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ES2373101T3 - Modulación de la expresión de apolipoproteína c-iii. - Google Patents

Modulación de la expresión de apolipoproteína c-iii. Download PDF

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ES2373101T3
ES2373101T3 ES04749914T ES04749914T ES2373101T3 ES 2373101 T3 ES2373101 T3 ES 2373101T3 ES 04749914 T ES04749914 T ES 04749914T ES 04749914 T ES04749914 T ES 04749914T ES 2373101 T3 ES2373101 T3 ES 2373101T3
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ES
Spain
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iii
apolipoprotein
oligonucleotide
antisense
seq
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ES04749914T
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English (en)
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Rosanne M. Crooke
Mark J. Graham
Kristina M. Lemonidis Tarbet
Kenneth W. Dobie
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Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

Un oligonucleótido antisentido de 20 a 30 nucleobases de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, en el que dicho oligonucleótido se hibrida específicamene con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III e inhibe la expresión de la apolipoproteína C-III y en el que dicho oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID Nº: 69, 71, 72, 73, 75, 78, 81, 84, 85, 86, 87 y 88 y tiene una secuencia que es al menos en el 90 % complementaria a dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III.

Description

Modulación de la expresión de apolipoproteína C-III
Campo de la invención
La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para modular la expresión de apolipoproteína C
5 III. En particular, la presente invención se refiere a compuestos, en particular compuestos oligonucleótidos que se hibridan con moléculas de ácidos nucleicos que codifican la apolipoproteína C-III. Dichos compuestos se muestran en el presente documento para modular la expresión de apolipoproteína C-III.
Antecedentes de la invención
Las lipoproteínas son partículas globulares, similares a micelas, que constan de un núcleo no polar de acilgliceroles y
10 ésteres de colesterilo rodeado por un recubrimiento anfífilo de proteína, fosfolípido y colesterol. Las lipoproteínas se han clasificado en cinco amplias categorías sobre la base de sus propiedades funcionales y físicas: quilomicrones, que transportan los lípidos de la dieta del intestino a los tejidos; lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL); lipoproteínas de densidad intermedia (IDL); lipoproteínas de baja densidad (LDL); todas ellas transportan triacilgliceroles y colesterol del hígado a los tejidos; y lipoproteínas de alta densidad (HDL), que transportan colesterol endógeno de los tejidos al
15 hígado.
Las partículas lipoproteicas experimentan un proceso metabólico continuo y tienen propiedades y composiciones variables. Las densidades de las lipoproteínas aumentan sin disminuir el diámetro de partícula debido a que la densidad de sus recubrimientos exteriores es inferior a la del núcleo interno. Los componentes proteicos de las lipoproteínas se conocen como apolipoproteínas. Al menos nueve apolipoproteínas están distribuidas en cantidades
20 significativas entre las diversas lipoproteínas humanas.
La apolipoproteína C-III es un constituyente de HDL y de lipoproteínas ricas en triglicéridos y tiene un papel en la eridemia hipertríglica, un factor de riesgo de enfermedad arterial coronaria. La apolipoproteína C-III ralentiza la eliminación de lipoproteínas ricas en triglicéridos inhibiendo la lipolisis, tanto inhibiendo la lipoproteína lipasa como interfiriendo en la unión de la lipoproteína a la matriz de glucosaminoglicano de la superficie celular (Shachter, Curr.
25 Opin. Lipidol., 2001, 12, 297-304).
El gen que codifica la apolipoproteína C-III humana (también denominada APOC3, APOC-III, APO CIII y APO C-III) fue clonado en 1984 por tres grupos de investigación (Levy-Wilson y col., DNA, 1984, 3, 359-364; Protter y col., DNA, 1984, 3, 449-456; Sharpe y col., Nucleic Acids Res., 1984, 12, 3917-3932).
La secuencia codificante está interrumpida por tres intrones (Protter y col., DNA, 1984, 3, 449-456). El gen de la
30 apolipoproteína C-III humana está ubicado aproximadamente a 2,6 kb en la dirección 3’ del gen de la apolipoproteína A-1 y estos dos genes se transcriben de forma convergente (Karathanasis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1985, 82, 6374-6378). También se clonó una variante de la apolipoproteína C-III humana con mutación Thr74 a Ala74 a partir de un paciente con un nivel inusualmente alto de apoliproteína C-III en suero. Debido a que la Thr74 está O-glucosilada, el mutante Ala74, por lo tanto, provocó unos niveles aumentados en suero de apolipoproteína C-III que carece del
35 resto carbohidrato (Maeda y col., J. Lipid Res., 1987, 28, 1405-1409).
Se han identificado cinco polimorfismos en la región promotora del gen: C(-641) a A, G(-630) a A, T(-625) a eliminación, C(-482) a T y T(-455) a C). Todos estos polimorfismos están en desequilibrio de unión con el polimorfismo SstI en la región 3’ no traducida. El sitio SstI distingue los alelos S1 y S2 y el alelo S2 se ha asociado con niveles elevados de triglicéridos en plasma (Dammerman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1993, 90, 4562-4566).
40 El promotor de apolipoproteína C-III está regulado a la baja por la insulina y este sitio polimórfico anula la regulación de insulina. De este modo, la sobreexpresión potencial de apolipoproteína C-III resultante de la pérdida de regulación de insulina puede ser un factor que contribuya al desarrollo de hipertrigliceridemia asociada con el alelo S2 (Li y col., J. Clin. Invest., 1995, 96, 2601-2605). El polimorfismo T(-455) a C se ha asociado con un aumento del riesgo de enfermedad arterial coronaria (Olivieri y col., J. Lipid Res., 2002, 43, 1450-1457).
45 Además de la insulina, se han identificado otros reguladores de la expresión del gen de la apolipoproteína III. Un elemento de respuesta para el receptor huérfano nuclear rev-erb alfa se ha localizado en las posiciones -23/-18 en la región promotora de la apolipoproteína C-III y el rev-erb alfa disminuye la actividad del promotor de la apolipoproteína C-III (Raspe y col., J. Lipid Res., 2002, 43, 2172-2179). La región promotora de la apolipoproteína C-III -86 a -74 se reconoce por dos factores nucleares CIIIb1 y CIIIB2 (Ogami y col., J. Biol. Chem., 1991, 266, 9640-9646). La expresión
50 de la apolipoproteína C-III está también regulada al alza por retinoides que actúan a través del receptor X retinoide, y las alteraciones en la abundancia del receptor X de retinoides afectan a la transcripción de apolipoproteína C-III (Vu-Dac y col., J. Clin. Invest., 1998, 102, 625-632). Se ha demostrado que la proteína de especificidad 1 (Sp1) y el factor nuclear del hepatocito 4 (HNF-4) actúan de forma sinérgica para transactivar el promotor de la apolipoproteína C-III a través del sitio de unión HNF-4 (Kardassis y col., Biochemistry, 2002, 41, 1217-1228). El HNF-4 también actúa
55 conjuntamente con SMAD3-SMAD4 para transactivar el promotor de la apolipoproteína C-III (Kardassis y col., J. Biol. Chem., 2000, 275, 41405-41414).
Se ha definido adicionalmente el papel de la apolipoproteína C-III en lipolisis usando ratones transgénicos e inactivados. La sobreexpresión de apolipoproteína C-III en ratones transgénicos provoca hipertrigliceridemia y una eliminación deficiente de triglicéridos VLDL (de Silva y col., J. Biol. Chem., 1994, 269, 2324-2335; Ito y col., Science, 1990, 249, 790-793). Los ratones inactivados con una ausencia total de la proteína apolipoproteína C-III mostraron
5 unos niveles significativamente reducidos de colesterol y triglicéridos en plasma en comparación con ratones de tipo silvestre y estaban protegidos de hipertrigliceridemia posprandial (Maeda y col., J. Biol. chem.,1994, 269, 2361023616).
Actualmente no existen agentes terapéuticos conocidos que afecten a la función de la apolipoproteína C-III. Se ha postulado que el efecto hipolipidémico de la clase de fármacos fibrato tiene lugar a través de un mecanismo en el 10 que el receptor activado por proliferadores de peroxisomas (PPAR) media el desplazamiento de HNF-4 desde el promotor de apolipoproteína C-III, dando como resultado la supresión transcripcional de la apolipoproteína C-III (Hertz y col., J. Biol. Chem., 1995, 270, 13470-13475). Los fármacos hipolipidémicos de la clase de las estatinas también reducen los niveles de triglicéridos usando un mecanismo desconocido que da como resultado el aumento de ARNm de la lipoproteína lipasa y una disminución de los niveles en plasma de apolipoproteína C-III (Schoonjans y col.,
15 FEBS Lett., 1999, 452, 160-164). En consecuencia, existe todavía una necesidad de agentes adicionales capaces de inhibir eficazmente la función de la apolipoproteína C-III.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido de 20 a 30 bases nitrogenadas de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, hibridándose específicamente dicho
20 oligonucleótido con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III e inhibiendo la expresión de la apolipoproteína C-III, y comprendiendo dicho oligonucleótido una secuencia seleccionada de entre las SEC ID Nº: 69, 71, 72, 73, 75, 78, 81, 84, 85, 86, 87 y 88 y tiene una secuencia que es al menos en un 90 % complementaria con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III.
La presente invención también proporciona un procedimiento de inhibición de la expresión de la apolipoproteína C-II
25 en células o tejidos in vitro que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el oligonucleótido antisentido de la invención de tal modo que se inhiba la expresión de apolipoproteína C-III.
La presente invención también proporciona un oligonucleótido antisentido de la invención para su uso en terapia.
Otros aspectos de la presente invención se establecen en las reivindicaciones.
Sumario de la divulgación
30 En el presente documento se divulgan composiciones y procedimientos para modular la expresión de apolipoproteína C-III. La tecnología antisentido surge como un medio eficaz para reducir la expresión de productos génicos específicos y es excepcionalmente útil en una serie de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación para la modulación de la expresión de la apolipoproteína C-III.
La presente divulgación se refiere a compuestos, especialmente oligómeros de ácidos nucleicos y similares a ácidos
35 nucleicos dirigidos a un ácido nucleico que codifica la apolopoproteína C-III y que modulan la expresión de la apolipoproteína C-III. También se divulgan composiciones farmacéuticas y de otro tipo que comprenden los compuestos que se divulgan en el presente documento.
También se divulgan procedimientos de análisis de moduladores de apolipoproteína C-III y procedimientos de modulación de la expresión de apolipoproteína C-III en células, tejidos o animales que comprenden poner en
40 contacto dichas células, tejidos o animales con uno o varios compuestos o composiciones de la divulgación. En estos procedimientos, las células o tejidos se ponen en contacto in vivo. Alternativamente, las células o tejidos se ponen en contacto ex vivo.
También se exponen en el presente documento procedimientos para tratar un animal, en particular un ser humano, sospechoso de tener, o que es propenso a tener, una enfermedad o afección asociada con la expresión de la
45 apolipoproteína C-III. Dichos procedimientos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente o profilácticamente activa de uno o varios de los compuestos o composiciones de la divulgación a una persona con necesidad de tratamiento.
También se divulga un procedimiento para preparar un compuesto de la divulgación que comprende hibridar específicamente in vitro una primera cadena de bases nitrogenadas de al menos 8 bases nitrogenadas contiguas a la
50 secuencia establecida en la SEC ID Nº: 4 y/o la SEC ID Nº: 18 a una segunda cadena de bases nitrogenadas que comprende una secuencia lo suficientemente complementaria a dicha primera cadena de tal modo que se permita una hibridación estable.
También se divulga en el presente documento un compuesto de la invención para su uso en terapia.
También se divulga en el presente documento el uso de un compuesto o composición de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de todas las afecciones divulgadas en el presente documento y de cualquiera de las mismas.
Descripción detallada
A. Visión general
5 La presente divulgación usa compuestos, preferentemente oligonucleótidos y especies similares, para su uso en la modulación de la función o el efecto de moléculas de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína C-III. Esto se realiza proporcionando oligonucleótidos que se hibridan específicamente con una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína C-III.
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "ácido nucleico diana" y "molécula de ácido nucleico
10 que codifica la apolipoproteína C-III" se han usado por conveniencia para incluir ADN que codifica la apolipoproteína C-III, ARN (incluidos pre-ARNm o ARNm y porciones de los mismos) transcrito a partir de dicho ADN y también ADNc derivado de dicho ARN.
La hibridación de un compuesto de la presente invención con su ácido nucleico diana se denomina generalmente como “antisentido". En consecuencia, el mecanismo incluido en la práctica de realizaciones de la invención se
15 denomina en el presente documento como “inhibición antisentido". Dicha inhibición antisentido se basa típicamente en la hibridación basada en enlaces de hidrógeno de cadenas o segmentos de oligonucleótidos de tal manera que al menos una cadena o un segmento se escinda, se degrade o se vuelva no operativa de cualquier otro modo. A este respecto, es preferente actualmente dirigirse a moléculas específicas de ácido nucleico y a sus funciones para dicha inhibición antisentido.
20 Las funciones de ADN sobre las que se interfiere incluyen replicación y transcripción. La replicación y la transcripción, por ejemplo, pueden ser a partir de una plantilla celular endógena, un vector, un constructo de plásmido o de otro tipo. Las funciones de ARN sobre las que se interfiere pueden incluir funciones tales como translocación del ARN a un sitio de traducción de proteínas, translocación del ARN a sitios dentro de la célula que están distantes del sitio de síntesis de ARN, traducción de proteínas a partir de ARN, ayuste del ARN para
25 proporcionar una o varias especies de ARN y actividad catalítica o formación de complejos que implican al ARN en las que puede estar involucrado, o pueden estar facilitadas por, el ARN. Un resultado preferente de dicha interferencia con la función de ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de apolipoproteína C-III. En el contexto de la presente divulgación, "modulación" y "modulación de la expresión" quieren decir o bien un aumento (estimulación) o una disminución (inhibición) en la cantidad o en los niveles de una molécula de ácido nucleico que codifica el gen, por
30 ejemplo, ADN o ARN. La inhibición es a menudo la forma preferente de modulación de la expresión y el ARNm es a menudo el ácido nucleico diana preferente.
En el contexto de la presente invención, “hibridación” significa el apareamiento de cadenas complementarias de compuestos oligoméricos. En la presente invención, el mecanismo preferente de apareamiento implica enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen inversos, entre
35 nucleósidos complementarios o bases nitrogenadas (bases nucleótidas) complementarias de las cadenas de compuestos oligoméricos. Por ejemplo, la adenina y la timina son bases nitrogenadas complementarias que se aparean mediante la formación de enlaces de hidrógeno. La hibridación puede tener lugar en diversas circunstancias.
Un compuesto antisentido puede hibridarse específicamente cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleido diana para provocar una pérdida de actividad, y existe un grado
40 suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a las secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en ensayos in vivo o tratamiento terapéutico y en condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
En la presente invención la expresión “condiciones de hibridación restrictivas” o “condiciones restrictivas” se refiere a
45 condiciones en las que un compuesto de la invención se hibridará a su secuencia diana, pero a un número mínimo de otras secuencias. Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia y son diferentes en circunstancias diferentes. En el contexto de la presente invención, “condiciones restrictivas” en las que los compuestos oligoméricos se hibridan a una secuencia diana se determina por la naturaleza y la composición de los compuestos oligoméricos y los ensayos en los que se está investigando.
50 "Complementario", tal como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad para un apareamiento preciso entre dos bases nitrogenadas de un compuesto oligomérico. Por ejemplo, si una base nitrogenada en una posición determinada de un oligonucleótido (un compuesto oligomérico) es capaz de formar un enlace de hidrógeno con una base nitrogenada en una posición determinada de un ácido nucleico diana, siendo dicho ácido nucleico diana una molécula de ADN, de ARN o de oligonucleótido, entonces la posición del enlace de hidrógeno entre el oligonucleótido y el
55 ácido nucleico diana se considera que es una posición complementaria. El oligonucleótido y la molécula adicional de ADN, ARN u oligonucleótido son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones complementarias de cada molécula están ocupadas por bases nitrogenadas que pueden formar enlaces de hidrógeno una con otra. De este modo, "que puede hibridarse específicamente" y "complementario" son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de apareamientos precisos o complementariedad a lo largo de un número suficiente de bases nitrogenadas de tal modo que tenga lugar una unión estable y específica entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana.
Se entiende en la técnica que la secuencia del compuesto antisentido puede ser, pero no necesita ser,
5 complementaria al 100 % a la del ácido nucleico diana para poder hibridarse específicamente. Además, un oligonucleótido puede hibridarse a lo largo de uno o varios segmentos de tal modo que segmentos interpuestos o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle o estructura de horquilla). En una realización, los compuestos antisentido de la presente divulgación comprenden al menos el 70 %,
o al menos el 75 %, o al menos el 80 %, o al menos el 85 % de complementariedad de secuencia a una región diana
10 que se encuentra dentro del ácido nucleico diana. En otra realización, los compuestos antisentido de la presente divulgación comprenden el 90 % de complementariedad de secuencia e, incluso más preferentemente, comprenden el 95 % o al menos el 99 % de complementariedad de secuencia con la región diana que se encuentra dentro de la secuencia de ácido nucleico diana a la que están dirigidos. Preferentemente, los compuestos antisentido comprenden al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de un compuesto antisentido divulgado en el presente documento. Por
15 ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 bases nitrogenadas del compuesto antisentido son complementarias a la región diana y, por lo tanto, se hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las bases nitrogenadas no complementarias restantes pueden estar agrupadas
o intercaladas entre bases nitrogenadas complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o a bases nitrogenadas complementarias. Como tal, un compuesto antisentido de 18 bases nitrogenadas de longitud que tiene 4 20 (cuatro) bases nitrogenadas no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría un 77,8 % de complementariedad total con el ácido nucleico diana y estaría, por lo tanto, dentro del alcance de la presente divulgación. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana puede determinarse de forma rutinaria usando los programas BLAST (basic local alignment search tools (herramienta básica de búsqueda de alineamientos locales)) y los
25 programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656).
El porcentaje de homología, de identidad de secuencia o de complementariedad puede determinarse por, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 cuatro Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, Estados Unidos), usando la configuración predeterminada, que usa el 30 algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489). En algunas realizaciones preferentes, la homología, la identidad de secuencia o la complementariedad, entre el oligómero y la diana es de entre aproximadamente el 50 % y aproximadamente el 60 %. En algunas realizaciones, la homología, la identidad de secuencia o la complementariedad es de entre aproximadamente el 60 % y aproximadamente el 70%. En realizaciones preferentes, la homología, la identidad de secuencia o la complementariedad es de entre 35 aproximadamente el 70 % y aproximadamente el 80 %. En realizaciones más preferentes, la homología, la identidad de secuencia o la complementariedad es de entre aproximadamente el 80 % y aproximadamente el 90 %. En realizaciones preferentes, la homología, la identidad de secuencia o la complementariedad es de aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 92 %, de aproximadamente el 94 %, de aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 96 %, de aproximadamente el 97 %, de aproximadamente el 98 % o de aproximadamente el 99
40 %.
B. Compuestos
De acuerdo con la presente divulgación, los compuestos incluyen compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), empalmadores alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos que se hibridan con al menos una porción del
45 ácido nucleico diana. Como tales, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos de cadena sencilla, de cadena doble circulares o con forma de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias o bucles internos o terminales. Una vez introducidos en un sistema, los compuestos pueden facilitar la acción de una o varias enzimas o proteínas estructurales para efectuar la modificación del ácido nucleico diana.
50 Un ejemplo no limitante de dichas enzimas es la ARNasa H, una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena sencilla que son “similares a ADN” producen como respuesta ARNasa H. La activación de ARNasa H, por lo tanto, da como resultado una escisión de la diana de ARN, potenciando de este modo enormemente la eficacia de la inhibición mediada por oligonucleótidos de la expresión génica. Se han postulado papeles similares para otras ribonucleasas tales como las
55 de las familias de enzimas ARNasa III y ribonucleasa L.
Aunque la forma preferente de compuesto antisentido es un oligonucleótido monocatenario, en muchas especies la introducción de estructuras bicatenarias, tales como moléculas de ARN bicatenario (ARNds) induce una reducción potente y específica mediada por antisentido de la función de un gen o de sus productos génicos asociados. Este fenómeno tiene lugar tanto en plantas como en animales y se cree que tiene una conexión evolutiva con la defensa
60 contra los virus y el silenciamiento de transposones.
La primera evidencia de que el ARNds podría provocar el silenciamiento génico en animales se tuvo en 1995 por el trabajo en el nematodo, Caenorhabditis elegans (Guo y Kempheus, Cell, 1995, 81, 611-620). Los efectos de interferencia principales del ARNds son postranscripcionales (Montgomery y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507). El mecanismo antisentido postranscripcional definido en Caenorhabditis elegans resultante de la
5 exposición al ARN bicatenario (ARNds) se ha denominado desde entonces ARN de interferencia (ARNi). Se ha generalizado que este término significa silenciamiento génico mediado por antisentido que implica la introducción de ADNds que provoca la reducción específica de secuencia de niveles de ARNm dirigido endógeno (Fire y col., Nature, 1998, 391, 806-811). Recientemente, se ha informado que estos oligómeros de ARN monocatenario de polaridad antisentido de los ARNds son inductores potentes de ARNi (Tijsterman y col., Science, 2002, 295, 694-697).
10 En el contexto de la presente invención, la expresión "compuesto oligomérico" se refiere a un polímero u oligómero que comprende una pluralidad de unidades monoméricas. En el contexto de la presente invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o desoxirribonucleico (ADN) o miméticos, quimeras, análogos y homólogos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos por bases nitrogenadas de origen natural, azúcares y enlaces covalentes entre nucleósidos (esqueleto), así como
15 oligonucleótidos que no tienen porciones de origen natural que operan de modo similar. Dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos son preferentes a menudo sobre las formas nativas debido a unas propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular potenciada, afinidad potenciada por un ácido nucleico diana y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos de la presente invención también incluyen oligonucleótidos modificados en los que una base
20 nitrogenada diferente está presente en una o varias de las posiciones de nucleótidos en el oligonucleótido. Por ejemplo, si el primer nucleótido es adenosina, pueden producirse oligonucleótidos modificados que contengan timidina, guanosina o citidina es esta posición. Esto puede realizarse en cualquiera de las posiciones del oligonucleótido. Estos oligonucleótidos se analizan después usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresión de la apolipoproteína C-III.
25 Aunque los oligonucleótidos son una forma preferente de los compuestos de la presente divulgación, la presente divulgación comprende también otras familias de compuestos, incluidos, pero no limitados a, análogos y miméticos de oligonucleótidos tales como los que se describen en el presente documento.
Los compuestos según la divulgación comprenden preferentemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleósidos enlazados). Un experto en
30 la técnica apreciará que esto abarca compuestos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 bases nitrogenadas de longitud.
En una realización preferente, los compuestos tienen de 12 a 50 bases nitrogenadas de longitud. Un experto en la
35 técnica apreciará que esto abarca compuestos de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 bases nitrogenadas de longitud.
En una realización preferente, los compuestos tienen de 15 a 30 bases nitrogenadas de longitud. Un experto en la técnica apreciará que esto abarca compuestos de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 bases nitrogenadas de longitud.
40 Son compuestos particularmente preferentes los oligonucleótidos de aproximadamente 12 a aproximadamente 50 bases nitrogenadas; son incluso más preferentes los que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 bases nitrogenadas.
Los compuestos antisentido de 8-80 bases nitrogenadas de longitud que comprenden un tramo de al menos ocho (8) bases nitrogenadas consecutivas seleccionadas de entre los compuestos antisentido ilustrativos se consideran
45 también compuestos antisentido adecuados.
Los compuestos antisentido preferentes incluyen secuencias de oligonucleótidos que comprenden al menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas desde el extremo 5’ de uno de los compuestos antisentido preferentes ilustrativos (siendo las bases nitrogenadas restantes un tramo consecutivo del mismo oligonucleótido que comienza inmediatamente cadena arriba del extremo 5’ del compuesto antisentido que puede hibridarse específicamente al 50 ácido nucleico diana y que continúa hasta el oligonucleótido que comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas). Similarmente, los compuestos antisentido preferentes están representados por secuencias de oligonucleótidos que comprenden al menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas desde el extremo 3’ de uno de los compuestos antisentido preferentes ilustrativos (siendo las bases nitrogenadas restantes un tramo consecutivo del mismo oligonucleótido que comienza inmediatamente cadena abajo del extremo 55 3’ del compuesto antisentido que puede hibridarse específicamente al ácido nucleico diana y que continúa hasta el oligonucleótido que comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas). Pueden encontrarse identificados ejemplos de compuestos de una variedad de fuentes de mamífero, incluido el ser humano, en los ejemplos y enumerados en las tablas 1 a 21. Un experto en la técnica equipado con los compuestos
antisentido preferentes que se ilustran en el presente documento será capaz, sin una experimentación excesiva, de identificar compuestos antisentido preferentes adicionales.
C. Dianas
"Dirigir” un compuesto antisentido a una molécula de ácido nucleico diana que codifica la apolipoproteína C-III, en el
5 contexto de la presente invención, puede ser un proceso de varias etapas. El proceso comienza habitualmente con la identificación de un ácido nucleico diana cuya función es ser modulado. Este ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir de un gen) cuya expresión esté asociada con un trastorno o estado patológico particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la presente invención, el ácido nucleico diana codifica la apolipoproteína C-III.
10 El proceso de dirección también incluye habitualmente la determinación de al menos una región, segmento o sitio diana dentro del ácido nucleico diana para una interacción antisentido que tenga lugar de tal modo que dé como resultado el efecto deseado, por ejemplo, la modulación de la expresión. Dentro del contexto de la presente invención, el término “región” se define como una porción de un ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Dentro de las regiones de ácidos nucleicos diana están los segmentos. Los “segmentos” se
15 definen como regiones más pequeñas o subporciones de regiones dentro del ácido nucleico diana. ”Sitios", tal como se usa este término en la presente invención, se definen como posiciones dentro de un ácido nucleico diana.
Ya que, tal como se sabe en la técnica, el codón de iniciación de la traducción es típicamente 5’-AUG (en moléculas de ARNm transcrito; 5’-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de iniciación de la traducción también se denomina "codón AUG", el "codón de inicio" o el "codón de inicio AUG". Se ha demostrado que una minoría de genes, 20 que tienen codones de iniciación de la traducción con la secuencia de ARN 5’-GUG, 5’-UUG o 5’-CUG, y 5’-AUA, 5’-ACG y 5’-CUG, operan in vivo. De este modo "codón de iniciación de la traducción" y "codón de inicio" pueden abarcar muchas secuencias de codones, incluso aunque el aminoácido iniciador en cada caso sean típicamente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). También se sabe en la técnica que los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, cualquiera de los cuales puede usarse con preferencia para la 25 iniciación de la traducción en un tipo celular o tejido particular, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la presente invención, "codón de inicio" y "codón de iniciación de la traducción" se refiere al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la traducción de un ARNm transcrito a partir de un gen que codifica la apolipoproteína C-III, independientemente de la(s) secuencia(s) de dichos codones. También se sabe en la técnica que un codón de terminación de la traducción (o “codón de detención”) de un gen puede tener de una a tres secuencias, es
30 decir, 5’-UAA, 5’-UAG y 5’-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5’-TAA, 5’-TAG y 5’-TGA, respectivamente).
Las expresiones “región de codón de inicio” y “región de codón de iniciación de la traducción” se refieren a una porción de dicho ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5’ o 3’) a partir de un codón de iniciación de la traducción. De modo similar, las 35 expresiones “región de codón de detención” y “región de codón de terminación de la traducción” se refieren a una porción de dicho ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5’ o 3’) a partir de un codón de terminación de la traducción. En consecuencia, la “región de codón de inicio” (o “región de codón de iniciación de la traducción”) y la "región de codón de detención" (o “región de codón de terminación de la traducción”) son todas las regiones que pueden ser dianas eficaces para los
40 compuestos antisentido que se divulgan en el presente documento.
El marco de lectura abierto (ORF) o "región codificante", que se sabe en la técnica que se refiere a la región entre el codón de iniciación de la traducción y el codón de terminación de la traducción, también es una región que puede ser una diana eficaz. Dentro del contexto del presente divulgación, una región preferente es la región intragénica que abarca el codón de iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierto (ORF) de un gen.
45 Otras regiones diana incluyen la región no traducida 5’ (5’UTR), conocida en la técnica por referirse a la porción de un ARNm en la dirección 5’ a partir de un codón de iniciación de la traducción y que, de este modo, incluye nucleótidos entre el sitio de remate 5’ y el codón de iniciación de la traducción de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen), y la región no traducida 3’ (3’UTR), conocida en la técnica por referirse a la porción de un ARNm en la dirección 3’ a partir de un codón de iniciación de la traducción y que, de este modo, incluye
50 nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3’ de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). El sitio de remate 5’ de un ARNm comprende un resto de guanosina metilada en N7 unido al resto del extremo 5’ del ARNm por medio de un enlace 5'-5' trifosfato. La región de remate 5’ de un ARNm se considera que incluye la estructura de remate 5’ en sí misma así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio de remate. También es preferente dirigirse a la región de remate 5’.
55 En consecuencia, la presente divulgación incluye compuestos antisentido que se dirigen a una porción de bases nitrogenadas 1 – 533 tal como se expone en la SEC ID Nº: 18. En una realización, los compuestos antisentido se dirigen al menos a una porción de 8 bases nitrogenadas de las bases nitrogenadas 1 -533 tal como se expone en la SEC ID Nº: 18 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región 5’ UTR tal como se expone en la SEC ID Nº: 18 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región 3’ UTR tal como se expone en la SEC ID Nº: 18 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región codificante tal como se expone en la SEC ID Nº: 18 y las tablas 1 y 4. En otras
5 realizaciones más, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de 8 bases nitrogenadas de un “segmento diana preferente” (tal como se define en el presente documento) tal como se expone en la tabla 3.
Además, la presente divulgación incluye compuestos antisentido que se dirigen a una porción de bases nitrogenadas 1 – 3958 tal como se expone en la SEC ID Nº: 4. En una realización, los compuestos antisentido se dirigen al menos a una porción de 8 bases nitrogenadas de las bases nitrogenadas 1 -3958 tal como se expone en la SEC ID Nº: 4 y las 10 tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región 5’ UTR tal como se expone en la SEC ID Nº: 4 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que comprende la región 3’ UTR tal como se expone en la SEC ID Nº: 4 y las tablas 1 y 4. En otra realización, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de bases nitrogenadas de 8 bases nitrogenadas que
15 comprende la región codificante tal como se expone en la SEC ID Nº: 4 y las tablas 1 y 4. En otras realizaciones más, los compuestos antisentido se dirigen a al menos una porción de 8 bases nitrogenadas de un “segmento diana preferente” (tal como se define en el presente documento) tal como se expone en la tabla 3.
Aunque algunos tránscritos de ARNm eucariótico se traducen directamente, muchos contienen uno o varias regiones, conocidas como “intrones” que se escinden de un tránscrito antes de traducirse. Las regiones restantes (y, por lo tanto, 20 traducidas) son conocidas como “exones” y se empalman entre sí para formar una secuencia de ARNm continua. Los sitios de ayuste diana, por ejemplo, empalmes intrón-exón o empalmes exón-intrón, también pueden ser particularmente útiles en situaciones en las que el ayuste aberrante está implicado en una enfermedad, o en el que una sobreproducción de un producto de ayuste particular está implicada en una enfermedad. Las uniones de fusión aberrante debidas a reordenamientos o deleciones también son sitios diana preferentes. Los tránscritos de producidos mediante el proceso
25 de ayuste de dos (o más) ARNm de diferentes fuentes génicas son conocidos como "tránscritos de fusión". También se sabe que los intrones pueden actúar como dianas eficaces usando compuestos antisentido que se dirigen, por ejemplo, a ADN o pre-ARNm.
Los tránscritos de ARN alternativos pueden producirse a partir de la misma región genómica de ADN. Estos tránscritos alternativos se conocen generalmente como "variantes". Más específicamente, "las variantes pre-ARNm"
30 son tránscritos producidos a partir del mismo ADN genómico que difieren de otros tránscritos producidos a partir del mismo ADN genómico en bien su posición de inicio o bien su posición de detención y contienen tanto secuencias intrónicas como exónicas.
Por medio de la escisión de una o varias regiones exónicas o intrónicas, o porciones de las mismas, durante el ayuste, las variantes de pre-ARNm producen "variantes de ARNm” más pequeñas. En consecuencia, las variantes de
35 ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante pre-ARNm única debe producir siempre una variante de ARNm única como resultado del ayuste. Estas variantes de ARNm se conocen también como “variantes de ayuste alternativas". Si no tiene lugar un ayuste de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es idéntica a la variante de ARNm .
Las variantes pueden producirse mediante el uso de señales alternativas para iniciar o detener la transcripción. Los
40 pre-ARNm y ARNm pueden poseer más de un codón de inicio o codón de detención. Las variantes que se origina a partir de pre-ARNm o ARNm que usan codones de inicio alternativos son conocidos como “variantes de inicio alternativas” de ese pre-ARNm o ARNm. Esos tránscritos que usan un codón de detención alternativo son conocidos como "variantes de detención alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo específico de variante de detención alternativa es la “variante poliA” en la que los múltiples tránscritos producidos son el resultado de la selección
45 alternativa de una de las “señales de detención poliA” por la maquinaria de la transcripción, produciendo, por lo tanto, tránscritos que terminan en sitios poliA únicos. Dentro del contexto de la divulgación, los tipos de variantes descritos en el presente documento también son ácidos nucleicos diana preferentes.
Las localizaciones del ácido nucleico diana a las que los compuestos antisentido preferentes se hibridan se denominan en adelante en el presente documento “segmentos diana preferentes". Tal como se usa en el presente
50 documento la expresión "segmento diana preferente" se define como al menos una porción de 8 bases nitrogenadas de una región diana a la que se dirige un compuesto antisentido activo. Aunque sin pretender vincularse a ninguna teoría, se cree actualmente que estos segmentos diana representan porciones del ácido nucleico diana que son accesibles para la hibridación.
Aunque las secuencias específicas de determinados segmentos diana preferentes se exponen en el presente
55 documento, un experto en la técnica reconocerá que éstas sirven para ilustrar y describen realizaciones particulares dentro del alcance de la presente divulgación. Los segmentos diana preferentes adicionales pueden ser identificados por un experto.
Los segmentos diana de 8-80 bases nitrogenadas de longitud que comprenden un tramo de al menos ocho (8) bases nitrogenadas consecutivas seleccionadas de entre los segmentos diana preferentes ilustrativos se consideran
también dianas adecuadas.
Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas a partir del extremo 5' de uno de los segmentos diana preferentes ilustrativos (siendo las bases nitrogenadas restantes un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente cadena arriba 5 del extremo 5’ del segmento diana y que continúa hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas). De forma similar, los segmentos diana preferentes están representados por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas a partir del extremo 3' de uno de los segmentos diana preferentes ilustrativos (siendo las bases nitrogenadas restantes un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente cadena abajo del extremo 3’ del segmento diana
10 y que continúa hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 bases nitrogenadas). Un experto en la técnica equipado con los segmentos diana preferentes que se ilustran en el presente documento será capaz, sin experimentación excesiva, de identificar segmentos diana preferentes adicionales.
Una vez una o varias regiones, segmentos o sitios diana se haya identificado, se eligen los compuestos antisentido que sean lo suficientemente complementarios a la diana, es decir, que se hibrida lo suficientemente bien y con
15 especificidad suficiente para proporcionar el efecto deseado.
Los compuestos oligoméricos están dirigidos o no están dirigidos a regiones de la secuencia de bases nitrogenadas de la apolipoproteína C-III diana (por ejemplo, tales como las dadas a conocer en los ejemplos 15 y 17) que comprenden las bases nucleótidos 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501550, 551-600, 601-650, 651-700, 701-750, 751-800, 801-850, 851-900, 901-950, 951-1000, 1001-1050, 1051-1100, 20 1101-1150, 1151-1200, 1201-1250, 1251-1300, 1301-1350, 1351-1400, 1401-1450, 1451-1500, 1501-1550, 1551-1600, 1601-1650, 1651-1700, 1701-1750, 1751-1800, 1801-1850, 1851-1900, 1901-1950, 1951-2000, 2001-2050, 2051-2100, 2101-2150, 2151-2200, 2201-2250, 2251-2300, 2301-2350, 2351-2400, 2401-2450, 2451-2500, 2501-2550, 2551-2600, 2601-2650, 2651-2700, 2701-2750, 2751-2800, 2801-2850, 2851-2900, 2901-2950, 2591-3000, 3001-3050, 3051-3100, 3101-3150, 3151-3200, 3201-3250, 3251-3300, 3301-3350, 3351-3400, 3401-3450, 3451-3500, 3501-3550, 3551-3600,
25 3601-3650, 3651-3700, 3701-3750, 3751-3800, 3801-3850, 3851-3900, 3901-3950, 3951-3958 de SEC ID Nº: 4, o cualquier combinación de las mismas.
Además, los compuestos oligoméricos están dirigidos o no están dirigidos a regiones de la secuencia de bases nitrogenadas de la apolipoproteína C-III diana (por ejemplo, tales como las dadas a conocer en los ejemplos 15 y 17) que comprenden las bases nucleótidos 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401
30 450, 451-500, 501-533 de la SEC ID Nº: 18, o cualquier combinación de las mismas.
En una realización, los compuestos oligonucleótidos son 100 % complementarios a estas secuencias o a secuencias pequeñas encontradas dentro de cada una de las secuencias enumeradas anteriormente. Preferentemente, los compuestos antisentido comprenden al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de un compuesto antisentido divulgado en el presente documento. En otra realización, los compuestos oligonucleótidos tienen de al menos 3 ó 5
35 bases nitrogenadas no coincidentes por cada 20 consecutivas en posiciones de bases nitrogenadas individuales a estas regiones diana. Otros compuestos más están dirigidos a regiones de superposición de las porciones identificadas anteriormente de la secuencia de la apoliproteína C-III.
D. Selección y validación de la diana
En una realización adicional, los “segmentos diana preferentes” identificado en el presente documento pueden
40 usarse en un proceso de selección para determinar compuestos adicionales que modulen la expresión de la apolipoproteína C-III. Los "moduladores" son los compuestos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III y que comprende al menos una porción de 8 bases nitrogenadas que es complementaria a un segmento diana preferente. El procedimiento de selección comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana preferente de una molécula de ácido nucleico que codifica la
45 apolipoproteína C-III con uno o más moduladores candidatos y seleccionar uno o varios moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III. Una vez se demuestre que el modulador o los moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, o bien disminuyendo o bien aumentando) la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apopoliproteína C-III, el modulador puede usarse en otros estudios de investigación de la función de la apolipoproteína C-III, o como
50 agente de investigación, de diagnóstico o terapéutico según la presente invención.
Los segmentos diana preferentes que se divulgan en la presente invención también pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos para formar oligonucleótidos bicatenarios (duplicados) estabilizados.
Se ha demostrado en la técnica que dichos restos de oligonucleótido bicatenario modulan la expresión diana y la
55 traducción regulada, así como el procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Además, los restos bicatenarios pueden ser objeto de modificaciones químicas (Fire y col., Nature, 1998, 391, 806-811; Timmons y Fire, Nature 1998, 395, 854; Timmons y col., Gene, 2001, 263, 103-112; Tabara y col., Science, 1998, 282, 430-431; Montgomery y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502-15507; Tuschl y col., Genes Dev., 1999, 13, 31913197; Elbashir y col., Nature, 2001, 411, 494-498; Elbashir y col., Genes Dev. 2001, 15, 188-200). Por ejemplo, se ha demostrado que dichos restos bicatenarios inhiben la diana mediante la hibridación clásica de cadena antisentido del dúplex a la diana, desencadenando, por lo tanto, la degradación enzimática de la diana (Tijsterman y col., Science, 2002, 295, 694-697).
5 Los compuestos de la presente invención también se pueden aplicar en los sectores de descubrimiento de fármacos y la validación de dianas. La presente invención comprende el uso de los compuestos y segmentos dianas preferentes identificados en el presente documento en investigaciones de descubrimiento de fármacos para elucidar la relación que existe entre la apolipoproteína C-III y un estado patológico, fenotipo o afección. Estos procedimientos incluyen detectar o modular la apolipoproteína C-III que comprende poner en contacto una muestra, tejido, célula u organismo
10 con los compuestos de la presente invención, medir el nivel de ácido nucleico o proteína de apolipoproteína C-III y/o un punto final fenotípico o químico relacionado en un punto temporal después del tratamiento y, opcionalmente, comparar el valor medido con una muestra no tratada o una muestra tratada con un compuesto adicional de la presente invención. Estos procedimientos también pueden realizarse en paralelo o en combinación con otros experimentos para determinar la función de genes desconocidos para el proceso de validación de diana o para
15 determinar la validez de un producto génico particular como una diana para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, afección o fenotipo particular.
E. Kits, reactivos de investigación, agentes de diagnóstico y agentes terapéuticos
Los compuestos de la presente invención se usan para agentes de diagnóstico, terapéuticos, de profilaxis y como reactivos de investigación y kits. En una realización, dichos compuestos de la presente invención son útiles en
20 sectores de obesidad y trastores relacionados con el metabolismo tales como hiperlipidemia. Además, los oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con especifidad exquisita, se usan a menudo por los expertos para elucidar la función de genes particulares o para distinguir entre funciones de varios miembres de una ruta biológica.
Para su uso en kits y agentes de diagnóstico, los compuestos de la presente invención, bien solos o bien en
25 combinación con otros compuestos o productos terapéuticos, se usan como herramientas en análisis diferenciales y/o combinatorios para elucidar los patrones de expresión de una porción o el complemento total de genes expresados dentro de células y tejidos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "sistema" se define como cualquier organismo, célula, cultivo celular o tejido que expresa, o se hace competente para expresar productos del gen que codifica la apolipoproteína
30 C-III. Éstos incluyen, pero no están limitados a, seres humanos, animales transgénicos, células, cultivos celulares, tejidos, xenotransplantes y combinaciones de los mismos
Como un ejemplo no limitante, los patrones de expresión dentro de células o tejidos tratados con uno o varios compuestos antisentido se comparan con células o tejidos control no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan para determinar niveles diferenciales de expresión génica tal como se aplican, por
35 ejemplo, para asociación de enfermedades, ruta de señalización, localización celular, nivel de expresión, tamaño, estructura o función de los genes examinados. Estos análisis pueden realizarse en células estimuladas o no estimuladas y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan a patrones de expresión.
Los ejemplos de procedimientos de análisis de expresión génica conocidos en la técnica incluyen chips o microchips de ADN (Brazma y Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celis, y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16), SAGE (serial analysis 40 of gene expresión (análisis en serie de la expresión génica))(Madden y col., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425), READS (restriction enzyme amplification of digested cDNAs (amplificación de enzimas de restricción de ADN digeridos) (Prashar y Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (total gene expression analysis (análisis de expresión génica total)) (Sut-cliffe y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 1976-81), chips de proteínas y proteómica (Celis y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut y col., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciación 45 de etiquetas de secuencias expresadas (EST) (Celis y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson y col., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), huella genética de ARN sustractiva (SuRF) (Fuchs y col., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larson y col., Cytometry, 2000, 41, 203-208), clonación sustractiva, presentación diferencial (DD) (Jurecic y Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), hibridación genómica comparativa (Carulli y col., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), técnicas de FISH (hibridación fluorescente in situ) (Going y Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904)
50 y procedimientos de espectrometría de masas (To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41).
Los compuestos de la presente invención son útiles para investigación y diagnóstico, debido a que estos compuestos se hibridan con ácidos nucleicos que codifican apolipoproteína C-III. Por ejemplos, los oligonucleótidos que se ha demostrado que se hibridan con la eficacia y en las condiciones que se divulgan en el presente documento como para ser inhibidores eficaces de la apolipoproteína C-III también serán cebadores y sondas 55 eficaces en condiciones que favorecen la amplificación o la detección de genes, respectivamente. Estos cebadores y sondas son útiles en procedimientos que requieren la detección específica de moléculas de ácidos nucleicos que codifican la apolipoproteína C-III y en la amplificación de dichas moléuclas de ácidos nucleicos para la detección o para su uso en estudios posteriores de la apolipoproteína C-III. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido, particularmente los cebadores y sondas, de la invención con un ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III
puede detectarse por medios conocidos en la técnica. Dichos medios pueden incluir la conjugación de una enzima al oligonucleótido, radiomarcado del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También pueden prepararse los kits que usan dichos medios de detección para detectar el nivel de apolipoproteína C-III en una muestra.
5 También se divulga un procedimiento para preparar un compuesto de la invención que comprende hibridar específicamente in vitro una primera cadena de bases nitrogenadas de al menos 8 bases nitrogenadas contiguas de la secuencia establecida en SEQ ID Nº: 4 y/o la SEC ID N.º: 18 a una segunda cadena de bases nitrogenadas que comprende una secuencia lo suficientemente complementaria a dicha primera cadena de tal modo que se permita una hibridación estable.
