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ES2559106B1 - Método de activación de la expresión del gen Pitx2 para promover la regeneración muscular - Google Patents

Método de activación de la expresión del gen Pitx2 para promover la regeneración muscular Download PDF

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ES2559106B1
ES2559106B1 ES201530645A ES201530645A ES2559106B1 ES 2559106 B1 ES2559106 B1 ES 2559106B1 ES 201530645 A ES201530645 A ES 201530645A ES 201530645 A ES201530645 A ES 201530645A ES 2559106 B1 ES2559106 B1 ES 2559106B1
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Diego Franco Jaime
Francisco HERNÁNDEZ TORRES
Estefanía LOZANO VELASCO
Daniel VALLEJO PULIDO
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Universidad de Jaen
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Abstract

La presente invención resuelve el problema de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares a través de la utilización de composiciones que comprendan un compuesto capaz de:#a. aumentar la expresión del gen Pitx2 en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y/o#b. reducir la expresión del miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de activacion de la expresion del gen Pitx2 para promover la regeneracion
muscular.
Campo tecnico de la invencion
La presente invencion se refiere al campo de la biotecnologia, en particular a la utilization de la expresion del gen Pitx2 para el tratamiento o la prevention de las distrofias musculares.
Antecedentes de la invencion
La siguiente discusion de los antecedentes de la invencion se proporciona meramente para ayudar al lector a comprender la invencion.
El musculo esqueletico tiene la capacidad de repararse y regenerarse debido a la presencia de celulas madre residentes, denominadas celulas satelite de musculo. En el tejido muscular maduro las celulas satelite constituyen una poblacion pequena, dispersa de celulas mitoticamente y fisiologicamente quiescentes, marcados por su expresion del factor de transcription Pax7 (Figura 1). Las celulas madre satelite del musculo adulto son un linaje procedente de las celulas progenitoras miogenicas embrionarias Pax3/pax7+ que permanecen en el musculo adulto en un estado de quiescencia y despues de una lesion se activan, proliferan y entran en el programa de diferenciacion miogenica debido a la regulation positiva de los genes de determination miogenica myf5, MyoD y myogenina formando asi nuevos mioblastos que eventualmente se fusionan entre si para generar nuevo tejido muscular (Figura 1).
Las distrofias musculares son un grupo de afecciones geneticas caracterizadas por trastornos degenerativos del musculo de caracter progresivo. Una de las caracteristicas mas graves en estas patologias consiste en la perdida gradual de tejido muscular esqueletico debido a una degeneration cronica acompanada por una regeneracion deficiente. Sus formas mas comunes en la infancia son las distrofias musculares de Duchenne (DMD) y Becker (BMD) y se caracterizan por ser trastornos hereditarios recesivos ligados al cromosoma X causados por mutaciones en el gen de la distrofina. La distrofina juega un papel estructural importante en la fibra muscular sirviendo de conexion entre la matriz extracelular y el citoesqueleto. La region N-terminal de esta protema se une a la protema del citoesqueleto actina, mientras que el extremo C-terminal es parte del complejo glicoproteico asociado a la distrofina (DGC) que conecta con la membrana de la fibra muscular (sarcolema). A falta de distrofina, la tension mecanica conduce a rupturas en el sarcolema
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causando una necrosis muscular progresiva, perdida de la ambulacion independiente al comienzo de la adolescencia, cardiomiopatia, insuficiencia respiratoria, y la muerte prematura en los individuos afectados.
En la actualidad no hay curacion para las distrofias musculares y las terapias existentes son ineficaces. Aunque, es probable que las terapias genicas puedan proporcionar una cura para estas enfermedades existen importantes obstaculos que limitan su aplicacion. Asi, se han realizado enfoques potenciales que han ido desde las estrategias de aumento de genes usando vectores virales o plasmidos destinados a la restauracion de la expresion de distrofina, hasta la regulation positiva de genes que podrian utilizarse para superar la falta de expresion del gen desertado. Aunque algunos de estos enfoques han demostrado ser parcialmente eficaces, los resultados obtenidos hasta el momento han puesto de manifiesto sus numerosas limitaciones. En particular, la perdida progresiva de la expresion del gen terapeutico observado despues del tratamiento ha indicado claramente que la modification de la fibra madura por si sola no es suficiente para mantener los efectos beneficiosos obtenidos por este enfoque terapeutico.
Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares, especialmente mediante la identification de nuevas aproximaciones para mejorar la regeneration muscular en estos pacientes.
Breve description de la invention
La presente invencion resuelve el problema de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares a traves de la utilization de composiciones que comprendan un compuesto capaz de:
a. aumentar la expresion del gen Pitx2 en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas celulas; y/o
b. reducir la expresion del miRNA-106b en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas celulas.
