ES2309228T3 - Uso de apoproteinas del suero lacteo en la profilaxis o el tratamiento de la infeccion microbiana o virica. - Google Patents

Abstract

Una apoproteína láctea despojada de sus ácidos grasos y/o restos de hidratos de carbono conjugados para su uso en la inhibición de la adhesión de posibles patógenos a o sobre la superficie de un cuerpo humano o animal.

Description

Uso de apoproteínas del suero lácteo en la profilaxis o el tratamiento de la infección microbiana o vírica.

Esta invención se refiere al uso de apoproteínas lácteas para prevenir o tratar la infección microbiana o vírica del cuerpo humano o animal. Más específicamente, estas apoproteínas lácteas se pueden usar solas o en combinación con uno o más ácidos orgánicos de cadena corta, y sus sales o ésteres, tales como ácido cítrico y/o uno o más ácidos grasos libres y sus monoésteres para inhibir la adhesión y/o el crecimiento de posibles patógenos.

Técnica anterior

La leche es un líquido blanquecino producido por las glándulas mamarias de mamíferos hembra maduros tras haber dado a luz. Los mamíferos son vertebrados de sangre caliente de la clase Mammalia, que incluye a los seres humanos, siendo los mamíferos más preferiblemente a efectos de la presente invención artiodáctilos del Suborden Ruminantia, tales como ganado, ovejas, cabras, ciervo y jirafas. La leche procedente del ganado y de las cabras son las fuentes preferidas de apoproteínas lácteas de la presente invención, simplemente porque la leche de estas fuentes se encuentra fácilmente disponible a escala comercial.

El suero lácteo es un término usado comúnmente en la industria láctea para describir la matriz líquida clara en la que se encuentran suspendidos los micelos de caseína y los glóbulos de grasa láctea. El suero lácteo de los rumiantes contiene la lactosa del azúcar lácteo; una variedad de proteínas que incluyen anticuerpos lácteos, lactoferrina y enzimas; y una variedad de lipoproteínas que incluyen la beta-lactoglobulina. El suero lácteo es una fuente preferida de apoproteínas lácteas.

La leche de vaca se procesa en la industria láctea para obtener bien mantequilla o queso. Se usa la agitación mecánica para romper los glóbulos de grasa láctea con el fin de obtener mantequilla, y se precipita la caseína para obtener cuajada a partir de la que se fabrica el queso. El residuo líquido que queda tras estos procedimientos se denomina comúnmente lactosuero. El lactosuero es esencialmente el suero de la leche con un mayor contenido de lipoproteínas que proceden principalmente de la membrana de los glóbulos de grasa. El lactosuero es una fuente preferida de apoproteínas lácteas. El término "apoproteína de suero lácteo" como se usa en la presente memoria pretende englobar las apoproteínas lácteas derivadas del suero de la leche o del lactosuero.

Hay una variedad de lipoproteínas y glicoproteínas diferentes en el suero lácteo, estando todas ellas caracterizadas por un esqueleto proteínico al que se conjugan los lípidos y/o los hidratos de carbono. Se puede usar la hidrólisis enzimática para eliminar los lípidos y/o los hidratos de carbono de este esqueleto proteínico con el fin de preparar la correspondiente apoproteína. Aunque se hayan aislado apoproteínas del suero lácteo, hay usos médicos conocidos para tales apoproteínas del suero lácteo.

Los lípidos o las grasas incluyen triésteres de ácidos grasos, que pueden ser iguales o diferentes, y glicerol, también descrito como tri-acilgliceroles o triglicéridos. Se puede usar una mayor hidrólisis para romper estos enlaces de tipo éster, liberando así ácido(s) graso(s) libre(s) de los tri-acilgliceroles. El uso de lipasa pregástrica de ternero para liberar ácidos grasos libres de los lípidos lácteos está descrito por Cynthia Q Sun et al ("Chemico-Biological Interactions" 140 (2002), pp 185-198). Esta autora informa sobre las propiedades inhibidoras del crecimiento de diversos ácidos grasos frente a los enterococos, que son gram-positivos, y a las bacterias coliformes, que son gram-negativas, pero no menciona el papel de las apoproteínas del suero lácteo.

Se sabe que los ácidos grasos libres presentan una potente actividad antimicrobiana y antivírica. En concreto, Schuster et al ("Pharmacology and Therapeutics in Dentistry", 5: pp 25-33; 1980) informaron que los ácidos linoleico, linolénico, caprílico y caproico inhibían el organismo de la caries dental, Streptococcus mutans, y ejercían una reducción general de la placa dental. Según el autor, las bacterias clasificadas como gram-negativas son más sensibles, mientras que las gram-positivas se ven menos afectadas. Además, Halldor Thormar et al ("Antimicrobial Agents and Chemotherapy"; enero de 1987, pp 27-31) revisaron las propiedades antivíricas de los ácidos grasos libres y sus monoésteres, demostrando la eficacia de los ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga y de los ácidos grasos saturados de cadena media (y sus monoglicérido-ésteres) contra los virus con envoltura, y su inactividad relativa contra los virus sin envoltura, produciéndose el efecto viricida posiblemente por la desestabilización de la propia envoltura vírica. Más recientemente, R. Corinne Sprong et al ("Antimicrobial Agents and Chemotherapy", abril de 2001, pp 1298-1301) revisaron la actividad bactericida de los ácidos libres grasos: se descubrió que los ácidos grasos C10:0 y C12:0 eran potentes agentes bactericidas. Gudmundur Bergsson et al ("Antimicrobial Agents and Chemotherapy", noviembre de 2001, pp 3209 - 3212) describieron las propiedades fungicidas de los ácidos grasos libres C10:0 y C 12:0 y sus monoglicéridos.

Muchas bacterias potencialmente patógenas son comensales comunes de la piel, el cabello y las membranas mucosas: colonizan estas zonas adhiriéndose a la capa superficial de las células epiteliales, pero son normalmente controladas por el sistema inmune secretor de las mucosidades y el sudor del huésped. La enfermedad causada por estas especies endógenas surge habitualmente como resultado de alguna debilitación de la capacidad inmune secretora del huésped, que permite la proliferación de estos patógenos endógenos.

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En general, se acepta la adhesión de bacterias patógenas al tejido del huésped como la primera etapa de la patogénesis, por lo que la capacidad de bloquear la adhesión debería ser útil en la prevención de la infección. El mecanismo de tal adhesión es variado y muchos organismos emplean una multiplicidad de factores tanto específicos como inespecíficos. Por ejemplo, los estafilococos secretan un ácido teicoico extracelular que se une específicamente a la fibronectina; la especie Candida emplea un glicocalix de manoproteína; y los estreptococos hacen uso de glucanos insolubles en agua para colonizar la dentadura. Debido a la variedad de estos factores, desde hace mucho tiempo se considera imposible crear un solo inhibidor que sea eficaz contra el amplio rango de especies potencialmente patógenas.

Se ha intentado en muchas ocasiones usar anticuerpos derivados de la vacunación de algún animal donante, pero debido a la especificidad inherente, el uso terapéutico de estos anticuerpos queda confinado al uso frente a las especies contra las que se han generado.

En todos los datos publicados anteriormente, se revela el uso de ácidos grasos libres para inhibir el crecimiento de una amplia gama de bacterias, hongos y virus, pero no existen datos publicados conocidos que revelen o sugieran su eficacia cuando se administran con una o más apoproteínas lácteas en la inhibición de la adhesión y/o el crecimiento de posibles patógenos en la asistencia sanitaria a seres humanos y animales.

La práctica común en el tratamiento médico y veterinario de la infección es la aplicación de una sustancia antibiótica diseñada para inhibir el agente infeccioso, que puede ser fungicida, bacteriano (ambos englobados en el término "microbiano") o vírico. En el uso a largo plazo, muchas sustancias antibióticas han perdido su potencia debido a la evolución de la resistencia por el agente infeccioso. El problema de la resistencia a antibióticos es más grave en situaciones postoperatorias en las que el agente infeccioso es un habitante común de la piel y del tracto respiratorio y, como tal, puede haber sido expuesto a antibióticos frecuentes y variados durante un tiempo, permitiéndole que desarrolle la resistencia contra estas sustancias. Se pueden diseminar grandes números de estos agentes normalmente inocuos durante procedimientos quirúrgicos o cuidados de enfermería y pueden dar lugar a infecciones cuando la tolerancia inmune del paciente ha sido debilitada por la enfermedad o una intervención médica prolongada; tales infecciones se describen frecuentemente como infecciones nosocomiales.

