)), inhibidores de kinasas de molécula pequeña (por ejemplo, CHIR-258), inhibidores de VEGF de molécula pequeña (por ejemplo, ZD-6474), inhibidores de molécula pequeña de la proteína del choque térmico (HSP) 90 (por ejemplo, 17-AAG), inhibidores de molécula pequeña de histona desacetilasas (por ejemplo, agentes de citodiferenciación híbrida/polar CHP, tales como el ácido suberanilohidroxámico (SAHA) y FR-901228) y agentes apoptóticos, tales como Trisenox® (trióxido arsénico) y Xcytrin® (motexafín gadolinio); terapias contra el cáncer basadas en vacunas/inmunoterapia, incluyendo, aunque sin limitación, enfoques vacunales (por ejemplo, Id-KLH, oncofago, vitaletina), inmunoterapia personalizada o inmunoterapia con idiotipos activos (por ejemplo, MyVax® Personalized Immunotherapy, anteriormente designada como GTOP-99), Promune® (CpG 7909, un agonista sintético para el receptor de tipo Toll 9 (TLR9)), terapia con interferón-alfa, terapia con interleuquina-2 (IL-2), terapia con IL-12, terapia con IL-15 y terapia con IL-21; terapia con esteroides; u otra terapia contra el cáncer; donde la terapia adicional contra el cáncer es administrada antes, durante o después de la terapia con el anticuerpo antagonista anti-CD40. Así, cuando las terapias combinadas consisten en la administración de un anticuerpo antagonista anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo en combinación con la administración de otro agente terapéutico, como quimioterapia, terapia de radiación, terapia con otros anticuerpos anticancerosos, terapia del cáncer basada en moléculas pequeñas o terapia del cáncer basada en vacunas/inmunoterapia, los métodos aquí expuestos incluyen la coadministración, usando formulaciones independientes o una sola formulación farmacéutica,

o la administración consecutiva en cualquier orden. Cuando los métodos aquí expuestos comprenden regímenes terapéuticos combinados, estas terapias pueden ser administradas simultáneamente, es decir, que el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo es administrado simultáneamente o dentro del mismo marco temporal que la otra terapia contra el cáncer (es decir, que las terapias se desarrollan simultáneamente, pero el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo no es administrado precisamente en el mismo momento que la otra terapia contra el cáncer). Alternativamente, también se puede administrar el anticuerpo antagonista anti-CD40 de la presente invención o el fragmento de unión a antígeno del mismo antes o después de la otra terapia contra el cáncer. Se puede realizar la administración secuencial de las diferentes terapias contra el cáncer independientemente de si el sujeto tratado responde al primer curso de terapia para disminuir la posibilidad de remisión o recidiva. Cuando las terapias combinadas incluyen la administración del anticuerpo antagonista anti-CD40 o del fragmento de unión a antígeno del mismo en combinación con la administración de un agente citotóxico, preferiblemente se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo antes de la administración del agente citotóxico.

[0112] En algunas realizaciones de la invención, los anticuerpos antagonistas anti-CD40 aquí descritos, o los fragmentos de unión a antígeno del mismo, son administrados en combinación con quimioterapia, y eventualmente en combinación con trasplante autólogo de médula ósea, donde el anticuerpo y el/los agente(s) quimioterapéutico(s) pueden ser administrados secuencialmente, en cualquier orden, o simultáneamente (es decir, al mismo tiempo o en el mismo marco temporal). Como ejemplos de agentes quimioterapéuticos adecuados, se incluyen, aunque sin limitación, fludarabina o fosfato de fludarabina, clorambucilo, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorrubicina, prednisona y sus combinaciones, por ejemplo, regímenes que contienen antraciclina, tales como CAP (ciclofosfamida y doxorrubicina más prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona más doxorrubicina), VAD (vincristina y doxorrubicina más dexametasona) y MP (melfalán más prednisona), y otros agentes citotóxicos y/o terapéuticos usados en quimioterapia, tales como mitoxantrona,

daunorrubicina, idarrubicina, asparraginasa y antimetabolitos, incluyendo, aunque sin limitación, citarabina, metotrexato, 5-fluorouracildacarbazina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina y nelarabina. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, es administrado antes del tratamiento con el agente quimioterapéutico. En realizaciones alternativas, el anticuerpo antagonista anti-CD40 es administrado tras el tratamiento con el agente quimioterapéutico. En aún otras realizaciones, el agente quimioterapéutico es administrado simultáneamente al anticuerpo antagonista anti-CD40 o al fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0113] Así, por ejemplo, en algunas realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, en combinación con fludarabina o fosfato de fludarabina. En una de tales realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo antes de la administración de fludarabina o fosfato de fludarabina. En realizaciones alternativas, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo tras el tratamiento con fludarabina o fosfato de fludarabina. En aún otras realizaciones, se administra la fludarabina o el fosfato de fludarabina simultáneamente al anticuerpo antagonista anti-CD40 o al fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0114] En otras realizaciones de la invención, se administra clorambucilo, un agente alquilante, en combinación con un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una de tales realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo antes de la administración de clorambucilo. En realizaciones alternativas, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo tras el tratamiento con clorambucilo. En aún otras realizaciones, se administra el clorambucilo simultáneamente al anticuerpo antagonista anti-CD40 o al fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0115] En aún otras realizaciones, se pueden combinar regímenes que contienen antraciclinas, tales como CAP (ciclofosfamida y doxorrubicina más prednisona) y CHOP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona más doxorrubicina), con la administración de un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una de tales realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo antes de la administración de regímenes que contienen antraciclinas. En otras realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo después del tratamiento con regímenes que contienen antraciclinas. En aún otras realizaciones, se administra el régimen que contiene antraciclinas simultáneamente al anticuerpo antagonista anti-CD40 o al fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0116] En realizaciones alternativas, se administra un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en combinación con alemtuzumab (Campath®; distribuido por Berlex Laboratories, Richmond, California). Alemtuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante (Campath-1H) que se dirige al antígeno CD52 expresado sobre células B malignas. En una de tales realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo antes de la administración de alemtuzumab. En otras realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo después del tratamiento con alemtuzumab. En aún otras realizaciones, se administra el alemtuzumab simultáneamente al anticuerpo antagonista anti-CD40 o al fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0117] En realizaciones alternativas, se administra un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en combinación con un anticuerpo anti-CD20 terapéutico que se dirige al antígeno CD20 sobre células B malignas, por ejemplo rituximab (Rituxán®), el anticuerpo totalmente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I131 tositumomab (Bexxar®) o ibritumomab tiuxetán (Zevalin®). En una de tales realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo antes de la administración del anticuerpo anti-CD20. En otras realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo después del tratamiento con el anticuerpo anti-CD20. En aún otras realizaciones, se administra el anticuerpo anti-CD20 simultáneamente al anticuerpo antagonista anti-CD40 o al fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0118] En realizaciones alternativas, se administra un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en combinación con una terapia contra el cáncer basada en moléculas pequeñas, incluyendo, aunque sin limitación, inhibidores de los microtúbulos y/o de la topoisomerasa (por ejemplo, el inhibidor mitótico dolastatina y análogos de la dolastatina, el agente de unión a tubulina T900607, XL119 y el inhibidor de la topoisomerasa aminocamptotecina), SDX-105 (clorhidrato de bendamustina), ixabepilona (un análogo de epotilona, al que también se hace referencia como BMS247550), inhibidores de la proteína kinasa C, por ejemplo midoestaurina ((PKC-412, CGP 41251, Nbenzoilestauroesporina), pixantrona, eloxatina (un agente antineoplásico), ganita (nitrato de galio), Thalomid® (talidomida), derivados inmunomoduladores de la talidomida (por ejemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak™ (inhibidor antisentido de la proteína kinasa C-alfa), SDX-101 (R-etodolac, que induce la apoptosis de los

linfocitos malignos), análogos de nucleósidos de purina de segunda generación, tales como la clofarabina, inhibidores de la producción de la proteína Bcl-2 por las células cancerosas (por ejemplo, los agentes antisentido oblimersen y Genasense®), inhibidores de proteasomas (por ejemplo, Velcade™ (bortezomib)), inhibidores de kinasas de molécula pequeña (por ejemplo, CHIR-258), inhibidores de VEGF de molécula pequeña (por ejemplo, ZD-6474), inhibidores de molécula pequeña de la proteína del choque térmico (HSP) 90 (por ejemplo, 17-AAG), inhibidores de molécula pequeña de las histona desacetilasas (por ejemplo, agentes de citodiferenciación híbrida/polar CHP, tales como el ácido suberanilohidroxámico (SAHA), y FR- 901228) y agentes apoptóticos, tales como Trisenox® (trióxido arsénico) y Xcytrin® (motexafín gadolinio). En una de tales realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo antes de la administración de la terapia contra el cáncer basada en moléculas pequeñas. En otras realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo después del tratamiento con la terapia contra el cáncer basa en moléculas pequeñas. En aún otras realizaciones, se administra la terapia contra el cáncer basada en moléculas pequeñas simultáneamente al anticuerpo antagonista anti-CD40 o al fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0119] En aún otras realizaciones, se puede usar un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en combinación con una terapia contra el cáncer basada en vacunas/inmunoterapia, incluyendo, aunque sin limitación, enfoques vacunales (por ejemplo, Id-KLH, oncofago, vitaletina), inmunoterapia personalizada o inmunoterapia con idiotipos activos (por ejemplo, MyVax® Personalized Immunotherapy, anteriormente designada como GTOP-99), Promune® (CpG 7909, un agonista sintético para el receptor de tipo Toll 9 (TLR9)), terapia con interferón-alfa, terapia con interleuquina-2 (IL-2), terapia con IL-12, terapia con IL-15 o terapia con IL-21; o terapia con esteroides. En una de tales realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo antes de la administración de la terapia contra el cáncer basada en vacunas/inmunoterapia. En otras realizaciones, se administra el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo después del tratamiento con la terapia contra el cáncer basada en vacunas/inmunoterapia. En aún otras realizaciones, se administra la terapia contra el cáncer basada en vacunas/inmunoterapia simultáneamente al anticuerpo antagonista anti-CD40 o al fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0120] En una de tales realizaciones, se puede usar un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en combinación con IL-2. La IL-2, un agente que se sabe expande el número de células efectoras "natural killer" (NK) en pacientes tratados, puede ser administrada antes de, o simultáneamente a, el anticuerpo antagonista anti-CD40 de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo. Este número expandido de células efectoras NK puede dar lugar a una mayor actividad CCDA del anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo administrado. En otras realizaciones, la IL-21 sirve como agente inmunoterapéutico para estimular la actividad de las células NK cuando se administra en combinación con un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0121] Además, también se puede usar una terapia de combinación con dos o más agentes terapéuticos y un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito para el tratamiento de estados morbosos en los que intervienen células que expresan CD40 estimuladas, por ejemplo cánceres relacionados con las células B, y trastornos autoinmunes y/o inflamatorios. Sin ser limitantes, como ejemplos se incluyen una terapia de triple combinación, en donde se administran dos agentes quimioterapéuticos en combinación con un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito, y en donde se administran un agente quimioterapéutico y otro anticuerpo monoclonal anticanceroso (por ejemplo, alemtuzumab, rituximab o anticuerpo anti-CD23) en combinación con un anticuerpo antagonista anti-CD40 aquí descrito. Como ejemplos de tales combinaciones, se incluyen, aunque sin limitación, combinaciones de fludarabina, ciclofosfamida y el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12

o CHIR-5.9 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y combinaciones de fludarabina, un anticuerpo anti-CD20, por ejemplo rituximab (Rituxán®; IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California), y el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Formulaciones farmacéuticas y modos de administración

[0122] Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 de esta invención son administrados a una concentración que resulta terapéuticamente efectiva para prevenir o tratar enfermedades mediadas por células que expresan CD40, tales como el LES, la CBP, la PTI, la esclerosis múltiple, la psoriasis, la enfermedad de Crohn, el rechazo de injertos y el linfoma de células B. Para alcanzar este objetivo, se pueden formular los anticuerpos usando una variedad de excipientes aceptables conocidos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos son administrados por inyección, ya sea intravenosa o intraperitonealmente. Los métodos para llevar a cabo esta administración son conocidos para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica. Puede también ser posible obtener composiciones para administración tópica u oral o que puedan ser capaces de transmitirse a través de las membranas mucosas.

[0123] La administración intravenosa es preferiblemente realizada por infusión a lo largo de un período de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas, más preferiblemente a lo largo de aproximadamente 1 a

aproximadamente 8 horas, incluso más preferiblemente a lo largo de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 horas, aún más preferiblemente a lo largo de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 horas, dependiendo del anticuerpo anti-CD40 que se esté administrando. Se puede administrar la infusión inicial con la composición farmacéutica a lo largo de un período de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 horas, administrando las infusiones posteriores más rápidamente. Se pueden administrar las infusiones posteriores a lo largo de un período de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas, incluyendo, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 horas o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas.

[0124] Se formula una composición farmacéutica de la invención de tal forma que sea compatible con su vía pretendida de administración. Como ejemplos de posibles vías de administración, se incluyen la administración parenteral (v.g., intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutánea (SC) o por infusión), oral y pulmonar (v.g., inhalación), nasal, transdérmica (tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabenes; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. Se puede ajustar el pH con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Se puede encerrar la preparación parenteral en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis de vidrio o de plástico.

[0125] Los anticuerpos anti-CD40 son típicamente proporcionados por una técnica estándar en un tampón farmacéuticamente aceptable, por ejemplo solución salina estéril, agua tamponada estéril, propilenglicol, combinaciones de los anteriores, etc. Se describen métodos para preparar agentes administrables por vía parenteral en Remington’s Pharmaceutical Sciences (18ª ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). Véase también, por ejemplo, WO 98/56418, que describe formulaciones farmacéuticas de anticuerpos estabilizadas adecuadas para su uso en los métodos aquí descritos.

[0126] La cantidad de al menos un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo que se ha de administrar es fácilmente determinada por alguien con conocimientos ordinarios en la técnica sin una excesiva experimentación. Como factores que influyen en el modo de administración y en la cantidad respectiva de al menos un anticuerpo antagonista anti-CD40 (o fragmento del mismo), se incluyen, aunque sin limitación, la gravedad de la enfermedad, la historia de la enfermedad y la edad, la altura, el peso, la salud y la condición física del individuo sometido a terapia. De forma similar, la cantidad de anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento del mismo que se ha de administrar dependerá del modo de administración y de si el sujeto recibirá una sola dosis o múltiples dosis de este agente antitumoral. En general, se prefiere una dosificación superior de anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo al aumentar el peso del sujeto sometido a terapia. La dosis de anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo que se ha de administrar es de aproximadamente 0,003 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, preferiblemente de 0,01 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg. Así, por ejemplo, la dosis puede ser de 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg o 50 mg/kg.

[0127] En otra realización de la exposición, el método consiste en la administración de múltiples dosis de anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento del mismo. El método puede consistir en la administración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más dosis terapéuticamente efectivas de una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento del mismo. La frecuencia y la duración de la administración de múltiples dosis de las composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpo anti-CD40 o un fragmento del mismo pueden ser fácilmente determinadas por un experto en la técnica sin una excesiva experimentación. Más aún, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo puede incluir un único tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, se trata a un sujeto con anticuerpo antagonista anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo en un rango de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal una vez por semana durante entre aproximadamente 1 y 10 semanas, preferiblemente entre aproximadamente 2 y 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 3 y 7 semanas e incluso más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 ó 6 semanas. El tratamiento puede tener lugar anualmente para prevenir la recidiva o cuando hay indicación de recidiva. También se apreciará que la dosificación efectiva de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo usada para el tratamiento puede aumentar o disminuir en el curso de un tratamiento particular. Se pueden producir cambios en la dosificación, y hacerse evidentes, por los resultados de los ensayos diagnósticos aquí descritos.

[0128] Así, en una realización, el régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente efectiva de al menos un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo los días 1, 7, 14 y 21 de un período de tratamiento. En otra realización, el régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente efectiva de al menos un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo los días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de una semana en un período de tratamiento. Otras realizaciones incluyen un régimen de dosificación que tiene una primera administración de una dosis terapéuticamente efectiva de al menos un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo los días 1, 3, 5 y 7 de una semana en un período de tratamiento; un régimen de dosificación

que incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente efectiva de al menos un anticuerpo anti-CD40

o fragmento del mismo los días 1 y 3 de una semana en un período de tratamiento; y un régimen de dosificación preferido que incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente efectiva de al menos un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo el día 1 de una semana en un período de tratamiento. El período de tratamiento puede consistir en 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. Los períodos de tratamiento pueden ser sucesivos o ir separados unos de otros en un día, una semana, 2 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año.

[0129] En algunas realizaciones, las dosis terapéuticamente efectivas de anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo varía de aproximadamente 0,003 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg o de aproximadamente 7 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg. Así, por ejemplo, la dosis de cualquier anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo el anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 o CHIR-5.9 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg o cualquier dosis de este tipo que quede dentro del rango de aproximadamente 0,003 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Se puede administrar la misma dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo a lo largo de cada semana de dosificación del anticuerpo. Alternativamente, se pueden usar diferentes dosis terapéuticamente efectivas de un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo a lo largo del curso de un período de tratamiento.

[0130] En otras realizaciones, la dosis terapéuticamente efectiva inicial de un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo según se define aquí en algún otro lugar puede encontrarse en el rango de dosificación inferior (es decir, de aproximadamente 0,003 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg), encontrándose las dosis siguientes dentro del rango de dosificación superior (es decir, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg).

[0131] En realizaciones alternativas, la dosis terapéuticamente efectiva inicial de un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define aquí en algún otro lugar puede encontrarse en el rango de dosificación superior (es decir, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg), encontrándose las dosis siguientes dentro del rango de dosificación inferior (es decir, de 0,003 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg). Así, en una realización, la dosis terapéuticamente efectiva inicial del anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo es de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, incluyendo aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg, y las dosis terapéuticamente efectivas siguientes del anticuerpo antagonista anti-CD40 o del fragmento de unión a antígeno del mismo son de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo aproximadamente 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg.

[0132] En algunas realizaciones de la invención, se inicia la terapia con el anticuerpo antagonista anti-CD40 administrando una "dosis de carga" del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto que necesite terapia con el anticuerpo antagonista anti-CD40. Por "dosis de carga", se entiende una dosis inicial del anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se administra al sujeto, donde la dosis del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo administrada entra dentro del rango de dosificación superior (es decir, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg). La "dosis de carga" puede ser administrada como una sola administración, por ejemplo una sola infusión, donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es administrado IV, o como múltiples administraciones, por ejemplo múltiples infusiones, donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es administrado IV, siempre que la "dosis de carga" completa se administre dentro de aproximadamente un período de 24 horas. Tras la administración de la "dosis de carga", se administran luego al sujeto una o más dosis terapéuticamente efectivas adicionales del anticuerpo antagonista anti-CD40 o del fragmento de unión a antígeno del mismo. Las dosis terapéuticamente efectivas siguientes pueden ser administradas, por ejemplo, según un esquema de dosificación semanal, o una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas. En dichas realizaciones, las dosis terapéuticamente efectivas siguientes quedan generalmente dentro del rango de dosificación inferior (es decir, de 0,003 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg).

[0133] Alternativamente, en algunas realizaciones, después de la "dosis de carga" las dosis terapéuticamente efectivas siguientes del anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo son administradas según un "esquema de mantenimiento", donde la dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es administrada una vez al mes, una vez cada 6 semanas, una vez cada dos meses, una vez cada 10 semanas, una vez cada tres meses, una vez cada 14 semanas, una vez cada cuatro meses, una vez cada 18 semanas, una vez cada cinco meses, una vez cada 22 semanas, una vez cada seis meses,

una vez cada 7 meses, una vez cada 8 meses, una vez cada 9 meses, una vez cada 10 meses, una vez cada 11 meses o una vez cada 12 meses. En tales realizaciones, las dosis terapéuticamente efectivas del anticuerpo antagonista anti-CD40 o del fragmento de unión a antígeno del mismo quedan dentro del rango de dosificación inferior (es decir, de 0,003 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg), en particular cuando las dosis siguientes son administradas a intervalos más frecuentes, por ejemplo, de una vez cada dos semanas a una vez cada mes, o dentro del rango de dosificación superior (es decir, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg), en particular cuando las dosis siguientes son administradas a intervalos menos frecuentes, por ejemplo, cuando las dosis siguientes son administradas con una separación de aproximadamente un mes a aproximadamente 12 meses.

[0134] Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 presentes en las composiciones farmacéuticas aquí descritas para uso en los métodos aquí expuestos pueden ser nativos o pueden ser obtenidos por técnicas recombinantes, y pueden proceder de cualquier fuente, incluyendo fuentes de mamíferos, tales como, v.g., ratón, rata, conejo, primate, cerdo y humano. Preferiblemente, dichos polipéptidos derivan de una fuente humana, y más preferiblemente son proteínas humanas recombinantes procedentes de líneas celulares de hibridomas.

