JPH085798B2

JPH085798B2 - 抗菌剤

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Publication number: JPH085798B2
Application number: JP62022986A
Authority: JP
Inventors: 定頼保科; 紀夫多田; 公生黒坂
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-02-02
Filing date: 1987-02-02
Publication date: 1996-01-24
Anticipated expiration: 2011-01-24
Also published as: JPS63190832A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、新規な抗菌剤、より詳しくはアポリポタン
パク質Ａ−Ｉを含有するリポタンパク質を有効成分とす
る抗菌剤に関する。

従来の技術近年、生体防御能が低下乃至障害された個体（compro
mised host）における易感染性の問題が着目され、殊に
該固体にそれまで無害であった病原体が病原性を発揮し
て惹起される、いわゆる日和見感染症（opportunistic
infection或いはterminal infection）が臨床分野にお
いて重要な問題となってきている。該日和見感染症の病
原体（起炎菌）については、臨床細菌学等の分野で研究
の結果、表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）、シュード
モナス（Pseudomonas）、セラティア（Serratia）等の
グラム陰性桿菌、ヘルペス（Herpes simplex,HSV）、パ
リセラーゾースタ（Varicella zoster,VZV）、サイトメ
ガロウイルス（Cytomegalovirus,CMV）等のウイルス、
キャンディダ（Candida albicans）、アスペルギルス
（Aspergillus fumigatus）、ノカルディア（Nocardia
asteroidea）等の真菌、カリニ原虫（Pneumocystis car
inii）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）等の原
虫等であることが明らかにされている。しかしながら該
感染症における宿主側の研究は不充分であり、例えば好
中機構、免疫機構を除いて、その感染防御機構としての
血清の細菌防御能等は未だ殆んど不明である。しかし
て、現在上記日和見感染症の治療には、公知の各種抗生
物質が用いられているが、現用の抗生物質中には、上記
病原菌に対して充分な効果を奏し得るものは存在せず、
宿主側の感染防御機構の知見を考慮にいれた該日和見感
染症に対する新しい薬剤の研究開発が切望されている。

一方、血漿リポタンパク質対する研究が、種々行なわ
れており、該リポタンパク質と免疫や癌との関連につい
てもいくつか報告がなされている。即ち、1971年にチャ
ン（Chan）らは、超低比重リポタンパク質（VLDL）に、
骨髄細胞によるコロニー刺激因子の産生を抑制する作用
のあることを報告している。1976年にチサリ（Chisar
i）らは、リポタンパク質がＴ細胞のロゼット形成を阻
害することを、ビーバー（Bieber）らはリポタンパク質
がPHA試験を抑制することを各々報告している。また197
9年にハッグマン（Hagmann）らは上記VLDLのほか、中間
型リポタンパン質（IDL）、低比重リポタンパク質（LD
L）が、EVウィルスによるＢリンパ球のトランスフォー
メーションを抑制すると報告している。更に、発癌と血
清コレステロール濃度の逆相間がフラミンガム調査をは
じめとするいくつかの施設で報告されており、リンパ球
を用いたインビトロの実験で、培養中のコレステロール
濃度を下げると、リンパ球膜のコレステロール濃度は低
下し、免疫異常をきたす旨の報告もある。リポタンパク
質による内皮細胞、繊維芽細胞に対する細胞毒性（cyto
toxicity）についての報告もいくつか存在している。し
かるに、リポタンパク質は勿論のこと、何らかの血清成
分が、日和見感染症に対する抗菌活性を示す旨の報告は
皆無である。

発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、各種病原菌による感染症、殊に日和
見感染症の予防及び治療に有効な新しい抗菌剤を提供す
ることにある。

問題点を解決するための手段本発明によれば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（以下
「アポＡ−Ｉ」という）を含有するリポタンパク質を有
効成分とする抗菌剤が提供される。

