ES2388273B1 - Uso de inhibidores de receptores de s1p para el tratamiento de la estenosis aórtica calcificada - Google Patents

Abstract

Uso de inhibidores de receptores de S1P para el tratamiento de la estenosis aórtica calcificada.#La presente invención se refiere al uso de al menos un inhibidor de los receptores de esfingosina-1-fosfato (S1P), preferiblemente de los receptores S1P{sub,1}, S1P{sub,3}, S1P{sub,4} o S1P{sub,2}, para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la estenosis aórtica calcificada. Más preferiblemente el inhibidor es un antagonista o un ARN de interferencia.

Description

Uso de inhibidores de receptores de S1 P para el tratamiento de la

estenosis aórtica calcificada

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, se refiere al uso de al menos un inhibidor de los receptores de esfingosina-1-fosfato (S1 P), preferiblemente de los receptores S1 P" S1 P2, S1 P" o S1 P4, para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la estenosis aórtica calcificada.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La estenosis aórtica degenerativa calcificada es la enfermedad valvular más frecuente en los países desarrollados, está asociada a una elevada morbimortalidad y se espera que su incidencia aumente dado el progresivo envejecimiento de la población.

La estenosis aórtica calcificada es una enfermedad degenerativa caracterizada por fibrosis y calcificación de la válvula aórtica que puede impedir el desarrollo normal de la vida del paciente; es la valvulopatía más frecuente en los países desarrollados y su prevalencia aumenta con la edad (Blase A, el al. 2009, Lancet, 373: 956-66; Yetkin E, el al. 2009, Int J Cardiol, 135: 4-13; O'Brien KD. 2006, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 26: 1721-1728; Newby DE, el al. 2006, Hearl, 92: 729-734). Esta enfermedad evoluciona lentamente, aunque cuando los síntomas aparecen, la progresión es rápida y si no hay sustitución valvular antes de 3 años la tasa de mortalidad supera el 50%. Se conocen varios aspectos de su patogenia y se han descrito varias moléculas pro-inflamatorias y pro-osteogénicas con papel relevante en la enfermedad, aunque aún no se ha encontrado la diana farmacológica de aplicación en la clínica. Se ha descrito la contribución de procesos de inflamación crónica y de calcificación tanto en el inicio como en la progresión de la enfermedad. En lesiones valvulares se ha detectado la infiltración de células inflamatorias, depósitos de lípidos oxidados, y la expresión de citocinas y metaloproteinasas. Las válvulas cardiacas constan de una matriz extracelular y el contenido celular lo forman células endoteliales y células intersticiales, estas últimas con capacidad de diferenciarse a

osteoblastos in vitro bajo la influencia de diferentes mediadores, y se piensa

que son las candidatas a promover la calcificación característica de la

enfermedad (Osman L, et al. 2006, Circu/atian, 114[suppl 1]: 1-547-1-552). La

patogenia de la estenosis aórtica calcificada presenta similitudes

etiopatogénicas con el proceso aterosclerótico (Yetkin E, et al. 2009, Int J Cardiol, 135: 4-13; O'Brien KD. 2006, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 26: 17211728). En un estudio multiétnico de aterosclerosis se ha asociado a sICAM-1, que es la forma soluble de la molécula de adhesión ICAM-1, con un aumento

de la prevalencia y la severidad de la calcificación de la válvula aórtica

(Shavelle et al. 2008, J Heart Valve Ois, 17: 388-395), que es una caracteristica de la estenosis aórtica calcificada (Yetkin E, et al. 2009, Int J Cardiol, 135: 4-13; O'Brien KD. 2006, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 26: 1721-1728).

En la actualidad el único tratamiento efectivo de la enfermedad es el reemplazamiento quirúrgico de la válvula aórtica. Se han desarrollado terapias experimentales inicialmente prometedoras, como el uso de los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina o el tratamiento con estatinas que inhiben la HMCoA reductasa y reducen los niveles de colesterol. Sin embargo estas estatinas, a pesar del potencial terapéutico mostrado en modelos animales y en

un estudio preliminar en pacientes (Yetkin E, et al. 2009, Int J Cardiol, 135: 413, Maura et al. 2007, Am CoII Cardiol, 49: 554-561), mostraron escasa eficacia en dos ensayos clínicos de doble ciego en pacientes (Cowell SJ, el al. 2005, N Engl J Med, 352: 2389-2397; Rossebo AB, et al. 2008, N Engl J Med, 359: 1343-1356).

Por otra parte, se sabe que la esfingosina 1-fosfato (S1 P) es un mediador

lipídico inflamatorio con potentes efectos en migración y proliferación celular

que juega un papel importante en la regulación de los sistemas cardiovascular

e inmune y en la patogenia de enfermedades como la aterosclerosis (Means y

Brown, 2009, Cardiovasc Res, 82: 193-200; Fyrst H, et al. 2010, Nat Chem Biol.

6: 489-497). Las funciones de S1 P varían según el tipo celular y el subtipo de receptor expresado, y se sabe que en el corazón juega un papel en la supervivencia celular y es cardioprotector en modelos experimentales de isquemia/reperfusión (Means y Brown, 2009, Cardiovasc Res, 82: 193-200;

Alewijnse el al., 2008. Eur J Pharmacol., 585: 292-302). La Sl P se une a

receptores de membrana denominados receptores de S 1 P, o EDG según la

antigua nomenclatura; en mamíferos se han descrito cinco receptores Sl P/EDG: Sl P,/EDG1 , Sl P,/EDG5, Sl P,JEDG3, Sl P,/EDG6, Sl Ps/EDG8

5 (Rivera J, el al. 2008, Nal Rev Immunol, 8: 753-763; ehun J, el al. 2010, Pharmacol Rev , 62: 579-587). Estos receptores no han sido relacionados con la prevención y/o tratamiento de la estenosis aórtica calcificada.

Por tanto, en la actualidad no existe ningún fármaco para la prevención y/o el

10 tratamiento efectivo de la estenosis aórtica calcificada. Como consecuencia, es necesaria la búsqueda de nuevos blancos farmacológicos con relevancia clínica que puedan usarse tanto para el tratamiento como para la prevención de la estenosis aórtica calcificada.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN La presente invención se refiere al uso de inhibidores de receptores de Sl P,

preferiblemente un antagonista o un siRNA de dichos receptores para la

20 elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la estenosis aórtica calcificada. Preferiblemente los receptores son Sl P1, Sl P2, 81 P" o 81 p,.

Ante la falta de estrategias terapéuticas efectivas para el tratamiento

25 farmacológico de la estenosis aórtica degenerativa calcificada, la presente invención proporciona una solución al problema de prevención y/o tratamiento de esta enfermedad mediante el uso de inhibidores de los receptores de 81 P, preferiblemente de los receptores Sl P" 81 P" 81 P" o 81 P,). Los resultados

proporcionan una nueva diana terapéutica que puede ser usada para prevenir 30 y/o reducir tanto la inflamación crónica como la calcificación asociadas a la estenosis aórtica calcificada.

La presente invención presenta las siguientes ventajas respecto del estado de

la técnica:

,

-En la presente invención se ha demostrado que hay un efecto sinérgico en la

activación de los receptores 31 P" 31 P2, 31 P3, o 31 P, conjuntamente con el receptor de la inmunidad innata tipo T 011 (TLR)-4, resultando en un aumento

5 exponencial de ciclooxigenasa (COX)-2, reconocido marcador anti-inflamatorio,

en células intersticiales de válvulas cardiacas. El bloqueo de esta sinergia, disminuye la inflamación mediada por COX-2, y podría bloquear la inflamación

asociada a la estenosis aórtica calcificada.

10 -Además en la presente invención se demuestra un efecto aditivo de los

receptores de 31 P junto con el receptor TLR4 en lo que respecta a la

calcificación in vitro asociada a estenosis aórtica, con lo que bloqueando los

receptores de 31 P, preferiblemente los receptores 31 P" 31 P2 o 31 P3

adicionalmente se disminuye dicha calcificación .

-

Adicionalmente se demuestra que el aumento de la expresión de ICAM-1 y de su forma soluble sICAM-1, un biomarcador asociado a la prevalencia y

severidad de la calcificación de la válvula aórtica que subyace a la estenosis aórtica calcificada, se produce como consecuencia de la activación conjunta de

20 los receptores de 31 P Y TLR4 en células intersticiales de válvulas cardiacas.