[0135] Las composiciones farmacéuticas útiles en los métodos aquí expuestos pueden incluir variantes biológicamente activas de los anticuerpos antagonistas anti-CD40 de la invención. Dichas variantes deben conservar la actividad biológica deseada del polipéptido nativo, de tal forma que la composición farmacéutica que incluye el polipéptido variante tenga el mismo efecto terapéutico que la composición farmacéutica que incluye el polipéptido nativo cuando se administre a un sujeto. Es decir, el anticuerpo anti-CD40 variante servirá como componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica de un modo similar al observado para el anticuerpo antagonista nativo, por ejemplo CHIR-5.9 o CHIR-12.12 expresado por la línea celular de hibridoma 5.9 ó 12.12, respectivamente. Se dispone de métodos en la técnica para determinar si un anticuerpo anti-CD40 variante conserva la actividad biológica deseada y por ello sirve como componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica. Se puede medir la actividad biológica de variantes de anticuerpos usando ensayos específicamente diseñados para medir la actividad del anticuerpo antagonista nativo, incluyendo los ensayos aquí descritos.

[0136] Se puede usar cualquier composición farmacéutica que contenga un anticuerpo antagonista anti-CD40 con las propiedades de unión aquí descritas como componente terapéuticamente activo en los métodos aquí expuestos. Por lo tanto, se pueden preparar composiciones líquidas, liofilizadas o deshidratadas por aspersión que contengan uno o más de los anticuerpos antagonistas anti-CD40 de la invención como solución o suspensión acuosa o no acuosa para posterior administración a un sujeto según los métodos aquí expuestos. Cada una de estas composiciones incluirá al menos uno de los anticuerpos antagonistas anti-CD40 de la presente invención como componente terapéutica o profilácticamente activo. Por "componente terapéutica o profilácticamente activo", se entiende que el anticuerpo anti-CD40 es incorporado específicamente a la composición para que produzca una respuesta terapéutica o profiláctica deseada con respecto al tratamiento, la prevención o el diagnóstico de una enfermedad o afección en un sujeto cuando se administra la composición farmacéutica a ese sujeto. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen agentes estabilizantes o agentes de masa apropiados,

: o ambos, para minimizar los problemas asociados a la pérdida de estabilidad y de actividad biológica de la proteína durante la preparación y el almacenamiento.

[0137] Se pueden añadir formulantes a composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo antagonista anti-CD40 de la invención. Estos formulantes pueden incluir, aunque sin limitación, aceites, polímeros, vitaminas, carbohidratos, aminoácidos, sales, tampones, albúmina, surfactantes o agentes de masa. Preferiblemente, los carbohidratos incluyen azúcar o alcoholes de azúcares, tales como mono-, di- o polisacáridos, o glucanos hidrosolubles. Los sacáridos o glucanos pueden incluir fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, sacarosa, dextrano, pululano, dextrina, α y β-ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietilalmidón y carboximetilcelulosa,

: o sus mezclas. Se define el "alcohol de azúcar" como un hidrocarburo C4 a C8 que tiene un grupo hidroxilo, y se incluyen galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol y arabitol. Se pueden usar estos azúcares o alcoholes de azúcares individualmente o en combinación. La concentración del azúcar o del alcohol de azúcar es de entre el 1,0% y el 7% p/v, más preferiblemente de entre el 2,0% y el 6,0% p/v. Preferiblemente, los aminoácidos incluyen formas levorrotatorias (L) de carnitina, arginina y betaína; sin embargo, se pueden añadir otros aminoácidos. Como polímeros preferidos, se incluyen polivinilpirrolidona (PVP), con un peso molecular medio de entre 2.000 y 3.000, o polietilenglicol (PEG), con un peso molecular medio de entre 3.000 y 5.000. Se muestran surfactantes que pueden ser añadidos a la formulación en EP Nº 270.799 y Nº 268.110.

[0138] Adicionalmente, se pueden modificar químicamente los anticuerpos por conjugación covalente a un polímero para aumentar su vida media circulante, por ejemplo. Se muestran polímeros preferidos y métodos para unirlos a péptidos en las Patentes EE.UU. Nº 4.766.106, Nº 4.179.337, Nº 4.495.285 y Nº 4.609.546. Son polímeros preferidos los polioles polioxietilados y el polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(O-CH2-CHO2)n-O-R, donde R puede ser hidrógeno o un grupo protector, tal como un grupo alquilo o alcanol. Preferiblemente, el grupo protector tiene entre 1 y 8 carbonos; más preferiblemente, es metilo. El símbolo n es un número entero positivo, preferiblemente de entre 1 y 1.000, más preferiblemente de entre 2 y 500. El PEG tiene un peso molecular medio preferido de entre 1.000 y 40.000, más preferiblemente de entre

2.000 y 20.000, más preferiblemente de entre 3.000 y 12.000. Preferiblemente, el PEG tiene al menos un grupo hidroxi; más preferiblemente, se trata de un grupo hidroxi terminal. Es este grupo hidroxi el que se activa

preferiblemente para reaccionar con un grupo amino libre sobre el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad de los grupos reactivos puede variar para conseguir un PEG/anticuerpo covalente conjugado de la presente invención.

[0139] Los polioles polioxietilados hidrosolubles son también útiles en la presente invención. Incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG) y similares. Se prefiere el POG. Una razón es porque el esqueleto de glicerol del glicerol polioxietilado es el mismo esqueleto que aparece de manera natural en, por ejemplo, animales y humanos en los mono-, di- y triglicéridos. Por lo tanto, esta ramificación no se vería necesariamente como un agente extraño en el organismo. El POG tiene un peso molecular preferido en el mismo rango que el PEG. Se muestra la estructura del POG en Knauf et al. (1988), J. Bio. Chem. 263: 15064-15070, y se encuentra una discusión de conjugados POG/IL-2 en la Patente EE.UU. Nº 4.766.106.

[0140] Otro sistema de administración de fármacos para aumentar la vida media circulante es el liposoma. Se discuten métodos de preparación de sistemas de administración basados en liposomas en Gabizon et al. (1982), Cancer Research 42: 4734; Cafiso (1981), Biochem. Biophys. Acta 649: 129; y Szoka (1980), Ann. Rev. Biophys. Eng. 9: 467. Se conocen en la técnica otros sistemas de administración de fármacos, y se describen en, v.g., Poznansky et al. (1980), Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y.), pp. 253-315; Poznansky (1984), Pharm. Revs. 36: 277.

[0141] Los formulantes que se han de incorporar en una composición farmacéutica deben proporcionar estabilidad al anticuerpo antagonista anti-CD40 o al fragmento de unión a antígeno del mismo. Es decir, el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo debe conservar su estabilidad física y/o química y tener la actividad biológica deseada, o sea, una o más de las actividades antagonistas definidas aquí anteriormente, incluyendo, aunque sin limitación, la inhibición de la secreción de inmunoglobulinas por las células B periféricas humanas normales estimuladas por las células T; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales estimuladas por las células T Jurkat; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales estimuladas por células que expresan CD40L o ligando CD40 soluble (sCD40L); inhibición de las señales intracelulares antiapoptóticas de "supervivencia" en cualquier célula estimulada por sCD40L o CD40L en fase sólida; inhibición de la transducción de señal CD40 en cualquier célula tras ligación con sCD40L o CD40L en fase sólida; e inhibición de la proliferación de las células B malignas humanas como se ha indicado aquí en algún otro lugar.

[0142] Los métodos para monitorizar la estabilidad de las proteínas son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Jones (1993), Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90; Lee, ed. (1991), Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York, New York); y los ensayos de estabilidad que se exponen aquí más adelante. En general, se mide la estabilidad de la proteína a una temperatura seleccionada durante un período especificado de tiempo. En realizaciones preferidas, una formulación farmacéutica de anticuerpo estable proporciona estabilidad al anticuerpo antagonista anti-CD40 o al fragmento de unión a antígeno del mismo cuando se almacena a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) durante al menos 1 mes, al menos 3 meses o al menos 6 meses, y/o es estable a aproximadamente 2-8°C durante al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses o al menos 24 meses.

[0143] Se considera que una proteína, tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, conserva su estabilidad física en un punto dado en el tiempo si no muestra signos visuales (es decir, decoloración o pérdida de transparencia) o mensurables (por ejemplo, utilizando cromatografía de exclusión por tamaños ("SEC") o dispersión de la luz UV) de precipitación, agregación y/o desnaturalización en esa composición farmacéutica. Con respecto a la estabilidad química, se considera que una proteína, tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, conserva su estabilidad química en un punto dado en el tiempo si las mediciones de estabilidad química son indicativas de que la proteína (es decir, el anticuerpo) conserva la actividad biológica de interés en esa composición farmacéutica. Los métodos de monitorización de los cambios en la estabilidad química son bien conocidos en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, métodos para detectar formas químicamente alteradas de la proteína, tales como las que resultan del recorte, usando, por ejemplo, SDS-PAGE, SEC y/o espectrometría de masas de ionización con desorción por láser/tiempo de vuelo asistida por matriz, y de la degradación asociada a cambios en la carga molecular (por ejemplo, asociada a desamidación), usando, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones. Véanse, por ejemplo, los métodos que se expondrán aquí más adelante.

[0144] Se considera que un anticuerpo antagonista anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, cuando se formula en una composición farmacéutica, conserva una actividad biológica deseada en un punto dado en el tiempo si la actividad biológica deseada en ese tiempo está dentro de aproximadamente un 30%, preferiblemente dentro de aproximadamente un 20%, de la actividad biológica deseada exhibida en el momento en que se preparó la composición farmacéutica, según se determina en un ensayo adecuado para la actividad biológica deseada. Los ensayos para medir la actividad biológica deseada de los anticuerpos antagonistas anti-CD40 aquí descritos, y de sus fragmentos de unión a antígeno, pueden ser realizados como se describe aquí en los Ejemplos. Véanse también los ensayos descritos en Schultze et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8200-8204; Denton et al. (1998), Pediatr. Transplant. 2: 6-15; Evans et al. (2000), J. Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998), Agents Actions Supl. 49:

17-22; Lederman et al. (1996), Curr. Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan et al. (1991), Current Protocols in Immunology

13: 12; Kwekkeboom et al. (1993), Immunology 79: 439-444; y Patentes EE.UU. Nº 5.674.492 y Nº 5.847.082.

[0145] En algunas realizaciones de la invención, se formula el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en una formulación farmacéutica líquida. Se puede preparar el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo los métodos aquí expuestos anteriormente. En una realización, el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9,

o el fragmento de unión a antígeno del mismo es producido recombinantemente en una línea de células CHO.

[0146] Después de su preparación y purificación, se puede formular el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo como una formulación farmacéutica líquida del modo aquí expuesto. Cuando se ha de almacenar el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo antes de su formulación, se puede congelar, por ejemplo, a ≤ -20°C, y descongelar luego a temperatura ambiente para su posterior formulación. La formulación farmacéutica líquida incluye una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40 o del fragmento de unión a antígeno del mismo. La cantidad de anticuerpo o de fragmento de unión a antígeno del mismo presente en la formulación toma en consideración la vía de administración y el volumen deseado de dosis.

[0147] De este modo, la composición farmacéutica líquida contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 50,0 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 40,0 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 30,0 mg/ml, de aproximadamente 5,0 mg/ml a aproximadamente 25,0 mg/ml, de aproximadamente 5,0 mg/ml a aproximadamente 20,0 mg/ml o de aproximadamente 15,0 mg/ml a aproximadamente 25,0 mg/ml. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica líquida contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5,0 mg/ml, de aproximadamente 5,0 mg/ml a aproximadamente 10,0 mg/ml, de aproximadamente 10,0 mg/ml a aproximadamente 15,0 mg/ml, de aproximadamente 15,0 mg/ml a aproximadamente 20,0 mg/ml, de aproximadamente 20,0 mg/ml a aproximadamente 25,0 mg/ml, de aproximadamente 25,0 mg/ml a aproximadamente 30,0 mg/ml, de aproximadamente 30,0 mg/ml a aproximadamente 35,0 mg/ml, de aproximadamente 35,0 mg/ml a aproximadamente 40,0 mg/ml, de aproximadamente 40,0 mg/ml a aproximadamente 45,0 mg/ml o de aproximadamente 45,0 mg/ml a aproximadamente 50,0 mg/ml. En otras realizaciones, la composición farmacéutica líquida contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo a una concentración de aproximadamente 15,0 mg/ml, de aproximadamente 16,0 mg/ml, de aproximadamente 17,0 mg/ml, de aproximadamente 18,0 mg/ml, de aproximadamente 19,0 mg/ml, de aproximadamente 20,0 mg/ml, de aproximadamente 21,0 mg/ml, de aproximadamente 22,0 mg/ml, de aproximadamente 23,0 mg/ml, de aproximadamente 24,0 mg/ml o de aproximadamente 25,0 mg/ml. La composición farmacéutica líquida contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo CHIR-12,12 o CHIR-5,9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un tampón que mantiene el pH de la formulación en un rango de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0, incluyendo aproximadamente un pH de 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 y otros valores tales dentro del rango de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0. En algunas realizaciones, el tampón mantiene el pH de la formulación en un rango de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,5, de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,0, de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 5,5, de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 6,5 o de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 6,0.

[0148] Se puede usar cualquier tampón adecuado que mantenga el pH de la formulación líquida de anticuerpo anti-CD40 en el rango de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0 en la formulación, en la medida en que se conserven la estabilidad fisicoquímica y la actividad biológica deseada del anticuerpo como se ha indicado aquí con anterioridad. Como tampones adecuados, se incluyen, aunque sin limitación, ácidos convencionales y sus sales, donde el contraión puede ser, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o magnesio. Como ejemplos de ácidos convencionales y sales de los mismos que pueden ser utilizados para tamponar la formulación farmacéutica líquida, se incluyen, aunque sin limitación, los tampones de ácido succínico o succinato, ácido cítrico o citrato, ácido acético

: o acetato, ácido tartárico o tartrato, ácido fosfórico o fosfato, ácido glucónico o gluconato, ácido glutámico o glutamato, ácido aspártico o aspartato, ácido maleico o maleato y ácido málico o malato. La concentración de tampón en la formulación puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, incluyendo aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM u otros valores tales dentro del rango de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración de tampón en la formulación es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM u otros valores tales dentro del rango de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM.

: o CHIR-5.9, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo y tampón succinato o tampón citrato en una

[0149] En algunas realizaciones de la invención, la formulación farmacéutica líquida contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12

concentración que mantiene el pH de la formulación en el rango de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0, preferiblemente de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,5. Por "tampón succinato" o "tampón citrato", se entiende un tampón que contiene una sal de ácido succínico o una sal de ácido cítrico, respectivamente. En una realización preferida, el contraión del succinato o del citrato es el catión sodio, y por lo tanto el tampón es el succinato de sodio o el citrato de sodio, respectivamente. Sin embargo, se espera que cualquier catión resulte efectivo. Otros posibles cationes para el succinato o el citrato incluyen, aunque sin limitación, potasio, amonio, calcio y magnesio. Como se ha indicado anteriormente, la concentración de tampón succinato o citrato en la formulación puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, incluyendo aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM u otros valores tales dentro del rango de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración de tampón en la formulación es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM o aproximadamente 15 mM. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 50,0 mg/ml, o de aproximadamente 5,0 mg/ml a aproximadamente 25,0 mg/ml, y tampón succinato o citrato, por ejemplo, tampón succinato de sodio o citrato de sodio, a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM y preferiblemente de aproximadamente 10 mM.

[0150] Cuando es deseable que la formulación farmacéutica líquida sea prácticamente isotónica, la formulación farmacéutica líquida que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del rango de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0 puede además contener una cantidad de un agente isotonizante suficiente para hacer que la formulación sea prácticamente isotónica. Por "prácticamente isotónica", se entiende que la formulación acuosa tiene una osmolaridad de aproximadamente 240 mmol/kg a aproximadamente 360 mmol/kg, preferiblemente de aproximadamente 240 a aproximadamente 340 mmol/kg, más preferiblemente de aproximadamente 250 a aproximadamente 330 mmol/kg, incluso más preferiblemente de aproximadamente 260 a aproximadamente 320 mmol/kg, aún más preferiblemente de aproximadamente 270 a aproximadamente 310 mmol/kg. Los métodos de determinación de la isotonicidad de una solución son conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Setnikar et al. (1959), J. Am. Pharm. Assoc. 48: 628.

[0151] Los expertos en la técnica están familiarizados con una variedad de solutos farmacéuticamente aceptables útiles para obtener isotonicidad en composiciones farmacéuticas. El agente isotonizante puede ser cualquier reactivo capaz de ajustar la presión osmótica de la formulación farmacéutica líquida de la presente invención a un valor prácticamente igual al de un fluido corporal. Es deseable usar un agente isotonizante fisiológicamente aceptable. Así, la formulación farmacéutica líquida que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del rango de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0 puede además contener componentes que pueden ser usados para proporcionar isotonicidad, por ejemplo, cloruro de sodio; aminoácidos, tales como alanina, valina y glicina; azúcares y alcoholes de azúcares (polioles), incluyendo, aunque sin limitación, glucosa, dextrosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, trehalosa, glicerol, sorbitol y xilitol; ácido acético, otros ácidos orgánicos o sus sales, y cantidades relativamente menores de citratos o fosfatos. La persona con conocimientos ordinarios sabrá de agentes adicionales que resulten adecuados para obtener una tonicidad óptima de la formulación líquida.

[0152] En algunas realizaciones preferidas, la formulación farmacéutica líquida que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12

o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del rango de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0 contiene además cloruro de sodio como agente isotonizante. La concentración de cloruro de sodio en la formulación dependerá de la contribución de otros componentes a la tonicidad. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 250 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 125 mM a aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 125 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 130 mM a aproximadamente 170 mM, de aproximadamente 130 mM a aproximadamente 160 mM, de aproximadamente 135 mM a aproximadamente 155 mM, de aproximadamente 140 mM a aproximadamente 155 mM o de aproximadamente 145 mM a aproximadamente 155 mM. En una de tales realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es de aproximadamente 150 mM. En otras de tales realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es de aproximadamente 150 mM, el tampón es tampón succinato de sodio o citrato de sodio a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, la formulación farmacéutica líquida contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del

mismo y la formulación tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0, de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,0 o de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 6,5. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 50,0 mg/ml o de aproximadamente 5,0 mg/ml a aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente 150 mM de cloruro de sodio y aproximadamente 10 mM de succinato de sodio o de citrato de sodio, a un pH de aproximadamente 5,5.

[0153] Se puede inhibir la degradación proteica debida a la congelación-descongelación o a la cizalladura mecánica durante el procesado de una formulación farmacéutica líquida de la presente invención por incorporación de surfactantes a la formulación con objeto de reducir la tensión superficial en la interfase solución-aire. Así, en algunas realizaciones, la formulación farmacéutica líquida contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del rango de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0 y además un surfactante. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del rango de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0, un agente isotonizante, tal como cloruro de sodio, a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM y además un surfactante.

[0154] Los surfactantes típicos empleados son surfactantes no iónicos, incluyendo ésteres del polioxietilensorbitol, tales como el polisorbato 80 (Tween 80) y el polisorbato 20 (Tween 20); ésteres de polioxipropileno-polioxietileno, tales como el Pluronic F68; alcoholes polioxietilénicos, tales como el Brij 35; simeticona; polietilenglicol, tal como el PEG 400; lisofosfatidilcolina; y polioxietilen-p-t-octilfenol, tal como el Tritón X-100. Se describe la estabilización clásica de productos farmacéuticos por medio de surfactantes o emulsionantes, por ejemplo, en Levine et al. (1991),

J. Parenteral Sci. Technol. 45(3): 160-165. Un surfactante preferido empleado en la práctica de la presente invención es el polisorbato 80. Cuando se incluye un surfactante, éste es típicamente añadido en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 1,0% (p/v), de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,4%, de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,2%, de aproximadamente el 0,005% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,005% a aproximadamente el 0,2%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 0,2%, de aproximadamente el 0,03% a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,03% a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,05% a aproximadamente el 0,5% o de aproximadamente el 0,05% a aproximadamente el 0,2%.

[0155] Así, en algunas realizaciones, la formulación farmacéutica líquida contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo; el tampón es tampón succinato de sodio o citrato de sodio a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM; la formulación tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0, de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,0 o de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 6,5; y la formulación contiene además un surfactante, por ejemplo polisorbato 80, en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 1,0% o de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,5%. Dichas formulaciones pueden eventualmente contener un agente isotonizante, tal como cloruro de sodio, a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM o de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 50,0 mg/ml o de aproximadamente 5,0 mg/ml a aproximadamente 25,0 mg/ml, incluyendo aproximadamente 20,0 mg/ml; de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM de cloruro de sodio, incluyendo aproximadamente 150 mM de cloruro de sodio; succinato de sodio o citrato de sodio a de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM, incluyendo aproximadamente 10 mM de succinato de sodio o citrato de sodio; cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM, incluyendo aproximadamente 150 mM; y eventualmente un surfactante, por ejemplo polisorbato 80, en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 1,0%, incluyendo de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 0,5%; donde la formulación farmacéutica líquida tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,0, de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,0, de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 5,5, de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 6,5 o de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 6,0.

[0156] La formulación farmacéutica líquida puede estar esencialmente libre de cualquier conservante y otros soportes, excipientes o estabilizadores indicados aquí anteriormente. Alternativamente, la formulación puede incluir uno o más conservantes, por ejemplo agentes antibacterianos y soportes, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables aquí descritos con anterioridad, siempre que no afecten de forma adversa a la

estabilidad fisicoquímica del anticuerpo antagonista anti-CD40 o del fragmento de unión a antígeno del mismo. Como ejemplos de soportes, excipientes y estabilizadores aceptables, se incluyen, aunque sin limitación, agentes tamponantes adicionales, cosolventes, surfactantes, antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina, agentes quelantes, tales como EDTA, complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) y polímeros biodegradables, tales como poliésteres. Se puede encontrar una discusión completa de formulación y selección de soportes, estabilizadores e isomolitos farmacéuticamente aceptables en Remington’s Pharmaceutical Sciences (18ª ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990).

