ES2317002T3

ES2317002T3 - Patron.

Info

Publication number: ES2317002T3
Application number: ES04744299T
Authority: ES
Inventors: Lars c/o DakoCytomation Denmark A/S WINTHER; Kurt c/o DakoCytomation Denmark A/S PII
Original assignee: Dako Denmark ApS
Current assignee: Dako Denmark ApS
Priority date: 2003-07-08
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2024-07-08
Also published as: JP2007527991A; DE602004017466D1; JP4741486B2; ATE412900T1; GB0315991D0; US20160054300A1; EP1642131B1; WO2005003773A1; EP1642131A1; US20060154234A1

Abstract

Un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el patrón de referencia un medio de incrustación, una partícula compacta que tiene una forma compacta con una cantidad de entidad detectable acoplada químicamente a la misma y soportada por el medio de incrustación, donde la partícula compacta es una partícula compacta biológica, preferiblemente una partícula compacta celular.

Description

Patrón.

Campo

Esta invención se refiere a los campos de la citología y la histología. En particular, la invención se refiere a los campos de la inmunohistoquímica y citogenética molecular, en particular a la disposición de patrones para medir la presencia o cantidad de entidades detectables por ejemplo en células, tejidos y órganos.

Antecedentes

Se han usado técnicas histológicas y citológicas para analizar biopsias y otras muestras de tejido, y como ayuda en diagnósticos médicos. La citología es el estudio de la estructura de todos los componentes normales y anómalos de las células y los cambios, movimientos y transformaciones de dichos componentes. Las células se estudian directamente en estado vivo o se matan (fijan) y se preparan, por ejemplo, por incrustación, seccionamiento o tinción para la investigación en microscopios de campo brillante o electrónicos.

Un procedimiento de citología bien conocido es el procedimiento médico del ensayo de Papanicolau usado para detectar cáncer de cuello de útero. Se toma un raspado, cepillado o frotis de la superficie de la vagina o del cuello del útero y se prepara en un portaobjetos y se tiñe para el examen microscópico y el análisis citológico. El aspecto de las células determina si son normales, sospechosas o cancerosas.

La histología es el estudio de grupos de células especializadas llamados tejidos que se encuentran en la mayoría de las plantas y animales multicelulares. La investigación histológica incluye el estudio de la muerte y regeneración de los tejidos y la reacción de los tejidos a las lesiones u organismos invasores. Como el tejido normal tiene un aspecto característico, a menudo se utiliza un examen histológico para identificar el tejido enfermo. Los análisis de inmunohistoquímica, IHC, y de hibridación in situ, ISH, son herramientas útiles en el diagnóstico histológico y en el estudio de la morfología de los tejidos.

Tanto la inmunohistoquímica (IHC) como la hibridación in situ (ISH) pretenden detectar una entidad detectable en una muestra usando agentes de unión específicos capaces de unirse a la entidad detectable. En inmunohistoquímica (IHC), el agente de unión específico comprende un anticuerpo, y la entidad detectable comprende un polipéptido, proteína o epítopo en su interior. En la hibridación in situ (ISH), la entidad detectable comprende un ácido nucleico (incluyendo ADN y ARN) en la muestra, y el agente de unión específico comprende una sonda tal como una sonda de ácido nucleico. La disponibilidad cada vez mayor de estos anticuerpos y sondas puede ayudar al diagnóstico diferencial del tejido enfermo y normal. En Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual) se describen con detalle métodos de hibridación in situ e inmunohistoquímica.

Las técnicas IHC e ISH requieren una serie de etapas de tratamiento realizadas en una sección de tejido montada en un portaobjetos u otro soporte plano para destacar por medio de tinción selectiva ciertos indicadores morfológicos de patologías.

De esta manera, por ejemplo, en la IHC, se toma una muestra de un individuo, se fija y se expone a anticuerpos contra el antígeno de interés. Pueden ser necesarias etapas de procesamiento adicionales, por ejemplo, la recuperación de antígenos, la exposición a anticuerpos secundarios (normalmente acoplados a una enzima adecuada), lavado y la exposición a sustratos enzimáticos cromogénicos, etc., para revelar el patrón de unión al antígeno. En general hay dos categorías de materiales histológicos: (a) preparaciones que comprenden tejidos y/o células frescas, que generalmente no se han fijado con agentes de fijación basados en aldehído, y (b) muestras de tejido fijadas e incrustadas, que a menudo constituyen el material de archivo.

En el caso de la ISH, se toma una muestra de un individuo, se fija y se expone a una sonda contra el ácido nucleico de interés. La entidad detectable típicamente comprende un ácido nucleico detectable, tal como un ADN y ARN, incluyendo ARN mensajero y ARNsi (ARN interferente pequeño o ARN interferente corto). La detección de los niveles de ARN/ADN indica el nivel de expresión de un gen particular y, por lo tanto, puede usarse para detectar una afección (tal como una patología) de una célula, tejido, órgano u organismo. Al ser la entidad detectable un ácido nucleico, típicamente se desnaturaliza para exponer los sitios de unión. La sonda típicamente es un ácido nucleico bi- o monocatenario tal como ADN o ARN, y se marca usando marcadores radiactivos tales como ^{31}P, ^{33}P o ^{32}S, o de forma no radiactiva usando marcadores tales como digoxigenina, o marcadores fluorescentes, de los que muchos se conocen en la técnica.

Se conocen muchos métodos para fijar e incrustar muestras de tejidos, por ejemplo, fijación con alcohol. Sin embargo, las técnicas de fijación/incrustación usadas más generalmente emplean fijación con formalina y posterior incrustación con parafina, FFPE. Un procedimiento de tinción FFPE IHC "típico" puede implicar las etapas de: corte y ajuste del tejido, fijación, deshidratación, infiltración de parafina, corte en secciones finas, montaje en portaobjetos de vidrio, calentamiento en horno, desparafinación, rehidratación, recuperación de antígeno, etapas de bloqueo, aplicación de anticuerpo primario, lavado, aplicación de conjugado anticuerpo secundario-enzima, lavado, aplicación de sustrato enzimático cromogénico, lavado, tinción con colorante de contraste, colocación de cubreobjetos y examen bajo un microscopio. En la ISH se realizan etapas similares. Después se evalúa la cantidad del antígeno relevante u otra entidad detectable tal como un ácido nucleico detectado por estas técnicas, para determinar si está por encima de un cierto umbral mínimo predeterminado y, por lo tanto, relevante desde el punto de vista del diagnóstico. Después puede planearse un tratamiento adecuado para el individuo si se considera necesario.

En la Figura 1 se muestra un ejemplo de tinción inmunohistoquímica para el diagnóstico, donde los tejidos se tiñen para el antígeno de cáncer de mama HER2. Los tejidos que no expresan el antígeno no se tiñen sustancialmente por el anticuerpo anti-HER2 (Figura 1A), mientras que los que expresan la proteína se tiñen en un grado sustancial por el anticuerpo anti-HER2 (Figura 1D).

Sin embargo, un problema importante en estas técnicas IHC e ISH se debe a la necesidad de realizar una determinación precisa de si las células de un tejido a examinar expresan el antígeno o la entidad detectable tal como un ácido nucleico a un nivel significativo desde el punto de vista del diagnóstico o no (es decir, si las células son "positivas" o "negativas" para la expresión de un antígeno). Hay una ausencia general de estandarización de técnicas de laboratorio, que lleva a la necesidad de un juicio subjetivo de los resultados. Incluso pequeñas diferencias de procedimiento pueden influir en el resultado final de la tinción, y la interpretación final de la tinción de la misma población celular puede no ser exactamente igual de un laboratorio a otro. Incluso cuando se incluyen controles internos (incluyendo controles positivos o negativos, o ambos) en los procedimientos, las variaciones en los protocolos de pre-tratamiento y de tinción entre diferentes trabajadores producirán variaciones en el control interno. Otras fuentes analíticas de error incluyen la calidad y cantidad de reactivos, la eficacia de recuperación de antígeno y diferencias en la instrumentación.

Estos problemas dificultan la evaluación de nuevos factores de pronóstico alternativos, produciendo resultados contradictorios para la mayoría de los factores de pronóstico en relación con su valor de pronóstico.

La necesidad de clasificación y estandarización se ha tratado en la técnica anterior de varias maneras. Por ejemplo, un kit de diagnóstico puede contener fotomicrografías de diferentes series de células a diversos niveles de tinción. El kit contiene una indicación de que una serie particular de células representa el punto límite o umbral, siendo las células que corresponden o superan esa tinción "positivas", y siendo las células que tiene menos tinción "negativas". Algunos kits más sofisticados pueden contener muestras reales de tejidos o células, que ya se han teñido, sobre portaobjetos de control. Por ejemplo, un kit puede incluir varios portaobjetos de referencia con secciones de líneas celulares de carcinoma de mama FFPE que representan diferentes niveles de una expresión de proteína específica de mama. En la Figura 1 se muestra un ejemplo de dicho sistema de clasificación para el antígeno HER2, donde los niveles de tinción de referencia de 0 ó 1+ se consideran negativos (Figuras 1A y 1B respectivamente), mientras que los de 2+ ó 3+ se consideran positivos para ese antígeno (Figuras 1C y 1D respectivamente).

Pueden incluirse descripciones escritas en relación con el patrón o distribución de la tinción para ayudar al análisis. Por ejemplo, Puntuación 0 (negativa): no se observa tinción, o se observa tinción de la membrana en menos de 10% de las células tumorales. Puntuación 1+ (negativa): se detecta una tinción de membrana ligera o apenas perceptible en más de 10% de las células tumorales. Las células sólo se tiñen en parte de la membrana. Puntuación 2+ (débilmente positiva): se observa una tinción de membrana de débil a moderada completa en más de 10% de las células tumorales. Puntuación 3+ (fuertemente positiva): se observa una tinción de membrana fuerte completa en más de 10% de las células tumorales.

Sin embargo, aunque con estos kits es posible establecer los niveles de referencia de la tinción, existe una dificultad considerable para establecer una calidad de tinción uniforme de las propias muestras. Esto se debe a una diversidad de factores diferentes que incluyen la falta de homogeneidad del material tisular, la naturaleza laboriosa y compleja de los procedimientos, la variabilidad en la calidad de los reactivos (incluyendo la afinidad y especificidad del anticuerpo/sonda), y la naturaleza subjetiva de la interpretación realizada por el especialista en la técnica. Además, otras fuentes de variabilidad en la tinción de la muestra incluyen las condiciones en las que se recogen, se procesan y se almacenan las muestras de tejido, la variabilidad en los procedimientos de recuperación de epítopo, y la precipitación del cromógeno catalizada con enzima.

Como intento de solucionar estos problemas, en la técnica anterior es conocida la inclusión de conjuntos de referencia de tejidos o células no teñidas con diferentes niveles de expresión del antígeno relevante (o ácido nucleico) con un kit de diagnóstico. Las células que constituyen las referencias pueden comprender muestras de biopsia (es decir, muestras de tejido) de individuos enfermos y no enfermos conocidos, o de individuos que expresan el antígeno o el ácido nucleico detectable relevante a niveles mayores de lo normal pero que no están clínicamente enfermos. Además, también pueden usarse como patrones de referencia las células del cultivo de tejidos que pueden transfectarse con vectores de expresión para permitir que expresen el antígeno o ácido nucleico detectable a diversos niveles. Los conjuntos de referencia comprenden portaobjetos con células fijadas con formalina e incluidas en parafina, pero que no están teñidas de otra manera, y que están incrustadas en parafina. Los portaobjetos después se procesan en paralelo con la muestra para revelar el nivel y patrón de tinción de antígeno (o ácido nucleico detectable). Finalmente, la muestra se compara con el conjunto de referencia para determinar si los niveles de expresión de ácido nucleico o de proteína son significativos desde el punto de vista del diagnóstico.

Los ejemplos de líneas celulares usadas actualmente como células de referencia en citoquímica incluyen la línea de células positivas para HER2 conocida como SK-BR-3, la línea celular positiva para el receptor de estrógenos, ER, negativa para el receptor de progesterona, PR, y positiva para p53, conocida como HCC70, la línea celular positiva para PR y negativa para ER conocida como HCC2218, la línea celular positiva para el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) conocida como NCI-H23, la línea celular positiva para el receptor de andrógenos y para el antígeno prostático específico (PSA) conocida como MDA PCA 2b, y la línea celular positiva para citoqueratina 19 y p53, conocida como HCC38. Muchas líneas celulares humanas y no humanas se pueden obtener a través de diversas organizaciones.

Sin embargo, existe un problema con estos patrones de referencia ya que es necesario identificar específicamente tejidos y células que expresan el antígeno o el ácido nucleico detectable a los diversos niveles de clasificación, y obtenerlos para el uso. Cuando se usan células de cultivo de tejidos, es necesario clonar primero el gen en cuestión y después diseñar y construir vectores de expresión apropiados. Después es necesario que estos vectores se introduzcan en las células por transfección, y que la expresión del gen se regule a alto nivel. Como las líneas celulares están creciendo de forma continua y en muchos laboratorios, el nivel de expresión de proteína puede cambiar a lo largo del tiempo, y es posible que no tenga la misma expresión de proteína o de ARNm de un laboratorio a otro. Tanto las líneas celulares transfectadas de forma transitoria como las líneas celulares transfectadas denominadas estables son lábiles durante el crecimiento, obteniéndose cambios de expresión de dianas y, por consiguiente, cambios en el nivel y en los patrones de tinción.

Además, hay problemas relacionados con la necesidad de incluir un material biológico potencialmente peligroso con los kits de diagnóstico. Con el uso de material de origen humano están asociados problemas reguladores y éticos; este material humano no es fácil de obtener en grandes cantidades a partir de una sola fuente, y puede ser necesario reunir material de diferentes fuentes, lo cual lleva a una mayor variabilidad.

Otras técnicas conocidas incluyen el uso de puntos de referencia hechos de geles de polímeros, que están unidos a portaobjetos de vidrio. El material polimérico contiene epítopos relevantes a teñir. Los dispositivos de control de calidad descritos en el documento WO 00/62064 y Sompuram et al., Clin. Chem., 48 (3), pág. 410, 2002 emplean dianas analíticas sustitutas, que comprenden péptidos sintéticos que simulan la conformación tridimensional del epítopo al que se une un anticuerpo, que se aplican y se acoplan a la superficie superior de un portaobjetos de vidrio.

Se sabe cómo acoplar colorantes a perlas hechas de poliestireno, que es un material hecho por el hombre, para uso en el calibrado del aparato de citometría de flujo. Sin embargo, no se describen dichas perlas de poliestireno soportadas en un medio de soporte, tal como parafina u otros sólidos o semisólidos.

También se sabe cómo acoplar anticuerpos contra una hormona indicadora de embarazo en células de oveja, para uso en pruebas de embarazo. A las células de oveja se les añade una muestra de orina de un sujeto de ensayo, y se observa visualmente en la aglutinación de las células. La aglutinación de las células de oveja indica la presencia de la hormona indicadora de embarazo en la muestra y, por lo tanto, el embarazo del individuo.

El documento EP0345953 (Shandon Scientific Limited) describe el uso de un material de ensayo para facilitar la estandarización de técnicas de inmunotinción. El material de ensayo comprende gránulos de un gel absorbente que absorben un antígeno de interés, y se fijan. Los gránulos se cortan a partir de un gel de agar solidificado usando un cortador de pocillos de 1,5 ó 2,5 mm de diámetro y se instalan en pocillos individuales en un bloque de un gel.

El documento WO91/05263 (Battifora) describe un control que es una sección o corte de un medio, en el que están incrustadas las células que expresan una cantidad definida de una molécula diana. Las células pueden incluir células de cultivo tisular, por ejemplo, líneas de células de cáncer de mama, o células transfectadas.

El documento WO 00/23799 (Smith) describe el uso de líneas de células tumorales que expresan la proteína p53 como patrones de inmunohistoquímica. Las células se estandarizan con respecto a la calidad por la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). El documento WO 00/23799 no describe el acoplamiento o acoplamiento químico de p53 a las células.

Compendio

En general, de acuerdo con la invención, se proporcionan patrones de referencia para entidades detectables. La entidad detectable preferiblemente comprende una entidad cuya presencia o cantidad se desea establecer en una muestra. Los patrones de referencia preferiblemente contienen una cantidad conocida o predeterminada de la entidad detectable, que se puede revelar directa o indirectamente.

Los patrones de referencia descritos en la presente memoria son adecuados para uso en comparación con una muestra que se sospecha que contiene la entidad detectable, o en la que se desconoce la cantidad de la entidad detectable. De esta manera, la comparación del patrón de referencia con la muestra puede usarse para medir la cantidad o la presencia de la entidad detectable en la muestra. Por lo tanto, los patrones de referencia pueden usarse para proporcionar una cantidad de referencia, una concentración de referencia, una señal de referencia, etc. de la entidad detectable, para uso en comparaciones.

En una realización de la invención, un patrón de referencia comprende una partícula compacta que es una partícula compacta biológica, preferiblemente celular. Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el patrón de referencia un medio de incrustación, una partícula compacta que tiene una forma compacta con una cantidad de entidad detectable acoplada químicamente a la misma y soportada por el medio de incrustación, donde la partícula compacta es una partícula compacta biológica, preferiblemente celular.

Esta realización se distingue de las células de oveja descritas anteriormente, ya que las células de oveja reaccionan con la hormona indicadora de embarazo en la muestra y, por lo tanto, indican su presencia proporcionando un resultado de SÍ/NO. Por el contrario, los patrones de referencia de la presente memoria no se usan para la detección per se, sino que proporcionan un patrón pasivo o control contra el cual se va a juzgar un ensayo. Además, la entidad detectable en el patrón de referencia de la presente memoria se acopla químicamente a la partícula compacta de origen biológico, preferiblemente celular. Por el contrario, en la técnica anterior la entidad a detectar, es decir, la hormona indicadora de embarazo, está en la muestra y no se une o acopla a las células de oveja. Por lo tanto, las células de oveja no pueden y no realizan la función de proporcionar un patrón de referencia.

En una segunda realización de la invención, un patrón de referencia comprende una partícula compacta que se soporta por un medio de incrustación. Por lo tanto, de acuerdo con un 2º aspecto de la invención, se proporciona un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el patrón de referencia un medio de incrustación, y una partícula compacta que tiene una forma compacta con una cantidad de entidad detectable acoplada a la misma y soportada por el medio de incrustación, donde la partícula compacta es una partícula compacta no biológica que tienen dimensiones parecidas a las de una célula.

La expresión "dimensiones parecidas a las de una célula" se explica con detalle más adelante en este documento, pero puede variar de 1 nm a menos de 1500 micrómetros, preferiblemente es de aproximadamente 100 \mum.

Preferiblemente, una cantidad detectable de la entidad detectable está presente en una región definida en una sección transversal del patrón de referencia. Preferiblemente, la entidad detectable adopta una forma compacta, preferiblemente una forma no extendida o no alargada, en el medio de incrustación. Preferiblemente, la forma compacta es tal que la relación entre la mayor dimensión y la menor dimensión es menor de 5:1, preferiblemente menor
de 2:1.

En realizaciones preferidas, la forma compacta comprende una forma en partículas, uniforme o regular. La forma compacta puede comprender una forma esférica, una forma ovoide, una forma elipsoidal, una forma de disco, una forma de célula, una forma de píldora o una forma de cápsula.

Más preferiblemente, la entidad detectable es una que no expresa de forma natural la partícula compacta, tal como una célula. En realizaciones preferidas, la entidad detectable es heteróloga para la partícula compacta. La entidad detectable puede acoplarse químicamente a la partícula compacta cuando es una partícula compacta no biológica.

Preferiblemente, la partícula compacta biológica comprende una célula o un virus. Preferiblemente, la célula o virus no expresa la entidad detectable. La célula puede seleccionarse entre el grupo consistente en: un microorganismo, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula eucariota, una célula de insecto, una célula animal, una célula de mamífero, una célula de ratón y una célula humana. La célula preferiblemente comprende una célula de insecto, preferiblemente una célula Sf9, o una célula de mamífero, preferiblemente una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO).

Como alternativa o además, la partícula biológica compacta puede comprender un orgánulo. El orgánulo puede comprender una mitocondria, un plástido, un cloroplasto o un núcleo. La entidad detectable preferiblemente carece sustancialmente de material celular.

Como alternativa o además, la partícula compacta puede comprender una microperla o una micela.

En realizaciones muy preferidas, la forma compacta tiene una dimensión menor de 1500 \mum, preferiblemente menor de 1000 \mum, menor de 500 \mum, menor de 250 \mum, menor de 100 \mum, preferiblemente menor de 50 \mum, más preferiblemente menor de 20 \mum y aún más preferiblemente menor de 10 \mum.

La región definida puede estar presente en al menos otra sección transversal del patrón de referencia, que comprende preferiblemente una cantidad similar de entidad detectable. La entidad detectable puede incrustarse en el medio de incrustación.

En realizaciones preferidas, la entidad detectable comprende una diana relevante desde el punto de vista del diagnóstico. La entidad detectable puede comprender un antígeno, un epítopo, un péptido, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, o dos o más de una pluralidad de cualquiera de los anteriores, o combinaciones de uno o más de los anteriores.

La entidad detectable preferiblemente se selecciona entre el grupo consistente en: un hapteno, una molécula biológicamente activa, un antígeno, un epítopo, una proteína, un polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico, un virus, un partícula parecida a un virus, un nucleótido, un ribonucleótido, un desoxirribonucleótido, un desoxirribonucleótido modificado, un heteroduplex, una nanopartícula, un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido, un carbohidrato, un colorante y mezclas, fusiones, combinaciones o conjugados de los anteriores.

Preferiblemente, la entidad detectable se selecciona entre el grupo consistente en: un hapteno, una molécula biológicamente activa, un antígeno, un epítopo, una proteína, un polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico, un virus, una partícula parecida a un virus, un nucleótido, un ribonucleótido, un desoxirribonucleótido, un desoxirribonucleótido modificado, un heteroduplex, una nanopartícula, un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido, un carbohidrato, un colorante, una diana relevante desde el punto de vista del diagnóstico, preferiblemente seleccionada entre el grupo consistente en: un antígeno, un epítopo, un péptido, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, o dos o más de una pluralidad de cualquiera de los anteriores, o mezclas, fusiones, combinaciones o conjugados de uno o más de los anteriores.

En realizaciones preferidas, la entidad detectable comprende uno o más de HER2, receptor de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR), p16, Ki-67, c-kit, cadena gamma 2 de laminina 5 y proteína del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ácidos nucleicos que los codifican y formas modificadas postraduccionalmente, preferiblemente formas fosforiladas de los mismos.

La presencia y/o cantidad de la entidad detectable puede revelarse por un agente de unión, preferiblemente un agente de unión marcado, que puede seleccionarse entre el grupo consistente en: un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo capaz de unirse específicamente a la entidad detectable, un ácido nucleico tal como un ADN o un ARN, preferiblemente un ácido nucleico capaz de unirse específicamente a la entidad detectable, un ácido proteína nucleico (APN), un colorante, un tinte especial, Au-cloruro, Hematoxilina-Eosina (H & E), tinción con metenamina-plata de Gomori (GMS), tinción con Ácido Peryódico-Schiff (PAS), Azul Tricromo, Tricromo de Masson, Azul de Prusia, Giemsa, Diff-Quick, Reticulum, Rojo Congo, Azul Alcián, Steiner, AFB, PAP, Gram, Mucicarmina, Verhoeff-van Gieson, Elastico, Carbol Fucsina y tinte de Golgi.

La presencia de la entidad detectable en una célula, tejido, órgano u organismo, en realizaciones muy preferidas, indica una enfermedad o afección. La región definida puede incluir un área de referencia, comprendiendo el área de referencia la entidad detectable en una cantidad predefinida. La cantidad de la entidad detectable en el área de referencia preferiblemente se compara con la cantidad de la entidad detectable en una muestra para determinar la presencia, cantidad o concentración de la entidad detectable en la muestra.

El patrón de referencia preferiblemente está en forma de una caja rectangular.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona un patrón de referencia para una entidad detectable, que comprende: (a) un medio de incrustación en una forma de caja preferiblemente que es sustancialmente rectangular; y (b) una célula con una cantidad de entidad detectable acoplada a la misma.

El patrón de referencia puede comprender dos o más partículas compactas, teniendo cada una, una entidad detectable unida. Puede comprender dos o más entidades detectables diferentes, estando cada una de ellas unida a la misma partícula compacta o a una partícula compacta diferente. Puede comprender dos o más partículas compactas que comprenden diferentes cantidades de entidad detectable en cada una.

En realizaciones preferidas, una sección plana del patrón de referencia comprende una pluralidad de áreas sobre las cuales se presenta la entidad detectable a diferente densidad. Una sección plana del patrón de referencia puede comprender una primera área que comprende la entidad detectable sustancialmente a una densidad significativa para el diagnóstico.

El patrón de referencia puede comprender además un control que comprende una partícula compacta que no comprende sustancialmente ninguna entidad detectable.

El medio de incrustación, en realizaciones preferidas, se selecciona entre el grupo consistente en: hielo, cera, parafina, resina acrílica, resina de metacrilato, epoxi, Epon, Araldite, Lowicryl, K4M y LR White y Durcupan.

De acuerdo con un 4º aspecto de la invención, se proporciona una sección plana, preferiblemente una sección plana transversal, preferiblemente con un espesor sustancialmente uniforme, de un patrón de referencia como se ha
descrito.

De acuerdo con un 5º aspecto de la invención, se proporciona un soporte, preferiblemente un portaobjetos tal como un portaobjetos de microscopio, que comprende dicha sección plana montada sobre el mismo.

De acuerdo con un 6º aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende un patrón de referencia como se ha indicado, junto con un agente de unión capaz de unirse específicamente a la entidad detectable, opcionalmente junto con instrucciones de uso.

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De acuerdo con un 7º aspecto de la invención, se proporciona un patrón de referencia, kit o sección plana como se ha descrito, donde el patrón de referencia se ha teñido preferiblemente con un anticuerpo o una sonda de ácido nucleico.

De acuerdo con un 8º aspecto de la invención, se proporciona un kit de diagnóstico para detectar la presencia o cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica, que comprende: (a) un patrón de referencia, una sección plana o portaobjetos como se ha descrito; (b) un agente de unión capaz de unirse de forma específica a la entidad detectable y, opcionalmente, (c) instrucciones de uso.

De acuerdo con un 9º aspecto de la invención, se proporciona una combinación de un patrón de referencia, una sección plana, soporte, kit o kit de diagnóstico como se ha indicado junto con un agente terapéutico capaz de tratar o aliviar al menos uno de los síntomas de una enfermedad o afección en un individuo.

Preferiblemente, al individuo se le diagnostica que padece o es susceptible de padecer una enfermedad o afección, si la cantidad de entidad detectable en la muestra o componente biológico es similar o mayor que la cantidad en el patrón de referencia. Preferiblemente, el agente de unión o agente terapéutico comprende un anticuerpo contra la entidad detectable.

De acuerdo con un 10º aspecto de la invención, se proporciona el uso de un patrón de referencia, una sección plana o un kit como se ha descrito, para determinar la presencia o cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica.

De acuerdo con un 11º aspecto de la invención, se proporciona un método para comparar la cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica con un patrón de referencia, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar una muestra biológica y obtener una primera señal indicadora de la cantidad de entidad detectable en la muestra biológica, o un componente de la misma; (b) proporcionar un patrón de referencia, sección plana, soporte, kit o kit de diagnóstico como se ha indicado anteriormente; (c) obtener una segunda señal de referencia indicativa de la cantidad de entidad detectable en el patrón de referencia o sección plana del mismo; y (d) comparar la primera señal obtenida en (a) con la señal de referencia.

Preferiblemente, la señal detectable se selecciona entre el grupo consistente en: radiación, densidad óptica, reflectancia, radiactividad, fluorescencia y actividad enzimática.

Preferiblemente, el patrón de referencia o su sección plana se somete a las mismas una o más etapas o condiciones, preferiblemente sustancialmente todas, que la muestra biológica, tales como: montaje en un portaobjetos, calentamiento en un horno, desparafinación, rehidratación, recuperación de antígeno, bloqueo, exposición al anticuerpo, exposición al anticuerpo primario, exposición a una sonda de ácido nucleico, lavado, exposición a un conjugado de anticuerpo secundario-enzima, exposición a sustrato enzimático, exposición a un sustrato cromogénico, y tinción con un colorante de contraste.

La muestra biológica puede comprender una célula, tejido u órgano, preferiblemente una célula, tejido u órgano de un organismo que se sospecha que padece una enfermedad o afección.

De acuerdo con un 12º aspecto de la invención, se proporciona un método para obtener una indicación adecuada para el diagnóstico de una enfermedad o una afección en un individuo, comprendiendo el método comparar la cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica de un individuo o componente del mismo con un patrón de referencia, por un método de acuerdo con el 11º aspecto de la invención. Preferiblemente, al individuo se le diagnostica que padece o es susceptible de padecer la enfermedad trastorno si la cantidad de entidad detectable en la muestra biológica o componente es similar o mayor que la del patrón de referencia.

De acuerdo con un 13º aspecto de la invención, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad o una afección en un individuo, comprendiendo el método las etapas de diagnosticar la enfermedad o afección en un individuo por un método de acuerdo con el 13º aspecto de la invención, y administrar un agente terapéutico al individuo.

Preferiblemente, el agente terapéutico comprende un anticuerpo capaz de unirse a la entidad detectable.

De acuerdo con un 14º aspecto de la invención, se proporciona un método para evaluar la eficacia o éxito de un procedimiento, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un patrón de referencia como se ha indicado anteriormente, en el que una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado del procedimiento; (b) realizar el procedimiento sobre el patrón de referencia; y (c) detectar un cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable.

Preferiblemente, una propiedad detectable de la entidad detectable cambia como resultado de un procedimiento satisfactorio, detectándose dicho cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable para establecer que el procedimiento es satisfactorio.

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Preferiblemente, una propiedad detectable de la entidad detectable cambia como resultado de un procedimiento insatisfactorio, detectándose dicho cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable para establecer que el procedimiento no es satisfactorio. El procedimiento puede seleccionarse entre el grupo consistente en: un procedimiento de hibridación in situ, un procedimiento inmunohistoquímico, desparafinación, recuperación de antígeno, bloqueo, bloqueo de biotina endógena, bloqueo de enzima endógena, una etapa de lavado, incubación con un agente de revelado tal como un anticuerpo primario, incubación con componentes de visualización secundarios, tinción con cromógeno, adquisición de información de tinción y análisis.

Preferiblemente, el procedimiento es un procedimiento de recuperación de antígeno, y en el que la propiedad detectable de la entidad detectable comprende el enmascarado o desenmascarado de uno o más epítopos. Preferiblemente la entidad detectable en el patrón de referencia se modifica para enmascarar uno o más epítopos, de los que algunos o todos se desenmascaran en un procedimiento de recuperación de antígeno que es satisfactorio.

Preferiblemente, el procedimiento es un procedimiento de desparafinación, y en el que la propiedad detectable de la entidad detectable comprende la presencia o cantidad de entidad detectable en el patrón de referencia después del procedimiento de desparafinación. La entidad detectable en el patrón de referencia preferiblemente es soluble en el medio de desparafinación, y al menos una parte, preferiblemente toda la entidad detectable se retira después de un procedimiento de desparafinación satisfactorio.

De acuerdo con un 15º aspecto de la invención, se proporciona el uso de un patrón de referencia como se ha descrito como un patrón de validación de recuperación de antígeno, un patrón de desparafinación, un patrón de validación de bloqueo, un patrón de validación de lavado, un patrón de validación de anticuerpo primario, un patrón de validación de anticuerpo secundario, un patrón de calibración, o un patrón de diagnóstico.

De acuerdo con un 16º aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de incrustación; (b) proporcionar una partícula compacta que tiene una forma compacta, donde la partícula compacta es una partícula compacta biológica, preferiblemente celular, preferiblemente una partícula compacta celular; (c) acoplar químicamente una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta y (d) soportar o incrustar la partícula compacta en el medio.

De acuerdo con un 17º aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de incrustación; (b) proporcionar una partícula compacta que tiene una forma compacta, donde la partícula compacta es una partícula compacta no biológica que tiene dimensiones parecidas a las de una célula; (c) acoplar una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta, y (d) soportar o incrustar la partícula compacta en el medio.

De acuerdo con un 18º aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar una partícula compacta que tiene una forma compacta de origen biológico, preferiblemente celular, acoplar químicamente una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta, y soportar o incrustar la partícula compacta en un medio de incrustación.

De acuerdo con un 19º aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar una partícula compacta que tiene una forma compacta, donde la partícula compacta es una partícula compacta no biológica que tiene dimensiones parecidas a las de una célula, acoplar una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta, y soportar o incrustar la partícula compacta en un medio de incrustación.

De acuerdo con un 20º aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método soportar una partícula compacta que tiene una forma compacta y dimensiones similares a las de una célula, que tiene una cantidad de entidad detectable acoplada químicamente a la misma en un medio de incrustación, donde la partícula compacta es una partícula compacta biológica, preferiblemente celular, preferiblemente una partícula compacta celular.

De acuerdo con un 21º aspecto de invención, se proporciona un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método soportar una partícula compacta que tiene una forma compacta y dimensiones parecidas a las de una célula, que tiene una cantidad de entidad detectable acoplada a la misma en un medio de incrustación, donde la partícula compacta es una partícula compacta no biológica que tiene dimensiones parecidas a las de una célula.

De acuerdo con un 22º aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de incrustación; (b) formar una cantidad de entidad detectable en una forma generalmente compacta y dimensiones parecidas a las de una célula por medio de (i) acoplamiento químico a una partícula compacta que es una partícula compacta biológica, preferiblemente celular, preferiblemente una partícula compacta celular, o (ii) acoplamiento a una partícula compacta que es una partícula compacta no biológica que tiene dimensiones parecidas a las de una célula; y (c) incrustar la entidad detectable en el medio de incrustación.

El método puede comprender además unir una cantidad de una segunda entidad detectable a la partícula compacta, o a una segunda partícula compacta. Además puede comprender unir una segunda cantidad diferente de la o cada entidad detectable a la o cada partícula compacta. Cada partícula compacta puede incrustarse en el medio de incrustación.

La o cada entidad detectable puede acoplarse covalentemente a su partícula compacta respectiva.

De acuerdo con un 23º aspecto de la invención, se proporciona un patrón de referencia para una entidad detectable, que comprende una entidad detectable acoplada químicamente a una célula e incrustada en un medio de incrustación.

De acuerdo con un 24º aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de proporcionar una célula o un virus, acoplar químicamente una cantidad de entidad detectable a la célula o virus, e incrustar la célula o virus en un medio de incrustación.

La célula preferiblemente no expresa la entidad detectable. Preferiblemente, la célula se selecciona entre el grupo consistente en: un virus, una célula bacteriana, una célula eucariota, una célula de insecto, preferiblemente una célula Sf9, una célula animal, una célula de mamífero, preferiblemente una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO), una célula de ratón y una célula humana.

De acuerdo con un 25º aspecto de la invención, se proporciona un método para establecer una distribución celular de entidad detectable en un patrón de referencia, comprendiendo el método proporcionar una célula o un componente de la misma que no expresa una entidad detectable, acoplar químicamente una cantidad de la entidad detectable a la célula o componente, y soportar la célula o componente en un medio de incrustación.

El patrón de referencia descrito en la presente memoria puede denominarse convenientemente "Célula Reflectora".

Breve descripción de las figuras

A continuación se describen con detalle realizaciones de la invención haciendo referencia a modo de ejemplo a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra un sistema de calificación o de puntuación típico de tinción de antígenos para la evaluación de la expresión de proteínas. Se tiñe tejido de mama humano en relación con el antígeno HER2 con anticuerpo anti-HER2 usando HercepTest^{TM}, Dakocytomation, código Nº K 5204. Figura 1A: Puntuación 0 (negativa). No se observa tinción, o se observa tinción de la membrana en menos de 10% de células tumorales; Figura 1B: Puntuación 1+ (negativa). Se detecta tinción de membrana ligera o apenas perceptible en más de 10% de las células tumorales. Las células sólo se tiñen en parte de la membrana; Figura 1C: Puntuación 2+ (débilmente positiva). Se observa una tinción de membrana completa de débil a moderada en más de 10% de las células tumorales; Figura 1D: Puntuación 3+ (fuertemente positiva). Se observa una tinción de membrana completa fuerte en más de 10% de las células tumorales.

La Figura 2 muestra una realización del patrón de referencia descrito en esta memoria. En esta realización, se modifica una partícula compacta, por ejemplo, químicamente, con una entidad detectable tal como una diana relevante desde el punto de vista del diagnóstico, y se incrusta en bloques de parafina. Figura 2A: patrón de referencia que comprende una sola partícula compacta esférica; Figura 2B: patrón de referencia que comprende múltiples partículas compactas esféricas; Figura 2C: patrón de referencia que comprende una sola partícula compacta en una forma cilíndrica plana; Figura 2D: patrón de referencia que comprende múltiples partículas compactas cilíndricas planas, en orientaciones aleatorias. Los cortes del patrón de referencia pueden estar teñidos para IHC o ISH como cualquier otro "tejido".

La Figura 3 muestra ejemplos de formas de partícula compactas. Figura 3A: partícula compacta con forma esférica. Figura 3B: partícula compacta con forma cilíndrica, incluyendo una forma cilíndrica plana. Figura 3C: partícula compacta con una forma de baldosa o cuboide, de cubo o cúbica. Las Figuras 3D y 3E muestran partículas compactas con forma irregular.

La Figura 4 muestra una realización de un patrón de referencia que tiene una forma alargada. También se muestra el patrón de entidad detectable en los cortes y secciones a través de partes del patrón de referencia mostradas en líneas discontinuas. Figura 4A: el patrón de referencia puede comprender una sola o múltiples partículas compactas, en este caso en forma cilíndrica plana, soportadas en un medio de incrustación. La partícula o partículas compactas tienen una o más entidades detectables unidas a ellas. Figura 4B: una sección transversal del patrón de referencia incluye un área definida que comprende una cantidad de la entidad detectable, preferiblemente una cantidad definida de entidad detectable. Figura 4C: cuando se disponen múltiples partículas compactas en el patrón de referencia, uno o más cortes o secciones del patrón de referencia incluirán más de un área definida que comprende una cantidad o cantidades de la entidad detectable.

La Figura 5 demuestra que múltiples partículas compactas pueden ponerse en haces perpendiculares a la dirección de corte, y cortarse en secciones finas que contienen puntos de referencia uniformes. La Figura 5A muestra una realización del patrón de referencia en la que una pluralidad de partículas compactas se disponen en un patrón uniforme en el medio de incrustación. La Figura 5B muestra una realización del patrón de referencia en la que una pluralidad de partículas compactas se disponen en un patrón no uniforme en el medio de incrustación. Más adelante se muestra el patrón de entidad detectable en los cortes y secciones a través de partes del patrón de referencia mostradas en líneas discontinuas.

La Figura 6 muestra un ejemplo de cómo puede procesarse el patrón de referencia, o un corte o sección del mismo, preferiblemente en paralelo con una muestra biológica que se ha fijado, incrustado y cortado.

La Figura 7 muestra varios ejemplos de partículas compactas de origen celular o biológico. Figura 7A: bacteriófago o virus, bacteria; Figura 7B: células bacterianas, colonias de células bacterianas; Figura 7C: glóbulos rojos, Figura 7D: una célula animal; Figura 7E: una célula vegetal.

La Figura 8 muestra las etapas en la fabricación de un patrón de referencia que comprende una partícula compacta celular; sólo se muestra la unión a la superficie de la célula. Figura 8A: entidad detectable; Figura 8B: célula; Figura 8C: célula con entidad detectable unida a la misma, opcionalmente a través de un enlazador o espaciador (12); Figura 8D: patrón de referencia que comprende una célula con una entidad detectable unida a la misma y soportada en un medio de soporte; Figura 8E: patrón de referencia que comprende una pluralidad de células con entidad detectable unida a la misma y soportada en un medio de soporte; Figura 8F: sección o corte a través de una parte del patrón de referencia mostrada en líneas discontinuas, que muestra áreas definidas que comprenden preferiblemente cantidades definidas de entidad detectable.

La Figura 9A muestra una realización adicional del patrón de referencia, donde el patrón de referencia tiene una forma generalmente alargada con una sección transversal pentagonal. Dos series de partículas compactas con formas diferentes se soportan por el medio de incrustación, y cada una de éstas se dispone de una manera lineal. La Figura 9B muestra secciones transversales de dicho patrón de referencia, que comprenden dos áreas con formas diferentes que comprenden cantidades detectables de la o cada entidad detectable.

La Figura 10 muestra una realización del patrón de referencia descrito en la presente memoria, donde una muestra que comprende células, tejidos, etc. se soporta en el medio de soporte junto con la entidad detectable en una partícula compacta. Por ejemplo, en el mismo medio puede incrustarse una muestra de tejido y una partícula compacta con una entidad detectable unida a la misma. Los cortes o secciones del patrón de referencia comprenden una cantidad detectable de la entidad detectable, junto con el tejido, etc.

La Figura 11 muestra un diagrama de proceso de un método para producir y manipular una realización de la referencia descrita en la presente memoria. "Manipulación": partículas compactas tales como células se fijan y/o activan, dianas que comprenden entidades detectables se acoplan a la partícula compacta y la partícula compacta acoplada resultante se incrusta en agarosa y se fija. "Operaciones de una Unidad de IHC Estándar": las partículas compactas se incrustan en parafina, y se cortan en cortes. Los cortes se montan en portaobjetos de microscopio de vidrio, y se someten a procedimientos de tinción inmunohistoquímica (IHC) convencionales.

La Figura 12 muestra un diagrama de proceso de un método para producir y manipular una realización del patrón de referencia descrito en la presente memoria. Se lavan partículas compactas tales como células, después se modifican químicamente con una entidad detectable adecuada tal como un péptido o colorante. Las partículas compactas modificadas opcionalmente se incrustan en gel de agarosa y después se fijan con formalina. Los bloques de agarosa después se cortan en cilindros largos, se deshidratan y se incrustan en parafina. Los cortes se cortan y se tratan como las otras muestras FFPE.

La Figura 13 es una ilustración esquemática del acoplamiento covalente de péptidos que contienen sulfhidrilo a una partícula (por ejemplo, célula) usando el agente de reticulación heterobifuncional, éster de N-(\gamma-Maleimidobutiriloxi)-succinimida ("GMBS"). Una fracción de los grupos amino en las células (Figura 13A) reacciona con el éster de NHS en el GMBS, dando como resultado una partícula con funcionalidad maleimida (Figura 13B). El péptido con el grupo sulfhidrilo reacciona químicamente de forma selectiva con el grupo maleimida de la partícula, dando como resultado péptidos acoplados covalentemente a la partícula. (Figura 13C). El péptido se introduce en diversas partes de la partícula (Figura 13D), dependiendo de las condiciones durante el acoplamiento.

La Figura 14 muestra fotografías que ilustran parte de las operaciones de la unidad para preparar el sistema de referencia de la invención usando, por ejemplo, células de insecto sf9 intactas y un procedimiento de fijación con formalina e incrustación con parafina (FFPE). Las células se desarrollan como cultivos en suspensión en un medio controlado (Figura 14A), se transfieren a recipientes de centrífuga (Figura 14B) y se aíslan del medio por centrifugación (Figura 14C).

Las células en suspensión se lavan y se cuentan en un hemacitómetro (Figura 14D) antes de inactivarse con un agente de reticulación heterobifuncional (Figura 14E) y de acoplarse con un péptido, se lavan y se procesan como una preparación FFPE. Las células se incrustan en cilindros de agarosa, se fijan durante una noche y se enrollan en papel limpiador de lentes ópticas y se ponen en una histocápsula para facilitar su manipulación (Figura 14F) antes de deshidratarse e infiltrarse con parafina.

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La Figura 15 muestra la tinción de núcleos de células CHO modificadas con el péptido Ki67 tratados con una preparación de citocentrifugación. Tinción de control con hematoxilina (Figura 15A). Inmunovisualizado usando anticuerpo monoclonal MIB1^{TM} dirigido contra la proteína Ki-67, HRP/Envision y DABplus. (Figura 15B). Las fotografías se toman a 20 aumentos.

La Figura 16 muestra la tinción de núcleos de células CHO modificadas con el péptido Ki67 tratados en una preparación FFPE. Inmunovisualizado usando anticuerpo monoclonal MIB1^{TM} dirigido contra la proteína Ki-67, HRP/Envision y DABplus. La fotografía se toma a 20 aumentos.

La Figura 17 muestra la tinción de núcleos de células CHO modificadas con el péptido Ki67, tratados en una preparación FFPE. Durante la conjugación del péptido se usa un detergente. Inmunovisualizado usando anticuerpo monoclonal MIB1^{TM} dirigido contra la proteína Ki-67, HRP/Envision y DABplus. La fotografía se toma a 20 aumentos.

La Figura 18 muestra la tinción de núcleos de células CHO modificadas con el péptido Ki-67, tratados en una preparación de citocentrifugación. Inmunovisualizado usando anticuerpo monoclonal MIB1^{TM} dirigido contra la proteína Ki-67, seguido de anticuerpo secundario de cabra anti-ratón biotinilado y estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (DAKOcytomation LSAB+) y finalmente el sistema de sustrato cromogénico Vector Red. Los núcleos teñidos se fotografían en un microscopio de campo brillante (Figura 18A) y en un microscopio de fluorescencia (Figura 18B).

La Figura 19 muestra la tinción de células CHO modificadas con el péptido HER2, tratadas como preparaciones de citocentrifugación o FFPE y tinción de células de referencia Herceptest que expresan HER2. Inmunovisualizado usando anticuerpo de conejo contra la proteína HER2, HRP/Envision y DABplus. Preparación de citocetrifugación de células no prefijadas (Figura 19A), células prefijadas (Figura 19B), preparación FFPE de células no prefijadas (Figura 19C) y preparación FFPE de células prefijadas (Figura 19D). Preparación FFPE de células de referencia Herceptest MDA-175 (Figura 19E) y SK-BR-3 (Figura 19F). Las fotografías se toman a 20 aumentos.

La Figura 20 muestra la tinción de Ki-67 o núcleos de células CHO modificadas con péptido irrelevantes, tratados en una preparación de citocentrifugación. Inmunovisualizado usando anticuerpo monoclonal MTB1^{TM} dirigido contra la proteína Ki-67, HRP/Envision y DABplus. Células modificadas con péptido HER2 irrelevante (Figura 20A), Células modificadas con una baja (Figura 20B) y alta (Figura 20C) concentración de péptido Ki-67 (Figura 20B). Las fotografías se toman a 20 aumentos.

La Figura 21 muestra la tinción de células sf9 modificadas con el péptido p16 y fijadas, tratadas como una preparación FFPE. Las células se tratan con un reactivo de permeabilización. Inmunovisualizado usando anticuerpo monoclonal p16 clon E6H4, HRP/Envision y DABplus. La fotografía se toma a 20 aumentos.

La Figura 22 muestra la tinción de células sf9 modificadas con péptido p16 y prefijadas, tratadas como preparaciones FFPE. Las células se tratan con un reactivo de permeabilización y se acoplan con mezclas conocidas de péptidos relevantes e irrelevantes. Inmunovisualizado usando anticuerpo monoclonal p16 clon E6H4, HRP/Envision y DABplus. Células teñidas usando 30 eq. (Figura 22A) y 10 eq. de péptido irrelevante (Figura 22B). Las fotografías se toman a 20 aumentos.

La Figura 23 muestra la tinción de células sf9 modificadas con el péptido p16 y prefijadas, tratadas como preparaciones FFPE. Las células se tratan con un reactivo de permeabilización y se acoplan con una mezcla conocida de péptido relevante e irrelevante. Inmunovisualizado usando anticuerpo monoclonal p16 clon E6H4, HRP/Envision y DABplus. Reproducido cuatro veces (Figuras 23A, B, C y D). Las fotografías se toman a 20 aumentos.

La Figura 23E es la densidad media de señal fluorescente para las dianas marcadas con fluoresceína por célula para cada una de las cuatro preparaciones, como se mide en un citométro de flujo.

La Figura 24 muestra la tinción de células sf9 modificadas con el péptido p16 y prefijadas, tratadas como preparaciones FFPE. Las células se tratan con un reactivo de permeabilización y se acoplan con diferentes mezclas conocidas de agente de reticulación y péptido relevante e irrelevante. Inmunovisualizado usando anticuerpo monoclonal p16 clon E6H4, HRP/Envision y DABplus. Las Figuras 24A, B y C son fotografías de las células teñidas tomadas a 40 aumentos con (A) un exceso 3x de péptido irrelevante, (B) un exceso 6x de péptido irrelevante y (C) un exceso 10x de péptido irrelevante, respectivamente.

La Figura 25 muestra la tinción de células sf9 modificadas con el péptido p16 y prefijadas, tratadas como en preparaciones citológicas ThinPrep (Figura 25A) o Autocyte/TriPath (Figura 25B). Inmunovisualizado usando el anticuerpo monoclonal p16 clon E6H4, HRP/Envision y DABplus. Las fotografías se toman a 20 aumentos.

La Figura 26 muestra diagramas de citómetro de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas y no teñidas. Distribución de células en un gráfico de puntos de dispersión frontal (FSC-H) frente a dispersión lateral (SSC-H) (Figura 26A), FL1-H frente a recuento (Figura 26B), y FSC-H frente a FL-H (Figura 26C).

La Figura 27 muestra diagramas de citómetro de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas. Distribución de células CHO activadas inmunomarcadas con un conjunto de IgG de control negativo para F(ab)_{2} de Conejo conjugado con FITC (DAKO X0929) y un anticuerpo F(ab)_{2} porcino Anti-Ig de conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC).

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La Figura 28 muestra diagramas de citómetro de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas. Distribución de células CHO activadas marcadas con péptido HER2/neu e inmunomarcadas con anticuerpo de conejo anti-HER2/neu y un F(ab)_{2} porcino Anti-Ig de conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC).

La Figura 29 muestra diagramas de citómetro de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu levemente prefijadas. Diagramas de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas. Distribución de células en un gráfico de puntos de dispersión frontal (FSC-H) frente a dispersión lateral (SSC-H) (Figura 29A), FL1-H frente a recuentos (Figura 29B), y FSC-H frente a FL-H (Figura 29C).

La Figura 30 muestra diagramas de citómetro de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas. Distribución de células CHO activadas inmunomarcadas con un conjunto de IgG de control negativo para F(ab)_{2} de Conejo conjugado con FITC (DAKO X0929) y un anticuerpo F(ab)_{2} porcino Anti-Ig de conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC).

La Figura 31 muestra diagramas de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas. Distribución de células CHO activadas marcadas con péptido HER2/neu e inmunomarcadas con anticuerpo de conejo anti-HER2/neu y un F(ab)_{2} porcino Anti-Ig de conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC).

La Figura 32 muestra un histograma lineal de un solo parámetro de citométro de flujo que muestra perlas de calibración (Dakocytomation Fluorospheres) que contienen seis intensidades de fluorescencia diferentes usadas para el control diario del citómetro de flujo y la estandarización de la señal.

La Figura 33 muestra diagramas de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas usando una alta concentración de agente de reticulación. Distribuciones de células no teñidas en un gráfico de puntos de dispersión frontal (FSC-H) frente a dispersión lateral (SSC-H) (Figura 33A), FL1-H frente a recuento (Figura 33B) y FSC-H frente a FL-H (Figura 33C).

La Figura 34 muestra diagramas de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas usando una alta concentración (GMBS 1,00 \muM) de agente de reticulación. Distribuciones de células CHO inmunomarcadas con conjunto de IgG de control negativo para F(ab)_{2} de Conejo y un anticuerpo F(ab)_{2} porcino Anti-Ig de conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína.

La Figura 35 muestra diagramas de flujo de células CHO modificadas con péptido irrelevante (HER3) y prefijadas usando altas concentraciones de agente de reticulación. Distribuciones de células CHO inmunomarcadas con anticuerpo de Conejo Anti-HER2/neu marcado con isotiocianato de fluoresceína.

La Figura 36 muestra diagramas de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas usando una baja concentración (GMBS 0,04 \muM) de agente de reticulación. Distribuciones de células CHO inmunomarcadas con anticuerpo de Conejo Anti-HER2/neu marcado con isotiocianato de fluoresceína.

La Figura 37 muestra diagramas de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas usando una concentración media (GMBS 0,20 \muM) de agente de reticulación. Distribuciones de células CHO inmunomarcadas con anticuerpo de Conejo Anti-HER2/neu marcado con isotiocianato de fluoresceína.

La Figura 38 muestra diagramas de flujo de células CHO modificadas con HER2/neu prefijadas usando una concentración alta (GMBS 1,00 \muM) de agente de reticulación. Distribuciones de células CHO inmunomarcadas con anticuerpo de Conejo Anti-HER2/neu marcado con isotiocianato de fluoresceína.

La Figura 39 muestra diagramas de citómetro de flujo de células sf9 modificadas con el péptido HER2/neu prefijadas y no teñidas. Distribución de células en un gráfico de puntos de dispersión frontal (FSC-H) frente a dispersión lateral (SSC-H) (Figura 39A), FL1-H frente a recuento (Figura 39B) y FSC-H frente a FL-H (Figura 39C).

