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FR2863168A1 - Utilisation d'inducteurs de la voie de degradation de la gamma-butyrolactone pour inactiver le signal n-acy homoserine lactone. - Google Patents

Utilisation d'inducteurs de la voie de degradation de la gamma-butyrolactone pour inactiver le signal n-acy homoserine lactone. Download PDF

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FR2863168A1
FR2863168A1 FR0314231A FR0314231A FR2863168A1 FR 2863168 A1 FR2863168 A1 FR 2863168A1 FR 0314231 A FR0314231 A FR 0314231A FR 0314231 A FR0314231 A FR 0314231A FR 2863168 A1 FR2863168 A1 FR 2863168A1
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FR
France
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butyrolactone
inducer
degradation pathway
gbl
organism
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FR0314231A
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Denis Faure
Aurelien Carlier
Yves Dessaux
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Abstract

Utilisation d'un inducteur de la voie de dégradation de la γ-butyrolactone comme antibactérien, notamment dans les domaines de l'agriculture, de l'industrie agroalimentaire et de la médecine humaine et animale.

Description

La présente invention est relative à l'utilisation d'inducteurs de la voie
de dégradation de la y-butyrolactone pour inactiver le signal N-acyl homosérine lactone produit par des bactéries pathogènes et aux applications de ces inducteurs comme antibactériens, notamment dans les domaines de l'agriculture, de l'industrie
agroalimentaire et de la médecine humaine et animale.
L'augmentation constante du nombre de souches de bactéries multirésistantes aux antibiotiques, ainsi que la formation de biofilms résistants aux antibiotiques, antiseptiques et désinfectants, pose des problèmes dans les domaines de la santé humaine et animale, de l'agriculture et de l'industrie agroalimentaire.
En conséquence, pour lutter plus efficacement contre les bactéries pathogènes, il existe un réel besoin de disposer d'alternatives au traitement par les antibiotiques et au nettoyage par les désinfectants classiques.
Pour contourner les défenses de l'hôte (humain, animal ou végétal), les bactéries ont développé une stratégie de contrôle de la virulence par un mécanisme de communication intercellulaire, dépendant de la densité de population, dénommé quorum-sensing. Ces bactéries sont capables de produire, de détecter et de répondre à des petites molécules signal, autoinductibles et diffusibles, dénommées quormones ; lorsque la population bactérienne atteint une densité suffisante, la concentration en quormone dépasse un seuil critique et l'expression des gènes de virulence est activée par l'interaction des quormones avec des facteurs régulateurs de la transcription spécifiques, permettant ainsi une attaque synchrone, massive et efficace de l'hôte.
Ainsi, l'interruption du signal des quormones, également dénommé quorum quenching représente une nouvelle approche pour identifier de nouveaux composés pouvant être utilisés comme antibactériens aussi bien dans le domaine de la médecine humaine et vétérinaire (prévention et traitement des infections bactériennes), que dans celui de l'agriculture (lutte contre les pathogènes végétaux), de l'industrie agroalimentaire (conservation des aliments) et de la santé humaine et vétérinaire (désinfection de matériel à usage médical, industriel, domestique, ainsi que de l'environnement), (pour une revue voir Camara et al., The Lancet, 2002, 2, 667-676 et Zhang et al., Trends in Plant Science, 2003, 8, 238244).
Parmi les quormones, celles de la famille des N-acyl homosérine lactones (NAHL) qui sont présentes chez de nombreuses bactéries pathogènes à Gram négatif, sont les mieux caractérisées. Ces bactéries pathogènes incluent notamment les genres Burkholderia, Erwinia et Pseudomonas, responsables de la destruction des cultures de plantes d'intérêt agronomique comme le riz ou la pomme de terre, ainsi que d'infections nosocomiales et opportunistes chez l'homme.
Les NAHL sont constituées d'un cycle homosérine lactone, lié par l'intermédiaire d'une liaison amide à un groupement acyle d'une chaîne carbonée en C4-C14, saturée ou insaturée, éventuellement substituée au niveau du carbone en posi- tion 3, par un groupement hydroxyle ou carbonyle (Figure 1 de Camara et al., précité). Elles interagissent spécifiquement avec des facteurs de transcription de la famille LuxR, permettant ainsi de maintenir la concentration intracellulaire en facteur LuxR qui sont instables et rapidement dégradés en l'absence de liaison avec des NAHL.
La biosynthèse des NAHL implique la synthèse d'acyl-ACP (ACP pour Acyl Carrier Protein) par la voie de synthèse des acides gras et la catalyse de la réaction entre 1'Acyl-ACP et la S-adénosylméthionine, par la NAHL synthase. La dégradation enzymatique des NAHL implique deux voies distinctes, la première impliquant une hydrolase à zinc dénommée lactonase, et la seconde une acylase.
Parmi les gènes codant respectivement pour ces lactonases et ces acylases, on peut citer: le gène aiiA chez Bacillus sp (Dong et al., P.N.A.S., 2000, 97, 3526-3531) et ses homologues comme les gènes attM chez Agrobacterium tumefaciens (Zhang et al., P.N.A.S., 2002, 99, 4638-4643) et ahlD chez Arthobacter sp. (Park et al., Microbiol., 2003, 149, 1541- 1550), et le gène aiiD chez Ralstonia sp. (Lin et al., Mol. Microbiol., 2003, 47, 849-860) et ses homologues comme le gène pvdQ chez Pseudomonas aeruginosa (Huang et al., Appl. Env. Microbiol., 2003, 69, 5941-5949).