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Breve descripcion de las figuras
Figura 1. Origen embrionario de las celulas satelite de musculo. (Buckingham and Vincent, Current Opinion in Genetics& Development, 2009)
Figura 2. Ay B) Sobreexpresion de Pitx2 en celulas satelite de raton mediante transfeccion con el vector lentiviral bicistronico LVX-Pitx2c-ZSGreen. C) La expresion de los miRNAs: miR-15b, miR-106b, miR-23b y miR-503 (qRT-PCR) esta disminuida en las celulas satelite que sobre-expresan Pitx2, tanto en las celulas en estadios tempranos de activavion (EPq) como en estadios mas avanzados de activacion (EPa) (qRT-PCR). D) La transfecccion con el vector lentiviral bicistronico LVX-Pitx2c-ZSGreen conduce a una disminucion de la expresion de los genes de control de ciclo celular ciclina D1 y ciclina D2 (qRT-PCR) indicando que, de forma similar a lo que ocurre en mioblastos, la via Pitx2-miRNAs controla proliferacion en celulas satelite. E) Cuantificacion por inmunohistoqdmica del numero de celulas en proliferacion (Ki67+) en cultivos de celulas satelite sobre-expresando Pitx2.
Figura 3. A) La expresion de Myf5 (qRT-PCR) aumenta en las celulas satelite que sobreexpresan Pitx2 y B) la cuantificacion por inmunohistoqdmica muestra un aumento significativo de las celulas Myf5+. C) La sobreexpresion del miR-106b conduce a una disminucion de la expresion de Myf5 validandolo como target de este miRNA. D: Actividad normalizada de la luciferase de el 3’-UTR Myf5 luciferasa reporter (WT Myf5 3’-UTR), con el plasmido vado (Vector) o co-transfectando con pre-miR-106b muestra la perdida de la actividad luciferasa con el miR-106b. No hay perdida de la actividad luciferasa cuando la miR-106b "seed sequence” fue mutada.
Figura 4. A) Analisis mediante qRT-PCR de sobreexpresion de Pitx2c en los musculos de ratones MDX inyectados con celulas satelite distroficas transfectadas con el vector lentiviral LVX- Pitx2c-ZS-Green vector en comparacion con los musculo inyectados con celulas transfectadas con el lentivirus vado (LVX-ZS-Green vector); porcentaje de fibras formadas “de novo” (ZS-Green + cells) en los musculos trasplantados despues de 15 dias e imagen representativa. B) La disminucion de la expresion de miR-31 en los musculos trasplantados con celulas sobreexpresando Pitx2 conduce a un aumento en los niveles de expresion de distrofina asi como a un aumento significativo de las fibras que expresan distrofina. C) Treadmill test muestra la mejora funcional de ratones DMDmdx injectados con celulas que sobreexpresan Pitx2. D) Analisis inmunohistoqdmico de celulas en proliferacion (Ki67+) despues de 15 dias del transplante celular. E) Analisis de expresion mediante qRT-PCR de
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los miRNAS modulados por Pitx2 en el musculo de los ratones DMDmdx a los que se les realizo el trasplante celular con celulas que sobreexpresan Pitx2. F) Los niveles de expresion de las ciclinas D1 y D2 asi como del factor de transcripcion Myf5 estaban aumentados en los musculos trasplantados con celulas que sobreexpresan Pitx2 indicando que la cascada molecular Pitx2-miRNAS esta conservada en el sistema de trasplante “in vivo”.
Descripcion detallada de la invencion Definiciones
Tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el termino "gen Pitx2" es un miembro de la familia de factores de transcripcion bicoid homeodominio que juega un papel relevante en la morfogenesis (Referencia secuencia polinucleotidica del Genbank con numero de acceso NM_000325 identificativa de Homo sapiens paired-like homeodomain 2 (PITX2))
El termino "aumento" o "aumentar" se refiere a aumentos por encima del nivel basal. Por ejemplo, los niveles basales son normales en los niveles in vivo antes de, o en ausencia de, la adicion de un compuesto activador.
El termino "reduccion" o "reducir" o “inhibir” o “inhibicion” se refiere a reducciones por debajo del nivel basal. Por ejemplo, los niveles basales son normales en los niveles in vivo antes de, o en ausencia de, la adicion de un compuesto inhibidor.
En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hara referencia a un numero de terminos que se definiran para tener los siguientes significados:
"Opcional" u "opcionalmente" significa que el suceso o circunstancia descrito posteriormente puede o no ocurrir, y que la descripcion incluye casos en los que dicho evento o circunstancia ocurre y casos en los que no.
Como se usa aqui, los terminos "prevenir", "previniendo" y "prevencion" se refieren a los metodos para evitar o impedir el desarrollo de una enfermedad o trastorno o retardar la recurrencia o la aparicion de uno o mas smtomas de un trastorno en un sujeto resultante de la administration de un agente profilactico.
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El termino "vehiculo farmaceuticamente aceptable" pretende incluir la formulacion utilizada para estabilizar, solubilizar y ser mezclado de alguna manera con ingredientes activos que se administran a los animales vivos, incluyendo los seres humanos. Esto incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, y similares, compatibles con la administration farmaceutica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, tal uso en las composiciones esta contemplado.
El termino "enfermedad", como se usa aqui, pretende ser sinonimo generalmente, y se usa de manera intercambiable con los terminos "trastorno" y "condition" (como en la condition medica), en que todos reflejan una condicion anormal del cuerpo o de una de sus las partes que perjudica el funcionamiento normal y se manifiesta tipicamente por signos distintivos y smtomas.