10 También se divulga en el presente documento un compuesto de la divulgación para su uso en terapia.
También se divulga en el presente documento el uso de un compuesto o composición de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de todas las afecciones divulgadas en el presente documento y de cualquiera de las mismas.
Entre los usos de diagnóstico está la medición de apoliproteína C-III en pacientes para identificar a los que pueden
15 beneficiarse de una estrategia de tratamiento dirigida a reducir los niveles de apolipoproteína C-III. Dichos pacientes adecuados para diagnóstico incluyen pacientes con hipertrigliceridemia (por ejemplo, para tendencias de diagnóstico para enfermedad arterial coronaria), metabolismo de lípidos anormal, obesidad, hiperlipidemia, entre otros trastornos.
La especificidad y sensitividad de antisentido también se usan de un modo controlado por los expertos en la técnica para usos terapéuticos. Los compuestos antisentido se han usado como restos terapéuticos en el tratamiento de
20 estados patológicos en animales, incluidos seres humanos. Los fármacos de oligonucleótidos antisentido, incluidos ribozimas, se han administrado de un modo inocuo y eficaz a seres humanos y actualmente se están llevando a cabo numerosos ensayos clínicos. De este modo, se ha establecido que los compuestos antisentido pueden ser útiles en modalidades terapéuticas que puede configurarse que son útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialemente seres humanos.
25 Para terapia, un animal, preferentemente un ser humano, sospechoso de tener una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresión de la apolipoproteína C-III se trata administrando compuestos antisentido según la divulgación. Por ejemplo, en una realización no limitante, los procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal con necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la apolipoproteína C-III. Los inhibidores de la apolipoproteína C-III de la presente divulgación inhiben eficazmente la actividad de la proteína
30 apolipoproteína C-III o inhiben la expresión de la proteína apoliproteína C-III. Por ejemplo, un compuesto de este tipo que reduzca los niveles de apolipoproteína C-III es útil para prevenir la morbimortalidad de sujetos con transtornos cardiacos. Por ejemplo, tal como se demuestra en los ejemplos, la reducción de apolipoproteína C-III puede dar como resultado la reducción de los niveles de colesterol, triglicéridos y glucosa en el suero. De este modo, los inhibidores de la apolipoproteína C-III son útiles en el tratamiento de hipertrigliceridemia, metabolismo anormal de lípidos,
35 metabolismo anormal de colesterol, ateroesclerosis, hiperlipidemia, diabetes, incluida diabetes de tipo 2, obesidad, enfermedad cardiovascular, enfermedad arterial coronaria, entre otros trastornos relacionados con un metabolismo anormal o de otro tipo.
En una realización, la actividad o expresión de la apolipoproteína C-III en un animal se inhibe aproximadamente el 10 %. Preferentemente, la actividad o expresión de la apolipoproteína C-III en un animal se inhibe aproximadamente el 40 30 %. Más preferentemente, la actividad o expresión de la apolipoproteína C-III en un animal se inhibe aproximadamente el 50 %. De este modo, los compuestos oligoméricos modulan la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en al menos el 10 %, en al menos el 20 %, en al menos el 25 %, en al menos el 30 %, en al menos el 40 %, en al menos el 50 %, en al menos el 60 %, en al menos el 70 %, en al menos el 75 %, en al menos el 80 %, en al menos el 85 %, en al menos el 90 %, en al menos el 95 %, en al menos el 98 %, en al menos el 99 %
45 o el 100 %.
Por ejemplo, la reducción de la expresión de apolipoproteína C-III puede medirse en suero, tejido adiposo, hígado o cualquier otro fluido corporal, tejido u órgano del animal. Preferentemente, las células presentes en dichos fluidos, tejidos u órganos que están siendo analizados contienen una molécula de ácido nucleico que codifica la apoliproteína C-III y/o apolipoproteína C-III. Los compuestos de la presente invención pueden usarse en
50 composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable. El uso de los compuestos y procedimientos de la presente invención también pueden ser útiles profilácticamente.
F. Modificaciones
Tal como se sabe en la técncia, un nucleósido es una combinación base-azúcar. La porción de la base del nucleósido
55 es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para los nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido o bien al resto 2’, 3’ o 5’-hidroxilo del azúcar. Al formar oligonucleótidos, los grupos fosfato unen covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí formando un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal pueden unirse posteriormente formando un compuesto circular; no obstante, son preferentes, generalmente, los compuestos lineales. Además, los compuestos lineales pueden tener complementariedad de bases nitrogenadas internas y pueden, por lo tanto, plegarse de modo que se produzca un
5 compuesto bicatenario total o parcial. Dentro de los oligonucleótidos, los grupos fosfato se denominan comúnmente formadores del esqueleto entre nucleósidos del oligonucleótido. La unión normal o esqueleto de ARN y ADN es una unión 3’ a 5’ fosfodiéster.
Uniones entre nucleósidos modificadas (esqueleto)
Los ejemplos específicos de compuestos antisentido útiles en la presente invención incluyen oligonucleótidos que
10 contienen esqueletos modificados o uniones entre nucleósidos no naturales. Tal como se definen en la presente memoria descriptiva, los oligonucleótidos que tienen esqueletos modificados incluyen los que mantienen un átomo de fósforo en el esqueleto y los que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Para los fines de la presente memoria descriptiva y tal como se refiere a los mismos a veces en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto internucleósidico también pueden considerarse oligonucleótidos.
15 Los esqueletos de oligonucleótidos modificados preferentes que contienen un átomo de fósforo incluyen, por ejemplo fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y de otros alquilos que incluyen fosfonatos de 3’-alquileno, fosfonatos de 5’-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, forforamidatos que incluyen 3’-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen uniones 3’-5’ normales,
20 análogos unidos 2’-5’ de los mismos y los que tieen polaridad inversa en los que una o varias uniones entre nucleótidos es una unión 3’ a 3’, 5’a 5’ o 2’ a 2’. Los oligonucleótidos preferentes que tienen polaridad invertida comprenden una unión 3’ a 3’ única en la unión entre nucleótidos del extremo 3’, es decir, un resto de nucleósido invertido sencillo, que puede ser no básico (la base nitrogenada se ha perdido o tiene un grupo hidroxilo en el sitio de la misma). También están incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.
25 Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de las uniones que contienen fósforo mencionadas anteriormente incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos Nº: 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 y 5.625.050,
30 algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud.
Los esqueletos de oligonucleótidos modificados preferentes que no incluyen un átomo de fósforo en el mismo tienen esqueletos que se forman por uniones entre nucleósidos alquílicas de cadena corta o cicloalquílicas, uniones entre nucleósidos mixtas de heteroátomos y alquilo o cicloalquilo, o una o más uniones entre nucleósidos heteroatómicas
o heterocíclicas de cadena corta. Éstos incluyen los que tienen uniones de morfolino (formadas en parte desde la
35 porción de azúcar de un nucleósido); esqueletos de siloxano, esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metileno formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazon; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de los oligonucleótidos mencionados
40 anteriormente incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos Nº: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 y 5.677.439, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud.
45 Azúcar modificado y uniones entre nucleótidos - miméticos
En otros miméticos de oligonucleótido preferentes, tanto el azúcar como el enlace entre nucleótidos (es decir, el esqueleto), de las unidades de nucleótidos están reemplazados por grupos nuevos. Las unidades de bases nitrogenadas se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado. Un compuesto de este tipo, un mimético de oligonucleótido que se ha demostrado que tiene propiedades de hibridación excelentes, se denomina un 50 ácido nucleico peptídico (PNA). En compuestos PNA, el esqueleto de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las bases nitrogenadas se mantienen y están unidas directamente o indirectamente a átomos de nitrógeno azoicos de la porción de amida del esqueleto. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de los compuestos PNA mencionados anteriormente incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos Nº:
55 5.539.082; 5.714.331 y 5.719.262. También se pueden encontrar ensañanzas sobre compuestos PNA en Nielsen y col., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Son realizaciones preferentes de la invención oligonucleótidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleótidos con esqueletos con heteroátomos, y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-[conocido como un esqueleto de metileno (metilimino) o MMI], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -O-N(CH3)-CH2-CH2- [en el que el esqueleto de fosfodiéster nativo se representa como -O-P-O-CH2-] del documento de patente de Estados Unidos Nº
5.489.677 mencionado anteriormente, y los esqueletos de amida del documento de patente de Estados Unidos Nº.
5.602.240 mencionado anteriormente. También son preferentes los oligonucleótidos que tienen estructuras de esqueleto 5 de morfolino del documento de patente de Estados Unidos Nº 5.034.506 mencionado anteriormente.
Azúcares modificados
Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o varios restos de azúcar sustituidos. Los oligonucleótidos preferentes comprenden uno de los grupos siguientes en la posición 2’: OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, pudiendo ser el alquilo, el alquenilo y el alquinilo alquilo C1 10 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o no sustituidos. Son particularmente preferentes O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O (CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, en los que n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferentes comprenden uno de los grupos siguientes en la posición 2’: alquilo C1 a C10 inferior, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, o-alcarilo o O-aralquilo inferiores sustituidos, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2 N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, 15 aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo comunicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. Una modificación preferente incluye 2’-metoxietoxi (2’-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2’-O-(2-metoxietilo) o 2’-MOE) (Martin y col., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación
20 preferente adicional incluye 2’-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2’-DMAOE, tal como se describe en ejemplos más adelante en el presente documento, y 2’-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2’-O-dimetil-amino-etoxi-etilo o 2’-DMAEOE), es decir, 2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2, que también se describe en ejemplos más adelante en el presente documento.
Otras modificaciones preferentes incluyen 2’-metoxi (2’-O-CH3), 2’-aminopropoxi (2’-OCH2CH2CH2NH2), 2’-alilo (2’
25 CH2-CH=CH2), 2’-O-alilo (2’-O-CH2-CH=CH2) y 2’-fluoro (2’-F). La modificación 2’ puede estar en la posición arabino (arriba) o en la posición ribo (abajo). Una modificación 2’-arabino es 2’-F. También pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones del oligonucleótido, particularmente en la posición 3’ del azúcar del nucleótido del extremo 3’ o de oligonucleótidos unidos en 2’-5’ y la posición 5’ del nucleótido del extremo 5’. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en el sitio del azúcar pentofuranosilo. Las
30 patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos Nº: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747 y 5.700.920, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud.
35 Otra modificación preferente del azúcar incluye ácidos nucleicos inaccesibles (LNA) en los que el grupo 2’-hidroxilo está unido al átomo de carbono 3’ o 4’ del anillo de azúcar, formando, por lo tanto, un resto de azúcar bicíclico. La unión es preferentemente un grupo metileno (-CH2-)n que hace de puente entre el átomo de oxígeno 2’ y el átomo de carbono 4’, en el que n es 1 ó 2. Los LNA y la preparación de los mismos se describen en las Publicaciones de patente internacional Nº. WO 98/39352 y WO 99/14226.
40 Bases nitrogenadas naturales y modificadas
Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituiciones de bases nitrogenadas (a menudo denominadas en la técnica simplemente como "bases"). Tal como se usan en el presente documento, bases nitrogenadas "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases purinas adenina (A) y guanina (G) y las bases pirimidinas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las bases nitrogenadas modificadas incluyen otras bases 45 nitrogenadas sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halo-uracilo y citosina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en la posición 8, 550 halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en la posición 5, 7metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras bases nitrogenadas modificadas incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1Hpirimido[5,4-b][1,4]benzoti-azin-2(3H)-ona), abrazaderas en G tales como una fenoxazina citidina sustituida (por 55 ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4] benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido [4,5-b] indol-2ona), piridoindol citidina (H-pirido[3’,2’:4,5] pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Las bases nitrogenadas modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base purina o pirimidina está reemplazada por otros heterociclos, por ejemplo, 7desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras bases nitrogenadas incluyen las divulgadas en el documento de patente de Estados Unidos Nº 3.687.808, las divulgadas en The Concise Encyclopedia Of 60 Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, las divulgadas por Englisch y col., Angewandte Chemie, edición internacional, 1991, 30, 613, y las divulgadas por Sanghvi, Y.S.,
capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas bases nitrogenadas son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos de la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluidas 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las
5 sustituciones 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 ºC y son actualmente sustituciones de bases preferentes, incluso más particularmente si se combinan con modificaciones 2’-O-metoxietil azúcar.
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de algunas de las bases nitrogenadas modificadas citadas anteriormente así como otras bases nitrogenadas incluyen, pero no están limitadas a, el 10 documento de patente de Estados Unidos Nº 3.687.808 citada anteriormente, así como los documentos de patente de Estados Unidos Nº: 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096 y 5.681.941, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud y el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.750.692, que se encuentra en propiedad conjunta con la
15 presente solicitud.
Conjugados
Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica la unión química al oligonucleótido de uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales tales como 20 grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la presente invención incluyen intercaladores, moléculas comunicadoras, poliaminas, polietileno, glicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de oligómeros y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, coumarinas y pigmentos. Los grupos que potencian las propiedades 25 farmacodinámicas, en el contexto de la presente invención, incluyen grupos que mejoran la captación, potencian la resistencia a la degradación y/o potencian la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Los grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de la presente invención, incluyen grupos que mejoran la captación, la distribución, el metabolismo o la excreción de los compuestos de la presente invención. Se divulgan grupos conjugados representativos en la Solicitud de patente internacional PCT/US92/09196, presentada el 30 23 de octubre de 1992, y en el documento de patente de Estados Unidos Nº 6.287.860. Los restos conjugados incluyen, pero no están limitados a, restos lipídicos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexilS-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosofolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietileno glicol, o ácido adamantano acético, un resto palmitílico, o un resto de octadecilamina o de 35 hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Los oligonucleótidos de la invención también pueden conjugarse con sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triiodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico. Los conjugados oligonucleótido-fármaco y su preparación
40 se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 09/334.130 (presentada el 15 de junio de 1999).
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichos conjugados de oligonucleótido incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos Nº: 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717; 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735;
45 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud.
50 Compuestos quiméricos
No es necesario para todas las posiciones en un compuestos dado estar uniformemente modificado y, de hecho, más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un compuesto individual o incluso en un nucleósido individual dentro de un oligonucleótido.
La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos
55 antisentido “quiméricos” o "quimeras," en el contexto de la presente invención, son compuestos antisentido, en particular oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Estos oligonucleótidos contienen típicamente al menos una región en la que el oligonucleótido está modificado de modo que confiere sobre el oligonucleótido una resistencia aumentada a la degradación por nucleasa, captación celular aumentada, estabilidad
60 aumentada y/o afinidad de unión aumentada por el ácido nucleico diana. Una región adicional del nucleótido puede servir con sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplos, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. La activación de la ARNasa H, por lo tanto, da como resultado la escisión de la diana de ARN, potenciando ampliamente de este modo la eficacia de la inhibición mediada por oligonucleótidos de la expresión génica. La escisión de los híbridos ARN:ARN
5 puede, de igual manera, realizarse mediante las acciones de endorribonucleasas, tales como ARNasa L, que escinde tanto el ARN celular como vírico. La escisión de la diana de ARN puede detectarse rutinariamente mediante electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociadas conocidas en la técnica.
En una realización, los oligonucleótidos quiméricos deseables tienen 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una
10 región central que consta de diez 2’-desoxinucleótidos, flanqueados en ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por cinco 2’-metoxietil (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones internucleosídicas son fosfortioato a lo largo del oligonucleótido y todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas.
En otra realización, determinados oligonucleótidos quiméricos preferentes son los divulgados en los ejemplos del presente documento. Los oligonucleótidos químericos particularmente quiméricos son los denominados ISIS 304757,
15 ISIS 304758, ISIS 304755, ISIS304800 y ISIS 304756.
Los compuestos antisentido quiméricos de la presente invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos tal como se ha descrito anteriormente. Dichos compuestos también se han denominado en la técnica como híbridos o gapmer. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas estructuras híbridas
20 incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos Nº: 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356 y 5.700.922, algunas de las cuales se encuentran en propiedad conjunta con la presente solicitud.
G. Formulaciones
Los compuestos de la invención también pueden mezclarse, encpasularse, conjugarse o asociarse de otro modo con
25 otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas o de otro tipo, para asistir en la captación, distribución y/o absorción. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas formulaciones que asisten la captación, distribución y/o absorción incluyen, pero no están limitadas a, los documentos de patente de Estados Unidos Nº: 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020;
30 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575 y
5.595.756.
Los compuestos antisentido de la invención comprenden cualesquiera sales farmacéuticamente aceptables, ésteres
o sales de dichos ésteres, o cualquier otro compuestos que después de la administración a un animal, incluidos
35 seres humanos, sean capaces de proporcionar (directamente o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o un residuo del mismo. En consecuencia, por ejemplo, la divulgación también se refiere a profármacos y a sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención, a sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y a otros bioequivalentes. El término “profármaco” indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, el fármaco) dentro del organismo o de las células del
40 mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos y/o condiciones. En particular, las versiones profármaco de los oligonucleótidos de la presente invención se preparan como derivados de SATE [(S-acetil2-tioetil) fosfato] según los procedimientos divulgados en la Solicitud internacional de patente Nº WO 93/24510 de Gosselin y col., publicada el 9 de diciembre de 1993, o en la Solicitud internacional de patente Nº WO 94/26764 y el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.770.713 de Imbach y col.
45 La expresión “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención: es decir, sales que mantienen la actividad biológica deseada del compuesto progenitor y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos. Para oligonucleótidos, los ejemplos preferentes de sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos Nº 6.287.860.
50 La presente invención también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos antisentido de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por una serie de vías dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y de la zona que se va a tratar. La administración puede ser tópica (que incluye oftálmicamente y por membranas mucosas que incluyen la administración vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluyen por
55 nebulizador, intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intreperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación 2’-O-metoxietilo son particularmente útiles para la administración oral. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos. Los vehículos farmacéuticos, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares convencionales pueden ser necesarios o deseables. Los condones, guantes y similares recubiertos también pueden ser útiles.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden estar presentes convenientemente en formas
5 de dosificación unidad pueden prepararse según técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de mezclar los ingredientes activos con el/los vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan mezclando uniformemente e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, dar forma al producto.
10 Las composiciones de la presente invención pueden formularse in cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero sin limitarse a, comprimidos, cápsulas, cápsulas en gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener, además, sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, incluidas, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano.
15 La suspensión también puede contener estabilizantes.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, soluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender uno o variso promotores de penetración, vehículos, excipientes y otros ingredientes activos o inactivos.
20 Las emulsiones son típicamente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotas que generalmente exceden 0,1 µm de diámetro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas y el fármaco activo que puede estar presente como solución bien en la fase acuosa, en la fase oleosa o bien por sí mismo como fase separada. Las microemulsiones están incluidas como una realización de la presente invención. Las emulsiones y sus usos son bien conocidas en la técnica y se describen adicionalmente en el
25 documento de patente de Estados Unidos Nº 6.287.860.
Las formulaciones de la presente invención incluyen formulaciones liposomales. Tal como se usa en la presente invención, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta por lípidos anfífilos dispuestos en una bicapa o en bicapas esféricas. Los liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada a partir de material lipófilo y un interior acuoso que contiene la composición que se va a administrar. Los liposomas
30 catiónicos son liposmas cargados positivamente que se cree que interactúan con moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. Los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente se cree que atrapan el ADN más que acomplejarse con el mismo. Tanto los liposomas catiónicos como los no catiónicos se han usado para proporcionar ADN a las células.
Los liposomas también incluyen liposomas “estabilizados estéricamente”, una expresión que, tal como se usa en el
35 presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o varios lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado una duración en circulación potenciada con respecto a liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquellos en los que parte de la porción lipídica que forma la vesícula del liposoma comprende uno o varios glucolípidos o está derivatizada con uno o varios polímeros hidrófilos, tales como un resto polietileno glicol (PEG). Los liposomas y sus
40 usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos Nº 6.287.860.
Las formulaciones y composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden incluir tensioactivos. El uso de tensioactivos en productos farmacéuticos, formulaciones y en emulsiones es bien conocidos en la técnica. Los tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos Nº
6.287.860.
45 En una realización, la presente invención usa diversos potenciadores de la penetración para incluir en la administración eficaz de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos. Además de dirigir la difusión de fármacos no lipófilos a través de membranas celulares, los potenciadores de la penetración también potencian la permeabilidad de fármacos lipófilos. Los potenciadores de la penetraciónpueden clasificarse como que pertenecen a una de cinco categorías amplias, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no
50 quelantes. Los potenciadores de la penetración se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos Nº 6.287.860.
Un experto en la técnica reconocerá que las formulaciones se diseñan rutinariamente según su pretensión de uso, es decir, su vía de administración.
Las formulaciones preferentes para administración tópica incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos de la
55 invención se mezclan con un agente de administración tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas preferentes incluyen los neutros (por ejemplo dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, diestearolifosfatidil colina) los negativos (por ejemplo dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) y los catiónicos (por ejemplo dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA).
Para la administración tópica o de otro tipo, los oligonucleótidos de la invención pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los oligonucleótidos pueden acomplejarse con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos preferentes
5 y sus ésteres, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos Nº 6.287.860. Las formulaciones tópicas se describen en detalle en la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 09/315.298, presentada el 20 de mayo de 1999.
Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanoparticulas, suspensiones o soluciones en agua o en medios no acuosos, cápsulas, cápsulas en gel, bolsitas, 10 comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, espesantes o aglutinantes. Las formulaciones orales preferentes son aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención se administran conjuntamente con uno o varios potenciadores de la penetración tensioactivos o quelantes. Los tensioactivos preferentes incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos y/o sales biliares de los mismos. Los ácidos/sales biliares y ácidos grasos y sus usos se describen 15 adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos Nº 6.287.860, que se incorpora al presente documento en su totalidad. También son preferentes las combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales grasas en combinación con ácidos/sales biliares. Una combinación particularmente preferente es la sal sódica de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Otros potenciadores de la penetración incluyen polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-20-cetil éter. Los oligonucleótidos de la invencón pueden administrarse 20 oralmente, en forma de gránulos que incluye partículas secas pulverizadas o complejos para formar micro o nanopartículas. Los agentes acomplejantes de oligonucleótidos y sus usos se describen adicionalmente en el documento de patente de Estados Unidos Nº 6.287.860. Las formulaciones orales para oligonucleótidos y su preparación se describen en detalle en la Solicitud de patente publicadda de Estados Unidos Nº 2003/0040497 (27 de febrero, 2003) y sus solicitudes principales; la Solicitud de patente publicadda de Estados Unidos Nº 2003/0027780 (6
25 de febrero, 2003) y sus solicitudes principales; y la Solicitud de patente publicada de Estados Unidos Nº 10/071.822, presentada el 8 de febrero, 2002.
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventicular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitarse a, potenciadores de la penetración, compuestos vehículos y otros vehículos o excipientes
30 farmacéuticamente aceptables.
Determinadas realizaciones de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen uno o varios compuestos oligoméricos y uno o varios de otros agentes quimioterapéuticos que operan mediante un mecanismo no antisentido. Los ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no están limitados a, fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, 35 epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosido, bis-cloroetilnitrosurea, busulfan, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostaza nitrogenada, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 540 fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, teniposida, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la invención, dichos agentes quimioterapéuticos pueden usarse individualemente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido durante un periodo seguido de MTX y oligonucleótido), o en combinación con uno o varios de otros agentes quimioterapéuticos (por ejemplos, 5-FU, MTX y
45 oligonucleótido o 5-FU, radioterapia y oligonucleótido). Los fármacos antiinflamatorios, que incluyen, pero no se limitan a, fármacos antiinflamatorios y corticoesteroides, y fármacos antivirales, que incluyen, pero no se limitan a. ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también pueden combinarse en composiciones de la invención. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros fármacos no antisentido también están dentro del ámbito de la presente invención. Pueden usarse juntos o secuencialmente dos o más compuestos combinados.
50 En otra realización relacionada, las composiciones de la presente invención pueden contener uno o varios compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o varios compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo acido nucleico diana. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden contener dos o más compuestos antisentido dirigidos a regiones diferentes del mismo ácido nucleico diana. Se conocen en la técnica numerosos ejemplos de compuestos antisentido. Pueden usarse
55 juntos o secuenciamente dos o más compuestos combinados.
H. Dosificación
La formulación de composiciones terapéuticas y su administración subsiguiente (dosificación) se asume que está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y de la respuesta del estado patológico que se va tratar, con una duración del curso del tratamiento de varios días a varios meses, o hasta 60 que se efectúe una cura o se logre una disminución del estado patológico. La planificación óptima de la dosificación
pueden calcularse a partir de mediciones de la acumulación de fármaco en el organismo del paciente. Los expertos pueden determinar fácilmente las dosis óptimas, las metodologías de dosificación y las tasas de repetición. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleótidos individuales y pueden estimarse, en general, sobre la base de los CE50 que se ha encontrado que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En
5 general, la dosis varía de 0,01 µg a 1,00 g por kg de peso corporal y puede administrarse una o más veces al día, a la semana, al mes o al año, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la técnica pueden estimar fácilmente las tasas de repetición para dosificaciones sobre la base del tiempo de residencia medido y las concentraciones de fármaco en fluidos y tejidos corporales. Después de un tratamiento exitoso, puede ser deseable que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado patológico, en la que el nucleótido se administra en dosis de mantenimiento que varían de 0,01 µg a 1,00 g por kg de peso corporal, una o varias veces al día a una vez cada 20 años.
Mientras la presente invención se ha descrito con especificidad según algunas de sus realizaciones preferentes, los siguientes ejemplos sirven sólo como ilustración de la invención y no pretenden limitarla.
Ejemplos
15 Los ejemplos que no se refieran directamente a la invención reivindicada están por motivos de comparación e ilustración.
Ejemplo 1: Síntesis de fosforamiditas de nucleósido
Los compuestos siguientes, que incluyen fosforamiditas y sus intermedios se prepararon tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos Nº 6.426.220 y en la Publicación de patente internacional Nº WO 02/36743; 5’-O-dimetoxitritil-timidina intermedio para 5-metil dC amidita, 5’-O-dimetoxitritil-2’-deoxi-5-metilcitidina intermedio para 5-metil-dC amidita, 5’-O-dimetoxitritil-2’-desoxi-N4-benzoil-5-metilcitidina penúltimo intermedio para 5-metil dC amidita, [5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-desoxi-N4-benzoil-5-metilcitidin-3’-O-il]-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita (5metil dC amidita), 2’-fluorodesoxiadenosina, 2’-fluorodesoxiguanosina, 2’-fluorouridina, 2’-fluorodesoxicitidina, 2’-O-(2metoxietil) amiditas modificadas, intermedio 2’-O-(2-metoxietil)-5-metiluridina, intermedio penúltimo 5’-O-DMT-2’-O25 (2-metoxietil)-5-metiluridina, [5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-O-(2-metoxietil)-5-metil-uridin-3’-O-il]-2-cianoetil-N,Ndiisopropilfosforamidita (MOE T amidita), intermedio 5’-O-dimetoxitritil-2’-O-(2-metoxietil)-5-metilcitidina, intermedio penúltimo 5’-O-dimetoxitritil-2’-O-(2-metoxietil)-N4-benzoil-5-metil-citidina, [5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-O-(2metoxietil)-N4-benzoil-5-metilcitidin-3’-O-il]-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita (MOE 5-Me-C amidita), [5’-O-(4,4’dimetoxitrifenilmetil)-2’-O-(2-metoxietil)-N6-benzoiladenosin-3’-O-il]-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita (MOE A amidita), [5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-O-(2-metoxietil)-N4-isobutirilguanosin-3’-O-il]-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita (MOE G amidita), 2’-O-(aminooxietil) nucleósido amiditas y 2’-O-(dimetilaminooxietil) nucleósido amiditas, 2’-(dimetilaminooxietoxi) nucleósido amiditas, 5’-O-terc-butildifenilsilil-O2-2’-anhidro-5-metiluridina, 5’-Oterc-butildifenilsilil-2’-O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina, 2’-O-([2-ftalimidoxi)etil]-5’-t-butildifenilsilil-5-metiluridina, 5’-O-tercbutildifenilsilil-2’-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina, 5’-O-terc-butildifenilsilil-2’-O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5
35 metiluridina, 2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina, 5’-O-DMT-2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina, 5’-O-DMT-2’O-(2-N,N-dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3’-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita], 2’-(aminooxietoxi) nucleósido amiditas, N2-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2’-O-(2-etilacetil)-5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)guanosina-3’-[(2-cianoetil)-N,Ndiisopropil-fosforamidita], 2’-dimetilaminoetoxietoxi (2’-DMAEOE) nucleósido amiditas, 2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]-5-metil uridina, 5’-O-dimetoxitritil-2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metil uridina y 5’-O-dimetoxitritil2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metil uridina-3’-O-(cianoetil-N,N-diisopropil) fosforamidita.
Ejemplo 2: Oligonucleótidos y síntesis de oligonucleótidos
Los compuestos antisentido que se usan según la presente invención pueden prepararse conveniente y rutinariamente mediante técnicas bien conocidas de síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis se comercializa por parte de varias empresas, incluida, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA, Estados
45 Unidos). Puede usarse adicional o alternativamente cualquier otro medio para dicho síntesis conocido en la técnica. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucléotidos tales como los fosoforotioatos y sus derivados alquilados.
Oligonucleótidos: Los oligonucleótidos de fosfodiéster (P=O) no sustituidos y sustituidos se sintetizan en un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems modelo 394) usando química estándar de fosforamidita con oxidación por yodo.
Los fosforotioatos (P=S) se sintetizan de forma similar a los oligonucleótidos de fosfodiéster con las siguientes excepciones: la tiación se efectuó usando una solución al 10 % p/v de 1,1-dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona en acetonitrilo para la oxidación de los enlaces de fosfito. El tiempo de la etapa de reacción de tiación se aumentó a 180 s y fue precedida por la etapa normal de remate. Después de escisión a partir de la columna CPG y desbloqueo en
55 hidróxido de amonio concentrado a 55 ºC (12-16 h), los oligonucleótidos se recuperaron por precipitación con >3 volumenes de etanol de una solución 1 M de NH4OA. Los oligonucleótidos de fosfinato se preparan tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.508.270.
Los oligonucleótidos de fosfonato de alquilo se preparan tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos Nº 4.469.863.
Los oligonucleótidos de fosfonato de 3’-desoxi-3’-metileno se preparan tal como se describe en los documentos de patente de Estados Unidos Nº. 5.610.289 ó 5.625.050.
Los oligonucleótidos de fosforamidita se preparan tal como se describe en los documentos de patente de Estados 5 Unidos Nº 5.256.775 ó 5.366.878.
Los oligonucleótidos de fosfonotioato de alquilo se preparan tal como se describe en las Solicitud de patente internacional Nº PCT/US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como WO 94/17093 y WO 94/02499, respectivamente).
Los oligonucleótidos de 3’-desoxi-3’-amino fosforamidato se preparan tal como se describe en el documento de
10 patente de Estados Unidos Nº 5.476.925. Los oligonucleótidos de fosfotriéster se preparan tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.023.243.
Los oligonucleótidos de borano fosfato se preparan tal como se describe en los documentos de patente de Estados Unidos Nº 5.130.302 y 5.177.198.
Oligonucleósidos: Los oligonucleósidos unidos a metilenmetilimino, también identificados como oligonucleósidos
15 unidos a MMI, los oligonucleósidos unidos a metilendimetilhidrazo, también identificados como oligonucleósidos unidos a MDH y los oligonucleósidos unidos a metilencarbonilamino, también identificados como oligonucleósidos unidos a amida-3 y los oligonucleósidos unidos a metilenaminocarbonilo, también identificados como oligonucleósidos unidos a amida-4, así como compuestos de esqueleto mixto que tienen, por ejemplo, uniones alternas MMI y P=O o P=S se preparan tal como se describe en los documentos de patente de Estados Unidos Nº
20 5.378.825, 5.386.023, 5.489.677, 5.602.240 y 5.610.289.
Los oligonucleósidos unidos a formacetal y tiformacetal se preparan tal como se describe en los documentos de patente de Estados Unidos Nº 5.264.562 y 5.264.564.
Los oligonucleótidos unidos a óxido de etileno se preparan tal como se describe en el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.223.618.
25 Ejemplo 3: Síntesis de ARN
En general, la química de síntesis de ARN se base en la incorporación selectiva de varios grupos protectores en reacciones intermedias estratégicas. Aunque un experto en la técnica entenderá el uso de grupos protectores en síntesis orgánica, una clase útil de grupos protectores incluye silil éteres. En particular, se usan silil éteres voluminosos para proteger el 5’-hidroxilo en combinación con un grupo protector de ortoéster lábil frente a ácidos en
30 el 2’-hidroxilo. Este conjunto de grupos protectores se usa, entonces, con tecnología de síntesis en fase sólida estándar. Es importante eliminar, por último, el grupo protector de ortoéster lábil frente a ácidos después de todas las etapas de síntesis. Además, el uso temprano de grupos protectores de sililo durante la síntesis asegura la eliminación sencilla cuando se desee, sin la desprotección no deseada del 2’ hidroxilo.
Siguiendo esté procedimiento para proteger secuencialmente el 5’-hidroxilo en combinación con la protección del 2’
35 hidroxilo mediante grupos protectores que se eliminan diferencialmente y son lábiles químicamente de modo diferencial, se sintetizaron los oligonucleótidos de ARN.
Los oligonucleótidos de ARN se sintetizan en etapas. Cada nucleótido se añade secuencialmente (dirección 3’ a 5’) a un oligonucleótido unido a un soporte sólido. El primer nucléosido del extremo 3’ de la cadena se une covalentemente a un soporte sólido. Se añaden el precursor de nucleótidos, una fosforamidita de ribonucleósido, y el activador, que
40 acopla la segunda base en el extremo 5’ del primer nucleósido. El soporte se lava y cualquier grupo 5’-hidroxilo no reaccionado se remata con anhídrido acético para proporcionar restos 5’-acetilo. La unión se oxida después para proporcionar una unión más estable y deseada en última instancia P(V). Al final del ciclo de adición de nucleótidos, el grupo 5’-sililo se escinde con fluoruro. El ciclo se repite para cada nucleótido subsiguiente.
Siguiendo con la síntesis, los grupos protectores de metilo en los fosfatos se escinden en 30 minutos usando 2
45 carbamoil-2-cianoetilen-1,1-ditiolato de disodio trihidrato (S2Na2) 1 M en DMF. La solución de desprotección se lava a partir del oligonucléotido unido al soporte sólido usando agua. Después, el soporte se trata con metilamina al 40 % en agua durante 10 minutos a 55 ºC. Esto libera los oligonucleótidos de ARN a la solución, desprotege las aminas exocíclicas y modifica los grupos 2’. En este estado pueden analizarse los oligonucleótidos mediante HPLC de intercambio aniónico.
50 Los grupos 2’-ortoéster son los últimos grupos de protección que se eliminan. El grupo protector de ortoéster de monoacetato de etilenglicol desarrollado por Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO, Estados Unidos) es un ejemplo de un grupo protector de ortoéster útil que tiene las siguientes propiedades importantes. Es estable en las condiciones de síntesis de fosforamidita de nucleósidos y la síntesis de oligonucleótidos. No obstante, después de la síntesis de oligonucleótido, el oligonucleótido se trata con metilamina, que no sólo escinde el oligonucleótido del soporte sólido, sino que también elimina los grupos acetilo de los ortoésteres. Los sustituyentes 2-etilhidroxilo resultantes en el ortoéster son menos electroaceptores que su precursor acetilado. Como resultado, el ortoéster modificado se vuelve más lábil frente a la hidrólisis catalizada por ácidos. Específicamente, la velocidad de escisión es aproximadamente 10 veces más rápida después de eliminar los grupos acetilo. Por lo tanto, este ortoéster posee
5 suficiente estabilidad con el fin de ser compatible con la síntesis de oligonucleótidos y ahora, cuando se modifica subsiguientemente, permite que la desprotección se realice en condiciones acuosas relativamente templadas compatibles con el producto de oligonucleótido de ARN final.
Adicionalmente, los procedimientos de síntesis de ARN son bien conocidos en la técnica (Scaringe, S. A. Ph.D. Thesis, Universidad de Colorado, 1996; Scaringe, S. A. y col., J. Am. Chem. Soc, 1998, 120, 11820-11821;
10 Matteucci, M. D. y Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc, 1981, 103, 3185-3191; Beaucage, S. L. y Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862; Dahl, B. J. y col., Acta Chem. Scand. 1990, 44, 639-641; Reddy, M. P. y col., Tetrahedrom Lett., 1994, 25, 4311-4314; Wincott, F. y col., Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684; Griffin, B. E. y col., Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313; Griffin, B. E. y col., Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331).
Los compuestos antisentido de ARN (oligonucleótidos de ARN) de la presente invención pueden sintetizarse mediante
15 los procedimientos del presente documento o adquirirse de Dharmacon Research, Inc (Lafayette, CO, Estados Unidos). Una vez sintetizados, los compuestos de ARN complementarios pueden alinearse después mediante procedimientos conocidos en la técnica para formar compuestos antisentido bicatenarios (duplicados). Por ejemplo, los dúplex pueden formarse combinando 30 µl de cada una de las cadenas complementarias de oligonucleótidos de ARN (solución de oligonucleótidos de ARN 50 uM) y 15 µl de tampón de alineación 5X (acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30
20 mM, pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM) seguido de calentamiento durante 1 minuto a 90 ºC, después 1 hora a 37 ºC. Los compuestos antisentido duplicados resultantes pueden usarse en kits, ensayos, análisis u otros procedimientos para investigar el papel de un ácido nucleico diana.
Ejemplo 4: Síntesis de oligonucleótidos quiméricos
Los oligonucleótidos sintéticos, oligonucleósidos u oligonucleótidos/oligonucleósidos mixtos de la invención pueden
25 ser de varios tipos diferentes. Estos incluyen un primer tipo en el que el segmento "hueco" de nucleósidos unidos se posiciona entre los segmentos "flanco" 5' y 3' de nucleósidos unidos y un segundo tipo de “extremo abierto” en el que el segmento “hueco" se localiza bien en el extremo 3' o bien en el 5' del compuestos oligomérico. Los oligonucleótidos del primer tipo también se conocen en la técnica como “gapmers” u oligonucleótidos con huecos. Los olignucleótidos del segunto tipo también se conocen en la técnica como "hemimers" o "wingmers".
30 Oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos de [2’-O-Me]--[2’-desoxi]--[2’-O-Me]
Los oligonucleótidos quiméricos que tienen segmentos de oligonucleótidos de 2’-O-alquil fosforotioato y de 2’-desoxi fosforotioato se sintetizan usando un sintetizador de ADN automático de Applied Biosystems modelo 394, como anteriormente. Los oligonucleótidos se sintetizan usando el sintetizador automático y 2’-desoxi-5’-dimetoxitritil-3’-Ofosforamidita para la porción de ADN y 5’-dimetoxitritil-2’-O-metil-3’-O-fosforamidita para los flancos 5’ y 3’. El ciclo de 35 síntesis estándar se modifica incorporando etapas de acoplamiento con tiempos de reacción aumentados para la 5’dimetoxitritil-2’-O-metil-3’-O-fosforamidita. El oligonucleótido totalmente protegido se escinde del soporte y se desprotege en amoniaco concentrado (NH4OH) durante 12-16 h a 55 ºC. El oligo desprotegido se recupera después usando un procedimiento apropidado (precipitación, cromatografía en columna, volumen reducido al vacío y se analiza espectrofotométricamente para determinar el rendimiento y la pureza por electroforesis capilar y espectrometría de
40 masas.
Oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos de [2’-O-(2-metoxietil)]--[2’-desoxi]--[2’-O-(metoxietil)]
Los oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos de [2’-O-(2-metoxietil)]--[2’-desoxi]--[2’-O-(metoxietilo)] se prepararon igual que en el procedimiento anterior para oligonucleótidos quiméricos de 2’-O-metilo con la sustitución de 2’-O-(metoxietil) amiditas por las 2’-O-metil amiditas.
45 Oligonucleótidos quiméricos de [2’-O-(2-metoxietil)fosfodiéster]--[2’-desoxi fosforotioato]--[2’-O-(metoxietil) fosfodiéster]
Los oligonucleótidos quiméricos de [2’-O-(2-metoxietil)fosfodiéster]--[2’-desoxi fosforotioato]--[2’-O-(metoxietil) fosfodiéster] se prepararon igual que en el procedimiento anterior para oligonucleótidos de 2’-O-metilo quiméricos con la sustitución de 2’-O-(metoxietil) amiditas por las 2’-O-metil amiditas, oxidación con yodo para generar las uniones
50 entre nucleótidos fosfodiéster dentro de las porciones de los flancos de las estructuras quiméricas y la sulfuración usando 1,1-dióxido de 3,H-1,2 benzoditiol-3-ona (Beaucage Reagent) para generar las uniones fosforotioato entre nucleótidos para el hueco central.
Otros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos y oligonucleótidos/oligonucleósidos quiméricos mixtos se sintetizan según el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.623.065.
55 Ejemplo 5: Diseño y selección de compuestos antisentido duplicados dirigidos a la apolipoproteína C-III
Una serie de dúplex de ácidos nucleicos que comprende los compuestos antisentido de la presente divulgación y sus complementos se diseña para dirigirse a la apolipoproteína C-III. La secuencia de bases nitrogenadas de la cadena antisentido del dúplex comprende al menos una porción de un oligonucleótido en la tabla 1. Los extremos de las cadenas pueden modificarse por adición de una o varias bases nitrogenadas para formar un saliente. Después, la cadena en
5 sentido correcto del ARNds se diseña y se sintetiza como el complemento de la cadena antisentido y también puede contener modificaciones o adiciones en cada extremo. Por ejemplo, en una realización, ambas cadenas del dúplex de ARNds serían complementarias con respecto a las bases nitrogenadas centrales, teniendo cada una salientes en uno de los extremos o en ambos.
Por ejemplo, un dúplex que comprende una cadena antisentido que tiene la secuencia
10 CGAGAGGCGGACGGGACCG (SEC ID Nº: 465) y que tiene un saliente de dos bases nitrogenadas de desoxitimidina (dT) tendría las estructuras siguientes (secuencia antisentido SEC ID Nº: 466, secuencia complementaria SEC ID Nº: 467):
Cadena antisentido
Cadena complementaria
En otra realización, un dúplex que comprende una cadena antisentido que tiene la misma secuencia CGAGAGGCG
15 GACGGGACCG (SEC ID Nº: 465) puede prepararse con extremos romos (ningún saliente de cadena sencilla) tal como se muestra (secuencia antisentido SEC ID Nº: 465, secuencia complementaria SEC ID Nº: 468):
Cadena antisentido
Cadena complementaria
Las cadenas de ARN del dúplex pueden sintetizarse mediante procedimientos divulgados en el presente documento o adquirirse de Dharmacon Research Inc., (Lafayette, CO, Estados Unidos). Una vez sintetizadas, las cadenas 20 complementarias se alinean. Las cadenas sencillas se dividen en partes alícuotas y se diluyen a una concentración 50 µM. Una vez diluidas, se combinan 30 µl de cada cadena con 15 µl de una solución 5X de tampón de alineación. La concentración final de dicho tampón es acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM, pH 7,4, y acetato de magnesio 2 mM. El volumen final es de 75 µl. Esta solución se incuba durante 1 minuto a 90 ºC y después se centrifuga durante 15 minutos. El tubo se deja asentar durante 1 hora a 37 ºC y al final de dicho periodo se usan los