Différentes stratégies ont été envisagées pour interrompre le signal NAHL: - inhibition de la synthèse des NAHL; le triclosan est un anti- biotique qui inhibe la synthèse des acides gras, eux mêmes nécessaires à la synthèse des NAHL (Hoang et al., J. Bacteriol., 1999, 191, 5489-5497). Toutefois cet antibiotique n'est pas spécifique des NAHL et entraîne des résistances.
- inhibition de la reconnaissance du signal NAHL par les récepteurs cellulaires bactériens; l'utilisation d'analogues des NAHL incluant notamment des furanones halogénées et des dérivés d'amides ou de 1,2acylhydrazine (Manefield et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66, 2079-2084; Demande Internationale PCT WO 03/039529 et Brevet américain US 6,455,031) a été proposée. Les furanones halogénées forment un complexe instable avec les facteurs de transcription de la famille LuxR et accélèrent la dégradation de ces protéines (Hentzer et al., EMBO, 2003, 22, 3803-3815). Toutefois, ces composés ne sont pas des inhibiteurs spécifiques du signal NAHL et ils sont inutilisables en médecine humaine et vétérinaire du fait de leur toxicité.
- dégradation enzymatique des NAHL par expression de lactonases et d'acylases exogènes; l'utilisation de vecteurs recombinants ou de bactéries expri- mant une lactonase exogène, ainsi que de plantes et d'animaux transgéniques dérivés a été proposée (Demandes internationales PCT WO 02/061099 et WO 02/16623; Dong 15 et al., Nature, 2001, 411, 813-817; Dong et al., PNAS, 2000, 97, 3526-3631; Leadbetter et al., J. Bacteriol., 2000, 182, 6921-6926; Uroz et al., Microbiol., 2003, 149, 1981-1989) ; des plantes transgéniques exprimant la lactonase exogène codée par le gène aiiA de Bacillus sp sont plus résistantes à l'infection par des bactéries patho- gènes productrices de NAHL que les plantes non modifiées. Toutefois, cette approche 20 est lourde à mettre en oeuvre étant donné qu'elle implique la construction de plantes ou d'animaux transgéniques ou l'inoculation de vecteurs recombinants exprimant une lactonase ou une acylase.
Les stratégies envisagées n'ont jusqu'à présent pas permis d'identifier de composés capables d'inactiver le signal NAHL, qui soient spécifiques, 25 non-toxiques et faciles à mettre en oeuvre.
En conséquence, les Inventeurs se sont donné pour but l'identification de tels composés.
La voie de dégradation de la y butyrolactone (GBL) implique trois enzymes: (i) la lactonase convertit la y butyrolactone (GBL) en y- hydroxybutyrate (GHB), (ii) la NAD-alcool déshydrogénase oxyde le GHB en succinate semialdéhyde (SSA) et (iii) la NAD-SSA déshydrogénase oxyde le SSA en acide succinique (SA), un composé du cycle de Krebs.
Alors que SA et SSA sont des intermédiaires de différentes voies métaboliques, communs aux eucaryotes et aux procaryotes, GHB et GBL sont rares dans la nature. GHB est décrit essentiellement comme un intermédiaire métabolique de GBL possédant des propriétés psychotropes (Mason et al., Acad. Emerg. Med., 2003, 9, 730-739). GBL est produit à des fins industrielles et est trouvé chez les plantes et dans les boissons fermentées comme le vin (Lee et al. J. Agri. Food. Chem., 2000, 48, 4290-4293; Vose et al., J. Forensic Sci., 2000, 46, 1164-1167).
La voie de dégradation de la y butyrolactone a été mise en évidence uniquement chez l'homme et le rat mais pas chez les bactéries (Mason et al., précité).
Le gène attM de A. tumefaciens appartient à l'opéron attKLM qui, à ce jour, est unique parmi les génomes bactériens séquencés; il code pour une lactonase qui ouvre le cycle y butyrolactone des NAHL et appartient à la famille des hydrolases à zinc (Zhang et al., précité ; Carlier A. et al., Appl. Env. Microbiol., 2003, 69, 4989-4993). La fonction des autres gènes de l'opéron attKLM n'a pas été identi- fiée. En outre, l'implication de l'opéron attKLM dans une voie métabolique n'est pas décrite.
Les Inventeurs ont montré que l'opéron attKLM est impliqué dans la voie de dégradation et d'assimilation de la 'y butyrolactone (GBL), du yhydroxybutyrate (GHB) et du succinate semialdéhyde (SSA). Cette voie d'assimilation est la suivante: (i) la lactonase codée par attM convertit la ybutyrolactone (GBL) en y-hydroxybutyrate (GHB), (ii) la NAD-alcool déshydrogénase codée par attL oxyde le GHB en succinate semialdéhyde (SSA) et (iii) la NADSSA déshydrogénase codée par attK oxyde le SSA en acide succinique (SA), un composé du cycle de Krebs.
Ils ont également montré que GBL, GHB et SSA sont des inducteurs de l'expression de l'opéron attKLM capables d'inactiver spécifiquement les signaux NAHL endogènes et exogènes chez Agrobacterium tumefaciens et dans une micro-flore complexe (consortium bactérien) ; ces inducteurs sont capables de stimuler l'expression d'une lactonase (endogène) chez ces bactéries et par voie de conséquence la dégradation enzymatique des NAHL endogènes et exogènes par lesdites bactéries.