El termino "terapia de combination" significa la administracion de dos o mas agentes terapeuticos para tratar una afeccion o trastorno terapeutico descrito en la presente description. Dicha administracion abarca la co-administration de estos agentes terapeuticos de una manera sustancialmente simultanea, tal como en una sola capsula que tiene una relation fija de ingredientes activos o en multiples capsulas separadas para cada ingrediente activo. Ademas, tal administracion tambien abarca el uso de cada tipo de agente terapeutico de una manera secuencial. En cualquier caso, el regimen de tratamiento proporcionara efectos beneficiosos de la combinacion de compuestos en el tratamiento de las afecciones o trastornos descritos en la presente.
La frase "terapeuticamente eficaz" pretende calificar la cantidad de ingredientes activos utilizados en el tratamiento de una enfermedad o trastorno. Esta cantidad sera la necesaria para lograr el objetivo de reducir o eliminar dicha enfermedad o trastorno.
El termino "sujeto" se refiere a todos los mamiferos, incluyendo los seres humanos. Los ejemplos de sujetos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, vacas, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos, y conejos.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en su totalidad se incorporan por referencia en esta solicitud a fin de describir mas completamente el estado de la tecnica a la que esta pertenece. Las
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referencias descritas son tambien individualmente y espedficamente incorporadas aqu como referencia por el material contenido en ellas que es discutido en la frase sobre la que se basa dicha referencia.
Descripcion de la invencion
La presente invencion aborda el problema de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares, aumentando la capacidad de regenerar el tejido perdido, como resultado de la distrofia muscular, de las celulas madre de musculo esqueletico.
Con este proposito los autores de la presente invencion han evaluado la contribucion del gen Pitx2 en la regulacion de la transcripcion, espedfica de tejido, de distintos microRNAs durante la miogenesis. Los analisis de perfiles de expresion genica (microRNA-microarrays) en una lmea celular de mioblastos (lmea celular Sol8) ha llevado a identificar a los autores de la presente invencion una serie de microRNAs (miRNAs) que son regulados diferencialmente en mioblastos Sol8 que sobreexpresan Pitx2 (ver figura 2). Los analisis de los efectos de dichos microRNAs en la proliferacion de mioblastos y la identificacion de sus supuestas dianas demuestran que Pitx2 regula un subconjunto de microRNAs que presenta un profundo efecto en la progresion del ciclo celular de mioblastos (miR15b, miR-23b, miR- 106b y miR-503). Adicionalmente, los autores de la invencion encontraron que esta via Pitx2-miRNAs tambien regula la proliferacion celular en celulas satelite aisladas del musculo esqueletico de raton (Figura 1). Estos resultados indican que Pitx2 actua amplificando la poblacion de mioblastos derivados de celulas satelite durante los procesos de diferenciacion de la miogenesis regenerativa (Figura 3).
Adicionalmente, estos resultados demuestran que reducir la expresion de miRNA-106b en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas celulas, amplifica la poblacion de mioblastos derivados de celulas satelite durante los procesos de diferenciacion de la miogenesis regenerativa (ver figuras 3 y 4).
Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invencion se refiere al uso de una composicion (de aqu en adelante "composicion de la presente invencion”) que comprende un compuesto capaz de
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- aumentar la expresion del gen Pitx2, compuesto activador, en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas celulas; y/o
- reducir la expresion del miRNA-106b, compuesto inhibidor, en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas celulas;
para la elaboration de un medicamento para promover la regeneration muscular.
Alternativamente, el primer aspecto de la invention se refiere a una composition que comprende un compuesto capaz de
- aumentar la expresion del gen Pitx2, compuesto activador, en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas celulas; y/o
- reducir la expresion del miRNA-106b, compuesto inhibidor, en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas celulas;
para su uso en promover la regeneracion muscular.

Por "aumenta la expresion del gen Pitx2" se entiende el aumento sobre la lmea de base, o en comparacion con a control, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18,

19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42,
43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65,66,

67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ,
91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o mas veces.
Los compuestos activadores se pueden identificar mediante un metodo de cribado que permita identificar en un compuesto la capacidad de activar Pitx2, que comprende poner en contacto una celula, preferiblemente una celula madre satelite de musculo, con un compuesto que se sospecha que pueda activar Pitx2; ensayando el contenido de las celulas para determinar la cantidad y/o actividad biologica de Pitx2, y comparar la cantidad determinada y/o la actividad biologica de Pitx2a un nivel predeterminado, en el que un cambio de dicho importe y/o la actividad biologica de Pitx2 es indicativa de un compuesto
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que activa Pitx2. En una realizacion preferida, la deteccion se realiza por RT-PCR cuantitativa en tiempo real, usando cebadores espedficos para cada isoforma.
En el contexto de la presente invencion por celulas madre satelite de musculo se entiende celulas madre, o pre-celulas musculares, que sirven para ayudar a la regeneracion del musculo esqueletico adulto. A raiz de la proliferacion (cuando las celula satelite se activan) y la diferenciacion posterior (cuando comienzan a expresar factores de transcripcion que las comprometen hacia un linaje miogenico (mioblastos)), las celulas satelite se fusionan entre si o con las adyacentes fibras musculares danadas, lo que aumenta el numero de mionucleos en las fibras para el crecimiento y la reparacion. La activacion y proliferacion de celulas satelite es necesario a fin de satisfacer las necesidades de formacion de nuevas fibras musculares para regenerar el musculo. La diferenciacion es necesaria para que las celulas satelite puedan convertirse primero en mioblastos y tras el proceso de fusion, en fibras.