25 dúplex de ARNds en experimentación. La concentración final del dúplex de ARNds es 20 µM. Esta solución puede almacenarse congelada (-20 ºC) y descongelarse hasta 5 veces.
Una vez preparados, los compuestos antisentido duplicados se evalúan para determinar su capacidad de modulación de la expresión de la apolipoproteína C-III.
Cuando las células han alcanzado un 80 % de confluencia, se tratan con compuestos antisentido duplicados de la
30 invención. Para células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavan una vez con 200 µl de medio de suero reducido OPTI-MEM-1™ (Gibco BRL) y después se tratan con 130 µl de medio OPTI-MEM-1™ que contiene 12 µg/ml de reactivo LIPOFECTIN™ (Gibco BRL) y el compuesto antisentido dúplex deseado a una concentración final de 200 nM. Despúes de 5 horas de tratamiento, el medio se reemplaza con medio reciente. Las células se recogen 16 horas después del tratamiento, en dicho momento se aísla el ARN y se mide la reducción de diana por RT-PCR.
35 Ejemplo 6: Aislamiento de oligonucléotidos
Después de la escisión a partir del soporte sólido de vidrio poroso contolado y de desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55 ºC durante 12-16 horas, los oligonucleótidos u oligonucleótidos se recuperan por precipitación de NH4OAC 1 M con >3 volumenes de etanol. Los oligonucleótidos sintetizados se analizaron por electroscopía de masas por electropulverización (determinación del peso molecular) y por electroforesis en gel capilar y se determinó que eran
40 al menos en el 70 % material de cadena completa. Las cantidades relativas de uniones fosforotioato y fosfodiéster obtenidas en la síntesis se determinaron mediante la relación del peso molecular correcto con respecto al producto de 16 uma (+/-32 +/-48). Para algunos estudios los oligonucleótidos se purificaron por HPLC, tal como se describe por Chiang y col., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171. Los resultados obtenidos con material purificado por HPLC fueron similares a los obtenido con material no purificado por HPLC.
45 Ejemplo 7: Síntesis de oligonucleótidos. Formato de placas de 96 pocillos
Los oligonucleótidos se sintetizaron mediante química de fosforamidita en fase sólida P(III) en un sintetizador automático capaz de ensamblar 96 secuencias simultáneamente en un formato de 96 pocillos. Las uniones entre nucleótidos fosfordiéster se realizaron por oxidación con yodo acuoso. Las uniones entre nucleótidos fosforotioato se generaron por sulfuración usando 1,1-dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona (Beaucage Reagent) en acetonitrilo 50 anhidro. Las beta-cianoetil-diiso-propil fosforamiditas protegidas de bases se adquirieron de proveedores comerciales (por ejemplo, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos, o Pharmacia, Piscataway, NJ, Estados Unidos).
Los nucleósidos no estándar se sintetizaron como para los procedimientos estándar o patentados. Se utilizan como beta-cianoetildiisopropil fosforamiditas protegidas de bases.
Los oligonucleótidos se escindieron del soporte y se desprotegieron con NH4OH concentrado a temperatura elevada (5560 ºC) durante 12-16 horas y el producto liberado se secó después al vacío. El producto seco se resuspendió después 5 en agua estéril para proporcionar una placa maestra a partir de la cual se diluyeron después todas las muestras de placas analíticas y de ensayo usando un pipeteador automático.
Ejemplo 8: Análisis de oligonucleótidos. Formato de placas de 96 pocillos
La concentración de oligonucleótidos en cada pocillo se evaluó por dilución de muestras y espectroscopía de absorción UV. La integridad de longitud completa de los productos individuales se evaluó por electroforesis capilar (CE) 10 bien en un formato de 96 pocillos (aparato Beckman P/ACE™ MDQ) o bien, para muestras preparadas individualmente, en un aparato de CE comercial (por ejemplo, un aparato Beckman P/ACE™ 5000, ABI 270). La composición de la base y el esqueleto se confirmó por análisis de masas de los compuestos usando espectroscopía de masas con electropulverización. Todos las placas de ensayo se diluyeron a partir de la placa maestra usando pipeteadores robóticos de varios canales. Se consideró que las placas eran aceptables si al menos el 85 % de los
15 compuestos de la placa tenían al menos el 85 % de longitud completa.
Ejemplo 9: Cultivo celular y tratamiento de oligonucleótidos
El efecto de compuestos antisentido en la expresión de ácidos nucleicos diana pueden analizarse en cualquiera de entre una variedad de tipos celulares siempre que el ácido nucleico esté presente en niveles medibles. Esto puede determinarse rutinariamente usando, por ejemplo, PCR o inmunotransferencia (Northern). Los tipos celulares
20 siguientes se proporcionan por fines ilustrativos, pero pueden usarse rutinariamente otros tipos celulares, siempre que la diana se exprese en el tipo celular elegido. Esto puede determinarse fácilmente mediante procedimientos de rutina en la técnica, por ejemplo inmunotransferencia (Northern), ensayos de protección de ribonucleasa o RT-PCR.
Células T-24:
Se obtuvo la linea celular T-24 de carcinoma de vejiga de células transicionales humanas de la Colección
25 estadounidense de cultivos tipo (ATCC) (Manassas, VA, Estados Unidos). Las células T-24 se cultivaron de forma rutinaria en medio basal 5A de McCoy (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos) suplementado con suero de carnero fetal al 10 % (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos), penicilina (100 unidades por ml) y estreptomicina (100 microgramos por ml) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las celular se sometieron rutinariamente a tripsinización y a dilución cuando alcanzaron una confluencia del 90 %. Las células se
30 sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-primaria Nº 353872) a una densidad de 7.000 células/pocillo para su uso en análisis RT-PCR.
Para el análisis de inmunotransferencia (Northern) u otros análisis, las células se siembran en placas de cultivo de tejidos de 100 mm o de otro tamaño estándar y se tratan de forma similar usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
35 Células A549:
Se obtuvo la linea celular A549 de carcinoma de pulmón humano de la Colección estadounidense de cultivos tipo (ATCC) (Manassas, VA, Estados Unidos). Las células A549 se cultivaron de forma rutinario en medio basal DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos) suplementado con suero de carnero fetal al 10 % (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos), penicilina (100 unidades por ml) y estreptomicina (100 microgramos por
40 ml) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las celular se sometieron rutinariamente a tripsinización y a dilución cuando alcanzaron una confluencia del 90 %.
Células NHDF:
Se obtuvieron fibroblastos dérmicos de recién nacido humano (NHDF) de Clonetics Corporation (Walkersville, MD, Estados Unidos). Los NHDF se mantuvieron rutinariamente en medio de crecimiento de fibroblastos (Clonetics
45 Corporation, Walkersville, MD, Estados Unidos) suplementado tal como recomienda el proveedor. Las células se mantuvieron durante hasta 10 pasos tal como recomienda el proveedor.
Células HEK:
Se obtuvieron queratinocitos embiónicos humanos (NHDF) de Clonetics Corporation (Walkersville, MD, Estados Unidos). Los HEK se mantuvieron rutinariamente en medio de crecimiento de queratinocitos (Clonetics Corporation,
50 Walkersville, MD, Estados Unidos) formulado tal como recomienda el proveedor. Las células se mantuvieron durante hasta 10 pasos tal como recomienda el proveedor.
Células HepG2:
Se obtuvo la linea celular HepG2 de hepatoblastoma humano de la Colección estadounidense de cultivos tipo (ATCC) (Manassas, VA, Estados Unidos). Las células HepG2 se cultivaron rutinariamente en MEM de Eagle suplementado con suero de carnero fetal al 10 %, aminoácidos no esenciales y piruvato de sodio 1 mM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD, Estados Unidos). Las celular se sometieron rutinariamente a tripsinización y a dilución cuando alcanzaron una confluencia del 90 %. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-primaria Nº 3872) a
5 una densidad de 7.000 células/pocillo para su uso en análisis RT-PCR.
Para el análisis de inmunotransferencia (Northern) u otros análisis, las células se siembran en placas de cultivo de tejidos de 100 mm o de otro tamaño estándar y se tratan de forma similar usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
Células Hep3B:
10 Se obtuvo la linea celular Hep3B de carcinoma hepatocelular humano de la Colección estadounidense de cultivos tipo (ATCC) (Manassas, VA, Estados Unidos). Las células Hep3B se cultivaron de forma rutinaria en MEM de Dulbeccos de alta concentración de glucosa suplementado con suero de carnero fetal al 10 %, L-glutamina e clorhidrato de piridoxina (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD, Estados Unidos). Las celular se sometieron rutinariamente a tripsinización y a dilución cuando alcanzan una confluencia del 90 %. Las células se sembraron en placas de 24
15 pocillos (Falcon-primaria Nº 3846) a una densidad de 50.000 células/pocillo para su uso en análisis de RT-PCR.
Para el análisis de inmunotransferencia (Northern) u otros análisis, las células se siembran en placas de cultivo de tejidos de 100 mm o de otro tamaño y se tratan de forma similar usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
Hepatocitos de ratón primarios:
20 Los hepatocitos de ratón primarios se prepararon a partir de ratones CD-1 adquiridos de Charles River Labs (Wilmington, MA, Estados Unidos) y se cultivaron de forma rutinaria en DMEM, de alta concentración de glucosa (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) suplementado con suero de bovino fetal al 10 % (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 100 unidades por ml de penicilina y 100 microgramos por ml de espectrosmicina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las células se cultivaron hasta
25 un 80 % de confluencia para su uso en experimentos de transfección de oligonucleótidos antisentido.
Para el análisis de inmunotransferencia (Northern) u otros análisis, las células se siembran en placas de cultivo de tejidos de 100 mm o de otro tamaño y se tratan de forma similar usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
Hepatocitos de rata primarios:
30 Los hepatocitos de rata primarios se prepararon a partir de ratas Sprague-Dawley adquiridas de Charles River Labs (Wilmington, MA, Estados Unidos) y se cultivaron rutinariamente en DMEM, de alta concentración de glucosa (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) suplementado con suero de bovino fetal al 10 % (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 100 unidades por ml de penicilina y 100 microgramos por ml de espectrosmicina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las células se cultivaron hasta
35 un 80 % de confluencia para su uso en experimentos de transfección de oligonucleótidos antisentido.
Tratamiento con compuestos antisentido:
Cuando las células alcanzaron un 65 – 75 % de confluencia, se trataron con oligonucleótidos. Para células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavaron una vez con 100 µl de medio de suero reducido OPTI-MEM™-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y después se trataron con 130 µl de OPTI-MEM™-1 de
40 medio que contenía 3,75 µg/ml de reactivo LIPOFECTIN™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y la concentración deseada de oligonucleótido. Las células se tratan y los datos se obtienen por triplicado. Despúes de 4-7 horas de tratamiento a 37 ºC, el medio se reemplaza con medio reciente. Las células se recogieron 1624 horas después del tratamiento con oligonucleótido.
La concentración de oligonucleótido usado varía de línea celular a línea celular. Para determinar la concentración
45 óptima de oligonucleótido para una línea celular particular, las células se trataron con un oligonucleótido de control positivo a una variedad de concentraciones. Para células humanas el oligonucleótido de control positivo se selecciona de bien ISIS 13920 (TCCGT-CATCGCTCCTCAGGG, SEC ID Nº: 1) que está dirigido a H-ras humano, o bien ISIS 18078, (GT-GCGCGCGAGCCCGAAATC, SEC ID Nº: 2) que está dirigido a quinasa Jun-N-terminal 2 (JNK2) humana. Ambos controles con 2’-O-metoxietil gapmers (2’-O-metoxietilos se muestran en negrita) con un esqueleto de
50 fosforotioato. Para células de ratón o rata, el oliogonucleótido de control positivo es ISIS 15770, ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, SEC ID Nº: 3, un 2’-O-metoxietil gapmer (2’-O-metoxietilo se muestra en negrita) con un esqueleto de fosforotioato que está dirigido a c-raf tanto de ratón como de rata. La concentración de oligonucleótido de control positivo que da como resultado un 80 % de inhibición de ARNm de c-H-ras (para ISIS 13920), JNK2 (para ISIS 18078) o c-raf (para ISIS 15770) se usa después como la concentración para seleccionar
55 nuevos nucleótidos en experimentos subsiguientes para esa línea celular. Si no se logra una inhibición del 60 %, la concentración más baja de oligonucleótido de control positivo que da como resultado una inhibición del 60 % de ARNm de c-H-ras, JNK2 o c-raf se usa después como la concentración para seleccionar nuevos nucleótidos en experimentos subsiguientes para esa línea celular. Si no se logra el 60 % de inhibición, esa línea celular particular se considera inadecuada para los experimentos de transfección de oligonucleótidos. Las concentraciones de oligonucleótidos antisentido que se usan en el presente documento son de 50 nM a 300 nM.
5 Ejemplo 10: Análisis de la inhibición con oligonucleótidos de la expresión de apolipoproteína C-III
La modulación antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III puede analizarse mediante una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante análisis de inmunotransferencia (Northern), reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva o PCR en tiempo real (RT-PCR). Actualmente es preferente la PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede 10 realizarse sobreel ARN celular total o ARNm de poli(A)+. El procedimiento preferente de análisis de ARN de la presente invención es el uso del ARN celular total tal como se describe en otros ejemplos del presente documento. Los procedimientos de aislamiento son bien conocidos en la técnica. El análisis de inmunotransferencia (Northern) también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se realiza usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7600, 7700 ó 7900, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos,
15 y se usa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los niveles proteicos de la apolipoproteína C-III pueden cuantificarse de una variedad de formas bien conocidas en la técncia, tales como inmunoprecipitación, análisis de inmunotransferencia (Western), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o selección celular activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a la apolipoproteína C-III pueden identificarse y obtenerse a partir de una variedad de fuentes, tales como el catálogo
20 MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI, Estados Unidos), o pueden prepararse usando procedimientos de generación de anticuerpos monoclonales y policlonales convencionales bien conocidos en la técnica.
Ejemplo 11: Diseño de ensayos fenotípicos y estudios in vivo para el uso de inhibidores de apolipoproteína C-III
25 Ensayos fenotípicos
Una vez se han identificado los inhibidores de apolipoproteína C-III usando los procedimientos divulgados en el presente documento, los compuestos se analizan adicionalmente en uno o varios ensayos fenotípicos, teniendo cada uno puntos finales medibles que predicen la eficacia en el tratamiento de un estado patológico o trastorno particular. Los ensayos fenotípicos, kits y reactivos para su uso son bien conocidos por los expertos en la técnica y se usan en 30 el presente documento para analizar el papel y/o la asociación de apolipoproteína en estados de salud y de enfermedad. Los ensayos fenotípicos representativos que pueden adquirirse de uno cualquiera de entre varios proveedores comerciales incluyen los ensayos para determinar la viabilidad celular, la citotoxicidad, la proliferación o supervivencia celular (Molecular Probes, Eugene, OR, Estados Unidos; PerkinElmer, Boston, MA, Estados Unidos), ensayos basados en proteínas que incluyen ensayos enzimáticos (Panvera,-LLC, Madison, WI,Estados Unidos; BD 35 Bio-sciences, Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos; Oncogene Research Products, San Diego, CA, Estados Unidos), regulación celular, transducción de señales, inflamación, procesos oxidativos y apoptosis (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI, Estados Unidos), acumulación de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos), ensayos de angiogénesis, ensayos de formación de tubos, ensayos de citocinas y hormonas y ensayos de metabolismo (Chemicon International Inc., Temecula, CA, Estados Unidos; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Estados
40 Unidos).
En un ejemplos no limitante, las células que se ha determinado que son apropiadas para un ensayo fenotípico particular (es decir, células MCF-7 seleccionadas para estudios de cáncer de mama; adipocitos para estudios de obesidad) se tratan con inhibidores de la apolipoproteína C-III identificados a partir de estudios in vitro y compuestos control a concentraciones óptimas que se determinan usando los procedimientos descritos anteriormente. Al final del
45 periodo de tratamiento, las células tratadas y no tratadas se analizan usando uno o varios procedimientos específicos para el ensayo para determinar los resultados y puntos finales fenotípicos.
Los puntos finales fenotípicos incluyen cambios en la morfología celular en función del tiempo o de la dosis de tratamiento, así como cambios en niveles de componentes celulares tales como proteínas, lípidos, ácido nucleicos, hormonas, sacáridos o metales. Las mediciones del estado celular, que incluyen pH, estado del ciclo celular,
50 captación o excreción de indicadores biológicos por la célula, son también puntos finales de interés.
El análisis del genotipo de la célula (medición de la expresión de uno o varios de los genes de la célula) después del tratamiento también se usa como indicador de la eficacia o potencia de los inhibidores de apolipoproteína C-III. Los genes caracterizadores o los genes sospechosos de estar asociados con un estado patológico, trastorno o fenotipo específico se miden tanto en células tratadas como en células no tratadas.
55 Estudios in vivo
Los sujetos individuales de los estudios in vivo descritos en el presente documento son animales vertebrados de sangre caliente que incluyen seres humanos.
El ensayo clínico se somete a controles rigurosos para asegurar que no se ponga en riesgo innecesariamente a los individuos y que éstos estén informados de su papel en el estudio. Para justificar los efectos psicológicos de los tratamientos que se van a recibir, a los voluntarios se les administró aleatoriamente placebo o inhibidor de la apolipoproteína C-III. Además, para evitar que los médicos estuvieran predispuestos con respecto a los tratamientos,
5 no se les informó de si la medicación que van a administrar es un inhibidor de la apolipoproteína C-III o un placebo. Usando este enfoque de aleatoriedad, cada voluntario tiene la misma posibilidad de que se le administre el nuevo tratamiento o el placebo.
Los voluntarios reciben bien el inhibidor de apolipoproteína C-III o placebo durante un periodo de ocho semanas y se miden parámetros biólogicos asociados con el estado patológico o trastorno indicado al comienzo (mediciones de 10 línea bases antes de cualquier tratamiento, al final (después del tratamiento final) y a intervalos regulares durante el periodo de estudio. Dichas mediciones incluyen los niveles de moléculas de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína C-III o los niveles de proteína apolipoproteína C-III en fluidos corporales, tejidos y órganos en comparación con los niveles de antes del tratamiento. Otras mediciones incluyen, pero no están limitadas a, índices del estado patológico o trastorno que hay que tratar, peso corporal, tensión arterial, valoraciones en suero de
15 indicadores farmacológicos de enfermedad o toxicidad, asó como mediciones de ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción).
La información registrada de cada paciente incluye edad (años), sexo, altura (cm), historial familiar del estado patológico o trastorno (sí/no), valoración de motivación (alguna/moderada/grande) y número y tipo de regímenes de tratamiento previos para la enfermedad o el trastorno indicado.
20 Los voluntarios que toman parte en este estudio son adultos sanos (edad: 18 a 65 años) y participan en el estudio un número aproximadamente igual de varones que de mujeres. Los voluntarios con determinadas características se distribuyen equitativamente entre el tratamiento con placebo y el tratamiento con inhibidor de apolipoproteína C-III. En general, los voluntarios tratados con placebo no presentan una respuesta al tratamiento o ésta es pequeña, mientras que los voluntarios tratados con inhibidor de apolipoproteína C-III muestran tendencias positivas en el índice
25 del estado patológico o trastorno al finalizar el estudio.
Ejemplo 12: Aislamiento de ARN
Aislamiento de ARNm de Poli(A)+
Se aisló ARNm de Poli(A)+ de acuerdo con Miura y col., (Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764). Otros procedimientos para aislar ARNm de poli(A)+ son rutinarios en la técnica. Brevemente, para células cultivadas en placas de 96 30 pocillos, el medio de cultivo se eliminó de las células y cada pocillo se lavó con 200 µl de PBS frío. Se añadieron a cada pocillo 60 µl de tampón de lisis (Tris-HC l10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, NP-40 al 0,5 %, complejo vanadilribonucleósido 20 mM), la placa se agitó vigorosamente y después se incubó a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se transfirieron 55 µl de lisado a placas de 96 pocillos recubiertas con Oligo d(T) (AGCT Inc., Irvine, CA, Estados Unidos). Las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con 200 µl
35 de tampón de lavado (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,3 M). Después del lavado final, la placa se transfirió a toallas de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado y después se secaron al aire durante cinco minutos. Se añadieron a cada pocillo 60 µl de tampón de elución (Tris-HCl 5 mM, pH 7,6), precalentados a 70 ºC, la placa se incubó sobre una placa caliente a 90 ºC y el eluato se transfirió después a una placa nueva de 96 pocillos.
Las células cultivadas en placas estándar de 100 mm o de otro tamaño pueden tratarse de forma similar usando 40 volúmenes apropiados de todas las soluciones.
Aislamiento de ARN total
El ARN total se aisló usando un kit RNEASY 96™ y tampones adquiridos de Qiagen Inc. (Valencia, CA, Estados Unidos) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. Brevemente, para células cultivadas en placas de 96 pocillos, el medio de crecimiento se retiró de las células y cada pocillo se lavó con 200 µl de PBS frío. Se 45 añadieron a cada pocillo 150 µl de tampón RLT y la placa se agitó vigorosamente durante 20 segundos. Después se añadieron a cada pocillo 150 µl de etanol al 70 % y los contenidos se mezclaron pipeteando tres veces hacia arriba y hacia abajo. Después se transfirieron las muestras a una placa RNEASY 96™ de 96 pocillos unida a un colector QIAVAC™ equipado con una bandeja de recogida de desechos y unido a una fuente de vacío. Se aplicó vacío durante 1 minuto. Se añadieron 500 µl de tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se incubaron durante 15 50 minutos y se aplicó de nuevo vacío durante 1 minuto. Se añadieron 500 µl adicionales de tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se aplicó vacío durante 2 minutos. Después se añadió 1 ml de tapón RPE a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se aplicó vacío durante un periodo de 90 segundos. Después se repitio el lavado con tampón RPE y se aplicó vacío durante 3 minutos adicionales. Después se retiró la placa del colector QIAVAC™ y se transfirió sobre toallas de papel para que se secara. Después se volvió a unir la placa al colector QIAVAC™ equipado
55 con una gradilla de tubos de recolección que contenía tubos de recolección de 1,2 ml. Después se eluyó el ARN pipeteando 140 µl de ARNasa exenta de agua a cada pocillo, incubando durante 1 minuto y, después, aplicando vacío durante 3 minutos.
Las etapas repetitivas de pipeteo y elución puedn automatizarse usando un aparato QIAGEN® Bio-Robot™ 9604 (Qiagen, Inc., Valencia, CA, Estados Unidos). Esencialmente, después de lisar las células en la placa de cultivo, la placa se transfiere a una cubierta robótica en la que se llevaron a cabo las etapas de pipeteo, tratamiento de ADNasa y de elución.
Ejemplo 13: Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III
5 La cuantificación de los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III se realizó por PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7600, 7700 ó 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Éste es un sistema de detección por fluorescencia, de tubo cerrado, no basado en gel, que permite la cuantificación de alto rendimiento de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. Al contrario que la PCR estándar, en la que los
10 productos de amplificación se cuantifican después de completar la PCR, los productos en PCR cuantitativa en tiempo real se cuantifican según se van acumulando. Esto se realiza incluyen en la reacción PCR una sonda oligonucleótido que se alinea específicamente entre los cebadores de PCR directos e inversos y contiene dos colorantes fluorescentes. Un colorante informador (por ejemplo, FAM o JOE, obtenidos bien de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos, bien de Operon Technologies Inc., Alameda, CA, Estados Unidos, o bien de Integrated
15 DNA Technologies Inc., Coralville, IA, Estados Unidos) se une al extremo 5’ de la sonda y el colorante inactivador (por ejemplo, TAMRA, obtenido bien de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos, bien de Operon Technologies Inc., Alameda, CA, Estados Unidos, o bien de Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA, Estados Unidos) se une al extremo 3’ de la sonda. Cuando la sonda y los colorantes están intactos, la emisión del colorante informador se inactiva por la proximidad del colorante inactivador 3’. Durante la amplificación, el alineamiento de la
20 sonda con la secuencia diana crea un sustrato que puede escindirse por la actividad de 5'-exonucleasa de la Taq polimerasa. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación por PCR, la escisión de la sonda por Taq polimerasa libera el colorante informador del resto de la sonda (y, en consecuencia, del resto inactivador) y se genera la señal fluorescente específica de secuencia. Con cada ciclo, las moléculas informadoras adicionales se escinden de sus sondas respectivas y se realiza un seguimiento de la intensidad de la fluorescencia a intervalos regulares mediante
25 un láser óptico integrado en un sistema de detección de secuencia ABI PRISM™. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones de señal de ARNm de las muestras de control no tratadas genera una curva estándar que se usa para cuantificar el porcentaje de inhibición después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido de las muestras de ensayo.
Antes del análisis por PCR cuantitativa, los conjuntos cebador-sonda específicos del gen diana que se analiza se
30 evalúan para determinar su capacidad de ser "multiplexados" con una reacción de amplificación GAPDH. En la multiplexación, tanto el gen diana como el gen patrón interno GAPDH se amplifican simultáneamente en una muestra única. En este análisis, el ARNm aislado de células no tratadas se diluye serialmente. Cada dilución se amplifica en presencia de conjuntos cebador-sonda específicos de GAPDH sólo, del gen diana sólo (“monoplexación”) o de ambos (multiplexación). Siguiendo la amplificación por PCR, se generan curvas estándar de
35 señal de GAPDH y ARNm diana como función de la dilución de las muestras monoplexadas y multiplexadas. Si tanto la pendiente y el coeficiente de correlación de las señales de GAPDH y diana generadas de las muestras multiplexadas están dentro del 10 % de sus valores correspondientes generados de muestras monoplexadas, el conjunto cebadorsonda específico para esa diana se considera multiplexable. También se conocen en la técnica otros procedimientos de PCR.
40 Los reactivos de PCR se obtuvieron de Invitrogen Corporation, (Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las reacciones de RT-PCR se realizaron añadiendo 20 µl de cóctel de PCR (2,5 x tampón PCR menos MgCl2, MgCl2 6,6 mM, dATP, dCTP, dCTP y dGTP, cada uno 375 µM, cebador directo y cebador inverso, cada uno 375 nM, sonda 125 nM, 4 unidades de inhibidor de ARNsa, 1,25 unidades de PLAT-INUM® Taq, 5 unidades de transcriptasa inversa MuLV y 2,5 x colorante ROX) a placas de 96 pocillos que contenían 30 µl de solución de ARN total (20-200 ng). La reacción a tiempo
45 real se llevó a cabo por incubación durante 30 minutos a 48 ºC. Siguiendo a 10 minutos de incubación a 95 ºC para activar el PLATINUM® Taq, se llevaron a cabo 40 ciclos de un protocolo de PCR de dos etapas: 95 ºC durante 15 segundos (desnaturalización) seguidos de 60 ºC durante 1,5 minutos (alineamiento/extensión).
Las cantidades de diana génica obtenidas por RT-PCR en tiempo real se normalizan usando bien el nivel de expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o bien cuantificando el ARN total usando el reactivo
50 RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, Estados Unidos). La expresión de GAPDH se cuantifica por RT-PCR en tiempo real, operando simultáneamente con la diana, multiplexación, o por separado . El ARN total se cuantifica usando reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, Estados Unidos). Los procedimientos de cuantificación de ARN usando reactivo RiboGreen™ se enseñan en Jones, L.J. y col., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374).
55 En este ensayo,se pipetean 170 µl de reactivo de trabajo RiboGreen™ (reactivo RiboGreen™ diluido 1:350 en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) a una placa de 96 pocillos que contiene 30 µl de ARN molecular purificado. La placa se lee en un lector CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems) con excitación a 485 nm y emisión a 530 nm.
Las sondas y los cebadores de apolipoproteína C-III humana se diseñaron para que se hibridaran con una secuencia de apolipoproteína C-III humana usando información de secuencias publicada (nucleótidos 6238608 a 6242565 de la 60 secuencia de número de acceso del GenBank NT_035088.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID Nº:
4). Para la apolipoproteína C-III humana los cebadores de PCR fueron: cebador directo: TCAGCTTCATGCAGGGTTACAT (SEC ID Nº: 5) cebador inverso: ACGCTGCTCAGTGCATCCT (SEC ID Nº: 6) y la sonda PCR fue: FAM-AAGCACGCCACCAAGACCGCC-TAMRA (SEC ID Nº: 7) en la que FAM es el colorante fluorescente y TAMRA es el colorante inactivador. Para GAPDH humano los cebadores PCR fueron: cebador directo:
5 GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEC ID Nº: 8) cebador inverso: GAAGATGGTGATGGGATTTC GGGTCTCGCTCCT-GGAAGAT(SEC ID Nº: 9) y la sonda PCR fue: 5’ JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3’ (SEC ID Nº: 10) en la que JOE es el colorante fluorescente y TAMRA es el colorante inactivador.
Las sondas y los cebadores de apolipoproteína C-III de ratón se diseñaron para que se hibridaran con una secuencia de apolipoproteína C-III de ratón usando información de secuencias publicada (número de acceso del GenBank
10 L04150.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 11). Para la apolipoproteína C-III de ratón los cebadores de PCR fueron: cebador directo: TGCAGGGCTACATGGAACAA (SEC ID Nº: 12) cebador inverso: CGGACTCCTGCACGCTACTT (SEC ID Nº: 13) y la sonda PCR fue: FAM-CTCCAA-GACGGTCCAGGATGCGC-TAMRA (SEC ID Nº: 14) en la que FAM es el colorante fluorescente informador y TAMRA es el colorante inactivador. Para GAPDH de ratón los cebadores PCR fueron:
15 cebador directo: GGCAAATTCAACGGCACAGT(SEC ID Nº: 15)
cebador inverso: GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT(SEC ID Nº: 16) y la sonda PCR fue: 5’ JOE-AAGGCCGA-GAATGGGAAGCTTGTCATC- TAMRA 3’ (SEC ID Nº: 17) en la que JOE es el colorante fluorescente informador y TAMRA es el colorante inactivador.
Ejemplo 14: Análisis de inmunotransferencia (Northern) de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III
20 Dieciocho horas después del tratamiento antisentido, las monocapas celulares se lavaron dos veces con PBS frío y se lisaron en 1 ml de reactivo RNAZOL™ (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX, Estados Unidos). El ARN total se preparó siguiendo protocolos recomendados por el fabricante. Se fraccionaron veinte microgramos de ARN total por electroforesis a través de geles de agorosa al 1,2 % que contenían formaldehído al 1,1 % usando un sistema tampón MOPS (AMRESCO, Inc. Solon, OH, Estados Unidos). El ARN se transfirió del gel a membranas de nailon
25 HYBOND™-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Estados Unidos) mediante transferencia capilar durante la noche usando un sistema tampón de transferencia Northern/Southern (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX, Estados Unidos). La transferencia de ARN se confirmó mediante visualización UV. Las membranas se fijaron mediante reticulación UV usando un reticulador UV STRATALINKER™ 2400 (Stratagene, Inc, La Jolla, CA, Estados Unidos) y después se analizaron usando solución de hibridación QUICKHYB™ (Stratagene, La Jolla, CA, Estados
30 Unidos) usando las recomendaciones del fabricante para condiciones restrictivas.
Para detectar la apolipoproteína C-III humana se preparó una sonda específica de apolipoproteína PCR humana usando el cebador directo TCAGCTTCATGCAGGGTTACAT (SEC ID Nº: 5) y el cebador inverso ACGCTGCTCAGTGCATCCT (SEC ID Nº: 6). Para normalizar por variaciones en la eficacia en la carga y la transferencia se retiraron membranas y se analizaron para evaluar el ARN de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
35 (GAPDH) humano (Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos).
Para detectar la apolipoproteína C-III de ratón se preparó una sonda específica de apolipoproteína PCR de ratón usando el cebador directo TGCAGGGCTACATGGAACAA (SEC ID Nº: 12) y el cebador inverso CGGACTCCT-GCACGCTACTT (SEC ID Nº: 13). Para normalizar por variaciones en la eficacia en la carga y la transferencia se retiraron membranas y se analizaron para evaluar el ARN de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de
40 ratón (Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos). Las membranas hibridadas se visualizaron y cuantificaron usando un aparato PHOSPHORIMAGER™ y el programa informático IM-AGEQUANT™ V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, Estados Unidos). Los datos se normalizaron a niveles de GAPDH en controles no tratados.
Ejemplo 15: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
45 Se diseñó una serie de compuestos antisentido para dirigirlos a regiones diferentes de ARN de apolipoproteína C-III humana, usando secuencias publicadas (nucleótidos 6238608 a 6242565 de número de acceso del GenBank NT_035088.1, que representa una secuencia genómica que se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 4, y el número de acceso del GenBank NM_000040.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 18). Los compuestos se muestran en la tabla 1. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia
50 diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 1 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2’-desoxinucleótidos, que están flanqueados por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de
55 citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III humana mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de los tres experimentos en los que se trataron células HepG2 con los oligonucleótidos antisentido. El control positivo para cada dato puntual se identifica en la tabla por el número de secuencia ID. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
Tabla 1 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA %DE INHIBICIÓN SEC ID N.º SECUENCIA CONTROL SEC ID N.º
167824
5’UTR 4 414 ctggagcagctgcctctagg 79 19 1
167835
Codificante 4 1292 ccctgcatgaagctgagaag 60 20 1
167837
Codificante 18 141 gtgcttcatgtaaccctgca 88 21 1
167846
Codificante 4 1369 tggcctgctgggccacctgg 66 22 1
167848
Codificante 4 3278 tgctccagtagtctttcagg 81 23 1
167851
Codificante 4 3326 tgacctcagggtccaaatcc 41 24 1
304739
5’UTR 4 401 ctctagggatgaactgagca 62 25 1
304740
5’UTR 4 408 cagctgcctctagggatgaa 44 26 1
304741
5’UTR 18 17 ttcctggagcagctgcctct 57 27 1
304742
5’UTR 18 24 acctctgttcctggagcagc 78 28 1
304743
Codón de inicio 18 29 atggcacctctgttcctgga 78 29 1
304744
Codón de inicio 4 1065 gggctgcatcggcacctctgt 73 30 1
304745
Codificante 4 1086 ggcaacaacaaggagtaccc 90 31 1
304746
Codificante 4 1090 ggagggcaacaacaaggagt 80 32 1
304747
Codificante 18 87 agctcgggcagaggccagga 49 33 1
304748
Codificante 18 92 tctgaagctcgggcagaggc 72 34 1
304749
Codificante 18 97 cggcctctgaagctcgggca 11 35 1
304750
Codificante 4 1267 catcctcggcctctgaagct 49 36 1
304751
Codificante 4 1273 gggaggcatcctcggcctct 65 37 1
304752
Codificante 4 1278 gagaagggaggcatcctcgg 82 38 1
304753
Codificante 4 1281 gctqagaagggagqcatcct 75 39 1
304754
Codificante 4 1289 tgcatgaagctgagaaggga 74 40 1
304755
Codificante 18 143 gcgtgcttcatgtaaccctg 95 41 1
304756
Codificante 4 1313 ttggtggcgtgcttcatgta 92 42 1
304757
Codificante 4 1328 gcatccttggcggtcttggt 98 43 1
304758
Codificante 4 1334 ctcagtgcatccttggcggt 97 44 1
304759
Codificante 4 1336 tgctcagtcatccttggcg 93 45 1
304760
Codificante 4 1347 ctcctgcacgctgctcagtg 65 46 1
304761
Codificante 4 1349 gactcctgcacgctgctcag 77 47 1
301762
Codificante 4 1358 gccacctgggactcctgcac 89 48 1
304763
Codificante 18 210 gcccctggcctgctgggcca 71 49 1
304764
Codificante 18 211 agcccctggcctgctgggcc 62 50 1
E04749914 02-12-2011
(continuación)
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA %DE INHIBICIÓN SEC ID N.º SECUENCIA CONTROL SEC ID N.º
304765
Codificante 4 3253 gaagccatcggtcacccagc 71 51 1
304766
Codificante 4 3255 ctgaagccatcggtcaccca 85 52 1
304767
Codificante 4 3265 tttcagggaactgaagccat 73 53 1
304768
Codificante 4 3273 cagtagtctttcagggaact 40 54 1
304769
Codificante 4 3283 aacggtgctccagtagtctt 66 55 1
304770
Codificante 4 3287 ccttaacggtgctccagtag 88 56 1
304771
Codificante 4 3295 gaacttgtccttaacggtgc 59 57 1
304772
Codificante 4 3301 ctcagagaacttgtccttaa 88 58 1
304773
Codificante 4 3305 agaactcagagaacttgtcc 75 59 1
304774
Codificante 4 3310 atcccagaactcagagaact 0 60 1
304775
Codificante 4 3320 cagggtccaaatcccagaac 70 61 1
304776
Codificante 4 3332 ttggtctgacctcagggtcc 90 62 1
304777
Codificante 4 3333 gttggtctgacctcagggtc 84 63 1
304778
Codificante 4 3339 gctgaagttggtctgacctc 81 64 1
304779
Codificante 4 3347 cagccacggctgaagttggt 75 65 1
304780
Codón de detención 4 3351 caggcagccacggctgaagt 83 66 1
304781
Codón de detención 4 3361 attgaggtctcaggcagcca 79 67 1
304782
3’UTR 4 3385 tggataggcaggtggacttg 64 68 1
304783
3’UTR 18 369 ctcgcaggatggataggcag 76 69 1
304784
3’UTR 18 374 aggagctcgcaggatggata 58 70 1
304785
3’UTR 18 380 gacccaaggagctcgcagga 73 71 1
304786
3’UTR 18 385 tgcaggacccaaggagctcg 92 72 1
304787
3’UTR 4 3417 tggagattgcaggacccaag 88 73 1
304788
3’UTR 4 3422 agccctggagattgcaggac 69 74 1
304789
3’UTR 4 3425 ggcagccctggagattgcag 76 75 1
304790
3’UTR 4 3445 ccttttaagcaacctacagg 65 76 1
304791
3’UTR 4 3450 ctgtcccttttaagcaacct 53 77 1
304792
3’UTR 4 3456 agaatactgtcccttttaag 72 78 1
304793
3’UTR 4 3461 cactgagaatactgtccctt 67 79 1
304794
3’UTR 4 3469 taggagagcactgagaatac 59 80 1
304795
3’UTR 4 3472 gggtaggagagcactgagaa 74 81 1
304796
3’UTR 4 3509 aggccagcatgcctggaggg 63 82 1
304797
3’UTR 4 3514 ttgggaggccagcatgcctg 55 83 1
304798
3’UTR 4 3521 agctttattgggaggccagc 90 84 1
304799
3’UTR 4 3526 tgtccagctttattgggagg 85 85 1
304800
3’UTR 4 3528 cttgtccagctttattggga 94 86 1
E04749914 02-12-2011
(continuación)
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA %DE INHIBICIÓN SEC ID N.º SECUENCIA CONTROL SEC ID N.º
304801
3’UTR 4 3533 agcttcttgtccagctttat 74 87 1
304802
3’UTR 4 3539 catagcagcttcttgtccag 73 88 1
304803
Unión exón:intrón 4 416 acctggagcagctgcctcta 87 89 1
304804
Unión exón:intrón 4 424 agggcattacctggagcagc 68 90 1
304805
Unión exón:intrón 4 1053 acctctgttcctgcaaggaa 74 91 1
304806
Unión exón:intrón 4 1121 aagtgcttacgggcagaggc 78 92 1
304807
Unión exón:intrón 4 1380 gcgggtgtacctggcctgct 52 93 1
304808
Intrón 4 2337 aaccctgttgtgaactgcac 59 94 1
304809
Intrón 4 2405 agtgagcaataccgcctgag 80 95 1
304810
Intrón 4 2542 cgggcttgaattaggtcagg 56 96 1
Tal como se muestra en la tabla 1, las secuencias SEC ID Nº 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 y 96 mostraron al 5 menos un 45 % de inhibición de la expresión de la apolipoproteína C-III en este ensayo y son, por lo tanto, preferentes. Son más preferentes las secuencias SEC ID Nº 75, 86 y 85. Las regiones diana a las que estas secuencias preferentes son complementarias se denominan en el presente documento “segmentos diana preferentes” y son preferentes, por lo tanto, como diana para los compuestos de la presente divulgación. Los segmentos diana preferentes se muestran en la tabla 3. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido
10 preferentes que se muestran en la tabla 1. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en un ácido nucleico diana particular al que se une el oligonucleótido. En la tabla 3 se muestran también las especies en las que se han encuentrado cada uno de los segmentos diana preferentes.
Ejemplo 16: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
15 Se desiñó una segunda serie de compuestos antisentido para dirigirla a diferentes regiones del ARN de apolipoproteína C-III de ratón usando secuencias publicadas (número de acceso del GenBank L04150.1, que se incorpora al presente documento como secuencia SEC ID Nº: 11). Los compuestos se muestran en la tabla 2. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en el ácido nucleico diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 2 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud,
20 compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2’-desoxinucleótidos, que están flanqueados por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III de ratón mediante PCR cuantitativa
25 en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de los tres experimentos en los que se trataron células hepatocíticas principales con los oligonucleótidos antisentido. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
Tabla 2 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
167858
5’UTR 11 1 tagggataaaactgagcagg 47 97
167859
5’UTR 11 21 ctggagtagctagctgcttc 30 98
167860
Codón de inicio 11 41 gctgcatggcacctacgtac 80 99
167861
Codificante 11 62 ccacagtgaggagcgtccgg 86 100
167862
Codificante 11 88 ggcagatgccaggagagcc a 55 101
167863
Codificante 11 104 ctacctcttcagctcgggca 56 102
167864
Codificante 11 121 cagcagcaaggatccctcta 83 103
167865
Codificante 11 131 gcacagagcccagcagcaa g 49 104
167867
Codificante 11 215 ccctggccaccgcagctata 67 105
167868
Codificante 11 239 atctgaagtgattgtccatc 11 106
167869
Codificante 11 254 agtagcctttcaggaatctg 57 107
167870
Codificante 11 274 cttgtcagtaaacttgctcc 89 108
167871
Codificante 11 286 gaagccggtgaacttgtcag 55 109
167872
Codificante 11 294 gaatcccagaagccggtgaa 29 110
167873
Codificante 11 299 ggttagaatcccagaagccg 55 111
167874
Codificante 11 319 tggagttggttggtcctcag 79 112
167875
Codón de detención 11 334 tcacgactcaatagctggag 77 113
167877
3’UTR 11 421 cccttaaagcaaccttcagg 71 114
167878
3’UTR 11 441 agacatgagaacatactttc 81 115
167879
3’UTR 11 471 catgtttaggtgagatctag 87 116
3’UTR
tcttatccagctttattagg
Tal como se muestra en la tabla 2, las SEC ID Nº 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 5 114, 115, 116 y 117 mostraron al menos un 45 % de inhibición de la expresión de la apolipoproteína C-III de ratón en este experimento y son, por lo tanto, preferentes. Son más preferentes las secuencias SEC ID Nº 117, 116 y 100. Las regiones diana a las que estas secuencias preferentes son complementarias se denominan en el presente documento “segmentos diana preferentes” y son preferentes, por lo tanto, como diana para los compuestos de la presente divulgación. Estos segmentos diana preferentes se muestran en la tabla 3. Las secuencias representan el complemento 10 inverso de los compuestos antisentido preferentes que se muestran en la tabla 2. Se muestra que estas secuencias contienen timina (T) pero un experto en la técnica apreciará que la timina (T) se reemplaza generalmente por uracilo (U) en secuencias de ARN. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en un ácido nucleico diana particular el que se une el oligonucleótido. En la tabla 3 se muestran también las especies en las que se han encontrado cada uno de los segmentos diana preferentes.
Tabla 3 – Secuencia y posición de segmentos diana preferentes identificados en apolipoproteína C-III.
SITIO ID
SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA ASOCIADO INVERSO DE SEC ID ACTIVO EN SEC ID N.º
82975
4 414 cctagaggcagctgctccag 19 H. sapiens 118
82980
4 1292 cttctcagcttcatgcaggg 20 H. sapiens 119
82981
18 141 tgcagggttacatgaagcac 21 H. sapiens 120
82985
4 1369 ccaggtggcccagcaggcca 22 H. sapiens 121
82987
4 3278 cctgaaagactactggagca 23 H. sapiens 122
220510
4 401 tgctcagttcatccctagag 25 H. sapiens 123
220512
18 17 agaggcagctgctccaggaa 27 H. sapiens 124
220513
18 24 gctgctccaggaacagaggt 28 H. sapiens 125
220514
18 29 tccaggaacagaggtgccat 29 H. sapiens 126
220515
4 1065 acagaggtgccatgcagccc 30 H. sapiens 127
220516
4 1086 gggtactccttgttgttgcc 31 H. sapiens 128
220517
4 1090 actccttgttgttgccctcc 32 H. sapiens 129
220518
18 87 tcctggcctctgcccgagct 33 H. sapiens 130
220519
18 92 gcctctgcccgagcttcaga 34 H. sapiens 131
220521
4 1267 agcttcagaggccgaggatg 36 H. sapiens 132
220522
4 1273 agaggccgaggatgcctccc 37 H. sapiens 133
220523
4 1278 ccgaggatgcctcccttctc 38 H. sapiens 134
220524
4 1281 aggatgcctcccttctcagc 39 H. sapiens 135
220525
4 1289 tcccttctcagcttcatgca 40 H. sapiens 136
220526
18 143 cagggttacatgaagcacgc 41 H. sapiens 137
220527
4 1313 tacatgaagcacgccaccaa 42 H. sapiens 138
220528
4 1328 accaagaccgccaaggatgc 43 H. sapiens 139
220529
4 1334 accgccaaggatgcactgag 44 H. sapiens 140
220530
4 1336 cgccaaggatgcactgagca 45 H. sapiens 141
220531
4 1347 cactgagcagcgtgcaggag 46 H. sapiens 142
220532
4 1349 ctgagcagcgtgcaggagtc 47 H. sapiens 143
220533
4 1358 gtgcaggagtcccaggtggc 48 H. sapiens 144
220534
18 210 tggcccagcaggccaggggc 49 H. sapiens 145
220535
18 211 ggcccagcaggccaggggct 50 H. sapiens 146
220536
4 3253 gctgggtgaccgatggcttc 51 H. sapiens 147
220537
4 3255 tgggtgaccgatggcttcag 52 H. sapiens 148
220538
4 3265 atggcttcagttccctgaaa 53 H. sapiens 149
220540
4 3283 aagactactggagcaccgtt 55 H. sapiens 150
220541
4 3287 ctactggagcaccgttaagg 56 H. sapiens 151
220542
4 3295 gcaccgttaaggacaagttc 57 H. sapiens 152
E04749914 02-12-2011
(continuación)
SITIO ID
SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA ASOCIADO INVERSO DE SEC ID ACTIVO EN SEC ID N.º
220543
4 3301 ttaaggacaagttctctgag 58 H. sapiens 153
220544
4 3305 ggacaagttctctgagttct 59 H. sapiens 154
220546
4 3320 gttctgggatttggaccctg 61 H. sapiens 155
220547
4 3332 ggaccctgaggtcagaccaa 62 H. sapiens 156
220548
4 3333 gaccctgaggtcagaccaac 63 H. sapiens 157
220549
4 3339 gaggtcagaccaacttcagc 64 H. sapiens 158
220550
4 3347 accaacttcagccgtggctg 65 H. sapiens 159
220551
4 3351 acttcagccgtggctgcctg 66 H. sapiens 160
220552
4 3361 tggctgcctgagacctcaat 67 H. sapiens 161
220553
4 3385 caagtccacctgcctatcca 68 H. sapiens 162
220554
18 369 ctgcctatccatcctgcgag 69 H. sapiens 163
220555
18 374 tatccatcctgcgagctcct 70 H. sapiens 164
220556
18 380 tcctgcgagctccttgggtc 71 H. sapiens 165
220557
18 385 cgagctccttgggtcctgca 72 H. sapiens 166
220558
4 3417 cttgggtcctgcaatctcca 73 H. sapiens 167
220559
4 3422 gtcctgcaatctccagggct 74 H. sapiens 168
220560
4 3425 ctgcaatctccagggctgcc 75 H. sapiens 169
220561
4 3445 cctgtaggttgcttaaaagg 76 H. sapiens 170
220562
4 3450 aggttgcttaaaagggacag 77 H. sapiens 171
220563
4 3456 cttaaaagggacagtattct 78 H. sapiens 172
220564
4 3461 aagggacagtattctcagtg 79 H. sapiens 173
220565
4 3469 gtattctcagtgctctccta 80 H. sapiens 174
220566
4 3472 ttctcagtgctctcctaccc 81 H. sapiens 175
220567
4 3509 ccctccaggcatgctggcct 82 H. sapiens 176
220568
4 3514 caqqcatgctggcctcccaa 83 H. sapiens 177
220569
4 3521 gctggcctcccaataaagct 84 H. sapiens 178
220570
4 3526 cctcccaataaagctggaca 85 H. sapiens 179
220571
4 3528 tcccaataaagctggacaag 86 H. sapiens 180
220572
4 3533 ataaagctggacaagaagct 87 H. sapiens 181
220573
4 3539 ctggacaagaagctgctatg 88 H. sapiens 182
220574
4 416 tagaggcagctgctccaggt 89 H. sapiens 183
220575
4 424 gctgctccaggtaatgccct 90 H. sapiens 184
220576
4 1053 ttccttgcaggaacagaggt 91 H. sapiens 185
220577
4 1121 gcctctgcccgtaagcactt 92 H. sapiens 186
220578
4 1380 agcaggccaggtacacccgc 93 H. sapiens 187
220579
4 2337 gtgcagttcacaacagggtt 94 H. sapiens 188
220580
4 2405 ctcaggcggtattqctcact 95 H. sapiens 189
E04749914 02-12-2011
(continuación)
SITIO ID
SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA ASOCIADO INVERSO DE SEC ID ACTIVO EN SEC ID N.º
220581
4 2542 cctgacctaattcaagcccg 96 H. sapiens 190
82997
11 1 cctgctcagttttatcccta 97 M. musculus 191
82999
11 41 gtacgtaggtgccatgcagc 99 M. musculus 192
83000
11 62 ccggacgctcctcactgtgg 100 M. musculus 193
83001
11 88 tggctctcctggcatctgcc 101 M. musculus 194
83002
11 104 tgcccgagctgaagaggtag 102 M. musculus 195
83003
11 121 tagagggatccttgctgctg 103 M. musculus 196
83004
11 131 cttgctgctgggctctgtgc 104 M. musculus 197
83006
11 215 tatagctgcggtggccaggg 105 M. musculus 198
83008
11 254 cagattcctgaaaggctact 107 M. musculus 199
83009
11 274 ggagcaagtttactgacaag 108 M. musculus 200
83010
11 286 ctgacaagttcaccggcttc 109 M. musculus 201
83012
11 299 cggcttctgggattctaacc 111 M. musculus 202
83013
11 319 ctgaggaccaaccaactcca 112 M. musculus 203
83014
11 334 ctccagctattgagtcgtga 113 M. musculus 204
83016
11 421 cctgaaggttgctttaaggg 114 M. musculus 205
83017
11 441 gaaagtatgttctcatgtct 115 M. musculus 206
83018
11 471 ctagatctcacctaaacatg 116 M. musculus 207
83019
11 496 cctaataaagctggataaga 117 M. musculus 208
Debido a que se ha encontrado por experimentación que estos “segmentos diana preferentes” están abiertos a, y accesibles a, hibridación con los compuestos antisentido de la presente divulgación, un experto en la técncia reconocerá o será capaz de determinar, usando nada más que experimentación de rutina, otras realizaciones que
5 abarcan otros compuestos que se hibridan específicamente con estos segmentos diana preferentes y, en consecuencia, inhiben la expresión de la apolipoproteína C-III.
De acuerdo con la presente divulgación, los compuestos antisentido incluyen compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), empalmadores alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos cortos que se hibridan con al menos una porción
10 del ácido nucleico diana.
Ejemplo 17: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi. Compuestos antisentido adicionales
Se diseñó una serie adicional de compuestos antisentido para dirigirlos a regiones diferentes de ARN de
15 apolipoproteína C-III humana, usando secuencias publicadas (nucleótidos 6238608 a 6242565 de número de acceso del GenBank NT_035088.1, que representa una secuencia genómica que se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 4, y el número de acceso del GenBank NM_000040.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 18). Los compuestos se muestran en la tabla 4. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 4 son oligonucleótidos
20 quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2’desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de
25 apoliproteína C-III mediantePCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedios de tres experimentos en los que se trataron células HepG2 con los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 4 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
ISIS Nº
SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
167826
4 1063 gctgcatggcacctctgttc 0 209
167828
4 1110 ggcagaggccaggagcgcca 0 210
167830
18 91 ctgaagctcgggcagaggcc 9 211
167832
18 101 tcctcggcctctgaagctcg 0 212
167840
4 1315 tcttggtggcgtgcttcatg 0 213
167842
4 1335 gctcagtgcatccttggcgg 38 214
167844
4 1345 cctgcacgctgctcagtgca 28 215
167847
4 3256 actgaagccatcggtcaccc 0 216
167850
4 3306 cagaactcagagaacttgtc 0 217
167852
4 3336 gaagttggtctgacctcagg 0 218
167853
4 3420 ccctggagattgcaggaccc 0 219
167854
4 3426 gggcagccctggagattgca 22 220
167855
4 3446 cccttttaagcaacctacag 27 221