La Figura 40 muestra diagramas de citómetro de flujo de células sf9 modificadas con el péptido HER2/neu prefijadas y no teñidas. Distribuciones de células sf9 inmunomarcadas con conjunto de IgG de control negativo para F(ab)_{2}
de Conejo y un anticuerpo F(ab)_{2} porcino Anti-Ig de Conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína.

La Figura 41 muestra diagramas de citómetro de flujo de células sf9 modificadas con el péptido PhosphoHER2 prefijadas y no teñidas. Distribución de células en un gráfico de puntos de dispersión frontal (FSC-H) frente a dispersión lateral (SSC-H) (Figura 39A), FL1-H frente al recuento (Figura 39B) y FSC-H frente a FL-H (Figura 39C).

La Figura 42 muestra diagramas de citómetro de flujo de células sf9 modificadas con el péptido PhosphoHER2 prefijadas y no teñidas. Distribuciones de células sf9 inmunomarcadas con conjunto de IgG de control negativo para
F(ab)_{2} de Conejo y un anticuerpo F(ab)_{2} porcino Anti-Ig de Conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína.

La Figura 43 muestra diagramas de citómetro de flujo de células sf9 modificadas con el péptido HER2/neu prefijadas y no teñidas. Distribución de células sf9 activadas marcadas con el péptido HER2/neu e inmunomarcadas con anticuerpo de Conejo Anti-HER2/neu y un F(ab)_{2} porcino Anti-Ig de Conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC).

La Figura 44 muestra diagramas de citómetro de flujo de células sf9 modificadas con el péptido PhosphoHER2 prefijadas y no teñidas. Distribución de células sf9 activadas marcadas con el péptido HER2/neu e inmunomarcadas con anticuerpo de Ratón Anti-PhosphoHER2 (DAK-H2-PY-1248) y un F(ab)_{2} de conejo Anti-Ig de Ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC).

La Figura 45 muestra la tinción con DAB de la resina PEGA: (A) acoplada con Fitc 1 mM, (B) acoplada con FITC 10 mM, (C) control de anticuerpo negativo en PEGA acoplada con Fitc 10 mM, (D) control negativo EnVision y (E) resina PEGA no modificada, inmunovisualizado usando un conjugado de anticuerpo dirigido contra Fitc, HRP/Envision y DABplus y con 20 aumentos en un microscopio de campo brillante. (F) es la resina modificada con FITC 10 mM, y (G) es la resina no modificada, tomándose estas dos últimas fotografías en un microscopio fluorescente, a 10 aumentos.

La Figura 46 muestra múltiples fotografías de la tinción con DAB de una resina PEGA modificada con 0,5 mg de IgG de Conejo/ml inmunovisualizada usando un conjugado de anticuerpo dirigido contra Fitc, HRP/Envision y DABplus y tomada a (A) 20 aumentos y (B) 10 aumentos.

La Figura 47 muestra múltiples fotografías de la tinción con DAB de una resina PEGA modificada con 1,5 mg de IgG de Conejo/ml inmunovisualizada usando un conjugado de anticuerpo dirigido contra Fitc, HRP/Envision y DABplus y tomada a (A) 20 aumentos y (B) 10 aumentos.

La Figura 48 muestra la tinción con DAB de control de una resina PEGA. (A) Control negativo de EnVision usando conjugados de cabra anti-ratón, (B) matriz Mini Leak no modificada, todos tomados a 10 aumentos.

La Figura 49 muestra la tinción con DAB de Mini Leak acoplada con (A) 0,0 g/l, (B) 0,01 g/l, (C) 0,05 g/l, (D) 0,10 g/l, (E) 0,15 g/l o (F) 0,19 g/l de péptido diana HER2, respectivamente. Inmunovisualizado usando HercepTest^{TM} con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína HER2, HRP/Envision y DABplus. Todas las fotomicrografías se tomaron a 20 aumentos en un microscopio de campo brillante.

La Figura 50 muestra diversas tinciones de control de células de matriz Mini Leak modificadas y células de referencia. (A) Control con anticuerpo primario negativo y (B) control negativo de Envision en células Mini Leak modificadas con HER2/p16, (C) matriz Mini Leak no modificada teñida con Herceptest y (D), (E) y (F) cortes de control de HercepTest^{TM}.

La Figura 51 muestra la tinción con DAB de Mini Leak acoplada con (A) 0,0 g/l, (B) 0,19 g/l, (C) 0,15 g/l, (D) 0,10 g/l, (E) 0,05 g/l o (F) 0,01 g/l de péptido diana p16, respectivamente. Inmunovisualizado usando el kit de citología CINtec^{TM} p16^{INK4a} con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína p16, HRP/Envision y DABplus. Todas las fotomicrografías se tomaron a 20 aumentos en un microscopio de campo brillante.

La Figura 52 muestra diversas tinciones de control de células de matriz Mini Leak modificadas. (A) Control de anticuerpo primario negativo y (B) control negativo Envision en células Mini Leak modificadas con HER2/p16, y (C) matriz Mini leak no modificada teñida con el kit CINtec^{TM} p16^{INK4a} .

Descripción detallada

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las capacidades de un especialista habitual en la técnica. Estas técnicas se explican en la bibliografía. Véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Tecniques, John Wiley & Sons; J.M. Polak y James O'D. McGee, 1990, In situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual by Edward Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); y Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Editado por Jane Roskams y Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-630-3.

Patrones de referencia

Se describen nuevos patrones de referencia que pueden usarse para estandarizar y clasificar muestras en cualquier procedimiento de tinción, incluyendo procedimientos inmunohistoquímicos (IHC) o procedimientos de hibridación in situ (ISH), y procedimientos de citometría de flujo, así como métodos para usar y preparar los patrones de referencia descritos en la presente memoria. Los sistemas de referencia de los presente solicitantes pueden fabricarse usando procedimientos relativamente sencillos.

Un patrón de referencia como se describe en la presente memoria comprende al menos los siguientes componentes: (i) una cantidad de una entidad detectable relevante, y (ii) una partícula compacta que tiene una forma compacta. La entidad detectable se acopla o se acopla químicamente a la partícula compacta. La partícula compacta puede comprender, en algunas realizaciones, una partícula compacta biológica, preferiblemente celular. En otras realizaciones, la partícula compacta comprende una partícula compacta no biológica. El patrón de referencia además comprende un medio de incrustación que soporta la partícula compacta, y preferiblemente puede estar en forma de un bloque.

Las partículas compactas biológicas son de naturaleza anatómica, histológica o celular. Típicamente son entidades tales como virus, células, tejidos, orgánulos, etc. Típicamente, se obtienen directamente a partir de un material biológico, y pueden usarse en dicho estado. Sin embargo, puede haberse producido algún procesamiento limitado. Típicamente, éste se limita a etapas sencillas tales como el aislamiento a partir de otras entidades similares (por ejemplo, separación de una célula de interés de otra célula), lavado, permeabilización etc. Las partículas compactas biológicas no se han sometido a una purificación o refinado significativo o sustancial. Los materiales biológicos tienen algunas o muchas características, de forma típica sustancialmente todas las características, del material de origen, tal como el tamaño, forma, color, composición, etc. En realizaciones preferidas, las partículas compactas biológicas retienen al menos la estructura, preferiblemente la estructura citoesquelética, del material de origen. Son realizaciones preferidas partículas compactas biológicas, tales como las que se usan como patrones de referencia en citometría de flujo, donde el análisis depende de la capacidad de dispersar luz, y es difícil imitar las características de dispersión de las células verdaderas usando un material sintético.

Las partículas compactas biológicas no se purifican hasta el grado sustancial de que sus componentes se separen entre sí. Como tales, las partículas compactas biológicas específicamente no incluyen componentes purificados que pueden haber formado parte en alguna ocasión de un material biológico, tales como agar o agarosa. Por lo tanto, las partículas compactas biológicas son típicamente de composición compleja y heterogénea.

Por otra parte, las partículas compactas no biológicas son de naturaleza molecular. Típicamente son entidades químicas o bioquímicas tales como moléculas o compuestos, incluyendo moléculas y macromoléculas complejas tales como polipéptidos, ácidos nucleicos, etc. Los ejemplos de partículas compactas no biológicas incluyen microperlas, trozos de agar, partículas de sílice, etc. Típicamente son de composición homogénea, y normalmente son puras o se aíslan a partir de otras entidades químicas o bioquímicas.

Las partículas compactas no biológicas son baratas y fáciles de fabricar y manipular. Pueden implicar menos riesgo para la persona que las maneja que el material biológico. Las realizaciones en las que se prefieren partículas compactas no biológicas incluyen el uso como patrones de validación de procedimientos, donde la imitación de las características celulares es menos importante, que, por ejemplo, en la citometría de flujo.

En algunas realizaciones, la partícula compacta tiene dimensiones parecidas a las de una célula, por lo que se entiende que la partícula compacta tiene, al menos en algunos aspectos, una o más características de una célula. Dichas características preferiblemente corresponden a las características externas de una célula, preferiblemente las dimensiones, tales como el tamaño, forma y geometría. En realizaciones muy preferidas, la dimensión comprende longitud, altura, anchura, radio, etc. Preferiblemente, la dimensión es la distancia máxima entre dos puntos cualesquiera de la partícula compacta. Por consiguiente, en realizaciones preferidas, la partícula compacta tiene una dimensión máxima que corresponde a la de una célula típica. En particular, la partícula compacta preferiblemente tiene una característica de dimensión de una célula o tejido, es decir, la partícula compacta es comparable en tamaño a la célula o tejido. Las dimensiones específicas que se prefieren se indican más adelante.

Preferiblemente, la presencia de la dimensión parecida a la de una célula en la partícula compacta permite que imite a la célula en al menos algunos aspectos de forma que, cuando se examina cerca de una célula o tejido, como puede ser el caso, la partícula compacta parezca similar a esa célula o tejido. La similitud se extiende, pero no abarca o incluye, la presencia o ausencia de la entidad detectable. Al ser esto así, una comparación entre la partícula compacta y la célula o el tejido permitirá al observador determinar la diferencia mínima entre las dos, siendo esta diferencia la presencia o ausencia de la entidad detectable en o sobre la célula o el tejido. Por lo tanto, la partícula compacta puede usarse como patrón de referencia para una entidad detectable presente o no presente en la célula o el tejido.

La entidad detectable se une acoplándose químicamente, preferiblemente por acoplamiento químico, a la forma compacta. La partícula compacta tiene una forma compacta, no alargada ni extendida. Puede comprender una partícula compacta "biológica", tal como una célula, tejido, orgánulo, etc., o puede comprender una partícula compacta "no biológica", tal como una microperla, perla de agarosa o perla de látex. Más adelante se describen con mayor detalle partículas compactas "biológicas" y "no biológicas". En algunas realizaciones, la partícula compacta comprende una célula. En realizaciones preferidas, la célula no expresa la entidad detectable. Más adelante se proporcionan detalladamente ejemplos de dichas partículas compactas.

Haciendo referencia a las Figuras, la Figura 2 muestra un patrón de referencia de acuerdo con este documento, que tiene una forma cuboide. El patrón de referencia comprende una partícula compacta que tiene una forma compacta, en este caso una esfera, soportada por un medio de incrustación. La Figura 2C muestra un patrón de referencia en una forma cuboide que comprende una partícula compacta en forma de un disco o cilindro plano. A la partícula compacta se le une una cantidad de entidad detectable, como se describe con más detalle más adelante (no mostrado en las Figuras 2).

El patrón de referencia puede comprender una sola partícula compacta (Figuras 2A y 2C) o puede comprender más de una partícula compacta, por ejemplo, una pluralidad de partículas compactas (Figuras 2B y 2D). En el último caso, cuando la partícula compacta es asimétrica, o tiene una forma no uniforme, las partículas compactas pueden estar en la misma orientación entre sí, o como se muestra en la Figura 2D, en diferentes orientaciones. Cuando el medio de incrustación soporta más de una partícula compacta, las partículas compactas pueden tener la misma forma, o diferentes formas (por ejemplo, un patrón de referencia que comprende una partícula compacta esférica y una partícula compacta con forma de cilindro plano o disco). En la Figura 9A se ilustra un patrón de referencia que comprende dos partículas compactas con formas diferentes y en la Figura 9B se ilustra una sección transversal de dicho patrón.

La partícula compacta puede ser de cualquier forma, siempre que ésta sea una forma "compacta", como se define más adelante. A continuación se proporcionan con detalle ejemplos de formas de partícula compacta. Las formas pueden ser regulares o no regulares, amorfas o uniformes.

La Figura 3 muestra ejemplos de dichas formas. La Figura 3A muestra una partícula compacta con una forma esférica, que es la forma más "compacta" de todas las formas posibles. La Figura 3B muestra una partícula compacta en una forma cilíndrica, incluyendo una forma cilíndrica plana. La Figura 3C muestra una partícula compacta con forma de baldosa o una forma cuboide, de cubo o cúbica. Las Figuras 3D y 3E muestran partículas compactas con forma irregular.

Las partículas compactas pueden llevar la misma entidad detectable o diferentes entidades detectables. Puede haber una, dos, tres, cuatro, cinco o más, o una pluralidad de entidades detectables en el patrón de referencia. Éstas pueden unirse por acoplamiento o acoplamiento químico a la misma partícula compacta, o a diferentes partículas compactas. Las entidades detectables iguales o diferentes pueden acoplarse en la misma cantidad o en cantidades diferentes a la o a cada partícula compacta. El lector especialista puede prever diversas combinaciones.

En realizaciones preferidas, el patrón de referencia es tal que en una región definida, preferiblemente un área de referencia en una sección transversal del patrón de referencia, está presente una cantidad de la entidad detectable, preferiblemente una cantidad detectable de la entidad detectable. Esto se ilustra en la Figura 4.

Haciendo referencia a la Figura 4, la Figura 4A muestra una realización de un patrón de referencia, en este caso en forma de una caja rectangular. La Figura 4B muestra una sección transversal del patrón de referencia. Una cantidad (preferiblemente una cantidad detectable) de la entidad detectable se dispone en un área definida en la sección transversal. Cuando más de una partícula compacta se suspende en el medio de incrustación, más de un área definida que comprende una cantidad de la o de cada entidad detectable puede estar presente en la o en cada sección transversal, como se muestra en la Figura 4C.

Las partículas compactas, con la entidad o entidades detectables acopladas o acopladas químicamente a las mismas, pueden disponerse en el medio de incrustación. De esta manera, las partículas compactas pueden formar un haz, o un grupo o cualquier tipo de patrón definido dentro del patrón de referencia. Como se muestra en la Figura 5A, por ejemplo, las partículas compactas pueden disponerse de una forma lineal, de cabeza a cola o en una fila. Pueden formarse múltiples líneas o filas de partículas compactas. La Figura 9 también muestra un patrón de referencia que comprende varias partículas compactas (en este caso en dos formas diferentes) dispuestas en una línea.

Diferentes secciones transversales de dicho patrón de referencia a lo largo del eje longitudinal del patrón de referencia muestran patrones similares de áreas definidas o áreas de referencia que comprenden cantidades de la entidad detectable, como se muestra en la Figura 5A (parte inferior). Esto también se ilustra en la Figura 9B, donde se producen dos áreas o áreas de referencia definidas con formas diferentes (en este caso una forma cuadrada y una forma circular) en una sección transversal, como resultado del patrón de referencia que comprende dos partículas compactas con formas diferentes.

Cuando el patrón de disposición de partículas compactas es uniforme a lo largo de la longitud del patrón de referencia, se obtiene una configuración en la que cada corte o sección proporciona el mismo patrón de áreas de referencia o patrones similares. Esto puede preferirse para los fines de fabricación.

Como alternativa, o adicionalmente, las partículas compactas pueden disponerse en un patrón más holgado o incluso aleatoriamente en el patrón de referencia. Como se muestra en la Figura 5B, las partículas compactas se soportan por el medio de incrustación en la referencia de una manera no uniforme. En este caso, las tres secciones o cortes de muestra tomados del patrón de referencia muestran diferentes patrones de áreas de referencia en las secciones transversales.

La entidad detectable es una cuya presencia y preferiblemente cuya cantidad es revelable, es decir, su presencia es demostrable o su cantidad es medible, directa o indirectamente. Puede ser visible a simple vista, o visible con ayuda de amplificación tal como el uso de un microscopio. La entidad detectable puede ser visible sólo cuando se tiñe con un colorante. La entidad detectable que se incrusta o soporta puede tener una diversidad de formas, como se describe con más detalle más adelante. La entidad detectable preferiblemente es una que es detectable por medio del uso de un agente de unión, que puede unirse a la entidad detectable y revelar su presencia. La entidad detectable puede comprender,
en particular, una proteína, péptido o polipéptido, o nucleótidos o ácidos nucleicos, en particular, ADN y ARN.

En este documento se proporcionan más adelante detalles adicionales sobre entidades detectables adecuadas para uso en el patrón de referencia descrito en la presente memoria.

Preferiblemente, el patrón de referencia es tal que una sección transversal del mismo incluye un área definida que comprende una cantidad predefinida o conocida de entidad detectable. Cuando se conoce la cantidad de entidad detectable en el patrón de referencia, puede compararse con la presente en la muestra para establecer la cantidad o calidad de la entidad detectable en esa muestra, o preferiblemente en células comprendidas en la muestra.

En realizaciones muy preferidas, se toman cortes o secciones del patrón de referencia. Estos cortes o secciones deben tratarse como parte de la invención descrita en la presente memoria.

Estos cortes o secciones comprenden áreas definidas que comprenden la entidad detectable, como se muestra en las Figuras 4B, 4C, 5A y 5B. Pueden realizarse múltiples cortes o secciones a partir de un patrón de referencia. Los cortes o secciones pueden tratarse como cualquier sección de material de FFPE, para revelar la entidad detectable. El tratamiento de los cortes o secciones del patrón de referencia conjuntamente (preferiblemente en paralelo) con la muestra asegura la uniformidad y reduce o elimina variaciones debidas a diferencias en protocolos, materiales, etc., como se ha descrito anteriormente en este documento.

En realizaciones preferidas, las secciones o cortes se toman a lo largo de una o más, preferiblemente todas, de estas etapas, preferiblemente en paralelo con la sección de FFPE relevante. La Figura 6 muestra un ejemplo de cómo puede procesarse el patrón de referencia, o un corte o sección del mismo (por ejemplo, los cortes planos generados en las Figuras 4B, 4C, 5A, 5B, 8F, 9 y 10 anteriores), preferiblemente en paralelo con una muestra biológica que se ha fijado, incrustado y cortado. Los cortes planos se montan en un portaobjetos de microscopio de vidrio, y se retira el medio de incrustación de parafina. El portaobjetos con un corte plano montado después se rehidrata y puede someterse a técnicas de recuperación de antígeno convencionales. El portaobjetos después se tiñe usando anticuerpos específicos para revelar la presencia y distribución del antígeno. También puede realizarse una tinción con colorante de contraste y tinción secundaria, opcionalmente con un sustrato cromogénico cuando la tinción secundaria está asociada
a enzimas.

Los cortes o secciones no necesitan ser de espesor uniforme, pero pueden serlo. También será evidente que la intensidad de la tinción puede cambiar por el espesor del corte. Por ejemplo, podrían obtenerse diversas intensidades de tinción usando cortes de diferentes espesores. De esta manera, el nivel de tinción puede variarse variando el espesor de la sección y, por lo tanto, la cantidad de material que comprende la entidad detectable por área. Como se apreciará, éste es un método muy sencillo para controlar la intensidad de tinción.

Los patrones de referencia descritos en la presente memoria proporcionan medios sencillos para establecer un "patrón", en otras palabras, un valor establecido de una propiedad medible por medio del cual pueda juzgarse una muestra o artículo de ensayo. Pueden usarse como patrones de color, tales como patrones de fluorescencia y patrones de quimioluminiscencia, patrones de posición, patrones de cantidad, patrones de calidad o como patrones de diagnóstico.

En particular, los patrones de referencia descritos en la presente memoria permiten determinar el estado o condición de una muestra, o cualquier componente de la muestra. En algunas realizaciones preferidas, permiten la detección de si una muestra comprende niveles relevantes desde el punto de vista del diagnóstico de un antígeno relevante particular. Preferiblemente, los patrones de referencia como se describen en la presente memoria se usan para medir los niveles o cantidades de entidad detectable en tejidos o preferiblemente células que comprenden muestras biológicas.

En realizaciones preferidas, el nivel, cantidad etc. de la entidad detectable en la muestra puede ser indicativa de una "situación" o estado de una célula o tejido incluido en dicha muestra. Por lo tanto, dicho nivel, cantidad etc. es preferiblemente indicativo de la situación del organismo del que procede la célula o el tejido. La situación puede ser cualquier estado de la célula, tejido, órgano u organismo, cuya detección pueda ser deseable. Se incluyen situaciones que puede adoptar la célula, etc., como parte de procesos biológicos normales, tal como parte de un programa de desarrollo o diferenciación. Aunque el término "situación" incluye situaciones fisiológicamente normales o no alteradas, preferiblemente se refiere a situaciones que no son fisiológicamente normales.

Las situaciones preferidas que no son fisiológicamente normales incluyen patologías o cualquier situación que conduzca a una enfermedad. Preferiblemente, las expresiones "nivel relevante desde el punto de vista del diagnóstico", "cantidad relevante desde el punto de vista del diagnóstico" y "cuantía relevante desde el punto de vista del diagnóstico", deben utilizarse para hacer referencia a un nivel, cantidad o cuantía de una entidad detectable en una muestra, que es indicativa de una situación o enfermedad en un individuo del que se toma la muestra.

La cantidad relevante desde el punto de vista del diagnóstico de una entidad detectable dependerá de la enfermedad o situación particular en cuestión, y puede establecerse como patrones. Se entenderá que el especialista conocerá dichos patrones, y podrá determinar la cantidad relevante desde el punto de vista del diagnóstico dependiendo de la enfermedad o afección.

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Forma compacta

El patrón de referencia descrito en la presente memoria comprende la entidad detectable en una forma generalmente compacta en el medio de incrustación. Esto se consigue por acoplamiento o acoplamiento químico de la entidad detectable a una partícula compacta que tiene una forma compacta, y soporte de ésta en el medio de incrustación. Por lo tanto, la entidad detectable tiene o adopta una forma generalmente compacta en el patrón de referencia como se describe en la presente memoria.

En esta y en la siguiente sección se proporcionan ejemplos de partículas compactas que tienen formas
compactas.

Por lo anterior, se apreciará que la "forma compacta" no se refiere a la forma específica de las moléculas o átomos que constituyen la entidad detectable, ya que éstas pueden ser de cualquier forma. En su lugar, debe considerarse que la expresión hace referencia a la disposición o localización general de la entidad detectable dentro del medio de incrustación. Por ejemplo, la masa o volumen de la entidad detectable, por ejemplo, en un estado contiguo, preferiblemente tiene una "forma compacta" cuando se dispone en el medio de incrustación.

Por "compacta" se entiende una forma que generalmente no es alargada. En otras palabras, son formas "compactas" las que generalmente son no alargas o no extendidas, o preferiblemente no están extendidas en ninguna dimensión. La forma compacta puede ser una que generalmente no está extendida, o no es alargada o larga y estrecha. Por lo tanto, dichas "formas compactas" generalmente poseen dimensiones lineales que generalmente pueden ser similares, o que no difieren en una gran cantidad.

Preferiblemente, la relación de dos dimensiones cualesquiera de la forma compacta es 5:1 o menor, más preferiblemente 4:1 o menor, aún más preferiblemente 3:1, 2,5:1, 2,4:1, 2,3:1, 2,2:1, 2,1:1, 2:1, 1,9:1, 1,8:1, 1,7:1, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, o menor. Preferiblemente, no dos pares de dimensiones tienen una relación de 5:1 o
mayor.

En realizaciones muy preferidas, la mayor dimensión de la forma compacta es menor de 5 veces la menor dimensión de la forma compacta. En algunas realizaciones, la mayor dimensión de la forma compacta no es significativamente mayor que la menor dimensión, es decir, la forma es relativamente uniforme.

Debe considerarse que la "mayor dimensión", como se usa esta expresión en este documento, hace referencia a la longitud del eje mayor, es decir, el eje que contiene la línea más larga que puede trazarse a través de la partícula compacta. De forma similar, la "menor dimensión" es la longitud del eje menor, que es el eje que contiene la línea más corta que puede trazarse a través de la partícula compacta.

En los ejemplos de formas de partículas compactas mostrados en la Figura 3, por ejemplo, cada una de las formas tiene una dimensión mayor que es menos de 5 veces su dimensión menor.

En particular, en los patrones de referencia descritos en la presente memoria, se incluyen formas regulares en las que las dimensiones lineales son aproximadamente iguales, o comparables, o en las que la relación entre la dimensión mayor y la dimensión menor es menor de 5:1. En realizaciones muy preferidas, por lo tanto, las relaciones anteriores se refieren a la relación entre la dimensión mayor y la dimensión menor. En algunas realizaciones, la relación de dos dimensiones (preferiblemente la dimensión mayor con respecto a la dimensión menor) es menor de 1,1:1, preferiblemente 1:1 (es decir, una forma regular o uniforme).

Por lo tanto, cuando sea aplicable, preferiblemente la longitud de la forma es menor que 5x su anchura o diámetro, preferiblemente menor de 4x su anchura o diámetro, preferiblemente menor de 3x, y más preferiblemente, menor de 2x o menos.

Como alternativa o además, una "forma compacta" puede definirse matemáticamente usando una o más de las medidas descritas a continuación.

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Relación de Circularidad

La Relación de Circularidad (4 x pi x área) en relación al (perímetro)^{2} proporciona una medida de la "compacidad" de formas bidimensionales, véase:

Relación de circularidad = \frac{4\pi \ \text{*} \ área}{(per\text{í}metro) \ \text{*} \ (per\text{í}metro)}

En una realización muy preferida, la partícula compacta y/o la entidad detectable tienen una forma compacta como se determina por la Relación de Circularidad, como se describe más adelante.

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Usando la Relación de Circularidad como una medida de la compacidad, un círculo - que es la forma bidimensional más compacta - tiene un valor de compacidad de 1. Los objetos que tienen límites más extendidos, o más o menos complicados o irregulares, tienen menor compacidad. Por ejemplo, una elipse tiene menor compacidad que un círculo usando esta medida, y un cuadrado tiene una compacidad de \pi/4. Un rectángulo con una longitud de 5 veces su anchura tiene una compacidad de \pi/7,2.

Esta medida de compacidad que usa la Relación de Circularidad puede aplicarse a una o más secciones transversales de una forma tridimensional para determinar la compacidad global de la forma. De esta manera, usando esta medida, una forma es "compacta" si ninguna de sus secciones transversales tiene una compacidad medida por la relación de circularidad de \pi/7,2 o mayor. Preferiblemente, la sección transversal con la mayor compacidad, medida por la Relación de Circularidad, tiene una compacidad sustancialmente menor de \pi/7,2. En realizaciones muy preferidas, la mayoría, o preferiblemente sustancialmente todas sus secciones transversales, tienen una compacidad medida por la Relación de Circularidad menor de \pi/7,2.

Aunque se usa la Relación de Circularidad, en una realización muy preferida, como medida de la compacidad de la partícula compacta pueden usarse en realizaciones alternativas otras medidas de compacidad, por ejemplo, la Relación de Forma, la Relación C y la Relación de Radio.

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Relación de Forma

La Relación de Forma (4 x área) con respecto a (pi * longitud^{2}) proporciona una medida alternativa de la "compacidad" de formas bidimensionales, véase:

Relación de forma = \frac{4\pi \ \text{*} \ área}{\pi(L) \ \text{*} \ (L)'}, donde L es la longitud de una línea que une los dos puntos más distantes del área
{}\hskip17cm (es decir, la mayor dimensión). Usando la Relación de Forma como una medida de compacidad, un círculo - que es la forma bidimensional más compacta - tiene una compacidad de 1. Los objetos que tienen límites más extendidos, o más o menos complicados o irregulares, tienen menor compacidad. Por ejemplo, una elipse tiene una compacidad menor que un círculo usando esta medida, y un cuadrado tiene una compacidad de 2/\pi. Un rectángulo con una longitud 5 veces su anchura tiene una compacidad de 10/13\pi.

Esta medida de compacidad que usa la Relación de Forma puede aplicarse a una o más secciones transversales de una forma tridimensional para determinar la compacidad global de la forma. De esta manera, usando esta medida, una forma es "compacta" si ninguna de sus secciones transversales tiene una compacidad medida por la Relación de Forma de 10/13\pi o mayor. Preferiblemente, la sección transversal con la mayor compacidad, medida por la Relación de Forma, tiene una compacidad sustancialmente menor de 10/13\pi. En realizaciones muy preferidas, la mayoría, o preferiblemente sustancialmente todas sus secciones transversales, tienen una compacidad medida por la Relación de Forma menor de 10/13\pi.

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Relación C

La Relación C (área) con respecto a (pi * radio^{2}), proporciona una medida alternativa de la "compacidad" de formas bidimensionales, véase:

Relación C = \frac{área}{\pi(R) \ \text{*} \ (R)'}, donde R es el radio del círculo más pequeño que rodeará a la forma. Usando la
{}\hskip17cm Relación C como una medida de compacidad, un círculo - que es la forma bidimensional más compacta - tiene una compacidad de 1. Los objetos que tienen límites más extendidos, o más o menos complicados o irregulares, tienen menor compacidad. Por ejemplo, una elipse tiene una compacidad menor que un círculo usando esta media, y un cuadrado tiene una compacidad de 2/\pi. Un rectángulo con una longitud 5 veces su anchura tiene una compacidad de 10/13\pi.

Esta medida de compacidad que usa la Relación C puede aplicarse a una o más secciones transversales de una forma tridimensional para determinar la compacidad global de la forma. De esta manera, usando esta medida, una forma es "compacta" si ninguna de sus secciones transversales tiene una compacidad medida por la Relación C de 10/13\pi o mayor. Preferiblemente, la sección transversal con la mayor compacidad, medida por la Relación C, tiene una compacidad sustancialmente menor de 10/13\pi. En realizaciones muy preferidas, la mayoría, o preferiblemente sustancialmente todas sus secciones transversales, tienen una compacidad medida por la Relación C menor
de 10/13\pi.

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Relación de Radios

La Relación de Radios (r) con respecto a (R), proporciona una medida alternativa de "compacidad" de formas bidimensionales, véase:

Relación de Radios = \frac{r}{R} donde r es el radio del círculo mayor que se ajustará dentro de la forma y R es el radio
{}\hskip17cm del círculo más pequeño que rodeará a la forma. Usando la Relación de Radios como una medida de compacidad, un círculo - que es la forma bidimensional que es más compacta - tiene una compacidad de 1. Los objetos que tienen límites más extendidos, o más o menos complicados o irregulares, tienen menor compacidad. Por ejemplo, una elipse tiene una compacidad menor que un círculo usando esta medida, y un cuadrado tiene una compacidad de \sqrt{2}/2. Un rectángulo con una longitud 5 veces su anchura tiene una compacidad de 1/\sqrt{26}.

Esta medida de compacidad que usa la Relación de Radios puede aplicarse a una o más secciones transversales de una forma tridimensional para determinar la compacidad global de la forma. De esta manera, usando esta medida, una forma es "compacta" si ninguna de sus secciones transversales tiene una compacidad medida por la Relación de Radios de 1/\sqrt{26} o mayor. Preferiblemente, la sección transversal con la mayor compacidad, medida por la Relación de Radios, tiene una compacidad sustancialmente menor de 1/\sqrt{26}. En realizaciones muy preferidas, la mayoría, o preferiblemente sustancialmente todas sus secciones transversales, tienen una compacidad medida por la Relación de Radios menor de 1/\sqrt{26}.

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Forma

La forma compacta puede comprender un sólido regular, una esfera, un esferoide, un esferoide oblato, un esferoide aplanado, un elipsoide, un cubo, un cono, un cilindro o un poliedro. Los poliedros preferidos incluyen poliedros sencillos o poliedros regulares. Los poliedros incluyen, por ejemplo, un hexaedro, holiedro, cuboide, deltaedro, pentaedro, tetradecaedro, poliedro, tetraflexágono, trapezoedro, poliedro truncado, cúpula geodésica, heptaedro y hexecontaedro. Cualquiera de las formas anteriores preferiblemente es tal que son "compactas", de acuerdo con la definición proporcionada anteriormente. Por ejemplo, cuando la forma comprende un esferoide oblato, éste tiene el aplastamiento apropiado de tal forma que el esferoide sea compacto y no alargado.

En realizaciones preferidas, la forma compacta puede comprender una forma de globo, una forma de cigarro, una forma de salchicha, una forma de disco, una forma de lágrima, una forma de bola o una forma elíptica, siempre que las dimensiones sean como se ha indicado anteriormente. La forma compacta también puede comprender una forma esférica, una forma de cubo, una forma cuboide, una forma de baldosa, una forma ovoide, una forma elipsoidal, una forma de disco, una forma de célula, una forma de píldora, una forma de cápsula, una forma de cilindro plano, una forma de judía, una forma de gota, una forma globular, una forma de guisante o una forma de gránulo, etc.

En la Figura 3 se muestran algunos ejemplos de formas de partículas compactas.

La forma compacta puede ser no lineal, y puede tener una orientación curvada que comprende una o más porciones curvadas. Puede tener forma rizada u ondulada, y seguir siendo una forma compacta.

La forma compacta puede tener una sección transversal uniforme o puede tener una sección transversal no uniforme. Por ejemplo, la forma compacta puede comprender una forma de lente o una forma de salchicha. En algunas realizaciones, la forma compacta tiene una sección transversal uniforme a través de al menos una parte sustancial de la forma compacta, preferiblemente sustancialmente la longitud de la forma compacta. Por lo tanto, en estas realizaciones el área de sección transversal de la forma compacta es sustancialmente la misma en todas las partes de la entidad detectable. Sin embargo, pueden preverse realizaciones en las que la entidad detectable no se distribuye uniformemente a lo largo de la forma compacta.

El perfil de sección transversal de la forma compacta, es decir, el área definida que comprende la entidad detectable en sección transversal, puede tener una diversidad de configuraciones. Preferiblemente, el área definida tiene forma circular, elíptica o elipsoidal. Sin embargo, el área definida puede tener una forma de píldora, una forma regular o una forma irregular. Pueden establecerse diferentes perfiles de sección transversal por el uso de formas compactas con perfiles apropiados. Preferiblemente, el perfil de sección transversal es similar al tamaño o la forma de una célula, o ambos, por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota, preferiblemente una célula animal y más preferiblemente una célula humana. Es decir, el perfil de sección transversal preferiblemente tiene un perfil de sección transversal de dimensiones parecidas a las de una célula.

Preferiblemente, el perfil de sección transversal de la forma compacta, o la menor dimensión de la forma compacta, tiene un diámetro de (o una dimensión máxima de) menos de 1500 \mum, 1400 \mum, 1300 \mum, 1200 \mum, 1000 \mum,
900 \mum, 800 \mum, 700 \mum, 600 \mum, 500 \mum, preferiblemente menos de 400 \mum, más preferiblemente menos de
300 \mum, más preferiblemente menos de 200 \mum, más preferiblemente entre 0,5 \mum y 100 \mum, más preferiblemente entre 1 \mum y 100 \mum, incluso más preferiblemente entre 10 \mum y 20 \mum y aún más preferiblemente entre 2 \mum y 20 \mum. Son realizaciones particularmente preferidas aquellas con diámetros o dimensiones máximas de, o sustancialmente de, 1 \mum, 2 \mum, 3 \mum, 4 \mum, 5 \mum, 6 \mum, 7 \mum, 8 \mum, 9 \mum, 10 \mum, 11 \mum, 12 \mum, 13 \mum, 14 \mum, 15 \mum, 16 \mum, 17 \mum, 18 \mum, 19 \mum o 20 \mum.

En realizaciones muy preferidas, el perfil de sección transversal de la forma compacta es del orden de tamaño de una célula procariota o eucariota típica, es decir, entre 1 \mum y 100 \mum.

Se apreciará que estos tamaños no son limitantes, y el usuario sabrá como variar el tamaño dependiendo de la aplicación. Además, cuando el patrón de referencia comprende más de una entidad detectable, o más de una forma compacta, o ambas cosas, se apreciará que cada una de éstas puede tener independientemente las características y propiedades indicadas anteriormente. Además, cuando el patrón de referencia comprende dos o más formas compactas, éstas pueden teñirse a la misma densidad, o a diferentes densidades.

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Partícula Compacta

Como se ha indicado anteriormente, el patrón de referencia comprende una entidad detectable acoplada o acoplada químicamente a una partícula compacta. La partícula compacta sirve como estructura, sustrato o soporte para la entidad detectable, y permite que la entidad detectable mantenga una forma compacta en el medio de incrustación. La partícula compacta también puede ayudar a retener la forma de la entidad detectable, o su morfología, distribución o concentración constante en el medio de incrustación. La distribución o disposición de la entidad detectable generalmente puede seguir la forma de la partícula compacta. La partícula compacta también presenta la entidad detectable para la detección.

Cuando se usa en este documento la expresión "partícula compacta", el término "partícula" en esta frase no debe entenderse de forma que la "partícula compacta" sea necesariamente muy pequeña o diminuta, ni de forma que sea una parte de alguna entidad de mayor tamaño. De hecho, la "partícula" puede ser tan grande como sea necesario, siempre que realice sus funciones en el patrón de referencia como se describe en otras partes de este documento. Sin embargo, se requiere que la partícula tenga una forma "compacta" como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, la partícula compacta tiene una forma compacta cuando se soporta por el medio de incrustación en el patrón de referencia, pero preferiblemente también tiene una forma compacta cuando no se soporta de esta manera (por ejemplo, antes o después del acoplamiento, fijación, etc.).

La partícula compacta puede comprender cualquier material, siempre que tenga las propiedades físicas que la permitan realizar sus fines como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, como un punto de unión para la entidad detectable. La partícula compacta, por lo tanto, puede comprender un material que es tenaz, rígido, maleable, sólido o de otra forma para este fin. Puede comprender un material sólido o semisólido, gel, etc. El material es al menos reactivo para permitir el acoplamiento o el acoplamiento químico de la entidad detectable, o capaz de volverse reactivo por un activador, pero por lo demás puede comprender una sustancia generalmente inerte. La partícula compacta puede comprender un compuesto, de tal forma que la partícula compacta puede estar constituida por más de un material. Por ejemplo, el núcleo de la partícula compacta puede comprender un material diferente de las partes de la superficie. De esta manera, el núcleo de la partícula compacta puede comprender un material generalmente inerte, mientras que las partes de superficie pueden comprender un material reactivo para el acoplamiento o acoplamiento químico de la entidad detectable.

La partícula compacta puede ser de origen natural o sintético. En la técnica se conocen bien materiales naturales y sintéticos y fuentes para obtenerlos. Preferiblemente, la partícula compacta tendrá al menos alguna resistencia mecánica, al menos alguna resistencia al ataque químico o al tratamiento térmico o cualquier combinación de estas propiedades.

En realizaciones preferidas, una partícula compacta que tiene una o más entidades detectables a la misma o diferentes concentraciones se incrusta en un medio de incrustación de parafina. En las Figuras 11 y 12 se muestra un diagrama de proceso que muestra cómo puede realizarse un patrón de referencia de acuerdo con esta realización. La etapa de incrustación en agarosa, descrita con más detalle más adelante, es opcional.

En el patrón de referencia puede estar presente más de una partícula compacta. Por ejemplo, pueden emplearse dos o más partículas compactas, comprendiendo cada una entidad detectable diferente. Además, pueden proporcionarse diferentes cantidades de la misma entidad detectable en diferentes partículas compactas. Finalmente, más de una entidad detectable puede conjugarse o acoplarse o acoplarse químicamente a una partícula compacta. Pueden usarse múltiples partículas compactas, comprendiendo cada una de ellas una sola, dos o más entidades detectables, en cantidades idénticas o diferentes.

La o cada partícula compacta que comprende la o cada entidad detectable puede disponerse sustancialmente a través del patrón de referencia o al menos a través de una parte del mismo. Por ejemplo, cuando el patrón de referencia tiene forma de una caja rectangular, la o cada partícula compacta puede disponerse en puntos de un extremo a otro (es decir, a través de sustancialmente toda la longitud de la caja rectangular).

Preferiblemente, la partícula compacta tiene un diámetro comprendido entre aproximadamente de 0,5 \mum y 100 \mum, más preferiblemente entre 1 \mum y 100 \mum, incluso más preferidamente entre 10 \mum y 20 \mum y aún más preferiblemente entre 2 \mum y 20 \mum. Son posibles otros diámetros, por ejemplo, menores de 1500 \mum, menores de 1000 \mum, menores de 500 \mum, menores de 200 \mum, etc.

La entidad detectable o cada partícula compacta puede teñirse usando uno cualquiera de varios colorantes conocidos en la técnica, para una identificación y/o localización más fácil. Cuando el patrón de referencia comprende dos o más partículas compactas, cada una de las partículas compactas se tiñe preferiblemente usando un color diferente, para permitir una distinción más fácil entre las partículas compactas.

Como se ha descrito anteriormente, la o cada partícula compacta puede incrustarse en el mismo medio de incrustación que la muestra (por ejemplo, una célula o un tejido a ensayar), al mismo tiempo, antes o después de incrustar la muestra en ese medio. En realizaciones preferidas, la o cada partícula compacta se co-incrusta en un medio de incrustación que comprende parafina. Preferiblemente, la incrustación de dicha partícula compacta se realiza como parte del proceso de incrustación en parafina de la muestra en FFPE.

La partícula compacta puede comprender un objeto "biológico" o un objeto "no-biológico". En realizaciones preferidas, la partícula compacta comprende una partícula compacta biológica.

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Partícula compacta biológica/partícula compacta celular

En algunas realizaciones, la partícula compacta procede, o consiste en, una partícula compacta biológica.

Por partículas compactas "biológicas" se entiende las que tienen una o más de las siguientes características generales: no son sintéticas o hechas por el hombre, proceden de un objeto biológico y comprenden, proceden o consisten en objetos que están o estuvieron vivos.

Preferiblemente, la partícula compacta biológica es una parte anatómica, histológica o celular de un organismo vivo, ya sea un virus, célula, tejido, etc. Preferiblemente, cuando la partícula compacta procede de algo que está o estuvo vivo, la partícula compacta preferiblemente mantiene la morfología de esa cosa viva. Es decir, cuando tiene lugar la derivación o el procesamiento, esa derivación o procesamiento preferiblemente es de naturaleza sencilla o mínima. En particular, la partícula compacta biológica no comprende un componente químico o bioquímico purificado o semipurificado de un objeto biológico o una cosa viva, por ejemplo, no comprende una proteína o macromolécula purificada.

Los ejemplos de partículas compactas biológicas incluyen un tejido, una célula, cualquier parte o producto de una célula, tal como un orgánulo, núcleo, mitocondria, plástido, cloroplasto, etc. Otros ejemplos de partículas compactas biológicas incluyen tejidos o agregaciones de células.

En realizaciones preferidas, la partícula compacta biológica puede comprender una partícula compacta celular, término por el que se entiende que procede o comprende una célula. Una partícula compacta celular puede comprender o proceder de células enteras, o de partes de células tales como un orgánulo o cualquier otro compartimento subcelular. Los ejemplos de éstos incluyen estructuras celulares tales como núcleos, mitocondrias, vacuolas, paredes celulares, membranas celulares, orgánulos, citoesqueleto, etc.

Preferiblemente, la partícula compacta celular no expresa, de forma natural o de otra manera, la entidad detectable.

La partícula compacta celular puede proceder de cualquier parte del cuerpo, y de cualquier organismo de cualquier especie. En una realización muy preferida, la partícula compacta celular comprende una célula. La célula puede ser una célula procariota o una célula eucariota. Se incluyen organismos de una sola célula, denominados comúnmente microorganismos. Las partículas compactas que pueden usarse, por lo tanto, incluyen una bacteria, una levadura, un hongo, un protozoo, una ameba, un alga, etc. También se incluyen como partículas compactas celulares virus de diversos tipos tales como bacteriófagos, retrovirus, poxvirus, adenovirus, etc.

También pueden emplearse células de organismos multicelulares, de cualquier parte. Las partículas compactas celulares incluyen células vegetales, células animales, células de insectos, células de peces, células de mamíferos, células de ratón, células de primates, células humanas, etc. La célula puede proceder de cualquier parte del organismo, de cualquier tejido u órgano, tal como la piel, corazón, cerebro, músculo, mama, hueso, fibroblasto, sistema vascular, sistema sanguíneo, sistema linfático, etc. La célula puede aislarse del organismo y usarse directamente, o la célula puede ser una célula cultivada, tanto en cultivo primario como en cultivo secundario. En la técnica son bien conocidos métodos de cultivo primario y secundario de células de tejido cultivadas.

En la Figura 7 se ilustran ejemplos de partículas compactas celulares adecuadas para uso en el patrón de referencia descrito en esta memoria: bacteriófago o virus, bacteria (Figura 7A), células bacterianas, colonias de células bacterianas (Figura 7B), glóbulos rojos (Figura 7C), una célula animal (Figura 7D) y una célula vegetal (Figura 7E).

La partícula compacta preferiblemente no comprende la entidad detectable en su estado natural, sino más bien la entidad detectable está acoplada o acoplada químicamente a ella para uso en el patrón de referencia. Por ejemplo, cuando la partícula compacta comprende o procede de una célula, la célula es una que normalmente no contiene la entidad detectable. De esta manera, la célula preferiblemente es una que no expresa la entidad detectable, ya sea porque no se expresa el gen para la entidad detectable (cuando la entidad detectable comprende un polipéptido o ácido nucleico), o porque la entidad detectable no es un producto normal de dicha célula (cuando, por ejemplo, la entidad detectable comprende un producto metabólico), o la célula procede de un organismo diferente, por ejemplo, una especie diferente, de una célula que normalmente comprende la entidad detectable.

La célula o una parte de la misma puede usarse intacta, o puede tratarse o procesarse antes o después de la unión por acoplamiento o acoplamiento químico de la entidad detectable. Preferiblemente, la partícula compacta celular mantiene la morfología celular después del tratamiento. Por ejemplo, la partícula compacta celular puede permeabilizarse, por ejemplo, por medio del uso de detergentes, o fijarse usando un agente de fijación. Los medios para la permeabilización de las células son bien conocidos en la técnica e incluyen el uso de digitonina, Tritón X100, etc. La partícula compacta celular puede comprender una estructura citoesquelética. La entidad detectable puede acoplarse o acoplarse químicamente a cualquier parte relevante de la partícula compacta celular, tal como su superficie o su interior. La entidad detectable preferiblemente puede acoplarse o acoplarse químicamente a la superficie de la partícula compacta celular, tal como la superficie de la célula, por ejemplo, a moléculas de la membrana plasmática tales como lípidos, fosfolípidos, proteínas de la superficie celular, receptores, receptores unidos a la membrana, etc.

La entidad detectable puede dirigirse a la localización deseada por medio de una parte de unión, que preferiblemente es capaz de reconocer, dirigirse o unirse a la localización deseada. La parte de unión puede reconocer, unirse a o dirigirse por medio de carga, pH, interacciones iónicas, interacciones no iónicas, interacciones hidrófobas, transporte activo, etc. La parte de unión puede comprender una sonda, tal como una sonda de ácido nucleico capaz de reconocer y unirse a otro ácido nucleico presente en o dentro de la localización. Por ejemplo, la entidad detectable puede unirse a la superficie celular al comprender una parte de unión capaz de unirse a una entidad de la superficie celular, tal como un anticuerpo.

La parte de unión puede comprender un anticuerpo, o una parte del mismo, capaz de unirse de forma específica a una proteína expresada dentro o en la localización deseada, tal como una proteína de la superficie celular, tal como un receptor. El anticuerpo o una parte del mismo puede unirse o acoplarse a la entidad detectable por cualquier número de maneras, por ejemplo, como se describe más adelante, o como una proteína de fusión con la entidad detectable.

La entidad detectable también puede unirse a la célula, al insertarse en la membrana plasmática de la misma manera que una proteína transmembrana. Para este fin, la entidad detectable puede modificarse por unión o acoplamiento a una secuencia de inserción en la membrana, por ejemplo, una secuencia de 7TM o una secuencia de membrana de bacteriorrodopsina.

Como alternativa, o adicionalmente, la entidad detectable puede unirse a otras partes de la célula, por ejemplo, partes internas o cualquier componente celular, particularmente cuando ha tenido lugar la permeabilización. La célula preferiblemente se fija antes del acoplamiento o acoplamiento químico. En algunos casos, hay alcance para modificar la forma de la célula en alguna medida antes de la fijación, acoplamiento o acoplamiento químico o soporte en el medio de incrustación. Por ejemplo, puede proporcionarse a la célula una señal química o biológica para permitir que cambie la forma. Otros tratamientos, por ejemplo, el tratamiento con proteasas de cultivos celulares en monocapa, permiten a las células redondearse hasta adquirir una forma generalmente compacta.

Los ejemplos de células particularmente preferidas incluyen células Sf9, que son una línea de células de insectos derivadas del gusano cogollero Spodoptera frugiperda. Las células Sf9 son bien conocidas en la técnica, para uso como hospedadores de expresión de baculovirus, y generalmente también se conocen métodos de cultivo, tratamiento y procesamiento de dichas células (véase por ejemplo, O'Reilly, D.R., L.K. Miller, y V. A. Luckow, (1994). Baculovirus Expresion Vectors).

Sf9 se clonó por G.E. Smith y C.L. Cherry en 1983 a partir de la línea parental, IPLB-SF 21 AE, que procedía de tejido de ovario de pupas del gusano cogollero Spodoptera frugiperda, por Vaughn, et al., en 1977 (Vaughn JL, et al. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro 13: 213-217, 1977). Las células Sf9 pueden cultivarse en un medio de propagación que comprende Medio de Insectos de Grace con L-glutamina y suplementarse con: 500 mg/l de cloruro cálcico, 2800 mg/l de cloruro potásico, 3330 mg/l de hidrolizado de lactalbúmina, 3330 mg/l de yeastolate y suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10% (previamente ensayado para cultivo de células de insecto) a una temperatura de 28 grados centígrados. Las células pueden subcultivarse resuspendiendo suavemente las células en el medio de cultivo gastado por medio de una pipeta a través de la monocapa o golpeando el matraz contra la palma de la mano (esto último solo es preferible cuando se trabaja con matraces de mayor tamaño). Si antes del subcultivo están presentes muchas células flotantes, el medio antiguo y las células flotantes pueden desecharse y el medio puede reemplazarse antes del subcultivo. Las células deben incubarse a 28 grados centígrados. Se recomienda una relación de subcultivo de 1:5 o mayor.

Las células de insecto Sf9 pueden obtenerse en la Colección Americana de Cultivos Tipo, con el número de catálogo CRL-1711. Además, estas células están disponibles en el mercado, por ejemplo, en BD Biosciences Pharmingen (número de catálogo 551407) como Células Sf9 Ready-Plaque^{TM} de Novagen (número de catálogo 70033-3) y como células Sf9 TriEx^{TM}, también de Novagen (número de catálogo 71023-3). Los medios para cultivar células Sf9 incluyen EX-CELL^{TM} 420 (JRH, Biosciences, Inc.), Sf-900 II SFM (Life Technologies, Inc.), HyQSFX-Insect^{TM} (HyClone Laboratories, Inc.), y High Five^{TM} (Invitrogen Corporation).

La partícula compacta celular también puede comprender una célula animal, tal como una célula de ratón. En realizaciones preferidas, la partícula compacta comprende una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO). La línea celular de Ovario de Hámster Chino comprende células epiteliales adherentes, y se inició a partir de una biopsia de un ovario de un hámster chino adulto (Cricetulus griseus) por T. T. Puck en 1957 (Puck TT, et al. Genetics of somatic mammalian cells III. Long-term cultivation of euploid cells from human and animal subjects. J. Exp. Med. 108: 945-956, 1958).

De acuerdo con los métodos y composiciones descritas en la presente memoria, pueden usarse como partículas compactas células de ésta línea celular, así como cualquiera de sus derivados. De esta manera, por ejemplo, la línea celular CHO-K1 (Colección Americana de Tejidos Tipo con número de catálogo: CCL-61) procede de un subclon de la línea de células CHO de Puck parental, y requiere prolina en el medio para el crecimiento. CHO-K1 puede propagarse en medio F12K de Ham con L-glutamina 2 mM ajustado para que contenga 1,5 g/l de bicarbonato sódico, suero bovino fetal al 90%, 10% a una temperatura de 37 grados centígrados. Las células pueden subcultivarse retirando el medio, y aclararse con solución de tripsina al 0,25% y EDTA al 0,03%. La solución se retira y se añaden de 1 a 2 ml más de solución de tripsina-EDTA. El matraz se deja en reposo a temperatura ambiente (o a 37 grados centígrados) hasta que las células se separan. Se añade medio de cultivo nuevo, se aspira y se distribuye en nuevos matraces de cultivo. Se recomienda una relación de subcultivo de 1:4 a 1:8 para esta línea celular.

