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ES2573669T3 - Agente profiláctico o terapéutico para la diabetes - Google Patents

Agente profiláctico o terapéutico para la diabetes Download PDF

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ES2573669T3
ES2573669T3 ES11803673.0T ES11803673T ES2573669T3 ES 2573669 T3 ES2573669 T3 ES 2573669T3 ES 11803673 T ES11803673 T ES 11803673T ES 2573669 T3 ES2573669 T3 ES 2573669T3
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ES
Spain
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polynucleotide
base sequence
cells
diabetes
mir
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ES11803673.0T
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Rie Kunisada
Hirokazu Matsumoto
Hidefumi Uchiyama
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

Un agente para usar en la profilaxis o tratamiento de la diabetes, que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homología no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada en las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o un polinucleótido que comprende una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases, o una de sus sales.

Description

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DESCRIPCION
Agente profilactico o terapeutico para la diabetes Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un nuevo agente para la profilaxis o el tratamiento de la diabetes. Mas en particular, la presente invencion se refiere a un agente terapeutico para la diabetes, que contiene un polinucleotido tal como microARN (en lo sucesivo denominado a veces "miARN") y similares, y similares.
Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo de cribado de un farmaco terapeutico para la diabetes y similares, un metodo para determinar la susceptibilidad de pacientes con diabetes a un farmaco terapeutico para la diabetes y similares, y similares.
Antecedentes de la invencion
La diabetes es una de las cinco enfermedades principales en los pafses avanzados, y su influencia esta creciendo anualmente tambien en otros pafses. Se sabe que las celulas p pancreaticas encargadas del control de glucosa en la sangre gestionan el aumento en la cantidad de insulina necesaria en el cuerpo debido a la obesidad, embarazo, diabetes y similares, aumentando la masa celular por hipertrofia, neogenesis, crecimiento y supresion de apoptosis. Puesto que el farmaco terapeutico actual para la diabetes es principalmente una terapia sintomatica para controlar el nivel de glucosa en la sangre, es diffcil curar la diabetes completamente una vez que se ha desarrollado. Con dichos antecedentes, se espera el desarrollo de un farmaco terapeutico para la diabetes, que tenga un efecto de aceleracion de la proliferacion de celulas p pancreaticas como accion principal y se dirija a la cura completa de la diabetes.
En anos recientes, se ha sugerido que varios miARN se expresan en celulas animales y tienen funciones biologicamente importantes. Por ejemplo, se ha descrito que miR-375 suprime la cantidad de insulina secretada de las celulas p pancreaticas de una forma dependiente de glucosa (documento de no patente 1).
Como otro ejemplo, el documento de no patente 2 describe que miRNA-34a y miRNA-146 son regulados por aumento en celulas beta pancreaticas como resultado de cantidades mayores de acidos grasos libres en la dieta. Se describe ademas que ambos genes diana de los miARN implicados en la muerte de celulas beta pancreaticas (apoptosis) y que un aumento de su presencia que resulta de un exceso de acidos grasos libres conduce a una mayor cantidad de apoptosis de celulas beta.
Como para el miR-199b*, hay informes que han documentado que el nivel de expresion de miR-199b-prec disminuye en un tejido de cancer de pulmon (documento de no patente 3), miR-199b-5p funciona como un factor regulador de la senal Notch por la regulacion de la expresion de HES1 en una lmea celular de mieloma (documento de no patente 4), el nivel de expresion de miR-199b disminuye durante la diferenciacion de celulas HL-60 de leucemia humana por el 4-hidroxinonenal (documento de no patente 5), mmu-miR-199b es expresado en celulas de piel de cabra (documento de no patente 6), el nivel de expresion de miR-199b es significativamente bajo en celulas ciliadas de cancer humano comparado con celulas normales (documento de no patente 7) y similares. Ademas, se ha descrito un metodo de diagnostico de cancer de mama usando miR-199b (documento de patente 1), un metodo de diagnostico de cancer de pulmon usando miR-199b-prec (documento de patente 2), un metodo terapeutico de cancer usando hsa-mir-199a (documento de patente 3) y similares.
Lista de documentos
Documentos de patente
documento de patente 1: WO2007/081740
documento de patente 2: WO2007/081720
documento de patente 3: WO2009/099465
Documentos de no patente
documento de no patente 1: Nature, 2004, 432, pag. 226-230 documento de no patente 2: Diabetes, 2008, 57, pag. 2728-36 documento de no patente 3: Cancer Cell, 2006, 9, pag.189-198 documento de no patente 4: PLoS ONE, 2009, 4, e4998
documento de no patente 5: Free Radical Biology & Medicine, 2009, 46, pag. 282-288 documento de no patente 6: OMICS: A Journal of Integrative Biology, 2007, 11, pag. 385-396
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documento de no patente 7: Cancer Letters, 2010, 291, pag. 99-107 Compendio de la invencion Problemas a resolver por la invencion
Un objeto de la presente invencion es proporcionar un medio nuevo para la profilaxis o tratamiento de la diabetes, que tiene efecto de aceleracion de la proliferacion de celulas p pancreaticas como una accion principal. Ademas, otro objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo de diagnostico muy conveniente y preciso para la susceptibilidad a un agente profilactico o terapeutico para la diabetes.
Medios de resolver los problemas
Los autores de la presente invencion han realizado un analisis de expresion completo en un tejido de pancreas de un modelo de pancreatectoirna parcial de notable aceleracion de la proliferacion de todas las celulas pancreaticas, incluyendo las celulas p pancreaticas, del cuerpo, y ademas han examinado el efecto de aceleracion de la proliferacion de miARN para las celulas p pancreaticas en el sistema de evaluacion de proliferacion de celulas p pancreaticas in vivo, usando celulas de islotes de cultivo primario, y encontraron que miR-199b* inesperadamente tiene una actividad de aceleracion de la proliferacion de celulas p pancreaticas. Basandose en estos descubrimientos, los autores de la presente invencion han llevado a cabo estudios adicionales y han completado la presente invencion.
Por consiguiente, la presente invencion se refiere a lo siguiente.
[1] Un agente para la profilaxis o tratamiento de la diabetes, que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada en las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o un polinucleotido que comprende una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases, o una sal de los mismos.
[1A] Un metodo como se describe en la reivindicacion 5.
Se describe ademas [2], un agente para la proliferacion de celulas p pancreaticas, que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no inferior al 90% con la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o un polinucleotido que comprende una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases, o una sal de los mismos.
[3] Un metodo para la profilaxis o tratamiento de la diabetes en un mamffero, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o un polinucleotido que comprende una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases, o una sal de los mismos, a dicho mamffero.
[4] Un metodo para la proliferacion de celulas p pancreaticas en un mamffero, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o un polinucleotido que comprende una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases, o una sal de los mismos, a dicho mamffero.
[5] Uso de un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o un polinucleotido que comprende una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases, o una sal de los mismos, para la produccion de un agente para la profilaxis o tratamiento de la diabetes.
[6] Uso de un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o un polinucleotido que comprende una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases, o una sal de los mismos, para la produccion de un agente para la proliferacion de celulas p pancreaticas.
[7] Un metodo de cribado de un farmaco para la profilaxis o tratamiento de la diabetes, que comprende medir un nivel de expresion de un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.
[8] Un metodo de cribado de una sustancia que hace proliferar las celulas p pancreaticas, que comprende medir un nivel de expresion de un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4.
[9] Un metodo para determinar la susceptibilidad de un paciente con diabetes a un farmaco para la profilaxis o tratamiento de la diabetes, que comprende medir un nivel de expresion de un polinucleotido que comprende una
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secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.
[10] Un metodo para determinar la susceptibilidad de un paciente con diabetes a un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas, que comprende medir un nivel de expresion de un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.
Efecto de la invencion
Puesto que el polinucleotido de la presente invencion acelera la proliferacion de celulas p pancreaticas, tiene un efecto profilactico o terapeutico para enfermedades tales como la diabetes, y similares. Ademas, usando la expresion del polinucleotido de la presente invencion como un mdice, se puede llevar a cabo el cribado de un agente profilactico o terapeutico para la diabetes, y la determinacion de la susceptibilidad a un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra los niveles de expresion relativos de miR-199b* maduro en celulas de islotes de cultivo primario de ratas transfectadas con el precursor de miARN Pre-miR que expresa mmu-miR-199b*. Para el tratamiento estadfstico, se uso la prueba de Williams parametrica (# indica significativo).
La figura 2 muestra el aumento de numero de celulas positivas para insulina y positivas para BrdU, y el numero de celulas positivas para insulina en celulas de islotes de cultivos primarios de rata transfectadas con precursor de miARN Pre-miR que expresa mmu-miR-199b*. Para el tratamiento estadfstico relacionado con la dependencia a la concentracion, se uso la prueba de Williams parametrica (# indica significativo), y para el tratamiento estadfstico de otros items, se uso la prueba t (* muestra 0,01<P<0,05, ** muestra P<0,01).
La figura 3 muestra el aumento del numero de celulas positivas para insulina y positivas para BrdU en celulas de islotes de cultivo primario de rata transfectadas con precursor de miARN Pre-miR que expresa hsa-miR-199a-3p, precursor de miARN Pre-miR que expresa hsa-miR-199a-Sp o precursor de miARN Pre-miR que expresa hsa-miR- 199b-5p. Para el tratamiento estadfstico relacionado con la dependencia a la concentracion, se uso la prueba de Williams parametrica (# indica significativo), y para el tratamiento estadfstico de otros items, se uso la prueba t (* muestra 0,01<P<0,05, ** muestra P<0,01).
La figura 4 muestra el aumento de expresion de los genes de ciclina D1 y ciclina E2 en celulas de islotes de cultivo primario transfectadas con precursor de miARN Pre-miR que expresa mmu-miR-199b*. Para el tratamiento estadfstico, se uso la prueba de Williams parametrica (# indica significativo).
Descripcion detallada de la invencion
En la presente memoria descriptiva, miARN se refiere a un transcrito de ARN no procesado (p. ej., precursor) o procesado (p. ej., maduro) producido a partir del gen de miARN. El transcrito de ARN no procesado mencionado antes tambien se indica como "miARN zenku-tai" o "precursor de miARN", y en general esta constituido por aproximadamente 70-100 bases. El precursor de miARN es procesado en una molecula de ARN activa que tiene 1925 bases por digestion con ribonucleasa (p. ej., Dicer), Argonaut, o ribonucleasa III (p. ej., ribonucleasa III de Escherichia coli). En la presente memoria descriptiva, la molecula de ARN activa que tiene 19-25 bases se denomina "miARN maduro". La actividad del miARN maduro se refiere a una actividad para unirse a un ARNm diana que tiene una secuencia complementaria del miARN maduro, y produce escision del ARNm diana.
El polinucleotido para usar en la presente invencion (en la presente memoria descriptiva, a veces se denomina "el polinucleotido de la presente invencion"), o una de sus sales, contiene al menos una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en lo siguiente (A)-(C):
(A) la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4;
(B) una secuencia de bases que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4; y
(C) una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases del apartado (A) o (B) mencionados antes.
En la presente memoria descriptiva, salvo que se especifique en particular, la secuencia de bases del polinucleotido se describe como una secuencia de cualquiera de aDn y ARN, pero se puede considerar la sustitucion entre sf de la timina (T) y uracilo (U) en posiciones opcionales. Ademas, cuando el polinucleotido es ADN, no es necesario decir que cualquier uracilo (U) se sustituye por timina (T), y cuando el polinucleotido es ARN, todas las timinas (T) se sustituyen por uracilo (U).
En el apartado (A) mencionado antes, la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 1 es una secuencia de bases de mmu-miR-199b* (tambien denominada mmu-miR-199b-5p). La secuencia de bases mostrada en la SEQ ID
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NO: 2 es mmu-miR-199b (tambien denominada mmu-miR-199b-3p), que es la misma secuencia de bases de hsa- miR-199b-3p, mmu-miR-199a-3p, hsa-miR-199a-3p y rno-miR-199a-3p. La secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 3 es una secuencia de bases de mmu-miR-199a-5p, hsa-miR-199a-5p y rno-miR-199a-5p. La secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 4 es una secuencia de bases de hsa-miR-199b-5p.
La secuencia de bases del apartado (B) mencionado antes tiene una homologfa no menor de 90%, preferiblemente no menor que 95% (es decir, identidad) con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.
Como se usa en la presente memoria, "homologfa" significa la proporcion (%) de las mismas bases respecto a todas las bases que se solapan en el alineamiento optimo, donde se alinean dos secuencias de bases usando un algoritmo matematico conocido en el campo tecnico relevante (el algoritmo es tal que se puede introducir un hueco en una o ambas secuencias para el alineamiento optimo). La homologfa de la secuencia de bases en la presente memoria descriptiva se puede calcular, por ejemplo, usando un algoritmo de calculo de homologfa NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) en las siguientes condiciones (valor esperado=10; permitir hueco; filtracion=ON; puntuacion de correspondencia=1; puntuacion de correspondencia erronea=-3). Otros algoritmos para determinar la homologfa de una secuencia de bases incluyen, por ejemplo, el algoritmo descrito en Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) [dicho algoritmo esta incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 33893402 (1997))], el algoritmo descrito en Needleman et al., J. Mol. Bio., 48: 444-453 (1970) [dicho algoritmo esta incorporado en el programa GAP en el paquete de programas GCG], el algoritmo descrito en Myers y Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988) [dicho algoritmo esta incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), que es parte del paquete de programas de alineamiento de secuencias CGC], el algoritmo descrito en Pearson et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988) [dicho algoritmo esta incorporado en el programa FASTA en el paquete de programas de GCG] y similares, y tambien se pueden usar preferiblemente de la misma forma.