Ejemplo 18: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III humana mediante 5 oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi. Estudio de respuesta a la dosis en células HepG2
Un subconjunto de los oligonucleótidos antisentido de los ejemplos 15 y 17 se analizó adicionalmente en un estudio de respuesta a la dosis. Las dosis de tratamiento de ISIS 167842 (SEC ID Nº: 214), ISIS 167844 (SEC ID Nº: 215), ISIS 167846 (SEC ID Nº: 22), ISIS 167837 (SEC ID Nº: 21), ISIS 304789 (SEC ID Nº: 75), ISIS 304799 (SEC ID Nº: 85) e
10 ISIS 304800 (SEC ID Nº: 86) fueron 50, 150 y 300 nM. Los compuestos se analizaron para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III en células HepG2 mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de dos experimentos y se muestran en la tabla 5.
Tabla 5 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III humana mediante oligonucleótidos de 15 fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
Dosis de oligonucleótidos
ISIS Nº
SEC ID N.º 50 nm 150 nM 300 nM
Porcentajeinhibición
de
167842
214 88 77 92
167844
215 86 86 84
167846
22 79 80 79
167837
21 83 86 84
304789
75 81 91 92
304799
85 82 93 88
304800
86 80 86 91
Estos datos demuestran que la expresión de apolipoproteína C-III está inhibida de un modo dependiente de la dosis después del tratamiento de células con compuestos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III. Estos compuestos se
analizaron adicionalmente en células Hep3B para determinar su capacidad para reducir los niveles de ARNm en células Hep3B y se determinó que ISIS 167842 y 167837 inhibieron la expresión de apolipoproteína C-III de un modo dependiente de la dosis en esta línea celular también.
Ejemplo 19: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de ratón mediante 5 oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi. Estudio de respuesta a la dosis en hepatocitos de ratón primarios
Un subconjunto de los oligonucleótidos antisentido del ejemplo 16 se analizó adicionalmente en un estudio de respuesta a la dosis. Las dosis de tratamiento con ISIS 167861 (SEC ID Nº: 100), ISIS 167870 (SEC ID Nº: 108), ISIS 167879 (SEC ID Nº: 116) e ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117) fueron 40, 120 y 240 nM. Los compuestos se analizaron para
10 determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III en células de hepatocitos primarios mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Los datos son datos promedio de dos experimentos y se muestran en la tabla 6.
Tabla 6 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi – estudio de respuesta a la dosis
Dosis de oligonucleótidos
ISIS Nº
SEC ID N.º 40 nM 120 nM 240 nM
Porcentaje de inhibición
167861
100 48 49 61
167870
108 16 16 46
167879
116 25 54 81
167880
117 76 81 93
Estos datos demuestran que la expresión de aplipoproteína C-III de ratón puede inhibirse de un modo dependiente de la dosis mediante tratamiento con compuestos antisentido.
Ejemplo 20: Análisis de inmunotransferencia (Northern) de niveles proteicos de lipoproteína C-III
Los análisis de inmunotransferencia (Western) se realizaron usando procedimientos estándar. Las células se
20 recogieron 16-20 h después del tratamiento con oligonucleótido y se lavaron una vez con PBS, suspendido en tampón Laemmli (100 µl/pocillo), se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel SDS-PAGE al 16 %. El gel se somete a 150 V durante 1,5 horas y se transfiere a membranas para el análisis de inmunotransferencia (Western). Se usa un anticuerpo primario apropiado dirigido a la apolipoproteína C-III, con un anticuerpo secundario radioetiquetado o etiquetado fluorescentemente dirigido contra las especies de anticuerpo primario. Las bandas se visualizaron usando un
25 instrumento PHOSPHORIMAGER™ (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA, Estados Unidos).
Ejemplo 21: Efectos de inhibición antisentido de apolipoproteína C-III (ISIS 167880) en niveles de colesterol y triglicéridos en suero
Se usaron ratones C57BL/6, una cepa de la que se ha informado que es susceptible a la formación inducida por hiperlipidemia de placas ateroescleróticas, en los estudios siguientes para evaluar oligonucleótidos antisentido de
30 apolipoproteína C-III como agentes potenciales para reducir los niveles de colesterol y triglicéridos.
Se evaluaron ratones C57BL/6 machos (n=8) que recibieron una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasa) en el transcurso de 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117) sobre los niveles de colesterol y triglicéridos en suero. Los animales control recibieron tratamiento salino. Se dosificó intraperitonealmente a los ratones cada tres días (dos veces a la semana), después de ayunar durante la noche, 50 mg/kg de ISIS 167880 o
35 solución salina durante seis semanas.
Se tuvo en ayuno durante la noche a ratones C57BL/6 macho alimentados con una dieta de roedor normal y después se dosificó intraperitonealmente cada tres días solución salina (control), 50 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117) o 50 mg/kg de ISIS 167879 (SEC ID Nº: 116) durante dos semanas.
A la conclusión del estudio, cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y
40 se evaluaron los niveles en suero de colesterol y triglicéridos y se compararon con el control salino. Las mediciones de los niveles de colesterol y triglicéridos en suero se obtuvieron mediante un análisis clínico rutinario.
Los ratones alimentados con dieta rica en grasas con ISIS 167880 mostraron una reducción tanto en colesterol (196 mg/dl para animales control y 137 mg/dl para ISIS 167880) como en triglicéridos (151 mg/dl para animales control y 58 mg/dl para ISIS 167880) en suero al finalizar el estudio.
No se observó ningún efecto en los niveles de colesterol en suero para ratones magros tratados con ISIS 167880 (91 mg/dl para animales control y 91 mg/dl para ISIS 167880), no obstante, los triglicéridos se redujeron (91 mg/dl para 5 animales control y 59 mg/dl para ISIS 167880) al finalizar el estudio.
Los ratones magros tratados con ISIS 167879 mostraron un aumento en el colesterol (91 mg/dl para animales control y 116 mg/dl para ISIS 167879) pero una reducción de triglicéridos (91 mg/dl para animales control y 65 mg/dl para ISIS 167879) en suero al finalizar el estudio.
Estos resultados indican que en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, ISIS 167880 reduce el colesterol y
10 los triglicéridos a niveles que son comparables a miembros de la misma camada magros mientras que no tiene efectos perjudiciales sobre los animales magros. (Véase la tabla 7 para un resumen de los datos in vivo.)
Ejemplo 22: Efectos de inhibición antisentido de apolipoproteína C-III (ISIS 167880) en niveles de AST y ALT en suero
Se usaron ratones C57BL/6 en los estudio siguientes para evaluar la toxicidad en hígado de oligonucleótidos 15 antisentido de apolipoproteína C-III.
Se evaluaron ratones C57BL/6 machos (n=8) recibieron una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasa) en el transcurso de 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117) sobre los niveles de enzimas hepáticas (AST y ALT). Los animales control recibieron tratamiento salino. Se dosificó intraperitonealmente a los ratones cada tres días (dos veces a la semana), después de ayunar durante la noche, 50 mg/kg de ISIS 167880 o
20 solución salina durante seis semanas.
Se tuvo en ayuno durante la noche a ratones C57BL/6 macho alimentados con una dieta de roedor normal y después se les dosificó intraperitonealmente cada tres días solución salina (control), 50 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117) o 50 mg/kg de ISIS 167879 (SEC ID Nº: 116) durante dos semanas.
Al concluir el estudio y cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se
25 evaluaron los niveles de AST y ALT en suero, que se midieron usando procedimientos clínicos rutinarios. El aumento en los niveles de las enzimas hepáticas ALT y AST puede indicar toxicidad y daño en el hígado.
Los ratones alimentados con la dieta rica en grasas tratados con ISIS 167880 mostraron un aumento en los niveles de AST durante la duración del estudio, en comparación con los controles salinos, (157 UI/l para ISIS 167880, en comparación con 92 UI/l para el control salino).
30 Los niveles de ALT en ratones alimentados con la dieta rica en grasas aumentaron con el tratamiento con ISIS 167880 durante la duración del estudio, en comparación con los controles salinos, (64 UI/l para ISIS 167880, en comparación con 40 UI/l para el control salino).
Los ratones magros tratados con ISIS 167880 no mostraron un aumento significativo ni en los niveles de AST ni en los de ALT durante la duración del estudio, en comparación con los controles salinos (niveles de AST de 51 UI/l para
35 control en comparación con 58 UI/l para ISIS 167880; niveles de ALT de 26 UI/l para control en comparación con 27 UI/l para ISIS 167880).
Los ratones magros tratados con ISIS 167879 no mostraron ningún cambio en los niveles de AST y mostraron un aumento en los niveles de ALT durante la duración del estudio, en comparación con los controles salinos (niveles de AST de 51 UI/l para control en comparación con 51 UI/l para ISIS 167879; niveles de ALT de 26 UI/l para control en
40 comparación con 21 UI/l para ISIS 167879).
Estos resultados sugieren un efecto de toxicidad en hígado secundario para ISIS 167880 en ratones alimentados con una dieta rica en grasas pero ninguna toxicidad para ISIS 167880 o 167879 en ratones alimentados con una dieta de roedor normal. (Véase la tabla 7 para un resumen de los datos in vivo.)
Ejemplo 23: Efectos de inhibición antisentido de apolipoproteína C-III (ISIS 167880) en niveles de glucosa en 45 suero
Se evaluaron ratones C57BL/6 machos (n=8) que recibieron una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasa) en el transcurso de 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117) sobre los niveles de glucosa en suero. Los animales control recibieron tratamiento salino. Se dosificó intraperitonealmente a los ratones cada tres días (dos veces a la semana), después de ayunar durante la noche, 50 mg/kg de ISIS 167880 o solución salina
50 durante seis semanas.
Se tuvo en ayuno durante la noche a ratones C57BL/6 macho alimentados con una dieta de roedor normal y después se dosificó intraperitonealmente cada tres días solución salina (control), 50 mg/kg de ISIS 167880 (SEc ID Nº: 117) o 50 mg/kg de ISIS 167879 (SEC ID Nº: 116) durante dos semanas.
Al concluir el estudio y cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de glucosa en suero, que se midieron mediante procedimientos clínicos rutinarios.
En los ratones alimentados con la dieta rica en grasas, ISIS 167880 redujo los niveles de glucosa en suero a 183 mg/dl, en comparación con el control salino de 213 mg/dl. En ratones magros, ISIS 167880 no tuvo ningún efecto
5 significativo sobre los niveles de glucosa en suero con mediciones de 203 mg/dl, en comparación con el control salino con 204 mg/dl; mientras que ISIS 167879 sólo aumentó ligeramente los niveles de glucosa en suero a 216 mg/dl.
Estos resultados indican que en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, ISIS 167880 es capaz de reducir la glucosa en suero a niveles comparables a miembros de la misma camada magros, mientras que no tiene efectos
10 perjudiciales sobre los animales magros. (Véase la tabla 7 para un resumen de los datos in vivo.)
Ejemplo 24: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III (ISIS 167880) sobre niveles de ARNm de apolipoproteína C-III en ratones C57BL/6
Se tuvo en ayuno durante la noche a ratones C57BL/6 macho alimentados con una dieta rica en grasas y después se les dosificó intraperitonealmente cada tres días solución salina o 50 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117)
15 durante seis semanas.
Se tuvo en ayuno durante la noche a ratones C57BL/6 macho alimentados con una dieta de roedor normal y después se les dosificó intraperitonealmente cada tres días solución salina (control) o 50 mg/kg de ISIS 167880 (SEc ID Nº: 117) o 50 mg/kg de ISIS 167879 (SEC ID Nº: 116) durante dos semanas.
Al terminar el estudio, cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se
20 evaluaron los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III en el hígado. Los ratones alimentados con la dieta rica en grasas a los que se dosificó ISIS 167880 tenían niveles de ARNm de apolipoproteína C-III del 8 % de la los ratones tratados con solución salina. Los ratones magros mostraron disminución del ARNm de apolipoproteína C-III después del tratamiento con bien ISIS 167880 o bien ISIS 167879. Los ratones magros a los que se dosificó ISIS 167880 tenían niveles de ARNm de apolipoproteína C-III del 21 % de la los ratones tratados con solución salina y los tratados
25 con ISIS 167879 tenían niveles de ARNm de apolipoproteína C-III del 27 % de la los ratones tratados con solución salina.
Estos resultados indican que tanto en ratones alimentados con una dieta rica en grasas como en ratones magros, los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra apolipoproteína C-III son capaces de disminuir los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo en una medida similar. (Véase la tabla 7 para un resumen de los datos in vivo.)
30 Tabla 7 - Efectos del tratamiento con ISIS 167880 o 167879 sobre el colesterol, los triglicéridos, la glucosa, la enzima hepática y el ARNm de apolipoproteína C-III en hígado en ratones C57BL/6 magros y alimentados con una dieta rica en grasas
.
Unidades medidas del marcador biológico
ISIS Nº Dieta, duración del experimento
Rica en grasas, 6 semanas
Magra, 2 semanas
Colesterol mg/dl
control 196 91
167880
137 91
167879
N.D. 116
Triglicéridos mg/dl
control 151 91
167880
58 59
167879
N.D. 65
Glucosa mg/dl
control 213 204
167880
183 203
167879
N.D. 216
Enzimas hepáticas
AST UI/l control 92 51
167880
157 58
167879
N.D. 51
E04749914 02-12-2011
(continuación)
Unidades medidas del marcador
ISIS Nº Dieta, duración del experimento
ALT UI/l
control 40 26
167880
64 27
167879
N.D. 21
ARNm de polipoproteína C-III % de control
167880 8 % 21 %
167879
N.D. 27 %
En resumen, estos resultados indican que en ratones alimentados con una dieta rica en grasas, ISIS 167880 es capaz de reducir la glucosa, el colesterol y los triglicéridos en suero a niveles comparables a miembros de la misma camada magros, mientras que no tiene efectos perjudiciales sobre los animales magros. Además, los oligonucleótidos antisentido
5 dirigidos contra apolipoproteína C-III son capaces de disminuir los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo en una medida similar en ratones alimentados con una dieta rica en grasas y ratones magros. Estos resultados sugieren un efecto de toxicidad en hígado secundario para ISIS 167880 en ratones alimentados con una dieta rica en grasas pero ninguna toxicidad para ISIS 167880 o 167879 en ratones alimentados con una dieta de roedor normal.
Ejemplo 25: Inhibición antisentido de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo
10 Se usaron ratones C57BL/6, una cepa de la que se ha informado que es susceptible a la formación inducida por hiperlipidemia de placas ateroescleróticas, en los estudios siguientes para evaluar oligonucleótidos antisentido de apolipoproteína C-III como agentes potenciales para reducir los niveles de colesterol y triglicéridos. En consecuencia, en una realización adicional, los ratonesC57BL/6 con una dieta rica en grasas se trataron con oligonucleótidos dirigidos a apolipoproteína C-III.
15 Se analizaron ratones C57BL/6 machos (n=8; 7 a 8 semanas que edad) que recibieron una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas) para evaluar la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hígado 6 semanas después del trtamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III. Los ratones recibieron dos veces a la semana inyecciones intraperitoneales a una dosis de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117), ISIS 167875 (SEC ID Nº: 113), ISIS 167878 (SEC ID Nº: 115) o ISIS 167879 (SEC ID Nº: 116). Los animales control recibieron tratamiento
20 de solución salina dos veces a la semana durante un periodo de 6 semanas.
Al terminar el estudio, cuarenta y ocho horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron para determinar la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en el hígado. El ARN se aisló del hígado y el ARNm se cuantificó tal como se describe en el presente documento. Se hizo la media de los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de cada grupo de tratamiento (n=8). Con relación a los animales tratados con solución salina, el
25 tratamiento con ISIS 167875, ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880 dieron como resultado una reducción del 24 %, 56 %, 50 % y 77 % de los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III, respectivamente, lo que demuestra que estos compuestos reducen significativamente la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en el hígado.
Ejemplo 26: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en colesterol, triglicéridos, glucosa en suero y transaminasas en suero
30 En una realización posterior, los ratones tratados con solución salina o una dosis de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117), ISIS 167875 (SEC ID Nº: 113), ISIS 167878 (SEC ID Nº: 115) o ISIS 167879 (SEC ID Nº: 116) tal como se describe en el ejemplo 25 se analizaron para determinar los niveles de colesterol y triglicéridos en suero después de 6 semanas de tratamiento.
Al finalizar el estudio, cuarenta y ocho horas después de la dosis de solución salina o compuestos antisentido, los
35 animales se sacrificaron y se analizaron para determinar los niveles de colesterol, triglicéridos y glucosa en suero mediante análisis rutinarios usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). Las transaminasas ALT y AST en suero, aumentos en los que pueden indicar hepatotoxicidad, también se midieron usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). Los niveles de colesterol, triglecéridos y glucosa en suero se presentan en la tabla 8 como resultado promedio de cada grupo de
40 tratamiento (n=8) en mg/dl. ALT y AST, que también se muestran en la tabla 8, también se muestran como resultado promedio para cada grupo de tratamiento (n=8), en unidades internaciones/l (UI/l).
Tabla 8 - Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en colesterol, triglicéridos, glucosa y transaminasas en suero
Tratamiento
Marcador en suero
Solución Salina ISIS 167875 ISIS 167878 ISIS 167879 ISIS 167880
Colesterol total mg/dl
172 197 180 132 155
Colesterol HDL mg/dl
149 162 157 117 137
Colesterol LDL mg/dl
25 37 28 24 21
Triglicéridos en suero mg/dl
126 99 75 60 52
ALT UI/l
24 555 32 45 66
AST UI/l
56 489 76 117 132
Glucosa mg/dl
273 234 251 189 255
Se observó una reducción significativa de los niveles de triglicéridos en suero después del tratamiento con ISIS
5 167875, ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880, que redujeron los niveles de triglicéridos el 22 %, 40 %, 52 % y 58 %, respectivamente. Esta reducción de triglicéridos en suero se correlaciona con la reducción de la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hígado. Además, las reducciones de triglicéridos en diana y en suero siguiendo al tratamiento con ISIS 167878, ISIS 167879 e ISIS 167880 no fueron acompañadas por hepatotoxicidad, tal como indica la falta de aumentos significativos en los niveles de ALT y AST. Los niveles de glucosa se redujeron
10 significativamente siguiendo el tratamiento con ISIS 167879.
Ejemplo 27: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en el peso corporal y en el peso de los órganos
Los ratones tratados con solución salina o una dosis de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117), ISIS 167875 (SEC ID Nº: 113), ISIS 167878 (SEC ID Nº: 115) o ISIS 167879 (SEC ID Nº: 116) tal como se describe en el ejemplo 25
15 se analizaron para determinar cambios en el peso corporal y en el peso de almohadilla grasa, hígado y bazo. En la conclusión del estudio, cuarenta y ocho horas después de la dosis final de solución salina o de compuesto antisentido, los animales se sacrificaron y se midieron los pesos corporales y de los órganos. Los datos mostrados en la tabla 9 representan pesos promedio de todos los animales de cada grupo de tratamiento (n=8). El peso corporal se presenta en gramos (g), mientras que los pesos de bazo, hígado y almohadilla grasa se presentan en miligramos (mg).
20 Tabla 9 - Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en el peso corporal y de los órganos
Tratamiento
Solución salina
ISIS 167875 ISIS 167878 ISIS 167879 ISIS 167880
Peso corporal (g)
33 30 32 28 30
Peso del hígado (mg)
126 190 141 133 146
Peso de la almohadilla grasa (mg)
182 125 125 61 62
Peso del bazo (mg)
8 12 12 12 14
de ratón dio como resultado reducciones significativos en el peso de la almohadilla grasa. ISIS 167875 e ISIS 167878 produjeron ambos una reducción del 31 % en el peso de la almohadilla grasa, mientras que ISIS 167879 e ISIS 167880 produjeron ambos una reducción del 66 % en el peso de la almohadilla grasa. Los pesos corporales no cambiaron significativamente y el peso de los bazos aumentaron ligeramente siguiendo el tratamiento del compuestos antisentido.
5 Con la excepción de los hígados de los animales tratados con ISIS 167875, los pesos de los hígados no cambiaron significativamente.
Ejemplo 28: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en niveles de triglicéridos en hígado
La esteatosis hepática se refiere a la acumulación de lípidos en el hígado, o “hígado graso”, que está causada frecuentemente por el consumo de alcohol, diabetes e hiperlipidemia y puede progresar hasta el estado final del daño
10 hepático. Dadas las consecuencias perjudiciales de un trastorno de hígado graso, es necesario identificar compuestos que previenen o mejoran la esteatosis hepática. La esteatosis hepática se evaluar tanto mediante mediciones del contenido de triglicéridos en tejidos como mediante el examen de tejidos hepáticos.
El contenido de triglicéridos en el tejido hepático se evaluó en los animales tratados con solución salina o una dosis de 25 mg/kg de ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117), ISIS 167875 (SEC ID Nº: 113), ISIS 167878 (SEC ID Nº: 115) o ISIS 15 167879 (SEC ID Nº: 116) tal como se describe en el ejemplo 25. El contenido de triglicéridos en el tejido hepático se midió usando el ensayo para triglicéridos GPO (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, Estados Unidos). Los análisis histológicos se realizaron usando procedimientos rutinarios, mediante los que se fijó el tejido hepático en formalina tamponada a pH nuetro, embebida en parafina, se seccionaron y subsiguientemente se tintaron con hematoxilina y eosina, para visualizar núcleos y citoplasma, respectivamente. Alternativamente, el tejido hepático se procuró después
20 de estar recién congelado, seccionado y subsiguientemente tintado con colorante Oil red O para visualizar los depósitos de lípidos y se contratintó con eosina para marcar el citoplasma . Las muestras preparadas se evaluaron mediante microscopía de luz.
Con relación a los ratones tratados con solución salina, los niveles de triglicéridos en tejido hepático se redujeron significativamente en un 25 %, 35 %, 40 % y 64 % siguiendo el tratamiento con ISIS 167875, ISIS 167878, ISIS 25 167879 e ISIS 167880, respectivamente. Los análisis histológicos de secciones de hígado tintadas revelaron de forma similar una reducción de triglicéridos en el tejido hepático. De este modo, tal como se demuestra mediante mediciones de triglicéridos en tejido y análisis histológicos de secciones de tejido hepático, el tratamiento con compuestos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III redujeron el contenido de triglicéridos. Como tales, los compuestos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III son agentes terapéuticos candidatos para la prevención o mejora de
30 esteatosis hepática.
Ejemplo 29: Inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en hepatocitos primario de macacos cangrejeros
Los compuestos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III se analizaron para evaluar sus efectos sobre la expresión de apolipoproteína C-III en hepatocitos de macaco cangrejero primarios. Los hepatocitos de macaco cangrejero primarios preplaqueados se adquirieron de InVitro Technologies (Baltimore, MD, Estados Unidos). Las
35 células se cultivaron en DMEM de alta glucosa (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 100 unidades/ml y 100 µg/ml de estreptomicina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos).
Las células, a una densidad de 80.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos se trataron con 10, 50, 150 y 300 nM de ISIS 304789 (SEQ ID Nº: 75), ISIS 304799 (SEC ID Nº: 85) o ISIS 304800 (SEC ID Nº: 86). ISIS 113529 40 (CTCTTACT-GTGCTGTGGACA, SEC ID Nº: 222) sirvió como oligonucleótido control. ISIS 113529 es un oligonucleótido quimérico ("gapmer") de 20 nucleótidos de longitud, compuesto por una región “hueco” que consta de diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueada a ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE)nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de
45 citidina son 5-metilcitidinas.
Después de 24 horas de tratamiento como oligonucleótidos antisentido, se midió el ARNm de apolipoproteína C-III por PCR en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos del presente documento, usando los cebadores y la sonda diseñados para la secuencia de apolipoproteína C-III humana (SEC ID Nº 5, 6 y 7) para medir el ARNm de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero. Se usaron cebadores y sonda diseñados para GAPDH humana (SEC ID 50 Nº 8, 9 y 10) para medir la expresión de ARNm de GAPDH de macaco cangrejero, con el fin de normalizar las cantidades de diana génica obtenidas por PCR en tiempo real. Las células no tratadas sirvieron como control con respecto al cual se normalizaron los datos. Los datos son la media de tres experimentos y se presentan en la tabla
10.
Tabla 10 -inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en hepatocitos primarios de macacos cangrejeros
Dosis de oligonucleótidos
ISIS Nº
SEC ID N.º 10 nM 50 nM 150 nM 300 nM
% de inhibición
304789
75 0 7 1 55
304799
85 34 60 66 48
304800
86 9 53 59 57
113529
222 N.D. N.D. 0 0