La Figura 8 ilustra un proceso para la producción de un patrón de referencia como se describe en este documento, en el que se emplea una partícula compacta celular. Como se muestra en la Figura 8A, se proporciona una cantidad de entidad detectable 1, por cualquier medio adecuado, por ejemplo, purificación de fuentes naturales, expresión recombinante, etc. También se proporciona una entidad compacta mostrada en la Figura 8B que comprende una célula 2, o más de una célula, por cualquier medio adecuado (por ejemplo, son bien conocidos en la técnica métodos de cultivo, purificación o clonación de células).

La cantidad de entidad detectable 1 después se acopla o se acopla químicamente a la célula 2, dando como resultado una entidad compacta que comprende una célula, con una entidad detectable acoplada o acoplada químicamente a la misma (Figura 8C). En realizaciones preferidas, la entidad detectable se acopla o se acopla químicamente a la célula acoplándose químicamente, por ejemplo usando un agente de reticulación como se describe con más detalle más adelante. Como también se describe con más detalle más adelante, la entidad detectable puede acoplarse químicamente de forma directa a la célula, o como se muestra en la Figura, la entidad detectable puede acoplarse o acoplarse químicamente a la célula a través de un espaciador 12.

La propia célula con la entidad detectable acoplada o acoplada químicamente a la misma puede usarse como un patrón de referencia. Como alternativa, o además, la partícula compacta celular con la entidad detectable acoplada o acoplada químicamente a la misma se soporta o incrusta en un medio de incrustación (Figura 8D). En realizaciones preferidas del patrón de referencia, varias partículas compactas celulares se soportan en el medio de incrustación (véase la Figura 8E). Pueden tomarse cortes o secciones de dicho patrón de referencia y usarse para los fines descritos en la presente memoria. Estos cortes o secciones comprenden una cantidad detectable de la entidad detectable en una región definida en una sección transversal del patrón de referencia (Figura 8F).

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Partículas Compactas No Biológicas

En una realización alternativa, la partícula compacta comprende un objeto "no biológico".

Las partículas compactas no biológicas, a diferencia de la naturaleza histológica o celular de las partículas compactas biológicas, son de naturaleza molecular. Típicamente son entidades químicas o bioquímicas tales como moléculas o compuestos, incluyendo moléculas complejas y macromoléculas tales como polipéptidos, ácidos nucleicos, etc. Los ejemplos de partículas compactas no biológicas incluyen microperlas, trozos de agar, partículas de sílice, etc. Típicamente son de composición homogénea y normalmente son puras o se aíslan a partir de otras entidades químicas o bioquímicas.

Las partículas compactas no biológicas son baratas y fáciles de fabricar y manipular. Pueden implicar menor riesgos para la persona que las manipula que el material biológico. Las realizaciones en las que se prefieren partículas compactas no biológicas incluyen el uso como patrones de validación de procedimientos, donde la imitación de las características celulares es menos importante que, por ejemplo, en la citometría de flujo.

La partícula compacta no biológica, en última instancia, puede tener un origen biológico - de esta manera, puede ser un componente purificado de un material biológico tal como una proteína sérica, celulosa, agarosa, etc. Los objetos no biológicos pueden incluir los que se han purificado, o refinado, a partir de una fuente biológica, tal como agar y agarosa. Sin embargo, no retienen ninguna característica histológica o celular sustancial, en particular características estructurales del material de origen tal como la forma celular y el tamaño de las células. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, la partícula compacta "no-biológica" carece o carece sustancialmente de material celular, incluyendo tejidos.

En realizaciones muy preferidas, la partícula compacta no biológica puede ser una "partícula compacta no celular", es decir, una que no comprende o procede de una célula.

Dicha partícula compacta no biológica o no celular, por lo tanto, puede comprender un material sintético, o un material no natural. Se conocen en la técnica diversas partículas compactas de diversas formas e incluyen, por ejemplo, perlas de diversos tipos. Las realizaciones particularmente preferidas de partículas compactas incluyen microperlas tales como perlas de agarosa, perlas de poliacrilamida, perlas de gel de sílice, etc.

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Perlas

Las perlas o microperlas adecuadas para uso incluyen las que se usan para cromatografía en gel, por ejemplo, un medio de exclusión molecular tal como Sephadex. Las microperlas adecuadas de este tipo incluyen Sephadex G-10 que tiene un tamaño de perla de 40-120 (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.103-9), Sephadex G-15 que tiene un tamaño de perla de 40-120 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.104-7), Sephadex G-25 que tiene un tamaño de perla de 20-50 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.106-3), Sephadex G-25 que tiene un tamaño de perla de 20-80 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.107-1), Sephadex G-25 que tiene un tamaño de perla de 50-150 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.109-8), Sephadex G-25 que tiene un tamaño de perla de 100-300 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.110-1), Sephadex G-50 que tiene un tamaño de perla de 20-50 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.112-8), Sephadex G-50 que tiene un tamaño de perla de 20-80 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.113-6), Sephadex G-50 que tiene un tamaño de perla de 50-150 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.114-4), Sephadex G-50 que tiene un tamaño de perla de 100-300 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.115-2), Sephadex G-75 que tiene un tamaño de perla de 20-50 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.116-0), Sephadex G-75 que tiene un tamaño de perla de 40-120 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.117-9), Sephadex G-100 que tiene un tamaño de perla de 20-50 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.118-7), Sephadex G-100 que tiene un tamaño de perla de 40-120 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.119-5), Sephadex G-150 que tiene un tamaño de perla de 40-120 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.121-7), y Sephadex G-200 que tiene un tamaño de perla de 40-120 \mum (Sigma Aldrich, número de catálogo 27.123-3).

También pueden usarse perlas de Sepharose como las usadas en cromatografía líquida. Son ejemplos perlas de Q-Sepharose, S-Sepharose y SP-Sepharose, disponibles por ejemplo en Amersham Biosciences Europe GmbH (Freiburg, Alemania) como Q Sepharose XL (número de catálogo 17-5072-01), Q Sepharose XL (número de catálogo 17-5072-04), Q Sepharose XL (número de catálogo 17-5072-60), SP Sepharose XL (número de catálogo 17-5073-01), SP Sepharose XL (número de catálogo 17-5073-04) y SP Sepharose XL (número de catálogo I 17-5073-60) etc.

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Micelas

La partícula compacta no biológica o no celular también puede comprender una micela. La micela puede tener una monocapa o una bicapa. Puede tener proteínas u otras moléculas insertadas, que pueden servir como puntos de acoplamiento o acoplamiento químico de la partícula compacta. Las micelas pueden obtenerse seleccionando primero uno o más tensioactivos. Por ejemplo, pueden usarse dos tensioactivos diferentes tales como copolímeros de bloque de óxido de propileno y óxido de etileno y monolaurato de polioxietileno sorbitán. Sin embargo, pueden utilizarse uno, dos, tres o más tensioactivos. Los tensioactivos adecuados también incluyen derivados de capril imidazolina, alquil poliglicol éteres, lanolinas de polioxialquileno, copolímeros de bloque de óxido de propileno y óxido de etileno y monolaurato de polioxietileno sorbitán.

Los tensioactivos después se dispersan en una base acuosa. Los tensioactivos seleccionados para la presente composición está formados por moléculas que tienen un grupo terminal hidrófilo y una cola de hidrocarburo hidrófoba. El grupo hidrófilo tiene propensión al agua mientras que la cola hidrófoba posee aversión al agua. De esta manera, por encima de una cierta concentración, las moléculas de tensioactivo tienden a asociarse entre sí en un grupo, con lo que los grupos hidrófilos se exponen al agua y se configuran de tal manera que forman una configuración generalmente circular o esférica, mientas que las colas hidrófobas se extienden hacia el interior y se asocian entre sí, quizás en una relación entrecruzada. Efectivamente, esto forma agregados de moléculas de tensioactivo que se denominan micelas.

Se postula que la parte hidrófila de las micelas forma una cubierta o una mezcla continua alrededor de un área interior que está ocupada por las colas hidrófobas de las moléculas de tensioactivo. De esta manera, esto crea o da lugar a una estructura de tipo de cubierta.

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Entidad detectable

En realizaciones muy preferidas, la entidad detectable es una que es heteróloga con respecto a la partícula compacta. Es decir, la partícula compacta en su estado natural no está asociada con la entidad detectable.

De esta manera, por ejemplo, cuando la partícula compacta comprende una partícula compacta celular, la entidad detectable es una que normalmente no se expresa por la célula, sino que se acopla o se acopla químicamente a la misma por manipulación o intervención humana, tal como por ejemplo por acoplamiento químico. Por lo tanto, los métodos y composiciones descritos en la presente memoria no hacen uso de células que expresan de forma natural una entidad particular detectable, tales como líneas de células de cáncer, ni incluyen células que se han inducido para expresar una entidad particular detectable por transfección.

Preferiblemente, la célula no incluye la entidad detectable en su estado natural, en ninguna parte del ciclo celular o fase del desarrollo, y la expresión de la entidad detectable preferiblemente no es inducible. Preferiblemente, la célula no es una célula transfectada, es decir, la célula no incluye material genético que se ha introducido artificialmente en su interior. De esta manera, la entidad detectable no se expresa por la célula por estar transfectada, sino que más bien se añade externamente al contexto de la célula por manipulación.

La entidad detectable es una entidad cuya presencia y preferiblemente cuya cantidad es revelable, es decir, su presencia se puede demostrar o su cantidad se puede medir, directa o indirectamente. En general, la entidad de detectable puede ser cualquier cosa que sea capaz de producir una señal detectable, o una señal revelable, por sí misma, de forma natural o cuando se estimula para hacerlo así.

La entidad detectable puede producir una señal sola o junto con una o más entidades, por ejemplo, cuando se pone en contacto con agentes de revelado tales como anticuerpos y/o anticuerpos secundarios. La propia entidad detectable puede marcarse, como se describe en otras parte de este documento, usando cualquier de una diversidad de marcadores, por ejemplo, marcadores radiactivos y no radiactivos, como se conoce en la técnica. En la sección denominada "detección y visualización" proporcionada más adelante está contenida una discusión adicional de este aspecto.

El patrón de referencia preferiblemente comprende la entidad detectable en un estado relativamente puro, es decir, sustancialmente aislado de otras moléculas o compuestos. La entidad detectable preferiblemente carece o carece sustancialmente de componentes celulares con los que normalmente puede estar asociada. Por ejemplo, la entidad detectable puede estar en forma aislada.

La entidad detectable preferiblemente es de naturaleza no celular, pero no es necesariamente de origen no celular. Por esto se entiende que la entidad detectable puede proceder de la célula, pero preferiblemente es una que ha experimentado algún procesamiento, por ejemplo purificación o concentración, para aislar la entidad detectable de al menos otro componente celular. En particular, la entidad detectable no comprende, por ejemplo, material celular de partida o células enteras. Preferiblemente, la entidad detectable no comprende cantidades sustanciales de estructuras celulares tales como paredes celulares, membranas celulares, orgánulos, citoesqueleto, etc. Preferiblemente, en estas realizaciones, la entidad detectable comprende componentes "moleculares" en un estado relativamente puro, en comparación con su entorno dentro de la célula.

En otras palabras, la entidad detectable preferiblemente comprende material no celular y/o componentes no celulares. Preferiblemente no comprende cantidades sustanciales de material celular, por ejemplo, "carece de células". Para este fin se prefiere la síntesis química o la producción recombinante de la entidad detectable.

La naturaleza del agente de unión dependerá de la entidad detectable, pero puede comprender un agente de unión no específico o preferiblemente un agente de unión específico. De esta manera, pueden emplearse como agentes de unión, agentes de unión no específicos tales como colorantes, por ejemplo, colorantes usados típicamente para teñir tejidos. Sin embargo, se prefieren agentes de unión específicos.

La entidad detectable puede comprender una "molécula pequeña", tal como compuestos orgánicos o inorgánicos sencillos. La entidad detectable puede comprender, en particular, un hapteno tal como di-nitrofenol (DNP). La entidad detectable puede incluir colorantes, tales como colorantes fluorescentes.

En realizaciones muy preferidas, la entidad detectable comprende un ácido nucleico, tal como ADN, ARN, APN o ALN o un polipéptido, tal como una proteína o antígeno, u otro polipéptido que comprende epítopos. La entidad detectable puede comprender además un péptido, tal como un péptido modificado, incluyendo un péptido acetilado, metilado, mutado por deleción, etc. En el caso de inmunohistoquímica (IHC) se prefieren patrones de referencia que comprenden entidades detectables de proteína etc., mientras que en el caso de la hibridación in situ (ISH) se prefieren patrones de referencia que comprenden ácidos nucleicos etc.

Cuando la entidad detectable comprende un ácido nucleico, el agente de unión puede comprender en particular una sonda de ácido nucleico. Para este fin, puede comprender un ácido nucleico tal como ADN o ARN, o un derivado del mismo, tal como un ácido péptido nucleico, APN o ácido nucleico bloqueado, ALN. La sonda de ácido nucleico preferiblemente es capaz de hibridar específicamente con una secuencia en la entidad detectable, preferiblemente en condiciones rigurosas. En particular, la sonda de ácido nucleico puede comprender al menos una secuencia complementaria a una secuencia en la entidad detectable. Preferiblemente, el agente de unión al ácido nucleico o sonda comprende una parte monocatenaria, o está desnaturalizado para exponer sitios de unión.

Cuando la entidad detectable comprende una proteína tal como un antígeno, el agente de unión preferiblemente comprende cualquier molécula capaz de unirse específicamente a la proteína. En particular, el agente de unión puede comprender un anticuerpo (monoclonal o policlonal) capaz de unirse específicamente al antígeno.

En los ejemplos anteriores, los ácidos nucleicos típicamente se detectan por unión de agentes que comprenden ácidos nucleicos, mientras que las proteínas típicamente se detectan por medio de anticuerpos. Sin embargo, se apreciará que pueden elegirse pares de entidad detectable - agente de unión basados en interacciones de proteína y ácido nucleico. De esta manera, se sabe que, por ejemplo, ciertas proteínas de unión a ácidos nucleicos tales como las proteínas de dedos de zinc, proteínas HLH, etc., pueden unirse a secuencias de ácidos nucleicos específicas. De esta manera, una proteína de unión a un ácido nucleico puede usarse como un agente de unión para detectar una entidad detectable que comprende un ácido nucleico afín, y un ácido nucleico puede usarse como agente de unión para detectar una entidad detectable que comprende una proteína de unión al ácido nucleico afín.

Preferiblemente la entidad detectable se selecciona entre el grupo consistente en una proteína, un polipéptido, un péptido, un péptido fosfilado, un péptido fosforilado, un péptido glucado, un glicopéptido, un ácido nucleico, un virus, una partícula parecida a un virus, un nucleótido, un ribonucleótido, un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido y un carbohidrato o una combinación de los mismos (por ejemplo, material cromosómico que comprende tanto componentes proteicos como de ADN o un par o serie de efectores, donde uno o más se convierten a otro en la forma activa, por ejemplo catalíticamente).

En realizaciones preferidas, la entidad detectable comprende un polipéptido o un ácido nucleico. En realizaciones muy preferidas, la entidad detectable comprende convenientemente un indicador de un estado de una célula tal como un indicador de la salud o del estado patológico de la célula.

Por ejemplo, la presencia o cantidad de la entidad detectable puede servir para indicar que la célula está en un estado sano, normal o funcional. Sin embargo, preferiblemente, la entidad detectable es tal que es un indicador de un estado anómalo de la célula, por ejemplo, un estado de enfermedad. En otras palabras, si la entidad detectable está presente en una célula o tejido, puede deducirse que la célula o tejido u órgano o individuo que la comprende está enfermo. La entidad detectable puede ser para el diagnóstico de una sola enfermedad, o de varias enfermedades, o de un síndrome tal como SIDA, o de una afección médica. Preferiblemente, la enfermedad, síndrome o afección es tratable.

Preferiblemente, la presencia, cantidad o concentración de la entidad detectable en una célula o tejido se detecta para proporcionar una indicación de una afección de la célula o tejido, preferiblemente una afección patológica de la célula o tejido. Por lo tanto, en realizaciones en las que el patrón de referencia se emplea como patrón de diagnóstico, la entidad detectable puede comprender cualquier entidad relevante desde el punto de vista del diagnóstico.

De esta manera, en esta realización preferida, la entidad detectable es esencialmente un marcador de una situación patológica o un marcador de enfermedad, cuya presencia o cantidad en una célula indica que la célula está o es probable que esté enferma. La presencia de la entidad detectable puede ser de diagnóstico o puede servir simplemente como un indicador, que junto con otros indicadores, por ejemplo un panel de indicadores, indica la probabilidad de una enfermedad. La cantidad de la entidad detectable en la célula o tejido puede ser significativa, es decir, es si está por encima de un nivel umbral o no lo que es indicativo de la enfermedad.

Preferiblemente, la enfermedad comprende cáncer. Por lo tanto, la entidad detectable es preferiblemente un marcador de cáncer o una proteína de cáncer o un ácido nucleico de cáncer. En la técnica se conocen varios cánceres y proteínas relacionadas con cánceres, por ejemplo, ras, BRCA1, HER2, ATM, RhoC, telomerasa, etc. El antígeno carcinoembriónico (CEA) está asociado con cánceres del tracto digestivo (por ejemplo del colon) así como con otros trastornos malignos y no malignos. A continuación se indican ejemplos de otros marcadores de cáncer, y se apreciará que los ácidos nucleicos que los codifican también pueden usarse como entidades detectables.

Los niveles de antígeno prostático específico (PSA) son elevados en cánceres de próstata y algunas veces están aumentados en afecciones de próstata (por ejemplo BPH) o prostatitis.

El CA 19.9 está asociado principalmente con cánceres gastrointestinales. Algunas veces también se han observado valores aumentados en pacientes con metástasis y afecciones no malignas, por ejemplo hepatitis, cirrosis o pancrea-
titis.

HER2 está asociado con cánceres de mama. Los valores aumentados de la proteína HER2, o la sobreexpresión, a menudo están asociados con un crecimiento rápido de las células tumorales que puede conducir a situaciones metastásicas. Los pacientes con metástasis que sobreexpresan la proteína HER2 pueden beneficiarse de la terapia con HERCEPTIN (terapia con anticuerpos anti-HER2).

Los valores elevados de CA 125 a menudo están asociados con cáncer de los ovarios. Sin embargo, también pueden producir niveles elevados de CA 125 situaciones no malignas tales como endometriosis, embarazo durante el primer semestre, quistes ováricos o enfermedad inflamatoria pélvica. La asociación entre la historia familiar y la incidencia de cánceres está bien documentada.

Los valores de CA 15.3 a menudo están elevados en pacientes con cánceres de mama. Cuando existe una historia de cáncer entre miembros de una familia, puede aconsejarse a los pacientes someterse también a una mamografía. Además del cáncer de mama, también se sabe que otras afecciones no malignas (por ejemplo la cirrosis, enfermedades benignas de ovarios y mama) producen niveles elevados de CA 15.3.

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Los niveles de alfa fetoproteína (AFP) a menudo están elevados en cánceres hepáticos (hepatocelular) y testiculares (no-seminomatosos). También están presentes niveles elevados durante el embarazo o algunos cánceres gastrointestinales. También se usa AFP en combinación con otros ensayos como ensayos de selección para defectos del tubo neural abiertos.

El carcinoma nasofaríngeo (NPC) es un carcinoma de células escamosas, no glandular, no linfomatoso, que se produce a partir de las células epiteliales de la nasofaringe. Es la forma más común de cáncer nasofaríngeo, con una mayor incidencia en adultos. Algunos síntomas clínicos incluyen problemas de la nariz o el oído, sangre en la mucosa nasal, bultos en el cuello, aumento de los ganglios linfáticos (normalmente cervicales) y sensación de obstrucción nasal. Se ha demostrado que el virus de Epstein Bar (EBV) tiene una relación directa con NPC cuando puede detectarse en tumores NPC y los pacientes con NPC tienen una tendencia a tener mayores títulos de anticuerpos específicos de EBV que la población general. La detección precoz a través de la exploración normalmente tiene como resultado un pronóstico favorable.

El inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1) también se conoce como inhibidor de metaloproteinasa 1, inhibidor de la colagenasa de fibroblastos, inhibidor de colagenasa y actividad potenciadora de eritroides (EPA). Se ha notificado que la sobreexpresión de TIMP-1 hepático bloquea el desarrollo de carcinomas hepatocelulares inducidos por TAg por inhibición del crecimiento y la angiogénesis. El TIPM-1 está asociado, por ejemplo, con cáncer pulmonar no microcítico (NSCLS), melanoma maligno y condrosarcoma.

También pueden usarse como entidades detectables proteínas supresoras de tumores, tales como p53 y Rb.

Las entidades detectables pueden comprender inmunoglobulina Kappa y cadenas ligeras Lambda. La entidad o entidades detectables pueden comprender uno o más marcadores de pronóstico tales como el receptor de estrógenos (ER) alfa y beta y el receptor de progesterona (PR), proteína p53, proteínas relacionadas con la proliferación tales como Ki-67 y antígeno nuclear de células proliferativas (PCNA). La entidad o entidades detectables pueden comprender una o más moléculas de adhesión celular tales como Cadherina E, y proteínas supresoras de tumores tales como p16, p21, p27 y Rb. La entidad o entidades detectables pueden comprender uno o más factores hematológicos tales como CD3, CD15, CD20, CD30, CD34, CD45, CD45RO, CD99, cadenas ligeras Kappa y Lambda y factor VIII. Además, cualquiera de los siguientes puede usarse como entidad detectable: CD3, CD4, CD5, CD8, CD13, CD14, CD19; CD34 de clase I, CD34 de clase II, CD34 de clase III, CD45, CD45RO, CD64, CD117, proteína p16, p19, p21, p53, antígeno nuclear de células proliferativas, antígeno Ki-67, antígeno epitelial, antígeno de la membrana epitelial, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, glicoforina A, antígeno HLA-ABC, antígeno HLA-DP/DQ/DR, herpes simple 1 y 2 (HSV 1&2), antígeno de papilomavirus, antígeno de VIH-1,2, antígeno de adenovirus, antígeno superficial del virus de la hepatitis B, antígeno de Helicobacter Pylori, antígeno de Chlamydia, antígeno de Chlamydia Pneumoniae y antígeno de CMV.

La entidad o entidades detectables pueden comprender uno o más marcadores de la diferenciación epitelial tales como antígeno prostático específico (PSA), fosfatasa alcalina específica de próstata (PSAP), citoqueratina, antígeno de membrana epitelial, antígeno carcinoembriónico (CEA), mucina polimórfica epitelial, marcadores de la diferenciación mesenquimática, Desmina, Actina, Vimentina y Colágeno de tipo IV. La entidad o entidades detectables pueden comprender uno o más marcadores melanocíticos tales como S-100 y HMB45. La entidad o entidades detectables pueden comprender uno o más marcadores tales como CD117, CD133, CD45, CD4, CD8, CD19, CD20, CD56, CD13, CD33, CD235a, CD15, BerEP4, enolasa específica de neuronas, proteína ácida fibrilar glial, Cromogranina, sinaptofisina, c-Kit, receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), HER2/neu, HER3 y HER4 y sus ligandos tales como EGF y TGF-alfa y otras proteínas tirosina quinasa asociadas a receptores tales como el receptor de la insulina (IR), el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), y receptores de factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3), proteínas relacionadas con la apoptosis tales como M30, Bcl-2, p53, caspasas y Fas.

En una realización, la entidad detectable comprende c-kit. El antígeno CD117, c-kit o KIT es una proteína transmembrana de 145 kDa que pertenece a la familia de tirosina quinasas asociadas a receptores de clase III. El dominio tirosina quinasa intracitoplásmico se divide por un inserto hidrófilo largo entre la región de unión al ATP y el sitio activo de la fosfotransferasa (Fleishman R. A. Trends Genet 1993; 9:285-90). La región extracelular consiste en cinco dominios de tipo inmunoglobulina, donde se cree que el segundo y tercer bucles están implicados en la unión al ligando (Blechman JM, et al J Biol Chem 1993; 268:4399-4406). El ligando natural de c-kit se ha denominado factor de células madre, factor de Steel (SLF), o factor de crecimiento de mastocitos. C-kit se expresa en 1-4% de las células de médula ósea normales (Papayannopoulou et al, Blood 1991; 78: 1403-12; Bühring H-J, Ullrich A, Schaudt K. Müller CA, Busch FW. The product of the proto-oncogene c-kit).

La mayoría de las células de médula positivas (50-70%) coexpresan CD34 y comprenden células progenitoras y sus precursores de todos los linajes hematopoyéticos (Kikutani et al en: Schlossman et al., editors. Leukocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1995. p. 1855-64: Bühring et al, en: Schlossman SF, Boumsell L. Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leukocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1995. p. 1882-8). c-kit está asociado casi exclusivamente con fases inmaduras de la hematopoyesis, el desarrollo de melanocitos, la diferenciación de osteoclastos, y la diferenciación de células de Langerhans. c-kit se expresa en mastocitos y se ha descubierto que se expresa en los blastos de pacientes con AML, pero está ausente en la mayoría de los blastos de ALL (Bühring et al, Br J Haematol 1992; 82: 287-94).

En otra realización, la entidad detectable comprende una laminina, preferiblemente la cadena gamma 2 de la laminina 5.

Las lamininas son glicoproteínas grandes heterotriméricas de la membrana basal compuestas por una cadena \alpha, una \beta y una \gamma. En el momento actual se sabe que cinco cadenas \alpha, tres cadenas \beta, y tres cadenas \gamma forman al menos cinco isoformas diferentes. La proteína laminina 5, consistente en las cadenas \alpha3, \beta3 y \gamma2, inicialmente se sintetiza como un precursor de 460 kDa, que experimenta un procesamiento proteolítico específico a una forma menor después de la secreción en la matriz extracelular. La cadena \gamma2 de la laminina 5 es una isoforma única ya que la expresión de sus subunidades se restringe a tejidos epiteliales, donde forma parte del sistema de anclaje epitelial y la locomoción celular. La proteína de la cadena \gamma2 de la laminina 5 es esencial para la adhesión de los queratinocitos basales a la membrana basal subyacente, funcionando como un ligando de adhesión para las integrinas \alpha3\beta1, \alpha6\beta1 y \alpha6\beta4 (Decline et al, J Cell Sci 2000; 114: 811-231; Salo, S, Function of the \gamma2 chain in epithelial adhesion and migration, and expression in epithelial cells and carcinomas (academic dissertation). Oulu: Oulu Univ.; 1999). Los datos que se van acumulando sugieren un aumento de la expresión de la proteína de la cadena \gamma2 de la laminina 5 en varios carcinomas humanos diferentes, siendo su expresión característica de células cancerosas con un fenotipo de células en gemación (Salo, S, mencionado anteriormente). Varios estudios indican que la expresión de la proteína de la cadena \gamma2 de la laminina 5 puede servir como marcador para el cáncer invasivo en diversos tipos de carcinomas de células escamosas (Skyldberg et al, J. Natl Cancer Inst 1999; 91: 1882-7; Nordström et al, Int J Gynecol Cancer 2002; 12: 105-9), adenocarcinomas de colon
(Pyke et al, Cancer Res 1995; 55: 4132-9), y adenocarcinomas de pulmón (Määttä et al, J Pathol 1999; 188: 361-8).

En realizaciones preferidas, la entidad detectable comprende uno cualquiera o más de HER2, receptor de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR), p16, Ki-67, c-kit, cadena \gamma2 de la laminina 5 y proteína del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ácidos nucleicos que los codifican y formas modificadas postraduccionalmente, preferiblemente formas fosforiladas de éstas.

HER2, también conocido como NEW y ERBB2, se describe con detalle en Coussens et al, Science. 6 de diciembre de 1985; 230 (4730): 1132-9; Spivak-Kroizman et al, J Biol Chem. 25 de abril de 1992; 267 (12): 8056-63; King et al, J Biol Chem. 5 de agosto de 1986; 261 (22): 10073-8; y Plowman et al, Proc Natl Acad Sci USA. julio de 1990; 87(13): 4905-9.

El receptor de estrógenos se conoce en la técnica y se describe con detalle, por ejemplo, en Ponglikitmongkol, et al, EMBO J. noviembre de 1988; 7 (11): 3385-8; Lazennec et al., Gene. 12 de diciembre de 1995; 166 (2): 243-7; Waterman et al., Mol Endocrinol. enero de 1988; 2 (1): 14-21; Green, et al Nature 320: 134-139, 1986; Greene, et al Science 231: 1150-1154, 1986.

El receptor de progesterona, PGR o PR, se describe con detalle, por ejemplo, en Misrahi et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 143: 740-748, 1987; Conneely et al, J Soc Gynecol Investig. enero-febrero de 2000; 7 (1 Suppl): S25-32; Mote et al, J Clin Endocrinol Metab. agosto de 1999; 84 (8):2963-71.

P16 también se conoce como CDKN2, INHIBIDOR DE CDK4, SUPRESOR MULTIPLE DE TUMORES 1; MTS1, TP16, p16 (INK4), p16(INK4A), p19(ARF) y p14(ARF). Se describe con detalle, por ejemplo, en Bogenrieder et al, Hautarzt. febrero de 1998 Feb; 49 (2):91-100; Uchida et al, Leuk Lymphoma, marzo de 1998; 29 (1-2):27-35 y Geradts et al, Cancer Res. diciembre de 1995; 55 (24): 6006-11.

Ki-67 se describe con detalle, por ejemplo, en Schluter et al, J. Cell Biol. 123:513-522, 1993.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) también se conoce como HOMOLOGO DEL ONCOGÉN VIRAL DE LEUCEMIA ERITROBLÁSTICA AVIAR V-ERB-B; ONCOGÉN ERBB; ERBB1; ANTÍGENO 7 DE ESPECIES y S7. Se describe con detalle, por ejemplo, en Carlin et al, Proc Natl Acad Sci USA; agosto de 1982; 79 (16):5026-30; Kondo et al, Cytogenet Cell Genet. 1983; 35 (1):9-14; Revis-Gupta et al, Proc Natl Acad Sci USA. 15 de julio de 1991; 88 (14):5954-8; Huang et al, J Biol Chem. 23 de mayo de 2003; 278 (21): 18902-13. Epub 14 de marzo de 2003.

También pueden usarse como entidades detectables ácidos nucleicos que codifican cualquiera de éstos.

Se apreciará que no es estrictamente necesario usar las proteínas de las entidades detectables anteriores en los patrones de referencia descritos en la presente memoria, y que es posible detectar los antígenos usando ácidos nucleicos que codifican las proteínas. Por lo tanto, debe apreciarse que el patrón de referencia puede comprender una entidad detectable que es un ácido nucleico capaz de codificar cualquiera de las entidades detectables de polipéptido descritas anteriormente.

Ni que decir tiene que el agente de unión o agente de revelado en este caso preferiblemente comprende un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico capaz de unirse específicamente al menos a una parte de la entidad detectable de ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico complementario.

Cuando la entidad detectable comprende un polipéptido, puede estar sin modificar o comprender una o más modificaciones postraduccionales, tales como la adición de un carbohidrato (glicosilación), ADP-ribosilo (ADP ribosilación), ácido graso (prenilación, que incluye pero sin limitación: miristoilación y palmitilación), ubiquitina, (ubiquitinación), fosforilación y desfosforilación de proteínas y sentrina (sentrinización; una modificación de proteínas similar a la ubiquitinación).

Preferiblemente, la modificación postraduccional comprende la fosforilación. Por ejemplo, la entidad detectable puede comprender HER2 fosforilado o receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) fosforilado. La entidad detectable puede comprender además c-kit fosforilado, la cadena gamma 2 de la laminina 5 fosforilada, el receptor de estrógenos (ER) fosforilado, el receptor de progesterona (ER) fosforilado, p16 fosforilada y/o Ki-67 fosforilada. Las entidades detectables fosforiladas son particularmente preferidas cuando se está usando el patrón de referencia en aplicaciones de citometría de flujo.

La entidad detectable también puede comprender convenientemente un antígeno, preferiblemente un antígeno relevante desde el punto de vista del diagnóstico, que es detectable por unión a un anticuerpo relevante. Puede emplearse cualquier antígeno adecuado, y una persona especialista conocerá los antígenos que son adecuados para dichos fines de diagnóstico.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "entidad detectable" incluye, pero sin limitación, un átomo o molécula, donde una molécula puede ser inorgánica u orgánica, un hapteno, una molécula efectora biológica y/o un ácido nucleico que codifica un agente tal como una molécula efectora biológica, una proteína, un polipéptido, un péptido, un péptido modificado, un péptido acetilado, un péptido metilado, un péptido mutante, un péptido delecionado, un péptido fosfilado, un péptido fosforilado, un péptido glucado, un glicopéptido, un ácido nucleico, un virus, una partícula parecida a un virus, un nucleótido, un ribonucleótido, un ácido nucleico, un ADN, un ARN, un ácido péptido nucleico (APN), un ácido nucleico bloqueado (ALN), un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido y un carbohidrato. La entidad detectable puede estar en solución o en suspensión (por ejemplo, en forma cristalina, coloidal u otra forma de partículas). La entidad detectable puede estar en forma de un monómero, dímero, oligómero, etc. o, por el contrario, en un complejo.

Se apreciará que no es necesario usar una sola entidad detectable, y que es posible usar dos o más entidades detectables en el patrón de referencia. Por consiguiente, la expresión "entidad detectable" también incluye mezclas, fusiones, combinaciones y conjugados de átomos, moléculas etc. como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, una entidad detectable puede incluir, pero sin limitación: un ácido nucleico combinado con un polipéptido; dos o más polipéptidos conjugados entre sí; una proteína conjugada con una molécula biológicamente activa (que puede ser una molécula pequeña tal como un profármaco); o una combinación de cualquiera de éstos con una molécula biológicamente activa.

En realizaciones preferidas, la entidad detectable comprende una "molécula efectora biológica" o "molécula biológicamente activa". Estos términos se refieren a una entidad que tiene actividad en un sistema biológico que incluye, pero sin limitación, una proteína, polipéptido o péptido que incluye, pero sin limitación, una proteína estructural, una enzima, una citoquina (tal como un interferón y/o una interleuquina), un antibiótico, un anticuerpo monoclonal o policlonal, o una parte eficaz del mismo, tal como un fragmento de F(ab)2, F(ab') o Fv, pudiendo ser dicho anticuerpo o parte del mismo natural, sintético o humanizado, una hormona peptídica, un receptor, una molécula de señalización u otra proteína; un ácido nucleico como se define más adelante, incluyendo, pero sin limitación, un oligonucleótido u oligonucleótido modificado, un oligonucleótido antisentido o un oligonucleótido antisentido modificado, ADNc, ADN genómico, un cromosoma artificial o natural (por ejemplo, un cromosoma artificial de levadura), o parte del mismo, ARN, incluyendo ARNm, ARNt, ARNr o una ribozima, o un ácido péptido nucleico (APN), ácido nucleico bloqueado (ALN), un virus o partículas parecidas a virus; un nucleótido o ribonucleótido o un análogo sintético de los mismos, que puede estar modificado o no modificado; un aminoácido o análogo del mismo, que puede estar modificado o no modificado; una hormona no peptídica (por ejemplo, esteroide); un proteoglicano; un lípido; o un carbohidrato. También son de utilidad como entidades detectables moléculas pequeñas que incluyen agentes químicos inorgánicos y orgánicos. En una realización particularmente preferida, la molécula biológicamente activa es una entidad detectable farmacéuticamente activa, por ejemplo, un isótopo.

La entidad detectable puede emitir una señal detectable, tal como luz u otra radiación electromagnética. La entidad detectable puede ser un radioisótopo como se conoce en la técnica, por ejemplo ^{32}P o ^{35}S o ^{99}Tc, o una molécula tal como un ácido nucleico, polipéptido u otra molécula como se explica más adelante conjugada con dicho radioisótopo. La entidad detectable puede ser opaca a la radiación, tal como la radiación de rayos X. La entidad detectable también puede comprender un medio de dirección por el cual se dirige a una célula, tejido, órgano u otro compartimento particular dentro del cuerpo de un animal. Por ejemplo, la entidad detectable puede comprender un anticuerpo radiomarcado específico para moléculas, tejidos o células definidas en un organismo.

La entidad detectable puede comprender un colorante, incluyendo colorantes azo, pigmentos orgánicos, azul cibacrón, etc.

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Se apreciará que la entidad detectable puede comprender una o más entidades como se ha indicado anteriormente, y en particular puede comprender dos o más o una pluralidad de cualquiera de las entidades anteriores, o combinaciones de una o más de la entidades anteriores.

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Unión de la entidad detectable

La entidad detectable se une a una partícula compacta que tiene una forma compacta por acoplamiento o acoplamiento químico, y la partícula compacta que comprende la entidad se soporta en el medio de incrustación. Preferiblemente, la partícula compacta que comprende la entidad detectable se incrusta en el medio de incrustación.

La entidad detectable se acopla o se acopla químicamente a una partícula compacta. El acoplamiento o acoplamiento químico, etc., entre la entidad detectable y la partícula compacta puede ser permanente o transitorio, y puede implicar interacciones covalentes o no covalentes (incluyendo formación de enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas, fuerzas hidrófobas, interacciones de Van der Waals, etc.).

En algunas realizaciones, la entidad detectable se acopla químicamente a la partícula compacta por medio de un enlazador, como se muestra en la técnica y se describe con más detalle más adelante. El uso de dicho acoplamiento químico permite acoplar la cantidad de entidad detectable de una manera precisa a la partícula compacta.

El término "unido" implica una asociación permanente o semipermanente entre la partícula compacta y la entidad detectable. La entidad detectable se acopla o se acopla químicamente a la partícula compacta. Este acoplamiento o acoplamiento químico puede ser transitorio o suelto, siempre que esa asociación sea suficiente para que la entidad detectable adopte una forma que se define sustancialmente por la colocación y/o forma de la partícula compacta durante y después del soporte o incrustación. Lo único verdaderamente importante es que la partícula compacta mantenga la entidad detectable en su sitio durante la etapa o etapas de soporte o preferiblemente de incrustación en el medio.

La partícula compacta simplemente puede retener la entidad detectable, o prevenir de otra manera su difusión o que se desprenda por lavado. La retención puede ser transitoria o puede persistir a lo largo de una parte sustancial de la etapa de soporte o incrustación, preferiblemente a lo largo del transcurso de esa etapa.

En realizaciones preferidas, la entidad detectable se acopla covalentemente a la partícula compacta. En estas realizaciones preferidas, la entidad detectable se acopla químicamente o forma enlaces cruzados con una o más moléculas que constituyen la partícula compacta. Más adelante, en la sección titulada "acoplamiento" se describen con más detalle métodos preferidos de acoplamiento químico. No es necesario decir que la cantidad de entidad detectable acoplada a la partícula compacta en esta realización controlará la cantidad de entidad detectable que está presente en la sección transversal y, por lo tanto, el nivel de tinción conseguido.

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Espaciadores

Además, en ciertas realizaciones puede ser deseable incluir medios espaciadores entre la entidad detectable y la partícula compacta, o componentes de la partícula compacta. Estos medios espaciadores pueden comprender convenientemente enlazadores o espaciadores como se conocen en la técnica. El objetivo de los medios espaciadores es separar la entidad detectable de la partícula compacta (u otro componente de la partícula compacta) para evitar, por ejemplo, el impedimento estérico y promover la detección de la entidad detectable. Por consiguiente, dependiendo de la aplicación, puede preferirse el uso de espaciadores más cortos o más largos.

Los medios espaciadores pueden comprender enlazadores o espaciadores que son polímeros de diferentes longitudes (cuya longitud puede controlarse controlando el grado de polimerización). En la técnica se conocen numerosos espaciadores y enlazadores y la persona especialista sabrá como elegirlos y usarlos dependiendo de la aplicación. La persona especialista también sabrá qué longitud de espaciador usar.

Los espaciadores pueden estar hechos, por ejemplo, de polietilenglicol, derivados de PEG o polialcanos u homopoliaminoácidos. También pueden usarse dextranos y dendrímeros, como se conocen en la técnica. En particular, los enlazadores o espaciadores pueden comprender polímeros de nucleótidos (ácidos nucleicos, polinucleótidos, etc.) o polímeros de aminoácidos (proteínas, péptidos, polipéptidos, etc.).

Por ejemplo, cuando la entidad detectable comprende un péptido o polipéptido, éste puede sintetizarse o expresarse (por ejemplo como una proteína de fusión) junto con restos de aminoácidos adicionales (constituyendo éstos el espaciador o enlazador). No es necesario que el enlazador o espaciador esté contiguo con la entidad detectable, sino que puede estar acoplado a la misma, de forma covalente o no covalente (como se ha descrito anteriormente) usando cualquier medio adecuado, por ejemplo por medio del uso de los agentes de reticulación descritos más adelante.

Se apreciará que cuando se usan péptidos como espaciadores, la configuración y longitud de los espaciadores peptídicos se limita sólo por los propios métodos de síntesis de péptidos. De esta manera, por ejemplo, la flexibilidad de los métodos de síntesis de péptidos permite la síntesis de péptidos largos, cortos y ramificados, incluyendo péptidos con aminoácidos naturales y no naturales. En particular, es deseable el uso de espaciadores ramificados, por ejemplo, estructuras peptídicas ramificadas ya que permite unir a un espaciador o enlazador más de una molécula de una entidad detectable. Además, los espaciadores con estructuras ramificadas o de árbol permiten el acoplamiento o unión de más de un tipo de entidad detectable. Por ejemplo, una primera entidad detectable puede acoplarse a un brazo del espaciador, una segunda entidad detectable puede acoplarse a un segundo brazo, etc. Además, pueden acoplarse a cada brazo diferentes cantidades de la misma o de diferentes entidades detectables.

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Protocolo ejemplar

Esta sección proporciona una corta visión general de un procedimiento preferido no limitante por medio del cual una entidad detectable puede acoplarse o acoplarse químicamente a la partícula compacta que tiene una forma compacta.

El proceso para fabricar el patrón de referencia, usando, por ejemplo, células sf9 de insecto intactas y un procedimiento de fijación con formalina e incrustación con parafina (FFPE) incluye una o más de las siguientes etapas de procedimiento: (1) las células se cultivan como un cultivo en suspensión en matraces giratorios en medio en un entorno controlado antes de aislarse del medio por centrifugación y lavarse (Figura 14A, B y C). (2) Las células en suspensión se cuentan en un hemacitómetro (Figura 14D).

(3) Las células en suspensión se activan con un agente de reticulación heterobifuncional (Figura 14E), se lavan por centrifugación repetida y resuspensión, se acoplan con un péptido, se lavan de nuevo y se cuentan, antes de procesarse como una preparación FFPE. (4) Las células se incrustan en cilindros de agarosa y se fijan durante una noche y posteriormente se envuelven en papel para limpiar lentes ópticas y se ponen en una histocápsula para una manipulación fácil (Figura 14F). (5) Las células incrustadas en gel se deshidratan por tratamiento secuencial con mezclas de etanol/agua seguidas de xileno y posterior infiltración con parafina fundida y moldeo de los bloques finales. (6) Los bloques de parafina se cortan en un microtomo, se montan en portaobjetos, se desparafinan, se inmunovisualizan y se evalúan en un microscopio como muestras de tejido de convencionales.

Para preparaciones citológicas, la suspensión celular después de la Etapa 3 se monta en portaobjetos usando un procedimiento de citocentrifugación, Autocyte/TriPath o ThinPrep^{TM}, seguido de inmunovisualización y evaluación en un microscopio como muestras patrón. En el caso de preparaciones citológicas evaluadas en un citómetro de flujo, la suspensión celular diluida se inmunovisualiza usando reactivos marcados con fluorescente y se evalúa en un citómetro de flujo rutinario.

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Hinchamiento

En algunas realizaciones, la partícula compacta puede hincharse al menos parcialmente antes o durante la asociación con la entidad detectable. En realizaciones preferidas, puede dejarse que la partícula compacta se hinche parcial o completamente antes o durante el acoplamiento químico a la entidad detectable.

Aunque la expresión "hinchamiento " en algunos contextos puede tomarse como una referencia a la captación de disolvente en un gel de polímero insoluble, el uso de la expresión en la presente invención se considera más general, incluyendo específicamente el tratamiento mecánico, físico o químico para aumentar el volumen o el área de superficie o la accesibilidad a sitios, preferiblemente sitios internos, de la partícula compacta tal como una microperla.

El hinchamiento de la partícula compacta permite que la entidad detectable acceda al interior de la partícula compacta así como a partes de la superficie. De esta manera puede modularse o controlarse el grado de penetración de la entidad detectable en partes del núcleo de la partícula compacta, y por lo tanto el acoplamiento a la misma. Los diferentes patrones de distribución modulados resultantes de la entidad detectable en la partícula compacta pueden usarse para diferentes entidades detectables dependiendo de su distribución en la célula.

La partícula compacta puede hincharse por varios medios. Por ejemplo, la partícula compacta puede tratarse mecánicamente. La partícula compacta puede abrirse mecánicamente tal como por separación. El grado de hinchamiento o contracción puede controlarse controlando la cantidad de acción mecánica o de separación, según sea el
caso.

Preferiblemente, sin embargo, se deja que la partícula compacta se hinche al exponerse a un agente de hinchamiento, cuya absorción o adsorción permite cambiar el volumen de la partícula compacta, preferiblemente aumentarlo. Un ejemplo preferido de un agente de hinchamiento es el agua. Cuando se usa un agente de hinchamiento, el grado de hinchamiento puede modularse por diversos métodos. Por ejemplo, puede variarse la cantidad de agente de hinchamiento, tal como agua, que se expone a una cantidad fija de partícula compacta. Además, también puede variarse el tiempo o la temperatura, o ambos, de exposición del agente de hinchamiento o agua a la partícula compacta junto con o en lugar de controlar la cantidad expuesta.

En realizaciones preferidas, el acoplamiento entre la entidad detectable y la partícula compacta es tal que óptimamente se realiza en un medio no acuoso tal como un medio orgánico. Un medio orgánico preferido es tolueno, xileno, diclorometano, acetona o dimetilformamida, ya que éstos son compatibles con reactivos de acoplamiento y activación preferidos, por ejemplo vinilsulfona, azlactonas, cloruro cianúrico, diclorotriazina, clorotriazina, isocianatos, ésteres de N-hidroxil succinimida, aldehídos, epóxidos, carbonil diimidazol, bromuro de cianógeno, cloruro de tresilo, bromoacetilo y bromuro de alquilo.

En este caso, la cantidad o grado de hinchamiento puede controlarse convenientemente añadiendo cantidades de diferentes disolventes en el medio no acuoso. En otras palabras, el grado de hinchamiento puede controlarse permitiendo el acoplamiento en una mezcla de medio no acuoso y agua en proporciones variables o mezclando diferentes disolventes no acuoso tales como tolueno y alcoholes.

También pueden usarse mezclas de disolventes, ya sean orgánicos, inorgánicos, miscibles con agua, inmiscibles con agua, etc. Las mezclas de disolventes pueden ser de cualquier disolvente mezclable - por ejemplo, alcoholes y agua, acetona y agua, alcoholes y tolueno, tolueno y dimetilformamida - o cualquier mezcla de los mismos, que sea compatible con la partícula compacta y el agente químico de acoplamiento usado.

En este caso, la cantidad o grado de hinchamiento puede controlarse convenientemente añadiendo cantidades de agua en el medio no acuoso. En otras palabras, el grado de hinchamiento puede controlarse permitiendo el acoplamiento en una mezcla de medio no acuoso y agua en proporciones variables. Cuanto más agua esté presente, mayor será la cantidad de hinchamiento.

La partícula compacta puede dejarse hinchar de una forma sustancialmente completa durante o antes del acoplamiento. La entidad detectable entonces tiene acceso al interior o núcleo de la partícula compacta y puede acoplarse a la misma, dando como resultado al menos alguna tinción en dichas partes de núcleo. En casos extremos, la entidad detectable se acopla a sustancialmente todas las partes en una sección transversal de la partícula compacta. La exposición a un anticuerpo relevante produce una tinción homogénea (es decir, tinción tanto en el núcleo como en las regiones periféricas de la partícula compacta). El perfil de sección transversal de la partícula compacta y el patrón de referencia, por lo tanto, tiene una distribución uniforme de entidad detectable. Dicha realización se prefiere cuando se sabe que la entidad detectable tiene una distribución tanto en la membrana celular como en el citoplasma, o incluso a través de sustancialmente todas las partes de la célula.

Cuando se sabe o se sospecha que la entidad detectable tiene alguna distribución en el citoplasma, pero quizás la mayoría está presente en la membrana celular, dicha distribución o patrón de tinción puede imitarse permitiendo o dejando que la partícula compacta se hinche parcialmente durante o después del acoplamiento. El hinchamiento parcial produce una partícula compacta en la que las secciones transversales tienen sustancialmente más entidad detectable en partes de la superficie en comparación con partes del núcleo. La tinción con anticuerpos no es homogénea y se concentra en las regiones periféricas o superficiales de la partícula compacta, siendo limitada la tinción interna.

Cuando no se permite que tenga lugar el hinchamiento, las moléculas de la entidad detectable sólo reaccionarán y se acoplarán con partes de la superficie de la partícula compacta. La entidad detectable sólo puede acceder y acoplarse a partes periféricas o superficiales de la partícula compacta. No tiene lugar acoplamiento en la parte interna o de núcleo de la partícula compacta, dando como resultado una tinción que se restringe sustancialmente a la superficie (tinción de superficie densa, sin tinción interna).

Esto produce una partícula compacta con una distribución de sección transversal de entidad detectable que está restringida sustancialmente a partes externas de la partícula compacta, sin sustancialmente ninguna tinción en las partes interiores o nucleares de la partícula compacta. El perfil resultante, por lo tanto, tendrá una forma "anillo". Esta forma de anillo puede ser útil cuando se sabe que la entidad detectable en una célula se restringe a la superficie celular, ya que el patrón de tinción en ambos casos será similar. Por lo tanto, los patrones de referencia como se han descrito en los que no se permite que tenga lugar hinchamiento pueden emplearse de forma útil como patrones para medir la presencia, cantidad y/o distribución de una entidad detectable que es, por ejemplo, una proteína de membrana o un receptor de la superficie celular.

Además, se apreciará que las diferentes distribuciones conseguidas como se ha descrito anteriormente por medio de la modulación del hinchamiento pueden emplearse con el objetivo de controlar la entrada de un agente en la célula. De esta manera, por ejemplo, pueden usarse para rastrear si un agente particular, tal como un fármaco, es capaz de pasar a través de la membrana celular y penetrar en la célula. La eficacia de una secuencia de translocación de membrana (MTS) tal como proteína de Drosophila antennapaedia o TAT de VIH (o sus fragmentos) puede controlarse de esta manera.

La forma compacta de la partícula compacta, y por lo tanto la entidad detectable, se establece en el medio de varias formas. En la forma más sencilla, el medio se forma alrededor de la partícula compacta que comprende la entidad detectable acoplada o acoplada químicamente a la misma. Por ejemplo, un medio de incrustación tal como parafina puede tratarse con calor y fundirse, y el medio de incrustación fundido puede verterse alrededor de la partícula compacta; una vez solidificado, el medio de incrustación encerrará a la partícula compacta en su interior. En estas situaciones, puede ser deseable durante el proceso que la partícula compacta se mantenga en su sitio, por ejemplo, con un medio de sujeción u otro soporte. Este medio de sujeción puede tener la facilidad de llevar más de una partícula compacta, preferiblemente múltiples partículas compactas en un patrón particular. Una vez solidificado el medio de incrustación, el soporte puede liberarse de la partícula compacta o partículas compactas.

Además, la partícula compacta puede incrustarse o soportarse en otro medio antes de incrustarse en el medio de incrustación. Esta realización se ilustra en el diagrama de proceso mostrado en las Figuras 11 y 12, que incluye una etapa de incrustación en agarosa. En esta realización, la partícula compacta se mantiene en su sitio en el contexto de un gel de agarosa, que puede fundirse y verterse alrededor de la partícula compacta para encerrarla. La partícula compacta puede mantenerse en su sitio durante este procedimiento con un medio de sujeción, como se ha descrito anteriormente. Después puede cortarse una tira, parte o bloque del gel de agarosa que incluya la partícula compacta incrustada. Después, el propio bloque de agarosa se incrusta en el medio de incrustación, por ejemplo, por fusión, vertido y solidificación del medio de incrustación como se ha descrito anteriormente. La ventaja de dichas realización es que el gel de agarosa se manipula más fácilmente en comparación con la partícula compacta desnuda. Ni que decir tiene que el gel de agarosa debe tener una tenacidad adecuada, y pueden requerirse concentraciones de agarosa comprendidas entre 0,5% y 1%, 2%, 3%, 4%, 5% o mayores.

También será evidente que las propias partículas compactas incrustadas en agarosa (sin incrustación con parafina) pueden usarse como patrón de referencia. En esta realización, el medio de incrustación es la propia agarosa. El bloque de agarosa que contiene partículas compactas incrustadas puede cortarse en secciones como se describe en otras partes de este documento, para producir cortes o secciones para procedimientos posteriores de fijación y tinción. Para este fin, los bloques de agarosa pueden congelarse, de forma que el corte se realice de forma más fácil.

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Usos del patrón de referencia

Como se ha descrito anteriormente, los patrones de referencia descritos en la presente memoria proporcionan un medio sencillo para establecer un "patrón", en otras palabras, un valor establecido de una propiedad medible de una entidad detectable. También puede medirse la misma u otra propiedad de una entidad igual, similar o diferente en una muestra o artículo de ensayo, y los valores pueden compararse.