Una de tales infecciones nosocomiales se denomina comúnmente SARM (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina). El Staphylococcus aureus es un habitante común del tracto respiratorio de muchos individuos, en donde es portado asintomáticamente sin que cause normalmente ninguna infección. Debido a su naturaleza ubicua, se cree que ha estado expuesto a muchas de las sustancias antibióticas usadas comúnmente, y ahora existen cepas que son resistentes a todos los antibióticos usados comúnmente incluyendo la meticilina. La vancomicina es "el fármaco que se usa como último recurso" para el SARM, pero recientemente han surgido cepas que son resistentes a la vancomicina. Además, el Enterococcus faecalis resistente a la vancomicina (EFRV) es un habitante común del intestino y puede ser diseminado desde ahí durante procedimientos quirúrgicos, dando lugar a otra infección nosocomial.

La transferencia génica horizontal es un término biológico usado para describir la posible transferencia de la resistencia genética de una especie a otra. La transferencia de la resistencia antibiótica de especies tales como el EFRV a especies patógenas tales como el Clostridium difficile (colitis pseudomembranosa) es un hecho potencialmente desastroso y que provoca una gran preocupación en la profesión médica.

Existe, por tanto, una gran necesidad por nuevas sustancias antimicrobianas que se puedan usar para tratar tales infecciones resistentes a antibióticos y otras que sean refractarias a los tratamientos convencionales, y por nuevas sustancias antivíricas para tratar infecciones víricas para las que los remedios terapéuticos actuales son poco eficaces.

Es un objetivo de la presente invención retardar, preferiblemente, bloquear, la adhesión de organismos patógenos y así prevenir o tratar la infección microbiana o vírica del cuerpo humano o animal.

Otro objetivo de la presente invención es combinar el retardo o el bloqueo de la adhesión con una inhibición del crecimiento, alcanzando así una utilidad incluso mayor.

Otro objetivo más de la presente invención consiste en lograr estas utilidades mediante el uso de un material benigno tal como, pero sin limitarse al, suero lácteo, pues éste facilita un uso mucho más frecuente del que se considera prudente con muchas medicinas basadas químicamente agresivas.

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Afirmaciones de la invención

En una primera realización, esta invención se refiere al uso de al menos una apoproteína láctea despojada de sus ácidos grasos y/o restos de hidrato de carbono conjugados para prevenir o tratar la infección microbiana o vírica del cuerpo humano o animal. Sin desear quedar vinculados a esto, se cree que esto se lleva a cabo mediante la inhibición de la adhesión de posibles especies patógenas. Específicamente, el esqueleto proteínico del suero lácteo, más correctamente denominado apoproteína del suero lácteo, que queda tras retirar de las lipoproteínas lácteas y de las glicoproteínas lácteas el lípido y/o el hidrato de carbono conjugado, presenta una potente inhibición de amplio espectro de la adhesión de posibles patógenos a células epiteliales humanas, tal y como se ejemplificará más adelante. Cuando se usa suero lácteo como fuente, la apoproteína residual, despojada de sus ácidos grasos y/o restos de hidratos de carbono conjugados, es anfótera e inhibe la adhesión de bacterias u otros organismos patógenos a la superficie de la célula huésped evitando así la primera etapa de la patogénesis. La proteína anfótera tiene tanto un extremo hidrófobo (soluble en grasa) como uno hidrófilo (soluble en agua). La superficie celular de muchas especies microbianas tiene una capa lipídica o glico-lipídica que atrae el extremo hidrófobo de la proteína anfótera. De este modo, las apoproteínas del suero lácteo revisten la superficie del organismo patógeno, estableciendo una barrera molecular cruda que evita que el organismo patógeno (tal como un hongo, una bacteria o un virión) se aproxime lo suficiente a la superficie de la célula huésped como para establecer la adhesión.

Preferiblemente, las apoproteínas lácteas anteriormente mencionadas se usan con ácidos grasos libres o sus monoésteres (incluyendo monoglicéridos). Como se sabe, los ácidos grasos libres y sus monoglicéridos son potentes agentes antimicrobianos y antivíricos frente a una amplia variedad de especies, inhibiendo su crecimiento. De este modo, la administración simultánea o consecutiva (en cualquier orden) de al menos una apoproteína láctea y al menos un ácido graso libre o su monoéster inhibe el crecimiento, así como inhibe la adhesión de una amplia variedad de especies microbianas y víricas. Una formulación derivada de la hidrolización del suero lácteo o lactosuero contiene tanto apoproteína(s) lácteas como ácido(s) graso(s) libre(s).

Alternativamente, las apoproteínas lácteas anteriormente mencionadas se usan con ácidos orgánicos de cadena corta, o sus ésteres o sales. De este modo, la administración simultánea o consecutiva (en cualquier orden) de al menos una apoproteína láctea y de al menos un ácido orgánico de cadena corta, o su éster o sal, inhibe el crecimiento, así como inhibe la adhesión de una amplia variedad de especies microbianas y víricas.

Todavía más preferiblemente, las apoproteínas lácteas anteriormente mencionadas se pueden usar tanto con ácidos grasos libres y sus monoésteres, como con ácidos orgánicos de cadena corta, y sus sales y ésteres. De este modo, la administración simultánea o consecutiva (en cualquier orden) de al menos una apoproteína láctea; de al menos un ácido graso libre o su monoéster; y de al menos un ácido orgánico de cadena corta, o su éster o sal, inhibe el crecimiento, así como inhibe la adhesión de una amplia variedad de especies microbianas y víricas. Las formulaciones que contienen los tres componentes se pueden preparar mediante la hidrolización del suero lácteo o lactosuero.

En esta invención se demostrará la utilidad del uso de al menos una apoproteína de suero lácteo según lo definido anteriormente, opcionalmente, con al menos un ácido graso libre o un monoéster del mismo, o una mezcla de los mismos y/o opcionalmente al menos un ácido orgánico de cadena corta, o su sal o su éster, o una mezcla de los mismos, en el tratamiento de infecciones resistentes a antibióticos del tracto gastrointestinal y orofaringeal, del epitelio mucoso y de la piel.

Mientras que las infecciones de organismos tales como el SARM y el EFRV, y muchas infecciones víricas suponen una grave amenaza para la salud, existen agentes aparentemente menos inocuos que son comensales comunes del cuerpo y que pueden dar lugar a trastornos o enfermedades a largo plazo. Un ejemplo de esto es la generación de la caries dental por la bacteria Streptococcus mutans. La caries dental normalmente es considerada un problema estético, y como tal es tratada por los dentistas. Sin embargo, existen pruebas que sugieren que la colonización de la boca por Streptococcus mutans puede generar anticuerpos que, en circulación sistémica, pueden reaccionar de forma cruzada con el tejido cardiaco dando lugar a largo plazo a una enfermedad cardiaca y a un daño autoinmune en otros
órganos.

En esta invención, se demuestra que el uso de apoproteína(s) de suero lácteo inhibe la adhesión de Streptococcus mutans, proporcionando así un complemento útil en la profilaxis de la caries dental con los consiguientes beneficios a largo plazo para la salud.

La levadura Candida albicans es un habitante común de la piel y de las membranas mucosas de muchos individuos, en donde es portada asintomáticamente. La Candida coloniza las membranas mucosas adhiriéndose primero a la superficie de una célula epitelial de la mucosa desde donde prolifera y se infiltra en el lumen celular causando la candidiasis bucal.

Los constituyentes de la mucosa secretados desde estos tejidos inhiben normalmente la adherencia y la proliferación; en algunos individuos, hay una debilitación de la capacidad secretora normal y se establece un proceso patógeno. El uso de apoproteína(s) del suero lácteo (inhibidores de la adhesión) y de ácido(s) graso(s) libre(s) o sus monoésteres y/o ácido(s) orgánico(s), o sus sales o ésteres, (ambos inhibidores del crecimiento) proporcionarán una profilaxis adecuada en aquellos individuos que padezcan una candidiasis bucal recurrente.

Las infecciones víricas no responden a los anticuerpos convencionales. Aunque hay medicamentos antivirales especializados tales como el "Aciclovir" usado, por ejemplo, en el tratamiento del Herpes simplex, éstos son en general caros y se limitan a un espectro muy pequeño de infecciones víricas. Aunque muchas infecciones víricas tienen un aspecto sistémico, en algunas se manifiestan síntomas tópicos como sarpullido cutáneo, ampollas y llagas, que son los que frecuentemente causan el mayor trastorno al individuo afectado. El uso de aplicaciones tópicas de formulaciones que contienen apoproteínas del suero lácteo con ácido(s) graso(s) libre(s) y sus monoésteres proporcionarán una actividad antivírica local que, cuando se use como complemento al tratamiento antivírico sistémico, aliviarán los síntomas externos.