[0157] Después de preparar la formulación farmacéutica líquida u otra composición farmacéutica aquí descrita, se puede liofilizar ésta para evitar la degradación. Los métodos para liofilizar composiciones líquidas son conocidos para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica. Justo antes de su uso, se puede reconstituir la composición con un diluyente estéril (solución de Ringer, agua destilada o solución salina estéril, por ejemplo), que puede incluir ingredientes adicionales. Tras su reconstitución, la composición es preferiblemente administrada a los sujetos usando los métodos conocidos para los expertos en la técnica.

Uso de anticuerpos antagonistas anti-CD40 en la fabricación de medicamentos

[0158] La presente exposición también proporciona el uso de un anticuerpo antagonista anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un cáncer caracterizado por el crecimiento de células B neoplásicas, donde se coordina el medicamento con un tratamiento con al menos otra terapia contra el cáncer. Como cánceres caracterizados por el crecimiento de células B neoplásicas, se incluyen, aunque sin limitación, los cánceres relacionados con células B antes aquí discutidos, por ejemplo, el linfoma no Hodgkin, la leucemia linfocítica crónica, el mieloma múltiple, el linfoma de células B, el linfoma de células B de grado alto, el linfoma de células B de grado intermedio, el linfoma de células B de grado bajo, la leucemia linfoblástica aguda de células B, la leucemia mieloblástica, la enfermedad de Hodgkin, el plasmacitoma, el linfoma folicular, el linfoma folicular de células pequeñas segmentadas, el linfoma folicular de células grandes, el linfoma folicular mixto de células pequeñas segmentadas, el linfoma difuso de células pequeñas segmentadas, el linfoma linfocítico pequeño difuso, la leucemia prolinfocítica, el linfoma linfoplasmacítico, el linfoma de la zona marginal, el linfoma de tejidos linfoides asociados a mucosas, el linfoma de células B monocitoides, el linfoma esplénico, la leucemia de células vellosas, el linfoma difuso de células grandes, el linfoma mediastínico de células B grandes, la granulomatosis linfomatoide, la linfomatosis intravascular, el linfoma difuso de células mixtas, el linfoma difuso de células grandes, el linfoma inmunoblástico, el linfoma de Burkitt, el linfoma relacionado con el SIDA y el linfoma de células de manto.

[0159] Por "coordinado", se entiende que el medicamento que contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo ha de ser usado antes, durante o después del tratamiento del sujeto con al menos otra terapia contra el cáncer. Como ejemplos de otras terapias contra el cáncer, se incluyen, aunque sin limitación, cirugía; terapia de radiación; quimioterapia, eventualmente en combinación con trasplante autólogo de médula ósea, donde, como agentes quimioterapéuticos adecuados, se incluyen, aunque sin limitación, fludarabina o fosfato de fludarabina, clorambucilo, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorrubicina, prednisona y sus combinaciones, por ejemplo, regímenes que contienen antraciclinas, tales como CAP (ciclofosfamida y doxorrubicina más prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona más doxorrubicina), VAD (vincristina y doxorrubicina más dexametasona) y MP (melfalán más prednisona), y otros agentes citotóxicos y/o terapéuticos usados en quimioterapia, tales como mitoxantrona, daunorrubicina, idarrubicina, asparraginasa y antimetabolitos, incluyendo, aunque sin limitación, citarabina, metotrexato, 5fluorouracildacarbazina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina y nelarabina; terapia con otros anticuerpos monoclonales anticancerosos (por ejemplo, alemtuzumab (Campath®) u otro anticuerpo anti-CD52 que se dirija a la glicoproteína de la superficie celular CD52 sobre células B malignas; rituximab (Rituxán®), el anticuerpo totalmente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuxetán (Zevalin®) o cualquier otro anticuerpo anti-CD20 terapéutico que se dirija al antígeno CD20 sobre células B malignas; el anticuerpo anti-CD19 (por ejemplo, MT103, un anticuerpo biespecífico); el anticuerpo anti-CD22 (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) u otro anticuerpo anticanceroso que se dirija al factor de crecimiento endotelial vascular humano; el anticuerpo anti-CD22 que se dirige al antígeno CD22 sobre células B malignas (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal BL-22, una toxina alfaCD22); el anticuerpo α-M-CSF que se dirige al factor estimulante de las colonias de macrófagos; anticuerpos que se dirigen al activador del receptor de kappaB del factor nuclear (RANK) y su ligando (RANKL), que se sobreexpresan en el mieloma múltiple; al anticuerpo anti-CD23 que se dirige al antígeno CD23 sobre células B malignas (por ejemplo, IDEC-152); el anticuerpo anti-CD38 que se dirige al antígeno CD38 sobre células B malignas; anticuerpos que se dirigen a los receptores del complejo de histocompatibilidad mayor de clase II (anticuerpos anti-MHC) expresados sobre células B malignas; otros anticuerpos anti-CD40 (por ejemplo, SGN-40) que se dirigen al antígeno CD40 sobre células B malignas; y anticuerpos que se dirigen al receptor 1 del ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL-R1) (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humano agonista HGS-ETR1) expresado sobre una serie de tumores sólidos y de tumores de origen hematopoyético); terapia contra el cáncer basada en moléculas pequeñas, incluyendo, aunque sin limitación, inhibidores de los microtúbulos y/o de la topoisomerasa (por ejemplo, el inhibidor mitótico dolastatina y análogos de la dolastatina, el agente de unión a tubulina T900607, XL119 y el inhibidor de la topoisomerasa aminocamptotecina), SDX-105 (clorhidrato de

bendamustina), ixabepilona (un análogo de epotilona, al que también se hace referencia como BMS-247550), inhibidores de la proteína kinasa C, por ejemplo, midoestaurina ((PKC-412, CGP 41251, N-benzoilestauroesporina), pixantrona, eloxatina (un agente antineoplásico), ganita (nitrato de galio), Thalomid® (talidomida), derivados inmunomoduladores de la talidomida (por ejemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak™ (inhibidor antisentido de la proteína kinasa C-alfa), SDX-101 (R-etodolac, que induce la apoptosis de linfocitos malignos), análogos de nucleósidos de purina de segunda generación, tales como clofarabina, inhibidores de la producción de la proteína Bcl-2 por las células cancerosas (por ejemplo, los agentes antisentido oblimersen y Genasense®), inhibidores de proteasomas (por ejemplo, Velcade™ (bortezomib)), inhibidores de kinasas de molécula pequeña (por ejemplo, CHIR-258), inhibidores de VEGF de molécula pequeña (por ejemplo, ZD-6474), inhibidores de molécula pequeña de la proteína de choque térmico (HSP) 90 (por ejemplo, 17-AAG), inhibidores de molécula pequeña de histona desacetilasas (por ejemplo, agentes de citodiferenciación híbrida/polar CHP, tales como el ácido suberanilohidroxámico (SAHA) y FR-901228) y agentes apoptóticos, tales como Trisenox® (trióxido arsénico) y Xcytrin® (motexafín gadolinio); terapias contra el cáncer basadas en vacunas/inmunoterapia, incluyendo, aunque sin limitación, enfoques vacunales (por ejemplo, Id-KLH, oncofago, vitaletina), inmunoterapia personalizada o inmunoterapia con idiotipos activos (por ejemplo, MyVax® Personalized Immunotherapy, anteriormente designada como GTOP-99), Promune® (CpG 7909, un agonista sintético para el receptor de tipo Toll 9 (TLR9)), terapia con interferón-alfa, terapia con interleuquina-2 (IL-2), terapia con IL-12; terapia con IL-15 y terapia con IL-21; terapia con esteroides; u otra terapia contra el cáncer; donde el tratamiento con la terapia adicional contra el cáncer, o con las terapias adicionales contra el cáncer, se produce antes, durante o después del tratamiento del sujeto con el medicamento que contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se ha indicado aquí con anterioridad.

[0160] En algunas realizaciones, la presente exposición proporciona el uso del anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un linfoma de células B, por ejemplo el linfoma no Hodgkin, en un sujeto, donde se coordina el medicamento con tratamiento con al menos otra terapia contra el cáncer seleccionada entre el grupo consistente en quimioterapia, terapia con anticuerpos anticancerosos, terapia contra el cáncer basada en moléculas pequeñas y terapia contra el cáncer basada en vacunas/inmunoterapia, donde se ha de usar el medicamento antes, durante o después del tratamiento del sujeto con la otra terapia contra el cáncer, o, en el caso de múltiples terapias de combinación, antes, durante o después del tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer.

[0161] Así, por ejemplo, en algunas realizaciones, la exposición proporciona el uso del anticuerpo monoclonal CHIR

12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un linfoma de células B, por ejemplo un linfoma no Hodgkin, en un sujeto, donde se coordina el medicamento con un tratamiento mediante quimioterapia, donde el agente quimioterapéutico es seleccionado entre el grupo consistente en citoxán, doxorrubicina, vincristina, prednisona y sus combinaciones, por ejemplo CHOP. En otras realizaciones, la exposición proporciona el uso del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un linfoma de células B, por ejemplo un linfoma no Hodgkin, en un sujeto, donde se coordina el medicamento con un tratamiento con al menos otro anticuerpo anticanceroso seleccionado entre el grupo consistente en alemtuzumab (Campath®) u otro anticuerpo anti-CD52 que se dirija a la glicoproteína de la superficie celular CD52 sobre células B malignas; rituximab (Rituxán®), el anticuerpo totalmente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuxetán (Zevalin®) o cualquier otro anticuerpo anti-CD20 terapéutico que se dirija al antígeno CD20 sobre células B malignas; el anticuerpo anti-CD19 (por ejemplo, MT103, un anticuerpo biespecífico); el anticuerpo anti-CD22 (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) u otro anticuerpo anticanceroso que se dirija al factor de crecimiento endotelial vascular humano; y cualquier combinación de éstos; donde el medicamento ha de ser utilizado antes, durante o después del tratamiento del sujeto con la otra terapia contra el cáncer, o, en el caso de múltiples terapias de combinación, antes, durante o después del tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer.

[0162] En aún otras realizaciones, la presente exposición proporciona el uso del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12

o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un linfoma de células B, por ejemplo un linfoma no Hodgkin, en un sujeto, donde se coordina el medicamento con un tratamiento con al menos otra terapia contra el cáncer basada en moléculas pequeñas seleccionada entre el grupo consistente en inhibidores de los microtúbulos y/o de la topoisomerasa (por ejemplo, el inhibidor mitótico dolastatina y análogos de la dolastatina, el agente de unión a tubulina T900607, XL119 y el inhibidor de la topoisomerasa aminocamptotecina), SDX-105 (clorhidrato de bendamustina), ixabepilona (un análogo de epotilona, al que también se hace referencia como BMS-247550), inhibidores de la proteína kinasa C, por ejemplo, midoestaurina ((PKC-412, CGP 41251, N-benzoilestauroesporina), pixantrona, eloxatina (un agente antineoplásico), ganita (nitrato de galio), Thalomid® (talidomida), un agente apoptótico, tal como Xcytrin® (motexafín gadolinio), inhibidores de la producción de la proteína Bcl-2 por las células cancerosas (por ejemplo, los agentes antisentido oblimersen y Genasense®), nelarabina y cualquier combinación de éstos; donde el medicamento ha de ser utilizado antes, durante o después del tratamiento del sujeto con la otra terapia contra el cáncer, o, en el caso de múltiples terapias de combinación, antes, durante o después del tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer.

[0163] En aún otras realizaciones, la presente exposición proporciona el uso del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12

o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un linfoma de células B, por ejemplo un linfoma no Hodgkin, en un sujeto, donde se coordina el medicamento con un tratamiento con al menos otra terapia contra el cáncer basada en vacunas/inmunoterapia seleccionada entre el grupo consistente en enfoques vacunales (por ejemplo, Id-KLH, oncofago, vitaletina), inmunoterapia personalizada o inmunoterapia con idiotipos activos (por ejemplo, MyVax® Personalized Immunotherapy, anteriormente designada como GTOP-99), Promune® (CpG 7909, un agonista sintético para el receptor de tipo Toll 9 (TLR9)), terapia con interleuquina-2 (IL-2), terapia con IL-12, terapia con IL-15 y terapia con IL-21, y cualquier combinación de éstos; donde el medicamento ha de ser utilizado antes, durante o después del tratamiento del sujeto con la otra terapia contra el cáncer, o, en el caso de múltiples terapias de combinación, antes, durante o después del tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer.

[0164] En algunas realizaciones, la presente exposición proporciona el uso del anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para tratar una leucemia relacionada con las células B, por ejemplo la leucemia linfocítica aguda de células B (B-ALL), en un sujeto, donde se coordina el medicamento con un tratamiento con al menos otra terapia contra el cáncer seleccionada entre el grupo consistente en quimioterapia y terapia antimetabolitos, donde el medicamento ha de ser utilizado antes, durante o después del tratamiento del sujeto con la otra terapia contra el cáncer, o, en el caso de múltiples terapias de combinación, antes, durante o después del tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer. Como ejemplos de tales realizaciones, se incluyen, aunque sin limitación, aquellos casos en los que se coordina el medicamento que contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, con un tratamiento con un agente quimioterapéutico o antimetabolito seleccionado entre el grupo consistente en citoxán, doxorrubicina, vincristina, prednisona, citarabina, mitoxantrona, idarrubicina, asparraginasa, metotrexato, 6tioguanina, 6-mercaptopurina y sus combinaciones; donde el medicamento ha de ser utilizado antes, durante o después del tratamiento del sujeto con la otra terapia contra el cáncer, o, en el caso de múltiples terapias de combinación, antes, durante o después del tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer. En uno de tales ejemplos, se coordina el medicamento con un tratamiento con citarabina más daunorrubicina, citarabina más mitoxantrona y/o citarabina más idarrubicina; donde el medicamento ha de ser utilizado antes, durante o después del tratamiento del sujeto con B-ALL con la otra terapia contra el cáncer, o, en el caso de múltiples terapias de combinación, antes, durante o después del tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer.

[0165] También se expone aquí el uso de un anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 aquí expuesto, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer caracterizado por crecimiento neoplásico de células B, incluyendo los cánceres relacionados con células B aquí descritos anteriormente, donde el medicamento es utilizado en un sujeto que ha sido pretratado con al menos otra terapia contra el cáncer. Por "pretratado" o "pretratamiento", se entiende que el sujeto ha recibido una o más de otras terapias contra el cáncer (es decir, que se le ha tratado con al menos otra terapia contra el cáncer) antes de recibir el medicamento que contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo. "Pretratado" o "pretratamiento" incluye a sujetos que han sido tratados con al menos otra terapia contra el cáncer dentro de un plazo de 2 años, de 18 meses, de 1 año, de 6 meses, de 2 meses, de 6 semanas, de 1 mes, de 4 semanas, de 3 semanas, de 2 semanas, de 1 semana, de 6 días, de 5 días, de 4 días, de 3 días, de 2 días o incluso de 1 día antes de iniciar el tratamiento con el medicamento que contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR- 5.9 aquí expuesto, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. No es necesario que el sujeto fuera un respondedor al pretratamiento con la terapia previa contra el cáncer o las terapias previas contra el cáncer. Así, el sujeto que recibe el medicamento que contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo podría haber respondido o podría no haber respondido (es decir, que el cáncer era refractario) al pretratamiento con la terapia previa contra el cáncer, o a una o más de las terapias previas contra el cáncer cuando el pretratamiento incluyese múltiples terapias contra el cáncer. Como ejemplos de otras terapias contra el cáncer para las que un sujeto puede haber recibido pretratamiento antes de recibir el medicamento que contiene el anticuerpo antagonista anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se incluyen, aunque sin limitación, cirugía; terapia de radiación; quimioterapia, eventualmente en combinación con trasplante autólogo de médula ósea, donde, como agentes quimioterapéuticos adecuados, se incluyen, aunque sin limitación, los enumerados aquí anteriormente; terapia con otros anticuerpos monoclonales anticancerosos, incluyendo, aunque sin limitación, los anticuerpos anticancerosos enumerados aquí anteriormente; terapia contra el cáncer basada en moléculas pequeñas, incluyendo, aunque sin limitación, las moléculas pequeñas enumeradas aquí anteriormente; terapias contra el cáncer basadas en vacunas/inmunoterapia, incluyendo, aunque sin limitación, las enumeradas aquí anteriormente; terapia con esteroides; otra terapia contra el cáncer; o cualquier combinación de las mismas.

[0166] "Tratamiento", en el contexto del uso coordinado de un medicamento aquí descrito con una o más de otras terapias contra el cáncer, se define aquí como la aplicación o administración del medicamento o de la otra terapia contra al cáncer a un sujeto, o la aplicación o administración del medicamento u otra terapia contra el cáncer a un tejido o línea celular aislada de un sujeto, donde el sujeto tiene un cáncer caracterizado por crecimiento neoplásico de células B, un síntoma asociado a dicho cáncer o una predisposición al desarrollo de dicho cáncer, donde el

propósito es curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o producir efectos sobre el cáncer, cualquier síntoma asociado al cáncer o la predisposición al desarrollo del cáncer.

[0167] Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no a modo de limitación.

EXPERIMENTAL

[0168] Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 usados en los ejemplos que se dan a continuación son CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Los anticuerpos anti-CD40 CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD40 humano del subtipo IgG1 humana generados por inmunización de ratones transgénicos portadores del locus de la cadena pesada de la IgG1 humana y el locus de la cadena ligera κ humana (XenoMouse® technology; Abgenix; Fremont, California). Tal como se muestra por análisis FACS, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen específicamente al CD40 humano y pueden prevenir la unión del ligando de CD40. Ambos mAb pueden competir con el ligando de CD40 preunido al CD40 de la superficie celular. Ambos anticuerpos son potentes antagonistas e inhiben la proliferación in vitro mediada por el ligando de CD40 de células B normales, así como de células cancerosas de pacientes con LNH y LLC. In vitro, ambos anticuerpos matan las líneas de células cancerosas, así como las células cancerosas primarias de pacientes con LNH por CCDA. Se vio actividad antitumoral dependiente de dosis en un modelo de linfoma humano de xenoinjerto. La afinidad de unión de CHIR-5.9 al CD40 humano es de 1,2x10-8 M y la afinidad de unión de CHIR-12.12 al CD40 humano es de 5x10-10 M.

[0169] La línea de hibridoma de ratón 131.2F8.5.9 (CMCC#12047) y la línea de hibridoma 153.8E2.D10.D6.12.12 (CMCC#12056) fueron depositadas en la American Type Culture Collection [ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209 (USA)] bajo el Número de Depósito de Patente PTA-5542 y PTA-5543, respectivamente.

[0170] Se han empleado los siguientes protocolos en los ejemplos descritos a continuación.

Ensayo ELISA para cuantificación de inmunoglobulinas

[0171] Se estimaron las concentraciones de IgM e IgG humanas por ELISA. Se revistieron placas de ELISA de 96 pocillos con 2 μg/ml de mAb IgG de cabra antihumano (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) o con 2 μg/ml de mAb IgM de cabra antihumano 4102 (Bio Source International, California) en tampón carbonato 0,05 M (pH 9,6), por incubación durante 16 horas a 4°C. Se lavaron las placas 3 veces con PBS-0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) y se saturaron con BSA durante 1 hora. Después de 2 lavados, se incubaron las placas durante 2 horas a 37°C con diferentes diluciones de las muestras de ensayo. Después de 3 lavados, se detectó la Ig unida por incubación durante 2 horas a 37°C con 1 μg/ml de mAb IgG de cabra antihumano o mAb IgM de cabra antihumano marcado con peroxidasa. Se lavaron las placas 4 veces y se reveló la actividad peroxidasa unida por adición de O-fenilendiamina como substrato. Se usaron patrones de IgG o IgM humana (Caltaq, Burlingame, California) para establecer una curva estándar para cada ensayo.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre periférica humana

[0172] Se añadieron 20 ml de solución de Ficoll-Paque (baja endotoxina; Pharmacia) por tubo de poliestireno de 50 ml, en 3 tubos, 30 minutos antes de añadir la sangre. Se calentó la solución de Ficoll-Paque hasta la temperatura ambiente. Se prepararon 3 l de lejía en dilución 1:10 y se usaron para lavar todos los tubos y las pipetas que estuvieran en contacto con la sangre. Se depositó una capa de sangre encima de la solución de Ficoll-Paque sin perturbar la capa de Ficoll, a razón de 1,5 ml de sangre/1 ml de Ficoll-Paque. Se centrifugaron los tubos a 1.700 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente con el freno de la centrífuga apagado. Se retiró tanta capa superior (plasma) como fue posible, minimizando el vacío con objeto de evitar retirar la segunda capa de solución. Se recogió la segunda capa, que contiene los linfocitos B y T, usando una pipeta Pasteur estéril, y se puso en dos tubos de poliestireno de 50 ml. Se diluyó el material recogido con 3 x el volumen de RPMI frío sin aditivos y se centrifugaron los tubos a 1.000 RPM durante 10 minutos. Se retiró el medio por aspiración y se resuspendieron las células de ambos tubos de 50 ml en un total de 10 ml de RPMI frío (con aditivos) y se transfirieron a un tubo de 15 ml. Se contaron las células usando el hemacitómetro y se centrifugaron luego a 1.000 RPM durante 10 minutos. Se retiró el medio y se resuspendieron las células en 4 ml de RPMI. Esta fracción contenía las PBMC.