En el sentido más general, el patrón de referencia permite revelar la presencia de la entidad detectable. De esta manera, para algunos fines, a menudo es suficiente obtener una información sencilla sobre la presencia de la entidad detectable en el patrón de referencia. Sin embargo, para otros fines, puede desearse información sobre una o más características de la entidad detectable. De esta manera, por ejemplo, pueden determinarse características tales como una dimensión, cantidad, calidad, color, orientación, posición, reactividad (o cualquier combinación de dos cualesquiera o más de éstas). Los patrones de referencia también puede usarse para validar uno o más procedimientos en un método.

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Patrón de Color

En una realización, se detecta o determina el color de la entidad detectable. De esta manera, por ejemplo, puede desearse tener un patrón de color en una serie de experimentos de tinción. En este caso, el patrón de referencia descrito en la presente memoria puede usarse para proporcionar un color "patrón" por inclusión de una entidad detectable que tiene, o está teñida para proporcionar, un color predeterminado.

El uso de dicho "patrón de color" permite a un operario juzgar si una muestra, que puede teñirse, es similar o diferente del color "patrón". Por ejemplo, puede esperarse que la muestra cuando se tiña produzca un cierto color azul si es positiva y el patrón de referencia, por lo tanto, puede comprender una entidad detectable que tenga o pueda teñirse para producir dicho color azul. De esta manera, el color de la muestra puede compararse con el color azul proporcionado por el patrón de referencia para establecer si la muestra debe considerarse positiva o no.

Además, el "patrón de color" también puede usarse, por ejemplo, para la calibración de la maquinaria óptica. Por lo tanto, las desviaciones o errores en la detección de color que se producen durante el uso de la maquinaria óptica pueden prevenirse o ajustarse comparando la respuesta de la maquinaria con el color patrón y realizando un ajuste adecuado si es necesario. En el patrón de referencia pueden incluirse dos o más colores "patrón", por ejemplo de diferentes longitudes de onda, para una calibración más precisa.

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Patrón de Posición

Puede detectarse o determinarse la posición de la entidad detectable dentro del patrón de referencia. De esta manera, el área que comprende el color esperado puede detectarse por un operario o por medio de una maquinaria, por ejemplo, para establecer un punto de referencia para una localización en cuadrícula en la muestra. La distancia entre dicho punto de referencia y un punto de la muestra puede medirse fácilmente para proporcionar información sobre la distancia, área o volumen dentro del patrón de referencia o la muestra. El patrón de referencia o el patrón posición pueden comprender dos o más de estos patrones de posición, preferiblemente tres o más patrones de posición. El uso de múltiples localizaciones de color, del mismo color o de colores diferentes, permite una mayor precisión de dimensionamiento, colocación y navegación por medio de triangulación.

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Patrón de Cantidad/Calidad

En otras realizaciones, se detecta o determina la cantidad de la entidad detectable. Esto se consigue más fácilmente por reacción con el agente de unión y el agente de unión puede marcarse para este fin. Preferiblemente, agente de unión se une a la entidad detectable de una forma estequiométrica. La intensidad de la tinción por el agente de unión entonces proporciona información sobre la cantidad o cuantía de entidad detectable. Sin embargo, se apreciará que pueden ser tan importantes o útiles otras características de la tinción y no sólo la intensidad.

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Patrón de Validación

Además de los otros usos descritos en otras partes de este documento, el patrón de referencia descrito en la presente memoria puede usarse para validar o verificar una o más etapas procedurales en un método. Por medio de la validación y verificación se hace referencia específicamente a un proceso por medio del cual se mide el éxito, eficacia o eficiencia de una etapa procedural.

En general, se describe un método de validación de un procedimiento, comprendiendo el método proporcionar un patrón de referencia para una entidad detectable como se describe en este documento, aplicar el procedimiento al patrón de referencia o a una parte del mismo (en particular un corte o sección del mismo) y detectar un cambio en una propiedad de la entidad detectable como resultado del procedimiento. La propiedad de la entidad detectable que se cambia preferiblemente es una que indica el éxito o fallo (o éxito o fallo relativo) del procedimiento. En particular, la entidad detectable puede modificarse de tal forma que el procedimiento, cuando sea satisfactorio, elimine la modificación. Como alternativa, o además, la entidad detectable puede modificarse por el procedimiento. En cualquier caso, la modificación es una que se puede detectar fácilmente como un medio para detectar el éxito o fallo del
procedimiento.

Por lo tanto, se describe un método para evaluar la eficacia o éxito de un procedimiento, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un patrón de referencia como se describe en este documento en el que se cambia una propiedad detectable de la entidad detectable como resultado del procedimiento; (b) realizar el procedimiento sobre el patrón de referencia; y (c) detectar un cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable.

En una realización, una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado de un procedimiento satisfactorio, detectándose el cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable para establecer que el procedimiento es satisfactorio. Como alternativa, o además, una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado de un procedimiento satisfactorio, detectándose el cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable para establecer que el procedimiento no es satisfactorio.

También se describe el uso de un patrón de referencia como se describe en este documento, como un patrón de validación de recuperación de antígeno, patrón de desparafinación, un patrón de validación de bloqueo, un patrón de validación de lavado, un patrón de validación de anticuerpo primario, un patrón de validación de anticuerpo secundario, un patrón de calibración o un patrón de diagnóstico. La entidad detectable preferiblemente comprende una propiedad que es detectable y que se cambia como resultado del procedimiento, es decir, si el procedimiento es satisfactorio o no es satisfactorio.

En particular, el patrón de referencia descrito en la presente memoria puede usarse para validar una cualquiera o más de las etapas empleadas en procedimientos de tinción para IHC tradicionales. Estas etapas pueden incluir: eliminación de parafina, eliminación de antígeno (AR), bloqueo, bloqueo de biotina endógena (por ejemplo, cuando se usa un sistema de visualización basado en biotina), bloqueo enzimático endógeno (por ejemplo, actividad fosfatasa o peroxidasa), una o más etapas de lavado, incubación con un agente de revelado tal como un anticuerpo primario, incubación con componentes de visualización secundarios, tinción con cromógenos (por ejemplo, catalizada por enzimas), adquisición y análisis de la información de tinción.

En particular, el patrón de referencia puede usarse para validar: i) la verificación de la capacidad o funcionalidad del sistema de visualización para teñir la población celular en el procedimiento de tinción particular, ii) verificar la capacidad o funcionalidad del anticuerpo primario para teñir la población celular en el procedimiento de tinción particular, iii) definir una intensidad umbral de tinción para contar células teñidas de forma positiva, iv) definir la relación de intensidad umbral de diagnóstico entre dos o más poblaciones teñidas, v) o verificar la función de reactivos individuales en el protocolo de tinción, por ejemplo, recuperación de antígeno, eficacia de lavado, bloqueo de actividad peroxidasa y reactivos de visualización secundarios.

En realizaciones muy preferidas, el patrón de referencia puede usarse como patrón de validación para las etapas de la adición del anticuerpo primario, la etapa de recuperación de antígeno, la adición de reactivos de visualización secundarios y adquisición y análisis de información de la tinción.

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Patrón de Validación del Procedimiento General

En una realización particular, la entidad detectable puede comprender estreptavidina o avidina. La estreptavidina o biotina puede unirse a la partícula compacta. El patrón de referencia resultante después puede usarse como un indicador sencillo para la adición correcta de ciertos reactivos, por ejemplo incubación con el anticuerpo primario correcto. Por medio de la adición, por ejemplo, de una pequeña cantidad de anticuerpo de ratón biotinilado a la otra solución de anticuerpo primario no marcado, el sistema de visualización teñirá el patrón de referencia positivo si se usa el anticuerpo primario correcto en el portaobjetos particular.

En otra realización particular, la entidad detectable puede comprender una inmunoglobulina, por ejemplo, una inmunoglobulina o anticuerpo de conejo o ratón. La inmunoglobulina podría unirse, por ejemplo, a la partícula compacta en realizaciones que las emplean. De esta manera puede validarse la capacidad de los sistemas de visualización secundarios para reconocer y teñir anticuerpos de conejo o ratón.

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Patrón de Validación de Recuperación de Antígeno

El patrón de referencia puede usarse como patrón de validación de recuperación de antígeno. Para este fin, se describe un método para evaluar la eficacia o éxito de un procedimiento de recuperación de antígeno, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un patrón de referencia como se describe en este documento, en el que una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado del procedimiento de recuperación de antígeno, comprendiendo la propiedad detectable de la entidad detectable el enmascarado o desenmascarado de uno o más epítopos; (b) realizar el procedimiento de recuperación de antígeno sobre el patrón de referencia; y (c) detectar un cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable.

En realizaciones muy preferidas, la entidad detectable en el patrón de referencia se modifica para enmascarar uno o más epítopos, estando algunos o todos ellos desenmascarados en un procedimiento de recuperación de antígeno que es satisfactorio.

Los procedimientos de recuperación de antígeno ("AR") pueden estandarizarse o controlarse empleando patrones de referencia que comprenden entidades detectables que no pueden teñirse normalmente o en las cuales el nivel de tinción depende en gran medida del proceso de recuperación de antígeno.

La entidad detectable puede modificarse de tal forma que pierda completa o parcialmente su antigenicidad. En otras palabras, uno o más epítopos en la entidad detectable pueden enmascararse de forma artificial o natural. La recuperación correcta del antígeno desenmascara el epítopo o epítopos o antígenos y se revela por la tinción correcta de la entidad detectable en procedimientos posteriores.

El enmascarado o pérdida de antigenicidad (que puede afectar a uno o más epítopos) puede realizarse químicamente. Por ejemplo, la misma partícula compacta modificada con inmunoglobulina descrita anteriormente podría fijarse, por ejemplo, con formaldehído. En particular, la entidad detectable podría "enmascararse" por sobre-fijación con formaldehído, dando como resultado la pérdida de la mayor parte o todos los epítopos y una lenta difusión en el material de referencia.

También puede usarse paraformaldehído y cualquier otro agente de fijación conocido en la técnica. También pueden emplearse para este fin derivados con reactivos de acetilación, alquilación u otros reactivos de enmascarado. Se conocen numerosos métodos por la bibliografía de química orgánica, por ejemplo, enmascarado usando bases de Schiff, ésteres, éteres o derivados de hemiacetal.

El enmascarado también puede realizarse inmunológicamente, por ejemplo, por medio del uso de un anticuerpo de enmascarado adecuado u otro agente de unión. Por lo tanto, el material de referencia puede contener dianas enmascaradas química y/o inmunológicamente para el anticuerpo primario o el sistema de visualización secun-
dario.

El desenmascarado o desprotección puede conseguirse por recuperación de antígeno quimioselectiva o recuperación de antígeno aleatoria. También pueden emplearse dianas enmascaradas, que sólo se teñirán cuando se usen procedimientos de recuperación de antígeno excesivos.

Dicho patrón de referencia puede usarse como un indicador de la recuperación de antígeno correcta. El procedimiento de recuperación de antígeno correcta desenmascarará la inmunoglobulina y teñirá esta realización del patrón de referencia. Las partículas compactas con otras proteínas o péptidos podrían fijarse, por ejemplo, con formaldehído y de esta forma perder totalmente su antigenicidad. Dicho patrón de referencia será indicativo de una recuperación de antígeno correcta. El procedimiento de recuperación de antígeno correcta desenmascará la inmunoglobulina y teñirá esta realización del patrón de referencia.

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Patrón de Desparafinación

El patrón de referencia puede usarse como patrón de validación para desparafinación, es decir, para la etapa de eliminación de parafina.

Para este fin, se describe un método para evaluar la eficacia o éxito de un procedimiento de desparafinación, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un patrón de referencia como se describe en este documento, en el que una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado del procedimiento de desparafinación, donde la propiedad detectable de la entidad detectable comprende la presencia o cantidad de entidad detectable en el patrón de referencia después del procedimiento de desparafinación; (b) realizar el procedimiento de recuperación de antígeno sobre el patrón de referencia ; y (c) detectar un cambio en la propiedad detectable de la entidad
detectable.

En realizaciones muy preferidas, la entidad detectable del patrón de referencia es soluble en el medio de desparafinación, y al menos una parte, preferiblemente toda la entidad detectable se retira después de un procedimiento de desparafinación satisfactorio.

De esta manera, el material de referencia con dianas acopladas de forma no covalente o acopladas químicamente y dianas insolubles en agua detectadas, por ejemplo, por los sistemas de visualización secundarios puede indicar una desparafinación insuficiente si se tiñen.

Por ejemplo, en procedimientos de ICH tradicionales, la desparafinación se realiza lavando con tolueno o, por ejemplo, aceite de cítricos o de coco seguido de rehidratación en soluciones de alcohol/agua. De esta manera, un patrón de referencia usado para este fin puede comprender entidades detectables que se separan, retiran o disgregan fácilmente de sus posiciones dentro del medio de soporte. Por ejemplo, pueden acoplarse de forma suelta o acoplarse químicamente, por ejemplo, por medios no covalentes, a las partículas compactas en ciertas realizaciones. Para estos fines, es deseable que la entidad detectable sea insoluble en agua. Si la etapa de desparafinación se realiza de manera apropiada, entonces la entidad detectable no debe revelarse por reactivos tales como sistemas de visualización secundarios.

Además, a la parafina se le puede añadir un marcador tal como un colorante. Dicho colorante preferiblemente teñiría la identidad detectable o la partícula compacta sobre la que se acopla o se acopla químicamente la entidad detectable. Cuando ha tenido lugar una desparafinación insuficiente, la presencia del colorante será fácilmente visible al ojo humano (o se detectará fácilmente por maquinaria tal como sistemas de análisis de imágenes). Esto indicará que ha tenido lugar una desparafinación insuficiente.

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Patrón de Validación de Bloqueo

El patrón de referencia descrito en la presente memoria también puede emplearse para validar cualquier etapa de bloqueo, por ejemplo, el bloqueo de una actividad endógena, tal como la actividad endógena de biotina o la actividad enzimática.

De esta manera, por ejemplo, necesitan bloquearse biotina u otros haptenos, que se depositan de forma natural en tejidos, antes de que se pueda usar un sistema de visualización usando biotina u otros haptenos. Se debe a la presencia de la biotina endógena que se prefieran los sistemas de visualización secundarios (por ejemplo, cabra anti-ratón o cabra anti-conejo), ya que producen menos interferencias "de fondo". Para validar el bloqueo, el material de referencia puede contener biotina (u otros haptenos tales como Digoxigenina o DNP) usada en el sistema de visualización, que puede unirse a la partícula compacta cuando esté presente. La tinción positiva de este material de referencia indicará un bloqueo de biotina insuficiente - debido, por ejemplo, a reactivos que no reaccionan, una mezcla/difusión ineficaz en el portaobjetos o un tiempo de incubación demasiado corto.

El material de referencia también puede contener una enzima unida covalentemente usada en el sistema de tinción catalizado por enzimas como entidad detectable. Las enzimas típicas usadas son peroxidasa o fosfatasa. Por ejemplo, la entidad detectable puede comprender peroxidasa de rábano picante. Como alternativa, o además, pueden usarse partículas compactas modificadas, por ejemplo, con peroxidasa de rábano picante para validar un bloqueo de peróxido endógeno correcto y eficaz. Si el patrón de referencia permanece sin teñir después de la última etapa de cromógeno de peróxido, se determinará que el bloqueo es eficaz.

De esta manera, la tinción positiva de este material de referencia indicará un bloqueo enzimático latente insuficiente - debido, por ejemplo, a reactivos que no reaccionan, un bloqueo reversible, una mezcla/difusión ineficaz en el portaobjetos o un tiempo de incubación demasiado corto. El material podría combinarse con el material de referencia de recuperación de antígeno.

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Patrón de Validación de Lavado

El patrón de referencia también puede usarse para validar la eficacia de cualquier número de etapas de lavado, por ejemplo, lavado con tampón. El material de referencia podría incluir una entidad detectable que es insoluble en disolvente orgánico (por ejemplo, insoluble en tolueno), y parcialmente insoluble en agua para el sistema de visualización primario o secundario. La diana no debe unirse covalentemente en el material de referencia. Podría unirse por emparejamiento iónico o unión compleja con metales o simplemente por adsorción.

La diana podría tener un peso molecular grande para ensayar la capacidad de tampones de lavado de difundirse al interior del material y retirar la diana. El límite de peso molecular ("MwCO") del material de referencia debe corresponder con el Pm (peso molecular) de las dianas por, por ejemplo, selección del tamaño de poros o el grado de fijación.

La tinción positiva de este material de referencia indicará un lavado insuficiente - debido, por ejemplo, al número de etapas de lavado, al tipo de tampón usado, una mezcla ineficaz en el portaobjetos o una temperatura o tiempo de difusión demasiado bajos. Para este fin, la sección de tejido de muestra montada y el material de referencia preferiblemente deben tener el mismo espesor.

Como alternativa, la diana podría sustituirse con un colorante detectable de alto peso molecular atrapado en el material de referencia. El colorante se retirará por lavado eficaz - y solo está presente si el lavado es insuficiente o ineficaz. Como alternativa, podría usarse un patrón de referencia que comprende una partícula compacta (o entidad detectable) hecha de un material parcialmente soluble en agua. Si la partícula compacta o la entidad detectable desaparece, el lavado era eficaz.

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Patrón de Validación de Anticuerpo Primario

El patrón de referencia puede usarse como patrón para cualquier etapa de incubación, por ejemplo, la etapa de incubación con el anticuerpo primario correcto. Uno de los errores humanos más críticos en la tinción para IHC es la incubación con el anticuerpo erróneo.

El patrón de referencia para uso en la validación de la adición o incubación con el anticuerpo primario correcto, por lo tanto, podría comprender una entidad detectable que es capaz de unirse (preferiblemente por medio de una unión específica) a un compañero de unión. El compañero de unión se añadiría a la solución de anticuerpo primario como un "marcador", que se uniría o acoplaría específicamente a la entidad detectable y, por lo tanto, indicaría que se usó el anticuerpo primario correcto. Se apreciará que el anticuerpo primario puede venderse en una forma que comprende el "marcador".

Como ejemplo particular, la entidad detectable puede comprender o consistir en estreptavidina y el "marcador" comprender o consistir en biotina. Por ejemplo, el anticuerpo primario puede suplementarse con un anticuerpo de ratón irrelevante biotinilado, que específicamente se uniría a una entidad detectable en el patrón de referencia, por ejemplo, una entidad detectable que comprende o consiste en biotina. Cuando se toman secciones o cortes del patrón de referencia (como se prefiere), la mancha de referencia se teñirá de forma positiva por el sistema de visualización si se usó el anticuerpo correcto. Se apreciará que el propio anticuerpo primario podría modificarse con biotina y funcionar como "marcador" de forma que no sea estrictamente necesario un "marcador" adicional.

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Patrón de Validación de Anticuerpo Secundario

Para uso en la validación de la adición de un anticuerpo secundario, el material de referencia podría contener anticuerpos de ratón o conejo unidos covalentemente o fracciones de los mismos en diversas densidades. La tinción positiva y graduada de este material de referencia validará la funcionalidad del sistema de visualización secundario. El mismo material de referencia podría combinarse con el material de referencia útil para validar la etapa de recuperación de antígeno.

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Patrón de Calibración

Aparte del análisis de los diversos materiales de referencia para la tinción primaria o secundaria graduada, el sistema de referencia podría consistir en o contener colores permanentes y formas físicas adecuadas para calibrar cámaras, dispositivos ópticos y algoritmos de software.

Por lo tanto, en otro aspecto, el patrón de referencia puede servir como calibrador para cualquier equipo, por ejemplo, un equipo de procesamiento de imágenes digitales o cualquier sistema de análisis de imágenes automático. Esto puede conseguirse, por ejemplo, definiendo un color particular, intensidad o un número de acontecimientos particular. Esto es particularmente útil en escáneres automáticos y microscopios. Por medio de la combinación de un material teñido con una tinción inmunológica o especial, puede facilitarse la orientación y navegación en el portaobjetos de microscopio.

Dicho material de referencia podría ayudar a definir tamaños, colores, espectros de colores, límites entre áreas teñidas, nivel de tinción con colorante de contraste e interferencias de fondo.

Por lo anterior se apreciará que es posible construir un patrón de referencia que pueda usarse para validar más de una de las etapas procedurales. Por ejemplo, se describen patrones de referencia que son capaces de validar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más etapas procedurales en cualquier método. Estos patrones de referencia pueden comprender de forma conveniente una pluralidad de (o más de una) entidades detectables, que pueden ser iguales o diferentes, como se ha descrito anteriormente. La disposición de las entidades detectables en el patrón de referencia preferiblemente es tal que el corte o sección resultante tomada del patrón de referencia comprenda más de un "punto" de área de referencia, dispuesta convenientemente en una matriz.

Dichos patrones de referencia pueden dar lugar a cortes o secciones que comprenden, por ejemplo, una "matriz de puntos" de 9 materiales de referencia diferentes. Por ejemplo, pueden comprender puntos con dianas para el anticuerpo primario en diferente densidad - proporcionando niveles de tinción graduados; puntos con dianas fijadas ligeramente y graduadas para el sistema de visualización secundario - validación general de la etapa de recuperación de antígeno; puntos con dianas fijadas ligeramente y graduadas para el anticuerpo primario - validación de la etapa de recuperación de antígeno diana específico o recuperación de antígeno "umbral" necesaria para la tinción; puntos con dianas "sobre-fijadas" para el sistema de visualización secundario - validación general de la etapa de recuperación de antígeno; puntos con dianas para el sistema de visualización secundario (por ejemplo Ab de ratón o conejo) en diferente densidad - validación general del sistema de visualización secundario; puntos con actividad peroxidasa y/o fosfatasa - validación de la etapa de bloqueo de enzima endógena; puntos con biotina unida - validación de la etapa de bloqueo de biotina endógena (si, por ejemplo, se usan sistemas de visualización de tipo LSAB); puntos con dianas unidas de forma no covalente y de peso molecular algo elevado para el sistema de visualización secundario - validación general de las etapas de lavado; puntos con una forma, tamaño y color distintos, homogéneos y permanentes - calibración del sistema de análisis de imágenes automático.

En realizaciones muy preferidas, el patrón de referencia comprende una matriz de "puntos de referencia" en el mismo portaobjetos que el tejido de muestra del paciente. En dicha realización, es posible realizar la validación automáticamente por medio del software de análisis de imágenes.

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Patrones de diagnóstico

En realizaciones muy preferidas, el patrón de referencia es o puede usarse como patrón de diagnóstico. Por esto se entiende que la entidad detectable se detecta para revelar un estado de una célula, preferiblemente una situación fisiológica o médica de la célula. Sin embargo, se apreciará que en algunos o en muchos casos, la simple detección de una propiedad de la entidad detectable puede ser insuficiente por sí misma para proporcionar un diagnóstico médico. Por lo tanto, se apreciará que en algunos casos puede ser deseable realizar otros ensayos para establecer un diagnóstico.

En realizaciones en las que el patrón de referencia se emplea como patrón de diagnóstico, la entidad detectable convenientemente comprende un indicador de un estado de una célula tal como un indicador del estado de salud o de enfermedad de la célula, por ejemplo, un marcador de enfermedad. De esta manera, una entidad detectable puede indicar, por medio de su presencia o cantidad en una muestra relevante, el estado del organismo (tal como su estado de salud o su estado de enfermedad) del que se tomó la muestra. Más adelante se describen con más detalle marcadores de enfermedades, en particular, marcadores de cáncer.

Preferiblemente, el patrón de referencia es tal que una sección transversal del mismo incluye un área definida que comprende una cantidad de entidad detectable. Esto se muestra en la ilustración de las Figuras 4B, 5A, 5B, 8F, 9B y 10. La cantidad de entidad detectable en el patrón de referencia o en la sección transversal puede compararse con la de la muestra para establecer si esta última está presente en cantidades idénticas o similares, o en cantidades menores, o en cantidades mayores que en el patrón. Sin embargo, se apreciará que aunque el patrón de referencia descrito en la presente memoria es más útil para detectar la presencia y/o cantidad de una entidad detectable en una muestra, puede usarse de forma más sencilla para indicar si una entidad detectable en una muestra es igual o diferente de la entidad detectable del patrón de referencia.

La cantidad o cuantía de entidad detectable en el patrón de referencia o sección transversal preferiblemente es una cantidad conocida o predeterminada. La cantidad puede variarse controlando la cantidad que se acopla o se acopla químicamente o queda retenida en la partícula compacta, como se describe con más detalle más adelante. Cuando se toman cortes o secciones del patrón de referencia, también puede conseguirse variación en cantidad cambiando el espesor (y por lo tanto la cantidad de entidad detectable capturada) de la sección o corte.

En realizaciones muy preferidas, la cantidad de una entidad detectable en el patrón de referencia comprende una cantidad relevante desde el punto de vista del diagnóstico.

A diferencia de la técnica anterior, en el patrón de referencia descrito pueden incorporarse cantidades precisas y conocidas de entidad detectable. Además, pueden solucionarse las variaciones entre una muestra y otra que se producían en la técnica anterior. El resultado es un sistema de graduación más preciso.

En algunas realizaciones, están presentes diferentes cantidades de la entidad detectable en el patrón de referencia. En una realización preferida, el patrón de referencia comprende dos o más cantidades de la misma entidad detectable, en partículas compactas separadas. Preferiblemente se proporciona un intervalo de cantidades de cuantías crecientes de la entidad detectable, preferiblemente en un intervalo aritmético o más preferiblemente un intervalo logarítmico. Preferiblemente, el intervalo comprende una cantidad relevante desde el punto de vista del diagnostico o clínico de la entidad detectable, es decir, una cantidad de entidad detectable que si está presente en la muestra a aproximadamente o por encima de esa cantidad, indica que la muestra contiene o es probable que contenga células o tejidos que están enfermos o son propensos a padecer una enfermedad.

La comparación de las cantidades presentes en una célula o tejido u otra muestra biológica con el patrón de referencia de acuerdo con esta realización proporcionará una indicación de si la muestra particular es "positiva" o "negativa" para la entidad detectable particular. Cuando la entidad detectable comprende un antígeno de enfermedad, tal como un antígeno de cáncer (o expresa ADN/ARN, incluyendo ARN mensajero, procedente de un gen de cáncer) su presencia o cantidad puede usarse como diagnóstico para una enfermedad relevante. Por lo tanto, se proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad en un individuo, que comprende comparar la presencia o cantidad (o ambas cosas) de una entidad detectable en una muestra biológica del individuo con la cantidad en un patrón de referencia como se describe en la presente memoria. Preferiblemente, la comparación se realiza frente a una cantidad clínicamente relevante de entidad detectable en el patrón de referencia (es decir, una cantidad en una muestra en o por encima de la cual se indica, se sospecha o se diagnostica la presencia de una enfermedad).

En una realización particular, la entidad detectable comprende antígeno HER2, la célula o tejido comprende tejido de mama y la enfermedad que se diagnostica, o de la que se indica la presencia, comprende cáncer de mama. La entidad detectable también puede comprender otros antígenos en lugar de o además de HER2, preferiblemente seleccionados entre el grupo consistente en: receptor de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR), p16, Ki-67 o receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (véase también la sección "Entidad Detectable"). Pueden usarse mezclas de dos cualesquiera o más de éstos. La entidad detectable puede comprender un ácido nucleico que codifica cualquiera de los anteriores, o cualquier entidad detectable como se especifica en la sección "Entidad Detectable"; en particular, dichos patrones de referencia que comprenden ácidos nucleicos son útiles para estandarizar la hibridación in situ. En particular, el patrón de referencia puede comprender un marcador de cáncer de ácido nucleico, tal como marcadores de cáncer de ADN/ARN (por ejemplo, un marcador de ARNm de cáncer).

Preferiblemente, el patrón de referencia comprende, además de una cantidad relevante desde el punto de vista clínico o de diagnóstico de entidad detectable, un control negativo, es decir, un área o volumen o trayectoria definida que no comprende ninguna entidad detectable, o una entidad detectable en una cantidad indetectable, por ejemplo en una forma compacta o alargada.

La enfermedad diagnosticada puede tratarse opcionalmente por medio de la administración de un agente terapéutico apropiado. Dicho agente o fármaco puede ser uno que se sepa que es eficaz para tratar dicha enfermedad. En particular, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo contra la entidad detectable. Dicho anticuerpo puede comprender el mismo anticuerpo que se usó para teñir y detectar la entidad detectable en el patrón de referencia y/o la muestra biológica, o puede ser una variante del mismo, tal como un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo monocatenario tal como un ScFv.

En particular, la entidad detectable puede comprender HER2, el agente de unión puede comprender cualquier anticuerpo anti-HER2 y el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo anti-HER2 humanizado tal como Herceptin (Trastuzumab, Genentech). La entidad detectable puede comprender un ácido nucleico de HER2, tal como ARN de HER2, ARNm de HER2 o un ADN de HER2. La entidad detectable puede comprender cualquier molécula tal como un ácido nucleico capaz de unirse al ácido nucleico de HER2 y, en particular, puede comprender una secuencia complementaria a al menos una parte del ácido nucleico de HER2.

En varias publicaciones se describen HER2 y Herceptina, incluyendo Pegram M, Hsu S, Lewis G, et al. Inhibitory effects of combinations of HER2/neu antibody and chemotherapeutic agents udsed for treatment of human breast cancers. Oncogene. 1999; 18: 2241-2251; Argiris A, DiGiovanna M. Synergistic interactions between tamoxifen and Herceptin. Proc Am Assoc Cancer Res. 2000; 41: 718. Abstract 4565; Pietras RJ, Fendly BM, Chazin VR, et al. Antibody to HER2/neu receptor blocks DNA repair after cisplatin in human breast and ovarian cancer cells. Oncogene. 1994; 9: 1829-1838; Baselga J, Norton L, Albanell J, et al. Recombinant humanized anti-HER2 antibody (Herceptinú) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res. 1998; 58: 2825-2831; Sliwkowski MX, Lofgren JA, Lewis GD, et al. Nonclinical studies addressing the mechanism of action of trastuzumab (Herceptin). Semin Oncol. 1999; 26 (suppl 12): 60-70; Lewis GD, Figari I, Fendly B, et al. Differential responses of human tumor celI lines to anti-p185^{HER2} monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 1993; 37: 255-263 and Pegram MD, Baly D, Wirth C, et al. Antibody dependent celI-mediated cytotoxicity in breast cancer patients in Phase III clinical trials of a humanized anti-HER2 antibody. Proc Am Assoc Cancer Res. 1997; 38: 602. Abstract 4044.

En otras realizaciones, en el patrón de referencia está presente más de una entidad detectable. En particular, se prevé una pluralidad de tipos diferentes de entidades detectables en un solo patrón de referencia. Cuando en el patrón de referencia está presente más de una entidad detectable, cada una de éstas puede estar en o sobre o acoplada o acoplada químicamente a la misma partícula compacta, o pueden estar presentes más de una particular compacta. En el último caso, la o cada partícula compacta puede comprender una o más entidades detectables diferentes. Las entidades detectables pueden estar presentes en la misma cantidad o en diferentes cantidades, en la o cada partícula compacta.

Por lo tanto, dos o más entidades detectables diferentes pueden soportarse en el medio de incrustación, estando al menos una de ellas acoplada o acoplada químicamente a una partícula compacta. Preferiblemente, todas las diferentes entidades detectables se acoplan o se acoplan químicamente a partículas compactas. El patrón de referencia puede comprender una sola o más de una cantidad de una primera entidad detectable y una sola o más de una cantidad de una segunda entidad detectable. En el patrón de referencia pueden estar presentes múltiples entidades detectables en las mismas o diferentes cantidades. Cuando está presente más de una entidad detectable, el medio de referencia preferiblemente comprende al menos una entidad detectable en una cantidad o cuantía que es significativa desde el punto de vista del diagnóstico o clínico.

Por lo tanto, el patrón de referencia puede comprender una cantidad de una primera entidad detectable acoplada o acoplada químicamente a una partícula compacta. El patrón de referencia puede comprender además una cantidad de una segunda entidad detectable unida o acoplada a la misma partícula compacta, o en una segunda partícula compacta. Además, el patrón de referencia puede comprender una segunda cantidad diferente de la o cada entidad detectable unida o acoplada a la partícula compacta, o en una segunda partícula compacta o partícula compacta adicional. Las múltiples entidades detectables iguales o diferentes y/o cantidades de las mismas pueden mezclarse o separarse en el espacio y/o el tiempo.

Por ejemplo, las entidades detectables pueden comprender HER2, junto con otro antígeno de cáncer tal como ras, o en particular un antígeno de cáncer de mama tal como una proteína BRCA1 o BRCA2. Como alternativa o además, el patrón de referencia comprende una cantidad de proteína supresora de tumores tal como proteína de retinoblastoma (Rb). Las entidades detectables también pueden comprender ácidos nucleicos tales como ácidos nucleicos de HER2 y otros ácidos nucleicos de antígenos de cáncer. Las entidades detectables pueden comprender una o más entidades detectables de polipéptidos, junto con una o más entidades detectables de ácido nucleico.

Estas realizaciones de patrones de referencia que comprenden una pluralidad de entidades detectables son útiles en aplicaciones en las que se realiza el ensayo de una muestra usando más de un agente de unión. De esta manera, se prevé el uso de dichos patrones de referencia en el ensayo usando, por ejemplo, "bancos" o "paneles" de anticuerpos/sondas. Estos ensayos pueden usarse para detectar la presencia o ausencia, o los niveles relativos o absolutos de diferentes entidades detectables en una muestra, siendo cada uno de ellos relevante desde el punto de vista del diagnóstico. Esta información relativa o comparativa típicamente es más útil que un solo ensayo de presencia/ausencia. De esta manera, pueden usarse múltiples ensayos para generar un "perfil" del paciente o individuo en cuestión. Los perfiles generados a partir de individuos que padecen (o que se sospecha que padecen) una enfermedad o afección pueden compararse con perfiles correspondientes de individuos "normales" o no afectados. Los perfiles, o la información generada por la comparación de los perfiles, puede usarse para diagnosticar (o ayudar en el diagnóstico de) una enfermedad o afección en ese individuo para seleccionar el mejor tratamiento posible ("terapia individualizada").

En realizaciones en las que está presente más de una partícula compacta, puede ser ventajoso disponer las partículas compactas en un haz o en más de un haz. Las partículas compactas pueden disponerse de tal forma que sea fácil encontrar los puntos y agrupamientos de referencia diferentes. Por ejemplo, un patrón asimétrico de haces de partículas compactas puede ayudar al usuario a orientar el portaobjetos de forma correcta.

Ni que decir tiene que cuando está presente más de una entidad detectable en el patrón de referencia, las dos o más entidades detectables pueden estar presentes en diferentes partículas compactas. Como alternativa, más de una entidad detectable puede estar presente en una sola partícula compacta. Por ejemplo, más de una entidad detectable puede conjugarse o acoplarse o acoplarse químicamente a una partícula compacta. Pueden usarse múltiples partículas compactas, comprendiendo cada una, una sola, dos o más entidades detectables.

La o cada entidad detectable está presente en una partícula compacta en el patrón de referencia; esto puede conseguirse por diversos medios como se describe con detalle más adelante.

El patrón de referencia, o los cortes o secciones del mismo pueden envasarse en un kit. El kit puede comprender un agente de unión, tal como un anticuerpo, que es capaz de unirse de forma específica a la entidad detectable. El kit puede comprender un bloque de microtomo con el patrón de referencia, cortes o secciones montadas sobre el mismo. El kit puede comprender además otros reactivos tales como reactivos de detección, lavado o procesamiento, así como instrucciones para el uso. El kit puede comprender además instrucciones para el uso u otros indicios, por ejemplo, coadyuvantes de puntuación tales como tarjetas o fotografías de un tejido enfermo y/o normal.

El kit también puede comprender un agente terapéutico que sea capaz de tratar o al menos aliviar al menos uno de los síntomas de una enfermedad. También se proporciona una combinación de un patrón de referencia como se describe en este documento, o una sección o corte del mismo, junto con un agente terapéutico.

En realizaciones particulares, la enfermedad es una cuya presencia en un individuo se ha indicado o se sospecha, donde una muestra biológica comprende una cantidad relevante desde el punto de vista del diagnóstico de la entidad detectable. En particular, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo contra la entidad detectable, o un ácido nucleico capaz de unirse a la entidad detectable, o cualquier otro agente terapéutico que se sepa que es eficaz para tratar o prevenir la enfermedad. Por ejemplo, un kit o combinación para detectar el cáncer de mama puede comprender un patrón de referencia en el que la entidad detectable comprende el antígeno HER2 o un ácido nucleico de HER2. El kit puede comprender además anticuerpo anti-HER2 para detectar ese antígeno, y también puede comprender cualquier fármaco para el cáncer de mama, por ejemplo, Herceptin (un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige a la proteína HER2 en pacientes con cáncer de mama metastásico). Otras realizaciones del kit incluyen cualquier antígeno seleccionado entre el grupo consistente en: receptor de estrógenos (ER), PR, p16, Ki-67 o receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (véase también la sección "Entidad Detectable").

En realizaciones preferidas, la entidad detectable es de naturaleza molecular (véase la descripción proporcionada más adelante) y el patrón de referencia, por lo tanto, carece sustancialmente de material celular. Sin embargo, en algunas realizaciones, pueden incorporarse en el patrón de referencia componentes celulares, por ejemplo partes de una célula (por ejemplo, cualquier compartimento subcelular u orgánulo tal como el núcleo, mitocondrias, cloroplastos, vacuolas, etc.) o las propias células enteras.

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Patrones de citometría de flujo

Los sistemas de referencia descritos en la presente memoria pueden usarse, por ejemplo, como patrón de referencia para aplicaciones tales como un Clasificador de células Activadas por Fluorescencia (FACS). En estas aplicaciones, en las que el patrón de referencia puede comprender preferiblemente partículas compactas celulares o biológicas, no es necesario que esté presente el medio de incrustación. Es decir, cuando se usan células o componentes celulares como partículas compactas para el acoplamiento químico de una entidad detectable, las propias células o componentes celulares pueden considerarse patrones de referencia.

La citometría de flujo es un sistema para medir células, perlas o partículas según se mueven en una corriente de líquido, en la denominada celda de flujo, a través de un haz láser o de luz que pasa por un área de detección. Se mide la dispersión relativa de la luz y la fluorescencia discriminada por color de las partículas. En el citómetro de flujo pueden identificarse diferentes células por su distinta morfología celular, tal como por su densidad, forma y tamaño. Por los datos obtenidos por el citómetro de flujo no es visible la morfología de los tejidos como tales, ya que las células se rompen.

Un citómetro de flujo consiste, en general, en una fuente de luz, una celda de flujo, dispositivos ópticos para enfocar luz de diferentes colores sobre un detector, un amplificador de señal y un procesador y ordenador para registrar y analizar los datos. En los citómetros de flujo modernos se usan láseres como fuente de luz preferida. El láser más común usado es el láser de iones de argón. Éste produce una línea principal a 488 nm que proporciona una fuente de luz azul para la excitación de, por ejemplo, fluoresceína, ficoeritrina y conjugados en tándem y para el yoduro de propidio usado en mediciones de ADN. El la celda de flujo, las células se alinean por enfoque hidrodinámico, de forma que pasan a través de los haces de láser una cada vez.

La dispersión de luz se utiliza para identificar la población de células o partículas de interés, mientras que la medición de la intensidad de fluorescencia proporciona una información específica sobre las células individuales. Las células individuales mantenidas en la corriente de fluido se pasan a través de uno o más haces de láser. Las células dispersan la luz láser, que al mismo tiempo hace que los colorantes fluorescentes emitan luz a diversas frecuencias. Los tubos fotomultiplicadores (PMT) convierten la luz en señales eléctricas y se recogen los datos de las células.

Lo que hace de la citometría de flujo una técnica tan poderosa es su capacidad de medir varios parámetros en muchos miles de células individuales en un periodo de tiempo muy corto, midiendo su fluorescencia y la manera en la que dispersan la luz. Como ejemplo, usando luz azul para la excitación, es posible medir la fluorescencia roja, verde y naranja y la cantidad de luz dispersada, tanto frontal como en ángulo recto con respecto al haz, en cada célula de una población de miles.

Muchos instrumentos pueden medir al menos cinco parámetros diferentes. Como todos los parámetros no pueden combinarse para presentarse simultáneamente de una forma correlacionada, se emplea un sistema denominado gating (delimitación de ventanas de análisis). Se definen regiones de interés o "Gates" ("ventanas de análisis"), que permiten la selección de poblaciones de células específicas para la presentación de parámetros adicionales. Puede usarse un citómetro de flujo para analizar subpoblaciones de células, que se han marcado con fluorescencia, con velocidad y precisión. También es posible la clasificación basándose en otras características, por ejemplo el tamaño.

Los instrumentos de citometría de flujo generan simultáneamente tres tipos de datos: 1) la dispersión frontal (FSc) proporciona el tamaño aproximado de la célula o partícula, 2) la dispersión lateral u ortogonal (SSc) proporciona la complejidad o granularidad de la célula o partícula y 3) se usa marcaje fluorescente para investigar, por ejemplo, la estructura y la función de la célula. Las dispersiones frontal y lateral se usan para la identificación preliminar de las células. En una muestra de sangre periférica, por ejemplo, pueden definirse poblaciones de linfocitos, monocitos y granulocitos basándose en la dispersión frontal y lateral. Se usa dispersión frontal y lateral para excluir los desechos y las células muertas. Pueden identificarse partículas, por ejemplo, por su tamaño y/o su fluorescencia.

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Las poblaciones de células o partículas pueden representarse en histogramas de un solo parámetro o de dos parámetros. La dispersión de luz y las señales de fluorescencia pueden analizarse después de una amplificación lineal o logarítmica. Una vez que se ha identificado la población de células o partículas a analizar, se determina la fluorescencia asociada con anticuerpos o colorantes unidos después de haber establecido la fluorescencia de fondo.

Algunos citómetros de flujo pueden clasificar físicamente células o partículas en poblaciones específicas. Esto se realiza más comúnmente por deflexión electrostática de gotas cargadas que contienen una célula. La celda de flujo se hace vibrar y hace que la corriente de líquido se rompa en pequeñas gotas según deja la boquilla de salida. En el momento en el que una célula o partícula de interés está dentro de la gota que se está formando en ese momento, se carga la celda de flujo - cargándose de esta manera la gota. La corriente de gotas después pasa a través de un par de placas cargadas eléctricamente, y las gotas que están cargadas (que contienen las células o partículas de interés) se desvían por deflexión a un recipiente de recogida.

El campo eléctrico creado entre las placas puede dirigir a las células o partículas hacia uno de varios receptáculos de recogida especificados por el usuario. Las gotas no cargadas fluyen hacia el interior de un recipiente de residuos. El análisis de concentraciones de células o subseries de células, a menudo denominado "recuento absoluto", puede tener un interés adicional para el diagnóstico médico o para el control del estado de las células en cultivos celulares u otros procesos biotecnológicos.

El citómetro de flujo puede explorar rápidamente grandes números de células por encima de la capacidad de los métodos patológicos o citológicos tradicionales. La información obtenida ayuda en el diagnóstico, clasificación y pronóstico de una diversidad de enfermedades. Las aplicaciones a las que se puede aplicar la citometría de flujo han aumentado rápidamente desde la clasificación de células a la medición de antígenos de la superficie celular y análisis de ADN para ayudar a la interpretación de trastornos malignos.

Los usos comunes de la citometría de flujo en el laboratorio clínico rutinario incluyen inmunofenotipificación de neoplasmas hematopoyéticos, evaluación del estado inmune, especialmente cuantificación de células T CD4+ en pacientes positivos para el VIH y análisis del ciclo celular del ADN de tumores sólidos. Diferentes poblaciones de células que componen el sistema hematopoyético expresan antígenos de la superficie celular claramente diferentes en diversas fases de maduración. Por medio de la detección y medición de estos antígenos expresados, la citometría de flujo puede ayudar en la clasificación del linaje celular de leucemias y linfomas.

Aunque no se pretende que sea una modalidad de diagnóstico independiente, la citometría de flujo a menudo puede subclasificar malignidades hematopoyéticas más allá de las capacidades de las técnicas morfológicas y citoquímicas tradicionales.

Los usos rutinarios más comunes de la citometría de flujo han sido la medición de antígenos de la superficie (marcadores) por medio del marcaje inmunofluorescente usando anticuerpos monoclonales. Los marcadores comúnmente son células B totales, células T totales y subseries de células T. A los marcadores para las células T totales, células T auxiliares y células T supresoras se les han asignado las categorías de grupos de diferenciación (CD) de CD3, CD4 y CD8 respectivamente. Este espectro de marcadores, de los que hay más de 45 en total, se usan para la clasificación clínica de estados de inmunodeficiencia, leucemias linfoides, enfermedades autoinmunes y para el control de su respuesta a la terapia.

Por ejemplo, las mediciones de CD4 y CD8 son especialmente útiles para controlar la progresión del SIDA, ya que las células CD4+ disminuyen por la infección por VIH, mientras que las células CD8 persisten. El número absoluto de células CD4+ también es un marcador de la progresión de la infección por VIH a un SIDA más manifiesto. La relación de CD4/CD8 también puede usarse para evaluar el éxito de una terapia inmunosupresora con ciclosporina A en pacientes de trasplantes.

Para la evaluación del estado inmune, típicamente se identifican subpoblaciones de linfocitos y se cuantifican por medio del citómetro de flujo utilizando anticuerpos monoclonales contra diversos antígenos de la superficie celular. Los pacientes con enfermedad de inmunodeficiencia adquirida o congénita y los pacientes con una terapia con fármacos inmunosupresores presentan alteraciones características en las poblaciones de linfocitos.

El procedimiento de tinción directa típico para la citometría de flujo puede incluir una o varias de las siguientes etapas además de las etapas de lavado y de mezcla: fijación de las células con, por ejemplo, formaldehído tamponado, permeabilización, adición de un reactivo específico diana marcado con fluorescencia, incubación, centrifugación, aspiración del sobrenadante del sedimento celular, resuspensión, dilución y análisis en el citómetro de flujo.

Las ventajas de la citometría de flujo son numerosas; sin embargo, tiene varios inconvenientes, siendo el principal el hecho de que los datos obtenidos no sean absolutamente cuantitativos, ya que la intensidad de la señal para cada color fluorescente depende, por ejemplo, de los parámetros de los PMT, de las condiciones exactas del láser y del algoritmo de compensación. Otro inconveniente es que el volumen de la suspensión celular analizada no se mide directamente. Por lo tanto, no se está midiendo directamente la concentración absoluta - es decir, las células por volumen.

La concentración absoluta de células en una muestra puede medirse, por ejemplo, añadiendo un volumen conocido de una solución de perlas de polímero marcadas con fluorescencia a la muestra. La concentración o número de perlas de polímero se ha establecido por otro método. Por medio del recuento del número de perlas de polímero y las células en el citómetro de flujo, puede calcularse la concentración absoluta de células - o "recuento absoluto" como se denomina con frecuencia. Un ejemplo conocido de esta técnica es el sistema TrueCount (BD Bioscience).

La luz emitida por los colorantes fluorescentes se detecta en uno o varios de los canales, los canales FL1, FL2, FL3, etc. Como algunos de los colorantes fluorescentes tienen espectros de emisión, que pueden detectarse en varios canales, a menudo es necesario corregir los datos obtenidos compensando el excedente de señal en varios canales.

La compensación se ha realizado en la técnica anterior usando perlas hechas de un material polimérico sólido, a menudo poliestireno. En las perlas de poliestireno se incrustan los colorantes en cuestión o las perlas se funcionalizan en la superficie con el colorante. Después puede medirse el excedente entre los canales del detector y el algoritmo de compensación puede ajustarse a los parámetros del presente instrumento.

La citometría de flujo se ha vuelto indispensable tanto en un laboratorio rutinario como en un laboratorio de investigación. Según se encuentren nuevos colorantes fluorescentes y se produzca anticuerpos monoclonales para cada vez más antígenos, continuarán aumentando las aplicaciones a las que puede aplicarse la citometría de flujo.

Como se indica por las descripciones anteriores, la técnica es compleja y utiliza moléculas con altas afinidades para tinciones específicas. No se ha utilizado completamente todo el potencial del análisis por un citómetro de flujo, ya que la comparación de los resultados de diagnóstico puede ser difícil de interpretar entre un laboratorio y otro debido a la falta de estandarización y de referencias. De esta manera, se está persiguiendo continuamente la mejora de los medios existentes, en particular con respecto al material de referencia interno.

El patrón de referencia descrito en este documento puede usarse para calibrar el nivel de tinción para una diana de diagnóstico o relación de dianas de diagnóstico particular. El uso de un control interno refleja y explica las variaciones en los protocolos de pre-tratamiento y tinción.

Aparte de la capacidad de verificar y calibrar los procedimientos de tinción, el nivel de tinción y la calidad del reactivo de tinción como, por ejemplo, en las aplicaciones basadas en portaobjetos tales como IHC y citología, el patrón de referencia tiene varias propiedades ventajosas específicas para uso en aplicaciones de un citómetro de flujo. Éstas se describen con detalle más adelante:

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Aplicaciones Dobles

El mismo patrón de referencia puede teñirse y medirse en técnicas basadas en portaobjetos y en un citómetro de flujo. Los datos de dos técnicas independientes pueden combinarse para reforzar adicionalmente la validez del análisis y calibrar las diferentes técnicas en una relación entre sí.

Debe entenderse que el patrón de referencia puede adoptar la forma de una célula, y es capaz de imitar una cualquiera o más propiedades de la célula, tales como la forma, tamaño, capacidad de dispersión etc. Por lo tanto, las imperfecciones técnicas de usar perlas poliméricas podrían evitarse usando el patrón de referencia y usando un soporte celular como se describe en la presente memoria.

A continuación se describen algunas realizaciones preferidas adicionales.

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Compensación

El patrón de referencia puede usarse como un patrón de compensación. Los colorantes incrustados dentro de perlas sólidas tales como, por ejemplo, partículas de látex de poliestireno tienen una espectro fluorescente distorsionado en comparación con los colorantes usados como marcadores, por ejemplo, sobre anticuerpos en solución durante la tinción de muestras. Además, los colorantes fluorescentes tales como, por ejemplo, RPE, APC o sus conjugados en tándem acoplados o unidos como marcadores a la superficie de polímeros u otras partículas sólidas pueden tener espectros distorsionados debido a interacciones de superficie. Durante el posterior análisis de la muestra, por lo tanto, la situación de compensación puede no representar el verdadero excedente de señales entre canales.

Por medio del uso de materiales celulares como base del patrón de referencia, es decir, empleando una entidad detectable acoplada químicamente un soporte que es de origen biológico o celular, se pueden usar colorantes en los medios correctos y en condiciones casi idénticas al análisis real.

Es de un interés particular la posibilidad de usar patrones de compensación marcados con el mismo lote o remesa de reactivo fluorescente usado en el análisis posterior de la muestra. Por lo tanto, los parámetros de compensación pueden calcularse basándose en referencias de compensación de colorante con las mismas propiedades que durante el análisis.

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Clasificación

El patrón de referencia puede usarse como patrón de clasificación. Por lo tanto, el patrón de referencia puede usarse para verificar y controlar la calidad de clasificación del citómetro de flujo. Como el material de referencia puede ser parecido a una célula y puede teñirse, por ejemplo, como muestras verdaderas del paciente, la calidad de la clasificación puede compararse de un ensayo a otro y de un laboratorio a otro.

Esto tendrá una importancia especial para la clasificación clínica, por ejemplo, la clasificación de células T específicas en las que la calidad de la clasificación tiene una tremenda importancia y necesita documentarse en relación con un patrón. Además, la clasificación de células en baja concentración necesitará una optimización y validación muy precisa usando patrones de células.

Las perlas sólidas tales como, por ejemplo, partículas de látex de poliestireno tienen un inconveniente en comparación con los patrones de referencia descritos en la presente memoria, ya que es posible que no representen verdaderamente, por ejemplo, a las células del paciente durante la optimización y validación de los experimentos de clasificación.

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Enumeración o Recuento Absoluto

El patrón de referencia puede usarse para la calibración del recuento absoluto de una manera similar al uso de perlas sólidas. Por lo tanto, puede usarse como patrón de enumeración o como un patrón de recuento absoluto.

El recuento absoluto tiene una importancia especial para el análisis en relación con los trasplantes (recuentos de CD34) y para el análisis de acontecimientos raros, tales como el recuento de plaquetas o la enfermedad mínima residual. Por medio de la combinación, por ejemplo, de dianas marcadas con fluorescencia o dianas unidas al patrón de referencia, será posible, por ejemplo, marcar inmunológicamente la diana en caso de citometría de flujo.

Midiendo adicionalmente el número o la concentración de células de referencia por otros métodos, el mismo patrón de referencia puede calibrar el análisis de citometría de flujo con respecto a, por ejemplo, el recuento, el nivel de tinción y la compensación.

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Forma del patrón de referencia

El patrón de referencia descrito en la presente memoria puede tomar cualquier forma adecuada.

El patrón de referencia puede tener una forma amorfa, por ejemplo, una forma amorfa alargada, pero preferiblemente tiene una forma definida. Generalmente puede adoptar la forma de una esfera, pero preferiblemente el patrón de referencia es de forma poliédrica.