Ainsi, les Inventeurs ont montré que les inducteurs de la voie de dégradation de la y-butyrolactone représentent de nouveaux composés antibactériens.
En outre, du fait de son implication dans la dégradation enzymatique des NAHL, la voie de dégradation de la y-butyrolactone représente une cible métabolique pour l'identification de nouveaux composés antibactériens, capables d'inactiver spécifiquement le signal NAHL chez les bactéries pathogènes utilisant ce signal.
Cette nouvelle approche pour interrompre le signal NAHL, qui repose sur la stimulation des capacités naturelles d'un organisme procaryote ou eucaryote, notamment d'une bactérie ou d'un mammifère humain ou nonhumain à dégrader les NAHL est dénommée metabolic quenching ; elle consiste à stimuler l'expression de lactonase(s) endogène(s) chez ledit organisme, par l'induction d'une voie métabolique, à l'aide de composés chimiques biodégradables.
En conséquence, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un inducteur de la voie de dégradation de la y-butyrolactone comme antibactérien.
Au sens de la présente invention, on entend par un inducteur de la voie de dégradation de la y-butyrolactone, un composé capable d'activer la voie méta- bolique telle que définie ci-dessus, chez un organisme procaryote ou eucaryote, notamment une bactérie ou un mammifère humain ou non-humain.
L'induction de la voie de dégradation de la y-butyrolactone chez ledit organisme est mesurée, soit directement par mesure des activités lactonase (GBL comme substrat), NAD alcool déshydrogénase (GHB comme substrat), et NAD-SSA déhydrogénase (SSA comme substrat) ou par mesure de l'activité d'un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur d'un gène codant pour une enzyme de la voie de dégradation de la y- butyrolactone telle que définie ci-dessus (lactonase, NAD alcool déshydrogénase, NAD-SSA déhydrogénase), soit indirectement par mesure comparative de la quantité de NAHL dégradée en présence ou en l'absence d'inducteur. Les méthodes de mesure de l'activité d'un gène rapporteur et de la quantité de NAHL dégradée sont des méthodes classiques connues de l'Homme du métier.
L'invention englobe l'utilisation de composés chimiques naturels ou synthétiques, produits par synthèse chimique ou par un procédé microbiologique, notamment à l'aide d'un microorganisme modifié, notamment par l'introduction d'un vecteur recombinant approprié, lesquels composés présentent les propriétés telles que définies ci-dessus.
Selon une disposition avantageuse de l'utilisation selon l'invention, ledit inducteur est choisi parmi les composés répondant à la formule (1) : R2 C3 HO/ C2 R3
R
dans laquelle R1, R2 et R3 représentent chacun un hydrogène, un groupement hydroxyle, amine ou carbonyle, ou bien un groupement alkyle, acyle ou hydroxyalkyle en C1-C4; étant entendu que lorsque R3 est un groupement hydroxyle, il peut réagir avec le groupement hydroxyle porté par le carbone en position 1 (C1) pour former un ester cyclique (lactone), ainsi que leurs sels dérivés.
De préférence, ledit inducteur est choisi parmi: la y-butyrolactone, le yhydroxybutyrate, le succinate semialdéhyde, l'acide 4-aminobutyrique, l'acide 3-aminobutyrique, l'acide 2-aminobutyrique, l'acide 2hydroxybutyrique, l'acide 3-hydroxybutyrique et l'acide butyrique.
Conformément à l'invention, lesdits sels dérivés sont notamment des 15 sels de sodium, de potassium, de phosphate, de carbonate; de préférence il s'agit d'un sel physiologiquement ou pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit inducteur est utilisé pour la préparation d'un médicament pour la prévention et le traitement d'infections par des microorganismes pathogènes producteurs de N-acyl homosérine lactone, chez l'homme et les animaux.
Conformément à l'invention, le médicament tel que défini ci-dessus est capable de stimuler l'expression de lactonase(s) endogène(s) chez un individu (homme ou animal) ou bien chez les bactéries de la flore dudit individu, et donc d'induire la dégradation enzymatique des N-acyl homosérine lactones produites par des bactéries qui sont pathogènes pour cet individu.
Selon ce mode de réalisation avantageux, les composés de formule (I) et leurs sels sont utilisés par voie entérale (orale, sublinguale), parentérale ou (I) locale. Ils peuvent se présenter sous la forme de comprimés, simples ou dragéifiés, de gélules, de granules, de sirop, de suppositoires, de préparations injectables, de pommades, de crèmes, de gels, d'aérosol, lesquels sont préparés selon les méthodes usuelles.
Dans ces formes galéniques, les composés de formule (I) sont associés à des excipients habituellement employés dans des compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, disper- sants ou émulsifiants, les conservateurs.
La posologie utile varie en fonction de l'affection à traiter, de la voie et du rythme d'administration, ainsi que de la nature et du poids de l'espèce à traiter (humaine ou animale).
Parmi les microorganismes pathogènes producteurs de N-acyl homosérine lactone, qui sont responsables d'infections chez l'homme, on peut citer, de façon non-limitative: Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Aeromonas aerophila, Chromobacterium violaceum, Yersininia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis et Serratia liquefaciens.