Como consecuencia, el uso de antagonistas de los receptores de S1 P,

preferiblemente de los receptores 31 P" 31 P2, 31 P3 o 31 P, evitaría la agravación de la estenosis aórtica calcificada.

25 Por tanto, la presente invención proporciona el uso de antagonistas de los receptores de esfingosina 1-fosfato (31 P), preferiblemente de los receptores 31 P" 31 P2, 31 P3 o 31 P, para bloquear de forma simultánea la inllamación y calcificación que subyacen a la estenosis aórtica calcificada y como

consecuencia, para prevenir y/o tratar dicha enfermedad, para la que 30 actualmente no existe terapia farmacológica efectiva.

Un aspecto de la presente invención se refiere al uso de al menos un inhibidor

de un receptor de 31 P (el artículo "un" debe interpretarse como artículo indefinido), es decir, al uso de al menos un inhibidor del receptor 31 P" 31 P2, 81 P3, 81 P, o 81 P5, o de cualquier combinación de inhibidores, para la

elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la

estenosis aórtica calcificada. En adelante, para referirnos al uso descrito en

este párrafo se puede emplear el término "uso de la presente invención" o "uso de la invención".

En la presente invención no se muestran resultados de inhibición del receptor 81 P5. Al igual que ocurre con el receptor 81 P, por el momento no hay disponibles inhibidores quimicos para estos receptores. A modo de ejemplo, en

la presente invención se muestran resultados de inhibición del receptor S 1 P 4 con la tecnología de ARN de interferencia. Teniendo en cuenta la similitud

estructural y funcional con respecto al resto de inhibidores 81 P ensayados en

la presente invención, es esperable que la inhibición de la función de 81 P5 por medios conocidos por el experto en la materia, es decir, por medios que no requieran un paso inventivo, o experimentación indebida, como por ejemplo el diseño de ARN de interferencia capaces de inhibir o disminuir la actividad del

mismo, proporcione el mismo efecto técnico descrito para la inhibición del resto

de receptores.

Los inhibidores pueden ser específicos de un tipo de receptor 81 P,

preferiblemente de los receptores 81 P 81 P2, 81 P3 o 81 P" pueden inhibir dos, "

tres o cuatro de ellos. La inhibición puede producirse en un rango de

concentración óptimo del inhibidor correspondiente. Es decir, mientras que un

rango de concentración puede inhibir a un receptor, es posible que la inhibición de otro receptor se produzca a una concentración que no se encuentre en

dicho rango.

El término "inhibidor del receptor de 81 P" tal como se utiliza en la presente

invención, se refiere a una molécula que se une a cualquiera de los receptores

de 81 P, preferiblemente de los receptores 81 P 81 P2, 81 P3 o 81 P, Y " disminuye la expresión y/o actividad del receptor al que se une, y/o su

señalización intracelular.

El inhibidor se selecciona de la lista que comprende, pero sin que sirva de

limitación, antagonistas (preferiblemente químicos), ARN de silenciamiento o

anticuerpo especifico para el receptor correspondiente (preferiblemente el

anticuerpo es monoclonal). en la presente invención este anticuerpo puede

5 denominarse anticuerpo neutralizante del efecto de S 1 P. Se ha descrito el posible papel terapéutico de anticuerpos que neutralizan el efecto de S1 P en cáncer (Huwiler A y Pfeilschifter J, 2008. Biochem Pharmacol, 75: 1893-1900; Visentin B el al. 2006 Cancer Cel/, 9: 225-38).

lOEn la presente invención se demuestra de forma clara y no ambigua que

mediante la inhibición especifica de los receptores S1 P S1 P2, S1 P3 o S1 P, se "

consiguen reducir los parámetros indicadores de la inflamación y calcificación asociada a la estenosis aórtica calcificada. En los ejemplos de la presente invención se demuestra que los antagonistas químicos y diferentes ARN de 15 silenciamiento, específicos para dichos receptores, solucionan el problema técnico de la presente invención, suponiendo estos ejemplos una demostración

clara de que inhibidores de muy diferente naturaleza tienen el mismo efecto

técnico, por tanto la presente invención no debe limitarse al uso de los

inhibido res concretos ensayados sino que debe referirse a otros inhibidores

20 conocidos para los receptores S1P" S1P2, S1P3 o S1P, en la fecha de

presentación de la presente invención. En definitiva, la presente invención

aporta al estado de la técnica que la inhibición de dichos receptores, mediante cualquier medio o producto, es útil en la prevención y/o tratamiento de la

estenosis aórtica calcificada.

El término "estenosis aórtica calcificada" se refiere a una enfermedad

degenerativa de la válvula aórtica causada por la calcificación degenerativa de

las cúspides aórticas, es decir, la estenosis aórtica calcificada está

caracterizada por el engrosamiento y la calcificación de las valvas de la válvula 30 aórtica y el consiguiente estrechamiento del orificio valvular del corazón,

dificultando de esta manera el flujo de sangre desde el ventrículo izquierdo

hacia la aorta respecto de un individuo sano que no padece dicha enfermedad.

El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención se

refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una

enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente

mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:

(i)

inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;

(ii)

aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la

regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;

(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.

El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste

en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamifero, y

más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene

predisposición por la condición patológica.

El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso

humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán "medicamentos veterinarios" las "premezclas para piensos medicamentosos" elaboradas para ser incorporadas a un pienso.

Opcionalmente, el medicamento de la presente invención comprende, al menos, un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptables.

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la

absorción de cualquiera de los componentes de la composición de la presente

invención , estabiliza dichos componentes o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica en el sentido de darle consistencia o aportar sabores

que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los componentes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o

celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del

medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la

disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Por tanto, el término "excipiente" se define como aquella materia que, incluida en las "formas galénicas", se añade a los principios activos o a sus asociaciones para

posibilitar su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades físico-químicas de la composición

farmacéutica y su biodisponibilidad. El excipiente "farmacéuticamente

aceptable" debe permitir la actividad de los compuestos de la composición

farmacéutica, es decir, que sea compatible con dichos componentes.

La "forma galénica o forma farmacéutica" es la disposición a que se adaptan

los principios activos y excipientes para constituir un medicamento. Se define

por la combinación de la forma en la que la composición farmacéutica es

presentada por el fabricante y la forma en la que es administrada.

El ''vehículo'' o portador, es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor

dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la composición farmacéutica de la presente invención hasta un volumen o peso determinado ; o

bien que aún sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor

dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento.

Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente

aceptable es el diluyente.

Además, el excipiente y el vehículo deben ser farmacológicamente aceptables, es decir, que el excipiente y el vehículo esté permitido y evaluado de modo que

no cause daño a los organismos a los que se administra.

Por otra parte, el medicamento descrito, además de dicho vehículo y/o excipiente, comprende opcionalmente otra sustancia activa. Además del requerimiento de la eficacia terapéutica, donde dicha composición farmacéutica puede necesitar el uso de otros agentes terapéuticos, pueden existir razones fundamentales adicionales que obligan o recomiendan en gran medida el uso de una combinación de un compuesto de la invención y otro agente terapéutico. El término "principio activo" es toda materia, cualquiera que sea su origen, humano, animal, vegetal, químico o de otro tipo, a la que se atribuye una actividad apropiada para constituir un medicamento.

En cada caso la forma de presentación del medicamento se adaptará al tipo de

administración utilizada, por ello, la composición de la presente invención se

puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de

administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente

efectiva. El medicamento descrito en la invención se puede formular en formas

sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimido, cápsula,

polvo, gránulo, ungüento, solución, supositorio, inyección, inhalante, gel,

microesfera o aerosol. El medicamento se puede presentar en una forma

adaptada a la administración oral, sublingual, nasal, intracatecaJ, bronquial,

linfática, rectal, transdérmica o inhalada, pero sin limitarse a estas formas. Por otra

parte, el inhibidor de los receptores de 81 P de la presente invención, preferiblemente de los receptores 81 P 81 P2, 81 P3 o 81 P" puede ir asociado,

"

por ejemplo, pero sin limitarse, con liposomas o micelas.

Una realización preferida de la presente invención se refiere al uso de la

invención, donde el inhibidor es un antagonista, o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos farmacéuticamente aceptables, El antagonista de la

presente invención es de tipo químico. El antagonista es un compuesto que se

une a un receptor de S 1 P, preferiblemente a los receptores S 1 P1, Sl P2, S 1 P3 o

S1 P4, y actúa como un antagonista funcional bloqueando parcial o totalmente

su activación por los agonistas.