Una realizacion preferida del primer aspecto de la invencion, se refiere al uso de la composicion de la invencion, donde dicho medicamento se usa para promover la regeneracion muscular en el tratamiento de una distrofinopatia o distrofia. Preferiblemente, donde dicha distrofinopatia o distrofia se selecciona de la lista que consiste en la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker.
Otra realizacion preferida del primer aspecto de la invencion o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composicion de la invencion, donde dicho compuesto, compuesto activador, es un polinucleotido de ADN (de aqu en adelante polinucleotido de la invencion) que comprende una secuencia seleccionada de la lista que consiste en:
- la secuencia polinucleotidica del Genbank con numero de acceso NM_000325 o su secuencia complementaria;
- una secuencia que hibrida selectivamente con la secuencia de (a); y
- una secuencia polinucleotidica de ADN que codifica para una secuencia aminoaddica identica en al menos el 90%, 92%, 94%, 96%, 98% o 99% basandose en la identidad de la totalidad de los aminoacidos de dicha secuencia, a la secuencia aminoaddica del Genbank con numero de acceso NP 000316.
OlOlVOOOVVVOlllVOlllOOlOOVOVOVOVVVOlVVOlOVOOVVVOOVVVVOVOVlV 1V1QO VVOVO VVVO VOVOOO VVVOVVVIO VOOOOIOOIOO VVOVIOOIVIIVVOOOIO s e VOVVVOIIOOOOOOIOVVOOOOOIVOOOOOIIOOVOOVIOOIVOOOOOOOOVOVOOOV 00000V010100000000V0010V001V10V000110010V0100VV0010000000 VVOVOOIOOOVOOOOVIOOOOIIOOVOOIOVOOVOOVVVOOVVVOIOVOVOIOOOVOO 001000V0010VV10100V0V000V1V11101V100010010V0000000000V11001 OIOOOIOOOOVOOOOIOOOOOOIIVVOIOOOIOOOOOVIOVOIOOVVOVVOIIOVVIV oe V01000V0VV01010V001000000010000V0V010V00V0100001001V00V001 00101V00V01V00100101V1010VV000V0000111101V00V0V0V01V0101000 OOVVOIOOVVOIVIOIOVVOIIOIIOOOOIIOOVOVVOOVOOIVIOOOIOOOOOIVOVII OOOOOVVOOOOOOOOIOVVOVVOVIOOIIVIOOOVOOOVIOIVOVOOVOOVIOOOOVO OIVOIOOOOIVVOIIOVOOOOOOOOIIOOOIVVOVVOOIVIOOVOOOOOVOOVOOVVO sz OOOVOOOVOVVVOVOOIVVVOOOOOOIOOIVVOVVOIIOOIIIOOOOOIOVOOOOOVV OOOVIIOOVVOOVOOIOIOIOOOIVVVOVVOOOOVOVOOIOIVOVOOOOOVIOOOOVV OOVOVOOlllOVOOOOVOOlOOVOOVOOlOOVOOVOOOVOOVlllOVOlOVOOOOVOO OOOOVVVOOOOOVVOVVOVVIOIOOOOVOOVOOOOOOOOIOOVOOVOIVVOVVOOOO VOOVOOOVVVVIVOVVVOVOVOOOOOOVOOOOOOVOOIOOVOVOOOIOIVOOVOVOOI oz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GTGTATAACATTTCGTACAATATTATTGTTTTACTTTTCAGCAAATATGAAACAAATGTGTT
TTATTTCATGGGAGTAAAATATACTGCATACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
En el contexto de la presente invencion, la secuencia aminoaddica con numero de acceso NP_000316 (SEQ ID NO 2) se identifica como. pituitary homeobox 2 isoform c [Homo sapiens]. Dicha secuencia aminoaddica se expone a continuacion:
MNCMKGPLHLEHRAAGTKLSAVSSSSCHHPQPLAMASVLAPGQPRSLDSSKHRLEVHTIS
DTSSPEAAEKDKSQQGKNEDVGAEDPSKKKRQRRQRTHFTSQQLQELEATFQRNRYPDM
STREEIAVWTNLTEARVRVWFKNRRAKWRKRERNQQAELCKNGFGPQFNGLMQPYDDMY
PGYSYNNWAAKGLTSASLSTKSFPFFNSMNVNPLSSQSMFSPPNSISSMSMSSSMVPSAV
TGVPGSSLNSLNNLNNLSSPSLNSAVPTPACPYAPPTPPYVYRDTCNSSLASLRLKAKQHS
SFGYASVQNPASNLSACQYAVDRPV
En el contexto de la presente invencion, el grado de identidad de una secuencia aminoaddica se basa en la identidad de la totalidad de los aminoacidos de dicha secuencia.