Parmi les microorganismes pathogènes producteurs de N-acyl homosérine lactone, qui sont responsables d'infections chez les animaux, on peut citer, de façon non-limitative: des pathogènes de mammifères et d'oiseaux tels que Serratia liquefaciens et des pathogènes de poisson et de crustacés tels qu'Aeromonas aerophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum, et Vibrio harveyi, Yersinia ruckeri.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit médicament comprend du succinate semialdéhyde.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit inducteur est destiné à un usage phytosanitaire, pour la prévention et/ou le traitement d'infections par des microorganismes pathogènes producteurs de N-acyl homosérine lactone, chez les plantes.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit inducteur est destiné à un usage agroalimentaire, pour la conservation des produits frais, notamment des fruits et de légumes.
Conformément à l'invention, ledit inducteur tel que défini ci-dessus est capable de stimuler l'expression de lactonase(s) endogène(s) chez les bactéries (pathogènes ou non-pathogènes) présentes dans l'environnement, soit des cultures, notamment dans le sol, soit des récoltes lors du stockage. Ces lactonases sont capables de dégrader les N-acyl homosérine lactones produites par des bactéries pathogènes pour les cultures végétales ou pouvant endommager les récoltes. Ainsi, ledit inducteur est utilisé pour la protection des cultures végétales au champ, ou en milieu confiné, telles que les serres ou les bacs ou bien des récoltes lors du stockage.
Avantageusement, lorsque ledit inducteur est utilisé pour la protection des cultures végétales au champ, ou en milieu confiné, telles que les serres ou les bacs, il est utilisé sous forme d'une composition mixte comprenant des éléments nutritifs pour les cultures végétales telles que définies ci-dessus, notamment pour les cultures de pomme de terre ou de riz en serre ou en bac.
Parmi les microorganismes pathogènes producteurs de N-acyl homosérine lactone, qui sont responsables d'infections chez les plantes on peut citer de façon non-limitative: Erwinia sp, notamment, Erwinia carotovora et Erwinia chrysantemi, Burkholderia sp., notamment Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Burkholderia plantarii, Agrobacterium tumefaciens, Pantoea stewartii et Ralstonia solanacearum.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit inducteur est utilisé pour désinfecter l'environnement ou le matériel.
Ledit produit antibactérien est utilisé, de façon non-limitative, pour désinfecter: le sol, l'eau, ou bien du matériel à usage médical ou chirurgical, industriel ou domestique.
Conformément à l'invention, ledit inducteur tel que défini ci-dessus est capable de stimuler l'expression de lactonase(s) endogène(s) chez les bactéries associées à des surfaces sous forme de biofilms, et donc d'induire la dégradation des N-acyl homosérine lactones produites par des bactéries pathogènes utilisant ce signal.
La présente invention a également pour objet un inducteur de la voie de dégradation de la y-butyrolactone tel que défini ci-dessus comme médicament.
La formulation et la posologie dudit médicament sont telles que définies ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un procédé de sélectionlcriblage de composés antibactériens, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes: a) la mise en contact d'un organisme ou de cellules dérivées dudit organisme avec un composé à tester, b) la mesure par tout moyen approprié de l'induction de la voie de dégradation de la y-butyrolactone chez ledit organisme ou lesdites cellules, et c) la sélection des composés capables d'induire la voie de dégradation de la y-butyrolactone chez ledit organisme ou lesdites cellules.
Conformément à l'invention: - ledit organisme est un organisme procaryote tel qu'une bactérie ou eucaryote tel qu'un mammifère non-humain et lesdites cellules sont des cellules primaires ou des lignées cellulaires.
- lorsqu'il s'agit d'un mammifère non-humain, ledit composé est administré par voie orale, locale ou parentérale.
- l'induction de la voie de dégradation de la y-butyrolactone chez ledit organisme ou lesdites cellules est mesurée, soit directement par mesure des activités lactonase (GBL comme substrat), NAD alcool déshydrogénase (GHB comme substrat), et NAD-SSA déhydrogénase (SSA comme substrat) ou par mesure de l'activité d'un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur d'un gène codant pour une enzyme de la voie de dégradation de la y-butyrolactone telle que définie ci-dessus (lactonase, NAD alcool déshydrogénase, NAD-SSA déhydrogénase), soit indirectement par mesure comparative de la quantité de NAHL dégradée en présence ou en l'absence d'inducteur. Les méthodes de mesure de l'activité d'un gène rapporteur et de la quantité de NAHL dégradée sont les méthodes classiques connues de l'Homme du métier.
La présente invention a également pour objet un composé antibactérien, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé de sélection/criblage tel que défini ci-dessus.
Les composés tels que définis dans la présente invention, notamment le succinate semialdéhyde présentent les avantages suivants par rapport aux inactivateurs du signal NAHL de l'art antérieur: ils sont peu coûteux et biodégradables; l'utilisation de ces composés ne nécessite ni la construction de plantes transgéniques, ni l'inoculation de bactéries génétiquement modifiées, ni l'utilisation d'antibiotiques.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples démontrant la capacité des inducteurs de la voie de dégradation de la ybutyrolactone à inactiver le signal NAHL endogène et exogène chez les bactéries, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels: la figure 1 est une représentation schématique de la région attJKLM de A. tumefaciens, ainsi que des différentes constructions bactériennes et plasmidiques dérivées de cette région, utilisées dans cette étude. Les lignes doubles représentent l'ADN du vecteur de clonage, les lignes simples et les boites ouvertes représentent l'ADN du plasmide pAt de la souche C58 d'A. tumefaciens.
- la figure 2 illustre la structure des composés utilisés dans cette 20 étude.
- la figure 3 illustre l'expression d'attL et d'attM chez E. coli.