El antagonista de la presente invención, puede existir en forma de

enantiómeros o diastereómeros. En la presente invención también se contempla el uso de solvatos del antagonista (como por ejemplo, pero sin limitarse, hidratos), prodrogas (sinónimo de profármacos), o claratos. Las sales

farmacéuticamente aceptables se seleccionan de entre cloruro, bromuro ioduro

o cualquier otra sal farmacéuticamente aceptable.

Los antagonistas de los receptores de Sl P de la presente invención,

preferiblemente de los receptores S1 P" S1 P2, S1 P, o S1 P4, pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples (por ejemplo, Z,

E), incluyendo isómeros ópticos o enantiórneros, dependiendo de la presencia

de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros

individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.

En la presente invención, el término "sales farmacéuticamente aceptables" de

los compuestos antagonistas, se refiere a sales preparadas de ácidos no

tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos orgánicos ° inorgánicos. Los ácidos orgánicos °inorgánicos no tóxicos se seleccionan de la lista que comprende, pero sin limitarse: acético, algínico, antranílico, bencenosulfónico, benzoico, camforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, fórmico,

fumárico, furoico, glucónico, glutámico, glucorénico, galacturónico, glicídico,

hidrobrómico, hidroclórico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanesulfónico, múcico, nítrico, pamoico, pantoténico, fenilacético, propiónico, fosfórico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, sulfúrico, tartárico ° ptoluenosulfónico.

El compuesto de la invención puede estar en forma cristalina como compuestos

libres o como solvatos. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se

utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente y farmacológicamente aceptables, es decir, solvatos del antagonista de los receptores de S 1 P, 5 preferiblemente de los receptores S1 P S1 P" S1 P3 o S1 P4, que pueden ser

"

utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos

farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la

preparación de solvatos o sales farmacéuticamente y farmacológicamente

aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es

10 crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación conocidos por los expertos en la materia.

Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran las prodrogas o

15 profármacos de los antagonistas de los receptores de S 1 P, preferiblemente de

los receptores S1 P S1 P" S1 P3 o S1 P4. El término "profármaco" o "prodroga" "

tal como aquí se utiliza incluye cualquier compuesto derivado del antagonista,

por ejemplo y no de forma limitativa: ésteres (incluyendo ésteres de ácidos

carboxílicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato

20 de sales metálicas, etc.), carbamatos, amidas, amidas biohidrolizables, ésteres biohídrolizables, carbamatos bíohidrolizables, ureídos biohidrolízables, fosfatos bíohídrolízables. Otros ejemplos de prodrogas íncluyen compuestos que comprenden grupos -NO, -NO" -ONO, o -ON02-que al ser administrado a un individuo puede ser transformado directa o indirectamente en dicho antagonista

25 en el mencionado individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto

que aumenta la biodisponibilidad del antagonista cuando se administra a un

individuo o que potencia la liberación del antagonista en un compartimento

biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica, siempre y cuando

pueda ser administrado a un individuo y proporcione el antagonista de los

30 receptores de S1 P, preferiblemente de los receptores S1 P" S1 P" S1 P3 o S 1 P4, en un compartimento biológico del mismo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Los términos "amidas biohídrolizables", "ésteres biohídrolízables", "carbamatos bíohidrolizables",

"u re idos biohidrolizables", "fosfatos biohidrolizables", se refieren a carbamato,

carbonato, ureido y fosfato , respectivamente, de un compuesto que: 1) no

interfiera con la actividad biológica del complejo pero que confiere al

compuesto propiedades ventajosas in vivo, como absorción, duración del

5

efecto, o del inicio del efecto ; o 2) es biológicamente inactivo, pero se convierte

in vivo a compuesto biológicamente activo.

Más preferiblemente el antagonista se selecciona de la lista que comprende

FTY720, VPC23019, VPC25239, VPC01 091 , Ascotricina A, Ascotricina B,

tO

JTE013, W146 , W123, BML-241, 8uramina o toxina pertussis, o cualquiera de

sus sales, isómeros o solvatos farmacéuticamente aceptables. Según

realizaciones aún más preferidas del uso de la presente invención, el

antagonista se selecciona de la lista que comprende VPC23019, JTE013,

Suramina o toxina pertussis, o cualquiera de sus sales, isómeros o solvatos

15

farmacéuticamente aceptables.

A continuación se describen los antagonistas de la lista anterior:

-FTY720 (2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil)-propano-1 ,3-diol) (sales: hidrocloruro,

20

fosfato), también denominado "fingolimod" es un agente con efecto

inmunosupresor que regula la migración de linfocitos mediante su interacción

con 81 P" aunque puede unirse a todos los receptores de 81 P/EOG con

excepción de 81P2 (Takabe K etal. 2008, Pharmacol Rev, 60 : 181-195; Oong

800n 1, 2010, Acta Pharmacol Sinica, 31: 1213-1222). Además de su efecto

25

agonista, FTY720 se comporta como un antagonista funcional de 81 P" pues el

tratamiento con FTY720 in vivo induce la internalización y degradación de la

expresión de S1 P 1, con lo que actuaría como un inhibidor no competitivo

selectivo de receptores de 51 P, (M.H. Graler y E.J. Goetzl, 2004. FASEB J, 18 :

551-553; Matloubian et al., 2004. Nature, 427: 355-360; Dong-8oom 1, 2010.

30

Acta Pharmacol Sinica, 31: 1213-1222)

La estructura química de la sal de ácido clorhídrico de FTY720 es la siguiente:

-

VPC23019 ((R)-ácido fosfórico mono-[2-amino-2-(3-octiHenilcarbamoil)-etil] ester) es un antagonista selectivo no competitivo de 81 P, Y81 P, (Takabe K et 5 al. 2008. Pharmacol Rev, 60: 181-195; 00ng-800n 1, 2010. Acta Pharmacol Sinica, 31: 1213-1222).

10 -VPC25239 es un antagonista selectivo 81 P, Y 81 P, (Takabe K et al. 2008. Pharmacol Rev, 60: 181-195; 00ng-800n 1, 2010. Acta Pharmacol Sinica, 31: 1213-1222).

-VPC-01 091-P .1-[1-Amino-3-(4-octilfenil)ciclopentil]metanol-fosfato, es un 15 antagonista de los receptores 81 P,; 00ng-800n 1, 2010. Acta Pharmacol Sinica, 31: 1213-1222).

-

Ascotricina A y B son inhibidores de receptores de 81 P, (Ascotricin A y

Ascotricin B, está más extendido el término en inglés que en español, es por

20 ello que se menciona en la presente solicitud) (Yonesu K, et al. J Anfibiot, 2009,

62: 359-64; 00ng-800n 1, 2010. Acta Pharmacol Sinica, 31 :1213-1222).

-

JTE013 (N-(3,5-dicloropiridina-4-il)-2-(4-isopropil-1 ,3-dimetil-1 H-pirazolo[3,4

b]piridina-6-il)-hidrazinacarboxamida), es capaz de unirse a los receptores S1 P1

25 , 81 P2 , 81 P, , 81 P, Y 81 P,. Es un antagonista potente de 81 P2. 8in embargo, el fabricante comenta que usado 1000 veces más concentrado inhibe un 4.5% de 81P, y no antagoniza 81P,. JTE-013 puede no ser un compuesto tan selectivo, al menos en modelos de roedores, pues su efecto inhibitorio de la

contracción vascular se observa tanto en ratones deficientes en 81 P, como en los no deficientes (8alomone 8 el al. 2008. Br J Pharmacol, 153: 140-7).

La estructura quimica del compuesto JTE013 es:

CI

Cl

15 -W146 (3-amino-4-(3-hexilfenilamino)-4-oxobutil ácido fosfónico) es un antagonista específico de 81 P,. La estructura de la sal de trifluoroacetato es:

-

W123 (3-(2-(3-hexilfenilamino)-2-oxoetilamino) ácido propanoico) es un antagonista especifico de 81 P,.

25 -BML-241 (2-undeciHiazolidina-4-ácidocarboxilico), también denominado como CAY10444. Es un antagonista selectivo del receptor 81 P" bloqueando el

aumento de calcio en células HeLa en un 40% a una concentración de 1 O ~M.