El "Famvir" es una formulación de marca de Aciclovir (Smith Kline Beecham) diseñada como agente antivírico sistémico para una administración oral en el tratamiento de infecciones secundarias de Varicella zoster (culebrilla). El virus Varicella causa la varicela en infecciones primarias con erupciones cutáneas de consideración de vesículas llenas de pus que se rompen y forman costras. La infección causa un picor intenso y, cuando se rasca, las llagas pueden dejar importantes cicatrices. El virus permanece latente durante muchos años tras la recuperación y puede reactivarse por condiciones de estrés o inmunocompromiso, siendo la infección secundaria conocida como culebrilla y estando caracterizada por un sarpullido cutáneo extremadamente doloroso. El uso de formulaciones tópicas que contienen apoproteína(s) de suero lácteo y éster(es) graso(os) libre(s), así como monoésteres de los mismos, según lo descrito en la presente memoria minimizará los síntomas superficiales de la piel y actuará como un útil complemento de la terapia antivírica convencional. Igualmente, otras infecciones en las que haya una dimensión (cutánea) superficial tal como la rubeola (sarampión) y herpes (herpes labial) son indicaciones clínicas adecuadas para las aplicaciones tópicas. La formulación estándar según lo descrito en lo sucesivo en la presente memoria, que es suero de la leche o lactosuero hidrolizado, se espera que sea eficaz contra organismos patógenos a una concentración en el intervalo de 0,5 a 25 mg/ml. Por supuesto, se entenderá que la concentración requerida dependerá del número de organismos patógenos por encontrar y de las concentraciones relativas de los mismos. Igualmente, los intervalos de concentración deseados para la(s) apoproteína(s); para el(los) ácido(s) graso(s) libre(s) y para el(los) ácido(s) orgánico(s) también dependerá del número de organismos patógenos por encontrar y de sus concentraciones relativas.

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Ácidos grasos libres

Un ácido graso libre es un ácido orgánico que comprende una cadena de hidrocarburo con al menos un grupo funcional de ácido carboxílico, estando el último habitualmente, aunque no necesariamente, en una posición terminal. Los ácidos grasos pueden ser bien saturados, en los que todos los enlaces carbono-carbono de la cadena de hidrocarburo son simples, o insaturados, en los que al menos hay un enlace carbono-carbono doble o triple en la cadena de hidrocarburo. Los ácidos grasos libres o sus monoésteres son preferiblemente naturales o, alternativamente, se liberan mediante, por ejemplo, la hidrólisis de fuentes naturales tales como, pero sin limitarse, al suero lácteo, a la yema de huevo y a los aceites vegetales.

Preferiblemente, los ácidos grasos libres antimicrobianos y antivirales útiles son saturados o insaturados y tienen una cadena de hidrocarburo con un número par de átomos de carbono (C4-24) o una mezcla de los mismos.

Los ácidos grasos libres insaturados adecuados tienen una cadena de hidrocarburo con C14-24 y se seleccionan preferiblemente entre ácidos palmitoleico (C16:1), oleico (C18:1), linoleico (C18:2), alfa y gamma linolénico (C18:3), araquidónico (C20:4), eicosapentanoico (C20:5) y tetracosenoico (C24:1), en los que las cifras entre paréntesis representan el número de átomos de carbono de la cadena de hidrocarburo con el número de enlaces dobles (o triples) tras los dos puntos que representa el grado de instauración.

Los ácidos grasos libres saturados adecuados tienen una cadena de hidrocarburo con C4-C18 y se seleccionan preferiblemente entre ácidos butírico o isobutírico (C4:0), succínico (C4:0), caproico (C6:0), adípico (C6:0), caprílico (C8:0), cáprico (C10:0), laúrico (C12:0), mirístico (C14:0), palmítico (C16:0) y esteárico (C18:0), que son eficaces frente a los hongos y a las bacterias gram-negativas, coliformes y estafilococos.

Debería entenderse que el(los) ácido(s) graso(s) o sus monoésteres, bien naturales o no, se pueden modificar mediante la sustitución química incluyendo, pero no limitándose a, la alquilación de cadenas cortas tales como la metilación o la acetilación; la esterificación y muchas otras derivaciones para modificar la potencia antimicrobiana, estando tales ácido grasos libres modificados también destinados a formar parte de la presente invención. Sin embargo, a efectos de la presente invención, es preferible usar ácidos grasos libres naturales no modificados, o mezclas de los mismos o sus monoésteres, preferiblemente, sus monoglicéridos, tales como aquéllos liberados de reservas naturales de grasa seleccionadas entre suero lácteo, yema de huevo y aceites vegetales.

La hidrólisis del contenido de lípidos del suero lácteo proporciona una mezcla adecuada de ácidos grasos libres cuya inhibición de amplio espectro del crecimiento microbiano y vírico se puede obtener de manera útil a efectos terapéuticos y profilácticos. La siguiente tabla proporciona una descomposición típica de la composición de los ácidos grasos del lípido de suero lácteo.

TABLA 1 Composición de los ácidos grasos del lípido del suero lácteo

1

Ácidos orgánicos

Los ácidos orgánicos adecuados, si están presentes, tienen una cadena de hidrocarburo corta (por ejemplo, C2-6) con al menos un grupo funcional de ácido carboxílico. El término "ácido" pretende englobar sus sales o ésteres. La cadena de hidrocarburo puede estar saturada o insaturada, lineal o ramificada, sustituida o no sustituida. Los ácidos orgánicos adecuados incluyen ácidos glicólico, oxálico, láctico, glicérico, tartrónico, málico, maleico, fumárico, tartárico, malónico, glutárico, propenoico, cis o trans butenoico y cítrico. De los ácidos orgánicos, se prefiere el ácido cítrico, que es una cadena de tres carbonos con tres restos de ácido carboxílico. El ácido cítrico se produce durante el metabolismo de los hidratos de carbono de los mamíferos, y es un ácido orgánico débil que puede ser neutralizado por una solución alcalina, tal como hidróxido de sodio, para proporcionar la sal de sodio-citrato de sodio. Como tal, existe de forma natural en el cuerpo a bajas concentraciones. Tal y como se muestra y se reivindica en esta invención, cuando se añade citrato de sodio a las apoproteínas del suero lácteo según lo descrito anteriormente, se puede ampliar la potencia de los ácidos grasos con respecto a cultivos in vitro de determinadas bacterias.

Utilidades antimicrobianas y antivirales

Debido a la naturaleza poliespecífica de la inhibición de la adhesión que se puede alcanzar usando sólo apoproteí-
na(s) de suero lácteo o debido a la naturaleza poliespecífica de la inhibición de la adhesión y de la inhibición del crecimiento usando apoproteína(s) de suero lácteo en combinación con ácido(s) graso(s) libre(s) y/o ácido(s) orgáni-
co(s), hay una gama muy diversa de posibles patógenos a los que es posible dirigirse.

Incluidas entre las bacterias gram-positivas de relevancia están los estreptococos, lactobacilos, corinobacterias, propionibacterias, actinomicetos, clostridium, bacilos y enterococos.

Las gram-negativas incluyen estafilococos, y las especies Enterobacteria, Escherichia, Salmonella, Shigella y Chlamydia también son sensibles.

Entre las especies de hongos, se ha demostrado que la levadura Candida albicans es sensible, así como los dermatofitos que incluyen la especie Trichophyton.

Los protozoos de sensibilidad relevante incluyen Entamoeba histolytica, Giardia lamblia y Cryptosporidium neoformatans.

El término "microbiano" pretende englobar a las bacterias, los hongos y los protozoos.

Incluidos entre los viriones con envoltura de relevancia están Herpes viridae, (Herpes simplex, Varicela-zoster y Epstein-barr); Poxviridae, (Ortopoxvirus y Avipoxvirus); Togaviridae, (Alfavirus, Flavivirus, Rubivirus y Pestivirus); Coronaviridae, (virus de la bronquitis); Retroviridae (leucemia de las células T humanas y virus de la inmunodeficiencia humana); el virus de la gripe, Lyssavirus, Virus de la encefalitis de California, virus Lassa, Paramixovirus, Pneumovirus y Morbillivirus.

Sistemas de administración farmacéuticamente y cosméticamente aceptables

Se puede administrar un sistema de administración farmacéuticamente aceptable que comprenda una cantidad farmacéutica o cosméticamente eficaz de al menos una apoproteína de suero lácteo, con o sin una cantidad farmacéutica o cosméticamente eficaz de al menos un ácido graso libre y sus monoésteres y/o una cantidad farmacéutica o cosméticamente eficaz de al menos un ácido orgánico y sus ésteres o sales para alcanzar un efecto clínicamente útil.

Las pomadas proporcionan un mecanismo de administración útil para calmar los síntomas superficiales de las infecciones víricas y bacterianas que se manifiestan en sarpullido cutáneo, ampollas y pústulas, entre los que se encuentran incluidos el herpes, la culebrilla, el acné y la dermatitis infecciosa.

Los vendajes y los apósitos para heridas se pueden impregnar para obtener una liberación sostenida del material activo en la zona de una infección.

Particularmente en el caso del Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, el sistema de administración puede comprender un pulverizado nasal para la descontaminación de los vehículos conocidos. El uso de un sistema de administración en forma de una loción para la piel proporcionará la descontaminación tópica de la piel y del cabello.

El sistema de administración puede comprender gotas para los ojos destinadas al tratamiento o a la prevención de la infección del ojo.