La secuencia de bases del apartado (B) mencionado antes abarca la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, excepto que se eliminan, sustituyen, anaden o insertan 1 o 2 bases. Los ejemplos de dichas secuencias de bases incluyen (i) la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, excepto que se eliminan 1 o 2 bases, (ii) la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, excepto que se anaden 1 o 2 bases, (iii) la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, excepto que se insertan 1 o 2 bases, (iv) la secuencia de bases mostrada por las sEq ID NO: 1, 2, 3 o 4, excepto que se sustituyen 1 o 2 bases por otra base, y (v) las secuencias de bases en donde dichas mutaciones estan combinadas (con la condicion de que el numero total de bases eliminadas, sustituidas, anadidas o insertadas sea 2).
Cuando las secuencias de bases contienen mutaciones (eliminacion, sustitucion, adicion o insercion), como se ha mencionado antes, no hay restricciones en relacion con las posiciones de las mutaciones.
La secuencia de bases del apartado (C) mencionado antes, es completamente complementaria de la secuencia de bases de los apartados (A) o (B) mencionados antes.
El polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, tiene una actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas. Los ejemplos de las celulas p pancreaticas mencionadas antes incluyen celulas p pancreaticas de mairnferos (p. ej., ser humano, mono, raton, rata, conejo, cerdo).
La actividad del polinucleotido para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas se puede medir de acuerdo con el metodo descrito en los ejemplos mencionados mas adelante. Por ejemplo, las celulas de islotes de cultivo primario de rata, se transfectan con un polinucleotido diana de evaluacion en una concentracion final de 2,5-50 nM usando DharmaFECT1 (Thermo Scientific) y similares, y se compara el numero de celulas p pancreaticas el dfa 5 desde la transfeccion entre el grupo transfectado con el polinucleotido diana de evaluacion y el grupo de control negativo (grupo transfectado con miARN desordenado o grupo sin transfeccion con el polinucleotido diana de evaluacion).
Por ejemplo, una actividad para aumentar el numero de celulas p pancreaticas en 10% o mas comparado con el control negativo, se puede definir como "una actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas".
Aunque la longitud del polinucleotido de la presente invencion no esta particularmente limitada siempre que tenga una actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas de marnffero, desde los aspectos de facilidad de smtesis, en general tiene no mas de 200 pb, preferiblemente no mas de 100 pb, mas preferiblemente no mas de 80 bp.
Los ejemplos preferibles del polinucleotido de la presente invencion incluyen polinucleotidos que contienen la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4.
Los ejemplos mas preferibles del polinucleotido de la presente invencion incluyen polinucleotidos que consisten en la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4.
El polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, puede ser un polinucleotido que contiene 2-desoxi-D- ribosa, un polinucleotido que contiene D-ribosa, un polinucleotido que contiene N-glucosido de base purica o base
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pirimidmica, un polinucleotido que contiene cadena principal no nucleotidica (p. ej., poKmero de acido nucleico de protema disponible en el comercio y acido nucleico espedfico de secuencia sintetico) u otro polfmero que contiene un enlace especial (con la condicion de que el polfmero contiene un nucleotido que tiene una configuracion que permite el emparejamiento de bases y la union de bases, como se muestra en el ADN y ARN), y similares. Estos pueden ser ADN bicatenarios, ADN monocatenarios, ARN bicatenarios, ARN monocatenarios, o Idbridos de ADN:ARN, y tambien pueden ser polinucleotidos no modificados (u oligonucleotidos no modificados); los polinucleotidos con modificaciones conocidas, por ejemplo, aquellos con marcadores conocidos en la tecnica, aquellos con remates, aquellos metilados, aquellos con sustitucion de uno o mas nucleotidos naturales por su analogo, aquellos con modificaciones intramoleculares de nucleotidos tales como aquellos con enlaces sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriesteres, fosforamiditas, carbamatos y similares) y aquellos con enlaces cargados o enlaces que contienen azufre (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos y similares); aquellos que tienen grupos en cadenas laterales tales como protemas (nucleasas, inhibidores de nucleasas, toxinas, anticuerpos, peptidos senal, poli-L-lisina y similares) o sacaridos (por ejemplo, monosacaridos y similares); aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno y similares); aquellos con queladores (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes y similares); aquellos con agentes alquilantes; o aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, acidos nucleicos a anomeros y similares). Como se usa en el presente documento, "nucleotido" y "acido nucleico" puede comprender no solo las bases puricas y pirimidmicas, sino tambien otras bases heterodclicas modificadas. Los ejemplos de otras bases heterodclicas modificadas incluyen base purica y base pirimidmica metilada, y base purica y base pirimidmica acilada. El nucleotido de la presente invencion o un nucleosido que constituyen el nucleotido de la presente invencion puede tener un resto de azucar modificado. Los ejemplos de la modificacion del resto de azucar incluyen sustitucion por un atomo de halogeno, un grupo alifatico y similares, de un grupo hidroxilo en el resto azucar, y conversion en un grupo funcional, tal como eter, amina y similares, de un grupo hidroxilo en el resto azucar.
Para mejorar la estabilidad el polinucleotido de la presente invencion se puede modificar qmmicamente. Los ejemplos de dicha modificacion qmmica incluyen, (a) modificacion qmmica internucleosida en la cadena principal ((a-
1) modificacion qmmica de polinucleotido que tiene un atomo de fosforo internucleosido en la cadena principal y (a-
2) modificacion qmmica de polinucleotido que no tiene un atomo de fosforo internucleosido en la cadena principal), (b) modificacion qmmica del resto azucar, (c) modificacion del resto nucleobase, (d) modificacion por conjugacion con fragmentos dirigidos, (e) modificacion qmmica por un polinucleotido que constituye una region qmmicamente independiente, y (f) modificacion descrita en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, EE.UU.
Los ejemplos preferidos de la modificacion qmmica (a-1) mencionada antes del polinucleotido que tiene un atomo de fosforo internucleosido en la cadena principal incluyen fosforotioato, fosforotioato asimetrico, fosforoditioato, fosfotriester, aminoalquilfosfotriester, 3'-alquilenfosfonato, alquil(p. ej., metil)fosfonato que contiene fosfonato asimetrico, fosfinato, 3'-aminofosforamidato, fosforamidato, fosforamidato que contiene aminoalquil-fosforamidato, tionofosforamidato, tionoalquilfosfonato, tionoalquilfosfotriester, boranofosfato, sus analogos de enlace 2'-5', y modificacion en donde las parejas adyacentes de unidades de nucleosidos son de 3'-5' a 5'-3', o de 2'-5' a 5'-2'.
El polinucleotido (a-1) mencionado antes que tiene un atomo de fosforo internucleosido en la cadena principal, se puede producir por los metodos descritos, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050 y similares, o un metodo analogo a estos.
Los ejemplos preferidos de los polinucleotidos (a-2) mencionados antes que no tienen un atomo de fosforo internucleosido en la cadena principal, incluyen un polinucleotido que tiene una cadena principal formada por un enlace internucleosido de cadena de alquilo corta o cicloalquilo, enlace internucleosido en donde el heteroatomo y el alquilo o cicloalquilo se mezclan, o uno o mas heteroatomos en cadena corta o enlace internucleosido heterodclico. Estos incluyen aquellos que tienen un enlace morfolino (parcialmente formado a partir del resto azucar del nucleosido); cadena principal de siloxano; cadena principal de sulfuro, sulfoxido o sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; cadena principal que contiene alqueno; cadena principal de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadena principal de amida; y cadena principal que contiene una parte mixta de componentes N, O, S y CH2.
El polinucleotido (a-2) mencionado antes que no tiene un atomo de fosforo internucleosido en la cadena principal, se puede producir, por ejemplo, por el metodo descrito en las patentes de EE.UU. n° 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.677.439 y similares, o un metodo analogo al mismo.
Los ejemplos de la modificacion qmmica (b) mencionada antes del resto azucar, incluyen la modificacion qmmica de sustitucion en la posicion 2' con un sustituyente seleccionado del siguiente grupo A.
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Grupo A: OH; F; O- S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-[(alquilen)n-O]n-alquilo, en donde el alquilo, alquileno, alquenilo y alquinilo pueden estar sustituidos o no sustituidos con alquilo C1 a C10, alquileno C1 a C10, o alquenilo y alquinilo C2 a C10. Se prefieren en particular O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, y O(CH2)nO(CH2)mNH2, donde n y m son de 1 a 10 (preferiblemente de 1 a 3) y NH2 puede estar mono o disustituido con alquilo C1 a C6 (p. ej., metilo). La modificacion qmmica particularmente preferida incluye metoxietoxi (-O-CH2CH2OCH3 tambien conocido como -MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486504), dimetilaminooxietoxi (grupo -O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como -DMAOE), y dimetilaminoetoxietoxi (-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N (CH3)2, tambien conocido como 2'-DMAEOE).
Otros ejemplos de la modificacion qmmica (b) mencionada antes del resto azucar, incluyen la modificacion qmmica de sustitucion en la posicion 2' con un sustituyente seleccionado del siguiente grupo B.
Grupo B: (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alquilarilo, aralquilo, O-alquilarilo o O-aralquilo) C1 a C10 , SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3), ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalquilarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escision de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas del polinucleotido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas del polinucleotido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares.
Otros ejemplos de la modificacion qmmica (b) mencionada antes del resto azucar, incluyen la modificacion qmmica de sustitucion en la posicion 2' con metoxi, aminopropoxi o fluoro. Otros ejemplos de la modificacion qmmica del resto azucar incluyen la modificacion qmmica de sustitucion en la posicion 3' del azucar en el nucleotido 3' terminal o azucar en la union 2'-5' del polinucleotido y posicion 5' del nucleotido 5' terminal con metoxi, aminopropoxi o fluoro, y modificacion de sustitucion del azucar pentofuranosilo por un mimetico del azucar tal como resto ciclobutilo.
Los ejemplos de modificacion qmmica de otro resto azucar incluyen la modificacion para bloquear un resto azucar como se describe en la patente de EE.UU. n° 6.770.748.
Los ejemplos de modificacion qmmica de otro resto azucar incluyen la modificacion de reticulacion de un resto azucar como se describe en los documentos US7217805, WO2003/068795, WO2005/021570, US7569686, WO2009/100320, WO2007/146511, WO2007/142315, WO2007/134181 y WO2007/090071.
Un polinucleotido que tiene la modificacion qmmica mencionada antes del resto azucar se puede producir, por ejemplo, de acuerdo con el metodo descrito en las patentes de EE.UU. n° 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.700.920 y similares, o un metodo analogo al mismo.
Los ejemplos de la modificacion (c) mencionada antes del resto nucleobase incluyen 5-metilcitosina (5-me-C), 5- hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de alquilo (p. ej., derivados de 6-metilo) de adenina y guanina, derivados de alquilo (p. ej., derivados de 2-propilo) de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halogenouracilo y citosina, 5-propinil-uracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, adeninas y guaninas sustituidas en 8 (p. ej., 8-halogeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8- hidroxilo), uracilos y citosinas sustituidos en 5 (p. ej., 5-halogeno, 5-bromo, 5-trifluorometilo), 7-metilguanina y 7- metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3- desazaadenina, nucleobases descritas en la patente de EE.UU. n° 3.687.808, nucleobases descritas en The Concise Enciclopedia Of Polymer Science And Engineering, paginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, nucleobases descrito por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y nucleobases descritas por Sanghvi, Y S., Capttulo 15, Antisense Research and Applications, paginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993.
Algunos de estas nucleobases son particularmente utiles para aumentar la afinidad de union del nucleotido de la invencion o sal del mismo y un ARNm diana.
El polinucleotido (c) mencionado antes que tiene modificacion del resto nucleobase, se puede producir, por ejemplo, de acuerdo con el metodo descrito en las patentes de EE.UU. n° 3.687.808, 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066: 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.750.692 y similares, o un metodo analogo al mismo.
Los ejemplos de los fragmentos directores usados para la modificacion (d) anterior por conjugacion con fragmentos directores incluyen restos de lfpidos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 199, 86, 6553-6556), acido colico (Manobaram et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994 4 1053-1060), un tioeter, p. ej., beril-S-tritiltiol (Manobaran et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifatica, p. ej., restos dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolfpido, p. ej., di-hexadecil- rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o acido adamantano-acetico
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(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys, Acta, 1995, 1264, 229-237), o un resto octadecilamina o hexilaminocarboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther, 1996, 277, 923-937).
Por aplicacion de la modificacion (d) mencionada antes por conjugacion con fragmentos directores del polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se puede promocionar la actividad del polinucleotido, y la distribucion intracelular o incorporacion intracelular.
El polinucleotido que tiene la modificacion (d) mencionada antes por conjugacion con fragmentos directores se puede producir, por ejemplo, de acuerdo con el metodo descrito en las patentes de EE.UU. n° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802;
5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779;
4.789.737; 4.824.941;4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241;
5.391.723; 5.416.203; 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481;
5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928; 5.688.941 y similares, o un metodo analogo al mismo.