Su estructura química es la siguiente:

s·········\

.•~"-...//,,,.//""-"-..._/"'-.,V/~./ZN/\...COÚH

5 -Suramina (8-[ (4-metil-3-{[3-( {(3-( {2-metil-5-[ (4,6,8-trisulfo-1-naftil)carbamoil] fenil}carbamoil)fenil]carbamoil}amino)benzoil]amino}benzoil)amino]naftaleno1,3,5-ácido trisulfónico) , es un antagonista específico de la señalización intracelular de S1 P, por inhibir de modo competitivo y reversible las fosfatasas de tirosina y desacoplar las proteínas G.

-

Toxina pertussis. Esta toxina es una exotoxina a base de proteínas tipo AB5

producida por la bacteria Bordetefla pertussis. La toxina de B. pertussis cataliza

15 la ADP-ribosilación de las cadenas alfa de proteínas G heterotriméricas impidiendo su interacción a receptores, y por tanto bloqueando la señalización intracelular de receptores acoplados a proteínas G, entre ellos los receptores de S1P (Goodemote KA et al. J Bio/ Chem, 1995. 270: 10272-7.). Se ha

descrito que en el sistema cardiovascular la toxina pertussis inhibe la

20 señalización de los receptores S1 P, y S 1 P, Y parcialmente la de S1 P, (Takuwa y et al. 2008, Biochim Biophys Acta" 1781 :483-488) aunque podría inhibir la señalización de S1 P4 y S1 P" que se sabe que está acoplada a Gi/o (Takabe K

el al. 2008, Pharmacol Rev, 60:181-195)

Según otra realización preferida, el inhibidor es un ARN de silenciamiento o lo

que es lo mismo, un ARN de interferencia (siRNA).

Según varias realizaciones más preferidas del uso de la presente invención:

-

En el caso de que el receptor sea S1 P" el siRNA es un ARN de doble cadena cuya secuencia sentido es SEO ID NO: 11 (5'-GCCCACUUUAUCUAAAUGA3) En la presente invención se entiende que el ARN de doble cadena está formado por una cadena sentido y una cadena antisentido, donde dichas

cadenas son secuencias complementarias entre sí. En este caso, el siRNA es

una secuencia de ARN de doble cadena cuya cadena antisentido es SEO ID NO: 12 (5'-CGGGUGAAAUAGAUUUACU-3'), que está hibridada completamente con SEO ID NO: 11. Es decir, esta realización preferida de la presente invención se refiere al uso de la secuencia de siRNA de doble cadena SEO ID NO: 11 /SEO ID NO: 12 para la elaboración de un medicamento para la

prevención y/o el tratamiento de estenosis aórtica calcificada.

-

Si el receptor es S1 P3, el siRNA es un ARN de doble cadena cuya secuencia sentido es SEO ID NO: 13 (5'-GGUGGCCAACCACAACAAC-3) En este caso, el siRNA es una secuencia de ARN de doble cadena cuya cadena antisentido es SEO ID NO: 14 (5'-CCACCGGUUGGUGUUGUUG-3"), que está hibridada completamente con SEO ID NO: 13. Es decir, esta realización preferida de la

presente invención se refiere al uso de la secuencia de siRNA de doble cadena

SEO ID NO: 13/SEO ID NO: 14 para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de estenosis aórtica calcificada.

-

Si el receptor es S1 P4, el siRNA es un ARN de doble cadena cuya secuencia sentido es SEO ID NO: 15 (5'-GCCGCGUCUACGGCUUCAU-3) En este caso, el siRNA es una secuencia de ARN de doble cadena cuya cadena antisentido es SEO ID NO: 16 (5'-CGGCGCAGAUGCCGAAGUA-3'), que está hibridada completamente con SEO ID NO: 15. Es decir, esta realización

preferida de la presente invención se refiere al uso de la secuencia de siRNA

de doble cadena SEO ID NO: 15/SEO ID NO: 16 para la elaboración de un

medicamento para la prevención y/o el tratamiento de estenosis aórtica

calcificada.

-

Si el receptor es S1 P" el siRNA es un ARN de doble cadena cuya secuencia sentido es SEO ID NO: 35 (5'-GCAAGUUCCACUCGGCAAU-3) En este caso, el siRNA es una secuencia de ARN de doble cadena cuya cadena antisentido es SEO ID NO: 36 (5'-CGUUCAAGGUGAGCCGUUA-3'), que está hibridada completamente con SEO ID NO: 35. Es decir, esta realización preferida de la presente invención se refiere al uso de la secuencia de siRNA de doble cadena SEO ID NO: 35/SEO ID NO: 36 para la elaboración de un medicamento para la

prevención y/o el tratamiento de estenosis aórtica calcificada.

Para mejorar la función de los siRNA se pueden añadir los nucleótidos (U) o (tg) en el extremo 3' de la cadena sentido o en el extremo 5' de la cadena

antisentido del siRNA de la presente invención. De esta forma estos nucleótidos son salientes, no hibridando con ningún otro nucleótido de la cadena complementaria. La adición de estos nucleótidos en los extremos 3' o 5' no afecta al reconocimiento del ARN mensajero correspondiente.

Preferiblemente, los siRNA resultado de dicha adición son:

-

SEO ID NO: 11-U (SEO ID NO: 26): Es decir, SEO ID NO: 26 tiene la secuencia 5'-GCCCACUUUAUCUAAAUGAU-3' / SEO ID NO: 12-U (SEO ID NO: 27): Es decir, SEO ID NO: 27 tiene la secuencia 5'ttCGGGUGAAAUAGAUUUACU-3'. -SEO ID NO: 13-tt (SEO ID NO: 28): Es decir, SEO ID NO: 28 tiene la secuencia 5'-GGUGGCCAACCACAACAAC-U-3' / U-SEO ID NO: 14 (SEO ID NO: 29): Es decir, SEO ID NO: 29 tiene la secuencia 5'UCCACCGGUUGGUGUUGUUG-3'. -SEO ID NO: 15-U (SEO ID NO: 30): Es decir, SEO ID NO: 30 tiene la secuencia 5'-GCCGCGUCUACGGCUUCAUU-3' / gt-SEO ID NO: 16 (SEO ID

NO: 31): Es decir, SEO ID NO: 31 tiene la secuencia 5'gtCGGCGCAGAUGCCGAAGUA-3', -SEO ID NO: 35-tt (SEO ID NO: 40): Es decir, SEO ID NO: 40 tiene la secuencia 5'-GCAAGUUCCACUCGGCAAUU-3' / gt-SEO ID NO: 36 (SEO ID NO: 41 ): Es decir, SEO ID NO: 41 tiene la secuencia 5' gtCGUUCAAGGUGAGCCGUUA-3',

Una realización aún más preferida se refiere al uso de la invención en el que la secuencia de siRNA de doble cadena está codificada en una secuencia de

ADN formada por dos secuencias, A y B, donde la secuencia A está unida por

el extremo 3' al extremo 5" de la secuencia B, formando una secuencia A-B. Es decir, esta realización de la presente invención se refiere al uso de la secuencia

A-B o preferiblemente al uso del vector de expresión que comprende dicha

secuencia A-B, para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de estenosis aórtica calcificada. En este sentido se contemplan varias posibilidades:

-

En el caso de que el receptor sea S1P" A es SEO ID NO: 17 (5'GCCCACTTIATCTAAATGA-3') y B es SEO ID NO: 18 (5'TCATTTAGATAAAGTGGGC-3'). En este caso se formaría la secuencia SEO ID NO: 19; 5'-GCCCACTTIATCTAAATGA-TCATTIAGATAAAGTGGGC-3' (SEO ID NO: 17-SEO ID NO: 18). Preferiblemente las secuencias A y B tienen los nucleótidos (U) unidos al extremo 3', dando como resultado la secuencia SEO ID NO: 32; 5'-GCCCACTTTATCTAAATGAUTCATTTAGATAAAGTGGGCU-3'.