Aislamiento de las células B a partir de las PBMC

[0173] Se pusieron 100 μl de Dynabeads (anti-hCD19) en un tubo de plástico de 5 ml. Se añadieron 3 ml de PBS estéril a las perlas y se mezclaron y se pusieron en el soporte magnético, y se dejó que se asentaran luego durante 2 minutos. Se retiró la solución usando una pipeta Pasteur. Se añadieron 3 ml de PBS estéril, se mezcló y se puso en el soporte magnético, y se dejó luego que se asentara durante 2 minutos. Se repitió este procedimiento con PBS estéril una vez más para un total de 3 lavados. Se añadieron las PBMC a las perlas y se incubaron, con mezcla, durante 30 minutos a 40°C. Se puso el tubo que contenía las PBMC y las perlas en el soporte magnético durante 2 minutos y se transfirió luego la solución a un nuevo tubo de 5 ml en el soporte magnético. Después de 2 minutos, se transfirió la solución a un nuevo tubo de 15 ml. Se repitió esta etapa cuatro veces más y se recogieron las soluciones

de las primeras cuatro veces en el tubo de 15 ml, y se centrifugó luego a 1.000 RPM durante 5 minutos. Esta etapa produjo la pella para la separación de las células T.

[0174] Se añadieron 100 μl de RPMI (con aditivos) para recoger las perlas y se transfirió la solución a un tubo de 0,7 ml. Se añadieron 10 μl de perlas Dynal Detacha a la suspensión a temperatura ambiente y se dejó rotar durante 45 minutos. Se transfirió la suspensión a un nuevo tubo de 5 ml y se añadieron 3 ml de RPMI (con aditivos). Se puso el tubo en el soporte magnético durante 2 minutos. Se transfirió la solución a un nuevo tubo de 5 ml en el soporte durante 2 minutos y luego a un tubo de 15 ml. Se repitió la etapa previa tres veces más, recogiendo la solución en el tubo de 15 ml. Se centrifugó el tubo de 15 ml a 1.000 RPM durante 10 minutos y se resuspendieron las células en 10 ml de RMPI. Se repitió la etapa de lavado 2 veces más para un total de 3 lavados. Se contaron las células antes de la última centrifugación. Esta etapa completó la purificación de las células B. Se guardaron las células en FCS al 90% y DMSO al 10% y se congelaron a -80°C.

Aislamiento de las células T

[0175] Se preparó la Columna de Enriquecimiento de células T humanas (R&D Systems, kit de columna anti-h CD 3) usando 20 ml de tampón de lavado de columna 1X mezclando 2 ml de tampón de lavado de columna 10X y 18 ml de agua destilada estéril. Se limpió la columna con etanol al 70% y se puso en la parte superior de un tubo de 15 ml. Se retiró la tapa superior de la columna en primer lugar para evitar que entrara aire hacia la parte inferior de la columna. A continuación, se retiró la tapa inferior y se limpió la punta con etanol al 70%. Se dejó que el fluido del interior de la columna drenara en el tubo de 15 ml. Se puso un nuevo tubo estéril de 15 ml bajo la columna después de haber drenado el tampón de la columna hasta el nivel del filtro blanco. Se suspendió la fracción de PBMC carente de células B en 1 ml de tampón y se añadió a la parte superior de la columna. Se dejó incubar a las células con la columna a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se eluyeron las células T de la columna con 4 alícuotas de 2 ml cada una de tampón de lavado de columna 1X. Se centrifugaron las células T recogidas a 1.000 RPM durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en 10 ml de RPMI. Se contaron las células y se centrifugaron una vez más. Se retiró el sobrenadante, para completar la purificación de las células T. Se guardaron las células en FCS al 90% y DMSO al 10% y se congelaron a -80°C.

[0176] Para los procedimientos anteriores, la composición del RPMI contenía un 10% de FCS (inactivado a 56°C durante 45 min.), un 1% de Pen/Strep (100 U/ml de Penicilina, 0,1 μg/ml de Estreptomicina), un 1% de Glutamato, un 1% de piruvato de sodio y 50 μM de 2-ME.

Ensayo citofluorométrico de flujo

[0177] Se incubaron células Ramos (106 células/muestra) en 100 μl de anticuerpo primario (10 μg/ml en PBS-BSA) durante 20 min. a 4°C. Después de 3 lavados con PBS-BSA o HBSS-BSA, se incubaron las células en 100 μl de fragmentos F(ab’)2 marcados con FITC de anticuerpos de cabra anti-IgG humana (Caltaq) durante 20 min. a 4°C. Después de 3 lavados con PBS-BSA y 1 lavado con PBS, se resuspendieron las células en 0,5 ml de PBS. Se realizaron los análisis con un FACSCAN V (Becton Dickinson, San José, California).

Generación de clones de hibridomas

[0178] Se fusionaron esplenocitos de ratones inmunizados con células de mieloma murino SP 2/0 o P 3 x 63Ag8.653 en una proporción de 10:1 usando polietilenglicol al 50% como han descrito previamente de Boer et al. (1988), J. Immunol. Meth. 113: 143. Se resuspendieron las células fusionadas en medio IMDM completo suplementado con hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,01 mM), timidina (0,016 mM) y 0,5 ng/ml de hIL-6 (Genzyme, Cambridge, Massachusetts). Se distribuyeron entonces las células fusionadas entre los pocillos de placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos, de tal forma que cada pocillo contuviera 1 hibridoma en crecimiento como media.

[0179] Después de 10-14 días, se rastrearon los sobrenadantes de las poblaciones de hibridomas en cuanto a producción de anticuerpos específicos. Para el rastreo de la producción de anticuerpos específicos por los clones de hibridomas, se reunieron los sobrenadantes de cada pocillo y se estudiaron en cuanto a especificidad de la actividad anti-CD40 por ELISA en primer lugar. Se utilizaron luego los positivos para la tinción celular fluorescente de células B transformadas con EBV como se describe para el ensayo FACS anterior. Se clonaron las células de hibridomas positivas dos veces por dilución limitante en IMDM/FBS que contenía 0,5 ng/ml de hIL-6.

Ejemplo 1: Producción de anticuerpos anti-CD40

[0180] Se generaron varios anticuerpos monoclonales anti-CD40 antagonistas totalmente humanos del isotipo IgG1. Se usaron ratones transgénicos portadores del locus de la cadena pesada de la IgG1 humana y del locus de la cadena κ humana (tecnología Abgenix γ-1 XenoMouse® (Abgenix; Fremont, California)) para generar estos anticuerpos. Se usaron células SF9 de insecto que expresaban el dominio extracelular de CD40 como inmunógeno. Se fusionaron un total de 31 bazos de ratón con las células SP2/0 de mieloma de ratón para generar 895 anticuerpos que reconocen el CD40 recombinante en ELISA (Tablas 1A y 1B). Como media, aproximadamente un 10% de los hibridomas producidos usando la tecnología Abgenix XenoMouse® pueden contener la cadena ligera lambda de ratón en lugar de la cadena kappa humana. Se seleccionaron los anticuerpos que contenían la cadena ligera lambda de ratón. Se seleccionó un subgrupo de 260 anticuerpos que también mostraban unión al CD40 de la superficie celular para posterior análisis. Se usaron hibridomas estables seleccionados durante una serie de procedimientos de subclonación para posterior caracterización en ensayos de unión y funcionales.

Tabla 1A. Una fusión típica

Título anti-CD40

Fusión #: (1:100K) Eficiencia de la fusión # de pocillos rastreados # de ELISA+ # de superficie celular+

153: 3 100% 960 123 33

154: 4,67 15% 140 0 0

155: 6 ~40% 960 3 3

156: 3,17 ~25% 220 1 0

157: 4,67 90% 960 32 6

158: 4,4 90% 960 23 8

159: 1,17 100% 960 108 18

160: 1,78 90% 960 30 5

Total: 6.120 320 73

Tabla 1B. Resumen de cuatro grupos de fusiones

# de ratones: Hibridomas positivos a ELISA Hibridomas positivos a superficie celular

31: 895 260

Tabla 2. Resumen del grupo inicial de datos con anticuerpos IgG1 anti-CD40

Hibridoma madre: Clones de hibridoma Unión a la superficie celular Antagonista CCDA CDC CMCC # Secuencia de ADN de la región V

131.2F5.8.5.1: +++ ++ ND ND ND

131.2F5: 131.2F5.8.5.9 +++ +++ ++ - 12047 Sí

131.2F5.8.5.11: +++ +++ ++ - 12055 Sí

153.3CSD8D7.8.4.7.1: ++ ND ND ND ND

153.3C5: 153.3C5D8D7.8.4.7.8 ++ ND ND ND ND

153.3C5D8D7.8.4.7.11: +++ +++ + ND ND

153.1D2.9.1: +++ ND ND ND 12067

153.1D2: 153.1D2.9.8 +++ +++ ++ - 12057

153.1D2.9.12: +++ ND ND ND 12068

158.6F3.5.1: +++ +++ ++ - 12054 Sí

158.6F3: 158.6F3.5.7 +++ ND ND ND 12061

158.6F3.5.10: +++ ND ND ND 12062

153.8E2D10D6.12.7: +++ ND ND ND 12075

153.8E2_: 153.8E2D10D6.12.9 +++ ND ND ND 12063

153.8E2D10D6.12.12: +++ +++ ++++ - 12056 Sí

155.2C2E9F12.2.10.4: +++ +/- ND ND 12064

155.2C2: 155.2C2E9F12.2.10.5 +++ ND ND ND 12065

155.2C2E9F12.2.10.6: +/- ND ND ND 12066

166.5E6G12.1: +++ ND ND ND 12069

166.5E6_: 166.5E6G12.3 +++ ND ND ND 12070

166.5E6G12.4: +++ + ND ND 12071

177.8C10: 177.8C10B3H9 +++ ++ ND ND ND

183.4B3E11.6.1.5: ++ ND ND ND ND

183.4B3: 183.4B3E11.6.1.9 ++ ND ND ND ND

183.4B3E11.6.1.10: +++ ++ ND ND ND

183.2G5D2.8.7: +++ +/- ND ND ND

183.2G5: 183.2G5D2.8.8 +++ ND ND ND ND

183.2G5D2.8.9: +++ ND ND ND ND

184.6C11D3.2: ++ ND ND ND 12078

184.6C11: 184.6C11D3.3 ++ ND ND ND 12080

184.6C11D3.6: +/- +/- ND ND 12079

185.3E4F12.5.6: 444 ND ND ND 12072

185.3E4_: 185.3E4F12.5.11 +++ ND ND ND 12073

185.3E4F12.5.12: +++ + ND ND 12074

185.1A9E9.6.1: + ND ND ND ND

185.1A9: 185.1A9E9.6.6 +++ +++ + ND ND

185.9F11E10.3B5.1: +++ ND ND ND ND

185.9F11: 185.9F11E10.3B5.8 +++ ND ND ND ND

185.9F11E103B5.12: +++ +++ ND ND ND

Se identificaron clones de 7 hibridomas madre con actividad antagonista. En base a su potencia antagonista y a sus actividades CCDA relativas, se seleccionaron dos clones de hibridomas. Sus nombres son: 131.2F8.5.9 (5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (12.12).

[0181] Se identificaron clones de otros 7 hibridomas con actividad antagonista (Tabla 2 anterior). En base a su potencia antagonista y a sus actividades CCDA relativas, se seleccionaron dos clones de hibridomas para posterior evaluación. Se denominan 131.2F8.5.9 (5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (12.12). Se muestra el perfil de unión de estos

55 dos anticuerpos a la línea celular de linfoma CD40+ como histograma citométrico de flujo en la Figura 1.

Ejemplo 2: Secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de los anticuerpos anti-CD40 humanos

[0182] Se amplificaron los ADNc codificantes de las regiones variables de los anticuerpos candidatos por PCR, se clonaron y se secuenciaron. Las secuencias de aminoácidos para la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo CHIR-12.12 están expuestas en las Figuras 9A y 9B, respectivamente. Véanse también la SEC. Nº ID.: 2 (cadena ligera para el mAb CHIR-12.12) y la SEC. Nº ID.: 4 (cadena pesada para el mAb CHIR-12.12). En la Figura 9B se muestra una variante de la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12 (véase también la SEC. Nº ID.: 5), que difiere de la SEC. Nº ID.: 4 en que tiene un residuo de serina que substituye al residuo de alanina en la posición 153 65 de la SEC. Nº ID.: 4. En las Figuras 10A y 10B, respectivamente, se muestran las secuencias de nucleótidos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo CHIR-12.12. Véanse también la SEC. Nº ID.: 1

(secuencia codificante para la cadena ligera del mAb CHIR-12.12) y la SEC. Nº ID.: 3 (secuencia codificante para la cadena pesada del mAb CHIR-12.12). En las Figuras 11A y 11B, respectivamente, se muestran las secuencias de aminoácidos para la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo CHIR-5.9. Véanse también la SEC. Nº ID.: 6 (cadena ligera para el mAb CHIR-5.9) y la SEC. Nº ID.: 7 (cadena pesada para el mAb CHIR-5.9). En la Figura 11B se muestra una variante de la cadena pesada para el mAb CHIR-5.9 (véase también la SEC. Nº ID.: 8), que difiere de la SEC. Nº ID.: 7 en que tiene un residuo de serina que substituye al residuo de alanina en la posición 158 de la SEC. Nº ID.: 7.

[0183] Tal como se espera para anticuerpos derivados de hibridomas independientes, existe una variación substancial en las secuencias nucleotídicas en las regiones determinantes de complementariedad (RDC). Se cree que la diversidad en la región RDC3 de VH determina más significativamente la especificidad del anticuerpo.

Ejemplo 3: Efecto de CHIR-5.9 y CHIR-12.12 sobre la interacción CD40/CD40L in vitro

[0184] Los anticuerpos candidatos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 previenen la unión del ligando de CD40 al CD40 de la superficie celular y desplazan el ligando de CD40 preunido. Se estudiaron los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 en cuanto a su capacidad para prevenir la unión del ligando de CD40 a CD40 sobre la superficie de una línea de células de linfoma (Ramos). La unión de ambos anticuerpos (no marcados) previno la posterior unión de PE-ligando de CD40, según se midió mediante ensayos de citometría de flujo (Figura 2A). En un segundo grupo de ensayos, se estudiaron los dos anticuerpos en cuanto a su capacidad para reemplazar el ligando de CD40 preunido al CD40 de la superficie celular. Ambos anticuerpos eran efectivos para competir con el ligando de CD40 preunido, siendo CHIR

5.9 ligeramente más efectivo que CHIR-12.12 (Figura 2B).

Ejemplo 4: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen a un epitopo diferente sobre CD40 que 15B8

[0185] Los anticuerpos monoclonales candidatos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 compiten entre sí por la unión a CD40, pero no con 15B8, un mAb anti-CD40 IgG2 (véase la Publicación Internacional Nº WO 02/28904). Se diseñaron estudios de unión competitiva de anticuerpos que utilizaban Biacore usando chips biosensores CM5 con proteína A inmovilizada mediante copulación de amina, que se usó para capturar cualquiera de los anti-CD40, CHIR-12.12 o 15B8. Se observaron curvas de unión de asociación/disociación normales con concentraciones variables de CD40his (datos no mostrados). Para los estudios competitivos, se capturó CHIR-12.12 o 15B8 sobre la superficie de la proteína A. A continuación, se hizo fluir un complejo de CD40-his/Fab de CHIR-5.9 (100 nM de CD40:1 μM de Fab de CHIR-5.9), a concentraciones variables, a través de la superficie modificada. En el caso de CHIR-12.12, no se observó ninguna asociación del complejo, lo que indica que CHIR-5.9 bloquea la unión de CHIR-12.12 a CD40-his. Para 15B8, se observó asociación del complejo de Fab de CHIR-5.9, lo que indica que CHIR-5.9 no bloquea la unión de 15B8 al sitio de unión de CD40. Sin embargo, la constante de disociación del complejo aumentó dramáticamente (datos no mostrados).

[0186] También se ha determinado que 15B8 y CHIR-12.12 no compiten por la unión a CD40-his. Se montó este experimento capturando CHIR-12.12 sobre el chip biosensor de proteína A, bloqueando los sitios residuales de proteína A con hIgG1 de control, uniendo CD40-his y haciendo fluir luego 15B8 sobre la superficie modificada. 15B8 sí se unía en estas condiciones, lo que indica que CHIR-12.12 no bloquea la unión de 15B8 a CD40.

Ejemplo 5: Propiedades de unión de los hibridomas seleccionados

[0187] Se inmovilizó proteína A sobre chips biosensores de CM5 mediante copulación con amina. Se capturaron anticuerpos monoclonales anti-CD40 humanos, a razón de 1,5 μg/ml, sobre la superficie modificada del biosensor durante 1,5 minutos a 10 μl/min. Se hizo fluir CD40-his soluble recombinante sobre la superficie del biosensor a concentraciones variables. Se diluyeron el anticuerpo y el antígeno en HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM y 0,005% de Surfactante P20 (HBS-EP). Se determinaron la constante cinética y la constante de afinidad usando el programa Biaevaluation con un ajuste modelo de interacción/global 1:1.

[0188] Tal como se muestra en la Tabla 3 a continuación, existe una diferencia de 121 veces mayor en la constante de disociación de CHIR-5.9 y CHIR-12.12, lo que da como resultado una afinidad 24 veces mayor para CHIR-12.12.

Anticuerpo: ka (M-1 s -1) kd (s-1) KD (nM)

Anti-CD40, CHIR-5.9: (12,35 ± 0,64) x 105 (15,0 ± 1,3) x 10-3 12,15 ± 0,35

Anti-CD40, CHIR-12.12: (2,41 ± 0,13) x 105 (1,24 ± 0,06) x 10-4 0,51 ± 0,02

Ejemplo 6: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son potentes antagonistas para la proliferación mediada por CD40 de linfocitos humanos de sujetos normales

[0189] El acoplamiento entre CD40 y el ligando de CD40 induce proliferación de las células B humanas. Se espera que un anticuerpo antagonista anti-CD40 inhiba esta proliferación. Se estudiaron dos anticuerpos candidatos (CHIR

5.9 y CHIR-12.12) en cuanto a su capacidad para inhibir la proliferación inducida por el ligando de CD40 de PBMC de sujetos humanos normales. Se usaron transfectantes de células CHO fijadas con formaldehído que expresaban ligando de CD40 (CD40L) como fuente de ligando de CD40. Se cultivaron PBMC humanas durante 4 días con las células CHO fijadas con formaldehído que expresaban ligando de CD40 en presencia de concentraciones variables del mAb anti-CD40 CHIR-5.9 o CHIR-12.12. Se midió la proliferación por la incorporación de timidina tritiada. Se sometieron las células a pulsos con timidina marcada con tritio a 37°C durante 14-18 horas.

5 [0190] Se vio que ambos anticuerpos eran muy efectivos en la inhibición de la proliferación inducida por ligando de CD40 de PBMC humanas (Tabla 4A, mAb CHIR-5.9, Tabla 4B, mAb CHIR-12.12). Se llevó a cabo el experimento con múltiples donantes de PBMC (n=12 para CHIR-5.9 y n=2 para CHIR-12.12) para asegurarse de que la inhibición observada no era una peculiaridad de las células de un solo donante. Se realizaron valoraciones de seguimiento con

10 4 donantes adicionales de PBMC para el mAb CHIR-12.12, observándose tendencias similares. Se usó un amplio rango de concentraciones de anticuerpo (de 0,01 μg/ml a 100 μg/ml) en estos ensayos. Se pudo conseguir una inhibición casi completa de la proliferación inducida por el ligando de CD40 a una concentración de anticuerpos de 0,1 μg/ml en la mayoría de los casos. La concentración de anticuerpos (pM) para inhibir en un 50% la proliferación de linfocitos inducida por el ligando de CD40 (CI50) para linfocitos de 6 donantes dio una CI50 media (pM) de 47

15 (SD=21; donante 1, 24; donante 2, 66; donante 3, 45; donante 4, 84; donante 5, 30; donante 6, 35), que se compara favorablemente con la CI50 media (pM) de 49,65 mostrada en la Tabla 4B. En base al conjunto actual de datos, ambos anticuerpos candidatos parecen similar en cuanto a su potencia de inhibición de la proliferación inducida por el ligando de CD40 de las PBMC normales.