Cuando el polinucleotido de la presente invencion o una sal del mismo se modifica qmmicamente, no es necesario que todos los nucleosidos que constituyen el nucleotido de la presente invencion o una de sus sales, esten uniformemente modificados, y de hecho las modificaciones mencionadas antes se pueden incorporar en uno o mas nucleotidos o nucleosidos dentro del nucleotido de la invencion o nucleosidos que constituyen dicho nucleotido
El polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se puede someter simultaneamente a 2 o mas clases de modificaciones qmmicas.
Por ejemplo, el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, puede contener, como los compuestos PNA (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500), modificacion qmmica tanto en el resto azucar como internucleosida en la cadena principal, y el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, que tiene dicha modificacion muestra propiedad superior de union al ARNm diana. Un polinucleotido que contiene la modificacion qmmica tanto en el resto azucar como internucleosida en la cadena principal, se puede producir, por ejemplo, de acuerdo con el metodo descrito en las patentes de EE.UU. n° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262, o un metodo analogo al mismo.
El polinucleotido de la presente invencion preferiblemente es un ARN monocatenario o bicatenario (ARN modificado o no modificado).
El polinucleotido de la presente invencion puede formar una sal con una base inorganica, una base organica, un acido inorganico, un acido organico, y similares. Los ejemplos de las sales mencionadas antes con base inorganica incluyen metales alcalinos tales como sal de sodio, sal de potasio; sales de metales alcalinoterreos tales como sal de calcio, sal de magnesio y similares; sal de aluminio, sal de amonio y similares. Los ejemplos de sales mencionadas antes con base organica incluyen sales con trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciclohexilamina, N,N'-dibenciletilendiamina. Los ejemplos de las sales mencionadas antes con acido inorganico incluyen sales de acido clortudrico, acido bromtudrico, acido mtrico, acido sulfurico, acido fosforico. Los ejemplos de las sales mencionadas antes con acido organico incluyen sales con acido formico, acido acetico, acido trifluoroacetico, acido fumarico, acido oxalico, acido tartarico, acido maleico, acido dtrico, acido sucdnico, acido malico, acido metanosulfonico, acido bencenosulfonico, acido p-toluenosulfonico. De estas sales, se prefiere una sal farmacologicamente aceptable.
Preferiblemente, cuando el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se introduce en celulas de mairnfero, produce directamente, o despues de ser escindido por RNasa espedfica de ARNbc tal como Drosha, Dicer y similar, contenida en las celulas, un ARN monocatenario activo que consiste en la secuencia de bases mencionadas antes en (A) o (B). La produccion de dichos ARN monocatenarios se puede confirmar, por ejemplo, preparando ADNc a partir de celulas usando el kit TaqMan MicroRNA Cells-to-Ct™ (Ambion) y similares, y sometiendo el ADNc a un metodo de RT-PCR cuantitativo usando ensayos de miARN de TaqMan (ABI) y similares.
El ARN monocatenario activo mencionado antes se puede obtener a partir de un precursor de miARN por una ruta de procesamiento natural (p. ej., usando lisado celular), o por una ruta de procesamiento de smtesis (p. ej., usando enzima de procesamiento aislada tal como Dicer, Argonaut, ribonucleasa III aisladas, y similares). Ademas, el ARN monocatenario activo mencionado antes tambien se puede producir de forma biologica o qmmica.
El polinucleotido de la presente invencion es mas preferiblemente un ARN monocatenario que contiene la secuencia de bases mencionada antes en (A) o (B), o un ARN bicatenario que contiene el ARN monocatenario como una cadena.
Realizaciones espedficas del polinucleotido de la presente invencion son como siguen:
(1) un ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mencionada antes en el apartado (A) o (B), o un ARN bicatenario que contiene el ARN monocatenario como una cadena;
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(2) un ARN bicatenario que contiene
un ARN monocatenario que contiene una primera secuencia de bases (una de las secuencias de bases mostradas por las SEQ ID NO: 1, 3 y 4, o una secuencia de bases que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases), y
un ARN monocatenario que contiene una segunda secuencia de bases (una de las secuencias de bases mostradas por las SEQ ID NO: 2 y una secuencia de bases que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases), en donde dichos dos ARN monocatenarios son hibridados;
(3) un ARN monocatenario que contiene la primera secuencia de bases mencionada antes y la segunda secuencia de bases mencionada antes, en donde la primera secuencia de bases y la segunda secuencia de bases estan unidas por una region de bucle en horquilla, y en la estructura de bucle en horquilla, la primera secuencia de bases forma de manera intramolecular una estructura de doble cadena con la segunda secuencia de bases.
Los ejemplos del ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases (A) o (B) en el apartado (1) mencionado antes, incluyen miR-199b maduro monocatenario y miR-199a maduro monocatenario de mairnferos. Los ejemplos preferibles del ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases (A) o (B) en el apartado (1) mencionado antes, incluyen
el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 1 (mmu-miR-199b* (tambien denominada mmu-miR-199b-5p)), ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 2 (mmu-miR-199b (tambien denominada mmu-miR-199b-3p, hsa-miR-199b-3p, mmu-miR-199a- 3p, hsa-miR-199a-3p o rno-miR-199a-3p)),
el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 3 (mmu-miR-199a-5p (tambien denominada hsa-miR-199a-5p o rno-miR-199a-5p)), y
el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 4 (hsa-miR-199b-5p).
El ARN bicatenario del apartado (2) mencionado antes contiene un ARN monocatenario que tiene una homologfa no menor de 90%, preferiblemente no menor de 95%, con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 3 o 4. El ARN bicatenario del apartado (2) mencionado antes contiene un ARN monocatenario que tiene una homologfa no menor de 90%, preferiblemente no menor de 95%, con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 2.
El ARN del apartado (2) mencionado antes es ARN que contiene de forma representativa miR-199b o miR-199a de un marnffero. Espedficamente, se pueden mencionar el ARN que contiene un ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 1 (mmu-miR-199b*) y un ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 2 (mmu-mik-199b),
el ARN que contiene un ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 4 (hsa-miR-199b-5p) y un ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 2 (mmu-miR-199b),
el ARN que contiene un ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 3 (mmu-miR-199a-5p) y un ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 2 (mmu-miR-199b), y similares.
En el apartado (3) mencionado antes, la longitud de la region de bucle en horquilla no esta particularmente limitada, siempre que el ARN tenga una actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas. En general tiene aproximadamente 5 - 25 bases. La secuencia de bases de la region de bucle en horquilla no esta particularmente limitada, siempre que pueda formar un bucle y el ARN tenga una actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas.
Como ARN del apartado (3) mencionado antes, se pueden mencionar de forma representativa el precursor del miARN y el transcrito primario de marnffero miR-199b o miR-199a, un ARN monocatenario que contiene una secuencia de bases de estos ARN y similares. Espedficamente, se pueden mencionar el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 5 (precursor mmu-miR-199b),
el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 6 (precursor hsa-miR- 199b),
el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8 (precursor mmu-miR-199a),
el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 (precursor hsa-miR-199a),
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el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 11 (transcrito primario de mmu-miR-199b),
el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 12 (transcrito primario de hsa-miR-199b),
el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14 (transcrito primario de mmu-miR-199a),
el ARN monocatenario que consiste en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO; 16 (transcrito primario de hsa-miR-199a),
el ARN monocatenario que contiene cualquiera de las secuencias de bases mostradas por las SEQ ID NO: 5 -16 y similares.
Los numeros de acceso en NCBI de los miARN mostrados por las SEQ ID NO: 1 a 10 son como se describen a continuacion.
mmu-miR-199b*: SEQ ID NO: 1 (MIMAT0000672) mmu-miR-199b: SEQ ID NO: 2 (MIMAT0004667) mmu-miR-199a-5p: SEQ ID NO: 3 (MIMAT0000229) hsa-miR-199b-5p: SEQ ID NO: 4 (MIMAT0000263) precursor de mmu-miR-199b: SEQ ID NO: 5 (MI0000714) precursor de hsa-miR-199b: SEQ ID NO: 6 (MI0000282) precursor de mmu-miR-199a: SEQ ID NO: 7 (MI0000241) precursor de mmu-miR-199a: SEQ ID NO: 8 (MI0000713) precursor de hsa-miR-199a: SEQ ID NO: 9 (MI0000242) precursor hsa-miR-199a: SEQ ID NO: 10 (MI0000281)
La secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 2 mencionada antes, tambien se denomina mmu-miR-199b-3p y es la misma que mmu-miR-199a-3p (n° de acceso en NCBI MIMAT0000230), hsa-miR-199a-3p (n° de acceso en NCBI MIMAT0000232) y hsa-miR-199b-3p (n° de acceso en NCBI MIMAT0004563).
La secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 3 mencionada antes es la misma que hsa-miR-199a-5p (n° de acceso en NCBI MIMAT0000231) y rno-miR-199a-5p.
El polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se puede sintetizar basandose en la informacion de secuencia descrita en la presente memoria descriptiva o base de datos conocida, y usando un sintetizador de ADN/ARN automatico disponible en el comercio (Applied Biosystems, Beckman, y similares). Ademas, los polinucleotidos bicatenarios se pueden preparar sintetizando por separado ambas cadenas usando un sintetizador de ADN/ARN automatico, y desnaturalizando las cadenas en una solucion de tampon de reasociacion adecuado, de aproximadamente 90°C a aproximadamente 95°C, y despues reasociando de aproximadamente 30°C a aproximadamente 70°C, durante aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas. Tambien se puede preparar un polinucleotido bicatenario mas largo sintetizando las cadenas de oligonucleotido complementarias de forma que se solapen entre sf, reasociando estas cadenas, y despues llevando a cabo el ligado con una ligasa.
Ademas, un vector de expresion para expresar el polinucleotido mencionado antes de la presente invencion (en lo sucesivo, a veces denominado "el vector de expresion de la presente invencion") tambien es una realizacion preferida del polinucleotido de la presente invencion. El vector de expresion de la presente invencion esta constituido de modo que el polinucleotido de la presente invencion mencionado antes puede ser expresado en celulas de mairnfero. El vector de expresion de la presente invencion se puede producir por ligamiento del polinucleotido de la presente invencion mencionado antes, o un ADN que codifica el mismo, en la direccion 3' del promotor en un vector de expresion adecuado.
Los ejemplos de vectores de expresion incluyen, pero no se limitan a plasmido derivado de Escherichia coli (p. ej., pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmido derivado de Bacillus subtilis (p. ej., pUB110, pTP5, pC194), plasmido derivado de levadura (p. ej., pSH19, pSH15), bacteriofago tal como fago A y similares, virus animales tales como retrovirus, virus vaccinia, baculovirus etc., y similares, asf como pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV y pcDNAI/Neo.
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El promotor puede ser cualquiera siempre que pueda funcionar en celulas de mairnfero. Los ejemplos de los promotores incluyen promotores pol II y promotores pol III. Los ejemplos de los promotores Pol III incluyen el promotor de U6, promotor de H1, promotor de rARN 5s, promotor de tARN, promotor de 7SL, promotor de 7SK, promotor de retrovirus LTR y promotor de adenovirus Val. De estos, se prefiere el promotor de U6, promotor de H1 o promotor de tARN. Los ejemplos de los promotores pol II incluyen promotor de insulina, promotor de citomegalovirus, promotor de T7, promotor de T3, promotor de SP6, promotor de RSV, promotor de EF-1a, promotor de p-actina, promotor de Y-globulina, y promotor de SRa. De estos se prefiere el promotor de insulina.
Como vectores de expresion, ademas de los anteriores, tambien estan los que albergan opcionalmente un potenciador, una senal de empalme, una senal de adicion de poliA, un marcador de seleccion un origen de replicacion de SV40 (en lo sucesivo abreviado tambien como SV40ori) y similares. Como ejemplos de los marcadores de seleccion, se pueden usar el gen de la dihidrofolato reductasa (en lo sucesivo abreviado tambien como dhfr) [resistencia a metotrexato (MTX)], el gen de resistencia a la ampicilina (en lo sucesivo abreviado tambien como Ampr), el gen de resistencia a la neomicina (en lo sucesivo abreviado tambien como Neor, resistencia a G418) y similares.
El polinucleotido mencionado antes de la presente invencion, o una de sus sales tiene, por ejemplo, los siguientes usos.
<1> uso como un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes,
<2> uso como un agente para la proliferacion de celulas p pancreaticas,
<3> uso para el cribado de un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes, y similares,
<4> uso para determinar la susceptibilidad a un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes y similar.
<1> Uso como un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes
Como se muestra en los ejemplos mencionados mas adelante, el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, tiene una actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas. Dicho hecho, muestra que la administracion del polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, a pacientes con diabetes y similares, puede acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas en dichos pacientes, y puede prevenir o tratar enfermedades tales como la diabetes y similares, y el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, es util como un medicamento.
Por lo tanto, el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se puede usar como un medicamento, tal como un agente para la profilaxis o tratamiento de la diabetes (p. ej., diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, diabetes gestacional, diabetes por obesidad); un agente para la profilaxis o tratamiento de la tolerancia alterada a la glucosa (TAG); un agente para prevenir el avance de la tolerancia alterada a la glucosa a la diabetes, y similares.