Ejemplo 30: Secuencia de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero
Se secuenció una porción del gen de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero. Las posiciones 8 a 476 de la
5 secuencia de ARNm de apolipoproteína C-III (que se incorpora en su totalidad al presente documento como SEC ID Nº: 18) contiene el segmento diana al que se hibrida ISIS 304789. Se secuenció la región correspondiente de ARNm de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero. El ARN se aisló y purificó a partir de hepatocitos de macaco cangrejero (InVitro Technologies, Gaith-ersburg, MD, Estados Unidos) y se sometió a una reacción de transcriptasa inversa (kit de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ADNc resultante fue el sustrato para 40 ciclos de
10 amplificación por PCR, usando cebadores 5’ y 3’ diseñados para las posiciones 8 y 476, respectivamente, del ARNm de apolipoproteína C-III humana (Amplitaq PCR kit, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Siguiendo a la purificación en gel del fragmento de 468 pb resultante, las reacciones de secuenciación directa e inversa de cada producto se realizaron por Retrogen (San Diego, CA, Estados Unidos). La secuencia de macaco cangrejero se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 223 y es en el 92 % idéntica a las posiciones 8 a
15 476 del ARNm de apolipoproteína C-III humana.
Ejemplo 31: Oligonucleótidos de fosforoditioacto quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi, dirigidos a apolipoproteína C-III de macaco cangrejero
Se usó la secuencia de apolipoproteína C-III de macaco cangrejero, incorporada al presente documento como SEC ID Nº: 223, para diseñar un oligonucleótido antisentido que tiene el 100 % de complementariedad con el ARNm de 20 apolipoproteína C-III de macaco cangrejero. ISIS 340340 (GGCAGCCCTGGAGGCTGCAG; incorporada el presente docuemento como SEC ID Nº: 224) está dirigida al nucleótido 397 de SEC ID Nº: 223, dentro de una región que corresponde a la 3’ UTR de la apolipoproteína C-III humana con la que se hibrida ISIS 304789. ISIS 340340 es un oligonucleótido quimérico ("gapmer") de 20 nucleótidos de longitud, compuesto por una región “hueco” central que consta de diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueada a ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco
25 nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’metoxietil (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.
Ejemplo 32: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de rata mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
Con el fin de diseñar oligonucleótidos antisentido para las regiones codificantes y no traducidas de ARNm de
30 apolipoproteína C-III de rata, se secuenció un segmento de ARNm de apolipoproteína C-III de rata para proporcionar la secuencia 3’ UTR, ya que la secuencia de ARNm de apolipoproteína C-III de rata publicada está restringida a la región codificante. El ARN se aisló y purificó a partir de hepatocitos de rata (InVitro Technologies, Gaith-ersburg, MD, Estados Unidos) y se sometió a una reacción de transcriptasa inversa (kit de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ADN resultante fue el sustrato para 40 ciclos de amplificación por PCR (Amplitaq PCR kit,
35 Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), usando cebadores directos e inversos para alinearse a los extremos 5’ y 3’, respectivamente, de ARNm de apolipoproteína C-III de ratón. Siguiendo a la purificación en gel del fragmento de 427 pb resultante, las reacciones de secuenciación directa e inversa de cada producto se realizaron por Retrogen (San Diego, CA, Estados Unidos). La secuencia de rata se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 225 e incluye 121 pb adicionales en la dirección 3’ desde el codón de detención de la aplipoproteína
40 C-III con respecto a la secuencia publicada (número de acceso al GenBank NM_012501.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 226).
Se diseñó una serie de compuestos antisentido para diferentes regiones diana del ARNm de aplipoproteína C-III de rata usando la secuencia SEC ID Nº: 225. Los compuestos se muestran en la tabla 11. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de 45 la tabla 11 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” central que consta de diez 2’-desoxinucleótidos, que están flanqueados por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también
conocidos como (2’-MOE)nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.
Los compuestos se analizan para determinar su efecto sobre niveles de ARNm de apoliproteína C-III mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos del presente documento. Las sondas y los
5 cebadores de apolipoproteína C-III de ratón se diseñaron para que se hibridaran con una secuencia de apolipoproteína C-III de rata usando información de secuencias publicada (número de acceso del GenBank NM_012501.1, que se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 226). Para la apolipoproteína C-III de rata los cebadores de PCR fueron:
cebador directo: GAGGGAGAGGGATCCTTGCT (SEC ID Nº: 227)
10 cebador inverso: GGACCGTCTTGGAGGCTTG (SEC ID Nº: 228)
y la sonda PCR fue: FAM-CTGGGCTCTATGCAGGGCTACATGGA-TAMRA, SEC ID Nº: 229) en la que FAM es el colorante fluorescente y TAMRA es el colorante inactivador. Para GAPDH de rata los cebadores PCR fueron:
cebador directo: TGTTCTAGAGACAGCCGCATCTT (SEC ID Nº: 230)
cebador inverso: CACCGACCTTCACCATCTTGT (SEC ID Nº: 231)
15 y la sonda PCR fue JOE-TTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA-TAMRA (SEC ID Nº: 232) en la que JOE es el colorante fluorescente informador y TAMRA es el colorante inactivador.
Los datos son de un experimento en el que se trataron hepatocitos de rata primarios con una concentración 150 nM de oligonucleótidos antisentido. Los resultados, que se muestran en la tabla 11, se expresan como porcentaje de inhibición con respecto a células control no tratadas. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
20 Tabla 11 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de rata mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
340982
Codificante 225 213 TGAACTTATCAGTGAACTTG 0 233
340987
Codificante 225 238 TCAGGGCCAGACTCCCAGAG 7 234
340988
Codificante 225 258 TTGGTGTTGTTAGTTGGTCC 0 235
340991
Codificante 225 258 TTGGTGTTGTTAGTTGGTCC 0 236
353932
Codificante 225 10 AGAGCCACGAGGGCCACGA T 0 237
353933
Codificante 225 20 AGAGGCCAGGAGAGCCACG A 15 238
353934
Codificante 225 30 CAGCTCGGGCAGAGGCCAG G 2 239
353935
Codificante 225 40 TCTCCCTCATCAGCTCGGGC 0 240
353936
Codificante 225 59 GCCCAGCAGCAAGGATCCCT 73 241
353937
Codificante 225 69 CCTGCATAGAGCCCAGCAGC 0 242
353938
Codificante 225 79 TCCATGTAGCCCTGCATAGA 90 243
353940
Codificante 225 99 GGACCGTCTTGGAGGCTTGT 76 244
353941
Codificante 225 109 AGTGCATCCTGGACCGTCTT 61 245
353942
Codificante 225 119 CATGCTGCTTAGTGCATCCT 0 246
353943
Codificante 225 129 CAGACTCCTGCATGCTGCTT 57 247
353944
Codificante 225 139 ACAGCTATATCAGACTCCTG 0 248
353945
Codificante 225 148 CTGGCCACCACAGCTATATC 0 249
E04749914 02-12-2011
(continuación) E04749914 02-12-2011
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
353946
Codificante 225 169 AAGCGATTGTCCATCCAGCC 0 250
353949
Codificante 225 195 TGCTCCAGTAGCCTTTCAGG 0 251
353950
Codificante 225 200 GAACTTGCTCCAGTAGCCTT 35 252
353951
Codificante 225 204 CAGTGAACTTGCTCCAGTAG 0 253
353952
Codificante 225 209 CTTATCAGTGAACTTGCTCC 0 254
353953
Codificante 225 217 CCAGTGAACTTATCAGTGAA 0 255
353954
Codificante 225 221 GAGGCCAGTGAACTTATCAG 0 256
353955
Codificante 225 224 CCAGAGGCCAGTGAACTTAT 31 257
353956
Codificante 225 229 GACTCCCAGAGGCCAGTGAA 0 258
353957
Codificante 225 234 GGCCAGACTCCCAGAGGCC A 0 259
353958
Codificante 225 247 AGTTGGTCCTCAGGGCCAGA 0 260
353959
Codificante 225 250 GTTAGTTGGTCCTCAGGGCC 0 261
353960
Codificante 225 254 TGTTGTTAGTTGGTCCTCAG 0 262
353961
Codificante 225 262 AGAGTTGGTGTTGTTAGTTG 0 263
353962
Codificante 225 267 GCTCAAGAGTTGGTGTTGTT 0 264
353963
Codificante 225 271 CACGGCTCAAGAGTTGGTGT 0 265
353964
Codón de detención 225 275 GTCTCACGGCTCAAGAGTTG 0 266
353966
Codón de detención 225 285 GAACATGGAGGTCTCACGGC 55 267
353967
Codón de detención 225 289 TCTGGAACATGGAGGTCTCA 0 268
353968
3’UTR 225 293 CACATCTGGAACATGGAGGT 0 269
353969
3’UTR 225 297 CAGACACATCTGGAACATGG 0 270
353970
3’UTR 225 301 TGGCCAGACACATCTGGAAC 49 271
353972
3’UTR 225 309 AGGATAGATGGCCAGACACA 47 272
353973
3’UTR 225 313 CAGCAGGATAGATGGCCAGA 0 273
353974
3’UTR 225 317 GAGGCAGCAGGATAGATGG C 38 274
353975
3’UTR 225 321 TTCGGAGGCAGCAGGATAGA 0 275
353976
3’UTR 225 325 AACCTTCGGAGGCAGCAGGA 19 276
353977
3’UTR 225 329 GAGCAACCTTCGGAGGCAGC 88 277
353978
3’ UTR 225 333 CTTAGAGCAACCTTCGGAGG 77 278
353979
3’UTR 225 337 TCCCCTTAGAGCAACCTTCG 0 279
353980
3’UTR 225 341 ACTTTCCCCTTAGAGCAACC 45 280
353981
3’UTR 225 345 ATATACTTTCCCCTTAGAGC 28 281
353982
3’UTR 225 349 GAGAATATACTTTCCCCTTA 96 282
353983
3’UTR 225 353 GCATGAGAATATACTTTCCC 69 283
(continuación)
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
353984
3’UTR 225 357 AAAGGCATGAGAATATACTT 47 284
353985
3’UTR 225 361 GGATAAAGGCATGAGAATAT 0 285
353986
3’UTR 225 365 GGAGGGATAAAGGCATGAGA 0 286
353987
3’UTR 225 386 GCATGTTTAGGTGAGGTCTG 100 287
353988
3’UTR 225 390 GACAGCATGTTTAGGTGAGG 0 288
353990
3’UTR 225 398 TTATTTGGGACAGCATGTTT 0 289
353991
3’UTR 225 402 GCTTTTATTTGGGACAGCAT 0 290
353992
3’UTR 225 407 TCCCAGCTTTTATTTGGGAC 22 291
Se diseñó una serie adicional de compuestos antisentido para diferentes regiones diana del ARNm de aplipoproteína C-III de rata usando secuencias descritas en el presente documento (SEC ID Nº: 225 y la secuencia con el número de acceso del Genbank NM_ 012501.1, incorporada al presente documento como SEC ID Nº: 226). Los compuestos 5 se muestran en la tabla 12. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 12 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos
10 (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.