El sistema de administración puede comprender cremas o geles intravaginales, por ejemplo, geles hidratantes o lubricantes, u óvulos vaginales comúnmente usados en el cuidado femenino para evitar las infecciones recurrentes por la levadura Candida albicans y como protección frente a la enfermedad bacteriana y vírica.

El sistema de administración puede comprender un apósito para heridas post-quirúrgico en el que el(los) agente(s) activo(s) esté(n) distribuidos en un polímero de liberación sostenida. Se puede usar tal sistema de administración para minimizar las infecciones nosocomiales que surgen del SARM y de otras bacterias resistentes a antibióticos.

El sistema de administración puede comprender además excipiente(s) antioxidantes y ser administrados parenteralmente o mediante una infusión i.v. para alcanzar un efecto antivírico sistémico y/o un efecto antimicrobiano.

El sistema de administración puede comprender alternativa o adicionalmente una bebida de tipo lácteo o un alimento, en el que el(los) agente(s) activo(s) estén revestidos de una cubierta entérica para facilitar su transporte por el estómago hacia el intestino, donde el(los) agente(s) activo(s) se pueden usar como agente profiláctico frente a infecciones intestinales, incluyendo la colitis pseudomembranosa.

El sistema de administración puede comprender productos para la higiene oral tales como gomas de mascar, colutorios, pastas de dientes y adhesivos y fijadores para prótesis dentales para conseguir una reducción de la caries y de la placa dental, y proporcionar una protección a largo plazo frente a la gingivitis, la periodontitis y la candidiasis bucal recurrente.

El sistema de administración puede comprender alimentos procesados en los que el(los) agente(s) activo(s) evitan el deterioro microbiano y/o vírico, y la posibilidad de una enfermedad portada en los alimentos procedente de organismos tales como Salmonella y Campylobacter.

Descripción de las figuras

El diagrama 1 ilustra cuatro cromatogramas de exclusión por tamaño separados, y éstos están marcados con A,
B, C y D.

A).

Punto temporal 0 horas, pre-tratamiento: Un máximo delantero a un t.r. de 7,174 minutos iluminado a 280 nm tiene un máximo subyacente visible a 330 nm. La absorbancia a 330 nm proviene del resto lipídico conjugado a las proteínas de gran tamaño que constituyen la fracción primaria.

B).

Punto temporal: 2 horas de haber comenzado el tratamiento: el máximo principal a 7,174 minutos se ha degradado con el aumento coetáneo en dos fracciones posteriores a un t.r. de 9,7 y 10,6 minutos. La fracción lipídica a 330 nm se ha degradado y no hay un aumento visible de la absorbancia a 330 nm con los máximos posteriores.

C).

Punto temporal: 8 horas: muestra una mayor degradación de la fracción lipídica sin ningún cambio significativo en las últimas proteínas de 280 nm.

D).

Punto temporal: 16 horas: la incubación prolongada no muestra ningún cambio en el perfil global en ninguna longitud de onda.

El diagrama 2 ilustra el uso de la adhesión de Candida albicans a célula epitelial bucal como la medida de la eficacia del material analítico, el suero lácteo, antes y después de la hidrólisis enzimática. El "control" representa la adhesión total media (36%) alcanzada sin que estén presentes sustancias inhibidoras. El suero lácteo antes de la hidrólisis a 1 mg/ml y 2 mg/ml proporcionó una inhibición de alrededor del 39% de la adhesión del control (adhesión del 22%, que desciende de la adhesión del 36%). A una pre-hidrólisis de 5 mg/ml, se alcanza una inhibición de la adhesión del 45%. El mismo material se muestra a las mismas concentraciones tras la hidrólisis enzimática. 1 mg/ml es aparentemente menos eficaz que la pre-hidrólisis del mismo material, sin embargo, a 2 mg/ml, hay una inhibición del 62% (en comparación con el 39%) y a 5 mg/ml, hay una inhibición de la adhesión del 100%, en comparación con una pre-hidrólisis del 45%.

El diagrama 3 presenta la inhibición relativa de la adhesión de Candida alcanzada desde cada fracción lipídica y proteínica de la formulación estándar. El "control" está a una adhesión del 45%. La fracción proteínica a 1 mg/ml está mostrando una adhesión del 19% (inhibición del 58%), a 2 mg/ml, la adhesión desciende hasta el 3%, siendo la inhibición del 94%, y quedando totalmente bloqueada a 5 mg/ml. En comparación, no hay un efecto inhibidor de la adhesión visible desde la fracción lipídica a ninguna concentración.

El diagrama 4 muestra, usando la misma fracción lipídica y proteínica del diagrama 3, las propiedades inhibidoras del crecimiento relativo de la fracción lipídica sobre el crecimiento de Candida albicans a 10, 8 y 6 mg/ml. Hay un aumento progresivo de las propiedades inhibidoras del crecimiento a medida que aumenta la concentración con una destrucción visible del cultivo de levadura a 10 mg/ml en base a la pérdida de densidad óptica.

El diagrama 5 muestra el efecto de la fracción proteínica del diagrama 3 anterior usando el crecimiento de Candida albicans. No hay una inhibición aparente del crecimiento que surja a partir de la fracción proteínica a ninguna de las concentraciones analizadas.

El diagrama 6 muestra las propiedades inhibidoras del crecimiento de Candida de la formulación estándar a 0, 1 y 5 mg/ml. Se alcanza una inhibición del 90% a la concentración más elevada.

El diagrama 7 muestra un ensayo de intervención del crecimiento en el que las sustancias inhibidoras se añaden tras 5 horas de crecimiento normal de Candida albicans. Resulta evidente la inmediatez de la inhibición a concentraciones de 8 y 6 mg/ml. A concentraciones más bajas, el efecto es más lento, pero la inhibición global es igual de eficaz a 4 mg/ml y también se aprecia cierta inhibición a 2 mg/ml.

El diagrama 8 muestra las propiedades inhibidoras de la adhesión de Candida de la formulación estándar a 1, 2 y 5 mg/ml, en la que la levadura ha sido pretratada mediante la exposición a la sustancia de análisis durante 10 minutos antes de ser expuesta a célula epitelial bucal. A 1 mg/ml hay una inhibición de la adhesión del 53% mg/ml, mientras que a 2 y 5 mg/ml no se produce adhesión. El blanco proteínico de este ejemplo es albúmina de suero bovino a
1 mg/ml que muestra una inhibición de sólo el 13% (en relación con el 53% de la formulación estándar).

Diagrama 9 muestra la misma formulación estándar usada en el diagrama 8 anterior para pretratar las células epiteliales bucales durante 10 minutos antes de ser expuestas al cultivo de Candida. A 1 mg/ml hay una inhibición de la adhesión del 55% mg/ml, mientras que la adhesión queda totalmente inhibida a 2 y 5 mg/ml. El blanco proteínico de este ejemplo es clara de huevo des-ovalbuminizada que a 1 mg/ml proporciona una inhibición de la adhesión de alrededor del 12%.

El diagrama 10 muestra la formulación estándar que inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) en aproximadamente el 50% en comparación con el control en el que se usa solución tamponada con fosfato (PBS) como "blanco" analítico. Cuando se complementa la formulación estándar con 2, 4 y 5 mg/ml de citrato de sodio, el crecimiento se inhibe progresivamente hasta cero a las concentraciones más elevadas.

El diagrama 11 muestra las propiedades inhibidoras de la formulación estándar frente a la adhesión del SARM a célula epitelial bucal en comparación con citrato de sodio y ASB.

A 5 mg/ml, la formulación estándar alcanza una inhibición de la adhesión del 98%, mientras que a la misma concentración, el citrato de sodio tiene una inhibición del aproximadamente 10%, no hay efecto del blanco
proteínico.

El diagrama 12 muestra que el crecimiento del organismo causante de la caries dental Streptococcus mutans se inhibe mediante 5 mg/ml de la formulación estándar, en las condiciones analíticas descritas en el texto.

El diagrama 13 muestra que Streptococcus mutans se adhiere a perlas de hidroxiapatita usadas aquí como sustituto del esmalte dental. La formulación estándar a 0,8 mg/ml alcanza una inhibición de la adhesión del aproximadamente 100% en las condiciones analíticas. El citrato de sodio afecta a la adhesión de este organismo en alrededor del 10% a 0,8 mg/ml, mientras que la albúmina de suero bovino usada como blanco proteínico alcanza una inhibición de alrededor del 30% en estas condiciones analíticas.