El polinucleotido de la presente invencion o una de sus sales, se dirige a genes tales como MLK3, FGF7, Ptprf, RB1 y Serpine2 (en particular, MLK3 yFGF7), y se considera que posiblemente acelera la proliferacion de celulas p pancreaticas suprimiendo la expresion de estos genes, y previene o trata enfermedades tales como la diabetes y similares. Por lo tanto, un inhibidor de MLK3, FGF7, Ptprf, RB1 y Serpine2 (en particular, MLK3 y FGF7) (p. ej., compuesto de bajo peso molecular, anticuerpo neutralizante, ARNip, acido nucleico de sentido contrario) tambien se puede usar como un medicamento tal como un agente para la profilaxis o tratamiento de la diabetes (p. ej., diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, diabetes gestacional, diabetes por obesidad); un agente para la profilaxis o tratamiento de la tolerancia alterada a la glucosa (TAG); un agente para suprimir el avance de la tolerancia alterada a la glucosa a la diabetes, y similares.
Como criterios de diagnostico de la diabetes, de acuerdo con una publicacion de la Sociedad Japonesa de Diabetes, la diabetes mellitus es una afeccion en donde el nivel de glucosa en la sangre en ayunas (concentracion de glucosa en plasma venoso) no es menor que 126 mg/dl, el valor a las 2 horas (concentracion de glucosa en plasma venoso) de la prueba de tolerancia a la glucosa oral de 75 g (PTGO 75 g) no es menor que 200 mg/dl o el nivel de glucosa en la sangre ocasional (concentracion de glucosa en plasma venoso) no es menor que 200 mg/dl. Ademas, una afeccion que no esta dentro del alcance de la definicion anterior de diabetes mellitus, y que no es una "afeccion en donde el nivel de glucosa en la sangre en ayunas (concentracion de glucosa en plasma venoso) es menor que 110 mg/dl o el valor a las 2 horas (concentracion de glucosa en plasma venoso) de la prueba de tolerancia a la glucosa oral de 75 g (PTGO 75 g) es menor que 140 mg/dl" (tipo normal), se llama "tipo lfmite".
De acuerdo con publicaciones de ADA y la OMS, la diabetes mellitus es una afeccion donde el nivel de glucosa en la sangre en ayunas (concentracion de glucosa en plasma venoso) no es menor que 126 mg/dl, y el valor a las 2 horas (concentracion de glucosa en plasma venoso) de la prueba de tolerancia a la glucosa oral de 75 g no es menor que 200 mg/dl.
Ademas, de acuerdo con las publicaciones anteriores de ADA y la OMS, la tolerancia alterada a la glucosa es una afeccion donde el valor a las 2 horas (concentracion de glucosa en plasma venoso) de la prueba de tolerancia a la
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glucosa oral de 75 g no es menor que 140 mg/dl, y es menor que 200 mg/dl. Ademas, de acuerdo con la publicacion de ADA, una afeccion donde el nivel de glucosa en la sangre en ayunas (concentracion de glucosa en plasma venoso) no es menor que 100 mg/dl y es menor que 126 mg/dl, se llama GAA (Glucosa alterada en ayunas). Por otra parte, de acuerdo con la publicacion de la OMS, una afeccion de GAA (glucosa alterada en ayunas) como tal, donde el nivel de glucosa en la sangre en ayunas (concentracion de glucosa en plasma venoso) no es menor que 110 mg/dl y es menor que 126 mg/dl, se llama GAA (Glucemia alterada en ayunas).
El polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, tambien se usa como un agente para la profilaxis o tratamiento de la diabetes determinada por los criterios de diagnostico mencionados antes, tipo lfmite, tolerancia alterada a la glucosa, GAA (glucosa alterada en ayunas) y GAA (glucemia alterada en ayunas). Ademas, el compuesto de la presente invencion puede prevenir el avance del tipo lfmite, tolerancia alterada a la glucosa, GAA (glucosa alterada en ayunas) y GAA (glucemia alterada en ayunas).
El polinucleotido de la presente invencion o una de sus sales, tambien se puede usar, por ejemplo, como un agente para la profilaxis o el tratamiento de complicaciones de la diabetes [p. ej., neuropatfa, nefropatia, retinopatfa, cataratas, macroangiopatfa, osteopenia, coma diabetico hiperosmolar, infecciones (p. ej., infeccion respiratoria, infeccion del tracto urinario, infeccion gastrointestinal, infecciones de tejidos dermicos blandos, infecciones en miembro inferior), gangrena diabetica, xerostomia, hipoacusia, trastornos cerebrovasculares, trastornos de la circulacion periferica de la sangre], caquexia diabetica, smdrome de resistencia a la insulina y similares.
El polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se puede administrar como un medicamento (a veces abreviado como "el medicamento de la presente invencion"), por via oral o parenteral, como esta o en una mezcla con un vetnculo farmacologicamente aceptable.
En otra realizacion, ademas, el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se puede formular en una preparacion biologica, una preparacion de liposomas, una preparacion de emulsion o microemulsion.
El medicamento de la presente invencion se puede producir usando un metodo de produccion conocido por sf mismo, que se usa en general en el campo tecnico de preparaciones (p. ej., el metodo descrito en la Farmacopea Japonesa). En este caso, se pueden anadir adecuadamente aditivos tales como excipiente, aglutinante, disgregante, lubricante, agente edulcorante, tensioactivo, agente de suspension, emulsionante, agente dispersante, espesante, diluyente, potenciador de la penetracion, una composicion para formar complejos del polinucleotido de la presente invencion o una de sus sales, y similares; agente de suministro topico y similares, que se usan en general en el campo tecnico de las preparaciones, en cantidades adecuadas, cuando sea necesario.
Los ejemplos de las formas farmaceuticas del medicamento de la presente invencion para la administracion oral del polinucleotido de la presente invencion o una de sus sales, incluyen preparaciones orales como comprimido (incluyendo comprimido recubierto de azucar, comprimido recubierto de pelfcula, comprimido sublingual, comprimido bucal, comprimido de integracion rapida en la cavidad bucal), pfldora, granulo, polvo, capsula (incluyendo capsula blanda, microcapsula), jarabe, emulsion, suspension y pelfculas (p. ej., pelfcula de adherencia a membrana mucosa de la cavidad bucal), polvo, microgranulo, nanogranulo, capsula de gel, pulverizador y similares.
En una realizacion, el medicamento de la presente invencion es una preparacion oral que se administra en combinacion con uno o mas potenciadores de la penetracion.
Los ejemplos preferidos de potenciadores de la penetracion incluyen acido graso o un ester o una de sus sales; y acidos biliares o una de sus sales.
Los acidos biliares preferidos o una de sus sales incluyen acido quenodesoxicolico (CDCA), acido ursodesoxiquenodesoxicolico (UDCA), acido colico, acido deshidrocolico, acido desoxicolico, acido glucolico, acido glicolico, acido glicodesoxicolico, acido taurocolico, acido taurodesoxicolico, tauro-24,25-dihidro-fusidato sodico, acido glicodihidrofusfdico o una de sus sales farmaceuticamente aceptable (p. ej., sal de sodio). Los acidos grasos preferidos o uno de sus esteres o sus sales, incluyen acido araquidonico, acido undecanoico, acido oleico, acido laurico, acido capnlico, acido caprico, acido minstico, acido palmftico, acido estearico, acido linoleico, acido linolenico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarinitina, una acilcolina, un monoglicerido, un diglicerido, eter launlico polioxietilenado 9, eter cetflico polioxietilenado 20 o una de sus sales farmaceuticamente aceptable (p. ej., sal de sodio).
En algunas realizaciones, se pueden usar combinaciones de potenciadores de la penetracion (p. ej., un acido graso o una de sus sales en combinacion con un acido biliar o una de sus sales). Una combinacion preferida son las sales de sodio del acido laurico, acido caprico y UDCA.
Cuando el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se prepara en un comprimido, por ejemplo, se puede preparar usando un excipiente, un aglutinante, un disgregante, un lubricante y similares, y cuando se va a preparar una pfldora o un granulo, se puede preparar usando un excipiente, un aglutinante o un disgregante. Cuando se va a preparar un polvo o una capsula, se puede preparar usando un excipiente y similares, cuando se va a preparar un jarabe, se puede preparar usando un edulcorante y similares, y cuando se va a preparar una emulsion
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o una suspension, se puede preparar usando un agente de suspension, un tensioactivo, un emulsionante y similares.
Los ejemplos de excipientes incluyen lactosa, sacarosa, glucosa, almidon, sacarosa, celulosa microcristalina, glicirriza en polvo, manitol, hidrogenocarbonato sodico, fosfato calcico y sulfato calcico.
Los ejemplos de los aglutinantes incluyen pasta lfquida de almidon al 5-10% en peso, solucion de goma arabiga o solucion de gelatina al 10-20% en peso, solucion de tragacanto al 1-5% en peso, solucion de carboximetilcelulosa, solucion de alginato sodico y glicerina.
Los ejemplos de los disgregantes incluyen almidon y carbonato de calcio.
Los ejemplos de los lubricantes incluyen estearato magnesico, acido estearico, estearato de calcio y talco purificado.
Los ejemplos de edulcorantes incluyen glucosa, fructosa, azucar invertido, sorbitol, xilitol, glicerina y jarabe simple.
Los ejemplos de los tensioactivos incluyen lauril-sulfato sodico, polisorbato 80, monoester de acido graso de sorbitan y estearato de polioxilo 40.
Los ejemplos de agentes de suspension incluyen goma arabiga, alginato sodico, carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa y bentonita.
Los ejemplos de los emulsionantes incluyen goma arabiga, tragacanto, gelatina, polisorbato 80 y similares.
Cuando el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se produce en forma de granulos o pulverizador, se puede usar una composicion para la formacion de complejo del polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, y similares. Los ejemplos de las composiciones incluyen poliaminoacidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivatizadas con DEAE, pululanos, celulosas y almidones. Los ejemplos preferidos de las composiciones incluyen chitosan, N- trimetilchitosan, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P (TDAE), poliamino(p. ej., p-amino)-estireno, poli(cianoacrilato de metilo), poli(cianoacrilato de etilo), poli(cianoacrilato de butilo), poli(cianoacrilato de isobutilo), poli(cianoacrilato de isohexilo), DEAE-metacrilato, DEAE-acrilato de hexilo, DEAE-acrilamida, DEAE-albumina y DEAE-dextrano, poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de hexilo), poli(D,L-acido lactico), poli(DL-acido lactico-co-glicolico) (PLGA), alginato, y polietilenglicol (PEG).
Una preparacion oral que contiene el polinucleotido de la presente invencion se puede producir de acuerdo con los metodos descritos en la patente de EE.UU. n° 6.887.906, US-A-2003/0027780, patente de EE.UU. n° 6.747.014 y similares, o un metodo analogo a los mismos.
Los ejemplos de las formas farmaceuticas para administracion parenteral del polinucleotido de la presente invencion o una de sus sales, incluyen inyeccion, instilacion, supositorio, parche transdermico, pomada, locion, crema, gotas, pulverizador y polvo. Ademas, se puede hacer una preparacion de liberacion sostenida combinando el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, con una base adecuada (p. ej., polfmero de acido butmco, polfmero de acido glicolico, copolfmero de acido butmco-acido glicolico, una mezcla de un polfmero de acido butmco y un polfmero de acido glicolico, ester de acido graso y poliglicerol).
Los ejemplos de los metodos de inyeccion incluyen inyeccion intravenosa asf como inyeccion subcutanea, inyeccion intracutanea, inyeccion intramuscular, instilacion y similares. Los ejemplos de las preparaciones de liberacion sostenida incluyen un agente transdermico de iontoforesis y similares.
Dichas inyecciones se preparan por metodos conocidos por sf mismo, o por disolucion, suspension o emulsion del nucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, en un lfquido acuoso o aceitoso esterilizado. Los ejemplos de lfquidos acuosos para inyeccion incluyen solucion salina fisiologica, soluciones isotonicas que contienen glucosa u otros farmacos auxiliares (p. ej., D-sorbitol, D-manitol, cloruro sodico y similares), y similares, y se pueden usar en combinacion con agentes solubilizantes adecuados tales como alcoholes (p. ej., etanol), polialcoholes (p. ej., propilenglicol, polietilenglicol) y tensioactivos no ionicos (p. ej., polisorbato 80, HCO-50). Los ejemplos de los lfquidos aceitosos incluyen aceite de sesamo, aceite de soja y similares, y se pueden usar en combinacion con agentes solubilizantes tales como benzoato de bencilo y alcohol bendlico. Ademas, se pueden mezclar tampones (p. ej., tampon de fosfato, tampon de acetato sodico), agentes calmantes (p. ej., cloruro de benzalconio, hidrocloruro de procama), estabilizantes (p. ej., albumina de suero humana, polietilenglicol), conservantes (p. ej., alcohol bendlico, fenol) y similares. Una inyeccion preparada en general se introduce en una ampolla.
En una realizacion, el medicamento de la presente invencion se puede formular como una inyeccion.
La inyeccion puede contener una solucion acuosa esterilizada o una solucion acuosa que contiene un agente de tamponamiento, diluyente y otros aditivos adecuados (p. ej., potenciador de la penetracion, compuesto vehfculo y otros vehmulos o excipientes farmaceuticamente aceptables, etc.) en solucion acuosa esterilizada.