-

En el caso de que el receptor sea S1 P3, A es SEO ID NO: 20 (5'GGTGGCCAACCACAACAAC-3') y B es SEO ID NO: 21 (5'GTTGTTGTGGTTGGCCACC-3'). En este caso se formaria la secuencia SEO ID NO: 22; 5'-GGTGGCCAACCACAACAAC-GTTGTTGTGGTTGGCCACC-3' (SEO ID NO: 20-SEO ID NO: 21). Preferiblemente las secuencias A y B tienen los nucleótidos (U) unidos al extremo 3', dando como resultado la secuencia SEO ID NO: 33; 5'-GGTGGCCAACCACAACAACttGTTGTTGTGGTTGGCCACCtt-3', -En el caso de que el receptor sea S1 P" A es SEO ID NO: 23 (5-GCCGCGTCTACGGCTICAT-3') y B es SEO ID NO: 24 (5'ATGAAGCCGTAGACGCGGC-3'). En este caso se formaria la secuencia SEO ID NO: 25; 5'-GCCGCGTCTACGGCTICAT-ATGAAGCCGTAGACGCGGC-3' (SEO ID NO: 23-SEO ID NO: 24), Preferiblemente la secuencia A tiene los nucleótidos (U) unidos al extremo 3' y la secuencia B tiene los nucleótidos (tg) unidos al extremo 3', dando como resultado la secuencia SEO ID NO: 34; 5'GCCGCGTCTACGGCTICATU-ATGAAGCCGTAGACGCGGCtg-3'.

-

En el caso de que el receptor sea S1 P2, A es SEO ID NO: 37 (5'GCAAGTICCACTCGGCAAT-3') y B es SEO ID NO: 38 (5'ATIGCCGAGTGGAACTIGC-3'). En este caso se formaria la secuencia SEO ID NO: 39; 5'-GCAAGTICCACTCGGCAAT-ATIGCCGAGTGGAACTIGC-3' (SEO ID NO: 37-SEO ID NO: 38). Preferiblemente la secuencia A tiene los nucleótidos (U) unidos al extremo 3' y la secuencia B tiene los nucleótidos (tg) unidos al extremo 3', dando como resultado la secuencia SEO ID NO: 42; 5'GCAAGTICCACTCGGCAATtt-A TIGCCGAGTGGAACTIGCtg-3',

Como se puede observar, las secuencias A y B son secuencias complementarias y como consecuencia, el ARN transcrito a partir de la misma hibridará consigo mismo formando una horquilla, es decir, formando un

hairpinRNA (hpRNA),

En estos casos, la secuencia A-B de ADN que codifica el ARN transcrito tiene

que estar integrada en un sistema de expresión adecuado para que la

transcripción tenga lugar a partir de la secuencia A-B de ADN. Por ejemplo, pero sin que sirva de limitación, este sistema de expresión puede ser un vector

de expresión en el que la secuencia A-B de AON esté insertada entre una

secuencia reguladora de la expresión génica (como por ejemplo pero sin

limitarse, un promotor) y una secuencia terminadora de la transcripción, de modo que la transcripción que tenga lugar rinda cualquiera de los fragmentos

de siRNA de interés, descritos en la presente invención.

El término ''vector de expresión" se refiere a un fragmento de ADN que tiene la

capacidad de replicarse en un determinado huésped y puede servir de vehículo

para llevar a cabo la transcripción de una secuencia de interés que haya sido

insertada en el mismo. El vector puede ser un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un vector viral, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con la definición realizada de vector.

Los fragmentos de siRNA de la presente invención transcritos por el sistema de

expresión descrito, es decir, los hpRNA formados son un tipo de ARN de doble hebra (dsRNA) que es reconocido y cortado por una endoribonucleasa, la endoribonucleasa Dicer, dando como resultado fragmentos de siRNA que

provocan el silenciamiento post-transcripcional de las secuencias nucleotídicas

diana, llevando a la degradación del ARN mensajero correspondiente, de forma

que no se obtiene la proteína resultante de la expresión de las secuencias de

ARN mensajero. De las dos cadenas o hebras de siRNA formadas a partir del

corte con Oieer, sólo una de ellas, denominada hebra guía, se incorpora en el

complejo enzimático RISC mientras que la otra hebra se degrada. Las

características termodinámicas del extremo 5' del siRNA determinan cual de las dos hebras se incorpora al complejo RISC. Normalmente se incorpora como

hebra guía aquella con menor estabilidad en el extremo 5'. Para que se

produzca el silenciamiento post-transcripcional, la hebra guía debe ser complementaria al ARN mensajero que se pretende silenciar. A continuación , el

complejo RISC se une al ARN complementario de la hebra guía del siRNA presente en el complejo y se produce el corte del ARN mensajero.

Según una realización aún más preferida del uso de la presente invención, entre la secuencia A y B hay una secuencia nucleotídica espaciadora de al

menos un nucleótido de longitud. Más preferiblemente, la secuencia

espaciadora es una secuencia no codificante. La secuencia espaciadora puede ser parte de una secuencia de un intrón de un gen o la secuencia completa de dicho intrón. La función de la secuencia espaciadora es actuar de bisagra de los pares de secuencias descritos para que se pueda producir el apareamiento

O hibridación de las secuencias de ARN codificadas por el polinucleótido.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Muestra la expresión de transcritos de ARN mensajero de receptores de Sl P en células intersticiales de válvula aórtica humana.

Los resultados de la PCR cuantitativa, una vez normalizados con el gen de referencia actina, indican que las células expresan todos los receptores de 81 P, siendo 81 P2 el más abundante, seguido de 81 P3 Y 81 P,. Los resultados son representativos de más de 5 experimentos independientes. RNAm se refiere al ARN mensajero.

FIG. 2. Muestra la activación de cascadas de señalización por Sl P y TLR4.

Imagen fotográfica que ilustra que tanto los receptores de 81 P como los receptores TLR4 son funcionales pues el tratamiento celular con sus ligandos, 81 P Y LP8 respectivamente, promueve la activación de cascadas de señalización intracelulares como la MAP quinasa p38 en células intersticiales de válvula control (A) y válvula estenótica (B). La uniformidad de carga del gel se confirmó con un anticuerpo que reconoce la MAP quinasa ERK, quinasa regulada por señales extracelulares. R, reposo (células tratadas con el vehículo); LP8, lipopolisacárido; 81 P, eslingosina 1-losfato.

FIG. 3. Muestra la sinergia de los receptores de Sl P y TLR4 en la

inducción de moléculas pro-inflamatorias.

(A) Las células intersticiales de válvula control se trataron con esfingosina-1

fosfato, S1 P (ligando de los receptores S1 P,., ) y/o LPS (ligando de TLR4), y se

analizó la inducción de la expresión de la enzima COX-2 y la molécula de

adhesión ICAM-1 usando anticuerpos específicos. Se observó un efecto

5

sinérgico, pues el tratamiento combinado con S1 P y LPS induce la expresión

de COX-2 e ICAM-1 en mayor medida que la suma del efecto de los agonistas

por separado. El efecto sinérgico se observó a dosis fisiológicas de S1 P, entre

0,01-1 ~M, y cuando se trata en combinación con un ligando de TLR4 pero no

con un ligando de TLR2, Pam3CSK4. La inducción de la expresión de

ID

inhibidores es inferior en células de válvula pulmonar. (B) Cinética en células

intersticiales de válvula estenótica. El efecto de sinergia se observó a tiempos

después de la estimulación celular de 8, 12 Y24h. Un anticuerpo anti-~-tubulina

se usó para comprobar la uniformidad de carga. Los resultados son

representativos de más de 5 experimentos independientes. (C) Mediante

15

ensayos de ELlSA se cuantificó la concentración de sICAM-1 secretado al

medio extracelular de células tratadas como en el panel A. Los resultados son

representativos de 3 experimentos independientes.

AVIC, células intersticiales de válvula aórtica; ERK, quinasa regulada por

20

señales extracelulares; LPS (o también indicado con la abreviatura L),

lipopolisacárido; Pam (o también indicado con la abreviatura P), Pam3CSK4,

agonista de TLR2rrLR1 ; PIC, células intersticiales de válvula pulmonar; p-NF

KEl, forma fosforilada del factor de transcripción NF-kappaB,; R, reposo (células

tratadas con el vehículo) ; S1 P (o también indicado con la abreviatura S),

25

esfingosina 1-fosfato.

FIG. 4. Muestra el efecto de los receptores de 51 P Y TLR4 en la inducción de la activídad enzimátíca de fosfatasa alcalina en células ínterstícíales

procedentes de válvula control.