En esta realizacion de la invencion, dentro de los polinucleotidos de la invencion se pueden incluir en ella nucleotidos sinteticos o modificados. Un numero de tipos diferentes de modificacion de polinucleotidos son conocidos en la tecnica. Estos incluyen metilfostato y cadenas principales de fosforotioato, adicion de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y 5 'de la molecula. Para los fines de la presente invencion, se debe entender que los polinucleotidos descritos en este documento pueden ser modificados por cualquier metodo disponible en la tecnica.
Los polinucleotidos de acuerdo con la invencion se puede producir recombinantemente, sinteticamente o mediante cualquier medio disponible para los expertos en la tecnica. Tambien pueden ser clonados por tecnicas estandar. Los polinucleotidos se proporcionan tipicamente en forma aislada y/o purificada.
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Otra realizacion preferida del primer aspecto de la invencion o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composicion de la invencion, donde el compuesto es un polinucleotido de ADN que comprende una secuencia seleccionada de la lista que consiste en la secuencia polinucleotidica con numero de acceso NM_000325 (SEQ ID NO 1) o su secuencia complementaria o una secuencia polinucleotidica que codifica para una secuencia aminoaddica identica en al menos el 99%, basandose en la identidad de la totalidad de los aminoacidos de dicha secuencia, a la secuencia aminoaddica con numero de acceso NP_000316.
En un aspecto preferido de la invencion adicional, los polinucleotidos de la invencion, tales como los expuestos anteriormente, pueden ser transportados, sin degradacion, por vectores plasmidicos o virales que incluyen un promotor de expresion del acido nucleico en las celulas en las que es suministrado.
Asi, en una realizacion adicional de la invencion, los compuestos activadores de la invencion pueden comprender cualquiera de los polinucleotidos de la invencion descritos anteriormente o un plasmido o un vector capaz de transportar o suministrar dichos polinucleotidos, preferiblemente mediante un vector viral.
Los vectores virales son, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, virus vaccinia, virus de la polio, virus del SIDA, virus trofico neuronal, Sindbis y otros virus de ARN, incluyendo entre estos, virus con la estructura del VIH. Tambien se prefieren las familias virales que comparten las propiedades de estos virus que los hacen adecuados para su uso como vectores. Los retrovirus son virus de la leucemia murina de Maloney, MMLV, y retrovirus que expresan las propiedades deseables de MMLV como un vector. Los vectores retrovirales son capaces de llevar una carga util genetica mas grande, es decir, un gen o transgen marcador, que otros vectores virales, y por esta razon son un vector comunmente usado. Sin embargo, no son tan utiles en celulas no proliferativas. Los vectores de adenovirus son relativamente estables y faciles de trabajar, tienen trtulos elevados, y se puede enviar en la formulacion de aerosol, y pueden transfectar celulas que no se dividen. Los vectores virales de la viruela son grandes y tienen varios sitios para la insercion de genes, que son termoestables y pueden almacenarse a temperatura ambiente. Una realizacion preferida es un vector viral que ha sido disenado con el fin de suprimir la respuesta inmunitaria del organismo huesped, provocados por los antigenos virales.
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Los compuestos activadores pueden comprender, ademas de los polinucleotidos descritos de la invencion, plasmidos o vectores o los peptidos de la invencion, por ejemplo, Kpidos tales como los liposomas, tales como liposomas cationicos (por ejemplo, DOTMA, DOPE, DC-colesterol) o liposomas anionicos.
Los liposomas pueden comprender ademas protemas para facilitar la direccion a celula en particular, si se desea. La administracion de una composicion que comprende un compuesto y un liposoma cationico que se puede administrar a la sangre aferente a un organo diana. Ademas, el activador se puede administrar como un componente de una microcapsula que pueden ser dirigidos a tipos de celulas espedficas, tales como cardiomiocitos, o donde la difusion del compuesto o la administracion del compuesto de la microcapsula esta disenado para un tipo espedfico o una dosis.
Por lo tanto, otra realizacion preferida del primer aspecto de la invencion o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composicion de la invencion, en el que dicho compuesto es un vector o plasmido capaz de transportar o suministrar la secuencia de polinucleotidos, tal y como se define esta en el contexto de la presente invencion, a las celulas madre satelite de musculo. Preferiblemente dicho vector es un vector viral que codifica para la secuencia de polinucleotidos tal y como esta queda definida arriba. Mas preferiblemente dicho vector viral seleccionado de la lista que consiste en vectores adenovirales, lentivirales, retrovirales y adenoasociados.
Otra realizacion preferida del primer aspecto de la invencion o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composicion de la invencion, en el que dicho medicamento comprende celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto definido en el primer aspecto de la invencion o en cualquiera de sus realizaciones preferidas. Preferiblemente, dichas celulas tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son celulas de origen autologo. Mas preferiblemente, dichas celulas transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano que padece una distrofinopatia o una distrofia.
Por otro lado y tal y como se ha comentado con anterioridad, las figuras 3 y 4 de la presente invencion demuestran que reducir la expresion miRNA-106b en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del
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compuesto en dichas celulas amplifica la poblacion de mioblastos derivados de celulas satelite durante los procesos de diferenciacion de la miogenesis regenerativa.