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La inyeccion tambien se puede usar para administracion topica (administracion intrapancreas).
Cuando el medicamento de la presente invencion se formula en una forma farmaceutica para administracion topica (supositorio, parche transdermico, pomada, locion, crema, gotas, pulverizador, polvo, etc.), se puede usar un agente de suministro topico.
Los ejemplos de agentes de suministro topico incluyen liposomas constituidos por lfpidos (p. ej., dioleoilfosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG, dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoilfosfatidiletanolamina DOTMA, fosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilglicerol o dioleoilfosfatidiletanolamina), acidos grasos y esteres de acidos grasos (p. ej., acido araquidonico, acido oleico, acido eicosanoico, acido laurico, acido capnlico, acido caprico, acido minstico, acido palmttico, acido estearico, acido linoleico, acido linolenico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1- dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un ester de alquilo C1-10 (p. ej., miristato de isopropilo IPM), monoglicerido, diglicerido o sus sales farmaceuticamente aceptables) y similares, liposomas
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disponibles en el comercio (Lipofectin (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) y Effectene (Qiagen, Valencia, Calif.)), liposomas descritos en Nature Biotechnology, 15: 647-652 (1997), liposomas descritos en J. Am Soc. Nephrol. 7: 1728 (1996), liposomas descritos en la patente de EE.UU. n° 6.271.359, liposomas descritos en la publicacion PCT WO 96/40964 y liposomas descritos en Nat Biotechnol. 23:1002-1007 (2005). El termino "liposoma" usado en la presente invencion significa una vesfcula compuesta de lfpidos anfifflicos dispuestos en una bicapa o bicapas esfericas, e incluye monocapas, micelas, bicapas y vesfculas.
El polinucleotido de la presente invencion o su sal, se puede encapsular dentro de liposomas o puede formar complejos con los mismos, en particular liposomas cationicos. Alternativamente, el polinucleotido de la presente invencion o su sal, puede formar complejos con lfpidos, en particular con lfpidos cationicos.
Una preparacion para la administracion topica se puede producir de acuerdo, por ejemplo, con el metodo descrito en la patente de EE.UU. n° 6.747.014 y similares, o un metodo analogo al mismo.
Los ejemplos de los liposomas para usar para la formulacion del medicamento de la presente invencion como una preparacion liposomal incluyen (aa) liposomas cationicos, (bb) liposomas anionicos, (cc) liposomas no ionicos, (dd) liposomas "estericamente estabilizados", (ee) liposomas que comprenden glicolfpidos, (ff) liposomas que comprenden lfpidos derivatizados con polfmeros hidrofilos, (gg) transfersomas, y (hh) SNALP.
Los ejemplos de los liposomas cationicos (aa) mencionados antes incluyen liposomas usados en Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985.
Los ejemplos de los liposomas no ionicos (cc) mencionados antes incluyen Novasome™ I (dilaurato de glicerilo/colesterol/eter de estearilo polioxietileno-10) y Novasome™ II (distearato de glicerilo/colesterol/eter de estearilo polioxietileno-10) (Hu et al. S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Los ejemplos de los liposomas "estericamente estabilizados "(dd) mencionados antes, son aquellos en los que parte de la porcion de lfpido que forma vesfcula del liposoma (dd-1) comprende uno o mas glucolfpidos, tales como monosialogangliosido Gmi, o (dd-2) se derivatiza con uno o mas polfmeros hidrofilos, tales como un resto polietilenglicol (PEG).
El liposoma es ventajoso en cuanto que extiende el periodo en que el medicamento de la presente invencion esta presente en la sangre que circula.
Los ejemplos de los liposomas que comprenden glucolfpidos (ee) mencionados antes, incluyen liposomas (ee-1) que comprenden monosialogangliosido Gm-i, sulfato galactocerebrosido y fosfatidilinositol, y (ee-2) liposomas que comprenden esfingomielina, gangliosido Gmi o un ester de sulfato galactocerebrosido (patente de EE.UU. n° 4.837.028 y WO 88/04924).
Con el uso de estos liposomas, las semividas de los liposomas en la sangre se puede prolongar (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64; Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949).
Los ejemplos de los liposomas que comprenden lfpidos derivatizados con polfmeros hidrofilos (ff) mencionados antes incluyen liposomas (ff-1) que comprenden un detergente no ionico que contiene un resto PEG (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778), (ff-2) liposomas derivatizados con glicoles de partfculas de poliestireno polimericos hidrofilos (FEBS Lett., 1984, 167, 79), (ff-3) liposomas que comprenden fosfolfpidos sinteticos modificados por la union de grupos carboxflicos de polialquilenglicoles (p. ej., PEG) (patente de EE.Uu. n° 4.426.330 y 4.534.899), (ff-4) liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivatizada con PEG o estearato de PEG (FEBS Lett., 1990, 268, 235), (ff-5) liposomas que comprenden otros fosfolfpidos derivatizados con PEG formados a partir de la combinacion de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG (Biochimica et Biophysica Acts, 1990, 1029, 91), (ff-6) liposomas que tienen restos PEG covalentemente unidos en su superficie externa (patente europea n° EP 0445131 B1 y WO 90/04384), (ff-7) liposomas que contienen 1-20 por ciento en moles de PE derivatizado con PEG (patentes de EE.UU. n° 5.013.556 y 5.356.633, patente de EE.UU. n° 5.213.804 y patente europea n° EP 0496813 B1, (ff-8)
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liposomas que comprenden una serie de otros conjugados de Kpido-poUmero (WO 91/05545, patente de EE.UU. n° 5.225.212 y WO 94/20073), (ff-9) liposomas que comprenden lfpidos de ceramida modificados con PEG (WO 96/10391), y (ff-10) liposomas que contienen PEG que se pueden derivatizar ademas con restos funcionales en sus superficies (patente de EE.UU. n° 5.540.935 y patente de EE.UU. n° 5.555.948).
Los liposomas que comprenden PEG se pueden preparar de acuerdo con metodos descritos en las patentes de EE.uU. n° 6.049.094; 6.224.903; 6.270.806; 6.471.326; 6.958.241 y similares, o un metodo analogo a los mismos.
Los ejemplos de las SNALP (hh) mencionadas antes incluyen SPLP (incluyendo pSPLP (documento WO 00/03683) y SNAlp). Las SNALP y SPLP pueden contener ademas un lfpido cationico, un lfpido no cationico, y opcionalmente, un lfpido que previene la agregacion de partfculas (p. ej., conjugado de PEGfflpido).
El medicamento de la presente invencion formulado en una preparacion que contiene SNALP es util para la administracion sistemica, puesto que extiende de forma ventajosa el tiempo de vida en la circulacion despues de inyeccion intravenosa (i.v.) y se acumula en un sitio distal (p. ej., sitio ffsicamente lejos del sitio de administracion).
Las preparaciones que contienen SNALP se pueden producir de acuerdo con los metodos descritos, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6.586.410; 6.815.432; y WO96/40964 y similares, o un metodo analogo a los mismos.
Las preparaciones de liposomas mencionadas antes incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesfculas. El "liposoma" usado en la presente invencion esta compuesto de lfpidos anfifflicos dispuestos en bicapa o bicapas esfericas.
Los ejemplos de los lfpidos anfifflicos mencionados antes incluyen lfpidos cationicos que tienen un pKa de 4 a 15, que comprenden al menos un grupo protonable (p. ej., cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DODMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLendMA), 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleiloxi-3-
(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleiloxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3- dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloxi-3- dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA-Cl), sal de cloruro de 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin- MPZ), o 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2- dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano, o analogos de los mismos o una mezcla de los mismos), un lfpido representado por la formula:
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en donde
Xa e Xb son cada uno independientemente alquileno C1-6;
n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5;
cada R es independientemente H,
O
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m es 0, 1, 2, 3 o 4;
Y esta ausente, O, NR2, o S;
R1 es alquilo, alquenilo o sustituyentes; y
R2 es H, alquilo, alquenilo sustituyentes.
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alquinilo; cada uno de los cuales esta opcionalmente sustituido con uno o mas
o alquinilo; cada uno de los cuales esta opcionalmente sustituido con uno o mas
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Otros ejemplos de Ifpidos anfifflicos incluyen Kpidos no cationicos (Upidos anionicos o Kpidos neutros) (p. ej., diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOpC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano- 1-carboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil-PE, 16-O-dimetil-PE, 18-1-trans-PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), 1-2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina, colesterol, o una mezcla de los mismos).
Ejemplos adicionales de lfpidos anfifflicos incluyen un polietilenglicol (PEG)fflpido que incluye un PEG-diacilglicerol (DaG), un PEG-dialquiloxipropilo (DAA) (p. ej., un PEG-dilauriloxipropilo (C12), un PEG-dimiristiloxipropilo (C14), un PEG-dipalmitiloxipropilo (C16), un PEG-disteariloxipropilo (C18)), un PEG-fosfolfpido, un PEG-ceramida (Cer), y una mezcla de los mismos.
Las preparaciones de liposomas pueden contener un lfpido que previene la agregacion de partfculas (p. ej., esteroide tal como colesterol).
Las ventajas de formar el medicamento de la presente invencion como una preparacion de liposomas son como sigue: los liposomas obtenidos de fosfolfpidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar una amplia variedad de farmacos solubles en agua y lfpidos; los liposomas pueden proteger farmacos encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y la degradacion (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, pag. 245); mayor acumulacion del polinucleotido de la presente invencion o una de sus sales en el sitio diana; la capacidad de administrar una amplia variedad de farmacos, tanto hidrofilos como hidrofobos, en la piel.
El medicamento de la presente invencion se puede formular como una emulsion.
Los emulsionantes mencionados antes pueden contener tensioactivos, emulsionantes naturales, bases de absorcion, solidos finamente dispersos, conservantes, antioxidantes y similares (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, pag. 199).
Como los tensioactivos mencionados antes, se pueden usar tensioactivos publicamente conocidos (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Ringer and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, pag. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volumen 1, pag. 199).
Los ejemplos de los emulsionantes naturales mencionados antes incluyen lanolina, cera de abeja, fosfatidos, lecitina y goma arabiga.
Los ejemplos de los conservantes mencionados antes incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, esteres de acido p-hidroxibenzoico y acido borico.
Los ejemplos de los antioxidantes mencionados antes incluyen depuradores de radicales tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado; agentes de reduccion tales como acido ascorbico y metabisulfito sodico; acido cftrico, acido tartarico; y lecitina.
La aplicacion de formulaciones en emulsion por via dermatologica, oral y parenteral y los metodos para su fabricacion se han descrito en la bibliograffa (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, pag. 199).
Las formulaciones en emulsion para el suministro oral se han usado muy ampliamente debido a su facilidad de formulacion, asf como a la eficacia desde un punto de vista de la absorcion y biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, pag. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Decker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, pag. 199).
El medicamento de la presente invencion se puede formular como microemulsiones.
Las microemulsiones mencionadas antes pueden contener aceites, agua, tensioactivos, cotensioactivos y/o electrolitos.
Los ejemplos de los tensioactivos mencionados antes incluyen, pero no se limitan a tensioactivos ionicos, tensioactivos no ionicos, Brij 96, eteres de oleilo polioxietilenado, esteres de acido graso y poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (M0310), monooleato de hexaglicerol (P0310), pentaoleato de hexaglicerol (P0500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (M0750), sesquioleato de decaglicerol (S0750), decaoleato de decaglicerol (DA0750), solo o en combinacion con cotensioactivos. Los ejemplos de los cotensioactivos mencionados antes incluyen un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol. Los cotensioactivos penetran en la pelfcula de tensioactivo y por consiguiente crean una pelfcula
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desordenada debido al espacio vado entre las moleculas de tensioactivo. La pelmula sirve para aumentar la fluidez interfacial. Sin embargo, las microemulsiones se pueden preparar sin usar cotensioactivos y sistemas de microemulsion autoemulsionantes exentos de alcohol conocidos en la tecnica. La fase acuosa puede ser tipicamente, pero no se limita a agua, una solucion acuosa del farmaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles, y derivados de etilenglicol. Los aceites mencionados antes incluyen Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, esteres de acido graso, mono, di y trigliceridos de cadena media (C8-C12), esteres de acido graso y glicerilo polioxietilado, alcoholes grasos, gliceridos poliglicolizados, gliceridos poliglicolizados saturados C8-C10, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones se preparan dispersando primero un aceite en una solucion acuosa de tensioactivo y despues anadiendo un alcohol de longitud de cadena intermedia y similares, para formar un sistema transparente.
Las microemulsiones son eficaces desde el punto de vista de la solubilizacion del polinucleotido de la presente invencion o una de sus sales, y la absorcion potenciada del polinucleotido de la presente invencion o una de sus sales (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Ademas, las microemulsiones son eficaces desde el punto de vista de la administracion oral mas facil que formas farmaceuticas solidas, potencia clmica superior y menor toxicidad (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143).
En una realizacion del medicamento de la presente invencion, la relacion (relacion en masa/masa) del lfpido al polinucleotido esta en el intervalo de aproximadamente 1:1 - aproximadamente 50:1, aproximadamente 1:1 - aproximadamente 25:1, aproximadamente 3:1 - aproximadamente 15:1, aproximadamente 4:1 - aproximadamente 10:1, aproximadamente 5:1 - aproximadamente 9:1, o aproximadamente 6:1 - aproximadamente 9:1.