- la figure 4 illustre la croissance de A. tumefaciens en présence de GBL, GHB, SA et SSA. A.: Courbes de croissance en milieu AB-GBL, de: A. tumefaciens C58 (carrés pleins), A. tumefaciens C101 (carrés vides), et A. tumefaciens C58 contenant les plasmides p6000 (triangles pleins) ou pMIR113 (triangles vides).
B: Courbes de croissance de A. tumefaciens C58 (carrés pleins) et A. tumefaciens C101 (carrés vides) en milieu AB-GHB, AB-SSA et AB-SA. Les expériences sont réalisées en triplicat, les déviations standard étant inférieures à la taille des symboles utilisés.
- la figure 5 illustre l'expression des fusions transcriptionnelles attJ::lacZ et attK::lacZ chez A. tumefaciens C58. L'activité Ç3galactosidase des bactéries mesurée à partir de quatre cultures indépendantes, est exprimée en unités de Miller. Avant les mesures d'activité (3-galactosidase, les cellules sont incubées avec des concentrations croissantes des facteurs suivants: (A) mannitol (carrés vides), GBL (carrés noirs) ; (B) mannitol (carrés vides), GHB (carrés noirs), SSA (canés gris).
- la figure 6 illustre l'accumulation de NAHL en l'absence d'inducteurs de attKLM. Les souches de A. tumefaciens sont cultivées en milieu ABmannitol. A: la concentration en oxo-C8HSL dans le milieu de culture est comparée à deux temps (GP1 et GP2) durant la croissance de A. tumefaciens C58 (carrés pleins) et C101 (carrés vides). B: l'expression de la fusion attK::lacZ est mesurée chez A. tumefaciens C58, en présence de concentrations croissantes de C6HSL (carrés vides) et de oxo-C8HSL (carrés pleins). C: l'expression des fusions transcriptionnelles attJ::lacZ, attK::lacZ et de la fusion constitutive Pk::lacZ est mesurée durant les phases de croissance exponentielle (barres vides) et stationnaire (barres grises). Les mesures d'activité (3-galactosidase sont réalisées dans quatre cultures indépendantes et exprimées en unités de Miller.
- la figure 7 illustre l'inactivation du signal NAHL en présence des inducteurs de attKLM. Les quantités résiduelles de C6HSL (A, C, D et F) et oxo-C8HSL (graphiques B et E) présentes dans les cultures inoculées avec A. tumefaciens sont mesurées et exprimées en pourcentage par rapport aux quantités correspondantes de C6HSL et C8HSL présentes dans un milieu contrôle non inoculé (quantité de C6HSL et C8HSL = 100). Avant leur inoculation dans un milieu contenant des NAHL, les cellules de A. tumefaciens C58 (symboles vides) et C101 (symboles pleins) sont induites par l'un des facteurs suivants: (A, B, D et E) mannitol (cané), GBL (triangle) ; (C et F), SA (carré), SSA (triangle) et GHB (losange). Les expériences sont réalisées en triplicat. . - la figure 8 illustre l'inactivation du signal NAHL par une microflore complexe activée. Après enrichissement en milieu GBL (carré vide), GHB (triangle vide), SSA (losange vide), SA (carré plein), la capacité de la microflore télurique (A: 109 UFC/ml et B: 108 UFC/ml) a dégrader le C6HSL (25 M) est testée. La quantité résiduelle de C6HSL est exprimée en pourcentage, par rapport à la quantité de C6HSL 30 présente dans une microflore contrôle activée par du mannitol (quantité de C6HSL = 100). Les résultats correspondent à quatre mesures effectuées dans quatre expériences indépendantes.
Exemple 1: Souches et plasmides utilisés pour l'étude de l'opéron att%LM Dans les exemples, les souches bactériennes et les plasmides suivants ont été utilisés dans les conditions telles que décrites ci-après.
1) Souches bactériennes Les exemples mettent en oeuvre la souche C58 de A. tumefaciens ainsi que ses dérivés C58.C1, C58.C2 et C58.00, déficientes pour les plasmides respectivement, pTi (C58.C1), pAt (C58.C2), et pTi et pAt (C58.00), (Vaudequin-Dransart V. et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 1998, 11, 583-591).
Le mutant AtJKLM::aph de A. tumefaciens, dénommé C101 (figure 1) dérive de la souche C58 par une procédé standard de remplacement de gène par l'introduction d'un plasmide suicide, par électroporation (Ugalde JE. et al., J. Bacteriol., 1998, 180, 6557-6564). De manière plus précise, le gène aph isolé à partir du plasmide p34S-Km (Dennis J. et Zylstra JC., Appl. Env. Microbiol., 1998, 64, 2710-2715), a été utilisé pour remplacer la région attJKLM (gi:17938588) entre les nucléotides 143 303 et 146, en référence à la séquence du plasmide pAtC58 (Wood DW. et al. , Science, 2001, 294, 2317-2323).
Les souches NTLR4 d'A. tumefaciens (Cha C. et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 1998, 11, 1119-1129) et CV026 de Chromobacterium violaceum (McClean KH. et al., Microbiol., 1997, 143, 3703-3711) sont utilisées en tant que capteur d'AHSL, respectivement pour oxo-C8HSL et C6HSL.