本発明抗菌剤は、殊に日和見感染症の病原菌（起炎
菌）に対して優れた抗菌活性を奏するものであり、該感
染症の予防及び治療剤として有効である。特に本発明抗
菌剤は、かかる日和見感染症が高頻度に見られる抗癌剤
投与時、即ち急性白血病の化学療法や骨髄移植時等にお
ける各種の感染症、例えばガンジダ症、クリプトコック
ス症、アスペルギルス症、接合菌症、黒色真菌感染症、
ウイルス感染症、サイトメガロウイルス肺炎、之等の合
併症等の予防及び治療剤として有用である。

本発明抗菌剤の有効成分とするリポタンパク質は、ア
ポタンパク質としてアポＡ−Ｉを含有することを必須と
する。しかして上記リポタンパク質は、アポＡ−Ｉを含
有する限り特に限定されず、通常の可溶性リポタンパク
質は、いずれも本発明抗菌剤の有効成分として利用でき
る。特にヒト血漿リポタンパク質は上記有効成分として
好ましいものであり、その内でも通常の方法、例えば比
重遠心法、電気泳動法、沈澱法、ゲル過法、イオン交
換クロマトグラフィー、免疫学的方法及びそれらの組合
せ等によって分離される高比重リポタンパク質（HDL）
は好ましい。かかる本発明抗菌剤有効成分として好まし
く利用できるリポタンパク質は、比重として1.006〜1.2
10、好ましくは1.063〜1.210、ゲル過による分子量と
して180000〜2300000、好ましくは180000〜360000を有
しているものを包含する。

本発明有効成分としては、アポＡ−Ｉに着目した上記
免疫学的方法、特にアポＡ−Ｉ抗体を利用したアプィニ
ティクロマトグラフィーにより得られるリポタンパク質
が最も好ましい。

本発明抗菌剤は、通常一般的な医薬製剤の形態で用い
られる。該製剤はこの分野で通常使用される各種の担
体、例えば充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、
表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて
調製される。この医薬製剤としては各種の形態が治療目
的に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸
剤、散財、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、
坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等が挙げられる。錠剤
の形態に成形するに際しては、担体として例えば乳糖、
白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭
酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の
賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、
ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメ
チルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸
カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デン
プン、アルギン酸アナトリウム、カンテン末、ラミナラ
ン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキ
シエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸
ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、
乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水
素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラ
ウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デ
ンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベント
ナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ス
テアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の
滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤
皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸用
被錠、フイルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠
とすることができる。丸剤の形態に成形するに際して
は、担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカ
オ脂、硬化植物油、カオリン、タルク糖の賦形剤、アラ
ビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の
結合剤、ラミナランカンテン等の崩壊剤等を使用でき
る。坐剤の形態に成形する際しては、担体として例えば
ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、
高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセ
ライド等を使用できる。注射剤として調製される場合、
液剤、乳剤及び懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であ
るのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、
希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレン
グリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポ
リオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチ
レンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。尚、
この場合等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブ
ドウ等、グリセリン等を製剤中に含有させてもよく、ま
た通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を配合しても
よい。上記各形態の本発明製剤中には、更に必要に応じ
て慣用される着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等
を配合することができ、また他の医薬品有効成分化合物
を含有させることもできる。

本発明抗菌剤中に含有されるべき有効成分の量は、特
に限定されず広範囲から適宜選択されるが、通常蛋白量
として全組成物中に0.05〜50重量％、好ましくは0.1〜3
0重量％含有される量とするのが適当である。

本発明抗菌剤の投与方法は、特に制限はなく各種製剤
形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に
応じて適宜決定できる。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁
剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等は経口投与される。注
射剤は単独であるいはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補
液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて単独で
筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤は
直腸内投与される。

本発明抗菌剤の投与量は用法、患者の年齢、性別その
他の条件、湿案の程度等により適宜選択されるが、通常
有効成分量が蛋白量として１日当り体重1kg当り約0.1〜
100mgとなる量とするのがよい。

実施例以下、本発明を更に詳しく説明するため、実験例を挙
げる。

実験Ｉこの実験は、日和見感染を起こし易い疾患について、
血清中の抗菌活性を検討したものである。

まず、60穴のマイクロプレートに滅菌したリン酸緩
衝生理食塩水（PBS）を20μずつ分注し、これに0.45
μｍのミリポァフィルターで滅菌過した被験血清各μ
を加えて倍数希釈した。