Procedimientos y materiales

Las proteínas del suero lácteo se pueden extraer de la leche entera fresca, preferiblemente, de la leche entera fresca de rumiante, separando primero las materias grasas usando una centrifugación. Entonces se acidifica el sobrenadante hasta un pH 4,5, punto en el que precipitan las caseínas. Una mayor centrifugación dejará un sobrenadante claro que contiene la lactosa del azúcar lácteo, las proteínas del suero lácteo y los minerales disueltos. Entonces se retira la lactosa, que representa una proporción sustancial del contenido de sólidos del suero lácteo (hasta el 50%), mediante diálisis o ultra-filtración. La fracción "rica en proteínas conjugadas" resultante tendrá una composición que se aproxima a la siguiente (v/v):

2

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Muchas de estas proteínas son lipoproteínas complejas o glicoproteínas con macromoléculas no proteínicas sustanciales conjugadas a ellas, pero el componente proteínico principal del lactosuero procedente de mamíferos rumiantes es la beta-lactoglobulina, que puede representar hasta el 70% del lactosuero y el 90% del calostro (la primera leche tras el parto). La beta-lactoglobulina es una lipoproteína con cantidades sustanciales de isoprenoide, retinol, conjugado a ella, pero los lípidos y los ácidos grasos constituyen una parte sustancial del componente no proteínico.

Alternativamente, una fuente conveniente de proteínas de suero lácteo es el polvo de lactosuero de la industria láctea, que se puede obtener comercialmente de muchas fuentes diferentes. En muchos casos, los proveedores comerciales ya han retirado el contenido de lactosa, proporcionando un material "rico en proteínas conjugadas" con un contenido en grasa de entre el 6 y el 10%, siendo tal material el de la fuente preferida para su uso en esta invención. Aunque algunos proveedores comerciales usan la temperatura ultra-alta (UHT) para aumentar la estabilidad de almacenamiento del lactosuero líquido, tal tratamiento desnaturaliza el esqueleto proteínico e inutiliza el material a los efectos descritos en la presente memoria. Cuando el contenido de grasa es menor del 6%, éste puede ser complementado volviendo a añadir grasa láctea al polvo de lactosuero, cuando sea reconstituido (en agua purificada (agua purificada por ósmosis inversa)) para la hidrólisis enzimática según lo descrito en la presente memoria.

Una fuente comercial adecuada del polvo de lactosuero bajo en lactosa estandarizado es "Carbelac 80", un concentrado proteínico de lactosuero procedente de Carbery Milk Products, Ballineen, County Cork, Irlanda.

Análisis de inhibición del crecimiento

Es posible demostrar la inhibición del crecimiento de diversas bacterias o levaduras haciendo crecer el organismo en un medio adecuado con y sin las sustancias analíticas tales como apoproteínas de suero lácteo, ácidos grasos libres/monoésteres y/o ácidos orgánicos/sales/ésteres; siendo el formato de análisis adecuadamente diseñado con blancos y controles de los medios. Se puede usar un análisis con placas de microvaloración para aumentar el número de puntos analíticos, midiéndose el crecimiento mediante la determinación de la densidad óptica.

Para garantizar que no surja ningún efecto de dilución por la adición de las diferentes concentraciones del material analítico, se preparan las soluciones analíticas disolviendo o suspendiendo la cantidad apropiada de sustancia analítica en el medio de crecimiento recién preparado apropiado para esa bacteria o levadura. Comúnmente, las soluciones analíticas se preparan a partir de una solución madre con una concentración de 20 mg/ml, preparada disolviendo, por ejemplo 200 mg de sustancia analítica en un volumen final de 10 ml de medio de crecimiento recién preparado. Se centrifuga la solución madre a 6.000 rpm durante 10 minutos para eliminar los sólidos suspendidos. Luego se diluye asépticamente la solución madre usando los volúmenes apropiados de solución madre y de medio de crecimiento recién preparado, hasta alcanzar las concentraciones analíticas de, por ejemplo, 10, 8, 6, 4, 2 mg/ml.

La etapa de dilución para alcanzar dichos 10 mg/ml a partir de una solución madre de 20 mg/ml se encuentra descrita en la presente memoria como 1:2, y esto pretende significar que un volumen de solución madre se diluye con 1 volumen de diluyente para obtener un volumen final de 2 volúmenes. Esta convención se usará en la presente memoria para referirse a todas las etapas de dilución usadas en la presente memoria.

Las soluciones preparadas son precalentadas hasta 37ºC. Se añaden 100 microlitros a cada pozo según lo necesario inmediatamente antes de la adición de 100 microlitros del inóculo preparado. De este modo, se somete la concentración analítica de 10 mg/ml a otra dilución 1:2 en el pozo de análisis, tal que los "10 mg/ml" son realmente 5 mg/ml en el propio pozo de análisis. El Multiskan Ascent tiene un ciclo de agitación automática que se usa para garantizar una distribución homogénea del cultivo antes de cada lectura de la DO.

En cuanto a la inhibición del crecimiento de Candida albicans, se usa una placa de microvaloración de 96 pozos "Nunc" (Nalge Nunc International, Copenhague, Dinamarca), conteniendo cada uno de sus pozos los 200 microlitos anteriormente mencionados. Los puntos analíticos se realizan por cuadruplicado. El inóculo está constituido por 100 microlitros de bacterias recién cultivadas o de levadura preparada según lo descrito más adelante. El volumen final de cada pozo está constituido por un total de 200 microlitros que comprenden 100 microlitros de la dilución apropiada de la sustancia analítica y 100 microlitros del inóculo en medio recién preparado.

Se cargan las placas inoculadas en un lector de placas de microvaloración incubado "Multiskan Acent" (LabSystems, Helsinki, Finlandia) y se mantienen a 37ºC durante un período de hasta 18 horas durante el cual se miden los cambios de la densidad óptica de los pozos a 600 nm cada hora. Al final del ciclo de crecimiento, se procesan los resultados haciendo la media de cada pozo por cuadruplicado e ilustrando los cambios gráficamente.

Levadura

Cultivo durante 12 horas (una noche) de Candida albicans en medio mínimo de levadura Oxoid con adición de glucosa al 5% (p/v) (Oxoid en una marca comercial), diluido 1:10 (uno hasta un volumen final de 10) (v/v) con medio recién preparado a 37ºC, añadiendo 100 microlitros a cada pozo.

La levadura Candida albicans tiene un pH óptimo para el crecimiento de entre 4,0 y 4,5, siendo muchos de sus procesos patógenos también óptimos en este intervalo de pH. El análisis de crecimiento descrito anteriormente se puede modificar con el uso de tampón de lactato de sodio 50 mM a un pH 4,0 para preparar el medio mínimo de levadura y la solución de análisis, con el fin de reflejar más adecuadamente el medio in vitro en el que la formulación estándar es eficaz.

Se puede usar, por consiguiente, una metodología similar para medir el crecimiento y la inhibición del crecimiento de las bacterias (y los hongos) modificando el medio de cultivo. En el caso de Streptococcus mutans y Staphylococcus aureus, ambos mostrados en la presente memoria como ejemplos, el medio de crecimiento es caldo infusión cerebro corazón Oxoid (Oxoid es una marca comercial).

Análisis de adhesión

La medida de la adhesión y de la inhibición de la misma necesita la selección de un sustrato adecuado y de un procedimiento para enumerar los organismos que se adhieren (o no) al sustrato. La mayoría de los posibles organismos patógenos se adhieren a células epiteliales de la mucosa, y es posible cosechar fácilmente del interior de la mejilla una fuente conveniente de una célula epitelial de la mucosa representativa. Las células epiteliales bucales (CEB) se cosechan raspando las membranas de la mucosa bucal usando un depresor de la lengua de madera como se explica a continuación.

Cosecha de células epiteliales bucales

Se envuelven en hojalata depresores de la lengua estándar de madera como los usados en los exámenes clínicos bucales y se introducen en autoclave. Se colocan alícuotas de 5,0 ml de fosfato de potasio 0,1M que contiene cloruro de sodio al 0,9% (p/v) con un pH ajustado hasta 6,8 (i.e., PBS) en botellas de muestras de 25 ml estériles. Entonces se usan depresores de la lengua para raspar el interior de la mejilla del voluntario y se transfieren las raspaduras recogidas a los recipientes de PBS. Se centrifugan las muestras recogidas a 1.000 rpm durante 3 minutos para sedimentar las CEB, dejando las bacterias y otros restos orales en suspensión. Se decanta el sobrenadante procedente de estos tubos y se añaden otros 5 ml de PBS estéril recién preparado, se vuelven a suspender las CEB y se vuelven a centrifugar dos veces hasta obtener "células lavadas".

Hay muchos procedimientos distintos para enumerar las bacterias y la levadura, siendo todos ellos conocidos por los expertos en la técnica e incluyendo éstos el recuento de placas viables, el recuento directo al microscopio, el marcado por radio-centelleo y el marcado fluorescente. Es adecuado cualquiera de los procedimientos de enumeración validados, siempre y cuando no interfiera en la capacidad del organismo para adherirse al sustrato seleccionado.

En los ejemplos ofrecidos más adelante en la presente memoria, se ha seleccionado el recuento directo al microscopio para la levadura Candida y una etiqueta fluorescente para las bacterias. Sin embargo, lo más importante es que se han enumerado en concreto la levadura y las bacterias que no se adhieren procedentes de la población estándar sin esforzarse por contar las células que se adhieren, porque lo habitual es que el sustrato interfiera en el recuento.