Más preferiblemente, el patrón de referencia sustancialmente tiene una forma seleccionada entre el grupo consistente en: un poliedro regular, un prisma, un prisma recto, un prisma recto regular, un cuboide, un caja rectangular y un cubo. El patrón de referencia preferiblemente tiene una forma alargada, de tal forma que posee un eje largo.

En realizaciones muy preferidas, el patrón de referencia tiene una forma cuboide, un cuboide es el término que se usa en la presente memoria para hacer referencia a una caja cerrada compuesta de tres pares de caras rectangulares opuestas entre sí y unidas por ángulos rectos entre sí, también conocida como paralelepípedo rectangular. El cuboide también es un prisma recto, un caso especial de paralelepípedo, y corresponde a lo que se conoce de forma coloquial como "caja" (rectangular).

Cuando se toman secciones o cortes del patrón de referencia, preferiblemente éstas se toman en planos que están sustancialmente formando ángulos rectos con respecto a la orientación del patrón de referencia, es decir, longitudinalmente. Como alternativa, o en combinación, las secciones o cortes pueden tomarse transversalmente con respecto a la orientación del patrón de referencia.

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Medio de incrustación

El patrón de referencia comprende un medio un incrustación en el que se soporta la partícula compacta. Como "medio de incrustación" puede usarse cualquier material o medio que sea capaz de incrustar y soportar la entidad detectable.

Preferiblemente, dicho medio de incrustación puede soportar la entidad detectable de forma que retenga sustancialmente su forma, posición o configuración. En realizaciones preferidas, el medio de incrustación soporta la entidad detectable en una forma compacta. En realizaciones preferidas, la entidad detectable se mantiene en posición dentro del medio de incrustación, es decir, no mueve o cambia la posición. El medio de incrustación puede comprender un material rígido o semi-rígido tal como un sólido, semisólido o un gel. En realizaciones muy preferidas, el medio de incrustación no incluye un líquido, tal como agua o un tampón. Preferiblemente, el medio de incrustación es sólido o semisólido.

El medio de incrustación puede comprender una matriz o trama o una red o retícula, sobre la que se soporta la entidad detectable, por ejemplo. La matriz, trama, etc., puede comprender cualquier material fibroso adecuado, por ejemplo, fibra de carbono o fibra de vidrio. Puede emplearse una matriz o trama holgada, etc., proporcionando una estructura sustancialmente abierta. Como alternativa, en ciertas realizaciones puede preferirse una estructura más densa.

El medio de incrustación preferiblemente rodea o envuelve al menos a una parte de la entidad detectable, preferiblemente su totalidad. Para este fin puede emplearse cualquier medio de incrustación conocido en la técnica, tal como un medio de incrustación inmunohistoquímico (IHC) o de hibridación in situ (ISH). Pueden usarse polímeros, preferiblemente obtenidos por polimerización de monómeros, como se describe más adelante. Los ejemplos preferidos de dichos medios de incrustación comprenden parafina y agarosa.

El medio de incrustación puede ser homogéneo o puede ser heterogéneo y comprender otro material. Este "otro material" puede comprender células, partes de células, fragmentos de tejidos, colorantes, materiales granulares, etc.

El objetivo de incluir este otro material es producir un "transfondo" o "fondo" en cualquier corte o sección tomada del patrón de referencia; la presencia del "transfondo" permite detectar o localizar más fácilmente la región definida que comprende la entidad detectable, es decir, aumenta el contraste. Además, la presencia del "transfondo" permite al espectador realizar una determinación más precisa de la presencia o cantidad de la entidad detectable dentro del medio de incrustación. Esto se debe al "efecto óptico" bien conocido en el que el ojo percibe dos señales de intensidades idénticas como si fueran de intensidades diferentes, dependiendo del fondo. De esta manera, por ejemplo, en una muestra clínica, la señal a detectar por el ojo (por ejemplo, una célula que está teñida) puede tener un fondo que comprende otras células, otras células de diferentes tipos, vasos sanguíneos, tejido óseo, etc. Por consiguiente, el uso del otro material dentro del medio de incrustación asegura que el ojo percibirá señales del patrón de referencia de una intensidad similar a las de la muestra en cuestión como si fueran similares o idénticas, en lugar de tener una intensidad diferente.

El medio de incrustación puede comprender además medios de orientación. Los medios de orientación pueden comprender cualquier indicación visible dentro del medio que ayuda o permite al usuario determinar su orientación o dirección o posición. El medio de orientación puede comprender, en particular, reticulaciones o una red de líneas dentro del medio. El medio de orientación puede comprender una o más líneas generalmente paralelas en uno más planos. Preferiblemente, se incluye una red tridimensional de dichos planos comprendiendo cada uno líneas paralelas. Por lo tanto, la matriz puede incluir estructuras visibles que parecen, por ejemplo, una tela de gallinero para ayudar al usuario a navegar sobre el portaobjetos, ya que los patólogos están entrenados en buscar en estructuras de tipo "gallinero".

El medio de incrustación puede comprender un material biológico tal como células, tejidos, órganos, etc., o parte de éstos tales como orgánulos, estructuras celulares, etc. El material biológico puede rodear completamente la entidad detectable o puede estar colocado a distancia de ella. En cualquier configuración, una sección o corte plano comprenderá una región definida que comprende la entidad detectable, junto con una sección del tejido, etc. En la primera configuración, la región definida se localiza dentro de la sección del tejido y puede permitir realizar comparaciones más fáciles entre las dos.

El medio de incrustación puede comprender cualquier material adecuado, por ejemplo, un material que se usa para incrustar tejidos o muestras en inmunohistoquímica, tal como parafina.

Preferiblemente, el medio de incrustación es inerte. Más preferiblemente, el medio de incrustación es transparente a la radiación, preferiblemente transparente a la luz visible.

Aunque el medio de incrustación usado más comúnmente es parafina, puede usarse cualquier otro tipo de medio de incrustación adecuado. Se incluyen materiales tales como Araldite M, Resina Dammar, Divinilbenceno, Durcupan (Fluka), Medio de Incrustación Epoxi, dimetacrilato de etilenglicol, metacrilato de glicol, resina de incrustación Histocryl, Lowicryl HM20, metacrilato de butilo, metacrilato de hidroxipropilo, metacrilato de metilo, cera de parafina y Paraplast. El medio de incrustación puede formarse por la polimerización de monómeros tales como monómero de ácido metacrílico y monómero de estireno. En la sección titulada "Polímeros" proporcionada más adelante se presentan detalles adicionales de la formación de medios de incrustación a través de la polimerización.

El medio de incrustación puede comprender hielo, es decir, una sección congelada que comprende agua congelada en la que está incrustado el tejido, etc. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula compacta que comprende la entidad detectable acoplada o acoplada químicamente a la misma se soporta en el mismo medio de incrustación que el propio tejido de la muestra, célula u órgano. Estas realizaciones son ventajosas porque sólo necesita manipularse una sección de corte, en lugar de una para el patrón de referencia y otra para la muestra.

Estas realizaciones de los patrones de referencia pueden conseguirse incrustando una partícula compacta con una entidad detectable acoplada o acoplada químicamente a la misma como se describe más adelante en el mismo medio de incrustación que la muestra. Se apreciará que la partícula compacta puede incrustarse en el medio de incrustación al mismo tiempo, antes o después de incrustar la muestra en ese medio. En otras palabras, la partícula compacta con la entidad detectable puede incrustarse en el medio de incrustación en cualquier momento con respecto a la incrustación de la muestra en el medio de incrustación. Preferiblemente, la partícula compacta con la entidad detectable se incrusta como parte del proceso de incrustación de parafina en FFPE.

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Secciones y montaje

El patrón de referencia puede proporcionarse en una sola pieza y usarse sin procesamiento adicional. Preferiblemente, sin embargo, el patrón de referencia puede cortarse en cortes o secciones y estas secciones o cortes pueden usarse como los propios patrones. Como se ilustra en las Figuras 4B, 4C, 5A, 5B, 8F, 9 y 10, los cortes o secciones comprenden áreas definidas que comprenden la entidad detectable y pueden prepararse múltiples cortes o secciones a partir de un patrón de referencia.

Se apreciará que las áreas definidas en los cortes o secciones que comprenden la entidad detectable tienen una forma compacta y se soportan por el medio de soporte, tratándose preferiblemente los propios cortes o secciones como "patrones de referencia" como se describe en este documento.

Los cortes o secciones pueden tomarse usando cualquier medio adecuado (por ejemplo, un microtomo tal como un microtomo de banco o un microtomo de tipo basculante). El espesor de los cortes o secciones típicamente es el de los cortes de microtomo convencionales. Preferiblemente, los cortes o secciones tienen entre aproximadamente 0,5 y 300 \mum, preferiblemente entre 5 y 200 \mum, preferiblemente entre aproximadamente 10 y 100 \mum, preferiblemente entre aproximadamente 1 y 100 \mum, preferiblemente entre aproximadamente 20 y 30 \mum, y más preferiblemente entre aproximadamente 2 y 10 \mum de espesor. En una realización muy preferida, los cortes o secciones tienen un espesor de 5 \mum o aproximadamente este espesor.

Para cualquier muestra FFPE pueden tomarse múltiples secciones o cortes del patrón de referencia de una manera similar. La sección o corte resultante del patrón de referencia puede tratarse de la misma manera que cualquier otra muestra de célula o tejido incrustada y fijada.

El corte o sección del patrón de referencia puede montarse en un soporte adecuado para ayudar a la manipulación. Dicho soporte puede comprender convenientemente un portaobjetos, tal como portaobjetos de microscopio, hecho de vidrio u otro material. La sección o corte de la sección de referencia puede montarse de una manera similar a una sección de un material incrustado en FFPE. Dichas técnicas de montaje se conocen en este campo. La sección o corte puede montarse de una manera temporal, permanente o semi-permanente y en particular puede fijarse al soporte, por ejemplo, por tensión adhesiva o superficial.

El corte o sección también puede ponerse sobre un revestimiento, que típicamente es una pieza plana fina de material capaz de soportar el corte o sección. El corte o sección puede transportarse o venderse con el revestimiento, un corte o sección en una sola pieza de revestimiento o una pluralidad de cortes o secciones. Por ejemplo, dicho revestimiento puede estar hecho de papel, cartón, plástico, acetato de celulosa, etc. La superficie del revestimiento puede tratarse para prevenir la adhesión del corte o sección, por ejemplo, por silicona. Una realización preferida de dicho revestimiento, por lo tanto, comprende papel siliconizado. El uso de dicho revestimiento permite montar fácilmente el corte o sección en un portaobjetos de microscopio, preferiblemente cerca de la muestra del paciente.

Los métodos para unir o montar secciones en portaobjetos incluyen el uso de portaobjetos limpios y se basan en la tracción capilar y sin adhesivos. Otras técnicas incluyen pegamentos tales como, por ejemplo, glicerina de clara de huevo, mezclas de glicerina-gelatina, pegamento de acetato de polivinilo, gelatina de cromo-alumbre y recubrimientos de polilisina. El calentamiento o "combustión" de la sección como medio para facilitar el montaje de la sección debe usarse con precaución, ya que el tejido puede destruirse.

El soporte puede comprender indicios para ayudar a la cuantificación de la entidad detectable. Estos indicios pueden localizarse preferiblemente en las proximidades del área que comprende la entidad detectable. Los indicios pueden relacionarse con la cantidad de la entidad detectable o el grado asignado a esa cantidad o la naturaleza de la entidad detectable.

La cantidad de tinción en el corte o sección después puede compararse con la de la muestra para proporcionar una evaluación del significado del nivel de tinción de esta última. Se apreciará que aunque se prefiere que se someta a los procedimientos de procesamiento el corte o sección tomado del patrón de referencia, en algunas realizaciones puede ser deseable que el propio patrón de referencia se someta al procesamiento.

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Detección y visualización

El patrón de referencia puede comprender la entidad detectable en un estado fácilmente visualizable; en otras palabras, una entidad detectable en una forma que no necesita procesarse adicionalmente para identificar su presencia o cantidad. El marcador detectable, por lo tanto, puede comprender un marcador, tal como un marcador fluorescente o radiactivo, o marcarse de otra manera con un agente que es capaz de emitir radiación. El marcador preferiblemente emite luz; más preferiblemente, la luz se emite como resultado de fluorescencia. La entidad detectable puede detectarse por medio de la detección de la emisión de la señal (o un cambio en la emisión de la señal) por el marcador detectable, y la detección puede comprender además la excitación del marcador detectable y el control de la emisión de fluorescencia. La cantidad de la señal emitida puede medirse para indicar la cantidad de entidad detectable presente.

Sin embargo, en realizaciones preferidas, el patrón de referencia comprende una entidad detectable que no se modifica sustancialmente con respecto a su forma nativa, por ejemplo, que está sin marcar. En estas realizaciones, la presencia y/o cantidad de la entidad detectable sólo se revela sobre el procesamiento adicional del patrón de referencia, por ejemplo, por aplicación de las etapas tomadas convencionalmente para revelar una entidad detectable en una muestra biológica.

De esta manera, puede usarse la aplicación de un medio de revelado primario tal como un agente de unión que se une a la entidad detectable, preferiblemente de forma específica. La entidad detectable, el agente de unión o la combinación de los dos pueden detectarse adicionalmente por medio del uso de medios de revelado secundarios. Cuando el agente de unión comprende un anticuerpo y la entidad detectable comprende un antígeno, el anticuerpo, antígeno o el complejo de antígeno-anticuerpo puede revelarse por un anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario puede conjugarse con una enzima, que es capaz de producir una señal cuando reacciona con un sustrato cromogénico. Se apreciará que puede aplicarse cualquier etapa o serie de etapas que pueden usarse para revelar, detectar o cuantificar una entidad detectable en una muestra biológica al patrón de referencia o sus secciones. Preferiblemente, dicha etapa o etapas son las que se emplean convencionalmente en inmunohistoquímica, por ejemplo, etapas de detección para detectar la entidad en secciones de FFPE.

La sección o corte del patrón de referencia puede someterse, en particular, a uno cualquiera o más de los procedimientos usados para teñir una muestra incrustada en FFPE o una sección de la misma. De esta manera, el corte o sección del patrón de referencia pretende ser y puede someterse a uno cualquiera o más de los procedimientos posteriores de incrustación típicos usados para teñir muestras de tejidos, para revelar el antígeno. En realizaciones preferidas, la sección o corte se somete a todos o sustancialmente todos estos procedimientos. Por lo tanto, preferiblemente, la sección o corte se somete a uno cualquiera o más, preferiblemente a todos los siguientes: montaje sobre un portaobjetos, horneado, desparafinación, rehidratación, recuperación de antígeno, bloqueo, exposición al anticuerpo, exposición a un anticuerpo primario, lavado, exposición a un conjugado de anticuerpo secundario-enzima, exposición a un sustrato enzimático, exposición a un sustrato cromogénico y tinción con colorantes de contraste.

El calentamiento en horno se refiere a calentar suavemente el portaobjetos con el corte de parafina sobre él. La parafina se funde parcialmente y el tejido se adhiere a la superficie de vidrio.

En realizaciones preferidas, la entidad detectable se expone a un anticuerpo y la unión del anticuerpo se visualiza en cualquiera de varias formas. Para una introducción general en diferentes técnicas de visualización de inmunocitoquímica, véase, por ejemplo, Lars-Inge Larsson "Immunocytochemistry: Theory and Practice", CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, y John D. Pound (ed.); "Immunochemical Protocols, vol 80" in the series: "Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3.

Los métodos de detección usados más comúnmente en inmunohistoquímicas son visualización directa de fluorescencia o partículas de oro y detección colorimétrica mediada por enzimas.

Para los estudios fluorescentes directos, los marcadores pueden ser, por ejemplo, 5-(y 6)-carboxifluoresceína, ácido 5 ó 6-carboxifluoresceína, 6-(fluoresceína)-5-(y 6)-carboxamido hexanoico, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, tetrametilrodamina y colorantes tales como Cy2, Cy3 y Cy5, opcionalmente coumarina sustituida incluyendo AMCA, PerCP, ficobiliproteínas incluyendo R-ficoeritrina (RPE) y aloficoeritrina (APC), Rojo de Texas, Rojo de Princeston, proteína fluorescente Verde (GFP) y análogos de los mismos, y conjugados de R-ficoeritrina o aloficoeritrina y, por ejemplo, Cy5 o Rojo de Texas, y marcadores fluorescentes inorgánicos basados en nanocristales semiconductores (tales como quantum dot y nanocristales Qdot^{TM}), y marcadores fluorescentes de resolución en el tiempo basados en lantánidos tales como Eu3+ y Sm3+.

Puede usarse oro coloidal o plata como marcadores directos para estudios de inmunocitoquímica para microscopía electrónica y microscopía óptica. La amplificación de la señal puede obtenerse por medio de un aumento adicional de la plata de las partículas de oro coloidal.

Los métodos enzimáticos generales usan avidina marcada o estreptavidina-biotina (LAB o LSAB), complejo de avidina o estreptavidina-biotina (ABC), complejo de enzima anti-enzima (PAP y APAAP), complejo directo de anticuerpo basado en polímero de dextrano-enzima (EPOS, DakoCytomation); complejo de anticuerpo basado en polímero de dextrano indirecto-enzima (EnVision, DakoCytomation) o complejo de puente doble de enzima-anti-enzima.

La tinción enzimática usa marcadores enzimáticos tales como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (GAL), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, beta-N-acetilglucosaminidasa, invertasa, Xantina Oxidasa, luciferasa de luciérnaga y glucosa oxidasa (GO).

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Los ejemplos de sustratos usados comúnmente para peroxidasa de rábano picante incluyen 3,3'-diaminobenzidina (DAB), diaminobenzidina con aumento de níquel, 3-amino-9-etil-carbazol (AEC), dihidrocloruro de Benzidina (BDHC), reactivo de Hanker-Yates (HYR), azul de Indofano (IB), tetrametilbenzidina (TMB), 4-cloro-1-naftol (CN), \Box-naftol pironina (\Box-NP), o-dianisidina (OD), 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP), Nitro azul tetrazolio (NBT), cloruro de 2-(p-yodofenil)-3-p-nitrofenil-5-fenil tetrazolio (INT), tetranitro azul tetrazolio (TNBT), 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-gaIactósido/ferro-ferricianuro (BCIG/FF).

Los ejemplos de sustratos usados comúnmente para Fostasa Alcalina incluyen Naftol-AS-B1-fosfato/rojo rápido TR (NABP/FR), Naftol-AS-MX-fosfato/rojo rápido TR (NAMP/FR), Naftol-AS-B1-fosfato/rojo rápido TR
(NABP/FR), Naftol-AS-MX-fosfato/rojo rápido TR (NAMP/FR), Naftol-AS-B1-fosfato/fucsina nueva (NABP/NF), bromocloroindolil fosfato/nitro azul tetrazolio (BClP/NBT), 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-b-d-galactopiranósido
(BCIG).

Uno de los sistemas de detección más potentes es la deposición de indicador catalizada (CARD); este método de amplificación se basa en la deposición de tiramida marcada sobre un tejido por medio de la acción enzimática de la HRP. Después de la inmunotinción con HRP, la tiramida marcada se aplica y se une cerca del sitio de actividad de HRP. Después, la tiramida unida y marcada se visualiza por fluorescencia tradicional o por detección mediada por enzimas colorimétricas.

Los compuestos marcadores mencionados anteriormente, en general, pueden aplicarse a las dos sondas y anticuerpos (o a cualquier otra sustancia usada para detectar una diana deseada).

El método de visualización de las muestras marcadas incluye microscopios de campo brillante o escáneres, microscopios o escáneres fluorescentes, microscopio electrónico de transmisión (TEM) o microscopio electrónico de barrido (SEM).

Se han introducido sistemas de tinción automáticos para reducir costes, aumentar la uniformidad de la preparación del portaobjetos, reducir un trabajo rutinario laborioso y más significativamente reducir errores humanos del procedimiento.

Los sistemas automáticos actuales pueden manipular cualquier ensayo inmunoquímico incluyendo ensayos que se basan en inmunofluorescencia, procedimientos de inmunoensayo indirectos, métodos de tinción con oro o enzimático. Realizan todas las etapas del ensayo inmunohistoquímico independientemente de la complejidad o de su orden, en el tiempo y temperatura indicados.

Tradicionalmente, las técnicas inmunocitoquímicas han usado anticuerpos específicos para la identificación y visualización de antígenos específicos. La técnica es compleja y se necesitan muchas etapas y moléculas con altas afinidades para una tinción específica.

También pueden usarse "tintes especiales", descritos en una sección separada más adelante, solos o en combinación con visualización inmunohistoquímica.

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Tinción e inmunotinción

En lo sucesivo se describen algunas de las etapas individuales en un procedimiento de tinción. Cada una, algunas o todas estas etapas pueden aplicarse al patrón de referencia o a un portaobjetos o sección del mismo.

Se necesitan agentes de fijación para conservar las células y tejidos de una manera reproducible y segura para la vida. Para conseguir esto, se sumergen bloques de tejido, secciones o frotis en un fluido de fijación, o en el caso de frotis se secan. Los agentes de fijación estabilizan las células y tejidos protegiéndolos de esta manera de los rigores de las técnicas de procesamiento y tinción.

Puede usarse cualquier agente de fijación adecuado, por ejemplo, etanol, ácido acético, ácido pícrico, 2-propanol, tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina dihidrato, acetoína (mezcla de monómeros) y dímero, acroleína, crotonaldehído (cis + trans), formaldehído, glutaraldehído, glioxal, dicromato potásico, permanganato potásico, tetróxido de osmio, Paraformaldehído, cloruro mercúrico, tolileno-2,4-diisocianato, ácido tricloroacético, ácido túngstico. Los tipos preferidos de agentes de fijación incluyen formalina (formaldehído acuoso) y la formalina tamponada neutra (NBF) está entre los usados más comúnmente. Otros agentes de fijación preferidos incluyen glutaraldehído, acroleína, carbodiimida, imidatos, benzoequinona, ácido ósmico y tetróxido de osmio.

Las muestras de biopsia recientes, preparaciones citológicas (incluyendo preparaciones de tacto y frotis de sangre), secciones y tejidos congelados para análisis inmunohistoquímico se fijan comúnmente en disolventes orgánicos, incluyendo etanol, ácido acético, metanol y/o acetona.

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Anticuerpos

En realizaciones preferidas, se emplea un anticuerpo capaz de unirse a la entidad detectable para revelar su presencia.

Los anticuerpos comprenden moléculas de inmunoglobulina. Las moléculas de inmunoglobulina, en el sentido más amplio, son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas, una familia de polipéptidos que comprenden en el plegamiento de inmunoglobulina característico de las moléculas de anticuerpo, que contiene dos láminas \beta y, normalmente, un enlace disulfuro conservado. Los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas están implicados en muchos aspectos de interacciones celulares y no celulares in vivo, incluyendo papeles extendidos del sistema inmune (por ejemplo, anticuerpos, moléculas de receptor de células T y similares), implicación en la adhesión celular (por ejemplo las moléculas ICAM) y señalización intracelular (por ejemplo, moléculas receptoras tales como el receptor de PDGF). Los métodos descritos en la presente memoria para detectar entidades detectables y para usar el patrón de referencia, por lo tanto, pueden hacer uso de cualquier molécula de la superfamilia de inmunoglobulinas que sea capaz de unirse a una diana. También pueden usarse péptidos o fragmentos derivados de inmunoglubolinas.

Anticuerpos, como se usa en la presente memoria, se refiere a anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a una diana seleccionada, y que incluyen Fv, ScFv, F(ab') y F(ab')_{2}, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos modificados por ingeniería genética incluyendo anticuerpos quiméricos, con injertos de CDR y humanizados, y anticuerpos seleccionados artificialmente producidos usando técnicas de presentación de fagos o técnicas alternativas. Los fragmentos pequeños, tales como Fv y ScFv, poseen propiedades ventajosas para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas gracias a su pequeño tamaño y a la consiguiente mejor distribución en tejidos. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario o ScFv.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos alterados que comprenden una proteína efectora tal como una toxina o un marcador. El uso de anticuerpos marcados permite la formación de imágenes de la distribución del anticuerpo in vivo. Estos marcadores pueden ser marcadores radiactivos o marcadores radioopacos, tales como partículas de metal, que se pueden visualizar fácilmente dentro del cuerpo de un paciente. Además, pueden ser marcadores fluorescentes (tales como los descritos en la presente memoria) u otros marcadores que son visualizables en muestras de tejido extraídas de pacientes. Los anticuerpos con grupos efectores pueden unirse a cualquier medio de asociación como se ha descrito anteriormente.

Los anticuerpos pueden obtenerse a partir de un suero animal, o en el caso de anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, producirse en un cultivo celular. Puede usarse tecnología de ADN recombinante para producir los anticuerpos de acuerdo con un procedimiento establecido, en cultivos de bacterias, levaduras, células de insectos o preferiblemente células de mamífero. El sistema de cultivo celular seleccionado preferiblemente secreta el producto de anticuerpo.

El crecimiento de las células de hibridoma o células hospedadoras de mamífero in vitro se realiza en medios de cultivo adecuados, que son medios de cultivo convencionales, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o medio RPMI 1640, opcionalmente enriquecido por un suero de mamífero, por ejemplo suero bovino fetal, u oligoelementos y suplementos que mantienen el crecimiento, por ejemplo, células de alimentación tales como células de exudado peritoneal de ratón normal, células de bazo, macrófagos de médula ósea, 2-aminoetanol, insulina, transferrina, lipoproteína de baja densidad, ácido oleico o similares. De forma similar, la multiplicación de células hospedadoras que son células bacterianas o células de levadura se realiza en medios de cultivo adecuados conocidos en la técnica, por ejemplo, para bacterias en medio LB, NZCYM, NZYM, NZM, Terrific Broth, SOB, SOC, 2 x YT o Medio Mínimo M9, y para levaduras en medio YPD, YEPD, Medio Mínimo o Medio Dropout Mínimo Completo.

El uso de células de insecto como hospedadores para la expresión de proteínas tiene ventajas ya que el proceso de clonación y expresión es relativamente fácil y rápido. Además, hay una alta probabilidad de obtener una proteína plegada correctamente y biológicamente activa cuando se compara con la expresión bacteriana o de levaduras. Las células de insecto pueden cultivarse en medio sin suero, que es más barato y más seguro en comparación con el medio que contiene suero. Como vector de expresión pueden usarse baculovirus recombinantes, y la construcción puede usarse para transfectar una línea de células hospedadoras, que puede ser cualquiera de varias líneas de células de lepidópteros, en particular Spodoptera frugiperda Sf9, como se conoce en la técnica. Se proporcionan revisiones de la expresión de proteínas recombinantes en células hospedadoras de insecto por Altmann et al. (1999), Glycoconj J 1999, 16, 109-23 y Kost y Condreay (1999), Curr Opin Biotechnol, 10, 428-33.

La producción in vitro proporciona preparaciones de anticuerpo relativamente puras y permite un aumento de escala para proporcionar grandes cantidades de los anticuerpos deseados. En la técnica se conocen procedimientos para el cultivo de células bacterianas, de levadura, de insecto y de mamífero e incluyen cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo en un reactor accionado por aire o en un reactor agitador continuo, o un cultivo de células inmovilizadas o atrapadas, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, en microperlas de agarosa o en cartuchos cerámicos.

También puede obtenerse grandes cantidades de los anticuerpos deseados multiplicando células de mamífero in vivo. Para este fin, se inyectan células de hibridoma que producen los anticuerpos deseados en mamíferos histocompatibles para provocar el crecimiento de tumores productores de anticuerpo. Opcionalmente, los animales se inducen con un hidrocarburo, especialmente aceites minerales tales como pristano (tetrametil-pentadecano), antes de la inyección. Después de una a tres semanas, se aíslan los anticuerpos de los fluidos corporales de esos mamíferos. Por ejemplo, células de hibridoma obtenidas por fusión de células de mieloma adecuadas con células de bazo productoras de anticuerpo de ratones Balb/c, o células transfectadas derivadas de la línea de células de hibridoma Sp2/0 que producen los anticuerpos deseados se inyectan por vía intraperitoneal en ratones Balb/c opcionalmente pretratados con pristano y, después de una a dos semanas, se recoge el fluido ascítico de los animales.

La técnica anterior y otras técnicas se describen, por ejemplo, en Kohler y Milstein, (1975) Nature 256:495-497; US 4.376.110; Harlow y Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor, incorporado en la presente memoria como referencia. En las referencias anteriores y también, por ejemplo, en los documentos EP 0623679; EP 0368684 y EP 0436597 se describen técnicas para la preparación de moléculas de anticuerpo recombinante.

Los sobrenadantes de cultivo de células se exploran con respecto a los anticuerpos deseados, preferiblemente por tinción inmunofluorescente de células que expresan la diana deseada por inmunotransferencia, por medio de un inmunoensayo enzimático, por ejemplo un ensayo tipo sándwich, un ensayo dot o un radioinmunoensayo.

Para el aislamiento de los anticuerpos, las inmunoglobulinas en los sobrenadantes de cultivo o en fluido ascítico pueden concentrarse, por ejemplo por precipitación con sulfato amónico, diálisis frente a un material higroscópico tal como polietielenglicol, filtración a través de membranas selectivas o similares. Si es necesario y/o se desea, los anticuerpos se purifican por los métodos cromatográficos habituales, por ejemplo exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa y/o cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo cromatografía de afinidad con una proteína que contiene una diana o con Proteína A.

Los anticuerpos generados de acuerdo con los procedimientos anteriores pueden clonarse por aislamiento de ácido nucleico a partir de las células, de acuerdo con procedimientos convencionales. De forma útil, pueden aislarse dominios variables de ácido nucleicos de los anticuerpos y usarse para construir fragmentos de anticuerpos tales como scFv.

Preferiblemente, los métodos descritos en la presente memoria emplean ácidos nucleicos recombinantes que comprenden un inserto que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpos. Por definición, estos ácidos nucleicos comprenden ácidos nucleicos monocatenarios codificantes, ácidos nucleicos bicatenarios que consisten en los ácidos nucleicos codificantes y ácidos nucleicos complementarios a los mismos, o los propios ácidos nucleicos complementarios (monocatenarios).

Además, pueden sintetizarse ácidos nucleicos que codifican un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpos de forma enzimática o química teniendo los ácidos nucleicos la secuencia auténtica codificante de un dominio variable de cadena pesada natural y/o del dominio variable de cadena ligera, o un mutante del mismo. Un mutante de la secuencia auténtica es un ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos mencionados anteriormente donde uno o más aminoácidos se han delecionado o cambiado por uno o más aminoácidos distintos. Preferiblemente, la modificación o modificaciones están fuera de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del dominio variable de cadena pesada y/o del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo. Dicho ácido nucleico mutante también puede ser un mutante silencioso en el que uno o más nucleótidos se han reemplazado por otros nucleótidos codificando los nuevos codones el mismo aminoácido o aminoácidos. Dicha secuencia mutante también es una secuencia degenerada. Las secuencias degeneradas están degeneradas dentro del significado del código genético ya que un número ilimitado de nucleótidos se reemplazan por otros nucleótidos sin producir un cambio de la secuencia de aminoácidos codificada originalmente. Estas secuencias degeneradas pueden ser útiles debido a sus sitios de restricción diferentes y/o frecuencia de codones particulares que se prefieren por el hospedador específico, particularmente células de levadura, bacterianas o de mamífero, para obtener una expresión óptima del dominio variable de cadena pesada y/o de un dominio variable de cadena ligera.

Se pretende que el término mutante incluya un mutante de ADN obtenido por mutagénesis in vitro o in vivo de ADN de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Puede usarse tecnología de ADN recombinante para mejorar anticuerpos. De esta manera, puede construirse anticuerpos quiméricos para reducir la inmunogenicidad de los mismos en aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Además, la inmunogenicidad puede minimizarse humanizando los anticuerpos por injertos de CDR [Patente Europea 0 239 400 (Winter)] y, opcionalmente, modificación de regiones flanqueantes [Patente Europea 0239400; Riechmann et al., (1988) Nature 322:323-327, y como se revisó en la solicitud de patente internacional WO 90/07861 (Protein Design Labs)].

Puede emplearse ácidos nucleicos recombinantes que comprenden un inserto que codifica un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo fusionado a un dominio constante humano \gamma, por ejemplo, \gamma1, \gamma2, \gamma3\gamma o \gamma4, preferiblemente \gamma1 o \gamma4. De forma similar, también pueden usarse ADN recombinantes que comprenden un inserto que codifica un dominio variable de cadena ligera y un anticuerpo fusionado a un dominio constante humano \kappa o \lambda, preferiblemente \kappa.

Más preferiblemente, pueden usarse anticuerpos injertados con CDR, que preferiblemente son únicamente dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera con injertos de CDR. Ventajosamente, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera están unidos por medio de un grupo espaciador, que comprende opcionalmente una secuencia señal que facilita el procesamiento del anticuerpo en la célula hospedadora y/o un ADN que codifica un péptido que facilita la purificación del anticuerpo y/o un sitio de escisión y/o un espaciador de péptido y/o una molécula efectora. Estos anticuerpos se conocen como ScFv.

Además, los anticuerpos pueden generarse por mutagénesis de genes de anticuerpo para producir repertorios de anticuerpos artificiales. Esta técnica permite la preparación de bibliotecas de anticuerpo, como se describe más adelante; las bibliotecas de anticuerpos también están disponibles en el mercado. Por lo tanto, se usan repertorios artificiales de inmunoglobulinas, preferiblemente repertorios artificiales de ScFv, como fuente de inmunoglobulina.

Los anticuerpos aislados o clonados pueden unirse a otras moléculas, por ejemplo, medios de asociación de ácidos nucleicos o proteínas por acoplamiento químico, usando protocolos conocidos en la técnica (por ejemplo Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor, y Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook, J. (1991), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

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Sondas de ácido nucleico

Como se ha indicado anteriormente, la entidad detectable puede comprender un ácido nucleico y estas realizaciones de patrón de referencia que comprenden entidades detectables de ácido nucleico se usan convenientemente como patrones en hibridación in situ. En estas realizaciones, se emplea una sonda de ácido nucleico capaz de unirse a la entidad detectable de ácido nucleico para revelar su presencia.

Preferiblemente la sonda de ácido nucleico en particular comprende al menos una secuencia que es capaz de hibridar con una secuencia en la entidad detectable. En particular, puede comprender al menos una secuencia que es complementaria a dicha secuencia. La sonda de ácido nucleico preferiblemente es monocatenaria y puede comprender en particular ADN monocatenario o ARN monocatenario.

El término "hibridación" como se usa en este documento se refiere al "proceso por medio del cual una cadena de ácido nucleico se une con un cadena complementaria por medio de la formación de pares de bases". Preferiblemente, la sonda de ácido nucleico incluye secuencias que pueden hibridar en condiciones rigurosas (por ejemplo, 50ºC y SSC 0,2x {SSC 1x = NaCl 0,15 M, Na_{3}citrato 0,015 M, pH 7,0} a al menos una secuencia de nucleótidos en la entidad detectable. Más preferiblemente, la sonda de ácido nucleico incluye secuencias que pueden hibridar en condiciones muy rigurosas (por ejemplo, 65ºC y SSC 0,1x {SSC 1x = NaCl 0,15 M, Na_{3}citrato 0,015 M, pH 7,0}.

Las sondas de ácido nucleico capaces de hibridar de forma selectiva con una secuencia de nucleótidos en la entidad detectable, o con su complemento, generalmente tendrán una homología de al menos 75%, preferiblemente de al menos 85% o 90% y más preferiblemente de al menos 95% o 98% con la secuencia de nucleótidos complementaria correspondiente en la entidad detectable en una región de al menos 20, preferiblemente al menos 25 ó 30, por ejemplo, al menos 40, 60 ó 100 o más nucleótidos contiguos. Las sondas preferidas comprenden al menos una región con una homología de al menos 80 ó 90% y más preferiblemente de al menos 95% con la secuencia de nucleótidos en la entidad detectable.

La expresión "hibridable de forma selectiva" significa que la sonda de ácido nucleico puede hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana a un nivel significativamente superior al nivel de fondo. La hibridación de fondo puede producirse debido a las otras secuencias de nucleótidos presentes, por ejemplo, en la muestra a procesar para ISH. En este caso, el nivel de fondo implica un nivel de señal generado por la interacción entre la sonda y un miembro de ADN no específico de la biblioteca que tiene una intensidad menor de 10 veces, preferiblemente menor de 100 veces que la interacción específica observada con el ADN diana. Esta intensidad de interacción puede medirse, por ejemplo, por medio de radiomarcaje de la sonda, por ejemplo con ^{32}P.

Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión al ácido nucleico, como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzimology, Vol. 152, Academia Press, San Diego CA) y confieren una "rigurosidad" definida, como se explica más adelante.

Se produce una rigurosidad máxima a aproximadamente Tm-5ºC (5ºC por debajo de la Tm de la sonda); alta rigurosidad a aproximadamente 5ºC a 10ºC por debajo de la Tm; rigurosidad intermedia aproximadamente 10ºC a 20ºC por debajo de la Tm; y baja rigurosidad a aproximadamente 20ºC a 25ºC por debajo de la Tm. Como entenderán los especialista en la técnica, puede usarse una hibridación de máxima rigurosidad para identificar sondas que comprenden secuencias de nucleótidos idénticas mientras que puede usarse una hibridación de rigurosidad intermedia (o baja) para identificar sondas que comprenden secuencias polinucleotídicas similares o relacionadas.

Las secuencias de nucleótidos que no tienen una homología de 100% con una secuencia en la entidad detectable pero que pueden usarse como sondas pueden obtenerse de varias formas. Pueden predecirse secuencias conservadas, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos de varias variantes/homólogos. Los alineamientos de secuencia pueden realizarse usando un software informático conocido en la técnica. Por ejemplo, se usa ampliamente el programa GCG Wisconsin PileUp.

Las sondas puede producirse de forma recombinante, por síntesis o por cualquier medio disponible para los especialista en la técnica. En general, las sondas se producirán por medio sintéticos, que implican una fabricación por etapas de la secuencia de ácido nucleico deseada, añadiendo un nucleótido cada vez. En la técnica se pueden obtener fácilmente métodos para realizar esto usando técnicas automáticas.

Las secuencias de nucleótidos más largas para uso como sondas de ácido nucleico generalmente se producirán usando medios recombinantes, por ejemplo, usando una técnica de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto implicará la obtención de un par de cebadores (por ejemplo de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean una región de la secuencia de dirección que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con ARNm o ADNc obtenido de una célula animal o humana, realizando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en condiciones que producen amplificación de la región deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para que contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados de forma que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación adecuado.

Las sondas de ácido nucleico pueden marcarse por diversos medios, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, la sonda puede marcarse usando marcadores radiactivos tales como ^{31}P, ^{33}P o ^{32}S o de forma no radioactiva, usando marcadores tales como digoxigenina o marcadores fluorescentes, de los que se conocen muchos en la técnica.

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Tintes y colorantes

Aunque se prefieren los anticuerpos como agentes de unión para uso para revelar la entidad detectable, pueden usarse otros tintes o colorantes adecuados para revelar la diana. Por ejemplo, los colorantes usados típicamente para colorear tejidos pueden usarse para teñir la diana o entidad detectable. Estos colorantes típicamente se unen de una forma estequiométrica, de tal manera que cuanto más entidad detectable esté presente más colorante está unido. Sin embargo, la tinción sencilla para revelar la presencia y/o localización a menudo puede proporcionar suficiente información.

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Tintes y Colorantes "Especiales"

Por lo tanto, debe entenderse, que el patrón de referencia descrito en la presente memoria también puede teñirse no sólo usando reconocimiento inmunológico por medio del uso de, por ejemplo anticuerpos, sino también por medio de agentes químicos, que se denominan en este documento "tintes especiales".

Los más comunes son la tinción general con Hematoxilina-Eosina (H y E), la tinción con metenamina-plata de Gomori (GMS) útil para identificar, por ejemplo, carbohidratos de hongos y la tinción con ácido peryódico-Schiff (PAS) útil para identificar, por ejemplo glucógeno, mucosustancias ácidas y neutras, pared celular fúngica, membranas basales, fibras de colágeno, y fibras reticulares.

Hay numerosas formulaciones de tintes especiales, variaciones y combinaciones, incluyendo Au-cloruro, azul tricromo, tricromo de Masson, azul de Prusia, Giemsa, Diff-Quik, Reticulum, Rojo Congo, azul alcián, Steiner, AFB, PAP, Gram, Mucicarmina, Verhoeff-van Gieson, Elastic, Carbol Fucsina y tinte de Golgi.

También debe entenderse que algunos de los tintes especiales mencionados anteriormente teñirán específicamente sondas diana tales como, por ejemplo, algunos carbohidratos o restos hidrófobos que se introducen fácilmente en el patrón de referencia descrito en la presente memoria.

Además, también puede realizarse cualquier combinación de una o más tinciones inmunológicas y una o más tinciones especiales.

Por ejemplo, los tintes y colorantes adecuados pueden incluir cualquiera de los siguientes: 1,4-fenilendiamina, cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio, 2,4-dinitro-5-fIuoroanilina, 2-naftol (beta), 3,3'-diaminobenzidina, 4-cloro-1-naftol, 4-cloro-1-naftol, naranja de acridina, hidrocloruro de naranja de acridina hidratado, proteinato de plata, azul Alcián 8GX, alizarina, rojo de alizarina S, azul alcalino 4B, molibdato amónico tetrahidrato, hidrocloruro de anilina, auramina O, azocarmina B, azocarmina G, azofloxina, azure A, azure B, azure II, azure II-eosina, mezcla de azure sicc., tinción de Giemsa, rosa bengala B, benzopurpurina 4B, azul de Prusia soluble, azul de Prusia insoluble, marrón Bismarck Y (G), marrón Bismarck R, nitrato de bismuto (Ill) básico, acetato de plomo (II) trihidrato, citrato de plomo (II) trihidrato (II), nitrato de plomo (II), nitrato de plomo (II), tartrato de plomo (II), tetraacetato de plomo, solución de carmín borax (de acuerdo con Grenacher), verde brillante, azul de cresilo brillante, "azul de cresilo brillante", solución de azul de cresilo brillante, verde de bromocresol y complexometría, sal sódica de verde de bromocresol, púrpura de bromocresol, azul de bromofenol, bromosulfaleína, sal de sodio de azul de bromotimol, colorante carbol-Fucsina en polvo, solución de carbol-Fucsina (de acuerdo con Kinyoun), solución de carbol-Fucsina (de acuerdo con Ziehl-Neelsen), solución de carbol-violeta de genciana, solución de carbol-azul de metileno, Carmín, ácido carmínico, azul de celestina, dihidrocloruro de mostaza de quinacrina, amarillo de quinolina, negro de clorazol, óxido de cromo (VI) óxido de cromo (VI), cromotrop 2 R y complexometría, crisoidina G, cloruro de Cobalto anhidro, naftenato de cobalto, Co \sim10%, cianosina, citocromo c de corazón de caballo liofilizado, polvo sin sal, citocromo c de corazón de caballo, citrocromo c de corazón de caballo, citocromo c de corazón bovino, citocromo c de músculo de mama de lechón, solución de tinción diferencial, rojo directo, rojo directo 80, sal de azul rápido B, sal de azul rápido BB, sal de azul rápido RR, verde rápido FCF, sal de rojo rápido 3 GL, sal de rojo rápido RC, sal de violeta rápido B, alcohol de eosina soluble, eosina amarillenta, solución de eosina amarillenta, solución de eosina-hematoxilina (de acuerdo con Ehrlic), eosina-azul de metileno (de acuerdo con Leishman), eosina-azul de metileno (de acuerdo con Wright), eosina-azul de metileno, eosina-solución de azul de metileno (de acuerdo con Wright), solución de eosina-azul de metileno (de acuerdo con Wright-Lillie), eosina escarlata, rojo de eriocromo B, azul extra de eritrosina, solución de ácido acético, violeta de etilo, azul de Evans Fluka, solución de colorante (de acuerdo con Boroviczeny A:Toluidine Blue-Safranine fix), solución de colorante (de acuerdo con Boroviczeny B: Eosine Solution), ferritina de bazo de caballo, Fat Red Bluish, Fat Black, isotiocianato de fluoresceína, Fucsina, solución de Fucsina, galocianina, violeta de genciana, solución de Giemsa, cloruro de oro hidratado (\sim 52% Au), cloruro de oro hidratado (ACS, > 49% Au), solución de oro, coloidal, Hemalaun, hemateína, hematoxilina, solución de hematoxilina A (de acuerdo con Weigert), solución de hematoxilina B (de acuerdo con Weigert), solución de hematoxilina (de acuerdo con Boehmer), solución de hematoxilina (de acuerdo con Delafield), solución de hematoxilina (de acuerdo con Mayer), reactivo de Hanker-Yates, solución de Hayem, hesperidina, indigocarmina, cloruro de indio (lII) hidrato, cloruro de indio (III) anhidro, cloruro de yodonitrotetrazolio, solución de iso-cloridazón, Janus GreenB, dicromato potásico, hexahidrodroxoantimonato potásico (V), permanganato potásico, permanganato potásico, (Hg < 0,000005%, ACS), solución de carmín amoniacal (de acuerdo con Best), solución de carmín ácida (de acuerdo con Mayer), rojo rápido nuclear, rojo Congo, indicador, rojo de cresol, acetato de violeta de cresilo, indicador violeta de cristal, solución de violeta de cristal, solución de azul de lactofenol, nitrato de lantano hexahidrato, Light Green SF Yellowish, Lipid Crimson, carbonato de litio, solución de lugol, oxalato verde de malaquita, solución de May-Grünwald, amarillo de metanilo, azul de metileno, sal doble de cloruro de cinc, azul de metileno, concentrado de azul metileno (de acuerdo con Ehrlich), solución alcalina de azul de metileno (de acuerdo con Löffler), sal doble de cinc de verde de metileno, verde de metilo, naranja de metilo, violeta de metilo, Morin, mucicarmina, N-(4-amino-2,5-dietoxifenil)benzamida, N,N-dimetilanilina, N,N-dimetil-p-toluidina, acetato de naftol AS, naftol AS-BI-beta-D-glucurónido, (los siguientes derivados de naftol son sustratos enzimáticos (AP)) sal disódica de naftol AS-BI-fosfato heptahidrato, naftol AS-BI-fosfato, naftol AS-BI-fosfato, naftol AS-BS-fosfato, naftol AS-cloroacetato, naftol AS-D-acetato, naftol AS-D-cloroacetato, naftol AS-E-acetato, naftol AS-E-fosfato, naftol AS-MX-acetato, sal disódica de naftol AS-MX-fosfato no hidrato, naftol AS-MX-fosfato, para histología, naftol AS-fosfato, para histología, naftol AS-TR-fosfato, naftol AS-TR-fosfato, naftol Blue Black, naftol Yellow S, naftol Green B y complexometría, tungstato sódico de dihidrato, aceite de clavo, cloruro de neotetrazolio, New Coccine, Fucsina Nueva, nuevo azul de metileno N, rojo neutro, alcohol de nigrosina B soluble, nigrosina soluble en agua, azul de Nilo A, cloruro de azul de Nilo, ninhidrina, ninhidrina, amarillo de nitrazina, cloruro de azul de nitrotetrazolio, cloruro de azul de nitrotetrazolio, clor. de azul de nitrotetrazolio, naranja G, solución de naranja G (alcohólica), orceína, orceína, cloruro de paladio(II) anhidro, óxido de paladio(lI) hidratado, parafucsina, hidrocloruro de parafucsina, peroxidasa de rábano picante (liofilizado en polvo sin sal \sim 100 U/mg), fenosafranina, sal amónica de ácido fosfomolíbdico hidratado, hidrato de ácido fosfomolíbdico, hidrato de sal sódica de ácido fosfomolíbdico, pentóxido de fósforo, hidrato de ácido fosfotúngstico, ftalocianina, ácido pícrico humedecido con agua (H_{2}O \sim 40%), yoduro de pinacianol, óxido de platino (IV) hidratado, Ponceau BS, Ponceau S, piridina, pironina Y (G), resorufina, rodamina B, cloruro de rutenio(III) anhidro, rojo de rutenio, safranina T, solución de safranina (de acuerdo con Olt), sal de calcio de fucsina ácida, indicador de fucsina ácida, Scarlet R, reactivo de Schiff para aldehídos, plata, Codex France, coloidal, nitrato de plata, Sirius Rose BB, "Stains-all", azul de Sudán II, naranja de Sudán G, rojo de Sudán B, negro de Sudán B, cloruro de ácido de sulforrodamina B, tartrazina, cloruro de tetranitroazul tetrazolio, cloruro de azul tetrazolio, violeta de tetrazolio, nitrato de talio(I), amarillo de tiazol G, indicador de adsorción, azul de tiazolilo, bromuro de tetrazolio, tiocarbohidrazida, tioflavina T, acetato de tionina, azul de toluidina, tropaeolin 000 Nº 1, tropaeolin 000 Nº 2, azul tripán, solución de azul tripán, solución de Tuerk al 0,4%, acetato de uranilo dihidrato, nitrato de uranilo hexahidrato, sal de azul de variamina B, solución de vesuvina (de acuerdo con Neisser), Victoria Blue B, Water Blue, solución de Weigert, hidrato de ácido tungstosilícico, tinte de Wright, FF xilenocianol (indicador redox).

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Recuperación de antígeno

Para facilitar el reconocimiento específico en tejidos fijos, a menudo es necesario recuperar o desenmascarar las dianas por medio de un pretratamiento de las muestras para aumentar la reactividad de la mayoría de las dianas. Este procedimiento se denomina "recuperación de antígeno", "recuperación de diana" o "recuperación de epítopo", "desenmascarado de diana" o "desenmascarado de antígeno". Puede encontrarse una revisión extensiva de la recuperación de antígeno (desenmascarado de antígeno) en Shi S-R, Cate RJ, Taylor CR. Antigen retrieval immunocytochemistry: past, present, future. J Histochem Cytochem 1997: 45(3); 327-343.

La recuperación de antígeno o recuperación de diana incluye una diversidad de métodos por medio de los cuales se maximiza la disponibilidad de la diana para la interacción con un reactivo de detección específico. Las técnicas más comunes son digestión enzimática con una enzima proteolítica (por ejemplo proteinasa, pronasa, pepsina, papaína, tripsina o neuraminidasa) en un tampón apropiado o recuperación de epítopo inducida por calor (HIER) usando irradiación de microondas, calentamiento en un horno normal, esterilización en autoclave o cocción a presión en un tampón estabilizador del pH apropiado, normalmente que contiene EDTA, EGTA, Tris-HCl, citrato, urea, glicina-HCl o ácido bórico.

Al tampón de HIER se le pueden añadir detergentes para aumentar la recuperación de epítopo o se pueden añadir al medio de dilución y/o a tampones de aclarado para reducir la unión no específica.

Además, la relación entre señal e interferencias puede aumentarse por diferentes métodos físicos, incluyendo aplicación de vacío y ultrasonidos o congelación y descongelación de las secciones antes o durante la incubación de los reactivos.

Los sitios de unión a biotina endógenos o la actividad enzimática endógena (por ejemplo, fosfatasa, catalasa o peroxidasa) pueden retirarse como una etapa en el procedimiento de tinción.

De forma similar, el bloqueo de sitios de unión inespecíficos con proteínas inertes tales como HSA, BSA, ovalbúmina, suero bovino fetal u otros sueros, o detergentes tales como Tween20, Triton X-100, Saponina, Brij o Pluronics se usa ampliamente. También se usa el bloqueo de sitios de unión inespecíficos en el tejido o las células con versiones no marcadas y no específicas diana de los reactivos específicos.

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Otras técnicas

En los procedimientos de tinción usando las denominadas "técnicas de flotación libre", una sección de tejido se pone en contacto con diferentes reactivos y tampones de lavado en suspensión o flotando libremente en recipientes apropiados, por ejemplo, tubos de microcentrífuga.

Las secciones de tejidos pueden transferirse de un tubo a otro con diferentes reactivos y tampones durante el procedimiento de tinción usando, por ejemplo, un dispositivo de "tipo anzuelo", una espátula o un anillo de vidrio.

Los diferentes reactivos y tampones también pueden cambiarse por decantación suave o succión al vacío. Como alternativa, los recipientes con las secciones de tejido pueden vaciarse en una red de tinción especial, tal como las "Netwells" de Corning y la sección de tejido puede lavarse antes de transferirse de nuevo al tubo para la siguiente etapa de tinción.

Todas las etapas del procedimiento de tinción individuales, incluyendo por ejemplo, fijación, recuperación de antígeno, lavado, incubación con reactivos de bloqueo, reactivos inmunoespecíficos y por ejemplo el desarrollo catalizado por enzimas de los tintes coloreados, se realizan mientras que la sección de tejido está flotando libremente o se mantiene en las redes. Después de revelar el tinte, la sección de tejido se monta en portaobjetos, se seca, antes de teñirse con un colorante de contraste y se cubre con un cubreobjetos antes de analizarse, por ejemplo, en un microscopio.

Ocasionalmente, la sección de tejido se monta en portaobjetos después de la incubación crítica con los reactivos inmunoespecíficos. El resto del proceso de tinción después se realiza en las secciones de tejido montadas en portaobjetos.