20 Tabla 4A. Efecto del mAb CHIR-5.9 sobre la proliferación de PBMC inducida por CD40L.

Exp. #: PBMC solas CHO-CD40L solas PBMC+CHO-CD40L Conc. Abs (μg/ml) hulgG1 CHIR-5.9

CPM: % inhibición CPM % inhibición

PBMC010: 1851 1851 1851 1851 121 121 121 121 4436 4436 4436 4436 1 0,25 0,0625 0,0156 5080 -26 5498 -43 6029 -65 5814 -56 2622 74 2907 62 2619 74 1199 131

PBMC011: Donante #1 Donante #2 Donante #3 Donante #4 21622162 2162 2162 22162216 2216 2216 23962396 2396 2396 45524552 4552 4552 178 178 178 178 294 294 294 294 241 241 241 241 133 133 133 133 8222 8222 8222 8222 7873 7873 7873 7873 11021 11021 11021 11021 15301 15301 15301 15301 10 1 0,1 0,01 10 1 0,1 0,01 10 1 0,1 0,01 10 1 0,1 0,01 13137 -84 11785 -61 10758 -43 11322 -53 16679 -164 14148 -117 12422 -85 13870 -112 11641 -7 13528 -30 12176 -14 11895 -10 22098 -64 19448 -39 18398 -29 22767 -70 2252 101 1438 115 1249 119 4705 602362 103 1202 124 756 133 6606 242631 100 1450 114 990 120 5357 683768 109 2040 125 1728 128 9481 55

PBMC012: 777 777 777 777 117 117 117 117 6041 6041 6041 6041 10 1 0,1 0,01 7327 -25 6212 -3 7006 -19 7524 -29 2150 76 1550 87 828 101 1213 94

PBMC: 1857 73 7889 100 9399 -25 3379 76

014

1857: 73 7889 20 8120 -4 3870 67

1857: 73 7889 4 8368 -8 2552 90

1857: 73 7889 0,8 9564 -28 1725 103

PBMC-: Donante 3203 127 10485 100 15425 -69 1497 126

015: #1

3203: 127 10485 20 11497 -14 1611 124

3203: 127 10485 4 11641 -16 1359 128

3203: 127 10485 0,8 12807 -32 1490 126

Donante: 3680 175 15145 100 21432 -56 1792 118

#2

3680: 175 15145 20 16998 -16 1779 118

3680: 175 15145 4 17729 -23 1965 117

3680: 175 15145 0,8 17245 -19 2217 115

Donante: 2734 152 19775 100 22967 -19 1664 107

#3

2734: 152 19775 20 21224 -9 1848 106

2734: 152 19775 4 20658 -5 1534 108

2734: 152 19775 0,8 18923 5 1262 110

PBMC016: 1118 36 13531 0,1 10928 21 745 103

1118 1118: 36 36 13531 13531 0,05 0,01 11467 11942 17 13 962 3013 102 85

PBMC: 962 75 12510 1 13597 -9 258 107

017

% Medio: -42 107

de

inhibición

de

PBMC

humanas

a 100

μg/ml % Medio: -69 98

de

inhibición

de

PBMC

humanas

a 10

μg/ml % Medio: -41 107

de

inhibición

de

PBMC

humanas

a 1 μg/ml % Medio: -28 117

de

inhibición

de

PBMC

humanas

a 0,1

μg/ml % Medio: -44 64

de

inhibición

de

PBMC

humanas

a 0,01 μg/ml

% Medio de inhibición de PBMC humanas -35 101

% de inhibición: 100-(CPM con Abs-PBMC solas-CHO-CD40L solas)/(CPM de PBMC+CHO-CD40L-PBMC solasCHO-CD40L solas)*100%

[0191] Además de células B, las PBMC humanas también incluyen células "natural killer", que pueden mediar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (CCDA). Para clarificar el mecanismo de la inhibición mediada por anticuerpos de la proliferación, se realizaron ensayos con células B purificadas a partir de PBMC humanas. De forma

5 similar a los resultados obtenidos con PBMC, ambos anticuerpos inhibían potentemente la proliferación inducida por el ligando de CD40 de células B purificadas (Tabla 5, n=3). Estos datos demuestran que la actividad antagonista de los anticuerpos candidatos, y no el mecanismo de la CCDA, es la causa de la inhibición de la proliferación en estos ensayos.

Ejemplo 7: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 no inducen una fuerte proliferación de las células B humanas de sujetos normales

[0192] El ligando de CD40 activa la proliferación de las células B normales y de las células de linfomas de células B. La unión de algunos anticuerpos anti-CD40 (agonistas) puede proporcionar una señal estimulatoria similar para la proliferación de células B normales y cancerosas. Anticuerpos con fuerte actividad estimulatoria de las células B no son candidatos adecuados para el tratamiento terapéutico de linfomas de células B. Se estudiaron los dos anticuerpos candidatos en cuanto a su capacidad para inducir la proliferación de las células B de donantes voluntarios normales. Se cultivaron las células B purificadas por centrifugación en gradiente Ficoll-Hypaque Plus a partir de PBMC de donantes normales en placas de 96 pocillos con concentraciones variables de anticuerpos candidatos (rango de 0,001 a 100 μg/ml) durante un total de 4 días. En el grupo control positivo, se cultivaron las PBMC con células CHO fijadas con formaldehído que expresaban el ligando de CD40. Se midió la proliferación de las células B por la incorporación de timidina tritiada a 37°C durante 14-18 horas. Mientras que el ligando de CD40 presentado sobre células CHO inducía una vigorosa proliferación de las células B, que daba lugar a un índice de estimulación (IE) medio de 145, los anticuerpos candidatos inducían sólo una débil proliferación, con un índice de estimulación de 2,89 y 5,08 para CHIR-12.12 y CHIR-5.9, respectivamente (n=3) (Tabla 6).

Tabla 6. Proliferación de células B purificadas a partir de sujetos humanos normales en respuesta a los mAb anti- CD40 candidatos

Exp. #: Donante # Células B Células B+CHO-CD40L Conc. Abs (μg/ml) Células B+huIgG1 Células B+CHIR-5.9 Células B+CHIR-12.12

CPM
CPM: Índice Es. (1) CPM Índice Es. (2) CPM Índice Es. (2) CPM Índice Es. (2)

Célula B004 congelada 1 418 3132 7,49 100 498 1,19 418 3132 20 245 0,59 418 3132 4 241 0,58 418 3132 0,8 376 0,90: 401 0,96 232 0,56 232 0,56 298 0,71 458 1,10 370 0,89 211 0,50 230 0,55

Congelada 2 81 27240 336,30 100 34 0,42 81 27240 20 48 0,59 81 27240 4 41 0,51 81 27240 0,8 34 0,42: 454 5,60 706 8,72 567 7,00 736 9,09 122 1,51 255 3,15 367 4,53 408 5,04

Célula B005 3 267 24552 91,96 1 691 2,59 267 24552 0,1 686 2,57 267 24552 0,01 808 3,03 267 24552 0,001 567 2,12: 2101 7,87 2267 8,49 2203 8,25 846 3,17 1223 4,58 1557 5,83 1027 3,85 826 3,09

Índice de estimulación (IE) medio 145,25Índice Es. (1): = CPM (células B+CHO-CD40L)/CPM (células B solas)Índice Es. (2): = CPM (células B+Abs)/CPM (PBMC solas) 1,29: 5,08 2,88

[0193] Además de células B, las PBMC humanas incluyen tipos celulares que llevan receptores de Fc (FcR) para moléculas de IgG1 que pueden proporcionar entrecruzamiento de anticuerpos anti-CD40 unidos a CD40 sobre las células B. Este entrecruzamiento podría aumentar potencialmente la actividad estimulatoria de los anticuerpos anti-CD40. Para confirmar la falta de actividad estimulatoria de las células B de los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 en presencia de células entrecruzantes, se realizaron experimentos de proliferación con PBMC totales que contenían células B, así como células FcR+. Los datos de estos experimentos (Tabla 7A, mAb CHIR-5.9; Tabla 7B, mAb CHIR12.12) confirman que estos anticuerpos candidatos, incluso en presencia de células portadoras de FcR, en general no estimulan la proliferación de las células B por encima de la proliferación de fondo inducida por la IgG1 humana control (n=10). El ligando de CD40 inducía un índice de estimulación (IE) medio de 7,41. Los IE medios con los anticuerpos candidatos eran de 0,55 y 1,05 para CHIR-12.12 y CHIR-5.9, respectivamente. Sólo una de las 10 PBMC donantes estudiadas mostró alguna respuesta estimulatoria al anticuerpo CHIR-5.9 (donante #2 en la Tabla 7). La falta de actividad estimulatoria por parte de los mAbs candidatos fue además confirmada midiendo la proliferación de PBMC en respuesta a los anticuerpos anti-CD40 candidatos inmovilizados sobre la superficie de plástico de los pocillos de cultivo (n=2). Los IE medios con estimulación con ligando de CD40, CHIR-12.12 y CHIR

5.9 eran de 22, 0,67 y 1,2, respectivamente (Tabla 8). Tomados conjuntamente, estos datos muestran que los anticuerpos anti-CD40 candidatos no poseen fuertes propiedades estimulatorias de las células B.

Tabla 7A. Proliferación de PBMC de sujetos humanos normales en respuesta al mAb CHIR-5.9. Tabla 7B. Proliferación de PBMC de sujetos humanos normales en respuesta al mAb CHIR-12.12.

Exp. #: PBMC PBMC+CHO-CD40L Conc. Abs (μg/ml) PBMC+huIgG1 PBMC+CHIR-5.9

CPM: Índice (1) CPM Índice (2) CPM Índice (2)

PBMC010 1417 5279 3,73 1417 5279 1417 5279 1417 5279: 1 0,25 0,0625 0,0156 1218 0,86 1712 1,21 1449 1,02 1194 0,84 597 3 4,22 481 5 3,40 364 2 2,57 324 2 2,29

PBMC011 Donante #1 2138 8247 3,86 2138 8247 2138 8247 2138 8247 Donante #2 2374 1156 1 4,87 2374 1156 1 2374 1156 1 2374 1156 1 Donante #3 3229 7956 2,46 3229 7956 3229 7956 3229 7956 Donante #4 4198 1431 4 3,41 4198 1431 4 4198 1431 4 4198 1431 4: 101 0,1 0,01 101 0,1 0,01 101 0,1 0,01 101 0,1 0,01 3047 1,43 2726 1,28 2026 0,95 2424 1,13 4966 2,09 2544 1,07 2177 0,92 4672 1,97 5035 1,56 2826 0,88 2277 0,71 3078 0,95 5012 1,19 3592 0,86 5298 1,26 5758 1,37 317 7 1,49 361 7 1,69 201 1 0,94 186 0 0,87452 3 1,91 244 5 1,03 146,2 0,62 189 6 0,80211 9 0,66 109 9 0,34 105 2 0,33 189 9 0,59517 6 1,23 470 2 1,12 431 9 1,03 540 0 1,29

PBMC014 2350 8787 3,74 2350 8787 2350 8787 2350 8787: 10020 4 0,8 2722 1,16 2315 0,99 2160 0,92 2328 0,99 247 1 1,05 244 7 1,04 165 9 0,71 167 1 0,71

PBMC015 Donante #1 3284 1293 6 3,94 3284 1293 6 3284 1293 6 3284 1293 6 Donante #2 6099 1912 1 3,14 6099 1912 1 6099 1912 1 6099 1912 1 Donante #3 2479 1982 6 8,00 2479 1982 6 2479 1982 6 2479 1982 6: 10020 4 0,8 10020 4 0,8 10020 4 0,8 3598 1,10 2751 0,84 3135 0,95 4027 1,23 2999 0,49 4025 0,66 4496 0,74 3834 0,63 3564 1,44 1874 0,76 1779 0,72 2274 0,92 168 2 0,51 156 2 0,48 110 5 0,34 141 9 0,43510 4 0,84 391 7 0,64 334 1 0,55 413 9 0,68120 4 0,49 782 0,32 634 0,26 937 0,38

PBMC016 1148 1578 9 13,75 1148 1578 9 1148 1578 9: 0,10,05 0,01 1255 1,09 1284 1,12 1446 1,26 103 6 0,90 871 0,76 952 0,83

IE medio de las PBMC: 5,09 1,06 1,03

Índice (1): = (PBMC+CHO-CD40L)/PBMCÍndice (2): = (PBMC+Abs)/PBMC

Exp. #: PBMC PBMC+CHO-CD40L Conc. Abs (μg/ml) PBMC+huIgG1 PBMC+CHIR-12.12

CPM: Índice (1) CPM Índice (2) CPM Índice (2)

PBMC025: Donante #1 40514051 4051 4051 42292 10,44 42292 42292 42292 0,10,01 0,001 0,0001 2909 0,72 4725 1,17 8080 1,99 4351 1,07 2451 0,61 8924 2,20 8782 2,17 4342 1,07

Donante #2: 22602260 2260 2260 14987 6,63 14987 14987 14987 0,10,01 0,001 0,0001 2538 1,12 3524 1,56 3159 1,40 2801 1,24 6741 2,98 8921 3,95 4484 1,98 2533 1,12

PBMC026: Donante #1 20852085 2085 2085 18313 8,78 18313 18313 18313 0,10,01 0,001 0,0001 1386 0,66 2871 1,38 2602 1,25 1709 0,82 2761 1,32 3162 1,52 3233 1,55 1766 0,85

Donante #2: 676676 676 676 18054 26,71 18054 18054 18054 0,10,01 0,001 0,0001 660 0,98 2864 4,24 693 1,03 984 1,46 2229 3,30 1238 1,83 1507 2,23 811 1,20

PBMC027: Donante #1 27422742 2742 2742 13028 4,75 13028 13028 13028 0,10,01 0,001 0,0001 4725 1,72 4575 1,67 3218 1,17 5107 1,86 2795 1,02 5353 1,95 3501 1,28 4272 1,56

Donante #2: 13381338 1338 1338 11901 8,89 11901 11901 11901 0,10,01 0,001 0,0001 1633 1,22 1520 1,14 1517 1,13 1047 0,78 1943 1,45 5132 3,84 2067 1,54 2076 1,55

PBMC028: Donante #1 42884288 4288 4288 22547 5,26 22547 22547 22547 0,10,01 0,001 0,0001 3686 0,86 3113 0,73 4414 1,03 2452 0,57 2525 0,59 2047 0,48 3515 0,82 4189 0,98

Donante #2: 21482148 2148 2148 54894 25,56 54894 54894 54894 0,10,01 0,001 0,0001 9127 4,25 4566 2,13 5285 2,46 4667 2,17 5574 2,59 6515 3,03 5919 2,76 4298 2,00

PBMC029: Donante #1 609609 609 609 10054 16,51 10054 10054 10054 0,10,01 0,001 0,0001 359 0,59 473 0,78 461 0,76 625 1,03 363 0,60 956 1,57 1159 1,90 558 0,92

Donante #2: 77377737 7737 7737 23132 2,99 23132 23132 23132 0,10,01 0,001 0,0001 4940 0,64 6041 0,78 5098 0,66 5135 0,66 3493 0,45 3644 0,47 5232 0,68 5241 0,68

PBMC030: Donante #1 41644164 4164 4164 57205 13,74 57205 57205 57205 101 0,1 0,01 2713 0,65 3627 0,87 4590 1,10 4384 1,05 1046 0,25 1576 0,38 1512 0,36 2711 0,65

Donante #2: 33243324 3324 3324 53865 16,20 53865 53865 53865 101 0,1 0,01 6376 1,92 4720 1,42 3880 1,17 3863 1,16 4731 1,42 5219 1,57 5869 1,77 5657 1,70

PBMC032: Donante #1 1808 15271 8,45 10 2349 1,30 4790 2,65

1808: 15271 1 3820 2,11 5203 2,88

1808: 15271 0,1 2098 1,16 6332 3,50

1808: 15271 0,01 1789 0,99 5005 2,77

IE medio de las PBMC: 11,92 1,30 1,62

Índice (1): = CPM de (PBMC+CHO-CD40L)/CPM de PBMCÍndice (2): = CPM de (PBMC+Abs)/CPM de PBMC

Ejemplo 8: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son capaces de matar a las células diana portadoras de CD40 por CCDA

[0194] Los anticuerpos candidatos pueden matar a las células diana portadoras de CD40 (líneas de linfoma) mediante el mecanismo de CCDA. Tanto CHIR-5.9 como CHIR-12.12 son anticuerpos totalmente humanos del 5 subtipo IgG1 y se espera que tengan capacidad de inducir la muerte de las células diana mediante el mecanismo de CCDA. Se les estudió en cuanto a su capacidad para matar a líneas de células cancerosas en ensayos in vitro. Se seleccionaron dos líneas celulares de linfoma humanas (Ramos y Daudi) como células diana para estos ensayos. Se usaron PBMC o células NK enriquecidas de 8 donantes voluntarios normales como células efectoras en estos ensayos. Se observó una respuesta CCDA más potente con CHIR-12.12 en comparación con CHIR-5.9 frente a las 10 células diana de ambas líneas celulares cancerosas de linfoma. Las líneas celulares de linfoma también expresan CD20, el antígeno diana para rituximab (Rituxán®), lo que permitió la comparación de la actividad CCDA de estos dos mAb candidatos con la actividad CCDA de rituximab. Para la línea celular de linfoma diana, se observó una lisis específica media del 35%, 59% y 47% para CHIR-5.9, CHIR-12.12 y rituximab, respectivamente, cuando se usaron a una concentración de 1 μg/ml (Tabla 9). Ninguno de los dos anticuerpos mostró mucha actividad en los ensayos de

15 citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

Tabla 9. Muerte dependiente de mAb anti-CD40 de líneas celulares de linfoma por CCDA.

Muerte dependiente de mAb anti-CD40 de líneas celulares de linfoma por CCDA.

Exp. #: Célula efectora Razón E:T Células diana: Línea celular de linfoma humana (Ramos o Daudi)

% Lisis IgG1: Conc. Abs (μg/ml) CHIR-5.9 CHIR-12.12 Rituxán

% Lisis: % Lisis% lisis IgG1 % Lisis % Lisis% lisis IgG1 % Lisis % Lisis% lisis IgG1

CCDA005: huNK 3 17,05 5 30,75 13,70 65,22 48,17 ND ND

Alarmor Blue: huNK 3 40,81 5 58,62 17,81 87,87 47,06 ND ND

CCDA006: huNK 2 -3,09 10 3,50 6,59 43,71 46,8 34,82 37,91

Alarmor Blue: -8,62 1 -10,10 -1,48 45,13 53,75 37,07 45,69

-11: 0,1 -14,80 -3,80 39,82 50,82 33,61 44,61

-4,54: 0,01 2,53 7,07 50,07 54,61 28,49 33,03

51Cr: huNK 5 1,5 10 32,09 30,59 47,24 45,742 ND ND

2,4: 1 18,01 15,61 37,42 35,022 ND ND

2,5: 0,1 14,67 12,17 37,63 35,131 ND ND

CCDA009: huNK 10 2,32 5 66,20 63,88 97,70 95,38 86,2 83,88

Calceína AM: 0,48 1 67,20 66,72 123,00 122,52 88,2 87,72

-1,43: 0,2 78,40 79,83 118,00 119,43 88,8 90,23

3,39: 0,04 69,10 65,71 109,00 105,61 84,9 81,51

CCDA011: huNK 8 3,18 1 15,36 12,19 51,59 48,42 22,44 19,27

Calceína AM: 4,58 0,01 7,39 2,81 46,80 42,22 14,68 10,10

5,41: 0,002 6,35 0,94 5,10 -0,31 9,58 4,16

7,03: 0,0004 7,76 0,73 5,99 -1,04 5,99 -1,04

CCDA012: huNK 10 13,34 10 73,31 59,97 117,80 104,46 50,75 37,31

Calceína AM: 13,50 1 74,76 61,26 88,64 75,14 65,97 52,47

12,27: 0,01 58,52 46,25 72,88 60,61 50,16 37,89

13,61: 0,005 57,50 43,89 69,45 55,84 39,28 25,67

11,95: 0,001 56,81 44,86 65,17 53,22 33,07 21,12

CCDA013: PBMC 100 2,54 1 21,03 18,49 37,94 35,40 32,28 29,74

51Cr: 2,45 0,1 15,50 13,05 30,82 28,37 27,18 24,73

2,92: 0,01 14,53 11,61 22,59 19,67 12,79 9,87

2,78: 0,001 3,90 1,12 8,99 6,21 3,13 0,35

CCDA014: PBMC 100 4,64 10 53,54 48,90 56,12 51,48 ND ND

51Cr: 4,64 1 46,84 42,20 43,00 38,36 ND ND

4,64: 0,1 45,63 40,99 39,94 35,30 ND ND

4,64: 0,01 7,73 3,09 9,79 5,15 ND ND

4,64: 0,001 8,83 4,19 10,81 6,17 ND ND

% de lisis medio a una concentración de mAbs de 1 μg/ml: 3,51 59,03 47,23

*La muerte de más del 100% se debe a muerte incompleta por el detergente usado para el control del 100% de muerte.

Ejemplo 9: CD40 está presente sobre la superficie de células LNH de pacientes a los que se ha realizado biopsia de nódulos linfáticos

5 [0195] Se aislaron células LNH de nódulos linfáticos biopsiados de pacientes y se conservaron en nitrógeno líquido hasta su uso. La viabilidad celular en el momento del análisis superaba el 90%. Se tiñeron las células de dos pacientes sensibles a rituximab y tres resistentes a rituximab (cinco pacientes en total) o bien con un 15B8-FITC con marcaje directo, o bien con 15B8 más anti-huIgG2-FITC y se analizaron por citometría de flujo. Se vio que las células LNH de todos los pacientes expresaban CD40. La Tabla 10 muestra que una media de un 76% de las células LNH

10 expresan CD40 (un rango del 60-91%).