Tabla 12 - Oligonucleótidos de fosforoditioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi, dirigidos a apolipoproteína C-III de rata
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.º
340937
Codificante 226 8 CACGATGAGGAGCATTCGGG 292
340938
Codificante 226 13 AGGGCCACGATGAGGAGCAT 293
340939
Codificante 225 6 CCACGAGGGCCACGATGAGG 294
340940
Codificante 225 11 GAGAGCCACGAGGGCCACGA 295
340941
Codificante 225 16 GCCAGGAGAGCCACGAGGGC 296
340942
Codificante 225 21 CAGAGGCCAGGAGAGCCACG 297
340943
Codificante 225 26 TCGGGCAGAGGCCAGGAGAG 298
340944
Codificante 225 31 TCAGCTCGGGCAGAGGCCAG 299
340945
Codificante 225 36 CCTCATCAGCTCGGGCAGAG 300
340946
Codificante 225 41 CTCTCCCTCATCAGCTCGGG 301
340947
Codificante 225 46 GATCCCTCTCCCTCATCAGC 302
340948
Codificante 225 51 GCAAGGATCCCTCTCCCTCA 303
340949
Codificante 225 56 CAGCAGCAAGGATCCCTCTC 304
340950
Codificante 225 61 GAGCCCAGCAGCAAGGATCC 305
340951
Codificante 225 66 GCATAGAGCCCAGCAGCAAG 306
340952
Codificante 225 71 GCCCTGCATAGAGCCCAGCA 307
340953
Codificante 225 76 ATGTAGCCCTGCATAGAGCC 308
340954
Codificante 225 81 GTTCCATGTAGCCCTGCATA 309
E04749914 02-12-2011
(continuación) E04749914 02-12-2011
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.º
340955
Codificante 225 86 GGCTTGTTCCATGTAGCCCT 310
340956
Codificante 225 91 TTGGAGGCTTGTTCCATGTA 311
340957
Codificante 225 96 CCGTCTTGGAGGCTTGTTCC 312
340958
Codificante 225 101 CTGGACCGTCTTGGAGGCTT 313
340959
Codificante 225 106 GCATCCTGGACCGTCTTGGA 314
340960
Codificante 225 111 TTAGTGCATCCTGGACCGTC 315
340961
Codificante 225 116 GCTGCTTAGTGCATCCTGGA 316
340962
Codificante 225 121 TGCATGCTGCTTAGTGCATC 317
340963
Codificante 225 126 ACTCCTGCATGCTGCTTAGT 318
340964
Codificante 225 131 ATCAGACTCCTGCATGCTGC 319
340965
Codificante 225 136 GCTATATCAGACTCCTGCAT 320
340966
Codificante 225 141 CCACAGCTATATCAGACTCC 321
340967
Codificante 225 146 GGCCACCACAGCTATATCAG 322
340968
Codificante 226 163 CTGCTGGCCACCACAGCTAT 323
340969
Codificante 226 168 AGCCCCTGCTGGCCACCACA 324
340970
Codificante 226 173 CATCCAGCCCCTGCTGGCCA 325
340971
Codificante 226 178 TTGTCCATCCAGCCCCTGCT 326
340972
Codificante 226 179 ATTGTCCATCCAGCCCCTGC 327
340973
Codificante 225 168 AGCGATTGTCCATCCAGCCC 328
340974
Codificante 225 173 TTTGAAGCGATTGTCCATCC 329
340975
Codificante 225 178 AGGGATTTGAAGCGATTGTC 330
340976
Codificante 225 183 CTTTCAGGGATTTGAAGCGA 331
340977
Codificante 225 188 GTAGCCTTTCAGGGATTTGA 332
340978
Codificante 225 193 CTCCAGTAGCCTTTCAGGGA 333
340979
Codificante 225 198 ACTTGCTCCAGTAGCCTTTC 334
34980
Codificante 225 203 AGTGAACTTGCTCCAGTAGC 335
340981
Codificante 225 208 TTATCAGTGAACTTGCTCCA 336
34983
Codificante 225 218 GCCAGTGAACTTATCAGTGA 337
340984
Codificante 225 223 CAGAGGCCAGTGAACTTATC 338
340985
Codificante 225 228 ACTCCCAGAGGCCAGTGAAC 339
340986
Codificante 225 233 GCCAGACTCCCAGAGGCCAG 340
340989
Codificante 225 248 TAGTTGGTCCTCAGGGCCAG 341
340990
Codificante 225 253 GTTGTTAGTTGGTCCTCAGG 342
340992
Codificante 225 263 AAGAGTTGGTGTTGTTAGTT 343
340993
Codificante 225 268 GGCTCAAGAGTTGGTGTTGT 344
340994
Codón detención de 225 272 TCACGGCTCAAGAGTTGGTG 345
353939
Codificante 225 89 GGAGGCTTGTTCCATGTAGC 346
(continuación)
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.º
353947
Codificante 225 180 TCAGGGATTTGAAGCGATTG 347
353948
Codificante 225 190 CAGTAGCCTTTCAGGGATTT 348
353965
Codón detención de 225 281 ATGGAGGTCTCACGGCTCAA 349
353971
3’ UTR 225 305 TAGATGGCCAGACACATCTG 350
353989
3’ UTR 225 394 TTGGGACAGCATGTTTAGGT 351

Ejemplo 33: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de rata mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi. Estudio de respuesta a la dosis en hepatocitos de rata primarios
5 Se seleccionaron cuatro oligonucleótidos para los estudios de respuesta a la dosis adicionales. Los hepatocitos de rata primarios se trataron con 10, 50, 150 y 300 nM de ISIS 167878 (SEC ID Nº: 115), ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117), ISIS 340982 (SEC ID Nº: 233), o el control oligo mezclado ISIS 113529 (SEC ID Nº: 222) y se midieron los niveles de ARNm 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos tal como se describe en otros ejemplos del presente documento. Las células no tratadas sirvieron como control con respecto al que se normalizaron los datos.
10 Los resultados de estos estudios se muestran en la tabla 13. Los datos se promediaron a partir de tres experimentos y se expresaron como porcentaje de inhibición con relación a los controles no tratados. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".