El método de flotación libre se ha usado principalmente en secciones de tejido gruesas. Es importante que las secciones nunca se sequen durante el proceso de tinción.

Las ventajas del método de flotación libre incluyen una penetración uniforme y buena de los reactivos de tinción inmunohistoquímica. El método de flotación libre permite altas concentraciones de reactivos y una buena mezcla.

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Materiales histológicos, técnicas y análisis

En general hay dos categorías de materiales histológicos. El patrón de referencia descrito en la presente memoria puede emplearse convenientemente para el análisis de cada tipo.

La primera categoría incluye preparaciones que son tejidos y/o células recientes, que generalmente no se fijan con agentes de fijación basados en aldehídos. Estas muestras comúnmente incluyen materiales de biopsia, que pueden analizarse mientras se está realizando el procedimiento quirúrgico (secciones congeladas), preparaciones citológicas (incluyendo, por ejemplo preparaciones de tacto y frotis sanguíneos), y tejidos, que deben analizarse histoquímicamente. Estas muestras se colocan directamente en un portaobjetos o cubreobjetos o se congelan y se seccionan en portaobjetos. Estas muestras después se fijan, normalmente con un agente de fijación basado en alcohol o acetona y se tiñen.

La segunda categoría más común incluye una muestra de tejido fijada e incrustada en parafina, a menudo un material de archivo. Éstas a menudo reciben el nombre de muestras "fijadas con formalina e incrustadas con parafina" (FFPE). Estas muestras se fijan, normalmente usando un agente de fijación basado en formalina, se deshidratan usando, por ejemplo, xileno, se incrustan en un medio de incrustación adecuado tal como parafina o plástico (por ejemplo, Epon, Araldite, Lowicryl, LR White o poliacrilamida), se seccionan en un portaobjetos, se desparafinan o se tratan de otra manera, se rehidratan y se tiñen.

Las muestras biológicas pueden tratarse usando las técnicas citológicas e histológicas descritas en la presente memoria antes de teñirse y compararse con el patrón de referencia.

La muestra puede purificarse o concentrarse, o las células pueden aislarse antes del análisis. La muestra también puede incrustarse en parafina y seccionarse antes del análisis. Estos procedimientos se conocen fácilmente por el especialista en la técnica.

La muestra puede montarse en un soporte. Por el término "montarse" se entiende ponerse o unirse a un soporte sustancialmente plano. Puede emplearse cualquier soporte adecuado. Se incluye la colocación de la muestra de tejido o célula sobre un soporte, por ejemplo, para visualización en un portaobjetos de microscopio. La muestra puede unirse para impedir adicionalmente que se caiga o se deslice durante la manipulación del soporte. El método de unión al soporte incluye métodos basados en la unión física, atracción capilar, adhesivos y unión química. La muestra puede estar fijada o no fijada.

En particular, el soporte puede ser un portaobjetos de vidrio, una membrana, un filtro, un portaobjetos polimérico, un portaobjetos de cámara, una placa o una placa petri.

La muestra o sus partes puede dejarse crecer o cultivarse de manera adecuada directamente en el soporte antes del análisis. Los ejemplos de medios de cultivo adecuados incluyen medios de cultivo de origen biológico tales como suero sanguíneo o extracto de tejido; medio sintético definido químicamente o mezclas de los mismos. Los cultivos de células normalmente se desarrollan como capas individuales de células sobre, por ejemplo, una superficie de vidrio o plástico, en matraces o en portaobjetos de cámaras, o como una suspensión en un medio líquido o semisólido. Las células pueden transferirse y montarse sobre un soporte más adecuado, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio. Si se cultiva sobre un portaobjetos de cámara, que es adecuado, por ejemplo, para la visualización en un microscopio, las células pueden permanecer en el soporte.

Sin embargo, las células no necesitan cultivarse o dejarse crecer antes del análisis. A menudo, la muestra se analizará directamente sin cultivo. Debe entenderse que las muestras para el análisis directo pueden experimentar los procedimientos de procesamiento descritos anteriormente.

La muestra puede, directamente o después de haberse sometido a una o más etapas de procesamiento, analizarse principalmente en dos tipos de métodos principales, métodos in situ (análisis in situ) y métodos in vitro (análisis in vitro).

En este contexto, los métodos in situ deben entenderse como ensayos en los que se conserva esencialmente la morfología de las células de la muestra. Por "esencialmente conservado" se entiende que se conserva la morfología global, haciendo posible identificar algunas o todas las composiciones estructurales del tejido o las células. Son ejemplos análisis de frotis, biopsias, preparaciones de tacto y extensión de la muestra sobre el soporte. Las muestras pueden someterse, entre otras cosas, a fijación, permeabilización u otras etapas de procesamiento antes del análisis.

Los métodos in vitro deben entenderse como métodos en los que no se conserva la morfología global. En el caso de los métodos in vitro, la muestra se somete a un tratamiento que altera la morfología de la estructura celular. Estos tratamientos son conocidos para el especialista en la técnica e incluyen el tratamiento con disolventes orgánicos, tratamiento con reactivos caotrópicos fuertes tales como altas concentraciones de tiocianato de guanidina, tratamiento enzimático, tratamiento con detergentes, agitación con perlas, tratamiento térmico, sonicación y/o aplicación de una prensa French.

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Procedimientos detallados

La siguiente sección proporciona una descripción detallada de procedimientos para obtener muestras FFPE, así como tinción con anticuerpos y detección. Se recoge de los libros de texto de referencia Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855.

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Preparación de Paraformaldehído

Se estabilizan soluciones comerciales al 37% convencionales de formaldehído con metanol al 10-15% para inhibir la polimerización del formaldehído en paraformaldehído. Para la mayoría de los agentes de fijación, debe usarse paraformaldehído en lugar del formaldehído comercial. El paraformaldehído se disuelve en agua, liberando formaldehído en el proceso. Para preparar una solución al 4% de paraformaldehído, añadir 8 g a 100 ml de agua. Calentar a 60ºC en una campana extractora de humos. Añadir unas cuantas gotas de NaOH para ayudar a la disolución. Cuando se ha disuelto completamente el sólido, dejar a enfriar la solución a temperatura ambiente y añadir 100 ml de PBS 2x. Esta solución madre debe prepararse diariamente.

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Preparación de Secciones de Tejido Incrustadas en Parafina

1. Cortar bloques pequeños de aproximadamente 1 cm^{2} x 0,4 cm. 2. Colocar en paraformaldehído el 4% recién preparado o agente de fijación de Bouin (para preparar 1 l, disolver 2 g de ácido pícrico en 500 ml de agua desionizada. Filtrar a través de Whatman Nº 1 o equivalente. Añadir 20 g de paraformaldehído y calentar a 60ºC en una campana extractora de humos. Añadir unas cuantas gotas de NaOH 1 N para disolver. Enfriar y añadir 500 ml de PBS 2x.
3. Incubar durante un periodo de 2 horas a una noche. 4. Seguir procedimientos de incrustación en parafina convencionales. 5. Recoger secciones de 4 \mum en portaobjetos de vidrio limpios. 6. Poner en una estufa a 60ºC durante 30 minutos. 7. Quitar la cera en xileno. Cambiar dos veces, durante 3 minutos cada vez. 8. Rehidratar pasando a través alcoholes graduados (dos cambios, etanol absoluto, 3 minutos cada uno, seguido de dos cambios, etanol al 95%, 3 minutos cada uno). 9. Aclarar en agua.

A continuación pueden aplicarse los anticuerpos a la muestra, como se describe más adelante.

Cuando se van a usar métodos de detección de marcaje con peroxidasa, puede ser necesario bloquear o inhibir la actividad enzimática endógena dentro de la muestra antes de la aplicación de anticuerpo. Para bloquear la actividad peroxidasa endógena, la muestra se incuba con una solución de 4 partes de metanol a una parte de peroxido de hidrógeno al 3% durante 20 minutos. El peróxido de hidrógeno generalmente se suministra como una solución al 30% y debe almacenarse a 4ºC, en condiciones en las que durará aproximadamente un mes. Para muestras que contienen altas actividades de peroxidasa, tales como bazo o médula ósea, pueden obtenerse mejores resultados usando una solución de hidrocloruro de fenilhidrazina al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

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Fijación

Todos los protocolos de fijación deben (1) prevenir la fuga de antígeno, (2) permeabilizar la célula para permitir el acceso del anticuerpo, (3) mantener el antígeno en tal forma que pueda reconocerse eficazmente por el anticuerpo y (4) mantener la estructura celular.

Comúnmente se usa una amplia serie de agentes de fijación y la elección correcta del método dependerá de la naturaleza del antígeno a examinar y de las propiedades de la preparación de anticuerpo. Los métodos de fijación generalmente se clasifican en dos categorías, disolventes orgánicos y reactivos de reticulación. Los disolventes orgánicos tales como alcoholes y acetona eliminan los lípidos y deshidratan las células, precipitando las proteínas en la arquitectura celular. Los reactivos de reticulación forman enlaces intermoleculares, normalmente por medio de grupos amino libres, creando de esta manera una red de antígenos unidos. Los dos métodos pueden desnaturalizar antígenos de proteína y por esta razón los anticuerpos preparados contra las proteínas desnaturalizadas pueden ser más útiles para la tinción de células. En algunos casos, los anticuerpos anti-proteínas desnaturalizadas son los únicos que pueden funcionar.

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Fijación de Células Unidas en Paraformaldehído o Glutaraldehído

La fijación en reactivos de reticulación de proteínas tales como paraformaldehído o glutaraldehído conserva la estructura celular mejor que los disolventes orgánicos, pero puede reducir la antigenicidad de algunos componentes celulares. La fijación sencilla con paraformaldehído o glutaraldehído no permite el acceso del anticuerpo a la muestra y por lo tanto se continúa por una etapa de permeabilización usando un disolvente orgánico o un detergente no iónico. Usar el disolvente orgánico es fácil, pero puede destruir ciertos elementos de la arquitectura celular, aunque la fijación previa con paraformaldehído ayuda a conservar la estructura celular. Si es importante la conservación de la estructura celular, la primera elección sería usar un detergente no iónico.

1. Antes de la tinción, preparar la solución de paraformaldehído o glutaraldehído. En el caso del paraformaldehído, preparar una solución al 4%. En el caso del glutaraldehído, preparar una solución al 1% (calidad de microscopio electrónico) en PBS. Precaución, el glutaraldehído es tóxico. Trabajar en una campana extractora de humos. 2. Lavar el cubreobjetos, portaobjetos o placa suavemente en PBS. 3. En el caso del paraformaldehído, incubar en una solución al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente. En el caso del glutaraldehído, incubar en una solución al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente en una campana extractora de humos. 4. Lavar las células dos veces con PBS. En esta etapa, las células fijadas con glutaraldehído pueden retirarse de la campana extractora de humos. 5. Permeabilizar las células fijadas por incubación en cualquier de los siguientes: (i) Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 2 minutos a temperatura ambiente. Algunos antígenos pueden necesitar un periodo tan prolongado como de 15 minutos. Comprobar esto para cada antígeno; (ii) metanol durante 2 minutos a temperatura ambiente; o (iii) acetona durante 30 segundos a temperatura ambiente (en el caso de células cultivadas en placas de cultivo de tejidos, usar acetona al 50%/metanol al 50%). (Opcional) En el caso del glutaraldehído, bloquear los grupos aldehídos reactivos libres por incubación con etanolamina 0,2 M pH 7,5 durante 2 horas a temperatura ambiente o incubando con tres cambios de 5 minutos cada uno con 0,5 mg/ml de borohidruro sódico en PBS. En algunos casos esto también puede ayudar a las células fijadas con paraformaldehído, pero en general no es necesario. 6. Aclarar suavemente en PBS con cuatro cambios durante 5 minutos.

La muestra ahora está lista para la aplicación de anticuerpos, como se describe más adelante.

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Desenmascarado de los Epítopos Ocultos con Proteasas

La fijación en formaldehído o glutaraldehído puede enmascarar o cambiar algunos epítopos. A menudo, estos epítopos pueden volverse a exponer por medio de una incubación suave de la muestra en proteasas. La tripsina funciona bien. Incubar la muestra en solución de tripsina al 0,1%, CaCl_{2} al 0,1%, Tris 20 mM pH 7,8 durante 2-20 minutos a temperatura ambiente. Detener la digestión aclarando la muestra bajo agua corriente fría durante 5 minutos.

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Unión de Anticuerpos a Células Acopladas

Los anticuerpos generalmente se aplican de forma directa al área de las células de los tejidos que se están estudiando.

1. Las células se fijan y se lavan. Poner los cubreobjetos, portaobjetos o placas en una cámara humidificada. Los portaobjetos o cubreobjetos pueden ponerse en una placa petri que contiene un filtro saturado con agua. Lo mejor es poner los cubreobjetos en una capa de parafilm; esto ayuda a impedir que la solución de anticuerpo enrolle el borde del cubreobjetos y permite coger los cubreobjetos con pinzas finas, ya que el parafilm se puede comprimir. 2. Añadir la primera solución de anticuerpo. Todas las diluciones deben realizarse en soluciones que contienen proteína. Por ejemplo, usar PBS que contiene BSA al 3%. En el caso de anticuerpos primarios no marcados: Lo mejor es aplicar anticuerpos monoclonales como sobrenadantes de cultivo de tejido (concentración específica de anticuerpo de 20-50 mg/l, usar en estado puro). Los líquidos ascíticos, anticuerpos monoclonales y policlonales purificados y sueros policlonales brutos deben ensayarse en una serie de diluciones destinadas a producir concentraciones de anticuerpo específicas comprendidas entre 0,1 y 10 mg/l. Si se desconoce la concentración específica de anticuerpo de la muestra de anticuerpo, preparar y ensayar diluciones 1/10, 1/100, 1/1000 y 1/10.000 del material de partida. En el caso de anticuerpos primarios marcados: los anticuerpos primarios pueden marcarse con enzimas, fluorocromos o yodo. Deben ensayarse a varias diluciones en ensayos preliminares para determinar el intervalo correcto de trabajo. Las concentraciones demasiado elevadas producirán altos niveles de fondo; una concentración demasiado baja dependerá de la abundancia de antígeno en estudio y de la especificidad del anticuerpo. 3. Incubar los cubreobjetos, portaobjetos o placas durante un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente en la cámara humidificada. Para algunas reacciones, las incubaciones prolongadas de hasta 24 horas pueden aumentar la sensibilidad. 4. Lavar en tres cambios de PBS durante 5 minutos. Este tampón
puede suplementarse con Triton X-100 al 1% o NP-40 para ayudar con cualquier problema del efecto de fondo.

Si el primer anticuerpo está marcado, la muestra está lista para la etapa de detección. En caso contrario:

5. Aplicar el reactivo secundario marcado. Es esencial realizar todas las diluciones en una solución que contiene proteína tal como BSA al 3% en PBS o inmunoglobulina al 1% en PBS (preparada a partir de la misma especie que el reactivo de detección). Los reactivos secundarios útiles incluyen anticuerpos anti-inmunoglobulina, proteína A o proteína G. Pueden marcarse con enzimas, fluorocromos, oro o yodo. Los reactivos secundarios marcados pueden adquirirse en varios proveedores o pueden prepararse. En el caso de reactivos marcados con enzimas: Si se usa una preparación comercial, ensayar diluciones de los anticuerpos secundarios 1/50 a 1/1000. Los reactivos marcados con fosfatasa alcalina deben manipularse usando solución salina tamponada con Tris, no PBS. En el caso de los reactivos marcados con fluorocromo: Si se usan preparaciones comerciales, ensayar diluciones comprendidas entre 1/10 y 1/300. En el caso de los reactivos marcados con oro: Lavar las partículas de oro una vez en PBS. Diluir en PBS que contiene gelatina al 1% y añadir a la muestra. En el caso de los reactivos marcados con yodo: Añadir el anticuerpo yodado a aproximadamente 0,1 mg/l. Normalmente se usan actividades específicas entre 10 y 100 Ci/g.

6. Incubar con el reactivo secundario marcado durante un mínimo de 20 minutos a temperatura ambiente en la cámara humidificada. Para los reactivos marcados con oro, observar periódicamente bajo el microscopio hasta que se obtenga una señal satisfactoria. 7. Lavar en tres cambios de PBS (o Tris-solución salina) durante 5 minutos.

La muestra ahora está lista para la etapa de detección.

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Detección Usando Reactivos Marcados con Enzimas

Los reactivos marcados con enzimas se detectan usando sustancias cromogénicas solubles que precipitan después de la acción enzimática, produciendo un producto coloreado insoluble en el sitio de localización enzimática (Avrameas y Uriel 1966; Nekane y Pierce 1967 a,b; Avrameas 1972). Para cada enzima se dispone de una serie de sustratos y los siguientes protocolos representan algunas de las alternativas más útiles. En el mercado están disponibles una amplia serie de reactivos conjugados o pueden prepararse como se ha descrito. Las enzimas pueden acoplarse a anticuerpos anti-inmunoglobulina, proteína A, proteína G, avidina o estreptavidina.

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Reactivos Marcados con Peroxidasa de Rábano Picante

Una serie de sustratos son útiles, incluyendo diaminobencidina, cloronaftol y aminoetilcarbazol. En realizaciones preferidas, está indicado el uso de diaminobencidina.

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Diaminobencidina

La diaminobencidina (DAB) es el sustrato usado más comúnmente y uno de los más sensibles para la peroxidasa de rábano picante. Produce un producto de color pardo intenso que es insoluble tanto en agua como en alcohol. La tinción con DAB es compatible con una amplia serie de tintes histológicos comunes.

1. Disolver 6 mg de DAB (usar tetrahidrocloruro de DAB) en 10 ml de tampón Tris 0,05 M pH 7,6. 2. Añadir 0,2 ml de solución al 3% de H_{2}O_{2} en H_{2}O. El H_{2}O_{2} generalmente se suministra como una solución al 30% y debe almacenarse a 4ºC, temperatura a la que durará aproximadamente un mes. 3. Si aparece un precipitado, filtrar a través de un papel de filtro Whatman Nº 1 (o equivalente). 4. Aplicar a la muestra e incubar durante 1-20 minutos. Detener la reacción por lavado en agua. (Opcional) Teñir con un colorante de contraste si es necesario. 5. Montar en DPX.

Diaminobencidina/Metal

El sustrato de diaminobencidina para la peroxidasa de rábano picante puede hacerse más sensible añadiendo sales metálicas tales como cobalto o níquel a la solución de sustrato. El producto de reacción es de color gris pizarra a negro y los productos son estables tanto en agua como en alcohol. La tinción con DAB/Metal es compatible con una amplia serie de tintes histológicos comunes.

1. Disolver 6 mg de DAB (usar tetrahidrocloruro de DAB) en 9 ml de tampón Tris 0,05 M pH 7,6. 2. Añadir 1 ml de una solución madre al 0,3% p/v de cloruro de níquel en H_{2}O (como alternativa, puede usarse la misma cantidad de cloruro de cobalto). 3. Añadir 0,1 ml de una solución al 3% de H_{2}O_{2} en H_{2}O. El H_{2}O generalmente se suministra como una solución al 30% y debe almacenarse a 4ºC, condiciones a las que durará aproximadamente 1 mes. 4. Si aparece un precipitado, filtrar a través de un papel de filtro Whatman Nº 1 (o equivalente). 5. Aplicar a la muestra e incubar durante 1-20 minutos. Detener la reacción por lavado en H_{2}O. (Opcional) Teñir con un colorante de contraste si es necesario. 5. Montar en DPX.

Acoplamiento

La entidad detectable puede unirse o acoplarse a la partícula compacta por varios métodos. Por ejemplo, la entidad detectable puede acoplarse a la partícula compacta por medio del uso de bromuro de cianógeno.

Se usan agentes de reticulación química para modificar covalentemente proteínas para estudiar interacciones de ligando-receptor, cambios conformacionales en la estructura terciaria para el marcaje con proteínas. Los agentes de reticulación se dividen en agentes de reticulación homobifuncionales que contienen dos grupos reactivos idénticos, o agentes de reticulación heterobiduncionales, con dos grupos reactivos diferentes. Los agentes de reticulación heterobifuncionales permiten conjugaciones secuenciales, minimizando la polimerización.

Homobifuncional

1

2

3

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Heterobifuncional

4

5

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Cada uno de estos reactivos puede obtenerse a partir de varios fabricantes, por ejemplo, de Calbiochem (Nº de código en la columna 2) o Pierce Chemical Company.

La partícula compacta puede activarse antes del acoplamiento para aumentar su reactividad. En realizaciones preferidas, la partícula compacta se activa usando ácido cloroacético seguido de acoplamiento usando EDAC/NHS-OH. Las partículas compactas también pueden activarse usando diisocianato de hexano para proporcionar grupos amino primarios. Dichas partículas compactas activadas pueden usarse en combinación con cualquier agente de reticulación heterobifuncional. En ciertas realizaciones, la partícula compacta se activa usando divinil sulfona. Estas partículas compactas activadas comprenden restos que pueden reaccionar con grupos amino o tiol, en un péptido, por ejemplo.

La partícula compacta también puede activarse usando cloruro de tresilo, dando restos que son capaces de reaccionar con grupos amino o tiol. La partícula compacta también puede activarse usando cloruro de cianógeno, dando restos que pueden reaccionar con grupos amino o tiol

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Acoplamiento de péptidos

En realizaciones preferidas, la entidad detectable comprende un péptido. El acoplamiento de péptidos a una partícula compacta se describe con más detalle en esta sección.

Los péptidos pueden obtenerse por métodos de síntesis en fase sólida. La primera etapa de la técnica, introducida por primera vez por Merrifield (R.B. Merrifield, Solid Phase Peptide Sythesis. The synthesis of a Tetrapeptide., J. A. Chem. Soc. 85, página 2149-2154, (1963) y R.B. Merrifield, Solid Phase Synthesis, Science 232, página 341-347, (1986)) consiste en el ensamblaje de la cadena peptídica con derivados de aminoácidos protegidos en un soporte polimérico. La segunda etapa de la técnica es la escisión del péptido del soporte con la escisión conjunta de todos los grupos protectores de la cadena lateral para dar el péptido libre bruto. Para conseguir péptidos de mayor tamaño, estos procesos pueden repetirse secuencialmente.

La flexibilidad del método permite la síntesis de péptidos largos, cortos y ramificados, incluyendo péptidos con aminoácidos naturales y no naturales, diferentes enlazadores y los denominados espaciadores. Los espaciadores típicamente son de polietilenglicol, derivados de PEG o polialcanos u homo poli aminoácidos. El método de síntesis en fase sólida permite la preparación de péptidos terminados con funcionalidades reactivas, por ejemplo tioles libres, para esquemas de acoplamientos quimioselectivos en el material de partícula compacta.

Una secuencia de aminoácidos puede repetirse en la secuencia peptídico final para aumentar la inmunorreactividad con un anticuerpo específico. La secuencia repetitiva y reactiva puede separarse con secuencias de aminoácidos irrelevantes en un péptido lineal. Además, por medio de la síntesis de construcciones de péptidos ramificados o dendríticos, tales como los péptidos antigénicos múltiples (MAP), puede mejorarse la inmunorreactividad.

Como revisión de la metodología general, incluyendo los diferentes esquemas de protección química y los soportes sólidos y solubles, véase por ejemplo, G. Barany, N. Kneib-Cordonier, D.G. Mullen, Solid-Phase peptide synthesis: A silver anniversary report, Int. J. Peptide Protein Res. 30, página 705-739, (1987), y G.B. Fields, R.L. Noble, Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids, Int. J. Peptide Protein Res. 35, página 161-214 (1990).

Otros métodos para obtener péptidos incluyen ligamiento de fragmentos enzimáticos, técnicas de ingeniería genética tales como, por ejemplo, mutagénesis dirigida. La ingeniería genética de oligonucleótidos, productos de PCR o fragmentos clonados de material de ADN que codifica secuencias de aminoácidos relevantes usando técnicas de clonación de ADN convencionales ha sido un método bien establecido para obtener polipéptidos. Como alternativa, los péptidos pueden obtenerse después del aislamiento a partir de fuentes naturales, tal como por purificación de proteínas y digestión.

La conjugación de la molécula diana (por ejemplo, péptido) puede conseguirse formando enlaces covalentes o usando pares de unión fuertes, por ejemplo enlaces iónicos, biotina-avidina. Son ejemplos de otras entidades de unión distintas de estreptavidina, avidina y derivados y biotina y análogos de biotina el dominio de cremallera de leucina de AP-1 (Jun y fos), hexa-his (resto de quelato metálico), afinidad de glutatión hexa-hat GST (glutatión S-transferasa), vancomicina trivalente, D-Ala-D-Ala, lectinas que se unen a una diversidad de compuestos, incluyendo carbohidratos, lípidos y proteínas, por ejemplo Con A (Canavalia ensiformis), concanavalina A y WGA (aglutinina de gérmen de trigo) y tetranectina o proteína A o G. Estos y otros métodos son bien conocidos para los especialistas en la técnica de la conjugación.

La conjugación covalente confiere varias ventajas, incluyendo una mayor resistencia a la degradación.

El método de acoplamiento útil para la conjugación depende de la estructura química de la diana y la partícula compacta implicada. Los reactivos químicos típicos usados son los denominados agentes de reticulación de longitud cero, y agentes de reticulación homobifuncionales, heterobifuncionales o poliméricos.

Los agentes de reticulación de longitud cero tales como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) o meto-p-toluenosulfonato de 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida (CHMC) y otras carbodiimidas pueden facilitar el acoplamiento directo entre, por ejemplo, Glu o Asp y restos de lisina y, por ejemplo, el extremo N de un péptido.

Los agentes de reticulación homobifuncionales tales como glutar(di)aldehídos, imidatos, bencidinas bis-diazotizadas, bis(imido ésteres), bis(succinimidil ésteres), diisocianatos, cloruros de diácido, divinilsulfona o similares, permite unir grupos amino o hidroxilo de forma covalente entre sí a través de una molécula enlazadora corta. El formaldehído o glutar(di)aldehído también puede facilitar la reticulación entre la partícula compacta y el péptido.

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El uso de agentes de reticulación heterobifuncionales se describe con más detalle para reticular péptidos con una partícula compacta por medio de una metodología conocida por cualquier especialista en la técnica de la
conjugación.

Los agentes de reticulación heterobifuncionales tienen la ventaja de proporcionar un mayor control sobre la reticulación que métodos que se basan, por ejemplo, en agentes de reticulación homobifuncionales.

Los esquemas más comunes para formar un heteroconjugado implican el acoplamiento indirecto de un grupo amina sobre una biomolécula a un grupo tiol presente en una segunda biomolécula, normalmente por medio de una secuencia de reacción de dos o tres etapas. La alta reactividad de los tioles y su rareza relativa en muchas biomoléculas hace que los grupos tiol sean dianas ideales para una reticulación química controlada.

Si no está presente un grupo tiol, pueden introducirse grupos tiol por varios métodos. Un método común incluye el uso de 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo (SPDP) seguido de reducción del conjugado de 3-(2-piridilditio)propionilo con DTT o TCEP. La reducción libera el cromóforo 2-piridinationa, que puede usarse para determinar el grado de tiolación.

Como alternativa, el grado de tiolación puede medirse usando 5,5'-ditiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB, reactivo de Ellman) que produce estequiométricamente el cromóforo ácido 5-mercapto-2-nitrobenzoico tras la reacción con un grupo tiol.

Los agentes de reticulación heterobifuncionales típicamente contienen un grupo carboxilo activado en un extremo que puede reaccionar con grupos amino y un grupo maleimido o yodoacetamido en el extremo opuesto que reacciona fácilmente con el grupo sulfhidrilo de restos de cisteína.

Dos agentes de reticulación heterobifuncionales usados con frecuencia son éster de N-gamma-maleimidobutiriloxisuccinimida (GMBS) y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carbonato de succinimidilo (SMCC).

Debe entenderse que el agente de reticulación puede contener un resto reactivo fotoactivado. El resto fotorreactivo actúa como grupo reactivo enmascarado. Por medio del uso de un método de acoplamiento fotoactivo, es posible llevar a la molécula diana a una parte específica, por ejemplo, de la partícula compacta antes de usar el grupo fotorreactivo para el acoplamiento covalente.

Típicamente, el péptido se sintetiza con un solo resto de cisteína en el extremo N- o C-. Como alternativa, pueden usarse los restos internos de Cys o restos de Cys en un enlazador. Si el péptido no contiene ningún grupo tiol, pueden introducirse uno o más de estos grupos usando uno de varios métodos de tiolación, típicamente modificando uno de los grupos amino.

Debe entenderse que el acoplamiento de sondas dianas, tales como, por ejemplo, péptidos, no se limita por el uso de esquemas de acoplamiento selectivo de tiol.

Otros restos químicos útiles para esquemas de conjugación quimioselectiva o aleatoria incluyen grupos carboxilo, hidroxilo, aromáticos, fenólicos o amino. Los grupos amino son especialmente útiles ya que son muy reactivos a valores de pH relevantes, pueden formar enlaces químicos fuertes y están ampliamente distribuidos en el material biológico.

La posibilidad de emplear esquemas de conjugación usando el grupo amino en el extremo N- de péptidos, incluyendo el grupo amino en la cadena lateral de lisina o polilisina, tiene una especial relevancia para las composiciones y métodos descritos en la presente memoria.

El agente de reticulación primero se hace reaccionar con los grupos amino en la partícula compacta, seguido de la eliminación del agente de reticulación sin reaccionar usando, por ejemplo, decantación o centrifugación. El vehículo activado después se hace reaccionar con el péptido que contiene Cys. El exceso de péptido se retira usando, por ejemplo, una columna de desalificación, diálisis, filtración o centrifugación. La cantidad de péptido o agente de reticulación unido puede evaluarse por diversos métodos analíticos directos o indirectos.

La secuencia de conjugación puede invertirse uniendo primero el agente de reticulación heterobifuncional al péptido, antes de unirlo a tioles en la partícula compacta.

Durante la reacción de conjugación, los tioles libres a menudo se protegen frente a la oxidación espontánea por la adición de EDTA, EGTA o tributilfosfina o similar o por medio del uso de una atmósfera protectora.

Otros métodos de reticulación covalente incluyen el uso de agentes de reticulación poliméricos homo o heterofuncionales. Los ejemplos de reactivos incluyen dextranos activados con tresilo o vinilsulfona o polímeros o derivados de ácido poliacrílico activados. Especialmente se prefiere el divinilo para la activación de, por ejemplo, grupos hidroxilo en partículas compactas, ya que la segunda vinilsulfona resultante es muy reactiva con los tioles.

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La cantidad de péptido acoplado puede determinarse por varios métodos, incluyendo la incorporación de un resto de beta-alanina inmediatamente adyacente al resto de cisteína en el péptido. Después puede usarse un análisis de aminoácidos para determinar la cantidad de beta-alanina presente después de la purificación del conjugado resultante.

Los agentes de reticulación pueden ofrecer la posibilidad de incluir un indicador o resto detectable. Este resto puede usarse para medir la cantidad de agente de reticulación unido a la biomolécula. El indicador puede ser fluorescente, radiactivo, un hapteno o cualquier otra molécula detectable.

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Polímeros

El medio de incrustación puede producirse por polimerización de monómeros como se describe con detalle en esta sección.

Los polímeros hechos a partir de monómeros polimerizables tienen amplias aplicaciones. Por ejemplo, los polímeros se usan como aditivos para aplicaciones de recubrimiento tales como pinturas y adhesivos.

Los polímeros se preparan por polimerización de uno o más tipos de monómeros polimerizables, tales como polimerización en emulsión, polimerización en solución, polimerización en suspensión o polimerización en masa. El monómero o monómeros pueden polimerizarse en presencia de ingredientes opcionales tales como uno cualquiera de emulsionantes, estabilizantes, agentes tensioactivos, iniciadores (tales como fotoiniciadores), inhibidores, dispersantes, agentes oxidantes, agentes reductores, modificadores de la viscosidad, catalizadores, aglutinantes, activadores, aceleradores, espesantes, plastificantes, agentes de saponificación, agentes de transferencia de cadena, tensioactivos, cargas, colorantes, sales metálicas y disolventes.

Hay numerosas referencias sobre la polimerización de monómeros polimerizables. Por ejemplo, pueden encontrarse algunas enseñanzas en "Emulsion Polymerization: Theory and Practice" por D.C. Blackley (publicado por Wiley en 1975) y "Emulsion Polymerization" por F.A. Bovey et al. (publicado por Interscience Publishers en 1965). Por ejemplo, un polímero puede prepararse a partir de monómeros tales como acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de butilo, acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de decilo, metacrilato de metilo, metacrilato de etilo, metacrilato de butilo, estireno, butadieno, etileno, acetato de vinilo, ésteres de vinilo, ácidos monocarboxílicos terciarios C_{9}, C_{10} y C_{11}, cloruro de vinilo, vinil piridina, vinil pirrolidina, cloruro de vinilideno, acrilonitrilo, cloropreno, ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido itacónico, ácido maleico y ácido fumárico.

Pueden encontrarse ejemplos de enseñanzas adicionales sobre la polimerización de monómeros polimerizables en "Vinyl and Related Polymers" por C.E. Schildkenecht (New York: John Wiley & Sons 1952) y "Monomeric Acrylic Esters" por E. H. Riddle (New York: Reinhold Publishing Corp. 1954) y por A.G. Alexander (J Oil Colour Chemists' Association [1962] 45 12) y G.G. Greth. y J.E. Wilson (J Appl Polymer. Sci [1961] 5 135).

Pueden encontrarse enseñanzas más recientes en relación con los métodos de polimerización en los documentos EP-A-0622378, EP-A-0634428, EP-A-0623632, EP-A-0635522, EP-A-0633273, EP-A-0632157, EP-A-0630908, EP-A-0630641, EP-A-0628614, EP-A-0628610, EP-A-0622449, EP-A-062430 y EP-A-0625529.

Por el término "agente de reticulación" se entiende un compuesto que aumenta el grado de reticulación de un monómero durante la polimerización en comparación con la polimerización del monómero en ausencia del agente de reticulación.

Los monómeros pueden proporcionarse en forma de una composición polimerizable. La composición polimerizable también puede comprender componentes adicionales convencionales tales como uno cualquiera o más de los siguientes: emulsionantes, estabilizantes, agentes tensioactivos, iniciadores (tales como fotoiniciadores), inhibidores, dispersantes, agentes oxidantes, agentes reductores, modificadores de la viscosidad, catalizadores, aglutinantes, activadores, aceleradores, adherentes, plastificantes, agentes de saponificación, agentes de transferencia de cadena, agentes de reticulación, surfactantes, cargas, colorantes, sales metálicas y disolventes.

A modo de ejemplo, los tensioactivos y dispersantes pueden ser sales de colofonia grasa y ácidos nafténicos, productos de condensación de ácido naftalenosulfónico y formaldehído de bajo peso molecular, polímeros y copolímeros carboxílicos del equilibrio hidrófilo-lipófilo apropiado, alquil sulfatos superiores tales como lauril sulfato sódico, alquil aril sulfonatos tales como dodecil benceno sulfonato, isopropilbenceno sulfonatos e isopropilnaftaleno sulfonatos sódicos o potásicos; sulfosuccinatos, tales como dioctilsulfosuccinato sódico o alquil sulfosuccinatos superiores de metales alcalinos, por ejemplo, octal sulfosuccinato sódico, N-metil-N-palmotoil taurato sódico, oleil isetionato sódico, sales de metales alcalinos de alquilarilpolietoxietanol sulfatos o sulfonatos, por ejemplo, t-octilfenoxi-polietoxietil sulfato sódico que tiene de 1 a 5 unidades de óxido de etileno. Los inhibidores de la polimerización típicos que pueden usarse incluyen hidroquinona, monometil éter, benzoquinona, fenotiazina y azul de metileno.

En una realización preferida, el colorante se selecciona entre el grupo consistente en: 2-hidroxibenzofenona, oxidiazoles, ácido salicílico, monobenzoato de resorcinol, benzotriazol, preferiblemente 2H-benzotriazol, benzotiazolazina, preferiblemente 2N-benzotiazolazina, ácido \alpha-ciano-\beta-fenilcinámico, polialquilpiperidina y derivados de los mismos.

Preferiblemente, el colorante se selecciona entre benzotriazol, en particular 2H-benzotriazol y derivados del mismo.

La composición puede comprender uno o más comonómeros adicionales. Los ejemplos de dichos uno o más comonómeros adicionales que pueden usarse incluyen uno de los siguientes: (alquil y cicloalquil) acrilatos; (alquil y cicloalquil) metacrilatos; ácidos olefínicos polimerizables de radicales libres, incluyendo derivados alcoxi-, alquilfenoxi-, alquilfenoxi-(poli óxido de etileno)-, vinil éster-, amina sustituida (incluyendo sales de amonio cuaternario de las mismas), nitrilo-, halo-, hidroxi- y sustituidos con ácido (por ejemplo fosfo- o sulfo-) de los mismos; y otros restos polimerizables etilénicamente insaturados adecuados; incluyendo combinaciones de los mismos. Preferiblemente, los grupos alquilo y cicloalquilo contiene hasta 20 átomos de carbono, por ejemplo (alquil C_{1}-C_{20} y cicloalquil C_{1}-C_{20}) acrilatos y (alquil C_{1}-C_{20} y cicloalquil C_{1}-C_{20}) metacrilatos. Con más detalle, los comonómeros típicos incluyen uno cualquiera de acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de n-propilo, acrilato de isopropilo, acrilato de n-butilo, acrilato de isobutilo, acrilato de t-butilo, acrilato de isobornilo, acrilato de pentilo, acrilato de hexilo, acrilato octilo, acrilato de iso-octilo, acrilato de nonilo, acrilato de laurilo, acrilato de estearilo, acrilato de eicosilo, acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de ciclohexilo, acrilato de cicloheptilo, metacrilato de metilo, metacrilato de etilo, metacrilato de hidroximetilo, metacrilato de hidroximetilo, metacrilato de propilo, metacrilato de n-butilo, metacrilato de t-butilo, metacrilato de isobutilo, metacrilato de pentilo, metacrilato de hexilo, metacrilato de ciclohexilo, metacrilato de 2-etilhexilo, metacrilato de isobornilo, metacrilato de heptilo, metacrilato de cicloheptilo, metacrilato de octilo, metacrilato de iso-octilo, metacrilato de nonilo, metacrilato de decilo, metacrilato de laurilo, metacrilato de eicosilo, metacrilato de dodecilo, acrilato de pentadecilo, acrilato de cetilo, acrilato de estearilo, acrilato de eicosilo, acrilato de isodecilo, estearato de vinilo, acrilato de nonilfenoxi-(óxido de etileno)_{1-20}, octadeceno, hexadeceno, tetradeceno, dodeceno, metacrilato de dodecilo, metacrilato de pentadecilo, metacrilato de cetilo, metacrilato de estearilo, metacrilato de eicosilo, metacrilato de isodecilo, metacrilato de nonilfenoxi-(óxido de etileno)_{1-20}, ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido fumárico, ácido crotónico, ácido itacónico, anhídrido fumárico, anhídrido crotónico, anhídrido itacónico, ácido maleico, anhídrido maleico, estireno, alfa-metil estireno, vinil tolueno, acrilonitrilo, metacrilonitrilo, etileno, acetato de vinilo, cloruro de vinilo, cloruro de vinilideno, acrilamida, metacrilamida, 2-cianoetil acrilato de metacrilamida, metacrilato de 2-cianoetilo, metacrilato de dimetilaminoetilo, metacrilato de dimetilaminopropilo, metacrilato de t-butilaminoetilo, acrilato de glicidilo, metacrilato de glicidilo, acrilato de glicerilo, metacrilato de glicerilo, acrilato de bencilo, metacrilato de bencilo, acrilato de fenilo, metacrilato de fenilo, vinil piridina, vinil pirrolidina, siloxanos, silanos y mezclas de los mismos. En los documentos US-A-2879178, US-A-3037006, US-A-3502627, US-A-3037969 y US-A-3497485 se describen otros monómeros polimerizables.

Los comonómeros preferidos incluyen uno cualquiera de metacrilato de glicerilo (GMA), metacrilato de (2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metilo (GMAK), metacrilato de hidroxietilo (HEMA), ácido metacrílico, ácido acrílico, GYMA, N-vinil pirrolidona, metacrilatos de alquilo (tales como metacrilatos de alquilo C_{1-20} más preferiblemente metacrilatos de alquilo C_{1-15}, más preferiblemente metacrilatos de alquilo C_{1-10}, más preferiblemente metacrilatos de alquilo C_{1-5} tal como metacrilato de metilo), acrilatos de alquilo (tales como acrilatos de alquilo C_{1-20} más preferiblemente acrilatos de alquilo C_{1-15}, más preferiblemente acrilatos de alquilo C_{1-10}, más preferiblemente acrilatos de alquilo C_{1-5} tales como acrilato de metilo), metacrilatos de arilo, acrilatos de arilo, diacetona acrilamida, acrilamida, metacrilamida, N-alquil acrilamidas (tales como N-alquil acrilamidas C_{1-20}, más preferiblemente N-alquil acrilamidas C_{1-15}, más preferiblemente N-alquil acrilamidas C_{1-10}, más preferiblemente N-alquil acrilamidas C_{1-5}, tales como metil acrilamida), N-alquil metacrilamidas (tales como N-alquil metacrilamidas C_{1-20}, más preferiblemente N-alquil metacrilamidas C_{1-15}, más preferiblemente N-alquil metacrilamidas C_{1-10}, más preferiblemente N-alquil metacrilamidas C_{1-5}, tales como metil metacrilamida) acetato de vinilo, ésteres de vinilo, estireno, otras olefinas sustituidas, N-dialquil acrilamidas (tales como N-dialquil acrilamidas C_{1-20}, más preferiblemente N-dialquil acrilamidas C_{1-15}, más preferiblemente N-dialquil acrilamidas C_{1-10}, más preferiblemente N-dialquil acrilamidas C_{1-5}, tales como N,N-dimetil acrilamida), N-dialquil metacrilamidas (tales como N-dialquil metacrilamidas C_{1-20}, más preferiblemente N-dialquil metacrilamidas C_{1-15}, más preferiblemente N-dialquil metacrilamidas C_{1-10}, más preferiblemente N-dialquil metacrilamidas C_{1-5}, tales como N,N-dimetil metacrilamida), 3-metacriloxipropil-tris(trimetilisilil-siloxi)silano (monómero de TRIS), acrilatos y metacrilatos de alquilo y arilo sustituidos con flúor (preferiblemente donde el alquilo es alquilo C_{1-20}, más preferiblemente alquilo C_{1-15}, más preferiblemente alquilo C_{1-10} más preferiblemente alquilo C_{1-5}) y combinaciones de los mismos.

Los comonómeros más preferidos incluyen uno cualquiera de metacrilato de gIicerilo (GMA), metacrilato de (2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metiIo (GMAK), metacrilato de 2-hidroxietiIo (2-HEMA), ácido metacrílico, ácido acrílico y metacrilato de glicidilo o combinaciones de los mismos.

Las listas de comonómeros también incluyen derivados sustituidos de esos monómeros, tales como monómeros halogenados, especialmente derivados de monómeros fluorados y derivados de acetal y cetal.

El monómero polimerizable de la composición y dichos unos o más comonómeros adicionales pueden seleccionarse de forma que la composición consista esencialmente en GMA y HEMA.

Puede usarse cualquier método de polimerización adecuado típico. El método preferido es la polimerización por radicales libres, térmica o iniciada por radiación UV.

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Otros aspectos

A continuación se indican aspectos y realizaciones adicionales en los siguientes párrafos numerados:

Párrafo 1. Un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el patrón de referencia un medio de soporte, preferiblemente un medio de incrustación, una partícula compacta que tiene una forma compacta soportada por el medio y una cantidad de entidad detectable unida a la partícula compacta.

Párrafo 2. Un patrón de referencia para una identidad detectable, comprendiendo el patrón de referencia una partícula compacta que tiene una forma compacta con una cantidad de entidad detectable unida a la misma, donde la partícula compacta es de origen biológico, preferiblemente celular.

Párrafo 3. Un patrón de referencia de acuerdo con el párrafo 1 ó 2, en el que una cantidad detectable de la entidad detectable está presente en una región definida en una sección transversal del patrón de referencia.

Párrafo 4. Un patrón de referencia de acuerdo con el párrafo 1, 2 ó 3, donde la entidad detectable adopta una forma compacta, preferiblemente una forma no extendida o no alargada, en el medio de soporte.

Párrafo 5. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la forma compacta es tal que la relación entre la dimensión más larga y la dimensión más corta es menor de 5:1, preferiblemente menor de 2:1.

Párrafo 6. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la forma compacta comprende una forma en partículas, uniforme o regular.

Párrafo 7. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la forma compacta comprende una forma esférica, una forma ovoide, una forma de elipse, una forma de disco, una forma de célula, una forma de píldora o una forma de cápsula.

Párrafo 8. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la entidad detectable es heteróloga con respecto a la partícula compacta.

Párrafo 9. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la entidad detectable está acoplada químicamente a la partícula compacta.

Párrafo 10. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la partícula compacta comprende una célula.

Párrafo 11. Un patrón de referencia de acuerdo con el párrafo 10, donde la célula no expresa la entidad detectable.

Párrafo 12. Un patrón de referencia de acuerdo con el párrafo 10 u 11, donde la célula se selecciona entre el grupo consistente en: un virus, una célula bacteriana, una célula eucariota, una célula de insecto, una célula animal, una célula de mamífero, una célula de ratón y una célula humana.

Párrafo 13. Un patrón de referencia de acuerdo con el párrafo 10, 11 ó 12, donde la célula comprende una célula de insecto, preferiblemente una célula Sf9, o una célula de mamífero, preferiblemente una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO).

Párrafo 14. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 9, donde la partícula compacta comprende un orgánulo.

Párrafo 15. Un patrón de referencia de acuerdo con el párrafo 14, donde el orgánulo comprende una mitocondria, un plástido, un cloroplasto o un núcleo, preferiblemente derivado de una célula como se indica en cualquiera de los párrafos 11 a 13.

Párrafo 16. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 9, donde la entidad detectable carece sustancialmente de material celular.

Párrafo 17. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 9 y 16, donde la partícula compacta comprende una microperla o una micela.

Párrafo 18. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la forma compacta tiene una dimensión menor de 100 \mum, preferiblemente menor de 50 \mum, más preferiblemente menor de 20 \mum, y aún más preferiblemente menor de 10 \mum.

Párrafo 19. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la región definida está presente en al menos una sección transversal distinta del patrón de referencia, comprendiendo preferiblemente una cantidad similar de entidad detectable.

Párrafo 20. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde el medio de soporte comprende un medio de incrustación en el que está incrustada la entidad detectable.

Párrafo 21. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la entidad detectable comprende una diana relevante desde el punto de vista del diagnóstico.

Párrafo 22. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la entidad detectable comprende un antígeno, un epítopo, un péptido, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico o dos o más o una pluralidad de cualquiera de los anteriores, o combinaciones de uno o más de los anteriores.

Párrafo 23. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la entidad detectable se selecciona entre el grupo consistente en: un hapteno, una molécula biológicamente activa, un antígeno, un epítopo, una proteína, un polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico, un virus, una partícula parecida a un virus, un nucleótido, un ribonucleótido, un desoxirribonucleótido, un desoxirribonucleótido modificado, un heterodúplex, una nanopartícula, un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido, un carbohidrato, un colorante y mezclas, fusiones, combinaciones o conjugados de los anteriores.

Párrafo 24. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, en el que la entidad detectable comprende uno cualquiera o más de los siguientes: HER2, receptor de estrógenos (ER), PR, p16, Ki-67 y proteína del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y ácidos nucleicos que lo codifican.

Párrafo 25. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la presencia y/o cantidad de la entidad detectable se puede revelar por un agente de unión, preferiblemente un agente de unión marcado.

Párrafo 26. Un patrón de referencia de acuerdo con el párrafo 25, donde el agente de unión se selecciona entre el grupo consistente en: un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo capaz de unirse de forma específica a la entidad detectable, un ácido nucleico tal como un ADN o un ARN, preferiblemente un ácido nucleico capaz de unirse de forma específica a la entidad detectable, un ácido proteína nucleico (APN), un colorante, un tinte especial, cloruro de Au, Hematoxilina-Eosina (H y E), tinte de metenamina-plata de Gomori (GMS), tinción con Ácido Peryódico-Schiff (PAS), Azul de Tricromo, Tricromo de Masson, Azul de Prusia, Giemsa, Diff-Quik, Reticulum, Rojo Congo, Azul Alcián, Steiner, AFB, PAP, Gram, Mucicarmina, Verhoeff-van Gieson, Elastic, Carbol Fucsina y tinte de Golgi.

Párrafo 27. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la presencia de la entidad detectable en una célula, tejido, órgano u organismo indica una enfermedad o una afección.

Párrafo 28. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde la región definida incluye un área de referencia, comprendiendo el área de referencia la entidad detectable en una cantidad predefinida.

Párrafo 29. Un patrón de referencia de acuerdo con el párrafo 28, donde la cantidad de la entidad detectable en el área de referencia se compara con la cantidad de la entidad detectable en una muestra para determinar la presencia, cantidad o concentración de la entidad detectable en la muestra.

Párrafo 30. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde el patrón de referencia está en forma de una caja rectangular.

Párrafo 31. Un patrón de referencia para una entidad detectable que comprende: (a) un medio de incrustación preferiblemente en una forma de caja sustancialmente rectangular; y (b) una célula con una cantidad de entidad detectable acoplada a la misma.

Párrafo 32. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, que comprende dos o más partículas compactas, teniendo, cada una, una entidad detectable unida a la misma.

Párrafo 33. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior que comprende dos o más entidades detectables diferentes, estando cada una de ellas unida a la misma o a diferentes partículas compactas.

Párrafo 34. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior que comprende dos o más partículas compactas, comprendiendo diferentes cantidades de entidad detectable en cada una.

Párrafo 35. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde una sección plana del patrón de referencia comprende una pluralidad de áreas sobre las que está presente la entidad detectable a diferentes densidades.

Párrafo 36. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, en el que una sección plana del patrón de referencia comprende un primera área que comprende la entidad detectable sustancialmente a una densidad significativa desde el punto de vista del diagnóstico.

Párrafo 37. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, que comprende además un control que comprende una partícula compacta que no comprende sustancialmente ninguna entidad detectable.

Párrafo 38. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde el medio de incrustación se selecciona entre el grupo consistente en: hielo, cera, parafina, resina acrílica, resina de metacrilato, epoxi, Epon, Araldite, Lowicryl, K4M, y LR White y Durcupan.

Párrafo 39. Un patrón de referencia para una entidad detectable que comprende un medio circundante junto con una cantidad de entidad detectable localizada en el medio circundante en una cantidad definida, donde la entidad detectable adopta una forma compacta en el medio circundante.

Párrafo 40. Una sección plana, preferiblemente una sección plana transversal, preferiblemente con un espesor sustancialmente uniforme, de un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior.

Párrafo 41. Un soporte, preferiblemente un portaobjetos tal como un portaobjetos de microscopio, que comprende una sección plana de acuerdo con el párrafo 40 montada sobre la misma.

Párrafo 42. Un kit que comprende un patrón de referencia de acuerdo con cualquier párrafo anterior, junto con un agente de unión capaz de unirse de forma específica a la entidad detectable, opcionalmente junto con instrucciones para el uso.

Párrafo 43. Un patrón de referencia, kit o sección plana de acuerdo con cualquier párrafo anterior, donde el patrón de referencia se ha teñido, preferiblemente, con un anticuerpo o una sonda de ácido nucleico.

Párrafo 44. Un kit de diagnóstico para detectar la presencia o la cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica, que comprende: (a) un patrón de referencia, una sección plana o portaobjetos de acuerdo con cualquier párrafo anterior; (b) un agente de unión capaz de unirse de forma específica a la entidad detectable; y opcionalmente (c) instrucciones para el uso.

Párrafo 45. Una combinación de un patrón de referencia, sección plana, soporte, kit o kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1-44 junto con un agente terapéutico capaz de tratar o aliviar al menos uno de los síntomas de una enfermedad o afección en un individuo.

Párrafo 46. Una combinación de acuerdo con el párrafo 45, donde el individuo se diagnostica como un individuo que padece o es susceptible de padecer la enfermedad o afección, si la cantidad de entidad detectable en la muestra biológica o componente es similar o mayor que la que está en el patrón de referencia.

Párrafo 47. Un kit de diagnóstico de acuerdo con el párrafo 44, o una combinación de acuerdo con el párrafo 45 ó 46, donde el agente de unión o el agente terapéutico comprende un anticuerpo contra la entidad detectable.

Párrafo 48. Uso de un patrón de referencia, una sección plana o un kit de acuerdo con cualquier párrafo anterior, para determinar la presencia o cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica.

Párrafo 49. Un método para comparar la cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica con un patrón de referencia, comprendiendo el método las etapas de:

párrafo (a) proporcionar una muestra biológica y obtener una primera señal indicativa de la cantidad de entidad detectable en la muestra biológica, o un componente de la misma;

párrafo (b) proporcionar un patrón de referencia, sección plana, soporte, kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de los párrafo 1 a 44;

párrafo (c) obtener una segunda señal de referencia indicativa de la cantidad de entidad detectable en el patrón de referencia o sección plana del mismo; y

párrafo (d) comparar la primera señal obtenida en (a) con la señal de referencia.