2) Conditions de culture La souche DH5a d'E. coli est l'hôte de routine pour les expériences de clonage et d'expression de gène. La souche DH5a est cultivée à 37 C dans du milieu riche (milieu LB) et dans du milieu minimum (milieu M9), (Sambroock J. et al., Molecular cloning: a laboratory manual 1989, 2nd Ed. Vol. 3), supplémenté avec du NAD (0,66g/1) , du y-aminobutyrate (lg/l) comme source d'azote (Schneider BL. et al., J. Bacteriol., 2002, 184, 6976-6986), et une source de carbone appropriée (2g/1). Les souches de A. tumefaciens sont cultivées à 30 C dans du milieu riche (milieu TY) et du milieu minimum (milieu AB), (Chilton MD. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 3672-3676), supplémenté avec NH4CI (lg/l) et une des sources de carbone suivantes (2g/l) : mannitol, y butyrolactone (GBL), y- valerolactone (GVL), homosérine lactone (HSL), y-hydroxybutyrate (GHB), succinate semialdéhyde (SSA) et acide succinique (SA). Le mannitol est par ailleurs utilisé comme source de carbone pour toutes les précultures d'Agrobacterium. Les courbes de croissance de A. tumefaciens et E. coli sont établies par mesure de la densité optique (DO) à 600 nm. Enfin, les antibiotiques sont utilisés aux concentrations suivantes: ampicilline (50mg/l), kanamycine (50mg/1) et tétracycline (10mg/1).
3) Plasmides Les schémas des plasmides utilisés sont présentés à la figure 1.
Le plasmide pMIR102 qui exprime constitutivement la lactonase codée par legène attM est décrit dans Carlier A. et al., Appl. Env. Microbiol., 2003, 69, 4989-4993.
Le plasmide pMIR117 a été construit par clonage dans le vecteur pGEM -T (Promega, Madison, USA), d'un fragment d'amplification du gène attL, obtenu à l'aide des amorces (5'-3'), SEQ ID N 1: ATACCTGTGCTCGGCCATC et SEQ ID N 2: TGCTGTCAGAAATGGGTCAG.
Le plasmide pMIR113 a été construit par clonage entre les sites BamHI et Pstldu plasmide pME6000 (Maurhofer M. et al., Phytopathol., 1998, 88, 678684), d'un fragment d'amplification chevauchant le gène attJ, obtenu à l'aide des amorces 5'-3', SEQ ID N 3: CAAACCATCGACGCAATATG et SEQ ID N 4: GCGGGATCCCTGGGGTATTGG.
Les plasmides pMIR121 et pMIR122 contenant respectivement les fusions transcriptionnelles attJ:lacZ et attK:lacZ, ont été obtenus de la façon suivante: les promoteurs divergents attJ et attKLM ont été amplifiés en un simple fragment, à l'aide des amorces 5'-3', SEQ ID Na 5: TCAGCCATGCACTATCCTTGA et SEQ ID N 6: GTCTAGCCATCCGCGGCTT, fusionnés avec la cassette lacZ-aph dépourvue de promoteur du plasmide pKOK5 (Kokotek W. et Lotz W., Gene, 1989, 84, 467-471), et les fragment Sphl-Sad ont été sous-clonés dans le vecteur pME6031 (Heeb S. et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 2000, 13, 232-237).
Le plasmide pMIR123 exprimant constitutivement le gène lacZ a été 30 obtenu par clonage de la cassette lacZ-aph devant le promoteur Pk du vecteur p6010 (Heeb S. et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 2000, 13, 232-237).
Exemple 2: Les gènes attM et attL codent pour des protéines impliquées dans l'assimilation de la y-butyrolactone.
L'analyse des séquences en acides aminés des produits des gènes attK et attL montre une forte identité entre AttK et plusieurs NAD-succinate semialdéhyde déshydrogénase (71% avec la NAD-dépendante déshydrogénase de COG1012) et entre AttL et plusieurs NAD-alcool déshydrogénases (49% avec l'alcool déhydrogénase IV de COG1454) ; la famille COG a été définie par Tatusov et al., NAR, 2001, 29, 22-28. Cette analyse indique que les trois enzymes codées par cet opéron pourraient participer à la voie de dégradation de la GBL.
L'implication de AttL et AttM dans les deux premières étapes enzymatiques de la voie de dégradation de la GBL, a été vérifiée expérimentalement chez E. coli qui assimile naturellement SA et SSA.
La figure 3 montre que l'expression de attL est suffisante pour convertir E. coli en bactérie qui assimile efficacement GHB, mais que attL et attM sont simultanément nécessaires pour la croissance d'E. coli en présence de GBL.
Ces résultats indiquent que les trois enzymes codées par cet opéron participent à la voie de dégradation de GBL: (i) la lactonase codée par attM convertie GBL en GHB, (ii) la NAD-alcool déshydrogénase codée par attL oxyde GHB en SAA et (iii) la NAD-SSA déshydrogénase codée par attK oxyde vraisemblablement SSA en SA, un composé du cycle de Krebs.
Exemple 3: La croissance d'A. tumefaciens en présence de GBL est dépendante de l'opéron attKLM; GBL, GHB et SSA stimulent la transcription de attKLM. 1) La croissance d'A. tumefaciens en présence de GBL est dépendante de l'opéron attKLM L'implication de l'opéron attKLM dans la voie d'assimilation de GBL a été vérifiée expérimentalement par l'analyse de la croissance de la souche C58 et des mutants dérivés, en milieu minimum (AB) supplémenté en GBL, GHB, SSA ou SA comme source de carbone (figure 4).