(A) La figura refleja la actividad enzimática de fosfatasa alcalina expresada como picomoles de producto generados por ~gramos de proteína y hora, y es representativa de 4 experimentos independientes en duplicado. (B) Con objeto

de comparar experimentos independientes, en la figura se representa el

aumento de actividad enzimática inducido con respecto a la actividad

enzimática en presencia de medio control. Las barras corresponden a la

desviación estándar. *Asterisco indica p = 0,0160 cuando se compara con el

efecto de medio condicionado (Análisis ANOVA, 3 columnas), •• p=0,005 cuando se compara el efecto con el del medio condicionado (Análisis ANOV A, 4 columnas). '''p=0,0107 cuando se compara el efecto con el de los agonistas por separado (ANOVA, 3 columnas). Crtl indica medio control; MC indica medio

condicionado de calcificación.

FIG. 5. Muestra el efecto de inhibición de la sinergia con algunos antagonistas de receptores de 51 P.

(A-6) Las células se pre-trataron con antagonistas farmacológicos de receptores de S 1 P, posteriormente se activaron con S1 P y LPS, y se realizó el

análisis como en la figura 3. El pre-tratamiento con suramina, inhibidor de

S1 P3, bloquea el efecto sinérgico del tratamiento combinado con S1 P y LPS en la inducción de la expresión de COX-2 (5A), de ICAM-1 (5A) y de la presencia de la forma soluble de ICAM en el medio extracelular (Figura 56); el tratamiento con PTX inhibe en menor medida que suramina. En el panel A un anticuerpo anti-~-tubulina se usó para comprobar la uniformidad de carga, y los resultados son representativos de más de 5 experimentos de western blct independientes. El panel 6 es representativo de 2 experimentos de ELlSA independientes. L indica LPS; PTX, toxina pertussis (inhibidor de Gi, inhibe la señalización de varios receptores de S1 P); S, S1 P; Sura, Suramina. (C) El ensayo de ARN de interferencia se realizó en células transfectadas con dúplex de ARN de interferencia especifico para receptores S1 P" S1 P' , S1 P3 YS1 P4 con objeto de bloquear su expresión. Como se observa, la inhibición de algunos receptores de S 1 P bloquea el efecto de sinergia en la inducción de moléculas pro-

inflamatorias. Los receptores de S1 P se pueden nombrar con la nomenclatura antigua en la que S1 P, equivale a EDG de la siguiente manera: S1 P,/EDG1 , 81 P,/EDG5, S1 P,IEDG3 Y S1 P.,IEDG6.

FIG. 6. Muestra el efecto de inhibición del efecto aditivo en la inducción de

la actividad enzimática de fosfatasa alcalina con algunos antagonistas de

receptores de S1 P.

La figura refleja la actividad enzimática de fosfatasa alcalina expresada como picomoles de producto generados por ~gramos de proteina y hora, y es representativa de 3 experimentos independientes en duplicado. El pretratamiento de células intersticiales de válvulas aórticas control con VPC23019 inhibe el efecto aditivo en la inducción de la actividad enzimática de fosfatasa alcalina inducido por 51 P Y LP5 observado en la Figura 4A. El pretratamiento con JTE013, inhibidor de 51 P2, inhibe el efecto aditivo, aunque en menor medida que VPC23019, JTE, JTE013; MC indica medio condicionado de calcificación; LP5, lipopolisacárido; 51 P, esfingosina 1-fosfato; VPC, VPC23019.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma, En los ejemplos y/o figuras de la presente invención se puede emplear la nomenclatura antigua de los receptores de 51 P. Los receptores de 51 P se pueden denominar como receptores EDG con la siguiente equivalencia: 51 P,/EDG1 , 51 P2/EDG5, 51 P,IEDG3, 51 PJEDG6, 51 P,IEDG8.

EJEMPLO 1. EXPRESiÓN DE RECEPTORES DE SlP EN CÉLULAS INTERSTICIALES DE VÁLVULAS CARDíACAS

Técnica 1a: Aislamiento y cultivo primario de células intersticiales procedentes de válvulas aórticas y pulmonares humanas. Se aislaron células intersticiales de válvulas aórticas de pacientes con estenosis aórtica calcificada a los que se

reemplazó quirúrgicamente la válvula aórtica (estenóticas), y de válvulas

aórticas y pulmonares procedentes de pacientes sometidos a trasplante

cardiaco sin enfermedad valvular conocida (control no estenótica). Las

muestras empleadas en la presente invención proceden de pacientes que están en el estadio avanzado de la estenosis aórtica y es calcificada; en estadios iniciales la estenosis aórtica es asintomática. El aislamiento celular se

realizó según un método recientemente descrito basado en el tratamiento secuencial con colagenasa tipo II (Meng el al. 2008, Am J Physiol Cell Physiol,

294: 29-35). La suspensión celular se centrifugo, se añadió medio M199

suplementado con penicilina G, estreptomicina, anfotericina B y 10% de suero de ternera fetal, y las células intersticiales se cultivaron en un incubador con

atmósfera humidificada y un 5% de CO,. El cultivo primario se dejó crecer

durante 7-10 días en monocapas hasta confluencia. La expresión de a2-actina se utilizó como marcador de células de estirpe de miofibroblasto. Las células intersticiales en cultivo son fundamentalmente miofibroblastos como se había

descrito anteriormente (Meng el al. 2008, Am J Physiol Cell Physiol, 294:2935).

Resultados: No se observaron diferencias morfológicas entre células procedentes de válvula aórtica y de válvula pulmonar, ni entre células aisladas de válvulas control y estenóticas.

Técnica lb: Extracción de ARN y ensayos de PCR cuantitativa. El ARN

mensajero se analizó mediante PCR cuantitativa (Real Time Quantitative

Reverse Transcription). Para ello se aisló el ARN total mediante el método de

Trizol , y mediante "retro-transcripción" usando una transcriptasa reversa se

obtuvo cONA, proporcionando así el molde o sustrato a la polimerasa estable para la reacción de PCR. La PCR se realizó utilizando primers específicos de receptores de S1 P y SYBR-Green siguiendo las instrucciones del fabricante (MJ Research) . Los valores obtenidos se normalizaron respecto a un control

interno para evitar la variabilidad en la concentración inicial de ARN. La especificidad de la reacción se determinó realizando la curva de

desnaturalización de cada población de AONs. La expresión relativa se calculó como 2 -' . CT donde .. CT es la diferencia en los valores del ciclo umbral (CT) entre el gen dado y el gen de referencia interno, valor que se normaliza con

respecto al valor control. Los cebadores usados son los siguientes: Sl P,

humano, cebador directo 5'-TATCAGCGCGGACAAGGAGAACAG-3' (SEQ ID NO: 1); cebador reverso ATAGGCAGGCCACCCAGGATGAG-3-(SEO ID NO: 2). Sl P2 humano, cebador directo 5--TCGGCCTTCATCGTCATCCTCT-3' (SEO ID NO: 3); cebador reverso 5'-CCTCCCGGGCAAACCACTG-3' (SEO ID NO: 4). Sl P3 humano, cebador directo 5'-CTTGGTCATCTGCAGCTTCAT-3' (SEO ID NO: 5); cebador reverso 5'-TCATTGTCAAGTGCCGCTCGAT-3-(SEO ID NO: 6). Sl P, humano, cebador directo 5--GAGAGCGGGGCCACCAAGAC3' (SEO ID NO: 7); cebador reverso 5'-GGTTGACCGCCGAGTTGAGGAC-3' (SEO ID NO: 8). Sl P, humano, cebador directo 5'ACAACTACACCGGCAAGCTC-3' (SEO ID NO: 9); cebador reverso 5-GCCCCGACAGTAGGATGTT-3-(SEO ID NO: 10).

Resultados: Los datos obtenidos, una vez normalizados con el gen de

referencia, actina, indican que todos los receptores de Sl P se expresan, siendo

el receptor Sl P2 el más abundante, seguido de Sl P3 y Sl P,. En las válvulas

eslenóticas se observa reducción de la expresión de receptores S 1 P 4 Y S 1 Ps

(Figura 1).

EJEMPLO 2. FUNCIONALIDAD DE RECEPTORES DE S1P V TLR4: ACTIVACiÓN DE CASCADAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULARES

Técnica: Extractos citoplasmáticos y análisis de Weslern blo!.

-

Agonistas: Para los ensayos in vilro, la Sl P (a concentraciones de 0,01-1 ~M) se usó como agonista de los receptores de Sl P, y el lipopolisacárido (LPS, a concentraciones de 0.1-1 ¡1g/ml) se usó como ligando del receptor TLR4, que es

el receptor tipo Tall mas expresado en células intersticiales de válvulas aórticas

y cuya expresión aumenta en la estenosis aórtica calcificada (López J, el al. Int.