Aunque el contenido del polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, en el medicamento de la presente invencion vana dependiendo de la forma de preparacion, en general no es menor de aproximadamente 0,01% en peso y es menor de 100% en peso, preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 85% en peso, mas preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 70% en peso, con respecto a la preparacion entera.
Aunque el contenido del aditivo en el medicamento de la presente invencion vana dependiendo de la forma de preparacion, en general es de aproximadamente 1 a aproximadamente 99,9% en peso, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 90% en peso, con respecto a la preparacion entera.
El polinucleotido de la presente invencion tambien se puede suministrar a las celulas diana o tejidos diana por un metodo biologico.
Aunque las celulas diana mencionadas antes no estan particularmente limitadas siempre que sean celulas de mairnfero (p. ej., ser humano, raton, rata, conejo, oveja, cerdo, bovino, gato, perro, mono) que expresen de forma natural el polinucleotido de la presente invencion, por ejemplo, se pueden usar celulas de ser humano. Los ejemplos de tejidos diana mencionados antes incluyen islotes pancreaticos que contienen celulas p pancreaticas, pancreas, pulmon, vejiga, placenta, glandula mamaria y colon.
Aunque los metodos biologicos mencionados antes incluyen el uso de un vector vmco, se pueden usar diferentes metodos, que no estan limitados por estos.
El polinucleotido de la presente invencion se suministra usando, por ejemplo, un vector vmco (p. ej., adenovirus y vector del virus del herpes) a celulas del fngado y celulas del pancreas.
El vector vmco que expresa el polinucleotido de la presente invencion se puede producir por una tecnica de biologfa molecular convencional.
El polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, es estable y de toxicidad baja, y se puede administrar de forma segura a marnfferos (p. ej., ser humano, raton, rata, conejo, oveja, cerdo, bovino, gato, perro, mono). Aunque la dosis diaria vana dependiendo de la afeccion y el peso corporal de los pacientes, el tipo de polinucleotido, la via de administracion y similares, cuando se administra por via oral a pacientes para el tratamiento de la diabetes, por ejemplo, la dosis para un ser humano adulto (peso corporal de aproximadamente 60 kg) por dfa es de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 mg, preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 300 mg, mas preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg, como un principio activo (el polinucleotido de la presente invencion), y la dosis se puede administrar en una vez, o en 2 o 3 porciones.
Cuando el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se administra por via parenteral, en general se administra en una forma lfquida (p. ej., inyeccion). Aunque la dosis individual vana dependiendo del sujeto de administracion, el organo diana, smtomas, metodo de administracion y similares, se administra de forma conveniente en forma, por ejemplo, de una inyeccion, en general de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg, mas preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg, por kg de peso corporal por inyeccion intravenosa.
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El polinucleotido de la presente invencion o una de sus sales, se puede usar en combinacion con otros farmacos, espedficamente otro agente para la profilaxis o tratamiento de la diabetes, o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas.
Los ejemplos de los agentes profilacticos o terapeuticos para la diabetes incluyen preparaciones de insulina (p. ej., preparaciones de insulina animal extrafdas del pancreas bovino o de cerdo; preparaciones de insulina humana geneticamente sintetizadas usando Escherichia coli o levadura; insulina-zinc; insulina-zinc protamina; fragmento o derivado de insulina (p. ej., INS-1), preparacion oral de insulina, sensibilizadores de insulina (p. ej., pioglitazona o una de sus sales (preferiblemente hidrocloruro), rosiglitazona o una de sus sales (preferiblemente maleato), Metaglidasen, AMG-131, Balaglitazone, MBX-2044, Rivoglitazona, Aleglitazar, Chiglitazar, Lobeglitazona, PLX-204, PN-2034, GFT-505, THR-0921, compuesto descrito en los documentos WO 2007/013694, WO 2007/018314, WO 2008/093639 o WO 2008/099794), inhibidores de a-glucosidasa (p. ej., voglibosa, acarbosa, miglitol, emiglitato), biguanidas (p. ej., metformina, buformina o una de sus sales (p. ej., hidrocloruro, fumarato, succinato)), secretagogos de insulina (p. ej., sulfonilureas (p. ej., tolbutamida, glibenclamida, gliclazida, clorpropamida, tolazamida, acetohexamida, gliclopiramida, glimepirida, glipizida, glibuzol), repaglinida, nateglinida, mitiglinida o uno de sus hidratos de sal de calcio), inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (p. ej., Alogliptina o una de sus sales (preferiblemente benzoato), Vildagliptina, Sitagliptina, Saxagliptina, BI1356, GRC8200, MP-513, PF-00734200, PHX1149, SK-0403, ALS2-0426, TA-6666, TS-021, KRP-104, 2-1[6-[(3R)-3-amino-1-piperidinil]-3,4-dihidro-3-metil- 2,4-dioxo-1(2H)-pirimidinil]metil]-4-fluorobenzonitrilo o una de sus sales), agonistas p3 (p. ej., N-5984), agonistas GPR40 (p. ej., compuestos descritos en los documentos WO 2004/041266, WO 2004/106276, WO 2005/063729, WO 2005/063725, WO 2005/087710, WO 2005/095338, WO 2007/013689 o WO 2008/001931), agonistas del receptor de GLP-1 (p. ej., GLP-1, GLP-1MR, Liraglutida, Exenatida, AVE-0010, BIM-51077, Aib(8,35)hGLP- 1(7,37)NH2, CJC-1131, Albiglutida), agonistas de amilina (p. ej., pramlintida), inhibidores de fosfotirosina fosfatasa (p. ej., vanadato sodico), inhibidores de gluconeogenesis (p. ej., inhibidores de glucogeno fosforilasa, inhibidores de glucosa-6-fosfatasa, inhibidores de FBPasa), inhibidores de SGLT2 (cotransportados de sodio-glucosa 2) (p. ej., Depagliflozina, AVE2268, TS-033, YM543, Ta-7284, Remogliflozina, ASP1941), inhibidores de SGLT1, inhibidores de 11p-hidroxiesteroide deshidrogenasa (p. ej., BVT-3498, INCB-13739), adiponectina o un agonista de la misma, inhibidores de IKK (p. ej., AS-2868), farmacos que mejoran la resistencia a la leptina, agonistas del receptor de somatostatina, activadores de glucoquinasa (p. ej., Piragliatina, AZD1656, AZD6370, TTP-355, compuestos descritos en los documentos WO 2006/112549, WO 2007/028135, WO 2008/047821, WO 2008/050821, WO 2008/136428 o WO 2008/156757), GIP (peptido insulinotropico dependiente de glucosa), agonista de GPR119 (p. ej., PSN821), FGF21, analogos de FGF y similares.
Los ejemplos de los farmacos para la proliferacion de celulas p pancreaticas incluyen inhibidores de la dipeptidil peptidasa IV (p. ej., Alogliptina o una de sus sales (preferiblemente benzoato), Vildagliptina, Sitagliptina, Saxagliptina, BI1356, GRCS200, MP-513, PF-00734200, PHX1149, SK-0403, ALS2-0426, TA-6666, TS-021, KRP- 104, 2-[[6-[(3R)-3-amino-1-piperidinil]-3,4-dihidro-3-metil-2,4-dioxo-l(2H)-pirimidinil]metil]-4-fluorobenzonitrilo o una de sus sales), agonistas del receptor de GLP-1 (p. ej., GLP-1, GLP-1MR, Liraglutida, Exenatida, AVE-0010, BIM-51077, Aib(8,35)hGLP-1(7,37)NH2, cJc-1131, Albiglutida) hormonas del crecimiento y similares.
<2> Uso como un agente para la proliferacion de celulas p pancreaticas,
El polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, tiene una actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas. Los ejemplos de las celulas p pancreaticas mencionadas antes incluyen celulas p pancreaticas de mairnferos (p. ej., raton, rata, hamster, conejo, gato, perro, bovino, oveja, mono, ser humano).
Por lo tanto, el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, es util como un agente para la proliferacion de celulas p pancreaticas de mai^ero; un agente para la proliferacion de celulas p pancreaticas antes del trasplante de islotes; un agente para ayudar a la proliferacion de celulas p pancreaticas despues de trasplante de islote; y un agente terapeutico para la pancreatitis.
La actividad del polinucleotido para la proliferacion de celulas p pancreaticas se puede medir por el metodo descrito en detalle antes y de acuerdo con el metodo descrito en los ejemplos descritos mas adelante.
El agente para la proliferacion de celulas p pancreaticas, que contiene el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, se puede producir de la misma forma que el medicamento mencionado antes de la presente invencion, y se puede administrar a mai^eras de forma segura.
<3> Uso para el cribado de un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes, y similares
Puesto que el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, tiene una actividad de acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas, una sustancia que acelera la expresion intracelular del polinucleotido de la presente invencion tambien acelera la proliferacion de celulas p pancreaticas, y es eficaz para la profilaxis o tratamiento de enfermedades tales como la diabetes y similares. Por lo tanto, los polinucleotidos de la presente invencion se pueden usar en un metodo para el cribado de una sustancia que produce proliferacion de celulas p pancreaticas, un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes (o un sustancia candidato del mismo), que
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comprende comparar la expresion del polinucleotido de la presente invencion en celulas que tienen la capacidad de expresar dicho polinucleotido en presencia o ausencia de una sustancia de ensayo.
El nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion se puede medir detectando el polinucleotido de la presente invencion usando una sonda de acido nucleico o cebador de acido nucleico que detecta espedficamente el polinucleotido de la presente invencion (p. ej., polinucleotido capaz de hibridar con el polinucleotido de la presente invencion en condiciones de restriccion alta (es decir, acido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica el polinucleotido de la presente invencion o una parte del mismo, o una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases que codifica el polinucleotido de la presente invencion o una parte del mismo)).
Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo para el cribado de una sustancia que hace proliferar las celulas p pancreaticas o un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes (o una sustancia candidato del mismo), que comprende cultivar celulas que tienen la capacidad de expresar el polinucleotido de la presente invencion en presencia o ausencia de una sustancia de ensayo, medir y comparar el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion en ambas condiciones usando una sonda de acido nucleico, cebador de acido nucleico o similar, que detecta espedficamente el polinucleotido de la presente invencion, en donde se selecciona una sustancia que promueve la expresion del polinucleotido como un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes.
(En lo sucesivo a veces denominado "el metodo de cribado de la presente invencion").
Aunque las celulas mencionadas antes que tienen capacidad de expresar el polinucleotido de la presente invencion no estan particularmente limitadas siempre que sean celulas de mairnfero (p. ej., de ser humano, raton, rata, conejo, oveja, cerdo, bovino, gato, perro, mono) que expresen de forma endogena el polinucleotido de la presente invencion, por ejemplo, se usan celulas p pancreaticas humanas. Ademas, tambien se puede usar un tejido que contiene celulas que tienen la capacidad de expresar el polinucleotido de la presente invencion. Los ejemplos de los tejidos incluyen islotes pancreaticos que contienen celulas p pancreaticas, pancreas, pulmon, vejiga, placenta, glandula mamaria y colon. Como tejidos, se usan preferiblemente islotes pancreaticos que contienen celulas p pancreaticas, pancreas y similares. Cuando se usan celulas o tejidos derivadas de un animal no humano, se pueden aislar del organismo vivo y cultivar, o se puede administrar una sustancia de ensayo al organismo vivo y las celulas o tejidos en el mismo se pueden aislar despues de un determinado tiempo.
Los ejemplos de las sustancias de ensayo incluyen protema, peptido, compuesto no peptfdico, compuesto de smtesis, producto de fermentacion, extracto celular, extracto de planta, extracto de tejido animal y similares. Estas sustancias pueden ser nuevas o conocidas. Ademas, la biblioteca de compuestos producida usando una tecnica de qmmica combinatoria, biblioteca de peptidos aleatorios producida por smtesis en fase solida o presentacion en fago, y similares, tambien son ejemplos preferidos de las sustancias de ensayo.
Por ejemplo, el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion se puede medir concretamente como sigue.
(i) Se administra una sustancia de ensayo a un marnffero no humano (p. ej., raton, rata, conejo, oveja, cerdo, bovino, gato, perro, mono, ave). Un determinado tiempo despues de la administracion, se recupera una muestra biologica que contiene celulas que expresan de forma natural el polinucleotido de la presente invencion, tal como islote, pancreas y similares. El polinucleotido de la presente invencion que es expresado en las celulas contenidas en la muestra biologica obtenida se puede cuantificar, por ejemplo, preparando un extracto de ARN que contiene micro ARN de las celulas por un metodo convencional, y sometiendo el extracto de ARN obtenido a RT-PCR, matriz de acido nucleico, analisis por transferencia Northern y similares.
(ii) Las celulas de mamffero que expresan el polinucleotido de la presente invencion (p. ej., celulas p pancreaticas) son cultivadas in vitro de acuerdo con un metodo convencional, durante el cual se anade una sustancia de ensayo al medio. Despues de cultivo durante un determinado tiempo, se puede cuantificar el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion, que esta contenido en las celulas, y analizar usando un metodo tal como RT-PCR, matriz de acido nucleico, analisis por transferencia Northern y similares.