菌液として、ブドウ球菌（S.epidermidis H155株）
を、トリプトソイブイヨン培地（TSB）中にて12時間培
養し、次いで同培地で100倍希釈して３時間培養後、菌
数を１×10⁸cfu/mlに調整し、更に５倍濃度のカジトン
グルコース培地（casiton glucose broth）で10⁴培希釈
し、菌数を10⁴cfu/mlに再調整したものを用いた。

上記で調整した菌液５μをの各ウェルに分注
し（この時菌数は50cfu/ウェルとなる）、37℃で12時間
培養し、菌体の増殖率を観察した。

上記において被験血清の何倍の倍数希釈液まで菌
体の増殖が阻止されるかを指標として、該被験血清の抗
菌作用の強さを判断した。

各種疾患患者及び健常人の血清を被験血清として得ら
れた結果を下記第１表に示す。

上記第１表より、健康常人血清は、８〜24倍希釈まで
抗菌活性を示すが、日和見感染症を起こし易い疾患、例
えば白血病、顆粒球減少症、癌等の患者血清では、１〜
６倍希釈までしか抗菌活性を示さず、生体防御機構が明
らかに低下していることが判る。

実験２この実験は、血清の分子量分画を行ない該血清中の抗
菌活性を示す物質の分子量を求めたものである。

被験血清3mlを、ウロトロゲルAcA54を用いて、下記
条件で分画した。

カラムサイズ:2.5×100cm 溶出液:0.3M NaCl含有2.5mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
8）フラクション:2ml/チューブその結果、フラクションNo.70及び71に強い抗菌活性
（測定は実験１に従う）を示す物質が得られた。

この物質の分子量は、ヒト血中高比重リポタンパク質
（HDL）に相当した。

実験３実験２の結果に基づき、以下の通りヒトHDLの抗菌活
性を検討した。

被験血清5mlを、イオン交換クロマトグラフィーDE5
2セルロース（ワットマン）を利用して下記条件下に分
画した。

使用樹脂重量:10g（容量18ml）溶出液:2.5mMトリス塩酸緩衝液（pH7.8）、０→1M NaC
lグラジエント溶出フラクション:1ml/チューブ各フラクションの抗菌活性を実験１に準じて、測定し
た結果、フラクションNo.2〜13に活性が認められ、その
内特にNo.12〜13とNo.4〜６は抗菌活性が強かった。

上記で得た抗菌活性の認められるフラクション
（フラクションNo.12〜13）を、TSK G3000SWを用いた
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によりゲル過し
た。その条件は、流速0.5ml/分、300psi、0.5AuFs、0.5
ml/チューブ＝10滴、溶出液＝0.2M Na₂HPO₄緩衝液（pH
6.8）である。

その結果、リテンションタイム29分〜39分に強い公金
活性（測定は実験１に同じ）を示す物質のフランション
が得られた。

上記で得た抗菌活性物質を、SDSゲルで泳動位置
を観察した〔臨床検査、Vol.29,No,1985年,pp1416〜142
1〕。

その結果、上記の抗菌活性物質中に、アポＡ−Ｉと
同位置に泳動される物質の存在を確認し、このことから
HDの抗菌作用の存在が確認された。

実験４この実験は、リポタンパク質の抗菌活性を検討したも
のである。

被験血清より、超遠心法にて、各リポタンパク質分
画を分離し、それぞれHDL、LDL及びVLDLを採取した。

上記HDL、LDL及びVLDLのそれぞれを50mM NH₄HCO₃
（pH8.0）緩衝液にて同一濃度に調整し、0.45μｍミリ
ポアーフィルターを通過させた後、各1mlを小試験管に
分注した。対照（コントロール）として同緩衝液1mlを
同操作により調整した。