Por consiguiente, un segundo aspecto de la presente invention se refiere a una composition que comprende un compuesto, compuesto inhibidor, capaz de reducir la expresion del miRNA-106b en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas celulas, para la elaboration de un medicamento para promover la regeneration muscular.
En el contexto de la presente invencion, por "inhibir o reducir la expresion del miRNA-106b" se entiende la reduction sobre la lmea de base, o en comparacion con a control, por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,
54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,
78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%,
o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o mas veces.
Los compuestos inhibidores se pueden identificar mediante un metodo de cribado que permita identificar en un compuesto la capacidad de inhibir o reducir la expresion intracelular del miRNA-106b, que comprende poner en contacto una celula, preferiblemente una celula madre satelite de musculo, con un compuesto que se sospecha que pueda inhibir o reducir la expresion del miRNA-106b; ensayando el contenido de las celulas para determinar la cantidad y/o actividad biologica de la expresion del miRNA-106b, y comparar la cantidad determinada y/o la actividad biologica del miRNA-106b a un nivel predeterminado, en el que un cambio de dicho importe y/o la actividad biologica de la expresion de miRNA-106b es indicativa de un compuesto con la capacidad de inhibir o reducir la expresion intracelular del miRNA-106b. En una realization preferida, la detection se realiza por RT-PCR cuantitativa en tiempo real.
En una realizacion preferida del segundo aspecto de la invencion, dicho medicamento se usa para promover la regeneracion muscular en el tratamiento de una distrofinopatia.
En otra realizacion preferida del segundo aspecto de la invencion o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicha distrofia o distronifopatia se selecciona de la lista que consiste en la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker.
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En aun otra realization preferida del segundo aspecto de la invention o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicho compuesto es un ARN de interferencia (ARNip) del miRNA-106b tal y como un oligonucleotido antisentido de RNA del miRNA-106b o un polinucleotido que exprese dicho oligonucleotido antisentido. Preferiblemente, dicho compuesto es un oligonucleotido sintetico antisentido de RNA del miRNA-106b que opcionalmente presenta modificaciones para incrementar su resistencia a las nucleasas. Mas preferiblemente, dicho compuesto es un vector o plasmido capaz de transportar o suministrar dicho ARN de interferencia (ARNip) del miRNA-106b a las celulas madre satelite de musculo. Preferiblemente dicho vector es un vector viral y mas preferiblemente se selecciona de cualquiera de los mencionados en el primer aspecto de la presente invencion.
En otra realizacion preferida del segundo aspecto de la invencion o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicho medicamento comprende celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto tal y como se ha definido este en el segundo aspecto de la invencion o en cualquiera de sus realizaciones preferidas. Preferiblemente, dichas celulas tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son celulas de origen autologo. Mas preferiblemente, dichas celulas transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano que padece una distrofinopatia (una distrofia).
Por ultimo, un tercer aspecto de la invencion se refiere a un metodo de cribado de un compuesto capaz de promover la regeneration muscular que comprende:
1. Seleccionar compuestos a partir de una libreria de compuestos;
2. Testar si alguno de dichos compuestos es capaz de:
a. aumentar la expresion del gen Pitx2 en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas celulas; y/o
b. reducir la expresion del miRNA-106b en las celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas celulas; y
3. Seleccionar aquel o aquellos compuestos capaces de llevar a cabo el mencionado en cualquiera de los apartados anteriores.
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En el contexto de la presente invention, los polinucleotidos de ADN de la invention, tales como los descritos anteriormente, que se suministran a las celulas, se pueden integrar en el genoma de la celula huesped, normalmente a traves de secuencias de integration. Estas secuencias estan a menudo relacionadas con las secuencias virales, particularmente en sistemas basados en virus cuando se utilizan. Estos sistemas de integracion virales tambien pueden ser incorporados en los acidos nucleicos que se van a entregar usando un sistema de adicion de acido no nucleico basada de entrega, tal como un liposoma, de modo que el acido nucleico contenido en el sistema de suministro puede integrarse en el genoma del hospedador.
Otras tecnicas generales para la integracion en el genoma del huesped incluyen, por ejemplo, sistemas disenados para promover la recombination homologa con el genoma del huesped. Estos sistemas se basan tipicamente en la secuencia de flanqueo del acido nucleico a expresar que tiene una homologia suficiente con una secuencia diana en el genoma de la celula huesped donde la recombinacion entre el vector de acido nucleico y el acido nucleico diana tiene lugar, haciendo que el acido nucleico suministrado sea integrado en el genoma del huesped. Estos sistemas y los metodos necesarios para promover la recombinacion homologa son conocidos por los expertos en la tecnica.
Los compuestos activadores o inhibidores descritos en la presente memoria se pueden administrar en un vehiculo farmaceuticamente aceptable y se puede enviar a las celulas del sujeto in vivo y / o ex vivo mediante una variedad de mecanismos bien conocidos en la tecnica como se ha comentado anteriormente.