Párrafo 50. Un método de acuerdo con el párrafo 49, donde la señal detectable se selecciona entre el grupo consistente en: radiación, densidad óptica, reflectancia, radioactividad, fluorescencia y actividad enzimática.

Párrafo 51. Un método de acuerdo con el párrafo 49 o 50, donde el patrón de referencia o la sección plana del mismo se somete a la misma una o más etapas o condiciones, preferiblemente sustancialmente todas, que la muestra biológica.

Párrafo 52. Un método de acuerdo con el párrafo 49, 50 ó 51, donde el patrón de referencia o la sección plana del mismo se procesa a través de una o más, preferiblemente todas, las siguientes etapas: montaje en un portaobjetos, horneado, desparafinación, rehidratación, recuperación de antígeno, bloqueo, exposición a anticuerpo, exposición a anticuerpos primarios, exposición a una sonda de ácido nucleico, lavado, exposición a un conjugado de anticuerpo secundario-enzima, exposición a sustrato enzimático, exposición a sustrato cromogénico y tinción con colorante de contraste.

Párrafo 53. Un método o uso de acuerdo con los párrafos 48 ó 52, donde la muestra biológica comprende una célula, tejido u órgano, preferiblemente una célula, tejido u órgano de un organismo que se sospecha que padece una enfermedad o afección.

Párrafo 54. Un método para diagnosticar una enfermedad o afección en un individuo, comprendiendo el método las etapas de:

párrafo (a) obtener una muestra biológica a partir del individuo; y

párrafo (b) comparar la cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica o componente de la misma con un patrón de referencia, en un método de acuerdo con el párrafo 49.

Párrafo en el que preferiblemente el individuo se diagnostica como un individuo que padece o es susceptible de padecer la enfermedad o afección, si la cantidad de entidad detectable en la muestra biológica o componente es similar o mayor a la presente en el patrón de referencia.

Párrafo 55. Un método de tratamiento de una enfermedad o una afección en un individuo, comprendiendo el método las etapas de diagnosticar la enfermedad o afección en un individuo en un método de acuerdo con el párrafo 54, y administrar un agente terapéutico al individuo.

Párrafo 56. Un método de tratamiento de acuerdo con el párrafo 55, donde el agente terapéutico comprende un anticuerpo capaz de unirse a la entidad detectable.

Párrafo 57. Un método para evaluar la eficacia o éxito de un procedimiento, comprendiendo el método las etapas de:

párrafo (a) proporcionar un patrón de referencia de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 39, donde una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado del procedimiento;

párrafo (b) realizar el procedimiento sobre el patrón de referencia;

párrafo (c) detectar un cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable.

Párrafo 58. Un método de acuerdo con el párrafo 57, donde una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado de un procedimiento satisfactorio, detectándose dicho cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable para establecer que el procedimiento es satisfactorio.

Párrafo 59. Un método de acuerdo con párrafo 57, en el que una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado de un procedimiento no satisfactorio, detectándose dicho cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable para establecer que el procedimiento no es satisfactorio.

Párrafo 60. Un método para validar un procedimiento de acuerdo con el párrafo 57, 58 ó 59, donde el procedimiento se selecciona entre el grupo consistente en: un procedimiento de hibridación in situ, un procedimiento inmunohistoquímico, de desparafinación, recuperación de antígeno, bloqueo, bloqueo de biotina endógena, bloqueo de enzima endógena, una etapa de lavado, incubación con un agente de revelado tal como un anticuerpo primario, incubación con componentes de visualización secundarios, tinción con cromógeno y adquisición y análisis de información de
tinción.

Párrafo 61. Un método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 57 a 60, donde el procedimiento es un procedimiento de recuperación de antígeno y donde la propiedad detectable de la entidad detectable comprende el enmascarado o desenmascarado de uno o más epítopos.

Párrafo 62. Un método de acuerdo con cualquiera de los párrafo 57 a 61, donde la entidad detectable en el patrón de referencia se modifica para enmascarar uno o más epítopos, estando algunos o todos de dichos epítopos desenmascarados en un procedimiento de recuperación de antígeno que es satisfactorio.

Párrafo 63. Un método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 57 a 60, donde el procedimiento es un procedimiento de desparafinación y donde la propiedad detectable de la entidad detectable comprende la presencia o cantidad de entidad detectable en el patrón de referencia después del procedimiento de desparafinación.

Párrafo 64. Un método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 57 a 60 y 63, donde la entidad detectable en el patrón de referencia es soluble en el medio de desparafinación, y donde al menos una parte, preferiblemente toda la entidad detectable se retira después de un procedimiento de desparafinación satisfactorio.

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Párrafo 65. Uso de un patrón de referencia como se indica en cualquier párrafo anterior, como un patrón de validación de recuperación de antígeno, un patrón de desparafinación, un patrón de validación de bloqueo, un patrón de validación de lavado, un patrón de validación de anticuerpo primario, un patrón de validación de anticuerpo secundario, un patrón de calibración o un patrón de diagnóstico.

Párrafo 66. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de soporte, preferiblemente un medio de incrustación; (b) proporcionar una partícula compacta que tiene una forma compacta; (c) unir una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta y (d) soportar o incrustar la partícula compacta en el medio.

Párrafo 67. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar una partícula compacta de origen biológico, preferiblemente celular, y unir una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta.

Párrafo 68. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método soportar una partícula compacta que tiene una forma compacta y una cantidad de entidad detectable unida a la misma en un medio de soporte.

Párrafo 69. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de incrustación; (b) formar una cantidad de entidad detectable en una forma generalmente compacta por unión a una partícula compacta; y (c) incrustar la entidad detectable en el medio de incrustación.

Párrafo 70. Un método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 66 a 69, que comprende además unir una cantidad de una segunda entidad detectable a la partícula compacta o a una segunda partícula compacta.

Párrafo 71. Un método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 66 a 70, que comprende además unir una segunda cantidad diferente de la o cada entidad detectable a la o cada partícula compacta.

Párrafo 72. Un método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 66 a 71, donde el medio de soporte comprende un medio de incrustación y la o cada partícula compacta se soporta por incrustación en el medio de incrustación.

Párrafo 73. Un método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 66 a 72, donde la o cada entidad detectable se acopla covalentemente a su partícula compacta respectiva.

Párrafo 74. Un patrón de referencia para una entidad detectable, que comprende una entidad detectable unida a una célula y soportada por un medio de soporte.

Párrafo 75. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de proporcionar una célula, unir o acoplar covalentemente una cantidad de entidad detectable a la célula, e incrustar la célula en un medio de incrustación.

Párrafo 76. Un patrón de referencia de acuerdo con el párrafo 74 o un método de acuerdo con el párrafo 75, donde la célula no expresa la entidad detectable.

Párrafo 77. Un método o patrón de referencia de acuerdo con el párrafo 74, 75 ó 76, donde la célula se selecciona entre el grupo consistente en: un virus, una célula bacteriana, una célula eucariota, una célula de insecto, preferiblemente una célula Sf9, una célula animal, una célula de mamífero, preferiblemente una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO), una célula de ratón y una célula humana.

Párrafo 78. Una célula artificial u orgánulo que comprende una entidad detectable unida a una partícula compacta que tiene una forma compacta.

Párrafo 79. Un método para obtener una célula artificial u orgánulo que comprende una entidad detectable, comprendiendo el método proporcionar una partícula compacta que tienen una forma compacta y unir una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta.

Párrafo 80. Una célula modificada u orgánulo que comprende una entidad detectable acoplada a una célula, o a un componente de la misma, que preferiblemente no expresa la entidad detectable.

Párrafo 81. Un método para obtener una célula modificada u orgánulo que comprende una entidad detectable, comprendiendo el método proporcionar una célula o un componente de la misma que no expresa la entidad detectable y acoplar una cantidad de entidad detectable a la célula o al componente.

Párrafo 82. Un método para establecer una distribución celular de entidad detectable en un patrón de referencia, comprendiendo el método proporcionar una célula o un componente de la misma que no expresa una entidad detectable, acoplar una cantidad de entidad detectable a la célula o componente y soportar la célula o componente en un medio de soporte.

Párrafo 83. Un patrón de referencia sustancialmente como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, con referencia a y como se muestra en los dibujos adjuntos.

Párrafo 84. Una sección plana preferiblemente con un espesor sustancialmente uniforme de un patrón de referencia sustancialmente como se ha descrito anteriormente en la presente memoria con referencia a y como se muestra en los dibujos adjuntos.

Párrafo 85. Uso de un patrón de referencia o una sección plana para determinar la presencia o cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica, siendo dicho uso sustancialmente como se ha descrito anteriormente en la presente memoria con referencia a y como se muestra en los dibujos adjuntos.

Párrafo 86. Un método para determinar la cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica sustancialmente como se ha descrito anteriormente en la presente memoria con referencia a y como se muestra en los dibujos adjuntos.

Párrafo 87. Un método de diagnóstico de una enfermedad o una afección en un individuo sustancialmente como se ha descrito anteriormente en la presente memoria con referencia a y como se muestra en los dibujos adjuntos.

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Ejemplos

Para ilustrar la utilidad amplia y general de la presente invención, se han preparado y evaluado varios sistemas de referencia incluyendo el uso de diferentes tipos de células, células enteras intactas o membranas nucleicas aisladas, prefijadas, no fijadas o permeabilizadas, varias dianas diferentes, mezclas con dianas irrelevantes y con intensidades de tinción graduadas y diversos sistemas de visualización.

Los sistemas de referencia se han evaluado como diversas preparaciones citológicas por medio del microscopio y en un citómetro de flujo y como preparaciones fijadas con formalina e incrustadas con parafina (FFPE) evaluadas en un microscopio de campo brillante o de fluorescencia.

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Ejemplo 0 Materiales y Métodos

A continuación se describen algunos de los procedimientos generales:

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A. Aislamiento de células CHO

Se obtienen células de ovario de hámster chino (células CHO) a partir de la ATCC (Nº de cat.: CLL-61) y se cultivan en medio de mezcla nutriente de Gibco F-12K que contiene suero bovino fetal (FCS) al 10%, penicilina y estreptomicina. Las células se cultivan a 37ºC con 5% de CO_{2}. En la confluencia, las células se separan por la adición de tripsina-EDTA y después se lavan en medio F-12K sin FCS. Las células se cuentan en un hemacitómetro (NucleoCounter, Chemometec, Dinamarca).

Las células se aíslan del medio por centrifugación suave a 800 rpm (aproximadamente 90 x g) a 20-24ºC durante 5-10 minutos. El sedimento celular se resuspende en NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 10 mM (MERCK Nº de cat. 6580 y Nº de cat. 6346) pH 7,2, NaCl 0,145 M MERCK Nº de cat. 6404 (PBS) (0,33 ml por 10 millones de células) seguido de centrifugación.

Las células intactas se usan directamente para el acoplamiento de la diana o se tratan adicionalmente para obtener la membrana nuclear.

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B. Aislamiento de células sf9

Se cultivan células de insecto sf9 (gusano cogollero, ovario de pupa de Spodoptera frugiperda, ECACC 89070101) como cultivos en suspensión en matraces giratorios en medio (InVitrogen, Nº de Cat. 11605-045 grace) que contiene FCS al 10%, glutamina y antibióticos a 27ºC, en una atmósfera con más de 20% de oxígeno sin acceso especial al CO_{2}.

Las células se aíslan del medio por centrifugación y se lavan como se ha descrito anteriormente para las células CHO. Las células intactas se usan directamente para el acoplamiento de la diana o se tratan adicionalmente para obtener la membrana nuclear.

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C. Aislamiento de membranas nucleares

La preparación nuclear se obtiene de acuerdo con Edgar Schreiber et al. (1989), Nucleic Acids research, Vol. 17, Número 15, página 6419.

La lisis de la membrana citoplásmica celular (no la lisis de la envuelta nuclear) se controla cuidadosamente por resuspensión del sedimento celular en HEPES 10 mM frío a 4-8ºC (Sigma, Nº de cat. H-3375, pH 7,9, KCl 10 mM, EDTA 0,2 mM (MERCK Nº de cat. 1.08418) y DTT 1 mM (Sigma, Nº de cat. D-0632) en una relación vol:vol de 1:6. La suspensión de aproximadamente 150 millones de células se deja en hielo en 4,5 ml de tampón hipotónico durante un intervalo de 10 a 15 minutos seguido de 10 segundos de mezcla vorticial muy suave.

Se añade detergente Nonidet P-40 (BDH, Nº de cat. 56009) a una concentración final 0,15% v/v seguido de 10 segundos adicionales de mezcla vorticial suave.

Las membranas nucleares se inspeccionan visualmente para comprobar que están intactas en más de 90% por microscopía de campo brillante de contraste de fase y se sedimentan a 1000 rpm (aproximadamente 140 x g) a 4-8ºC durante 5 minutos.

La recuperación de las membranas nucleares intactas es mayor de 130 millones, de acuerdo con el recuento de células en el hemacitómetro.

Las membranas nucleares se usan para el acoplamiento de diferentes dianas.

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D. Procedimiento general para el acoplamiento de epítopos peptídicos en células intactas o membranas nucleares

Se resuspenden aproximadamente 30 millones de núcleos o sedimentos de células en 1,00 ml de Na_{2}CO_{3} 25 mM frío, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM y 1 mg/ml de D-glucosa (MERCK Nº de cat. 1.08342) (en lo sucesivo denominado tampón de acoplamiento).

Los núcleos o las células se lavan dos veces por centrifugación a 800 rpm (aproximadamente 90 x g) a 20-24ºC durante 10 minutos. Posteriormente se resuspenden en 1 ml (0,33 ml x 10 millones de células) de tampón de acoplamiento frío.

La suspensión de aproximadamente 30 millones de núcleos o células se activa con un agente de reticulación heterobifuncional (éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)-succinimida) ("GMBS", Nº de cat. 22309, Pierce Chemical Company, 0,84 mg/ml en dimetilformamida) durante 20 minutos a 30-37ºC.

La reacción se inactiva por la adición de un exceso molar de 3 veces de L-glicina (MERCK, Nº de cat. 1.04201, 1,0 mg/ml) por agente de reticulación heterobifuncional durante 5 a 10 minutos a 30-37ºC.

Los núcleos o las células se lavan de nuevo dos veces por centrifugación a 800 rpm (aproximadamente 90 x g) a 20-24ºC durante 10 minutos; seguido de resuspensión en 1 ml (0,33 ml por 10 millones de células) de tampón de acoplamiento frío.

Después de la etapa de lavado, los núcleos activados se resuspenden en el tampón de acoplamiento general y se conjugan con un péptido particular que contiene una funcionalidad tiol.

Se añade una solución del péptido seleccionado y se incuba con la suspensión de células activadas durante 20 a 30-37ºC.

Después del lavado por centrifugación y resuspensión dos veces en el tampón de acoplamiento general, el sedimento resuspendido se transfiere para un procesamiento citológico o FFPE adicional y evaluación inmunocitoquímica.

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Preparaciones generales de FFPE Incrustación en gel de agarosa

Se mide el volumen total de la suspensión de células. Se calienta la misma cantidad de una solución de agarosa (2,0% en peso en agua desionizada, calidad de proteína HSA 1000, FMC BioPolymer/Látex, obtenido en Medinova Scientific A/S, Hellerup, Dinamarca) a 60ºC en un baño de agua. La suspensión de células se calienta a 60ºC durante unos pocos minutos antes de añadirse la solución de agarosa. La mezcla caliente se mezcla muy suavemente durante unos pocos segundos.

La suspensión de gel líquido caliente se extrae rápidamente en una pipeta de plástico larga de un solo uso (Transfer Pipettes, Nº de cat. 262, Corning Samco Corporation, San Fernando, USA). Todas las burbujas de aire se dejan escapar antes de enfriar la pipeta en un baño de agua.

Se corta la punta de la pipeta de plástico y el gel solidificado se aprieta para que salga hacia el exterior y entre en agua fría. Se recogen los cilindros de gel de aproximadamente 3 mm de diámetro y 40 mm de longitud y se cortan en piezas de aproximadamente 15 mm de longitud con una cuchilla quirúrgica.

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Fijación

Cada pieza de gel se transfiere a un recipiente (tubo de ensayo de 30 ml de Poliestireno Nunc/Nalgene) con formalina tamponada neutra, NBF (20 ml, NaH_{2}PO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 10 mM, (MERCK Nº de cat. 6580 y Nº de cat. 6346), NaCl 0,145 M (Merck Nº de cat. 6404), pH 7,0, ajustado a formaldehído al 4% a partir de formaldehído al 37% (Merck, Nº de código 4003) y se deja durante una noche en una campana de laboratorio ventilada (18 horas a temperatura ambiente).

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Deshidratación e incrustación en parafina

Las piezas de gel que contienen las células se enrollan suavemente en papel limpiador de lentes de microscopio (Leica Nº de catálogo 8060861) y se ponen en una histocápsula de plástico marcada (Sekura, Japón, ProHosp: Mega-casete Nº de código 59040, aproximadamente 32x26x10 mm), antes de deshidratarse e incrustarse en parafina.

Las células incrustadas en gel se deshidratan por tratamiento secuencial con etanol al 70% dos veces durante 45 minutos, etanol al 96% dos veces durante 45 minutos, etanol al 99% dos veces durante 45 minutos, xileno dos veces durante 45 minutos, antes de transferirse a parafina fundida (Merck Nº de código 7337.9020, punto de fusión 56-58ºC) y se deja durante una noche (12-16 horas) a 60ºC. Las piezas infiltradas con parafina se transfieren a parafina caliente limpia y se dejan allí durante 60 minutos más antes de incrustarse con parafina en un molde (Sekura, ProHosp 4166 mega, aproximadamente 31x23x13 mm) y se enfría para formar los bloques de parafina finales.

Los bloques de parafina marcados que contienen el material de referencia incrustado se almacenan en frío (2-8ºC) y en la oscuridad antes de cortarse, montarse, desparafinarse y teñirse.

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Corte, montaje y desparafinación

Los bloques de parafina se montan en un microtomo (Leica 0355 modelo RM2065, cuchillas Feather S35, fijado a 0,5 micrómetros). Los primeros milímetros se cortan y se tiran antes de cortar y recoger las secciones de parafina en espesores de 5 micrómetros a temperatura ambiente. Las secciones de parafina se estiran suavemente en un baño de agua caliente a 45-60ºC antes de recogerse y montarse en portaobjetos de microscopio marcados (Superfrost plus, Menzel-gläser Nº de código 041300). Los portaobjetos se secan, se calientan en una estufa a 60ºC y el exceso y la parafina fundida se retiran con un pañuelo de papel.

Los portaobjetos se desparafinan por incubaciones sucesivas dos veces en xileno durante 2-5 minutos, dos veces en etanol al 96% durante 2-5 minutos, dos veces en etanol al 70% durante 2-5 minutos y una vez en TBS (Tris-HCl 50 mM (Tris(hidroximetil)aminometano p.a., Crystal Chem Inc., Il, USA), NaCl 150 mM, pH 7,6) durante 5 minutos.

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Recuperación de antígeno y bloqueo

Los portaobjetos se tratan con un tampón de recuperación de antígeno (del kit de investigación DakoCytomation p16 para histología, Nº de producto OA315) durante 40 minutos a 95-98ºC en un baño de agua y se deja enfriar a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.

Los portaobjetos se lavan suavemente con un tampón de lavado (DakoCytomation, Nº de catálogo S3006, en este documento denominado después "tampón de lavado") durante 5 minutos, seguido de incubación con una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos para inactivar la actividad del peróxido endógeno. (Solución de Bloqueo de Peroxidasa DakoCytomation Nº de código S2023), antes de lavarse una vez con TBS durante 5 minutos.

Para asegurar una buena cobertura de reactivo en el material, el área en el portaobjetos con material de referencia se encierra en un círculo con una barrera de goma de silicona ("DakoPen", DakoCytomation Nº de Código S 2002).

Los portaobjetos se transfieren a una rejilla en una cámara pequeña y cerrada para evitar el secado durante las etapas posteriores del procedimiento.

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Inmunovisualización

El procedimiento global consta de incubar primero con un anticuerpo primario contra la diana relevante, seguido del lavado, incubación con una mezcla de conjugado de dextrano polimérico que contiene peroxidasa de rábano picante y anticuerpo de cabra secundario y tinción con un cromógeno HRP.

Con más detalle, la inmunovisualización de las células se realiza usando el anticuerpo primario contra la diana en cuestión (200 microlitros por portaobjetos para preparaciones de FFPE y 300 microlitros por portaobjetos para preparaciones citológicas).

Todos los portaobjetos se lavan en el tampón de lavado durante 5 minutos, seguido de incubación con conjugado Envision+/HRP (Dakocytomation, Envision, Nº de código K4001, 200 microlitros por portaobjetos a partir de las preparaciones FFPE y 300 microlitros por portaobjetos a partir de las preparaciones citológicas) durante 30 minutos.

Los portaobjetos se lavan suavemente tres veces en el tampón de lavado durante 5 minutos, seguido de incubación con un sistema de sustrato cromogénico de diaminobencidina (DAB +, DakoCytomation Nº de código K 3468) durante 10 minutos para las preparaciones FFPE de acuerdo con las instrucciones del producto.

Para las preparaciones citológicas, el sustrato cromogénico se incuba dos veces durante 5 minutos.

Todos los portaobjetos se lavan con el agua destilada en 5 minutos, antes de teñirse con un colorante de contraste con Hematoxilina en 5 minutos y lavarse en agua corriente en 5 minutos, de acuerdo con las instrucciones del producto (DakoCytomation, Nº de producto S3301).

Los portaobjetos se cubren usando un medio de montaje acuoso, Faramount (DakoCytomation Nº de código S 3025) y se examinan en un microscopio de campo brillante (Leica DM LB) a 10 ó 40 aumentos, usando una intensidad de luz 8. Los portaobjetos se fotografían digitalmente (Olympus DP50-CU) y se corrige el efecto de fondo blanco de las fotografías.

Las preparaciones citológicas se realizan de acuerdo con uno de tres métodos basados en portaobjetos: Citocentrifugación, Autocyte/TriPath o ThinPrepTM.

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Preparaciones citológicas generales usando una técnica "citocentrifugación"

Se obtienen recuentos totales de las células usando un hemocitómetro. La suspensión celular se ajusta a 0,5-1,0 millones de células por mililitro. Se sedimentan alícuotas de células en portaobjetos de vidrio usando una "citocentrifugación 2" (Shandon Scientific, Cheshire, Reino Unido).

Los portaobjetos de vidrio de microscopio se montan en el clip junto con la tarjeta de filtro y finalmente el citocanal. El sistema de portaobjetos ensamblado se pone en la centrífuga antes de añadir la suspensión de células (50 o 100 microlitros por portaobjeto), se cierra la tapa de la centrífuga y la centrífuga se hace funcionar a 800 vueltas por minuto durante 5 minutos.

El sistema de portaobjetos ensamblados se retira de la centrífuga y el portaobjetos con la preparación celular se separa de la tarjeta de filtro y el citocanal.

Los portaobjetos se secan durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células montadas en el portaobjetos se fijan por pulverización con alcohol y glicerol que contiene Mercofix (Merck, Nº de producto 77-323-2 y 77-323-1) y se dejan secar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Los portaobjetos podrían almacenarse en estado congelado durante un máximo de 3 semanas antes de procesarse adicionalmente.

Los portaobjetos se someten a recuperación de antígeno, bloqueo e inmunovisualización como se ha descrito anteriormente para las preparaciones FFPE.

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Preparaciones citológicas generales usando una técnica Autocyte/Tripath

El procedimiento general se realiza como se indica en el manual "Manual preparation of LBC based on AutoCyte principle" (Cytyc Corporation, MA, USA). Los reactivos, tubos de centrífuga y filtros se adquieren en Cytyc (Cytyc Corporation, MA, USA).

Una muestra de células se separa de todo el desecho celular por centrifugación, antes de recogerse en un dispositivo de filtro, montarse en portaobjetos y fijarse usando una solución de alcohol tamponado.

Con más detalle, los portaobjetos (portaobjetos de microscopio Cytyc Thin Prep, Nº de producto 70214-001) se tratan con el "Slidecoate-reagent" durante 10 minutos antes de secarse al aire durante 30 minutos.

La suspensión de células (aproximadamente 2-4 ml) y el "Reactivo de Densidad" (4 ml) se mezclan en un tubo de centrífuga usando un mezclador vorticial.

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La bomba de filtro se pone en el recipiente de muestra y se aprieta hasta abajo. El recipiente de muestra con la bomba se pone en la parte superior del tubo de centrífuga que contenía el reactivo de densidad. El tubo se centrifuga durante 2 minutos a 200 rpm.

La mezcla se divide en dos capas y la capa superior se retira cuidadosamente por medio de una pipeta y se desecha. La muestra se centrifuga de nuevo durante 2 minutos a 500 rpm seguido de decantación del líquido del sedimento celular en la parte inferior del tubo. El sedimento celular se resuspende en agua (2,00 ml).

Los portaobjetos recubiertos se ponen en la rejilla de portaobjetos AutoCyte y el dispositivo de la cámara Prep Settling se monta en la parte superior.

A cada cámara se le añade la suspensión de células (400 microlitros) y la mezcla se deja sedimentar durante 10 minutos. El exceso de líquido se decanta y el portaobjetos se retira de la cámara.

Los portaobjetos se secan durante 60 minutos. Las células montadas en el portaobjetos se fijan por pulverización con alcohol y glicerol que contiene Mercofix (Merck Nº de producto 77-323-2 y 77-323-1) y se dejan secar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos podrían almacenarse durante un máximo de 3 semanas antes de procesarse adicionalmente.

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Preparaciones citológicas generales usando técnicas Thin Prep^{TM}

El procedimiento general se realiza como se indica en el manual para ThinPrep 2000, (Cytyc Corporation, MA, USA).

En resumen, el vial de muestra que contiene las células se pone en el aparato. Bajo el control del microprocesador del instrumento, se realizan automáticamente las siguientes etapas: En primer lugar, una etapa de dispersión suave rompe la muestra y mezcla minuciosamente la muestra. Una serie de pulsos de presión negativa se generan que extraen líquido a través de un filtro TransCyt® para recoger una capa fina y uniforme de material celular de diagnóstico. El material celular después se transfiere a un portaobjetos de vidrio usando colocación mecánica controlada por ordenador y presión de aire positiva. El portaobjetos después se expulsa en un baño de fijación de células que contiene metanol tamponado antes de teñirse y evaluarse.

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Tinción fluorescente general de preparaciones citológicas evaluadas en un citómetro de flujo

Los recuentos de células totales se obtienen usando el hemocitómetro. Las células se tiñen usando el método de tinción indirecto o directamente.

Aproximadamente 1,0 millones de células en suspensión se centrifugan a 13 G durante 5 minutos a temperatura ambiente en tubos Falcon (Becton Dickinson Nº de producto 352052). Al sedimento se le añaden 10 microlitros de un control de anticuerpo negativo, anticuerpo específico no marcado o una solución de anticuerpo específico marcado con fluorescencia (diluido 1 a 20 en PBS).

La suspensión se mezcla vorticialmente durante 5 a 10 segundos (MT2 Minishaker, IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Alemania) a aproximadamente 3000 vueltas por minuto antes de la incubación estática a 4ºC durante 30 minutos en la oscuridad. Al tubo se le añaden 2 ml de PBS, se mezcla vorticialmente durante 5 a 10 segundos, se centrifuga a 13 G en 5 minutos a temperatura ambiente. A los sedimentos de células marcadas se les añaden 400 microlitros de tampón PBS, se mezcla vorticialmente durante 5 a 10 segundos antes de analizarse en un citómetro de flujo.

Las células marcadas directamente se analizan en un citómetro de flujo convencional (FACS Calibur, Master description 4CS-E1822, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Erembodegem, Bélgica).

Para el marcaje indirecto, el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia se añade repitiendo el procedimiento anterior antes de analizarse en el citómetro de flujo.

Las células de referencia se analizan y evalúan usando el software convencional (Becton Dickinson Cell Quest versión 3.3). Los datos se presentan representando la dispersión frontal (FSC-H) frente a la dispersión lateral (SSC-H), el logaritmo del canal de fluorescencia (por ejemplo, FL-1) frente a los recuentos y la dispersión frontal (FSH-H) frente al logaritmo del canal de fluorescencia (por ejemplo, FL-1).

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A continuación se describen los péptidos usados:

Péptidos

Los péptidos usados como diana en los ejemplos se obtienen de NeoSystems, Strasbourg, Francia o Novartis, Basilea, Suiza.

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Péptido Nº 1

El péptido Ki-67 (NeoSystems, Nº de lote SP011749C) contiene un epítopo para el anticuerpo MIB1^{TM} (Dakocytomation Ki67 clon MIB-1, marca comercial). El epítopo para el anticuerpo monoclonal MIB1^{TM}, según se ha esclarecido, se incluye en la secuencia de aminoácidos de 18 unidades -Ala-Gly-Phe-Lys-Glu-Leu-Phe-Gln-Thr-Ala-Gly-Phe-Lys-Glu-Leu-Phe-Gln-Thr. El péptido tiene un Pm de 2164,5 Da.

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Péptido Nº 2

El péptido Ki-67 biotinilado (NeoSystems, Nº de lote SP010864B) contiene un epítopo para el anticuerpo MIB1^{TM} similar al péptido Nº 1 y contiene una cisteína en el extremo C para fines de acoplamiento y un derivado de biotinilo en el extremo amino. El péptido tiene un Pm de 2390,8 Da.

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Péptido Nº 3

El péptido HER2 (NeoSystems, Nº de lote 991729) contiene un epítopo para el anticuerpo policlonal contra HER2/neu (anticuerpo de conejo DakoCytomation A0485).

El anticuerpo de conejo reconoce varias secuencias de aminoácidos lineales en la parte intracelular de la proteína tirosina quinasa asociada a receptor HER2/neu denominada aa 1242Thr a aa 1255Val y el péptido contiene una cisteína separada adicional en el extremo C para fines de acoplamiento. El péptido tiene un Pm de 1676,9 Da.

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Péptido Nº 4

El péptido p16 (NeoSystems, Nº de lote SP021294) contiene un epítopo para el anticuerpo monoclonal E6H4 que según se ha esclarecido está incluido en la parte C terminal de la proteína p16-INK4 humana denominada aa 144Arg a aa 151Pro (Swiss-Protein, Nº de acceso P42771), sintetizada como una secuencia de aminoácidos repetida dos veces, marcada con fluoresceína en el extremo amino y que contiene una cisteína separada adicional en el extremo C para fines de acoplamiento. El péptido tiene un Pm (peso molecular) de 2201,3 Da.

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Péptido Nº 5

El péptido p16 (NeoSystems, Nº de lote SP0010864) con la misma secuencia de aminoácidos que el péptido Nº 4, marcado con biotina en el extremo amino y que contiene una cisteína separada en el extremo C para fines de acoplamiento. El péptido tiene un Pm de 2390,3 Da.

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Péptido Nº 6

El péptido Ki-67 (NeoSystems, Nº de lote SP0211991) contiene un epítopo para el anticuerpo MIB1^{TM} similar al péptido Nº 1, sintetizado como una secuencia de aminoácidos repetida dos veces y que contiene una cisteína en el extremo C para fines de acoplamiento. El péptido tiene un Pm de 1817,2 Da.

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Péptido Nº 7

El péptido HER7 (NeoSystems, Nº de lote SP000432) contiene un epítopo para el anticuerpo policlonal contra HER3.

El anticuerpo reconoce varias secuencias de aminoácidos lineales en la parte intracelular del receptor HER3 cerca de la secuencia de aminoácidos 1289. El péptido tiene un Pm de 1617 Da.

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Péptido Nº 8

El péptido HER2 fosfonado (Novartis, NVP-ABN-379-A1-1) contiene un epítopo para el anticuerpo policlonal contra la parte intracelular de la proteína tirosina quinasa asociada al receptor HER2/neu denominada aa 1242Thr a aa 1255Val, fosfonada en la posición de aminoácidos 1248Tirosina y que contiene una cisteína separada adicional en el extremo C para fines de acoplamiento. El péptido tiene un Pm de 1753,8 Da.

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Confirmación Experimental 1. Uso del péptido Ki-67 como diana y Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) con Tinción Envision/DAB de núcleos aislados de células CHO en una preparación citológica de citocentrifugación

Se aíslan 10 millones de núcleos de células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y se activan como se describe en general anteriormente.

La activación se realiza con "GMBS" 0,5 \muM (0,14 mg, 10 mg/ml de DMF), inactivada con L-glicina y se hace reaccionar finalmente con una concentración 0,125 \muM (0,29 mg) de péptido Ki-67 (péptido Nº 2, epítopo para el anticuerpo MIB1^{TM}, PM 2390,8 Da) que contiene una cisteína en el extremo C y un derivado de biotinilo en el extremo amino.

Las células se tratan como una preparación citológica de citocentrifugación y se montan en portaobjetos como se ha descrito anteriormente en el procedimiento general.

La inmunovisualización de los núcleos se realiza como se ha descrito anteriormente en la sección general. En resumen, el anticuerpo monoclonal primario es el clon MIB1^{TM} (DakoCytomation, 7240, dilución 1:200), seguido de incubación con inmunoglobulinas de cabra anti-ratón y peroxidasa de rábano picante marcada en un polímero de dextrano (DakoCytomation Envision, Nº de código K4001) y finalmente un sistema de sustrato cromogénico de diaminobencidina (DakoCytomation DABplus, Nº de código 3468).

En paralelo se procesa una tinción con colorante de contraste de hematoxileno negativo inmunohistoquímicamente para visualizar claramente los núcleos.

La Figura 15A muestra la tinción con hematoxilina homogénea de los nucléolos.

La Figura 15B muestra la inmunotinción con DAB como una tinción distribuida homogéneamente en la membrana nuclear de las células y en la lámina, en la cromatina y los nucléolos. Las dos fotografías se toman a 20 aumentos.

En conclusión, el péptido diana puede acoplarse a los núcleos aislados. El tinte de hematoxilina ilustra adicionalmente la calidad de los núcleos aislados.

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2. Uso del péptido Ki-67 como diana y tinción con peroxidasa de rábano picante (HRP) Envision/DAB de núcleos aislados de células CHO en una preparación fijada con formalina e incrustada con parafina (FFPE)

Se aíslan 10 millones de núcleos de células de ovario de hámster chino y se activan como se ha descrito anteriormente. La activación se realiza con "GMBS" 1,0 \muM, seguido por reacción con L-glicina 3 \muM (exceso molar 3 x) con respecto a "GMBS" y reacción final con una concentración 0,1 \muM de péptido Ki-67 (péptido Nº 2, epítopo para el anticuerpo MIB1^{TM}, PM 2390,8 Da), que contiene una cisteína en el extremo C y un derivado de Biotinilo en el extremo amino.

Las células se tratan como una preparación FFPE, se montan en portaobjetos y se inmunovisualizan como se describe en el Ejemplo 1 y en el procedimiento general.

La Figura 16 es una fotografía de las células CHO teñida tomadas a 20 aumentos. Se observa una inmunotinción muy fuerte en la membrana nuclear celular y en la lámina, hasta la cromatina y hasta el núcleo. La tinción ilustra claramente la posibilidad de teñir células enteras convencionales fijadas con formalina e incrustadas con parafina (FFPE).

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3. Efecto de detergentes añadidos durante la activación y conjugación de la diana de péptido Ki-67 y tinción HRP Envision/DAB de núcleos aislados de células CHO en una preparación de tejidos FFPE

Los núcleos activados se hacen reaccionar con una concentración 0,02 \muM de péptido Ki-67 (péptido Nº 1, epítopo para el anticuerpo MIB1^{TM} que contiene una cisteína en el extremo C, PM 2164,5 Da), con 0,1% v/v de Nonidet P-40 y 0,1% v/v de Pluronics F-127 (BASF), añadido en la mezcla de conjugación.

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Las células se tratan como una preparación FFPE, se montan en portaobjetos y se inmunovisualizan como se ha descrito anteriormente.

La Figura 17 es una fotografía de las células CHO teñidas tomada a 20 aumentos.

La intensidad de la inmunotinción se reduce notablemente en comparación con la tinción en el Ejemplo 2.

El patrón de tinción indica que usando detergentes durante la conjugación aumenta la penetración de los reactivos en el material celular y hace que la tinción se distribuya más uniformemente entre las células individuales. Además, la distribución celular y el aspecto general del tinte son más homogéneas.

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4. Uso del péptido Ki-67 como diana e inmunotinción con Fosfatasa Alcalina (AP)/Rojo rápido LSAB + Inmunotinción de núcleos aislados de células CHO en una preparación de tejido citológico de citocentrifugación y evaluado por microscopía de campo brillante y de fluorescencia

En resumen, se aíslan aproximadamente 30 millones de núcleos de células de ovario de hámster chino, se activan y se conjugan como se ha descrito anteriormente. La activación se realiza con "GMBS" 3,0 \muM (0,84 mg), seguido de reacción con una concentración 9,0 \muM (exceso molar 3 x) de L-glicina con respecto a "GMBS" y reacción final con una concentración 0,06 \muM (0,13 mg) de péptido Ki-67 (péptido Nº 1, epítopo para el anticuerpo MIB1^{TM}, PM 2164,5 Da), que contiene una cisteína en el extremo C.

La inmunovisualización de núcleos se realiza por incubación con el anticuerpo monoclonal primario que es el clon MIB1^{TM} (Dakocytomation 7204), como en el procedimiento general. Esto se continúa por incubación durante una hora con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón biotinilado y estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (DAKOcytomation LSAB+, código Nº K5005), y finalmente sistema de sustrato cromogénico Vector Red (DakoCytomation, Nº de código SK-5100C), todo de acuerdo con las instrucciones del producto.

La Figura 18A es una fotografía de las células CHO teñidas con Vector Red tomada a 20 aumentos. De forma similar al sistema de tinción HRP Envision, el sistema de visualización de estreptavidina-biotina AP LSAB proporcionó la tinción esperada.

Se observa una fuerte inmunotinción de color rojo intenso tanto en la membrana nuclear como en la lámina de la célula, en la cromatina y en los nucléolos.

La misma preparación se evalúa en un microscopio de fluorescencia (Leica DMRA, con Sensys Photometrics Camera) usando un kit de filtro Pinkel TRITC (Chroma Technology Corp.) y se representa en la Figura 18B.

El uso del tinte fluorescente mejoró notablemente la intensidad observada de la inmunotinción en comparación con la microscopía de campo brillante.

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5. Efecto de prefijación de células CHO intactas antes de la activación y conjugación de la diana peptídica HER2

Este ejemplo ilustra el efecto de prefijar células CHO intactas antes de la activación y conjugación de la diana peptídica HER2. La células resultantes se tratan como preparaciones citológicas de citocentrifugación o preparaciones FFPE, HRP Envision/DAB teñidas por el protocolo Herceptest^{TM} y se comparan con las líneas de células de control MDA-175 y SK-BR-3.

En resumen, se aíslan aproximadamente 20 millones de células de Ovario de Hámster Chino como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 con la excepción de la etapa de lisis.

Las células se dividen en dos poblaciones del mismo tamaño. La primera población se prefija usando una concentración final de 0,7% v/v de paraformaldehído en un tampón PBS, pH 7,2, y se deja durante 15 minutos en hielo antes de la activación con GMBS.

Las poblaciones celulares prefijadas y no prefijadas posteriormente se procesan en paralelo.

La activación se realiza con "GMBS" 1,0 \muM, seguido de reacción con L-glicina 3,0 \muM (exceso molar 3 x) con respecto a "GMBS", y reacción final con péptido HER2/neu 0,25 \muM (0,42 mg) (péptido Nº 3, epítopo para anticuerpo DakoCytomation A0485, PM 1674.8), que contenía una cisteína en el extremo C.

Las células CHO intactas y modificadas con el péptido se dividen en dos poblaciones y se tratan como preparación citológica para citocentrifugación o como una preparación FFPE, respectivamente, y se montan en portaobjetos como se ha descrito anteriormente en el procedimiento general.

Las células CHO intactas se inmunovisualizan usando el sistema inmune HercepTest (DakoCytomation K5204), que incluye el anticuerpo policlonal primario (DakoCytomation A0485) dirigido contra la proteína receptora
HER2/neu.

Las células de referencia FFPE (líneas celulares MDA-175 y SK-BR-3) incluidas en el kit Herceptest se tratan y se tiñen en paralelo. Los portaobjetos se fotografían a 20 aumentos.

La Figura 19A es la preparación de citocentrifugación teñida con HRP/DAB sin una etapa de prefijación y la Figura 19B con una etapa de prefijación.

La Figura 19C es la preparación FFPE teñida con HRP/DAB sin una etapa de prefijación y la Figura 19D con una etapa de prefijación.

La Figura 19E es las células de referencia de FFPE Herceptest MDA-175 (puntuación +1) teñidas con HRP/DAB y la Figura 19F es las células de referencia de FFPE de Herceptest SK-BR-3 (puntuación + 3) teñidas con HRP/DAB.

Tanto para las preparaciones de citocentrifugación como para las preparaciones FFPE, puede verse que la estabilización por fijación antes de la modificación química del material celular produce una tinción mejor definida de los componentes celulares en comparación con las células no fijadas.

El aumento de la homogeneidad y la tinción bien definida pueden ser ventajosa en algunas aplicaciones en citoquímica ya que las células de referencia pueden usarse para guiar al interpretador a alcanzar la puntuación correcta. En comparación con las células de referencia teñidas de la Dakocotymation Herceptest, la homogeneidad intercelular es mejor y la preparación contenía menos desechos celulares.

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6. Efecto de usar diferentes niveles de péptido diana durante la conjugación para obtener tinción graduada de núcleos aislados a partir de células CHO en preparaciones de citocentrifugación

La diana en este ejemplo es el péptido Ki-67 y se inmunovisualiza por tinción con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) Envision/DAB.

En resumen, se aíslan aproximadamente 10 millones de núcleos de células de ovario de hámster chino y se activan como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 y 2.

La población de núcleos se divide en tres poblaciones. La activación se realiza por reacción con "GMBS" 0,5 \muM seguido de reacción con L-glicina 1,5 \muM (exceso molar 3 x) con respecto a "GMBS" y reacción con (A) péptido Ki-67 0,125 \muM (péptido 5, Pm 2390,3 Da) (B) péptido Ki-67 0,50 \muM (péptido 5, Pm 2390,3 Da) o (C) péptido HER2 irrelevante 0,50 \muM (péptido Nº 3, Pm 1676,9 Da). Los dos péptidos contienen una cisteína en el extremo C.

Las tres poblaciones de núcleo se tratan como una preparación citológica de citocentrifugación y se montan en portaobjetos y se inmunovisualizan usando el anticuerpo monoclonal primario contra Ki-67 (Clon MIB-1, DakoCytomation 7240), como se describe en el procedimiento general.

La Figura 20 representa fotografías de los núcleos de CHO teñidos tomadas a 20 aumentos: núcleos acoplados con el péptido HER2 irrelevante (Figura 20A), núcleos acoplados con la baja concentración (0,125 \muM, Figura 20B) y alta concentración de péptido Ki-67 (0,50 \muM, Figura 20C).

La Figura 20A muestra la baja tinción no específica de los núcleos modificados con el péptido irrelevante.

La Figura 20B y la Figura 20C muestran diferentes niveles de tinción (aproximadamente 2+ y 3+ respectivamente). Las preparaciones son algo heterogéneas y contienen algunos desechos.

Las dos fotografías demuestran que la intensidad de la inmunotinción y por medio de ésta la puntuación citoquímica pueden ajustarse por la concentración del péptido durante el acoplamiento.

La preparación de núcleos es útil como referencia para dianas normalmente localizadas en el núcleo, ya que el tamaño y la morfología serán similares como se ve en el microscopio.

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7. Uso de un péptido de motivo de epítopo p16 doble como diana y tinción con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) Envision/DAB de células sf9 intactas prefijadas en una preparación FFPE

En este ejemplo, antes de la activación química, las células se tratan con DakoCytomation IntraStain^{TM}, que es un reactivo de permeabilización.

Se aíslan 200 millones de células sf9 intactas sin una etapa de lisis como se ha descrito previamente, se prefijan usando una concentración final de 4,0% v/v de paraformaldehído en un tampón PBS, pH 7,2 en hielo durante 20 minutos, se lavan, seguido de tratamiento con DakoCytomation IntraStain^{TM} (0,4 ml/millón de células) durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de una etapa de lavado. Las células en general se activan como se ha descrito anteriormente.

La activación se realiza con "GMBS" 10 \muM seguido de reacción con L-glicina 30 \muM (exceso molar 3 x) y una reacción final con una concentración 0,01 \muM de péptido Nº 4 (PM 2201,3) con un epítopo doble para el anticuerpo p16 y que contiene un resto de fluoresceína en el extremo N y una cisteína en el extremo C.

Las células se tratan como una preparación FFPE, se montan en portaobjetos y se inmunovisualizan usando el anticuerpo monoclonal primario contra p16 (clon p16 E6H4, DakoCytomation, 0,62 microgramos/ml) como se describe en el procedimiento general.

La Figura 21 es una fotografía de las células sf9 teñidas tomada a 20 aumentos.

Se observa una inmunotinción a lo largo de las células individuales. El patrón de tinción es homogéneo en las diversas partes (membrana, citoplasma y núcleo) de las células. La intensidad de tinción entre las células varía de células teñidas débilmente (1+) a teñidas fuertemente (4+).

El patrón de tinción ilustra el efecto positivo del reactivo intratinte para ayudar al transporte de reactivos a las diversas partes de las células. La tinción resultante no sólo se localiza, por ejemplo, en la membrana celular.

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8. Uso del péptido p16 como diana y tinción con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) Envision/DAB de células sf9 intactas prefijadas, en una preparación FFPE

En este ejemplo las células se tratan con DakoCytomation IntraStain^{TM} y se acoplan con mezclas conocidas del péptido del motivo de p16 doble relevante y un péptido irrelevante para obtener tinción específica con diferentes intensidades.

Se aíslan 200 millones de células sf9, se prefijan y se tratan con Intrastain como en el Ejemplo 124 previo.

La población de células se divide en dos poblaciones del mismo tamaño (A y B) y se activan en paralelo como se ha descrito anteriormente. La activación se realiza con "GMBS" 10 \muM, seguido de reacción con L-glicina 30 \muM (exceso molar 3 x).

La población A se hace reaccionar con una solución premezclada de una concentración 0,01 \muM de péptido Nº 4 (igual que en el Ejemplo 7 anterior) y 0,30 \muM (población A) o 0,10 \muM (población B) de un péptido irrelevante (péptido Nº 6, que es un péptido KI67 de motivo epitópico doble (Pm 1817,2 Da), conteniendo ambos una cisteína en el extremo C.

Las células se tratan como una preparación FFPE, se montan en portaobjetos y se inmunovisualizan usando el anticuerpo monoclonal primario contra p16 (clon p16 E6H4, DakoCytomation) como se describe en el procedimiento general.

La Figura 22A (usando un péptido irrelevante equivalente a 30) y la Figura 22B (usando un péptido irrelevante equivalente a 10) son fotografías de las células sf9 teñidas tomadas a 20 aumentos.

La tinción de la población (A) usando un anticuerpo de control negativo (DakoCytomation N 1698) no dio una tinción con DAB detectable.

La intensidad de la tinción se puntúa a 0,5 - 1+ en la Figura 22A y 1 - 1,5 + en la Figura 22B.

Comparando la Figura 22A (péptido irrelevante equivalente a 30) y la Figura 22B (péptido irrelevante equivalente a 10), con la Figura 21 (sin péptido irrelevante), puede verse que la intensidad de la tinción se reduce por la adición del péptido irrelevante.

Además, la homogeneidad del nivel de tinción entre las células se mejora por la adición del péptido irrelevante en la mezcla de reacción.

En conclusión, es posible reducir la intensidad de la tinción por la adición de péptido irrelevante en la mezcla de acoplamiento. El nivel de tinción débil obtenido de 0,5 a 1,0 es importante, ya que los ensayos IHC a menudo necesitan valores umbral en este intervalo.

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9. Reproducibilidad en la preparación de cuatro lotes en total de células sf9 intactas prefijadas y tratadas con Intrastain con el péptido p16 doble como diana y el uso de un péptido irrelevante

Las células que se están evaluando para la densidad de péptidos en un citómetro de flujo y tratadas como preparaciones FFPE y teñidas con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) Envision/DAB.

Se aíslan 300 millones de células sf9 intactas, se prefijan y se tratan con Intrastain como en el Ejemplo 124. La activación se realiza con "GMBS" 165 \muM, seguido de reacción con L-glicina 400 \muM (exceso molar 3 x) y reacción final con una solución premezclada de una concentración 0,015 \muM de péptido Nº 4 (PM 2201,3), con un epítopo doble para el anticuerpo p16 y que contiene un resto de fluoresceína en el extremo N y una cisteína en el extremo C, y péptido irrelevante (péptido Nº 6) 0,15 \muM (exceso 10 veces), péptido KI67 de motivo epitópico doble (1817,2 Da) que contiene una cisteína en el extremo C.

Una décima parte de la población de células se fija (paraformaldehído al 0,7% v/v en tampón PBS, pH 7,2, 15 minutos en hielo) y se evalúa en citometría de flujo para determinar el nivel de acoplamiento de fluoresceína y péptido. Se representa la señal media de fluorescencia (FL1) por célula después de 100000 acontecimientos.

El resto de las células se trata como una preparación FFPE, se montan en portaobjetos y se inmunovisualizan usando el anticuerpo monoclonal primario contra p16 (clon p16 E6H4, DakoCytomation), como se describe en el procedimiento general.

El mismo personal de laboratorio repitió el procedimiento entero desde el primer aislamiento de las células a la tinción y colocación final del cubreobjetos cuatro veces en paralelo.

Las Figuras 23A, B, C y D son fotografías de las cuatro preparaciones de células sf9 teñidas tomadas a 40 aumentos.

La intensidad de la tinción recibe una puntuación de +1 para todas las preparaciones - siendo el patrón de tinción y la localización casi idénticos en todas las preparaciones.

Las densidades medias de la señal fluorescente para la fluoresceína (FL1) para las cuatro preparaciones se resumen en la Figura 23E. La señal media de fluoresceína variaba de 133,9 a 192,8 unidades para las cuatro preparaciones.

En conclusión, el procedimiento pudo reproducirse cuatro veces para dar la misma intensidad de tinción con DAB. La medición de la señal fluorescente desde el péptido relevante puede usarse como un método independiente para estimar la densidad diana media en las células.

La variación observada en la densidad diana como se ve en el método de citometría de flujo no pudo detectarse por la inmunotinción de DAB/HRP.

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10. Uso del péptido p16 como diana y tinción con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) Envision/DAB de células sf9 intactas prefijadas, en una preparación FFPE

En este ejemplo, las células se tratan con DakoCytomation IntraStain^{TM} y se acoplan con diferentes concentraciones de agente de reticulación y mezclas del péptido de motivo p16 doble relevante y un péptido ki76 irrelevante para obtener la tinción específica con diferentes intensidades. La relación entre el agente de reticulación y la concentración total de péptido se mantiene constante.

Se aíslan 300 millones de células sf9, se prefijan y se tratan con Intrastain como en Ejemplo 124. La población de células se divide en tres poblaciones del mismo tamaño (A, B y C) y se activan en paralelo como se ha descrito anteriormente.

La activación se realiza con "GMBS" (A) 60 \muM, (B) 105 \muM o (C) 165 \muM, respectivamente, seguido de reacción con 3 equivalentes de L-glicina con respecto a GMBS: L-glicina (A) 180 \muM (B) 325 \muM y (C) 495 \muM.

Las células activadas con maleimida se hacen reaccionar con diferentes relaciones del péptido p16 relevante (péptido Nº 4 (PM 2201,3) y del péptido Ki-67 irrelevante (Nº 6, 1817,2 Da), conteniendo ambos una cisteína en el extremo C.

(A) Péptido Nº 4 0,015 \muM y péptido Nº 6 0,045 \muM, (B) péptido Nº 4 0,015 \muM y péptido Nº 6 0,090 \muM y (C) péptido Nº 4 0,015 \muM y péptido Nº 6 0,150 \muM.

En resumen, la relación de concentraciones entre L-glicina y GMBS y la relación de concentraciones entre GMBS y el péptido total se mantiene constante a 3.

La concentración del péptido p16 relevante se mantiene constante a 0,015 \muM, y la relación entre concentraciones de péptido relevante e irrelevante es 3, 6 y 10 respectivamente.

Las células se tratan como una preparación FFPE, se montan en portaobjetos y se inmunovisualizan usando el anticuerpo monoclonal primario contra p16 (clon p16, E6H4, DakoCytomation), como se describe en el procedimiento general.

Las Figuras 24A, B y C son fotografías de las células sf9 de FFPE teñidas con HRP/DAB tomadas a 40 aumentos con (A) exceso 3 x de péptido irrelevante, (B) exceso 6 x de péptido irrelevante (C) exceso 10 x de péptido irrelevante, respectivamente.

La intensidad de tinción, como se ve en el microscopio, recibe una puntuación de (A) 3+ (con muy pocos 1+), (B) 1,0-2,0+ y (C) 0,5-1,0+, respectivamente.

Además, el patrón de tinción y la localización son iguales para las tres preparaciones.