Como resultado de la medicion, los cambios en el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion, que son causados por la sustancia de ensayo, se correlacionan con una actividad para la proliferacion de celulas p pancreaticas, o una actividad para prevenir o tratar la diabetes. Por lo tanto, una sustancia que promueve la expresion del polinucleotido de la presente invencion se puede seleccionar como una sustancia que hace proliferar las celulas p pancreaticas o un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes (o una sustancia candidato del mismo).
Opcionalmente, se puede confirmar si la sustancia seleccionada en la etapa mencionada antes, tiene una actividad para hacer proliferar celulas p pancreaticas (incluyendo una actividad para acelerar la proliferacion), o puede prevenir o tratar la diabetes.
La presencia o ausencia de una actividad de proliferacion de celulas p pancreaticas se puede determinar, por ejemplo, cultivando in vitro celulas p pancreaticas de un mamnfero, en presencia o ausencia de una sustancia de
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ensayo, y un determinado tiempo despues del inicio del cultivo, medir el nivel de proliferacion de celulas p pancreaticas en ambas condiciones, por un metodo conocido por s^ mismo, tal como en ensayo de MTT y similares, compararlos.
Ademas, la presencia o ausencia de una actividad para prevenir o tratar la diabetes se puede determinar, por ejemplo, administrando una sustancia de ensayo a un mamufero no humano modelo de diabetes, y un tiempo determinado despues de la administracion, evaluar los smtomas de la diabetes tales como la glucosa en sangre en el mamnfero no humano, y comparar los smtomas con aquellos sin administracion de la sustancia de ensayo.
Los ejemplos de los mamfferos no humanos modelo de diabetes incluyen modelos de diabetes de tipo 2 en ratones tales como raton KK (p. ej., raton KK/Ta, raton KK/Snk), raton KK-Ay (p. ej., KK-A//Ta mouse), raton db/db C57BL/KsJ, raton db/db C57BL/6J, raton ob/ob y raton con dieta con carga alta de grasa, y modelo de diabetes de tipo 2 en rata tal como rata GK, rata ZDF y rata con dieta con carga alta de grasa. Los ejemplos de modelo de diabetes de mamfferos no humanos incluyen modelos animales de diabetes de tipo 1 tales como modelo animal de diabetes inducida por estreptozotocina (STZ) y modelo de STZ de multiples dosis bajas.
Despues, una sustancia de ensayo que se ha confirmado que tiene una actividad de proliferacion de celulas p pancreaticas y/o actividad para prevenir o tratar la diabetes, se puede seleccionar como una sustancia que hace proliferar las celulas p pancreaticas o un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes (o una sustancia candidato del mismo).
Una sustancia seleccionada por el metodo de cribado de la presente invencion es util como un agente para la proliferacion de celulas p pancreaticas; un agente para la profilaxis o tratamiento de la diabetes (p. ej., diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, diabetes gestacional, diabetes por obesidad); un agente para la profilaxis o tratamiento de la tolerancia alterada a la glucosa (TAG); un agente para suprimir el avance de la tolerancia alterada a la glucosa a la diabetes (o una sustancia candidato del mismo).
Ademas, una sustancia seleccionada por el metodo de cribado de la presente invencion tambien es util como un agente para la profilaxis o tratamiento de complicaciones diabeticas [p. ej., neuropatfa, nefropatfa, retinopatfa, cataratas, macroangiopatfa, osteopenia, coma diabetico hiperosmolar, infecciones (p. ej., infeccion respiratoria, infeccion del tracto urinario, infecciones gastrointestinales, infecciones de tejidos dermicos blandos, infecciones de miembro inferior), gangrena diabetica, xerostomia, hipoacusia, trastornos cerebrovasculares, trastornos de la circulacion periferica de la sangre], caquexia diabetica, smdrome de resistencia a la insulina y similares (o una sustancia candidato del mismo).
La sustancia seleccionada por el metodo de cribado de la presente invencion se puede formular de la misma forma que en el medicamento mencionado antes de la presente invencion. Puesto que la preparacion asf obtenida es segura y tiene toxicidad baja, se puede administrar, por ejemplo, a mamfferos (p. ej., ser humano, rata, raton, hamster, conejo, oveja, cabra, cerdo, bovino, caballo, gato, perro, mono, chimpance).
<4> Uso para evaluar la susceptibilidad a farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes, etc.
Puesto que el polinucleotido de la presente invencion, o una de sus sales, tiene una actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas, se puede determinar la susceptibilidad de un paciente a un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas, en la decision de un diseno de administracion de un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas y similares, poniendo en contacto un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas que se va a administrar a las celulas de un paciente, midiendo el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion en las celulas, y correlacionando los cambios en el nivel de expresion y la susceptibilidad al farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o el farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas. Por lo tanto, se describe un metodo para determinar la susceptibilidad a un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas, que comprende comparar la expresion del polinucleotido de la presente invencion en celulas que tienen una capacidad de expresar el polinucleotido entre la presencia y ausencia de un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas (en lo sucesivo denominado a veces "metodo de determinacion de la presente invencion").
Mas espedficamente, se describe un metodo para determinar la susceptibilidad a un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas, que comprende cultivar celulas que tienen una capacidad para expresar el polinucleotido de la presente invencion, en presencia o ausencia de un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas, midiendo los niveles de expresion del polinucleotido de la presente invencion en ambas condiciones, usando una sonda de acido nucleico o cebador de acido nucleico que detecta espedficamente el polinucleotido de la presente invencion, y comparandolos.
En el metodo de determinacion, como celulas que tienen una capacidad de expresar el polinucleotido de la presente invencion, se usan celulas de un sujeto de ensayo (ser humano u otro mamffero (p. ej., raton, rata, conejo, oveja, cerdo, bovino, gato, perro, mono)) programado para la administracion de un farmaco profilactico o terapeutico para
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la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas. Las celulas no estan particularmente limitadas siempre que expresen de forma natural el polinucleotido de la presente invencion (p. ej., celulas p pancreaticas) o una muestra biologica que las contenga (p. ej., islote, pancreas, pulmon, vejiga, placenta, glandula mamaria, colon), dandose preferencia a las celulas p pancreaticas. La celula, tejidos y similares, derivados de un mai^ero se pueden aislar del cuerpo y cultivar, o se puede administrar un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas a un organismo vivo y, despues de un determinado tiempo, se pueden aislar las celulas o una muestra biologica que las contiene.
Los ejemplos de los farmacos profilacticos o terapeuticos para la diabetes incluyen los ilustrados como el farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes mencionado antes.
Los ejemplos de los farmacos para la proliferacion de celulas p pancreaticas incluyen los ilustrados como el farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes mencionado antes.
En el metodo de determinacion, el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion se puede medir espedficamente como sigue.
(i) Se administra un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas a un ser humano o un mairnfero no humano (p. ej., raton, rata, conejo, oveja, cerdo, bovino, gato, perro, mono, ave). Un determinado tiempo despues de la administracion, se recupera por biopsia o similares, una muestra biologica que contiene celulas que expresan de forma endogena el polinucleotido de la presente invencion, tales como islotes, pancreas o similares. El polinucleotido de la presente invencion que es expresado en las celulas contenidas en la muestra biologica recogida se puede cuantificar, por ejemplo, extrayendo el ARN que contiene miARN de las celulas etc., por un metodo convencional, y usando un metodo tal como RT-PCR, matriz de acido nucleico y similares, o tambien se puede cuantificar por analisis de transferencia Northern, conocidos por sf mismos.
(ii) Las celulas de mamffero (p. ej., celulas p pancreaticas) que expresan el polinucleotido de la presente invencion se cultivan in vitro de acuerdo con un metodo convencional en un medio al que se ha anadido un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas. Despues de cultivo durante un determinado tiempo, se puede cuantificar el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion contenido en las celulas, y analizar por un metodo tal como RT-PCR, matriz de acido nucleico, analisis por transferencia Northern y similares.
Mediante el analisis mencionado antes, se correlacionan los cambios en el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion causados por un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas, y la susceptibilidad a dicho farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas. Despues, basandose en la correlacion positiva entre los cambios en el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion y la susceptibilidad a dicho farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas, se determina la susceptibilidad a dicho farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas.
Cuando un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas promueve el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion, se puede determinar que el sujeto de ensayo tiene mucha posibilidad de ser susceptible a dicho farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas (es decir, es alta la posibilidad de que dicho farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas sea eficaz para el sujeto de ensayo). Por otra parte, cuando el nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion no es promovido, se puede determinar que el sujeto de ensayo puede no ser susceptible a dicho farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas (es decir, existe la posibilidad de que dicho farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas no sea eficaz para el sujeto de ensayo).
Cuando el grado de promocion del nivel de expresion del polinucleotido de la presente invencion es mayor, se puede determinar que el sujeto de ensayo tiene una mayor posibilidad de tener susceptibilidad a dicho farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas.
Usando el metodo de determinacion, se puede acordar un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes y un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas, que se espera que sea eficaz para pacientes, en la determinacion del plan de administracion de un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas, seleccion de farmaco y similares.
Un polipeptido que contiene la siguiente secuencia de bases tambien se puede usar como un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un farmaco para la proliferacion de celulas p pancreaticas, de la misma forma que el polinucleotido de la presente invencion, y se puede usar ademas para un metodo para el cribado de un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes y similares, y un metodo para determinar la susceptibilidad a un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes y similares.
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<A> Una secuencia de bases que tiene una homologfa no menor de 70% con la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4;
<B> Una secuencia parcial continua que tiene una longitud no menor de 5 nucleotidos, que esta contenida en la secuencia de bases mostrada por la sEq ID NO: 1, 2, 3 o 4;
<C> Una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases de los apartados <A> o <B> mencionados antes.
La secuencia de bases del aparatado <A> mencionado antes tiene una homologfa (es decir, identidad) no menor de 70% y menor de 90%, preferiblemente no menor de 75% y menor de 90%, no menor de 80% y menor de 90%, no menor de 85% y menor de 90%, con la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.
Ademas, la secuencia de bases del aparatado <A> mencionado antes, abarca la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, excepto que se eliminan, sustituyen, anaden o insertan 3, 4, 5 o 6 bases. Los ejemplos de las secuencias de bases incluyen (i) la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, excepto que se eliminan 3, 4, 5 o 6 bases, (ii) la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, excepto que se
anaden 3, 4, 5 o 6 bases, (iii) la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, excepto que se
insertan 3, 4, 5 o 6 bases, (iv) la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, excepto que se
sustituyen 3, 4, 5 o 6 bases por otras bases, y (v) las secuencias de bases que contienen esas mutaciones en
combinacion (el numero total de bases eliminadas, sustituidas, anadidas o insertadas es 3, 4, 5 o 6).
Cuando la secuencia de bases contiene mutaciones (eliminacion, sustitucion, adicion o insercion), como se ha mencionado antes, no hay restricciones en relacion con las posiciones de las mutaciones.
La longitud de la secuencia parcial del aparatado <B> mencionado antes, es al menos 5 nucleotidos, preferiblemente, no menor de 7 nucleotidos, no menor de 10 nucleotidos, no menor de 12 nucleotidos, no menor de 15 nucleotidos o no menor de 17 nucleotidos.
La posicion de la secuencia parcial del aparatado <B> mencionado antes en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, no esta limitada siempre que el polinucleotido tenga una actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas de un mamffero. Como un ejemplo de la posicion de la secuencia parcial del apartado <B> mencionado antes, en la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, se pueden mencionar la 3'-terminal y la 5'-terminal de la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4.
Como una realizacion preferida del polinucleotido de la presente invencion que contiene una secuencia parcial del aparatado <B> mencionado antes, se puede mencionar un polinucleotido que consiste en una secuencia parcial continua que tiene una longitud de nucleotidos no menor de 5, que esta contenida en la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4.
La secuencia de bases del apartado <C> mencionado antes, es completamente complementaria a la secuencia de bases del apartado <A> o <B> mencionado antes.
La presente invencion se explica con mas detalle a continuacion en relacion con los ejemplos, que no deben considerarse limitantes.
Ejemplos
Las abreviaturas en los siguientes ejemplos son las usadas actualmente en la tecnica indican, por ejemplo, los siguiente,
ARN: acido ribonucleico miARN: microARN
RT-PCR: Reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa BrdU; 5-bromo-2'-desoxiuridina
SEQ ID NO en la lista de secuencias en la presente descripcion muestra las siguientes secuencias.