Si los metodos ex vivo se emplean, las celulas o los tejidos pueden eliminarse y mantenerse fuera del cuerpo segun protocolos estandar bien conocidos en la tecnica. Los compuestos activadores o inhibidores se pueden introducir en las celulas a traves de cualquier mecanismo de transferencia de genes, tales como, por ejemplo, suministro de genes mediado por fosfato de calcio, electroporacion, microinyeccion o proteoliposomas. Las celulas transducidas pueden entonces infundirse (por ejemplo, en un vehiculo farmaceuticamente aceptable) o ser homotopicamente trasplantadas en el sujeto por metodos estandar para el tipo de celula o tejido. Los metodos estandar son conocidos para el transplante o infusion de varias celulas en un sujeto.
Los compuestos activadores o inhibidores de la presente invencion se pueden utilizar en conjunto con otros metodos de tratamiento.
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Ademas, proporcionado en la presente memoria, se incluye un metodo para aumentar o mejorar el estado clmico y la perception de bienestar de un sujeto con distrofia o con una distrofinopatia, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de un compuesto activador inhibidor, lo que aumenta o mejora el estado clmico del sujeto tratado por un cierto periodo de tiempo.
Los metodos actuales de tratamiento incluyen tambien un metodo para aumentar la eficacia de otros agentes propuestos para la misma enfermedad, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de un compuesto activador o inhibidor, y, opcionalmente, un vehmulo farmaceuticamente aceptable, aumentando asi la eficacia del otro agente o agentes.
En cualquier caso, las composiciones que comprenden el compuesto activador o inhibidor se pueden administrar in vivo en un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Por "farmaceuticamente aceptable" se entiende un material que no es biologicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material puede administrarse a un sujeto, junto con el acido nucleico o vector, sin causar ningun efecto biologico indeseable o interactuar de una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composition farmaceutica en la que esta contenido. El vehmulo, naturalmente, se selecciona para minimizar cualquier degradation del ingrediente activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como es bien conocido para un experto en la tecnica.
Las dosificaciones efectivas y los calendarios de administration de las composiciones que comprenden el compuesto activador o inhibidor descritos en este documento pueden ser determinadas empmcamente, y hacer tales determinaciones esta dentro de la experiencia en la tecnica. Los intervalos de dosificacion para la administracion de las composiciones son aquellos lo suficientemente grandes para producir el deseado efecto anti-hipertrofico en el trastorno. La dosificacion no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilacticas, y similares. Generalmente, la dosificacion variara con la edad, condition, sexo y extension de la enfermedad en el paciente, la via de administracion, o si otros farmacos se incluyen en el regimen, y puede ser determinada por un experto en la tecnica. La dosificacion puede ser ajustada por el medico individual en caso de cualquier contraindicacion. La dosis puede variar, y puede ser administrada en una o mas administraciones de dosis diarias, durante
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uno o varios dias. Se pueden encontrar orientaciones en la bibliografia para las dosificaciones apropiadas para las clases dadas de productos farmaceuticos.
El siguiente ejemplo sirve meramente para ilustrar la presente invention.
Ejemplos
Ejemplo 1. Pitx2 y regeneration muscular
En base a los resultados mostrados en las figuras, y teniendo en cuenta que, interesantemente, la expresion de Pitx2 esta significativamente aumentada durante la regeneracion muscular en raton y disminuida en el modelo murino de Distrofia muscular de Duchenne (ratones DMDmdx), llevamos a cabo un aproximacion experimental de trasplante de celulas "in vivo" para testar si Pitx2 podia mejorar la capacidad regenerativa de las celulas satelite aisladas de musculos distroficos. Es importante senalar que la posibilidad de modificar la capacidad regenerativa de las propias celulas distroficas supone una ventaja significativa para su aplicacion terapeutica en humanos (posibilidad de utilizar las celulas del paciente distrofico). Los resultados obtenidos permiten poner de manifiesto que la sobreexpresion Pitx2 mejora la regeneracion muscular llevada a cabo por las celulas satelite distroficas aumentando la regeneracion muscular en ratones MDX. Asi, nuestros resultados demuestran que el trasplante de celulas satelite distroficas sobreexpresando Pitx2 en ratones DMDmdx conduce a:
- Un aumento en el numero de miofibras formadas “de novo” (Figura 4A);
- Reprime la expresion de miR- 31 produciendo una restauracion de la distrofina (Figura 4B)
- Produciendo finalmente una mejora funcional del musculo muy significativa (Figura 4C).
Por lo tanto, estos analisis nos llevan a identificar a miR- 31 como un miRNA regulado por Pitx2 durante la regeneracion muscular . Ademas , tambien hemos obtenido evidencias adicionales que muestra que la via de Pitx2-miRNAs controlando la proliferation celular esta tambien presente en nuestro modelo de trasplante celular “in vivo” en ratones DMDmdx (Figuras 4D-F). En conjunto, estos resultados colocan a Pitx2 como molecula reguladora de diferentes miRNAs que desempenan un papel fundamental en los circuitos moleculares que controlan la proliferacion y/o diferenciacion de las celulas satelite. Revelando el importante
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papel de Pitx2 en la biologia celular de las celulas satelite del musculo esqueletico e identificando funciones desconocidas de Pitx2 modulando la miogenesis regenerativa en el musculo distrofico.
Ejemplo 2. Exposicion detallada de los resultados de la invencion.