La base de la técnica implica exponer un número (conocido) estandarizado de levaduras o bacterias a un sustrato estandarizado (número de CEB), dejando un período de incubación de 60 minutos para que las células se adhieran, y filtrando luego la población combinada a través de una malla de nylon de 10 micrómetros. La malla retendrá las CEB y aquellas levaduras o bacterias que se adhieran a las mismas, las levaduras o bacterias que no se adhieren serán lavadas a su través, donde pueden ser enumeradas en el filtrado y expresadas como un porcentaje de la población original que no se adhiere; siendo el porcentaje de adherencia su inverso.

El recuento directo al microscopio de la levadura y las CEB se realiza usando un portaobjetos hemocitométrico graduado, siendo el procedimiento conocido por los expertos en la técnica.

El marcado fluorescente de las bacterias se realiza tras la adhesión (sobre aquellas células del filtrado) usando tintes fluorescentes tales como BCECF/AM (Calbiochem Biosciences Inc., La Jolla, CA) y Syto 13 (Molecular Probes, Oregón, EE.UU.). Los procedimientos de marcado son según lo descrito por los fabricantes de tintes. La cantidad de fluorescencia se mide en un fluorímetro (Fluroscan de Lab-Systems, Helsinki, Finlandia) y es directamente proporcional al número de bacterias presentes.

Se puede usar el siguiente procedimiento general para medir la adherencia de la levadura Candida albicans a CEB y la inhibición de tal adherencia usando la formulación de apoproteína(s) de suero lácteo según lo descrito anteriormente. El mismo procedimiento general es adecuado para medir la inhibición de la adherencia de Staphylococcus aureus a CEB y también la inhibición de la adherencia de Streptococcus mutans, con la excepción de que el sustrato para Streptococcus mutans sea hidroxilapatita en polvo disponible en Merck y se usa como sustituto del esmalte
dental.

Se prefiere un aislado clínico recién preparado de Candida albicans pues muchos de los cultivos han perdido virulencia en las colecciones de cultivos. Si algún aislado clínico no está disponible, se puede usar la cepa tipo de C. albicans ATCC 10231 para conseguir resultados representativos (ATCC es la colección americana de cultivos tipo que se encuentra en Maryland, EE.UU.).

La levadura se cultiva comúnmente en agar de extracto de malta Oxoid (siendo Oxoid una marca comercial). El caldo de dextrosa y peptona de extracto de levadura Oxoid se usa para cultivos líquidos, y éstos son inoculados desde placas de agar recién preparadas e incubadas con agitación a 37ºC durante 10 horas. Tras diez horas, se cosecha la levadura por centrifugación y se lava en PBS estéril a un pH 6,8.

Se recuentan al microscopio tanto las CEB lavadas como las células de lavadura lavadas recién cultivadas, y se ajustan las concentraciones tal que la levadura esté en el orden de 1 x 10^{5} y las CEB en el orden de 1 x 10^{3}. Los volúmenes iguales de las dos soluciones cuando se mezclan ofrecerán una proporción de 100 células de levadura por CEB.

Al analizar diversas concentraciones de sustancias analíticas tales como de apoproteína(s) de suero lácteo, éstas se añaden lo diluidas que se desee al PBS (pH 6,8) usado en la suspensión final de bien levadura o células bucales. Comúnmente, se usan concentraciones de 5, 2 y 1 mg por ml, y se llevan a cabo análisis para determinar la eficacia de la formulación en la inhibición de la adhesión, revistiendo previamente las CEB o revistiendo previamente la levadura. Se deja un período de sólo diez minutos como "pre-revestimiento" antes de la combinación con el resto de las dos suspensiones cuando comienza la adhesión. La formulación se muestra eficaz bien en el pre-revestimiento de células epiteliales bucales como en el pre-revestimiento de Candida albicans. De este modo, se puede alcanzar una mayor utilidad creando una barrera molecular protectora sobre cualquiera de estas o ambas superficies. Específicamente, el pre-revestimiento de células epiteliales bucales evitará el establecimiento de la adhesión, mientras que el pre-revestimiento del organismo patógeno, en este caso de la levadura, evitará que una colonia ya establecida se propague a otras zonas.

Se mezclan volúmenes iguales de dos soluciones/suspensiones y se incuban con una agitación suave durante 60 minutos, tras lo que la mezcla se filtra a través de una malla de nylon con una porosidad definida de 10 micrómetros. Se recuenta el número de levaduras del filtrado al microscopio y se expresa como un porcentaje de la población original. Cuando se usan aislados clínicos de alta virulencia, no es raro alcanzar el 40% de adherencia.

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Ejemplo 1

Preparación de ácidos grasos libres de suero lácteo y de apoproteínas de suero lácteo

El material inicial es polvo de lactosuero libre de lactosa (Carbelac 80 de Carbery Milk Products). El Carbelac 80 es comúnmente lactosuero al 100%, del que comúnmente el 0% es nata, el 80% es proteína, el 5% es humedad, el 8% es grasa y el 3% es ceniza. Se disuelven 30 gramos de este material inicial hasta un volumen final de 1 litro de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un pH 6,8. Se añade a esto 1 gramo de una composición adecuada de varias enzimas esterasas (principalmente, lipasas, pero también amilasas y proteasas), por ejemplo, "lipasa de tipo 2 cruda procedente de páncreas porcino" disponible en Sigma. Se incuba la mezcla a 37ºC durante 18 horas; se trata térmicamente a 60ºC durante 10 minutos para desactivar la enzima y se seca por pulverización.

Otras enzimas esterasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, "Palatasa" y "Novozima" comercialmente disponibles en Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca y usadas en una mezcla 50:50 (p/p) a 1 gramo por 30 gramos de lactosuero libre de lactosa.

Se puede seguir cromatográficamente el transcurso de la formación de la apoproteína y los ácidos grasos libres/monoglicéridos según lo ilustrado en el diagrama 1. La CLAR (de exclusión por tamaño) de filtración sobre gel usando Sephacryl S-200 y PBS (pH 6,8) como tampón de elución proporcionará una resolución adecuada para ilustrar los hechos principales producidos durante la hidrólisis enzimática. El uso de dos longitudes de onda para controlar el eluyente es ventajoso; a 280 nm, las proteínas se iluminan, mientras que el uso de una longitud de onda de 330 nm ilumina el componente de lípido/hidrato de carbono conjugado a estas proteínas. Un máximo delantero al tiempo de retención (t.r.) de 7,174 minutos (Diagrama 1A) representa la elución temprana de las proteínas de gran tamaño, siendo el componente lipídico visible como un máximo subyacente. En el transcurso de la hidrólisis (Diagramas 1B (2 horas) y 1C (8 horas)), desaparece el máximo delantero y su lípido/hidrato de carbono conjugado, con un aumento acorde en la concentración de dos fracciones posteriores (280 nm) a 9,7 y 10,6 minutos, siendo éstas proteínas más pequeñas y las apoproteínas procedentes del máximo delantero. El diagrama 1D muestra que la hidrólisis prolongada (16 horas) no muestra más cambios en el t.r. en ninguna longitud de onda.

Usando los procedimientos según lo destacado anteriormente, una composición típica de lactosuero libre de lactosa tratado enzimáticamente (o fracción rica en apoproteína(s) y en ácidos grasos libres) estará constituida por la siguiente "formulación típica":

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Se puede mejorar el procedimiento de preparación de apopoproteína(s) mediante la adición de tensioactivos tales como componentes purificados de sales biliares tales como ácido cólico y/o mediante la adición de cofactores enzimáticos adecuados tales como sales de calcio y/o mediante la adición de tampones adecuados tales como citrato de sodio. En algunas aplicaciones tales como la inhibición del crecimiento del SARM, el citrato de sodio residual también contribuye a las propiedades inhibidoras del crecimiento pero no a la inhibición de la adhesión. Se puede mejorar la estabilidad de los ácidos grasos libres y de sus monoglicéridos mediante la adición de antioxidantes tales como, por ejemplo, alfa-tocoferol (vitamina E).

Se puede manipular el contenido de gamma-globulina (inmunoglobulina) del lactosuero mediante la inmunización del animal donante. Los procedimientos de inmunización son conocidos, pudiéndose diseñar a medida y ampliar la especificidad de las inmunoglobulinas hacia cualquier determinado organismo usando cepas atenuadas de ese organismo en la vacuna. Aunque el uso de tales lactosueros inmunes pertenece al ámbito de la presente invención, se prefiere el uso de lactosuero no inmune, en el que la gamma-globulina "nativa" no tenga una especificidad particular por ningún organismo.

El material hidrolizado resultante presenta una inhibición del crecimiento y una inhibición de la adhesión según lo ilustrado en los siguientes ejemplos, en los que se usa Streptococcus mutans, el organismo de la caries dental, la levadura Candida albicans y el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina.