Tabla 10

ID del pacientea: Tipo de pacienteb % positivoc

MS81d: 15B8e

B: RC n.d.f 91,02

J: RC n.d. 60,36

H: NR n.d. 85,08

H: NR 72,24 81,19

K: NR n.d. 70,69

L: NR n.d. 66,82

% positivo medio 76

a Pacientes con LNH tratados con mAb anti-CD20 b Respuesta de los pacientes al mAb anti-CD20; RC=respondedor completo; NR= no respondedor c % de células en el umbral de los linfocitos que se tiñen positivamente d MS81, mAb anti-CD40 agonista e 15B8, mAb anti-CD40 antagonista f n.d., no determinado

15 Ejemplo 10: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 no estimulan la proliferación de las células cancerosas de los nódulos linfáticos de pacientes con LNH

[0196] Se sabe que el ligando de CD40 proporciona una señal estimulatoria para la supervivencia y la proliferación

de las células de linfoma de pacientes con LNH. La unión de algunos anticuerpos anti-CD40 (agonistas) puede 20 proporcionar una señal estimulatoria similar para la proliferación de las células cancerosas del paciente. Anticuerpos

con una fuerte actividad estimulatoria de las células B no son candidatos adecuados para el tratamiento terapéutico

de los linfomas de células B. Se estudiaron los dos anticuerpos candidatos en cuanto a su capacidad para inducir la

proliferación de las células LNH de 3 pacientes. Se cultivaron las células aisladas de biopsias de nódulos linfáticos

(NL) con concentraciones variables de los anticuerpos candidatos (rango de 0,01 a 300 μg/ml) durante un total de 3 25 días. Se midió la proliferación celular por la incorporación de timidina tritiada. Ninguno de los dos mAbs candidatos

inducía proliferación alguna de las células cancerosas a ninguna de las concentraciones estudiadas (Tabla 11). Los

anticuerpos, incluso en presencia de IL-4, un factor de crecimiento de las células B, exógenamente añadida, no

inducían la proliferación de las células LNH (estudiado en una de las tres células de los pacientes). Estos resultados

indican que CHIR-5.9 y CHIR-12.12 no son anticuerpos anti-CD40 agonistas y no estimulan la proliferación in vitro 30 de las células LNH de los pacientes.

Tabla 11. Proliferación de células cancerosas de NL de pacientes con LNH en respuesta a los mAbs anti-CD40 candidatos

Donante #: Conc. Abs (μg/ml) CPM Índice Es. CPM células + CHIR12.12 Índice Es. CPM células + MS81 Índice Es.

Células + IgG1: Células + CHIR-5.9 CHIR-5.9 CHIR-12.12 MS81

PP: 0,01 180 203 1,23 133,67 0,74 ND ND

0,1: 107,5 151,67 1,41 136 1,27 ND ND

1: 130,67 206,67 1,58 197,33 1,51 179 1,37

10: 152,5 245 1,61 137,33 0,90 871,67 5,71

100: 137,67 332,33 2,41 157,33 1,14 ND ND

300: 137,67 254,33 1,85 100,67 0,73 ND ND

MM: 0,01 165 180,33 1,09 124 0,75 ND ND

0,1: 180,5 149,67 0,83 111,33 0,62 ND ND

1: 62 109,67 1,77 104,67 1,69 ND ND

10: 91,5 93,33 1,02 100 1,09 763 8,34

100: 123 173 1,41 105,33 0,86 ND ND

300: 109 183,67 1,69 157 1,44 ND ND

BD (IL-4): 0,01 1591,5 1623,67 1,02 1422 0,89 ND ND

0,1: 1405 1281 0,91 1316,33 0,94 ND ND

1: 1526 1352,33 0,89 1160 0,76 1508,33 0,99

10: 1450 1424 0,98 1244 0,86 4146,67 2,86

100: 1406,67 1497,67 1,06 1255,33 0,89 ND ND

300: 1410,33 1466,67 1,04 1233 0,87 ND ND

5 Ejemplo 11: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 pueden bloquear la proliferación mediada por el ligando de CD40 de las células cancerosas de pacientes con linfoma no Hodgkin

[0197] El acoplamiento entre CD40 y el ligando de CD40 induce proliferación de las células cancerosas de pacientes con LNH. Se espera que un anticuerpo antagonista anti-CD40 inhiba esta proliferación. Se estudiaron los dos 10 anticuerpos anti-CD40 candidatos a concentraciones variables (de 0,01 μg/ml a 100 μg/ml) en cuanto a su capacidad para inhibir la proliferación inducida por el ligando de CD40 de células LNH de pacientes. Se cultivaron células LNH de pacientes en suspensión sobre un alimentador que expresaba CD40L en presencia de IL-4. Se midió la proliferación de las células LNH por la incorporación de 3H-timidina. Se vio que ambos anticuerpos eran muy efectivos en la inhibición de la proliferación inducida por el ligando de CD40 de las células LNH (Tabla 12, n=2). Se

15 pudo conseguir una inhibición prácticamente completa de la proliferación inducida por el ligando de CD40 a una concentración de anticuerpos de 1,0 a 10 μg/ml.

Tabla 12. Inhibición de la proliferación inducida por el ligando de CD40 de células cancerosas de los NL de pacientes con LNH 20

Paciente: Conc. Abs (μg/ml) CPM IgG1 CHIR-5.9 CHIR-12.12 Rituximab

CPM: % Inhibición CPM % Inhibición CPM % Inhibición

BD: 0,01 0,1 1 10 100 29525,5 29554 29486,67 29710 29372,33 25369 20265,33 6785,33 506,33 512,33 14 31 77 98 98 24793 13671 453 371 386,67 16 54 98 99 99 29490,329832,726355,329427,3ND 0 -1 11 1 ND

PP: 0,01 0,1 1 10 100 23572 22520 23535,67 23101,5 23847,33 23229,33 19092,33 1442,33 608,67 ND 1 15 94 97 ND 23666 17197 802,67 221,33 252 0 24 97 99 99 25317,326349,726515,725478,3ND -7 -17 -13 -10ND

% Inhibición: 100-(CPM con Abs de ensayo/CPM con mAb control)*100%

Ejemplo 12: Efecto de CHIR-5.9 sobre el número de células LNH viables cuando se cultivan con células portadoras de ligando de CD40

25 [0198] Se investigaron los efectos de CHIR-5.9 sobre los números de células LNH viables cuando se cultivan con células portadoras de ligando de CD40 a lo largo de un período prolongado de tiempo (días 7, 10 y 14). La señalización mediada por el ligando de CD40 a través de CD40 es importante para la supervivencia de las células B. Este conjunto de experimentos evaluó el efecto de anticuerpos anti-CD40 sobre los números de células LNH los días 7, 10 y 14. Se cultivaron células LNH de cinco pacientes en suspensión sobre células alimentadoras irradiadas que

expresaban CD40L en presencia de IL-4. Se añadieron los anticuerpos IgG humana de control y CHIR-5.9 a concentraciones de 10 μg/ml el día 0 y el día 7. Se contaron las células viables bajo cada condición el día especificado. Los números celulares en el grupo control (IgG) aumentaron con el tiempo tal y como se esperaba. Se recuperaron números reducidos de células de los cultivos tratados con CHIR-5.9 en comparación con el grupo control. Se observaron los mayores niveles de reducción en los números de células por el anticuerpo CHIR-5.9 el día 14, y éstos eran como media del 80,5% (rango de 49-94%) en comparación con el control de isotipo (n=5). Estos datos están resumidos en la Tabla 13.

Tabla 13. Efecto del anticuerpo anti-CD40 (CHIR-5.9/5.11) sobre los números de células de pacientes con LNH a lo largo de un prolongado período de cultivo (día 7, 10 y 14)

Paciente: Días en cultivo Números de células viables % de reducción en comparación con el control de IgG

IgG: mAb CHIR-5.9/5.11

PS: 0 7 10 14 100000 0 935000 127090 0 102910 0 1000000 447500 504100 525000 0,0052,1460,3448,98

MT: 0 7 10 14 100000 0 267600 683400 145000 0 1000000 182500 191600 225000 0,0031,8071,9684,48

BRF: 0 7 10 14 250000 145000 207500 570500 250000 86667 65000 33330 0,0040,2368,679416

DP: 0 7 10 14 250000 188330 235000 428330 250000 136670 128330 58330 0,0027,4345,3986,38

PP: 0 7 10 14 250000 270000 311670 458330 250000 176670 128330 53330 0,0034,5758,8388,36

* % de reducción en comparación con los Abs control=100-(Abs de ensayo/Abs control)*100

Ejemplo 13: CHIR-5.9 y CHIR-12-12 son capaces de matar a las células cancerosas de los nódulos linfáticos de pacientes con LNH por CCDA

[0199] Tanto CHIR-5.9 como CHIR-12.12 son anticuerpos totalmente humanos de isotipo IgG1 y se vio que inducían la muerte de líneas celulares de linfoma in vitro por el mecanismo de CCDA (Tabla 9). Se estudiaron en cuanto a su capacidad para matar a las células cancerosas de un solo paciente con LNH en ensayos in vitro. Se usaron células NK enriquecidas de donantes voluntarios normales, o bien frescas tras su aislamiento, o bien después de cultivarlas durante la noche a 37°C, como células efectoras en este ensayo. Se obtuvieron resultados similares tanto con células NK recién aisladas como con células NK usadas después de su cultivo durante la noche. Se observó el mayor nivel de CCDA con CHIR- 12.12 en comparación con CHIR-5.9 frente a las células LNH del paciente. Las células LNH también expresan CD20, el antígeno diana para el rituximab (Rituxán®), lo que permitió comparar la actividad CCDA de estos dos mAbs candidatos con rituximab. El anticuerpo CHIR-12.12 y rituximab muestran un nivel similar de actividad CCDA, obteniendo CHIR-5.9 puntuaciones más bajas en este ensayo. Estos datos están mostrados en las Figuras 3A y 3B.

Ejemplo 14: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 pueden bloquear la supervivencia y la proliferación mediadas por CD40 de las células cancerosas de pacientes con LLC

[0200] Los anticuerpos candidatos pueden bloquear la supervivencia y la proliferación mediadas por CD40 de las células cancerosas de pacientes con LLC. Se cultivaron células LLC de pacientes en suspensión sobre células CHO fijadas con formaldehído que expresaban CD40L bajo dos condiciones diferentes: adición de anticuerpo IgG de isotipo humano (control) y adición de anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12. Se añadieron todos los anticuerpos a concentraciones de 1, 10 y 100 μg/ml en ausencia de IL-4. Se realizaron los recuentos celulares a las 24 y 48 h mediante un ensayo MTS. Se recuperaron números reducidos de células de los cultivos tratados con CHIR-5.9- (n=6) y CHIR-12.12- (n=2) en comparación con el grupo control. Se observaron las mayores diferencias en los números de células entre el cultivo tratado con el mAb anti-CD40 y el cultivo tratado con el anticuerpo control en el punto de tiempo de las 48 h. Estos datos están resumidos en la Tabla 14.

Tabla 14. Efecto de los anticuerpos candidatos sobre la supervivencia y la proliferación inducidas por CD40 de células cancerosas de pacientes con LLC medido a las 48 h del inicio del cultivo

Paciente #: Conc. Ab (μg/ml) Números de células relativos % Reducción en los números de células*

IgG1: CHIR5.9/5.11 CHIR-12.12 RDC-5.9/5.11 RDC-12.12

1: 1 10 100 269,31 101,58 130,71 25,27 33,07 40,16 ND ND ND 90,62 67,44 69,28 ND ND ND

2: 1 10 100 265,55 227,57 265,99 75,8 128,5 6,4 ND ND ND 71,46 43,53 97,59 ND ND ND

3: 1 10 100 85,9 70,44 77,65 35,39 39,51 20,95 ND ND ND 58,80 43,91 73,02 ND ND ND

4: 1 10 100 80,48 63,01 55,69 15,03 19,51 3,65 ND ND ND 81,32 69,04 93,45 ND ND ND

5: 1 90,63 91,66 89,59 -1,14 1,15

10: 78,13 82,28 60,41 -5,31 22,68

100: 63,53 86,47 39,59 -36,11 37,68

6: 1 130,21 77,6 71,88 40,40 44,80

10: 131,77 78,13 73,96 40,71 43,87

100: 127,08 76,56 82,29 39,75 35,25

Ejemplo 15: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 muestran actividad antitumoral en modelos animales. Farmacología/eficacia in vivo

[0201] Se espera que los mAbs candidatos produzcan efectos farmacológicos deseados para reducir la carga tumoral por cualquiera, o ambos, de dos mecanismos antitumorales, bloqueo de la señal de proliferación/supervivencia e inducción de CCDA. Los modelos de xenoinjertos de linfomas humanos actualmente disponibles utilizan líneas celulares de linfoma a largo plazo que, contrariamente a las células cancerosas primarias, no dependen de la estimulación por CD40 para su crecimiento y supervivencia. Por lo tanto, no se espera que el componente de la actividad antitumoral de estos mAbs basada en el bloqueo de la señal de proliferación/supervivencia del tumor contribuya a la eficacia antitumoral en estos modelos. La eficacia en estos modelos depende a la CCDA, el segundo mecanismo antitumoral asociado a los mAbs CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Se valoraron dos modelos de linfoma humano de xenoinjerto basados en las líneas celulares Namalwa y Daudi en cuanto a las actividades antitumorales de los mAbs candidatos. Para demostrar aún más su actividad terapéutica, se evaluaron estos mAbs candidatos en un modelo de linfoma humano de xenoinjerto no estadificado y estadificado basado en la línea celular Daudi.

Resumen de los datos de eficacia in vivo

[0202] Cuando se administró intraperitonealmente (i.p.) una vez por semana durante un total de 3 dosis, CHIR12.12, uno de los dos mAbs candidatos, inhibía significativamente el crecimiento del linfoma de células B no estadificado agresivo (Namalwa) de un modo dosis-dependiente (Figura 4). El segundo mAb candidato, CHIR-5.9, fue estudiado solamente a una única dosis en este estudio y resultó ser menos efectivo que CHIR-12.12 a la misma dosis. Es interesante el hecho de que se vio que CHIR-12.12 era más eficaz en este modelo que rituximab. Es posible que la menor eficacia por parte de rituximab pudiera ser debida a una baja expresión de CD20 en la línea celular de linfoma Namalwa. La eficacia observada con los mAbs candidatos tiene mayor importancia, ya que sólo es operativo uno de los dos mecanismos de muerte de las células cancerosas (CCDA) en el modelo actual de linfoma de xenoinjerto. Se espera que dos mecanismos de muerte, CCDA y bloqueo de la señal de supervivencia, contribuyan a las actividades antitumorales en pacientes humanos con linfomas. Esto aumentará probablemente la posibilidad de conseguir eficacia en pacientes humanos con linfomas. Los mAbs anti-CD40 candidatos también mostraron una tendencia hacia la inhibición del crecimiento tumoral en un segundo modelo de linfoma de células B (modelo de Daudi no validado, datos no mostrados). En estudios de seguimiento, los dos anticuerpos candidatos mostraron tener una eficacia antitumoral dependiente de dosis en los modelos de linfoma de Daudi tanto no estadificado como estadificado (Figuras 5 y 6, respectivamente). En el modelo de Daudi estadificado, el mAb CHIR

12.12 resultó ser más eficaz en la reducción del volumen tumoral que una dosis similar de Rituxán®.

Modelos de linfoma de células B humano de xenoinjerto

[0203] Para asegurar un crecimiento tumoral consistente, se irradiaron ratones desnudos deficientes en células T en la totalidad de su cuerpo a 3 Gy para suprimir aún más su sistema inmune un día antes de la inoculación del tumor.

Se inocularon células tumorales subcutáneamente en el flanco derecho a razón de 5x106 células por ratón. Se inició el tratamiento bien un día después de la implantación del tumor (modelos de linfoma de células B humano de xenoinjerto subcutáneo no estadificado, Namalwa y Daudi), bien cuando el volumen del tumor alcanzó 200-400 mm3 (modelo de Daudi estadificado, normalmente 15 días después de la inoculación del tumor). Se inyectaron a los ratones portadores de tumores mAbs anti-CD40 intraperitonealmente (i.p.) una vez por semana a las dosis indicadas. Se registraron los volúmenes de los tumores dos veces por semana. Cuando el volumen del tumor en cualquiera de los grupos alcanzó 2500 mm3, finalizó el estudio. Obsérvese que, en el modelo de Daudi estadificado, los datos del volumen tumoral fueron analizados hasta el día 36 debido a la muerte de algunos ratones después de ese día. Se contó la completa regresión (CR) hasta el final del estudio. Se analizaron los datos usando la prueba ANOVA o Kruskal-Wallis y la prueba posterior correspondiente para la comparación multigrupo.

[0204] En el modelo de Namalwa no estadificado, el mAb anti-CD40 CHIR-12.12, pero no Rituxán® (rituximab), inhibía significativamente (p = <0,01) el crecimiento de los tumores Namalwa (reducción del volumen tumoral del 60% frente al 25% para rituxamab, n=10 ratones/grupo) (Figura 4). Así, en este modelo, el mAb anti-CD40 CHIR

12.12 era más potente que rituximab. Es notorio que el segundo mAb candidato, CHIR-5.9, era al menos tan eficaz como rituximab a una dosis de 1/10 con respecto a la de rituximab. Tanto el mAb anti-CD40 CHIR-12.12 como rituxán prevenían significativamente el desarrollo tumoral en el modelo tumoral de Daudi no estadificado (14/15 de resistencia al desafío tumoral) (Figura 5).

[0205] Cuando se compararon además estos anticuerpos monoclonales anti-CD40 en un modelo de Daudi de xenoinjerto estadificado, en donde se inició el tratamiento cuando el tumor subcutáneo era palpable, el mAb anti-CD40 CHIR-12.12, a 1 mg/kg, provocó una significativa reducción del tumor (p=0,003), con un 60% de regresión completa (6/10), mientras que rituximab, a la misma dosis, no inhibió significativamente el crecimiento del tumor ni causó una regresión completa (0/10). Véase la Figura 6.

[0206] Resumiendo, el mAb anti-CD40 CHIR-12.12 inhibía significativamente el crecimiento tumoral en modelos de linfoma experimentales. A la misma dosis y con el mismo régimen, el mAb CHIR-12.12 mostró una mejor actividad anticancerosa que Rituxán® (rituximab). Además, no se observó ningún signo clínico de toxicidad a esta dosis y con este régimen. Estos datos sugieren que el mAb anti-CD40 CHIR-12.12 tiene una potente actividad antilinfoma humano in vitro y en modelos de xenoinjerto y podría resultar clínicamente efectivo para el tratamiento del linfoma.

Ejemplo 16: Farmacocinética de CHIR-5.9 y CHIR-12.12

[0207] Se estudió la farmacocinética de mAb anti-CD40 en ratones tras la administración de una sola dosis IV e IP. El mAb anti-CD40 exhibía una alta biodisponibilidad sistémica tras administración IP y una prolongada vida media terminal (>5 días) (datos no mostrados). Se realizó este estudio piloto para ayudar en el diseño de estudios farmacológicos; sin embargo, tiene poca o ninguna importancia para la actividad de desarrollo de este mAb, ya que este mAb totalmente humano no presenta reacción cruzada con CD40 de ratón.

Ejemplo 17: Caracterización del epitopo para los anticuerpos monoclonales CHIR-12.12 y CHIR-5.9

[0208] Para determinar la localización del epitopo sobre CD40 reconocido por los anticuerpos monoclonales CHIR

12.12 y CHIR- 5.9, se realizaron SDS-PAGE y análisis Western blot. Se separó CD40 purificado (0,5 μg) en un gel de NUPAGE al 4-12% en condiciones reductoras y no reductoras, se transfirió a membranas de PVDF y se sondeó con anticuerpos monoclonales a una concentración de 10 μg/ml. Se sondearon los blots con IgG antihumana conjugada a fosfatasa alcalina y se reveló usando el substrato estabilizado Western BlueR para fosfatasa alcalina (Promega).

[0209] Los resultados indican que el anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 reconoce epitopos sobre la forma tanto no reducida como reducida de CD40, exhibiendo la forma no reducida del CD40 una mayor intensidad que la forma reducida del CD40 (Tabla 15; blots no mostrados). El hecho de que el reconocimiento fuera positivo para ambas formas de CD40 indica que este anticuerpo interactúa con un epitopo conformacional, parte del cual es una secuencia lineal. El anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 reconoce primariamente la forma no reducida del CD40, lo que sugiere que este anticuerpo interactúa con un epitopo primariamente conformacional (Tabla 15; blots no mostrados).

Tabla 15. Identificación de dominio

Dominio 1: Dominio 2 Dominio 3 Dominio 4

mAb CHIR-12.12: - + - -

mAb CHIR-5.9: - + - -

mAb 15B8: + - - -

[0210] Para mapear la región antigénica sobre CD40, se clonaron los cuatro dominios extracelulares de CD40 y se expresaron en células de insectos como proteínas de fusión GST. Se aseguró la secreción de los cuatro dominios con una señal de secreción GP67. Se analizó el sobrenadante de las células de insectos por SDS-PAGE y análisis Western blot para identificar el dominio que contenía el epitopo.

[0211] El anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 reconoce un epitopo sobre el Dominio 2 en condiciones tanto reductoras como no reductoras (Tabla 16; blots no mostrados). Por el contrario, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 exhibe un reconocimiento muy débil hacia el Dominio 2 (Tabla 16; blots no mostrados). Ninguno de estos anticuerpos reconoce los Dominios 1, 3 ó 4 en este análisis.

Tabla 16. Análisis del Dominio 2

Reducido: No reducido

mAb CHIR-12.12: ++ +++

mAb CHIR-5.9: + +

10 [0212] Para definir con mayor precisión el epitopo reconocido por el mAb CHIR-12.12, se sintetizaron péptidos a partir del Dominio 2 extracelular de CD40, que corresponde a la secuencia PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT (residuos 61-104 de la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o en la SEC. Nº ID.: 12). Se generaron membranas SPOTs (Sigma) que contenían treinta y cinco

15 péptidos 10-méricos con una compensación de 1 aminoácido. Se realizó un análisis Western blot con el mAb CHIR

12.12 e IgG antihumana beta-galactosidasa como anticuerpo secundario. Se denudó el blot y se volvió a sondear con mAb CHIR-5.9 para determinar la región reconocida por este anticuerpo.