(SEQ ID NO: 1) secuencia de bases de mmu-miR-199b*
(SEQ ID NO: 2) secuencia de bases de mmu-miR-199b
(SEQ ID NO 3) secuencia de bases de mmu-miR-199a-5p
(SEQ ID NO: 4) secuencia de bases de hsa-miR-199b-5p
(SEQ ID NO: 5) secuencia de bases del precursor de mmu-miR-199b
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(SEQ ID NO: 6) secuencia de bases del precursor de hsa-miR-199b
(SEQ ID NO: 7) secuencia de bases del precursor de mmu-miR-199a-1
(SEQ ID NO: 8) secuencia de bases del precursor de mmu-miR-199a-2
(SEQ ID NO: 9) secuencia de bases del precursor de hsa-miR-199a-1
(SEQ ID NO 10) secuencia de bases del precursor de hsa-miR-199a-2 (SEQ ID NO: 11) secuencia de bases del transcrito primario de miR-199b de raton
(SEQ ID NO: 12) secuencia de bases del transcrito primario de miR-199b humano
(SEQ ID NO: 13) secuencia de bases del transcrito primario de miR-199a de raton
(SEQ ID NO: 14) secuencia de bases del transcrito primario de miR-199a de raton
(SEQ ID NO: 15) secuencia de bases del transcrito primario de miR-199a humano
(SEQ ID NO: 16) secuencia de bases del transcrito primario de miR-199a humano
(SEQ ID NO: 17) secuencia de bases de la sonda usada en el ejemplo 3 (SEQ ID NO: 18) secuencia de bases del cebador directo usado en el ejemplo 3 (SEQ ID NO: 19) secuencia de bases del cebador inverso usado en el ejemplo 3 (SEQ ID NO: 20) secuencia de bases de la sonda usada en el ejemplo 3 (SEQ ID NO: 21) secuencia de bases del cebador directo usado en el ejemplo 3 (SEQ ID NO: 22) secuencia de bases del cebador inverso usado en el ejemplo 3 (SEQ ID NO: 23) secuencia de bases de la sonda usada en el ejemplo 3 (SEQ ID NO: 24) secuencia de bases del cebador directo usado en el ejemplo 3 (SEQ ID NO: 25) secuencia de bases del cebador inverso usado en el ejemplo 3 (SEQ ID NO: 26) secuencia de bases de rno-mir-146b (SEQ ID NO: 27) secuencia de bases de hsa-mir-375 Ejemplo 1
Se inyecto una solucion de colagenasa P 0,7 mg/ml (Roche Diagnostics, Cat.11914428) en el pancreas de ratas Wistar macho (de 9 a 12 semanas de edad) por el conducto coledoco, y se retiro el pancreas. El bazo retirado se dejo reposar a 37°C durante 20 min, y el tejido del pancreas se rompio mediante pipeta y se lavo con HBSS (Invitrogen). Se preparo una suspension de celulas de los islotes por centrifugacion por gradiente de densidad usando Ficoll PM400 (Amersham Biotech). Las celulas de los islotes de cultivo primario de rata se obtuvieron de la suspension de celulas de los islotes mencionada antes, usando una solucion enzimatica para dispersar las celulas nerviosas (Nerve-Cell Culture System). Las celulas de los islotes de cultivo primario de rata se suspendieron en DMEM (Invitrogen) que contema glucosa 11 mM, suero de caballo al 1% (Invitrogen), HEPES 25 mM (Dojindo), y P.S. (Invitrogen). Las celulas de los islotes mencionadas antes suspendidas en DMEM se sembraron en una placa de 96 pocillos revestida con membrana basal Matrigel (Becton, Dickinson and Company) con 2,0x104 celulas/100 pl/pocillo. El dfa 2 despues de siembra, las celulas se transfectaron con el precursor de miARN Pre-miR (concentracion final 2,5 - 50 nM, adquirido en ABI, ID: PM10526) que expresa mmu-miR-199b* o Pre-miR control negativo n° 1 (10 nM, adquirido en ABI, ID: AM17110) usando DharmaFECT1 0,2 pl/pocillo (Thermo Scientific) en presencia de BrdU (concentracion final 10 pM) y, 24 h desde la transfeccion, el medio se cambio al DMEM mencionado antes anadido con BrdU 10 pM. Las ID y las secuencias de bases de los miARN maduros de los precursores de miARN Pre-miR usados en el ejemplo 1 y el ejemplo 2 mencionado mas adelante, se muestran en la tabla 1. El nivel de expresion del ARNm de mmu-miR-199b* despues de la transfeccion mencionada antes se analizo como sigue. Es decir, 2 dfas despues de la transfeccion, se preparo ADNc de acuerdo con el protocolo adjunto con el kit TaqMan MicroRNA Cells-to-Ct™ (Ambion) de las celulas de los islotes despues de transfeccion, y se aplicaron al metodo de RT-PCR cuantitativo (ABI prism 7900 Sequence Detection System, ABI) usando ensayos de miARN TaqMan (ABI). La ID del ensayo de miARN TaqMan ABI) mencionado antes se muestra en la tabla 1.
Nombre del miARN maduro
n° de acceso Secuencia de bases del miARN maduro ID de Pre- miR ID TaqMan
Pre-miR control Neg n° 1
AM17110
mmu-miR-199b*
MIMAT0000672 CCCAGUGUUUAGACUACCUGUUC (SEQ ID NO: 1) PM10526 001131
hsa-miR-199a-3p
MIMAT0000232 ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA (SEQ ID NO: 2) PM11779 002304
hsa-miR-199a-5p
MIMAT0000231 CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC (SEQ ID NO: 3) PM10893 000498
hsa-miR-199b-5p
MIMAT0000263 CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC (SEQ ID NO: 4) PM10553 000500
K)
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Como se muestra en la figura 1, el nivel de expresion de mmu-miR-199b* aumento notablemente de una forma dependiente de la concentracion del precursor de miARN Pre-miR que expresa mmu-miR-199b*.
Ejemplo 2
Las celulas de los islotes de cultivo primario de rata preparadas de la misma forma que en el ejemplo 1 se transfectaron con concentracion final del precursor de miARN Pre-miR 2,5 - 50 nM que expresa mmu-miR-199b* (adquirido en ABI, ID: PM10526), precursor de miARN Pre-miR que expresa hsa-miR-199a-3p (adquirido en ABI, ID: PM11779), precursor de miARN Pre-miR que expresa hsa-miR-l99a-5p (adquirido en ABI, ID: PM10893) o precursor de miARN Pre-miR que expresa hsa-miR-199b-5p (adquirido en AMBI, ID: PM10553), o Pre-miR control negativo n° 1 10 nM (adquirido en ABI, ID: AM17110), y se evaluo la actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas el dfa 5 desde la transfeccion. La actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas se evaluo espedficamente como sigue. Es decir, 5 dfas desde la transfeccion mencionada antes, las celulas de los islotes de cultivo primario de rata se sumergieron en para-formaldelmdo al 4% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a temperatura ambiente durante 30 min, y se sumergieron en solucion de HCl 1,5 N durante 1 h. Despues, las celulas se sumergieron en PBS (Invitrogen) que contema suero de cabra normal al 10% (GIBCO, en lo sucesivo denominado NGS) y Triton X-100 al 0,2% (Sigma) a temperatura ambiente durante 20 min. Ademas, se hizo reaccionar una solucion de anticuerpo policlonal de cobayo anti-insulina (ABCAM) y anticuerpo monoclonal de raton anti-BrdU (Dako) diluida 200 veces con NGS al 1% que contema PBS, a 4°C durante la noche, y las celulas se lavaron tres veces con PBS (200 pl/pocillo). Se hicieron reaccionar anticuerpo de cerdo anti-IgG de cobaya Alexa fluor 568 (Invitrogen) y anticuerpo de cabra anti-IgG de raton Alexa fluor 488 (Invitrogen) diluido 200 veces, y Hoechst33342 5 pM (Invitrogen) en PBS que contema NGS al 1% a temperatura ambiente durante 1 h. Las celulas se lavaron tres veces con PBS (200 pl/pocillo), y se sometieron a analisis por el Analizador IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), y se obtuvieron 20 campos de imagenes por 1 pocillo usando lentes de objetivo x10. Usando el programa Developer, se analizaron por pocillo aproximadamente 3000-4000 celulas de las celulas positivas para insulina y aproximadamente 500 de las celulas positivas para insulina y positivas para BrdU.
Los resultados obtenidos por el analisis mencionado antes se muestran en la figura 2. Como se muestra en la figura 2, debido a la expresion de mmu-miR-199b*, el numero de celulas positivas para insulina y positivas para BrdU aumento significativamente de una forma dependiente de la concentracion, y el numero de celulas positivas para insulina aumento significativamente por el tratamiento 50 nM. Por lo tanto, se mostro que las celulas p pancreaticas proliferan al aumentar la expresion genica de mmu-miR-199b* Ademas, como se muestra en la figura 3, se encontro que la expresion forzada de hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199a-5p o hsa-miR-199b-5p aumentaba significativamente el numero de celulas positivas para insulina y positivas para BrdU de una forma dependiente de la concentracion de cada precursor de miARN Pre-miR sometido a la transfeccion, y hada proliferar las celulas p pancreaticas de la misma forma que con mmu-miR-199b*
Ejemplo 3
De la misma forma que en el ejemplo 1, celulas de los islotes de cultivos primarios de rata se transfectaron con precursor de miARN Pre-miR que expresa mmu-miR-199b* (concentracion final 2,5 - 50 nM, adquirido en ABI, ID: PM10526) o Pre-miR control negativo n° 1 10 nM (adquirido en ABI, ID: AM17110). El dfa 2 desde la transfeccion, se extrajo el ARN total usando RNeasy96 (Qiagen) de las celulas de los islotes despues de dicha transfeccion. Se sintetizo ADNc a partir del ARN total usando un kit de reactivos PrimeScript RT (Takara). Usando el ADNc, se llevo a cabo un metodo de RT-PCR cuantitativo (ABI prism 7900 Sequence Detection System, ABI), y se calculo el nivel de expresion del ARNm de los genes de ciclina D1 y ciclina e2 por genes de protema de union a TATA (TBP). Las secuencias de las sondas y cebadores usadas para el presente analisis se muestran en la tabla 2.
Gen
Sonda dire eta inversa
rTBP
5'-Fam-CCACAGGGTGCCATGACTC 5'-CTTCCACCTTATGCTCAG 5'-GACT GAAGAT GGGAATT C
(SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19)
rCiclina D1
5'-Fam-AGAACAAGCAGATCATCCGCAA 5'-CACTTCCTCTCCAAAATG 5'-GGGTT GGAAAT GAACTT C
(SEQ ID NO: 20) (SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 22)
rCiclina E2
5'-Fam-CAGAGGAGATCACCAAGAAGCATC 5'-CCAAGAAGAGAAAAACAGC 5'-GCCAACAATTCCTAATCTC
(SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 24) (SEQ ID NO: 25)
K)
O)
Los resultados del calculo antes mencionado se muestran en la figura 4. Como se muestra en la figura 4, se encontro que mmu-miR-199b* promovfa la expresion de los genes de ciclina D1 y ciclina E2 de una forma dependiente de la concentracion del precursor de miARN introducido, y produda la proliferacion de celulas p pancreaticas.
5 Ejemplo de referencia
Usando un metodo equivalente al de los ejemplos 1 a 3 antes mencionados, se mostro que rno-mir-146b y hsa-mir- 375, cuyas ID y secuencias de bases se muestran en la siguiente tabla 3, tambien teman una actividad para acelerar la proliferacion de celulas p pancreaticas.
Tabla 3
Nombre del miARN
n° de acceso Secuencia madura
Pre-miR control Neg n° 1
rno-mir-146b
MIMAT0005595 UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCUGU (SEQ ID NO: 26)
hsa-mir-375
MIMAT0000728 UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA (SEQ ID NO: 27)
10
A partir de estos resultados, se sugirio que el miR-146b maduro, miR-375 maduro y sus precursores, tambien se pueden usar como un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes o un agente para la proliferacion de celulas p pancreaticas, como el polinucleotido de la presente invencion. Ademas, tambien se sugirio que el miR-146b maduro, miR-375 maduro y sus precursores, se pueden usar para el cribado de un farmaco profilactico o terapeutico 15 para la diabetes y similares, y la determinacion de la susceptibilidad a un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes y similares.
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un nuevo farmaco profilactico o terapeutico para enfermedades tales como la diabetes y similares. Ademas, se proporcionan un metodo para el cribado de un 20 farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes y similares, y un metodo para determinar la susceptibilidad a un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes y similares, que se basan en una nueva teona cientffica.
Esta solicitud se basa en la solicitud de patente n° 2010-156261 (fecha de presentacion: 8 de julio, 2010) presentada en Japon.

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un agente para usar en la profilaxis o tratamiento de la diabetes, que comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases
    5 mostrada en las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o un polinucleotido que comprende una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases, o una de sus sales.
  2. 2. El agente segun la reivindicacion 1, para usar en la profilaxis o tratamiento de la diabetes, que es un agente de proliferacion de celulas p pancreaticas.
  3. 3. Un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de
    10 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, o un polinucleotido que comprende una
    secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases, o una de sus sales, para usar en la profilaxis o tratamiento de la diabetes.
  4. 4. El polinucleotido segun la reivindicacion 3, para usar en la profilaxis o tratamiento de la diabetes, que se usa en la proliferacion de celulas p pancreaticas.
    15 5. Un metodo para cribar un farmaco para la profilaxis o tratamiento de la diabetes, que comprende
    (i) cultivar celulas que tienen una capacidad para expresar un polinucleotido que comprende una secuencia de bases igual o que tiene una homologfa no menor de 90% con la secuencia de bases mostrada por las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, en presencia o ausencia de una sustancia de ensayo, y
    (ii) medir y comparar los niveles de expresion del polinucleotido, en donde se selecciona una sustancia que 20 promueve la expresion del polinucleotido como un farmaco profilactico o terapeutico para la diabetes.
  5. 6. El metodo segun la reivindicacion 5, que es para el cribado de una sustancia que produce la proliferacion de celulas p pancreaticas.
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