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La "formulación estándar" según lo descrito y ejemplificado en lo sucesivo en la presente memoria comprende (v/v):

4

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El procedimiento de hidrólisis activa las propiedades inhibidoras de la adhesión que no están presentes en el lactosuero pre-activado. El diagrama 2 ilustra este efecto mediante la comparación del suero lácteo pre- y post-hidrolizado (siendo éste último la formulación estándar) sobre la inhibición de la adhesión de Candida albicans a células epiteliales bucales. Tal y como se observará, aunque la leche no hidrolizada presente cierta inhibición de la adhesión, hay una marcada inhibición dependiente de la concentración de la adhesión en presencia de suero lácteo hidrolizado, tal que no se detecta ninguna adherencia de Candida albicans a 5 mg/ml.

Separación de las apoproteínas del suero lácteo

Se puede dividir la formulación estándar usando un procedimiento de extracción con cloroformo: metanol para separar las fracciones de lípido y apoproteína.

El procedimiento fue realizado usando una concentración de la formulación estándar a 10 mg/ml de solución salina tamponada con fosfato a un pH 6,8. Se añadió un ml de esta solución a tubos de vidrio que contenían 5 ml de cloroformo y 2,5 ml de metanol. Se sometió la mezcla a un movimiento vorticial durante 30 segundos y luego se agitó durante 30 minutos, tras lo que se dejó reposar hasta que se hubo completado la separación de las capas de disolvente. Se retiró la capa de metanol más superficial usando una pipeta de Pasteur. Se secaron al vacío alícuotas de cada fracción de disolvente. Cualquier compuesto polar (proteínas) se encuentra presente en la fracción de disolvente polar (metanol), quedando los compuestos no polares (ácidos grasos) retenidos en la capa de cloroformo. Se elevaron las fracciones de metanol secadas en una décima parte de su volumen original en solución salina tamponada con fosfato a pH 6,8 y se elevó la fracción de cloroformo secada en una décima parte del volumen original de etanol, y se diluyó en PBS a efectos analíticos.

El diagrama 3 ilustra las propiedades inhibidoras de la adhesión de tanto la fracción rica en apoproteína(s) como de la fracción rica en lípidos, dependiendo la inhibición de la adhesión de la concentración asociada con la fracción rica en apoproteína(s) y no con la fracción lipídica. De hecho, a 5 mg/ml, no se pudo detectar casi ninguna adhesión de Candida albicans.

El diagrama 4 ilustra las propiedades inhibidoras del crecimiento dependientes de la concentración de la fracción rica en lípidos sobre Candida albicans, mientras que el diagrama 5 muestra que la fracción rica en apoproteína(s) no tiene efecto sobre el crecimiento (hay, de hecho, cierta ampliación del crecimiento a 10 mg/ml de la concentración creciente de fracción proteínica).

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Ejemplo 2

Se evaluaron las propiedades inhibidoras del crecimiento de la formulación estándar frente a un aislado clínico recién preparado de Candida albicans usando el análisis de crecimiento descrito en el apartado de "Procedimientos y materiales" anterior. El análisis fue un formato de placas de microvaloración y cada concentración analítica se realizó por cuadruplicado. Se midió el crecimiento a 660 nm durante un período de 20 horas y los resultados se ilustraron en el diagrama 6. La formulación estándar (a 5 mg/ml) proporcionó una inhibición del crecimiento del casi 90% en comparación con el control con 0 mg/ml de formulación estándar añadida. La formulación estándar a 1 mg/ml proporcionó un resultado intermedio.

El uso de un procedimiento analítico similar, con la excepción de la adición de las sustancias analíticas tras 5 horas de crecimiento normal, se describe en la presente memoria como un ensayo de intervención. La formulación estándar se añade a concentraciones que varían de 0 mg/ml a 8 mg/ml. Las concentraciones analíticas se establecen tal que haya un efecto de dilución similar en todos los pozos cuando se añaden soluciones de análisis precalentadas (hasta 37ºC). En el diagrama 7, se presentan los resultados de un ensayo de intervención sobre un aislado clínico recién preparado de Candida albicans, habiendo sido procesados los datos para eliminar el cambio de densidad óptica a las 5 horas resultante de la adición del material analítico. El inmediato y espectacular efecto inhibidor dependiente de la concentración de la formulación estándar sobre el crecimiento de C. albicans resulta evidente a concentraciones de 8, 6, 4 y 2 mg/ml.

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Ejemplo 3

La formulación estándar inhibe la adhesión, así como el crecimiento. El procedimiento analítico de la adhesión se ha descrito en el apartado de "Procedimientos y materiales" anterior. Usando la misma formulación que en el ejemplo 2, en los diagramas 8 y 9, se ilustran los efectos inhibidores sobre la adhesión a CEB del mismo aislado clínico recién preparado.

En el diagrama 8, se han expuesto células de levadura a la formulación estándar durante 10 minutos antes de ser añadidas a las CEB. En el diagrama 9, se han expuesto CEB a la formulación estándar durante 10 minutos antes de ser añadidas a la suspensión de levadura.

El "control" en ambos análisis representa la adhesión alcanzada en condiciones analíticas cuando no hay presentes sustancias inhibidoras; 41% y 35% respectivamente. La adición de formulación estándar a 1 mg/ml en pre-tratamiento de Candida reduce la adhesión hasta un 20% (53% de inhibición), mientras que la misma concentración en pretratamiento de CEB reduce la adhesión hasta el 16% (55% de inhibición). A 2 y 5 mg/ml de formulación estándar en pretratamientos tanto de levadura como de CEB, hay una inhibición del 100% de la adhesión en las condiciones analíticas.

El "blanco proteínico" del diagrama 8 es albúmina de suero bovino y en el diagrama 9, se usó clara de huevo desovalbuminizada, ambas a 1 mg/ml y ambas con la pretensión de indicar que el efecto de la formulación estándar no es "simplemente" un efecto debido a la concentración proteínica.

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Ejemplo 4

En los diagramas 10 y 11, se demuestra la eficacia de la formulación estándar frente tanto al crecimiento como a la adhesión de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM).

El SARM habitualmente se sub-cultiva sobre agar sangre y se usa una sola colonia para inocular un tubo de caldo de infusión cerebro corazón Oxoid según lo descrito en el apartado de "Procedimientos y materiales" anterior. Tras 8 horas, se usa el inóculo en los análisis de crecimiento y de adhesión usando las metodologías descritas anteriormente.

El SARM no es tan sensible a los ácidos grasos libres/monoglicéridos como otros organismos, siendo la adición de sales de citrato, como las contenidas en la formulación estándar, esencial para una inhibición significativa del crecimiento de este organismo en concreto.

El diagrama 10 ilustra el efecto de la formulación estándar a 5 mg/ml y con concentraciones crecientes de citrato de trisodio (0, 2, y 5 mg/ml). La inhibición completa del crecimiento se alcanza cuando se añade el citrato de trisodio a 4 ó 5 mg/ml a la formulación estándar de 5 mg/ml. El citrato de trisodio se añade a las soluciones analíticas mientras se están preparando en el medio de crecimiento según lo descrito en los métodos de "análisis del crecimiento". Específicamente, según lo descrito, se mezcla la solución madre de la formulación estándar (concentración de 20 mg/ml) con un volumen igual de una solución de citrato de trisodio (concentración de 20 mg/ml). De este modo, se alcanza una dilución de 1:2 en una solución que contiene 10 mg/ml de formulación estándar y 10 mg/ml de citrato de trisodio. Según lo explicado anteriormente, esta formulación compuesta es, en el pozo de análisis, una formulación estándar a 5 mg/ml y un citrato de trisodio a 5 mg/ml. Por supuesto, igualmente, se puede mezclar la solución de formulación estándar madre de 20 mg/ml con un volumen igual de una solución de citrato de trisodio que contenga 16 mg/ml o 8 mg/ml, para obtener una formulación estándar complementada con 4 y 2, respectivamente, mg/ml de citrato de trisodio según lo mostrado en el diagrama 10.

El SARM se adhiere a las CEB, y éstas se usan aquí de una manera similar a la descrita para Candida albicans. El citrato de sodio, solo, no tiene efectos sobre la adhesión del SARM a CEB, mientras que, según lo ilustrado en el diagrama 11, se alcanza una inhibición casi completa de la adhesión a 5 mg/ml de la formulación estándar (sin adición de citrato de sodio) en las condiciones analíticas. La albúmina de suero bovino se usa como "blanco proteínico" y este material no tiene efecto sobre la adhesión del SARM a CEB.

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Ejemplo 5

El organismo Streptococcus mutans se considera el agente causante de la caries dental, pues se adhiere ávidamente a la superficie del esmalte dental. La fermentación del hidrato de carbono resulta en la secreción del ácido láctico, que hace descender el pH localizado hasta donde se produce la disolución del esmalte dental y la aparición de la caries dental.