Tabla 13 – Inhibición antisentido de la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hepatocitos de rata primaria 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos
Dosis de oligonucleótidos
ISIS Nº
SEC ID N.º 10 nM 50 nM 150 nM 300 nM
% de inhibición
167878
115 0 0 0 4
167880
117 21 19 20 33
340982
233 15 70 83 91
113529
222 N.D. N.D. N.D. 9
Tal como se muestra en la tabla 13, ISIS 340982 fue eficaz en reducir los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de un modo dependiente de la dosis.
Ejemplo 34: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de rata mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi Estudio adicional de respuesta a la
20 dosis en hepatocitos de rata primarios
Se seleccionó un grupo adicional de oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III de rata para los estudios de respuesta a la dosis. Los hepatocitos de rata primarios se trataron con una concentración 10, 50, 150 y 300 nM de ISIS 353977 (SEC ID Nº: 277), ISIS 353978 (SEC ID Nº: 278), ISIS 353982 (SEC ID Nº: 282), ISIS 353983 (SEC ID Nº: 283) o ISIS 353987 (SEC ID Nº: 287) durante un periodo de 24 horas. Los niveles de expesión diana se
25 cuentificaron por PCR en tiempo real tal como se describe en el presente documento. Las células no tratadas sirvieron como control con respecto al que se normalizaron los datos. Los resultados, que se muestran en la tabla 14, son la media de tres experimentos y se presentan como porcentaje de inhibición de ARNm de apolipoproteína relativos a las células control no tratadas.

Tabla 14 – Inhibición dependiente de la dosis de la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hepatocitos de rata primarios 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos
Dosis de oligonucleótidos
ISIS Nº
SEC ID N.º 10 nM 50 nM 150 nM 300 nM
% de inhibición
353977
277 26 10 3 2
353978
278 46 23 8 5
353982
282 35 21 10 2
353983
283 46 23 12 2
353987
287 38 25 12 4
Estos datos muestran que ISIS 353977, ISIS 353978, ISIS 353982, ISIS 353983 e ISIS 353987 reducen eficazmente el 5 ARNm de apolipoproteína C-III de un modo dependiente de la dosis.
Ejemplo 35: Inhibición antisentido de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III in vivo
Se evaluaron los efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III en ratas. Se alimentaron ratas Sprague-Dawley macho de 6 semanas de edad (Charles River Labs, Wilmington, MA, Estados Unidos) con una dieta de roedor normal. Los animales recibieron inyecciones intraperitoneales de ISIS 340982 (SEC ID Nº: 233) dos veces a la
10 semana durante dos semanas. Un grupo de animales (n= 4) recibieron 75 mg/kg de ISIS 340982 y un grupo de animales (n= 4) recibieron 100 mg/kg de ISIS 340982. Los animales tratados con solución salina (n = 4) sirvieron como grupo control.
Al finalizar el periodo de tratamiento, los animales se sacrificaron y se aisló ARN del hígado. Se midió el ARNm de apolipoproteína C-III tal como se describe para otros ejemplos del presente documento. Los resultados para cada
15 grupo de tratamieto se promediaron y los niveles de ARNm en hígado de ratones tratados con ISIS 340982 se normalizaron con los niveles de ARNm en hígado de los ratones tratados con solución salina. El tratamiento com 75 mg/kg o 100 mg/kg de ISIS 340982 dieron como resultado una reducción del 69 % y una reducción del 84 % en hígado de ARNm de apolipoproteína C-III, respectivamente, lo que demuestra que ISIS 340982 inhibe eficazmente la expresión de ARNm diana in vivo.
20 Ejemplo 36: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de rata in vivo sobre pesos corporales, de hígado y de bazo
Las ratas tratadas con ISIS 340782 (SEC ID Nº: 233) tal como se describe en el ejemplo 35 se analizaron para determinar cambios en el peso corporal y en el peso del hígado y del bazo. Los pesos corporales se registraron al comienzo del estudio (semana 0). Siguiendo al tratamiento de dos semanas con inyecciones dos veces a la semana de
25 solución salino o ISIS 340782 a una concentración de 75 o 100 mg/kg, los animales se sacrificaron, cuarenta y ocho horas después de la inyección cuarta y última, los animales se sacrificaron. Se registraron los pesos corporales, de hígado y de bazo a la conclusión del estudio.

Tabla 15 – Pesos corporales, de hígado y de bazo de ratas tratadas con oligonucleótido antisentido dirigido a apolipoproteína C-III
Medida
Solución Salina Tratamiento con ISIS 340892
75 mg/kg
100 mg/kg
Semana 0
Semana 2 Semana 0 Semana 2 Semana 0 Semana 2
Peso corporal (g)
529 536 485 448 478 425
Peso del hígado (g)
N.D. 19 N.D. 14 N.D. 16
Peso del bazo (mg)
N.D. 1,1 N.D. 1,6 N.D. 1,6
Estos datos demuestran que la inhibición antisentido de de ARNm de apolipoproteína C-III no estaba asociada con cambios en el peso corporal, del hígado o del bazo.
Ejemplo 37: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de rata in vivo niveles de lípicos y glucosa en sangre
Se analizaron las ratas tratadas tal como se ha descrito en el ejemplo 35 para evaluar los cambios en el colesterol total, los triglicéridos, colesterol HDL, colesterol LDL, ácidos grasos libres y glucosa en sangre. Las muestras de sangre se
5 recogieron justo antes de los tratamientos (semana 0) y se siguió con el tratamiento de dos semanas con inyecciones dos veces a la semana de solución salina o ISIS 340982 (SEC ID Nº: 233) a una concentración de 75 o 100 mg/kg. Los niveles de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos, ácidos grasos libres y glucosa se midieron usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). Los datos de los cuatro animales de cada grupo de tratamiento se promediaron. Los resultados se muestran en la tabla 16.
10 Tabla 16 - Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de rata en lípidos y glucosa en sangre
Tratamiento
Marcador biológico medido
Solución salina 75 mg/kg ISIS 340982 100 mg/kg ISIS 340982
Semana 0
Semana 2 Semana 0 Semana 2 Semana 0 Semana 2
Triglicéridos mg/dl
162 162 111 24 139 17
Colesterol total mg/dl
112 102 106 40 107 31
Colesterol HDL mg/dl
66 63 83 23 96 17
Colesterol LDL mg/dl
29 32 35 13 37 10
Ácidos grasos libres mg/l
0,48 0,46 0,72 0,70 0,57 0,53
Glucosa mg/dl
153 151 147 127 164 166
A partir de los datos mostrados en la tabla 16 se evidencia que el tratamiento con ISIS 340982, a ambas dosis administradas, reduce significativamente los triglicéridos, el colesterol total, el colesterol HDL y el colesterol LDL en circulación en ratas. Además, estos animales muestran una expresión reducida de ARNm de apolipoproteína C-III en
15 hígado después del tratamiento con ISIS 340982.
Ejemplo 38: Efectos de la inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de rata in vivo Transaminasas en suero
Las ratas tratadas tal como se ha descrito en el ejemplo 35 se analizaron para evaluar la toxicidad en el hígado después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido. Después del tratamiento de dos semanas con inyecciones 20 dos veces a la semana de 75 mg/kg y 100 mg/kg de ISIS 340982 (SEC ID Nº: 233), los animales se sacrificaron y su sangre se recigió y se procesó para realizar análisis clínicos rutinarios. Los aumentos de transaminasas ALT y AST en suero, que pueden indicar hepatotoxicidad, también se midieron usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY, Estados Unidos). Los niveles de ALT y AST, que se muestran en la tabla 17, también se muestran como resultado promedio para cada grupo de tratamiento de 4 animales, en unidades internaciones/litro
25 (UI/l).
Tabla 17 – Efectos del tratamiento con ISIS 340982 sobre los niveles de transaminas en suero en ratas
Tratamiento
transaminasas en suero
Solución Salina 75 mg/kg de 340982 ISIS 100 mg/kg de ISIS 340982
ALT UI/l
70 49 59
AST UI/l
93 127 147
Estos datos muestran que el tratamiento con ISIS 340982 en ratas, tanto a una dosis de 75 mg/kg como de 100 mg/kg, no dio como resultado una hepatotoxicidad significativa.
Ejemplo 39: Inhibición antisentido de la expresión de apolipoproteína C-III de hámster mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
5 Con el fin de diseñar oligonucleótidos antisentido para regiones diferentes de ARNm de apolipoproteína C-III de hámster, se secuenció un segmento de ARNm de apolipoproteína C-III de hámster Mesocricetus auratus para proporcionar un segmento de secuencia de región codificante y 3’ UTR, debido a que no estaba disponible ninguna secuencia de ARNm de apolipoproteína C-III de hámster. El ARN se aisló y purificó a partir de hepatocitos de hámster primarios (InVitro Technologies, Gaith-ersburg, MD, Estados Unidos) y se sometió a una reacción de transcriptasa
10 inversa (kit de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ADNc resultante fue el sustrato para 40 ciclos de amplificación por PCR (Amplitaq PCR kit, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), usando cebadores directos e inversos para alinearse a los extremos 5’ y 3’, respectivamente, de ARNm de apolipoproteína C-III de ratón. Siguiendo a la purificación en gel del fragmento de 435 pb resultante, las reacciones de secuenciación directa e inversa de cada producto se realizaron por Retrogen (San Diego, CA, Estados Unidos).
15 La secuencia de hámster se incorpora al presente documento como SEC ID Nº: 352.
Se diseñó una serie de compuestos antisentido para diferentes regiones diana del ARNm de aplipoproteína C-III de hámster (SEC ID Nº: 352). Los compuestos se muestran en la tabla 18. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia diana particular al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 18 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que
20 consta de diez 2’-desoxinucleótidos, que están flanqueados por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2-metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.
Los compuestos se analizaron para determinar su efecto sobre niveles de apoliproteína C-III hepatocitos primarios de
25 hámster mediante PCR cuantitativa en tiempo real tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Las sondas y cebadores de apolipoproteína C-III de hámster se diseñaron para que se hibridaran con una secuencia de apolipoproteína C-III de hámster, usando la secuencia de ARNm de hámster que se describe en el presente documento (SEC ID Nº: 352). Para apolipoproteína C-III de hámster, los cebadores fueron:
cebador directo: CGCTAACCAGCATGCAAAAG (SEC ID Nº: 353)
30 cebador inverso: CACCGTCCATCCAGTCCC (SEC ID Nº: 354) y la
sonda PCR fue: FAM-CTGAGGTGGCTGTGCGGGCC-TAMRA (SEC ID Nº: 355) en la que FAM es el colorante fluorescente y TAMRA es el colorante inactivador.
Para GAPDH de hámster, los cebadores PCR fueron:
cebador directo: CCAGCCTCGCTCCGG (SEC ID Nº: 356)
35 cebador inverso: CCAATACGGCCAAATCCG (SEC ID Nº: 357)
y la sonda PCR fue JOE-ACGCAATGGTGAAGGTCGGCG-TAMRA (SEC ID Nº: 358) en la que JOE es el colorante fluorescente informador y TAMRA es el colorante inactivador.
Los datos son de un experimento en el que se trataron hepatocitos de hámster primarios con una concentración 150 nM de los oligonucleótidos. Los datos, mostrados en la tabla 18, están normalizados para células control no tratadas.
40 Si está presente, "N.D." indica "sin datos".

Tabla 18 - Inhibición de niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de hámster mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
352929
Codificante 352 5 TGCCAAGAGGGCAACAATAG 17 359
352930
Codificante 352 10 AGGAGTGCCAAGAGGGCAAC 62 360
352931
Codificante 352 16 GATGCCAGGAGTGCCAAGAG 50 361
352932
Codificante 352 20 GGCAGATGCCAGGAGTGCCA 51 362
352933
Codificante 352 39 CTCTACCTCATTAGCTTCGG 0 363
352934
Codificante 352 41 CCCTCTACCTCATTAGCTTC 47 364
E04749914 02-12-2011
(continuación)
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
352935
Codificante 352 44 GACCCCTCTACCTCATTAGC 0 365
352936
Codificante 352 49 GCAAGGACCCCTCTACCTCA 15 366
352937
Codificante 352 54 CAGCAGCAAGGACCCCTCTA 45 367
352938
Codificante 352 59 GAGCCCAGCAGCAAGGACCC 0 368
352939
Codificante 352 65 TGCACAGAGCCCAGCAGCAA 84 369
352940
Codificante 352 70 AGCCCTGCACAGAGCCCAGC 0 370
352941
Codificante 352 75 CATGTAGCCCTGCACAGAGC 0 371
352942
Codificante 352 80 TGTTCCATGTAGCCCTGCAC 49 372
352943
Codificante 352 85 TGGCCTGTTCCATGTAGCCC 55 373
352945
Codificante 352 95 ACCTTCTTGGTGGCCTGTTC 62 374
352946
Codificante 352 106 GCGCATCCTGGACCTTCTTG 0 375
352948
Codificante 352 115 TGCTGGTTAGCGCATCCTGG 0 376
352949
Codificante 352 120 TTGCATGCTGGTTAGCGCAT 3 377
352950
Codificante 352 125 GACTTTTGCATGCTGGTTAG 59 378
352951
Codificante 352 130 CCTCAGACTTTTGCATGCTG 72 379
352952
Codificante 352 135 AGCCACCTCAGACTTTTGCA 75 380
352953
Codificante 352 140 CGCACAGCCACCTCAGACTT 64 381
352955
Codificante 352 153 CCAGTCCCTGGCCCGCACAG 66 382
352956
Codificante 352 159 GTCCATCCAGTCCCTGGCCC 73 383
352957
Codificante 352 161 CCGTCCATCCAGTCCCTGGC 0 384
352958
Codificante 352 165 GCCACCGTCCATCCAGTCCC 0 385
352959
Codificante 352 170 GTGAAGCCACCGTCCATCCA 12 386
352960
Codificante 352 174 GGAGGTGAAGCCACCGTCCA 0 387
352961
Codificante 352 193 TGCTCCAGTAGCTTTTCAGG 59 388
352962
Codificante 352 200 GTAAATGTGCTCCAGTAGCT 66 389
352963
Codificante 352 205 TGTCAGTAAATGTGCTCCAG 78 390
352965
Codificante 352 214 TGGAGACCGTGTCAGTAAAT 38 391
352966
Codificante 352 217 GGCTGGAGACCGTGTCAGTA 66 392
352967
Codificante 352 221 CAGAGGCTGGAGACCGTGTC 13 393
352968
Codificante 352 225 ATCCCAGAGGCTGGAGACCG 0 394
352969
Codificante 352 230 GAAGAATCCCAGAGGCTGGA 54 395
352970
Codificante 352 269 TCTCAAGGCTCAGTAGCTGG 0 396
352971
Codificante 352 275 TAGAGGTCTCAAGGCTCAGT 70 397
352972
Codón de detención 352 280 GAACGTAGAGGTCTCAAGGC 61 398
352973
Codón de detención 352 286 CATTTGGAACGTAGAGGTCT 64 399
352974
3’ UTR 352 292 CAAGCACATTTGGAACGTAG 0 400
352975
3’ UTR 352 300 TGGACACACAAGCACATTTG 0 401
E04749914 02-12-2011
(continuación)
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA % DE INHIBICIÓN SEC ID N.º
352976
3’ UTR 352 305 CAGGATGGACACACAAGCAC 43 402
352977
3’ UTR 352 311 GGCCAGCAGGATGGACACAC 81 403
352978
3’ UTR 352 318 GCCCAGAGGCCAGCAGGATG 60 404
352979
3’ UTR 352 348 CCTTTCAAACAACCTTCAGG 56 405
352980
3’ UTR 352 402 GGACAGCATGTTTAGGTGAC 67 406
Se diseñó una serie adicional de oligonucleótidos para diferentes regiones diana del ARNm de aplipoproteína C-III de hámster usando secuencias descritas en el presente documento (SEC ID Nº: 352). Los oligonucleótidos se muestran en la tabla 19. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia diana particular al que se 5 une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 19 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región “hueco” que consta de diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-O-(2metoxietil) nucleótidos, también conocidos como (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas.
10 Tabla 19 - Oligonucleótidos de fosforoditioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi dirigidos a ARNm de apolipoproteína C-III de hámster
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.º
352944
Codificante 352 90 CTTGGTGGCCTGTTCCATGT 407
352947
Codificante 352 110 GTTAGCGCATCCTGGACCTT 408
352954
Codificante 352 145 TGGCCCGCACAGCCACCTCA 409
352964
Codificante 352 210 GACCGTGTCAGTAAATGTGC 410
356295
Codificante 352 1 AAGAGGGCAACAATAGGAGT 411
356296
Codificante 352 6 GTGCCAAGAGGGCAACAATA 412
356297
Codificante 352 15 ATGCCAGGAGTGCCAAGAGG 413
356298
Codificante 352 25 CTTCGGGCAGATGCCAGGAG 414
356299
Codificante 352 31 CATTAGCTTCGGGCAGATGC 415
356300
Codificante 352 60 AGAGCCCAGCAGCAAGGACC 416
356301
Codificante 352 86 GTGGCCTGTTCCATGTAGCC 417
356302
Codificante 352 91 TCTTGGTGGCCTGTTCCATG 418
356303
Codificante 352 96 GACCTTCTTGGTGGCCTGTT 419
356304
Codificante 352 101 TCCTGGACCTTCTTGGTGGC 420
356305
Codificante 352 111 GGTTAGCGCATCCTGGACCT 421
356306
Codificante 352 116 ATGCTGGTTAGCGCATCCTG 422
356307
Codificante 352 121 TTTGCATGCTGGTTAGCGCA 423
356308
Codificante 352 126 AGACTTTTGCATGCTGGTTA 424
356309
Codificante 352 131 ACCTCAGACTTTTGCATGCT 425
356310
Codificante 352 136 CAGCCACCTCAGACTTTTGC 426
356311
Codificante 352 141 CCGCACAGCCACCTCAGACT 427
356312
Codificante 352 146 CTGGCCCGCACAGCCACCTC 428
356313
Codificante 352 151 AGTCCCTGGCCCGCACAGCC 429
E04749914 02-12-2011
(continuación)
ISIS Nº
REGIÓN SECUENCIA DIANA SEC ID Nº SITIO DIANA SECUENCIA SEC ID N.º
356314
Codificante 352 156 CATCCAGTCCCTGGCCCGCA 430
356315
Codificante 352 166 AGCCACCGTCCATCCAGTCC 431
356316
Codificante 352 171 GGTGAAGCCACCGTCCATCC 432
356317
Codificante 352 176 AGGGAGGTGAAGCCACCGTC 433
356318
Codificante 352 181 TTTTCAGGGAGGTGAAGCCA 434
356319
Codificante 352 187 AGTAGCTTTTCAGGGAGGTG 435
356320
Codificante 352 198 AAATGTGCTCCAGTAGCTTT 436
356321
Codificante 352 203 TCAGTAAATGTGCTCCAGTA 437
356322
Codificante 352 208 CCGTGTCAGTAAATGTGCTC 438
356323
Codificante 352 213 GGAGACCGTGTCAGTAAATG 439
356324
Codificante 352 218 AGGCTGGAGACCGTGTCAGT 440
356325
Codificante 352 223 CCCAGAGGCTGGAGACCGTG 441
356326
Codificante 352 228 AGAATCCCAGAGGCTGGAGA 442
356327
Codón detención de 352 274 AGAGGTCTCAAGGCTCAGTA 443
356328
Codón detención de 352 279 AACGTAGAGGTCTCAAGGCT 444
356329
Codón detención de 352 284 TTTGGAACGTAGAGGTCTCA 445
356330
3’ UTR 352 289 GCACATTTGGAACGTAGAGG 446
356331
3’ UTR 352 294 CACAAGCACATTTGGAACGT 447
356332
3’ UTR 352 299 GGACACACAAGCACATTTGG 448
356333
3’ UTR 352 304 AGGATGGACACACAAGCACA 449
356334
3’ UTR 352 309 CCAGCAGGATGGACACACAA 450
356335
3’ UTR 352 314 AGAGGCCAGCAGGATGGACA 451
356336
3’ UTR 352 319 GGCCCAGAGGCCAGCAGGAT 452
356337
3’ UTR 352 324 ACCCAGGCCCAGAGGCCAGC 453
356338
3’ UTR 352 329 GGGCCACCCAGGCCCAGAGG 454
356339
3’ UTR 352 353 CTTTCCCTTTCAAACAACCT 455
356340
3’ UTR 352 358 CAATARTTTCCCTTTCAAAC 456
356341
3’ UTR 352 363 CATGACAATACTTTCCCTTT 457
356342
3’ UTR 352 368 GAAAACATGACAATACTTTC 458
356343
3’ UTR 352 373 GGGATGAAAACATGACAATA 459
356344
3’ UTR 352 396 CATGTTTAGGTGACTTCTGG 460
356345
3’ UTR 352 401 GACAGCATGTTTAGGTGACT 461
356346
3’ UTR 352 406 TTTAGGACAGCATGTTTAGG 462
356347
3’ UTR 352 411 CTTTATTTAGGACAGCATGT 463
356348
3’ UTR 352 416 TCCAGCTTTATTTAGGACAG 464
Ejemplo 40: Inhibición antisentido de apolipoproteína C-III de hámster mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un hueco desoxi. Estudios de respuesta a la dosis en hepatocitos de hámster primarios
Se seleccionaron seis oligonucleótidos dirigidos a apolipoproteína C-III de hámster para los estudios de respuesta a la
5 dosis adicionales. Los hepatocitos de hámster primarios se trataron con una concentración 50, 150 y 300 nM de ISIS 352939 (SEC ID Nº: 369), ISIS 352952 (SEC ID Nº: 380), ISIS 352962 (SEC ID Nº: 389), ISIS 352963 (SEC ID Nº: 390), ISIS 352971 (SEC ID Nº: 397) o ISIS 352977 (SEC ID Nº: 403) y se midieron los niveles de ARNm 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos tal como se describe en otros ejemplos del presente documento. Las células no tratadas sirvieron como control con respecto al que se normalizaron los datos.
10 Los resultados de estos estudios se muestran en la tabla 20. Los datos se promediaron a partir de tres experimentos y se expresaron como porcentaje de inhibición con relación a los controles no tratados.