J. Cardiol. DOI: 10.1016/j.ijcard.2010.12.089).

Nota: En la presente invención se puede utilizar el sistema "Digital object idenldier" (001) para poder localizar el articulo científico ya que no cambia con el paso del tiempo, aunque el articulo sea reubicado en una dirección web

distinta puesto que lleva la información incorporada en forma de metadatos.

-Análisis de las cascadas de activación: usamos el método descrito

anteriormente (López J, el al. Inl. J. Cardiol. 001: 10.1 016/j.ijcard.201 0.12.089). Las células se trataron con S 1 P en combinación o no con LPS durante 15, 30, Y 60 mino A continuación las células se lisaron con tampón TNE (Tris-HCI 20mM pH 7,4, NaCI150 mM, EDTA 5 mM, NP40 al 0,01%) durante 10 min en hielo. Las proteinas procedentes de lisados celulares, 30-50 ~g de proteina total, se separaron por métodos de electroforesis en geles de poliacrilamida (SOS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante

sistemas de transferencia en líquido. La membrana se incubó primeramente en TBS+5% leche, a continuación con el anticuerpo primario correspondiente durante toda la noche a 4QC, y posteriormente con un anticuerpo secundario durante 45 mino Las proteínas se visualizaron mediante quimioluminiscencia

usando un kit de revelado de ECL (Amersham/GE). Se usaron anticuerpos frente a MAP quinasas (Cell Signalling): anti-P-p38 y como control de la

uniformidad de la carga se usó un anticuerpo frente a ERK, quinasa regulada por señales extracelulares.

Resultados. El tratamiento con S1 P promueve la activación de MAPK p38 con lo que se puede concluir que los receptores de S1 P son funcionales en células intersticiales de válvulas aórticas control (Figura 2A) y estenótica (Figura 2B). Además la activación conjunta de receptores de S 1 P Y TLR4 tiene efecto aditivo en la inducción de la activación de MAPK p38. La activación de MAPK p38 por LPS indica que los receptores TLR4 son funcionales, como se ha demostrado en un estudio previo (López J, el al. Inl. J. Cardiol. 001 :

10.1 016/j.ijcard.201 0.12.089).

EJEMPLO 3. MEDIADORES PRO·INFLAMATORIOS: EFECTO DE SINERGIA DE RECEPTORES DE S1 P y TLR4

Técnica : Extractos citoplasmáticos celulares y análisis de Weslern blol; método de ELlSA para cuantificar los niveles de mediadores en el medio extracelular.

Se realizó el mismo método que en el ejemplo 2 usando anticuerpos

específicos para la enzima COX-2 y la molécula de adhesión I CAM-l (Santa

Cruz). Se realizaron estudios de cinética de inducción y de dosis-respuesta. Como control de la carga se usaron anti-~ actina o anti-~-tubulina (Sigma).

Resultados: El tratamiento celular con 1 ~g/ml LPS induce la expresión de los mediadores pro-inflamatorios ciclooxigenasa (COX)-2 e ICAM-l a tiempos largos 12-24h, y 1 ~M SI P induce su expresión , aunque en menor medida. Sorprendentemente, el tratamiento combinado con SI P 1 ~M Y LPS de E. cofi 1 ).lg/ml induce la expresión de COX-2 e ICAM-! en mayor medida que el efecto de la suma de los agonistas, lo que indica un efecto de sinergia de acción entre receptores de SI P Y TLR4 en células intersticiales de válvula aórtica (Figura 3A, panel izquierdo).

A continuación se estudió la cinética del efecto. La inducción de COX-2 se observa a 8, 12 Y 24h después de la estimulación celular, incluso se observa en menor medida a tiempos tardíos como 48h y 72h (Figura 38). En cuanto a la dosis respuesta, manteniendo constante la concentración de LPS a 1 ).lg/ml y el tiempo de incubación de 12 h, se varió la dosis de SIP. El efecto sinérgico se observa a dosis fisiológicas de SIP, entre 0,ü1-1 ~M, yen combinación con un ligando de TLR4 (LPS) pero no de TLR2 (Pam3CSK4).

Seguidamente se cuantificaron los niveles de la forma soluble de la proteína ICAM-len el medio extracelular de células intersticiales. Se observó que el tratamiento de las células con LPS 1 ).lg/ml induce la secreción al medio extracelular de sICAM-l , y sorprendentemente el tratamiento combinado con SI P 1 ).lM Y LPS 1 ).lg/ml induce un aumento de los niveles de sICAM-l

superior a la suma simple del efecto de los agonistas, lo que indica un efecto

de sinergia de acción entre receptores de SI P Y TLR4 (Figura 3C).

Tal como se ha indicado, se observó que la activación simultánea de los

receptores de 81 P Y TLR4 en las células intersticiales de válvula aórtica promueve un efecto de sinergia en la inducción mantenida y exacerbada de

mediadores pro-inflamatorios, lo que podría contribuir al proceso de inflamación

crónica que se asocia a la enfermedad de la estenosis aórtica calcificada. En

concreto el tratamiento de células intersticiales con los agonistas

correspondientes, S1 P y LPS respectivamente, induce un efecto sinérgico en la

expresión de (i) COX-2, enzima inducible y precursora de mediadores inflamatorios lipídicos como prostaglandinas y prostaciclinas, (ii) ICAM-l, molécula de adhesión asociada a membranas, iii) la forma soluble de ICAM-l , que se ha asociado al aumento de la prevalencia y la severidad de la calcificación de la válvula aórtica (Shavelle el al. 2008. J.Heart Valve Dis., 17: 388-95) (Figura 3A). El efecto sinérgico se observa a dosis fisiológicamente relevantes de Sl P (Figura 3A), y se mantiene durante muchas horas (Figura 3B). Inesperadamente, el efecto de inducción es mucho menos marcado en células de origen pulmonar (Figura 3A, panel derecho) que en las de origen aórtico (Figura 3A, panel izquierdo), lo que estaría de acuerdo con el hecho de

que las válvulas pulmonares raramente sufren procesos patológicos de estenosis.

EJEMPLO 4. CALCIFICACiÓN IN VITRO: EFECTO ADITIVO DE RECEPTORES DE S1P V TLR4

Técnica: Medida de la expresión y de la actividad de un marcador temprano de calcificación, fosfatasa alcalina (ALP). Se usó el método descrito anteriormente (Yang X, el al. 2009, J Am CoII Cardiol, 53:491-500; Osman L el al. 2006, Circulalion, 114[suppl 1]:1-547-1-552). Brevemente, se sembraron 20.000 células intersticiales de válvulas control por pocillo en una placa de 24 pocillos, y se cultivaron en medio condicionado (Medio M199 suplementado con glicerofosfato 10 mM, vitamina 03 10 nM, dexamelasona 10 nM) solo o en presencia de 0,1 ¡1M Sl P, l¡1g/ml LPS, o de una combinación de ambos. En

paralelo las células se cultivaron en el medio M199 usado habitualmente para

su cultivo (medio control, Ctrl). Se añadió medio fresco 2 veces a la semana. A los 15-21 días de cultivo se midió la actividad de ALP.

Actividad enzimática de ALP (método cuantitativo). Las células se lisaron en un tampón compuesto por Tris-HCI 20 mM, NaCI 150 mM, NP40 al 0.2%, y glicerol

al 10%, pH 8). La actividad enzimática se midió en los lisados celulares «5¡Igr

de proteína) usando un kit fluorométrico muy sensible, en el que el sustrato

está acoplado a un marcador fluorescente, metilumbiliferona fosfato (MUP). En un tampón de glicina se incubaron el sustrato MUP y las muestras durante 30

min a 25 2C y protegido de la luz. A continuación se paró la reacción, y se midió

la fluorescencia a la longitud de onda de 360 excitación/440 nm emisión. La actividad de fasfatasa alcalina se calculó usando una curva estándar y

normalizando frente a la concentración de proteína. Los resultados se

expresaron como pmol/¡Ig de proteína por hora de reacción.