- çroissançe en milieu_GBL (figure 4A) La souche C58 d'A tumefaciens, bien qu'elle n'assimile pas un large spectre de lactones, car ni GVL, ni HSL ni C6HSL ne peuvent être utilisés comme source de carbone, est cependant capable de croître en présence de GBL comme 30 source de carbone. En revanche son dérivé C101 (AattJKLM::aph) qui ne possède pas l'opéron attKLM en est incapable.
Ce dernier phénotype est aussi observé lorsque des copies additionnelles du gène attJ codant pour des répresseurs transcriptionnels de attKLM sont 5 introduites dans A. tumefaciens C58.
L'implication de ces gènes codés par le plasmide pAt dans l'assimilation de la GBL est en accord avec les phénotypes des souches C58.C2, C58.00 et C58.Cl; les souches C58.C2 et C58.00 qui sont dépourvues de pAt ne peuvent pas croître en milieu AB-GBL, alors que la souche C58.Cl dans laquelle on a enlevé le plasmide pTi mais qui garde pAt, croît en milieu AB-GBL.
- croissance en milieu GHB,_SSA3 SA (figure 4B) Le mutant C101 est aussi affecté dans l'assimilation de GHB et SSA, alors qu'aucune différence n'est observée entre C58 et C101 durant leur croissance en milieu AB- SA.
2) GBL, GHB et SSA stimulent la transcription de attKLM L'effet de GBL, GHB et SSA sur la transcription de l'opéron attKLM a été analysée par mesure de l'activité 13-galactosidase chez A. tumefaciens C58 transformé par électroporation, soit par le plasmide pMIR122 portant la fusion transcriptionnelle attK::lacZ, soit par le plasmide pMIR121 portant la fusion transcriptionnelle attJ::lacZ, utilisé en comparaison.
L'activité de la (3-galactosidase est mesurée en utilisant l'onitrophenyl 13 D galactopyranoside comme substrat et exprimée en unités de Miller (Sambrook J. et al., Molecular cloning: a laboratory manual 1989, 2"d Ed. Vol. 3). Quatre cultures indépendantes sont réalisées pour chaque condition expérimentale.
Dans les expériences d'induction, les cellules contenant les fusions transcriptionnelles sont cultivées dans du milieu AB-mannitol, puis 360 l de ces cellules sont mélangés avec 40 l de solution d'inducteur à tester et incubées pendant 2 heures à 24 C jusqu'à ce que la mesure de l'activité 13-galactosidase soit effectuée.
L'addition de GBL à la culture de bactéries augmente fortement l'expression de la fusion attK::lacZ alors qu'une addition équivalente de mannitol n'a pas d'effet (figure 5). L'expression de la fusion attJ::lacZ est légèrement augmentée par l'addition de GBL (figure 5), indiquant que des facteurs cellulaires additionnels ou des modifications posttranscriptionnelles du facteur AttJ, comme des changements conformationnels en présence de GBL, pourraient participer à la régulation de l'opéron attKLM.
Les autres lactones, telles que GVL et HSL n'induisent pas l'expression de l'opéron attKLM alors que les deux intermédiaires métaboliques de la voie d'assimilation de GBL, GHB et SSA sont efficaces comme inducteurs (figure 5). Exemple 4: Interférence entre l'expression de attKLM et les signaux AHSL 1) Quantification des NAHL Les oxo-C8HSL produites par A. tumefaciens sont extraites avec de l'acétate d'éthyle, à partir d'un échantillon de 8 ml de surnageant de culture de Agrobacterium, et concentrées 100 fois avant quantification. Les essais de disparition des NAHL sont réalisé chez E. coli après addition dans le milieu de C6HSL à 25 gM comme décrit par Carlier et al. Appl. Env. Microbiol., 2003, 69, 4989-4993, et dans A. tumefaciens après addition de C6HSL à 25 gM et oxo-C8HSL à 10 gM. Dans cette expérience, les cultures de A. tumefaciens en phase stationnaire sont centrifugées et le culot est remis en suspension à une densité cellulaire de 5.107 UFC/ml dans du milieu AB frais supplémenté en mannitol, GBL, GHB, SSA ou SA comme source de carbone. Après 15 heures d'incubation sous agitation, les cellules induites sont lavées avec du NaCl 0,8% et inoculées à 109 UFC/ml dans du milieu AB frais, supplémenté avec du mannitol (0.2g/l) et NH4C1 (0,1g/1) et avec, soit C6HSL (25 gM), soit oxo-C8HSL (10 gM).
La quantité de NAHL résiduelles dans le milieu de culture est testée par chromatographie liquide inverse sur couche mince (TLC; plaques KC 18, Whatman) ; les échantillons sont séparés dans un système de solvant méthanol:eau (60:40), en comparaison avec une gamme de produits de référence appropriés, de concentration connue, telle que décrite dans Cha C. et al., Mol. Plant-Microbe lnteract., 1998, 11, 1119-1129 et McClean KH. et al., Microbiol., 1997, 143, 3703-3711.
2) Résultats Lorsque l'opéron attKLM n'est pas induit, par exemple en présence de mannitol comme source de carbone, A. tumefaciens C58 et son mutant C101 accumulent la même quantité d'oxo-C8HSL dans leur milieu de croissance (figure 6A). Dans les mêmes conditions, l'expression des fusions transcriptionnelles attJ:É:lacZ et attK::lacZ est à peine affectée par l'addition de C6HSL et oxo-C8HSL et ne varie pas en fonction du stade de croissance (figures 6B et 6C).