El diagrama 12 ilustra el efecto de 5 mg/ml de formulación estándar sobre el crecimiento de Streptococcus mutans. El análisis se lleva a cabo de la manera descrita para todos los análisis de crecimiento anteriores. A 5 mg/ml de formulación estándar, hay una inhibición completa del crecimiento del organismo durante las 15 horas analizadas. Durante el mismo período, el crecimiento del control, con solución salina tamponada con fosfato a un pH 6,8 añadida en lugar de la formulación estándar, muestra el esperado aumento logarítmico.

En la medición de la inhibición de la adherencia del Streptococcus mutans, se usó polvo de hidroxiapatita de Merck como sustituto del esmalte dental. El procedimiento analítico fue según lo descrito en el apartado de "Procedimientos y materiales" anterior, con las siguientes modificaciones: se añade 1 ml de cultivo recién preparado, ajustado hasta una densidad óptica de 0,1 a 600 nm a 5 mg de perlas de hidroxiapatita revestidas de saliva; se deja que se produzca la adherencia durante 1 hora; y se centrifuga a una velocidad lenta hasta que sedimente la hidroxiapatita con bacterias adherentes. El número de bacterias que permanece en el sobrenadante es ese porcentaje de la población original que no se adhiere, y se expresa como un porcentaje de la población original; siendo la inversa el porcentaje de inhibición de la adherencia.

El diagrama 13 ilustra el efecto inhibidor de la adhesión dependiente de la dosis de formulación estándar; alcanzándose la inhibición casi completa a 0,8 mg/ml. De nuevo, en este ejemplo, se usó la albúmina de suero bovino como "blanco proteínico" y en este sistema analítico, la ASB tiene un efecto inhibidor de alrededor del 30% a 0,8 mg/ml, mientras que el citrato de sodio presenta una inhibición de la adhesión de alrededor del 10%.

Claims (38)

1. Una apoproteína láctea despojada de sus ácidos grasos y/o restos de hidratos de carbono conjugados para su uso en la inhibición de la adhesión de posibles patógenos a o sobre la superficie de un cuerpo humano o animal.

2. El uso de una apoproteína láctea despojada de sus ácidos grasos y/o restos de hidratos de carbono conjugados para la fabricación de un medicamento destinado a inhibir la adhesión de posibles patógenos a o sobre la superficie de un cuerpo humano o animal.

3. Un sistema de administración farmacéuticamente aceptable que comprende al menos una apoproteína láctea despojada de sus ácidos grasos y/o restos de hidratos de carbono conjugados en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la, o cada, apoproteína láctea es una apolipoproteína láctea.

5. Un uso o un sistema de administración según la reivindicación 4, en el que la, o cada, apolipoproteína láctea es derivable de una lipoproteína láctea seleccionada entre betalactoglobulina y membrana de glóbulo de grasa, o una mezcla de las mismas.

6. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la, o cada, apoproteína láctea es derivable de alfa-lactalbúmina.

7. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la apoproteína láctea es obtenible mediante la hidrólisis de suero lácteo o lactosuero con una(s) enzima(s), preferiblemente, una(s) lipasa(s); la desnaturalización de la(s) enzima(s); y la separación de la fracción rica en apoproteína(s).

8. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la apoproteína láctea es obtenible mediante la hidrólisis de suero lácteo o lactosuero con una(s) enzima(s), preferiblemente, una(s) lipasa(s).

9. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la leche es leche de vaca o de cabra.

10. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos un ácido graso libre o una de sus mezclas; o un monoglicérido del mismo, o una de sus mezclas.

11. Un uso o un sistema de administración según la reivindicación 10, en el que el, o cada, ácido graso está saturado o insaturado, y tiene una cadena de hidrocarburo con un número par de átomos de carbono de C4-C24, o una de sus mezclas.

12. Un uso o un sistema de administración según la reivindicación 11, en el que el, o cada, ácido graso insaturado tiene una cadena de hidrocarburo con C14-C24, y se selecciona preferiblemente entre los ácidos palmitoleico, oleico, linoleico, alfa y gamma linolénico, araquidónico, eicosapentanoico y tetracosenoico, y sus monoglicéridos, o una mezcla de los mismos.

13. Un uso o un sistema de administración según la reivindicación 11, en el que el, o cada, ácido graso saturado tiene una cadena de hidrocarburo con C4-C18, y se selecciona preferiblemente entre los ácidos butírico, isobutírico, succínico, caproico, adípico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico y esteárico, y sus monoglicéridos, o una mezcla de los mismos.

14. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene además incorporado al menos un ácido orgánico, o una sal o un éster del mismo, o una de sus mezclas.

15. Un uso o un sistema de administración según la reivindicación 14, en el que el ácido orgánico se selecciona entre los ácidos glicólico, oxálico, láctico, glicérico, tartrónico, málico, maleico, fumárico, tartárico, masólico, glutárico, propenoico, cis o trans butenoico y cítrico, o sus sales o ésteres, o una de sus mezclas.

16. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene además incorporado un antioxidante, preferiblemente, alfa-tocoferol.

17. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16 en la forma de una solución para la infusión parenteral para el tratamiento sistémico o la prevención de una infección.

18. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16 en la forma de una pomada para una aplicación tópica en la prevención o el tratamiento de una infección cutánea.

19. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16 en la forma de una crema o un gel intravaginal, o un óvulo vaginal para prevenir o tratar la infección recurrente por Candida albicans.

20. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16 en la forma de un apósito quirúrgico para su uso en la prevención o el tratamiento de una infección.

21. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16 en la forma de un medicamento para la aplicación en las mucosas del ojo, de la nariz, de la boca, del intestino o de los genitales.

22. Un uso o un sistema de administración según la reivindicación 21 en la forma de un colirio destinado a prevenir o tratar las infecciones oculares.

23. Un uso o un sistema de administración según la reivindicación 21 en la forma de un pulverizado nasal para inhibir la transferencia de organismos resistentes a antibióticos desde un vehículo.

24. Un uso o un sistema de administración según la reivindicación 21 en la forma de un alimento o una bebida para su uso como agente profiláctico contra la infección intestinal.

25. Un uso o un sistema de administración según la reivindicación 21 en la forma de una formulación oral de asistencia sanitaria seleccionada entre una pasta de dientes, una goma de mascar, un colutorio u otro dentífrico para mejorar la higiene dental o como agente profiláctico contra la enfermedad bucal.

26. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 25, cuando depende de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el suero lácteo o el lactosuero hidrolizado está presente en un intervalo de concentración de 0,5 a 25 mg/ml.

27. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la apoproteína láctea está presente en un intervalo de concentraciones de 0,5-10 mg/ml, preferiblemente, 3-7 mg/ml.

28. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el ácido graso libre, o el monoglicérido del mismo, o una de sus mezclas, está presente en un intervalo de concentración de 0,5-5 mg/ml.

29. Un uso o un sistema de administración según la reivindicación 14 ó 15, en el que el ácido orgánico, o la sal o el éster del mismo, o una de sus mezclas, está presente en un intervalo de concentraciones de 0,5-5 mg/ml.

30. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, y 28, en el que la apoproteína láctea y el ácido graso libre o el monoglicérido del mismo, o una de sus mezclas, son para ser administrados bien simultánea o consecutivamente en 6 horas en cualquier orden.

31. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 y 29, cuando depende de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la apoproteína láctea y el ácido orgánico, o la sal o el éster del mismo, son para ser administrados bien simultánea o consecutivamente en 6 horas en cualquier orden.

32. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 y 29, cuando depende de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la apoproteína lácteam, el ácido graso libre, o el monoglicérido del mismo, y el ácido orgánico, o la sal o el éster del mismo, o una de sus mezclas, son para ser administrados bien simultánea o consecutivamente en 6 horas en cualquier orden.

33. Un uso o un sistema de administración según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16 para el cuidado cosmético de la piel.

34. Un producto que comprende: (a) al menos una apoproteína láctea despojada de sus ácidos grasos y/o restos de hidrato de carbono conjugados y (b) al menos un ácido graso libre o un monoglicérido del mismo.

35. Un producto según la reivindicación 34, en el que el, o cada, apoproteína láctea es una apoliproteína láctea.

36. Un producto según la reivindicación 35, en el que la, o cada, apolipoproteína láctea es derivable de una lipoproteína láctea seleccionada entre beta-lactoglobuina y membrana de glóbulo de grasa.

37. Un producto según la reivindicación 34, en el que la, o cada, apoproteína láctea es derivable de alfa-lactalbúmina.

38. Un producto según una cualquiera de las reivindicaciones 34-37, en el que la, o cada, ácido graso se selecciona entre los ácidos palmitoleico, oleico, linoleico, alfa y gamma linolénico, araquidónico, eicosapentanoico, tetracosenoico, butírico, isobutírico, succínico, caproico, adípico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico y esteárico, y sus monoglicéridos, o una de sus mezclas.