Tabla 20 – Inhibición antisentido de la expresión de ARNm de apolipoproteína C-III en hepatocitos de hámster primarios 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos
Dosis de oligonucleótidos
ISIS Nº
SEC ID N.º 50 nM 150 nM 300 nM
% de inhibición
352939
369 46 64 82
352952
380 59 68 60
352962
389 84 0 22
352963
390 0 0 42
352971
397 0 27 0
352977
403 48 72 56
Tal como se muestra en la tabla 20, ISIS 352939 fue eficaz en reducir los niveles de ARNm de apolipoproteína C-III de hámster de un modo dependiente de la dosis.
Ejemplo 41: Oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III de ratón
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III de ratón usando informacion de secuencia
20 publicada (número de acceso del GenBank L04150.1, incorporada al presente documento como SEC ID Nº: 11). Ambos están dirigidos a la posición del nucleótido 496 de SEC ID Nº: 11), tal como hace ISIS 167880 (SEC ID Nº: 117), pero varían en la composición química con relación a ISIS 167880. ISIS 340995 tiene 20 nucleótidos de longitud, está compuestos por una región hueco central de 10 nucleótidos de longitud, mientras que el hueco contiene tanto 2’ desoxinucleótidos como 2’-MOE (MOE) nucleótidos. La composición de los nucleótidos se muestra en el tabla 21, en la
25 que los 2’-MOE nucleótidos se indican en negrita y los 2’ desoxinucleótidos están subrayados. El hueco está flanqueado por ambos lados (extremos 5’ y 3’) por “flancos” de 5 nucleótidos compuestos por 2’-MOE nucleótidos. ISIS 340997 (SEC ID Nº: 117) tiene 20 nucleótidos de longitud y está compuesto uniformemente por 2’-MOE nucleótidos. A lo largo de ISIS 340995 y de ISIS 340997, las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato y todos los restos de citidinas son citidinas no modificadas.
30 Tabla 21 - Oligonucleótidos antisentido dirigidos a apolipoproteína C-III de ratón LISTADO DE SECUENCIAS
ISISNO
Región SECUENCIA DIANA SEC ID Nº Sitio diana SECUENCIA SEC ID N.º
340995
3’ UTR 11 496 TCTTATCCAGCTTTATTAGG 117
340997
3’ UTR 11 496 TCTTATCCAGCTTTATTAGG 117
<110> Isis Pharmaceuticals Inc. Rosanne M. Crooke Mark J. Graham
5 Kristina M. Lemonidis Kenneth W. Dobie
<120> MODULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE APOLIPOPROTEÍNA C-III
<130> BIOL0004WO
<150>
10 US 10/418,780
<151> 2003-04-16
<160> 468
<210> 1
<211> 20 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido
<400> 1 20 tccgtcatcg ctcctcaggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Oligonucleótido antisentido
<400> 2 gtgcgcgcga gcccgaaatc 20
<210> 3 30 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido
35 <400> 3 atgcattctg cccccaagga 20
<210> 4
<211> 3958
<212> ADN 40 <213> H. sapiens
<220>
<400> 4
5
<210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 5 tcagcttcat gcagggttac at
22
10
<210> 6 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 6 acgctgctca gtgcatcct
19
20
<210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sonda de PCR
25
<400> 7 aagcacgcca ccaagaccgc c 21
<210> 8 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial
30
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 8 gaaggtgaag gtcggagtc
19
35
<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
40
<400> 9 gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
5
<220> <223> Sonda de PCR
<400> 10 caagcttccc gttctcagcc
20
10
<210> 11 <211> 518 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 11
<210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 12 tgcagggcta catggaacaa
20
25
<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
30
<400> 13 cggactcctg cacgctactt 20
35
<210> 14 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sonda de PCR
<400> 14 ctccaagacg gtccaggatg cgc
23
5
<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
10
<400> 15 ggcaaattca acggcacagt 20
<210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 16 gggtctcgct cctggaagat
20
20
<210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sonda de PCR
25
<400> 17 aaggccgaga atgggaagct tgtcatc 27
30
<210> 18 <211> 533 <212> ADN <213> H. sapiens
<220> <221> CDS <222> (47)...(346)
<400> 18
5
<210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 19 ctggagcagc tgcctctagg
20
10
<210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 20 ccctgcatga agctgagaag
20
20
<210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
25
<400> 21 gtgcttcatg taaccctgca 20
<210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
30
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 22 tggcctgctg ggccacctgg
20
35
<210> 23 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 23 tgctccagta gtctttcagg
20
<210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 24 tgacctcagg gtccaaatcc
20
<210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 25 ctctagggat gaactgagca
20
<210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 26 cagctgcctc tagggatgaa
20
<210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 27 ttcctggagc agctgcctct
20
<210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 28 acctctgttc ctggagcagc
20
<210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido
<400> 29 atggcacctc tgttcctgga
20
<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 30 gggctgcatg gcacctctgt
20
<210> 31 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 31 ggcaacaaca aggagtaccc
20
<210> 32 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 32 ggagggcaac aacaaggagt
20
<210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 33 agctcgggca gaggccagga
20
<210> 34 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 34 tctgaagctc gggcagaggc
20
<210> 35 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 35
cggcctctga agctcgggca
20
<210> 36 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 36 catcctcggc ctctgaagct
20
<210> 37 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 37 gggaggcatc ctcggcctct
20
<210> 38 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 38 gagaagggag gcatcctcgg
20
<210> 39 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 39 gctgagaagg gaggcatcct
20
<210> 40 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 40 tgcatgaagc tgagaaggga
20
<210> 41 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 41 gcgtgcttca tgtaaccctg
20
<210> 42
<211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 42 ttggtggcgt gcttcatgta
20
<210> 43 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 43 gcatccttgg cggtcttggt
20
<210> 44 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido.
<400> 44 ctcagtgcat ccttggcggt
20
<210> 45 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 45 tgctcagtgc atccttggcg
20
<210> 46 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 46 ctcctgcacg ctgctcagtg
20
<210> 47 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 47 gactcctgca cgctgctcag
20
<210> 48 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 48 gccacctggg actcctgcac
20
<210> 49 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 49 gcccctggcc tgctgggcca
20
<210> 50 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 50 agcccctggc ctgctgggcc
20
<210> 51 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 51 gaagccatcg gtcacccagc
20
<210> 52 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 52 ctgaagccat cggtcaccca
20
<210> 53 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 53 tttcagggaa ctgaagccat
20
<210> 54 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 54 cagtagtctt tcagggaact
20
<210> 55 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 55 aacggtgctc cagtagtctt
20
<210> 56 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 56 ccttaacggt gctccagtag
20
<210> 57 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 57 gaacttgtcc ttaacggtgc
20
<210> 58 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 58 ctcagagaac ttgtccttaa
20
<210> 59 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 59 agaactcaga gaacttgtcc
20
<210> 60 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 60 atcccagaac tcagagaact
20
<210> 61 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 61 cagggtccaa atcccagaac
20
<210> 62 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 62 ttggtctgac ctcagggtcc
20
<210> 63 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 63 gttggtctga cctcagggtc
20
<210> 64 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 64 gctgaagttg gtctgacctc
20
<210> 65 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 65 cagccacggc tgaagttggt
20
<210> 66 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 66 caggcagcca cggctgaagt
20
<210> 67 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 67 attgaggtct caggcagcca
20
<210> 68 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 68 tggataggca ggtggacttg
20
<210> 69 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 69 ctcgcaggat ggataggcag
20
<210> 70 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 70 aggagctcgc aggatggata
20
<210> 71 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 71 gacccaagga gctcgcagga
20
<210> 72 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 72 tgcaggaccc aaggagctcg
20
<210> 73 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido
<400> 73 tggagattgc aggacccaag
20
<210> 74 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 74 agccctggag attgcaggac
20
<210> 75 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 75 ggcagccctg gagattgcag
20
<210> 76 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 76 ccttttaagc aacctacagg
20
<210> 77 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 77 ctgtcccttt taagcaacct
20
<210> 78 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 78 agaatactgt cccttttaag
20
<210> 79 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 79
cactgagaat actgtccctt
20
<210> 80 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 80 taggagagca ctgagaatac
20
<210> 81 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 81 gggtaggaga gcactgagaa
20
<210> 82 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 82 aggccagcat gcctggaggg
20
<210> 83 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 83 ttgggaggcc agcatgcctg
20
<210> 84 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 84 agctttattg ggaggccagc
20
<210> 85 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 85 tgtccagctt tattgggagg
20
<210> 86
<211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 86 cttgtccagc tttattggga
20
<210> 87 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 87 agcttcttgt ccagctttat
20
<210> 88 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 88 catagcagct tcttgtccag
20
<210> 89 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 89 acctggagca gctgcctcta
20
<210> 90 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 90 agggcattac ctggagcagc
20
<210> 91 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 91 acctctgttc ctgcaaggaa
20
<210> 92 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 92 aagtgcttac gggcagaggc
20
<210> 93 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 93 gcgggtgtac ctggcctgct
20
<210> 94 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 94 aaccctgttg tgaactgcac
20
<210> 95 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 95 agtgagcaat accgcctgag
20
<210> 96 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 96 cgggcttgaa ttaggtcagg
20
<210> 97 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 97 tagggataaa actgagcagg
20
<210> 98 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 98 ctggagtagc tagctgcttc
20
<210> 99 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 99 gctgcatggc acctacgtac
20
<210> 100 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 100 ccacagtgag gagcgtccgg
20
<210> 101 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 101 ggcagatgcc aggagagcca
20
<210> 102 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 102 ctacctcttc agctcgggca
20
<210> 103 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 103 cagcagcaag gatccctcta
20
<210> 104 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 104 gcacagagcc cagcagcaag
20
<210> 105 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 105 ccctggccac cgcagctata
20
<210> 106 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 106 atctgaagtg attgtccatc
20
<210> 107 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 107 agtagccttt caggaatctg
20
<210> 108 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 108 cttgtcagta aacttgctcc
20
<210> 109 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 109 gaagccggtg aacttgtcag
20
<210> 110 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido antisentido
<400> 110 gaatcccaga agccggtgaa
20
<210> 111 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido
<400> 111 ggttagaatc ccagaagccg
<210> 112
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido
<400> 112 tggagttggt tggtcctcag
<210> 113
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido
<400> 113 tcacgactca atagctggag
<210> 114
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido
<400> 114 cccttaaagc aaccttcagg
<210> 115
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido
<400> 115 agacatgaga acatactttc
<210> 116
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido
<400> 116 catgtttagg tgagatctag
<210> 117
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido antisentido 20
<400> 117 tcttatccag ctttattagg
20
<210> 118 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 118 ccuagaggca gcugcuccag
20
<210> 119 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 119 cuucucagcu ucaugcaggg
20
<210> 120 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 120 ugcaggguua caugaagcac
20
<210> 121 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 121 ccagguggcc cagcaggcca
20
<210> 122 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 122 ccugaaagac uacuggagca
20
<210> 123 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 123 ugcucaguuc aucccuagag
20
<210> 124 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 124 agaggcagcu gcuccaggaa
20
<210> 125 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 125 gcugcuccag gaacagaggu
20
<210> 126 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 126 uccaggaaca gaggugccau
20
<210> 127 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 127 acagaggugc caugcagccc
20
<210> 128 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 128 ggguacuccu uguuguugcc
20
<210> 129 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 129 acuccuuguu guugcccucc
20
<210> 130 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 130 uccuggccuc ugcccgagcu
20
<210> 131 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 131 gccucugccc gagcuucaga
20
<210> 132 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 132 agcuucagag gccgaggaug
20
<210> 133 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 133 agaggccgag gaugccuccc
20
<210> 134 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 134 ccgaggaugc cucccuucuc
20
<210> 135 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 135 aggaugccuc ccuucucagc
20
<210> 136 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 136 ucccuucuca gcuucaugca
20
<210> 137 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 137 caggguuaca ugaagcacgc
20
<210> 138 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 138 uacaugaagc acgccaccaa
20
<210> 139 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 139 accaagaccg ccaaggaugc
20
<210> 140 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 140 accgccaagg augcacugag
20
<210> 141 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 141 cgccaaggau gcacugagca
20
<210> 142 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 142 cacugagcag cgugcaggag
20
<210> 143 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens <220>
<400> 143 cugagcagcg ugcaggaguc
20
<210> 144 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 144 gugcaggagu cccagguggc
20
<210> 145 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 145 uggcccagca ggccaggggc
20
<210> 146 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 146 ggcccagcag gccaggggcu
20
<210> 147 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 147 gcugggugac cgauggcuuc
20
<210> 148 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 148 ugggugaccg auggcuucag
20
<210> 149 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 149 auggcuucag uucccugaaa
20
<210> 150 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 150 aagacuacug gagcaccguu
20
<210> 151 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 151 cuacuggagc accguuaagg
20
<210> 152 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 152 gcaccguuaa ggacaaguuc
20
<210> 153 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 153 uuaaggacaa guucucugag
20
<210> 154 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 154 ggacaaguuc ucugaguucu
20
<210> 155 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220> <400> 155 guucugggau uuggacccug
20
<210> 156 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 156 ggacccugag gucagaccaa
20
<210> 157 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 157 gacccugagg ucagaccaac
20
<210> 158 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 158 gaggucagac caacuucagc
20
<210> 159 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 159 accaacuuca gccguggcug
20
<210> 160 <211> 20
<212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 160 acuucagccg uggcugccug
20
<210> 161 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 161 uggcugccug agaccucaau
20
<210> 162 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 162 caaguccacc ugccuaucca
20
<210> 163 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 163 cugccuaucc auccugcgag
20
<210> 164 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 164 uauccauccu gcgagcuccu
20
<210> 165 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 165 uccugcgagc uccuuggguc
20
<210> 166 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 166 cgagcuccuu ggguccugca
20
<210> 167 <211> 20
<212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 167 cuuggguccu gcaaucucca
20
<210> 168 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 168 guccugcaau cuccagggcu
20
<210> 169 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 169 cugcaaucuc cagggcugcc
20
<210> 170 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 170 ccuguagguu gcuuaaaagg
20
<210> 171 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 171 agguugcuua aaagggacag
20
<210> 172 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 172 cuuaaaaggg acaguauucu
20
<210> 173 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 173 aagggacagu auucucagug
20
<210> 174 <211> 20
<212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 174 guauucucag ugcucuccua
20
<210> 175 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 175 uucucagugc ucuccuaccc
20
<210> 176 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 176 cccuccaggc augcuggccu
20
<210> 177 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 177 caggcaugcu ggccucccaa
20
<210> 178 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 178 gcuggccucc caauaaagcu
20
<210> 179 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 179 ccucccaaua aagcuggaca
20
<210> 180 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 180 ucccaauaaa gcuggacaag
20
<210> 181 <211> 20
<212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 181 auaaagcugg acaagaagcu
20
<210> 182 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 182 cuggacaaga agcugcuaug
20
<210> 183 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 183 uagaggcagc ugcuccaggu
20
<210> 184 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 184 gcugcuccag guaaugcccu
20
<210> 185 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 185 uuccuugcag gaacagaggu
20
<210> 186 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 186 gccucugccc guaagcacuu
20
<210> 187 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 187 agcaggccag guacacccgc
20
<210> 188 <211> 20
<212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 188 gugcaguuca caacaggguu
20
<210> 189 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 189 cucaggcggu auugcucacu
20
<210> 190 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 190 ccugaccuaa uucaagcccg
20
<210> 191 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 191 ccugcucagu uuuaucccua
20
<210> 192 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 192 guacguaggu gccaugcagc
20
<210> 193 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 193 ccggacgcuc cucacugugg
20
<210> 194 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 194 uggcucuccu ggcaucugcc
20
<210> 195 <211> 20
<212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 195 ugcccgagcu gaagagguag
20
<210> 196 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 196 uagagggauc cuugcugcug
20
<210> 197 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 197 cuugcugcug ggcucugugc
20
<210> 198 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 198 uauagcugcg guggccaggg
20
<210> 199 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 199 cagauuccug aaaggcuacu
20
<210> 200 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220> <400> 200 ggagcaaguu uacugacaag
20
<210> 201 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 201 cugacaaguu caccggcuuc
20
<210> 202 <211> 20 <212> ADN
<213> M. musculus
<220>
<400> 202 cggcuucugg gauucuaacc
20
<210> 203 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 203 cugaggacca accaacucca
20
<210> 204 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 204 cuccagcuau ugagucguga
20
<210> 205 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 205 ccugaagguu gcuuuaaggg
20
<210> 206 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 206 gaaaguaugu ucucaugucu
20
<210> 207 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 207 cuagaucuca ccuaaacaug
20
<210> 208 <211> 20 <212> ADN <213> M. musculus
<220>
<400> 208 ccuaauaaag cuggauaaga
20
<210> 209 <211> 20 <212> ADN
<213> H. sapiens
<220>
<400> 209 gcugcauggc accucuguuc
20
<210> 210 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 210 ggcagaggc caggagcgcca
20
<210> 211 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 211 cugaagcucg ggcagaggcc
20
<210> 212 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 212 uccucggccu cugaagcucg
20
<210> 213 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 213 ucuugguggc gugcuucaug
20
<210> 214 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 214 gcucagugca uccuuggcgg
20
<210> 215 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 215 ccugcacgcu gcucagugca
20
<210> 216 <211> 20 <212> ADN
<213> H. sapiens
<220>
<400> 216 acugaagcca ucggucaccc
20
<210> 217 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 217 cagaacucag agaacuuguc
20
<210> 218 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 218 gaaguugguc ugaccucagg
20
<210> 219 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 219 cccuggagau ugcaggaccc
20
<210> 220 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 220 gggcagcccu ggagauugca
20
<210> 221 <211> 20 <212> ADN <213> H. sapiens
<220>
<400> 221 cccuuuuaa gcaaccuacag
20
<210> 222 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 222 ctcttactgt gctgtggaca
20
<210> 223 <211> 479
<212> ADN
<213> M. fascicularis
<220>
<221> misc_feature
<222> 53, 63
<223> n = A,T,C or G
<400> 223
10
<210> 224 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
15
<400> 224 ggcagccctg gaggctgcag 20
20
<210> 225 <211> 427 <212> ADN <213> R. norvegicus
<400> 225
<210> 226
<211> 306
<212> ADN
<213> R. norvegicus
<400> 226
<210> 227 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 227 gagggagagg gatccttgct
20
<210> 228 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 228 ggaccgtctt ggaggcttg
19
<210> 229 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> PCR probe
<400> 229 ctgggctcta tgcagggcta catgga
26
<210> 230 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 230 tgttctagag acagccgcat ctt
23
<210> 231 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 231 caccgacctt caccatcttg t
21
<210> 232 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> PCR probe
<400> 232 ttgtgcagtg ccagcctcgt ctca
24
<210> 233 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 233 tgaacttatc agtgaacttg
20
<210> 234 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 234 tcagggccag actcccagag
20
<210> 235 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 235 ttggtgttgt tagttggtcc
20
<210> 236 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 236 ttggtgttgt tagttggtcc
20
<210> 237 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 237 agagccacga gggccacgat
20
<210> 238 <211> 20 <212> ADN
<213>
Secuencia artificial
<213>
Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 238 agaggccagg agagccacga
20
<210> 239 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 239 cagctcgggc agaggccagg
20
<210> 240 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 240 tctccctcat cagctcgggc
20
<210> 241 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 241 gcccagcagc aaggatccct
20
<210> 242 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 242 cctgcataga gcccagcagc
20
<210> 243 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 243 tccatgtagc cctgcataga
20
<210> 244 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Compuesto antisentido
<400> 244 ggaccgtctt ggaggcttgt
20
<210> 245 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 245 agtgcatcct ggaccgtctt
20
<210> 246 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 246 catgctgctt agtgcatcct
20
<210> 247 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 247 cagactcctg catgctgctt
20
<210> 248 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 248 acagctatat cagactcctg
20
<210> 249 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 249 ctggccacca cagctatatc
20
<210> 250 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 250
aagcgattgt ccatccagcc
20
<210> 251 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 251 tgctccagta gcctttcagg
20
<210> 252 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 252 gaacttgctc cagtagcctt
20
<210> 253 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 253 cagtgaactt gctccagtag
20
<210> 254 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 254 cttatcagtg aacttgctcc
20
<210> 255 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 255 ccagtgaact tatcagtgaa
20
<210> 256 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 256 gaggccagtg aacttatcag
20
<210> 257
<211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 257 ccagaggcca gtgaacttat
20
<210> 258 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 258 gactcccaga ggccagtgaa
20
<210> 259 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 259 ggccagactc ccagaggcca
20
<210> 260 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 260 agttggtcct cagggccaga
20
<210> 261 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 261 gttagttggt cctcagggcc
20
<210> 262 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 262 tgttgttagt tggtcctcag
20
<210> 263 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 263 agagttggtg ttgttagttg
20
<210> 264 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 264 gctcaagagt tggtgttgtt
20
<210> 265 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 265 cacggctcaa gagttggtgt
20
<210> 266 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 266 gtctcacggc tcaagagttg
20
<210> 267 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 267 gaacatggag gtctcacggc
20
<210> 268 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 268 tctggaacat ggaggtctca
20
<210> 269 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 269 cacatctgga acatggaggt
20
<210> 270 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 270 cagacacatc tggaacatgg
20
<210> 271 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 271 tggccagaca catctggaac
20
<210> 272 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 272 aggatagatg gccagacaca
20
<210> 273 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 273 cagcaggata gatggccaga
20
<210> 274 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 274 gaggcagcag gatagatggc
20
<210> 275 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 275 ttcggaggca gcaggataga
20
<210> 276 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 276 aaccttcgga ggcagcagga
20
<210> 277 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 277 gagcaacctt cggaggcagc
20
<210> 278 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 278 cttagagcaa ccttcggagg
20
<210> 279 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 279 tccccttaga gcaaccttcg
20
<210> 280 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 280 actttcccct tagagcaacc
20
<210> 281 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 281 atatactttc cccttagagc
20
<210> 282 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 282 gagaatatac tttcccctta
20
<210> 283 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 283 gcatgagaat atactttccc
20
<210> 284 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 284 aaaggcatga gaatatactt
20
<210> 285 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 285 ggataaaggc atgagaatat
20
<210> 286 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 286 ggagggataa aggcatgaga
20
<210> 287 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 287 gcatgtttag gtgaggtctg
20
<210> 288 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Compuesto antisentido
<400> 288 gacagcatgt ttaggtgagg
20
<210> 289 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 289 ttatttggga cagcatgttt
20
<210> 290 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 290 gcttttattt gggacagcat
20
<210> 291 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 291 tcccagcttt tatttgggac
20
<210> 292 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 292 cacgatgagg agcattcggg
20
<210> 293 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 293 agggccacga tgaggagcat
20
<210> 294 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 294
ccacgagggc cacgatgagg
20
<210> 295 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 295 gagagccacg agggccacga
20
<210> 296 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 296 gccaggagag ccacgagggc
20
<210> 297 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 297 cagaggccag gagagccacg
20
<210> 298 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 298 tcgggcagag gccaggagag
20
<210> 299 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 299 tcagctcggg cagaggccag
20
<210> 300 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 300 cctcatcagc tcgggcagag
20
<210> 301
<211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 301 ctctccctca tcagctcggg
20
<210> 302 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 302 gatccctctc cctcatcagc
20
<210> 303 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 303 gcaaggatcc ctctccctca
20
<210> 304 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 304 cagcagcaag gatccctctc
20
<210> 305 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 305 gagcccagca gcaaggatcc
20
<210> 306 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 306 gcatagagcc cagcagcaag
20
<210> 307 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 307 gccctgcata gagcccagca
20
<210> 308 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 308 atgtagccct gcatagagcc
20
<210> 309 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 309 gttccatgta gccctgcata
20
<210> 310 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 310 ggcttgttcc atgtagccct
20
<210> 311 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 311 ttggaggctt gttccatgta
20
<210> 312 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 312 ccgtcttgga ggcttgttcc
20
<210> 313 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 313 ctggaccgtc ttggaggctt
20
<210> 314 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 314 gcatcctgga ccgtcttgga
20
<210> 315 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 315 ttagtgcatc ctggaccgtc
20
<210> 316 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 316 gctgcttagt gcatcctgga
20
<210> 317 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 317 tgcatgctgc ttagtgcatc
20
<210> 318 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 318 actcctgcat gctgcttagt
20
<210> 319 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 319 atcagactcc tgcatgctgc
20
<210> 320 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 320 gctatatcag actcctgcat
20
<210> 321 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 321 ccacagctat atcagactcc
20
<210> 322 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 322 ggccaccaca gctatatcag
20
<210> 323 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 323 ctgctggcca ccacagctat
20
<210> 324 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 324 agcccctgct ggccaccaca
20
<210> 325 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 325 catccagccc ctgctggcca
20
<210> 326 <211> 20 <212> ADN
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 326 ttgtccatcc agcccctgct
20
<210> 327 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 327 attgtccatc cagcccctgc
20
<210> 328 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 328 agcgattgtc catccagccc
20
<210> 329 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 329 tttgaagcga ttgtccatcc
20
<210> 330 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 330 agggatttga agcgattgtc
20
<210> 331 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 331 ctttcaggga tttgaagcga
20
<210> 332 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Compuesto antisentido
<400> 332 gtagcctttc agggatttga
20
<210> 333 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 333 ctccagtagc ctttcaggga
20
<210> 334 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 334 acttgctcca gtagcctttc
20
<210> 335 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 335 agtgaacttg ctccagtagc
20
<210> 336 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 336 ttatcagtga acttgctcca
20
<210> 337 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 337 gccagtgaac ttatcagtga
20
<210> 338 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 338
cagaggccag tgaacttatc
20
<210> 339 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 339 actcccagag gccagtgaac
20
<210> 340 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 340 gccagactcc cagaggccag
20
<210> 341 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 341 tagttggtcc tcagggccag
20
<210> 342 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 342 gttgttagtt ggtcctcagg
20
<210> 343 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 343 aagagttggt gttgttagtt
20
<210> 344 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 344 ggctcaagag ttggtgttgt
20
<210> 345
<211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 345 tcacggctca agagttggtg
20
<210> 346 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 346 ggaggcttgt tccatgtagc
20
<210> 347 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 347 tcagggattt gaagcgattg
20
<210> 348 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 348 cagtagcctt tcagggattt
20
<210> 349 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 349 atggaggtct cacggctcaa
20
<210> 350 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 350 tagatggcca gacacatctg
20
<210> 351 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Compuesto antisentido
<400> 351 ttgggacagc atgtttaggt 20
<210> 352
<211> 435
<212> ADN
<213> M. auratus
<400> 352
<210> 353 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 353 cgctaaccag catgcaaaag
20
20
<210> 354 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
25
<400> 354 caccgtccat ccagtccc 18
30
<210> 355 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> PCR probe
<400> 355 ctgaggtggc tgtgcgggcc
20
35
<210> 356 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 356 ccagcctcgc tccgg
15
<210> 357 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 357 ccaatacggc caaatccg
18
<210> 358 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> PCR probe
<400> 358 acgcaatggt gaaggtcggc g
21
<210> 359 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 359 tgccaagagg gcaacaatag
20
<210> 360 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 360 aggagtgcca agagggcaac
20
<210> 361 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 361 gatgccagga gtgccaagag
20
<210> 362 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 362 ggcagatgcc aggagtgcca
20
<210> 363 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 363 ctctacctca ttagcttcgg
20
<210> 364 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 364 ccctctacct cattagcttc
20
<210> 365 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 365 gacccctcta cctcattagc
20
<210> 366 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 366 gcaaggaccc ctctacctca
20
<210> 367 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 367 cagcagcaag gacccctcta
20
<210> 368 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 368 gagcccagca gcaaggaccc
20
<210> 369 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 369 tgcacagagc ccagcagcaa
20
<210> 370 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 370 agccctgcac agagcccagc
20
<210> 371 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 371 catgtagccc tgcacagagc
20
<210> 372 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 372 tgttccatgt agccctgcac
20
<210> 373 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 373 tggcctgttc catgtagccc
20
<210> 374 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 374 accttcttgg tggcctgttc
20
<210> 375 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 375 gcgcatcctg gaccttcttg
20
<210> 376 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 376 tgctggttag cgcatcctgg
20
<210> 377 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 377 ttgcatgctg gttagcgcat
20
<210> 378 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 378 gacttttgca tgctggttag
20
<210> 379 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 379 cctcagactt ttgcatgctg
20
<210> 380 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 380 agccacctca gacttttgca
20
<210> 381 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Compuesto antisentido
<400> 381 cgcacagcca cctcagactt
20
<210> 382 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 382 ccagtccctg gcccgcacag
20
<210> 383 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 383 gtccatccag tccctggccc
20
<210> 384 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 384 ccgtccatcc agtccctggc
20
<210> 385 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 385 gccaccgtcc atccagtccc
20
<210> 386 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 386 gtgaagccac cgtccatcca
20
<210> 387 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 387
ggaggtgaag ccaccgtcca
20
<210> 388 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 388 tgctccagta gcttttcagg
20
<210> 389 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 389 gtaaatgtgc tccagtagct
20
<210> 390 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 390 tgtcagtaaa tgtgctccag
20
<210> 391 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 391 tggagaccgt gtcagtaaat
20
<210> 392 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 392 ggctggagac cgtgtcagta
20
<210> 393 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 393 cagaggctgg agaccgtgtc
20
<210> 394
<211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 394 atcccagagg ctggagaccg
20
<210> 395 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 395 gaagaatccc agaggctgga
20
<210> 396 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 396 tctcaaggct cagtagctgg
20
<210> 397 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 397 tagaggtctc aaggctcagt
20
<210> 398 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 398 gaacgtagag gtctcaaggc
20
<210> 399 <211> 20 <212> ADN <213> Artiticial Sequence
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 399 catttggaac gtagaggtct
20
<210> 400 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 400 caagcacatt tggaacgtag
20
<210> 401 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 401 tggacacaca agcacatttg
20
<210> 402 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 402 caggatggac acacaagcac<210> 403 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 403 ggccagcagg atggacacac
20
<210> 404 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 404 gcccagaggc cagcaggatg
20
<210> 405 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 405 cctttcaaac aaccttcagg
20
<210> 406 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 406
ggacagcatg tttaggtgac
20
<210> 407 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 407 cttggtggcc tgttccatgt
20
<210> 408 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 408 gttagcgcat cctggacctt
20
<210> 409 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 409 tggcccgcac agccacctca
20
<210> 410 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 410 gaccgtgtca gtaaatgtgc
20
<210> 411 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 411 aagagggcaa caataggagt
20
<210> 412 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 412 gtgccaagag ggcaacaata
20
<210> 413
<211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 413 atgccaggag tgccaagagg
20
<210> 414 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 414 cttcgggcag atgccaggag
20
<210> 415 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 415 cattagcttc gggcagatgc
20
<210> 416 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 416 agagcccagc agcaaggacc
20
<210> 417 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 417 gtggcctgtt ccatgtagcc
20
<210> 418 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 418 tcttggtggc ctgttccatg
20
<210> 419 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 419 gaccttcttg gtggcctgtt
20
<210> 420 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 420 tcctggacct tcttggtggc
20
<210> 421 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 421 ggttagcgca tcctggacct
20
<210> 422 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 422 atgctggtta gcgcatcctg
20
<210> 423 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 423 tttgcatgct ggttagcgca
20
<210> 424 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 424 agacttttgc atgctggtta
20
<210> 425 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 425 acctcagact tttgcatgct
20
<210> 426 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 426 cagccacctc agacttttgc
20
<210> 427 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 427 20 ccgcacagcc acctcagact
20
<210> 428 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 428 20 ctggcccgca cagccacctc
20
<210> 429 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 429 20 agtccctggc ccgcacagcc
20
<210> 430 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 430 20 catccagtcc ctggcccgca
20
<210> 431 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 431 20 agccaccgtc catccagtcc
20
<210> 432 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 432 ggtgaagcca ccgtccatcc
20
<210> 433 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 433 agggaggtga agccaccgtc
20
<210> 434 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 434 ttttcaggga ggtgaagcca
20
<210> 435 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 435 agtagctttt cagggaggtg
20
<210> 436 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 436 aaatgtgctc cagtagcttt
20
<210> 437 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 437 tcagtaaatg tgctccagta
20
<210> 438 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 438 ccgtgtcagt aaatgtgctc
20
<210> 439 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 439 ggagaccgtg tcagtaaatg
20
<210> 440 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 440 aggctggaga ccgtgtcagt
20
<210> 441 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 441 cccagaggct ggagaccgtg
20
<210> 442 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 442 agaatcccag aggctggaga
20
<210> 443 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 443 agaggtctca aggctcagta
20
<210> 444 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Compuesto antisentido
<400> 444 aacgtagagg tctcaaggct
20
<210> 445 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 445 tttggaacgt agaggtctca
20
<210> 446 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 446 gcacatttgg aacgtagagg
20
<210> 447 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 447 cacaagcaca tttggaacgt
20
<210> 448 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 448 ggacacacaa gcacatttgg
20
<210> 449 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 449 aggatggaca cacaagcaca
20
<210> 450 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 450
ccagcaggat ggacacacaa
20
<210> 451 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 451 agaggccagc aggatggaca
20
<210> 452 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 452 ggcccagagg ccagcaggat
20
<210> 453 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 453 acccaggccc agaggccagc
20
<210> 454 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 454 gggccaccca ggcccagagg
20
<210> 455 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 455 ctttcccttt caaacaacct
20
<210> 456 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 456 caatactttc cctttcaaac
20
<210> 457
<211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 457 catgacaata ctttcccttt
20
<210> 458 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 458 gaaaacatga caatactttc
20
<210> 459 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 459 gggatgaaaa catgacaata
20
<210> 460 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 460 catgtttagg tgacttctgg
20
<210> 461 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 461 gacagcatgt ttaggtgact
20
<210> 462 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 462 tttaggacag catgtttagg
20
<210> 463 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 463 ctttatttag gacagcatgt
20
<210> 464 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Compuesto antisentido
<400> 464 tccagcttta tttaggacag
20
<210> 465 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> antisense Oligonucleotide <400> 465 cgagaggcgg acgggaccg
19
<210> 466 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> antisense Oligonucleotide
<400> 466 cgagaggcgg acgggaccgt t
21
<210> 467 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> complement Oligonucleotide
<400> 467 ttgctctccg cctgccctgg c
21
<210> 468 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> complement Oligonucleotide
<400> 468 gctctccgcc tgccctggc
19

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un oligonucleótido antisentido de 20 a 30 nucleobases de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III, en el que dicho oligonucleótido se hibrida específicamene con dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III e inhibe la expresión de la apolipoproteína C-III y en el que dicho oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID Nº: 69, 71, 72, 73, 75, 78, 81, 84, 85, 86, 87 y 88 y tiene una secuencia que es al menos en el 90 % complementaria a dicha molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III.
  2. 2.
    El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que el oligonucleido tiene una secuencia que es al menos el 95 % complementaria a la molécula de ácido nucleido que codifica la apolipoproteína C-III.
  3. 3.
    El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que el oligonucleido tiene una secuencia que es al menos el 100 % complementaria a la molécula de ácido nucleido que codifica la apolipoproteína C-III.
  4. 4.
    El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína C-III humana que tiene la secuencia de la SEC ID Nº:4 o la SEC ID Nº:18.
  5. 5.
    El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido de ADN.
  6. 6.
    El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido de ARN.
  7. 7.
    El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que tiene al menos una unión entre nucleósidos, resto de azúcar o base nitrogenada modificada.
  8. 8.
    El nucleótido antisentido de la reivindicación 7, que tiene al menos un resto de azúcar 2’-O-metoxietílico.
  9. 9.
    El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 7, que tiene al menos una unión entre nucleósidos de fosforotioato.
  10. 10.
    El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 7, que tiene al menos una 5-metilcitosina.
  11. 11.
    El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido quimérico.
  12. 12.
    El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 11, en el que dicho oligonucleótido quimérico es de 20 nucleótidos de longitud, comprendiendo diez 2’-desoxinucleótidos flanqueados en cada lado por cinco 2'metoxietilnucleótidos, en el que los enlaces entre nucleósidos son fosforotioato y todos los restos de citosina son 5-metilcitosinas.
  13. 13.
    El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 12, en el que dicho oligonucleótido quimérico consta de una secuencia seleccionada de entre las SEC ID Nº: 69, 71, 72, 73, 75, 78, 81, 84, 85, 86, 87 y 88.
  14. 14.
    Un procedimiento de inhibición de la expresión de la apolipoproteína C-III en células o tejidos in vitro que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 de tal modo que se inhiba la expresión de apolipoproteína C-III.
  15. 15.
    Un oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en terapia.
  16. 16.
    El oligonucleótiod antisentido de la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento de una afección metabólica anormal.
  17. 17.
    El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 15, para su uso en el tratamietno de hipertrigliceridemia, metabolismo de lípidos anormal, metabolismo de colesterol anormal, ateroesclerosis, hiperlipidemia, diabetes, obesidad, enfermedad cardiovascular o enfermedad arterial coronaria.
  18. 18.
    El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 17, en el que dicha diabetes es diabetes de tipo 2.
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