[0213] El análisis SPOTs sondeando con el anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 a 10 μg/ml dio reacciones 20 positivas con las manchas 18 a 22. En la Tabla 17 se muestra la región de la secuencia cubierta por estos péptidos.

Tabla 17. Resultados del análisis SPOTs sondeando con el anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12

Número de mancha: Región de la secuencia

18: HQHKYCDPNL (residuos 78-87 de la SEC. Nº ID.: 10 o de la SEC. Nº ID.: 12)

19: QHKYCDPNLG (residuos 79-88 de la SEC. Nº ID.: 10 o de la SEC. Nº ID.: 12)

20: HKYCDPNLGL (residuos 80-89 de la SEC. Nº ID.: 10 o de la SEC. Nº ID.: 12)

21: KYCDPNLGLR (residuos 81-90 de la SEC. ID. Nº: 10 o de la SEC. Nº ID.: 12)

22: YCDPNLGLRV (residuos 82-91 de la SEC. Nº ID.: 10 o de la SEC. ID. Nº: 12)

25 [0214] Estos resultados corresponden a un epitopo lineal de: YCDPNL (residuos 82-87 de la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o en la SEC. Nº ID.: 12). Este epitopo contiene Y82, D84 y N86, que se ha predicho están implicados en la interacción CD40-ligando de CD40.

[0215] El análisis SPOTs con el mAb CHIR-5.9 mostró un débil reconocimiento de los péptidos representados por

30 las manchas 20-22 mostradas en la Tabla 18, lo que sugiere implicación de la región YCDPNLGL (residuos 82-89 de la secuencia mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o en la SEC. Nº ID.: 12) en su unión a CD40. Habría que hacer notar que los mAbs CHIR-12.12 y CHIR-5.9 compiten entre sí por la unión a CD40 en el análisis BIACORE.

Tabla 18. Resultados del análisis SPOTs sondeando con el anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-5.9 35

Número de mancha: Región de la secuencia

21: KYCDPNLGLR (residuos 81-90 de la SEC. Nº ID.: 10 o de la SEC. ID. Nº: 12)

22: YCDPNLGLRV (residuos 82-91 de la SEC. Nº ID.: 10 o de la SEC. Nº ID.: 12)

[0216] Los epitopos lineales identificados por los análisis SPOTs están dentro del módulo CD40 B1. La secuencia del módulo CD40 B1 es:

40 HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (residuos 80-103 de la SEC. Nº ID.: 10 o de la SEC. Nº ID.: 12).

[0217] En el epitopo lineal identificado para CHIR-12.12, es C83. Se sabe que este residuo de cisteína forma un enlace disulfuro con C103. Es probable que el epitopo conformacional del mAb CHIR-12.12 contenga este enlace disulfuro (C83-C103) y/o rodeando los aminoácidos conformacionalmente próximos a C103.

45 58

Ejemplo 18: Número de moléculas de CD20 y CD40 en las células Namalwa y Daudi

[0218] Se determinó el número de moléculas de CD20 y CD40 en las células Namalwa y Daudi según se describe en la Figura 7, usando concentraciones de anticuerpo de 0,01, 0,1, 1, 10 y 100 μg/ml. Como puede verse en la Figura 7, el número medio de moléculas de CD20 (diana para rituximab) es mayor en las líneas de células tanto Namalwa como Daudi que el número de moléculas de CD40 (diana para el mAb CHIR-12.12).

Ejemplo 19: CCDA del mAb CHIR-12.12 y de rituximab frente a células de linfoma Daudi

[0219] Se estudiaron el rituximab y el mAb candidato CHIR-12.12 in vitro en cuanto a la actividad CCDA a concentraciones variables frente a la línea de células de linfoma Daudi como células diana (T) y células NK purificadas de voluntarios humanos sanos como células efectoras (E). Se mezclaron células NK humanas recién aisladas con células de linfoma Daudi marcadas con calceína en una proporción E:T de 10. Se incubó la mezcla de células durante 4 horas a 37°C en presencia de las concentraciones establecidas de mAb CHIR-12.12 o de rituximab. Se midió el nivel de calceína liberado de las células diana lisadas en el sobrenadante como Unidades Fluorescentes Arbitrarias (UFA). Se calculó el porcentaje de lisis específica como: 100 x (UFA prueba - UFA liberación espontánea)/(UFA liberación máxima - UFA liberación espontánea), donde UFA liberación espontánea es la calceína liberada por las células diana en ausencia de anticuerpo o de células NK y UFA liberación máxima es la calceína liberada por las células diana tras lisis por el detergente.

[0220] Se observó lisis de las células Daudi dependiente de la concentración de anticuerpo (Figura 8; Tabla 19 a continuación). La lisis específica máxima de las células de linfoma diana inducida por el mAb anti-CD40 era mayor en comparación con la lisis inducida por rituximab (63,6% frente a 45,9%, n=6; prueba t pareada del mAb CHIR

12.12 frente a rituximab, p=0,0002). Además, la DE50 para el rituximab era como media (n=6) de 51,6 pM, 13 veces superior a la DE50 para el mAb anti-CD40 CHIR-12.12 para esta actividad.

Tabla 19. CCDA comparativa del mAb CHIR-12.12 y rituximab frente a células de linfoma Daudi

Donante de células NK: Muerte máxima (%) DE50 (pM)

mAb CHIR-12.12: Rituximab mAb CHIR-12.12 Rituximab

1: 50,2 34,9 3,2 14,2

2: 83,1 68,6 2,2 27,2

3: 64,2 36,9 4,1 66,9

4: 53,3 39,5 2,4 47,6

5: 74,8 56,6 2,8 24,1

6: 56,2 38,9 7,9 129,5

Media: 63,6 45,9 3,8 51,6

Ejemplo 20: CHIR-12.12 bloquea las rutas de supervivencia y señalización de CD40 mediadas por CD40L en células B humanas normales

[0221] El ligando de CD40 (CD40L) soluble activa las células B e induce diversos aspectos de respuestas funcionales, incluyendo el aumento de la supervivencia y la proliferación, y la activación de las rutas de señalización de NFκB, ERK/MAPK, PI3K/Akt y p38. Además, la estimulación de CD40 mediada por CD40L proporciona señales de supervivencia por reducción de la PARP escindida e inducción de las proteínas antiapoptóticas, XIAP y Mcl-1, en células B normales. La estimulación de CD40 mediada por CD40L también recluta TRAF2 y TRAF3 para unirse al dominio citoplásmico de CD40.

[0222] Los siguientes estudios demuestran que CHIR-12.12 inhibía directamente todos estos efectos de estimulación sobre las células B humanas normales. Por ejemplo, el tratamiento con CHIR-12.12 daba como resultado una mayor escisión de la caspasa-9, la caspasa-3 y la PARP, así como una reducción del XIAP y de la Mcl-1, de un modo dependiente del tiempo y de la dosis, restableciendo la apoptosis de las células B. El tratamiento con CHIR-12.12 también inhibía la fosforilación de la IκB kinasa (IKK) α y β (ruta NFκB), la ERK, la Akt y la p38 en respuesta a la estimulación de CD40 mediada por CD40L. Además, se vio que CHIR-12.12 no desencadenaba estos efectos apoptóticos sin una estimulación inicial de CD40 mediada por CD40L.

CHIR-12.12 inhibía la supervivencia mediada por el ligando de CD40 induciendo la escisión de PARP.

[0223] En estos experimentos, se estimularon 0,6x106 células B humanas normales de donantes sanos (porcentaje de pureza de entre un 85% y un 95%) con 1 μg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Se añadieron entonces CHIR-12.12 (10 μg/ml) e IgG control. Se recogieron las células a los 0 minutos, a los 20 minutos, a las 2 horas, a las 6 horas, a las 18 horas y a las 26 horas. Se detectaron los controles de caspasa-9 escindida, caspasa-3 escindida, PARP escindida y β-actina en lisados celulares por Western blot.

[0224] Resumiendo, se observó que la estimulación de CD40 mediada por CD40L proporcionaba señales de

supervivencia, ya que no se produjeron aumentos de caspasa-9 escindida, caspasa-3 escindida o PARP escindida a lo largo del tiempo, lo que indica que las células no estaban experimentando apoptosis. Sin embargo, el tratamiento con CHIR-12.12 dio lugar a un aumento de estos productos de escisión, lo que indica que el tratamiento con CHIR

12.12 abolía los efectos de la unión del CD40L sobre la señalización de supervivencia en células B normales estimuladas con sCD40L, restaurando la apoptosis de las células B (datos no mostrados).

CHIR-12.12 inhibía la expresión de proteínas antiapoptóticas de "supervivencia".

[0225] En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donantes sanos (porcentaje de pureza de entre un 85% y un 95%) con 1 μg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Se añadieron entonces CHIR-12.12 (10 μg/ml) e IgG control. Se recogieron las células a los 0 minutos, a los 20 minutos, a las 2 horas, a las 6 horas, a las 18 horas y a las 26 horas. Se detectaron los controles de Mcl-1, XIAP, CD40 y β-actina en lisados celulares por Western blot.

[0226] Resumiendo, la estimulación con sCD40L dio lugar a una expresión mantenida de Mcl-1 y XIAP a lo largo del tiempo. Sin embargo, el tratamiento de las células estimuladas con sCD40L con CHIR-12.12 dio lugar a una disminución en la expresión de estas proteínas a lo largo del tiempo (datos no mostrados). Como Mcl-1 y XIAP son señales de "supervivencia" capaces de bloquear la ruta apoptótica, estos resultados demuestran que el tratamiento con CHIR-12.12 elimina el bloqueo contra la apoptosis en células B normales estimuladas con sCD40L.

El tratamiento con CHIR-12.12 inhibía la fosforilación de IKKα (Ser 180) e IKKβ (Ser 181) en células B normales.

[0227] En estos experimentos, se estimularon 1,0 x106 células B humanas normales de donantes sanos (porcentaje de pureza de entre un 85% y un 95%) con 1 μg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Se añadieron entonces CHIR-12.12 (10 μg/ml) e IgG control. Se recogieron las células a los 0 y 20 minutos. Se detectaron los controles de IKKα (Ser 180) e IKKβ (Ser 181) fosforiladas e IKKβ total en lisados celulares por Western blot.

[0228] Resumiendo, la estimulación con sCD40L dio lugar a fosforilación de IKKα (Ser 180) e IKKβ (Ser 181) a lo largo del tiempo; sin embargo, el tratamiento con CHIR-12.12 abolió esta respuesta a la estimulación con sCD40L en células B normales (datos no mostrados).

El tratamiento con CHIR-12.12 inhibía la supervivencia mediada por el ligando de CD40 de un modo dependiente de dosis.

[0229] En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donantes sanos (porcentaje de pureza de entre un 85% y un 95%) con 1 μg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Se añadieron entonces CHIR-12.12 (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 μg/ml) e IgG control. Se recogieron las células a las 24 horas. Se detectaron los controles de PARP escindida y β-actina en lisados celulares por Western blot.

[0230] Resumiendo, el tratamiento con CHIR-12.12 dio lugar a un aumento de la escisión de PARP en las células estimuladas con sCD40L de un modo dependiente de la dosis y, por lo tanto, abolió la ruta de señalización de la supervivencia en células B normales estimuladas con sCD40L (datos no mostrados).

CHIR-12.12 inhibía la expresión de las proteínas antiapoptóticas de "supervivencia" de un modo dependiente de la dosis.

[0231] En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donantes sanos (porcentaje de pureza de entre un 85% y un 95%) con 1 μg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Se añadieron entonces CHIR-12.12 (0,5, 2 y 10 μg/ml) e IgG control. Se recogieron las células a las 22 horas. Se detectaron los controles de Mcl-1, XIAP, PARP escindida y β-actina en lisados celulares por Western blot.

[0232] Resumiendo, el tratamiento con CHIR-12.12 redujo la expresión de Mcl-1 y XIAP y aumentó la expresión de PARP escindida en las células estimuladas con sCD40L de un modo dependiente de la dosis y, por lo tanto, abolió estos bloqueos a la ruta apoptótica en células B normales estimuladas con sCD40L (datos no mostrados).

CHIR-12.12 no afectaba a la expresión de las proteínas antiapoptóticas, PARP escindida y XIAP, en ausencia de señalización de CD40L soluble.

[0233] En estos experimentos, se trataron 1,0 x 106 células B humanas normales de donantes sanos (porcentaje de pureza de entre un 85% y un 95%) con CHIR-12.12 (10 μg/ml) e IgG control solamente (es decir, que las células no fueron preestimuladas con sCD40L antes de añadir anticuerpo). Se recogieron las células a las 0, 4, 14 y 16 horas. Se detectaron los controles de XIAP, PARP escindida y β-actina en lisados celulares por Western blot.

[0234] Resumiendo, los resultados muestran que, sin estimulación con sCD40L, las células expresaban mayores

concentraciones de PARP escindida, mientras que la expresión de XIAP permanecía constante, tanto en las células control tratadas con IgG como en las células tratadas con CHIR-12.12 (datos no mostrados). Estos datos indican que CHIR-12.12 no desencadena apoptosis en células B humanas normales sin estimulación con CD40L.

CHIR-12.12 inhibe la fosforilación de IKKα (Ser 180) e IKKβ (Ser 181), Akt, ERK y p38 en células B normales.

[0235] En estos experimentos, se privaron de suero 1,0 x 106 células B humanas normales de donantes sanos (porcentaje de pureza de entre un 85% y un 95%) en medios que contenían un 1% de FBS y se estimularon con 1 μg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Se trataron los cultivos con CHIR-12.12 (1 y 10 μg/ml) e IgG control. Se recogieron las células a los 0 y a los 20 minutos. Se detectaron fosfo-IKKα, fosfo-IKKβ, IKKβ total, fosfo-ERK, ERK total, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-p38 y p38 total en lisados celulares por Western blot.

[0236] Resumiendo, la estimulación con sCD40L dio lugar a aumentos en la fosforilación de IKKα/β, la fosforilación de ERK, la fosforilación de Akt y la fosforilación de p38, conduciendo así a la supervivencia y/o a la proliferación de las células. El tratamiento de las células con CHIR-12.12 abolió los efectos de la estimulación con sCD40L sobre estas rutas de señalización en células B normales (datos no mostrados).

CHIR 12.12 inhibe múltiples rutas de señalización, tales como PI3K y MEK/ERK, en la cascada de señalización de CD40.

[0237] En estos experimentos, se privaron de suero 1,0 x 106 células B humanas normales de donantes sanos (porcentaje de pureza de entre un 85% y un 95%) en medios que contenían un 1% de FBS y se estimularon con 1 μg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Se trataron también los cultivos con CHIR-12.12 (1 y 10 μg/ml), Wortmanina (un inhibidor de PI3K/Akt, 1 y 10 μM), LY 294002 (un inhibidor de PI3K/Akt, 10 y 30 μM) y PD 98095 (un inhibidor de MEK, 10 y 30 μg/ml). Se recogieron las células a los 0 y a los 20 minutos. Se detectaron fosfo-ERK, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-IKKα/β y total en lisados celulares por Western blot.

[0238] Resumiendo, los resultados muestran que CHIR-12.12 abolía la fosforilación de todas estas moléculas de transducción de señal, mientras que los inhibidores de la transducción de señal mostraban sólo una abolición específica de la señalización, lo que indica que CHIR-12.12 probablemente inhibe secuencia arriba de estas moléculas de transducción de señal mediado por estimulación con CD40L (datos no mostrados).

CHIR-12.12 inhibe la unión de las moléculas señalizadoras TRAF2 y TRAF3 al dominio citoplásmico de CD40 en células B normales.

[0239] En estos experimentos, se privaron de suero 4,0 x 106 células B humanas normales de donantes sanos (porcentaje de pureza de entre un 85% y un 95%) durante cuatro horas en medios que contenían un 1% de FBS y se estimularon con 1 μg/ml de sCD40L (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK) durante 20 minutos. Se recogieron las células a los 0 y a los 20 minutos. Se inmunoprecipitó el CD40 usando anti-CD40 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, CA) y se sondeó en un Western blot con mAb anti-TRAF2 (Santa Cruz Biotechnology, CA), mAb anti-TRAF3 (Santa Cruz Biotechnology, CA) y mAb anti-CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA).

[0240] Resumiendo, los resultados muestran que TRAF2 y TRAF3 coprecipitaban con CD40 tras la estimulación con sCD40L. Por el contrario, el tratamiento con CHIR-12.12 abolía la formación del complejo de señalización CD40-TRAF2/3 en células B normales estimuladas con sCD40L. No hubo cambios en la expresión de CD40 (datos no mostrados).

[0241] Sin ceñirnos a la teoría, los resultados de estos experimentos, y los resultados de los ejemplos descritos anteriormente, indican que el anticuerpo CHIR-12.12 es un anticuerpo monoclonal anti-CD40 antagonista de doble acción que tiene una combinación única de atributos. Este anticuerpo monoclonal totalmente humano bloquea las rutas de señalización de CD40 mediadas por CD40L para la supervivencia y la proliferación de las células B; este antagonismo conduce a la muerte celular final. CHIR-12.12 también media en el reconocimiento y la unión por células efectoras, iniciando la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA). Una vez el CHIR-12.12 se ha unido a las células efectoras, se liberan enzimas citolíticas, lo que conduce a apoptosis y lisis de las células B. CHIR

12.12 es un anticuerpo antitumoral más potente que rituximab cuando se comparan en modelos tumorales preclínicos.

Ejemplo 21: Actividad agonista y antagonista frente a células cancerosas primarias de pacientes con LNH, LLC y MM

[0242] En colaboración con investigadores clínicos, se estudian los mAbs candidatos en cuanto a una variedad de actividades (enumeradas a continuación) frente a células cancerosas primarias de pacientes con LNH y LLC y mieloma múltiple.

•: Efecto agonista en ensayos de proliferación (8 pacientes con LNH, 8 pacientes con LLC y 8 pacientes con MM)

•: Efecto antagonista en ensayos de proliferación (8 pacientes con LNH, 8 pacientes con LLC y 8 pacientes con MM)

•: Efecto apoptótico mediante el ensayo de Anexina V (3-4 pacientes con LNH, 4 pacientes con LLC y 4 pacientes con MM)

•: Reversión de la señal de supervivencia mediante el ensayo de Anexina V (3 pacientes con LNH, 3 pacientes con LLC y 3 pacientes con MM)

•: Citotoxicidad dependiente del complemento (4 pacientes con LNH, 4 pacientes con LLC y 4 pacientes con MM)

•: Citotoxicidad dependiente de anticuerpos (6 pacientes con LNH, 6 pacientes con LLC y 6 pacientes con MM)

Ejemplo 22: Identificación de especies animales relevantes para los estudios de toxicidad

[0243] Dado que estos dos anticuerpos candidatos no presentan reacción cruzada con el CD40 de roedores, se han de identificar otras especies para el estudio de los efectos toxicológicos.

[0244] Se estudia la capacidad de los dos anticuerpos anti-CD40 candidatos para presentar una reacción cruzada con CD40 de animales mediante ensayos de citometría de flujo. Se prueban ratas, conejos, perros, monos cinomolgos y titíes para este estudio.

[0245] Los anticuerpos candidatos muestran actividad antagonista tras su unión a CD40 sobre células B humanas. Para identificar una especie animal que tenga una respuesta similar a los anticuerpos candidatos, se estudian linfocitos de especies que muestran unión a los anticuerpos candidatos en ensayos de proliferación en cuanto a la actividad antagonista. Se estudian además los linfocitos de las especies seleccionadas para la unión antagonista de los anticuerpos candidatos en cuanto a su capacidad para servir como células efectoras para provocar la muerte de líneas celulares de linfoma que expresan CD40 a través del mecanismo de CCDA. Finalmente, las especies animales seleccionadas son analizadas en un estudio de IHQ en cuanto al patrón de unión a tejidos de los anticuerpos candidatos. Se seleccionan las especies animales que responden a los anticuerpos candidatos en estos ensayos de un modo similar al observado para las células humanas para los estudios toxicológicos.

[0246] Los estudios iniciales indican que los mAbs anti-CD40 candidatos tienen reacción cruzada con el CD40 de monos cinomolgos.

Ejemplo 23: Perfil de abordaje de tumores de CHIR-5.9 y CHIR-12.12

[0247] Para determinar el perfil relativo de abordaje de tumores de los mAbs CHIR-12.12 y CHIR-5.9, se administran los mAbs candidatos y anticuerpos control de isotipo fluorescentemente marcados a ratones portadores de tumores. Se recogen especímenes de tumores y órganos normales a diferentes tiempos tras la dosificación. Se analiza la acumulación de anticuerpo marcado en los tumores y en los órganos normales.

Ejemplo 24: Mecanismo de acción de CHIR-5.9 y CHIR-12.12

[0248] Para elucidar el/los mecanismo(s) que media(n) en la inhibición del crecimiento tumoral por los mAbs CHIR

5.9 y CHIR-12.12, se emprenden los siguientes estudios:

[0249] Modelo de eliminación o bloqueo del receptor de Fc: La CCDA está mediada por la unión de células efectoras, tales como NK, macrófagos y monocitos, a la porción Fc del anticuerpo a través del receptor de Fc. Los ratones deficientes en la activación de los receptores de Fc, así como anticuerpos obtenidos por ingeniería para destruir la unión de Fc a esos receptores, bloquearán la inhibición del crecimiento tumoral mediada por CCDA. Una inhibición tumoral perdida o significativamente reducida en este modelo sugerirá que la inhibición del crecimiento tumoral por estos dos mAbs candidatos está principalmente mediada por el mecanismo de CCDA.