En conclusión, por medio de una simple variación del agente de reticulación, las concentraciones de diana específica y péptido irrelevante durante la activación y el acoplamiento, puede controlarse el nivel de tinción. El nivel relevante desde el punto de vista del diagnóstico puede ajustarse a 0,5 - 1,0+, que es de esperar que sea un valor de tinción umbral deseado desde el punto de vista del diagnóstico para, por ejemplo, la diana p16 en muestras cervicales.

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11. Uso del péptido p16 como diana y tinción con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) Envision/DAB de células sf9 intactas prefijadas en una preparación citológica TrinPrep o Autocyte/TriPath

Las células se tratan con DakoCytomation IntraStain^{TM} y se acoplan con una mezcla del péptido de motivo de p16 doble relevante y un péptido Ki-67 irrelevante.

Se aíslan 200 millones de células sf9 intactas, se prefijan y se tratan con Intrastain como en el Ejemplo 124. La activación se realiza con "GMBS" 20 \muM seguido por reacción con L-glicina 60 \muM (exceso molar 3 x) y reacción final con una solución premezclada de una concentración 0,04 \muM de péptido Nº 4 (PM 2201,3) y péptido KI67 irrelevante 0,4 \muM (Nº 6, 1817,2 Da), que contiene una cisteína en el extremo C.

Las células se tratan como ThinPrep o se tratan manualmente con una preparación Autocyte/TriPath como se describe en la sección general.

Las dos preparaciones se inmunovisualizan usando el anticuerpo monoclonal primario contra p16 (clon p16 E6H4, DakoCytomation) como se ha descrito en el procedimiento general.

Las Figuras 25A, B son fotografías de las células sf9 teñidas y tratadas con (A) ThinPrep o (B) Autocyte/TriPath tomadas a 20 aumentos.

La preparación ThinPrep representada en la Figura 25A está muy teñida y recibe una puntuación de 3-4+.

La preparación Autocyte/TriPath representada en la Figura 25B recibe una puntuación de 0-2+, recibiendo algunas células una puntuación de 2+ y algunas apareciendo casi sin teñir.

Los dos métodos de preparación proporcionaron un aspecto global de las células y un nivel de tinción muy diferente.

En conclusión, los métodos generales ThinPrep y Autocyte/TriPath usados ampliamente para tratar muestras citológicas pueden tratar el material de referencia. Los diferentes procedimientos dieron como resultado diferentes niveles de tinción y un aspecto global para el sistema modelo elegido.

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12. Uso de péptido HER2 neu como diana y tinción fluorescente de células de ovario de hámster chino (CHO) prefijadas enteras evaluados por citometría de flujo

Se aíslan 30 millones de células de ovario de hámster chino (CHO) como se ha descrito anteriormente en el experimento I con la excepción de la etapa de lisis.

Las células se prefijan usando una concentración final de 0,7% v/v de paraformaldehído en un tampón PBS, pH 7,2 y se dejan durante 15 minutos en hielo antes de la activación con GMBS.

La activación se realiza con "GMBS" 1,0 \muM seguido de reacción con L-glicina a 3,0 \muM (exceso molar 3 x) con respecto a "GMBS" y reacción final con una concentración 0,25 \muM de péptido HER2/neu (péptido Nº 3, epítopo para el anticuerpo Dakocytomation A0485, PM 1674,8), que contiene una cisteína en el extremo C.

La población de células se tiñe y se evalúa usando un citómetro de flujo siguiendo los procedimientos de citómetro de flujo generales descritos previamente.

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Las Figuras 26A, B y C muestran las células de control CHO no teñidas.

La fluorescencia del canal FL1 es muy baja (Figura 26C, parte derecha inferior).

Las Figuras 27A, B y C muestran las células CHO modificadas con HER2 incubadas con un grupo de inmunoglobulinas de control negativo para F(ab)_{2} (DakoCytomation X0929) y F(ab)_{2} porcino marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-inmunoglobulinas de conejo/FITC (DakoCytomation F0054).

La fluorescencia del canal FL1 es muy baja (Figura 27C, parte derecha inferior), indicando un bajo nivel de fondo inespecífico.

Las Figuras 28A, B y C muestran las células CHO modificadas con HER2 incubadas con inmunoglobulinas de conejo anti-HER2/neu (DakoCytomation A0485) y F(ab)_{2} porcino anti-inmunoglobulinas de conejo/FITC (DakoCytomation F0054).

La Figura 28C (parte derecha superior) muestra una fluorescencia FL1 muy elevada por la expresión del péptido HER2/neu de células positivas inmunomarcadas con inmunoglobulinas de conejo anti-HER2/neu y F(ab)_{2} porcino anti-inmunoglobulinas de conejo/FITC.

En conclusión las células pueden teñirse y evaluarse por citometría de flujo. El nivel de fondo no específico es muy bajo como se indica por la tinción usando anticuerpo no específico del mismo origen que el anticuerpo específico. Además, la autofluorescencia de las células solas es baja.

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13. Uso del péptido HER2 neu como diana y tinción fluorescente de células de ovario de hámster chino (CHO) enteras prefijadas evaluadas por citometría de flujo

En este ejemplo, la prefijación, es más leve y la cantidad de péptido diana es menor que en el ejemplo previo. Se compara la homogeneidad de la célula.

Se aíslan 20 millones de células de ovario de hámster chino (CHO) como se ha descrito anteriormente en el experimento 1 - con la excepción de la etapa de lisis. Las células se prefijan usando una concentración final de 0,5% v/v de paraformaldehído en tampón PBS, pH 7,2 y se dejan durante 15 minutos en hielo antes de la activación con GMBS.

La activación se realiza con "GMBS" 1,0 \muM, seguido de reacción con L-glicina 3,0 \muM (exceso molar 3 x) con respecto a "GMBS", y reacción final con una concentración 0,20 \muM de péptido HER2/neu (péptido Nº 3, epítopo para el anticuerpo Dakocytomation A0485, PM 1674,8) que contiene una cisteína en el extremo C.

La población de células se tiñe y se evalúa siguiendo los procedimientos del citómetro de flujo general descritos previamente.

La Figura 29 muestra las células de control CHO no teñidas.

La fluorescencia del canal FL1 es muy baja (Figura 29C, parte derecha inferior).

Las Figuras 30A, B y C muestran las células CHO modificadas por HER2 incubadas con un grupo de inmunoglobulina de control negativo para F(ab)_{2} de conejo (DakoCytomation X0929) y un F(ab)_{2} porcino marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-inmunoglobulinas de conejo/FITC (DakoCytomation F0054). La fluorescencia del canal FL1 es muy baja (Figura 30C, parte inferior derecha), que indica un bajo nivel de fondo inespecífico como en el ejemplo previo.

Las Figuras 31A, B y C muestran las células CHO modificadas con HER2 incubadas con anticuerpo anti-HER2/neu (DakoCytomation A0485) y F(ab)_{2} porcino anti-inmunoglobulinas de conejo/FITC (DakoCytomation F0054).

La Figura 31C (parte superior derecha) muestra una alta fluorescencia FL1 de la expresión del péptido HER2/neu de células positivas inmunomarcadas con anticuerpo de conejo anti-HER2/neu y F(ab)_{2} porcino anti-Inmunoglobulinas de conejo/FITC.

La Figura 32 muestra el histograma de una serie de flujo de microperlas de calibración usadas para asegurar la calidad y reducir la variabilidad de los datos de la citometría de flujo.

En comparación con el ejemplo previo (ejemplo 13), la auto fluorescencia y el nivel de fondo no específico están aproximadamente al mismo nivel bajo. La señal específica es algo superior. Esto indica una influencia significativa desde las condiciones de prefijación sobre la intensidad final de la señal fluorescente.

Los gráficos de dispersión frontal y lateral (Figura 29A, 30A, 31A) indican una población de células menos homogénea con respecto al tamaño y la granularidad que en la preparación que usa una mayor concentración durante la etapa de prefijación (Figura 26A, 27A, 28A).

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14. Uso del péptido HER2 neu como diana y tinción fluorescente de células de ovario de hámster chino (CHO) prefijadas enteras evaluado por citometría de flujo

Durante la activación se usan diferentes concentraciones de agente de reticulación. Se incluye un péptido no relevante.

En resumen, se aíslan aproximadamente 20 millones de células de CHO como se ha descrito anteriormente en los experimentos A y B y se activan con un nivel diferenciado de "GMBS" (0,04 \muM, 0,20 \muM y 1,00 \muM, respectivamente), que se hacen reaccionar con un exceso molar 3 x de L-glicina con respecto a "GMBS" y finalmente se hace reaccionar con péptido HER2/neu 0,04 \muM (péptido Nº 3, epítopo para el anticuerpo Dakocytomation A0485) o el péptido HER3 irrelevante (péptido Nº 7, PM 1617 Da) conteniendo ambos una cisteína en el extremo C.

Las poblaciones de células se tiñen y se evalúan siguiendo los procedimientos de citometría de flujo generales descritos previamente.

La Figura 33 muestra las células de control CHO no teñidas preparadas usando el alto nivel de GMBS (1,00 \muM) y la diana HER2. La fluorescencia del canal FL1 es baja (Figura 11C, parte inferior derecha).

La Figura 34 muestra células CHO preparadas usando el alto nivel de GMBS (1,00 \muM) y la diana HER2. Incubadas con grupo de inmunoglobulinas de control negativas para F(ab)_{2} de conejo (DakoCytomation X0929) y F(ab)_{2} porcino marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-inmunoglobulinas de conejo/FITC (DakoCytomation F0054).

La Figura 35 muestra la baja fluorescencia de células CHO, preparadas usando el alto nivel de GMBS (1,00 \muM) y la diana HER3 irrelevante e inmunomarcada directamente con anticuerpo de conejo de marcado con isocianato de fluoresceína (FITC), específico para el receptor de proteína HER2/neu (DAKOCYTOMATION).

Las Figuras 36, 37 y 38 muestran los datos del citómetro de flujo después del inmunomarcaje directo de las tres poblaciones celulares modificadas con HER2 diferentes (GMBS 0,04 \muM, 0,20 \muM y 1,00 \muM, respectivamente), con anticuerpo de conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), específico para el receptor de la proteína HER2/neu (Dakocytomation A40485 marcado con FITC).

En resumen, la Figura 36 muestra una señal de tinción baja, la Figura 37 muestra una señal de tinción media y la Figura 38 muestra una señal de tinción alta.

En conclusión, la concentración del agente de reticulación durante la activación puede usarse para ajustar la señal de tinción fluorescente específica resultante. Esto es importante para obtener células de referencia con diversas intensidades de tinción.

La autofluorescencia es baja como se ilustra en la Figura 11. La señal no específica es baja, como se ilustra en las Figuras 12 y 13.

Sin embargo, debe verse claramente que las poblaciones parecen dividirse en dos (Figura 34 y 35).

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15. Uso del péptido HER2/neu o HER2 fosforilado como diana y tinción fluorescente de células sf9 prefijadas enteras evaluadas por citometría de flujo

Se aíslan 40 millones de células Sf9 como se ha descrito anteriormente, se prefijan usando una concentración final de 0,50% v/v de paraformaldehído, activado con "GMBS" 2,0 \muM, se hacen reaccionar con un exceso molar 3 x de L-glicina con respecto a "GMBS" y finalmente se dividen en dos poblaciones y se hacen reaccionar con (A) péptido HER2/neu 0,08 \muM "SP991729" (péptido Nº 3, 1676,9 Da, epítopo para anticuerpo de conejo Dakocitomation A0485) o (B) fosfotirosina 0,08 \muM que contiene péptido HER2/neu "NVP-ABN-379-A1-1" (péptido Nº 8, Pm 1753,8 Da, epítopo para anticuerpo monoclonal Dakocytomation DAK-H2-PY-1248), conteniendo ambos una cisteína en el extremo C.

Las dos poblaciones de células se tiñen y se evalúan siguiendo los procedimientos de citometría de flujo generales descritos previamente.

La Figura 39 muestra las células de control Sf9 de HER2 no teñidas (población A).

La Figura 40 muestra las células de control Sf9 HER2 (población A) incubadas con un grupo de inmunoglobulina de control negativa de conejo (DakoCytomation X0903) y F(ab)_{2} porcino anti-inmunoglobulinas de conejo/FITC (DakoCytomation F0054).

La Figura 41 muestra las células de control Sf9 con péptido PhosphoHER2 no teñidas (población B).

La Figura 42 muestra las células de control Sf9 con péptido PhosphoHER2 (B) incubadas con inmunoglobulina de control negativa para IgG1 de ratón (Dakocytomation X0931) y F(ab)_{2} de conejo anti-inmunoglobulinas de ratón/FITC (Dakocytomation F0313).

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La Figura 43 muestra la tinción específica de las células de control Sf9 HER2 (población A).

La Figura 43A muestra la distribución de células en una transferencia puntual (dot blot) de dispersión frontal (FSC-H) frente a dispersión lateral (SSC-H) y la Figura 43B muestra dos poblaciones con diferentes niveles de expresión del péptido HER2/neu.

La Figura 43C muestra la alta fluorescencia de la expresión del péptido HER2/neu de células positivas incubadas con inmunoglobulinas de conejo anti-HER2/neu (Dakocytomation A0485, 0,1 g/l) y F(ab)_{2} porcino anti-inmunoglobulinas de conejo/FITC (Dakocytomation F0054).

La Figura 44 muestra la tinción específica de las células de control Sf9 con péptido PhosphoHER2 (B).

La Figura 44A muestra la distribución de células en una transferencia puntual de dispersión frontal (FSC-H) frente a la dispersión lateral (SSC-H) y la Figura 44B muestra dos poblaciones con diferentes niveles de expresión del péptido HER2/neu que contiene fosfotirosina.

La Figura 44C muestra la alta fluorescencia de la expresión del péptido HER2 fosforilado de células positivas incubadas con Anticuerpo Monoclonal Anti-Fosforilación-Específico de Estado HER2-PY1248 (Dakocytomation DAK-H2-PY-1284, 0,1 g/l) y F(ab)_{2} de conejo anti-inmunoglobulinas de ratón/FITC (Dakocytomation F0313).

La autofluorescencia y la tinción no específica son bajas (Figura 39, 40, 41 y 42). La tinción específica ilustra la posibilidad de teñir específicamente los dos derivados HER, que conjuntamente tienen interés de diagnóstico.

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16. Uso de FITC como diana y tinción con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) EnVision/DAB de células PEGA artificiales, en una preparación FFPE

En este ejemplo, como sistema de referencia se usan resinas artificiales hechas por el hombre. La resina es una resina de amino polietilenglicol (PEGA) modificada con FITC. La resina tiene una forma parecida a una célula y se caracteriza por su capacidad especial de hincharse tanto en disolventes orgánicos como en disolventes acuosos.

La resina amino PEGA (resina de Amino polietilenglicol, Novabiochem, San Diego, USA, Nº de código 01-64-0100) tiene el aspecto de partículas esféricas ligeramente amarillas. La modificación con FITC (5-isotiocianato de fluoresceína, "Isómero I", Molecular Probes, Nº de código F-1906) se realiza por acoplamiento directo a una parte de los grupos amino en un disolvente orgánico.

En resumen, la modificación se realiza lavando 1,0 g de la resina PEGA tres veces con tolueno (LabScan, Dinamarca, Nº de código H6518, 2 minutos, 10 ml/g a temperatura ambiente), seguido de reacción con una concentración 1 mM o 10 mM de FITC (1% en NMP, LabScan, Dinamarca) y trietilamina 10 mM (Aldrich, Nº de código 13.206-0).

Después de 17 horas de mezcla por inversión, las reacciones se detienen lavando 5 veces con agua. En paralelo, también se lava la resina PEGA no modificada.

Las resinas PEGA lavadas modificadas y no modificadas se incrustan por separado en una solución de agarosa (agarosa al 2% en peso, calidad de proteína HSA 1000, en PEI al 0,05% (Fluka Nº de código 03880) solución de TBS (DakoCytomation, K5325, pH 7,5 en litro de agua) y 100 mg de resina y se mezclan bien en 130 \mul de agua y además se añaden 400 \mul de solución de agarosa calentada a 60-62ºC e inmediatamente después se extrae en una jeringa de 1 ml. Después de que se haya enfriado la agarosa, se corta la punta de jeringa con una cuchilla afilada y el gel solidificado se vierte suavemente en agua.

Las piezas de gel se enrollan en papel limpiador de lentes de microscopio como se ha descrito en general previamente.

La fijación, deshidratación y alguna parte de la incrustación con parafina se realizan automáticamente en un procesador automático de tejidos Shandon Excelsior (Termo Shandon, AxLab, Vedbaer, Dinamarca). Las histocápsulas con la resina incrustada en el gel se transfieren a la cámara y se fijan durante 4 horas en formalina tamponada neutra (3,7% en PBS) a temperatura ambiente. Se deshidrata en seis etapas con una cantidad creciente de etanol, desde etanol al 70% a etanol al 99,9%, durando cada etapa 30 minutos con vacío a 30ºC. Posteriormente, la resina incrustada con gel se trata 3 veces durante 20 minutos con xileno con vacío a 30ºC. Para terminar el proceso, se trata 3 veces durante 80 minutos con parafina fundida a 60-62ºC con vacío. Cuando finaliza, se deja en parafina fundida a 60-62ºC durante una noche.

Las histocápsulas con la resina se transfieren a parafina fundida a 60-62ºC nueva y se incrustan en bloques de parafina como se ha descrito en general anteriormente.

El bloque de FFPE de la resina PEGA modificada o no modificada con FITC se corta, se monta en vidrios de microscopio recubiertos con poli-L-lisina (Electron Microscopy Science, código Nº 63410-01), y se desparafina como se ha descrito en general anteriormente.

La inmunovisualización de la resina PEGA modificada con FITC así como de la resina PEGA no modificada se realiza como se ha descrito previamente en el procedimiento general, incluyendo controles de anticuerpo primario, el sistema de visualización y la resina. En resumen, el anticuerpo policlonal primario (F(ab')) es anticuerpo anti-FITC-HRP de ratón (DakoCytomation Nº de código P5100, dilución 1:50), el control negativo de anticuerpo primario es IgG de conejo (DakoCytomation Nº de código X0936, dilución 1:1000). Seguido de inmunoglobulinas de cabra anti-ratón/de cabra anti-conejo y polímero de dextrano marcado con peroxidasa de rábano picante (DakoCytomation Nº de código K5007), y para el control negativo del sistema de visualización de inmunoglobulinas de cabra anti-ratón y polímero de dextrano marcado con peroxidasa de rábano picante (DakoCytomation Nº de código K4006). Finalmente, un sustrato cromogénico de diaminobencidina (DakoCytomation Nº de código K5007).

Las Figuras 45A, 45B y 45C son fotomicrografías de las resinas PEGA teñidas con DAB en un microscopio de campo brillante, tomadas, a 20 aumentos.

Las Figuras 45A y 45B son la resina PEGA teñida con DAB acoplada con una concentración 1 nM y 10 mM de FITC, respectivamente.

Las Figuras 45C y 45D son la resina PEGA teñida usando un anticuerpo primario de control negativo y el control EnVision negativo, respectivamente, ambos en la resina PEGA altamente modificada por FITC.

La Figura 45E es la resina PEGA no modificada teñida con DAB con anti-Fitc y EnVision.

La Figura 45F es una Figura representativa de fotomicrografías de resina modificada con FITC 10 mM (igual que en la Figura 45B) y la Figura 45G es la resina no modificada, tomada en un microscopio fluorescente a 16 aumentos.

En general, se observa una inmunotinción en la resina individual. Algunas perlas de la resina parecen estar huecas en el centro. La intensidad de la tinción recibe una puntuación de 1,5-2 en la Figura 45A (FITC 1 mM) y una puntuación de 2-2,5 en la Figura 45A (FITC 10 mM).

El control negativo del anticuerpo y el control del sistema de visualización secundario reciben una puntuación hasta 0,5 y la intensidad de tinción de la resina no modificada recibe una puntuación hasta 0. Esto indica un nivel de fondo general muy bajo debido a la resina y la modificación.

Además, la fluorescencia muestra algo de la modificación poco homogénea de la resina. La resina no modificada tenía una autofluorescencia muy baja.

En conclusión, es posible usar una resina artificial parecida a una célula y modificarla con un hapteno general bien conocido, inmunovisualizarla con tinción con DAB y evaluarla en un microscopio óptico de campo brillante.

La intensidad de la tinción se gradúa claramente por el alto y bajo grado de modificación de hapteno (Figura 45A y 45B) e indica la posibilidad de obtener un material de referencia con una baja intensidad de tinción, que se distingue claramente del efecto de fondo.

El material podría ser útil para la validación del sistema de visualización o el manual entero o el proceso de tinción automático.

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Ejemplo 17 Uso de inmunoglobulina de conejo como diana y tinción con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) EnVision/DAB de células de agarosa artificial, en una preparación FFPE

En este ejemplo, se usa una matriz de carbohidrato artificial hecha por el hombre como control del sistema de visualización. La matriz es una matriz activada con divinil sulfona modificada con IgG de conejo de perlas de agarosa esféricas, que tiene una forma parecida a una célula.

En resumen, la modificación de la matriz activada con vinil sulfona reactiva con amino, hidroxilo y tiol (Mini Leak, Kem-En-Tec, Copenhague, Nº de código 1012) con IgG de conejo (DakoCytomation Nº de código X0936) se realiza como un acoplamiento directo en tampón acuoso.

Con más detalle, la modificación se realiza lavando 1,7 g de la matriz Mini Leak 3 veces con agua (2 minutos, 10 ml/gramo a temperatura ambiente) seguido de reacción con 0,65 mg (0,50 mg/ml de matriz) o 1,95 mg (1,50 mg/ml de matriz) de IgG de conejo dializada (DakoCytomation, Nº de código X0936, NaCl 0,1 M, carbonato 50 mM a pH 9,0).

Después de 17,5 horas a temperatura ambiente mezclando por inversión, se inactiva con etanolamina (en total 0,010 M, pH 9,0). Después de 30 minutos, la matriz se lava 3 veces en agua (2 minutos, 10 ml/g a temperatura ambiente). En paralelo, también se lavan en agua matriz Mini Leak no modificada.

Las dos matrices Mini Leak modificadas con IgG y la matriz Mini Leak lavada y no modificada se incrustan por separado en una solución de agarosa como se ha descrito anteriormente.

Las piezas de gel se enrollan en papel limpiador de lentes de microscopio como se ha descrito en general anteriormente.

La fijación, deshidratación y alguna parte de la incrustación en parafina se realizan automáticamente en un procesado automático de tejidos Shandon Excelsior como se ha descrito previamente.

Las histocápsulas con la matriz se transfieren a parafina fundida a 60-62ºC nueva y se incrusta en bloques de parafina como se ha descrito en general anteriormente.

El bloque de FFPE de la matriz Mini Leak modificada con IgG de conejo o no modificada se corta, se monta en vidrios de microscopio recubiertos con Poli-L-lisina (Electron Microscopy Sciences, Nº de código 63410-01) y se desparafina como se ha descrito en general anteriormente.

La inmunovisualización de la matriz Mini Leak modificada con IgG de conejo así como la matriz Mini Leak no modificada se realiza como se ha descrito previamente en el procedimiento general, incluidos los controles del sistema de visualización y la matriz. En resumen, no se usa ningún anticuerpo primario. Visualización por inmunoglobulinas de cabra anti-ratón/cabra anti-conejo y polímero de dextrano marcado con peroxidasa de rábano picante (DakoCytomation Nº de código K5007) y para control negativo del sistema de visualización inmunoglobulinas de cabra anti-ratón y polímero de dextrano marcado con peroxidasa de rábano picante (DakoCytomation Nº de código K4006). Finalmente, un sistema de sustrato cromogénico de diaminobencidina (DakoCytomation Nº de código K5007).

Las Figuras 46, 47 y 48 son fotomicrografías de la matriz Mini Leak teñida con DAB como se ve en un microscopio de campo brillante.

Las Figuras 46A y 46B muestran fotomicrografías representativas de la matriz Mini Leak teñida con DAB modificada con 0,5 mg de IgG de conejo/ml, tomada a 10 y 20 aumentos, respectivamente.

Las Figuras 47A y 47B muestran fotomicrografías representativas de la matriz Mini Leak teñida con DAB modificada con 1,5 mg de IgG de conejo/ml, tomadas a 10 y 20 aumentos respectivamente.

La Figura 48A es el control negativo de EnVision usando conjugados de cabra anti-ratón, y la Figura 48B es una fotomicrografía de la matriz Mini Leak no modificada teñida con DAB y HRP EnVision, todas tomadas a 10 aumentos.

La intensidad de tinción recibe una puntuación de 0,5-1 en la Figura 46 (0,5 mg de IgG de conejo/ml de matriz) y 0,5-1 en la Figura 47 (1,5 mg de IgG de conejo mg/ml de matriz). La intensidad de tinción global se estima a 10 aumentos.

Se observa una inmunotinción a lo largo de toda la matriz individual. La baja puntuación de la matriz (Figura 47) parece tener pocas perlas con mayor intensidad de tinción.

La intensidad de tinción es ligeramente mayor en la superficie exterior del borde que en el interior de las perlas. Los diferentes tamaños de las perlas individuales se deben al proceso de corte y podrían deberse a una distribución no uniforme de los tamaños de las perlas originales. Unas pocas perlas tienen pequeñas cavidades en la parte central. No se observa ningún desecho significativo y todas las perlas parecen esféricas, indicando una buena calidad de la infiltración de parafina y el posterior corte.

El control del sistema de visualización recibe una puntuación de 0 y el control de la matriz recibe una puntuación menor de 0,5, Figura 48A y 48B, respectivamente.

En conclusión, es posible usar un material de afinidad sencillo como referencia artificial parecida a una célula y modificarlo con una inmunoglobulina de conejo, inmunovisualizarlo con tinción con DAB y evaluar en un microscopio óptico de campo brillante.

La matriz nativa y no modificada proporcionó una intensidad de tinción de fondo muy baja debido a la naturaleza de la matriz.

El material de referencia anterior podría ser útil para validación de la funcionalidad del segundo sistema de visualización. Además, la intensidad de tinción es baja y en el nivel relevante para muchos kit de diagnóstico IHC.

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18. Uso del péptido HER2 como diana y tinción con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) EnVision/DAB de células artificiales en una preparación FFPE

En este ejemplo, la matriz Mini Leak se acopla con el péptido HER2 y un péptido irrelevante para obtener una tinción específica a usar como referencia del reactivo primario.

La modificación de la matriz Mini Leak con el péptido HER2 (péptido Nº 3, epítopo para el anticuerpo DakoCytomation A0485) y un péptido p16 (péptido Nº 4) se realiza por acoplamiento directo entre el péptido que contiene tiol y la matriz activada con vinil sulfona en un disolvente acuoso.

El péptido p16 actúa como un péptido irrelevante en este ejemplo. La concentración del péptido diana se varía y la concentración total de péptido es constante para los acoplamientos.

Con más detalle, las seis modificaciones diferentes se realizan lavando 0,85 g de la matriz Mini Leak 2 veces en HEPES 50 mM, EDTA 2,5 mM pH 8 (20 minutos, 10 ml/gramo a temperatura ambiente), seguido por reacción con

a) 0,0 g/l de HER2 y 0,0 g/l de P16,

b) 0,01 g/l de HER2 y 0,19 g/l de P16,

c) 0,05 g/l de HER2 y 0,15 g/l de P16,

d) 0,10 g/l de HER2 y 0,10 g/l de P16

e) 0,15 g/l de HER2 y 0,05 g/l de P16 o

f) 0,19 g/l de HER2 y 0,01 g/l de P16, respectivamente

En total, una concentración de péptidos combinados de 0,20 g/l, en tampón Hepes (HEPES 100 mM, EDTA 5 mM, DMF al 5%, pH 8,0).

Después de 17 horas a temperatura ambiente de mezcla por agitación, las perlas se inactivan con un volumen 1/10 de etanolamina 0,1 M pH 9,0. Después de 30 minutos, la matriz se lava dos veces en HEPES 50 mM, EDTA 2,5 M, pH 8,0 (20 minutos, 10 ml/gramos a temperatura ambiente). En paralelo, también se lava la matriz Mini Leak no modificada.

Las matrices Mini Leak lavadas modificadas y no modificadas se incrustan por separado en una solución de agarosa y las piezas de gel se enrollan en papel limpiador de lentes de microscopio como se ha descrito previamente.

La fijación, deshidratación y la primera parte de la incrustación en parafina se realizan automáticamente en un procesador automático de tejidos Shandon Excelsior como se ha descrito previamente. Sin embargo, se fijó en NBF al 0,4% en lugar de una fijación con NBF al 3,7%.

Las histocápsulas con la matriz se transfieren a parafina fundida a 60-62ºC nueva y se incrustan en bloques de parafina como se ha descrito en general anteriormente.

El bloque de FFPE de la matriz Mini Leak modificada o no modificada con péptido HER2 se corta, se monta en vidrios de microscopio recubiertos con poli-L-lisina y se desparafina como se ha descrito en general anteriormente.

La inmunovisualización de la matriz Mini Leak modificada con el péptido HER2 así como de la matriz Mini Leak no modificada se realiza manualmente de acuerdo con el protocolo de HercepTest^{TM} (DakoCytomation Nº código K5205).

La inmunovisualización incluye el control del anticuerpo primario, así como del sistema de visualización, el acoplamiento, la matriz y un portaobjetos de control con diferentes líneas de células de referencia HER2 suministradas con el kit HercepTest^{TM}.

En resumen, el anticuerpo primario es el anticuerpo de conejo anti-proteína HER2 humana y como control negativo se usa IgG de conejo. La visualización se realiza por inmunoglobulinas de cabra anti-conejo y polímero de dextrano marcado con peroxidasa de rábano picante. El control negativo del sistema de visualización se realiza por inmunoglobulinas de cabra anti-ratón y polímero de dextrano marcado con peroxidasa de rábano picante (DakoCytomation Nº de código K4006). Finalmente se usa un sistema de sustrato cromogénico de diaminobencidina.

De la Figura 49A a la Figura 49F son fotomicrografías de la matriz Mini Leak teñida con DAB acoplada con (a) 0,0 g/l, (b) 0,01 g/l, (c) 0,05 g/l, (d) 0,10 g/l, (e) 0,15 g/l o (f) 0,19 g/l de péptido diana HER2, respectivamente. Todas las fotomicrografías se tomaron a 20 aumentos en un microscopio de campo brillante.

La Figura 50 representa las diversas tinciones de control: control de anticuerpo primario negativo (Figura 50A) y control negativo para Envision (Figura 50B), ambos en matriz Mini leak de 0,19 g/l de HER2. La Figura 50C es la matriz mini leak no modificada teñida con el Herceptest. Las Figuras 50D, E y F son portaobjetos de control de HercepTest^{TM}.

Se observa una inmunotinción muy similar a la tinción citoplásmica homogénea a lo largo de las células de la matriz individuales teñidas positivamente.

La intensidad de tinción recibe una puntuación de 0+ en la Figura 49B (0,01 g/l HER2) y aproximadamente 1+ en las Figuras 49 C, D, E y F (0,05-0,19 g/l de HER2). Los cuatro portaobjetos 1+ tenían números crecientes de células individuales teñidas con una mayor intensidad, pero la puntuación global de la tinción fue de aproximadamente 1+.

El control del acoplamiento, el sistema de visualización, el anticuerpo y la matriz recibieron una puntuación de 0+ en las Figuras 50 A, B y C. El portaobjetos de control HercepTest^{TM} tiene una puntuación de 0, 1+ y 3+ como se especifica en las instrucciones del kit.

En conclusión, es posible usar la matriz parecida a células artificiales y modificarla con una pequeña diana como el péptido HER2 con diferentes concentraciones, inmunovisualizarla con tinción con DAB y evaluarla en un microscopio óptico de campo brillante. El nivel de concentración de péptido durante la modificación covalente de la matriz proporcionó la inmunotinción graduada.

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19. Uso del péptido p16 como diana y tinción con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) Envision/DAB de células artificiales, en una preparación FFPE

En este ejemplo, la matriz mini leak se acopla con un péptido p16 y un péptido HER2 irrelevante de forma similar al ejemplo anterior.

La modificación de la matriz mini leak con el péptido p16 y un péptido irrelevante (HER2), y la preparación FFPE se describe en el ejemplo previo.

La inmunovisualización de la matriz Mini Leak modificada con el péptido p16 así como la matriz Mini Leak no modificada se realiza manualmente de acuerdo con el protocolo del kit de citología CINtec^{TM} p16^{INK4a} (DakoCytomation Nº de código K5339).

En la inmunovisualización se incluye el control del anticuerpo primario, así como del sistema de visualización, el acoplamiento y la matriz.

En resumen, el anticuerpo primario es anticuerpo de ratón anti-p16^{INK4a} humano y el control negativo es IgG2a de ratón. La visualización se realiza por inmunoglobulinas de cabra anti-ratón y polímero de dextrano marcado con peroxidasa de rábano picante. El control negativo del sistema de visualización consta de inmunoglobulinas de cabra anti-conejo y polímero de dextrano marcado con peroxidasa de rábano picante (DakoCytomation Nº de código K4003). Finalmente se usa un sistema de sustrato cromogénico de diaminobencidina.

La Figura 51 es un gráfico de la matriz Mini Leak teñida con DAB CINtec^{TM} p16^{INK4a} en un microscopio de campo brillante, tomada a 20 aumentos.

Las Figuras 51A a 51F son fotomicrografías de la matriz Mini Leak teñida con DAB acoplada con (a) 0,0 g/l, (b) 0,19 g/l, (c) 0,15 g/l, (d) 0,10 g/l, (e) 0,05 g/l o (f) 0,01 g/l de péptido diana p16, respectivamente.

La Figura 52 muestra las diversas tinciones de control: Control de anticuerpo primario negativo (Figura 52A) y control negativo Envision (Figura 50B), ambos en 0,19 g/l de matriz Mini Leak HER2. La Figura 52C es la matriz Mini Leak no modificada teñida con el kit CINtec^{TM} p16^{INK4a}.

Como en el ejemplo previo, se observa una inmunotinción homogénea a lo largo de toda la matriz individual.

La intensidad de tinción recibe una puntuación de 0,5+ a 3+ en la Figura 51F (0,01 g/l p16), de 1+ a 3+ en las Figuras 51 B, C, D y E (de 0,19 hasta 0,05 g/l de p16). La intensidad de la tinción se distribuyó de una manera algo heterogénea entre las células individuales.

El control del acoplamiento, el sistema de visualización, el anticuerpo y la matriz recibieron una puntuación de 0 (Figuras 52A-C), pero se observó alguna tinción de fondo en la agarosa entre las perlas individuales.

En conclusión, es posible usar la matriz de tipo de célula artificial y modificarla con una pequeña diana como el péptido p16, inmunovisualizarla con tinción con DAB y evaluar en el microscopio óptico de campo brillante.

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20. Medición del tamaño de las células artificiales

El siguiente ejemplo resume la medición del tamaño de las células artificiales obtenidas en los ejemplos 16 y 18.

Con más detalle, se cortaron los bloques de FFPE con resina PEGA modificada con Fitc (ejemplo 16, acoplado con FITC 10 mM) y matriz Mini Leak modificada con p16/HER2 (ejemplo 18, matriz Mini Leak modificada con 0,15 g/l de HER2 y 0,05 g/l de p16), se montaron y se tiñeron como se ha descrito previamente. El tamaño se calculó a 20 aumentos de forma relativa con la barra de escala calibrada.

Las diez perlas PEGA más grandes en 5 portaobjetos se midieron en dos direcciones (horizontal y perpendicular). La mayor tuvo 221 micrómetros y la media de las diez perlas grandes fue de 173 micrómetros. La Tabla 1A presentada a continuación resume los resultados.

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TABLA 1A

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Se evaluaron diez portaobjetos con matriz Mini leak modificada con p16. Se midió el tamaño de cada célula artificial individual. La mayor tuvo 152 micrómetros. La media de 20 células fue de 123 micrómetros. La Tabla 1B presentada a continuación resume los resultados para los diez portaobjetos mini leak con HER2.

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TABLA 1B

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Como las perlas individuales se cortan en diversos sitios, el tamaño de las células varía en gran medida. Las perlas o células mayores tenían 221 micrómetros y podían verse fácilmente en el campo de visualización del microscopio de campo brillante.

Aunque la invención se ha descrito en relación con realizaciones preferidas específicas, debe entenderse que la invención según se reivindica no debe limitarse de forma indebida a dichas realizaciones especificas. De hecho, dentro del alcance de las reivindicaciones se incluyen diversas modificaciones de los modos descritos para realizar la invención que son evidentes para los especialistas en biología molecular o campos relacionados. Estas modificaciones de los modos descritos para realizar la invención sólo pertenecen realmente a la presente invención en la medida en la que están incluidas.

Claims

1. Un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el patrón de referencia un medio de incrustación, una partícula compacta que tiene una forma compacta con una cantidad de entidad detectable acoplada químicamente a la misma y soportada por el medio de incrustación, donde la partícula compacta es una partícula compacta biológica, preferiblemente una partícula compacta celular.

2. Un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el patrón de referencia un medio de incrustación, una partícula compacta que tiene una forma compacta con una cantidad de entidad detectable acoplada a la misma y soportada por el medio de incrustación, donde la partícula compacta es una partícula compacta no biológica que tiene dimensiones parecidas a las de una célula.

3. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que una cantidad detectable de la entidad detectable está presente en una región definida en una sección transversal del patrón de referencia.

4. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, donde la entidad detectable adopta una forma compacta, preferiblemente una forma no extendida o no alargada, en el medio de soporte.

5. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la forma compacta es tal que la relación entre la dimensión más larga y la dimensión más corta es menor de 5:1, preferiblemente menor de 2:1.

6. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la forma compacta comprende una forma en partículas, uniforme o regular.

7. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la forma compacta comprende una forma esférica, una forma ovoide, una forma de elipse, una forma de disco, una forma de célula, una forma de píldora o una forma de cápsula.

8. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la entidad detectable es heteróloga con respecto a la partícula compacta.

9. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 1 o cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 dependientes de la misma, donde la partícula compacta comprende una célula o un virus.

10. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 9, donde la célula o el virus no expresa la entidad detectable.

11. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, donde la célula se selecciona entre el grupo consistente en: una célula bacteriana, una célula eucariota, una célula de insecto, una célula animal, una célula de mamífero, una célula de ratón y una célula humana.

12. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 9, 10 u 11, donde la célula comprende una célula de insecto, preferiblemente una célula Sf9, o una célula de mamífero, preferiblemente una célula de ovario de hámster chino (CHO).

13. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 1 o cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 dependientes de la misma, donde la partícula compacta comprende un orgánulo.

14. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 13, donde el orgánulo comprende una mitocondria, un plástido, un cloroplasto o un núcleo, preferiblemente derivado de una célula como se indica en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

15. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la entidad detectable carece sustancialmente de material celular.

16. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 2 o cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 dependientes de la misma, donde la partícula compacta comprende una microperla o una micela.

17. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la forma compacta tiene una dimensión menor de 1000 \mum, preferiblemente menor de 500 \mum, preferiblemente menor de 200 \mum, preferiblemente menor de 100 \mum, preferiblemente menor de 50 \mum, más preferiblemente menor de 20 \mum y aún más preferiblemente menor de 10 \mum.

18. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la región definida está presente en al menos una sección transversal distinta del patrón de referencia, comprendiendo preferiblemente una cantidad similar de entidad detectable.

19. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la entidad detectable se incrusta en el medio de incrustación.

20. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la entidad detectable comprende una diana relevante desde el punto de vista del diagnóstico.

21. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la entidad detectable comprende un antígeno, un epítopo, un péptido, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico o dos o más o una pluralidad de cualquiera de los anteriores, o combinaciones de uno o más de los anteriores.

22. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la entidad detectable se selecciona entre el grupo consistente en: un hapteno, una molécula biológicamente activa, un antígeno, un epítopo, una proteína, un polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico, un virus, una partícula parecida a un virus, un nucleótido, un ribonucleótido, un desoxirribonucleótido, un desoxirribonucleótido modificado, un heterodúplex, una nanopartícula, un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido, un carbohidrato, un colorante y mezclas, fusiones, combinaciones o conjugados de los anteriores.

23. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la entidad detectable comprende uno cualquiera o más de HER2, receptor de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR), p16, Ki-67, c-kit, cadena gamma 2 de laminina 5 y proteína del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ácidos nucleicos que los codifican y formas modificadas postraduccionalmente, preferiblemente formas fosforiladas de los mismos.

24. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la presencia y/o cantidad de la entidad detectable se puede revelar por un agente de unión, preferiblemente un agente de unión marcado.

25. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 24, donde el agente de unión se selecciona entre el grupo consistente en: un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo capaz de unirse de forma específica a la entidad detectable, un ácido nucleico tal como un ADN o un ARN, preferiblemente un ácido nucleico capaz de unirse de forma específica a la entidad detectable, un ácido proteína nucleico (APN), un colorante, un tinte especial, cloruro de Au, Hematoxilina-Eosina (H y E), tinte de metenamina-plata de Gomori (GMS), tinte de Ácido Peryódico-Schiff (PAS), Azul de Tricromo, Tricromo de Masson, Azul de Prusia, Giemsa, Diff-Quik, Reticulum, Rojo Congo, Azul Alcián, Steiner, AFB, PAP, Gram, Mucicarmina, Verhoeff-van Gieson, Elastic, Carbol Fucsina y tinte de Golgi.

26. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la presencia de la entidad detectable en una célula, tejido, órgano u organismo indica una enfermedad o una afección.

27. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la región definida incluye un área de referencia, comprendiendo el área de referencia la entidad detectable en una cantidad predefinida.

28. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 27, donde la cantidad de la entidad detectable en el área de referencia se compara con la cantidad de la entidad detectable en una muestra para determinar la presencia, cantidad o concentración de la entidad detectable en la muestra.

29. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde el patrón de referencia está en forma de una caja rectangular.

30. Un patrón de referencia para una entidad detectable, que comprende: (a) un medio de incrustación preferiblemente en una forma de caja sustancialmente rectangular; y (b) una célula con una cantidad de entidad detectable acoplada a la misma.

31. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende dos o más partículas compactas, teniendo, cada una, una entidad detectable unida a la misma.

32. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende dos o más entidades detectables diferentes, estando cada una de ellas unida a la misma o a diferentes partículas compactas.

33. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que comprende dos o más partículas compactas, comprendiendo diferentes cantidades de entidad detectable en cada una.

34. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde una sección plana del patrón de referencia comprende una pluralidad de áreas sobre las que está presente la entidad detectable a diferentes densidades.

35. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que una sección plana del patrón de referencia comprende un primera área que comprende la entidad detectable sustancialmente a una densidad significativa desde el punto de vista del diagnóstico.

36. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende además un control que comprende una partícula compacta que no comprende sustancialmente ninguna entidad detectable.

37. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde el medio de incrustación se selecciona entre el grupo consistente en: hielo, cera, parafina, resina acrílica, resina de metacrilato, epoxi, Epon, Araldite, Lowicryl, K4M, y LR White y Durcupan.

38. Una sección plana, preferiblemente una sección plana transversal, preferiblemente con un espesor sustancialmente uniforme, de un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.

39. Un soporte, preferiblemente un portaobjetos tal como un portaobjetos de microscopio, que comprende una sección plana de acuerdo con la reivindicación 38 montada sobre la misma.

40. Un kit que comprende un patrón de referencia de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, junto con un agente de unión capaz de unirse de forma específica a la entidad detectable, opcionalmente junto con instrucciones para el uso.

41. Un patrón de referencia, kit o sección plana de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde el patrón de referencia se ha teñido, preferiblemente, con un anticuerpo o una sonda de ácido nucleico.

42. Un kit de diagnóstico para detectar la presencia o la cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica, que comprende: (a) un patrón de referencia, una sección plana o portaobjetos de acuerdo con cualquier reivindicación anterior; (b) un agente de unión capaz de unirse de forma específica a la entidad detectable; y opcionalmente (c) instrucciones para el uso.

43. Una combinación de un patrón de referencia, sección plana, soporte, kit o kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42 junto con un agente terapéutico capaz de tratar o aliviar al menos uno de los síntomas de una enfermedad o afección en un individuo.

44. Una combinación de acuerdo con la reivindicación 43, donde el individuo se diagnostica como un individuo que padece o es susceptible de padecer la enfermedad o afección, si la cantidad de entidad detectable en la muestra biológica o componente es similar o mayor que la que está en el patrón de referencia.

45. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 42, o una combinación de acuerdo con la reivindicación 43 ó 44, donde el agente de unión o el agente terapéutico comprende un anticuerpo contra la entidad detectable.

46. Uso de un patrón de referencia, una sección plana o un kit de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, para determinar la presencia o cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica.

47. Un método para comparar la cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica con un patrón de referencia, comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar una muestra biológica y obtener una primera señal indicativa de la cantidad de entidad detectable en la muestra biológica, o un componente de la misma;

(b) proporcionar un patrón de referencia, sección plana, soporte, kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42;

(c) obtener una segunda señal de referencia indicativa de la cantidad de entidad detectable en el patrón de referencia o sección plana del mismo; y

(d) comparar la primera señal obtenida en (a) con la señal de referencia.

48. Un método de acuerdo con la reivindicación 47, donde la señal detectable se selecciona entre el grupo consistente en: radiación, densidad óptica, reflectancia, radiactividad, fluorescencia y actividad enzimática.

49. Un método de acuerdo con la reivindicación 47 ó 48, donde el patrón de referencia o la sección plana del mismo se somete a la misma una o más etapas o condiciones, preferiblemente sustancialmente todas, que la muestra biológica.

50. Un método de acuerdo con la reivindicación 47, 48 ó 49, donde el patrón de referencia o la sección plana del mismo se procesa a través de una o más, preferiblemente todas, las siguientes etapas: montaje en un portaobjetos, horneado, desparafinación, rehidratación, recuperación de antígeno, bloqueo, exposición a anticuerpo, exposición a anticuerpos primarios, exposición a una sonda de ácido nucleico, lavado, exposición a un conjugado de anticuerpo secundario-enzima, exposición a sustrato enzimático, exposición a sustrato cromogénico y tinción con colorante de contraste.

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51. Un método o uso de acuerdo con las reivindicaciones 46 a 50, donde la muestra biológica comprende una célula, tejido u órgano, preferiblemente una célula, tejido u órgano de un organismo que se sospecha que padece una enfermedad o afección.

52. Un método para obtener una indicación adecuada para el diagnostico de una enfermedad o una afección en un individuo, comprendiendo el método:

comparar la cantidad de una entidad detectable en una muestra biológica de un individuo, o componente de la misma, con un patrón de referencia por un método de acuerdo con la reivindicación 47;

donde preferiblemente se ha indicado que el individuo probablemente padecerá o será susceptible a la enfermedad o afección, si la cantidad de entidad detectable en la muestra biológica o componente es similar o mayor que la presente en el patrón de referencia.

53. Un patrón de referencia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 para uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o una afección en un individuo, comprendiendo el método las etapas de obtener una indicación adecuada para el diagnóstico de la enfermedad o afección en un individuo por un método de acuerdo con la reivindicación 52, y administrar un agente terapéutico al individuo.

54. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 53 para uso como se especifica en la presente memoria, donde el agente terapéutico comprende un anticuerpo capaz de unirse a la entidad detectable.

55. Un método para evaluar la eficacia o éxito de un procedimiento, comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar un patrón de referencia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, donde una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado del procedimiento;

(b) realizar el procedimiento sobre el patrón de referencia; y

(c) detectar un cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable.

56. Un método de acuerdo con la reivindicación 55, donde una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado de un procedimiento satisfactorio, detectándose dicho cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable para establecer que el procedimiento es satisfactorio.

57. Un método de acuerdo con la reivindicación 55, donde una propiedad detectable de la entidad detectable se cambia como resultado de un procedimiento no satisfactorio, detectándose dicho cambio en la propiedad detectable de la entidad detectable para establecer que el procedimiento no es satisfactorio.

58. Un método para validar un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 55, 56 ó 57, donde el procedimiento se selecciona entre el grupo consistente en: un procedimiento de hibridación in situ, un procedimiento inmunohistoquímico, de desparafinación, recuperación de antígeno, bloqueo, bloqueo de biotina endógena, bloqueo de enzima endógena, una etapa de lavado, incubación con un agente de revelado tal como un anticuerpo primario, incubación con componentes de visualización secundarios, tinción con cromógeno y adquisición y análisis de información de tinción.

59. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 58, donde el procedimiento es un procedimiento de recuperación de antígeno y donde la propiedad detectable de la entidad detectable comprende el enmascarado o desenmascarado de uno o más epítopos.

60. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 59, donde la entidad detectable en el patrón de referencia se modifica para enmascarar uno o más epítopos, estando algunos o todos de dichos epítopos desenmascarados en un procedimiento de recuperación de antígeno que es satisfactorio.

61. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 58, donde el procedimiento es un procedimiento de desparafinación y donde la propiedad detectable de la entidad detectable comprende la presencia o cantidad de entidad detectable en el patrón de referencia después del procedimiento de desparafinación.

62. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 58 y 61, donde la entidad detectable en el patrón de referencia es soluble en el medio de desparafinación, y donde al menos una parte, preferiblemente toda la entidad detectable se retira después de un procedimiento de desparafinación satisfactorio.

63. Uso de un patrón de referencia como se indica en cualquier párrafo anterior, como un patrón de validación de recuperación de antígeno, un patrón de desparafinación, un patrón de validación de bloqueo, un patrón de validación de lavado, un patrón de validación de anticuerpo primario, un patrón de validación de anticuerpo secundario, un patrón de calibración o un patrón de diagnóstico.

64. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de incrustación; (b) proporcionar una partícula compacta que tiene una forma compacta, donde la partícula compacta es una partícula compacta biológica, preferiblemente celular; (c) acoplar químicamente una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta y (d) soportar o incrustar la partícula compacta en el medio.

65. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de incrustación; (b) proporcionar una partícula compacta que tiene una forma compacta, donde la partícula compacta es una partícula compacta no biológica que tiene dimensiones parecidas a las de una célula; (c) acoplar una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta y (d) soportar o incrustar la partícula compacta en el medio.

66. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar una partícula compacta que tiene una forma compacta de origen biológico, preferiblemente de origen celular, acoplar químicamente una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta y soportar o incrustar la partícula compacta en un medio de incrustación.

67. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar una partícula compacta que tiene una forma compacta, donde la partícula compacta es una partícula compacta no biológica que tiene dimensiones parecidas a las de una célula, acoplar una cantidad de entidad detectable a la partícula compacta y soportar o incrustar la partícula compacta en un medio de incrustación.

68. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método soportar una partícula compacta que tiene una forma compacta y dimensiones parecidas a las de una célula que tiene una cantidad de entidad detectable acoplada químicamente a la misma en un medio de incrustación, donde la partícula compacta es una partícula compacta biológica, preferiblemente una partícula compacta celular.

69. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método soportar una partícula compacta que tiene una forma compacta y dimensiones parecidas a las de una célula que tiene una cantidad de entidad detectable acoplada químicamente a la misma en un medio de incrustación, donde la partícula compacta es una partícula compacta no biológica, que tiene dimensiones parecidas a las de una célula.

70. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar un medio de incrustación; (b) formar una cantidad de entidad detectable en una forma generalmente compacta y dimensiones parecidas a las de una célula por (i) acoplamiento químico a una partícula compacta que es biológica, preferiblemente una partícula compacta celular, o (ii) acoplamiento a una partícula compacta que es una partícula compacta no biológica que tiene dimensiones parecidas a las de una célula; y (c) incrustar la entidad detectable en el medio de incrustación.

71. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 64 a 70, que comprende además acoplar una cantidad de una segunda entidad detectable a la partícula compacta o a una segunda partícula compacta.

72. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 64 a 71, que comprende además acoplar una segunda cantidad diferente de la o de cada entidad detectable a la o cada partícula compacta.

73. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 64 a 72, donde la o cada partícula compacta se soporta por incrustación en el medio de incrustación.

74. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 64 a 73, donde la o cada entidad detectable se acopla covalentemente a su partícula compacta respectiva.

75. Un patrón de referencia para una entidad detectable que comprende una entidad detectable acoplada químicamente a una célula o un virus soportado por un medio de incrustación.

76. Un método para producir un patrón de referencia para una entidad detectable, comprendiendo el método las etapas de proporcionar una célula o un virus, acoplar químicamente una cantidad de entidad detectable a la célula o al virus e incrustar la célula o el virus en un medio de incrustación.

77. Un patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 75 o un método de acuerdo con la reivindicación 76, donde la célula o el virus no expresa la entidad detectable.

78. Un método o patrón de referencia de acuerdo con la reivindicación 75, 76 ó 77, donde la célula se selecciona entre el grupo consistente en: una célula bacteriana, una célula eucariota, una célula de insecto, preferiblemente una célula Sf9, una célula animal, una célula de mamífero, preferiblemente una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de ratón y una célula humana.

79. Un método para establecer una distribución celular de entidad detectable en un patrón de referencia, comprendiendo el método proporcionar una célula o un componente de la misma que no expresa una entidad detectable, acoplar químicamente una cantidad de entidad detectable a la célula o componente y soportar la célula o componente en un medio de soporte.