Resultados: 8e estudió la inducción de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina (ALP), marcador temprano de calcificación (Figura 4A-B). Los resultados indican que 81 P tiene un efecto pro-osteogénico, pues induce la actividad de ALP con respecto a los valores obtenidos con el medio condicionado y el medio control (Figura 4B). El efecto de 81 P es similar al observado con LPS, que recientemente se ha descrito como un activador de la

expresión y actividad de ALP (Yang X, el al. 2009. J Am Golf Gardiol, 53: 491500; López J, el al. Inl. J. Cardiol. 001: 10.1 016/j.ijcard.201 0.12.089). Más aún, el tratamiento combinado de 81 P con LP8 tiene un efecto aditivo en el

aumento de la actividad enzimática del marcador temprano de calcificación

ALP. Por tanto, se puede concluir que los receptores 81 P/EDG Y TLR4

cooperan en la inducción de calcificación in vitra, lo que podría contribuir al

proceso de osteogénesis característico de la estenosis aórtica calcificada.

EJEMPLO 5. BLOQUEO DE LA SINERGIA EN LA INDUCCiÓN DE MOLÉCULAS PRO-INFLAMATORIAS MEDIANTE ANTAGONISTAS DE ALGUNOS RECEPTORES DE S1P

Técnica: Ensayos de inhibición farmacológica con antagonistas comerciales y

análisis por Weslern blol y ELl8A (tal como se ha descrito en el ejemplo 3). 8e estudió el efecto de antagonistas comerciales especílicos del receptor 81 P, (10 ~M VPC23019, Avanti Polar), de 81 P3 (10 ~M de suramina, Biomo~, de 81 P, (10 ~M de JTE013, Tocris), y el efecto de la 100 ng/ml de toxina pertussis. La toxina y los antagonistas se preincubaron durante , h Y después se incubaron con S1 P 0,1 flM + LPS 1 flg/ml durante 12 horas y a continuación los lisados celulares se analizaron como se ha descrito en el ejemplo 3 (expresión de COX-2 e IGAM-1) y como en el ejemplo 4 (actividad enzimática de ALP).

Resultados: El estudio reveló que la suramina, inhibidor de S1 P" bloquea el efecto sinérgico del tratamiento combinado con SI P Y LPS tanto a nivel de la inducción de la expresión de las moléculas pro-inflamatorias GOX-2 (Figura 5A) como de IGAM-1 (Figura 5A) y los niveles de sIGAM-1 en el medio extracelular (Figura 58). El tratamiento con PTX, que inhibe Guo y por tanto la señalización intracelular de los receptores de S1 P especialmente S1 P"" bloquea la respuesta sinérgica aunque en menor medida (Figuras 5A-8). Por tanto, del estudio farmacológico se puede concluir que S1 P" y probablemente otros receptores de S 1 P, están implicados en el efecto de sinergia observada, y que bloqueando dichos receptores se reduciría la inflamación asociada a GOX-2 e IGAM-' , es más se inhibirían los niveles de un biomarcador asociado al aumento de prevalencia y severidad de la calcificación de la válvula aórtica, sICAM-1.

Técnica : Silenciamiento de la expresión génica de receptores de 81 P mediante

oligonucleótidos de ARN (si RNA). Se usaron oligonucleótidos específicos de ARN de los receptores de S1 P/EDG validados en estudios previos del grupo (Dueñas A, el al. 2008. Cardiovasc. Res. 79: 537-544). Las células intersticiales se transfectaron usando el reactivo Dharmafecl (Dharmacon) con 25 nM de siRNA de doble cadena diseñados para los receptores específicos (S1P, S1P2, S1P3 o S1P,). Mediante PGR cuantitativa se comprobó la inhibición especifica de la expresión de receptores

81 P1 81 P2, 81 P3 o 81 P4 con objeto de bloquear su expresión, y el resto de células se activaron con 81 P en presencia o no de LPS y se analizaron mediante ensayos de Weslern blol como en el ejemplo 3.

Resultados: Los ensayos de interferencia de ARN del receptor S1 P, demuestran que el receptor S1 P, (para el que no hay antagonista químico comercial específico, es por ello que se emplea el ARN de interferencia), está también implicado en el proceso de sinergia de receptores de S1 P y TLR4 en la inducción de moléculas pro-inflamatorias. Además, el silenciamiento del gen del receptor 51 P, o del receptor 51 P" bloquea el efecto de sinergia (Figura 5e); y el silenciamiento de la expresión del receptor 51 P, también inhibe el efecto sinérgico, lo que está de acuerdo con los resultados observados en el estudio farmacológico. En conjunto, los resultados del ensayo de interferencia muestran que cuando se reducen los niveles de los receptores S1 P1 S1 P2, 51 P, o 51 P4, se bloquea el efecto de sinergia de receptores de 51 P Y TLR4 en la inducción de moléculas pro-inflamatorias y como consecuencia dichos antagonistas de los receptores S 1 P podrían tener aplicación terapéutica.

EJEMPLO 6. BLOQUEO DEL EFECTO ADITIVO DE 51P V TLR4 EN LA CALCIFICACION IN VITRO MEDIANTE ANTAGONISTAS DE ALGUNOS RECEPTORES DE S1P

Técnica: Medida de la actividad de un marcador temprano de calcificación, ALP, tal como se ha descrito en el ejemplo 4. Pretratamiento celular con antagonistas de receptores de 51 P previa a la activación con 51 P Y LP5 como se ha descrito en el ejemplo 5.

Resultados: El estudio reveló que VPC23019 (10 ~M) , antagonista de receptores 51 P, Y 51 P" inhibe el efecto aditivo de receptores 51 P/EDG Y TLR4 en la actividad ALP. Además, JTE013 (1 O ~M), un inhibidor de 51 P" inhibe dicha actividad, aunque en menor medida (Figura 6). Por tanto, los resultados muestran que cuando se reducen los niveles de 51 P" 51 P, o 51 P" se bloquea el efecto aditivo de 51 P Y TLR4 en la calcificación in vilro, y como consecuencia los antagonistas de dichos receptores podrían tener aplicación terapéutica.

"

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   lo

   Uso de al menos un inhibidor de un receptor de esfingosina-1-fosfato

   5

   (81 P) seleccionado de la lista que comprende: VPC23019 , JTE013,

   W146, Suramina o toxina pertussis, o cualquiera de sus sales, isómeros

   o solvalos farmacéuticamente aceplables, o un ARN de silenciamienlo

   (si RNA), para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o

   el tratamiento de estenosis aórtica calcificada.

   10

2. 2.

   Uso según la reivindicación 1 donde el receptor de 8 1 P es 8 1 P" 8 1 P2,

   8 1 P3, o S1 P4.

3. 3.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2 donde si el receptor

   15

   es S1 P" el si RNA es un ARN de doble cadena cuya secuencia sentido

   es SEO ID NO: 11 y la cadena antisentido es SEO ID NO: 12.

4. 4.

   Uso según la reivindicación 3, donde la secuencia de siRNA de doble

   cadena está codificada en una secuencia A-B de ADN, donde A es SEO

   20

   IDNO: 17yBesSEOIDNO: 18.

5. 5.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2 donde si el receptor

   es S1 P3, el siRNA es un ARN de doble cadena cuya secuencia sentido

   es SEO ID NO: 13 y la cadena antisentido es SEO ID NO: 14.

   25

6. 6.

   Uso según la reivindicación 5, donde la secuencia de siRNA de doble

   cadena está codificada en una secuencia A-B de ADN, donde A es 8 EO

   ID NO: 20y B es SEO ID NO: 21.

   30

   7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2 donde si el receptor

   es S1 P4 , el siRNA es un ARN de doble cadena cuya secuencia sentido

   es SEO ID NO: 15 y la cadena antisentido es SEO ID NO: 16.

7. 8. Uso según la reivindicación 7, donde la secuencia de siRNA de doble cadena está codificada en una secuencia A-B de ADN , donde A es SEO ID NO: 23 y B es SEO ID NO: 24.

   5 9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde si el receptor es S1 P2, el siRNA es un ARN de doble cadena cuya secuencia sentido es SEO ID NO: 35 y la cadena antisentido es SEO ID NO: 36.
8. 10. Uso según la reivindicación 9, donde la secuencia de siRNA de doble

   10 cadena está codificada en una secuencia A-B de ADN, donde A es SEO ID NO: 37 y B es SEO ID NO: 38.
9. 11.Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4, 6, 8 o 10, donde entre la

   secuencia A y B hay una secuencia nucleotídica espaciadora de al

   15 menos un nucleótido de longitud.
10. 12.Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , donde el

    medicamento además comprende un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptables.