ES2342665T3

ES2342665T3 - Secuenciacion desde dos extremos.

Info

Publication number: ES2342665T3
Application number: ES04706053T
Authority: ES
Inventors: Yi-Ju Chen; John H. Leamon; Kenton Lohman; Michael T. Ronan; Maithreyan Srinivasan; Jonathan Rothberg; Michael Weiner
Original assignee: 454 Life Science Corp
Current assignee: 454 Life Science Corp
Priority date: 2003-01-29
Filing date: 2004-01-28
Publication date: 2010-07-12
Anticipated expiration: 2024-01-28
Also published as: WO2004070005A3; CA2513541A1; US20110201526A1; DE602004036672C5; JP2007525151A; EP1997889A2; JP2010178744A; CA2513899C; EP1594981A4; EP2145955A2; EP2145955B1; JP5726155B2; ES2380893T3; CA2727850C; JP2006515522A; CA2513535A1; CA2513535C; JP2013090635A; EP2159285A2; CN101128601A

Abstract

Método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico, que comprende las etapas de: (a) hibridar dos o más cebadores de secuenciación con una o una pluralidad de cadenas individuales de la molécula de ácido nucleico, en la que todos los cebadores excepto uno son cebadores reversiblemente bloqueados, (b) incorporar por lo menos una base en la molécula de ácido nucleico mediante elongación de polimerasa a partir de un cebador no bloqueado, (c) bloquear la elongación adicional de dicho cebador no bloqueado, (d) desbloquear uno de los cebadores reversiblemente bloqueados, formando un cebador desbloqueado, (e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que por lo menos uno de los cebadores reversiblemente bloqueados se haya desbloqueado y utilizado para determinar una secuencia mediante secuenciación pirofosfato.

Description

Secuenciación desde dos extremos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para secuenciar tanto la cadena sentido como la cadena antisentido de un ácido nucleico.

Antecedentes

La presente invención se refiere a un método para la secuenciación de las bases de ácido desoxirribonucleico (ADN). Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos para secuenciar tanto la cadena sentido como la cadena antisentido de ADN mediante la utilización de cebadores de secuenciación bloqueados y no bloqueados.

La secuenciación del genoma ofrece la posibilidad de diagnóstico, terapia y prevención de enfermedades, así como la modificación dirigida del genoma humano. Resultan necesarios métodos de secuenciación rápida que permitan la utilización de este potencial. La secuenciación de bases del ácido desoxirribonucleico (ADN) y del ácido ribonucleico (ARN) es una de las técnicas analíticas más importantes de la biotecnología, la industria farmacéutica, la industria alimentaria, el diagnóstico médico y otros campos de aplicación.

Se encuentran disponibles muchos métodos de secuenciación del ADN, tales como la secuenciación de Sanger utilizando la terminación dideoxi y la electroforesis en gel desnaturalizante (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:5463-5467, 1977), la secuenciación de Maxam-Gilbert utilizando el corte químico y la electroforesis en gel desnaturalizante (Maxam A.M. y Gilbert W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564, 1977), la pirosecuencación, mediante la detección del pirofosfato (PPi) liberado durante la reacción de la ADN polimerasa (Ronaghi M. et al., Science 281:363-365, 1998) y la secuenciación mediante hibridación (SBH) utilizando oligonucleótidos (Lysov I. et al., Dok1 Akad Nauk SSSR 303:1508-1511, 1988; Bains W. y Smith G.C., J. Theor. Biol. 135:303-307, 1988; Dmanac R. et al., Genomics 4:114-128, 1989; Khrapko K.R. et al., FEBS Lett. 256:118-122, 1989; Pevzner P.A., J. Biomol. Struct. Dyn. 7:63-73, 1989; Southern E.M. et al., Genomics 13:1008-1017, 1992).

Ronaghi et al. (Anal. Biochem. 267:65-71, 1999) se refieren a un método de secuenciación de ambas cadenas de un ácido nucleico. El método implica la amplificación por PCR de un ácido nucleico molde con un cebador biotinilado y un cebador no biotinilado. El producto amplificado, que comprende una cadena biotinilada y una cadena no biotinilada se separa en cadenas. Los autores se refieren a la utilización de perlas recubiertas con estreptavidina para la separación de cadenas. La cadena biotinilada queda unida a las perlas, mientras que la cadena no biotinilada se separa de la perla bajo condiciones desnaturalizantes. Las dos cadenas (biotinilada y no biotinilada) se secuencian separadamente. Al contrario que en la presente invención, que utiliza la secuenciación en fase sólida para ambas cadenas, dicho método utiliza la secuenciación en fase sólida para la cadena biotinilada y la secuenciación en fase solución para la secuencia de la cadena no biotinilada. Por lo tanto, el método de Ronaghi es similar al método tradicional de secuenciación del ADN que comprende la separación de las cadenas (por ejemplo utilizando un gel de urea) de un molde antes de la secuenciación. De esta manera, el método de Ronaghi adolece de la misma desventaja que los métodos tradicionales: el requisito de una etapa laboriosa de separación de cadenas y de aislamiento de las cadenas individuales antes de la secuenciación. Las desventajas del método de Ronaghi se incrementan geométricamente a medida que se incrementa el número de reacciones de secuenciación paralela. Por ejemplo, la secuenciación paralela de 1.000 moldes de doble cadena requeriría 1.000 separaciones y 2.000 aislamientos de cadenas individuales. Además, el método de Ronaghi, al igual que todos los métodos basados en la separación de cadenas, se limita a la determinación de secuencias a partir de dos cebadores (uno para cada cadena) por cada molde de doble cadena.

La secuenciación basada en el corte químico ha demostrado ser difícil de automatizar. Otros métodos de secuenciación son laboriosos debido a la necesidad de llevar a cabo una etapa de hibridación por cada esfuerzo de secuenciación. En muchas situaciones, la etapa de hibridación es la etapa limitante de la velocidad de una reacción de secuenciación.

Se han realizado intentos para llevar a cabo la secuenciación a partir de los dos extremos de un ácido nucleico, utilizando, por ejemplo, dos cebadores de secuenciación marcados diferentemente (por ejemplo Li-Cor, de Lincoln, Nebraska) en una reacción de secuenciación de Sanger (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:5463-5467, 1977). Estos métodos son variaciones de la secuenciación manual y requieren una etapa de fraccionamiento por tamaño (por ejemplo un gel) para determinar una secuencia. Aunque el fraccionamiento por tamaño puede resultar adecuado para tamaños de muestra reducidos, la secuenciación genómica que utilizase técnicas de fraccionamiento por tamaño requeriría 1.500.000 geles de fraccionamiento por tamaño (suponiendo una capacidad optimista de 2.000 pb por gel). Por estos motivos, los métodos de secuenciación que implican el fraccionamiento por tamaño no han sido adaptados para la secuenciación de genomas humanos.

Wiemarn et al., Analytical Biochemistry 234(2):166-174, 1996, páginas 166 a 174, describen una técnica "dúplex" de secuenciación del ADN que posibilita obtener simultáneamente dos secuencias independientes a partir de una reacción de secuenciación con la utilización de cebadores no marcados y el marcaje interno.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona un método de secuenciación de un ácido nucleico a partir de múltiples cebadores con una única etapa de hibridación de cebador. En este método, se hibridan dos o más cebadores de secuenciación al ADN molde que debe secuenciarse. El ADN molde puede ser de una cadena o de doble cadena desnaturalizado. A continuación, se bloquean todos los cebadores de secuenciación excepto uno. Se lleva a cabo nuevamente la secuenciación (por ejemplo la secuenciación a partir de pirofosfato) mediante elongación del cebador no bloqueado. Se deja que continúe la elongación hasta completarse (con polimerasa adicional y dNTPs, en caso necesario) o se termina (mediante polimerasa, ddNTPs y opcionalmente dNTPs); en cualquier caso impidiendo la elongación adicional del cebador no bloqueado. Se eliminan los reactivos de completado de cadena y/o de terminación. Seguidamente, se desbloquea uno de los cebadores bloqueados y se lleva a cabo la secuenciación pirofosfato mediante elongación del cebador nuevamente desbloqueado. Se continúa este procedimiento hasta desbloquear y secuenciar todos los cebadores de secuenciación. En una realización preferente, se utilizan dos cebadores (uno bloqueado y uno no bloqueado) para secuenciar ambos extremos de un ácido nucleico de doble cadena.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 ilustra un procedimiento ejemplar de secuenciación desde dos extremos;

Figura 2 ilustra los resultados de la demostración de la secuenciación desde los dos extremos en un aparato de pirosecuenciación de 454 Corp.;

Figura 3 ilustra los resultados del análisis de secuenciación desde los dos extremos, mostrando que se determina la secuencia de ambos extremos de un molde de ADN. SEC ID nº 6: atgcacatggttgacacagtggt; SEC ID nº 7: atgcacatggtt
gacacagtgg; SEC ID nº 8: atgccaccgacctagtctcaaactt;

Figura 4 ilustra una perla ejemplar de captura de ADN;

Figura 5 ilustra la encapsulación de una perla que comprende dos secuencias oligonucleótidas para la secuenciación de una doble cadena.

Figura 6 ilustra la PCR en fase solución y el procedimiento de direccionamiento a perla - una etapa en una realización preferente de la secuenciación desde dos extremos;

Figura 7 ilustra la rotura de emulsión y la recuperación de ADN molde amplificado en una perla - una etapa en una realización preferente de secuenciación desde dos extremos;

Figura 8 es una representación esquemática de un método preferente de secuenciación desde los dos extremos;

Figura 9 ilustra los resultados de la secuenciación de un genoma de Staphylococcus aureus;

Figura 10 ilustra las longitudes de lectura medias en un experimento que implicaba la secuenciación desde los dos extremos;

Figura 11 ilustra el número de pocillos para cada tramo del genoma en un experimento de secuenciación desde los dos extremos; y

Figura 12 ilustra un resultado y cadena de alineación típicos de un procedimiento de secuenciación desde los dos extremos. Las secuencias, mostradas en orden, de arriba a abajo, son: SEC ID nº 9 a SEC ID nº 22.

Descripción detallada de la invención y exposición

Tradicionalmente, la secuenciación de dos extremos de una molécula de ADN de doble cadena requeriría como mínimo la hibridación de cebador, la secuenciación de un extremo, la hibridación de un segundo cebador y la secuenciación del otro extremo. El método alternativo es separar las cadenas individuales del ácido nucleico de doble cadena y secuenciar individualmente cada cadena. La presente invención proporciona una tercera alternativa que es más rápida y menos laboriosa que los primeros dos métodos.

La presente invención proporciona un método de secuenciación de una molécula de ácidos nucleicos según se define posteriormente en las reivindicaciones. La presente invención también proporciona un método para determinar un haplotipo molecular de una muestra de ADN en múltiples locus, según se define posteriormente en las reivindicaciones. La invención según se define posteriormente en las reivindicaciones se describe, así como otros métodos que forman parte de la exposición.

La presente invención y la presente exposición proporcionan un método de secuenciación secuencial de ácidos nucleicos a partir de múltiples cebadores. Las referencias a la secuenciación del ADN en la presente solicitud se refieren a la secuenciación utilizando una polimerasa en la que la secuencia se determina a medida que se incorporan nucleótidos trifosfato (NTPs) en la cadena en crecimiento de un cebador de secuenciación. Un ejemplo de este tipo de secuenciación es el método de pirosecuenciación de detección de pirofosfatos (ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.274.320, nº 6.258.568 y nº 6.210.891).

En una realización, se proporciona un método de secuenciación de dos extremos de un ácido nucleico molde de doble cadena. El ADN de doble cadena comprende dos ADNs de una cadena, denominados en la presente memoria primer ADN de una cadena y segundo ADN de una cadena. Se hibrida un primer cebador con el primer ADN de una cadena y se hibrida un segundo cebador con el segundo ADN de una cadena. El primer cebador no se encuentra bloqueado, mientras que el segundo cebador se encuentra bloqueado.

Las expresiones "bloqueado" o "cebador bloqueado" se definen en la presente exposición como cualquier cebador en el que se ha impedido la elongación que realizaría una polimerasa. El bloqueo puede ser con un grupo de bloqueo químico que impida que un cebador sea polimerizado por la ADN polimerasa. Además, el bloqueo con un grupo químico debería ser reversible, de manera que, tras la reversión, el oligonucleótido nuevamente pueda servir como cebador de secuenciación. De esta manera, "bloqueo" significa lo mismo que "bloqueado", "bloqueado" significa lo mismo que "protegido", y "desbloqueado" significa lo mismo que "desbloqueo".

Los términos "protección", "protegido", "bloqueo" y "bloqueado" se definen en la presente exposición como la adición de un grupo químico a sitios reactivos en el cebador que evitan la polimerización de un cebador por parte de la ADN polimerasa. Además, la adición de dichos grupos químicos protectores debería ser reversible, de manera que, tras la reversión, el cebador ahora desprotegido nuevamente es capaz de servir como cebador de secuenciación. La secuencia de ácidos nucleicos se determina en una dirección (por ejemplo desde un extremo del molde) mediante elongación del primer cebador con ADN polimerasa utilizando métodos convencionales, tales como la secuenciación de pirofosfato. A continuación, se desprotege el segundo cebador y se determina la secuencia mediante elongación del segundo cebador en la otra dirección (por ejemplo desde el otro extremo del molde) utilizando ADN polimerasa y métodos convencionales, tales como la secuenciación de pirofosfato. Las secuencias del primer y segundo cebadores están diseñadas específicamente para hibridarse con los dos extremos del ADN de doble cadena o en cualquier localización a lo largo del molde en este método.

Además de la definición anterior, la protección y el bloqueo también pueden ser extrínsecos al cebador. Por ejemplo, puede unirse un anticuerpo u otra proteína a un sitio cadena abajo (por ejemplo una proteína de unión a ADN específica de una secuencia) para crear un cebador bloqueado, aunque el cebador no sea químicamente diferente a un cebador no bloqueado. Por ejemplo, el bloqueo y la protección pueden estar mediados por una proteína de unión a ADN que se una cadena abajo de un ácido nucleico cebador e impida la elongación. En este caso, el cebador se considera bloqueado o protegido. Además, en el caso de que la proteína de unión a ADN pueda ser desplazada, el cebador se considera que se encuentra bloqueado o protegido reversiblemente. Una proteína de unión a ADN es cualquier proteína de unión a ADN sintética o natural o equivalente funcional de la misma.

En otra realización se proporciona un método de secuenciación de un ácido nucleico a partir de múltiples cebadores. En este método, se hibridan varios cebadores de secuenciación con el ácido nucleico molde que debe secuenciarse. Todos los cebadores de secuenciación se encuentran reversiblemente bloqueados excepto uno. Un cebador bloqueado es un cebador oligonucleótido que no puede extenderse con una polimerasa y dNTPs utilizados comúnmente en las reacciones de secuenciación de ADN. Un cebador reversiblemente bloqueado es un cebador bloqueado que puede desbloquearse. Todos los cebadores bloqueados a los que se hace referencia en la presente invención se encuentran reversiblemente bloqueados. Tras el desbloqueo, un cebador reversiblemente bloqueado funciona como un cebador de secuenciación normal y es capaz de participar en una reacción de secuenciación normal.

Se proporciona un método de secuenciación secuencial de un ácido nucleico a partir de múltiples cebadores. El método comprende las etapas siguientes: en primer lugar, se proporciona uno o más ácidos nucleicos de molde que deben secuenciarse. En segundo lugar, se hibrida una pluralidad de cebadores de secuenciación con el ácido o ácidos nucleicos de molde. El número de cebadores de secuenciación puede representarse con el número n, en donde n puede ser cualquier número positivo superior a 1. Ese número puede ser, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó superior. De entre los cebadores un número n-1 puede encontrarse bloqueado con un grupo bloqueante. Por lo tanto, por ejemplo, en el caso de que n sea 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, n-1 sería 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, respectivamente. El cebador remanente (por ejemplo un número n de cebadores - un número (n-1) de cebadores bloqueados= un cebador remanente) no se encuentra bloqueado. En tercer lugar, el cebador no bloqueado se extiende y se determina la secuencia del ADN molde mediante métodos convencionales, tales como, por ejemplo, la secuenciación pirofosfato. En cuarto lugar, tras la secuenciación del primer cebador, se desbloquea uno de los cebadores bloqueados restantes. En quinto lugar, se extiende un cebador desbloqueado y se determina la secuencia del ADN molde mediante métodos convencionales, tales como, por ejemplo, la secuenciación pirofosfato. Opcionalmente puede repetirse el método hasta llevar a cabo la secuenciación a partir de todos los cebadores bloqueados.

En otro aspecto, se proporciona un método de secuenciación secuencial de un ácido nucleico, que comprende las etapas siguientes: (a) hibridar 2 ó más cebadores de secuenciación con el ácido nucleico, en el que todos los cebadores excepto uno se encuentran reversiblemente bloqueados, (b) determinar una secuencia de una cadena del ácido nucleico mediante elongación con polimerasa a partir del cebador no bloqueado, (c) desbloquear uno de los cebadores reversiblemente bloqueados formando un cebador desbloqueado, (d) repetir las etapas (b) y (c) hasta el desbloqueo de todos los cebadores reversiblemente bloqueados y su utilización para determinar una secuencia. En una realización, el presente método comprende una etapa adicional entre las etapas (b) y (c), es decir, la etapa de terminar la elongación del cebador desbloqueado mediante la puesta en contacto del cebador desbloqueado con ADN polimerasa y uno o más nucleótidos trifosfato o dideoxinucleótido trifosfatos. En todavía otra realización, el presente método comprende además una etapa adicional entre dichas etapas (b) y (c), es decir, terminar la elongación del cebador desbloqueado mediante la puesta en contacto del cebador desbloqueado con ADN polimerasa y un dideoxinucleótido trifosfato de entre ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP o una combinación de los mismos.

En otro aspecto, se proporciona un método de secuenciación de un ácido nucleico, que comprende:

(a) hibridar un primer cebador no bloqueado con una primera cadena del ácido nucleico, (b) hibridar un segundo cebador bloqueado con una segunda cadena, (c) exponer la primera y segunda cadenas a polimerasa, de manera que el primer cebador no bloqueado se extienda a lo largo de la primera cadena, (d) bloquear la elongación adicional del primer cebador de secuenciación (a lo que también se hace referencia como completar la extensión del primer cebador de secuenciación), (e) desbloquear el segundo cebador de secuenciación, y (f) exponer la primera y segunda cadenas a polimerasa de manera que se extienda el segundo cebador de secuenciación a lo largo de la segunda cadena. Puede bloquearse la elongación adicional (es decir, puede completarse la elongación) mediante cualquier medio adecuado, incluyendo el permitir que caiga el cebador o la adición de una caperuza al cebador (por ejemplo con ddNTPs o por medios químicos). En una realización preferente, bloquear la elongación adicional o el completado comprende la adición de caperuza o la terminación de la elongación.

En otra realización, se proporciona un método de secuenciación de dos extremos de un ácido nucleico molde de doble cadena que comprende una primer y un segundo ADN de una cadena. En la presente realización, se hibrida un primer cebador con el primer ADN de una cadena y se hibrida un segundo cebador con el segundo ADN de una cadena en la misma etapa. El primer cebador no se encuentra bloqueado, mientras que el segundo cebador se encuentra bloqueado.

Tras la hibridación, se determina la secuencia del ácido nucleico en una dirección (por ejemplo desde un extremo del molde) mediante elongación del primer cebador con ADN polimerasa utilizando métodos convencionales, tales como la secuenciación pirofosfato. En una realización preferente, la polimerasa no presenta actividad exonucleasa 3' a 5'. Seguidamente se desbloquea el segundo cebador, y se determina su secuencia mediante elongación del segundo cebador en la otra dirección (por ejemplo desde el otro extremo del molde) con ADN polimerasa utilizando métodos convencionales, tales como la secuenciación pirofosfato. Tal como se ha indicado anteriormente, las secuencias del primer y segundo cebadores están diseñadas para hibridarse a los dos extremos del ADN de doble cadena o en cualquier localización a lo largo del molde. Esta técnica resulta especialmente útil para la secuenciación de muchos ADNs de molde que contienen sitios únicos de hibridación de cebador de secuenciación en los dos extremos. Por ejemplo, muchos vectores de clonación son provistos de sitios únicos de hibridación de cebador de secuenciación flanqueando el sitio de inserción para facilitar la posterior secuenciación de cualquier secuencia clonada (por ejemplo Bluescript, Stratagene, La Jolla, CA).

Un beneficio de dicho método es que ambos cebadores pueden hibridarse en una única etapa. Los beneficios de este método y de otros métodos resultan especialmente útiles en sistemas de secuenciación en paralelo, en los que las hibridaciones son más complicadas de lo normal. Se dan a conocer ejemplos de sistemas de secuenciación paralela en la solicitud copendiente de patente US nº de serie 10/104, 280, publicada como la solicitud de patente número 2003/0068629.

Los oligonucleótidos cebadores utilizados en los métodos descritos en la presente memoria pueden sintetizarse mediante tecnología convencional, por ejemplo con un sintetizador comercial de oligonucleótidos y/o mediante ligación entre sí de subfragmentos que han sido sintetizados de esta manera.

En otra realización, puede determinarse la longitud del ácido nucleico molde de doble cadena. Los métodos para determinar la longitud de un ácido nucleico de doble cadena son conocidos de la técnica. La determinación de la longitud puede llevarse a cabo antes o después de la secuenciación del ácido nucleico. Entre los métodos conocidos de determinación de la longitud de la molécula de ácido nucleico se incluyen la electroforesis en gel, la electroforesis en gel de campo pulsado, la espectrometría de masas y similares. Debido a que un ácido nucleico de doble cadena de extremos romos comprende dos cadenas individuales de longitud idéntica, la determinación de la longitud de una cadena de un ácido nucleico resulta suficiente para determinar la longitud de la doble cadena correspondiente.

La reacción de secuenciación según la presente invención también permite determinar la longitud del ácido nucleico molde. En primer lugar, una secuencia completa de un extremo del ácido nucleico hasta el otro extremo permitirá determinar la longitud. En segundo lugar, la determinación de la secuencia de los dos extremos puede solaparse en la parte intermedia, permitiendo unir las dos secuencias. La secuencia completa puede determinarse y obtenerse la longitud. Por ejemplo, en el caso de que el molde presente una longitud de 100 pb, la secuenciación desde un extremo puede determinar las bases 1 a 75; la secuenciación desde el otro extremo puede determinar las bases 25 a 100; de esta manera existe un solapamiento de 51 bases en la parte intermedia entre las bases 25 y 75, y a partir de esta información, puede determinarse la secuencia completa entre 1 y 100 y obtenerse la longitud, de 100 bases, a partir de la secuencia completa.

Otro método comprende las etapas siguientes. En primer lugar, una pluralidad de cebadores de secuenciación, presentando cada uno una secuencia diferente, se hibrida con un ADN que debe secuenciarse. El número de cebadores de secuenciación puede ser cualquier valor superior a uno, tal como, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó más. Todos estos cebadores se encuentran reversiblemente bloqueados excepto uno. Este cebador no bloqueado se elonga en una reacción posterior y se determina la secuencia. Habitualmente, tras elongarse por completo un cebador, no puede extenderse y no afectará a la secuenciación posterior a partir de otro cebador. Si se desea, el cebador secuenciado puede terminarse utilizando un exceso de polimerasa y dNTPs, o utilizando ddNTPs. En el caso de que se realiza una etapa de terminación, los reactivos de terminación (dNTPs y ddNTPs) deben eliminarse tras la etapa. A continuación, se desbloquea uno de los cebadores reversiblemente bloqueados y se produce la secuenciación a partir del segundo cebador. Las etapas de desbloqueo de un cebador, la secuenciación a partir del cebador desbloqueado y, opcionalmente, la terminación de la secuenciación a partir del cebador se repiten hasta el desbloqueo de todos los cebadores bloqueados y su utilización en la secuenciación.

Los cebadores reversiblemente bloqueados deberían bloquearse con diferentes grupos químicos. Mediante la elección del método apropiado de desbloqueo, puede desbloquearse un cebador sin afectar a los grupos bloqueantes de los demás cebadores. En una realización preferente, el grupo bloqueante es PO_{4}. Es decir, el segundo cebador se bloquea con PO_{4} y el desbloqueo se lleva a cabo con la polinucleótido quinasa de T4 (utilizando su actividad de 3'-fosfatasa) o fosfatasa alcalina intestinal bovina (CLAP) o cualquier fosfatasa adecuada. En otra realización preferente, el bloqueante es un grupo tiol o un grupo fosforotiol.

El ácido nucleico molde puede ser un ADN, ARN o ácido nucleico péptido (APN). Aunque el ADN es el molde preferente, puede convertirse el ARN y el APN en ADN mediante técnicas conocidas, tales como la PCR con cebadores aleatorios, la transcripción inversa, la RT-PCR o cualquier combinación de estas técnicas. Además, los métodos de la invención resultan útiles para secuenciar ácidos nucleicos de secuencia desconocida y conocida. La secuenciación de un ácido nucleico de secuencia conocida resultaría útil, por ejemplo, para confirmar la secuencia del ADN sintetizado o para confirmar la identidad del patógeno sospechado con una secuencia de ácidos nucleicos conocida. Los ácidos nucleicos pueden ser una mezcla de más de una población de ácidos nucleicos. Es conocido que un cebador de secuenciación con suficiente especificidad (por ejemplo 20 bases, 25 bases, 30 bases, 35 bases, 40 bases, 45 bases o 50 bases) puede utilizarse para secuenciar un subconjunto de secuencias en un ácido nucleico largo o en una población de ácidos nucleicos no relacionados. De esta manera, por ejemplo, el molde puede ser una secuencia de 10 Kb o diez secuencias de 1 Kb cada una. En una realización preferente, el ADN molde presenta una longitud de entre 50 pb y 700 pb. El ADN puede ser de una cadena o de doble cadena.

En el caso de que el ácido nucleico molde sea de una cadena, pueden hibridarse varios cebadores con el ácido nucleico molde, tal como se muestra a continuación:

1

En el presente caso, resulta preferente que el cebador no bloqueado inicial sea el cebador que se hibrida en el extremo más 5' del molde. Ver el cebador 1 en la ilustración anterior. En esta orientación, la elongación del cebador 1 no desplazaría (mediante desplazamiento de cadena) el cebador 2, 3 ó 4. Tras finalizar la secuenciación desde el cebador 1, puede desbloquearse el cebador 2 e iniciarse la secuenciación del ácido nucleico. La secuenciación a partir del cebador 2 puede desplazar el cebador 1 o la versión elongada del cebador uno, pero no presentará ningún efecto sobre los cebadores bloqueados restantes (cebadores 3 y 4). Utilizando este orden, puede utilizarse cada cebador secuencialmente y una reacción de secuenciación a partir de un cebador que no afectaría a la secuenciación a partir de un cebador posterior.

Una característica de la invención es la capacidad de utilizar múltiples cebadores de secuenciación en uno o más ácidos nucleicos y la capacidad de secuenciar a partir de múltiples cebadores utilizando únicamente una etapa de hibridación. En la etapa de hibridación, pueden hibridarse todos los cebadores de secuenciación (por ejemplo el número n de cebadores de secuenciación) con el ácido o ácidos nucleicos molde simultáneamente. En la secuenciación convencional, habitualmente resulta necesaria una etapa de hibridación para la secuenciación a partir de un cebador. Una característica de la invención es que la secuenciación a partir de n cebadores (tal como se ha definido anteriormente) puede llevarse a cabo mediante una única etapa de hibridación. Esto elimina efectivamente n-1 etapas de hibridación.

En una realización preferente, las secuencias de los n cebadores son suficientemente diferentes para que los cebadores no se hibriden cruzadamente o se autohibriden. La hibridación cruzada se refiere a la hibridación de un cebador con otro cebador debido a la complementariedad de secuencias. Una forma de hibridación cruzada se denomina comúnmente "cebador dímero". En el caso de un cebador dímero, los extremos 3' de los dos cebadores son complementarios y forman una estructura que, al elongarse, es aproximadamente la suma de la longitud de los dos cebadores. La autohibridación se refiere a la situación en la que el extremo 5' de un cebador es complementario al extremo 3' del cebador. En este caso, el cebador presenta una tendencia a autohibridarse para formar una estructura similar a una horquilla.

Un cebador puede interaccionar o asociarse específicamente con la molécula de molde. Los términos "interaccionar" o "asociarse" se refieren en la presente memoria a que dos sustancias o compuestos (por ejemplo cebador y molde, grupo químico y nucleótido) se unen (por ejemplo se enlazan, se unen, se hibridan, se juntan, se unen covalentemente o se asocian de otra manera) entre sí suficientemente para que el ensayo pretendido pueda llevarse a cabo. Los términos "específico" o "específicamente" se refieren en la presente memoria a que dos componentes se unen selectivamente entre sí. Los parámetros requeridos para conseguir interacciones específicas pueden determinarse rutinariamente, por ejemplo utilizando métodos convencionales de la técnica.

Para obtener más sensibilidad o para ayudar en el análisis de mezclas complejas, los cebadores bloqueados pueden modificarse (por ejemplo derivatizarse) con grupos químicos diseñados para proporcionar señales únicas claras. Por ejemplo, cada cebador bloqueado puede derivatizarse con un aminoácido natural o sintético diferente unido mediante un enlace amida a la cadena oligonucleótida en una o más posiciones a lo largo de la parte hibridante de la cadena. La modificación química puede detectarse, evidentemente, después de escindirse del ácido nucleico diana, o mientras se encuentra asociada al ácido nucleico diana. Permitiendo que cada ácido nucleico diana bloqueado se identifique de una manera distinguible resulta posible someter a ensayo (por ejemplo para el cribado) un gran número de diferentes ácidos nucleicos diana en un único ensayo. Pueden llevarse a cabo muchos ensayos de este tipo de manera rápida y fácil. Este tipo de ensayo o conjunto de ensayos puede llevarse a cabo, por lo tanto, con eficiencia de alto rendimiento según se define en la presente invención.

En los métodos de la exposición, tras elongarse un primer cebador y determinarse la secuencia del ADN molde, se desbloquea y se secuencia un segundo cebador. No se produce interferencia entre la reacción de secuenciación del primer cebador y la reacción de secuenciación del segundo, ahora desbloqueado, cebador, debido a que el primer cebador se ha elongado completamente o se ha terminado. Debido a que el primer cebador se ha elongado por completo, la secuenciación a partir del segundo cebador, utilizando métodos convencionales tales como la secuenciación pirofosfato, no resultará afectada por la presencia del primer cebador elongado. La exposición también proporciona un método para reducir cualquier posible señal contaminante del primer cebador. La contaminación de las señales se refiere a las incidencias en las que el primer cebador no se ha elongado por completo. En este caso, el primer cebador continuará elongándose al desbloquear y elongar un cebador posterior. La elongación de tanto el primer como segundo cebadores podría interferir con la determinación de la secuencia del ADN.

En una realización preferente, la reacción de secuenciación (por ejemplo la reacción de elongación de cadena) a partir de un cebador en primer lugar se termina o se completa antes de iniciar una reacción de secuenciación en un segundo cebador. Una reacción de elongación de cadena de ADN puede terminarse mediante la puesta en contacto del ADN molde con ADN polimerasa y dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs), tales como ddATP, ddTTP, ddGTP y ddCTP. Tras la terminación, los dideoxinucleótidos trifosfato pueden eliminarse mediante lavado de la reacción con una solución sin ddNTPs. Un segundo método para bloquear la elongación adicional de un cebador es añadir nucleótidos trifosfato (dNTPs, tales como dATP, dTTP, dGTP y dCTP) y ADN polimerasa a una reacción para extender por completo cualquier cebador no completamente extendido. Tras completarse la extensión, los dNTPs y las polimerasas se eliminan antes de desbloquear el siguiente cebador. Mediante el completado o terminación de un cebador antes de desbloquear otro cebador, puede mejorarse la relación señal-ruido de la reacción de secuenciación (por ejemplo la secuenciación pirofosfato). Un tercer método puede implicar enzimas, proteínas u otros agentes que puedan reconocer una región de doble cadena >25 bases y cortar en la parte no extendida de la región de una cadena.

Las etapas de: (a) opcionalmente terminar o completar la secuenciación, (b) desbloquear un nuevo cebador, y (c) secuenciar a partir del cebador desbloqueado pueden repetirse hasta determinar una secuencia a partir de la elongación de cada cebador. En este método, la etapa de hibridación comprende "n" cebadores y un cebador no bloqueado. El cebador no bloqueado se secuencia en primer lugar y las etapas (a), (b) y (c) anteriormente indicadas pueden repetirse.

En una realización preferente, se utiliza la secuenciación pirofosfato para todas las secuenciaciones realizadas de acuerdo con el método de la presente exposición.

En otra realización preferente, la secuenciación desde los dos extremos se lleva a cabo según el procedimiento descrito de manera general en la figura 1. Este procedimiento puede dividirse en seis etapas: (1) creación de una perla de captura (figuras 1A y B), (2) amplificación mediante PCR en emulsión (figura 1C), (3) hibridación de cebadores bloqueados y desbloqueados (figura 1D), (4) secuenciación de la primera cadena mediante extensión del cebador desbloqueado (por ejemplo mediante secuenciación pirofosfato) (figura 1E), (4A) terminación/completado opcional de la secuenciación a partir de la primera cadena (figura 1E), seguido de la extracción de los reactivos de terminación/completado (figura 1F), (5) preparación de la segunda cadena mediante desbloqueo de un cebador previamente bloqueado (figuras 1H), (6) secuenciación de la segunda cadena mediante la adición de polimerasa (figuras 11) y secuenciación mediante elongación del cebador desbloqueado (figura 1J). Los datos recogidos de la secuenciación de ambas cadenas se muestran en la figura 2. Estos datos se analizaron adicionalmente para proporcionar los datos de secuencia en la figura 3.

En la etapa 1, se acopló una perla de captura activada con N-hidroxisuccinimida (NHS) (por ejemplo Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) (figura 1A, figura 4) a dos cebadores diferentes mediante un grupo marcado con 5'-amina. Los dos cebadores corresponden al extremo 5' de la cadena sentido (cebador de captura directo) y antisentido (cebador de captura inverso) del molde que debe amplificarse (figura 1B). Lo anterior resultaría en una perla con ambos cebadores de captura en la orientación 5' a 3'. Estos cebadores son 40-meros y consisten de dos partes: un cebador de PCR de 20 bases unido a un cebador de secuenciación de 20 bases. Los cebadores de PCR 20-meros se utilizan para la amplificación mediante PCR y los cebadores de secuenciación 20-meros se utilizan para derivar información de secuencia de moléculas de ADN extendidas a partir de los cebadores de captura de ADN. El acoplamiento a NHS forma un enlace amida químicamente estable con ligandos que contienen grupos de amina primaria. Además, puede acoplarse biotina a la perla de captura además de utilizar biotina marcada en la amina. El grupo biotina proporciona un mecanismo útil para la unión de reactivos de secuenciación adicionales (por ejemplo reactivos de secuenciación pirofosfato) a la perla. Las perlas (es decir, los soportes sólidos de captura de ácidos nucleicos) utilizados en la presente invención pueden ser de cualquier tamaño conveniente y fabricarse a partir de cualquier número de materiales conocidos.

Entre los ejemplos de dichos materiales se incluyen: compuestos inorgánicos, polímeros naturales y polímeros sintéticos. Entre los ejemplos específicos de estos materiales se incluyen: celulosa, derivados de celulosa, resinas acrílicas, vidrio, geles de sílice, poliestireno, gelatina, polivinilpirrolidona, copolímeros de vinilo y acrilamida, poliestireno entrecruzado con divinilbenceno o similar (ver Merrifield, Biochemistry 3:1385-1390, 1964), poliacrilamidas, geles de látex, poliestireno, dextrano, caucho, silicona, plásticos, nitrocelulosa, celulosas, esponjas naturales, geles de sílice, vidrio, metales plásticos, celulosa, dextranos entrecruzados (por ejemplo Sephadex^{TM}) y gel de agarosa (Sepharose^{TM}) y soportes de fase sólida conocidos por el experto en la materia. En una realización preferente, las perlas de captura son perlas de sefarosa de diámetro comprendido entre aproximadamente 25 y 30 \mum.

El ácido nucleico molde puede unirse a la perla de captura de cualquier manera conocida de la técnica. Existen numerosos métodos en la técnica para unir el ADN a una perla microscópica. La unión química covalente del ADN a la perla puede conseguirse mediante la utilización de agentes acoplantes estándares, tales como carbodiimida soluble en agua, para unir el fosfato 5' en el ADN a microesferas recubiertas de amina mediante un enlace fosfoamidato. Otra alternativa es acoplar en primer lugar línkers oligonucleótidos específicos a la perla utilizando una reacción química similar, y después utilizar ADN ligasa para unir el ADN al línker en la perla. Entre otras químicas de unión se incluyen la utilización de N-hidroxisuccinamida (NHS) y derivados de la misma, para unir el oligonucleótido a las perlas. En este método, un extremo del oligonucleótido puede contener un grupo reactivo (tal como un grupo amida) que forma un enlace covalente con el soporte sólido, mientras que el otro extremo del línker contiene otro grupo reactivo que puede unirse con el oligonucleótido que debe inmovilizarse. En una realización preferente, el oligonucleótido se une a la perla de captura de ADN mediante enlace covalente. Sin embargo, los enlaces no covalentes, tales como la quelación o los complejos de antígeno-anticuerpo, pueden utilizarse para unir el oligonucleótido a la perla.

Pueden utilizarse línkers oligonucleótidos que se hibridan específicamente a secuencias únicas en el extremo del fragmento de ADN, tal como el extremo solapante de un sitio de enzima de restricción o los "extremos cohesivos" de los vectores de clonación basados en el bacteriófago lambda, aunque las ligaciones de extremos romos también pueden utilizarse beneficiosamente. Estos métodos se describen en detalle en la patente US nº 5.674.743. Resulta preferente que en cualquier método utilizado para inmovilizar las perlas se continúe uniendo el oligonucleótido inmovilizado durante todas las etapas en los métodos de la invención. En una realización preferente, el oligonucleótido se une a la perla de captura de ADN mediante enlace covalente. Sin embargo, los enlaces no covalentes, tales como la quelación o los complejos de antígeno-anticuerpo, pueden utilizarse para unir el oligonucleótido a la perla.

En la etapa 2, se añade el ADN molde que presenta los cebadores directos e inversos como adaptadores y el ADN se amplifica mediante una estrategia de amplificación mediante PCR (figura 1C). En una realización, el ADN molde presenta un ADN adaptador ligado tanto en el extremo 5' como en el extremo 3'. Los adaptadores son 40-meros que contienen en tándem en una sola unidad las secuencias para la amplificación por PCR y la secuenciación. Se unen dos adaptadores diferentes a los extremos del ADN molde como parte del procedimiento de preparación de las muestras. En una realización, el ADN se amplifica mediante reacción en cadena de la polimerasa en emulsión, reacción en cadena de polimerasa dirigida a perlas, amplificación por círculo rodante o amplificación isotérmica mediante bucles. En una realización preferente, el ADN molde con adaptadores se añade de manera que una cadena de la molécula de ADN se hibride con uno de los cebadores en la perla de captura de ADN (contiene millones de cebadores de captura directos e inversos en la orientación 5' a 3'). Las perlas de captura de ADN seguidamente se resuspenden en una mezcla de reacción de PCR, que contiene los cebadores directos e inversos, se emulsiona y después se amplifica. La reacción de amplificación también consiste de dos etapas: a) cebadores de amplificación por PCR en fase solución que ayudan a amplificar el ADN molde a partir de una única molécula, y b) etapa de dirección a perla para capturar las moléculas de ADN amplificadas en la perla. En todas las situaciones, la cadena capturada sirve como molde para la extensión del cebador de captura. Debido a que los cebadores de captura se encuentran unidos covalentemente a las perlas, la cadena extendida a partir del cebador de captura también se encuentra covalentemente unida a las perlas. Un aspecto importante de este procedimiento es la orientación de las dos cadenas. Los dos cebadores de captura contienen secuencias que corresponden a los cebadores directos e inversos. Debido a que los dos cebadores de captura pueden hibridarse con dos cadenas separadas aunque complementarias del ADN, las perlas de captura contienen ambas cadenas del ADN molde. Además, debido a que los cebadores de captura se encuentran inmovilizados en el extremo 5', las dos cadenas se inmovilizan en la dirección 5' a 3'. Tras la amplificación, cada cebador de captura contiene una cadena inmovilizada y una cadena complementaria. A continuación, se agrupan las perlas y se tratan con álcali para liberar la cadena no inmovilizada. Las perlas ahora contienen un molde monocatenario que se encuentra listo para la secuenciación.

En la etapa 3, se añaden enzimas y reactivos de secuenciación a la reacción para facilitar la secuenciación mediante elongación del cebador (figura 1E). En una realización preferente, se suministran sulfurilasa y luciferasa (enzimas de secuenciación pirofosfato) en forma inmovilizada en una perla separada o acopladas a la perla de ADN mediante interacción biotina-estreptavidina. La adición de enzimas auxiliares durante un método de secuenciación ha sido dada a conocer en U.S.S.N. nº 10/104.280, publicada como la solicitud de patente US nº 2003/0068629.

En la etapa 4, se secuencia la primera cadena del ADN mediante elongación de un cebador no bloqueado. El método de secuenciación puede ser cualquier método conocido por el experto ordinario en la materia (por ejemplo la secuenciación pirofosfato) (figura 1E). En una realización preferente, las perlas de captura se cargan en una placa PicoTiter (PTP) y se secuencian automáticamente mediante secuenciación pirofosfato. En algunos casos, la secuencia de ácidos nucleicos que debe determinarse se encuentra próxima al extremo de un ADN molde. En este caso, la elongación del cebador de secuenciación se terminará naturalmente al alcanzar la polimerasa el final del ADN. En la mayoría de casos, el cebador de secuenciación no se encuentra próximo al extremo del ADN molde y tras determinar suficiente información a partir de la reacción de secuenciación, se termina la secuenciación mediante completado o terminación de la reacción de secuenciación.

La figura 1F muestra un método preferente para terminar la reacción de secuenciación mediante la adición de ddNTPs a la reacción. En la etapa 5, se prepara la segunda cadena del ácido nucleico mediante la adición de apirasa para eliminar los ddNTPs (figura 1G) y la polinucleótido quinasa (PNK), o fosfatasa alcalina intestinal bovina u otros enzimas capaces de eliminar el grupo 3' fosfato de la cadena del cebador bloqueado (figura 1H).

En la etapa 6, seguidamente se añade polimerasa para cebar la segunda cadena (figura 1I), seguido de la secuenciación de la segunda cadena según un método estándar conocido por el experto ordinario en la materia (fig. 1J). En la etapa 7, la secuencia tanto de la primera como de la segunda cadenas se analizan de manera que se determina una secuencia de ADN contiguo (figura 2).

Los métodos de la invención pueden llevarse a cabo a cualquier escala. Por ejemplo, puede utilizarse una única perla para la secuenciación en una probeta. En una realización preferente, se llevan a cabo los métodos de secuenciación en paralelo mediante la carga de las perlas sobre obleas. Se define una oblea como un sustrato con sitios posicionalmente definidos sobre la que puede inmovilizarse una pluralidad de perlas durante un periodo de tiempo suficientemente prolongado para que pueda llevarse a cabo una reacción de secuenciación en un ácido nucleico unido a la perla. Una oblea permite la secuenciación de dobles cadenas en paralelo a partir de una pluralidad de perlas. El diseño de las obleas (también denominadas placas PicoTiter y FORA) ha sido dado a conocer en los documentos USSN nº 10/104.280 y nº 09/14.338 (publicados como solicitudes de patente US nº 2003/0068629 y nº 7.244.559, respectivamente) y la patente US nº 6.274.320, publicada el 14 de agosto de 2001.

En un aspecto, la invención comprende un método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico, que comprende las etapas de: a) hibridar dos o más cebadores de secuenciación a una cadena o a una pluralidad de cadenas de la molécula de ácido nucleico, en la que todos los cebadores excepto uno son cebadores reversiblemente bloqueados, b) incorporar por lo menos una base en la molécula de ácido nucleico mediante elongación por la polimerasa a partir de un cebador no bloqueado, c) bloquear la elongación adicional del cebador no bloqueado, d) desbloquear uno de los cebadores reversiblemente bloqueados para formar un cebador desbloqueado, y e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que por lo menos uno de los cebadores reversiblemente bloqueados haya sido desbloqueado y utilizado para determinar una secuencia mediante secuenciación pirofosfato.

Para la utilización con dicho método, la etapa (c) de bloquear la elongación adicional puede comprender: i) completar la elongación a partir del cebador no bloqueado con polimerasa y dNTPs, o ii) terminar la elongación con polimerasa en un tampón que contenga manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o iii) terminar la elongación químicamente. El método puede comprender además la etapa de eliminar la polimerasa, los dNTPs y ddNTPs antes de la etapa (d).

En dicho método, puede bloquearse por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado con un grupo químico seleccionado de entre el grupo que consiste de un grupo PO_{4}, un grupo tio y un grupo fosforotiol. Además, por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado puede incluir un extremo 3' desapareado que puede desbloquearse mediante la puesta en contacto del cebador con una exonucleasa. Por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado puede incluir una o más bases no complementarias que forman un bucle y no se hibridan con la molécula de ácido nucleico, en la que la base o bases no se encuentran en el extremo 5' o 3' del cebador reversiblemente bloqueado, y en el que el cebador reversiblemente bloqueado comprende un dideoxinucleótido en su extremo 3'. Además, por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado se desbloquea mediante digestión de endonucleasas de la base o bases no complementarias que forman una muesca en la base o bases no complementarias.

Según dicho método, la etapa (b) puede incluir la elongación por la polimerasa desde el corte mediante una polimerasa con capacidad de desplazamiento de cadena. Además, por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado puede comprender una secuencia de 5'-NUX-3', en la que N representa una secuencia oligonucleótida de cualquier longitud, U es uracilo y X es un dideoxinucleótido. El cebador reversiblemente bloqueado puede desbloquearse con uracilo ADN glucosilasa y AP endonucleasa, generando un cebador desbloqueado con un extremo 3' extensible. Alternativamente, por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado puede comprender una secuencia de 5'-NYZ-3', en la que N representa una secuencia oligonucleótida de cualquier longitud, es un nucleótido modificado y representa una única base de nucleótido, y en la que el nucleótido modificado puede desbloquearse con formamidopirimidina (fapy)-ADN glucosilasa.

Esta base modificada puede ser, por ejemplo, 8-oxoguanina, 8-oxoadenina, fapy-guanina, metil-fapyguanina, fapy-adenina, aflatoxina B_{1}-fapy-guanina, 5-hidroxicitosina y 5-hidroxiuracilo.

A título de ejemplos, la molécula de ácido nucleico utilizada con dicho método puede ser ADN genómico, ADNc o ADN episómico y puede presentar una longitud de entre 100 y 1.000 pb. Además, por lo menos una cadena de la molécula de ácido nucleico o de los cebadores puede unirse a un soporte sólido.

Preferentemente se inmoviliza por lo menos un cebador en un soporte sólido, formando un cebador inmovilizado, y se une por lo menos una cadena a un soporte sólido mediante hibridación con el cebador inmovilizado. El soporte sólido puede ser un soporte sólido móvil esférico. En algunos casos por lo menos un cebador comprende un marcaje detectable. Además, por lo menos un cebador de secuenciación puede hibridarse con una cadena sentido del ácido nucleico y por lo menos un cebador de secuenciación se hibrida con una cadena antisentido de la molécula de ácido nucleico en la etapa (a).

Según dicho método, la elongación por la polimerasa puede ser de entre 1 y 250 bases. El método puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un recipiente de reacción tal como una probeta, una cámara de reacción de una placa PicoTiter, una cámara de reacción de una matriz, o una cámara de reacción microencapsulada de una emulsión de agua en aceite. La secuenciación puede llevarse a cabo mediante secuenciación pirofosfato o secuenciación de Sanger. Preferentemente la polimerasa no presenta actividad de exonucleasa 3' a 5'. La etapa de desbloqueo puede implicar poner en contacto un cebador reversiblemente bloqueado con un agente para eliminar un grupo PO_{4} en el cebador reversiblemente bloqueado. Este agente puede ser, por ejemplo, polinucleótido quinasa o fosfatasa alcalina. En una aplicación, el método puede utilizarse para determinar una primera secuencia de ácido nucleico próxima a un extremo de la molécula de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico próxima al segundo extremo de la molécula de ácido nucleico.

En otro aspecto, la invención comprende un método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde el método comprende: a) hibridar un primer cebador de secuenciación no bloqueado con una primera cadena de la molécula de ácido nucleico, b) hibridar un segundo cebador de secuenciación bloqueado con una segunda cadena de la molécula de ácido nucleico, c) incorporar por lo menos una base en la primera cadena mediante extensión del primer cebador no bloqueado con una polimerasa, d) bloquear la elongación adicional del cebador no bloqueado, e) desbloquear el segundo cebador de secuenciación, y f) incorporar por lo menos una base a la segunda cadena mediante extensión del segundo cebador con una polimerasa, en donde las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en cualquier orden o simultáneamente.

Con dicho método, la etapa (d) puede incluir: i) completar la elongación a partir del cebador no bloqueado con una polimerasa y dNTPs, o b) terminar la elongación con polimerasa en un tampón que contenga manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o c) terminar la elongación químicamente. El método puede comprender además una etapa de eliminación de la polimerasa, dNTPs y ddNTPs tras la etapa de bloqueo. En diversos aspectos el segundo cebador puede bloquearse con un grupo químico, tal como un grupo PO_{4}, un grupo tio y un grupo fosforotiol. El método puede utilizarse, por ejemplo, para determinar por lo menos una primera secuencia de ácido nucleico próxima a un primer extremo de la molécula de ácido nucleico y para determinar una segunda secuencia de ácido nucleico próxima a un segundo extremo de la molécula de ácido nucleico.

La invención también comprende un método para determinar un haplotipo molecular de una muestra de ADN en múltiples locus, que comprende las etapas de: a) hibridar 2 ó más cebadores de secuenciación contiguos a una pluralidad de locus en una muestra de ADN, en la que todos los cebadores excepto uno son cebadores reversiblemente bloqueados y en el que cada locus contiene una secuencia de ácido nucleico que determina un haplotipo, b) determinar un haplotipo en un locus mediante elongación por la polimerasa a partir de un cebador no bloqueado, c) bloquear la elongación adicional del cebador no bloqueado, d) desbloquear uno de los cebadores reversiblemente bloqueados, formando un cebador no bloqueado, e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que todos los cebadores reversiblemente bloqueados han sido desbloqueados y utilizados para determinar un haplotipo molecular, y en donde la secuenciación se lleva a cabo mediante secuenciación pirofosfato.

En dicho método, la etapa (c) de bloquear la elongación adicional puede comprender: i) completar la elongación a partir del cebador no bloqueado con la polimerasa y dNTPs, o ii) terminar la elongación con polimerasa en un tampón que contenga manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o iii) terminar la elongación químicamente. El método puede comprender además la etapa de eliminar la polimerasa, los dNTPs y los ddNTPs tras la etapa de bloqueo.

Además, la exposición comprende un método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de: a) hibridar un cebador de secuenciación con una cadena de la molécula de ácido nucleico, b) incorporar por lo menos una base en una cadena del ácido nucleico mediante elongación por la polimerasa a partir del cebador de secuenciación, c) bloquear la elongación adicional del cebador, y d) repetir las etapas (a) a (c) en la misma cadena de ácido nucleico o en una cadena diferente de ácido nucleico hasta determinar una cantidad deseada de secuencia.

Para determinados aspectos, la etapa (c) de dicho método comprende: i) completar la elongación a partir del cebador no bloqueado con polimerasa y dNTPs, o ii) terminar la elongación con polimerasa en un tampón que contenga manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o iii) terminar la elongación químicamente. Además, el método puede comprender además la etapa de eliminar la polimerasa, los dNTPs y los ddNTPs después de la etapa de bloqueo.

La exposición comprende además un método de secuenciación de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico de doble cadena, que comprende las etapas de: a) para cada una de las moléculas de doble cadena, separar dos cadenas de cada ácido nucleico de doble cadena y unir cada una de las dos cadenas complementarias a una única perla, generando una pluralidad de perlas en un único reactor, cada perla con ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico unidas a la misma, b) determinar la identidad de por lo menos una base de una de las cadenas, y c) determinar la identidad de por lo menos una base de la cadena complementaria de la molécula de ácido nucleico.

Ejemplos Ejemplo 1 Control de calidad del molde

El éxito de la reacción de PCR en emulsión, una primera etapa en los métodos de la presente exposición, se encontró que se relacionaba con la calidad de la especie de molde monocatenario. De acuerdo con lo anterior, se evaluó la calidad del material de molde con dos controles de calidad separados antes de iniciar el protocolo de PCR en emulsión. En primer lugar, se corrió una alícuota del molde monocatenario en el analizador 2100 BioAnalyzer (Agilent). Se utilizó un chip RNA Pico para verificar que la muestra incluía una población heterogénea de fragmentos, de tamaño comprendido entre aproximadamente 200 y 500 bases. En segundo lugar, se cuantificó la biblioteca utilizando el ensayo de fluorescencia RiboGreen en un fluorímetro de placas Bio-Tek FL600. Las muestras en las que se determinó que las concentraciones de ADN eran inferiores a 5 ng/\mul se consideraron excesivamente diluidas para ser utilizadas.

Ejemplo 2 Síntesis de perlas de captura de ADN

Se extrajeron de la columna perlas empaquetadas de una columna de afinidad HP de sefarosa activada con 1 ml de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Las perlas de tamaño comprendido entre 25 y 30 \mum se seleccionaron mediante pase en serie a través de secciones de malla de filtro de poro de 30 \mum y 25 \mum (Sefar America, Depew, NY, USA). Las perlas que pasaron a través del primer filtro pero que resultaron retenidas por el segundo se recogieron y se activaron tal como se describe en la literatura del producto (protocolo de Amersham Pharmacia nº 71700600AP). Se obtuvieron dos cebadores de captura largos diferentes marcados en la amina con HEG (hexaetilenglicol), correspondientes al extremo 5' de las cadenas sentido y antisentido del molde que debía amplificarse (5'-amina-3-espaciadores HEG gcttacctgaccgacctctgcctatcccetgttgcgtgtc-3', SEC ID nº 23, y 5'-amina-3 espaciadores HEG ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtc-3', SEC ID nº 24) (IDT Technologies, Coralville, IA, USA). Los cebadores se diseñaron para capturar ambas cadenas de los productos de amplificación, permitiendo la secuenciación desde los dos extremos, es decir, la secuenciación de la primera y segunda cadenas de los productos de amplificación. Los cebadores de captura se disolvieron en tampón fosfato 20 mM, pH 8,0, obteniendo una concentración final de 1 mM. Se unieron tres microlitros de cada cebador a las perlas tamizadas a través de 30-25 \mum (ver la figura 5). A continuación, las perlas se almacenaron en un tampón de almacenamiento de perlas (Tris 50 mM, Tween al 0,02% y azida sódica al 0,02%, pH 8).

Las perlas se cuantificaron utilizando un hemocitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA, USA) y se almacenaron a 4ºC hasta que se necesitaron.

Ejemplo 3 Preparación y formulación de mezcla de reacción de PCR

Al igual que en cualquier técnica de amplificación de moléculas individuales, la contaminación de las reacciones con amplicón foráneo o residual de otros experimentos podría interferir con un análisis de secuenciación. Para reducir la probabilidad de contaminación, la mezcla de reacción PCR se preparó en una campana de flujo laminar tratada con UV situada en una sala para PCR limpia. Por cada 600.000 reacciones de PCR en emulsión de perlas, se mezclaron los reactivos siguientes en un tubo de 1,5 ml: 225 \mul de mezcla de reacción (tampón HiFi Platinum 1X (Invitrogen), dNTPs 1 mM, MgSO_{4} 2,5 mM (Invitrogen), BSA al 0,1%, Tween al 0,01%, PPi-asa termoestable 0,003 U/\mul (NEB), cebador directo 0,125 \muM (5'-gcttacctgaccgacctctg-3', SEC ID nº 1) y cebador inverso 0,125 \muM (5'-ccattcccagctcgtcttg-3', SEC ID nº 2) (IDT Technologies, Coralville, IA, USA) y polimerasa Taq Hi-Fi Platinum 0,2 U/\mul (Invitrogen). Se extrajeron veinticinco microlitros de la mezcla de reacción y se almacenaron en un tubo para PCR individual de 200 \mul para la utilización como control negativo. Se almacenó tanto la mezcla de reacción como los controles negativos en hielo hasta que se necesitaron.

Ejemplo 4 Unión de especies de molde a perlas de captura de ADN

La amplificación de ADN clonal exitosa para la secuenciación se refiere al direccionamiento de un número controlado de especies de molde a cada perla. Para los experimentos descritos en la presente memoria, la concentración típica de molde diana se determinó que era de 0,5 copias de molde por cada perla de captura. A esta concentración, la distribución de Poisson dicta que 61% de las perlas no presentan asociado ningún molde, 30% presenta una especie de molde y 9% presentan dos o más especies de molde. La administración de un exceso de especies puede resultar en la unión y posterior amplificación de una población mixta (2 ó más especies) en una única perla, impidiendo la generación de datos de secuencia significativos. Sin embargo, la administración de un número excesivamente reducido de especies resultará en un menor número de pocillos que contengan molde (una especie por perla), reduciendo el grado de cobertura de la secuenciación. En consecuencia se consideró que la concentración de molde en la biblioteca de cadenas individuales era importante.

Se hibridaron moléculas de molde a cebadores complementarios en las perlas de captura de ADN mediante el método siguiente, llevado a cabo en una campana de flujo laminar tratada con UV. Se transfirieron seiscientas mil perlas de captura de ADN suspendidas en tampón de almacenamiento de perlas (ver el Ejemplo 9, posteriormente) a un tubo para PCR de 200 \mul. El tubo se centrifugó en una minicentrífuga de laboratorio durante 10 segundos, se hizo girar 180º y se centrifugó durante 10 segundos adicionales para asegurarse de que el pellet se formaba de manera uniforme. Se extrajo el sobrenadante y las perlas se lavaron con 200 \mul de tampón de hibridación (Tris 20 mM, pH 7,5 y acetato de magnesio 5 mM). El tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos para resuspender las perlas y éstas se peletizaron tal como anteriormente. La totalidad excepto aproximadamente 10 \mul del sobrenadante presente sobre las perlas fue extraído y se añadieron 200 \mul adicionales de tampón de hibridación. Las perlas se agitaron con vórtex nuevamente durante 5 segundos, se dejaron reposar durante 1 minuto y después se peletizaron tal como anteriormente. Se descartó la totalidad excepto 10 \mul de sobrenadante.

A continuación, se añadieron a las perlas 1,5 \mul de 300.000 moléculas/\mul de biblioteca de molde. El tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos para mezclar el contenido y los moldes se hibridaron con las perlas en un programa de desnaturalización/hibridación controlados preformado en un termociclador MJ. El programa permitió la incubación durante 5 minutos a 80ºC, seguido de una reducción de 0,1ºC/s hasta 70ºC, la incubación durante 1 minuto a 70ºC, la reducción en 0,1ºC/s hasta 60ºC, el mantenimiento a 60ºC durante 1 minuto, la reducción en 0,1ºC/s hasta 50ºC, el mantenimiento a 50ºC durante 1 minuto, la reducción en 0,1ºC/s hasta 20ºC, el mantenimiento a 20ºC. Tras completar el procedimiento de hibridación, se extrajeron las perlas del termociclador, se centrifugaron tal como se ha indicado anteriormente y se decantó cuidadosamente el tampón de hibridación. Las perlas de captura incluían, de promedio, 0,5 copias de ADN molde monocatenario unido a cada perla, y se almacenaron en hielo hasta que se necesitaron.

Ejemplo 5 Emulsificación

El procedimiento de emulsificación crea una emulsión de agua en aceite termoestable que contiene 10.000 microrreactores de PCR discretos por microlitro. Esto sirve como matriz para la amplificación clonal de cada molécula individual de las moléculas individuales de la biblioteca de diana. La mezcla de reacción y las perlas de captura de ADN para una sola reacción se emulsionaron de la manera siguiente. En una campana de flujo laminar tratada con UV se añadieron 200 \mul de solución para PCR (del Ejemplo 3) a un tubo que contenía 600.000 perlas de captura de ADN (del Ejemplo 4). Las perlas se resuspendieron mediante pipeteado repetido. A continuación, la mezcla de perlas para PCR se incubó a temperatura ambiente durante por lo menos 2 minutos, dejando que las perlas se equilibrasen con la solución para PCR. Simultáneamente, se añadió una alícuota de 450 \mul de aceite de emulsión (Span 80 al 4,5% (p/p), Atlox 4912 al 1% (p/p) (Uniqema, Delaware) en aceite mineral ligero (Sigma)) a un tubo de centrífuga de 2 ml de tapa plana (Dot Scientific) que contenía una barra de agitación magnética estéril de 1/4 de pulgada (Fischer). Este tubo seguidamente se introdujo en un soporte de plástico para tubos construido al efecto, que seguidamente se centró en una placa calefactora digital con agitación Fisher Isotemp (Fisher Scientific) funcionando a 450 rpm.

La solución de perlas para PCR se agitó con vórtex durante 15 segundos para resuspender las perlas. A continuación, se extrajo la solución con una jeringa de plástico desechable de 1 ml (Benton-Dickenson) en la que se había fijado una aguja de jeringa de seguridad de plástico (Henry Schein). La jeringa se introdujo en una bomba de jeringa (Cole-Parmer) modificada con una unidad de base de aluminio que orientaba la bomba verticalmente y no horizontalmente. El tubo con el aceite de emulsión se alineó en la placa de agitación de manera que se encontrase centrada en la parte inferior de la aguja de jeringa de plástico y la barra de agitación magnética girase correctamente. La bomba de jeringa se ajustó para dispensar 0,6 ml a un caudal de 5,5 ml/hora. La solución de perlas para PCR se añadió al aceite de emulsión gota a gota. Se procuró que las gotas no entrasen en contacto con las paredes del tubo al caer en el aceite bajo agitación.

Tras formarse la emulsión, se tuvo gran cuidado en minimizar la agitación de la emulsión durante el procedimiento de emulsificación y durante las etapas de distribución de alícuotas posteriores a la emulsificación. Se encontró que la agitación con vórtex, el pipeteado rápido o la mezcla excesiva podían provocar la rotura de la emulsión, destruyendo los microrreactores discretos. Al formar la emulsión, las dos soluciones se convirtieron en una mezcla blanca lechosa homogénea con la viscosidad de la mayonesa. Se vació el contenido de la jeringa en el aceite bajo agitación. A continuación, se sacó el tubo de emulsión del soporte y se golpeó suavemente con los dedos hasta que desaparecer cualquier capa residual de aceite presente en la parte superior de la emulsión. Se devolvió el tubo al dispositivo de soporte y se agitó con la barra de agitación magnética durante un minuto adicional. Se extrajo la barra de agitación de la emulsión haciendo correr una herramienta magnética de extracción a lo largo del exterior del tubo y se descartó la barra magnética.

Se extrajeron veinte microlitros de la emulsión de la parte intermedia del tubo utilizando una pipeta P100 y se vertieron sobre un portaobjetos de microscopía. Se utilizaron las puntas de pipeta más grandes, para minimizar las fuerzas de cizalla. Se observó la emulsión a una magnificación de 50X para garantizar que comprendía predominantemente perlas individuales en solución para PCR de microrreactores de 30 a 150 micrómetros de diámetro en aceite (figura esquemática mostrada en la figura 5). Tras el examen visual, se amplificaron inmediatamente las emulsiones.

Ejemplo 6 Amplificación

Se distribuyeron alícuotas de la emulsión en 7 ó 8 tubos para PCR separados. Cada tubo incluía aproximadamente 75 \mul de la emulsión. Se sellaron los tubos y se introdujeron en un termociclador MJ conjuntamente con los 25 \mul de control negativo indicados anteriormente. Se utilizaron los tiempos de ciclado siguientes: 1 ciclo de incubación durante 4 minutos a 94ºC (inicio en caliente), 30 ciclos de incubación durante 30 segundos a 94ºC y 150 segundos a 68ºC (amplificación) y 40 ciclos de incubación durante 30 segundos a 94ºC y 360 segundos a 68ºC (hibridación y extensión). Tras completar el programa de PCR, se sacaron los tubos y se rompieron las emulsiones inmediatamente o se
almacenaron las reacciones a 10ºC durante, como máximo, 16 horas para iniciar el proceso de rotura (ver la figura 6).

Ejemplo 7 Rotura de la emulsión y recuperación de las perlas

Tras la amplificación, se examinaron las emulsiones para rotura (separación de las fases aceitosa y acuosa). Las emulsiones no rotas se agruparon en un único tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mientras que la ocasional emulsión rota se descartó. Debido a que las muestras de emulsión eran bastante viscosas, quedaron cantidades significativas en cada tubo para PCR. La emulsión restante en los tubos se recuperó mediante la adición de 75 \mul de aceite mineral en cada tubo para PCR y pipeteando la mezcla. Esta mezcla se añadió al tubo de 1,5 ml que contenía la parte principal de material emulsionado. A continuación, se agitó con vórtex el tubo de 1,5 ml durante 30 segundos. Seguidamente, el tubo se centrifugó durante 20 minutos en la microcentrífuga de laboratorio a 13,2 Krpm (velocidad máxima).

Tras la centrifugación, la emulsión se separó en dos fases, con una gran interfase blanca. La fase aceite superior transparente se descartó, mientras que el material turbio de la interfase se dejó en el tubo. En una campana de humos químicos, se añadió 1 ml de hexanos a la fase inferior y capa de interfase. La mezcla se agitó con vórtex durante 1 minuto y se centrifugó a velocidad máxima durante 1 minuto en una microcentrífuga de laboratorio. La fase superior de aceite/hexano se separó y se descartó. A continuación, se añadió 1 ml de etanol al 80%/tampón de hibridación 1X a la fase acuosa, interfase y perlas restantes. Esta mezcla se agitó con vórtex durante 1 minuto o hasta disolver el material blanco de la interfase. Seguidamente se centrifugó la muestra en una microcentrífuga de laboratorio durante 1 minuto a velocidad máxima. El tubo se hizo girar 180 grados y se centrifugó nuevamente durante un minuto adicional. A continuación, se separó cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet de perlas.

El pellet blanco de perlas se lavó dos veces con 1 ml de tampón de hibridación que contenía Tween 20 al 0,1%. Se descartó la solución de lavado y las perlas se peletizaron tras cada lavado, tal como se ha indicado anteriormente. El pellet se lavó con 1 ml de agua picopura. Las perlas se peletizaron mediante el método de centrifugación-giro-centrifugación utilizado anteriormente. Se separó cuidadosamente la fase acuosa. A continuación, las perlas se lavaron con 1 ml de EDTA 1 mM tal como anteriormente, excepto en que las perlas se agitaron con vórtex brevemente a un ajuste intermedio durante 2 segundos antes de la peletización y eliminación del sobrenadante.

El ADN amplificado, inmovilizado sobre las perlas de captura, se trató para obtener ADN monocatenario. La segunda cadena se separó mediante incubación en una solución básica de disociación. Posteriormente se añadió un ml de solución de disociación (NaOH 0,125 M, NaCl 0,2 M) a las perlas. El pellet se resuspendió mediante agitación con vórtex a un ajuste intermedio durante 2 segundos, y el tubo se introdujo en un agitador orbital para tubos Thermolyne LabQuake durante 3 minutos. A continuación, las perlas se peletizaron tal como anteriormente, y el sobrenadante se separó cuidadosamente y se descartó. La solución residual de disociación se neutralizó mediante la adición de 1 ml de tampón de hibridación. Seguidamente, las perlas se agitaron con vórtex a velocidad intermedia durante 2 segundos. Las perlas se peletizaron y el sobrenadante se eliminó tal como anteriormente. Se repitió el lavado con tampón de hibridación, excepto en que únicamente se separaron 800 \mul del tampón de hibridación tras la centrifugación. Las perlas y el tampón de hibridación restante se transfirieron a un tubo para PCR de 0,2 ml. Las perlas se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a 4ºC durante, como máximo, 48 horas antes de continuar con el procedimiento de enriquecimiento.

El procedimiento en esta etapa se muestra esquemáticamente en la figura 7.

Ejemplo 8 Enriquecimiento de perlas

La masa de perlas incluía perlas con cadenas de ADN inmovilizadas amplificadas y perlas vacías o nulas. Tal como se ha indicado anteriormente, se calculó que 61% de las perlas no presentaba ADN molde durante el procedimiento de amplificación. Se utilizó el enriquecimiento para aislar selectivamente las perlas con ADN molde, maximizando de esta manera la eficiencia de la secuenciación. El procedimiento de enriquecimiento se describe en detalle posteriormente.

Las perlas con cadenas individuales del ejemplo anterior se peletizaron mediante el método de centrifugación-giro-centrifugación, y se eliminó la máxima cantidad posible de sobrenadante sin perturbar las perlas. Se añadieron quince microlitros de tampón de hibridación a las perlas, seguido de 2 \mul de cebador de enriquecimiento de 40 bases biotinilado 100 \muM (5'-biotina-espaciadores tetraetilenglicol ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtctcag-3', SEC ID nº 3). El cebador era complementario a los sitios agrupados de amplificación y secuenciación (cada uno de 20 bases de longitud) en el extremo 3' de la perla-molde inmovilizado. La solución se mezcló mediante vórtex a un ajuste intermedio durante 2 segundos, y se hibridaron los cebadores de enriquecimiento con las cadenas de ADN inmovilizadas utilizando un programa de desnaturalización/hibridación controlada en un termociclador MJ. El programa consistía de los tiempos de ciclado y temperaturas siguientes: incubación durante 30 segundos a 65ºC, reducción de 0,1ºC/s hasta 58ºC, incubación durante 90 segundos a 58ºC y mantenimiento a 10ºC.

Aunque los cebadores se hibridaban, se resuspendieron perlas recubiertas de estreptavidina MyOne^{TM} de Dynal mediante movimientos circulares suaves. A continuación, se añadieron 20 \mul de las perlas MyOne^{TM} a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenía 1 ml de líquido Potenciador (NaCl 2 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). La mezcla de perlas MyOne se agitó con vórtex durante 5 segundos y el tubo se introdujo en un imán MPC-S de Dynal. Las perlas paramagnéticas se peletizaron contra las paredes del tubo de microcentrífuga. Se eliminó cuidadosamente el sobrenadante y se descartó sin perturbar las perlas MyOne^{TM}. Se sacó el tubo del imán y se añadieron 100 \mul de líquido potenciador. El tubo se agitó con vórtex durante 3 segundos para resuspender las perlas y se almacenó en hielo hasta que se necesitó.

Tras completar el programa de hibridación, se añadieron 100 \mul de tampón de hibridación al tubo para PCR que contenía las perlas de captura de ADN y cebador de enriquecimiento. El tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos y el contenido se transfirió a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 ml. El tubo para PCR en el que se había hibridado el cebador de enriquecimiento a las perlas de captura se lavó una vez con 200 \mul de tampón de hibridación y se añadió la solución de lavado al tubo de 1,5 ml. Las perlas se lavaron tres veces con 1 ml de tampón de hibridación, se agitaron con vórtex durante 2 segundos y se peletizaron tal como anteriormente. Se eliminó cuidadosamente el sobrenadante. Tras el tercer lavado, las perlas se lavaron dos veces con 1 ml de líquido potenciador helado. Las perlas se agitaron con vórtex, se peletizaron y el sobrenadante se eliminó tal como anteriormente. Las perlas se resuspendieron en 150 \mul de líquido potenciador helado y la solución de perlas se añadió a las perlas MyOne^{TM} lavadas.

La mezcla de perlas se agitó con vórtex durante 3 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 3 minutos en un agitador orbital para tubos LabQuake. Las perlas MyOne^{TM} recubiertas de estreptavidina se unieron a los cebadores de enriquecimiento biotinilados hibridados a los moldes inmovilizados en las perlas de captura de ADN. A continuación, las perlas se centrifugaron a 2.000 rpm durante 3 minutos, después de los cuales las perlas se agitaron con vórtex con pulsos de 2 segundos hasta su resuspensión. Las perlas resuspendidas se dejaron sobre hielo durante 5 minutos. Seguidamente, se añadieron 500 \mul de líquido potenciador frío a las perlas y el tubo se insertó en un imán MPC-S de Dynal. Las perlas se dejaron en reposo durante 60 segundos para permitir la peletización contra el imán. A continuación, el sobrenadante con exceso de MyOne^{TM} y de perlas de captura de ADN nulas se separó cuidadosamente y se descartó.

El tubo se sacó del imán MPC-S y se añadió 1 ml de líquido potenciador frío a las perlas. Las perlas se resuspendieron con ligeros toques de los dedos. Era importante no agitar con vórtex las perlas en este momento, debido a que la mezcla vigorosa podría romper el enlace entre las perlas de captura MyOne^{TM} y las de captura de ADN. Las perlas se devolvieron al imán y se eliminó el sobrenadante. Este lavado se repitió tres veces adicionales para asegurarse de que se habían eliminado todas las perlas de captura nulas. Para separar los cebadores de enriquecimiento hibridados y las perlas MyOne^{TM}, se resuspendieron las perlas de captura de ADN en 400 \mul de solución de disociación, se agitaron con vórtex durante 5 segundos y se peletizaron con el imán. El sobrenadante con las perlas enriquecidas se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado. Para una recuperación máxima de las perlas enriquecidas, se añadió una segunda alícuota de 400 \mul de solución de disociación al tubo que contenía las perlas MyOne^{TM}. Las perlas se agitaron con vórtex y se peletizaron tal como anteriormente. El sobrenadante del segundo lavado se separó y se agrupó con el primer bolo de perlas enriquecidas. El tubo de perlas MyOne^{TM} utilizadas se descartó.

El tubo de microcentrífuga de perlas de captura de ADN enriquecido se introdujo en el imán MPC-S de Dynal para peletizar cualquier perla MyOne^{TM} residual. Las perlas enriquecidas en el sobrenadante se transfirieron a un segundo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se centrifugaron. Se separó el sobrenadante y las perlas se lavaron 3 veces con 1 ml de tampón de hibridación para neutralizar la solución de disociación residual. Tras el tercer lavado, se separaron 800 \mul del sobrenadante, y las perlas y solución restantes se transfirieron a un tubo para PCR de 0,2 ml. Las perlas enriquecidas se centrifugaron a 2.000 rpm durante 3 minutos y se decantó el sobrenadante. A continuación, se añadieron 20 \mul de tampón de hibridación y 3 \mul de dos cebadores de secuenciación 100 \muM diferentes (5'-ccatctgttccctccctgtc-3', SEC ID nº 4, y 5'-cctatcccctgttgcgtgtc-3' fosfato, SEC ID nº 5). El tubo se agitó con vórtex durante 5 segundos y se introdujo en un termociclador MJ para el programa de hibridación en 4 etapas siguiente: incubación durante 5 minutos a 65ºC, reducción a 0,1ºC/s hasta 50ºC, incubación durante 1 minuto a 50ºC, reducción a 0,1ºC/s hasta 40ºC, mantenimiento a 40ºC durante 1 minuto, reducción a 0,1ºC/s hasta 15ºC y mantenimiento a 15ºC.

Tras completar el programa de hibridación, las perlas se extrajeron del termociclador y se peletizaron mediante centrifugación durante 10 sgundos. El tubo se hizo girar 180º y se centrifugó durante 10 segundos adicionales. Se decantó el sobrenadante y se descartó y se añadieron 200 \mul de tampón de hibridación al tubo. Las perlas se resuspendieron con una segunda agitación con vórtex de 5 segundos y se peletizaron tal como anteriormente. Se separó el sobrenadante y las perlas se resuspendieron en 100 \mul de tampón de hibridación. En este punto las perlas se cuantificaron con un contador Coulter Multisizer 3 (Beckman Coulter). Las perlas se almacenaron a 4ºC y se mantuvieron estables durante por lo menos 1 semana.

Ejemplo 9 Secuenciación de doble cadena

Para la secuenciación de dobles cadenas, se utilizaron dos cebadores de secuenciación diferentes: un cebador MMP7A no modificado y un cebador MMP2Bp 3' fosforilado. En el procedimiento se siguen múltiples etapas. Este procedimiento se muestra esquemáticamente en la figura 8.

1): Secuenciación de la primera cadena. La secuenciación de la primera cadena implica la extensión del cebador no modificado mediante una ADN polimerasa mediante la adición secuencial de nucleótidos durante un número predeterminado de ciclos.

2): Adición de caperuza: la secuenciación de la primera cadena se terminó haciendo fluir un tampón de adición de caperuza que contenía tricina 25 mM, acetato de magnesio 5 mM, DTT 1 mM, PVP 0,4 mg/ml, BSA 0,1 mg/ml, Tween al 0,01% y 2 \muM de cada dideoxinucleótido y 2 \muM de cada desoxinucleótido.

3): Lavado: los desoxinucleótidos y dideoxinucleótidos residuales se eliminaron haciendo fluir tampón apirasa que contenía tricina 25 mM, acetato de magnesio 5 mM, DTT 1 mM, PVP 0,4 mg/ml, BSA 0,1 mg/ml, Tween al 0,01% y 8,5 unidades/l de apirasa.

4): Corte: el segundo cebador bloqueado se desbloqueó eliminando el grupo fosfato del extremo 3' del cebador 3' fosforilado modificado haciendo fluir un tampón de corte que contenía 5 unidades/ml de fosfatasas intestinales bovinas.

5): Continuación: el segundo cebador desbloqueado se activó mediante la adición de polimerasa haciendo fluir 1.000 unidades/ml de ADN polimerasas para capturar todos los sitios de cebador disponibles.

6): Secuenciación de la segunda cadena: la secuenciación de la segunda cadena mediante una ADN polimerasa mediante la adición secuencial de nucleótidos durante un número predeterminado de ciclos.

Mediante la utilización de los métodos descritos anteriormente, se secuenció el ADN genómico de Staphylococcus aureus. Los resultados se presentan en la figura 9. Se obtuvo un total de 31.785 lecturas basadas en 15.770 lecturas de la primera cadena y 16.015 lecturas de la segunda cadena. De entre éstas, un total de 11.799 lecturas se encontraban apareadas y 8.187 lecturas se encontraban desapareadas, obteniendo una cobertura total de 38%.

Las longitudes de lectura se encontraban comprendidas entre 60 y 130, con una media de 95 +/- 9 bases (figura 10).

La distribución del tramo genómico y el número de pocillos de cada tramo genómico se muestran en la figura 11. En la figura 12 se muestran series de alineación representativas de dicha secuenciación genómica.

Aunque en la presente memoria se han dado a conocer realizaciones particulares en detalle, ello se ha llevado a cabo a título de ejemplo con fines únicamente ilustrativos, y no se pretende que sean limitativas del alcance de la invención según las reivindicaciones adjuntas, proporcionadas posteriormente.

<110> Chen, Yi-Ju

\hskip1cm

Leamon, John H.

\hskip1cm

Lohman, Ken

\hskip1cm

Ronan, Michael T.

\hskip1cm

Srinivasan, Maithreyan

\hskip1cm

Rothberg, Jonathan

\hskip1cm

Weiner, Michael

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<120> Secuenciación desde los dos extremos

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<130> 21465-509 UTIL

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<150> US 60/443,471

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<151> 2003-01-29

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/465,071

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-04-23

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/476,592

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-06-06

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/476,504

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<151> 2003-06-06

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/476,592

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-06-06

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/476,602

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<151> 2003-06-06

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<150> US 60/497,985

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-08-25

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<160> 24

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcttacctga ccgacctctg

\hfill

20

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<210> 2

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccattcccca gctcgtcttg

\hfill

20

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<210> 3

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc tcag

\hfill

44

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<210> 4

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido

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<400> 4

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ccatctgttc cctccctgtc

\hfill

20

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<210> 5

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

cctatcccct gttgcgtgtc

\hfill

20

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<210> 6

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgcacatgg ttgacacagt ggt

\hfill

23

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<210> 7

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgcacatgg ttgacacagt gg

\hfill

22

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<210> 8

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgccaccga cctagtctca aactt

\hfill

25

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<210> 9

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tattgttgat gctgtaaaaa gaagctactg gtgtagtatt tttatgaagt t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgctcaaaga attcatttaa aatatgacca tatttcattg tatcttt

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcgaacag tcaagtacca cagtcagttg acttttacac aagcggat

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacaggtgtt ggtatgccat ttgcgatttg ttgcgcttgg ttagccg

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacatataaa catcccctat ctcaatttcc gcttccatgt aacaaaaaaa gc

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagatatcac ttgcgtgtta ctggtaagca ggcatgag

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attcaactct ggaaatgctt tcttgatacg cctcgatgat g

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgaggagc tgcaatggca atgggttaaa ggcatcatcg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtatctcga tttggattag ttgctttttg catcttcatt agacc

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cattaacatc tgcaccagaa atagcttcta atacgattgc

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgacgacgt ccagctaata acgctgcacc taaggctaat gataat

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaccatgca gatgctaaca aagctcaagc attaccagaa act

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttgctgca tcataattta atactacatc atttaattct ttgg

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resultado de secuenciación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagatggtg tgactaacca agttggtcaa aatgccctaa atacaaaaga t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttacctga ccgacctctg cctatcccct gttgcgtgt

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc

\hfill

40

Claims

1. Método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico, que comprende las etapas de:

(a) hibridar dos o más cebadores de secuenciación con una o una pluralidad de cadenas individuales de la molécula de ácido nucleico, en la que todos los cebadores excepto uno son cebadores reversiblemente bloqueados,

(b) incorporar por lo menos una base en la molécula de ácido nucleico mediante elongación de polimerasa a partir de un cebador no bloqueado,

(c) bloquear la elongación adicional de dicho cebador no bloqueado,

(d) desbloquear uno de los cebadores reversiblemente bloqueados, formando un cebador desbloqueado,

(e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que por lo menos uno de los cebadores reversiblemente bloqueados se haya desbloqueado y utilizado para determinar una secuencia mediante secuenciación pirofosfato.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa (c) de bloquear la elongación adicional comprende:

(a) completar la elongación a partir del cebador no bloqueado con polimerasa y dNTPS, o

(b) terminar la elongación con polimerasa en un tampón que contiene manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o

(c) terminar la elongación químicamente.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de eliminar dicha polimerasa, dNTPs y ddNTPs antes de dicha etapa (d).

4. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado se bloquea con un grupo químico seleccionado de entre el grupo que consiste de un grupo PO_{4}, un grupo tio y un grupo fosforotiol.

5. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta un extremo 3' desapareado que puede desbloquearse mediante la puesta en contacto de dicho cebador con una exonucleasa.

6. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta una o más bases no complementarias que forman un bucle y que no se hibridan con la molécula de ácido nucleico, en la que dicha base o bases no se encuentran en el extremo 5' ó 3' de dicho cebador reversiblemente bloqueado, y en el que dicho cebador reversiblemente bloqueado comprende un nucleótido dideoxi en su extremo 3'.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicho por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado resulta desbloqueado mediante digestión de endonucleasa de dicha base o bases no complementarias, formando una muesca en dicha base o bases no complementarias.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la etapa (b) comprende la elongación por polimerasa en dicha muesca por parte de una polimerasa con capacidad de desplazamiento de cadena.

9. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta una secuencia de 5'-NUX-3', en la que N representa una secuencia oligonucleótida de cualquier longitud, U es uracilo y X es un dideoxinucleótido.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicho cebador reversiblemente bloqueado resulta desbloqueado por la uracilo-ADN glucosilasa y AP endonucleasa, generando un cebador desbloqueado con un extremo 3' extensible.

11. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta una secuencia de 5'-NYZ-3', en la que N representa una secuencia oligonucleótida de cualquier longitud, Y es un nucleótido modificado, y Z representa una única base nucleótida, y en el que dicho nucleótido modificado puede ser desbloqueado por la formamidopirimidina (fapy)-ADN glucosilasa.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha base modificada se selecciona de entre el grupo que consiste de 8-oxoguanina, 8-oxoadenina, fapy-guanina, metil-fapy-guanina, fapy-adenina, aflatoxina-B_{1}-fapy-guanina, 5-hidroxicitosina y 5-hidroxiuracilo.

13. Método según la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico es un ADN genómico, ADNc o ADN episómico.

14. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador de secuenciación se hibrida con una cadena sentido del ácido nucleico y por lo menos un cebador de secuenciación se hibrida con una cadena antisentido de la molécula de ácido nucleico en la etapa (a).

15. Método según la reivindicación 1, en el que la elongación por polimerasa es de entre 1 y 250 bases.

16. Método según la reivindicación 1, en el que dicho método se lleva a cabo en un recipiente de reacción seleccionado de entre el grupo que consiste de una probeta, una cámara de reacción de una placa PicoTiter, una cámara de reacción de una matriz, y una cámara de reacción microencapsulada de una emulsión de agua en aceite.

17. Método según la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico presenta una longitud de entre 100 y 1.000 pb.

18. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos una de dichas cadenas de molécula de ácido nucleico o por lo menos uno de dichos cebadores se une a un soporte sólido.

19. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos una cadena de dicha molécula de ácido nucleico se une a un soporte sólido.

20. Método según la reivindicación 18, en el que por lo menos uno de dichos cebadores se inmoviliza en un soporte sólido para formar un cebador inmovilizado y una de dichas cadenas se une a un soporte sólido mediante hibridación con dicho cebador inmovilizado.

21. Método según la reivindicación 20, en el que el soporte sólido es un soporte sólido móvil esférico.

22. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador comprende un marcaje detectable.

23. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de desbloqueo comprende poner en contacto un cebador reversiblemente bloqueado con un agente para eliminar un grupo PO_{4} de dicho cebador reversiblemente bloqueado.

24. Método según la reivindicación 23, en el que dicho agente se selecciona de entre el grupo que consiste de polinucleótido quinasa y fosfatasa alcalina.

25. Método según la reivindicación 1, en el que dicha polimerasa no presenta actividad exonucleasa 3' a 5'.

26. Método según la reivindicación 1, en el que dicho método determina una primera secuencia de ácido nucleico próxima a un extremo de dicha molécula de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico próxima a un segundo extremo de dicha molécula de ácido nucleico.

27. Método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende:

(a) hibridar un primer cebador de secuenciación no bloqueado con una primera cadena de la molécula de ácido nucleico,

(b) hibridar un segundo cebador de secuenciación bloqueado con una segunda cadena de la molécula de ácido nucleico,

(c) incorporar por lo menos una base en dicha primera cadena mediante extensión de dicho primer cebador no bloqueado con una polimerasa,

(d) bloquear la elongación adicional de dicho cebador no bloqueado,

(e) desbloquear el segundo cebador de secuenciación, y

(f) incorporar por lo menos una base en dicha segunda cadena mediante extensión de dicho segundo cebador con una polimerasa,

en donde las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en cualquier orden o simultáneamente.

\vskip1.000000\baselineskip

28. Método según la reivindicación 27, en el que dicha etapa (d) de bloquear la elongación adicional comprende:

(c) terminar la elongación químicamente.

\vskip1.000000\baselineskip

29. Método según la reivindicación 28, que comprende además la eliminación de dichos polimerasa, dNTPs y ddNTPs después de dicha etapa de bloqueo.

30. Método según la reivindicación 27, en el que dicho segundo cebador se bloquea con un grupo químico seleccionado de entre el grupo que consiste de un grupo PO_{4}, un grupo tio y un grupo fosforotiol.

31. Método según la reivindicación 27, en el que dicho método determina por lo menos una primera secuencia de ácido nucleico próxima a un primer extremo de dicha molécula de ácido nucleico y determina una segunda secuencia de ácido nucleico próxima a un segundo extremo de dicha molécula de ácido nucleico.

32. Método para determinar un haplotipo molecular de una muestra de ADN en múltiples locus, que comprende las etapas de:

(a) hibridar 2 ó más cebadores de secuenciación contiguos a una pluralidad de locus en una muestra de ADN, en la que todos los cebadores excepto uno son cebadores reversiblemente bloqueados y en la que cada locus contiene una secuencia de ácido nucleico que determina un haplotipo,

(b) determinar un haplotipo en un locus mediante elongación de polimerasa a partir de un cebador no bloqueado,

(c) bloquear la elongación adicional de dicho cebador no bloqueado,

(e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que la totalidad de los cebadores reversiblemente bloqueados ha sido desbloqueada y utilizada para determinar un haplotipo molecular,

y en el que la secuenciación se lleva a cabo mediante secuenciación pirofosfato.

\vskip1.000000\baselineskip

33. Método según la reivindicación 32, en el que dicha etapa (c) de bloquear la elongación adicional comprende:

(c) terminar la elongación químicamente.

\vskip1.000000\baselineskip

34. Método según la reivindicación 33, que comprende además la etapa de eliminar dichos polimerasa, dNTPs y ddNTPs después de dicha etapa de bloqueo.