菌液として、ブドウ球菌（S.epidermidis H155株）
を、TSB中にて12時間培養後、同培地で100倍希釈して３
時間37℃で培養し、得られる培養液を同培地で更に100
倍希釈したものを用いた。これを上記で調整した各小
試験管に10μずつ添加し、菌数５×10₃cfu/試験管と
した。

上記の各試験管を、恒温槽にて37℃に保ち、経時
的に各試験管より50μを採取し、顕微鏡下に菌体数を
測定して、各試験管内のリポタンパク質の抗菌活性を調
べた。

０時間の菌数を1.0（標準）として、各試料における
経時的菌数の推移を算出した結果を、下位第２表に示
す。尚、被験血清として、被験者３名より各々採取した
ものを試験した。

上記第２表より、リポタンパク質の抗菌活性の強さ
は、HDL＞LDL＞VLDLであることが判る。より詳しくは、
上記各リボンタンパク質分画は、培養３時間後にて、い
ずれも対照に比して菌体の発育をよく阻止しているが、
培養９時間後において、VLDLは菌体の発育をむしろ促進
する結果となっている。一方、HDLは、培養21時間後に
も、菌体の発育を良好に阻止することが明らかである。

実験５抗アポＡ−Ｉ抗体のアフィニティクロマトグラフィー
によるリポタンパク質の精製実験３で得た抗菌活性物質分画（リテンションタイ
ム31分、32分及び33分の各分画）を原料分画N31、N32及
びN33として利用した。

各原料分画を、更に抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体
結合アフィニティカラム（アポカラムＡ−I:日本抗体研
究所社製、カラム容量1ml）に添加し、まず0.15M NaCl
含有0.01Mリン酸塩緩衝液（pH7.2）で溶出させて、第１
溶出液分画（カラム非吸着分画）を得た。次いで同緩衝
液でカラムを洗浄した後、0.5M NaCl含有1M酢酸緩衝液
でカラムに吸着された分画を溶出させ、得られた溶出液
を0.5倍量（v/v）の3.5Mトリス水溶液にて中和して、第
２溶出液分画（アポＡ−Ｉ含有タンパク質）を得た。

上記で用いた各原料分画、これらから得られた各
溶出分画（第１溶出液及び第２溶出液）並びに対照とし
て0.15M NaCl含有リン酸塩緩衝液（pH7.2）（対照Ｉ）
及び0.5M NaCl含有1M酢酸緩衝液＋0.5倍量（v/v）3.5M
トリス塩酸緩衝液（対照II）のそれぞれについて、実験
１のマイクロプレート法にて抗菌活性を検討した。但し
この検討は菌の増殖ありを（＋）、なしを（−）として
判定した。

得られた結果を下記第３表に示す。

尚、各画分に含まれるタンパク質の濃度（mg/ml）を
求めた結果は、下記第４表に示す通りである。

また、上記の各分画について、之等を前記実験３
のと同様にしてSDSSゲルに添加して、各々に含有され
るタンパク質の構成解析を行なった。

上記SDSゲル電気泳動のパターンを解析した結果、第
１溶出液には、アポＡ−Ｉの存在は認められず、第２溶
出液中にアポＡ−Ｉが検出された。

上記第３表及び第４表の結果より、第２溶出液分画
は、第１溶出液分画に比し、タンパク質濃度が低いにも
かかわらず、強い抗菌活性を示すことが明らかであり、
このことから、アポＡ−Ｉを有する粒子（リポタンパク
質）に強い活性が認められ、このリポタンパク質が抗菌
剤として有効であることが判った。

以下、本発明港菌剤の製剤例を挙げる。尚、各例にお
いては有効成分として、上記実験５ので得た第２溶出
液分画（アポＡ−Ｉ含有リポタンパク質）を用いた。

製造例１蛋白量として５重量％となるように有効成分が配合さ
れる以外は、通常のアミノ酸製剤及び脂肪乳剤と略同一
組成を有する注射剤をそれぞれ調製した。

製造例２蛋白量として10重量％の有効成分が配合される以外
は、日本薬局方記載の親水軟膏と同様にして親水軟膏を
調製した。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含有するリポ
タンパク質を有効成分とする抗菌剤。