Ces résultats indiquent qu'en l'absence d'inducteur de attKLM, 5 l'opéron attKLM n'affecte pas le taux de NAHL chez A. tumefaciens.
En revanche, lorsque A. tumefaciens croît en milieu AB-GBL, il n'accumule pas l'oxo-C8HSL dans le milieu de culture et devient capable d'inactiver les signaux C6HSL et oxo-C8HSL endogènes et exogènes étant donné que l'expression de la lactonase AttM est induite (figures 7A et 7B). Le large spectre de NAHL qui peut-être clivé par la lactonase indique que dans des conditions dans lesquelles l'opéron attKLM est induit, A tumefaciens est capable d'interrompre n'importe quel signal NAHL; il devient donc une bactérie dégradant efficacement les NAHL.
L'inactivation du signal NAHL est aussi observée lorsque A. tumefaciens est induit par GHB et SAA, alors que SA n'a pas d'effet (figure 7C).
Dans des expériences similaires (figures 7D à 7F), le mutant C101 est insensible à l'addition d'inducteurs, confirmant le lien génétique entre la disparition des NAHL dans le milieu de culture de A. tumefaciens C58 et l'expression de la voie de dégradation de GBL.
Exemple 5: Les inducteurs d'attKLM stimulent la capacité d'une flore complexe à inactiver les NAHL Des échantillons de la microflore télurique sont enrichis de la manière suivante: les suspensions bactériennes obtenues à partir de sol tempéré (Gif-sur-Yvette, France) sont inoculées à raison de 103 UFC/mI (densité finale) dans un milieu AB supplémenté avec des extraits de levure (0,2g/1), de l'actidione (100mg/1) et GBL, GHB, SSA, SA ou du mannitol comme source de carbone. Après 3 jours de phase d'enrichissement à 25 C, les bactéries sont lavées avec une solution de NaCl (0,8%) et leur capacité à inactiver les NAHL est testée dans un tampon KH2PO4/K2HPO4 (15mM, pH 6,5) supplémenté avec C6HSL (25 M) et des extraits de levure (0,2g/1), en suivant le protocole tel que décrit à l'exemple 4.
L'interférence entre la voie d'assimilation de GBL et l'inactivation des NAHL est testée dans une microflore complexe (consortium bactérien). Les populations du sol qui sont activées par les inducteurs de attKLM interrompent le signal C6HSL plus rapidement que les populations activées par de l'acide succinique (figure 8) ou du mannitol. En outre, l'analyse morphologique de la population testée a permis de vérifier que l'étape de culture de l'échantillon de bactéries téluriques en présence de GHB, GBL et SSA n'enrichissait pas la population en A. tumefaciens Ces résultats indiquent que les inducteurs d'attKLM sont donc capables de stimuler la capacité d'une microflore complexe à inactiver les NAHL.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims (11)

REVENDICATIONS
1 ) Utilisation d'un inducteur de la voie de dégradation de la ybutyrolactone comme antibactérien.
2 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit 5 inducteur est choisi parmi les composés répondant à la formule (I) : Ri 2 HO/ C] / -R3 dans laquelle R1, R2 et R3 représentent chacun un hydrogène, un groupement hydroxyle, amine ou carbonyle, ou bien un groupement alkyle, acyle ou hydroxyalkyle en C1-C4; étant entendu que lorsque R3 est un groupement hydroxyle, il peut réagir avec le groupement hydroxyle porté par le carbone en position 1 (C1), pour former un ester cyclique (lactone) , ainsi que leurs sels dérivés.
3 ) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit inducteur est choisi parmi: la y-butyrolactone, le y-hydroxybutyrate, le succinate semialdéhyde, l'acide 4-aminobutyrique, l'acide 3aminobutyrique, l'acide 2-aminobutyrique, l'acide 2-hydroxybutyrique, l'acide 3-hydroxybutyrique et l'acide butyrique.
4 ) Utilisation d'un inducteur de la voie de dégradation de la ybutyrolactone selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la préparation d'un médicament pour la prévention et le traitement d'infections par des microorganismes pathogènes producteurs de N-acyl homosérine lactone, chez l'homme et les animaux.
5 ) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit médicament comprend du succinate semialdéhyde.
6 ) Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit inducteur est destiné à un usage phytosanitaire, pour la (I) prévention et/ou le traitement d'infections par des microorganismes pathogènes producteurs de N-acyl homosérine lactone, chez les plantes.
7 ) Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit inducteur est destiné à un usage agroalimentaire, pour la 5 conservation des produits frais, notamment des fruits et de légumes.
8 ) Utilisation d'un inducteur de la voie de dégradation de la ybutyrolactone, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour désinfecter l'environnement ou le matériel.
9 ) Inducteur de la voie de dégradation de la y-butyrolactone tel que 10 défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3 comme médicament.
10 ) Procédé de sélection/criblage de composés antibactériens, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes: a) la mise en contact d'un organisme ou de cellules dérivées dudit organisme avec un composé à tester, b) la mesure par tout moyen approprié de l'induction de la voie de dégradation de la y-butyrolactone chez ledit organisme ou lesdites cellules, et c) la sélection des composés capables d'induire la voie de dégradation de la y-butyrolactone chez ledit organisme ou lesdites cellules.
11 ) Composé antibactérien, caractérisé en ce qu'il est susceptible 20 d'être obtenu par le procédé de criblage selon la revendication 10.
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