En primer lugar, tal y como se muestra en la figura 2, apartados A) y B), la transfeccion con el vector lentiviral bicistronico LVX-Pitx2c-ZSGreen resulto en la sobreexpresion de Pitx2 en celulas satelite de raton. Adicionalmente, esta sobreexpresion, ver figura 2 apartado C), resulto en una expresion disminuida de los miRNAs: miR-15b, miR-106b, miR-23b y miR- 503 (qRT-PCR), tanto en las celulas en estadios tempranos de activavion (EPq) como en estadios mas avanzados de activation (EPa) (qRT-PCR).
Por otro lado, tal y como se muestra en la figura 2 D), la transfeccion con el vector lentiviral bicistronico LVX-Pitx2c-ZSGreen conduce a una aumento de la expresion de los genes de control de ciclo celular ciclina D1 y ciclina D2 (qRT-PCR) indicando que, de forma similar a lo que ocurre en mioblastos, la via Pitx2-miRNAs controla proliferation en celulas satelite.
En segundo lugar, tal y como se ilustra en la figura 3 A), la expresion de Myf5 (qRT-PCR) aumenta en las celulas satelite que sobreexpresan Pitx2, es mas, la cuantificacion por inmunohistoqtimica, ver figura 3 apartado B), muestra un aumento significativo de las celulas Myf5+. Por otro lado, de acuerdo a la figura 3 apartado C), la sobreexpresion del miR-106b conduce a una disminucion de la expresion de Myf5 validandolo como target de este miRNA. Mas aun, se hicieron varios experimentos para calcular la actividad normalizada de la luciferasa del 3’-UTR Myf5 luciferasa reporter (WT Myf5 3’-UTR) transfectando con el plasmido vado (Vector) o co-transfectando con pre-miR-106b. Tal y como se muestra en la figura 3 apartado D, unicamente co-transfectando con WT pre-miR- 106b se produce una represion de la expresion de Myf5 por miR-106b demostrando, por tanto, que Myf5 es un target directo para el miR-106b.. De hecho, no hay perdida de la actividad luciferasa cuando la miR-106b "seed sequence” fue mutada, demostrando asi la especifidad de union del miR-106b a estas "seed sequence” del 3’UTR de Myf5 (ver figura 3 apartado D))
En tercer lugar, tal y como se muestra en la figura 4 apartado A), el analisis mediante qRT- PCR muestra la sobreexpresion de Pitx2c en los musculos de ratones MDX inyectados con celulas satelite distroficas transfectadas con el vector lentiviral LVX- Pitx2c-ZS-Green vector
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en comparacion con los musculo inyectados con celulas transfectadas con el lentivirus vado (LVX-ZS-Green vector); porcentaje de fibras formadas “de novo” (ZS-Green + cells) en los musculos trasplantados despues de 15 dias e imagen representativa. Por otro lado, la figura 4 apartado B), muestra como la disminucion de la expresion de miR-31 en los musculos 5 trasplantados con celulas que sobre-expresan Pitx2 conduce a un aumento en los niveles de expresion de distrofina asi como a un aumento significativo de las fibras que expresan distrofina. Adicionalmente, los autores de la presente invencion llevaron a cabo un Treadmill test, ver figura 4 apartado C), donde se muestra la mejora funcional de ratones DMDmdx injectados con celulas que sobreexpresan Pitx2. Por ultimo, la figura 4 apartado F, muestra 10 como los niveles de expresion de las ciclinas D1 y D2 asi como del factor de transcripcion Myf5 estaban aumentados en los musculos trasplantados con celulas que sobreexpresan Pitx2 indicando que la cascada molecular Pitx2-miRNAS esta conservada en el sistema de trasplante “in vivo”.
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Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Uso de una composition que comprende un compuesto polinucleotidico de ADN que a su vez comprende una secuencia que consiste en la secuencia polinucleotidica SEQ ID NO 1 o su secuencia complementaria, para la elaboration de un medicamento para promover la regeneration muscular.
  2. 2. El uso de la composicion de la reivindicacion 1, donde dicho medicamento se usa para promover la regeneracion muscular en el tratamiento de una distrofinopatia.
  3. 3. El uso segun la reivindicacion 2, donde dicha distrofinopatia se selecciona de la lista que consiste en la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker.
  4. 4. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho compuesto es un vector o plasmido capaz de transportar o suministrar dicha secuencia de polinucleotidos a las celulas madre satelite de musculo ex vivo.
  5. 5. El uso segun la reivindicacion 4, en el que dicho vector es un vector viral que codifica para la secuencia de polinucleotidos definida en la reivindicacion 1.
  6. 6. El uso segun la reivindicacion 5, en el que dicho vector es un vector viral seleccionado de la lista que consiste en vectores adenovirales, lentivirales, retrovirales y adenoasociados.
  7. 7. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho medicamento comprende celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano o animal tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto definido en la reivindicacion 1.
  8. 8. El uso segun la reivindicacion 7, donde dichas celulas tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto definido en la reivindicacion 1, son celulas de origen autologo.
    5
    10
    15
    20
    25
  9. 9. El uso segun la reivindicacion 7 o 8, donde dichas celulas transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto definido en la reivindicacion 1, son celulas madre satelite de musculo de un sujeto humano que padece una distrofinopatia.
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