Ejemplo 25: Formulación farmacéutica líquida para anticuerpos antagonistas anti-CD40

[0250] El objetivo de este estudio era investigar los efectos del pH de la solución sobre la estabilidad del anticuerpo antagonista anti-CD40 CHIR-12.12 por métodos tanto biofísicos como bioquímicos con objeto de seleccionar el ambiente óptimo de solución para este anticuerpo. Los resultados de la calorimetría de barrido diferencial (DSC) mostraron que la estabilidad conformacional de CHIR-12.12 es óptima en formulaciones que tienen un pH de 5,56,5. En base a una combinación de análisis de SDS-PAGE, HPLC de exclusión por tamaños (SEC-HPLC) y HPLC de intercambio de cationes (CEX-HPLC), la estabilidad fisicoquímica de CHIR-12.12 es óptima a un pH de aproximadamente 5,0-5,5. A la vista de estos resultados, una formulación farmacéutica líquida recomendada que contenga este anticuerpo es una formulación que contiene CHIR-12.12 a aproximadamente 20 mg/ml formulado en succinato de sodio aproximadamente 10 mM y cloruro de sodio aproximadamente 150 mM y que tenga un pH de aproximadamente pH 5,5.

Materiales y métodos

[0251] El anticuerpo CHIR-12.12 utilizado en los estudios de formulación es un anticuerpo monoclonal humano producido por un procedimiento de cultivo de células CHO. Este mAb tiene un peso molecular de 150 kDa y consiste en dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas unidas entre sí por enlaces disulfuro. Se dirige hacia el receptor de la superficie celular de CD40 sobre células que expresan CD40, incluyendo células B normales y malignas, para el tratamiento de diversos cánceres y enfermedades autoinmunes/inflamatorias.

[0252] El fármaco anti-CD40 utilizado para este estudio era un lote a granel de anti-CD40 (CHIR-12.12) purificado

5 derivado de células CHO. La composición del fármaco era 9,7 mg/ml de anticuerpo CHIR-12.12 en citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, a pH 6,5. La muestra de control en el estudio era el fármaco recibido, seguido de congelación a ≤ -60°C, descongelación a TA y ensayo junto con muestras de estabilidad en tiempos predeterminados. Se prepararon las muestras de estabilidad por diálisis del fármaco frente a soluciones de diferentes pH y se determinó la concentración de CHIR-12.12 en cada muestra por UV 280, como se presenta en la

10 Tabla 20.

Tabla 20. Formulaciones de CHIR-12.12

Composición del tampón: pH Concentración de CHIR-12.12 (mg/ml)

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 4,5 9,0

Succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 5,0 9,3

Succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 5,5 9,2

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 6,0 9,7

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 6,5 9,4

Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 7,0 9,4

Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 7,5 9,5

Glicina 10 mM, cloruro de sodio 150 mM: 9,0 9,5

15 [0253] Se estudió la estabilidad fisicoquímica del anticuerpo CHIR-12.12 en las diversas formulaciones utilizando los siguientes protocolos.

Calorimetría de barrido diferencial (DSC)

20 [0254] Se monitorizó la estabilidad conformacional de diferentes muestras de formulaciones usando un MicroCal VP-DSC con calentamiento de 15°C a 90°C a 1°C/min.

SDS-PAGE

25 [0255] Se estimaron la fragmentación y la agregación utilizando un gel de Tris-Glicina al 4-20% en condiciones no reductoras y reductoras. Se detectó la proteína por tinción con azul de Coomassie.

Cromatógrafo de exclusión por tamaños (SEC-HPLC)

30 [0256] Se midieron también la fragmentación y la agregación proteica mediante un HPLC Water Alliance con una columna Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL, fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0, como fase móvil a una velocidad de flujo de 0,7 ml/min.

Cromatografía de intercambio catiónico (CEX-HPLC)

35 [0257] Se midió la degradación relacionada con el cambio de carga utilizando un sistema de HPLC Waters 600s con una columna Dionex Propac WCX-10, HEPES 50 mM, pH 7,3, como fase móvil A y HEPES 50 mM que contenía NaCl 500 mM, pH 7,3, como fase móvil B, a una velocidad de flujo de 0,5°C/min.

40 Resultados y discusión

Estudio de estabilidad conformacional

[0258] El desplegamiento térmico de CHIR-12.12 reveló al menos dos transiciones térmicas, que probablemente

45 representan fusión por desplegamiento de los dominios Fab y Fc, respectivamente. A temperaturas superiores, la proteína presumiblemente se agregaba, dando como resultado una pérdida de señal DSC. Para el objetivo de rastreo de formulaciones, se definió la temperatura de transición térmica más baja como la temperatura de fusión, Tf, en este estudio. La Figura 13 muestra la temperatura de fusión térmica en función de los pH de las formulaciones. Las formulaciones a pH 5,5-6,5 dotaban al anti-CD40 de mayor estabilidad conformacional, como quedó demostrado

50 por las superiores temperaturas de fusión térmica.

Análisis de SDS-PAGE

[0259] Se incubaron las muestras de formulaciones de CHIR-12.12 a pH 4,5-9,0 a 40°C durante 2 meses y se

55 sometieron a análisis de SDS-PAGE (datos no mostrados). En condiciones no reductoras, se observaron especies con un peso molecular (PM) de 23 kDa y 27 kDa en las formulaciones con pH por encima de 5,5, y se observaron especies con un PM de 51 kDa en todas las formulaciones, pero aparecían menos a pH 5,0-5,5. Se pudo ver una especie con un PM de 100 kDa a pH 7,5 y pH 9,0.

[0260] En condiciones reductoras, CHIR-12.12 se redujo a cadenas pesadas y cadenas ligeras libres con un PM de

5 50 kDa y 24 kDa, respectivamente. La especie de 100 kDa parecía no ser totalmente reducible y aumentaba al aumentar el pH de la solución, lo que sugiere que podría producirse una asociación covalente diferente del disulfuro en las moléculas. Dado que había otras especies con identidades desconocidas en la SDS-PAGE, la comparación de la estabilidad de cada formulación se basa en la pureza restante de CHIR-12.12. Las formulaciones a pH 5,0-6,0 proporcionaban un ambiente más estable para CHIR-12.12. Se detectaron pocos agregados por SDS-PAGE (datos

10 no mostrados).

Análisis de SEC-HPLC

[0261] El análisis de SEC-HPLC detectó el CHIR-12.12 intacto como pico de la especie principal, una especie de

15 agregación como pico de especie frontal separado del pico de la especie principal y una especie de gran fragmento como pico de hombro en la parte posterior del pico de la especie principal, y se detectaron especies de pequeños fragmentos posteriores al pico de la especie principal. Después de incubar a 5°C y 25°C durante 3 meses, se detectaron cantidades insignificantes de fragmentos y agregados proteicos (<1,0%) en las formulaciones anteriores y el pico de la especie principal CHIR-12.12 seguía teniendo una pureza mayor del 99% (datos no mostrados). Sin

20 embargo, se desarrollaron gradualmente fragmentos de proteína tras almacenamiento a 40°C y se formaron más fragmentos a pH 4,5 y pH 6,5-9,0, como muestra la Tabla 21. Después de incubar las formulaciones de CHIR-12.12 a 40°C durante 3 meses, se detectó aproximadamente un 2-3% de agregados a pH 7,5 y pH 9,0, mientras que se detectó menos de un 1% de agregados en formulaciones a otros pH (datos no mostrados). Los resultados de SEC-HPLC indican que CHIR-12.12 es más estable a un pH de aproximadamente 5,0-6,0.

25 Tabla 21. Resultados de SEC-HPLC de muestras de estabilidad de CHIR-12.12 en condiciones de tiempo real y de almacenamiento acelerado

Muestra: % Pico principal % Fragmentos

t=0: 40ºC 1 m 40ºC 2 m 40ºC 3 m t=0 40ºC 1 m 40ºC 2 m 40ºC 3 m

Control: 99,4 99,2 99,9 99,5 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0

pH 4,5: 99,4 93,2 86,0 81,3 <1,0 6,4 13,2 18,1

pH 5,0: 99,8 98,7 91,3 89,2 <1,0 <1,0 7,8 10,2

pH 5,5: 99,8 98,9 91,4 90,6 <1,0 <1,0 7,6 8,8

pH 6,0: 99,6 97,7 90,4 87,3 <1,0 1,9 8,2 11,7

pH 6,5: 99,3 93,4 89,0 86,9 <1,0 5,6 9,9 12,4

pH 7,0: 99,2 93,9 87,4 85,1 <1,0 5,5 11,1 13,5

pH 7,5: 99,1 92,8 84,4 81,9 <1,0 6,4 12,9 16,2

pH 9,0: 99,3 82,4 61,6 50,6 <1,0 15,4 36,2 47,6

30 Análisis de CEX-HPLC

[0262] El análisis de CEX-HPLC detectó el CHIR-12.12 intacto como pico de la especie principal, variantes ácidas que eluían antes que el pico de la especie principal y variantes de adición de lisina C-terminal que eluían después del pico de la especie principal. La Tabla 22 muestra la dependencia de los porcentajes del resto del pico de especie 35 CHIR-12.12 principal y de las variantes ácidas con respecto al pH de la solución. La muestra control ya contenía un alto grado de especies ácidas (∼33%), probablemente debido a procesos de fermentación y purificación en fase temprana. La susceptibilidad de CHIR-12.12 a soluciones de mayor pH queda evidenciada por dos hechos. En primer lugar, la muestra de formulación inicial a pH 9,0 (t=0) ya generaba un 12% de especies más ácidas que el control. En segundo lugar, el porcentaje de especies ácidas aumentaba de manera abrupta al aumentar el pH. La

40 degradación relacionada con el cambio de carga se debe probablemente a desamidación. Los datos anteriores indican que este tipo de degradación de CHIR-12.12 quedaba minimizado a un pH de aproximadamente 5,0-5,5.

[0263] Tabla 22. Porcentaje de área del pico por CEX-HPLC para CHIR-12.12 en formulaciones a diferentes pH en condiciones de tiempo real y de almacenamiento acelerado 45

Muestra: % Pico principal % Variantes ácidas

t=0: 5ºC 3 m 25ºC 3 m 40ºC 1 m 40ºC 2 m t=0 5ºC 3 m 25ºC 3 m 40ºC 1 m 40ºC 2 m

Control: 49,2 49,8 49,8 49,2 50,3 32,0 33,7 33,7 32,0 33,6

pH 4,5: 48,5 49,7 43,7 39,7 30,0 32,5 32,6 38,0 44,2 56,4

pH 5,0: 49,6 49,8 48,3 40,6 31,4 32,7 31,8 35,0 44,3 57,1

pH 5,5: 50,7 50,3 48,1 40,0 30,2 32,6 31,8 37,8 48,9 63,3

pH 6,0: 50,2 49,9 47,9 37,4 23,9 33,1 33,6 38,5 54,9 72,7

pH 6,5: 49,4 49,9 42,3 29,7 14,6 33,3 33,6 47,7 65,2 84,6

pH 7,0: 49,7 49,9 21,9 - - 34,4 36,4 64,4 - -

pH 7,5: 49,3 48,3 12,7 - - 35,5 40,1 79,2 - -

pH 9,0: 41,3 31,8 - - - 44,7 59,9 - - -

Conclusión

[0264] El pH tiene un efecto significativo sobre la estabilidad conformacional y la estabilidad fisicoquímica de CHIR

12.12. Se determinó que la degradación relacionada con el cambio de carga era la principal ruta de degradación para CHIR-12.12, que se minimizó a pH 5,0-5,5. En base a los datos de estabilidad globales, una formulación farmacéutica líquida recomendada que contiene este anticuerpo es una formulación que contiene CHIR-12.12 a aproximadamente 20 mg/ml formulado en succinato de sodio aproximadamente 10 mM y cloruro de sodio aproximadamente 150 mM y que tiene un pH de aproximadamente pH 5,5.

Ejemplo 26: Estudios clínicos con CHIR-5.9 y CHIR-12.12

Objetivos clínicos

[0265] El objetivo global es proporcionar una terapia efectiva para tumores de células B abordándolos con una IgG1 anti-CD40. Estos tumores incluyen el linfoma de células B, el Linfoma Linfocítico Crónico (LLC), la Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), el Mieloma Múltiple (MM), la macroglobulinemia de Waldenstrom y la enfermedad de Castleman sistémica. Se determina la señal para estas enfermedades en la fase II, aunque se puede obtener alguna medida de actividad en la fase I. Inicialmente, se estudia el agente como un solo agente, pero se combinará con otros agentes, quimioterapia y otros anticuerpos a medida que evolucione el desarrollo.

Fase I

[0266]

•: Evaluar la seguridad y la farmacocinética - escalonamiento de dosis en sujetos con cánceres de células B.

•: Elegir la dosis en base a la seguridad, la tolerabilidad y el cambio en los marcadores séricos de CD40. En general, se busca una DMT, pero otras indicaciones de eficacia (depleción de células B CD40+, etc.) pueden resultar adecuadas para hallar la dosis.

•: Consideración de más de una dosis, especialmente para diferentes indicaciones, v.g., la dosis para el LLC puede ser diferente que para el LNH. Así, puede ser necesario algún hallazgo de dosis en la fase II.

•: Se dosifica a los pacientes semanalmente con toma de muestras para farmacocinética (Pk) en tiempo real. Inicialmente, la dosificación máxima permitida es un ciclo de 4 semanas. La Pk puede ser altamente variable dependiendo de la enfermedad estudiada, de la densidad de CD40, etc.

•: Este/estos ensayo(s) está(n) abierto(s) a sujetos con linfoma de células B, LLC y potencialmente otros cánceres de células B.

•: La decisión de interrumpir o continuar los estudios se basa en la seguridad, la dosis y la evidencia preliminar de actividad antitumoral.

•: Se determina la actividad del fármaco, determinada por el índice de respuesta, en la Fase II.

•: Identificar la(s) dosis para la Fase II.

Fase II

[0267] Se iniciarán diversas pruebas en los tipos de tumores anteriormente mencionados centrándose en el linfoma de células B, el LLC y el Mieloma Múltiple (MM). Pueden ser necesarias pruebas separadas en el LNH de grado bajo y de grado intermedio/alto, ya que CD40 puede tener una función diferente dependiendo del grado de linfoma. En la enfermedad de bajo grado, CD40 actúa más como factor de supervivencia, evitando la apoptosis. En la enfermedad de grado más alto, la interrupción de la señalización de CD40 puede dar lugar a muerte celular. Se pueden estudiar más de una dosis y más de un plan en un marco de fase II aleatorizado.

[0268] En cada enfermedad, se aborda a una población en la que ha fallado el estándar actual de cuidados:

•: LLC: pacientes que eran resistentes a Campath® y a la quimioterapia.

•: LNH de grado bajo: fallos de Rituxán® o CHOP-R

•: LNH intermedio: fallos de CHOP-R

•: Mieloma múltiple: fallos de la quimioterapia

•: La decisión de interrumpir el estudio o continuar con él se basa en la prueba de concepto terapéutico en Fase II

•: Determinar si se puede usar un marcador substituto como indicación precoz de eficacia clínica

•: Identificar las dosis para la Fase III

Fase III

[0269] La Fase III dependerá de dónde se detecte la señal en la fase II y de qué terapias competitivas se consideren como estándar. Si la señal se produce en una fase de la enfermedad en la que no hay estándar de terapia, entonces un estudio bien controlado de una sola rama podría servir como prueba crucial. Si hay agentes competitivos que se consideran estándar, entonces se realizan estudios comparativos directos.

LISTA DE SECUENCIAS [0270]

<110> Chen, Bao-Lu Hurst, Deborah Lee, Sang Hoon Long, Li Lu, Xiaofeng Luqman, Mohammad Yabannavar, Asha Zaror, Isabel

<120> Anticuerpos monoclonales antagonistas anti-CD40 y métodos para su utilización

<130> PP20107.004 (282916)

<150> 60/565.710

<151>

<150> 60/525.579

<151>

<150> 60/517.337

<151>

<160> 12

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 720

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia codificante para la cadena ligera del anticuerpo anti-CD40 humano 12.12

<221> CDS

<222> (1)...(720)

<400> 1

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Cadena ligera del anticuerpo anti-CD40 humano 12.12

<400> 2 10

<210> 3

<211> 2016 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: Secuencia codificante para la cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 humano 12.12 (con intrones) 20

<400> 3

<210> 4

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: Cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 humano 12.12 10

<400> 4 <210> 5

<211> 469

<212> PRT <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada de variante del anticuerpo anti-CD40 humano 12.12

<400> 5 <210> 6 <211> 239

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera del anticuerpo anti-CD40 humano 5.9

<400> 6

<210> 7

<211> 474

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 humano 5.9

20 <400> 7 <210> 8

<211> 474

<212> PRT <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada de variante del anticuerpo anti-CD40 humano 5.9

<400> 8 <210> 9

<211> 612

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(612)

5 <221> característica miscelánea

<222> (0)...(0)

<223> Secuencia codificante para la isoforma corta del CD40 humano

<400> 9 10

<210> 10

<211> 203 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 834

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(834) 15

<221> característica miscelánea

<222> (0)...(0)

<223> Secuencia codificante para la isoforma larga del CD40 humano

20 <400> 11

<210> 12

<211> 277

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Claims

Reivindicaciones

1. Un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano para uso en el tratamiento de un cáncer caracterizado por la expresión de CD40, donde dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano es seleccionado entre el grupo consistente en:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9, que se puede obtener de la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542, o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12, que se puede obtener de la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia del CD40 humano mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o en la SEC. Nº ID.: 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia del CD40 humano mostrada en la SEC. Nº ID.: 10 o en la SEC. Nº ID.: 12; y d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9, que puede ser obtenido de la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542, o con el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12, que puede ser obtenido de la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543, en un ensayo de unión competitiva,

donde dicho anticuerpo es administrado en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos.
2.

El anticuerpo para uso según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9, que puede ser obtenido de la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542, o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12, que puede ser obtenido de la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543.
3.

El anticuerpo para uso según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo incluye:

(i)

los residuos de la región determinante de complementariedad (RDC) de la SEC. Nº ID.: 2 y los residuos de la región determinante de complementariedad (RDC) de la SEC. Nº ID.: 4; o

(ii)

los residuos de la región determinante de complementariedad (RDC) de la SEC. Nº ID.: 6 y los residuos de la región determinante de complementariedad (RDC) de la SEC. Nº ID.: 7.
4.

El anticuerpo para uso según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en:

(i)

residuos 21-132 de la SEC. Nº ID.: 2;

(ii)

residuos 21-239 de la SEC. Nº ID.: 2;

(iii) SEC. Nº ID.: 2;

(iv)

residuos 20-139 de la SEC. Nº ID.: 4;

(v)

residuos 20-469 de la SEC. Nº ID.: 4;

(vi)

SEC. Nº ID.: 4;

(vii) residuos 20-469 de la SEC. Nº ID.: 5;

(viii) SEC. Nº ID.: 5;

(ix)

residuos 21-132 de la SEC. Nº ID.: 2 y residuos 20-139 de la SEC. Nº ID.: 4;

(x)

residuos 21-239 de la SEC. Nº ID.: 2 y residuos 20-469 de la SEC. Nº ID.: 4;

(xi)

residuos 21-239 de la SEC. Nº ID.: 2 y residuos 20-469 de la SEC. Nº ID.: 5;

(xii) SEC. Nº ID.: 2 y SEC. Nº ID.: 4; y

(xiii) SEC. Nº ID.: 2 y SEC. Nº ID.: 5.
5.

El anticuerpo para uso según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en:

(i)

residuos 21-132 de la SEC. Nº ID.: 6;

(ii)

residuos 21-239 de la SEC. Nº ID.: 6;

(iii) SEC. Nº ID.: 6;

(iv)

residuos 20-144 de la SEC. Nº ID.: 7;

(v)

residuos 20-474 de la SEC. Nº ID.: 7;

(vi)

SEC. Nº ID.: 7;

(vii) residuos 20-474 de la SEC. Nº ID.: 8;

(viii) SEC. Nº ID.: 8;

(ix)

residuos 21-132 de la SEC. Nº ID.: 6 y residuos 20-144 de la SEC. Nº ID.: 7;

(x)

residuos 21-239 de la SEC. Nº ID.: 6 y residuos 20-474 de la SEC. Nº ID.: 7;

(xi)

residuos 21-239 de la SEC. Nº ID.: 6 y residuos 20-474 de la SEC. Nº ID.: 8

(xii) SEC. Nº ID.: 6 y SEC. Nº ID.: 7; y

(xiii) SEC. Nº ID.: 6 y SEC. Nº ID.: 8.
6.

El anticuerpo para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho anticuerpo se une al CD40 humano con una afinidad (KD) de al menos aproximadamente 10-6 M o al menos 10-8 M.
7.

El anticuerpo para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal, donde dicho fragmento conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno CD40 humano.
8.

El anticuerpo para uso según la reivindicación 7, donde dicho fragmento es seleccionado entre el grupo consistente en un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv y un fragmento Fv de una sola cadena.
9.

El anticuerpo para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-8, donde dicho anticuerpo es producido en una línea de células CHO.
10.

El anticuerpo para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho anticuerpo es administrado en combinación con al menos otra terapia contra el cáncer.
11.

El anticuerpo para uso según la reivindicación 10, donde la otra terapia contra el cáncer es administrada antes, durante o después de la terapia con el anticuerpo antagonista anti-CD40.